EA 023909B1 20160729 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2016\PDF/023909 Полный текст описания [**] EA201491116 20121204 Регистрационный номер и дата заявки EP11191997.3 20111205 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2012/074351 Номер международной заявки (PCT) WO2013/083557 20130613 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21607 Номер бюллетеня [**] ПРОИЗВОДНЫЕ 6-ДИФТОРМЕТИЛ-5,6-ДИГИДРО-2H-[1,4]ОКСАЗИН-3-АМИНА Название документа [8] C07D413/10, [8] C07D413/12, [8] A61K 31/5377, [8] A61P 25/16, [8] A61P 25/28 Индексы МПК [ES] Трабанко-Суарес Андрес Авелино, [BE] Гейсен Хенрикус Якобус Мария, [BE] Суркин Михел, [BE] Прокопкова Хана Сведения об авторах [BE] ЯНССЕН ФАРМАЦЕВТИКА НВ Сведения о патентообладателях [BE] ЯНССЕН ФАРМАЦЕВТИКА НВ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000023909b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение формулы (I) или его таутомерная или стереоизомерная форма, где R 1 представляет собой C 1-3 алкил; R 2 представляет собой водород или фтор; L представляет собой связь или -NHCO-; Ar выбран из группы, состоящей из пиридинила, пиримидинила и пиразинила, каждый из которых необязательно замещен галогеном или С 1-3 алкокси; или его фармацевтически приемлемая соль присоединения.

2. Соединение по п.1, где R 1 представляет собой метил или этил.

3. Соединение по п.2, где Ar выбран из 5-метоксипиридинила, 5-пиримидинила и 5-фторпиразинила.

4. Соединение по п.1, где четвертичный атом углерода, замещенный R 1 , имеет R-конфигурацию.

5. Соединение, представляющее собой N-{3-[(2R*,3R)-5-амино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-ил]-4-фторфенил}-5-цианопиридин-2-карбоксамид.

6. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения нарушений, в которые вовлечена бета-секретаза, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Способ получения фармацевтической композиции по п.6, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемый носитель равномерно смешивают с терапевтически эффективным количеством соединения по любому из пп.1-5.

8. Применение соединения по любому из пп.1-5 для лечения или предупреждения болезни Альцгеймера (AD), умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, или деменции, ассоциированной с бета-амилоидом.

9. Способ лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-5.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Соединение формулы (I) или его таутомерная или стереоизомерная форма, где R 1 представляет собой C 1-3 алкил; R 2 представляет собой водород или фтор; L представляет собой связь или -NHCO-; Ar выбран из группы, состоящей из пиридинила, пиримидинила и пиразинила, каждый из которых необязательно замещен галогеном или С 1-3 алкокси; или его фармацевтически приемлемая соль присоединения.

2. Соединение по п.1, где R 1 представляет собой метил или этил.

3. Соединение по п.2, где Ar выбран из 5-метоксипиридинила, 5-пиримидинила и 5-фторпиразинила.

4. Соединение по п.1, где четвертичный атом углерода, замещенный R 1 , имеет R-конфигурацию.

5. Соединение, представляющее собой N-{3-[(2R*,3R)-5-амино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-ил]-4-фторфенил}-5-цианопиридин-2-карбоксамид.

6. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения нарушений, в которые вовлечена бета-секретаза, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Способ получения фармацевтической композиции по п.6, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемый носитель равномерно смешивают с терапевтически эффективным количеством соединения по любому из пп.1-5.

8. Применение соединения по любому из пп.1-5 для лечения или предупреждения болезни Альцгеймера (AD), умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, или деменции, ассоциированной с бета-амилоидом.

9. Способ лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-5.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
023909
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201491116
(22) Дата подачи заявки
2012.12.04
(51) Int. Cl.
C07D 413/10 (2006.01) C07D 413/12 (2006.01) A61K31/5377 (2006.01) A61P25/16 (2006.01) A61P25/28 (2006.01)
(54) ПРОИЗВОДНЫЕ 6-ДИФТОРМЕТИЛ-5,6-ДИГИДРО-2Ы-[1,4]ОКСАЗИН-3-АМИНА
(31) 11191997.3
(32) 2011.12.05
(33) EP
(43) 2014.12.30
(86) PCT/EP2012/074351
(87) WO 2013/083557 2013.06.13
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЯНССЕН ФАРМАЦЕВТИКА НВ (BE)
(72) Изобретатель:
Трабанко-Суарес Андрее Авелино
(ES), Гейсен Хенрикус Якобус Мария,
Суркин Михел, Прокопкова Хана
(BE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2011009943
(57) Изобретение относится к новым производным 6-дифторметил-5,6-дигидро-2Н-[1,4]оксазин-3-амина в качестве ингибиторов бета-секретазы, также известной как фермент, расщепляющий предшественник амилоида по бета-сайту, ВАСЕ, ВАСЕ1, Asp2 или мемапсин 2. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, к способам получения таких соединений и композиций и к применению таких соединений и композиций для предупреждения и лечения нарушений, в которые вовлечена бета-секретаза, таких как болезнь Альцгеймера (AD), умеренное когнитивное нарушение, угасание, деменция, деменция с тельцами Леви, церебральная амилоидная ангиопатия, слабоумие вследствие множественных инфарктов, синдром Дауна, деменция, ассоциированная с инсультом, деменция, ассоциированная с болезнью Паркинсона, и деменция, ассоциированная с бета-амилоидом.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новым производным 6-дифторметил-5,6-дигидро-2Н-[1,4]оксазин-3-амина в качестве ингибиторов бета-секретазы, также известной как фермент, расщепляющий предшественник амилоида по бета-сайту, ВАСЕ, ВАСЕ1, Asp2 или мемапсин 2. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, к способам получения таких соединений и композиций и к применению таких соединений и композиций для предупреждения и лечения расстройств, в которые вовлечена бета-секретаза, таких как болезнь Альцгеймера (AD), умеренное когнитивное нарушение, угасание, деменция, деменция с тельцами Леви, синдром Дауна, деменция, ассоциированная с инсультом, деменция, ассоциированная с болезнью Паркинсона, и де-менция, ассоциированная с бета-амилоидом.
Предпосылки изобретения
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нейродегенеративное заболевание, ассоциированное со старением. Пациенты с AD страдают нарушениями познавательной способности и потерей памяти, а также поведенческими проблемами, такими как тревожность. У более 90% пораженных AD имеется спорадическая форма расстройства, тогда как менее 10% случаев являются семейными или наследственными. В Соединенных Штатах у приблизительно 1 из 10 людей в возрасте 65 лет имеется AD, тогда как в возрасте 85 лет 1 из каждых двух индивидуумов поражен AD. Средняя предполагаемая продолжительность жизни от первоначального диагноза составляет 7-10 лет, и пациенты с AD нуждаются во всестороннем уходе, осуществляемом либо в доме престарелых, что является очень дорогостоящим, либо осуществляемом членами семьи. При возрастающем количестве пожилых людей в популяции AD представляет собой растущую медицинскую проблему. Доступные в настоящее время виды терапии AD обеспечивают лечение только симптомов заболевания и включают ингибиторы ацетилхолинэстеразы для улучшения когнитивных свойств, а также анксиолитики и нейролептики для контроля поведенческих проблем, ассоциированных с данной болезнью.
Характерными патологическими признаками в головном мозге пациентов с AD являются нейро-фибриллярные клубки, которые возникают в результате гиперфосфорилирования тау-белка, и амилоидные бляшки, которые образуются в результате агрегации пептида бета-амилоида 1-42 (Abeta 1-42). Abeta 1-42 образует олигомеры, а затем фибриллы и, в конечном итоге, амилоидные бляшки. Олигомеры и фибриллы считаются особенно нейротоксичными и могут вызывать большую часть неврологических повреждений, ассоциированных с AD. Средства, которые предупреждают образование Abeta 1-42, имеют потенциал, чтобы стать средствами, модифицирующими течение заболевания, для лечения AD. Abeta 142 образуется из белка-предшественника амилоида (АРР), состоящего из 770 аминокислот. N-конец Abeta 1-42 отщепляется бета-секретазой (ВАСЕ), а затем гамма-секретаза отщепляет С-конец. В дополнение к Abeta 1-42 гамма-секретаза также высвобождает Abeta 1-40, который является преобладающим продуктом расщепления, так же как Abeta 1-38 и Abeta 1-43. Эти формы Abeta также могут агрегироваться с образованием олигомеров и фибрилл. Таким образом, предполагается, что ингибиторы ВАСЕ будут предупреждать образование Abeta 1-42, а также Abeta 1-40, Abeta 1-38 и Abeta 1-43 и будут являться потенциальными терапевтическими средствами для лечения AD.
В WO-2011/009943 (Novartis) раскрывают незамещенные и 2-замещенные производные оксазина и их применение в качестве ингибиторов ВАСЕ для лечения неврологических расстройств. В WO-2011/020806 (Hoffmann-LaRoche) раскрывают 2,6-незамещенные производные 3-амино-5-фенил-5,6-дигидро-2Н-[1,4]оксазина, обладающие ингибирующими свойствами в отношении ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к производным 5,6-дигидро-2H-[1,4]оксазин-3-амина формулы
(I)
и их таутомерам и стереоизомерным формам, где R1 представляет собой Q^-алкил;
представляет собой водород или фтор; L представляет собой связь или -NHCO-;
Ar выбран из группы, состоящей из пиридинила, пиримидинила и пиразинила, каждый из которых необязательно замещен галогеном или C1-3алкокси;
и их фармацевтически приемлемым солям присоединения.
Примером настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и любое из соединений, описанных выше. Примером настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, полученная путем смешивания любого из соединений, описанных выше, и фармацевтически приемлемого носителя. Примером настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, включающий смешивание любого из соединений,
описанных выше, и фармацевтически приемлемого носителя.
Примером настоящего изобретения являются способы лечения расстройства, опосредованного ферментом бета-секретазой, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любого из соединений или фармацевтических композиций, описанных выше.
Дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение способы ингибирования фермента бета-секретазы, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любого из соединений или фармацевтических композиций, описанных в данном документе.
Примером настоящего изобретения является способ лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, демен-ции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, предпочтительно болезни Альц-геймера, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любого из соединений или фармацевтических композиций, описанных в данном документе.
Другим примером настоящего изобретения является любое из соединений, описанных выше, для применения при лечении: (а) болезни Альцгеймера, (b) умеренного когнитивного нарушения, (с) угасания, (d) деменции, (е) деменции с тельцами Леви, (f) синдрома Дауна, (g) деменции, ассоциированной с инсультом, (h) деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и (i) деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, у субъекта, нуждающегося в этом.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), определенным выше в данном документе, и их фармацевтически приемлемым солям и сольватам. Соединения формулы (I) являются ингибиторами фермента бета-секретазы (также известного как фермент, расщепляющий по бета-сайту, ВАСЕ, ВАСЕ1, Asp2 или мемапсин 2) и являются пригодными при лечении болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции, ассоциированной с инсультом, демен-ции с тельцами Леви, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, предпочтительно болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения или деменции, более предпочтительно болезни Альцгеймера.
В варианте осуществления настоящего изобретения R1 представляет собой метил или этил.
В варианте осуществления Ar выбран из 5-метоксипиридинила, 5-пиримидинила и 5-фторпиразинила.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения R2 представляет собой водород или
фтор.
В другом варианте осуществления четвертичный атом углерода, замещенный R1, характеризуется R-конфигурацией. Определения.
"Галоген" означает фтор, хлор и бром; "C1-3алкилокси" означает эфирный радикал, где ^^алюш представляет собой алкильную неразветвленную или с разветвленной цепью группу, имеющую 1, 2 или 3 атома углерода, например метил, этил, 1-пропил и 2-пропил.
Используемое в данном документе выражение "субъект" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку, который является или являлся объектом лечения, наблюдения или эксперимента.
Используемое в данном документе выражение "терапевтически эффективное количество" означает такое количество активного соединения или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский эффект в тканевой системе у животного или человека, желаемый исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом, что включает облегчение симптомов заболевания или расстройства, лечение которого осуществляется.
Используемое в данном документе выражение "композиция" предназначено охватывать продукт, содержащий определенные ингредиенты в определенных количествах, а также любого продукта, который получают, прямо или опосредованно, в результате комбинаций определенных ингредиентов в определенных количествах.
Выше и ниже в данном документе выражение "соединение формулы (I)" следует понимать как включающее его соли присоединения, сольваты и стереоизомеры.
Выражения "стереоизомеры" или "стереохимически изомерные формы" ранее и далее в данном документе используют взаимозаменяемо.
Настоящее изобретение включает все стереоизомеры соединения формулы (I) либо в виде чистого стереоизомера, либо в виде смеси из двух или более стереоизомеров.
Энантиомеры являются стереоизомерами, которые представляют собой не совпадающие при наложении зеркальные отображения друг друга. Смесь 1:1 пары энантиомеров является рацематом или рацемической смесью. Диастереомеры (или диастереоизомеры) являются стереоизомерами, которые не являются энантиомерам, т.е. они не соотносятся как зеркальные изображения. Следовательно, настоящее изобретение включает энантиомеры, диастереомеры, рацематы.
Абсолютная конфигурация определяется согласно системе Кана Ингольда-Прелога. Конфигурация при асимметричном атоме определяется либо как R, либо как S. Анализируемые соединения, абсолютная конфигурация которых неизвестна, могут быть обозначены как (+) или (-) в зависимости от направления, в котором они вращают плоскость поляризованного света.
Если указан конкретный стереоизомер, это означает, что указанный стереоизомер практически чистый, т.е. связан с менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, еще более предпочтительно менее 5%, в частности менее 2% и наиболее предпочтительно менее 1% других изомеров. Таким образом, если соединение формулы (I) указано, например, как (R), это означает, что соединение практически не содержит (S) изомер.
Соединения формулы (I) сосуществуют в динамическом равновесии с таутомерами формулы (1-а)
Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений по настоящему изобретению могут существовать в виде полиморфов, и в качестве таковых предполагается их включение в настоящее изобретение. Кроме того, некоторые из соединений по настоящему изобретению могут образовывать сольваты с водой (т.е. гидраты) или обычными органическими растворителями, при этом также предполагается, что такие сольваты охвачены объемом настоящего изобретения.
Что касается применения в медицине, соли соединений по настоящему изобретению относятся к нетоксичным "фармацевтически приемлемым солям". Однако, при получении соединений согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей могут быть использованы другие соли. Подходящие фармацевтически приемлемые соли соединений включают соли присоединения кислоты, которые можно получать, например, путем смешивания раствора соединения с раствором фармацевтически приемлемой кислоты, такой как соляная кислота, серная кислота, фумаровая кислота, малеи-новая кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, винная кислота, угольная кислота или фосфорная кислота. Более того, если соединения по настоящему изобретению несут кислотный фрагмент, их подходящие фармацевтически приемлемые соли могут включать соли щелочных металлов, например соли натрия или калия; соли щелочно-земельных металлов, например соли кальция или магния; и соли, образованные с подходящими органическими лигандами, например соли четвертичного аммония.
Типичные кислоты, которые можно использовать в получении фармацевтически приемлемых солей без ограничения включают следующие: уксусная кислота, 2,2-дихлоруксусная кислота, ацилированные аминокислоты, адипиновая кислота, альгиновая кислота, аскорбиновая кислота, L-аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, 4-ацетамидобензойная кислота, (+)-камфорная кислота, камфорсульфоновая кислота, капроновая кислота, капроевая кислота, каприловая кислота, коричная кислота, лимонная кислота, цикламовая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, галактаровая кислота, гентизиновая кислота, глюкогептоновая кислота, D-глюконовая кислота, D-глюкуроновая кислота, L-глутаминовая кислота, бета-оксо-глутаровая кислота, гликолевая кислота, гиппуровая кислота, броми-сто-водородная кислота, соляная кислота, (+)^-молочная кислота, (+)-DL-молочная кислота, лактобио-новая кислота, малеиновая кислота, (-)^-оксиянтарная кислота, малоновая кислота, (+)-DL-миндальная кислота, метансульфоновая кислота, нафталин-2-сульфоновая кислота, нафталин-1,5-дисульфоновая кислота, 1-гидрокси-2-нафтойная кислота, никотиновая кислота, азотная кислота, олеиновая кислота, оро-товая кислота, щавелевая кислота, пальмитиновая кислота, памовая кислота, фосфорная кислота, L-пироглутаминовая кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, себациновая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, серная кислота, дубильная кислота, (+)^-винная кислота, тио-циановая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, трифторметилсульфоновая кислота и ундециленовая кислота. Типичные основания, которые можно использовать в получении фармацевтически приемлемых солей без ограничения включают следующие: аммиак, L-аргинин, бенетамин, бензатин, гидроксид кальция, холин, диметилэтаноламин, диэтаноламин, диэтиламин, 2-(диэтиламино)-этанол, этаноламин, эти-лендиамин, N-метилглюкамин, гидрабамин, Ш-имидазол, L-лизин, гидроксид магния, 4-(2-гидроксиэтил)-морфолин, пиперазин, гидроксид калия, 1-(2-гидроксиэтил)-пирролидин, вторичный амин, гидроксид натрия, триэтаноламин, трометамин и гидроксид цинка.
Названия соединений по настоящему изобретению составлены в соответствии с правилами номенклатуры, согласованных с Химической реферативной службой (CAS), с использованием программного обеспечения от Advanced Chemical Development, Inc., (ACD/название продукта, версия 10.01; сборка 15494, 1 декабря 2006) или в соответствии с правилами номенклатуры, согласованных с Международным союзом теоретической и прикладной химии (IUPAC), с использованием программного обеспечения от Advanced Chemical Development, Inc., (ACD/название продукта, версия 10.01.0.14105, октябрь 2006). В случае таутомерных форм составляли название представленных таутомерных форм структуры. Другие не представленные таутомерные формы также включены в объем настоящего изобретения.
Получение соединений. Методика эксперимента 1.
Конечные соединения в соответствии с формулой (I) могут быть получены путем каталитической гидрогенизации промежуточного соединения формулы (II-а) в соответствии со схемой реакции (1). Указанное превращение можно выполнить путем обработки промежуточного соединения формулы (II-а) водородом в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, палладий на угле, подходящего каталитического яда, такого как, например, тиофен, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, этилацетат или метанол. Смесь перемешивают в атмосфере водорода при подходящей температуре, как правило, комнатной температуре, при подходящем давлении, таком как, например, атмосферное давление, например, в течение 16 ч. На схеме реакции (1) все переменные величины определены как в формуле (I).
Схема реакции 1
Методика эксперимента 2.
Промежуточные соединения формулы (II-b) можно, в общем, получить путем приведения в реакцию промежуточного соединения формулы (III) с соединением формулы (IV) в соответствии со схемой реакции (2), причем реакцию проводят в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, дихлорметан или метанол, в присутствии подходящего основания, такого как, например, три-этиламин, в присутствии конденсирующего средства, такого как, например, O-(7-азабензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилтиурония гексафторофосфат [HATU, CAS 148893-10-1] или 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилмофолиния хлорид [DMTMM, CAS 3945-69-5], при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 25°С в течение времени, необходимого для завершения реакции, например 1-16 ч. На схеме реакции (2) все переменные величины определены как в формуле (I).
Схема реакции 2
Методика эксперимента 3.
В общем, промежуточные соединения формулы (II-с) можно получить путем приведения в реакцию промежуточных соединений формулы (VI) с соответствующими арилборонатом или арилбороновой кислотой в реакции по типу Судзуки. Таким образом, промежуточные соединения формулы (VI) могут вступать в реакцию с арилборонатом или арилбороновой кислотой в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, 1,4-диоксан, этанол или смеси инертных растворителей, таких как, например, 1,2-диметоксиэтан/вода/этанол, в присутствии подходящего основания, такого как, например, водный K3PO4, Na2CO3 или Cs2CO3, Pd-комплексного катализатора, такого как, например, [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (II) [CAS 72287-26-4], или транс-бисдициклогексиламин)палладия диацетат [DAPCy, CAS 628339-96-8], или тетра-кис(трифенилфосфин)палладий(0) [CAS14221-01-3], при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 80°С, например, в течение периода времени 2-20 ч или, например, нагревание реакционной смеси при 130°С, например, в течение 10 мин в микроволновом излучении. На схеме реакции (3) все переменные величины определены как в формуле (I), и W представляет собой галоген. R3 и R4 могут представлять собой водород или алкил или, взятые вместе, могут образовать, например, двухвалентный радикал формулы -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- или -QCH^QCH^-.
Методика эксперимента 4.
В общем, промежуточные соединения формулы (III) можно получить после этапов реакции, показанных на схеме реакции (4) ниже.
Схема реакции 3
А - перегруппировка брома на амин. В - превращение тиоамида в амидин. С - превращение амида в тиоамид (тионирование).
Промежуточные соединения формулы (III) в приведенной выше схеме реакции (4) можно получить из соответствующих промежуточных соединений формулы (VI), следуя известному из уровня техники типу методики сочетания, катализируемого медью (этап реакции А). Указанное сочетание можно осуществлять путем обработки промежуточных соединений формулы (VI) азидом натрия в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, DMSO, в присутствии смеси подходящих оснований, таких как, например, диметилэтилендиамин и Na2CO3, медного катализатора, такого как, например, CuI, при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 110°C до завершения реакции, например в течение 1 ч.
Промежуточные соединения формулы (VI) из вышеуказанной схемы реакции (4) можно получить из соответствующих промежуточных соединений формулы (VII), следуя известным из уровня техники методикам превращения тиоамида в амидин (этап реакции В). Указанное превращение можно беспрепятственно осуществлять путем обработки промежуточных продуктов формулы (VII) источником аммиака, таким как, например, хлорид аммония или водный аммиак, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, вода или метанол и т.п., при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 60°C, например в течение 6 ч.
Промежуточные соединения формулы (VII) из вышеуказанной схемы реакции (4) можно получить из соответствующих промежуточных соединений формулы (VIII), следуя известным из уровня техники методикам тионирования (этап реакции С). Указанное превращение можно беспрепятственно осуществлять путем обработки промежуточных соединений формулы (VIII) тионирующим агентом, таким как, например, пентасульфид фосфора или 2,4-бис-(4-метоксифенил)-1,3-дитиа-2,4-дифосфетан-2,4-дисульфид [реагент Лавессона, CAS 19172-47-5], в реакционно-инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран или 1,4-диоксан и т.п., при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 50°C, например в течение 50 мин.
Методика эксперимента 5.
В общем, промежуточные соединения формулы (VIII) и (IX) можно получить из промежуточных соединений формулы (X), следуя известным из уровня техники методикам (этап реакции D). Указанное превращение можно осуществить путем обработки промежуточного соединения формулы (X) подходящим цинковым реагентом, таким как, например, цинковая пыль или цинк-медная пара, в подходящем растворителе, таком как уксусная кислота, при подходящей температуре, как правило, от комнатной температуры до 80°C в течение времени, необходимого для завершения реакции, например, в течение 1 -16 ч. Данное превращение обеспечивает смесь промежуточных соединений формулы (VIII) и (IX) в различном соотношении в зависимости от условий реакции и реактивов.
Схема реакции 5
Методика эксперимента 6.
В общем, промежуточные соединения формулы (X) можно получить после этапов реакции, показанных на схеме реакции (6) ниже.
Схема реакции 6
Е - хлорирование.
F - трифторметилирование.
G - циклизация.
Промежуточные соединения формулы (X) из вышеуказанной схемы реакции (6) можно получить из промежуточных соединений формулы (XI), следуя известным из уровня техники методикам хлорирования (этап реакции Е). Указанное превращение можно осуществить путем обработки промежуточного соединения формулы (XI) подходящим хлорирующим агентом, таким как, например, тионилхлорид, в присутствии основания, такого как, например, пиридин, в реакционно-инертном растворителе, таком как, например, дихлорметан. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например 0°C, в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 30-60 мин.
Промежуточные соединения формулы (XI) из вышеуказанной схемы реакции (6) можно получить из промежуточных соединений формулы (XII), следуя известным из уровня техники методикам триф-торметилирования (этап реакции F). Указанное превращение можно осуществить путем обработки промежуточного соединения формулы (XII) в присутствии фторида тетрабутиламмония (TBAF) или трифе-нилдифтор-силиката тетрабутиламмония (ТВАТ) трифторметилирующим агентом, таким как, например, (трифторметил)триметилсилан, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например, при комнатной температуре в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 2 ч.
Промежуточные соединения формулы (XII) из вышеуказанной схемы реакции (6) можно получить из промежуточных соединений формулы (XIV), следуя известным из уровня техники методикам циклизации (этап реакции G). Прежде всего, указанное превращение можно осуществить путем обработки промежуточных соединений формулы (XIV) промежуточным соединением формулы (XIII), таким как, например, хлорацетилхлорид, в присутствии основания, такого как, например, NaOH или DIPEA, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, дихлорметан, или смеси инертных растворителей, таких как, например, вода и 1,4-диоксан или вода и THF. рН реакционной смеси можно довести до подходящего значения рН, например 10-11, путем добавления подходящего основания, такого как, например, NaOH. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например, от 0°C до 25°C в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 1-4 ч. Полученный в результате неочищенный остаток можно в дальнейшем подвергнуть циклизации с получение промежуточного соединения (XII) путем добавления подходящего основания, такого как, например, K2CO3, Cs2CO3, ^^диизопропилэтиламин или NaHCO3, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, ацетонитрил или DMF. Реакционную смесь перемешивают при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при от 25 до 80°C в течение 2-24 ч или, например, нагревание реакционной смеси при 140°C в течение 15-30 мин в микроволновом излучении. Данное превращение также можно осуществить в отсутствии основания в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, ацетонитрил или DMF, при подходящей температуре, как правило, от 40 до 110°C в течение периода, например 24-48 ч.
Фармокология.
Соединения по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемые композиции ингиби-руют ВАСЕ и, следовательно, могут быть пригодными при лечении или предупреждении болезни Альц-геймера (AD), умеренного когнитивного нарушения (MCI), угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом.
Настоящее изобретение относится к соединению в соответствии с общей формулой (I), его стерео-изомерной форме или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания для применения в качестве лекарственного препарата.
Настоящее изобретение также относится к соединению в соответствии с общей формулой (I), его стереоизомерной форме или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания для применения при лечении или предупреждении заболеваний или состояний, выбранных из группы, состоящей из AD, MCI, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения в соответствии с общей формулой (I), его стереоизомерной форме или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания для получения лекарственного препарата для лечения или предупреждения любых болезненных состояний, упомянутых выше в данном документе.
Ввиду полезности соединения формулы (I) представлен способ лечения субъектов, таких как теплокровные животные, в том числе людей, страдающих любым из заболеваний, указанных выше в данном документе, или способ предупреждения у субъектов, таких как теплокровные животные, в том числе людей, любого из заболеваний, указанных выше в данном документе.
Указанные способы включают введение, т.е. системное или местное введение, предпочтительно пе
роральное введение, эффективного количества соединения формулы (I), его стереоизомерной формы, его фармацевтически приемлемой соли присоединения или сольвата субъекту, такому как теплокровное животное, в том числе человеку.
Способ лечения может также включать введение активного ингредиента по схеме от одного до четырех приемов в день. В таких способах лечения соединения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно составлены до введения. Как описано в данном документе ниже, подходящие фармацевтические составы получают с помощью известных методик с применением хорошо известных и общедоступных ингредиентов.
Соединения по настоящему изобретению, которые могут быть подходящими для лечения или предупреждения болезни Альцгеймера или ее симптомов, можно вводить отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами. Комбинированная терапия включает введение единого дозированного фармацевтического состава, который содержит соединение формулы (I) и одно или несколько дополнительных терапевтических средств, а также введение соединения формулы (I) и каждого дополнительного терапевтического средства в своем собственном отдельном дозированном фармацевтическом составе. Например, соединение формулы (I) и терапевтическое средство можно вводить пациенту вместе в единой пероральной дозированной композиции, такой как таблетка или капсула, или каждое средство можно вводить по отдельности в пероральных дозированных составах.
Фармацевтические композиции.
В настоящем изобретении также представлены композиции для предупреждения или лечения заболеваний, при которых ингибирование бета-секретазы является благоприятным, таких как болезнь Альц-геймера (AD), умеренное когнитивное нарушение, угасание, деменция, деменция с тельцами Леви, синдром Дауна, деменция, ассоциированная с инсультом, деменция, ассоциированная с болезнью Паркинсо-на, и деменция, ассоциированная с бета-амилоидом. Указанные композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения в соответствии с формулой (I) и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Хотя активный ингредиент можно вводить отдельно, предпочтительно предоставлять его в виде фармацевтической композиции. Следовательно, в настоящем изобретении дополнительно представлена фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Носитель или разбавитель должны быть "приемлемыми" в том смысле, что они должны быть совместимыми с другими ингредиентами композиции и должны быть не вредны для получающих их пациентов.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. Терапевтически эффективное количество конкретного соединения в форме основания или в форме соли присоединения в качестве активного ингредиента комбинируют в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, который может иметь разнообразные формы в зависимости от формы препарата, который необходимо ввести. Желательно, чтобы данные фармацевтические композиции находились в единичной лекарственной форме, подходящей предпочтительно для системного введения, такого как пероральное, чрескожное или парентеральное введение; или для местного введения, такого как с помощью ингаляции, назального спрея, глазных капель или с помощью крема, геля, шампуня и т.п. Например, при получении композиций в виде перораль-ной лекарственной формы можно использовать любую общепринятую фармацевтическую среду, такую как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п., в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазывающие вещества, связующие вещества, средства для улучшения распадаемости и т.п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Благодаря простоте их введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные пероральные единичные лекарственные формы, в случае которых несомненно используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель будет, как правило, по меньшей мере, в значительной степени содержать стерильную воду, хотя может включать и другие ингредиенты, например, для улучшения растворимости. Например, могут быть получены растворы для инъекций, в которых носитель содержит физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и раствора глюкозы. Также могут быть получены суспензии для инъекций, в случае которых могут быть использованы подходящие жидкие носители, суспендирующие средства и т.п. В композициях, подходящих для чрескожного введения, носитель необязательно содержит средство, усиливающее проникновение, и/или подходящее смачиваемое средство, необязательно в комбинации с подходящими добавками любой природы в минимальных пропорциях, при этом добавки не оказывают никаких существенных вредных воздействий на кожу. Указанные добавки могут облегчать нанесение на кожу и/или могут быть полезными при получении необходимых композиций. Данные композиции можно наносить различными путями, например в виде трансдермального пластыря, точечно или в виде мази.
Для простоты введения и равномерности дозирования особенно предпочтительным является составление вышеупомянутых фармацевтических композиций в единичной лекарственной форме. Единичная лекарственная форма, как используется в описании и формуле изобретения в данном документе, от
носится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок, причем каждая единица содержит предварительно определенное количество активного ингредиента, рассчитанное так, чтобы получить необходимый терапевтический эффект совместно с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных лекарственных форм являются таблетки (в том числе делимые или покрытые таблетки), капсулы, пилюли, пакеты с порошком, облатки, растворы или суспензии для инъекций, чайные ложки, столовые ложки и т.п. и их отдельные множества.
Точная дозировка и частота введения зависят от конкретного применяемого соединения формулы (I), конкретного состояния, лечение которого осуществляют, тяжести состояния, лечение которого осуществляют, возраста, веса, пола, степени тяжести расстройства и общего физического состояния конкретного пациента, а также от другой лекарственной терапии, которую может получать индивидуум, как хорошо известно специалисту в данной области. Более того, очевидно, что указанное эффективное суточное количество можно снижать или увеличивать в зависимости от ответа субъекта, подвергаемого лечению, и/или в зависимости от оценки врача, назначающего соединения по настоящему изобретению.
В зависимости от способа введения фармацевтическая композиция будет содержать от 0,05 до 99 вес.%, предпочтительно от 0,1 до 70 вес.%, более предпочтительно от 0,1 до 50 вес.% активного ингредиента и от 1 до 99,95 вес.%, предпочтительно от 30 до 99,9 вес.%, более предпочтительно от 50 до 99,9 вес.% фармацевтически приемлемого носителя, при этом все процентные содержания основываются на общем весе композиции.
Данные соединения можно применять для системного введения, такого как пероральное, чрескож-ное или парентеральное введение, или для местного введения, такого как с помощью ингаляции, назального спрея, глазных капель или с помощью крема, геля, шампуня или т.п. Соединения преимущественно являются перорально вводимыми. Точная дозировка и частота введения зависят от конкретного применяемого соединения в соответствии с формулой (I), конкретного состояния, лечение которого осуществляют, тяжести состояния, лечение которого осуществляют, возраста, веса, пола, степени тяжести расстройства и общего физического состояния конкретного пациента, а также другой лекарственной терапии, которую может получать индивидуум, что хорошо известно специалистам в данной области. Более того, очевидно, что указанное эффективное суточное количество можно снижать или увеличивать в зависимости от ответа субъекта, подвергаемого лечению, и/или в зависимости от оценки врача, назначающего соединения по настоящему изобретению.
Количество соединения формулы (I), которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения разовой лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от заболевания, лечение которого осуществляют, вида млекопитающего и конкретного способа введения. Однако, в качестве общего руководства подходящие стандартные дозы для соединений по настоящему изобретению могут предпочтительно содержать, например, от 0,1 мг до приблизительно 1000 мг активного соединения. Предпочтительная стандартная доза составляет от 1 мг до приблизительно 500 мг. Более предпочтительная стандартная доза составляет от 1 мг до приблизительно 300 мг. Еще более предпочтительно стандартная доза составляет от 1 мг до приблизительно 100 мг. Такие стандартные дозы можно вводить чаще одного раза в день, например 2, 3, 4, 5 или 6 раз в день, но предпочтительно 1 или 2 раза в день, чтобы общая дозировка для взрослого человека весом 70 кг находилась в диапазоне от 0,001 до приблизительно 15 мг/кг веса субъекта за введение. Предпочтительная дозировка составляет от 0,01 до приблизительно 1,5 мг/кг веса субъекта за введение, и такая терапия может длиться в течение нескольких недель или месяцев, а в некоторых случаях в течение нескольких лет. Однако следует понимать, что определенный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, включающих активность определенного используемого соединения; возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания индивидуума, подвергаемого лечению; время и путь введения; скорость выведения; другие лекарственные средства, которые были введены ранее; и тяжесть конкретного заболевания, терапию которого осуществляют, что хорошо понятно специалистам в данной области.
Типичной дозировкой может быть одна таблетка от 1 мг до приблизительно 100 мг или от 1 мг до приблизительно 300 мг, принимаемая один раз в день или несколько раз в день, или одна капсула или таблетка пролонгированного действия, принимаемая один раз в день и имеющая пропорционально более высокое содержание активного ингредиента. Эффект пролонгированного действия может быть обеспечен материалами капсулы, которые растворяются при различных значениях рН, с помощью капсул, которые медленно высвобождают лекарственное средство при осмотическом давлении, или с помощью любых иных известных средств с контролируемым высвобождением.
В некоторых случаях может понадобиться применение дозировок вне этих диапазонов, что будет очевидно специалистам в данной области. Кроме того, следует отметить, что клиницист или лечащий врач будет знать, как и когда начинать, прерывать, корректировать или завершать терапию в соответствии с ответом отдельного пациента.
В отношении композиций и способов, представленных выше, специалисту в данной области будет понятно, что предпочтительными соединениями для применения в каждом являются такие соединения, которые указаны как предпочтительные выше. Еще более предпочтительными соединениями для композиций и способов являются соединения, представленные в примерах ниже.
Экспериментальная часть.
Далее в настоящем документе выражение "т.пл." означает точка плавления, "водн." означает водный, "р.см." означает реакционная смесь, "к.т." означает комнатная температура, "DIPEA" означает N,N-диизопропилэтиламин, "DIPE" означает диизопропиловый эфир, "THF" означает тетрагидрофуран, "DMF" означает диметилформамид, "DCM" означает дихлорметан, "EtOH" означает этанол, "EtOAc" означает этилацетат, "АсОН" означает уксусная кислота, "iPrOH" означает изопропанол, "iPrNH2" означает изопропиламин, "MeCN" означает ацетонитрил, "МеОН" означает метанол, "Pd(OAc)2" означает диацетат палладия (II), "рац." означает рацемический, "насыщ." означает насыщенный, "SFC" означает сверхкритическая жидкостная хроматография, "SFC-MS" означает сверхкритическая жидкостная хроматогра-фия/масс-спектрометрия, "LC-MS" означает жидкостная хроматография/масс-спектрометрия, "GCMS" газовая хроматография/масс-спектрометрия, "HPLC" означает высокоэффективная жидкостная хроматография, "RP" означает обращенно-фазовая, "UPLC" означает сверхэффективная жидкостная хроматография, "Rt" означает время удерживания (в минутах), "[М+Н]+ означает протонированная масса свободного основания соединения, "DAST" означает трифторид диэтиламиносеры, "DMTMM" означает 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид, "HATU" означает O-(7-азабензотриазол-1-ил)-^^№,№тетраметилурония гексафторофосфат, "Xantphos" означает (9,9-диметил-9Н-ксантен-4,5-диил)бис[дифенилфосфин], "ТВАТ" означает трифенилдифторсиликат тетрабутиламмония, "TFA" означает трифторуксусная кислота, "Et2O" диэтиловый эфир, "DMSO" означает диметилсульфоксид, "MeCN" означает ацетонитрил. Для ключевых промежуточных соединений, как и для некоторых конечных соединений, абсолютную конфигурацию хиральных центров (обозначена как R и/или S) устанавливали посредством сравнения с образцами с известной конфигурацией или путем использования аналитических техник, пригодных для определения абсолютной конфигурации, таких как VCD (вибрационный круговой дихроизм) рентгеноструктурная кристаллография. Если абсолютная конфигурация хирального центра не известна, его произвольно обозначают R*.
А. Получение промежуточных соединений.
Пример А1. Получение промежуточного соединения 1
Триметилсилилцианид (30,7 мл, 230 ммоль) добавляли к перемешанному раствору 5-бром-2-фторацетофенона (25 г, 115 ммоль) и NH4Cl (18,5 г, 345 ммоль) в NH3/MeOH (150 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Затем растворитель выпарили in vacuo и остаток поглощали EtOAc (80 мл). Твердое вещество фильтровали и фильтрат выпаривали in vacuo с получением промежуточного соединения 1 (количественный выход 27,9 г), которое использовали на следующем этапе без дополнительной очистки.
Пример А2. Получение промежуточного соединения 2
Промежуточное соединение 1 (27 г, 111 ммоль) растворяли в HCl (37% в Н2О) (130 мл) и уксусной кислоте (130 мл) и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 16 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь концентрировали in vacuo. Добавляли воду и водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Водный слой ощелачивали водным раствором NaOH (25%) до рН 7. Водный слой частично концентрировали in vacuo. Смесь охлаждали в ледяной бане и осадок отфильтровывали, промывали водой, а затем Et2O и высушивали in vacuo с получением промежуточного соединения 2 (18 г, выход 62%) в виде белого твердого вещества.
Пример A3. Получение промежуточного соединения 3
Промежуточное соединение 2 (15 г, 57,2 ммоль) растворяли в МеОН (300 мл). Добавляли H2SO4 (330 мл) и реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 48 ч. Концентрировали р. см. in vacuo. Добавляли воду и ощелачивали раствор до рН 8 с помощью насыщенного водного раствора NHCO3. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Отделяли органический слой, сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 3 (15 г, выход 95%).
Промежуточное соединение 3 (10 г) разделяли на соответствующие энантиомеры с помощью препаративной SFC на (Chiralpak(r) Daicel AD 30x250 мм). Подвижная фаза (СО2, МеОН с 0,2% iPrNH2) с получением промежуточного соединения 4 (4,2 г, выход 42%).
Пример А4. Получение промежуточного соединения 4
Добавляли THF (150 мл) к раствору промежуточного соединения 4 (40 г, 145 ммоль) в NaOH (1М в H2O, 360 мл). Смесь перемешивали при к.т. в течение 4 ч. Смесь концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 5 (42 г) в виде белого твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки в следующем этапе реакции.
Пример А6. Получение промежуточного соединения 6
К охлажденному раствору промежуточного соединения 5 (41,3 г, 145 ммоль) в H2O (150 мл) добавляли по каплям раствор хлорацетилхлорида (24 мл, 304,5 ммоль) в 1,4-диоксане (75 мл). Одновременно добавляли NaOH (5M в Н2О, 29 мл) для доведения рН до 10-11. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали с помощью Et2O. Далее водный слой подкисляли HCl (6М в Н2О) до рН 2. Осажденное белое твердое вещество собирали путем фильтрации, промывали Н2О и высушивали с получением промежуточного соединения 6 (42 г, выход 86%).
Пример А7. Получение промежуточного соединения 7
Промежуточное соединение 6 (42 г, 124 ммоль) и NaHCO3 (20,8 г, 248 ммоль) растворяли в DMF (1000 мл), и реакционную смесь перемешивали при 80°C в течение 3 ч. Смесь частично концентрировали при пониженном давлении, охлаждали до к.т. и затем фильтровали через диатомовую землю. Фильтрат концентрировали in vacuo и остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: MeOH/DCM от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 7 (36 г, выход 96%).
Пример А8. Получение промежуточного соединения 8
К раствору промежуточного соединения 7 (11,6 г, 38,5 ммоль) в THF (117 мл) добавляли ТВАТ (2,08 г, 3,85 ммоль). Затем (трифторметил)триметилсилан (12,5 мл, 84,6 ммоль) добавляли по каплям и р.см. перемешивали при к.т. в течение 20 мин. Смесь погашали водным NaCl и экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали in vac-uo с получением промежуточного соединения 8 (14 г, выход 98%) в виде смеси цис-и транс-изомеров, которую без дополнительной очистки использовали в следующем этапе.
Пример А9. Получение промежуточного соединения 9
Промежуточное соединение 8 (14 г, 37,6 ммоль) растворяли в DCM (600 мл) и охлаждали до 0°C. Затем по каплям добавляли тионилхлорид (11,2 мл, 150 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°C и затем добавляли пиридин (18,2 мл, 225,7 ммоль). Через 30 минут реакционную смесь подвергали гидролизу водным раствором 1N HCl и затем экстрагировали с помощью DCM. Органические слои разделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в ме-таноле/DCM от 0/100 до 2/98). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 9 (6 г, выход 41%, смесь диастереоизомеров).
Промежуточное соединение 9 (7 г, 17,9 ммоль) и цинк-медную пару (8,55 г, 66,3 ммоль) перемешивали в уксусной кислоте (420 мл) при к.т. в течение 16 ч. Реакционную смесь фильтровали, промывали DCM и концентрировали in vacuo. Добавляли раствор гидроксида аммония (28% в воде) и DCM и смесь
Пример А10. Получение промежуточного соединения 10
перемешивали при к.т. в течение 1 ч. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенные органические слои сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo с получением промежуточного соединения 10 (6 г, выход 99%) в виде белого порошка. Пример All. Получение промежуточного соединения 11
Добавляли P2S5 (5,95 г, 26,8 ммоль) к раствору промежуточного соединения 10 (6 г, 17,9 ммоль) в THF (145 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 90 мин. Затем смесь охлаждали до к.т., отфильтровывали и органические растворители выпаривали in vacuo с получением промежуточного соединения 11 (5,9 г), которое использовали без дополнительной очистки на следующем этапе.
Пример А12. Получение промежуточного соединения 12
Промежуточное соединение 11 (5,9 г, 16,8 ммоль) растворяли в 7N аммиаке в МеОН (390 мл), и реакционную смесь перемешивали при 80°C в течение 2 ч. Растворитель выпаривали и неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в мета-ноле/DCM от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 12 (4,04 г, выход 72%).
Пример А13. Получение промежуточного соединения 13
Промежуточное соединение 12 (3,6 г, 10,7 ммоль) объединяли с NaN3 (1,75 г, 26,9 ммоль), CuI (2,56 г, 13,4 ммоль) и Na2CO3 (2,28 г, 21,5 ммоль) в DMSO (153 мл), и реакционную смесь дегазировали. После этого добавляли ^№-диметилэтилендиамин (2 мл, 18,8 ммоль), и смесь нагревали при 110°C в течение приблизительно 3 ч до завершения реакции. Реакционную смесь концентрировали in vacuo. Добавляли 7N аммиак в МеОН, и смесь перемешивали в течение ночи. Образовавшийся осадок отфильтровывали, и фильтрат концентрировали in vacuo. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 30/70). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 13 (1,52 г, выход
52%).
Пример А14. Получение промежуточного соединения 14
Растворяли 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (0,218 г, 1,42 ммоль) в МеОН (30 мл) и добавляли DMTMM (0,456 г, 1,548 ммоль). После перемешивания смеси в течение 5 мин добавляли раствор промежуточного соединения 13 (0,35 г, 1,29 ммоль) в МеОН (20 мл) при 0°C, а затем перемешивали смесь в течение 16 ч при комнатной температуре. Растворитель выпаривали in vacuo. Неочищенный материал очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo. Остаток суспендировали из DIPE/гептанов, фильтровали и высушивали в высоком вакууме с получением промежуточного соединения 14 (0,2 66 г, выход 51%) в виде белого твердого вещества.
Пример А15. Получение промежуточного соединения 15
Промежуточное соединение 15 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере А14. Начиная с промежуточного соединения 13 (0,35 г, 1,29 ммоль), промежуточное соединение 15 получали в виде белого твердого вещества (0,362 г, выход 71%).
Пример А16
Получение промежуточного соединения 16
1-(5-бром-2-фтор-фенил)этанон [(CAS 198477-89-3), 70 г, 322 ммоль) и оксид селена (71,6 г, 645 ммоль) растворяли в пиридине (52 0 мл). Реакционную смесь перемешивали при 100°C в течение 2 ч. Растворитель выпаривали и добавляли водный 1N раствор HCl. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои сушили (Mg2SO4), фильтровали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 16 (62 г, выход 78%), которое использовали в неочищенном виде в следующей реакции.
Пример А17. Получение промежуточного соединения 17
Хлорид тионила (37 мл, 510 ммоль) добавляли по каплям к перемешанному раствору промежуточного соединения 16 (42 г, 170 ммоль) в МеОН (456 мл) при 0°C. Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 18 ч. Растворитель выпаривали in vacuo, и остаток разделяли между насыщенным Na2CO3 и DCM. Органический слой отделяли, сушили (Mg2SO4), фильтровали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 17 (30 г, выход 68%) в виде желтого масла.
Пример А18. Получение промежуточного соединения 18
Изопропоксид титана(1У) (153 мл, 522 ммоль) добавляли к перемешанной смеси промежуточного соединения 17 (68 г, 261 ммоль) и ^)-2-метил-2-пропансульфинамида (37,9 г, 313 ммоль) в н-гептане (1000 мл). Смесь перемешивали при 80°C в течение 1,5 ч. Смесь охлаждали до к.т. и добавляли ледяную воду. Полученную в результате смесь фильтровали через прокладку из диатомовой земли и промывали н-гептаном. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 18 (87,9 г, выход 86%), которое использовали без дополнительной очистки в следующей реакции.
Пример А19. Получение промежуточного соединения 19
Бромид этилмагния (3М, 8 6 мл, 259 ммоль) по каплям добавляли к перемешанному раствору промежуточного соединения 18 (72,6 г, 185 ммоль) в DCM (1154 мл) при -78°C в атмосфере азота. Смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем погашали реакцию путем добавления насыщ. водн. раствора NH4Cl с последующим добавлением воды. Смесь экстрагировали с помощью DCM и промывали водой. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворители in vacuo. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: гептаны/EtOAc от 90/10 до 70/30). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 19 (25,56 г, выход 33%) в виде желтого масла.
Пример А20. Получение промежуточного соединения 20
2М водн. раствор NaOH (91 мл, 181,8 ммоль) добавляли к раствору неочищенного промежуточного соединения 19 (25,6 г, 60,6 ммоль) в МеОН (68 мл). Полученную в результате смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 5 ч. Смесь охлаждали до к.т. и затем разделяли между водой и EtOAc. Водный слой отделяли и нейтрализовали путем добавления 1М водн. раствора HCl, а затем экстрагировали с помощью DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворители in vacuo. Остаток суспендировали из DIPE и осадок отфильтровывали и сушили in vacuo с получением промежуточного соединения 20 (17,5 г, выход 76%, смесь диастереомеров) в виде белого твердого вещества.
Пример А21. Получение промежуточного соединения 21
мл) при комнатной температуре в течение 15 мин. К полученной в результате суспензии добавляли DIPE и осадок отфильтровывали и высушивали in vacuo с получением промежуточного соединения 21 (15,1 г, колич. выход, рацемат) в виде белого твердого вещества.
Пример А22. Получение промежуточного соединения 22
К охлажденному раствору промежуточного соединения 21 (15,1 г, 43,2 ммоль) и DIPEA (35 мл, 203,7 ммоль) в DCM (350 мл) добавляли по каплям хлорацетилхлорид (5,6 мл, 70,6 ммоль) при 0°C. После перемешивания при 0°C в течение 15 мин реакционную смесь нагревали до к.т. и подкисляли HCl (2М в H2O, 10 мл). Смесь экстрагировали с помощью EtOAc и промывали солевым раствором. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворители in vacuo. Неочищенный продукт растирали с DIPE и осадок отфильтровывали и высушивали in vacuo с получением промежуточного соединения 22 (8,04 г, выход 53%) в виде коричневого твердого вещества.
Пример А23. Получение промежуточного соединения 23
Промежуточное соединение 23 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере 7. Начиная с промежуточного соединения 22 (8 г, 22,69 ммоль), промежуточное соединение 23 получали в виде белого твердого вещества (4,5 г, выход 63%).
Пример А24. Получение промежуточного соединения 24
Промежуточное соединение 24 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере 8. Начиная с промежуточного соединения 23 (2,34 г, 7,4 ммоль), промежуточное соединение 24 получали в виде масла (1,9 г, выход 66%).
Пример А25. Получение промежуточного соединения 25
Промежуточное соединение 25 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере 9. Начиная с промежуточного соединения 2 4 (1,9 г, 4,92 ммоль), промежуточное соединение 25 получали в виде бледно-желтого твердого вещества (1,58 г, выход 79%).
Пример А26. Получение промежуточного соединения 26
Промежуточное соединение 25 (1,4 г, 3,46 ммоль) перемешивали в уксусной кислоте (42 мл) при 100°C в течение 5 мин. Добавляли цинк (0,91 г, 13,8 ммоль), и смесь перемешивали при 100°C в течение 1 ч. Дополнительный цинк (0,452 г, 6,9 ммоль) добавляли, и далее смесь перемешивали при 100°C. Спустя еще один час добавляли новую порцию цинка (0,226 г, 3,46 ммоль), и смесь перемешивали при 100°C в течение 2 ч. И наконец, дополнительно добавляли цинк (0,91 г, 13,8 ммоль), и смесь перемешивали при 100°C в течение 1 ч. После охлаждения реакционную смесь фильтровали, промывали DCM и концентрировали in vacuo. Добавляли раствор гидроксида аммония (28% в воде), водн. насыщ. раствор NaHCO3 и воду. Водный слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенные органические слои сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали in vacuo с получением промежуточного соединения 26 (1,26 г, выход 98%) в виде твердого белого вещества.
Пример А27. Получение промежуточного соединения 27
Промежуточное соединение 27 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере 11. Начиная с промежуточного соединения 26 (1,26 г, 3,4 ммоль), промежуточное соединение 27 получали в виде белого твердого вещества (1,09 г, выход 83%).
Пример А28. Получение промежуточного соединения 28 и промежуточного соединения 29
Промежуточное соединение 27 (1 г, 2,59 ммоль) растворяли в 7N аммиаке в МеОН (60 мл), и реакционную смесь перемешивали при 130°C в течение 15 мин в микроволновом излучении. Реакционную смесь концентрировали in vacuo и добавляли новую порцию 7N аммиака в МеОН (30 мл). Реакционную смесь перемешивали при 130°C в течение еще 15 мин в микроволновом излучении. Растворитель выпаривали, и неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 2/98). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 28 (0,29 г, выход 30%, цис-рацемат) в виде белого твердого вещества и промежуточного соединения 29 (0,27 г, выход 30%) в виде масла.
Пример А29. Получение промежуточного соединения 30
Промежуточное соединение 30 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере 13. Начиная с промежуточного соединения 29 (0,189 г, 0,542 ммоль), промежуточное соединение 30 получали в виде масла (0,16 г), которое использовали без дополнительной очистки в следующей реакции.
Пример АЗО. Получение промежуточного соединения 31
Промежуточное соединение 31 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере А14. Начиная с промежуточного соединения 30 (0,09 г, 0,315 ммоль), промежуточное соединение 31 получали в виде грязно-белого твердого вещества (0,028 г, выход 21%).
Пример А31. Получение промежуточного соединения 32
Промежуточное соединение 12 (0,4 г, 1,194 ммоль), 5-пиримидинилбороновую кислоту (0,296 г, 2,387 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (0,207 г, 0,179 ммоль) растворяли в смеси 1,4-диоксана (18 мл) и водного NaHCO3 (насыщ. раствор, 8,5 мл). Полученную в результате смесь продували N2 и затем нагревали при 70°C в течение 2 ч. Далее реакционную смесь разбавляли водой и затем экстрагировали с помощью DCM (3х). Объединенный органический слой промывали солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и выпаривали растворители in vacuo. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель, 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного продукта 32 (0,3 г, выход 7 5%) в виде белой пены.
Пример А32. Получение промежуточного соединения 33
Начиная с 3-бромацетофенона (CAS 2142-63-4) промежуточное соединение 33 синтезировали в соответствии с теми же схемами реакции, которые описаны для промежуточного соединения 12 в примерах А1-А12.
Промежуточное соединение 34 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в
Пример АЗЗ. Получение промежуточного соединения 34
Промежуточное соединение 13 (2,78 г, 10,25 ммоль) растворяли в EtOAc (70 мл) и добавляли палладий на угле (10%) (1,09 г) и тиофен (0,4% раствор в THF, 14 мл). Смесь подвергали гидрогенизации при к. т. и атмосферном давлении в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывали и растворители выпаривали in vacuo. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силика-гель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 10/90). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением промежуточного соединения 35 (0,478 г, выход 17%).
В. Получение конечных соединений.
Пример В1. Получение соединения: 1 №{3-[(2К*,3К)-5-шино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-дигдиро-2Н-1,4-оксазин-З -ил] -4-фторфенил} -5-метоксипиразин-2-карбоксамида
Промежуточное соединение 14 (0,154 г, 0,378 ммоль) растворяли в EtOAc (5 мл) и добавляли палладий на угле (10%) (0,04 г, 0,038 ммоль) и тиофен (0,4% раствор в THF, 0,5 мл, 0,026 ммоль). Смесь подвергали гидрогенизации при к.т. и атмосферном давлении в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывали и растворители выпаривали in vacuo. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 2/98). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo. Остаток суспендировали из DIPE, фильтровали и высушивали в высоком вакууме с получением соединения 1 (0,067 г, выход 43%).
Пример В2. Получение соединения 2: №{3-[(2К*,3К)-5-амино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-З -ил] -4-фторфенил} -5-фторпиридин-2-карбоксамида
Соединение 2 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере В1. Начиная с промежуточного соединения 15 (0,251 г, 0,0637 ммоль), соединение 2 получали в виде белого твердого вещества (0,114 г, выход 45%).
Пример В3. Получение соединения 3: цис-рац^-{3-[5-амино-2-(дифторметил)-3-этил-3,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-ил]-4-фторфенил}-5-метоксипиразин-2-карбоксамида
Промежуточное соединение 31 (0,028 г, 0,066 ммоль) растворяли в МеОН (1,3 мл) и подвергали гидрогенизации в реакторе H-cube (1 мл/мин, 10% Pd/C картридж, полный Н2 режим), сперва при 25°C, затем при 50°C и наконец при 80°C. Растворитель выпаривали in vacuo. Неочищенный продукт выпаривали с помощью препаративной HPLC (C18 XBridge 19x100 5 мкм), подвижная фаза (градиент от 80% 0,1% NH4CO3H/NH4OH, pH 9, раствор в воде, 20% CH3CN до 0% 0,1% NH4CO3H/NH4OH, pH 9, раствор в воде, 100% CH3CN). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo с получением соединения 3 (0,0032 г, выход 11%).
Пример В4. Получение соединения 4: (5Я,6Я*)-6-(дифторметил)-5-(2-фтор-5-пиримидин-5-илфенил)-5 -метил-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-З -амина
Соединение 4 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере В1. Начиная с промежуточного соединения 32 (0,155 г, 0,464 ммоль), получали соединение 4 (0,018 г, выход
12%).
Пример В5. Получение соединения 5: (5Я,6Я*)-6-(дифторметил)-5-метил-5-(3-пиримидин-5
илфенил)-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина
Н2Ул
N О j^^Ji^W ^ CHF2
Соединение 5 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере В1. Начиная с промежуточного соединения 34 (0,124 г, 0,392 ммоль), соединение 5 получали в виде белого твердого вещества (0,04 г, выход 32%).
Пример В6. Получение соединения 6: N-{3-[ (2К*,3Я)-5-амино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-З -ил] -4-фторфенил} -5-хлорпиридин-2-карбоксамида
5-хлорпиридин-2-карбоновую кислоту (63 мг, 0,4 ммоль) растворяли в МеОН (7 мл) и добавляли DMTMM (129 мг, 0,44 ммоль). После перемешивания смеси в течение 5 мин добавляли раствор промежуточного соединения 35 (100 мг, 0,366 ммоль) в МеОН (8 мл) при 0°C и перемешивали смесь в течение 16 ч при комнатной температуре. Растворитель выпаривали in vacuo. Неочищенный материал очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/DCM от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали in vacuo. Остаток растирали с DIPE, фильтровали и высушивали в высоком вакууме с получением соединения 6 (0,116 г, выход 74%) в виде белого твердого вещества.
Пример В7. Получение соединения 7: N-{3-[ (2Я*,3Я)-5-амино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-З -ил] -4-фторфенил} -5-цианопиридин-2-карбоксамида
Соединение 7 синтезировали в соответствии с тем же подходом, который описан в примере В6. Начиная с промежуточного соединения 35 (100 мг, 0,4 ммоль), получали соединение 7 (110 мг, выход 75%).
Соединения 1-7 в табл. 1 представляют собой соединения, полученные согласно одному из вышеперечисленных примеров. "Прим. №" относится к номеру примера, согласно протоколу которого синтезировали соединение. "№ соед." означает номер соединения. С2(Я*) означает, что абсолютная конфигурация при С2 является либо R, либо S, но пока неизвестна.
С. Аналитическая часть. LCMS.
Для исследования соединений по настоящему изобретению с помощью (LC)MS применяли следующие способы. Способ 1.
Измерение с помощью LC выполняли с использованием системы Acquity UPLC (Waters), включающей насос для двухкомпонентных смесей, дозатор, нагреватель колонки (установленный на 55°C), диодно-матричный детектор (DAD) и колонку, как определено в соответствующих способах ниже. Поток из колонки разделялся для MS-спектрометра. MS-детектор был оснащен источником ионизации электрораспылением. Масс-спектры получали сканированием от 100 до 1000 за 0,18 с с использованием времени выдержки 0,02 с. Напряжение капиллярной иглы составляло 3,5 кВ, и температуру источника поддерживали при 140°C. В качестве газа-распылителя применяли азот. Сбор и обработку данных проводили с помощью системы обработки данных Waters-Micromass MassLynx-Openlynx.
Обращенно-фазовую UPLC (сверхпроизводительную жидкостную хроматографию) проводили на колонке С18 с мостиковым гибридом этилсилоксан/диоксид кремния (ВЕН) (1,7 мкм, 2,1x50 мм; Waters Acquity) со скоростью потока 0,8 мл/мин. Две подвижные фазы (10 мМ ацетата аммония в Н20/ацетонитриле 95/5; подвижная фаза В: ацетонитрил) применяли для соблюдения условия градиента от 95% А и 5% В до 5% А и 95% В за 1,3 мин при удерживании в течение 0,7 мин. Используемый объем вводимой пробы составлял 0,75 мкл.
Напряжение на конусе составляло 10 В для способа положительной ионизации и 20 В для способа отрицательной ионизации.
Способ 2.
Измерение с помощью UPLC (сверхэффективной жидкостной хроматографии) проводили с применением системы Acquity UPLC (Waters), включающей дозатор, насос для двухкомпонентных смесей с дегазатором, четырехколоночный термостат, диодно-матричный детектор (DAD) и колонку, как определено в соответствующих способах. MS-детектор был оснащен двойным источником ионизации ESCI (ионизация электрораспылением в сочетании с химической ионизацией при атмосферном давлении). В качестве газа-распылителя применяли азот. Температуру источника поддерживали при 140°C. Сбор и обработку данных проводили с помощью программного обеспечения MassLynx-Openlynx.
Обращено-фазовую UPLC (сверхэффективную жидкостную хроматографию) проводили на RRHD Eclipse Plus-C18 (1,8 мкм, 2,1x50 мм) от Agilent со скоростью потока 1,0 мл/мин при 50°C без разделения для MS-детектора. Применяли следующие условия градиента: от 95% А (0,5 г/л раствора ацетата аммо-ния+5% ацетонитрила), 5% В (ацетонитрила) до 40% А, 60% В за 3,8 мин, до 5% А, 95% В за 4,6 мин, удерживание 5,0 мин. Объем вводимой пробы 2 мкл. Масс-спектры низкого разрешения (одноквадру-польный SQD-детектор) получали сканированием от 100 до 1000 за 0,1 с с применением межканальной задержки 0,08 с. Напряжение капиллярной иглы составляло 3 кВ. Напряжение на конусе составляло 25 В для режима положительной ионизации и 30 В для режима отрицательной ионизации.
Способ 3.
Измерения с помощью LC осуществляли с применением системы Acquity UPLC (Waters), включающей насос для двухкомпонентных смесей, дозатор, нагреватель колонки (установленный на 55°C), диодно-матричный детектор (DAD) и колонку, как определено в соответствующих способах ниже. Поток из колонки разделялся для MS-спектрометра. MS-детектор был оснащен источником ионизации электрораспылением. Масс-спектры получали сканированием от 100 до 1000 за 0,18 с с использованием времени выдержки 0,02 с. Напряжение капиллярной иглы составляло 3,5 кВ, и температуру источника поддерживали при 140°C. В качестве газа-распылителя применяли азот. Сбор и обработку данных проводили с помощью системы обработки данных Waters-Micromass MassLynx-Openlynx.
Обращенно-фазовую UPLC (сверхэффективную жидкостную хроматографию) проводили на колонке С18 с мостиковым гибридом этилсилоксан/диоксид кремния (ВЕН) (1,7 мкм, 2,1x50 мм; Waters Ac-quity) со скоростью потока 0,8 мл/мин Две подвижные фазы (10 мМ ацетата аммония в Н20/ацетонитриле 95/5; подвижная фаза В: ацетонитрил) применяли для соблюдения условия градиента от 95% А и 5% В до 5% А и 95% В за 1,3 мин при удержании в течение 0,3 мин. Используемый объем вводимой пробы составлял 0,5 мкл. Напряжение на конусе составляло 10 В для режима положительной ионизации и 20 В для режима отрицательной ионизации.
Точки плавления.
Значения представляют собой либо пиковые значения, либо диапазоны плавления, и их получали с погрешностями эксперимента, которые обычно связаны с этим аналитическим способом. DSC823e (указан DSC в табл. 2)
Для ряда соединений определяли точки плавления с помощью DSC823e (Mettler-Toledo). Точки плавления измеряли с градиентом температуры 30°C/мин. Максимальная температура составляла 400°C.
Таблица 2
№ соед-
[М+Н]4
Способ
Точка плавления
0, 75
410
227,3°С
0, 76
397
205, 7°С
1, 98
424
н.о.
0, 59
337
н.о.
0, 55
319
н.о.
0, 89
413
203, 9°С
0, 87
404
230, 9°С
Данные анализа: Rt означает время удерживания (в минутах), [М+Н]+ означает протонированную массу соединения, причем способ относится к способу, который применяли для (LC)MS, н.о. означает не определяли Оптические вращения.
Оптические вращения измеряли на поляриметре Perkin-Elmer 341 с натриевой лампой и представляли следующим образом: [a]^t C (с г/100 мл, растворитель).
Таблица 3
Данные анализа - значения оптического вращения для энантиомерно чистых соединений
соед.
an (°)
Длина волны
(нм)
Концентрация вес./об. %
Растворитель
Темп.
(°С)
+121,95
365
0,205
DMF
+11,85
589
0, 27
DMF
ЯМР.
Для ряда соединений спектры 1Н ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker DPX-360, на спектрометре Bruker DPX-400 или на спектрометре Bruker Avance 600 со стандартными последовательностями импульсов, действующими при 360, 400 и 600 МГц соответственно, с использованием хлороформа-d (дейтерированного хлороформа, CDCl3) или DMS0-d6 (дейтерированного DMSO, диметил^6 сульфокси-да) в качестве растворителей. Химические сдвиги (8) регистрировали в частях на миллион (ppm) относительно тетраметилсилана (TMS), который использовали в качестве внутреннего стандарта.
Таблица 4
Результат ЯМР
ЯМР (360 МГц, DMSO-de) 5 ч/млн 1,52 (с, ЗН) , 3,93-4,01 (м, 1Н) , 4,02 (с, ЗН) , 4,10 (д, J=15, 9 Гц, 1Н), 4,15 (д, J=15,9 Гц, 1Н) , 5,64 (тд, J=54,0, 4,4 Гц, 1Н), 5,80 (шир.с, 2Н), 7,11 (дд, J=12,l, 8,8 Гц, 1Н) , 7,80 (ддд, J=8,8, 4,1, 2,7 Гц, 1Н) , 8,04 (дд, J=7,3, 2,8 Гц, 1Н) , 8,42 (д, J=l,3 Гц, 1Н), 8,88 (д, J=l,3 Гц, 1Н), 10,44 (с, 1Н) ,
ЯМР (360 МГц, DMSO-d6) 5 ч/млн 1,52 (с, ЗН) , 3,93-4,01 (м, 1Н) , 4,02 (с, ЗН) , 4,10 (д, J=16, 0 Гц, 1Н), 4,15 (д, J=16,0 Гц, 1Н), 5,65 (тд, J=54,3, 4,3 Гц, 1Н), 5,81 (шир.с, 2Н), 7,11 (дд, J=12,l, 8,8 Гц, 1Н), 7,82 (дт, J=8,5, 3,6 Гц, 1Н) , 7,97 (дд, J=8,8, 2,9 Гц, 1Н), 8,03 (тд, J=6, 9, 2,7 Гц, 1Н), 8,22 (дд, J=8,8, 4,8 Гц, 1Н) , 8,74 (д, J=2,9 Гц, 1Н), 10,55 (шир.с, 1Н)
Н1 ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) б ч/млн 0,77 (т J=7,4 Гц, ЗН), 1, 97-2, 07 (м, 1Н) , 2,13-2,26 (м. 1Н), 4,07 (с, ЗН), 4,32 (шир.с, 2Н) , 4,18 (дд J=15,7, 1,2 Гц, 1Н), 4,33 (дд, J=15,6, 1,5 Гц, 1Н) 4,36 (ддт, J=21,0, 8,4, 2,2, 2,2 Гц, 1Н), 5,46 (тд J=54,0, 2,6 Гц, 1Н), 7,07 (дд, J=ll,6, 8,8 Гц, 1Н) 7,83 (дд, J=6,7, 2,8 Гц, 1Н) , 8,07 (ддд, J=8,8 4,2, 2,9 Гц, 1Н) , 8,16 (д, J=l,4 Гц, 1Н) , 9,02 (д. J=l,2 Гц, 1Н), 9,56 (шир.с, 1Н)
ЯМР (360 МГц, DMSO-d6) 5 ч/млн 1,56 (с, ЗН) 4,05-4,13 (м, 1Н), 4,11-4,17 (м, 2Н) , 5,80 (тд J=53,8, 4,0 Гц, 1Н), 5,90 (шир.с, 2Н) , 7,31 (дд. J=12,l, 8,4 Гц, 1Н), 7,76 (ддд, J=8,3, 4,5, 2,6 Гц 1Н), 8,10 (дд, J=7,5, 2,4 Гц, 1Н), 9,08 (с, 2Н) 9,20 (с, 1Н)
ЯМР (360 МГц, DMSO-d6) 5 ч/млн 1,57 (с, ЗН) , 3,85 (ддд, J=15,2, 7,5, 4,8 Гц, 2Н), 4,11 (д, J=15,7 Гц, 1Н), 4,26 (д, J=15,7 Гц, 1Н) , 5,24-5,64 (м, 1Н), 5,78 (шир.с, 2Н), 7,43-7,53 (м, 2Н), 7,647,74 (м, 1Н), 9,10 (с, 2Н), 9,20 (с, 1Н)
ЯМР (360 МГц, DMSO-d6) 5 ч/млн 1,53 (с, ЗН) , 4,00 (ддд, J=14,2, 10,0, 4,0 Гц, 1Н) 4,07-4,22 (м, 2Н) 5,47-5,81 (м, 1Н) 5,82 (с, 2Н) 7,12 (дд, J=12,l, 8,8 Гц, 1Н) 7, 78-7, 88 (м, 1Н) 8,04 (дд, J=7,l, 2,7 Гц, 1Н) 8,11-8,18 (м, 1Н) 8,20 (дд, J=8,4, 2,6 Гц, 1Н) 8,79 (д, J=l,8 Гц, 1Н) 10,61 (с, 1Н)
ЯМР (360 МГц, DMSO-d6) 5 ч/млн 1,53 (с, ЗН) , 3, 90-4, 06 (м, 1Н), 4,06-4,21 (м, 2Н) , 5,47-5,81 (м, 1Н), 5,81 (шир.с, 2Н), 7,13 (дд, J=12,l, 8,8 Гц, 1Н) 7, 76-7, 90 (м, 1 Н) 8,07 (дд, J=7,3, 2,9 Гц, 1Н) 8,28 (д, J=8,4 Гц, 1Н) 8,58 (дд, J=8,2, 2,0 Гц, 1Н) 9,20 (д, J=l,8 Гц, 1Н) 10,78 (с, 1Н)
D. Фармакологические примеры.
Соединения, представленные в настоящем изобретении, являются ингибиторами АРР-расщепляющего по бета-сайту фермента 1 (ВАСЕ1). Полагают, что ингибирование ВАСЕ1, аспарагино-вой протеазы, является существенным для лечения болезни Альцгеймера (AD). Полагают, что продуцирование и накопление бета-амилоидных пептидов (Abeta) из белка-предшественника бета-амилоида (АРР) играет ключевую роль в возникновении и прогрессировании AD. Abeta образуется из белка-предшественника амилоида (АРР) путем последовательного расщепления по N- и С-концам Abeta-домена с помощью бета-секретазы и гамма-секретазы соответственно.
Предполагается, что соединения формулы (I) действуют главным образом на ВАСЕ1 в силу своей способности ингибировать ферментативную активность. Поведение таких ингибиторов, которые тестировали с помощью биохимического анализа на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) и клеточного анализа "aLisa" на клетках SKNBE2, которые описаны ниже и которые являются подходящими для выявления таких соединений и, в частности, соединений в соответствии с формулой (I), показано в табл. 5 и 6.
Биохимический анализ на основе FRET.
Данный анализ основан на резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET). Субстратом для этого анализа является образованный из АРР 13-аминокислотный пептид, который содержит "шведскую" мутацию Lys-Met/Asn-Leu сайта расщепления белка-предшественника амилоида (АРР) бета-секретазой. Этот субстрат также содержит два флуорофора: (7-метоксикумарин-4-ил)уксусную кислоту (Мса), которая является донором флуоресценции с длиной волны возбуждения 320 нм и излучения 405 нм, и 2,4-динитрофенил (Dnp), который является соответствующим акцептором-гасителем. Расстояние между этими двумя группами выбирали так, что при световом возбуждении энергия флуоресценции донора в значительной степени гасилась акцептором посредством резонансного переноса энергии. При расщеплении с помощью ВАСЕ1 флуорофор Мса отделяется от гасящей группы Dnp, восстанавливая полный выход флуоресценции донора. Увеличение флуоресценции линейно зависит от степени протеолиза.
Вкратце, в 384-луночном формате рекомбинантный белок ВАСЕ1 при конечной концентрации 1 мкг/мл инкубировали в течение 120 мин при комнатной температуре с 10 мкМ субстрата в инкубационном буфере (40мМ цитратного буфера, рН 5,0, 0,04% PEG, 4% DMSO) в отсутствие или в присутствии соединения. Далее величину протеолиза непосредственно измеряли путем измерения флуоресценции в момент Т=0 и Т=120 (возбуждение при 320 нм и излучение при 405 нм). Результаты выражают в RFU (относительных единицах флуоресценции) как разницу между Т120 и Т0.
Кривую наилучшего приближения подбирают при помощи методики суммы наименьших квадратов для графика зависимости % мин контроля от концентрации соединения. Из него можно получить значение IC50 (ингибирующая концентрация, вызывающая 50% ингибирование активности).
LC - медиана значений низкого контроля;
=низкий контроль: реакция без фермента;
НС - медиана значений высокого контроля;
=высокий контроль: реакция с ферментом;
% эффекта=100-[(образец-LC)/(HC-LC)*100];
% контроля=(образец/НС)*100;
% мин контроля=(образец-LC)/(HC-LC)*100.
Осуществляли тестирование следующих соединений, представленных в качестве примера, главным образом, как описано выше, и они показали следующую активность.
Клеточный анализ aLisa на клетках SKNBE2.
В двух анализах aLisa количественно определяли уровни общего Abeta и Abeta 1-42, продуцированных и секретированных в среду клеток SKNBE2 нейробластомы человека. Анализ основан на клетках SKNBE2 нейробластомы человека, экспрессирующих белок-предшественник амилоида дикого типа (hAPP695). Соединения разводили и добавляли к этим клеткам, инкубировали в течение 18 ч и затем осуществляли измерения количества Abeta 1-42 и общего Abeta. Количество общего Abeta и Abeta 1-42 измеряли с помощью сэндвич-aLisa. aLisa представляет собой сэндвич-анализ с использованием биоти-нилированного антитела AbN/25, связанного с покрытыми стрептавидином гранулами, или антитела Ab4G8 или cAb42/26, конъюгированного с гранулами-акцепторами, для определения общего Abeta и Abeta 1-42 соответственно. В присутствии общего Abeta или Abeta 1-42 гранулы приближаются друг к другу. Возбуждение гранул-доноров вызывает высвобождение молекул синглетного кислорода, что запускает каскад переноса энергии на гранулы-акцепторы, что приводит к излучению света. Излучение света измеряли спустя 1 ч после инкубирования (возбуждение при 650 нм и излучение при 615 нм).
Кривую наилучшего приближения подбирали при помощи методики суммы наименьших квадратов для графика зависимости % мин контроля от концентрации соединения. Из него можно получить значение IC50 (ингибирующая концентрация, вызывающая 50% ингибирование активности).
LC - медиана значений низкого контроля;
=низкий контроль: клетки, предварительно инкубированные без соединения, без биотинилирован-ного Ab в aLisa;
НС - медиана значений высокого контроля;
=высокий контроль: клетки, предварительно инкубированные без соединения;
% эффекта=100-[(образец-LC)/(HC-LC)*100];
% контроля=(образец/НС)*100;
% мин контроля=(образец-LC)/(HC-LC)*100.
Осуществляли тестирование следующих соединений, представленных в качестве примера, главным образом, как описано выше, и они показали следующую активность.
Таблица 6
№ соед.
Клеточный анализ iyLisa на клетках
SKNBE2
abeta 42 pIC5o
Клеточный анализ aLisa на клетках
SKNBE2
Общий Abeta pICso
8, 38
8, 37
8, 07
8, 07
8, 38
8,43
6, 89
6, 89
6, 93
6, 93
8,48
8,47
8,46
8, 51
Демонстрация эффективности in vivo.
Средства, снижающие уровень Ар-пептида, по настоящему изобретению можно применять для лечения AD у млекопитающих, таких как люди, или, в альтернативном случае, могут проявлять эффективность на животных моделях, таких как, без ограничений, мышь, крыса или морская свинка. У млекопитающего может быть не выявлена AD или оно может не иметь генетической предрасположенности к AD, но может быть трансгенным таким образом, что у него сверхпродуцируется и в итоге накапливается Ap подобно тому, как это наблюдается у людей, пораженных AD.
Средства, снижающие уровень Ар-пептида, можно вводить в любой стандартной форме с помощью любого стандартного способа. Например, без ограничений, средства, снижающие уровень Ар-пептида, могут быть в форме раствора, таблеток или капсул, которые можно принимать перорально или инъекци-онно. Средства, снижающие уровень Ар-пептида, можно вводить в любой дозе, достаточной для того чтобы значительно снизить уровни Ap-пептидов в крови, плазме крови, сыворотке крови, цереброспинальной жидкости (CSF) или головном мозге.
Для того чтобы определить, будет ли однократный прием средства, снижающего уровень Ар42
пептида, снижать уровни Ар-пептида in vivo, использовали нетрансгенных грызунов, например мышей или крыс. Животных, которых подвергали обработке средством, снижающим уровень Ар-пептида, обследовали и сравнивали с теми, которых не подвергали обработке или подвергали обработке наполнителем, и осуществляли количественный анализ уровней растворимого Ар42 и общего Ар в головном мозге с помощью стандартных методик, например с использованием ELISA. Периоды обработки варьировали от часов (ч) до дней и их корректировали на основе результатов снижения уровня Ар42, как только можно было установить время возникновения эффекта.
Представлен стандартный протокол для измерения снижения уровня Ар42 in vivo, но он представляет собой только один из многих вариантов, которые можно применять для оптимизации уровней выявляемого Ap. Например, соединения, снижающие уровень Ар-пептида, были составлены в 20% гидрокси-пропил-р-циклодекстрине. Средства, снижающие уровень Ар-пептида, вводили в однократной дозе пе-рорально (п.о.) или в однократной дозе подкожно (п.к.) животным, которых не кормили в течение ночи. По истечении определенного времени, как правило 2 или 4 ч (как показано в табл. 7), животных умерщвляли и исследовали уровни Аa42.
Кровь собирали посредством декапитации и обескровливания в пробирки для сбора образцов, обработанные EDTA. Кровь центрифугировали при 1900 г в течение 10 мин при 4°C и плазму отделяли и подвергали сверхбыстрой заморозке для дальнейшего исследования. Головной мозг отделяли от черепа и заднего мозга. Отделяли мозжечок и разделяли левое и правое полушария. Левое полушарие хранили при -18°C для количественного анализа уровней исследуемых соединений. Правое полушарие промывали буфером на основе забуференного фосфатом солевого раствора (PBS), моментально замораживали на сухом льду и хранили при -80°C до гомогенизации для биохимических анализов.
Мышиный головной мозг от нетрансгенных животных повторно суспендировали в 8 объемах 0,4% DEA (диэтиламина)/50 мМ NaCl, содержащих ингибиторы протеазы (Roche-11873580001 или 04693159001), на грамм ткани, например, к 0,158 г мозга добавляли 1,264 мл 0,4% DEA. Все образцы гомогенизировали в системе FastPrep-24 (MP Biomedicals) с использованием лизирующей матрицы D (MPBio #6913-100) при 6 м/с в течение 20 с. Гомогенаты центрифугировали при 221,300xg в течение 50 мин. Полученную в результате высокоскоростного центрифугирования надосадочную жидкость затем переносили в новые пробирки Эппендорфа. Девять частей надосадочной жидкости нейтрализовали 1 частью 0,5М Tris-HCl, pH 6,8 и использовали для определения количества общего Ар и Ар42.
Для определения количества общего Ар и Ар42 в растворимой фракции гомогенатов головного мозга использовали иммуноферментные анализы. Вкратце, стандарты получали (разведение синтетических Ар 1-40 и Ар 1-42, Bachem) в 1,5 мл пробирке Эппендорфа в Ultraculture с конечными концентрациями в диапазоне от 10000 до 0,3 пг/мл. Образцы и стандарты инкубировали совместно с антителом, меченным HRPO по N-концу, для выявления Ар42 и с биотинилированным антителом 4G8 к среднему домену для выявления общего Ар. Затем 50 мкл смесей конъюгат/образец или конъюгат/стандарты вносили в планшет, покрытый антителами (иммобилизированные антитела селективно распознают С-концевую область Ар42, антитело JRF/cAp42/26 для выявления Ар42 и N-конца Ар, антитело JRF/rAp/2 для выявления общего Ар). Обеспечили инкубирование планшета в течение ночи при 4°C, с тем чтобы обеспечить возможность образования комплекса антитело-амилоид. Вслед за этими этапами инкубирования и последующей отмывки ELISA для количественного анализа Ар42 завершали добавлением флуо-рогенного субстрата Quanta Blu для пероксидазы согласно инструкциям изготовителя (Pierce Corp., Рокфорд, Иллинойс). Считывание осуществляли спустя 10-15 мин (возбуждение при 320 нм/излучение при
420 нм).
Для выявления общего Ар добавляли стрептавидин-пероксидазный конъюгат, после чего спустя 60 мин следовали дополнительный этап отмывки и добавление флуорогенного субстрата Quanta Blu для пероксидазы согласно инструкциям изготовителя (Pierce Corp., Рокфорд, Иллинойс). Считывание осуществляли спустя 10-15 мин (возбуждение при 320 нм/излучение при 420 нм).
В этой модели по меньшей мере 20% снижение уровня Ар42 по сравнению с таковым у животных, которых не подвергали обработке, было преимущественным.
п.о. означает перорально.
Осуществляли тестирование следующих соединений, представленных в качестве примера, главным образом, как описано выше, и они показали следующую активность.
или его таутомерная или стереоизомерная форма, где R1 представляет собой C^^ram;
представляет собой водород или фтор; L представляет собой связь или -NHCO-;
Ar выбран из группы, состоящей из пиридинила, пиримидинила и пиразинила, каждый из которых необязательно замещен галогеном или С1-3алкокси;
или его фармацевтически приемлемая соль присоединения.
2. Соединение по п.1, где R1 представляет собой метил или этил.
3. Соединение по п.2, где Ar выбран из 5-метоксипиридинила, 5-пиримидинила и 5-
фторпиразинила.
4. Соединение по п.1, где четвертичный атом углерода, замещенный R1, имеет R-конфигурацию.
5. Соединение, представляющее собой N-{3-[(2R*,3R)-5-амино-2-(дифторметил)-3-метил-3,6-
дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -ил] -4-фторфенил} -5-цианопиридин-2-карбоксамид.
6. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения нарушений, в которые вовлечена бета-секретаза, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Способ получения фармацевтической композиции по п.6, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемый носитель равномерно смешивают с терапевтически эффективным количеством соединения по любому из пп.1-5.
8. Применение соединения по любому из пп.1-5 для лечения или предупреждения болезни Альц-геймера (AD), умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, или деменции, ассоциированной с бета-амилоидом.
9. Способ лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, угасания, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-5.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023909
023909
- 1 -
- 1 -
023909
023909
- 1 -
- 1 -
023909
023909
- 1 -
- 1 -
023909
023909
- 1 -
- 1 -
023909
023909
- 1 -
- 1 -
023909
023909
- 1 -
- 1 -
023909
023909
- 4 -
- 3 -
023909
023909
- 9 -
023909
023909
- 12 -
023909
023909
- 15 -
- 15 -