[RU]

1. Соединение формулы (I) в которой группа X ₁ представляет собой -OR ₁ , -NR ₁ R ₂ или R ₃ ; R ₁ , R ₂ и R ₃ независимо представляют собой C _1-10 алкил, С _2-10 алкенил, С _3-10 циклоС _1-10 алкил, С _3-10 циклоС _2-10 алкенил, C _1-10 алкилС _3-10 циклоС _1-10 алкил, С _1-10 алкилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _2-10 алкенилС _3-10 цикло С _1-10 алкил, С _2-10 алкенилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _5-10 арил, С _5-10 гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, C _1-10 алкилС _5-10 арил, C _1-10 алкилС _5-10 гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С _2-10 алкенилС _5-10 арил или С _2-10 алкенилС _5-10 гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, при этом любая из указанных групп может быть необязательно замещена моноциклическим С _5-10 арилом или моноциклическим С _5-10 гетероарилом; и один или более атомов углерода в R ₁ , R ₂ и R ₃ , не являющихся частью С _5-10 арильной или С _5-10 гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O) _p , где р обозначает 0, 1 или 2, и один или более атомов углерода в R ₁ , R ₂ и R ₃ необязательно замещены карбонилом; или R ₁ и R ₂ связаны таким образом, что NR ₁ R ₂ представляет собой насыщенное или ненасыщенное С _4-8 гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены другим гетероатомом, выбранным из О, N и S(O) _p , где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом такое гетероциклическое кольцо необязательно может быть сконденсировано с С _5-10 арильным или С _5-10 гетероарильным кольцом; и где один или более атомов углерода группы R ₁ , R ₂ и R ₃ необязательно могут быть замещены одним или более атомами галогена; или R ₁ и/или R ₂ представляют собой водород; R ₉ представляет собой Н или ОН; n представляет собой одинарную или двойную связь, за исключением того, что когда n представляет собой двойную связь, R ₉ представляет собой Н; R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ и R ₈ независимо представляют собой Н, F, Cl, Br, С _2-10 алкенил или C _1-10 алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O) _p , где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом такая алкильная группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена; Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ и Х ₆ независимо представляют собой С или N, при этом в том случае, когда любая из указанных групп представляет собой N, присоединенный заместитель отсутствует; при условии, что когда все R ₄ , R ₆ , R ₇ и R ₈ представляют собой Н, а все Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ и Х ₆ представляют собой С, то тогда R ₅ не может представлять собой ОН, -OC _1-10 алкил или -O(СО)C _1-10 алкил; или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, где n представляет собой одинарную связь.

3. Соединение по п.1 или 2, где R ₉ представляет собой ОН.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где Х ₂ представляет собой С.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где Х ₃ представляет собой С.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где Х ₄ представляет собой С.

7. Соединение по любому из пп.1-6, где Х ₅ представляет собой С.

8. Соединение по любому из пп.1-7, где Х ₆ представляет собой С.

9. Соединение по любому из пп.1-8, где R ₄ представляет собой Н.

10. Соединение по любому из пп.1-9, где R ₈ представляет собой Н.

11. Соединение по любому из пп.1-10, где R ₅ представляет собой ОН.

12. Соединение по любому из пп.1-11, где R ₆ представляет собой Н, Me или F.

13. Соединение по любому из пп.1-12, где R ₇ представляет собой Н или F.

14. Соединение по любому из пп.1-13, где R ₆ и/или R ₇ представляет собой F.

15. Соединение по любому из пп.1-14, где Х ₁ представляет собой NR ₁ R ₂ .

16. Соединение по п.15, где R ₁ представляет собой C _1-10 алкил, C _2-10 алкенил, C _3-10 циклоС _1-10 алкил, C _3-10 циклоС _2-10 алкенил, C _1-10 алкилС _3-10 циклоС _1-10 алкил, C _1-10 алкилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _2-10 алкенилС _3-10 циклоС _1-10 алкил, C _2-10 алкенилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _5-10 арил, С _5-10 гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, C _1-10 алкилС _5-10 арил, C _1-10 алкилС _5-10 гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, С _2-10 алкенилС _5-10 арил или С _2-10 алкенилС _5-10 гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, a R ₂ представляет собой Н, C _1-10 алкил, С _2-10 алкенил или -ОС _1-10 алкил.

17. Соединение по п.15, где NR ₁ R ₂ представляет собой морфолинил, оксазинан или одну из групп, раскрытых в следующей таблице:

18. Соединение по п.1, выбранное из включая любой его таутомер или изомер, в которых С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис-связью; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образуется при соединении С-53 кето (если таковая присутствует) и С-15 гидроксильной группы и метанола; или его фармацевтически приемлемая соль.

19. Применение соединения по любому из пп.1-18 в качестве фармацевтического средства для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства.

20. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства, включающая соединение по любому из пп.1-18 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

21. Способ лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ-инфекция, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-18.

22. Способ получения соединения по любому из пп.1-18, который включает реакцию соединения формулы V в которой X ₁ определен в любом из пп.1-18, а каждый R ₁₁ независимо является C _1-4 алкилом или бензилом; с альдегидным макроциклом (соединение формулы VI) где Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ , Х ₆ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₉ , R ₉ и n определены в любом из пп.1-18.

23. Соединение формулы (VI) в которой Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ , Х ₆ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₉ , R ₉ и n определены в любом из пп.1-18.

(57) Реферат / Формула:

1. Соединение формулы (I) в которой группа X ₁ представляет собой -OR ₁ , -NR ₁ R ₂ или R ₃ ; R ₁ , R ₂ и R ₃ независимо представляют собой C _1-10 алкил, С _2-10 алкенил, С _3-10 циклоС _1-10 алкил, С _3-10 циклоС _2-10 алкенил, C _1-10 алкилС _3-10 циклоС _1-10 алкил, С _1-10 алкилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _2-10 алкенилС _3-10 цикло С _1-10 алкил, С _2-10 алкенилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _5-10 арил, С _5-10 гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, C _1-10 алкилС _5-10 арил, C _1-10 алкилС _5-10 гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С _2-10 алкенилС _5-10 арил или С _2-10 алкенилС _5-10 гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, при этом любая из указанных групп может быть необязательно замещена моноциклическим С _5-10 арилом или моноциклическим С _5-10 гетероарилом; и один или более атомов углерода в R ₁ , R ₂ и R ₃ , не являющихся частью С _5-10 арильной или С _5-10 гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O) _p , где р обозначает 0, 1 или 2, и один или более атомов углерода в R ₁ , R ₂ и R ₃ необязательно замещены карбонилом; или R ₁ и R ₂ связаны таким образом, что NR ₁ R ₂ представляет собой насыщенное или ненасыщенное С _4-8 гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены другим гетероатомом, выбранным из О, N и S(O) _p , где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом такое гетероциклическое кольцо необязательно может быть сконденсировано с С _5-10 арильным или С _5-10 гетероарильным кольцом; и где один или более атомов углерода группы R ₁ , R ₂ и R ₃ необязательно могут быть замещены одним или более атомами галогена; или R ₁ и/или R ₂ представляют собой водород; R ₉ представляет собой Н или ОН; n представляет собой одинарную или двойную связь, за исключением того, что когда n представляет собой двойную связь, R ₉ представляет собой Н; R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ и R ₈ независимо представляют собой Н, F, Cl, Br, С _2-10 алкенил или C _1-10 алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O) _p , где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом такая алкильная группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена; Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ и Х ₆ независимо представляют собой С или N, при этом в том случае, когда любая из указанных групп представляет собой N, присоединенный заместитель отсутствует; при условии, что когда все R ₄ , R ₆ , R ₇ и R ₈ представляют собой Н, а все Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ и Х ₆ представляют собой С, то тогда R ₅ не может представлять собой ОН, -OC _1-10 алкил или -O(СО)C _1-10 алкил; или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, где n представляет собой одинарную связь.

3. Соединение по п.1 или 2, где R ₉ представляет собой ОН.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где Х ₂ представляет собой С.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где Х ₃ представляет собой С.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где Х ₄ представляет собой С.

7. Соединение по любому из пп.1-6, где Х ₅ представляет собой С.

8. Соединение по любому из пп.1-7, где Х ₆ представляет собой С.

9. Соединение по любому из пп.1-8, где R ₄ представляет собой Н.

10. Соединение по любому из пп.1-9, где R ₈ представляет собой Н.

11. Соединение по любому из пп.1-10, где R ₅ представляет собой ОН.

12. Соединение по любому из пп.1-11, где R ₆ представляет собой Н, Me или F.

13. Соединение по любому из пп.1-12, где R ₇ представляет собой Н или F.

14. Соединение по любому из пп.1-13, где R ₆ и/или R ₇ представляет собой F.

15. Соединение по любому из пп.1-14, где Х ₁ представляет собой NR ₁ R ₂ .

16. Соединение по п.15, где R ₁ представляет собой C _1-10 алкил, C _2-10 алкенил, C _3-10 циклоС _1-10 алкил, C _3-10 циклоС _2-10 алкенил, C _1-10 алкилС _3-10 циклоС _1-10 алкил, C _1-10 алкилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _2-10 алкенилС _3-10 циклоС _1-10 алкил, C _2-10 алкенилС _3-10 циклоС _2-10 алкенил, С _5-10 арил, С _5-10 гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, C _1-10 алкилС _5-10 арил, C _1-10 алкилС _5-10 гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, С _2-10 алкенилС _5-10 арил или С _2-10 алкенилС _5-10 гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, a R ₂ представляет собой Н, C _1-10 алкил, С _2-10 алкенил или -ОС _1-10 алкил.

17. Соединение по п.15, где NR ₁ R ₂ представляет собой морфолинил, оксазинан или одну из групп, раскрытых в следующей таблице:

18. Соединение по п.1, выбранное из включая любой его таутомер или изомер, в которых С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис-связью; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образуется при соединении С-53 кето (если таковая присутствует) и С-15 гидроксильной группы и метанола; или его фармацевтически приемлемая соль.

19. Применение соединения по любому из пп.1-18 в качестве фармацевтического средства для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства.

20. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства, включающая соединение по любому из пп.1-18 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

21. Способ лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ-инфекция, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-18.

22. Способ получения соединения по любому из пп.1-18, который включает реакцию соединения формулы V в которой X ₁ определен в любом из пп.1-18, а каждый R ₁₁ независимо является C _1-4 алкилом или бензилом; с альдегидным макроциклом (соединение формулы VI) где Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ , Х ₆ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₉ , R ₉ и n определены в любом из пп.1-18.

23. Соединение формулы (VI) в которой Х ₂ , Х ₃ , Х ₄ , Х ₅ , Х ₆ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₉ , R ₉ и n определены в любом из пп.1-18.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
023907
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201391396
(22) Дата подачи заявки
2012.03.29
(51) Int. Cl.
C07K 5/06 (2006.01) C07D 231/54 (2006.01) A61P31/12 (2006.01) A61P31/18 (2006.01)
A61P 31/14 (2006.01)
(54) МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
(31) 1105293.3; 1113629.8; 1202060.8
(32) 2011.03.29; 2011.08.08; 2012.02.07
(33) GB
(43) 2014.02.28
(86) PCT/GB2012/050707
(87) WO 2012/131377 2012.10.04
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НЬЮРОУВИВ ФАРМАСЬЮТИКАЛ АБ (SE)
(72) Изобретатель:
Мосс Стивен Джеймс, Грегори Мэттью Алан, Уилкинсон Барри (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) WO-A1-2006138507
RICHARD SEDRANI ET AL.: "Sanglifehrin-Cyclophilin Interaction: Degradation Work, Synthetic Macrocyclic Analogues, X-ray Crystal Structure, and Binding Data", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, DC; US, vol. 125, 2 April 2003 (2003-04-02), pages 3849-3859, XP002632408, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ JA021327Y [retrieved on 2003-03-06] table 1; compound 2
WO-A1-2011098809 WO-A1-2011098805 WO-A1-2011098808
Введение
Настоящее изобретение относится к аналогам санглиферина, которые могут применяться в качестве ингибиторов циклофилина, например, при лечении вирусной инфекции, вызываемой такими вирусами, как вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита В (HBV) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), и/или в качестве иммунодепрессантов, например, для применения в профилактике отторжения трансплантата, а также в качестве противовоспалительных средств, например, для применения при воспалительных нарушениях. В настоящем изобретении также предложены способы их применения в медицине, в особенности для лечения HCV или ВИЧ инфекции, и применения в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства при заболеваниях, при которых может применяться ингибирование митохонд-риальной поры транзиентной проницаемости (mPTP), таких как мышечная дистрофия, или в качестве промежуточных соединений при получении других применяемых в медицине соединений.
Уровень техники
Гепатит С.
Вирус гепатита С (HCV) представляет собой вирус с позитивным РНК геномом, а вызываемая им инфекция является основной причиной посттрансфузионного гепатита. HCV является наиболее распространенной хронической инфекцией, передаваемой через кровь, и основной причиной смерти от заболеваний печени в США. По оценке Всемирной организации здравоохранения существует более 170 миллионов хронических носителей HCV инфекции, что составляет приблизительно 3% населения Земли. Приблизительно у 70-85% инфицированных HCV пациентов, не проходивших лечение, развивается хроническая HCV инфекция, и поэтому они подвергаются высокому риску развития цирроза печени и гепа-тоцеллюлярной карциномы. В развитых странах 50-76% всех случаев рака печени и две трети всех пересадок печени вызваны хронической инфекцией HCV (Manns et al., 2007).
В дополнение к болезням печени у пациентов с хронической инфекцией также могут развиваться другие заболевания, ассоциированные с хроническим HCV, при этом они являются источником при передаче HCV другим людям. Инфекция HCV вызывает не связанные с печенью осложнения, такие как артралгии (боль в суставах), кожную сыпь и повреждение внутренних органов, преимущественно почек. Инфекция HCV представляет важную проблему мирового здравоохранения, и в настоящее время не существует ни одной доступной вакцины против гепатита С (Strader et al., 2004; Jacobson et al. 2007; Manns et al., 2007; Pawlotsky, 2005; Zeuzem & Hermann, 2002).
Лечение HCV.
Современным стандартом лечения (SoC) являются подкожные инъекции пэгилированного интер-ферона-а (pIFNa) и пероральное введение противовирусного средства рибавирина в течение 24-48 недель. Успешное лечение определяется наличием стойкого вирологического ответа (SVR), который определяется отсутствием РНК HCV в сыворотке в конце периода лечения и 6 месяцев спустя. Суммарная эффективность SoC, главным образом, зависит от генотипа и уровней РНК HCV перед лечением. Пациенты с генотипом 2 и 3 будут с большей вероятностью реагировать на SoC, чем пациенты, инфицированные генотипом 1 (Melnikova, 2008; Jacobson et al., 2007).
Существенное количество пациентов с HCV не реагирует на терапию SoC должным образом или не может переносить терапию из-за побочных эффектов, что ведет к частым проблемам с прохождением полного курса лечения. Общая клиническая частота SVR при SoC составляет лишь приблизительно 50% (Melnikova, 2008). Развитие резистентности является другим основным фактором неудачной терапии (Jacobson et al., 2007). Для SoC также имеются противопоказания у некоторых пациентов, которых не рассматривают в качестве кандидатов на терапию, таких как пациенты, имевшие случаи тяжелой депрессии или болезни сердца. Побочные эффекты SoC, которые часто приводят к прекращению лечения, включают гриппоподобные симптомы, лихорадку, усталость, гематологическое заболевание, анемию, лейкопению, тромбоцитопению, алопецию и депрессию (Manns et al., 2007).
Принимая во внимание побочные эффекты, связанные с длительными терпиями с применением SoC, развитие резистентности и субоптимальный общий процент случаев успешного лечения, для лечения HCV инфекции срочно требуются более эффективные и более безопасные новые способы лечения. Цели новых способов лечения включают улучшенную эффективность, улучшенный профиль токсичности, улучшенный профиль резистентности, улучшенное качество жизни и итоговое повышение соблюдения пациентом режима лечения. HCV имеет короткий жизненный цикл и поэтому распространено развитие резистентности к лекарственным средствам в ходе лекарственной терапии.
Разрабатывается новая, специфично направленная противовирусная терапия против гепатита С (STAT-C), также известная как противовирусные лекарственные средства прямого действия (DAA), которые направлены против вирусных белков, таких как вирусная РНК-полимераза NS5B или вирусная протеаза NS3 (Jacobson et al., 2007; Parfieniuk et al., 2007). Кроме того, также разрабатываются новые соединения, которые направлены против белков человека (например, циклофилины), а не против вирусных мишеней, что может привести к снижению частоты случаев развития резистентности при лекарственной терапии (Manns et al., 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J-M, 2005).
Ингибиторы циклофилинов.
Циклофилины (СуР) являются семейством клеточных белков, которые проявляют пептидил-пролил
цис-транс-изомеразную активность, облегчающую изменения конформации и фолдинг белка. Белки СуР участвуют в клеточных процессах, таких как регуляция транскрипции, иммунный ответ, секреция белков и митохондриальная функция. Вирус HCV использует белки СуР в своем жизненном цикле при заражении человека. Первоначально считалось, что белки СуР стимулируют РНК-связывающую активность неструктурного белка HCV NS5B, РНК-полимеразы, которая способствует репликации РНК, хотя были предложены несколько альтернативных гипотез, включая необходимость для РР1-азной активности СуР. Различные изоформы СуР, включая А и В, как полагают, вовлечены в жизненный цикл HCV (Yang et al., 2008; Appel et al., 2006; Chatterji et al., 2009; Gaither et al., 2010). Способность вызывать нокауты в мышиных (Colgan et al., 2000) и человеческих Т-клетках (Braaten and Luban, 2001) указывает, что СуРА не обязателен для роста и выживания клеток. Подобные результаты наблюдали при прерывании гомологов СуРА в бактериях (Herrler et al., 1994), Neurospora (Tropschug et al., 1989) и Saccharomyces cerevisiae (Do-linski et al., 1997). Таким образом, ингибирование белков СуР представляет новую и привлекательную хозяйскую мишень для лечения инфекции HCV, a также новое потенциальное дополнение к существующим лекарственным средствам SoC или STAT-C/DAA с целью увеличения SVR, предотвращения развития резистентности и уменьшения побочных эффектов при лечении.
NIM-811, 3 SCY-635. 4
Циклоспорин A (Inoue et al., 2003) (CsA) и его близкие структурные неиммунодепрессивные клинические аналоги DEBIO-025 (Paeshuyse et al., 2006; Flisiak et al., 2008), NIM811 (Mathy et al., 2008) и SCY-635 (Hopkins et al., 2009), как известно, связываются с циклофилинами и в качестве ингибиторов цикло-филина показали in vitro и клиническую эффективность при лечении инфекции HCV (Crabbe et al., 2009; Flisiak et al., 2008; Mathy et al., 2008; Inoue et al., 2007; Ishii et al., 2006; Paeshuyse et al., 2006). Хотя предшествующие исследования резистентности к CsA выявили мутации в РНК-полимеразе NS5B HCV и привели к предположению, что только циклофилин В будет участвовать в процессе репликации HCV (Ro-bida et al., 2007), недавние исследования указали на существенную роль циклофилина А в репликации HCV (Chatterji et al., 2009; Yang et al., 2008). Принимая во внимание то, что мутации в вирусном белке NS5A также связаны с резистентностью к CsA, и что NS5A взаимодействует и с СуРА, и с СурВ для их специфичной пептидил-пролил цис/транс-изомеразной (PPI-азной) активности, также предполагается роль обоих циклофилинов в вирусном жизненном цикле (Hanoulle et al., 2009).
Действие аналогов циклоспорина против HCV не зависит от иммунодепрессивных свойств, которые зависят от кальциневрина. Это означает, что существенным требованием для активности HCV является связывание СуР, и связывание кальциневрина не требуется. DEBIO-025, наиболее клинически совершенный ингибитор циклофилина для лечения HCV, показал in vitro и in vivo активность против четырех самых распространенных генотипов HCV (генотипы 1, 2, 3 и 4). Исследования резистентности показали, что мутации, придающие устойчивость к DEBIO-025, отличались от мутаций, описанных для ингибиторов полимераз и протеаз, и что не было никакой перекрестной резистентности со STAT-C/DAA рези
стентными вирусными репликонами. Что еще более важно, DEBIO-025 также предотвращал развитие мутаций ускользания, которые придают резистентность к ингибиторам протеаз и полимераз (Crabbe et
al., 2009).
Впрочем, ингибиторы циклофилина на основе CsA в клиническом исследовании имеют множество проблем, которые, как полагают, связаны с их общим структурным классом и включают некоторые нежелательные явления, которые могут приводить к прекращению терапии и ограничивать уровни клинической дозы; переменная фармакокинетика, которая может приводить к переменной эффективности; и повышенный риск взаимодействий между лекарственными средствами, что может привести к сложностям с введением доз.
Наиболее частые нежелательные явления (АЕ) у пациентов, которые получали DEBIO-025, включали желтуху, боль в животе, рвоту, усталость и повышенную температуру. Наиболее клинически важными АЕ являлись гипербилирубинемия и снижение количества тромбоцитов (тромбоцитопения). ПЭГ-IFN может вызывать сильную тромбоцитопению, и комбинация с DEBIO-025 может представлять существенную клиническую проблему. Одновременное повышение билирубина и снижение тромбоцитов также было описано в ранних клинических исследованиях с NIM-811 (Ke et al., 2009). Хотя гипербилирубине-мия, наблюдаемая в ходе клинических исследований DEBIO-025, устранялась после прекращения терапии, она стала причиной прекращения терапии у 4 из 16 пациентов и снижения уровней дозы в будущих испытаниях. Поскольку противовирусное действие ингибиторов циклофилина при HCV зависит от дозы, снижение дозы привело к уменьшению противовирусного действия, при этом в ряде последующих испытаний с ингибиторами циклофилина на основе CsA не было показано никаких или показано слабое снижение вирусной нагрузки HCV при введении доз в качестве монотерапии (Lawitz et al., 2009; Hopkins et al., 2009; Nelson et al., 2009). DEBIO-025 и циклоспорин А, как известно, являются ингибиторами транспортеров желчи, таких как экспортирующие помпы солей желчных кислот, и других транспортеров печени (в особенности OAT1B 1/OAT1B3/MRP2/MRP3/cMOAT/ABCC2) (Crabbe et al., 2009). Было выдвинуто предположение, что взаимодействие с транспортерами желчи, в частности с MRP2, может являться причиной гипербилирубинемии, наблюдаемой при высоких уровнях дозы DEBIO-025 (Nelson et al., 2009, Wring et al., 2010). Межлекарственные взаимодействия (DDI) с соединениями класса CsA через ингиби-рование других транспортеров лекарственных веществ, таких как Р-гликопротеин (Pgp/MDR1), BSEP, OAT1B1 и ОАТ1В3 (Konig et al., 2010), также могут представлять проблему, потенциально ограничивая некоторые комбинации и применение у некоторых пациентов, подвергающихся терапии при сопутствующих инфекциях, таких как ВИЧ-инфекция (Seden et al., 2010).
Кроме того, DEBIO-025 и циклоспорин А являются субстратами для метаболизма под действием цитохрома Р450 (в особенности CYP3A4) и, как известно, являются субстратами и ингибиторами человеческого Р-гликопротеина (MDR1) (Crabbe et al., 2009). Также было показано, что циклоспорин А является ингибитором CYP3A4 in vitro (Niwa et al., 2007). Это указывает на то, что мог существовать повышенный риск межлекарственных взаимодействий с другими лекарственными средствами, которые являются субстратами, индукторами или ингибиторами CYP3A4, такими как, например, кетоконазол, циме-тидин и рифампицин. Кроме того, также ожидаются взаимодействия с лекарственными средствами, которые подвергаются транспорту Р-гликопротеином (например, дигоксин), что может вызывать сильные межлекарственные взаимодействия у пациентов с HCV, получающих лекарственную терапию для лечения других сопутствующих заболеваний (Crabbe et al., 2009). CsA, как также известно, имеет высоковариабельную фармакокинетику, причем предшествующие лекарственные формы демонстрировали биодоступность 1-89% при приеме внутрь (Kapurtzak et al., 2004). Без дорогостоящего контроля уровней в крови пациента это может привести к увеличению частоты возникновения побочных эффектов, вследствие повышенных уровней в плазме или к уменьшению клинического эффекта, вследствие пониженных уровней в плазме.
С учетом того, что ингибирование циклофилинов представляет новый многообещающий подход к лечению HCV, существует потребность в открытии и создании более эффективных и безопасных ингибиторов СуР для применения в комбинированной терапии против HCV инфекции.
Санглиферины.
Санглиферин A (SfA) и родственные ему природные соединения относятся к классу смешанных не-рибосомных пептид/поликетидов, продуцируемых Streptomyces. sp. A92-308110 (также известным как DSM 9954) (см., WO 97/02285), которые первоначально были обнаружены, благодаря их высокой аффинности к циклофилину А (СуРА). SfA является наиболее распространенным компонентом в ферментативных питательных средах и демонстрирует приблизительно в 20 раз более высокую аффинность к СуРА по сравнению с CsA. Это привело к предположению, что санглиферины могли бы применяться для лечения HCV (WO 2006/138507). Также было показано, что санглиферины проявляют более низкую им-мунодепрессивную активность, чем CsA, при анализе in vitro (Sanglier et al., 1999; Fehr et al., 1999). SfA связывается с высокой аффинностью с CsA-связывающим сайтом СуРА (Kallen et al., 2005).
Биосинтез санглиферинов.
Санглиферины биосинтезируются смешанной поликетидсинтазой (PKS)/нерибосомной пептидсин-тетазой (NRPS) (см. WO 2010/034243). 22-Членный макролидный каркас состоит из поликетидной углеродной цепи и трипептидной цепи. Пептидная цепь состоит из одной природной аминокислоты, валина, и двух неприродных аминокислот: ^)-метатирозина и (S)-пиперазиновой кислоты, связанных амидной связью. Гидроксилирование фенилаланина (in situ на NRPS или перед биосинтезом), с образованием (S)-метатирозина, как полагают, проходит через продукт гена sfaA.
Иммунодепрессивное действие санглиферинов.
Иммунодепрессивный механизм действия SfA отличается от механизма действия других известных иммунофилин-связывающих иммунодепрессивных лекарственных средств, таких как CsA, FK506 и ра-памицин. SfA не ингибирует фосфатазную активность кальциневрина, мишени CsA (Zenke et al., 2001), вместо этого его иммунодепрессивную активность связывали с ингибированием интерлейкина-6 (Hartel et al., 2005), интерлейкина-12 (Steinschulte et al., 2003) и ингибированием пролиферации интерлейкин-2-зависимых Т-клеток (Zhang & Liu, 2001). Однако молекулярная мишень и механизм, посредством которого SfA проявляет свое иммунодепрессивное действие, до настоящего времени остаются не известными.
Молекулярная структура SfA сложна и его взаимодействие с СуРА, как полагают, в значительной степени опосредовано макроциклической частью молекулы. Фактически, макроциклическое соединение (гидроксимакроцикл), полученное в результате окислительного расщепления SfA, показало сильную аффинность к СуРА (Sedrani et al., 2003). Данные рентгено-кристаллографического анализа показали, что гидроксимакроцикл связывается с тем же активным сайтом СуРА, что и CsA. Аналоги на основе макро-циклической группы SfA, как было также показано ранее, не обладают иммунодепрессивными свойствами (Sedrani et al., 2003), что обеспечивает возможность создания неиммунодепрессивных ингибиторов СуР для потенциального применения в терапии HCV.
В противоположность этому также существует возможность создания иммунодепрессивных средств с низкой токсичностью для применения в таких областях, как профилактика отторжения трансплантата, аутоиммунных, воспалительных и дыхательных нарушений, включая, без ограничения, болезнь Крона, синдром Бехчета, увеит, псориаз, атопический дерматит, ревматоидный артрит, нефритический синдром, апластическую анемию, билиарный цирроз печени, астму, фиброз легких, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ) и глютеновую энтеропатию. Было показано, что санглиферины имеют новый механизм иммунодепрессивной активности (Zenke et al., 2001), потенциально действуя через хемокины дендритных клеток (Immecke et al., 2011), и поэтому существует возможность создания средств, механизм действия которых отличается от механизма действия существующих клинических средств, таких как циклоспорин А, рапамицин и FK506. Было показано, что санглиферин А в 10 раз менее активен, чем циклоспорин А, таким образом, идеальное новое средство могло бы иметь улучшенную активность и/или терапевтическое окно.
Другие терапевтические применения ингибиторов циклофилинов.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
Было также показано, что ингибиторы циклофилинов, такие как CsA и DEBIO-025, могут потенциально применяться при ингибировании репликации ВИЧ. Ингибиторы циклофилинов, как полагают, нарушают функцию СуРА в процессе/завершении обратной транскрипции ВИЧ (Ptak et al., 2008). Впрочем, при клинической проверке DEBIO-025 лишь снижал уровни РНК ВИЧ-1 > 0,5 и > 1 log10 копий/мл у девяти и двух пациентов соответственно, тогда как у 27 из проходивших терапию пациентов не было показано никакого уменьшения уровней РНК ВИЧ-1 (Steyn et al., 2006). После этого DEBIO-025 испытывали у пациентов с сочетанной инфекцией HCV/ВИЧ, при этом он показал лучшую эффективность против HCV, и клинические испытания по ВИЧ были прекращены (см. Watashi et al., 2010).
Лечение ВИЧ.
Более 30 млн человек в мире инфицированы ВИЧ-1, при этом каждый год регистрируют 3 млн новых случаев. Варианты лечения были существенно усовершенствованы с введением высокоактивной антиретровирусной терапии (HAAPT) (Schopman et al., 2010). К 2008 г. было лицензировано почти 25 антиретровирусных средств для лечения ВИЧ-1, включая девять нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NRTI), четыре ненуклеозидных ингибитора обратной транскриптазы (NNRTI), девять ингибиторов протеазы (PI), один ингибитор слияния, один ингибитор CCR5 и один ингибитор интегразы (Shafer & Schapiro, 2008). Однако ни один из этих существующих режимов не приводит к полному устранению вируса, при этом они могут вызывать тяжелые побочные эффекты, и резистентность к противовирусным средствам все еще остается главной проблемой. Таким образом, сохраняется потребность в новых противовирусных терапиях, в особенности по механизму действия таких классов, в которых нет никаких разрешенных лекарственных средств, как в случае ингибиторов циклофилинов.
Вирус гепатита В.
Вирус гепатита В является ДНК-вирусом семейства Hepadnaviridae (гепаднавирусы) и возбудителем гепатита В. В противоположность случаям с HCV и ВИЧ, было очень мало опубликованных сообщений относительно активности ингибиторов циклофилинов против вируса гепатита В. Ptak с сотр. (2008) описывали слабую активность DEBIO-025 против HBV (IC50 4,1 мкМ), тогда как Xie с сотр. (2007) описывали некоторую активность CsA против HBV (IC50> 1,3 мкг/мл). Это отличается от ВИЧ и HCV, по которым имеются многочисленные сообщения о наномолярной противовирусной активности ингибиторов циклофилинов.
Лечение HBV.
Вирус HBV инфицирует до 400 млн человек во всем мире и является главной причиной хронического вирусного гепатита и гепатоцеллюлярной карциномы. На 2008 г. было зарегистрировано шесть лекарственных средств, лицензированных для лечения HBV; интерферон-а и пэгилированный интерфе-рон-а, три аналога нуклеозидов (ламивудин, энтекавир и телбивудин) и один аналог нуклеотидов (аде-фовир дипивоксил). Однако из-за высокой частоты устойчивости, плохой переносимости и возможных побочных эффектов необходимы новые терапевтические варианты (Ferir et al., 2008).
Ингибирование митохондриальной поры транзиентной проницаемости (mPTP).
Открытие высокопроводящих пор транзиентной проницаемости в митохондриях инициирует мито-хондриальную транзиентную проницаемость (МРТ). Это является причинным фактором, ведущим к некрозу и апоптозу в гепатоцитах после окислительного стресса, Са2+ токсичности и ишемии/реперфузии. Ингибирование циклофилина D (также известно как циклофилин F) ингибиторами циклофилинов, как было показано, блокирует открытие пор транзиентной проницаемости и защищает от гибели клеток после таких стрессов. Ингибиторы циклофилина D поэтому могут применяться при таких показаниях, в которых вовлечено открытие mPTP, таких как мышечная дистрофия, в частности врожденная мышечная дистрофия Ульриха и миопатия Бетлема (Millay et al., 2008, WO 2008/084368, Palma et al., 2009), рассеянный склероз (Forte et al., 2009), диабет (Fujimoto et al., 2010), амиотрофический боковой склероз (Martin 2009), биполярное расстройство (Kubota et al., 2010), болезнь Альцгеймера (Du and Yan, 2010), болезнь Хантингтона (Perry et al., 2010), восстановление после инфаркта миокарда (Gomez et al., 2007) и хроническое потребление алкоголя (King et al., 2010).
Другие терапевтические применения.
Ингибиторы циклофилинов обладают потенциальной активностью против других вирусов и поэтому при лечении вызываемых ими инфекций, например вируса ветряной оспы (Ptak et al., 2008), вируса гриппа A (Liu et al., 2009), коронавируса, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром, а также других коронавирусов человека и кошек (Chen et al., 2005, Ptak et al., 2008), вируса лихорадки денге (Kaul et al., 2009), вируса желтой лихорадки (Qing et al., 2009), вируса Западного Нила (Qing et al., 2009), вируса западного энцефалита лошадей (Qing и др., 2009), цитомегаловируса (Kawasaki et al., 2007) и вируса осповакцины (Castro et al., 2003).
Также имеются сообщения о применимости ингибиторов циклофилинов и ингибирования цикло-филинов в других терапевтических областях, например при раке (Han et al., 2009).
Общие замечания по поводу санглиферинов.
Одной из проблем при создании лекарственных препаратов на основе таких соединений, как сангли-ферины, является быстрый метаболизм и глюкуронидация, приводящие к низкой биодоступности при приеме внутрь. Это может привести к увеличению вероятности влияния пищи, к более высокой частоте неполного высвобождения из лекарственной формы и более высокой вариации в зависимости от пациента.
Таким образом, сохраняется потребность в идентификации новых ингибиторов циклофилинов, которые могут применяться в частности в лечении HCV инфекции, но также и в лечении других заболеваний, при которых ингибирование циклофилинов может быть полезным, например, при ВИЧ инфекции, мышечной дистрофии, или для восстановления после инфаркта миокарда, или в тех случаях, когда полезны иммунодепрессия или противовоспалительное действие. Предпочтительно такие ингибиторы цик-лофилинов обладают улучшенными свойствами по сравнению с доступными в настоящее время ингиби
торами циклофилинов, включая одно или более следующих свойств: более длительный полупериод существования или увеличенная биодоступность при приеме внутрь, возможно в результате сниженного метаболизма под действием Р4 50 и/или пониженной глюкуронидации, повышенная растворимость в воде, повышенная активность против HCV, сниженная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, например высокая экспозиция в целевых органах (например, печени в случае HCV), и/или длительный полупериод существования (позволяющий выполнять менее частое введение доз), пониженная частота взаимодействий между лекарственными средствами, например, посредством сниженных уровней метаболизма под действием CYP3A4 и ингибирования и уменьшенное (Pgp) ингибирование (что позволяет с большей легкостью получать комбинации нескольких лекарственных средств) и улучшенный профиль побочных эффектов, например слабое связывание с MRP2, что приводит к уменьшению вероятности гипербилирубинемии, пониженное иммунодепрессивное действие, повышенная активность против резистентных вирусных штаммов, в частности резистентных к CsA и аналогу CsA (например, DEBIO-025) вирусных штаммов, а также более высокий терапевтический (и/или селективный) индекс. В настоящем изобретении раскрыты новые аналоги санглиферинов, которые могут обладать одним или более вышеуказанными свойствами. В частности в настоящем изобретении раскрыты новые мутасинтетические аналоги санглиферинов, которые, как ожидают, будут характеризоваться уменьшенным метаболизмом под действием Р450 или глюкуронидацией, что, например, выражается в увеличенном полупериоде существования в микросомах и/или сниженной повышенной активностью против HCV, например, как показано низким ЕС50 репликонов.
Кроме того, также существует потребность в создании новых иммунодепрессивных средств, которые могут применяться в профилактике отторжения трансплантата или в лечении аутоиммунных, воспалительных и дыхательных нарушений.
Предпочтительно такие иммунодепрессанты обладают улучшенными свойствами по сравнению с известными природными санглиферинами, включая одно или более следующих свойств: более длительный полупериод существования или увеличенная биодоступность при приеме внутрь, возможно в результате сниженного метаболизма под действием Р450 и/или пониженной глюкуронидации, повышенная растворимость в воде, повышенная активность иммунодепрессивного действия, что можно наблюдать в анализах пролиферации Т-клеток, сниженная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, например высокая экспозиция в целевом органе и/или длительный полупериод существования (позволяющий выполнять менее частое введение доз), пониженная частота взаимодействий между лекарственными средствами, например, посредством сниженных уровней метаболизма под действием CYP3A4 и ингибирования и уменьшенное (Pgp) ингибирование (что позволяет с большей легкостью получать комбинации нескольких лекарственных средств) и улучшенный профиль побочных эффектов. В настоящем изобретении раскрыты новые аналоги санглиферинов, которые могут обладать одним или более вышеуказанными свойствами. В частности в настоящем изобретении раскрыты новые производные, которые характеризуются уменьшенным метаболизмом под действием Р450 или глюкуро-нидацией, что, например, выражается в увеличенном полупериоде существования в микросомах и/или повышенной иммунодепрессивной активности, например, как показано низким IC50 пролиферации Т-клеток.
Таким образом, как может быть замечено из примеров, соединения изобретения обладают следующими благоприятными терапевтически релевантными свойствами:
улучшенной противовирусной активностью против HCV и ВИЧ по сравнению с ингибиторами цик-лофилинов циклоспорином А, DEBIO-025 (алиспоривир) и санглиферином А предшествующего уровня техники;
уменьшенным клиренсом и увеличенной экспозицией при приеме внутрь по сравнению с соединением предшествующего уровня техники санглиферином А;
более активным ингибированием PPI-азной активности СурА по сравнению с ингибиторами цик-лофилинов циклоспорином А, DEBIO-025 (алиспоривир) и санглиферином А предшествующего уровня техники;
улучшенным профилем побочных эффектов и уменьшенной частотой взаимодействий между лекарственными средствами, что демонстрируется уменьшенным ингибированием транспортеров билирубина (ОАТР-1В1, ОАТР-1В3, MRP2 и MRP3) и уменьшенным ингибированием транспортеров ксенобиотиков (Pgp и BSEP).
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложены новые макроциклические аналоги санглиферинов, которые были получены посредством полусинтетической модификации мутасинтетических санглиферинов. Указанные аналоги могут быть получены при дигидроксилировании мутасинтетического санглиферина, например, описанного в формуле IIA и формуле IIB, с последующим расщеплением с образованием альдегидного макроцикла, сопровождаемым дальнейшими химическими реакциями, включая реакции по типу Хорнера-Эммонса и другие реакции конденсации с участием альдегида, с получением молекул с разнообразными заместителями, замещающими альдегид. В результате в настоящем изобретении предложены макроциклические аналоги санглиферинов, способы получения указанных соединений и способы приме
нения таких соединений в медицине или в качестве промежуточных соединений при получении других соединений.
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложены макроциклические аналоги санглиферинов и их производные согласно формуле (I) ниже или их фармацевтически приемлемая соль
в которой
группа Х1 представляет собой -OR1, -NR1R2 или R3;
R1, R2 и R3 независимо представляют собой C^^ram, С2-10алкенил, С3-10циклоС1-10алкил, С3-10цик-лоС2-10алкенил, С1-10алкилС3-10циклоС1 -10алкил, С1-10алкилС3-10циклоС2-10алкенил, С2-10алкенилС3-10цик-лоС1-10алкил, С2-10алкенилС3-10циклоС2-10алкенил, С5-10арил, С5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероато-ма, C1-10алкилС5-10арил, C1-10алкилС5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С2-10алкенилС5-10арил или С2-10алкенилС5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, при этом любая из указанных групп может быть необязательно замещена моноциклическим С5-10арилом или моноциклическим С5-10гетероари-
лом;
и где один или более атомов углерода в R1, R2 и R3, не являющихся частью С5-10ар ильной или С5-10 гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода в R1, R2 и R3 необязательно замещены карбони-
лом;
или R1 и R2 связаны таким образом, что NR1R2 представляет собой насыщенное или ненасыщенное С4-8гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены другим гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом такое гетероциклическое кольцо необязательно может быть сконденсировано с С5-10 арильным или С5-10гетероарильным кольцом;
и где один или более атомов углерода группы R1, R2 и R3 необязательно могут быть замещены одним или более атомами галогена;
или R1 и/или R2 представляют собой водород;
R9 представляет собой Н или ОН;
n представляет собой одинарную или двойную связь, за исключением того, что когда n представляет собой двойную связь, R9 представляет собой Н;
R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, F, Cl, Br, С2-10алкенил или ^^алюш, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом такая алкильная группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена;
Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6 независимо представляют собой С или N, при этом в том случае, когда любая из указанных групп представляет собой N, присоединенный заместитель отсутствует;
при условии, что когда все R4, R6, R7 и R8 представляют собой Н, а все Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6 представляют собой С, то тогда R5 не может представлять собой ОН, -OC^^Mm или -O^O^^^Mm;
или его фармацевтически приемлемая соль.
Определения.
Используемый в настоящем описании термин "аналог(и)" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны другому соединению, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного атома другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы).
Используемый в настоящем описании термин "санглиферин(ы)" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного атома другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в особенности продуцируемым при ферментации Streptomyces sp.
А92-308110. Примеры включают санглиферинподобные соединения, описанные в WO 97/02285 и WO 98/07743, такие как санглиферин В.
Используемый в настоящем описании термин "мутасинтетический санглиферин(ы)" или "мутасин-тетический аналог(и) санглиферина" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, В, С или D, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного или более атомов другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности продуцируемым при ферментации Streptomyces sp. A92-308110 или их мутанта, где в культуру подается аналог метатирозина.
Используемый в настоящем описании термин "аналог(и) метатирозина" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны метатирозину, но которые несколько отличаются по составу (как, например, в случае замены одного или более атомов другим атомом или в случае присутствия или отсутствия конкретной функциональной группы), в частности описанным в формуле (III).
Используемый в настоящем описании термин "макроциклический аналог", "макроциклический аналог санглиферина" или "макроциклический санглиферин" относится к соединению, указанному выше, представляющему изобретение в его самом широком аспекте, например соединение согласно формуле (I) выше или его фармацевтически приемлемую соль. Указанные соединения также именуются как "соединения изобретения" или "производные санглиферина" или "аналоги санглиферина", при этом указанные термины используются в настоящей заявке попеременно.
Используемый в настоящем описании термин "HCV" относится к вирусу гепатита С, однонитевому РНК-вирусу с оболочкой из вирусного семейства Flaviviridae.
Используемый в настоящем описании термин "ВИЧ" относится к вирусу иммунодефицита человека, возбудителю синдрома приобретенного иммунодефицита человека.
Используемый в настоящем описании термин "биодоступность" относится к степени или скорости, с которой лекарственное средство или другое вещество адсорбируется или становится доступным на участке биологической активности после введения. Данная характеристика зависит от множества факторов, включая растворимость соединения, скорость адсорбции в кишечнике, степень связывания с белками и метаболизм и т.д. в настоящей заявке описаны различные тесты на биодоступность, которые известны специалисту в данной области (см. также Egorin et al. 2002).
Термин "растворимость в воде", используемый в настоящем описании, относится к растворимости в водных средах, например фосфатно-солевом буфере (PBS) при рН 7,4, или в 5%-м растворе глюкозы. Тесты на растворимость в воде приведены ниже в примерах как "анализ растворимости в воде".
Фармацевтически приемлемые соли соединений изобретения, таких как соединения формулы (I), включают обычные соли, образованные из фармацевтически приемлемых неорганических или органических кислот или оснований, а также четвертичных аммониевых солей присоединения кислот. Более конкретные примеры подходящих солей кислот включают соляную, бромисто-водородную, серную, фосфорную, азотную, хлорную, фумаровую, уксусную, пропионовую, янтарную, гликолевую, муравьиную, молочную, малеиновую, винную, лимонную, памовую, малоновую, гидроксималеиновую, фенилуксус-ную, глутаминовую, бензойную, салициловую, фумаровую, толуолсульфоновую, метансульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, бензолсульфоновую, гидроксинафтойную, иодоводородную, яблочную, стеариновую, дубильную и т.п. Соли соляной кислоты представляют наибольший интерес. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, хотя и не являются сами по себе фармацевтически приемлемыми, могут применяться при получении солей, используемых в качестве промежуточных соединений при получении соединений изобретения и их фармацевтически приемлемых солей. Более конкретные примеры подходящих солей оснований включают соли натрия, лития, калия, магния, алюминия, кальция, цинка, N,N'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, N-метилглюкамина и прокаина. В дальнейшем ссылки на соединение согласно изобретению включают как соединения формулы (I), так и их фармацевтически приемлемые соли.
Используемый в настоящем описании термин "алкил" представляет собой алкильную группу с нормальной или разветвленной цепью, обычно содержащую 1-10 атомов углерода, например C1-6 алкильную группу. "Алкенил" относится к алкильной группе, содержащей два или более атомов углерода (например, 2-10 атома углерода, например C2-6 алкенильная группа), которая является ненасыщенной, с одной или более двойными связями.
Примеры алкильных групп включают C1-4алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изо-пропил и н-бутил. Примеры алкенильных групп включают С2-4алкенильные группы, такие как -СН=СН2 и -СН2СН=СН2.
Используемый в настоящем описании термин "циклоалкил" обозначает циклическую алкильную группу, обычно содержащую 3-10 атомов углерода, необязательно разветвленную, например циклобу-тил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. Примером разветвленной группы является 2-метилциклопентил. "Циклоалкенил" относится к циклической алкенильной группе, обычно содержащей 5-10 атомов углерода, например циклопентил, циклогексенил или циклогептенил. Циклоалкильные и циклоалкенильные группы могут быть, например, моноциклическими или бициклическими (включая спироциклические), но предпочтительно являются моноциклическими.
Используемый в настоящем описании термин "циклоалкил" обозначает циклическую алкильную группу, обычно содержащую 3-10 атомов углерода, необязательно разветвленную, например циклобу-тил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. Примером разветвленной группы является 2-метилциклопентил. "Циклоалкенил" относится к циклической алкенильной группе, обычно содержащей 5-10 атомов углерода, например циклопентил, циклогексенил или циклогептенил. Циклоалкильные и циклоалкенильные группы могут быть, например, моноциклическими, или бициклическими (включая спироциклические), но предпочтительно являются моноциклическими.
Используемый в настоящем описании термин "гетероциклил" обозначает циклоалкильную группу, в которой один или более атомов углерода в кольце (например, 1, 2 или 3 атома углерода в кольце, как 1 или 2, например 1) замещены гетероатомами, выбранными из О, N и S. Примеры включают морфолинил, пиперидинил, пирролидинил, пиперазинил и N-метилпиперазинил.
Используемый в настоящем описании термин "гетероцикленил" обозначает циклоалкенильную группу, в которой один или более атомов углерода в кольце (например, 1, 2 или 3 атома углерода в кольце, как 1 или 2, например 1) замещены гетероатомами, выбранным из О, N и S.
Примеры арильных групп включают (за исключением случаев, о которых указано) моноциклические группы, то есть фенил, и бициклические кольца (например, 9- и 10-членные кольца), которые являются ароматическими, или (в случае бициклических колец) содержат по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Например, бициклическое кольцо может быть полностью ароматическим, например наф-тильным, или может быть частично ароматическим (например, содержать одно ароматическое кольцо), таким как тетралин, инден или индан. Предпочтительным арилом является фенил. Арильные группы необязательно могут быть замещены, например, одним или более (например, 1, 2 или 3) заместителями, выбранными, например, из алкила (например, ^^алкала), гидроксила, CF3, галогена, алкокси (например, ^^лижси), нитро, -SO2Me, циано и -CONH2.
Примеры гетероарильных групп включают (за исключением случаев, о которых указано) моноциклические группы (например, 5- и 6-членные кольца) и бициклические кольца (например, 9- и 10-членные кольца), которые являются ароматическими, или (в случае бициклических колец) содержат по меньшей мере одно ароматическое кольц, и содержат один или более гетероатомов (например, 1, 2, 3 или 4 гете-роатома), выбранных из N, О и S. Примеры 5-членных гетероарильных колец включают пиррол, фуран, тиофен, оксазол, оксадиазол, тиазол и триазол. Примеры 6-членных гетероарильных колец включают пиридин, пиримидин и пиразин. Примеры бициклических колец включают полностью ароматические кольца, такие как хинолин, хиназолин, изохинолин, индол, циннолин, бензтиазол, бензимидазол, пурин и хиноксалин, а также частично ароматические кольца, такие как хромен, хроман, тетрагидрохинолин, ди-гидрохинолин, изоиндолин и индолин. Моноциклические гетероарильные группы являются предпочтительными. Вышеуказанные гетероарильные группы необязательно могут быть замещены, как описано выше для арильных групп.
В случае, когда бициклические арильные и гетероарильные группы являются частично ароматическими, связь с остальной частьют молекулы может идти через ароматическую часть или через неароматическую часть.
Термин "лечение" включает как профилактическую, так и терапевтическую обработку. Термин "формула II" относится к формуле IIA и формуле IIB в совокупности.
Описание фигур
Фиг. 1 - 1Н-ЯМР соединения 23, Фиг. 2 - 1Н-ЯМР соединения 24, Фиг. 3 - 1Н-ЯМР соединения 25, Фиг. 4 - 1Н-ЯМР соединения 26, Фиг. 5 - 1Н-ЯМР соединения 27, Фиг. 6 - 1Н-ЯМР соединения 28, Фиг. 7 - 1Н-ЯМР соединения 29, Фиг. 8 - 1Н-ЯМР соединения 30.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предложены макроциклические аналоги санглиферинов, как изложено выше, способы получения указанных соединений и способы применения таких соединений в медицине.
В одном варианте осуществления соединение является соответствующим метанольным аддуктом, в котором полукеталь образован комбинацией С-53 кето и С-15 гидроксильных групп и метанола. В другом варианте осуществления оно не является метанольным аддуктом.
Переменные n, Х2-Х6 и R4-R9.
Предпочтительно n обозначает одинарную связь.
Предпочтительно R9 представляет собой ОН.
Предпочтительно R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, F, Cl, Br, С2-6алкенил или C1-10алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2 и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом указанная алкильная
группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена.
В некоторых вариантах осуществления атом углерода C1-10алкильной группы (например, Cb^-кильной группы), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, замещен гетероатомом.
Если -СН3 замещен N, формируемой группой является -NH2. Если -СН2- замещен N, формируемой группой является -NH-. Если -CHR- замещен N, формируемой группой является -NR-. Следовательно, атомы азота в группе R4, R5, R6, R7 или R8 могут быть первичными, вторичными или третичными атомами азота.
Если -СН3 замещен О, формируемой группой является -ОН.
В случае, когда атом углерода C1-10алкильной группы (например, С1-6алкильной группы), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, замещен гетероатомом, он предпочтительно замещается О, S или N, в особенности N или О, в частности О.
В случае, когда любой из R4, R5, R6, R7 и R8 содержит группу S(O)p, переменная р соответственно обозначает 0 или 1. В одном варианте осуществления р обозначает 0. В другом варианте осуществления р обозначает 1. В другом варианте осуществления р обозначает 2.
В случае, когда C1-10алкильная группа (например, Cb^raunjm группа), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, содержит больше одного гетероатома, они обычно могут отделяться двумя или более атомами углерода.
Предпочтительно атомы углерода C1-10алкильной группы (например, C1-6алкильной группы), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, не замещены никаким гетероатомом.
В случае, когда атом углерода C1-10алкильной группы (например, C1-6алкильной группы), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, замещен карбонилом, карбонил соответственно расположен смежно с другим атомом углерода или атомом азота. Предпочтительно карбонильные группы не расположены смежно с атомами серы или кислорода.
Например, один или более R4, R5, R6, R7 и R8 могут представлять собой -COC^^m^, например
-СОМе.
Предпочтительно атомы углерода C1-10алкильной группы (например, С1-6алкильной группы), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, не замещены карбонилом.
C1-10алкильная группа (например, С1-6алкильная группа), которую может обозначать один или больше R4, R5, R6, R7 и R8, может быть замещена одним или более атомами галогена. Например, один или более R1, R2, R3, R4 и R5 могут представлять собой -CF3. В альтернативе один или более R4, R5, R6, R7 и R8 могут представлять собой C1-10алкил (например, С1-6алкил), замещенный одним или более (например, одним) атомом Cl или F (например, -CH2CH2Cl).
Предпочтительно C1-10алкильные группы (например, ^^кильные группы), которые могут обозначать R4, R5, R6, R7 и R8, не замещены галогеном.
В случае, когда одна или более групп R4, R5, R6, R7 и R8 представляют собой C1-10алкильную группу (например, ^^жильную группу), предпочтительно группа(ы) представляет собой C1-4алкил (например, С1-2алкил, такой как метил).
В варианте осуществления один или более из R4, R5, R6, R7 и R8 представляют собой C1-6алкил (такой как C1-2алкил) или С2-3алкенил, например один или более из R4, R5, R6, R7 и R8 представляют собой метил.
Предпочтительно R4 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6алкил (например, метил). Наиболее предпочтительно R4 представляет собой Н или F, в особенности Н.
Предпочтительно R5 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН, NH2 или C1-6алкил (например, метил). Более предпочтительно R5 представляет собой Н, F, ОН или NH2, в особенности ОН.
Предпочтительно R6 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6алкил (например, метил). Более предпочтительно R6 представляет собой Н, Me или F.
Предпочтительно R7 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6алкил (например, метил). Более предпочтительно R7 представляет собой Н или F.
Предпочтительно R8 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6алкил (например, метил). Более предпочтительно R8 представляет собой Н или F, в особенности Н.
Предпочтительно один или более, более предпочтительно два или более (например, три или больше) из R4, R5, R6, R7 и R8 не являются Н.
Предпочтительно один или более, например два или более из R4, R5, R6, R7 и R8 представляют собой F.
Предпочтительно R6 и/или R7 представляют собой F.
Предпочтительно по меньшей мере два из Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6 представляют собой С; более предпочтительно по меньшей мере три, более предпочтительно по меньшей мере четыре и наиболее предпочтительно все пять представляют собой С.
В одном варианте осуществления Х2 представляет собой N (таким образом, R4 отсутствует). В другом более предпочтительном варианте осуществления Х2 представляет собой С.
Предпочтительно Х3 представляет собой С.
Предпочтительно Х4 представляет собой С.
Предпочтительно Х5 представляет собой С.
Предпочтительно Х6 представляет собой С.
В варианте осуществления каждый Х2, Х3, Х4, Х5 и Х представляет собой С, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой Н, R7 представляет собой F и R8 представляет собой Н.
В варианте осуществления каждый Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6 представляет собой С, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой Me, R7 представляет собой Н и R8 представляет собой Н.
В варианте осуществления каждый Х2, Х3, Х4, Х5 и Х <5 представляет собой С, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой F, R7 представляет собой F и R8 представляет собой Н. Переменная Х1.
В одном варианте осуществления Х1 представляет собой -R3. В одном варианте осуществления X1 представляет собой -NR1R2. В одном варианте осуществления X1 представляет собой -OR1.
В некоторых вариантах осуществления атом углерода в R1, и/или R2, и/или R3 замещен гетероато-
мом.
Если -СН3 замещен N, формируемой группой является -NH2. Если -СН2- замещен N, формируемой группой является -NH-. Если -CHR- замещен N, формируемой группой является -NR-. Следовательно, атомы азота в группе R1, R2, R3 могут быть первичными, вторичными или третичными атомами азота.
Если -СН3 замещен О, формируемой группой является -ОН.
В случае, когда атом углерода в R1, и/или R2, и/или R3 замещен гетероатомом, он предпочтительно замещен О или N, в особенности О.
В случае, когда атом углерода в R1, и/или R2, и/или R3 замещен группой S(O)p, переменная р соответственно обозначает 0 или 1. В одном варианте осуществления р обозначает 0, в другом варианте осуществления р обозначает 1. В другом варианте осуществления р обозначает 2.
В случае, когда R1, и/или R2, и/или R3 содержат больше одного гетероатома, они могут быть, например, отделены двумя или больше атомами углерода.
Предпочтительно ни один атом углерода в R1, R2 и R3 не замещен гетероатомами.
В случае, когда атом углерода R1, и/или R2, и/или R3 замещен карбонилом, карбонил предпочтительно расположен смежно с другим атомом углерода или атомом азота. Предпочтительно карбонильные группы не расположены смежно с атомами серы или кислорода.
Например, R1, и/или R2, и/или R3 могут представлять собой -СОС1-4алкил, например, -СОМе.
Предпочтительно атом углерода в R1 не замещен карбонилом.
Предпочтительно атом углерода в R2 не замещен карбонилом.
Предпочтительно атом углерода в R3 не замещен карбонилом.
В случае, когда один или более атомов углерода в группе R1, и/или R2, и/или R3 замещен одним или более атомами галогена, примерами атомов галогена является F, Cl и Br, в особенности F и Cl, в частности F. Примером галогенированной группы R1, и/или R2, и/или R3 является -CF3.
Например, один или более R1, R2 и R3 может обозначать C1-10алкил (например, C1-6алкил), замещенный одним или более (например, одним) атомом Cl или F (например, -CH2CH2Cl).
Предпочтительно атом углерода в R1, R2 и R3 не замещен галогеном.
В случае, когда одна или более групп R1, R2 и R3 представляют собой C1-10алкильную группу (например, C1-6алкильную группу), предпочтительно группы представляют собой C1-4 алкил (например, C1-2 алкил, такой как метил).
В случае, когда R1, и/или R2, и/или R3 представляют собой -алкиларил, пример включает С1-2ал-киларил, например бензил.
В случае, когда R1, и/или R2, и/или R3 представляют собой -алкениларил, пример включает С2-3ал-кениларил, например этенилфенил.
В случае, когда R1, и/или R2, и/или R3 представляют собой -алкилгетероарил, пример включает С1-2 алкилгетероарил, например -метилпиридинил.
В случае, когда R1, и/или R2, и/или R3 представляют собой -алкенилгетероарил, пример включает С2-3алкенилгетероарил, например - этенилпиридинил.
Предпочтительно R1 не является водородом.
Предпочтительно оба, R1 и R2, не являются водородом.
Предпочтительно атом углерода в R2 не замещен никаким гетероатомом.
Когда X1 представляет собой NR1R2.
В случае, когда X1 представляет NR1R2, R1 может представлять собой, например, алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоал-кенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил.
R2 может представлять собой, например, Н, алкил (например, C^^ram), алкенил (например, С2-4 алкенил), или -Оалкил (например, -OC1-4алкил), в особенности Н или алкил.
Примерные группы R1 включают арил или гетероарил, замещенные моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом, -С1-4алкил, -ОС1-4алкил, -СОС1-4алкил или -С2-4алкенил, или R1 может представлять собой алкил или -Оалкил. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с R2, представляющим Н или алкил.
Другие примерные группы R1 включают метил, -CF3, этил, изопропил, -СН2СН=СН, изобутил, цик-логексил. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с R2, представляющим Н или Me.
Другие примерные группы R1 включают необязательно замещенный пиридинил или фенил, например фенил, замещенный фенилом. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с R2, представляющим Н, Me или -ОМе.
Другие примерные группы R1 включают -ОМе, -OCF3, -О-этил, O-изопропил, -SMe, O-н-пропил, -O-н-бутил, -О-трет-бутил, O-изобутил, О-СН2С(Ме)3. Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с R2, представляющим Н, Me, этил, изопропил или трет-бутил.
Другие примерные группы R1 включают -О-(необязательно замещенный фенил). Вышеуказанные примерные группы могут быть, например, взяты вместе с R2, представляющим Н или Me.
В альтернативе R1 и R2 могут быть связаны таким образом, что NR1R2 представляет собой насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее определенный показанный атом азота.
Гетероциклическое кольцо, которое может обозначать NR1R2, обычно содержит 4-8 атомов в кольце, например 5-7 атомов в кольце, в частности 5 или 6 атомов в кольце.
Гетероциклическое кольцо, которое, например, может обозначать NR1R2, обычно содержит только определенный атом азота (например, оно представляет собой пирролидин или пиперидин), или один или два (например, один) дополнительных гетероатома, в частности атом азота или кислорода.
Например, гетероциклическое кольцо, которое может обозначать NR1R2, может быть морфолини-лом или 1,2-оксазинаном (шестичленным насыщенным кольцом, содержащим О, смежный с N).
В случаях, когда NR1R2 представляет собой насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее определенный атом азота, в котором один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)P, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, и указанное гетероциклическое кольцо сконденсировано с арильным или гетероарильным кольцом, примером является тетрагидрохинолинил.
В альтернативе, NR1R2 предпочтительно представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, такое как пирролидиновое, пиперидиновое, морфолиновое или пиперазиновое кольцо, в котором 4-азот пиперазина необязательно замещен C1-4алкилом.
В другом варианте осуществления NR1R2 предпочтительно представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, такое как пирролидиновое, пиперидиновое, морфолиновое или пиперазиновое кольцо, в котором 4-азот пиперазина необязательно замещен C1-4алкилом и в котором атом углерода, смежный с атомом азота в кольце, замещен карбонилом. Таким образом, например, R1 и R2 вместе с азотом, к которому они присоединены, представляют собой пиперидинон.
В другом варианте осуществления атом кислорода является смежным с атомом азота, к которому присоединены R1 и R2. Например, R1 может представлять собой алкил или алкенил, в котором метилен, смежный с атомом азота, к которому присоединен R1, замещен О. Например, R1 может представлять собой -ОС1-4алкил, например ОМе. В альтернативе R1 и R2 соединены, и атом углерода, смежный с атомом азота, к которому присоединен R1, замещен О, например, с образованием 1,2-оксазинанового кольца или 1,2-изоксазолидина.
В другом варианте осуществления R1 и R2 связаны таким образом, что NR1R2 представляет собой насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены дополнительным гетероа-томом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2 и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом указанное гетероциклическое кольцо сконденсировано с арильным или гетероарильным кольцом (например, сконденсировано с фенильным или пиридинильным кольцом).
Примеры групп, которые может вместе формировать NR1R2, включают морфолинил, оксазинан (например, 1,2-оксазинан) и группы, представленные в следующей таблице:
один) заместителей в кольце, например группы, выбранные из ^^алкаш (например, метил), галоген (например, Cl или F), ^^люкси (например, метокси), гидроксил, CF3, циано, нитро, SO2Me и CONH2.
Вышеуказанные группы -NR1R2 необязательно могут быть замещены одним или более (например, одним или двумя) атомами галогена (например, F или Cl).
Когда X1 представляет собой OR1.
В случае, когда X1 представляет собой OR1, R1 может, например, представлять собой алкил, алке-нил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенил-циклоалкенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил.
В одном варианте осуществления R1 представляет собой арил или гетероарил, необязательно замещенный моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом. R1 может, например, представлять собой 4-бифенилил, в котором необязательно замещено одно из фенильных колец.
В варианте осуществления R1 может представлять собой арил или гетероарил, замещенный моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом, -C1-4алкил, -OC1-4алкил, -COC1-4алкил или -С2-4 алкенил.
В варианте осуществления R1 представляет собой C^^ram (такой как С4-6алкил), С2-6алкенил, С1-4 алкилС4-7циклоалкил или C1-4алкилС5-7циклоалкенил.
Предпочтительно R1 выбран из С2-10алкила (например, С2-6 алкила, такого как С4-6алкил), С2-10 алке-нила (например, С2-6алкенила, такого как С4-6алкенил), гетероарила и арила.
Таким образом, в одном варианте осуществления R1 выбран из С4-6алкила, С2-6алкенила, гетероари-ла и арила.
В одном варианте осуществления R1 выбран из С4-7циклоалкила, С1-2алкиларила и С1-2алкил-гетероарила.
Примерные группы R1 включают циклогексил, -метилциклопентил, -СН2СН=СН2, этил, н-пропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, СН2С(Ме)3, н-пентил, -Qrl^Qrl^QMe)^ н-гексил, н-гептил, циклопентил, -метилциклогексил, фенил, -метилфенил, метилпиридинил, тиазол, триазол, имидазол, оксазол, фуран, тиофен и тетразол, например, выбранные из -СН2СН=СН2, н-бутила, трет-бутила, изобутила, -СН2С(Ме)3, н-пентила, -СН2СН2С(Me)3, н-гексила, н-гептила, -циклопентила, -метилциклогексила, фенила, -метилфенила, -метилпиридинила, тиазола, триазола, имидазола, оксазола, фурана, тиофена и тет-разола.
Другие примерные группы R1 включают указанные выше арильные или гетероарильные группы, в которых арильная или гетероарильная группа замещена. Когда Х1 представляет собой R3.
В случае, когда X1 представляет собой R3, R3 может, например, представлять собой алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоал-кенил, арил, гетероарил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил, при этом любая из указанных групп необязательно может быть замещена моноциклическим арилом или моноциклическим гетероарилом; и где один или более атомов углерода в R3, не являющемся частью арильной или гетероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, за исключением случаев, когда смежный с карбонильной группой, к которой присоединен R3, не является О или N, и где один или более атомов углерода в R3 необязательно замещены кар-бонилом.
Предпочтительно R3 может, например, представлять собой алкил, алкенил, циклоалкил, циклоалке-нил, алкилциклоалкил, алкилциклоалкенил, алкенилциклоалкил, алкенилциклоалкенил, арил, гетероа-рил, алкиларил, алкилгетероарил, алкениларил или алкенилгетероарил.
Предпочтительно R3 представляет собой С1-6алкил, С2-6алкенил, C1-4алкилС4-7циклоалкил или С1-4 алкилС5-7циклоалкенил.
Примерные группы R3 включают -метилциклопентил, этилциклопентил, н-пропил, -СН(Ме)(этил), трет-бутил, -СН(этил)2, -СН(этил)(изопропил), -СН(Ме)(изобутил), СН(Ме)(н-пропил), СН(Ме)(н-бутил), -СН(метил)(н-пентил), -СН(этил)(н-пропил), циклопентил, тетрагидрофуран, циклогексил, циклогептил, гексагидрооксепин, -метилциклогексил, -этилциклогексил, СН(Ме)(Оэтил), -СН(Ме)(О-изопропил), -СН(ОМе)(этил), СН(Me)(О-этил), -СН(ОМе)(изопропил), -аН^ИОМе), -СН(Ме)(О-н-пропил), -СН(Ме)(О-н-бутил), -СН(этил)(О-этил), -СН2С(Ме)3, СН2СН2С(Me)3, тиазол, имидазол, триазол, тетра-зол, оксазол, фуран, пиридин и фенил.
Другие примерные группы R1 включают указанные выше арильные или гетероарильные группы, в которых арильная или гетероарильная группа замещена.
Другие предпочтительные варианты осуществления.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения Х1 представляет собой NMe(OMe), R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой Н, R7 представляет собой F, R8 представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Xi представляет собой NMe(OMe), R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R представляет собой Н, R7 представляет собой F, R8 представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, n обозначает двойную связь и R9 представляет собой Н, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Xi представляет собой NRiR2, в котором Ri и R2 вместе представляют собой СН2СН2СН2СН2О, которые соединены с формированием гетероцикла, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой Н, R7 представляет собой F, Rg представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Xi представляет собой NRiR2, в котором Ri и R2 вместе представляют собой СН2СН2СН2СН2О, которые соединены с формированием гетероцикла, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой Me, R7 представляет собой Н, R8 представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Xi представляет собой NMe(OMe), R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой F, R7 представляет собой F, Rg представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, X6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Х1 представляет собой NR1R2, в котором Ri и R2 вместе представляют собой СН2СН2СН2СН2О, которые соединены с формированием гетероцикла, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой F, R7 представляет собой F, R представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X1 представляет собой (2-пиридинил)1МН, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой F, R7 представляет собой F, R представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, X6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Xi представляет собой (2-пиридинил)№Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой ОН, R6 представляет собой F, R7 представляет собой Н, Rg представляет собой Н, Х2 представляет собой С, Х3 представляет собой С, Х4 представляет собой С, Х5 представляет собой С, Х6 представляет собой С, n обозначает одинарную связь и R9 представляет собой ОН, как представлено следующей структурой:
В некоторых вариантах осуществления двойная связь в положении С26, 27 (относительно структуры санглиферина А) может находиться в цис-форме вместо транс-формы.
В подходящем варианте осуществления изобретения двойная связь находится в цис-форме, как представлено следующей формулой:
Такие соединения могут быть получены в процессе химического синтеза.
Как правило, соединения изобретения получают при помощи мутасинтеза с образованием соединений формулы (II) с последующим полусинтезом.
Подходящие группы Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, R4, R5, R6, R7 и Rg в формуле (II) соответствуют группам, определенным для соединений формулы (I).
Как правило, способ получения предшественников соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемой соли включает
инокуляцию ферментационной питательной среды культурой продуцента санглиферина (такого как Streptomyces sp. А92-308110, также известного как DSM 9954) или более предпочтительно продуцента санглиферина с инактивированным или удаленным геном sfaA или гомологом гена sfaA;
введение в ферментационную питательную среду аналога метатирозина (как показано в формуле
(III));
продолжение ферментации до получения соединений формулы IIA и формулы IIB; экстракцию и выделение соединений формулы IIA и форму лы IIB;
полусинтетическую дериватизацию соединений формулы IIA и формулы IIB с получением соединения формулы I.
Соединения формулы (III) определены следующим образом:
Формула (III)
в которой R10 представляет собой Н или группу, образующую сложный эфир, такую как алкильная группа, например С1-6алкил, такой как Me.
Подходящие группы Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, R4, R5, R6, R7 и Rg в формуле (III) соответствуют группам, определенным для соединений формулы (I).
Вводимое соединение может быть рацемическим или являться L-формой соединения формулы (III).
Соединения формулы (III) доступны коммерчески или могут быть получены стандартными метода-
Схема: а) конденсация альдегида формулы (IV) с подходящим фрагментом, например ^пО)2Р(О)СН(МНРО)СО^10, и b) гидрирование и снятие защитных групп при необходимости. PG = защитная группа.
Альдегиды формулы (IV) могут быть доступны коммерчески или могут быть с легкостью синтезированы специалистом, квалифицированным в данной области. Химия защиты и снятия защиты может использоваться при получении соединений формулы (III) из соединений формулы (IV). Указанные методы известны специалисту, квалифицированному в данной области, и подходящие защитные группы описаны в Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts and Greene, 4th Edition, 2007).
После образования соединений формулы (IIA) и формулы (IIB) соединения изобретения получают с помощью полусинтетической дериватизации. Полусинтетические методы получения макроциклического альдегида санглиферина описаны в US 6124453, Metternich et al., 1999, Banteli et al., 2001 и Sedrani et al., 2003.
Обычно полусинтетический способ получения некоторых соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемой соли из мутасинтетического аналога санглиферина включает:
(a) дигидроксилирование аналога санглиферина;
(b) окислительное расщепление 1,2-диола с получением альдегида и
(c) конденсацию указанного альдегида со стабилизированным карбанионом (или его канонической формой), таким как фосфонатный карбанион, с использованием соединения формулы V.
Это ретросинтетически показано ниже
Следовательно, способ получения соединений изобретения включает реакцию соединения формулы (V) с альдегидным макроциклом (соединение формулы (VI)). Получение соединений формулы (VI) может быть выполнено способом, аналогичным описанному, предварительно в отношении превращения санглиферина А в его соответствующий альдегидный макроцикл (Metternich et al. 1999). Вкратце, соединение формулы (II) дигидроксилируют с использованием измененных условий Шарплесса (каталитический тетраоксид осмия). Использование хиральных лигандов способствует повышению селективности. Затем образующийся диол может быть подвергнут окислительному расщеплению с использованием, например, периодата натрия. Полученное соединение формулы VI может затем использоваться в качестве субстрата для дериватизации в соответствующий амид, сложный эфир или кетон. Обычно соединение формулы (V) растворяют в апротонном растворителе, охлаждают и обрабатывают основанием, например гидридом натрия. Затем добавляют соединение формулы (VI) и нагревают реакционную смесь. По истечении подходящего промежутка времени реакцию останавливают и очищают соединение формулы I в стандартных условиях (например, с помощью препаративной ВЭЖХ, препаративной ТСХ и т.д., флеш-хроматографии с нормальными фазами).
Дериватизации с целью введения изменений в группы R9 и n могут быть выполнены перед получением соединения формулы VI или после реакции с формированием соответствующего амида. Вкратце, гидроксил в R9 может быть удален при обработке подходящего субстрата в кислых условиях с получением конъюгированного триена.
Соединения формулы (V) могут быть известны или могут быть получены с использованием известных методов.
Например, соединения формулы (V), в которой X1 представляет собой NR1R2, могут быть с легкостью синтезированы из доступных аминов (например, R1R2NH). Как показано на схеме 1 (ниже), амин может использоваться для обработки хлорацетилхлорида или подобного, с образованием а-хлорамида. Затем а-хлорамид обрабатывают в реакции Арбузова с получением соединения формулы V. Другие пути к соединениям формулы V будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области.
Схема 1
Другие соединения формулы (V), в которой X1 представляет собой R3, могут быть известны или с легкостью могут быть синтезированы из доступных производных карбоновых кислот (например, R3COX). Как показано на схеме 2 (ниже), производное карбоновой кислоты может взаимодействовать с метилфосфонатом после обработки фосфоната основанием. Это приводит к соединению формулы (V), хотя другие пути к соединениям формулы V будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области.
Схема 2
Другие соединения формулы (V), в которой X1 представляет собой OR1, могут быть известны или с легкостью могут быть синтезированы из доступных спиртов (например, R1OH). Как показано на схеме 3 (ниже), спирт может использоваться для обработки хлорацетилхлорида или подобного, с образованием сложного а-хлорэфира. Затем а-хлорэфир обрабатывают в реакции Арбузова с получением соединения формулы II. Другие пути к соединениям формулы II будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области.
Если желательно или необходимо, защитные группы могут применяться для защиты функциональных групп в альдегидном макроцикле, макроцикле, спирте (R1OH), производном карбоновой кислоты (R1R2R3COX) или амине (R1R2NH) или в соединениях формулы V, как описано в T.W. Green, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, New York, 1999.
В дополнение к определенным методам и ссылкам, предствленным в настоящей заявке, специалист в данной области также может обратиться к стандартным руководствам по методам синтеза, включая, без ограничения, Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al., 1989) и March's Advanced Organic Chemistry (Smith and March, 2001).
Аналог санглиферина согласно изобретению можно вводить один или в комбинации с другими терапевтическими средствами. Совместное введение двух (или более) средств могут позволять вводить более низкие дозы каждого используемого средства, с уменьшением, таким образом, побочного эффекта, что может привести к повышению активности и поэтому, более высокого SVR, а также к уменьшению резистентности.
Таким образом, в одном варианте осуществления мутасинтетический аналог санглиферина вводят совместно с одним или более терапевтическими средствами для лечения инфекции HCV, взятыми из стандарта лечения. Это может быть интерферон (например, pIFNa и/или рибавирин).
В альтернативном варианте осуществления санглифериновый макроцикл изобретения вводят совместно с одним или более другими противовирусными средствами, такими как STAT-C (средство направленного действия для лечения HCV) или DAA (противовирусные средства прямого действия), которые могут являться одним или несколькими из следующего: ненуклеозидные ингибиторы полимеразы (например, АВТ-333, АВТ-072, BMS 791325, IDX375, VCH-222, BI 207127, ANA598, VCH-916, GS 9190, PF-00868554 (филибувир) или VX-759), нуклеозидные или нуклеотидные ингибиторы полимеразы (например, 2'-С-метилцитидин, 2'-С-метиладенозин, R1479, R1479, PSI-6130, R7128, R1626, PSI 7977 или IDX 184), ингибиторы протеазы (например, АВТ-450, АСН-1625, BI 201355, BILN-2061, BMS-650032, CTS 1027, данопревир, GS 9256, GS 9451, MK 5172, IDX 320, VX-950 (телапревир), SCH503034 (боце-превир), ТМС435350, МК-7009 (ванепревир), R7227/ITMN-191, ЕА-058, ЕА-063 или VX 985), ингибиторы NS5A (например, А-831, BMS 790052, BMS 824393, CY-102 или PPI-461), силимарин, ингибиторы NS4b, ингибиторы серин-С-пальмитоилтрансферазы, нитазоксанид или ингибиторы проникновения вируса (например, PRO 206).
В альтернативном варианте осуществления санглифериновый макроцикл изобретения вводят совместно с одним или более другими противовирусными средствами (таким как высокоактивная антирет-ровирусная терапия (ВААРТ)) для лечения ВИЧ, которые могут являться одним или несколькими из следующего: нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI) (например, эмтрицитабин или те-нофовир), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI) (например, рилипивирин или эфавиренц), ингибиторы протеазы (PI) (например, ритонавир или лопинавир), ингибиторы слияния (например, маравирок или энфувиртид), ингибиторы CCR5 (например, аплавирок или викривирок), ингибиторы созревания (например, бевиримат), моноклональные антитела к CD4 (например, ибализумаб) и ингибиторы интегразы (например, элвитегравир).
В альтернативном варианте осуществления санглифериновый макроцикл изобретения вводят совместно с одним или более другими противовирусными средствами для лечения HBV, которые могут являться одним или несколькими из следующего: интерфероны (например, интерферон-а или пэгилиро-ванный интерферон-а), аналоги нуклеозидов или нуклеотидов (например, ламивудин, энтекавир, адефо-вир дипивоксил или телбивудин), другие иммуномодуляторы (например, тимозин-a, CYT107 или DV-601) или HMG ингибиторы СоА редуктазы (например, симвастатин).
Лекарственные формы предпочтительно могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы и могут быть приготовлены любым из методов, известных в области фармации. Такие методы включают этап объединения действующего вещества (соединения изобретения) с носителем, который составляет один или большее количество дополнительных компонентов. В большинстве случаев лекарственные формы приготавливают путем однородного и тщательного смешивания действующего вещества с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими с последующим, в случае необходимости, формованием продукта.
Соединения изобретения обычно вводят перорально в форме фармацевтической композиции, вклю
чающей действующее вещество, необязательно в форме нетоксичной соли присоединения органической или неорганической, кислоты или основания, соли присоединения, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. В зависимости от нарушения и пациента, подлежащего лечению, а также от пути введения композиции можно вводить в различных дозах.
Например, соединения изобретения можно вводить перорально, буккально или подъязычно, в форме таблеток, капсул, суппозиториев, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизаторы или красители, для немедленного, замедленного или регулируемого высвобождения.
Такие таблетки могут содержать вспомогательные вещества, такие как микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, разрыхлители, такие как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный крахмал или крахмал тапиоки), на-трий-крахмалгликолят, натрий-кроскармеллозу и некоторые сложные силикаты, а также связующие добавки для гранулирования, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ), сахарозу, желатин и гуммиарабик. Дополнительно могут быть включены смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.
Твердые композиции аналогичного типа также могут использоваться в качестве наполнителей в желатиновых капсулах. Предпочтительные вспомогательные вещества в этом отношении включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы. В случае водных суспензий и/или эликсиров, соединения изобретения могут быть объединены с различными подсластителями или ароматизаторами, окрашивающими веществами или красителями, эмульгаторами и/или суспендирующими добавками и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, а также их комбинациями.
Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или более дополнительными компонентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены путем прессования в подходящей машине действующего вещества в свободнотекучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим веществом (например, повидоном, желатином, гид-роксипропилметилцеллюлозой), смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервирующим веществом, разрыхлителем (например, натрий-крахмалгликолятом, сшитым повидоном, сшитой натрий-карбоксиметилцеллюлозой), поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Формуемые таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящей машине смеси порошка соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть покрыты оболочкой или на них могут быть нанесены риски и могут иметь такой состав, чтобы обеспечивать медленное или регулируемое высвобождение из них действующего вещества при использовании, например, гидрокси-пропилметилцеллюлозы в переменных пропорциях, обеспечивая требуемый профиль высвобождения.
Лекарственные формы в соответствии с настоящим изобретением, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит установленное количество действующего вещества; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Действующее вещество также может быть представлено в виде болюса, электуария или пасты.
Следует понимать, что в дополнение к компонентам, конкретно указанным выше, лекарственные формы настоящего изобретения могут включать другие агенты, стандартные в данной области, относящиеся к типу рассматриваемой лекарственной формы, например, формы, подходящие для перорального введения, могут включать ароматизаторы.
Предпочтительно такие добавки, как консервирующие и буферные вещества, могут быть растворены в среде. С целью повышения стабильности композиция может быть заморожена после заполнения флакона, а вода - удалена в вакууме. Сухой лиофилизированный порошок затем закрывают во флакон, и сопровождающий флакон воды для инъекции может поставляться для восстановления жидкости перед применением.
Вводимая дозировка соединения изобретения будет изменяться в зависимости от конкретного соединения, заболевания, субъекта, природы и тяжести заболевания и физического состояния субъекта, а также выбранного пути введения. Соответствующая дозировка может быть с легкостью определена специалистом, квалифицированным в данной области.
Композиции могут содержать от 0,1%, предпочтительно от 5-60%, более предпочтительно от 10-30 мас.%, соединения изобретения, в зависимости от способа введения.
Специалисту в данной области будет очевидно, что оптимальное количество и интервал индивидуальных дозировок соединения изобретения будут определяться природой и степенью состояния, подвергаемого лечению, формой, путем и участком введения, а также возрастом и состоянием конкретного субъекта, подвергаемого лечению, и тем, что врач, в конечном счете, определит подходящие используемые дозировки. Такое введения доз может быть повторено настолько часто, насколько это необходимо. Если развиваются побочные эффекты, количество и/или частоту введения доз можно изменить или уменьшить, в соответствии с нормальной клинической практикой.
Дополнительные аспекты изобретения включают
применение соединения согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического средства для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ инфекция, для применения в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства;
фармацевтическую композицию, включающую соединение согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ инфекция, для применения в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства;
способ лечения вирусных инфекций (в особенности РНК-вирусных инфекций), таких как HCV или ВИЧ инфекция, или применение в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно изобретению.
Общие методы Материалы и методы
Бактериальные штаммы и условия роста.
Продуцент санглиферина Streptomyces sp. A92-308110 (DSM номер 9954, полученный от DSMZ, Braunschweig, Germany), также называемый BIOT-4253 и BIOT-4370, или его производные, такие как BIOT-4585, поддерживали на овсяной среде с агаром, МАМ, ISP4 или ISP2 (см. ниже) при 28°С.
BIOT-4585 (относительно методики конструирования, см. пример 1) выращивали на овсяном агаре при 28°С в течение 7-10 дней. Споры с поверхности агаровой чашки собирали в 20% мас./об. стерильный глицерин в дистиллированной воде и хранили в аликвотах по 0,5 мл при -80°С. Замороженный сток спор использовали для инокуляции посевной среды SGS или SM25-3. Инокулированную посевную среду инкубировали при встряхивании в пределах 200-300 об/мин с подбрасыванием на 5,0 или 2,5 см при 27°С в течение 24 ч. Ферментационную среду SGP-2 или ВТ6 инокулировали 2,5-10% посевной культуры и инкубировали при встряхивании в пределах 200-300 об/мин с подбрасыванием на 5 или 2,5 см при 24°С в течение 4-5 дней. Затем культуру собирали для экстракции.
Аналоги метатирозина.
Метил-(2S)-2-амино-3-(6-гидрокси(2-пиридил))пропаноат, метиловый эфир L-3-аминофенил-аланина, метиловый эфир L-4-метил-метатирозина, метиловый эфир L-4-фтор-метатирозина и метиловый эфир L-4,5-дифтор-метатирозина были приобретены у Netchem (USA).
DL-3-фторфенилаланин и L-фенилаланин были приобретены у Sigma (UK).
DL-метатирозин был приобретен у Fluorochem (UK).
L-метатирозин был приобретен у Alfa Aesar (UK).
^)-метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат был приобретен у NetChem (USA). (3-Бром-5-фторанизол (9-1) был приобретен у Accela ChemBio Co., Ltd., (Shanghai, China), a также может быть приобретен у Amfinecom Inc. (USA) или Apollo Scientific Ltd. (UK)).
DL-5-фтор-метатирозин (8), DL-5-фтор-метатирозин (9), метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (10), метил-2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11), метил-2-амино-3-(2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12) и метил-2-амино-3-(2,6-дифтор-3-гидроксифенил) пропаноат (13) синтезировали следующим образом:
DL-4-фтор-метатирозин (8)
К раствору 8-1 (3 г, 19,5 ммоль) в сухом ДХМ (150 мл) по каплям добавляли BBr3 (4M в ДХМ, 14,6 мл, 58,5 ммоль) при -70°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли воду со льдом и экстрагировали ДХМ. Органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив требуемое соединение 8-2.
К раствору 8-2 (0,9 г, 6,4 ммоль) в ацетоне (40 мл) добавляли K2CO3 (2,2 г, 16 ммоль) при комнат
ной температуре. Реакционную смесь оставляли на ночь с перемешиванием при комнатной температуре. Добавляли воду и удаляли ацетон в вакууме, а затем экстрагировали EtOAc, органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив требуемое соединение 8-3.
Смесь 8-3 (1 г, 4,34 ммоль), гиппуровой кислоты (860 мг, 4,80 ммоль), NaOAc (400 мг) и Ас2О (2,2 мл) перемешивали при 80°С в течение 2 ч. Желтую реакционную смесь охлаждали и добавляли холодный EtOH (10 мл), смесь охлаждали в ледяной бане в течение 15 мин и затем вливали в 30 мл воды со льдом, охлаждали и собирали продукт при помощи фильтрации. Твердое вещество сушили в вакууме, получив 8-4.
Раствор 8-4 (300 мг, 0,8 ммоль) и NaOAc (71 мг, 0,87 ммоль) в МеОН (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли на роторном испарителе и растворяли остаток в 50 мл EtOAc, раствор EtOAc два раза промывали водой и выпаривали, получив 8-5.
Раствор 8-5 (360 мг, 0,89 ммоль) в МеОН (50 мл) гидрировали над 10% Pd/C (77 мг) при нормальном давлении в течение 20 ч. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали с получением продукта 8-6.
Раствор 8-6 (210 мг) в 3H HCl (10 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч, раствор выпаривали досуха, а остаток очищали с помощью системы Combiflash с обращенными фазами, получив целевой продукт 8.
DL-5-фтор-метатирозин (9) и метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (10)
К раствору 9-1 (20 г, 97,55 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) по каплям добавляли н-бутиллитий (43 мл, 2,5М, 107,3 ммоль) при -78°С. Смесь перемешивали в течение 30 мин и при указанной температуре добавляли ^^диметилформамид (15,1 мл, 195,1 ммоль). Смесь перемешивали еще в течение 30 мин и убирали холодную баню. Через 1 ч реакцию останавливали насыщенным водным раствором хлорида аммония. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили (сульфат натрия), фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикаге-ле, получив 9-2.
К раствору 9-2 (6 г, 38,9 ммоль) в сухом ДХМ (200 мл) по каплям добавляли BBr3 (4M и ДХМ, 30 мл, 116,8 ммоль) при -70°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 3 ч, осторожно добавляли воду со льдом и экстрагировали ДХМ. Органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле, получив требуемое соединение 9-3.
К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (4,64 г, 14 ммоль) в ДХМ (150 мл) при комнатной температуре добавляли DBU (4,26 г, 28 ммоль). Через 10 мин добавляли 9-3 (1,95 г, 14 ммоль) и оставляли полученную смесь на ночь с перемешиванием при комнатной температуре. Раствор разбавляли EtOAc (150 мл), разделяли и промывали органический слой 1Н HCl, сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силика-геле, получив 9-4.
Раствор 9-4 (1 г) в МеОН (20 мл) гидрировали в течение ночи над 200 мг 10% Pd/C при нормальном давлении. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали с получением 10.
К раствору 10 (300 мг, 1,4 ммоль) в EtOH (30 мл) добавляли водн. NaOH (2H, 4 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли и остаток ней-трализовывали до рН 6 2Н HCl, после чего образовавшиеся белые кристаллы собирали фильтрацией, получив целевое соединение 9.
Получение 9а-2.
К раствору BnOH (1,61 мл, 15,54 ммоль) в ДМФА (30 мл) добавляли NaH (622 мг, 60% дисперсия в минеральном масле, 15,54 ммоль) при 0°С. Перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 0,5 ч с получением прозрачного раствора. 9а-1 (1,79 мл, 15,54 ммоль) добавляли при такой скорости, чтобы поддерживать температуру ниже 40°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, получив желтый раствор. Реакцию останавливали водой и экстрагировали петролейным эфиром (35 млх4). Объединенные органические слои выпаривали. И остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, используя для элюирования петролейный эфир, с получением 9а-2 (2,544 г) в виде бесцветного масла.
Получение 9а-3.
В сухую трехгорлую колбу добавляли Mg (170,1 мг, 7,10 ммоль), безводный ТГФ (10 мл) и небольшое количество иода под азотом. Добавляли 1/3 9а-2 (1,664 г, 5,9192 ммоль) в ТГФ (2 мл). Смесь нагревали до кипения с обратным холодильником. В это время желтая смесь постепенно приобретала ярко-желтый цвет. Затем по каплям добавляли остальные 2/3 9а-2 и продолжали кипятить реакционную смесь с обратным холодильником еще 0,5 ч.
К вышеуказанной смеси медленно добавляли ДМФА (0,504 мл, 6,51 ммоль) при 0°С. Перемешивание продолжали в течение 0,5 ч при комнатной температуре. Добавляли HCl (2 М, 10 мл) и выпаривали ТГФ. Остаток экстрагировали этилацетатом (25 млх 3). И объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором и выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя в градиенте от петролейного эфира до петролейного эфира/этилацетата = 20/1, получив 9а-3 (694 мг) в виде бесцветного масла.
Получение 9а-5.
К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата, 9а-4 (993 мг, 3,00 ммоль) в ДХМ (30 мл) при комнатной температуре добавляли DBU (832 мкл, 5,57 ммоль). Через 10 мин добавляли 9а-3 (694 мг, 3,01 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор промывали HCl (1 М, 10 мл) и объединенные органические слои сушили и выпаривали в вакууме.
Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии на силикагеле (элюция дихлорметан/этилацетат = 10/1), получив 9а-5 (1,11 г). Получение 10.
Раствор 9а-5 (100 мг) в МеОН (50 мл) гидрировали над 20 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение 2 ч. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив 10 (33 мг). Метил-2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11).
4 ч. Затем медленно добавляли лед/воду, слои разделяли, органические слои промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл ДХМ добавляли DBU (2,8 г, 18 ммоль) при комнатной температуре, через 10 мин добавляли соединение 11-2 (неочищенное соединение из предыдущей стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор разбавляли ДХМ (50 мл), промывали 1Н HCl (20 мл), сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 5/1), получив 11-3.
Смесь соединения 11-3 (500 мг, 1,5 ммоль) в МеОН (20 мл) гидрировали над 50 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив неочищенный продукт, который очищали при помощи системы Combiflash с обращенными фазами, с получением 11 в виде твердого белого вещества.
Метил-2-амино-З- (2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12)
К раствору соединения 12-1 (1,4 г, 9 ммоль) в 50 мл ДХМ по каплям добавляли BBr3 (4M в ДХМ, 3,6 мл, 13,5 ммоль) при -78°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при 20°С в течение 4 ч. После медленного добавления льда/воды слои разделяли, органический слой промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха.
Остаток использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл ДХМ при комнатной температуре добавляли DBU (2,7 мл, 18 ммоль), через 10 мин добавляли соединение 12-2 (неочищенное соединение из предыдущей стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор разбавляли ДХМ (100 мл), промывали 1Н HCl (30 мл), сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 5/1), получив 12-3.
Смесь соединения 12-3 (500 мг, 1,44 ммоль) в МеОН (10 мл) гидрировали над 100 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив неочищенный продукт, который очищали при помощи системы Combiflash с обращенными фазами, с получением требуемого соединения 12 в виде твердого белого вещества.
Метил-2-амино-З-(2,6-дифтор-З-гидроксифенил)пропаноат (13)
К раствору 2,4-дифторфенола (2 г, 15,4 ммоль) в 50 мл ДМФА добавляли K2CO3 (3,2 г, 23,1 ммоль) и BnBr (2,2 мл, 18,5 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли воду (100 мл) и ЕА (200 мл), органические слои промывали водой (50 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 10/1), получив неочищенное 13-1.
К раствору соединения 13-1 (2 г, 9 ммоль) в 10 мл ТГФ по каплям добавляли H-BuLi (4 мл, 2,5 М) при -78°С и перемешивали в течение 30 мин. Добавляли ДМФА (1,3 г, 0,018 ммоль) и снова перемеши
вали в течение 30 мин. Затем холодную баню убирали и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 ч перед добавлением воды. Смесь экстрагировали этилацетатом (20 млх3), сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 10/1), получив 13-2 в виде твердого желтого вещества.
К раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (728 мг, 2,2 ммоль) в 20 мл ДХМ добавляли DBU (319 мг, 2,1 ммоль) при комнатной температуре. Через 10 мин добавляли соединение 13-2 (500 мг, 2 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор разбавляли ДХМ (50 мл), промывали 1Н HCl (20 мл), сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат = 5/1), получив 13-3 в виде желтого масла.
Соединение 13-3 (600 мг, 1,32 ммоль) в МеОН (20 мл) гидрировали над 60 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора фильтрацией растворитель выпаривали, получив неочищенный продукт, который очищали при помощи системы Combiflash с обращенными фазами, с получением требуемого соединения 13 в виде твердого белого вещества.
Составы сред.
Воду, используемую для приготовления сред, подготавливали с использованием системы для очистки воды Millipore Elix Analytical Grade. Посевная среда SGS
Компонент (и поставщик) Состав
глюкоза (Sigma, G7021) 7,50 г
глицерин (Fisher scientific,
7, 50
G/0650/25)
дрожжевой экстракт (Becton Dickinson,
1, 35
212770)
солодовый экстракт (Becton Dickinson,
218630)
картофельный крахмал (растворимый) (Sigma, S2004} NZ-амин A (Sigma, СО626) жареная соевая мука, Mutrisoy (ADM, 063-160)
L-аспарагин (Sigma, А0884) CaC03 (Calcitec, V/40S) NaCl (Fisher scientific, S/3160/65) KH2P04 (Sigma, P3786) K2HP04 (Sigma, P5379) MgS04-7H20 (Sigma, M7774) раствор микроэлементов В агар
Пеногаситель SAG471 (GE Silicones, SAG471)
RO Н20 до конечного объема
рН перед стерилизацией доводили до рН 7,0 с использованием ЮМ NaOH/lOM H2S04 стерилизовали нагреванием 121°С, 20-30 мин (автоклавирование)
Примечания.
* пеногаситель использовали только в посевных ферментерах, но не в посевных колбах, ** конечный объем доводили с учетом посевного объема.
Раствор микроэлементов В. Компонент
Состав
FeS04-7H20 (Sigma, F8633) 5,00 г
ZnS04-7H20 (Sigma, Z0251) 4,00 г
MnCl2-4H20 (Sigma, M8530) 2,00 г
CuS04-5H20 (Aldrich, 20,919-8) 0,20 г
(NH4)6Mo7024 (Fisher scientific,
0,20 г
A/5720/48)
CoCl2'6H20 (Sigma, C2644) 0,10 г
H3B03 (Sigma, B6768) 0,10 г
KI (Alfa Aesar, A12704) 0,05 г
H2S04 (95%) {Fluka, 84720) 1,00 мл
RO Н20 до конечного объема 1,0 0 л
Продукционная среда SGP2.
Компонент Состав
Среда ISP4.
Компонент
Растворимый Крахмал (Difco) 10 г
К2НР04 1 г
MgS04. 7Н20 1 г
NaCl 1 г
(NH4)2S04 2 г
СаСОз 2 г
Раствор солей микроэлементов ISP 1 мл
Агар 20 г
до конечного объема 1 л
Приготовили пасту с крахмалом в малом объеме холодной воды и довести до объема 500 мл
Добавили другие компоненты в раствор II в 500 мл воды, рН должен быть между рН 7,0 и рН 7,4 (рН 7,3), Смешали два раствора и добавили агар
Соли микроэлементов ISP.
Компонент
FeS04 • 7Н20
МпС12•4Н20
ZnS04 1 7Н20
до конечного объема Хранить при 4 градусах С
Овсяный агар (ISP3).
Компонент Состав
Овсяная мука 20,00 г
ISP прослеживают раствор для элемента 1,00 мл
Бакто-агар (Becton Dickinson) 18,00 г
RO Н20 до конечного объема 1,00 л
20 г овсяной муки варили в 1 л воды на электроплитке (или в СВЧ-печи) в течение 20 мин. Готовую смесь фильтровали через миткаль/марлю и доводили до рН 7,2, а объем до 1 л. Добавляли 1 мл раствора микроэлементов ISP. Затем перед стерилизацией добавляли 18 г агара на 1 л.
Агар МАМ.
Пшеничный крахмал (Sigma) 10,00 г
Порошок кукурузного экстракта
2, 50 г
(Roquette)
Дрожжевой экстракт (Becton Dickinson) 3,00 г
СаСОз (Calcitec) 3,00 г
FeS04 (Sigma) 0,3 00 г
Бакто-агар (Becton Dickinson) 20,00 г
RO Н20 до конечного объема 1,00 л
рН 5,8 до автоклавирования
Компонент Состав
Продукционная среда ВТ6. Компонент
Состав
Глюкоза (Sigma)
Nutrisoy (ADM)
NaCl (Fisher)
(NH4)2S04 (Sigma)
CaC03 (Calcitec)
RO H20 до конечного объема
50, 00 30, 00
5, 00 3, 00
6, 00 1, 00
Довести рН до 7,0, затем добавить СаС03
Агар ISP2.
Компонент
Общий метод ферментации.
Криоконсервированные споры BIOT-4585 (методику конструирования см. в примере 1) размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали путем переноса 4,0 мл стока спор в 400 мл среды SM25 в 2 л колбе Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование вели в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (с подбросом на 5,0 см). Из посевной культуры 25 мл переносили в 250 мл продукционной среды SGP2+5% HP20 в 2 л колбе Эрленмейера с поропластовой пробкой. После культивирования в течение 24 ч при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см) в каждую продукционную колбу добавляли 2 мл 250 мМ раствора рацемического или 125 мМ раствора энантиомерно чистого нужного предшественника в 1М соляной кислоте и 2 мл 250 мМ метаноль-ного раствора DL-пиперазиновой кислоты, получив 1 мМ конечную концентрацию индивидуальных энантиомеров предшественников. Необязательно вместо 1М соляной кислоты можно использовать ДМСО. DL-пиперазиновую кислоту необязательно можно исключить. Культивирование продолжали в течение еще четырех дней при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см).
Анализ сред культивирования с помощью ЖХ-УФ и ЖХ-УФ-МС.
Добавляли среду культивирования (1 мл) и этилацетат (1 мл) и перемешивали в течение 15-30 мин с последующим центрифугированием в течение 10 мин, отбирали 0,4 мл органического слоя, выпаривали досуха и затем повторно растворяли в 0,20 мл ацетонитрила. Условия ВЭЖХ:
Колонка С18 Hyperclone BDS C183U, 4,6 мм х 150 мм
Вводили аликвоту 20 мкл Градиент растворителей: 0 мин: 55% В 1,0 мин: 55% В 6,5 мин: 100% В 10,0 мин: 100% В 10,05 мин: 55% В 13,0 мин: 55% В
Растворитель А: вода + 0,1% муравьиной кислоты
Растворитель В: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты При указанных условиях SfA элюируется при 5,5 мин. При указанных условиях SfB элюируется при 6,5 мин.
ЖХМС выполняли на интегрированной ВЭЖХ-системе Agilent НР1100 в комбинации с масс-спектрометром Bruker Daltonics Esquire 3000 + с ионизацией электрораспылением, работающим в режиме детекции положительных ионов, при использовании хроматографии и растворителей, описанных выше.
Метод QC ЖХ-МС. Условия ВЭЖХ:
Колонка С18 Hyperclone BDS C183U, 4,6 мм х 150 мм
Снабжена картриджем Phenomenex Analytical С18 Security
Guard Cartridge (KJO-4282)
Температура колонки 50°C Расход 1 мл/мин
УФ контроль при 210, 240 и 254 нм
Градиент растворителей:
0 мин: 10% В
2,0 мин: 10% В
15 мин: 100% В
17 мин: 100% В
17,05 мин: 10% В
20 мин: 10% В
Растворитель А: вода + 0,1% муравьиной кислоты Растворитель В: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты
Условия МС:
МС работает в режиме переключения (переключение между режимом положительных и отрицательных ионов), сканирование от 150 до 1500 а.е.м.
In vitro анализ репликонов для оценки HCV противовирусной активности.
Противовирусную эффективность против генотипа 1 HCV можно проверить следующим образом: за один день перед добавлением тестируемого продукта, клетки Huh5.2, содержащие репликон HCV генотипа 1b I389luc-ubi-neo/NS3-3'/5.1 (Vrolijk et al., 2003) и субкультивированные в питательной клеточной среде [DMEM (номер по кат. 41965039) с добавкой 10% FCS, 1% незаменимых аминокислот (11140035), 1% пенициллина/стрептомицина (15140148) и 2% генетецина (10131027); Invitrogen] в соотношении 1,3-1,4 и выращенные в течение 3-4 дней во флаконах для культур тканей на 75 см2 (Techno Plastic Products), собирали и сеяли в аналитическую среду (DMEM, 10% FCS, 1% незаменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина) при плотности 6500 клеток/лунка (100 мкл/лунка) в 96-луночных микротитровальных планшетах для культур тканей (Falcon, Beckton Dickinson для оценки антиметаболического действия и CulturPlate, Perkin Elmer для оценки противовирусного действия). Микро-титровальные планшеты инкубировали в течение ночи (37°С, 5% СО2, относительная влажность 9599%), получив неконфлюентный монослой клеток.
Готовили последовательные разведения; каждое последовательное разведение делали по меньшей мере в двух повторах. После подготовки анализа микротитровальные планшеты инкубировали в течение 72 ч (37°С, 5% СО2, относительная влажность 95-99%).
Для оценки антиметаболических эффектов аналитическую среду удаляли, заменяли 75 мкл 5% рас
твором MTS (Promega) в среде без фенольного красного и инкубировали в течение 1,5 ч (37°С, 5% СО2, относительная влажность 95-99%). Оптическое поглощение измеряли при длине волны 498 нм (Safire2, Tecan) и оптические плотности (значения OD) преобразовывали в процент от необработанных контролей.
Для оценки противовирусных эффектов аналитическую среду удаляли и промывали монослои клеток PBS. Промывочный буфер удаляли, добавляли 25 мкл лизисного буфера Glo (кат. Е2661, Promega), после чего лизис проводили в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл Lucif-erase Assay System (кат. Е1501, Promega) и сразу же количественно регистрировали сигнал люминесценции люциферазы (время интегрирования 1000 мс/лунка, Safire2, Tecan). Относительные единицы люминесценции преобразовывали в процент от необработанных контролей.
ЕС50 и ЕС90 (значения, полученные из кривой зависимости эффекта от дозы) представляют собой концентрации, при которых наблюдали, соответственно, 50% и 90% ингибирование вирусной репликации. СС50 (значение, полученное из кривой зависимости эффекта от дозы) представляет собой концентрацию, при которой метаболическая активность клеток уменьшилась бы до 50% от метаболической активности необработанных клеток. Индекс селективности (SI), характеризующий терапевтическое окно соединения, вычисляли как СС50/ЕС50.
Концентрация соединения, как полагают, вызывает истинный противовирусный эффект в системе HCV репликона, когда при соответствующей конкретной концентрации антирепликативный эффект превышает 70% порог, и при этом наблюдается не более чем 30% снижение метаболической активности.
In vitro анализ репликонов для оценки противовирусной активности HCV в генотипах 1а и 2а.
Репликонные клетки (сугеномные репликоны генотипа 1a (H77) и 2а (JFH-1)) выращивали в модифицированных по способу Дульбекко обогащенных средах (DMEM), с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина (pen-strep), 1% глутамина, 1% незаменимых аминокислот, 250 мкг/мл G418 в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Все реактивы для клеточных культур могут быть приобретены у Mediatech (Herndon, VA).
Репликонные клетки трипсинизировали и сеяли в количестве 5х103 лунка в 96-луночные планшеты с вышеуказанными средами без G418. На следующий день питательную среду меняли на DMEM, содержащую соединения, последовательно разведенные в присутствии 5% FBS. В анализе противовирусного действия против HCV репликона исследовали эффекты соединений в последовательных разведениях. Вкратце, клетки, содержащие HCV репликонов, сеяли в 96-луночные планшеты. Тестируемые продукты последовательно разводили в DMEM плюс 5% FBS. Разведенное соединение вносили в требуемые лунки в планшете. Через 72 ч инкубирования при 37°С клетки обрабатывали. Внутриклеточную РНК из каждой лунки экстрагировали при помощи набора RNeasy 96 kit (Qiagen). Уровень РНК HCV определяли с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскриптазой, используя реагенты TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) и систему определения последовательности ABI Prism 7900 (Applied Biosystems), как описано ранее (Vrolijk et al., 2003). Цитотоксическое действие измеряли с использованием реагентов TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents (Applied Biosystems) в качестве показателя количества клеток. Количество РНК HCV и рибосомной РНК затем использовали для получения применимых значений IC50 (концентрация, ингибирующая репликацию репликона на 50%).
Оценка микросомального метаболизма (анализ стабильности в микросомах).
Скорость метаболизма в микросомах можно проанализировать следующим образом.
Мышиные или человеческие микросомы печени разводили в буфере С (0,1 М калий-фосфатный буфер, 1,0 мМ ЭДТА, рН 7,4) до концентрации 2,5 мг/мл. Затем образцы стабильности в микросомах приготавливали, добавляя 50 мкл 5 мкМ стандартного раствора соединения (0,5 мкл 10 мМ стокового раствора в ДМСО в 9,5 мкл ACN, добавленного к 990 мкл буфера С) к 50 мкл микросомального раствора (2,5 мг/мл), 110 мкл буфера С и хорошо перемешивали. Все образцы предварительно инкубировали в течение приблизительно 15 мин при 37°С. После этого реакцию начинали, добавляя 40 мкл раствора NADPH (12,5 мМ) с осторожным перемешиванием. Аликвоты (40 мкл) отбирали в 0, 15, 30, 45 и 60 мин и останавливали реакцию, приливая ACN, содержащий внутренний стандарт (120 мкл). Белок удаляли центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин) и планшет с образцами анализировали на концентрацию соединения с помощью ЖХ-МС/МС. Затем полупериоды существования вычисляли стандартными методами, сравнивая концентрацию аналита с изначально присутствовавшим количеством.
Оценка стабильности в гепатоцитах.
Криоконсервированные гепатоциты, предварительно хранившиеся в жидком азоте, помещали во встряхиваемую водяную баню при 37±1°С на 2 мин ± 15 с. Затем гепатоциты добавляли в 10х объем предварительно нагретого бикарбонатного буфера Кребса-Хенселейта (КНВ) (2000 мг/л глюкозы, без карбоната кальция и бикарбоната натрия, Sigma), мягко перемешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. После центрифугирования супернатант тщательно удаляли и добавляли 10х объем предварительно нагретого буфера KHB, чтобы ресуспендировать осадок клеток. Клетки мягко перемешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. Затем супернатант удаляли и отбрасывали. После этого жизнеспособность и выход клеток определяли по числу клеток, и полученные значения
использовали для получения суспензий человеческих гепатоцитов до соответствующей посевной плотности (плотность живых клеток = 2х106 клеток/мл). Приготавливали 2х дозирующий раствор в предварительно нагретом KHB (1% ДМСО) (200 мкМ стандартный раствор: 20 мкл стокового растора субстрата (10 мМ) в 980 мкл ДМСО, 2х дозирующий раствор: 10 мкл 200 мкМ стандартного раствора в 990 мкл KHB (2 мкМ после разведения).
50 мкл предварительно нагретого 2х дозирующего раствора добавляли в лунки и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х 106 клеток/мл) и начинали отсчет времени. Планшет при этом инкубировали при 37°С. После завершения времени инкубирования (0, 15, 30, 60 и 120 мин) в каждую лунку добавляли 100 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, мягко перемешивали, и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2х106 клеток/мл). В конце инкубирования определяли жизнеспособность клеток. Образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин при 4°С, супернатанты разбавляли в 2 раза ультрачистой водой и анализировали уровни соединений с помощью ЖХ-МС/МС.
Оценка растворимости в воде.
Растворимость в воде можно определить следующим образом: 10 мМ стоковый раствор аналога санглиферина приготавливают в 100% ДМСО при комнатной температуре. Аликвоты объемом 0,01 мл в трех экземплярах доводят до 0,5 мл либо 0,1 М раствором PBS, рН 7,3, либо 100%-м ДМСО во флаконах из желтого стекла. Полученные 0,2 мМ растворы встряхивают при комнатной температуре на шейкерах IKA(r) vibrax VXR в течение 6 ч с последующим переносом полученных растворов или суспензий в пробирки Eppendorf объемом 2 мл и центрифугированием в течение 30 мин при 13200 об/мин. Затем аликво-ты надосадочной жидкости анализируют методом ЖХМС, как описано выше.
В альтернативе, растворимость в PBS при рН 7,4 может быть проверена следующим образом.
Получают калибровочную кривую, растворяя тестируемые соединения и контрольные соединения до 40, 16, 4, 1,6, 0,4, 0,16, 0,04 и 0,002 мкМ в 50% МеОН в Н2О. Затем стандартные точки разводят 1:20 в MeOH:PBS 1:1. Конечные концентрации после 1:20 разведения составляют 2000, 800, 200, 80, 20, 8, 2 и 1 нМ. Затем стандарты смешивают с равным объемом (1:1) ACN, содержащего внутренний стандарт (гид-роксимакроцикл, 6). Образцы центрифугируют (5 мин, 12000 об/мин), после чего анализируют с помощью ЖХ/МС.
Раствор (мкл)
МеОН/НгО (1:1) (мкл)
Рабочий раствор (мкМ)
Раствор (мкл)
МеОН/Оуфер (1:1) (мкл)
Конечный раствор (нМ)
10 мМ
240
400
400 мкМ
450
380
2000
480
380
800
40 мкМ
450
380
200
16 мкМ
450
1, 6
380
4 мкМ
450
0,4
380
1,6 мкМ
450
0,16
380
0,4 мкМ
450
0, 04
380
0,04 мкМ
Э50
0, 002
380
Тестируемые соединения приготавливали в виде стоковых растворов в ДМСО при концентрации 10 мМ. Стоковые растворы разводили в двух экземплярах в PBS, рН 7,4 в 1,5 мл пробирках Eppendorf до целевой концентрации 100 мкМ с конечной концентрацией ДМСО 1% (например, 4 мкл 10 мМ стоковый раствор в ДМСО в 396 мкл 100 мМ фосфатного буфера). Затем пробирки с образцами мягко встряхивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугировали (10 мин, 15000 об/мин) для осаждения нерастворенных частиц. Супернатанты переносили в новые пробирки и разводили (фактор разведения для индивидуального тестируемого продукта подтверждали уровнем сигнала соединения на прикладном аналитическом приборе) в PBS. Разведенные образцы затем смешивали с равным объемом (1:1) МеОН. В конце образцы смешивали с равным объемом (1:1) ACN, содержащего внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, 6), для анализа ЖХ-МС/МС.
Оценка способности проникать в клетки.
Способность проникать в клетки можно определить следующим образом.
Тестируемое соединение растворяли до 10 мМ в ДМСО и затем еще растворяли в буфере с получением конечной концентрации дозирования 10 мкМ. Маркер флюоресценции люциферовый желтый также включали, чтобы контролировать целостность мембран. Затем тестируемое соединение наносили на апикальную поверхность монослоев клеток Сасо-2 и измеряли проникновение соединения в базолате-ральный компартмент. Это выполняли в обратном направлении (из базолатерального в апикальное), чтобы исследовать активный транспорт. ЖХ-МС/МС использовали для количественного определения уров-
ней и тестируемых и стандартных контрольных соединений (таких как пропанолол и ацебутолол). In vivo оценка фармакокинетики.
In vivo анализы можно также использовать для измерения биодоступности соединения. В большинстве случаев соединение вводят подопытному животному (например, мыши или крысе) внутривенно (в/в) и перорально (р.о.) и через равные интервалы забирают пробы крови, чтобы исследовать характер изменения концентрации лекарственного соединения в плазме с течением времени. Динамика концентрации в плазме по времени может использоваться для вычисления абсолютной биодоступности соединения в процентах при использовании стандартных моделей. Пример типовой методики описан ниже.
Мышам вводили дозы 1, 10 или 100 мг/кг соединения изобретения или исходного соединения в/в или р.о. Пробы крови забирали в 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 и 2880 мин и с помощью ВЭЖХ определяли концентрацию соединения изобретения или исходного соединения в пробе. Динамику концентрации в плазме по времени затем использовали для получения таких ключевых параметров, как площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC - которая прямо пропорциональна общему количеству неизменного лекарственного вещества, которое достигает системного кровотока), максимальная (пиковая) концентрация препарата лекарственного вещества в плазме, время, за которое достигается максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме (пиковое время), при этом дополнительные факторы, которые используются при точном определении биодоступности, включают: конечный полупериод существования соединения, общий клиренс, объем распределения в равновесном состоянии и % F. Затем указанные параметры анализируют с помощью некомпартментного или компартментного методов, получая расчетное значение биодоступности в процентах, по поводу примера данного типа метода см. Egorin et al., 2002, а также приведенные там ссылки.
In vivo оценка фармакокинетики при пероральном и внутривенном введении (определенный метод).
Цельную кровь анализировали на предмет аналогов санглиферина. Соединения приготавливали в 5% этаноле/5% Cremophor EL/90% физрастворе для р.о. и для в/в введения. Группам по 3 самца CD1 мышей вводили дозы 1 мг/кг в/в либо 5 или 10 мг/кг р.о. Пробы крови (40 мкл) забирали из большой подкожной вены ноги перед введением дозы и через 0,25, 0,5, 2, 8 и 24 ч, разводили в равном количестве dH2O и сразу помещали в сухой лед. Образцы хранили при -70°С до анализа. Концентрацию соединения изобретения или исходного соединения в образце определяли с помощью ЖХМС следующим образом: в образец 20 мкл кровиЛ^ (1:1, об/об)/РК добавляли 20 мкл внутреннего стандарта (гидроксильный макроцикл, 6) до 100 нг/мл, 20 мкл рабочего раствора/МеОН и 150 мкл ACN, встряхивали на вортексе в течение 1 мин при 1500 об/мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Затем супернатант вводили в ЖХ-МС/МС. Строили график зависимости концентраций в крови от времени, который использовали для получения площади под кривой зависимости концентраций в цельной крови от времени (AUC которая прямо пропорциональна общему количеству неизменного лекарственного вещества, которое достигает системного кровотока). Полученные значения использовали для получения параметров РК по возможности.
In vitro оценка цитотоксичности.
Клетки Huh-7 и HepG2, полученные из АТСС, выращивали в модифицированных по способу Дуль-бекко обогащенных средах (DMEM), содержащих 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина (pen-strep) и 1% глутамина; тогда как клетки СЕМ (клети Т-клеточного лейкоза человека, полученные из АТСС) выращивали в среде RPMI 1640 с 10% FBS, 1% pen-strep и 1% глута-мина. Свежие МКПК человека выделяли из цельной крови, полученной по меньшей мере от двух доноров, нормальных по результатам скрининга. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови осаждали/промывали 2-3 раза с помощью центрифугирования на низкой скорости и ресуспендирования в PBS для удаления контаминирующих тромбоцитов. Промытые клетки крови затем разводили 1:1 фос-фатно-солевым буфером Дульбекко (D-PBS) и наслаивали на 14 мл среды для выделения лимфоцитов (LSM; Cellgrow, Mediatech, Inc.; плотность 1,078 +/- 0,002 г/мл; кат. 85-072-CL) в 50 мл центрифужной пробирке и центрифугировали в течение 30 мин при 600xg. Полосу МКПК осторожно отбирали из образовавшегося граничного слоя и затем промывали 2х в PBS при центрифугировании на низкой скорости. После завершающей промывки, клетки подсчитывали по вытеснению трипанового синего и ресуспенди-ровали в 1х107 клеток/мл в RPMI 1640 с добавкой 15% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 4 мкг/мл РНА-Р. Клетки оставляли для инкубирования на 48-72 ч при 37°С. После инкубирования МКПК центрифугировали и ресуспендировали в RPMI 1640 с 15% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 20 ЕД/мл рекомбинантного человеческого IL-2.
Цитотоксичность соединения против клеток, описанных выше, оценивали, определяя полулогарифмические концентрации каждого соединения в трех повторах. Клетка, содержащая только одну среду, служила в качестве клеточного контроля (СС). Клетки Huh-7 и HepG2 сеяли в 96-луночные планшеты при концентрации 5х103 клеток в лунке. На следующий день среду удаляли и добавляли 100 мкл соответствующей среды, содержащей 5% FBS. Разведения тестируемых лекарственных соединений приготавливали в 2х концентрации в микротитровальных пробирках и по 100 мкл каждой концентрации вно
сили в соответствующие лунки в стандартном формате. Через 72 ч клетки обрабатывали для оценки ци-тотоксичности.
МКПК разводили в свежей среде и сеяли на внутренние стенки 96-луночного планшета с кругло-донными лунками в количестве 5х104 клеток/лунка в объеме 100 мкл. Аналогично, клетки СЕМ сеяли в количестве 1 х 104 клеток/лунка. Затем 100 мкл 2х препаратов тестируемых лекарственных соединений добавляли в соответствующие лунки в стандартном формате. Культуры поддерживали в течение шести-семи дней и затем обрабатывали для определения цитотоксичности.
Цитотоксичность определяли при использовании набора для определения целостности мембран Cy-toTox-ONE(tm) homogeneous membrane integrity assay kit (Promega). В анализе измеряли высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH) из клеток с поврежденными мембранами во флуориметрическом, гомогенном формате. LDH, высвобождаемый в среду культивирования, измеряли с помощью сопряженного ферментного анализа, который приводит к превращению резазурина во флуоресцентный продукт резо-руфин. Величина производимой флюоресценции пропорциональна количеству лизированных клеток. Шесть последовательно разведенных концентраций каждого соединения наносили на клетки, чтобы получить, в соответствующих случаях, значения ТС50 (токсическая концентрация лекарственного соединения, уменьшающая жизнеспособность клеток на 50%) и ТС90 (токсическая концентрация лекарственного соединения, уменьшающая жизнеспособность клеток на 90%).
In vitro оценка ингибирования переносчиков MDR1 и MRP2.
Для оценки ингибирования и активации переносчиков MDR1 (Р-гликопротеин 1) и MRP2 in vitro может использоваться АТФазный анализ Solvo Biotechnology, Inc. (Glavinas et al., 2003). Соединения (в конц. 0,1, 1, 10 и 100 мкМ) инкубируют с мембранными везикулами MDR1 или MRP2 в отсутствие и в присутствии ванадата, чтобы изучить потенциальную активацию АТФазы. Кроме того, подобное инкубирование проводят в присутствии верапамила/сульфасалазина, чтобы обнаружить возможное ингиби-рование АТФазной активности переносчика. Активность АТФазы измеряют, определяя количество неорганического фосфата спектрофотометрически. Активацию вычисляют на основе ванадат-чувствительного увеличения АТФазной активности. Ингибирование определяют по уменьшению вера-памил/сульфасалазин опосредованной активности АТФазы.
In vitro оценка ингибирования Pgp переносчиков при использовании клеток MDCK.
Для оценки ингибирования переносчика Р-гликопротеина (Pgp/MDR1) использовали in vitro АТФазный анализ Cyprotex. Использовали клетки MDR1-MDCK, полученные из NIH (Rockville, MD, USA). После получения культуры, монослои подготавливали, дважды промывая базолатеральные и апикальные поверхности буфером при рН 7,4 и 37°С. Затем клетки инкубировали с буфером рН 7,4 в апикальных и в базолатеральных компартментах в течение 40 мин при 37°С в атмосфере с 5% CO2 и при относительной влажности 95% для стабилизации физиологических параметров. Для исследования транспорта в направлении от апикального к базолатеральному (А-В), буфер при рН 7,4 удаляли из апикального компартмента и меняли на дозирующий раствор лоперамида перед помещением в многолуночные планшеты с вкладышами. Растворы приготавливали, растворяя лоперамид в ДМСО с буфером, получив конечную концентрацию лоперамида 5 мкМ (конечную концентрацию ДМСО доводили до 1%). Флуоресцентный маркер целостности люциферовый желтый также включали в раствор для дозирования. Эксперимент проводили в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения (наносимого на апикальные и базолатеральные компартменты). Для транспорта в направлении от апикального к базолатеральному (В-А), субстрат Р-гликопротеина, лоперамид (конечная концентрация = 5 мкМ) помещали в базолате-ральный компартмент. Эксперимент проводили в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения (наносимого на апикальные и базолатеральные компартменты). Инкубирование проводили в атмосфере 5% CO2 с относительной влажностью 95% при 37°С в течение 60 мин. После инкубационного периода многолуночный планшет удаляли, а апикальные и базолатеральные образцы разводили для анализа ЖХ-МС/МС. Выполняли одиночное определение каждой концентрации тестируемого соединения. На каждом планшете также в качестве положительного контроля скринировали ингибитор. Тестируемое соединение оценивали при 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 и 50 мкМ. Целостность монослоев в ходе эксперимента проверяли, отслеживая проникание люциферового желтого, используя флюориметрический анализ. После анализа вычисляли IC50 (т.е. концентрацию ингибитора (тестируемого лекарственного соединения), при которой достигался полумаксимальный ингибирующий эффект.
In vitro оценка ингибирования переносчиков поглощения.
Для оценки ингибирования переносчиков поглощения ОАТ1В1 и ОАТ1В3 использовали in vitro анализ переносчиков поглощения Solvo Biotechnology, Inc. Эксперименты по поглощению с тестируемым продуктом (ТА) выполняли при 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 и 50 мкМ на клетках СНО, стабильно экспрессирующих SLC транспортеры ОАТР1В1 и ОАТР1В3 человека. Исходную линию клеток СНО-K использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки (1х105 в 200 мкл смеси 1:1 модифицированной по Дульбекко среды Игла и среды Хэма F-12 DMEM (F-12, Lonza, New Jersey, US) с добавкой 5 мМ бутирата натрия) высевали на стандартные 96-луночные планшеты для культур тканей и инкубировали 24 ч до эксперимента при 37°С в атмосфере 5% CO2 и 95% влажности воздуха. Перед началом экспери
ментов среду удаляли вакуумным аспиратором, клетки промывали 2х 100 мкл буфера Кребса-Хенселейта, рН 7,3 (приготовленного из реактивов Sigma, Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Эксперименты по поглощению проводили при 37°С в 50 мкл буфера Кребса-Хенселейта (рН 7,3), содержащего маркерный субстрат и ТА или растворитель соответственно. Концентрация органического растворителя была одинаковой в каждой лунке и не превышала 1% об./об. Маркерным субстратом для анализа ОАТР1В1 являлся E3S (0,1 мкМ), а для анализа ОАТР1В3^кю-3 (10 мкМ). Перемещенное количество маркерного субстрата определяли для каждой лунки в карте в имп/мин. Относительные активности вычисляли из уравнения
% активности = (А-В)/(0^)х 100, где А - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА на трансфицированных клетках, В - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА на исходных клетках, С - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя на трансфицированных клетках и D - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя на исходных клетках.
IC50 определяли как концентрацию ТА, требуемую для ингибирования транспорта маркерного субстрата на 50%. IC50 получали из трехпараметрического логистического уравнения; аппроксимирующую кривую зависимости относительной активности от концентрации ТА строили с помощью нелинейной регрессии.
In vitro оценка ингибирования эффлюксных переносчиков.
Для оценки ингибирования эффлюксных переносчиков MRP2, MRP3 и BSEP использовали in vitro анализ везикулярных переносчиков Solvo Biotechnology Inc. Тестируемые продукты (ТА) (при конц. 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 и 50 мкМ) инкубировали с эффлюксными транспортными мембранными везикулами (Solvoh Biotechnology Inc.) в отсутствие и в присутствии 4 мМ АТФ, чтобы выявить различия между опосредованным переносчиками поглощением и пассивной диффузией ТА в везикулы. В случае переносчиков MRP2 и MRP3 реакции проводили в присутствии 2 мМ глутатиона. Реакционные смеси предварительно инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Реакции инициировали добавлением 25 мкл 12 мМ Mg АТФ (конечная концентрация в анализе 4 мМ) или аналитического буфера для контроля фона. Реакции останавливали, добавляя 200 мкл охлажденного во льду промывочного буфера, и с последующей немедленной фильтрацией через стекловолоконные фильтры в 96-луночном формате (фильтр-планшет).
Сцинтилляционный буфер добавляли в промытый и высушенный фильтр-планшет, после чего считывали сцинтилляцию. Маркерными субстратами являлись таурохолат (2 мкМ) для BSEP везикул и E217pG (1 мкМ) для MRP2 и MRP3 везикул. Для всех лунок перемещенное количество маркерного субстрата определяли в имп/мин. Относительные активности вычисляли из следующего уравнения:
% активности = (А-В)/(0^)х 100,
где А - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА и АТФ, В - перемещенное количество субстрата в присутствии ТА, С - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя и АТФ и D - перемещенное количество субстрата в присутствии растворителя.
IC50 определяли как концентрацию ТА, требуемую для ингибирования транспорта маркерного субстрата на 50%. IC50 получали из трехпараметрического логистического уравнения; аппроксимирующую кривую зависимости относительной активности от концентрации ТА строили с помощью нелинейной регрессии.
In vitro анализ для оценки противовирусной активности в отношении ВИЧ.
Противовирусную эффективность против ВИЧ можно определить следующим образом: CD4+ Т-лимфоциты и макрофаги из крови выделяют, как описано ранее (Bobardt et al., 2008). Вкратце, человеческие МКПК выделяли из свежей крови в градиенте Ficoll-Hypaque (30 мин, 800 г, 25°С). Первичные человеческие CD4+ Т-клетки выделяли из МКПК с помощью положительной селекции с использованием анти-CD4 гранул Dynabeads и последующим отделением при использовании Detachabead. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen) с добавкой 10% FCS, MEM аминокислот, L-глутамина, MEM витаминов, пирувата натрия и пенициллина со стрептомицином, после чего активировали бактериальным суперантигеном стафилококковым энтеротоксином В (SEB; 100 нг/мл) и полученными от другого донора МКПК, убитыми митомицином С (отношение МКПК:CD4 клеток 10:1). Через три дня после стимуляции клетки делили 1:2 в среде, содержащей IL-2 (конечная концентрация 200 единиц/мл). Затем культуры делили 1:2 каждые 2 дня в среде IL-2 и заражали ВИЧ через 7 дней после стимуляции. Для получения первичных человеческих макрофагов, моноциты очищали от человеческих МКПК с помощью отрицательной селекции, активировали и культивировали при концентрации клеток 106/мл в DMEM с добавкой 10% FCS, MEM аминокислот, L-глутамина, MEM витаминов, пирувата натрия, а также пенициллина (100 ед./мл), стрептомицина (100 мг/мл) и 50 нг/мл рекомбинантного человеческого гранулоци-тарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и поддерживали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Для получения макрофагов, происходящих из моноцитов, клеткам позволяли прикрепляться к поверхности пластика и культивировали их в течение 6 дней, чтобы позволить пройти дифференцировке.
Клетки CD4+ HeLa, клетки Jurkat, активизированные CD4+ Т-лимфоциты периферической крови и макрофаги (500000 клеток/100 мкл) инкубировали с pNL4.3-GFP (X4 вирус) или pNL4.3-BaL-GFP (R5 вирус) (100 нг р24) в присутствии увеличивающихся концентраций тестируемого продукта. Через 48 ч инфекцию оценивали, анализируя процент GFP-положительных клеток методом FACS и вычисляя ЕС50.
In vitro анализ для оценки противовирусной активности в отношении HBV.
Противовирусную эффективность против HBV можно определить следующим образом: клетки HepG2 2.2.15 высевали в 96-луночные микротитровальные планшеты. Через 16-24 ч конфлюентный монослой клеток HepG2 2.2.15 промывали и заменяли среду полной средой, содержащей различные концентрации тестируемого соединения в трех повторах (например, шесть полулогарифмических концентраций). Через три дня среду культивирования заменяли свежей средой, содержащей надлежащим образом разведенные тестируемые соединения. Через шесть дней после первоначального введения тестируемого соединения супернатант клеточной культуры собирали, обрабатывали проназой и затем использовали в количественном TaqMan кПЦР анализе в реальном времени. PCR-амплифицированную ДНК HBV детектировали в реальном времени, контролируя усиление сигналов флюоресценции, обусловленных экзонуклеотической деградацией погашенной флуоресцентной маркерной молекулы, которая гибридизи-ровалась с амплифицированной ДНК HBV. При каждой ПЦР-амплификации одновременно генерировалась стандартная кривая при использовании разведений очищенной ДНК HBV. Противовирусную активность вычисляли по снижению уровней ДНК HBV (IC50). Затем анализ с поглощением красителя использовали для измерения жизнеспособности клеток, которая использовалась для вычисления токсичности (ТС50). Терапевтический индекс (TI) вычисляли как TC50/IC50.
In vitro анализ реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) для оценки иммунодепрессантной активности.
Иммунодепрессантную активность определяли следующим образом: популяции мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) выделяли из крови двух нормальных, не являющихся родственниками доноров-добровольцев (А и В) при использовании центрифугирования через Histopaque. Клетки подсчитывали и высевали по 1х105 клеток в лунку в 96-луночные планшеты со средой RPMI, содержащей добавки и 2% человеческую АВ сыворотку. Условия культивирования включали популяции клеток А и В по отдельности и смешанную популяцию клеток А и В в отсутствие или в присутствии тестируемых соединений, каждое соединение в 6 различных концентрациях. Соединения тестировали в дозах в пределах от 10 до 0,0001 мкМ с 1-log приращениями. Контрольные лунки содержали концентрацию среды для разведения (0,5% ДМСО), сопоставимую с концентрацией, присутствующей в лунках с тестируемыми соединениями. Культуры получали в трех экземплярах в 96-луночном планшете и инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2. В день 6 после начала анализа добавляли 3H-тимидин и собирали через 24 ч. Затем сравнивали уровни пролиферации в зависимости от различных условий культивирования.
Способность каждого разведения тестируемого соединения ингибировать пролиферацию в СКЛ вычисляли как процент ингибирования. Это позволило оценить IC50 (концентрацию тестируемого соединения, которая приводит к 50% снижению количества импульсов в минуту). Чтобы вычислить IC50, ось X преобразовали в логарифмический масштаб. Нелинейную регрессию использовали для аппроксимации точек данных в средние. Выбирали сигмоидальный переменный наклон.
Анализ ELISA взаимодействия Cyp-NS5A.
Данный анализ использовали для измерения разрушения комплексов Cyp-NS5A, что можно использовать для определения активности взаимодействия с циклофилином D. Вкратце, получение и очистку рекомбинантных белков GST, GST-CypD и Con1 NS5A-His выполняли, как описано ранее (Chatterji et al., 2010). Планшеты Nunc MaxiSorb с 8 лунками в стрипе покрывали GST или GST-CypD в течение 16 ч при 4°С и блокировали. Рекомбинантный NS5A-His (1 нг/мл) добавляли в лунки в 50 мкл связывающего буфера (20 мМ Трис, рН 7,9, 0,5М NaCl, 10% глицерина, 10 мМ DTT и 1% NP-40) в течение 16 ч при 4°С. Связанный NS5A-His затем детектировали, используя мышиные антитела против His (1 мкг/мл) (anti-6xHis, Clontech) и кроличьи антитела против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) и фосфатазой (разведение 1:1000). Все эксперименты проводили дважды, используя две различных партии рекомбинантных белков CypD и NS5A.
Анти-PPIазный анализ ингибирования циклофилинов.
Альтернативная методика анализа взаимодействия с циклофилинами описана ниже: PP^^'io активность рекомбинантного СурА или D, образующихся при расщеплении тромбином GST-CypA или D, определяли, отслеживая скорость гидролиза N-сукцинил-Ala-Ala-Pro-Phe-п-нитроанилида под действием химотрипсина.
Химотрипсин гидролизует только транс-форму пептида, при этом гидролиз цис-формы, концентрация которой максимально повышается при использовании стока, растворенного в трифторэтаноле, содержащем 470 мМ LiCl, лимитирован скоростью цис-транс-изомеризации. СурА или D уравновешивали в течение 1 ч при 5°С с выбранным тестируемым продуктом, используя диапазон концентраций лекарственного соединения от 0,1 до 20 нМ. Реакцию инициировали добавлением пептида и изменение оптического поглощения отслеживали спектрофотометрически со скоростью 10 точек данных в секунду. Холо
стые скорости гидролиза (в отсутствие СурА или D) вычитали из скоростей в присутствии СурА или D. Начальные скорости ферментативной реакции анализировали с помощью регрессионного анализа первого порядка динамики изменения оптического поглощения.
Примеры
Пример 1. Конструирование мутанта Streptomyces sp. А92-308110 (DSM9954) с делецией sfaA.
1.1 Конструирование конструкции с делецией sfaA.
Фрагмент EcoRV-StuI космиды TL3006 (SEQ ID NO: 3) длиной ~7 тпн, охватывающий sfaA (нук-леотидное положение 14396-21362, регистрационный номер последовательности в NCBI FJ809786), вырезали при расщеплении EcoRV и StuI и полученный выделенный фрагмент лигировали непосредственно в pKC1139, который предварительно расщепляли EcoRV и обрабатывали щелочной фосфатазой креветки (Roche). Эту плазмиду обозначили pSGK268.
Делецию в рамке считывания гена sfaA, содержащегося в этом клоне, выполняли при использовании набора рекомбинации Red/ET (recombination kit), поставляемого Gene Bridges (номер по каталогу К006).
(SEQ ID NO. 1) SfaA17161f 5'-
CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAAT TAACCCTCACTAAAGGGCG-31
(SEQ ID NO. 2) SfaA17825r 5'-
TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAA
TACGACTCACTATAGGGCTC-3'
Два олигонуклеотида, SfaA17161f и SfaA17825r, использовали для амплификации неомицинового маркера с ДНК-матрицы FRT-PGK-gb2-neo-FRT, поставляемой в наборе, при использовании ДНК-полимеразы KOD. Полученный амплифицированный продукт длиной ~1,7 тпн выделяли с помощью гель-электрофореза и очищали из геля с использованием смолы QiaEX.
Плазмидой pSGK268 трансформировали Е. coli DH10B, используя стандартные методы, и селекцию вели на чашках, содержащих апрамицин (50 мкг/мл). Введение конструкции с делецией проводили, по существу, согласно методике в наборе Gene Bridges. Одиночную колонию выращивали в течение ночи в 2TY с апрамицином (50 мкг/мл) и трансформировали плазмидой pRedET(tet) с селекцией на апрамицине (50 мкг/мл) и тетрациклине (3 мкг/мл) при 30°С. Одну колонию использовали для получения ночной культуры данного штамма в 3 мл 2TY с апрамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (3 мкг/мл) при 30°С. 0,5 мл данной культуры использовали для инокуляции 10 мл 2TY с апрамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (3 мкг/мл) при 30°С и выращивали культуру до OD^o^ ~0,5. По 1,4 мл этой культуры переносили в каждую из 2 пробирок eppendorf и 50 мкл 10% арабинозы добавляли в одну пробирку, чтобы вызвать экспрессию белков Red/ET рекомбинации. Пробирки встряхивали в течение ~1 ч при 37°С. Индуцированные и неиндуцированные клетки осаждали в настольной центрифуге и дважды промывали охлажденной стерильной водой, каждый раз ресуспендируя и центрифугируя клетки. Полученные осадки суспендировали приблизительно в 30-40 мкл воды и помещали в лед. Прерванный фрагмент длиной 1,7 тпн, выделенный ранее, добавляли в индуцированные и неиндуцированные пробирки и переносили на льду в 1 мм кюветы для электропорации Biorad. Образцы электропорировали (Biorad Micropulser при 1,8 кВ, конечное время затухания импульса ~4 мс), добавляли 1 мл 2TY (без антибиотиков) и перемешивали, чтобы удалить клетки из кюветы. Клетки инкубировали в течение ~3 ч при 37°С с встряхиванием (1100 об/мин, компактный термошейкер Eppendorf Thermomixer) перед посевом на чашки 2TY, содержащие апрамицин (50 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Колонии с чашек с индуцированными образцами сеяли на чашки 2TY, содержащие 50 мкг/мл канамицина для очистки и подтверждения введения кассеты устойчивости к канамицину. ПЦР на индивидуальных бактериальных колониях использовали для подтверждения введения кассеты. Плазмиды выделяли из этих культур и расщепляли, чтобы подтвердить ожидаемую плазмиду pSGK270. Затем плазмиды расщепляли NsiI для удаления маркерного фрагмента, а остальную часть снова лигировали с получением конструкции pSGK271 с делецией sfaA в рамке считывания.
1.2 Конъюгирование Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) и введение делеции sfaA. Плазмидой pSGK271 трансформировали Е. coli ET12567 pUZ8002 с использованием стандартных
методов и отбирали клоны на 2TY чашках, содержащих апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл). Полученный штамм инокулировали в 3 мл жидкой 2TY, содержащей апра-мицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С, 250 об/мин. 0,8 мл этой культуры использовали для инокуляции 10 мл жидкой 2TY, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл), в пробирке Falcon объемом 50 мл и инкубировали при 37°С и 250 об/мин до OD600HM ~0,5. Полученную культуру центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин при 4°С, дважды промывали в 10 мл среды 2TY, используя центрифугирование для осаждения клеток после каждой промывки. Полученный осадок ресуспендиро-вали в 0,5 мл 2TY и хранили на льду перед использованием. Этот процесс рассчитывали по времени так,
чтобы он совпал с полной готовностью спор Streptomyces, описанных ниже.
Споры Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370) собирали с 1-2-недельной конфлюент-ной чашки, ресуспендируя их в ~3 мл 20% глицерина. Споры центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин при комнатной температуре) и дважды промывали 50 мМ буфером TES перед ресуспендированием в 1 мл 50 мМ буфера TES и разделением в 2 пробирки eppendorf. Эти пробирки подвергали тепловому шоку при 50°С в течение 10 мин в водяной бане перед добавлением 0,5 мл 2TY и инкубированием в компактном термошейкере Eppendorf Thermomixer при 37°С в течение 4-5 ч.
Готовые Е. coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 и Biot-4370 смешивали в отношении 1:1 (по 250 мкл каждого штамма) и 1:3 (100 мкл Е. coli) и сразу сеяли на чашки R6 и переносили в инкубатор на 37°С. После инкубирования в течение приблизительно 2 ч на эти чашки наносили 2 мл стерильной воды, содержащей налидиксовую кислоту, чтобы получить конечную концентрацию в чашке 25 мкг/л. Чашки возвращали в инкубатор на 37°С на ночь перед нанесением 2 мл стерильной воды, содержащей апрами-цин, чтобы получить конечную концентрацию в чашке 20-25 мкг/л. Эксконъюгантные колонии, появившиеся через ~4-7 дней, переносили мазками на среду ISP4, содержащую апрамицин (25 мкг/л) и нали-диксовую кислоту (25 мкг/л), и инкубировали при 37°С. Как только начинал наблюдаться достаточный рост мицелия, штаммы переносили мазками на среду ISP4, содержащую апрамицин (25 мкг/л), при 37°С и позволяли спорулировать. Затем штаммы три раза пересевали (чтобы ускорить удаление термочувствительной плазмиды), переносили на ISP4 (без антибиотика) и инкубировали при 37°С в течение 3-4 дней. Наконец штаммы переносили на ISP4 и инкубировали при 28°С, чтобы позволить полное образование спор (5-7 дней). Споры собирали и последовательно разводили на чашках ISP4 при 28°С, чтобы отобрать одиночных колоний. Спорулировавшие одиночные колонии дважды переносили на чашки ISP4 с или без апрамицина (25 мкг/л) для подтверждения потери плазмиды и оставляли для подращивания на ~7 дней до анализа на продукцию санглиферинов.
1.3. Скрининг штаммов на продукцию санглиферинов в пробирках Falcon.
Один ~7 мм агаровый столбик хорошо спорулирующего штамма использовали для инокуляции 7 мл стерильной среды SM25-3 и инкубировали при 27°С и 200 об/мин в шейкере с подбросом на 5 см. Через 48 ч роста 0,7 мл данной культуры переносили в стерилизованные пробирки Falcon, содержащие 7 мл среды SGP2 с 5% смолы НР20. Культуры выращивали при 24°С и 300 об/мин в шейкере инкубаторе с подбросом на 2,5 см в течение 5 дней перед сбором. Аликвоты 0,8 мл бактериальной культуры отбирали и переносили в 2 мл пробирку eppendorf, обеспечивая надлежащее распределение смолы по всему объему культуры перед отбором аликвоты. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 15 мкл муравьиной кислоты и перемешивали содержимое пробирки в течение приблизительно 30 мин. Смесь осветляли центрифугированием и отбирали 170 мкл экстракта в ВЭЖХ флакон, анализировали с помощью ВЭЖХ.
1.4. Анализ штаммов на реверсию в дикий тип или sfaA фенотип.
Экстракты штаммов анализировали с помощью ВЭЖХ. Штаммы, которые продуцировали сангли-ферин А и В, не анализировали далее, поскольку они возвратились к дикому типу. Штаммы, не продуцирующие санглиферин А и В, показали низкие уровни (~1-2 мг/л) пикового времени удержания 6,5 мин, что отражает присутствие санглиферинподобного хромофора. Анализ ЖХМС показал, что этот пик имел значение m/z 1073, -16 единиц от ожидаемого m/z санглиферина. Предположили, что данный пик был обусловлен включением фенилаланина в отсутствие метагидрокситирозина.
Восемь штаммов, показывающих потерю продукции санглиферинов, впоследствии повторно выращивали, чтобы оценить, может ли потенциальная sfaA мутация быть дополнена химически, обеспечивая мутасинтетический процесс получения новых санглиферинов. Штаммы выращивали в посевной среде SM25-3 в течение 48 ч перед переносом в продукционную среду SGP2 с 5% смолы. После еще 24 ч роста штаммов в среду в трех повторах вводили 2 мМ DL метагидрокситирозин (добавка 100 мкл 0,16М раствора в 1М HCl) или 2 мМ L-фенилаланин, при этом штамм без таких добавок использовали в качестве контроля. Штаммы также подпитывали пипеколиновой кислотой (2 мМ) в метаноле для повышения выходов продукта. Штаммы собирали после роста еще в течение 4 дней, экстрагировали и анализировали с помощью ВЭЖХ. Было показано, что метагидрокситирозин полностью соответствует sfaA мутации, при этом добавление L-фенилаланина повышало уровни -16 аем соединения. Штамм Biot-4585 выбирали для дальнейшего исследования в качестве мутанта с делецией sfaA.
Пример 2. Другие способы создания конструкции с делецией sfaA.
Другие способы могут применяться для создания мутантов с делецией sfaA. Примеры включают мутанты с инактивацией sfaA в результате вставки (такие как пример 12 из WO 2010/034243). Данный штамм создавали, как описано в WO 2010/034243, и присвоили обозначение штамма BIOT-4452.
В альтернативной методике для введения делеции sfaA два олигонуклеотида
15209F 5'-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3' (SEQ ID
NO. 4) и 17219R 51-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3'
(SEQ ID NO. 5)
использовали для амплификации расположенной против хода транскрипции области гомологии, используя космиду TL3006 (SEQ ID NO. 3) в качестве матрицы и ДНК-полимеразу KOD. Амплифицированный
продукт обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 (NEB) и клонировали в pUC18, дефосфорилированный при обработке щелочной фосфатазой креветки (Roche). Полученную конструкцию проверяли рестрикци-онным анализом и тщательно секвенировали, чтобы убедиться в получении нужной последовательности и в том, что в процессе амплификации полимеразой не были введены ошибки. Эту конструкцию расщепляли по EcoRI и NsiI и анализировали продукты с помощью гель-электрофореза. Полосу, содержащую нужную последовательность (т.е. левую ~2 тпн область гомологии), вырезали из геля, и очищали с использованием стандартных методик (смола QiaEX). Вторую пару олигонуклеотидов
17766F 5'-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3' (SEQ ID NO, 6) И 19763R 5'-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3' (SEQ ID ЫО. 7)
использовали для амплификации расположенной по ходу транскрипции области гомологии, используя космиду TL3006 (SEQ ID NO. 3) в качестве матрицы и ДНК-полимераза KOD. Амплифицированный продукт обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 (NEB) и клонировали в pUC18, дефосфорилированный при обработке щелочной фосфатазой креветки (Roche). Полученную конструкцию проверяли рестрикци-онным анализом и тщательно секвенировали, чтобы убедиться в получении нужной последовательности и в том, что в процессе амплификации полимеразой не были введены ошибки. Эту конструкцию расщепляли по HindIII и NsiI и анализировали продукты с помощью гель-электрофореза. Полосу, содержащую нужную последовательность (т.е. правую ~2 тпн область гомологии), вырезали из геля, и очищали с использованием стандартных методик (смола QiaEX). Вектор pKC1139 расщепляли по EcoRI и HindIII и большой фрагмент вектора выделяли с помощью гель-электрофореза и очищали стандартными методами (смола QiaEX). Выделенные левый и правый фрагменты гомологии затем клонировали в указанный фрагмент pKC1139 в тройном лигировании, получив требуемую конструкцию с делецией sfaA.
В другой альтернативной методике создания конструкции с делецией sfaA использовали коммерческий синтез гена (т.е. Genscript или другого поставщика) для получения конструкции, содержащей требуемую последовательность (SEQ ID NO.8). Данную приобретенную конструкцию расщепляли, используя BamHI и XbaI, чтобы вырезать целевую последовательность, и анализировали продукты с помощью гель-электрофореза. Полосу, содержащую нужную последовательность (~4 тпн), вырезали из геля и очищали с использованием стандартных методов. Вектор pKC1139 расщепляли по BamHI и XbaI и большой фрагмент выделяли с помощью гель-электрофореза и очищали стандартными методами. Два выделенных фрагмента затем лигировали с получением требуемой конструкции с делецией sfaA.
Указанные альтернативные конструкции с делецией sfaA вводили в Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) путем конъюгирования и отбора вторичного кросса, используя методы, описанные в примере 1.2. Выращивание и анализ штаммов, сконструированных таким образом, также проводили согласно способам, описанным в примере 1.2.
Пример 3. Множественная подпитка мутанта с делецией sfaA.
Стоки спор мутанта с прерыванием sfaA (BIOT-4452 или BIOT-4585) приготавливали после роста на среде МАМ, ISP4, ISP3 или ISP2, сохраняли в 20% мас./об. глицерине в дистиллированной воде и хранили при -80°С. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали путем инокуляции стока спор (1% об./об.) в 7 мл посевной среды (среда SM25) в центрифужных пробирках объемом 50 мл с поропластовыми пробками. Пробирки с культурой инкубировали при 27°С, 250 об/мин (подброс на 5 см) в течение 48 ч. Из посевной культуры 10% (об./об.) переносили в 7 мл продукционной среды SGP-2 в центрифужных пробирках объемом 50 мл с поропластовыми пробками. Культивирование проводили при 24°С и 300 об/мин (подброс на 2,5 см). Для производства мутасинтетических аналогов санглиферинов, 0,05 мл 0,32М раствора (в 1Н HCl) вносимого в среду соединения (мутасинтона) добавляли в каждую пробирку через 24 ч после инокуляции до конечной концентрации 2 мМ. Дополнительно в каждую пробирку добавляли 0,05 мл 0,32М раствора пиперазиновой кислоты (в метаноле) в 24 ч с получением конечной концентрации 2 мМ. Культивирование продолжали в течение дополнительных четырех дней.
Образцы экстрагировали, перенося 0,8 мл цельной среды культивирования в пробирку eppendorf объемом 2 мл с крышкой. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 0,015 мл муравьиной кислоты. Затем смесь встряхивали в течение 30 мин на встряхивателе Vibrax. После этого пробирку центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин и отбирали 0,15 мл супернатанта для анализа. Экстракты анализировали, как описано в общих методах.
В табл. 1 показаны мутасинтоны, которые вводили в среду, таким образом, а также ЖХМС Н+ и Na+ аддукты, ожидаемая молекулярная масса и время удержания наблюдаемых мутасинтетических продуктов санглиферинов. Показаны основные пики, относящиеся к аналогам санглиферинов. Во всех случаях пики ЖХМС также наблюдали для аналогов санглиферина В (Масса -18).
Таблица 1
Введенный мутасинтон
Название мутасинтона
[м-н]"
наблюд, (m/z)
[М+Иа]* наблюл. (m/z)
Мол.
масса (аем)
Время удержания (минуты)
2-амино-З-(4-фтор-З-гидроксифенил)пропановая кислота
1106,4
1130,4
1107,4
5,5
2-амино-3 -(3-фтор-5 -
гидроксифенил)пропановая кислота
1106,4
ИЗО, 4
1107,4
5,7
метил 2-амино-З-(З-фтор-5-гидроксифенил)пропионат
1106,4
1130,4
1107,4
5,7
^XJ NH,
метил (?)-2-амино-З-(3-гидрокси-4 -метилфенил)пропаноат
1102,5
1126,7
1103,5
6, 0
"СПС
2 -амино- 3 - (3 -фторфенил)пропановая кислота
1090,4
1114,5
1091
6, 1
метил-(2S)-2-змино-З-(3-гидрокси(2-пиридил)(пропаноат
1089,5
1113,7
1090,5
4, 4
метил-2-амино-3-(2-фтор-5-
гидроксифенил)пропаноат
110S,5
1130,6
1107,5
5,5
метил-2-амино-3-(2-фтор-3~ гидроксифенил)пропаноат
1106,5
ИЗО, 6
1107,5
5, 1
метил-2-амино-З-(2,6-дифтор-3-
гидроксифенил)пропаноат
1124,4
1148,5
1125,5
5, 1
Пример 4. Выделение 63-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 14.
Ферментацию проводили, как описано в общих методах, используя метил-2-амино-3-(3-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат и DL-пиперазиновую кислоту в качестве предшественников, которые добавляли в 26 ч.
После сбора среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой, центрифугировали (3300 g) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании магнитной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали либо центрифугированием, либо позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом, и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (1,3 г).
Неочищенный экстракт (1,3 г) растворяли в этилацетате (2 мл) и наносили на колонку с силикаге-лем (10x2 см), уравновешенную этилацетатом (500 мл). Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (278 мг) растворяли в метаноле (1,8 мл) и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (20 мг).
Пример 5. Выделение 62, 63-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 15.
Ферментацию проводили, как описано в общих методах, используя метил-(8)-2-амино-3-(3,4-дифтор-5-гидроксифенил)пропаноат и DL-пиперазиновую кислоту в качестве предшественников, кото
рые добавляли в 26 ч.
После сбора среды культивирования объединяли и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 д) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании магнитной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали либо центрифугированием, либо позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (1,6 г).
Неочищенный экстракт (1,6 г) растворяли в 2 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (10x 2 см), уравновешенную этилацетатом (500 мл). Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (188 мг) растворяли в 1,8 мл метанола и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонит-рилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (15 мг).
Пример 6. Выделение 62-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 16.
В качестве предшественников использовали метил-(8)-2-амино-3-(4-фтор-3-гидроксифенил)про-паноат и DL-пиперазиновую кислоту. Работали в соответствии с общим методом за исключением того, что предшественники добавляли в 27 ч.
После сбора среды культивирования объединяли и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 g) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании магнитной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали либо центрифугированием, либо позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях.
Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный маслообразный материал (4,2 г).
Неочищенный экстракт (4,2 г) растворяли в 4 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15x2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (390 мг) растворяли в 2,4 мл метанола и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонит-рилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (38 мг).
Пример 7. Выделение 62-метилсанглиферина А, промежуточного соединения 17.
Криоконсервированные стоки спор BIOT-4585 размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали, перенося 0,4 мл стока спор в 400 мл среды SM25 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование проводили в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см). Из посевной культуры 20 мл переносили в 400 мл продукционной среды SGP2+5%HP20 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. После культивирования в течение 24 ч при 24°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см) в каждую продукционную колбу добавляли 2 мл 200 мМ раствора метил-(8)-2-амино-3-(3-гидрокси-4-метилфенил)пропаноата в 1М соляной кислоте и 2 мл 400 мМ метанольного раствора DL-пиперазиновой кислоты, получив конечную концентрацию 1 мМ индивидуальных энантиомеров предшественников. Культивирование было продолжено в течение еще четырех дней при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см).
Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целе
вого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этил-ацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (7,6 г).
Неочищенный экстракт (7,6 г) растворяли в 5 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15 x 2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (319 мг) растворяли в 2,4 мл метанола и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонит-рилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлением, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (14,9 мг).
Пример 8. Выделение 61-дегидроксисанглиферина А, промежуточного соединения 18.
Криоконсервированные стоки спор BIOT-4585 размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали, перенося 0,4 мл стока спор в 400 мл среды SM25 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование проводили в течение 48 часов при 27°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см). Из посевной культуры 500 мл переносили в 4,5 л продукционной среды SGP2+5%HP20 в 7 л ферментере Applikon и выращивали при 24°С, 400 об/мин (каскадный контроль перемешивания), с потоком воздуха 2,5 л/мин и 30% DOT (каскадный контроль давления растворенного кислорода (DOT)). После культивирования в течение 24 ч 7,5 мл 667 мМ раствора (8)-2-амино-3-фенилпропановой кислоты в 1М соляной кислоте добавляли в ферментер до конечной концентрации предшественника 1 мМ. Культивирование продолжали в течение еще четырех дней при 24°С, 400 об/мин (каскадный контроль перемешивания), с потоком воздуха 2,5 л/мин и 30% DOT (каскадный контроль
DOT).
Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой и центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях, но второй экстракт собирали центрифугированием. Объединенные экстракты в аце-тонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (55 г).
Неочищенный экстракт (55 г) суспендировали в 80% метаноле в воде и дважды экстрагировали 300 мл гексана. Целевое соединение было обнаружено в метанольно-водной части, и ее выпаривали досуха. Полученный высушенный экстракт (48 г) растворяли в 30 мл этилацетата и наносили на колонку с сили-кагелем (20x 5 см), уравновешенную 1 л этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом и затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (813 мг) растворяли в метаноле и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонит-рилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (34 мг).
Пример 9. Выделение, 58-дез(3-гидроксифенил)-58-(3-гидрокси-(2-пиридил)санглиферина А, промежуточного соединения 19.
В качестве предшественников использовали метил-(28)-2-амино-3-(3-гидрокси-(2-пиридил))пропа-ноат и DL-пиперазиновую кислоту. Работали в соответствии с общим методом за исключением того, что подброс в инкубаторе в течение вегетативного (посевного) культивирования составлял 2,5 см.
Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой, центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целе
вого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этил-ацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (7 г).
Неочищенный экстракт (7 г) растворяли в 4 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15 x 2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом, а затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате до 100% ацетона, затем в ступенчатом градиенте от 1% метанола до 5% метанола в ацетоне). Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (204 мг) растворяли в метаноле и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически в 50% В в течение 6 мин после введения, с последующим градиентом до 100% В в 30 мин. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (4 мг).
Пример 10. Выделение 61-дегидрокси-61-фторсанглиферина А, промежуточного соединения 20.
Криоконсервированные стоки спор BIOT-4585 размораживали при комнатной температуре. Вегетативные культуры (посевные культуры) приготавливали, перенося 0,4 мл стока спор в 400 мл среды SM25 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластовой пробкой. Культивирование проводили в течение 48 ч при 27°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см). Из посевной культуры 20 мл переносили в 400 мл продукционной среды SGP2+5%HP20 в 2 л колбах Эрленмейера с поропластозой пробкой. После культивирования в течение 24 ч при 24°С и 250 об/мин (подброс на 2,5 см) в каждую продукционную колбу добавляли 2 мл 400 мМ раствора 2-амино-3-(3-фторфенил)пропановой кислоты в 1М соляной кислоте и 2 мл 400 мМ метанольного раствора DL-пиперазиновой кислоты, получив конечную концентрацию 1 мМ индивидуальных энантиомеров-предшественников. Культивирование продолжали в течение еще четырех дней при 24°С и 250 об/мин (с подбросом на 2,5 см).
Среды культивирования объединяли в пулы и доводили рН до приблизительно рН 3 муравьиной кислотой, центрифугировали (3300 г) в течение 25 мин для отделения клеток и смолы от осветленной среды. Осветленную среду отбрасывали после анализа, подтвердившего присутствие менее чем 5% целевого соединения. Клетки и смолу перемешивали с 2 объемами ацетонитрила в течение 1 ч при использовании верхнеприводной лопастной мешалки. Экстракт в ацетонитриле собирали, позволяя ему осесть под действием силы тяжести. После этого проводили вторую экстракцию клеток и смолы ацетонитрилом при тех же условиях. Третий экстракт получали центрифугированием остатков смеси клеток и смолы. Объединенные экстракты в ацетонитриле концентрировали до объема остаточной воды при пониженном давлении, а затем доводили до рН 6. Этот раствор дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты выпаривали досуха при пониженном давлении, получив конечный неочищенный материал (10,5 г).
Неочищенный экстракт (10,5 г) растворяли в 7 мл этилацетата и наносили на колонку с силикагелем (15x2 см), уравновешенную 500 мл этилацетата. Колонку элюировали этилацетатом, а затем в ступенчатом градиенте с растущим содержанием ацетона (10, 20, 30% и т.д. в этилацетате).
Собирали фракции объемом приблизительно 250 мл и идентифицировали целевое соединение с помощью аналитической ЖХ, объединяли и выпаривали досуха. Полученный материал (342 мг) растворяли в метаноле и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Использовали колонку Waters Xterra MSC18 (10 мкм, 19 см x 250 мм) с подачей растворителя при 21 мл/мин. Растворитель А являлся водой, а растворитель В - ацетонитрилом. Колонку элюировали изократически при 53% В в течение 30 мин после введения. Чистые фракции идентифицировали с помощью ВЭЖХ-УФ и объединяли. Эти фракции выпаривали досуха при пониженном давлении, получив целевое соединение в виде грязно-белого аморфного вещества (6 мг).
Пример 11. Синтез диэтил-(2-(1,2-оксазинан-2-ил)-2-оксоэтил)фосфоната
? ? ° 9
OEt
'°4NH Cl^^a r <\N^Cl P(0Etb /0.NX^P~oEt
О нс, kj " U
2Ы 21-2 21
К раствору 21-1 (ChemCollect, Germany) (100 мг, 0,81 ммоль), Et3N (246 мг, 2,43 ммоль) в сухом ДХМ (5 мл) по каплям добавляли хлорацетилхлорид (138 мг, 1,22 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, вливали в воду со льдом и экстрагировали этилацета
том. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, и сушили над Na2SO4, фильтровали, выпаривали в вакууме. Остаток (21-2) использовали в следующей стадии без дополнительной очистки (123 мг, выход 90%).
Смесь 21-2 (123 мг, 0,75 ммоль) и триэтилфосфита (250 мг, 1,50 ммоль) перемешивали при 140°С в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали с помощью флеш-хроматографии, получив 21.
Альтернативный способ синтеза диэтил-(2-(1,2-оксазинан-2-ил)-2-оксоэтил)фосфоната, 21
21а-1 21а-2
К раствору t-BuOK (84,0 г, 0,75 моль) в тетрагидрофуране (2,0 л) порциями добавляли 21а-1 (50,0 г, 0,38 моль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. По каплям при комнатной температуре добавляли 1,4-дибромбутан (81,2 г, 0,38 моль). Затем смесь перемешивали при 80°С в течение 16 ч. После охлаждения добавляли воду (2000 мл), смесь экстрагировали этилацетатом (2x1000 мл). Объединенный органический слой сушили над безводным Na2SO4 в течение 16 ч, остаток после фильтрации и концентрирования очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир:этилацетат =100:1-10:1), получив 21а-2 (57 г) в виде бесцветного масла.
Общая методика получения 21а-3
К раствору 21а-2 (55 г, 0,29 моль) в метил-трет-бутиловом эфире (ТВМЕ, 80 мл) при комнатной температуре добавляли раствор 4Н HCl (600 мл, в ТВМЕ), смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и промывали ТВМЕ (50 мл) с получением 21а-3 (30 г) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения 21
21а-4 21
К перемешиваемому раствору 21а-4 (35 г, 0,18 моль), гидроксибензотриазола (НОВТ) (29 г, 0,21 моль) и Et3N (71 мл, 0,51 моль) в безводном дихлорметане (550 мл) порциями добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDCI) (41 г, 0,21 моль) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 0,5 ч, затем при 0°С добавляли 21а-3 (24 г, 0,20 моль) и перемешивали в течение 16 ч. После этого ТСХ (петролейный эфир/этилацетат 3/1) показала, что реакция прошла полностью. Тогда реакционную смесь медленно вливали в воду (500 мл) при энергичном перемешивании. Смесь экстрагировали дихлорметаном (2x 200 мл). Объединенный органический слой промывали насыщенным солевым раствором (2x100 мл), сушили Na2SO4, фильтровали и выпаривали, получив неочищенный продукт. После хроматографии (петролейный эфир/этилацетат, 100:1 - 10:1) получили 21 (38 г) в виде желтого масла.
Пример 12. Синтез диэтил-(2-оксо-2-(пиридин-2-иламино)этил)фосфоната
температуре в течение 3 ч, вливали в воду со льдом и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью системы Combiflash с обращенными фазами, получив 22-2.
Смесь 22-2 (170 мг, 1,00 ммоль) и триэтилфосфита (332 мг, 2,00 ммоль) перемешивали при 140°С в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали с помощью флеш-хроматографии, получив 22.
Пример 13. Получение соединения 23
К перемешиваемому раствору 14 (430 мг, 0,38 ммоль), (DHQ)2PHAL (18,6 мг, 0,024 ммоль), тетра-оксида осмия (0,156 мл, 0,012 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансуль-фонамида (74 мг, 0,77 ммоль) в 20 мл трет-бутилового спирта при комнатной температуре добавляли раствор феррицианида калия (382 мг, 1,16 ммоль) и карбоната калия (160 мг, 1,16 ммоль) в 20 мл воды, получив коричневую эмульсию. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали еще 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, упаривали при пониженном давлении и очищали с помощью обращенно-фазовой флеш-хроматографии, получив 23-2 в виде белого твердого вещества.
К перемешиваемому раствору 23-2 (240 мг, 0,21 ммоль) в 24 мл смеси 2:1 ТГФ и воды добавляли периодат натрия (91 мг, 0,42 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной частью воды и двумя частями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой флеш-хроматографии, получив 23-3.
К раствору диэтил-(2-(метокси(метил)амино)-2-оксоэтил)фосфоната (91 мг, 0,368 ммоль) в ТГФ (5,0 мл) добавляли NaH (2,8 мг, 0,1104 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 23-3 (70 мг, 0,092 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x30 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 23 в виде белого твердого вещества.
К раствору 21 (42 мг, 0,168 ммоль) в ТГФ (2,0 мл) добавляли NaH (1,2 мг, 0,05 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 23-3 (30 мг, 0,042 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали
Пример 14. Получение соединения 24
смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 24 в виде белого твердого вещества.
Пример 15. Получение соединения 25
К раствору 22 (48 мг, 0,168 ммоль) в ТГФ (2,0 мл) добавляли NaH (1,2 мг, 0,05 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 23-3 (30 мг, 0,042 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 25 в виде белого твердого вещества.
Пример 16. Получение соединения 26
К раствору 23 (13 мг, 0,015 ммоль), растворенного в диоксане (1 мл), добавляли водный раствор HCl (2M, 0,080 мл, 0,16 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 20°С в течение 24 ч и останавливали реакцию, вливая воду, после чего смесь экстрагировали этилацетатом (3x10 мл). Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и выпаривали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 26 в виде белого твердого вещества.
Пример 17. Получение соединения 27
К перемешиваемому раствору 17 (99 мг, 0,09 ммоль), (DHQ)2PHAL (4,2 мг, 0,0054 ммоль), тетраок-сида осмия (0,034 мл, 0,0027 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансуль-фонамида (18 мг, 0,18 ммоль) в 5 мл трет-бутилового спирта при комнатной температуре добавляли раствор феррицианида калия (90 мг, 0,27 ммоль) и карбоната калия (37 мг, 0,27 ммоль) в 5 мл воды, получив коричневую эмульсию. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали еще 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, выпаривали при пониженном давлении и очищали с помощью обращенно-фазовой флеш-хроматографией, получив 27-2 в виде белого твердого вещества.
К перемешиваемому раствору 27-2 (40 мг, 0,035 ммоль) в 3 мл смеси 2:1 ТГФ и воды добавляли пе-риодат натрия (15 мг, 0,07 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной частью воды и двумя частями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой флеш-хроматографии, получив 27-3 в виде белого твердого вещества.
К раствору 21 (28 мг, 0,104 ммоль) в ТГФ (2,0 мл) добавляли NaH (0,75 мг, 0,0312 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 27-3 (19,6 мг, 0,026 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x10 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 27 в виде белого твердого вещества.
Пример 18. Получение соединения 28
К перемешиваемому раствору 15 (349 мг, 0,31 ммоль), (DHQ)2PHAL (14 мг, 0,0186 ммоль), тетраок-сида осмия (0,117 мл, 0,0093 ммоль) в трет-бутиловом спирте (2,5 мас.%, 0,079 ммоль/мл) и метансуль-фонамида (59 мг, 0,62 ммоль) в 15 мл трет-бутилового спирта при комнатной температуре добавляли раствор феррицианида калия (128 мг, 0,93 ммоль) и карбоната калия (306 мг, 0,93 ммоль) в 15 мл воды, получив коричневую эмульсию. Через 2 ч добавляли раствор сульфита натрия и перемешивание продолжали еще 20 мин. Полученную смесь экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, выпаривали при пониженном давлении и очищали с помощью обращенно-фазовой флеш-хроматографии, получив 28-2 в виде белого твердого вещества.
К перемешиваемому раствору 28-2 (170 мг, 0,1466 ммоль) в 15 мл смеси 2:1 ТГФ и воды добавляли периодат натрия (62 мг, 0,2931 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Эту смесь экстрагировали тремя порциями этилацетата. Объединенные органические слои промывали одной частью воды и двумя частями насыщенного солевого раствора, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой флеш-хроматографии, получив 28-3 в виде белого твердого вещества.
К раствору 21 (41 мг, 0,155 ммоль) в ТГФ (1,0 мл) добавляли NaH (2,3 мг, 0,0575 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 28-3 (30 мг, 0,0387 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 28 в виде белого твердого вещества.
К раствору 22 (42 мг, 0,155 ммоль) в ТГФ (1,0 мл) добавляли NaH (2,3 мг, 0,0575 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 28-3 (30 мг, 0,0387 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 29 в виде белого твердого вещества.
Пример 20. Получение соединения 30
К раствору диэтил-(2-(метокси(метил)амино)-2-оксоэтил)фосфоната (37 мг, 0,155 ммоль) в ТГФ (1,0 мл) добавляли NaH (2,3 мг, 0,0575 ммоль) в безводном ТГФ (0,2 мл) при 0°С с перемешиванием. Затем раствор перемешивали при 20°С, пока он не становился прозрачным. После этого 28-3 (30 мг, 0,0387 ммоль) добавляли к прозрачному раствору и перемешивали смесь при 20°С в течение 2 ч. В смесь вливали воду (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали.
Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 30 в виде белого твердого вещества.
Пример 21. Биологические данные - HCV репликон и анализ.
Соединения анализировали в анализе репликонов генотипа 1b, используя клетки Huh5.2, как описано в общих методах. Циклоспорин А, 1, DEBIO-025, 2, санглиферин А, 5, и гидроксимакроцикл, 6, включали для сравнения.
Соединение
ЕС50
(мкМ)
CCS0 (мкМ)
Индекс селективности (СС50/ЕС50)
Циклоспорин Л, 1
0,62
DEBIO-025, 2
0, 096
11, 2
111
Санглиферин А, 5
0,318
9,1
28, 7
Гидроксимакроцикл, 6
8,4
83, 6
9, 9
0, 067
> 100
> 1493
0, 033
> 100
> 3030
0, 066
> 100
> 1515
0, 1
> 100
> 1000
0, 121
> 100
> 826
Как можно заметить, соединения изобретения 23, 24, 25, 26 и 27 значительно более активны в анализе репликонов в Huh5.2 (что продемонстрировано низким значением ЕС50), со значительно более высокой селективностью против линии клеток (что выражается высоким индексом селективности) по сравнению с CsA, Debio-025, SfA и гидроксимакроциклом.
Пример 22. Биологические данные - активность против ВИЧ.
Соединения анализировали в противовирусном анализе против ВИЧ, используя клетки HeLa, как описано в общих методах. Циклоспорин А, 1, DEBIO-025, 2, и противовирусные средства против ВИЧ, эмтрицитабин и тенофовир, включали для сравнения.
Соединение
Клетки HeLa ЕС5() (мкМ)
Циклоспорин А, 1
5,3
DEBIO-025, 2
1,5
Эмтрицитабин
0,4
Тенофовир
1,05
0, 13
Как можно заметить, соединение изобретения 24 значительно более активно по сравнению с CsA, DEBIO-025, эмтрицитабином и тенофовиром при ингибировании ВИЧ инфекции в данном анализе.
Пример 23. Биологические данные - PK In vivo при пероральном и в/в введении мышам.
Для оценки фармакокинетики соединений в in vivo соединения вводили внутрь в дозах 10 или 5 мг/кг и в/в в дозе 1 мг/кг группам CD1 мышей. Фармакокинетический анализ проводили, как описано в общих методах. Параметры РК представлены ниже.
Соединение
Уровень дозы (мг/кг)
Клиренс (л/ч/кг)
ро AUCiasc <нг*ч/мл)
Санглиферин А, 5
0, 054
2332
0, 039
2760
0, 017
8223
Как можно заметить, соединения 23 и 24 имели пониженный клиренс и повышенную экспозицию при введении внутрь (что продемонстрировано высоким значением ро AUCiast) по сравнению с сангли-ферином А.
Пример 24. Биологические данные - ингибирование PPfeKm активности СурА.
Для оценки прямого ингибирования пептидилпролил цис-транс-изомеразной (PP^toh) активности СурА использовали метод, описанный в общих методах. Циклоспорин А, 1, DEBIO-025, 2, и санглиферин А, 5, включали в качестве контролей.
Соединение
СурА РР1аза ICso (нМ)
Циклоспорин А, 1
9,7
DEBIO-025, 2
0,8
Санглиферин А, 5
2,4
0, 33
0, 31
1, 15
0,35
Как можно заметить, соединения изобретения 23, 24, 25 и 27 ингибировали PP^^'io активность СурА более эффективно, чем санглиферин A, DEBIO-025 и циклоспорин А.
Пример 25. Биологические данные - ингибирование переносчиков билирубина.
Для оценки потенциала нецелевого ингибирования переносчиков билирубина, которое считается причиной дозолимитирующей гипербилирубинемии, наблюдаемой при введении DEBIO-025, in vitro анализ ингибирования переносчиков проводили, как описано в общих методах.
Соединение
ОАТР1В1 1С50 (мкМ)
ОАТР1ВЗ
1С50 (мкМ)
MRP2
1С50 (мкМ)
MRP3
IC50 (мкМ)
Циклоспорин А, 1
0, 85
0, 13
4,1
3,1
DEBIO-025, 2
0,45
0,19
16, 0
> 50
4,3
1, 8
> 50
> 5 0
Как можно заметить, соединение изобретения 24 показывает намного меньшее ингибирование конъюгированных и неконъюгированных переносчиков билирубина по сравнению с DEBIO-025 и циклоспорином А.
Пример 26. Биологические данные - ингибирование переносчиков ксенобиотиков.
Для оценки потенциала взаимодействий между лекарственными средствами (DDI) посредством ин-
Как можно заметить, соединение изобретения 24 демонстрирует намного меньшее ингибирование переносчиков ксенобиотиков, потенциально участвующих во взаимодействии между лекарственными средствами, по сравнению с DEBIO-025 и циклоспорином А.
Ссылки.
Appel, N. , Т. Schaller, et al. (2006). "From structure to function: new insights into hepatitis С virus RNA replication." J Biol Chem 281(15): 9833-6.
Banteli, R. , J. Wagner, et al. (2001). "Synthesis of derivatives of the novel cyclophilin-binding immunosuppressant sanglifehrin A with reduced numbers of polar functions." Bioorg Med Chem Lett 11(12): 1609-12.
Chatterji, U., M. Bobardt, et al. (2009). "The isomerase active site of cyclophilin a is critical for HCV replication." J Biol Chem.
Colgan, J., M. Asmal, et al. (2000). "Isolation, characterization and targeted disruption of mouse ppia: cyclophilin A is not essential for mammalian cell viability." Genomics 68(2): 167-78.
Crabbe, R., G. Vuagniaux, et al. (2009). "An evaluation of the cyclophilin inhibitor Debio 025 and its potential as a treatment for chronic hepatitis C."Expert Opin Investig Drugs 18{2): 211-20.
Dolinski, K. , S. Muir, et al. (1997). "All cyclophilins and FK506 binding proteins are, individually and collectively, dispensable for viability in Saccharomyces cerevisiae," Proc Hatl Acad Sci USA 94(24): 13093-8.
E. Lawitz, R. R., T. Nguyen, M. Huang, J. Ke, J. Praestgaard, D. Serra, M. Koziel, T. Evans (2009). "Safety And Antiviral Efficacy Of 14 Days Of The Cycophilin Inhibitor NimSll In Combination With Pegylated Interferon ,2a In Relapsed Genotype 1 Hcv Infected Patients." Journal of Hepatology 50(SI): S379.
Egorin, M. J,, T. F. Lagattuta, et al. (2002). "Pharmacokinetics, tissue distribution, and metabolism of 17
(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin (NSC 707545) in CD2F1 mice and Fischer 344 rats."Cancer Chemother Pharmacol 49 (1): 7-1Э.
Fehr, Т., J. Kallen, et al. (1999) . "Sanglif ehrins А, В, С and D, novel cyclophilin-binding compounds isolated from Streptomyces sp. АЭ2-308110.II, Structure elucidation, stereochemistry and physico-chemical properties."J Antibiot (Tokyo) 52(5): 474-9.
Flisiak, R., A. Horban, et al. (2008). "The cyclophilin inhibitor Debio-025 shows potent anti-hepatitis С effect in patients coinfected with hepatitis С and human immunodeficiency virus." Hepatology 47(3): 817-26.
Furniss, B. S., Furniss, A.I., Vogel, A.I., Ed. (1989). Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, Prentice Hall.
Gaither, L. A., Borawski, J., Anderson, L. J., Balabanis, K. A. et al., (2010). "Multiple cyclophilins involved in different cellular pathways mediate HCV replication" Virology 397: 43-55.
Glavinas, H., Krajcsi, P., Cserepes, J., Sarkadi, B, (2004). "The role of ABC transporters in drug resistance, metabolism and toxicity."Curr. Drug. Deliv. 1(1): 27-42.
Gomez, L. , H. Thibault, et al. (2007). "Inhibition of mitochondrial permeability transition improves functional recovery and reduces mortality following acute myocardial infarction in mice." Am J Physiol Heart Circ Physiol 293(3): H1654-61.
Goto, K, , Watashi, K., Inoue, D., Hijikata, M., Shimotohno, K. (2009) "Identification of cellular and viral factors related to anti-hepatitis С virus activity of cyclophilin inhibitor" Cancer Science 100(10): 1943-1950.
Hanoulle, X., Badillo A, Wieruszeski JM, Verdegem D, Landrieu I, Bartenschlager R, Penin F, Lippens G (2009), "Hepatitis С virus NS5A protein is a substrate for the Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerase activity of Cyclophilins A and B." J Biol Chem.
Hartel, C. , P. Iblher, et al, (2006). "Immunosuppressive
activity of the immunophilin-binding drug Sanglifehrin A in human whole blood: potent inhibition of interleukin-6 produced by lymphocytes and monocytes." Scand J Immunol 63(1): 26-34.
Herrler, M. , H. Bang, et al. (1994). "Cloning and characterization of ppiB, a Bacillus subtilis gene which encodes a cyclosporin A-sensitive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase."Mol Microbiol 11(6); 1073-83.
Hite, M. , Turner, S., Federici, C. (2003), "Part 1: Oral delivery of poorly soluble drugs". Pharmaceutical Manufacturing and Packing Sourcer. Summer 2003 issue.
Immecke, S.N., Baal., N, et al. (2011). "The Cyclophilin-Binding Agent Sanglifehrin A Is a Dendritic Cell Chemokine and Migration Inhibitor." PLOS one 6(3):el8406.
Inoue, К., K. Sekiyama, et al. (2003). "Combined interferon alpha2b and cyclosporin A in the treatment of chronic hepatitis C: controlled trial." J Gastroenterol 38(6): 567-72.
Inoue, К. , T. Umehara, et al. (2007) . "Evaluation of a cyclophilin inhibitor in hepatitis С virus-infected chimeric mice in vivo."Hepatology 45(4): 921-8.
Ishii, N. , K. Watashi, et al. (2006). "Diverse effects of cyclosporine on hepatitis С virus strain replication." J Virol 80(9) : 4510-20 .
Ke, J., E. L., R. Rozier, T. Marbury, N. Nguyen, D. Serra, K. Dole, J. Praestgaard, M. Huang, T, Evans (2009). "Safety, And Tolerability Of Nim811, A Novel Cyclophilin Inhibitor For Hcv, Following Single And Multiple Ascending Doses In Healthy Volunteers And Hcv-Infected Patients." Journal of Hepatology 50(S1): S229.
Jacobson, I., McHutchison, JG, Sulkowski, M. (2007), Gastroenterol & Hepatol 3(S34): 1-10.
Kallen, J,, R. Sedrani, et al. (2005). "Structure of human cyclophilin A in complex with the novel immunosuppressant sanglifehrin A at 1.6 A resolution." J Biol Chem 280(23): 21965-71.
Kawasaki, H., E. S. Mocarski, et al. (2007). "Cyclosporine
inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells." J Virol 81(17): 9013-23.
Konig, J. H,, Glaeser, M. Keiser, к. Mandery, U. Klotz and M. F, Fromm (2010), Drug Metab Dispos, 39, 1097-1102.
Manns, M. P., G. R. Foster, et al. (2007). "The way forward in HCV treatment--finding the right path." Nat Rev Drug Discov 6(12): 991-1000.
Martin Cabrejas, L. M., S, Rohrbach, et al. (1999). "Macrolide Analogues of the Novel Immunosuppressant Sanglifehrin: New Application of the Ring-Closing Metathesis Reaction." Angew Chem Int Ed Engl 38(16): 2443-2446.
Mathy, J. E. , S. Ma, et al. (2008). "Combinations of cyclophilin inhibitor NIM811 with hepatitis С Virus NS3-4A Protease or NS5B polymerase inhibitors enhance antiviral activity and suppress the emergence of resistance." Antimicrob Agents Chemother 52(9): 3267-75.
Melnikova, I. (2008). "Hepatitis С therарies."Nature Rev Drug Disc 7: 799-800.
Metternich, R. , Denni, D. , Thai, Б, Sedrani, R. (1999). "Toward a Total Synthesis of the Immunosuppressant Sanglifehrin A. Preparation of Two Relay Compounds by Degradation and Their Use in the Reassembly of the Natural Product. " J. Org. Chem, 64: 9632-9639.
Millay, D. P., M. A. Sargent, et al. (2008). "Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial-dependent necrosis attenuates muscular dystrophy." Nat Med 14(4): 442-7.
Nelson, D. R., Ghalib, R.H., Sulkowski, M. , Schiff, E. , Rustgi, V., Pockros, P.J., Wang, C, Decosterd Kerhuel, D., and P. Grosgurin, Porchet, H,, Crabbe, R. (2009). "Efficacy And Safety Of The Cyclophilin Inhibitor Debio 025 In Combination With Pegylated Interferon Alpha-2a And Ribavirin In Previously Null-Responder Genotype 1 Hcv Patients." Journal of Hepatology 50{S1): S40.
Niwa, Т., Yamamoto, S, Saito, M, Shiraga, T, Takagi, A. (2007)."Effect of Cyclosporine and Tacrolimus on Cytochrome
Р450 Activities in Human Liver Microsomes."Yakugaku Zasshi 127 (1) : 209--216.
Paeshuyse, J. , A. Kaul, et al. (2006). "The non-immunosuppressive cyclosporin DEBIO-025 is a potent inhibitor of hepatitis С virus replication in vitro." Hepatology 43(4):
761-70.
Parfieniuk, A., J. Jaroszewicz, et al. (2007). "Specifically targeted antiviral therapy for hepatitis С virus." World J Gastroenterol 13(43): 5673-81.
Pawlotsky, J. M. (2000). "Hepatitis С virus resistance to antiviral therapy."Hepatology 32(5): 889-96.
Pawlotsky, J. M. (2005). "Current and future concepts in hepatitis С therapy."Semin Liver Pis 25(1): 72-83.
Pawlotsky, J. M. (2006) . "Virology of hepatitis В and С viruses and antiviral targets,"J Hepatol 44(1 Suppl): S10-3.
Pemberton, т. J. and J. E. Kay (2003). "Cyclophilin sensitivity to sanglifehrin A can be correlated to the same specific tryptophan residue as cyclosporin A, 11 FEBS Lett 555(2): 335-40.
Pockros, P. (2008). "Emerging Therapies for Chronic Hepatitis С Virus." Gastroenterol and Hepatology 4(10): 729734.
Ptak, R. G., P. A. Gallay, et al. (2008). "Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human cells by Debio-025, a novel cyclophilin binding agent."Antimicrob Agents Chemother 52(4): 1302-17,
Qu, X,, Jiang, N. et al., (2011). "Cloning, sequencing and characterization of the biosynthetic gene cluster' of sanglifehrin A, a potent cyclophilin inhibitor." Mol. Biosyst. 7:852-861
Robida, J. M., H. B. Nelson, et al. (2007). "Characterization of hepatitis С virus subgenomic replicon resistance to cyclosporine in vitro."J Virol 81(11); 5829-40.
Hopkins, S. D. H., E. Gavis, J. Lalezari, E. Glutzer, B. DiMassimo, P. Rusnak, S. Wring, C. Smitley, Y. and Ribeill (2009). "Safety, plasma pharmacokinetics, and anti-viral
activity of SCY-635 in adult patients with chronic hepatitis С virus infection."Journal of Hepatology 50(S1): S36.
Sanglier, J. J., V. Quesniaux, et al. (1999). "Sanglifehrins А, В, С and D, novel cyclophilin-binding compounds isolated from Streptomyces sp. A92-308110.I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological activity."J Antibiot (Tokyo) 52(5): 466-73.
Schneider, M. D. (2005). "Cyclophilin D: knocking on death's door." Sci STKE 2005(287): pe26.
Sedrani, R. , J. Kallen, et al. (2003). "Sanglifehrin-cyclophilin interaction: degradation work, synthetic macrocyclic analogues, X-ray crystal structure, and binding data." J Am Chem Soc 125(13): 3849-59.
Seden,K. D. Back and S. Khoo (2010), J Antimicrob Chemother, 65, 1079-1085.
Smith, M. В. а. м., J. , Ed. (2001). March's advanced organic chemistry, John Wiley and Sons Inc., UK,
Steinschulte, С., T. Taner, et al. (2003). "Cutting edge: sanglifehrin A, a novel cyclophilin-binding immunosuppressant blocks bioactive IL-12 production by human dendritic cells." J Immunol 171 (2) : 542-6.
Strader, D. В., Т. Wright, et al. (2004). "Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C."Hepatology 39(4): 1147-71.
Tropschug, H., I. B. Barthelmess, et al. (1989). "Sensitivity to cyclosporin A is mediated by cyclophilin in Neurospora crassa and Saccharomyces cerevisiae." Nature 342(6252): 953-5.
Vrolijk, J. M., A. Kaul, et al. (2003). "A repl icon-based bioassay for the measurement of interferons in patients with chronic hepatitis C."J Virol Methods 110(2): 201-9.
Wring, S. ,C. Wille, C. Rewerts, R. Randolph, A. Scribner and S. Hopkins (2010), Journal of Hepatology, 52, S263.
Yang, F., J. M. Robotham, et al. (2008) . "Cyclophilin A is an essential cofactor for hepatitis С virus infection and the principal mediator of cyclosporine resistance in vitro." J
Virol 82(11): 5269-78.
Zenke, G. , U. Strittmatter, et al. (2001). "Sanglifehrin A, a novel cyclophilin-binding compound showing immunosuppressive activity with a new mechanism of action." J Immunol 166(12): 7165-71.
Zeuzem, S. and E. Herrmann (2002)."Dynamics of hepatitis С virus infection."Ann Hepatol 1(2): 56-63.
Zhang, L. H. and J. 0. Liu (2001) . "Sanglifehrin A, a novel cyclophilin-binding immunosuppressant, inhibits IL-2-dependent T cell proliferation at the Gl phase of the cell cycle." J Immunol 166(9): 5611-8.
Все ссылки, включая патенты и заявки на патенты, указанные в настоящей заявке, включены посредством отсылки в наиболее полной степени.
По всему тексту описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, если из контекста не следует иного, слово "включает" и такие вариации, как "включающий", следует понимать как включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение формулы (I)
в которой
группа Xi представляет собой -ORb -NRiR2 или R3;
Rb R2 и R3 независимо представляют собой С1-10алкил, С2-10алкенил, С3-10циклоС1-10алкил, С3-10 цик-лоС2-10алкенил, Ci -i0алкилС3-10циклоС1 -10алкил, С1-10алкилС3-10циклоС2-10алкенил, С2-10алкенилС3-10цикло С1-10алкил, С2-10алкенилС3-10циклоС2-10алкенил, С5-10арил, С5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С1-10алкилС5-10арил, С1-10алкилС5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, С2-10алкенилС5-10арил или С2-10алкенилС5-10гетероарил, содержащий 1-4 гетероатома, при этом любая из указанных групп может быть необязательно замещена моноциклическим С5-10арилом или моноциклическим С5-10гетероарилом;
и один или более атомов углерода в R1, R2 и R3, не являющихся частью С5-10арильной или С5-10ге-тероарильной группы, необязательно замещены гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, и один или более атомов углерода в R1, R2 и R3 необязательно замещены карбонилом;
или R1 и R2 связаны таким образом, что NR1R2 представляет собой насыщенное или ненасыщенное С4-8гетероциклическое кольцо, содержащее указанный атом азота, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены другим гетероатомом, выбранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанного кольца необязательно замещены карбонилом, при этом такое гетероциклическое кольцо необязательно может быть сконденсировано с С5-10 арильным или С5-10гетероарильным кольцом;
и где один или более атомов углерода группы R1, R2 и R3 необязательно могут быть замещены одним или более атомами галогена;
или R1 и/или R2 представляют собой водород;
R9 представляет собой Н или ОН;
n представляет собой одинарную или двойную связь, за исключением того, что когда n представляет собой двойную связь, R9 представляет собой Н;
R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, F, Cl, Br, С2-10алкенил или С1-10алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены гетероатомом, вы
бранным из О, N и S(O)p, где р обозначает 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно замещены карбонилом, при этом такая алкильная группа необязательно может быть замещена одним или более атомами галогена;
Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6 независимо представляют собой С или N, при этом в том случае, когда любая из указанных групп представляет собой N, присоединенный заместитель отсутствует;
при условии, что когда все R4, R6, R7 и R8 представляют собой Н, а все Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6 представляют собой С, то тогда R5 не может представлять собой ОН, -ОС1-10алкил или -0(СО)С1-10алкил;
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п.1, где n представляет собой одинарную связь.
3. Соединение по п. 1 или 2, где R9 представляет собой ОН.
4. Соединение по любому из пп. 1-3, где Х2 представляет собой С.
5. Соединение по любому из пп.1-4, где Х3 представляет собой С.
6. Соединение по любому из пп. 1-5, где Х4 представляет собой С.
7. Соединение по любому из пп.1-6, где Х5 представляет собой С.
8. Соединение по любому из пп. 1-7, где Х6 представляет собой С.
9. Соединение по любому из пп. 1-8, где R4 представляет собой Н.
10. Соединение по любому из пп.1-9, где R8 представляет собой Н.
11. Соединение по любому из пп.1-10, где R5 представляет собой ОН.
12. Соединение по любому из пп.1-11, где R6 представляет собой Н, Me или F.
13. Соединение по любому из пп.1-12, где R7 представляет собой Н или F.
14. Соединение по любому из пп.1-13, где R6 и/или R7 представляет собой F.
15. Соединение по любому из пп.1-14, где Х1 представляет собой NR1R2.
16. Соединение по п.15, где R1 представляет собой С1-10алкил, С2-10алкенил, С3-10циклоС1-10алкил, С3-10 циклоС2-10алкенил, С1-10алкилС3-10циклоС1-10алкил, С1-10алкилС3-10циклоС2-10алкенил, С2-10алкенилС3-10 циклоС1-10алкил, С2-10алкенилС3-10циклоС2-10алкенил, С5-10арил, С5-10гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, С1-10алкилС5-10арил, С1-10алкилС5-10гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, С2-10 алкенилС5-10арил или С2-10алкенилС5-10гетероарил, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, a R2 представляет собой Н, С1-10алкил, С2-10алкенил или -ОС1-10алкил.
17. Соединение по п.15, где NR1R2 представляет собой морфолинил, оксазинан или одну из групп, раскрытых в следующей таблице:
включая любой его таутомер или изомер, в которых С26, 27 С=С связь, показанная как транс, является цис-связью; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образуется при соединении С-53 кето (если таковая присутствует) и С-15 гидроксильной группы и метанола; или его фармацевтически приемлемая соль.
19. Применение соединения по любому из пп.1-18 в качестве фармацевтического средства для лечения вирусных инфекций, таких как ИСУ или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства.
20. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, таких как ИСУ или ВИЧ-инфекция, или в качестве иммунодепрессанта или противовоспалительного средства, включающая соединение по любому из пп.1-18 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
21. Способ лечения вирусных инфекций, таких как ИСУ или ВИЧ-инфекция, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-18.
22. Способ получения соединения по любому из пп.1-18, который включает реакцию соединения формулы V
О О X Р
Формула V
в которой X1 определен в любом из пп.1-18, а каждый R11 независимо является С1-4 алкилом или бензилом;
с альдегидным макроциклом (соединение формулы VI)
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
1конечный объем доводили с учетом посевного объема,
023907
023907
- 1 -
- 1 -
023907
023907
- 1 -
- 1 -
023907
023907
- 1 -
- 1 -
023907
023907
- 1 -
- 1 -
023907
023907
- 4 -
- 3 -
023907
023907
- 24 -
023907
023907
- 26 -
023907
023907
- 27 -
- 27 -
023907
023907
- 27 -
- 27 -
023907
023907
- 28 -
- 28 -
023907
023907
- 28 -
- 28 -
023907
023907
- 28 -
- 28 -
023907
023907
- 29 -
- 29 -
023907
023907
- 29 -
- 29 -
023907
023907
- 29 -
- 29 -
023907
023907
- 51 -
- 51 -
023907
023907
- 56 -
- 56 -
023907
023907
- 58 -
- 58 -
023907
023907
- 59 -
- 59 -
023907
023907
- 60 -
- 60 -
023907
023907
- 61 -
- 61 -
023907
- 63 -
- 62 -