|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Колонка для афереза, наполненная твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента. 2. Колонка по п.1, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован, где носитель содержит иммобилизованный на нем стрептавидин и где один или более чем один биотинилированный хемокин связан со стрептавидином на носителе. 3. Колонка по п.1 или 2, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован через спейсерную группу. 4. Колонка по любому из пп.1-3, где носитель содержит или состоит из углевода, имеющего молекулярную массу более 100 кДа. 5. Колонка по п.4, где углевод представляет собой поперечно сшитую агарозу. 6. Колонка по любому из пп.1-5, где указанный один или более чем один хемокин выбран из CCL25, макрофагального воспалительного белка-1а (MIP-1а), MIP-1b, моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, хемокина, регулируемого тимусом и активацией (TARC), хемокина макрофагального происхождения (MDC), MIP-3, MIP-3a, MIP3b, MIP-4, I-309, HCC-1, HCC-2, хемокина вторичных лимфоидных тканей (SLC), интерлейкина-8 (IL-8), регулируемого ростом онкогена-а (GROa), GROb, GROg, хемокина, выделяемого T-клетками при активации (RANTES), белка-2, активирующего нейтрофилы (NAP-2), эпителиального пептида 78, активирующего нейтрофилы (ENA78), гранулоцитарного хемотаксического белка-2 (GCP-2), IP-10, монокина, индуцируемого интерфероном-гамма (MIG), I-TAC, фактора стромальных клеток (SDF), фракталкина, лимфотактина, эотаксина, эотаксина-2, I-309, хемокина B-лимфоцитов (BLC). 7. Колонка по п.6, где указанный один или более чем один хемокин представляет собой процессированный хемокин CCL25, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1. 8. Колонка по п.7, где указанный процессированный хемокин CCL25 биотинилирован в положении 72 (лизин) для обеспечения возможности иммобилизации указанного хемокина на твердом носителе. 9. Колонка по п.8, где указанный процессированный хемокин CCL25 дополнительно содержит полиэтиленгликолевый спейсер (ПЭГ-спейсер) между биотином и лизиновым остатком. 10. Колонка по любому из пп.1-9, где носитель имеет форму сфер, гранул или частиц неправильной формы, имеющих средний размер от 50 мкм до 2 мм. 11. Колонка по любому из пп.1-10, где носитель обработан агентом для придания ему антикоагулянтных свойств, как, например, у гепаринизированного носителя. 12. Способ удаления клетки, экспрессирующей штатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента, включающий: а) приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанной клетки на носителе; и б) отделение крови с уменьшенным содержанием указанной клетки от носителя. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий, перед стадией (а), получение периферической крови от пациента. 14. Способ по п.12 или 13, дополнительно включающий, после стадии (б), инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту. 15. Способ по любому из пп.12-14, где клетка представляет собой лейкоцит. 16. Способ по любому из пп.12-15, который используют в процессе лечения воспалительного состояния. 17. Способ по п.16, где воспалительное состояние представляет собой воспалительное расстройство кишечника (IBD). 18. Способ по любому из пп.12-17, где твердый носитель является таким, как определено в любом из пп. 2-11. 19. Способ по любому из пп.12-18, где периферическую кровь непрерывно получают от пациента и непрерывно проводят инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту. 20. Способ по любому из пп.12-19, где носитель расположен в колонке, через которую осуществляют ток крови. 21. Способ по любому из пп.12-20, где периферическая кровь обработана антикоагулянтом. 22. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения воспалительного состояния. 23. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения заболевания, характеризующегося присутствием повышенного уровня клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина. 24. Применение по п.23, где клетка представляет собой лейкоцит, в частности один или более из T-лимфоцита, моноцита, нейтрофильных гранулоцитов или эозинофила, в периферической крови больного.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Колонка для афереза, наполненная твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента. 2. Колонка по п.1, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован, где носитель содержит иммобилизованный на нем стрептавидин и где один или более чем один биотинилированный хемокин связан со стрептавидином на носителе. 3. Колонка по п.1 или 2, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован через спейсерную группу. 4. Колонка по любому из пп.1-3, где носитель содержит или состоит из углевода, имеющего молекулярную массу более 100 кДа. 5. Колонка по п.4, где углевод представляет собой поперечно сшитую агарозу. 6. Колонка по любому из пп.1-5, где указанный один или более чем один хемокин выбран из CCL25, макрофагального воспалительного белка-1а (MIP-1а), MIP-1b, моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, хемокина, регулируемого тимусом и активацией (TARC), хемокина макрофагального происхождения (MDC), MIP-3, MIP-3a, MIP3b, MIP-4, I-309, HCC-1, HCC-2, хемокина вторичных лимфоидных тканей (SLC), интерлейкина-8 (IL-8), регулируемого ростом онкогена-а (GROa), GROb, GROg, хемокина, выделяемого T-клетками при активации (RANTES), белка-2, активирующего нейтрофилы (NAP-2), эпителиального пептида 78, активирующего нейтрофилы (ENA78), гранулоцитарного хемотаксического белка-2 (GCP-2), IP-10, монокина, индуцируемого интерфероном-гамма (MIG), I-TAC, фактора стромальных клеток (SDF), фракталкина, лимфотактина, эотаксина, эотаксина-2, I-309, хемокина B-лимфоцитов (BLC). 7. Колонка по п.6, где указанный один или более чем один хемокин представляет собой процессированный хемокин CCL25, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1. 8. Колонка по п.7, где указанный процессированный хемокин CCL25 биотинилирован в положении 72 (лизин) для обеспечения возможности иммобилизации указанного хемокина на твердом носителе. 9. Колонка по п.8, где указанный процессированный хемокин CCL25 дополнительно содержит полиэтиленгликолевый спейсер (ПЭГ-спейсер) между биотином и лизиновым остатком. 10. Колонка по любому из пп.1-9, где носитель имеет форму сфер, гранул или частиц неправильной формы, имеющих средний размер от 50 мкм до 2 мм. 11. Колонка по любому из пп.1-10, где носитель обработан агентом для придания ему антикоагулянтных свойств, как, например, у гепаринизированного носителя. 12. Способ удаления клетки, экспрессирующей штатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента, включающий: а) приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанной клетки на носителе; и б) отделение крови с уменьшенным содержанием указанной клетки от носителя. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий, перед стадией (а), получение периферической крови от пациента. 14. Способ по п.12 или 13, дополнительно включающий, после стадии (б), инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту. 15. Способ по любому из пп.12-14, где клетка представляет собой лейкоцит. 16. Способ по любому из пп.12-15, который используют в процессе лечения воспалительного состояния. 17. Способ по п.16, где воспалительное состояние представляет собой воспалительное расстройство кишечника (IBD). 18. Способ по любому из пп.12-17, где твердый носитель является таким, как определено в любом из пп. 2-11. 19. Способ по любому из пп.12-18, где периферическую кровь непрерывно получают от пациента и непрерывно проводят инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту. 20. Способ по любому из пп.12-19, где носитель расположен в колонке, через которую осуществляют ток крови. 21. Способ по любому из пп.12-20, где периферическая кровь обработана антикоагулянтом. 22. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения воспалительного состояния. 23. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения заболевания, характеризующегося присутствием повышенного уровня клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина. 24. Применение по п.23, где клетка представляет собой лейкоцит, в частности один или более из T-лимфоцита, моноцита, нейтрофильных гранулоцитов или эозинофила, в периферической крови больного.
Евразийское ои 023912 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201100452
(22) Дата подачи заявки
2009.09.10
(51) Int. Cl. C07K14/52 (2006.01) A61M1/36 (2006.01) B01J20/32 (2006.01)
(54) ЛЕЧЕНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ
(31) 0801938-2
(32) 2008.09.10
(33) SE
(43) 2011.12.30
(86) PCT/GB2009/002196
(87) WO 2010/029317 2010.03.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АйТиЭйч ИММЬЮН ТЕРАПИ ХОЛДИНГЗ АБ (SE)
(72) Изобретатель:
(74)
Винквист Ола (SE), Коттон Грэхэм (GB)
Представитель:
Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU)
(56)
WO-A1-2008038785 WO-A2-2006125201 ANONYMOUS: "Pierce Monomelic Avidin Kit", INTERNET ARTICLE, 2007, XP002600558, Completes the disclosure of WO 2006125201 with respect to the immobilized monomeric avidin (Pierce, Number 20227)
THIERRY A.-C. ET AL.: "BIOTINYLATED SYNTHETIC CHEMOKINES THEIR USE FOR THE DEVELOPMENT OF NONRADIOACTIVE WHOLE-CELL BINDING ASSAYS", JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING, LARCHMONT, NY, US LNKD- DOI 10.1177/1087057103008003009, vol. 8, no. 3, 1 June 2003 (2003-06-01), pages 316-323, XP009027971, ISSN: 1087- 0571 * abstract
DE-A1-102005036505
WO-A1-2007133147
PAPADAKIS K.A.: "CHEMOKINES IN
NFLAMMATORY BOWEL DISEASE", CURRENT
ALLERGY AND ASTHMA REPORTS, CURRENT
SCIENCE, US, vol. 4, no. 1, 1 January 2004 (2004-01-01), pages 83-89, XP009055578, ISSN: 1529-7322, the whole document
NIESS JAN HENDRIK ET AL.: "Chemokines in immune surveillance of the intestine", CURRENT TOPICS IN MEMBRANES, SAN DIEGO, CA, US LNKD-DOI: 1016/51063-5823 (04)55006-8, vol. 55, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 143-158, XP008126751, ISSN: 1063-5823, pages 151-152, paragraph VII
CALDERON TINA M. ET AL.: "Overview and history of chemokines and their receptors", CURRENT
TOPICS IN MEMBRANES ELSEVIER ACADEMIC
PRESS INC, SAN DIEGO, CA, USA SERIES: CURRENT TOPICS IN MEMBRANES (ISSN 1063-5823 (PRINT)), 2005, pages 1-47, XP008126750, table 1
ZABEL ВА. ET AL.: "Human G protein-coupled receptor GPR-9-6/CC chemokine receptor 9 is selectively expressed on intestinal homing T lymphocytes, mucosal lymphocytes and themocytes and is required for thymus-expressed chemokine-mediated chemotaxis",
THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US LNKD- DOI:
10.1084/JEM.190.9.1241, vol. 190, no. 9, 1 November 1999 (1999-11-01), pages 1241-1254, XP002956581, ISSN: 0022-1007, page 1243, column 1, line 5 - line 11
DATABASE Uni Prot [Online], 15 July 1998 (1998-07-15), "RecName: Full=C-C motif chemokine 25, AltName Full=Chemokine TECK, AltName Full=Smal 1-inducible cytokine A25, AltName Full=Thymus-expressed chemokine, Flags Precursor", XP002618217, retrieved from EBI accession no UNI PROT: 015444, Database accession no. 015444, sequence
FOX JAMES M. ET AL.: "The molecular and cellular biology of cc chemokines and their receptors", CURRENT TOPICS IN MEMBRANES, SAN DIEGO, CA, US, vol. 55, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 73-102, XP008132315, ISSN: 1063-5823, page 78, line 1 - page 80,
line 9
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к продуктам для лечения и способам лечения воспалительных состояний, таких как воспалительное заболевание кишечника, в частности неспецифического язвенного колита (UC) и болезни Крона (CD), особенно фульминантного язвенного колита и болезни Крона, и средству для лечения.
Предшествующий уровень техники
Фульминантный язвенный колит представляет собой ухудшение неспецифического язвенного колита, отличающееся большим количеством лейкоцитов и сильной болью в животе. В настоящее время пациентов с фульминантным язвенным колитом лечат высокими дозами стероидов. В исследованиях III фазы было изучено лечение антителами против фактора некроза опухоли a (TNFa). Оба лекарственных средства в целом ингибируют воспаление. Они эффективны приблизительно в 50% случаев, но имеют серьезные нежелательные эффекты. Даже при успешном лечении фульминантный язвенный колит имеет тенденцию к рецидивированию.
У пациентов с фульминантным язвенным колитом, не отвечающих на консервативное лечение, обязательно немедленное хирургическое вмешательство. Неспецифический язвенный колит всегда ограничен толстой кишкой. В качестве крайней меры проводят резекцию толстой кишки и делают наружную илеостому. После восстановительного периода продолжительностью по меньшей мере 6 месяцев и в некоторых случаях дальнейшего консервативного лечения воспаления культи прямой кишки у большинства пациентов будут проводить либо наложение илеоректального анастомоза, либо реконструктивное хирургическое вмешательство с тазовым тонкокишечным резервуаром для восстановления непрерывности кишки. Оба способа приводят к частому жидкому стулу около шести раз в сутки и расстройствам водного и минерального баланса. Также возможны фульминантные эпизоды при болезни Крона (фульминант-ный колит Крона), также представляющие собой серьезные состояния, при которых необходимо немедленное консервативное и/или хирургическое вмешательство.
Несмотря на то что у пациентов с болезнью Крона возможно воспаление любой части желудочно-кишечного тракта, оно обычно ограничено наиболее дистальной частью тонкой кишки и начальной частью толстой кишки (илеоцекальной областью). Консервативное лечение не способно привести к излечению заболевания, хотя противовоспалительные лекарственные средства, такие как стероиды и азатио-прин, облегчают симптомы. Приблизительно 50% пациентов показано хирургическое вмешательство с резекцией стенозированных и истонченных сегментов кишечника; приблизительно у половины из них будут рецидивы и будет необходимо последующее хирургическое лечение. Таким образом, крайне обоснован способ, позволяющий специфично устранять воспаление при воспалительном расстройстве кишечника (IBD) и предотвращать рецидивы заболевания у пациента-индивида.
В WO 2008/038785 описана колонка для адсорбции клеток для удаления клеток, в частности активированных лейкоцитов и раковых клеток, и цитокинов из крови.
Краткое изложение сущности изобретения
Воспалительное заболевание кишечника характеризуется воспалением и лейкоцитарной инфильтрацией пораженной кишки.
Хемокины представляют собой класс цитокиновых молекул, вовлеченных в рекрутинг и активацию клеток при воспалении. Хемокины вызывают хемотаксис и активацию различных субпопуляций клеток в иммунной системе. Активность хемокинов обусловлена главным образом прочным связыванием с их рецепторами на поверхности лейкоцитов. Настоящее изобретение основано на понимании того, что взаимодействие между хемокинами и клетками, экспрессирующими их рецепторы, может быть использовано для лечения воспалительных состояний, в частности хронических воспалительных состояний, характеризующихся усиленным рекрутингом клеток, экспрессирующих рецепторы хемокинов, в очаг воспаления. Таким образом, изобретение способствует уменьшению рекрутинга воспалительных лейкоцитов в очаг воспаления, обусловленного индукцией высоких уровней экспрессии воспалительных хемокинов. Этого достигают с использованием таких воспалительных хемокинов для захвата воспалительных лейкоцитов от пациента. Конкретнее, лейкоциты и, в частности, одно или более из (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, обеспечивают начало и поддержание воспаления при IBD, и, таким образом, их удаление из кровообращения может снижать и даже устранять такое воспаление. Проточной цитометри-ей образцов биопсии кишки от пациентов с активным IBD авторы настоящего изобретения идентифицировали (активированные) T-лимфоциты, моноциты, нейтрофильные гранулоциты и эозинофилы; клетки, содержание которых велико в очаге воспаления, но которые также присутствуют в циркулирующей периферической крови.
Таким образом, в первом аспекте согласно изобретению предложен твердый носитель, содержащий один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор хемокина или хемо-кинов, в частности (активированного) лейкоцита, как описано здесь (такого как моноцит или лимфоцит), из периферической крови пациента. Хемокины представляют собой воспалительные хемокины, т.е. хе-мокины, индуцируемые в высоких уровнях клетками или тканями в ответ на повреждение или инфекцию
(и которые способствуют рекрутингу воспалительных лейкоцитов).
В контексте настоящего изобретения термин "хемокин" включает биотинилированные или меченные иным образом хемокины. Термин "хемокин" также включает модифицированные или процессиро-ванные варианты хемокина при условии, что модифицированная или процессированная форма сохраняет способность к связыванию с ее штатным рецептором (и, таким образом, остается функциональной в контексте изобретения). Модификации могут быть проведены для улучшения синтеза белка, например, однородности продукта и выхода. Модификации могут включать аминокислотные добавления, замены, делеции или другие модификации одной или более чем одной аминокислоты в хемокине. Модификации могут включать замену аминокислоты дикого типа искусственными аминокислотами, такими как нор-лейцин (NLeu), и дериватизированными аминокислотами, такими как пироглутаминовая кислота (pyro-Glu). Такие модификации могут быть проведены для минимизации образования побочных продуктов при хранении и применении колонок по изобретению. Модификации могут быть проведены для улучшения мечения, например, включение полиэтиленгликолевого спейсера (ПЭГ-спейсера) для облегчения биоти-нилирования. Биотинилирование хемокина и/или его конъюгацию с флуорохромами или другими группами для мечения проводят способом, не оказывающим существенного влияния на способность к связыванию с рецептором. Сайт-специфичное биотинилирование или другое мечение является предпочтительным, поскольку неселективное мечение хемокинов может снижать рецептор-связывающую активность. Биотинилирование или другое мечение в большинстве случаев предпочтительно при его проведении на C-конце или ближе к C-концу белка, поскольку авторы изобретения обнаружили, что модификации в этой области в большинстве случаев хорошо переносимы (исходя из минимального эффекта на способность к связыванию с рецептором). Процессинг может включать, в зависимости от обстоятельств, удаление либо N-концевых, либо C-концевых аминокислот, или и тех, и других. Обычно в процессированном варианте будут сохранены остатки, необходимые для правильного фолдинга хемокина, например, для сохранения структуры хемокиновой петли, согласно тому требованию, что процессированный вариант должен сохранять способность к связыванию с соответствующим рецептором (экспрессированным в лейкоците (на поверхности лейкоцита)). В определенных воплощениях процессированные варианты могут содержать примерно на 1-100 аминокислот меньше, например на 1, 2, 3, 4, 5 и так далее аминокислот меньше, чем аминокислотная последовательность дикого типа. Несомненно, процессированные варианты могут содержать другую модификацию, как подробно описано здесь. В определенных воплощениях модифицированный или процессированный вариант может иметь 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или большую общую идентичность аминокислотной последовательности с полноразмерным хемо-кином дикого типа (где делецию считают различием в аминокислотной последовательности). В определенных воплощениях в общей для молекул последовательности (т.е. аминокислотах, которые не были удалены) идентичность аминокислотной последовательности может составлять 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. Пример хемокина по изобретению, включающего как модификации, так и процес-синг, и специально приспособленного для применения в изобретении, подробно описан здесь. Процесси-рованный тимус-экспрессируемый хемокин (TECK) соответствует остаткам 1-74 полноразмерного зрелого белка (и, таким образом, лишен аминокислот 75-127 и N-концевого сигнального пептида из 23 аминокислот) и, таким образом, сохраняет хемокиновую петлю. В дополнение, включена замена метионина на норлейцин для предотвращения окисления остатка при сборке цепи. N-концевой глутаминовый остаток заменен пироглутамином для обеспечения однородности продукта во время синтеза. Биотинилирование проводят через ПЭГ-спейсер по е-функциональности лизинового остатка, расположенного в положении 72. Аминокислотная последовательность линейной молекулы (т.е. ПЭГ-спейсер и молекула биотина при аминокислоте 72 не показаны) содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1. Хемокины по изобретению могут быть синтезированы любым подходящим способом. Предпочтительно, проводят химический синтез хемокинов, поскольку это облегчает модификацию, и мечение, и тому подобное. Тем не менее, по необходимости также могут быть применены способы, основанные на рекомбинантной ДНК, в комбинации с подходящими технологиями мечения и модификации. Таким образом, согласно изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая процессированный белок CCL25, содержащий, состоящий по существу из или состоящий из аминокислот 1-74 (зрелой формы) CCL25 (т.е. формы, лишенной сигнального пептида, содержащего первые 23 аминокислоты). Таким образом, белок лишен аминокислот 75-127 аминокислотной последовательности зрелого CCL25. Изобретение также относится к вектору, содержащему такую молекулу нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяину, содержащей вектор. Вектор может дополнительно включать подходящий промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, для облегчения транскрипции соответствующей молекулы матричной РНК (мРНК). Клетка-хозяин может быть способна экспрессировать белок посредством транскрипции и трансляции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей процессированный белок CCL25, содержащий аминокислоты 1-74 CCL25 (и, таким образом, лишенный аминокислот 75-127 и N-концевого сигнального пептида из 23 аминокислот).
Рецепторы хемокинов экспрессированы на ряде мигрирующих клеток, таких как лимфоциты, гра-нулоциты и антиген-представляющие клетки, но также на определенных немигрирующих клетках, таких как эпителиальные клетки и фибробласты. Как упомянуто выше, хемокины по изобретению иммобили
зованы на твердом носителе так, чтобы обеспечить возможность удаления клетки, экспрессирующей ко-гнатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента. Когнат-ный рецептор каждого из предпочтительных хемокинов по изобретению приведен в табл. 1. В определенных примерах может быть более одного рецептора, с которым может связываться хемокин. Такие свойства хемокина могут преимущественно обеспечить возможность более эффективного лечения посредством захвата ряда клеток, экспрессирующих рецепторы, способствующие воспалительному состоянию. В определенных воплощениях носитель несет множество хемокинов с целью усиления захвата ряда провоспалительных клеток.
Воспаление, наблюдаемое у пациентов с IBD, поддерживается постоянным проникновением анти-ген-представляющих клеток (APC) и T-клеток из циркулирующей крови в слизистую оболочку кишки. Это постоянное накопление клеток регулируют хемокины и их рецепторы. Таким образом, хемокины представляют собой молекулы, вовлеченные в рекрутинг и активацию различных субпопуляций имму-нокомпетентных клеток при воспалении. Одним местным хемокином, образуемым в воспаленной слизистой оболочке кишки, является TECK (тимус-экспрессируемый хемокин, также называемый CCL25). Моноциты и лимфоциты в циркулирующей крови распознают данный хемокин через рецептор TECK; хемокиновый рецептор 9 (CCR9). Клетки связываются с TECK через рецептор CCR9 и начинают мигрировать в воспалительный очаг в кишке (1). По достижении воспаленной слизистой оболочки из моноцитов развиваются APC. Циркулирующие T-клетки, экспрессирующие CCR9, также проникают в воспалительные очаги в кишке, где происходит их активация. Удаление CCR9 или его лиганда, TECK, генетической делецией или ингибированием антителами ослабляет миграцию T-клеток в кишечник в моделях на мышах (2). Взаимодействие CCR9-TECK, по-видимому, играет центральную роль в миграции моноцитов и T-клеток по всему кишечнику; в тонкой кишке, а также в толстой кишке. В недавнем исследовании верифицировано присутствие как CCR9, так и TECK в толстой кишке здоровых людей и в кишечнике людей с IBD. Исследование ткани толстой кишки, полученной от пациентов либо с CD, либо с UC выявляет присутствие T-клеток, экспрессирующих CCR9, при иммуногистохимическом окрашивании. Кроме того, в толстой кишке также наблюдают присутствие рецепторного агониста TECK (3). У пациентов с IBD логическое обоснование состоит в удалении циркулирующих моноцитов и T-клеток, экспрессирую-щих CCR9, до того, как они достигают воспалительного очага в кишке, и, посредством этого, в уменьшении воспаления. С использованием колонки с биотинилированным TECK (bTECK), иммобилизованным на твердом носителе, на который происходит захват моноцитов и T-клеток, экспрессирующих CCR9, из кровообращения, постоянное поддержание воспаления должно быть угнетено, что сделает возможным заживление слизистой оболочки. Такое же логическое обоснование применимо к ряду других хемокинов, вовлеченных в рекрутинг лейкоцитов в воспаленные области кишечника. Например, в слизистой оболочке кишечника происходит секреция интерлейкина-8 (IL-8) с привлечением нейтрофилов посредством взаимодействия с рецептором IL-8. CCR6 регулирует миграцию Тн17-клеток в кишечник и баланс/распределение эффекторных T-клеток в воспаленной ткани (14). Таким образом, CCL20, иммобилизованный на твердом носителе, также полезен в данном изобретении для лечения воспалительных состояний, таких как IBO.
Хемокины по изобретению были выбраны на основании того факта, что обнаружено, что их экспрессии активирована при воспалительных расстройствах. Более того, было показано, что рецепторы хемокинов, присутствующие на клетках соответствующих типов, связаны с частотой таких воспалительных расстройств посредством рекрутинга клеток, экспрессирующих рецепторы, в очаг воспаления. Таким образом, хемокины по изобретению могут включать любой один или более из макрофагального воспалительного белка-1а (MIP-1a), MIP-1b, моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, хемокина, регулируемого тимусом и активацией (TARC), хемокина макрофагального происхождения (MDC), MIP-3, MIP-3a, MIP3b, MIP-4, I-309, HCC-1, HCC-2, хемокина вторичных лим-фоидных тканей (SLC), интерлейкина-8 (IL-8), регулируемого ростом онкогена-a (GROa), GROb, GROg, хемокина, выделяемого T-клетками при активации (RANTES), белка-2, активирующего нейтрофилы (NAP-2), эпителиального пептида 78, активирующего нейтрофилы (ENA78), гранулоцитарного хемотак-сического белка-2 (GCP-2), IP-10, монокина, индуцируемого интерфероном-гамма (MIG), I-TAC, фактора стромальных клеток (SDF), фракталкина, лимфотактина, эотаксина, эотаксина-2, I-309, хемокина В-лимфоцитов (BLC), CCL25. Особенно предпочтительные хемокины по изобретению включают MIP-1a, MIP-1b, MIP-3a, MIP-3b, MIP-4, SLC, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, TARC, MDC, IL-8, IP-10, MIG, I-TAC, фракталкин, CCL-25, RANTES. Наиболее предпочтительными хемокинами по изобретению являются хемокины, предпочтительно связывающиеся с активированными T-лимфоцитами, в частности MIP-1a, MCP, IP-10, MIG, ITAC, CCL25. Под "предпочтительным связыванием" понимают, что хемокины более склонны к связыванию с активированными T-лимфоцитами, чем с неактивированными T-лимфоцитами и/или с другими клетками крови. В определенном воплощении хемокин представляет собой CCL25. CCL25 предпочтительно связывается с клетками, экспрессирующими CCR9, в частности (активированными) лимфоцитами (CD4 и CD8 лимфоцитами) и моноцитами (такими как CD14-положительные моноциты).
В таблице описаны определенные хемокины, полезные в данном изобретении, включая утвержден
ное обозначение гена (согласно Комитету по номенклатуре генов организации "Геном человека" (HUGO Gene Nomenclature Committee)), название и информацию о последовательности. Также приведен/приведены штатный рецептор или рецепторы для каждого хемокина.
Хемокин
Утмржд еннов: обоаначе ни"гена
Утвержденное название гена:
Распело знание-
Региетрацион ныа~
кдоитнфикат оры. ~ (ID) ооеладпат лыгаети
Предмете
ующне^
обозначеии
Другие названия
Рецептор
MIP-13
CCL3
Хемоки новый (мотив С-С) лиганд 3
17q12
М23178 NM_002983
SCYA3
G0S19-1,
LD78ALPHA, MIP-1-альфа
CCRS
М1Р-1Ь
CCL4
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 4
17q21-q23
М23502 NM_002984
LAG1, SCYA4
MIP-1-бета, Act-2, АТ744.1
CCR5
МСР-1
CCL2
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 2
17q11.2 -q21.1
ВС009716 NM_0029B2
SCYA2
МСР1, MCP-1, MCAF, SMC-CF. GDCF-2. НС11, MGC9434
CCR2
МСР-2
CCL8
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 8
17q11.2
Х99886 NM_005623
SCYA8
MCP-2, НС14
CCR1, CCR2, CCR3, CCR5
МСР-3
CCL7
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 7
17q11.2 -q12
AF043339 NM_006273
SCYA6, SCYA7
MCP-3, NC28, FIC, MARC, МСРЗ
CCR1, CCR2, CCR3
МСР4
CCL13
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 13
17q11.2
AJ001634 NM_005408
SCYA13
MCP-4, NCC-1, SCYL1, СКМО, MGC17134
CCR1, CCR2, CCR3
TARC
CCL17
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 17
16q13
D43767 NM_002987
SCYA17
TARC, ABCD-2
CCR4, CCR8
MDC
CCL22
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 22
16q13
U83171 NM_002990
SCYA22
MDC, STCP-1, ABCD-1, DC/B-CK, A-152ES.1,MGC34554
CCR4
MIP-3
CCL23
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 23
17q11.2
U58913 NM_005064
NM_145898
SCYA23
Ckb-8, MPIF-1, MIP-3, СКЬ8
CCR1
MIP-3a
CCL20
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 20
2q33-q37
D8695S NM_004591
SCYA20
LARC, MlP-Sa, ExodUS-1, ST38, CKb4
CCR6
MIP-ЗЬ
CCL19
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 19
9p13
AB000887 NM_006274
SCYA19
ELC, MIP-3b, Exodus-3, CKM1
CCR7
MIP-4
CCL18
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 18 (легочный и регулируемы
активацией)
17q11.2
Y13710 NM_O02988
SCYA18
DC-CK1, PARC, AMAC-1, DCCK1, MtP-4, CKD7
Неизве стен
1-309
CCL1
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 1
17q11.2
M57506 NM_002981
SCYA1
I-309, ТСАЗ, P500, SISe
CCR8
HCC-1
CCL14
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 14
17q11.2
Z49270 NM_032962
SCYA14
HCC-1, HCC-3, NCC-2, SCYL2, CKM, MCIF
CCR1
HCC-2
CCL16
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 15
17q11.2
AF031587 NM_004167
SCYA15
HCC-2, NCC-3, SCYL3, MIP-5, Lkn-1, MIP-1d, HMRP-2B
CCR7
SLC
CCL21
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 21
9p13
AB002409 NM_002989
SCYA21
SLC, Exodus-2. TCA4, CKb9, SCkine
CXCR1 CXCR2
IL-8
IL8
Интерлейкин
4q13-q21
Y00787
SCYB8,LUCT,LECT,M ONCF.TSG-1, CXCL8,IL-e, NAP-1,3-10C.MONAP, AMCF-I, LYNAP, NAF, b-ENAP, GCP-1, K60
CXCR2
GROa
CXCL1
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 1 (активность, стимулирую щая рост меланомы, альфа)
4q13.3
J03561
MGSA, GR01, FSP
SCYB1, GROa, MGSA-a, NAP-3
CXCR2
GROb
CXCL2
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 2
4q13.3
M36820 rJM_002089
GR02
SCYB2, GROb, MIP-2a, MGSA-Ь, CINC-2a
CXCR2
GROg
CXCL3
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 3
4q21
M36821
GR03
SCYB3, GROg, MIP-2b, CINC-2b
CCR1, CCR3, CCR5
RANTES
CCL5
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 5
17q11.2 -q12
AF043341 NM_002985
D17S136 E, SCYA5
RANTES, SIScf, TCP228, MGC17164
CXCR2
NAP-2
РРВР
Протромбоци тарный основной белок
(хемокиноеы й (мотив С-Х-С) лиганд 7)
4ql2-q13
M54995 NMJJ02704
THBGB1
SCYB7,TG8,NAP-2-L1.LA-
PF4,MDGF,LDGF,6ST a-TG,CTAP3,CXCL7, PBP.b-
TG1,TQB1.CTAPlll, NAP-2
CXCR2
ENA-78
CXCL5
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 5
4q13.3
X78686 NM_002994
SCYB5
ENA-78
CXCR2
GCP-2
CXCL6
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 6 (гранулоцита рный
хемотаксичес кий белок 2)
4q13.3
U83303 NM_002993
SCYB6
GCP-2, CKA-3
CXCR2
IP-10
CXCL10
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 10
4q21
X02530
1NP10, SCYB10
IFI10, IP-10, crg-2, mob-1,C7, g)P-10
CXCR3
MIG
CXCL9
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 9
4q21
X72755
CMK, MIG
SCYB9, Humig, crg-10
CXCR3
l-TAC
CXCL11
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 11
4q21
U66096
SCYB9B, SCYB11
H174, b-R1, l-TAC, IP-
CXCR3 CXCR7
SDF
CXCL12
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 12 (фактор стромальных клеток 1)
10q11.1
L36033 NMJ300609
SDF1A, SDF1B, SDF1
SCYB12, SDF-1a, SDFHb, PBSF, TLSF-a, TLSF-b, TPAR1
CXCR4 CXCR7
Фрактал кин
CX3CL1
Хемокиновый (мотив С-ХЗ-С) лиганд 1
16q13
U84487 NM_002996
SCYD1
NTN, СЗХИпе, ABCD-3, CXC3C, CXC3, фракталкин, нейротактин
CX3CR
Лимфот актин
XCL1
Хемокиновый (мотив С) лиганд 1
1q24.2
D43768 NM_002995
LTN, SCYC1
LPTN, АТАС, SCM-1a, SCM-1, лимфотактин
XRC1
Эотакси
ССШ
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 11
17q21.1 -q21.2
AB063614 NM_002986
SCYA11
Эотаксин, MGC22554
CCR3
Эотакси н-2
CCL24
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 24
7q 11.23
U85768 NM_002991
SCYA24
Ckb-6, MPIF-2, эотаксин-2, MPIF2
CCR3
BLC
CXCL13
Хемокиновый (мотив С-Х-С) лиганд 13
4q21
AJ002211
SCYB13
BLC, BCA-1, BLR1L, ANGIE, ANGIE2
CXCR5
CCL26
CCL26
Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 25
19p13.2
U86358 NMJJ05624
SCYA25
TECK, СкЫ 6
CCR9
Хемокины по изобретению могут быть биотинилированы способами, известными в данной области техники, такими как описанные в WO 00/50088 A2, включенной сюда посредством ссылки. Как указано выше, предпочтительно сайт-специфическое мечение хемокинов по изобретению, хотя может быть применена любая методика мечения, не оказывающая существенного эффекта на способность хемокина к связыванию с рецептором. Различные биотинилированные сайт-специфическим образом и нативные хемокины имеются в продаже, например, от Almac, Craigavon, UK. В определенных воплощениях один или
более чем один хемокин биотинилирован через спейсерную группу. Спейсер может быть использован для предотвращения воздействия биотиновой группы на активность хемокина, в частности связывание хемокина с его когнатным рецептором. В изобретении может быть использован любой подходящий спейсер, способствующий сохранению рецептор-связывающих свойств хемокина. В определенных воплощениях спейсер представляет собой полиэтиленгликолевый спейсер (ПЭГ-спейсер). Здесь было показано, что ПЭГ является эффективным спейсером, позволяющим присоединить биотин к хемокину (который затем может быть иммобилизован на твердом носителе посредством взаимодействия со стрептави-дином) без снижения способности к связыванию с рецептором.
Твердые вещества-носители для иммобилизации хемокинов по изобретению известны в данной области техники. Полезное вещество-носитель представляет собой вещество-носитель, не вызывающее активации клеток крови, в частности лимфоцитов, приводящей к их коагуляции или адгезии на носителе. Полезно использовать носитель, обработанный агентом для придания ему антикоагулянтных свойств, в частности гепаринизированный носитель. Альтернативно, кровь пациента может быть обработана антикоагулянтом, таким как гепарин, перед нанесением на носитель. Полезные вещества-носители включают углеводы с большой молекулярной массой, в частности углеводы, имеющие молекулярную массу 100 кДа или более, такие как агароза в форме частиц, возможно поперечно сшитая, и целлюлоза. Другие предпочтительные вещества-носители представляют собой полимеры, такие как карбоксилированный полистирол, и стекло. Носитель по изобретению предпочтительно имеет форму частиц или волокон. Частицы носителя могут иметь правильную форму, такую как сферы или гранулы, или неправильную форму. Они могут быть пористыми или непористыми. Предпочтительный средний размер частиц носителя составляет от 50 мкм до 2 мм. Способы иммобилизации хемокинов на твердом носителе известны в данной области техники. Хемокин может быть иммобилизован на носителе прямым или непрямым способом. Прямая иммобилизация может представлять собой иммобилизацию посредством подходящего линкера. Предпочтительный способ непрямой иммобилизации хемокина основан на взаимодействии молекул биотина и авидина. Таким образом, биотинилирование хемокина и использование стрептавидина, иммобилизованного на твердом носителе, позволяет надежно присоединить хемокины к твердому носителю. Конкретно, способ может включать предоставление хемокина в биотинилированной форме, предоставление твердого носителя, имеющего стрептавидин, иммобилизованный на его поверхности, контакт носителя с водным раствором биотинилированного хемокина и отмывку носителя водным растворителем. В дополнение, для непрямой иммобилизации хемокинов на носителе могут быть применены взаимодействия антитело-антиген. В таких воплощениях носитель может быть дериватизирован с использованием антитела или его фрагмента или производного, имеющим известную аффинность в отношении определенной пептидной последовательности или гаптена с небольшой молекулой. Включение пептидной последовательности или гаптена на или в хемокин способствует иммобилизации на твердом носителе, покрытом соответствующим антителом или его фрагментом или производным. Таким образом, хемокин может быть модифицирован для включения пептидной последовательности или гаптена в линейную молекулу или может быть добавлен как боковая цепь или метка. Может быть использована любая подходящая пара антитело-антиген. Фрагмент или производное антитела могут представлять собой любой фрагмент или производное, сохраняющие специфичную аффинность связывания в отношении соответствующего антигена. Примеры включают Fab, scFV, домены VH, нанотела, антитела из тяжелых цепей и гуманизированные варианты антител от источника, не являющегося человеком, и тому подобное. Для иммобилизации хемокинов могут быть применены другие высокоаффинные взаимодействия, если хемокин может быть дериватизирован одним из взаимодействующих партнеров и твердый носитель дериватизирован другим взаимодействующим партнером без потери связывающей активности (т.е. связывания хемокина с его когнатным рецептором).
Альтернативно, хемокины могут быть иммобилизованы на твердом носителе прямым образом с использованием методик биологической конъюгации, признанных в данной области техники. Например, прямой иммобилизации белков на твердых носителях, активированных бромцианом, через амино-функциональные группы первичной последовательности белка. Альтернативно, сульфгидрильные функциональные группы белков могут быть использованы для прямой иммобилизации белка на носителях, дериватизированных алкилгалогенидами, или носителях, содержащих свободные тиольные функциональные группы. В других воплощениях возможна прямая иммобилизация белков, содержащих а-тиоэфирные функциональные группы, на носителях, содержащих 1,2-аминотиольные группировки (например, N-концевой цистеин), с применением природной химической реакции лигирования. Альтернативно, белки, модифицированные кетонами и альдегидами, могут быть иммобилизованы на твердых носителях, дериватизированных гидразинильными, гидразидными функциональными группами и аминоок-сифункциональными группами с применением реакций лигирования с образованием связи гидра-зон/оксим (и наоборот). Альтернативно, для иммобилизации белков на твердых носителях может быть применена "клик"-химия ("Click" chemistry), в соответствии с которой белок и носитель дериватизируют подходящими взаимно реакционно-способными химическими функциональными группами (азидами и алкинами). В других воплощениях для иммобилизации соответствующим образом дериватизированных белков на соответствующим образом дериватизированных твердых носителях может быть применена
химия лигирования Штаудингера.
Согласно настоящему изобретению раскрыта колонка для афереза, наполненная твердым носителем указанного выше типа, содержащим иммобилизованный на нем один или более чем один хемокин. Колонка наполнена твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экс-прессирующей когнатный рецептор хемокина или хемокинов, в частности (активированного) лейкоцита, как описано здесь (такого как моноцит или лимфоцит), из периферической крови пациента. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения колонка для афереза наполнена носителем, содержащим стрептавидин, иммобилизованный на носителе, и один или более чем один биотинилированный хемокин, связанный со стрептавидином на носителе. Предпочтительно, носитель представляет собой углевод с высокой молекулярной массой, возможно поперечно сшитый, такой как агароза. "Наполненная" означает, что колонка несет или содержит твердый носитель таким образом, что возможен ток (периферической) крови через колонку в контакте с твердым носителем. Таким образом, твердый носитель обеспечивает матрицу в колонке, через которую происходит ток крови, в определенных воплощениях непрерывным образом.
Таким образом, колонку по изобретению используют как емкость для носителя, обеспечивающего возможность удаления клеток, экспрессирующих когнатный рецептор хемокина, из образца крови. Конкретнее, колонка может быть использована для удаления одного или более чем одного (активированного) лейкоцита, в частности одного или более из (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, из периферической крови пациента (с IBD). В зависимости от профиля клеток отдельных пациентов для изготовления носителя выбирают определенные хемокины для специфичного удаления таких T-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофилов, или активированных клеток других типов, вовлеченных в воспаление кишечника.
Таким образом, согласно изобретению также предложен способ удаления клеток, таких как лейкоциты, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, как например одного или более из (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных грануло-цитов, (активированных) эозинофилов, из периферической крови пациента, в частности пациента, страдающего от воспалительного расстройства, конкретнее, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включающий: приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанной клетки на носителе; и отделение крови с уменьшенным содержанием указанной клетки от носителя. Данный способ может представлять собой ex vivo или in vitro способ. Однако в некоторых воплощениях способ дополнительно включает, перед стадией приведения в контакт, получение периферической крови от пациента. В другом воплощении способ дополнительно включает, после стадии отделения, инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту. В таком случае это представляет собой полный способ лечения лейкаферезом. Таким образом, способ лейкафереза включает получение периферической крови от пациента; приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанных клеток, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как одно или более из лейкоцитов, в частности (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов или (активированных) эози-нофилов, на носителе; отделение крови с уменьшенным содержанием указанных клеток, экспрессирую-щих рецептор соответствующего хемокина, таких как одно или более из лейкоцитов, в частности (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных грануло-цитов или (активированных) эозинофилов, от носителя; и инфузию крови с уменьшенным содержанием указанных клеток пациенту. Возможно непрерывное получение периферической крови от пациента. Сходным образом, возможна непрерывная инфузия крови с уменьшенным содержанием указанных клеток пациенту посредством применения подходящей схемы, как описано здесь. Таким образом, носитель может быть помещен в колонку, через которую осуществляют ток крови. Например, это может быть осуществлено с использованием подходящего насоса. Ток крови через колонку делает возможным захват лейкоцитов, экспрессирующих рецептор, хемокинами, иммобилизованными на носителе, и таким образом удаление указанных лейкоцитов из крови с предотвращением их содействия воспалительному состоянию.
Таким образом, в общих чертах согласно изобретению предложено применение колонки или носителя по изобретению в лечении воспалительного расстройства, такого как IBD, или в лечении заболевания, характеризующегося присутствием клеток (особенно лейкоцитов), экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как одно или более из (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, в периферической крови больного. Согласно изобретению также предложен хемокин, иммобилизованный на твердом носителе, для применения в терапии, в частности для лечения воспалительного расстройства, такого как IBD. Изобретение также относится к применению хемокина в изготовлении лекарственного
средства для лечения воспалительного расстройства, такого как IBD, где хемокин иммобилизован на твердом носителе.
Все воплощения, описанные в отношении носителя и колонки по изобретению, применимы к этим аспектам с необходимыми поправками, и для краткости их не повторяют.
Согласно изобретению также раскрыт способ получения магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, связанной с биотинилированным хемокином. Способ включает предоставление магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, суспендированной в водном растворителе, предоставление водного раствора биотинилированного хемокина, смешивание указанных выше суспензии и раствора, инкубацию смеси, разделение, возможно, магнитным способом, магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, связанной с полученным биотинилированным хемокином, и отмывку магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, связанной с биотинилированным хемокином, водным растворителем.
Магнитная покрытая стрептавидином микрогранула, связанная с биотинилированным хемокином, по изобретению может быть использована для отделения клеток крови, имеющих (экспрессирующих) рецепторы соответствующих хемокинов, от клеток крови без таких рецепторов. Разделение предпочтительно проводить в периферической крови магнитным сепаратором. Согласно предпочтительному аспекту изобретения после разделения проводят реинфузию периферической крови индивиду, от которого она была получена.
Способы и медицинские применения по изобретению могут, таким образом, быть адаптированы к потребностям отдельных пациентов или групп пациентов. Удалением из кровообращения клеток, активированных в отношении клеток слизистой оболочки кишечника, можно контролировать важный фактор воспалительного процесса при IBD. Способ по изобретению особенно эффективен в лечении или индукции обратного развития неспецифического язвенного колита или болезни Крона, в частности фульми-нантного (язвенного) колита или фульминантной болезни Крона.
Способы и медицинские применения по изобретению могут также быть применены для лечения пациентов с болезнью Крона удалением клеток и, в частности лейкоцитов, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как (активированные) T-клетки, (активированные) моноциты, (активированные) нейтрофилы, (активированные) эозинофилы, или клеток других типов, активированных в отношении антигена (антигенов), расположенного глубже в стенке кишки.
В более общем воплощении изобретения колонку по изобретению или носитель по изобретению используют в лечении заболевания, характеризующегося присутствием клеток и, в частности, лейкоцитов, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, как например одного или более из (активированных) T-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных грануло-цитов, (активированных) эозинофилов в периферической крови больного.
Изобретение будет теперь описано более подробно посредством ссылки на следующие неограничивающие воплощения и примеры.
Описание графических материалов
Фиг. 1а, 1б и 1в - связывание биотинилированного MIP-1a CD4+, CD8+ T-клетками и CD14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 1г, 1д и 1е - связывание биотинилированного MCP-1 CD4+, CD8+ T-клетками и CD14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 2а, 2б и 2в - связывание биотинилированного CCL25 CD4+, CD8+ T-клетками и CD14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 2г, 2д и 2е - связывание биотинилированного CCL25 CD4+, CD8+ T-клетками и CD14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови пациента с CD.
Фиг. 3а, 3б и 3в - связывание IL-8 CD4+, CD8+ T-клетками и CD16+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 4 - пластиковый корпус и верхняя часть, где показан распределительный лист (2) и блоки предохранительных фильтров (3 и 4).
Фиг. 5 - общая система лейкафереза.
Фиг. 6 - насос с воздушным детектором и оптическим детектором (4).
Фиг. 7 - уменьшение содержания популяций клеток, экспрессирующих CCR9, у одного донора крови. Общие популяции клеток не меняются после прохождения через колонку.
Фиг. 8 - уменьшение содержания популяций клеток, экспрессирующих CCR9, у одного пациента с IBD. Общие популяции клеток не меняются после прохождения через колонку.
Фиг. 9 - маркеры активации на клетках крови от одного донора крови до и после прохождения через колонку.
Фиг. 10 - секреция IFN-y на клетках до и после прохождения через устройство небольшого размера.
Фиг. 11 - результат на клетках, стимулированных фитогемагглютининовым (PHA) антигеном, до и после прохождения через колонку.
Фиг. 12 - результаты в отношении гибели клеток после инкубации клеток с высокими концентрациями bTECK.
Фиг. 13 - высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) очищенного прошедшего фол-динг биотинилированного TECK (Nleu).
Фиг. 14 - данные ионизации очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного TECK (Nleu) электрораспылением с тандемной масс-спектрометрией (ES/MS).
Описание предпочтительных воплощений
Материалы и методы.
Выделение лейкоцитов периферической крови. Гепаринизированную периферическую кровь от здоровых доноров крови или от пациентов с IBD фиксировали 4% параформальдегидом в течение 4 мин, разрушали эритроциты в течение 15 мин 0,83% раствором хлорида аммония и отмывали два раза в буфере для сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) с получением суспензии лейкоцитов крови.
Хемокины. Лейкоциты инкубировали в течение 30 мин в темноте при 4°C со следующими биоти-нилированными и меченными Alexa647 Fluor(r) хемокинами: CCL25 (в концентрациях 0,1 нг/мкл, 0,5 нг/мкл и 5 нг/мкл), MIP-1 а или MCP-1 (в концентрациях 10 нг/мкл и 50 нг/мкл). Клетки затем отмывали буфером для FACS и анализировали проточной цитометрией. Все хемокины, использованные в Примерах, были предоставлены Almac Sciences Scotland Ltd, Edinburgh, Scotland.
Анализ проточной цитометрией. Анализ проточной цитометрией проводили на цитометре FACS Calibur с двумя лазерами (BD Immunocytometry systems, San Jose, Ca, USA). В каждом образце подсчитывали и анализировали десять тысяч клеток. Для анализа данных использовали программное обеспечение Cell Quest Pro от Becton Dickinson.
Пример 1. Связывание моноцитов с MIP-1 а.
В эксперименте с биотинилированным MIP-1 а было обнаружено, что приблизительно 90% моноцитов, полученных из периферической крови здоровых доноров, связывались с цитокином после 30 мин инкубации (фиг. 1в), в то время как CD4+ и CD8+ лимфоциты не связывались с цитокином (фиг. 1а и 1б).
Пример 2. Связывание моноцитов с MCP-1.
В эксперименте с биотинилированным MCP-1 было обнаружено, что приблизительно 90% моноцитов, полученных из периферической крови здоровых доноров, связывались с цитокином после 30 мин инкубации (фиг. 1е), в то время как CD4+ и CD8+ лимфоциты не связывались с цитокином (фиг. 1г и 1д).
Пример 3. Аффинность клеток крови в отношении CCL25.
В эксперименте с биотинилированным CCL25 было обнаружено, что ни T-клетки (CD4+ лимфоциты; CD8+ лимфоциты), ни моноциты (CD14+ моноциты) из периферической крови здорового донора (фиг. 2а, 2б и 2в) не связывались с биотинилированным хемокином. В отличие от этого, приблизительно 80% CD8+ лимфоцитов и приблизительно 90% CD4+ лимфоцитов и моноцитов от пациента с болезнью Крона связывались с CCL25 (фиг. 2г, 2д и 2е).
Пример 4. Аффинность клеток крови в отношении биотинилированного IL-8.
На фиг. 3 показано связывание биотинилированного IL-8 (CXCL8) CD4+ лимфоцитами (фиг. 3а), CD8+ лимфоцитами (фиг. 3б) и CD16+ нейтрофилами (фиг. 3в), полученными от здоровых доноров. После 30 мин инкубации все CD16+ нейтрофилы связывались с IL-8. В отличие от этого, с CD4+ лимфоцитами и CD8+ лимфоцитами связывания не наблюдали.
Пример 5. Подготовка хемокиновой колонки для афереза клеток крови.
К стрептавидиновым гранулам из поперечно сшитой агарозы (ProZyme, San Leandro, CA, U.S.A.) размером от 75 мкм до 300 мкм, суспендированным (200 мл, "50% об./об.) в водном растворе 25 мМ фосфата натрия (рН 7,0) и 150 мМ NaCl, добавляли раствор 75 мкг биотинилированного MIP-1a (Almac Sciences) в том же буфере при 22°C и медленно перемешивали вручную в течение 3 мин. Смесь оставляли еще на 20 мин, носитель отфильтровывали, отмывали три раза нейтральным водным раствором фосфата натрия/хлорида натрия и заполняли им стеклянную колонку (внутренний диаметр 25 мм, длина 12 см).
Пример 6. Отделение моноцитов из периферической крови здорового донора хемокиновой колонкой из примера 6.
Гепаринизированную периферическую кровь от здорового донора мужского пола анализировали проточной цитометрией на CD4+ лимфоциты, CD8+ лимфоциты и CD14 моноциты. 100 мл крови фильтровали через колонку со скоростью приблизительно 8 мл/мин и отмывали буфером для FACS. Профильтрованную кровь анализировали на те же клетки. Было обнаружено, что колонка задерживала приблизительно 95% моноцитов, в то время как более 90% CD4+ и CD8+ лимфоцитов проходили через нее.
Пример 7. Получение магнитных гранул, конъюгированных со стрептавидином, связанных с био-тинилированным MIP-1 а.
Водную суспензию магнитных гранул, конъюгированных со стрептавидином (MagCellect Strepta-vidin Ferrofluid, 1 мл; R &D Systems, Minneapolis, MN, U.S.A.), смешивали с 30 мкг MIP-1a (Almac Sciences) в 50 мл 25 мМ фосфата натрия (рН 7,0) и 150 мМ NaCl и медленно перемешивали в течение 1 ч. Частицы отмывали три раза порциями того же растворителя объемом 20 мл и хранили в суспензии при
4°C.
Пример 8. Отделение CD14+ моноцитов из периферической крови здорового донора стрептавиди-новыми магнитными гранулами из примера 8.
100 мл гепаринизированной крови здорового донора из примера 7 смешивали с магнитными гранулами, конъюгированными со стрептавидином, связанными с биотинилированным MIP-1 а, и медленно перемешивали в течение 40 мин. Частицы отделяли от крови магнитным сепаратором и кровь анализировали на CD14+ моноциты и CD4+ и CD8+ лимфоциты. В то время как не было выявлено по существу ни одного CD14+ моноцита, CD4+ и CD8+ лимфоциты присутствовали приблизительно в исходных количествах.
Пример 9. Адаптированный лейкаферез. Устройство и свойства колонки. Введение.
Аферез является признанным лечением, применяемым для уменьшения содержания компонентов крови, таких как антитела, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и клетки крови. Лейкаферез представляет собой лечение аферезом, применяемое для удаления белых клеток крови, лейкоцитов. Пациента соединяют с системой экстракорпорального кровообращения; проводят забор крови из вены на одной руке, пропускают ее через колоночное устройство и возвращают в другую руку пациента. Побочные эффекты лечения лейкаферезом варьируют от нетяжелых явлений, таких как головная боль, головокружение, гипотензия, сильное сердцебиение и прилив крови к лицу, наблюдаемых у 0,1-5% пациентов, получающих лечение.
Колонка.
Колонка предназначена для использования в качестве лечения IBD лейкаферезом. Она обеспечит специфичное удаление лейкоцитов, экспрессирующих CCR9, проходящих хоминг в кишечнике, с помощью смолы, содержащей bTECK, с применением взаимодействия CCR9-TECK. Колонка состоит из трех объединенных компонентов, пластикового корпуса, матрицы из стрептавидиновых (SA) гранул Sepha-rose(tm) BigBeads и bTECK, связанного с матрицей. Лечение проводят с применением таких же методик, как стандартная процедура афереза.
Пластиковый корпус (фиг. 4).
Пластиковый корпус, разработанный для поддержания непрерывного тока крови через матрицу, состоит из прозрачной основной части и красной верхней части. Верхняя часть имеет распределительный лист (2) в месте притока крови (1) для ее равномерного распределения по всей области матрицы. Лист является первым предохранительным барьером, предотвращающим прохождение крупных частиц через колонку и к пациенту. Блоки предохранительных фильтров (3 и 4) расположены в местах притока (1) и оттока (5) крови пластикового корпуса. Блок предохранительных фильтров включает три фильтра, разработанных так, чтобы быть надежным барьером и задерживать все частицы крупнее клеток крови, проходящие через колонку.
Конструкция пластикового корпуса показана на фиг. 4. Конструкция с предохранительными фильтрами (3 и 4) на обоих концах колоночного устройства минимизирует риск проникновения частиц в организм пациента, в том числе в случае неправильного расположения устройства с током крови в направлении, противоположном предполагаемому.
Стрептавидиновые гранулы Sepharose(tm) BigBeads.
Вторым компонентом устройства является аффинная матрица, называемая стрептавидиновыми гранулами Sepharose(tm) BigBeads (Sepharose(tm) GE Healthcare, Sweden). Sepharose(tm) представляет собой гранулярную форму поперечно сшитой агарозы, являющейся полисахаридом, получаемым из морских водорослей. Sepharose(tm) и агарозу обычно используют в качестве матриц для колонок в биомедицинских аффинных методиках. Ее выбирают ввиду ее оптимальной распределительной способности, и она позволяет обеспечить обширную область, доступную для аффинного связывания.
bTECK.
С матрицей связан третий компонент устройства, bTECK. Этот пептид bTECK представляет собой синтетический сконструированный вариант человеческого хемокина TECK, процессированный и биоти-нилированный, но сохраняющий свою связывающую активность в отношении рецептора TECK, CCR9. Биотинилирование сконструированного TECK делает его способным связываться с молекулами стрепта-видина на матрице Sepharose(tm). Известно, что связывание биотина и стрептавидина является одним из сильнейших биологических взаимодействий с Kd порядка 4х10-14 М. Вычисленное соотношение сайтов связывания стрептавидин:биотин в колонке составляет 10:1. Таким образом, связывание матрицы и bTECK будет моментальным, минимизируя риск отсоединения bTECK от матрицы.
Система афереза.
Для проведения лейкафереза необходимы следующие компоненты: колонка, система трубок и насос
4008 ADS (Fresenius Medical Care).
Контур.
Система показана на фиг. 5. Пациента (1) соединяют с экстракорпоральным контуром стерильными иглами Venflon через вены правой и левой рук. Также подсоединяют емкость с физиологическим раство
ром (3) и физиологический раствор подают с использованием насоса ACD (2). Забор крови производят из одной руки пациента через систему стерильных трубок кровяным насосом (4), и пропускают ее через колонку (6), и вводят обратно пациенту. Систему трубок соединяют с колонкой стандартными диализными соединениями с наконечниками Люэра. Соединения на колонке имеют цветовой код для правильной сборки; красные трубки для притока крови к красной верхней части колонки и синие трубки для оттока крови обратно пациенту. Присутствует воздушный детектор (8). Сенсоры давления на входе (5) и венозного давления (Pven) (7) используют для мониторинга давления в контуре.
Насос 4008 ADS.
Насос для афереза от Fresenius Medical Саге позволяет мониторировать забор и введение крови пациенту, давление в системе экстракорпорального кровообращения и различать воздух посредством улавливателя пузырьков и воздушного детектора. Внутри улавливателя пузырьков расположен фильтр-улавливатель сгустков. Насос также имеет оптический детектор для различения света, например физиологического раствора или воздуха, присутствующего в системе трубок, и темноты, например крови, присутствующей в системе трубок.
Схематическое изображение насоса, на котором показан воздушный детектор и оптический фильтр, показано на фиг. 6. При выявлении насосной системой пузырьков воздуха и оптических флуктуации или при значениях давления в системе экстракорпорального кровообращения, выходящих за пределы установленного диапазона, насос немедленно останавливается и издает визуальный/звуковой сигнал тревоги.
Обозначения на фиг. 6:
1 - монитор;
2 - держатель емкости для отходов;
3 - модули (слева направо: кровяной насос, насос ACD, воздушный детектор);
4 - резервные места для других модулей;
5 - держатель поглотителя;
6 - детектор конденсата;
7 - штатив для внутривенных инъекций. Подготовка пациента.
Пациенту будут вводить антикоагулянты перед каждым лечебным сеансом. Стерильный физиологический раствор с 5000 IE гепарина будут использовать для прокачки системы экстракорпорального кровообращения, затем в контур будут вводить болюсную инъекцию 4000 IE гепарина в начале каждого лечебного сеанса.
Время лейкафереза и скорость потока.
Систему для афереза следует использовать при скорости потока 30-60 мл/мин. Лечение заканчивают после прохождения 1800 мл крови. Условия хранения.
Колоночные устройства следует хранить при 1-25°C, избегая замораживания и более высоких температур. Данные по стабильности в течение более 3 месяцев указывают на отсутствие различий функционирования с течением времени или при изменении температуры (комнатная температура и охлаждение). Колонки будут хранить в охлажденном состоянии до использования. Следует избегать механических повреждений, как например в результате сильных вибраций и повреждения. Колонку, которую хранили с нарушением этих рекомендаций, не следует использовать.
Условия транспортировки.
Колоночные устройства будут транспортировать в охлажденном состоянии, избегая замораживания и более высоких температур. Следует избегать механических повреждений, как например в результате сильных вибраций и повреждения.
Пример 10. Неклинические исследования.
Введение.
Еще в 1970-е гг. наблюдали накопление лимфоцитов, полученных из мезентериальных лимфатических узлов овец-доноров, в кишечнике после их переноса животным-реципиентам (4, 5). Эти начальные исследования на животных позволяли предположить способность к специфичному хомингу циркулирующих лимфоцитов, направляющихся в различные компартменты организма. Дальнейшие исследования в моделях на мышах продемонстрировали, что органоспецифичность различных подгрупп T-клеток обеспечивают несколько сигнальных метаболических путей. Было показано, что L-селектин (также известный как CD62L) является клеточным поверхностным белком, обеспечивающим миграцию лимфоцитов в мезентериальные лимфатические узлы (6). Было обнаружено, что в эндотелиальной выстилке кровеносных сосудов кишечника MadCAMI и TECK вовлечены в адгезию и миграцию связанных со слизистой оболочкой лимфоцитов и моноцитов. Исследования привлекли внимание к соответствующим рецепторам иммунокомпетентных клеток, альфа4бета7 и CCR9, соответственно (2). В данном контексте одна из моделей болезни Крона на мышах, TNFDeltaARE, позволила предположить, что метаболический путь альфа4бета7 функционировал независимо от TECK-CCR9-зависимого транзита и, по-видимому, являлся основным механизмом хоминга в кишечнике (7, 8). Тем не менее, в других моделях на мышах было установлено, что взаимодействие TECK-CCR9 является в равной степени важным в отношении
хоминга в кишечнике в воспаленной слизистой оболочке. В моделях на мышах TECK-/- и CCR9-/-, а также антитело-опосредованным ингибированием связывания TECK-CCR9 было продемонстрировано ослабленное воспаление слизистой оболочки (9-12). Таким образом, влияние различных механизмов хоминга, по-видимому, зависит от выбранной модели на животных. В нескольких исследованиях в моделях на мышах было показано, что T-клетки, экспрессирующие CCR9, предпочтительно мигрируют в тонкую кишку. Тем не менее, воспаление слизистой оболочки, ограниченное толстой кишкой, как наблюдают в модели неспецифического язвенного колита на мышах MDR1a-/-, демонстрирует зависимость от лимфоцитов, экспрессирующих CCR9. После введения белка ССХ282-В, блокирующего CCR9, происходит очевидное разрешение воспалительных поражений слизистой оболочки толстой кишки, позволяя предположить важную роль TECK-CCR9-взаимодействия также в слизистой оболочке толстой кишки (3). Результатом терапевтического значения TECK-CCR9-механизма хоминга стали несколько исследований у людей, и, как наблюдали на мышах, было обнаружено накопление T-клеток, экспрессирующих CCR9, в тонкой кишке человека (2, 3, 13). У пациентов с CD существует значительное повышение лимфоцитов, экспрессирующих CCR9, в мезентериальных лимфатических узлах по сравнению со здоровыми контролями (13). В дополнительных исследованиях был описан TECK и присутствие T-клеток, экспрессирую-щих CCR9, в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки у пациентов, страдающих от CD и UC. Было показано, что в слизистой оболочки толстой кишки здоровых контролей также присутствуют им-мунокомпетентные клетки, экспрессирующие CCR9, что говорит о важной роли данного рецептора в нормальном функционировании связанной с кишечником иммунной системы (3). Что касается воспалительного заболевания кишечника, то имеющиеся модели на животных не полностью соответствуют воспалению в кишечнике человека. Таким образом, для поиска неклинических доказательств при тестировании концепции основное внимание было уделено применению экспериментов in vitro на образцах крови от пациентов с IBD. В дополнение, белок bTECK, используемый в колонке для лейкафереза, специфичен в отношении человеческого поверхностного белка CCR9, что ограничивает осуществимость исследований эффективности на животных in vivo.
Уменьшение популяций клеток-мишеней in vitro.
Для исследования способности элиминировать клетки, экспрессирующие CCR9, проводили исследования in vitro на матрице, связанной с bTECK. Кровь получали от доноров крови и пациентов с IBD и пропускали через колоночное устройство, содержащее матрицу, связанную с bTECK. Образцы крови отбирали до и после прохождения через колонку и анализировали проточной цитометрией (FACS) на предмет уменьшения содержания клеток, экспрессирующих CCR9.
Результаты демонстрируют значительное уменьшение популяции CD14-положительных клеток-мишеней, экспрессирующих CCR9, после перфузии через матрицу; в то время как общее количество CD14-положительных клеток не изменяется. Исследования с уменьшением содержания клеток проводили на крови от здоровых доноров и пациентов с IBD, что подтвердило сходные эффекты. Результаты показаны на фиг. 7 и 8 соответственно.
В заключение, результаты, полученные in vitro, демонстрируют, что колонка специфично уменьшает количество клеток, экспрессирующих CCR9, на 50-75%. Влияние на клетки, не экспрессирующие CCR9, отсутствует.
Пример 11. Токсикологическая оценка и исследование безопасности.
Воздействие.
Возможны два разных пути воздействия колоночного устройства на пациента. Во-первых, местно на кровь и ее клетки химическими веществами, включая bTECK, в устройстве, и, во-вторых, системно химическими веществами, включая bTECK, высвобождаемыми из устройства и вводимыми в организм пациента через возвращаемую кровь. В обоих случаях возможности оценки общего воздействия ограничены, но исследования стабильности матрицы выявят системное воздействие сефарозы, стрептавидина и bTECK, см. ниже. Тем не менее, поскольку пластик и фильтрующие материалы соответствуют стандарту Управления по контролю за продуктами и лекарственными средствами (FDA)/Международной организации по стандартизации (ISO) 10993 и VI классу требований биологической оценки Фармакопеи США (USP), даже после лучевой стерилизации, можно сделать вывод, что воздействие токсичного вещества из этих частей устройства пренебрежимо мало. Кроме того, отсутствуют данные, которые позволили бы предположить какое-либо взаимодействие между различными компонентами колонки.
Стабильность матрицы.
Свойства стабильности матрицы изучали для оценки того, происходит ли какая-либо утечка вещества при активном тестировании колонки. Колонку, заполненную матрицей, промывали в насосной системе 2 л PBS (забуференного фосфатом физиологического раствора) со скоростью 30-100 мл/мин для отмывки остаточных частиц со стадии изготовления. Получали образцы жидкости до и после прохождения через колонку и анализировали микроскопией и твердофазным иммуноферментным анализом (ELI-SA) на предмет утечки продуктов.
После промывки колонки 2 л PBS не наблюдали видимой утечки вещества матрицы.
Стабильность связывания анализировали посредством ELISA. Для выявления отсоединившегося bTECK лунки инкубировали с антителом против стрептавидина в течение 1 ч при 4°C. Для выявления
отсоединившегося стрептавидина лунки инкубировали с биотинилированной пероксидазой в течение 1 ч при комнатной температуре. Результаты исследований продемонстрировали отсутствие утечки частиц сефарозы, стрептавидина или bTECK из матрицы. Биологические (токсикологические) данные.
Желаемый биологический эффект, специфичное удаление активированных лейкоцитов, направляющихся в желудочно-кишечный тракт (клеток, проходящих хоминг в кишечнике), обусловлен аттрак-тантным действием bTECK и связыванием с его специфичным рецептором CCR9 на клетках с большой рецептор-лигандной аффинностью. Клетки крови, не экспрессирующие рецептор, проходят через колонку и возвращаются пациенту. Воздействие при предполагаемом применении колонки может также вызывать различные нежелательные биологические (токсические) эффекты, которые следует оценивать согласно ISO 10993-1 данной категории медицинского устройства. На основании предполагаемого местного воздействия при равномерном распределении крови по поверхности колонки возможны неблагоприятные эффекты на кровь, в частности ее клетки. Хемокин bTECK или любое химическое вещество в устройстве может оказывать местные эффекты, такие как цитотоксичность и гематологические несовместимости. Кроме того, крайне важно исследовать любую активацию иммунокомпетентных клеток. bTECK или любое химическое вещество, высвобождаемое из колоночного устройства или пластиковых трубок при перфузии, будет также оказывать системное воздействие на пациента, что может приводить к биологическим (токсикологическим) эффектам. Эти вещества могут вызывать различные системные эффекты, из которых цитотоксичность, сенсибилизацию, раздражение и внутрикожную реактивность, системную токсичность (острую), подострую и субхроническую токсичность и гематологические несовместимости следует оценивать согласно ISO 10993-1. Проводили различные исследования для установления биологического эффекта bTECK, синтезированного в форме процессированного и биотинилированного варианта массой 9 кДа.
Специфичное уменьшение содержания клеток и анализ посредством FACS (сортировки клеток с возбуждением флуоресценции) in vitro.
Для исследований уменьшения количества клеток с использованием матрицы и bTECK в крови пациента с IBD использовали устройство небольшого размера для имитации способа в полноразмерном колоночном устройстве. Имитацию проводили с использованием набора нейлоновых фильтров в верхней части пластиковой трубки. Кровь аккуратно смешивали с матрицей и пропускали через фильтр в собирательную пробирку. Образцы нефильтрованной крови и фильтрованной крови лизировали перед окрашиванием антителами и дальнейшим анализом посредством FACS.
Получали образцы крови от доноров крови и исследования уменьшения содержания клеток проводили с использованием колонки-прототипа, содержащей матрицу, связанную с bTECK. Образцы отбирали до и после прохождения через колонку и лизировали перед окрашиванием антителами и дальнейшим анализом посредством FACS.
Специфичное уменьшение содержания клеток, экспрессирующих рецептор bTECK, было успешным с использованием как устройства небольшого размера, так и прототипа колоночного устройства. Также можно показать, что уменьшение содержания клеток было специфичным в отношении популяций клеток, экспрессирующих CCR9. Например, на фиг. 8 и 7 CCR9-положительные CD14-клетки и лимфоциты (CD4 и CD8) сильно снижены, менее 1/5 прошло через колонку, в то время как общее количество популяций CD14-клеток и лимфоцитов не изменялось после прохождения через колонку.
Активация, пролиферация и гибель клеток.
Цель состояла в изучении активации и функциональных свойств клеток, прошедших через колоночное устройство.
Маркеры активации.
Лизированные клетки инубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в 10% HUS (сыворотке с человеческими антителами) для предотвращения неспецифического связывания с клетками через Fc-рецепторы на их клеточной поверхности. Клетки окрашивали на маркеры активации; CD69 (лимфоциты), CD66b (гранулоциты) и HLA-DR (моноциты). Клетки собирали на FACSAria и анализировали посредством программного обеспечения FACSDiva. Число клеток, исследованных на предмет маркеров активации, после прохождения через колонку было таким же, как до прохождения через колонку (см. фиг. 9).
Высвобождение цитокинов.
Исследование для оценки высвобождения воспалительных цитокинов, набор для анализа секреции интерферона гамма (IFN-y) (Interferon gamma (IFN-y) Secretion Assay kit), использовали для изучения активации клеток до и после контакта с матрицей. Исследование секреции покажет количество клеток и то, какой фенотип клеток продуцирует IFN-y после стимуляции. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от 4 доноров крови разделяли посредством Ficoll. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI с 1% Pest + 1% L-Glut + 5% HUS) в концентрации 1х106 клеток/мл. Матрицу отмывали PBS и смешивали с 0,1 мкг/мл bTECK. Половину суспензии клеток пропускали через устройство небольшого размера с матрицей. Нефильтрованные и отфильтрованные клетки добавляли в
концентрации 500000 на лунку в 48-луночный планшет и инкубировали в течение 16 ч при 37°C. Фор-болмиристатацетат (РМА) (50 нг/мл) + иономицин (1 мкг/мл) добавляли к клеткам в качестве положительного контроля. Через 16 ч клетки анализировали на количество связанного с поверхностью и секре-тированного IFN-y. Другие моноклональные антитела для FACS-анализа представляли собой антитела против CD3, CD14 и 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Значительного изменения секреции IFN-y не было (см. фиг. 10).
Анализ пролиферации с включением трития ([3H]).
РВМС из гепаринизированной цельной крови от одного донора крови выделяли и приготавливали разделением посредством Ficoll. Клетки считали разводили в концентрации 2х 106 клеток/мл в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% питательной бычьей сыворотки (BGS) + 1% pest и 1% L-glut). Половину суспензии клеток пропускали через устройство небольшого размера с матрицей (концентрация стрептавидина 4 мг/мл), связанной с 200 нМ (0,2 мкг/мл) bTECK. 50 мкл на лунку из суспензии клеток с концентрацией 2х 106 клеток/мл (100000 клеток) в трех экземплярах добавляли в 96-луночный планшет, следуя протоколу. 50 мкл среды для культивирования клеток на лунку использовали в качестве отрицательного контроля и 50 мкл фитогемагглютининового (РНА) антигена (5 мкг/мл) на лунку - в качестве положительного контроля. Клетки инкубировали при 37°C до суток 2, 3 и 4.
Перед сбором клеток в лунки добавляли 25 мкл [3H]-тимидина и затем инкубировали при 37°C в течение 18 ч. Через 18 ч клетки собирали и проводят подсчет включенного [3H] в сцинтилляторе. Включение [3H] как признак пролиферации в клетках после прохождения через колонку было таким же, как до прохождения через колонку (см. фиг. 11).
Анализ гибели клеток апоптозом с использованием Annexin V.
РВМС выделяли от 3 доноров крови разделением посредством Ficoll. Клетки дважды отмывали в PBS и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI с 1% L-glut, 1% pest и 10% BGS) в концентрации 1 х 106/мл. Клетки стимулировали 5 мкг/мл или 10 мкг/мл bTECK. Клетки инкубировали в течение 16 ч в 24-луночном планшете. В качестве положительного контроля использовали дексаметазон (1 мкМ). Клетки отмывали два раза в PBS и окрашивали с использованием Annexin V, следуя протоколу набора BD Annexin V. Перед FACS-анализом к клеткам добавляли 100 мкл DAPI. Образцы анализировали на FACS Aria с программным обеспечением FACS Diva. Апоптотические клетки определяли как Annexin V-положительные и DAPI-отрицательные. Значительного увеличения Annexin V-положительных клеток после воздействия 5 или 10 мкг/мл bTECK не было (см. фиг. 12).
Заключение.
Исследования проводили на клетках до и после их прохождения через колоночное устройство или после непосредственного контакта со стрептавидиновой сефарозной матрицей, связанной с bTECK. Результаты показали незначительные эффекты на клетки, которые были в контакте с матрицей и bTECK, или отсутствие таких эффектов. Число CD69-клеток (лимфоцитов), CD66b-клеток (гранулоцитов) и HLA-DR-клеток (моноцитов) с маркерами активации было одинаковым до и после прохождения через колонку. Влияния на способность РВМС к пролиферации не было, и количество клеток, высвобождающих цитокины, было мало. Для большого количества bTECK, в 5-10 раз большего, чем количество, которое будут использовать в колоночном устройстве для начального клинического исследования, был показан незначительный эффект на гибель клеток.
Токсикологические исследования.
Анализ цитотоксичности in vitro.
Матрицу колонки исследовали на предмет цитотоксичности in vitro в культивированных клетках млекопитающих (мышиных фибробластах L 929). Исследование проводили в соответствии с руководством ISO 10993-5 Elution Test guideline. Исследуемый образец поставляли в форме суспензии агароз-ных гранул с покрытием в 20% этаноле. Перед исследованием агарозные гранулы отмывали и затем ре-суспендировали в равном объеме стерильного изотонического физиологического раствора (0,9% NaCl) для удаления этанола, поскольку матрицу колонки будут отмывать перед предполагаемым применением. Экстракт колонки получали инкубацией отмытого исследуемого образца в полной среде для культивирования клеток (среде НАМ F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина) в течение 24 ч при 37°C с аккуратным перемешиванием. Для экстракции использовали соотношение 0,2 мл исследуемого образца на мл среды (приблизительно 0,2 г/мл). Экстракт исследовали неразведенным, а также разведенным в соотношении 1 + 3 в свежей культуральной среде. Были включены отрицательные кон-троли (полипропиленовый экстракт, 6 см2/мл), положительные контроли (стабилизированный оловом поливинилхлоридный экстракт, 0,3 см2/мл) и необработанные контрольные культуры, обработанные полной средой для культивирования клеток. Клеточные культуры в трех экземплярах обрабатывали в каждой исследуемой точке в течение 48 ч. Контрольные обработки приводили к должным ответам, демонстрируя правильное функционирование и чувствительность системы исследования. Как для неразве-денного экстракта, так и для разведенного экстракта колонки было показано отсутствие токсичности (степень цитотоксичности 0).
Тест на гемолиз.
Матрицу колонки исследовали на предмет гемолитической активности (лизиса эритроцитов) in vitro. Тест на гемолиз проводили в соответствии с требованиями руководства ISO 10993-4. Тест был разработан согласно рекомендациям Института материаловедения (Material Science Institute (MSI), Tennessee, USA (1979)), при этом исследуемый образец непосредственно контактировал с разведенной смесью кроличьей крови в стерильном физиологическом растворе. Исследуемый образец поставляли в форме суспензии агарозных гранул с покрытием в 20% этаноле. Перед исследованием агарозные гранулы отмывали и затем ресуспендировали в равном объеме стерильного изотонического физиологического раствора (0,9% NaCl) для удаления этанола, поскольку матрицу колонки будут отмывать перед предполагаемым применением. Исследуемый образец помещали в стерильный изотонический физиологический раствор с использованием соотношения 0,2 мл исследуемого образца на мл физиологического раствора (приблизительно 0,2 г/мл). После инкубации в течение 39 мин при 37°C добавляли кроличью кровь (20 мкл крови на мл физиологического раствора) и инкубацию продолжали в течение еще 60 мин. Были включены отрицательные контроли (изотонический физиологический раствор) и положительные кон-троли (дистиллированная вода). Все обработки проводили трижды. В конце периода инкубации смеси центрифугировали в течение 5 мин при 500 д. Затем измеряли оптическую плотность надосадочных жидкостей при 545 нм. Вычисляли процент гемолиза. Наблюдаемая средняя степень гемолиза в образцах крови, обработанных матрицей колонки в условиях, использованных в данном исследовании, составляла -0,3%. Сделан вывод о том, что матрица колонки соответствует требованиям теста MSI на гемолиз (гемолиз < 5%).
Тест на свертывание человеческой крови.
Матрицу колонки исследовали на ее способность влиять на скорость свертывания образцов человеческой крови in vitro. Исследуемый образец поставляли в форме суспензии агарозных гранул с покрытием в 20% этаноле. Перед исследованием агарозные гранулы отмывали и затем ресуспендировали в равном объеме стерильного изотонического физиологического раствора (0,9% NaCl) для удаления этанола, поскольку матрицу колонки будут отмывать перед предполагаемым применением. Образец отмытого исследуемого образца (0,2 мл) помещали в пробирку. Также приготавливали пробирки отрицательного контроля (без обработки) и положительного контроля (флоридин). К каждой пробирке добавляли свежую человеческую кровь (1 мл). Соотношение для исследуемого образца составляло приблизительно 0,2 мл исследуемого образца на мл крови (приблизительно 0,2 г/мл). Пробирки помещали на водяную баню при приблизительно 37°C и регулярно встряхивали. Записывали время, необходимое для полного свертывания крови. Исследуемый образец и каждый контроль исследовали один раз с кровью от каждого из четырех людей. Результаты, полученные при контрольных обработках, продемонстрировали эффективность и чувствительность тест-системы.
Для среднего времени свертывания крови, обработанной матрицей, было показано незначительное снижение до 91% среднего значения отрицательного контроля. Тем не менее, данное снижение не рассматривают как значимое ввиду больших различий в исследовании между четырьмя донорами. Сделан вывод о том, что матрица колонки не влияла на время свертывания человеческой крови в данном эксперименте.
Заключение.
На основании результатов проведенных исследований и оценки колонки можно сделать вывод о том, что она имеет очень низкую токсичность, токсичность специфического типа в отношении органов-мишеней не была установлена.
Пример 12. Описание синтеза TECK, биотинилированного через ПЭГ-спейсер.
Молекула-мишень.
TECK (замена Met на Nleu), дериватизированный по е-аминофункциональности боковой цепи Lys72 с использованием ПЭГ-биотина (соль трифторуксусной кислоты (TFA)). Модификации.
Процессированная форма человеческого TECK, соответствующая остаткам 1-74 зрелого белка, включающая последовательность, соответствующую хемокиновой петле. Полноразмерный зрелый белок имеет 127 аминокислот (сигнальный пептид имеет 23 аминокислоты в незрелом белке из 150 аминокислот). Один метионин в последовательности был изменен на норлейцин для предотвращения окисления этого остатка при сборке цепи, что наблюдали при синтезе производного природной последовательности. Глутамин на N-конце белков является субстратом для образования pyroGlu в физиологических условиях. Таким образом, Gln1 последовательности был заменен пироглутамином для предотвращения образования смешанных разновидностей N-концевых Gin и pyroGlu. Это улучшает выход синтеза и обеспечивает получение гомогенного хемокина при изготовлении и применении колонки. Встречающийся в природе лизин в положении 72 был модифицирован биотинилированием на смоле. Между е-аминофункциональностью и биотином был включен ПЭГ-спейсер.
Показана линейная аминокислотная последовательность (SEQ ID N0:1) до присоединения молекул ПЭГ-спейсера и биотина к аминокислоте 72 (K):
Н- РуrGVFEDCCIA YHYFIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAI FYLPKBHRKVCGHPKSREVQRftHl eKLbDAKHKVF-OH
Сборку конструированной последовательности TECK проводили на твердом носителе с применением протоколов с флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc) для твердофазного пептидного синтеза: Н-Р yrGV FEDCCLAYHY PIСЯДVLRPAWTYRIQEVSGSCHLP AM FYLPKRHRjtVCGHPKSREVQRAHl eKLLDARMK (Dde) VF-
FESItt
FmocLys(Dde)-OH был включен как остаток 72 для облегчения сайт-специфического мечения в данном положении белка. Замена Met на Nile.
Замена N-концевого Gln на пироглутаминовую кислоту. Удаление защитной группы Dde.
Защитную группу Dde удаляли обработкой всей смолы (2,5 г) раствором 2% гидразина в диметил-формамиде (DMF) (100 мл) в течение периода продолжительностью 1 ч с получением 2,0 г смолы. Стадии мечения.
1. Сочетание с Fmoc-8-амино-3,6-диоктановой кислотой.
Смолу (1,5 г) выдерживали в DMF (2 мл) и затем добавляли раствор Fmoc-8-амино-3,6-диоктановой кислоты (0,38 г, 1 ммоль), раствор DIC (2 мл, 0,2 М в DMF) и раствор HOCt (2 мл, 0,2 М в DMF). Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч и затем отмывали в DMF.
2. Кэппинг.
Проводили кэппинг смолы с использованием 0,5 М уксусного ангидрида/раствора DMF (20 мл) в течение 5 мин и затем отмывали в DMF.
3. Удаление защитной группы Fmoc.
Удаление защитной группы Fmoc проводили обработкой 20% пиперидином в растворе DMF (2х50 мл) в течение 15 мин каждый раз. Смолу отмывали DMF.
4. Сочетание биотин-OSu.
Раствор эфира биотин-NHS (341 мг, 1 ммоль) и диизопропилэтиламина (DIPEA) (348 мкл) в DMF (10 мл) добавляли к смоле и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 3 ч. Смолу тщательно отмывали DMF и дихлорметаном (DCM), затем сушили в вакууме. Полученная сухая смола = 1,5 г.
Расщепление.
Сухую пептидную смолу (1,5 г) и смесь расщепляли TFA (30 мл), содержащей очистительную смесь, состоящую из TIS, тиоанизола, воды, EDT и фенола и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. Раствор фильтровали в холодный эфир и смолу промывали TFA. Пептид центрифугировали, отмывали эфиром, центрифугировали и лиофилизировали с получением 1,0 г неочищенного пептида.
Протокол фолдинга.
Неочищенный пептид (100 мг) растворяли в 6 М GnHCl (233 мл) и затем быстро разбавляли до концентрации GnHCl 2 М добавлением 50 мМ гидроксиметиламинометана (Трис), рН 8 (467 мл), содержащего 0,5 мМ окисленного глутатиона (GSSG) и 5 мМ восстановленного глутатиона (GSH). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 суток и затем анализировали посредством HPLC (Jupiter C18, колонка 250x4,6 мм, 10-60% В в течение 30 мин). HPLC-анализ подтвердил образование желаемого продукта, а также побочных продуктов с неправильным фолдингом.
Очистка.
Белок, прошедший фолдинг, очищали посредством HPLC с обращенной фазой с использованием Jupiter C18, колонка 250x21 мм, 9 мл/мин, 10-60% В в течение 50 мин. Было получено 11,1 мг чистого прошедшего фолдинг биотинилированного TECK (Nleu).
На фиг. 13 показана HPLC очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного TECK (Nleu). Белок элюировали с одним пиком на 21,6 мин.
На фиг. 14 показаны данные ионизации очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного TECK (Nleu) электрораспылением с тандемной масс-спектрометрией (ES/MS). Предполагаемая масса составила 8959,4 Да.
Данные функционального анализа.
Биотинилированный TECK (Nleu) исследовали на активность агониста в анализе Aequorin против hCCR9 (Euroscreen), и было сообщено значение средней эффективной концентрации (EC50) 63,6 нМ; ср. EC50 для нативного TECK составляет 67,87 нМ.
Ссылки
1. Fitzgerald КА, Oneill LA J, Gearing AJH, Callard RE. The Cytokine facts book; 2001.
2. Johansson-Lindbom B, Agace WW. Generation of gut-homing T cells and their localization to the small intestinal mucosa. Immunol Rev 2007:215:226-42.
3. Walters MJ, Berahovich, R., Wang, Y., Wei, Z., Ungashe, S., Lai, N., Ertl, L, Baumgart, Т., Howard, M., Schall, T. J. Presence of CCR9 and its ligand СС125ЯЕСК in the colon: scientific rationale for the use of CCR9 small molecule antagonist CCX282-B in colonic disorders. In: UEGW 2008; 2008; 2008.
4. Cahill RN, Poskitt DC, Frost DC, Trnka Z. Two distinct pools of recirculating T lymphocytes: migratory characteristics of nodal and intestinal T lymphocytes. J Exp Med 1977;145(2):420-8.
5. Hall JG, Hopkins J, Orlans E. Studies on the lymphocytes of sheep. III. Destination of lymph-borne immunoblasts in relation to their tissue of origin. Eur J Immunol 977;7(1):30-7,
6. Streeter PR, Rouse ВТ, Butcher EC. Immunohistologic and functional characterization of a vascular addressin involved in lymphocyte homing into peripheral lymph nodes. J Cell Biol 1988;107(5):1853-62.
7. Apostolaki M, Manoloukos M, Roulis M, et al. Role of beta7 integrin and the chemokine/chemokine receptor pair CCL25/CCR9 in modeled TNF-dependent Crohn's disease. Gastroenterology 2008;134(7):2025-35.
8. Staton TL, Habtezion A, Winslow MM, Sato T, Love PE, Butcher EC, CD8+ recent thymic emigrants home to and efficiently repopulate the small intestine epithelium. Nat Immunol 2006;7(5):482-8.
9. Wurbel MA, Malissen M, Guy-Grand D, Malissen B, Campbell J J. Impaired accumulation of antigen-specific CD8 lymphocytes in chemokine CCL25-deficient intestinal epithelium and lamina propria. J Immunol 2007;178(12):7598-606.
10. Wurbel MA, Malissen M, Guy-Grand D, et al. Mice lacking the CCR9 CC-chemokine receptor show a mild impairment of early T- and B-cell development and a reduction in T-cell receptor gammade!ta(+) gut intraepithelial lymphocytes. Blood 2001;98(9):2626-32.
11. Johansson-Lindbom B, Svensson M, Wurbel MA, Malissen B, Marquez G, Agace W. Selective generation of gut tropic T cells in gut-associated lymphoid tissue (GALT): requirement for GALT dendritic cells and adjuvant. J Exp Med 2003;198(6):963-9.
12. Rivera-Nieves J, Ho J, Bamias G, et al. Antibody blockade of CCL25/CCR9 ameliorates early but not late chronic murine ileitis. Gastroenterology 2006;131(5):1518-29.
13. Saruta M, Yu QT, Avanesyan A, Fleshner PR, Targan SR, Papadakis KA. Phenotype and effector function of CC chemokine receptor 9-expressing lymphocytes in small intestinal Crohn's disease. J Immunol 2007;178(5):3293-300.
14. Wang C. et al., Mucosal Immunol. 2009 March; 2(2): 173-183.
Настоящее изобретение не следует ограничивать в объеме конкретными воплощениями, описанными здесь. Несомненно, различные модификации изобретения, в дополнение к описанным здесь, станут ясны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и последующих графических материалов. Подразумевают, что такие модификации входят в объем приложенной формулы изобретения. Более того, все воплощения, описанные здесь, рассматривают как широко применимые, и их можно комбинировать с любыми другими совместимыми воплощениями, при необходимости.
Здесь приведены различные публикации, описания которых полностью включены посредством ссылки.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Колонка для афереза, наполненная твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента.
2. Колонка по п.1, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован, где носитель содержит иммобилизованный на нем стрептавидин и где один или более чем один биотинилированный хемокин связан со стрептавидином на носителе.
3. Колонка по п.1 или 2, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован через спейсерную группу.
4. Колонка по любому из пп.1-3, где носитель содержит или состоит из углевода, имеющего молекулярную массу более 100 кДа.
5. Колонка по п.4, где углевод представляет собой поперечно сшитую агарозу.
6. Колонка по любому из пп.1-5, где указанный один или более чем один хемокин выбран из CCL25, макрофагального воспалительного белка-1а (MIP^), MIP-1b, моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, хемокина, регулируемого тимусом и активацией (TARC), хемокина макрофагального происхождения (MDC), MIP-3, MIP-3a, MIP3b, MIP-4, I-309, HCC-1, HCC-2, хе-мокина вторичных лимфоидных тканей (SLC), интерлейкина-8 (IL-8), регулируемого ростом онкогена-а (GROa), GROb, GROg, хемокина, выделяемого T-клетками при активации (RANTES), белка-2, активирующего нейтрофилы (NAP-2), эпителиального пептида 78, активирующего нейтрофилы (ENA78), гра-нулоцитарного хемотаксического белка-2 (GCP-2), IP-10, монокина, индуцируемого интерфероном-гамма (MIG), I-TAC, фактора стромальных клеток (SDF), фракталкина, лимфотактина, эотаксина, эотак-сина-2, I-309, хемокина B-лимфоцитов (BLC).
7. Колонка по п.6, где указанный один или более чем один хемокин представляет собой процесси-рованный хемокин CCL25, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID
NO: 1.
8. Колонка по п.7, где указанный процессированный хемокин CCL25 биотинилирован в положении 72 (лизин) для обеспечения возможности иммобилизации указанного хемокина на твердом носителе.
9. Колонка по п.8, где указанный процессированный хемокин CCL25 дополнительно содержит по-лиэтиленгликолевый спейсер (ПЭГ-спейсер) между биотином и лизиновым остатком.
10. Колонка по любому из пп.1-9, где носитель имеет форму сфер, гранул или частиц неправильной формы, имеющих средний размер от 50 мкм до 2 мм.
11. Колонка по любому из пп.1-10, где носитель обработан агентом для придания ему антикоагу-лянтных свойств, как, например, у гепаринизированного носителя.
12. Способ удаления клетки, экспрессирующей штатный рецептор одного или более чем одного хе-мокина, из периферической крови пациента, включающий:
а) приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемоки-
ном, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии
указанной клетки на носителе; и
б) отделение крови с уменьшенным содержанием указанной клетки от носителя.
13. Способ по п.12, дополнительно включающий, перед стадией (а), получение периферической крови от пациента.
14. Способ по п.12 или 13, дополнительно включающий, после стадии (б), инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту.
15. Способ по любому из пп.12-14, где клетка представляет собой лейкоцит.
16. Способ по любому из пп.12-15, который используют в процессе лечения воспалительного состояния.
17. Способ по п.16, где воспалительное состояние представляет собой воспалительное расстройство кишечника (IBD).
18. Способ по любому из пп.12-17, где твердый носитель является таким, как определено в любом из пп. 2-11.
19. Способ по любому из пп.12-18, где периферическую кровь непрерывно получают от пациента и непрерывно проводят инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту.
20. Способ по любому из пп.12-19, где носитель расположен в колонке, через которую осуществляют ток крови.
21. Способ по любому из пп.12-20, где периферическая кровь обработана антикоагулянтом.
22. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения воспалительного состояния.
23. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения заболевания, характеризующегося присутствием повышенного уровня клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина.
13.
24. Применение по п.23, где клетка представляет собой лейкоцит, в частности один или более из T-лимфоцита, моноцита, нейтрофильных гранулоцитов или эозинофила, в периферической крови больного.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023912
023912
- 1 -
- 1 -
023912
023912
- 1 -
- 1 -
023912
023912
- 1 -
- 1 -
023912
023912
- 1 -
- 1 -
023912
023912
- 4 -
- 3 -
023912
023912
- 5 -
- 5 -
023912
023912
- 6 -
- 6 -
023912
- 21 -
- 20 -
023912
- 21 -
- 20 -
023912
023912
- 23 -
- 23 -
023912
023912
- 24 -
- 24 -
|
