EA 023897B1 20160729

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000023897b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Фармацевтическая композиция для индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающая синтетические нанотранспортеры, содержащие А-x-В, и фармацевтически приемлемый наполнитель, где х включает линкер; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не имеют 100% идентичности друг с другом.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где синтетические нанотранспортеры дополнительно включают А-x-В-y-С; где у может включать линкер или может не включать линкер; где С включает третий пептид, связывающийся с МНС II, и при этом третий пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; и где А, В и С не имеют 100% идентичности друг с другом.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, в которой (а) х и/или у включают линкер, который включает амидный линкер, дисульфидный линкер, сульфидный линкер, линкер на основе 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола, линкер на основе сложного тиолового эфира, гидразидный линкер, иминовый линкер, линкер на основе тиомочевины, амидиновый линкер или аминовый линкер; или (b) х и/или у включают линкер, включающий пептидную последовательность, сайт расщепления лизосомальной протеазой, биоразлагаемый полимер, линкер на основе замещенного или незамещенного алкана, алкена, замещенной или незамещенной ароматической или гетероциклической группы, рН-чувствительный полимер, гетеробифункциональные линкеры или спейсер на основе олигомерного гликоля; или (c) у не включает линкер, а А-x-В и С включают смесь, присутствующую в композиции.

4. Фармацевтическая композиция для индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающая одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, например ДНК или РНК, которые кодируют А-x-В или А-x-В-y-С, где, если присутствует более чем одна выделенная нуклеиновая кислота, выделенные нуклеиновые кислоты вместе используют в указанной композиции, и где х включает амидный линкер или пептидный линкер, и/или у включает амидный линкер или пептидный линкер, или не включает линкер, необязательно где х представляет собой: (а) пептидный линкер, который включает сайт расщепления лизосомальной протеазой; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, где у может включать линкер или может не включать линкер; где С включает третий пептид, связывающийся с МНС II, и при этом третий пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; и где А, В и С не имеют 100% идентичности друг с другом.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, в которой: (а) х или у представляет собой пептидный линкер, который включает сайт расщепления лизосомальной протеазой; (b) у не является линкером, и А-x-В и С кодируются двумя или более отдельными выделенными нуклеиновыми кислотами в композиции, где необязательно (i) x представляет собой амидный линкер или пептидный линкер, и А-x-В и С кодируются отдельными выделенными нуклеиновыми кислотами в композиции, или (ii) x представляет собой амидный линкер или пептидный линкер, и А-x-В и С кодируются одной и той же выделенной нуклеиновой кислотой в композиции; или (с) у не является линкером, и А-x-В и С кодируются одной и той же выделенной нуклеиновой кислотой в композиции.

6. Фармацевтическая композиция по п.4 или 5, включающая одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые являются комплементарными полноразмерными цепями упомянутых выделенных нуклеиновых кислот.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, необязательно (а) где по меньшей мере часть А-x-В или А-x-В-y-С композиции по любому из пп.1-6 присутствует на поверхности синтетического нанотранспортера; (b) где по меньшей мере часть А-x-В или А-x-В-y-С композиции по любому из пп.1-6 инкапсулирована синтетическим нанотранспортером; и/или (с) дополнительно включающая один или несколько антигенов.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где А-x-В включает полипептид, последовательность которого включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из следующих аминокислотных последовательностей (представленных как SEQ ID NO: 1-46): где необязательно (a) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична любой из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46; или (b) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность любой одной из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.4-6, включающая выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, последовательность которого включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46, где необязательно: (a) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична любой из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46; (b) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность любой из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, включающая выделенную нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной полноразмерной цепью упомянутой выделенной нуклеиновой кислоты.

11. Фармацевтическая композиция по п.9 или 10, где последовательность выделенной нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 60% идентична любой одной из следующих последовательностей нуклеиновых кислот (представленных как SEQ ID NO: 47-68): где необязательно (a) последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентична любой из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных как SEQ ID NO: 47-68; или (b) последовательность выделенной нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты любой из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных как SEQ ID NO: 47-68.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, включающая выделенную нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной полноразмерной цепью упомянутой выделенной нуклеиновой кислоты.

13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где природный пептид, связывающийся с HLA-DP, DQ или DR, включает пептидную последовательность, полученную или происходящую из Clostridium tetani, вируса гепатита Б, вируса герпеса человека, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса Эпштейна-Барра, вируса оспы птиц, вируса кори, вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, вируса эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусов человека, вируса натуральной оспы или инфекционных организмов, способных инфицировать людей и генерировать CD4+ клетки памяти человека, специфичные к инфекционному организму, после начала инфекции.

14. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где каждый из А и В или А, В и С содержит: (а) пептидные последовательности, полученные или происходящие из различных инфекционных организмов; или (b) пептидные последовательности, полученные или происходящие из идентичных инфекционных организмов; или (с) пептиды, имеющие различные репертуары, связывающиеся с МНС II.

15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где (а) А, х или В или (b) А, х, В, у или С содержит последовательность или химические модификации, которые повышают водорастворимость А-x-В или А-x-В-y-С соответственно, где последовательность или химические модификации включают добавление гидрофильных N- и/или С-концевых аминокислот, гидрофобных N- и/или С-концевых аминокислот, замещение аминокислот для достижения pI приблизительно 7,4 и достижения суммарного положительного заряда при приблизительно рН 3,0 и замещение аминокислот, восприимчивых к перегруппировке.

16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где первый и/или второй пептид, связывающийся с МНС II, и/или третий пептид, связывающийся с МНС II, имеет длину, находящуюся в диапазоне (а) от 5 до 50 мономерных звеньев полимера; (b) от 5 до 30 мономерных звеньев полимера; (с) от 6 до 25 мономерных звеньев полимера.

17. Лекарственная форма для индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающая: (а) композицию по пп.1-16 и необязательно антиген; необязательно, где по меньшей мере часть А-x-В или А-x-В-y-С композиции присутствует на поверхности синтетического нанотранспортера или инкапсулирована синтетическим нанотранспортером; или (b) вакцину, включающую композицию по любому из пп.1-16 и необязательно (i) антиген или (ii) адьювант.

18. Лекарственная форма по п.17, где природный пептид, связывающийся с HLA-DP, DQ или DR, включает пептидную последовательность, полученную или происходящую из Clostridium tetani, вируса гепатита Б, вируса герпеса человека, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса Эпштейна-Барра, вируса оспы птиц, вируса кори, вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, вируса эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусов человека, вируса натуральной оспы или инфекционных организмов, способных инфицировать людей и генерировать CD4+ клетки памяти человека, специфичные к инфекционному организму, после начала инфекции.

19. Лекарственная форма по любому из пп.17-18, где каждый из А и В или А, В и С содержит: (а) пептидные последовательности, полученные или происходящие из различных инфекционных организмов; или (b) пептидные последовательности, полученные или происходящие из идентичных инфекционных организмов; или (с) пептиды, имеющие различные репертуары, связывающиеся с МНС II.

20. Лекарственная форма по любому из пп.17-19, где (а) А, х или В или (b) А, х, В, у или С содержит последовательность или химические модификации, которые повышают водорастворимость А-x-В или А-x-В-y-С соответственно, где последовательность или химические модификации включают добавление гидрофильных N- и/или С-концевых аминокислот, гидрофобных N- и/или С-концевых аминокислот, замещение аминокислот для достижения pI приблизительно 7,4 и достижения суммарного положительного заряда при приблизительно рН 3,0 и замещение аминокислот, восприимчивых к перегруппировке.

21. Лекарственная форма по любому из пп.17-20, где первый и/или второй пептид, связывающийся с МНС II, и/или третий пептид, связывающийся с МНС II, имеет длину, находящуюся в диапазоне (а) от 5 до 50 мономерных звеньев полимера; (b) от 5 до 30 мономерных звеньев полимера; (с) от 6 до 25 мономерных звеньев полимера.

22. Способ индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающий введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 или лекарственной формы по любому из пп.17-21 субъекту.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское ои 023897 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. С07К1/00 (2006.01)
2016.07.29
(21) Номер заявки 201270313
(22) Дата подачи заявки 2010.08.24
(54) КОМПОЗИЦИИ, КОТОРЫЕ ИНДУЦИРУЮТ ХЕЛПЕРНОЕ ДЕЙСТВИЕ Т-КЛЕТОК
(31) 61/237,147; 61/335,611
(32) 2009.08.26; 2010.01.06
(33) US
(43) 2012.09.28
(86) PCT/US2010/002330
(87) WO 2011/031298 2011.03.17
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
СЕЛЕКТА БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Фрейзер Кристофер, Липфорд Грэйсон Б., Ламот Роберт, Алтройтер Дэвид Х. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20060093617 WO-A2-2006042333 EP-A2-1388586 WO-A2-2009101208 WO-A2-2007089607
(57) Настоящее изобретение касается, по меньшей мере частично, композиций и связанных способов, включающих пептиды, связывающиеся с МНС II. В одном варианте осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, включают пептид, по меньшей мере на 70% идентичный природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептиду, связывающемуся с HLA-DR.
Родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 U.S.C. § 119 США по предварительным заявкам 61/237147, поданной 26 августа 2009 г., и 61/335611, поданной 6 января 2010 г., содержание каждой из которых включено в данный документ по ссылке.
Предпосылки изобретения
Активность определенных вакцин можно увеличить путем сопутствующего обеспечения хелперно-го действия Т-клеток. Хелперное действие Т-клеток можно индуцировать посредством презентирования определенных пептидных антигенов, которые могут образовывать комплексы с МНС II. Необходимы композиции и способы, которые могут индуцировать усиленное хелперное действие Т-клеток в ответ на вакцину.
Краткое описание данного изобретения
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей А-x-E! и фармацевтически приемлемый наполнитель; где х включает линкер или не включает линкер; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей А-х-В и фармацевтически приемлемый наполнитель; где х включает линкер или не включает линкер; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей А-х-В и фармацевтически приемлемый наполнитель; где х включает линкер или не включает линкер; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей А-х-В и фармацевтически приемлемый наполнитель; где х включает линкер или не включает линкер; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей А-х-В и фармацевтически приемлемый наполнитель; где х включает линкер, который включает амидный линкер, дисульфидный линкер, сульфидный линкер, линкер на основе 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола, линкер на основе сложного тиолового эфира, гидразидный линкер, иминовый линкер, линкер на основе тиомочевины, амидиновый линкер или аминовый линкер; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на
100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей А-х-В и фармацевтически приемлемый наполнитель; где х включает линкер, включающий пептидную последовательность, сайт расщепления лизосомальной протеазой, биоразлагаемый полимер, линкер на основе замещенного или незамещенного алкана, алкена, замещенной или незамещенной ароматической или гетероциклической группы, рН-чувствительный полимер, гетеробифункциональные линкеры или спейсер на основе олигомерного гликоля; где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны
друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют композицию, включающую А-х-В, где при наличии более чем одной выделенной нуклеиновой кислоты выделенные кислоты вместе кодируют композицию, включающую А-х-В, где х не включает линкер, включает амидный линкер или пептидный линкер, где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют композицию, включающую А-х-В, где при наличии более чем одной выделенной нуклеиновой кислоты выделенные кислоты вместе кодируют композицию, включающую А-х-В, где х является амидным линкером, отсутствует или является пептидным линкером, где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют композицию, включающую А-х-В, где при наличии более чем одной выделенной нуклеиновой кислоты выделенные кислоты вместе кодируют композицию, включающую А-х-В, где х является амидным линкером, отсутствует или является пептидным линкером, где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют композицию, включающую А-х-В, где при наличии более чем одной выделенной нуклеиновой кислоты выделенные кислоты вместе кодируют композицию, включающую А-х-В, где х является амидным линкером, отсутствует или является пептидным линкером, где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют композицию, включающую А-х-В, где при наличии более чем одной выделенной нуклеиновой кислоты выделенные кислоты вместе кодируют композицию, включающую А-х-В, где х является амидным линкером, где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют композицию, включающую А-х-В, где при наличии более чем одной выделенной нуклеиновой кислоты выделенные кислоты вместе кодируют композицию, включающую А-х-В, где х представляет собой пептидный линкер, который включает сайт расщепления лизосо-мальной протеазой, где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и где А и В не на 100% идентичны друг другу.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей полипептид, последовательность которого включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из аминокислотных последовательностей, изложенных как SEQ ID NO: 1-46.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, последовательность полипептида которого включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из аминокислотных последовательностей, изложенных как SEQ ID NO: 1-46.
В аспекте данное изобретение касается композиции, включающей выделенную нуклеиновую кислоту, последовательность выделенной нуклеиновой кислоты которой включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 60% идентична любой из последовательностей нуклеиновых кислот, изложенных как SEQ ID NO: 47-68.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 демонстрирует иллюстративный пример данных по проточной цитометрии, демонстрирующих экспрессию IFN-Y у CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти, простимулированных пептидом.
Фиг. 2 демонстрирует процент центральных Т-клеток памяти, нормализованный к непростимулиро-ванным CD4+/CD45RAmed/CD62Lhigh/IFN-Y+ Т-клеткам. Пептидные химеры II класса дают выраженный вторичный иммунный ответ CD4 Т-клеток памяти. Пептиды добавляли с конечной концентрацией 4 мкм. Отрицательные и положительные контроли РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) были непростимулированными или простимулированными пулом из 5 пептидов (5РР) соответственно. Перед проточным цитометрическим анализом клетки окрасили с помощью CD4-FITC, CD45RA-PE и CD62LCy7PE. Клетки пермеабилизировали, фиксировали и окрашивали с помощью IFN-y. Центральные Т-клетки памяти представляют собой CD4+/CD45RAmedium/CD62Lhigh/IFN-y+. Показанные значения представляют собой процент CD62L+/IFN-y+ клеток, обнаруживаемый в гейте CD4+/CD62L. Значения нормализовали путем вычитания значений непростимулированного контроля для каждого донора.
Фиг. 3 демонстрирует количество (из 20) доноров, положительных по Т-клеткам памяти, дающим ответную реакцию на пептид. Доноров рассматривают положительными, если значения были больше 0,08% давших ответную реакцию центральных Т-клеток памяти в популяции CD4+CD45RAlow.
Фиг. 4 демонстрирует иллюстративные примеры данных по проточной цитометрии, демонстрирующих экспрессию TNF-a и IFN-y у пептид-специфичных CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти. Пептидные химеры II класса дают выраженный вторичный иммунный ответ дендритных клеток/CD4 Т-клеток памяти. Моноциты выделили из РВМС с помощью отрицательного отбора с магнитными бусинами и выращивали в IL-4 и GM-CSF в течение одной недели для индукции дифферен-цировки дендритных клеток (DC). Аутологичные CD4+ клетки выделили из криоконсервированных
РВМС и культивировали вместе с DC в присутствии или при отсутствии пептида. Определение экспрессии TNF-a и IFN-y у центральных Т-клеток памяти было таким, как описывалось ранее. Незрелые центральные Т-клетки памяти экспрессируют IFN-y/TNF-a и IL-2; коммитированные эффекторные Т-клетки памяти экспрессируют только IL-4 или IFN-y.
Фиг. 5 демонстрирует процент экспрессии IL-4, TNF-a или IFN-y у пептид-специфичных CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти. Показана экспрессия цитокинов в совместной культуре дендритных клеток/аутологичных CD4 Т-клеток в присутствии или при отсутствии пептида. Показано количество положительных по цитокинам Т-клеток памяти на 75000 событий, собранных проточной цитометрией (нормализованное к непростимулированным).
Фиг. 6 демонстрирует процент коэкспрессии TNF-a плюс IFN-y или TNF-a плюс IL-4 у пептид-специфичных CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти. Показана коэкспрессия ци-токинов в совместной культуре дендритных клеток/аутологичных CD4 Т-клеток в присутствии или при отсутствии пептида.
Фиг. 7 демонстрирует варианты TT830pDTt (SEQ ID NO: 13, 108-113, 126, 114-118 соответственно).
Фиг. 8 демонстрирует процент CD62L+/IFN-y+ центральных Т-клеток памяти в CD4+/CD45RAlow (4 донора). Пептидные химеры II класса дают выраженный вторичный иммунный ответ CD4 Т-клеток памяти. Центральные Т-клетки памяти представляют собой CD4+/CD45RAlow/CD62L+/IFN-y+. Показанные значения представляют собой процент CD62L+/IFN-y+ клеток, обнаруживаемых в гейте
CD4+/CD62L.
Фиг. 9 демонстрирует процент CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти (16 доноров), задействующих химерные пептиды с аденовирусным эпитопом. Пептидные химеры II класса дают выраженный вторичный иммунный ответ CD4 Т-клеток памяти. Центральные Т-клетки памяти представляют собой CD4+/CD45RAlow/CD62L+/IFN-y+. Показанные значения представляют собой процент CD62L+/IFN-y+ клеток, обнаруживаемых в гейте CD4+/CD62L. Показаны SEQ ID NO: 13, 17, 19 и 20 соответственно.
Фиг. 10 демонстрирует процент CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти (16 доноров) у аденовирусных AdVkDTt вариантов. Модифицированные AdVkDTt пептидные химеры дают выраженный вторичный иммунный ответ CD4 Т-клеток памяти. Центральные Т-клетки памяти представляют собой CD4+/CD45RAlow/CD62L+/IFN-y+. Показанные значения представляют собой процент CD62L+/IFN-y+ клеток, обнаруживаемых в гейте CD4+/CD62L. Показаны SEQ ID NO: 71-73 и 127-129 соответственно.
Фиг. 11 демонстрирует химерные эпитопы гриппа, отобранные по высококонсервативным общим профилям HLA-DR. Показаны SEQ ID NO: 39-44, 32 и 93-98 соответственно.
Фиг. 12 демонстрирует процент CD4+/CD45RAlow/CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти (5 доноров) у консервативных эпитопов гриппа. Модифицированные высококонсервативные пептидные химеры гриппа дают выраженный вторичный иммунный ответ CD4 Т-клеток памяти. Центральные Т-клетки памяти представляют собой CD4+/CD45RAlow/CD62L+/IFN-y+. Показанные значения представляют собой процент CD62L+/IFN-y+ клеток, обнаруживаемых в гейте CD4+/CD62L. Показаны SEQ ID NO: 101-106 соответственно.
Фиг. 13 демонстрирует титры антител к никотину, создаваемые композициями и синтетическими нанотранспортерами по данному изобретению.
Фиг. 14 демонстрирует титры антител к никотину, создаваемые композициями и синтетическими нанотранспортерами по данному изобретению.
Фиг. 15 демонстрирует выбор химерного эпитопа с помощью программы для прогноза эпитопа Т-клеток Immune Epitope Database* (IEDB). Для каждого пептида создали процентильный ранг с помощью каждого из трех способов (ARB, SMMalign и Sturniolo) путем сравнения балла пептида с баллами пяти миллионов случайных 15 мономерных звеньев полимера из базы данных SWISSPROT. Процентильные ранги для трех способов затем использовали для создания ранга для консенсусного способа. Процен-тильные ранги с небольшими числовыми значениями указывают на высокое сродство. Прогнозируемые связывания с высоким сродством ( <3 наивысших процентилей) выделены жирным шрифтом. Распределение аллелей дано для европейских популяций (болгарской, хорватской, кубинской (ЕС), чешской, финской, грузинской, ирландской, североамериканской (ЕС), словенской).
Фиг. 16 демонстрирует охват популяции по Европе с HLA-DR к прогнозируемым простым и химерным эпитопам.
Фиг. 17 демонстрирует анализ прогнозируемого связывания отдельных эпитопов класса II для гриппа A. SEQ ID NO: 78-82 проиллюстрированы в первой колонке таблицы.
Фиг. 18 демонстрирует анализ прогнозируемого связывания химерных эпитопов для гриппа А.
Фиг. 19 демонстрирует консервативные, общие для класса II химерные пептиды РВ1 для гриппа А+В. SEQ ID NO: 101-106 проиллюстрированы в первой колонке таблицы.
Фиг. 20 демонстрирует аминокислотную замену без потери прогнозируемой способности связывания с классом II. Показаны SEQ ID NO: 2, 120-122, 3 и 123-125 соответственно.
Детальное описание изобретения
Прежде чем описывать данное изобретение в деталях, должно быть понятно, что это изобретение не ограничивается отдельно проиллюстрированными материалами или технологическими параметрами, которые, конечно, могут различаться. Также следует понимать, что терминология, использованная в настоящем документе, применена только с целью описания отдельных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения применения альтернативной терминологии для описания данного изобретения.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном документе выше или ниже, включены в данный документ ссылкой во всей их полноте для любых целей.
Как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки с множественным числом, если содержание четко не диктует иное. Например, ссылка на "полимер" включает смесь из двух или более подобных молекул, ссылка на "растворитель" включает смесь из двух или более подобных растворителей, ссылка на "адгезив" включает смеси из двух или более подобных материалов и т.п.
A. Введение.
Изобретатели неожиданно и к удивлению обнаружили, что проблемы и ограничения, отмеченные выше, могут быть преодолены, применяя изобретение, раскрытое в данном документе. В частности, изобретатели неожиданно обнаружили, что является возможным обеспечение композиций по данному изобретению и относящихся к ним способов, которые решают проблемы и ограничения в данной области техники.
Иммунные ответы на вакцины можно благоприятно усилить с получением более сильного гуморального иммунного ответа путем включения в вакцину эпитопа памяти, связывающегося с классом II. Однако класс II состоит из трех различных наборов генов (HLA-DR, DP и DQ), каждый из которых с различной способностью связывания с эпитопом. Кроме того, каждый из генов имеет несколько аллелей, которые можно обнаружить в популяции и которые дают белки с различной способностью связывания с эпитопом, поэтому отдельные Т-клеточные эпитопы ограничены аллелями класса II. Ограничение эпито-пов по классу II таким образом создает проблему в том, что у эпитопа ограниченный охват популяции. Для того чтобы получить широкий охват популяции, пептид нужно сконструировать таким, чтобы он был неразборчивым и неизбирательным к DP, DQ и DR. Данную проблему можно преодолеть путем конструирования пептидов такими, чтобы они были специфичны к антигенам, воздействиям которых подверглась большая часть популяции, и имели широкую активность среди аллелей HLA класса II. Отдельные эпитопы, которые имеют широкую, но ограниченную активность, включают, например, эпитопы, обнаруживаемые в обычных вакцинах, такие как столбнячный токсин (ТТ) и дифтерийный токсин (DT). Кроме того, эпитопы, обнаруживаемые у встречающихся в природе вирусов, таких как аденовирус, воздействию которого подверглась большая часть популяции и имеет титры активных антител к, могут иметь широкий охват популяции. В идеальном случае сконструированные пептиды будут иметь эпитоп с высоким сродством к доминантному аллелю DP4 (DPA1*01/DPB1*401 и DPA1*0103/DPB1*0402) и/или эпитопы с высоким сродством к аллелям HLA-DR или HLA-DQ с широкой реактивностью в популяции. Для того чтобы идентифицировать пептиды с широким охватом класса II, изобретатели сконструировали и протестировали химерные эпитопы на основе прогнозируемого сродства к HLA класса II.
Как показано в примерах, пептиды по данному изобретению, которые были сконструированы на основе спрогнозированного сродства к HLA класса II, дают широкий охват среди множества аллелей DP, DQ и DR HLA класса II у людей и дают устойчивую активацию Т-клеток памяти. Эти новые пептиды демонстрируют широких охват среди нескольких аллелей класса II и значительное повышение в формировании вторичного иммунного ответа CD4+ Т-клетками памяти.
Примеры 1-4 иллюстрируют общий подход по данному изобретению. Примеры 5 и 6 иллюстрируют модификации физических свойств пептидов и композиции по данному изобретению, получаемые или производные от вируса гриппа. Примеры 7-13 иллюстрируют различные применения композиций по данному изобретению.
Данное изобретение теперь будет описано более подробно.
B. Определение.
"Адъювант" означает средство, которое не представляет собой конкретный антиген, но увеличивает силу и продолжительность иммунного ответа на совместно вводимый антиген. Такие адъюванты могут включать, но без ограничений, стимуляторы образраспознающих рецепторов, таких как Toll-подобные рецепторы, RIG-1 и NOD-подобные рецепторы (NLR), минеральные соли, такие как квасцы, квасцы, объединенные с монофосфориллипидом (MPL) А из энтеробактерий, таких как Escherihia coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium или Shigella f^neri, или, в частности, с MPL(r) (AS04), MPL А из вышеупомянутых бактерий отдельно, сапонины, такие как QS-21,Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX(tm), эмульсии, такие как MF59, Montanide(r) ISA 51 и ISA 720, AS02 (0321+сквален+ MPL(r)), липосомы и липосом-ные составы, такие как AS01, синтезированные или особым образом полученные микрочастицы и мик
ротранспортеры, такие как являющиеся производными от бактерий везикулы наружной мембраны (OMV) из N. gonorrheae, Chlamydia trachomatis и других, или хитозановые частицы, средства, образующие депо, такие как блок-сополимеры Pluronic(r), особым образом модифицированные или полученные пептиды, такие как мурамил-дипептид, аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты, такие как RC529, или белки, такие как бактериальные токсоиды или фрагменты токсинов.
В вариантах осуществления адъюванты включают агонисты для образраспознающих рецепторов (PRR), включая, но без ограничений, Toll-подобные рецепторы (TLR), в особенности TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 и/или их комбинации. В других вариантах осуществления адъюванты включают агонисты для Toll-подобных рецепторов 3, агонисты для Toll-подобных рецепторов 7 и 8 или агонисты для Toll-подобного рецептора 9; предпочтительно упомянутые адъюванты включают имидазохинолины; такие как R848; производные аденина, такие как те, которые раскрыты в патенте США № 632 9381 (Sumitomo Pharmaceutical Company); иммуностимулирующую ДНК или иммуностимулирующую РНК. В конкретных вариантах осуществления синтетическиенанотранспортеры включают в качестве адъювантов соединения, которые представляют собой агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) 7 и 8 ("агонисты TLR 7/8"). Пользу представляют соединения-агонисты TLR 7/8, раскрытые в патенте США № 6696076 Tomai и соавт., включая, но не ограничиваясь, имидазохинолинамины, имидазопиридинамины, 6,7-конденсированные циклоалкилимидазопиридинамины и 1,2-мостиковые имидазохинолинамины. Предпочтительные адъю-ванты включают имиквимод и резиквимод (также известный как R848). В конкретных вариантах осуществления адъювант может быть агонистом для поверхностной молекулы CD 40 DC (дендритных клеток). В определенных вариантах осуществления для стимуляции скорее иммунитета, нежели иммунологической неотвечаемости, синтетический нанотранспортер включает адъювант, который способствует созреванию DC (необходимых для примирования наивных Т-клеток) и продуцирования цитокинов, таких как интерфероны I типа, которые стимулируют иммунные ответы с помощью антител. В вариантах осуществления адъюванты также могут включать иммуностимулирующие молекулы РНК, такие как, но не ограничиваясь, дцРНК или поли I:C (TLR3 стимулятор), и/или раскрытые в F. Heil et al., "Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8" Science 303(5663), 1526-1529 (2004); J. Vollmer и соавт., "Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides" WO 2008033432 A2; A. Forsbach и соавт., "Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway" WO 2007062107 A2; E. Uhlmann et al., "Modified oli-goribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity" публикация заявки на патент США 2006241076; G. Lipford и соавт., "Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections" WO 2005097993 A2 ; G. Lipford и соавт., "Immunostimulatory G,U-containing oligoribonu-cleotides, compositions, and screening methods" WO 2003086280 A2. В некоторых вариантах осуществления адъювантом может быть агонист TLR-4, такой как бактериальный липополисахарид (LPS), VSV-G и/или HMGB-1. В некоторых вариантах осуществления адъюванты могут включать агонисты TLR-5, такие как флагеллин, или их части или производные, включая, но без ограничений, описанные в патентах США №№ 6130082, 6585980 и 7192725. В конкретных вариантах осуществления синтетические на-нотранспортеры включают лиганд Toll-подобного рецептора (TLR)-9, такой как иммуностимулирующие молекулы ДНК, содержащие CpGs, который индуцирует секрецию интерферона I типа и стимулирует активацию Т и В клеток, приводящую к повышенной продукции антител и цитотоксическому Т-клеточному ответу (Krieg et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct В cell activation. Nature. 1995. 374:546-549; Chu et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Thl) immunity. J. Exp. Med. 1997, 186:1623-1631; Lipford et al. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote В and cyto-юхю T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:23402344; Roman et al. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. Nat. Med. 1997. 3:849-854; Davis et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with re-combinant hepatitis В surface antigen. J. Immunol. 1998. 160: B70-876; Lipford et al., Bacterial DNA as immune cell activator. Trends Microbiol. 1998. 6:496-500; патент США № 6207646, Krieg и соавт.; патент США № 7223398, Tuck и соавт.; патент США № 7250403, Van Nest и соавт. или патент США № 7566703, Krieg и соавт.
В некоторых вариантах осуществления адъюванты могут быть провоспалительными стимулами, выделенными некротическими клетками (например, кристаллы уратов). В некоторых вариантах осуществления адъюванты могут быть активированными компонентами каскада комплемента (например, CD21, CD35 и т.д.). В некоторых вариантах осуществления адъюванты могут быть активированными компонентами иммунных комплексов. Адъюванты также включают агонисты рецептора комплемента, такие как молекула, которая связывается с CD21 или CD35. В некоторых вариантах осуществления аго-нист рецептора комплемента индуцирует опсонизацию эндогенного комплемента синтетического на-нотранспортера. В некоторых вариантах осуществления адъюванты являются цитокинами, которые относятся к малым протеинам или биологическим факторам (в диапазоне 5-20 кДа), которые выделяются клетками и имеют специфические эффекты на межклеточное взаимодействие, коммуникацию и поведение других клеток. В некоторых вариантах осуществления агонист цитокинового рецептора является малой молекулой, антителом, белком слияния или аптамером.
В вариантах осуществления по меньшей мере часть дозы адъюванта может быть пришита к синтетическим нанотранспортерам, предпочтительно вся доза адъюванта пришита к синтетическим нанон-транспортерам. В других вариантах осуществления по меньшей мере часть дозы адъюванта не пришита к синтетическим нанотранспортерам. В вариантах осуществления доза адъюванта включает два или более типов адъювантов. Например, и без ограничений, можно сочетать адъюванты, которые могут воздействовать на различные рецепторы TLR. В качестве примера в варианте осуществления агонист к TLR 7/8 можно сочетать с агонистом к TLR 9. В другом варианте осуществления агонист к TLR 7/8 можно сочетать с агонистом к TLR 4. В еще одном варианте осуществления агонист к TLR 9 можно сочетать с аго-нистом к TLR 3.
"Введение" или "ввод" означает обеспечение лекарства субъекту фармакологически пригодным способом.
"Антиген" означает В-клеточный антиген или Т-клеточный антиген.
"В-клеточный антиген" означает любой антиген, который собственно является или распознается и запускает иммунный ответ у В-клетки (например, антиген, который специфически распознается В-клеточным рецептором на В-клетке). В некоторых вариантах осуществления антиген, являющийся Т-клеточным антигеном, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. В-клеточные антигены включают, но без ограничений, белки, пептиды, малые молекулы и углеводы. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является небелковым антигеном (т.е. не является белковым или пептидным антигеном). В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является углеводом, связанным с инфекционным агентом. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является гликопро-теином или гликопептидом, связанным с инфекционным агентом. Инфекционный агент может быть бактерией, вирусом, грибом, простейшим или паразитом. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является слабоиммуногенным антигеном. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является веществом, которым злоупотребляют, или его частью. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является вызывающим привыкание веществом или его частью. Вызывающие привыкание вещества включают, но без ограничений, никотин, наркотическое средство, средство от кашля, транквилизатор и седативное средство. В некоторых вариантах осуществления В-клеточным антигеном является токсин, например токсин из химического оружия или естественных источников. В-клеточный антиген также может быть средством, вредным для окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген является аутоантигеном. В других вариантах осуществления В-клеточный антиген является аллоантигеном, аллергеном, контактным аллергеном, антигеном дегенеративного заболевания, гаптеном, антигеном инфекционного заболевания, раковым антигеном, антигеном атопического заболевания, антигеном аутоиммунного заболевания, вызывающим привыкание веществом, ксеноантигеном или ферментом нарушения обмена веществ или продуктом данного фермента.
"Пришивают", или "пришитый", или "пришивает" (и подобное) означает химически соединить одну частицу (например, фрагмент) с другой. В некоторых вариантах осуществления пришивание является ковалентным. В нековалентных вариантах осуществления нековалентное пришивание опосредовано не-ковалентными взаимодействиями, включая, но без ограничений, взаимодействия зарядов, аффинные взаимодействия, координационную связь металлов, физическую адсорбцию, взаимодействия типа хозяин-гость, гидрофобные взаимодействия, взаимодействия ТТ-стэкинга, взаимодействия водородных связей, взаимодействия ван-дер-Ваальса, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, ди-поль-дипольные взаимодействия и/или их комбинации.
"Производный" означает взятый из источника и подвергнутый существенной модификации. Например, пептид или нуклеиновую кислоту с последовательностью, которая лишь на 50% идентична природному пептиду или нуклеиновой кислоте, предпочтительно природному консенсусному пептиду или нуклеиновой кислоте, будут называть как производную от природного пептида или нуклеиновой кислоты. Однако не подразумевается, что нуклеиновые кислоты, которые являются производными, включают нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые не идентичны природной последовательности нуклеиновой кислоты, предпочтительно природной консенсусной последовательности нуклеиновой кислоты, исключительно в результате вырожденности генетического кода. Существенной модификацией является модификация, которая в значительной степени затрагивает химические и иммунологические свойства обсуждаемого материала. Производные пептиды и нуклеиновые кислоты могут также включать таковые с последовательностью, которая более чем на 50% идентична последовательности природного пептида или нуклеиновой кислоты, если указанные производные пептиды и нуклеиновые кислоты имеют измененные химические или иммунологические свойства по сравнению с природным пептидом или нуклеиновой кислотой. Эти химические или иммунологические свойства включают гидрофильность, стабильность, способность связывания с МНС II и способность пришиваться к транспортеру, такому как синтетический нанотранспортер.
"Лекарственная форма" означает лекарство в среде, транспортере, носителе или устройстве, пригодном для ввода субъекту.
"Инкапсулировать" или "инкапсулированный" означает заключать в синтетическом нанотранспор-тере, предпочтительно полностью заключать в синтетическом нанотранспортере. Большая часть или все вещество, которое инкапсулируется, не подвергается воздействию локального окружения, внешнего по отношению к синтетическому нанотранспортеру. Инкапсуляция отличается от наличия по меньшей мере части вещества на поверхности синтетического нанотранспортера, которая оставляет вещество подверженным воздействию локального окружения, внешнего по отношению к синтетическому нанотранспор-теру. В варианте осуществления примером процесса, который результате приводит к наличию по меньшей мере части вещества на поверхности синтетического нанотранспортера, является адсорбция.
"Пептид, связывающийся с МНС II" означает пептид, который связывается с главным комплексом гистосовместимости класса II с достаточным сродством, чтобы позволить комплексу пептид/МНС взаимодействовать с Т-клеточным рецептором на Т-клетках. Взаимодействие комплекса пептид/МНС с Т-клеточным рецептором на Т-клетках можно установить посредством измерения продукции цитокинов и/или Т-клеточной пролиферации с помощью традиционных методик. В вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, имеют значение сродства IC50 5000 нМ или менее и более предпочтительно 50 нМ или менее для связывания с молекулой МНС II. В вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, по данному изобретению (а именно включая первый, второй и третий пептиды, связывающиеся с МНС II) имеют длины, равные или более 5 мономерных звеньев полимера, и могут быть величиной с белок. В других вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, по данному изобретению (а именно включая первый, второй и третий пептиды, связывающиеся с МНС II) имеют длины, находящиеся в диапазоне от 5 до 50 мономерных звеньев полимера, предпочтительно находящиеся в диапазоне от 5 до 40 мономерных звеньев полимера, более предпочтительно находящиеся в диапазоне от 5 до 30 мономерных звеньев полимера и еще более предпочтительно от 6 до 25 мономерных звеньев полимера.
"Идентичность" означает процент аминокислот или остатков или оснований нуклеиновой кислоты, которые идентично расположены в одномерном выравнивании последовательностей. Идентичность является мерой того, насколько близко соотносятся сравниваемые последовательности. В варианте осуществления идентичность между двумя последовательностями можно определить с помощью программы BESTFIT. В вариантах осуществления упомянутые пептиды, связывающиеся с МНС II (такие как А, В или С), могут быть по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% или еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, и/или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR. В вариантах осуществления А, В и С не на 100% идентичны друг другу, и в вариантах осуществления А и В не на 100% идентичны друг другу. В вариантах осуществления упомянутые нуклеиновые кислоты могут быть по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% или еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны последовательности природной нуклеиновой кислоты, которая кодирует или комплементарна нуклеиновой кислоте, которая кодирует природный пептид, связывающийся с HLA-DP, природный пептид, связывающийся с HLA-DQ, и/или природный пептид, связывающийся с HLA-DR.
"Выделенная нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, которая отделена от ее естественного окружения и присутствует в достаточном количестве, чтобы позволить ее идентификацию или применение. Выделенной нуклеиновой кислотой может быть кислота, которая является (i) амплифици-рованной in vitro с помощью, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР); (ii) рекомбинантно полученной с помощью клонирования; (iii) очищенной как с помощью расщепления, так и с помощью разделения в геле; или (iv) синтезированной с помощью, например, химического синтеза. Выделенной нуклеиновой кислотой является нуклеиновая кислота, которая является легко манипулируемой с помощью методик рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области техники. Таким образом, нуклео-тидную последовательность, содержащуюся в векторе, у которого известны 5' и 3' рестрикционные сайты, или для которой раскрыты последовательности праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР), считают выделенной, а последовательность нуклеиновой кислоты, существующая в ее нативном состоянии в своем природном хозяине - нет. Выделенная нуклеиновая кислота может быть в значительной степени очищена, но не обязательно. Например, нуклеиновая кислота, которая является выделенной в пределах вектора клонирования или экспрессии, не является чистой, так как она может составлять лишь ничтожный процент материала в клетке, в которой она находится. Такая нуклеиновая кислота является выделенной, однако, поскольку данное выражение применяют в данном документе, поскольку она является легко манипулируемой с помощью стандартных методик, известных рядовым специалистам в данной области техники. Любая из приведенных в данном документе нуклеиновых кислот может быть выделенной.
"Выделенный полипептид" означает полипептид, который отделен от его естественного окружения и присутствует в значительном количестве, чтобы позволить его идентификацию или применение. Это
означает, например, что полипептид может быть (i) избирательно получен путем экспрессии клонирования или (ii) очищен с помощью хроматографии или электрофореза. Выделенные белки или полипептиды могут быть, а могут не быть в значительной степени чистыми. Поскольку выделенный полипептид можно смешать с фармацевтически приемлемым транспортером, то в фармацевтическом препарате полипептид может составлять лишь небольшой процент по весу препарата. Полипептид является, тем не менее, выделенным в том, что он был отделен от веществ, с которыми он может быть связан в живых системах, например изолирован от других белков. Любой из приведенных в данном документе пептидов или полипептидов может быть выделенным.
"Линкер" означает фрагмент, который соединяет два химических компонента вместе посредством либо единичной ковалентной связи, либо множественных ковалентных связей.
"Максимальный размер синтетического нанотранспортера" означает самый большой размер на-нотранспортера, измеренный вдоль любой оси синтетического нанотранспортера. "Минимальный размер синтетического нанотранспортера" означает самый маленький размер синтетического нанотранспортера, измеренный вдоль любой оси синтетического нанотранспортера. Например, для сфероидального синтетического нанотранспортера максимальный и минимальный размер синтетического нанотранспортера были бы, по существу, идентичными и являлись бы величиной его диаметра.
Подобным образом, для кубовидного синтетического нанотранспортера минимальный размер синтетического нанотранспортера был бы наименьшим из его высоты, ширины или длины, а максимальный размер синтетического нанотранспортера был бы наибольшим из его высоты, ширины или длины. В варианте осуществления минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических нанотранспортеров в образце, основываясь на общем количестве синтетических нанотранспортеров в образце, составляет больше 100 нм. В варианте осуществления максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических нанотранспортеров в образце, основываясь на общем количестве синтетических нанотранспортеров в образце, равен или меньше 5 мкм. Предпочтительно минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических нанотранспортеров в образце, основываясь на общем количестве синтетических нанотранспортеров в образце, равен или больше 110 нм, более предпочтительно равен или больше 120 нм, более предпочтительно равен или больше 130 нм и все же более предпочтительно равен или больше 150 нм. Предпочтительно максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических нанотранспортеров в образце, основываясь на общем количестве синтетических нанотранспор-теров в образце, равен или меньше 3 мкм, более предпочтительно равен или меньше 2 мкм, более предпочтительно равен или меньше 1 мкм, более предпочтительно равен или меньше 800 нм, более предпочтительно равен или меньше 600 нм и все же более предпочтительно равен или меньше 500 нм. В предпочтительных вариантах осуществления максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических нанотранспортеров в образце, основываясь на общем количестве синтетических нанотранспортеров в образце, равен или больше 100 нм, более предпочтительно равен или больше 120 нм, более предпочтительно равен или больше 130 нм, более предпочтительно равен или больше 140 нм и более предпочтительно также равен или больше 150 нм. Измерение размера синтетического нанотранспортера проводится суспендированием синтетического нанотранспортера в жидкой (обычно водной) среде с применением динамического светорассеяния (например, используя прибор Brookhaven ZetaPALS).
"Пептид, связывающийся с природным HLA-DP" означает пептид, полученный или который является производным от природного, который связывается специфически с лейкоцитарным антигеном человека DP MHC класса II с достаточным сродством, чтобы позволить комплексу пептид/HLA-DP взаимодействовать с Т-клеточным рецептором на Т-клетках. В вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с природным HLA-DP, имеют значение сродства IC50 5000 нМ или менее и более предпочтительно 50 нМ или менее для связывания с лейкоцитарным антигеном человека DP MHC класса II. В вариантах осуществления пептид, связывающийся с HLA-DP, включает пептидную последовательность, полученную или являющуюся производной от вирусов, бактерий или дрожжей, включая, но без ограничений, Clostridium tetani, вирус гепатита Б, вирус герпеса человека, вирус гриппа, вирус коровьей оспы, вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус оспы птиц, вирус кори, вирус саркомы Рауса (RSV), цитомегаловирус (CMV), вирус ветряной оспы (VZV), вирус эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусы человека и/или вирус натуральной оспы. Выполнили прогноз эпитопа класса II с помощью инструментов для прогноза эпитопа Т-клеток Immune Epitope Database* (IEDB) (http://www.immuneepitope.org/). Для каждого пептида создали процентильный ранг для каждого из трех способов (ARB, SMMalign и Sturniolo) путем сравнения балла пептида с баллами пяти миллионов случайных 15 мономерных звеньев полимера из базы данных SWISSPROT. Процентильные ранги для трех способов затем использовали для создания ранга для консенсусного способа.
"Пептид, связывающийся с природным HLA-DQ" означает пептид, полученный или который является производным от природного, который связывается специфически с лейкоцитарным антигеном чело
века DQ МНС класса II с достаточным сродством, чтобы позволить комплексу пептид/HLA-DQ взаимодействовать с Т-клеточным рецептором на Т-клетках. В вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с природным HLA-DQ, имеют значение сродства IC50 5000 нМ или менее и более предпочтительно 50 нМ или менее для связывания с лейкоцитарным антигеном человека DQ МНС класса II. В вариантах осуществления пептид, связывающийся с HLA-DQ, включает пептидную последовательность, полученную или являющуюся производной от вирусов, бактерий или дрожжей, включая, но без ограничений, Clostridium tetani, вирус гепатита Б, вирус герпеса человека, вирус гриппа, вирус коровьей оспы, вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус оспы птиц, вирус кори, вирус саркомы Рауса (RSV), цитомегаловирус (CMV), вирус ветряной оспы (VZV), вирус эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусы человека и/или вирус натуральной оспы. Выполнили прогноз эпитопа класса II с помощью инструментов для прогноза эпитопа Т-клеток Immune Epitope Database* (IEDB)
(http://www.immuneepitope.org/). Для каждого пептида создали процентильный ранг для каждого из трех способов (ARB, SMMalign и Sturniolo) путем сравнения балла пептида с баллами пяти миллионов случайных 15 мономерных звеньев полимера из базы данных SWISSPROT. Процентильные ранги для трех способов затем использовали для создания ранга для консенсусного способа.
"Пептид, связывающийся с природным HLA-DR" означает пептид, полученный или который является производным от природного, который связывается специфически с лейкоцитарным антигеном человека DR МНС класса II с достаточным сродством, чтобы позволить комплексу пептид/HLA-DR взаимодействовать с Т-клеточным рецептором на Т-клетках. В вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с природным HLA-DR, имеют значение сродства IC50 5000 нМ или менее и более предпочтительно 50 нМ или менее для связывания с лейкоцитарным антигеном человека DR МНС класса II. В вариантах осуществления пептид, связывающийся с HLA-DR, включает пептидную последовательность, полученную или являющуюся производной от вирусов, бактерий или дрожжей, включая, но без ограничений, Clostridium tetani, вирус гепатита Б, вирус герпеса человека, вирус гриппа, вирус коровьей оспы, вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус оспы птиц, вирус кори, вирус саркомы Рауса (RSV), цитомегаловирус (CMV), вирус ветряной оспы (VZV), вирус эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусы человека и/или вирус натуральной оспы. Выполнили прогноз эпитопа класса II с помощью инструментов для прогноза эпитопа Т-клеток Immune Epitope Database* (IEDB) (http://www.immuneepitope.org/). Для каждого пептида создали процентильный ранг для каждого из трех способов (ARB, SMMalign и Sturniolo) путем сравнения балла пептида с баллами пяти миллионов случайных 15 мономерных звеньев полимера из базы данных SWISSPROT. Процентильные ранги для трех способов затем использовали для создания ранга для консенсусного способа.
"Полученный" означает взятый из источника без существенной модификации. Существенной модификацией является модификация, которая в значительной степени затрагивает химические и иммунологические свойства обсуждаемого материала. Например, в качестве неограничивающего примера пептид или нуклеиновая кислота с последовательностью, которая более чем на 90%, предпочтительно более чем на 95%, предпочтительно более чем на 97%, предпочтительно более чем на 98%, предпочтительно более чем на 99%, предпочтительно на 100% идентична природной пептидной или нуклеотидной последовательности, предпочтительно природной консенсусной пептидной или нуклеотидной последовательности, и химическими и/или иммунологическими свойствами, которые существенно не отличаются от природного пептида или нуклеиновой кислоты, как сказали бы, является полученной из природной пептидной или нуклеотидной последовательности. Подразумевается, что нуклеиновые кислоты, которые являются полученными, включают нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые не идентичны природной консенсусной нуклеотидной последовательности исключительно вследствие вырожденности генетического кода. У таких нуклеиновых кислот может даже быть последовательность, которая менее чем на 90% идентична природной нуклеотидной последовательности, предпочтительно природной консенсусной нуклеотидной последовательности. Эти химические или иммунологические свойства включают гидрофильность, стабильность, способность связывания с МНС II и способность пришиваться к транспортеру, такому как синтетический нанотранспортер.
"Фармацевтически приемлемый наполнитель" означает фармакологически неактивный материал, применяемый вместе с упомянутыми пептидами в вариантах осуществления по разработке рецептуры композиций, лекарственных форм, вакцин данного изобретения и т.п. Фармацевтически приемлемые наполнители включают ряд материалов, известных в уровне техники, включая, но без ограничений, саха-риды (такие как глюкоза, лактоза и т.п.), консерванты, такие как противомикробные средства, вспомогательные добавки для растворения, красители, солевой раствор (такой как фосфатно-солевой буферный раствор), буферы, диспергаторы, стабилизаторы, другие наполнители, отмеченные в данном документе, и другие подобные материалы, которые традиционно известны.
"Субъект" означает животных, включая теплокровных млекопитающих, таких как человек и приматы; птиц; животных домашнего хозяйства или сельскохозяйственных животных, таких как кошки, собаки, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади и свиньи; лабораторных животных, таких как мыши, крысы и морские свинки, рыба; рептилии; животные в неволе и дикие животные; и тому подобное.
"Синтетический нанотранспортер(ы)" означает дискретный объект, который не встречается в при
роде и который обладает по меньшей мере одним размером, который меньше или равен 5 мкм. В качестве синтетических нанотранспортеров обычно включают наночастицы альбумина, однако в некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры не включают наночастицы альбумина. В вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры не включают хитозан.
Синтетический нанотранспортер может быть, но не ограничен этим, одной или несколькими нано-частицами на основе липидов, полимерными наночастицами, металлическими наночастицами, эмульсиями на основе поверхностно-активных веществ, дендримерами, бакиболами, нанопроволоками, вирусоподобными частицами, пептидами или белковыми частицами (такими как альбуминовые наночастицы) и/или наночастицами, которые создают, используя комбинацию наноматериалов, таких как липид-полимерные наночастицы. Синтетические нанотранспортеры могут иметь ряд различных форм, включая, но не ограничиваясь, сфероидальной, кубовидной, пирамидальной, продолговатой, цилиндрической, тороидальной и т.п. Синтетические нанотранспортеры согласно данному изобретению имеют одну или несколько поверхностей. Примеры синтетических нанотранспортеров, которые могут быть адаптированы для использования в практическом применении данного изобретения, включают: (1) биоразлагаемые наночастицы, раскрытые в патенте США № 5543158, Gref и соавт., (2) полимерные наночастицы из опубликованной заявки на патент США 20060002852, Saltzman и соавт., (3) сконструированные литографическим способом наночастицы из опубликованной заявки на патент США 20090028910, DeSimone и соавт., (4) раскрытие WO 2009/051837, von Andrian и соавт., или (5) наночастицы, раскрытые в опубликованной заявке на патент США 2008/0145441, Penades и соавт. В вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут иметь соотношение сторон более 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или более 1:10.
Синтетические нанотранспортеры согласно данному изобретению, которые имеют минимальный размер, равный или менее чем приблизительно 100 нм, предпочтительно равный или менее чем 100 нм, не содержат поверхности с гидроксильными группами, которые активируют комплемент, или, альтернативно, содержат поверхность, которая состоит в основном из фрагментов, не являющихся гидроксиль-ными группами, которые активируют комплемент. В предпочтительном варианте осуществления синтетические нанотранспортеры согласно данному изобретению, имеющие минимальный размер, равный или менее приблизительно 100 нм, предпочтительно равный или менее 100 нм, не имеют поверхности, которая, по сути, активирует комплемент, или, альтернативно, имеют поверхность, которая состоит в основном из частей, которые, по сути, не активируют комплемент. В более предпочтительном варианте осуществления синтетические нанотранспортеры согласно данному изобретению, имеющие минимальный размер, равный или менее приблизительно 100 нм, предпочтительно равный или менее 100 нм, не имеют поверхности, которая активирует комплемент, или, альтернативно, имеют поверхность, которая состоит в основном из частей, которые не активируют комплемент. В варианте осуществления синтетические нанотранспортеры по данному изобретению исключают вирусподобные частицы.
"Т-клеточный антиген" означает CD4+ Т-клеточный антиген или CD8+ Т-клеточный антиген. "CD4+ Т-клеточный антиген" означает любой антиген, который распознается и инициирует иммунный ответ в CD4+ Т-клетках (например, антиген, который специфически распознается Т-клеточным рецептором на CD4+ Т-клетках через презентирование антигена или его части, связанной с молекулой класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). "CD8+ Т-клеточный антиген" означает любой антиген, который распознается и инициирует иммунный ответ в CD8+ Т-клетках (например, антиген, который специфически распознается Т-клеточным рецептором на CD8+ Т-клетках через презентирование антигена или его части, связанной с молекулой класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС). В некоторых вариантах осуществления антиген, являющийся Т-клеточным антигеном, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. Т-клеточными антигенами в основном являются белки или пептиды, но могут являться и другие молекулы, такие как липиды и гликолипиды. Т-клеточными антигенами являются антигены, которые стимулируют ответ CD4+ Т-клеток или ответ CD8+ Т-клеток.
"Вакцина" означает композицию вещества, которая усиливает иммунный ответ на конкретный патоген или заболевание. Вакцина обычно содержит факторы, которые стимулируют иммунную систему субъекта к узнаванию специфического антигена как чужеродного и его устранение из организма субъекта. Вакцина также создает иммунологическую "память", поэтому антиген будет быстро узнаваться, и на него будет быстро дан ответ, если человек подвергнется повторному заражению. Вакцины могут быть профилактическими (например, для предупреждения будущей инфекции каким-либо патогеном) или терапевтическими (например, вакцина против опухолеспецифического антигена для лечения рака). Вакцины по данному изобретению могут включать один или несколько пептидов, связывающихся с МНС II, или одну или несколько нуклеиновых кислот, которые кодируют или которые комплементарны одной или нескольким нуклеиновым кислотам, которые кодируют один или несколько пептидов, связывающихся с МНС II.
С. Пептиды по данному изобретению и способы их получения и применения
В вариантах осуществления композиции по данному изобретению и относящиеся к ним способы включают А-х-В, где х может включать линкер или не включать линкер, А включает первый пептид, свя
зывающийся с МНС II, и В включает второй пептид, связывающийся с МНС II. Кроме того, в вариантах осуществления композиции по данному изобретению и относящиеся к ним способы включают А-х-В-у -С, где х может включать линкер или не включать линкер, у может включать линкер или не включать линкер, А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и С включает третий пептид, связывающийся с МНС II.
В определенных вариантах осуществления х и/или у, если у присутствует, могут не включать линкер, в случае чего А, В, С и различные комбинации каждого могут присутствовать в композициях по данному изобретению в виде смесей. Примеры таких комбинаций, которые могут присутствовать в виде смесей, включают, но без ограничений, А и В, А и В-У-С, А-х-В и С, А и В и С и т.д., где "и" используют для обозначения отсутствия связи, а "-х-" или "-у-" используют для обозначения наличия связи. Такой подход в отношении смесей можно использовать для легкого комбинирования ряда различных пептидов, связывающихся с МНС II, таким образом обеспечивая простоту в использовании и/или упрощение синтеза по сравнению, например, с созданием одной большой молекулы, которая содержит остатки пептидов, связывающихся с МНС II. Смеси можно составить с помощью традиционных фармацевтических способов смешивания. Таковые включают смешивание жидкость-жидкость, при котором две или больше суспензий, при этом каждая содержит один или несколько наборов пептидов, смешивают непосредственно или собирают вместе посредством одного или нескольких сосудов, содержащих разбавитель. Поскольку пептиды можно также получить или хранить в форме порошка, то можно осуществить сухое смешивание порошок-порошок также, как можно ресуспендировать два или более порошка в обычных средах. В зависимости от свойств пептидов и их потенциалов взаимодействия могут быть преимущества, присущие тому или иному способу смешивания.
Смеси могут быть получены с использованием традиционного фармацевтического производства и методик смешивания, чтобы получить пригодные лекарственные формы. Методики, пригодные для применения в практическом осуществлении данного изобретения, можно найти в Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; и Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M.E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. В вариантах осуществления типичные композиции по данному изобретению, которые включают смеси пептидов, могут включать неорганические или органические буферы (например, натриевые или калиевые соли фосфата, карбоната, ацетата или цитрата) и средства регулирования рН (например, соляная кислота, гидроксид натрия или калия, соли цитрата или ацетата, аминокислоты и их соли), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, а-токоферол), поверхностно-активные вещества (например, полисорбат 20, полисорбат 80, полиоксиэтилен 9-10, нонилфенол, дезоксихолат натрия), стабилизаторы раствора и/или крио/лиостабилизаторы (например, сахароза, лактоза, маннит, трегалоза), средства осмотического регулирования (например, соли или сахара), антибактериальные средства, (например, бензойная кислота, фенол, гентамицин), противовспенивающие средства (например, полидиме-тилсилозон), консерванты (например, тимерозал, 2-феноксиэтанол, EDTA), полимерные стабилизаторы и средства для регулирования вязкости (например, поливинилпирролидон, полоксамер 488, карбоксиме-тилцеллюлоза) и вспомогательные растворители (например, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол).
В вариантах осуществления х и/или у, если он присутствует, могут включать линкер. В вариантах осуществления линкер может непосредственно соединять аминокислоты, либо природные, либо модифицированные, которые являются частью пептида, связывающегося с МНС II, или линкер может добавлять атомы, предпочтительно множество атомов, для соединения с пептидами, связывающимися с МНС II. Линкеры могут быть полезны по ряду причин, включая, но без ограничений, облегчение синтеза, содействие химическому расщеплению, отделение пептидов, связывающихся с МНС II, вставку химически реакционноспособного сайта (по типу дисульфида) и/или сайта расщепления протеазой. Линкеры могут включать расщепляемые линкеры, которые расщепляются в определенных физиологических условиях, и нерасщепляемые линкеры, которое плохо расщепляются в типичных физиологических условиях, с которыми сталкиваются композиции по данному изобретению при введении субъекту.
В определенных вариантах осуществления х и/или у, если он присутствует, могут включать линкер, который включает амидный линкер, дисульфидный линкер, сульфидный линкер, линкер на основе 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола, линкер на основе сложных тиоловых эфиров или иминовый линкер. Дополнительные линкеры, пригодные в практическом осуществлении данного изобретения, включают линкеры на основе сложных тиоловых эфиров, образованные из тиола и кислоты, гидразидные линкеры, образованные из гидразина и кислоты, иминовые линкеры, образованные из амина и альдегида или кето-на, линкеры на основе тиомочевины, образованные из тиола и тиоизоцианата, амидиновые линкеры, образованные из амина и сложного имидатного эфира, и аминовые линкеры, образованные в результате восстановительного аминирования амина и альдегида. В вариантах осуществления х и/или у, если он присутствует, могут включать линкер, который включает пептидную последовательность, предпочтительно последовательности, которые включают сайт для расщепления лизосомальными протеазами (например, сайт для расщепления катепсином), биоразлагаемый полимер, линкер на основе замещенного или незамещенного алкана, алкена, замещенной или незамещенной ароматической или гетероциклической группы, рН-чувствительный полимер, гетеробифункциональные линкеры или спейсер на основе
олигомерного гликоля.
Расщепляемые линкеры включают, но без ограничений, пептидные последовательности, предпочтительно пептидные последовательности, которые включают сайт расщепления лизосомальной протеа-зой; биоразлагаемый полимер; разлагаемый под действием рН полимер или дисульфидную связь. Сайты расщепления лизосомальной протеазой включают пептидные последовательности, специфически распознаваемые как подлежащие расщеплению лизосомальными протеазами, включая сериновые протеазы, треониновые протеазы, аспартатные протеазы, цинковые протеазы, металлопротеазы, глутаминовые про-теазы, цистеиновые протеазы (AMSH/STAMBP катепсин F, катепсин 3, катепсин Н, катепсин 6, катепсин L, катепсин 7/катепсин 1 катепсин О, катепсин А катепсин S, катепсин В, катепсин V, катепсин C/DPPI, катепсин X/Z/P, катепсин D, легумаин). Биоразлагаемые полимеры разлагаются в ряде физиологических условий, в то время как разлагаемые под действием рН полимеры разлагаются с повышенной скоростью при условии низкого (ниже физиологического рН) рН. В определенных вариантах осуществления пептидная последовательность линкера включает аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 99 или 119.
pmglp (SEQ ID NO: 99).
skvsvr (SEQ ID NO: 119).
Дополнительную информацию можно найти в A. Purcell et al., "More than one reason to rethink the use of peptides in vaccine design." J. Nat. Rev. Drug. Discov. 2007; 5:404-14; R. Bei et al., "TAA polyepitope DNA-based vaccines: A potential tool for cancer therapy." J. Biomed Biotech. 2010 ; 102785: 1-12; W. Wrig-gers et al., "Control of protein functional dynamics by peptide linkers." Biopolymers. 2005;80(6): 736-46; J. Timmerman et al., "Carrier protein conjugate vaccines: the "missing link" to improved antibody and CTL responses?" Hum Vaccin. 2009 Mar; 5(3):181-3' B. Law et al., "Proteolysis: a biological process adapted in drug delivery, therapy, and imaging." Bioconjug Chem. 2009 Sep;20(9):1683-95.
Амидный линкер представляет собой линкер, образованный между аминогруппой на одном химическом компоненте с карбоксильной группой второго химического компонента. Эти линкеры могут быть получены с применением традиционных химий образования амидных линкеров с аминокислотами или полипептидами с соответствующими защитными группами. В варианте осуществления упомянутые амидные линкеры могут образовываться в течение всего синтеза А и В (или В и С и т.д.), упрощая, таким образом, создание х и/или у. Этот тип химизма связывания можно легко классифицировать, как включающий расщепляемую связывающую группу.
Дисульфидный линкер представляет собой линкер между двумя атомами серы формы, например R1-S-S-R2. Дисульфидный линкер может быть образован с помощью окислительного соединения двух одинаковых или различных молекул, таких как пептиды, содержащие меркаптановые заместители (-SH), или предпочтительно с помощью предварительно образованного линкера формы, например H2N-R1-S-S-R2-CO2H, где аминогруппа и/или карбоксильная функциональная группа надлежащим образом защищены. Этот тип химизма связывания чувствителен к восстановительному расщеплению, которое может привести к разделению двух отдельных пептидов памяти. Это существенно, поскольку восстанавливающую среду можно обнаружить в лизосомах, которые являются целевым компартментом, представляющим иммунологический интерес.
Для образования линкеров можно использовать гидразидный и альдегидный/кетоновый химизм. Получают первый пептид, содержащий гидразидную или альдегидную/кетоновую функциональную группу, концевую для цепи первого пептида. Получают второй пептид либо с гидразидом (если первый пептид содержит альдегид/кетон), либо альдегидом/кетоном (если первый пептид содержит гидразид), концевым для цепи второго пептида. Двум пептидам затем позволяют прореагировать со связыванием двух пептидов через гидразоновую функциональную группу. В целом, образованная таким образом гид-разоновая связь является расщепляемой в кислых условиях, таких как те, которые обнаруживаются в ли-зосоме. Если нужна большая стабильность линкера, то гидразон можно подвергнуть восстановлению с образованием соответствующего стабильного (нерасщепляемого) алкилированного гидразида (подобно восстановительному аминированию амина с альдегидом или кетоном с образованием соответствующего алкиламина).
Нерасщепляемые линкеры можно образовать посредством различных химизмов и можно образовать с помощью ряда различных материалов. Обычно линкер считают нерасщепляемым, если каждый такой нерасщепляемый линкер стабилен в течение более 12 ч в условиях лизосомального рН. Примеры нерасщепляемых линкеров включают, но без ограничений, группы, содержащие амины, сульфиды, триа-золы, гидразоны, амид(сложные эфиры)ы и замещенные или незамещенные алканы, алкены, ароматические группы или гетероциклы; полимеры; спейсеры на основе олигомерного гликоля; и/или не встречающиеся в природе или химически модифицированные аминокислоты. Далее следуют примеры нескольких общепринятых методик. Этот список далеко не полный и возможны многие другие способы.
Сульфидный линкер имеет форму, например, R1-S-R2. Этот линкер можно получить либо посредством алкилирования меркаптана, либо посредством реакции присоединения Михаэля меркаптана на одной молекуле, такой как пептид, к активированному алкену на второй молекуле, такой как пептид, либо посредством присоединения радикала меркаптана на одной молекуле, такой как пептид, к алкену на вто
где R1 и R2 могут быть любыми химическими структурными элементами и являются полученными с помощью 1,3-биполярного присоединения азида, прикрепленного к первому пептиду, к концевому алкину, прикрепленному ко второму пептиду. Этот химизм подробно описан у Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002) и зачастую называется "клик-химия Шарплесса". Получают первый пептид, содержащий азидную или алкиновую функциональную группу, концевую для цепи первого пептида. Получают второй пептид либо с алкином (если первый пептид содержит азид), либо азидом (если первый пептид содержит алкин), концевым для цепи второго пептида. Двум пептидам затем позволяют вступить в реакцию в циклоприсоединении 3+2 с или без катализатора, которая связывает два пептида через 1,2,3-триазиновую функциональную группу.
Для образования линкера можно использовать серную "клик"-химию. Получают первый пептид, содержащий меркаптановую или алкеновую функциональную группу, концевую для цепи первого пептида. Получают второй пептид либо с алкеном (если первый пептид содержит меркаптан), либо меркаптаном (если первый пептид содержит алкен), концевым для цепи второго пептида. Двум пептидам позволяют вступить в реакцию в присутствии света или источника радикалов, что связывает два пептида через сульфидную функциональную группу.
Для образования линкера можно использовать химизм реакции присоединения Михаэля. Несмотря на то, что для данной цели можно использовать ряд пар акцепторов и доноров, предпочтительным примером данного способа является применение меркаптанов в качестве донора в реакции Михаэля и активированных алкенов в качестве акцептора в реакции Михаэля. Данный химизм отличается от упомянутой выше серной клик-химии в том, что алкенам должно не хватать электрона и не нужен радикальный катализ. Получают первый пептид, содержащий меркаптановую или алкеновую функциональную группу, концевую для цепи первого пептида. Получают второй пептид либо с алкеном (если первый пептид содержит меркаптан), либо меркаптаном (если первый пептид содержит алкен), концевым для цепи второго пептида. Двум пептидам позволяют вступить в реакцию в присутствии кислоты или основания, что связывает два пептида через сульфидную функциональную группу.
В вариантах осуществления каждый из А и В; А и С, В и С и А, В и С включают пептиды, имеющие различные репертуары связывания с МНС II. DP, DQ и DR представляют собой белки, кодируемые независимыми генами. В аутбредной человеческой популяции присутствует большое количество вариантов (аллелей) DP, DQ и DR, и у каждого аллеля различное характерное связывание с пептидом. Например, конкретный природный пептид, связывающийся с HLA-DP, может связываться с некоторыми аллелями DP, но не с другими. Пептидный "репертуар связывания" относится к комбинации аллелей, обнаруживаемых у DP, DQ и/или DR, с которыми будет связываться отдельный пептид. Идентификация пептидов и/или их комбинаций, которые связываются со всеми аллелями DP, DQ и/или DR, вызывая таким образом вторичные иммунные ответы памяти у высокого процента людей до включительно 100% людей, предоставляет средства улучшения эффективности вакцины.
В вариантах осуществления каждый из А и В включает последовательность, полученную или являющуюся производной от различного инфекционного организма. В вариантах осуществления каждый из А, В и С включает пептидную последовательность, полученную или являющуюся производной от различного инфекционного организма. В вариантах осуществления предпочтительные пептидные последовательности могут быть таковыми пептидного или белкового эпитопа, который может распознаваться Т-клеткой. Предпочтительные пептидные последовательности включают таковые пептиды, связывающиеся с МНС II, полученные или являющиеся производными от Clostridium tetani, вируса гепатита Б, вируса герпеса человека, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса Эпштейна-Барра (EBV), вируса оспы птиц, вируса кори, вируса саркомы Рауса (RSV), цитомегаловируса (CMV), вируса ветряной оспы (VZV), вируса эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусов человека, вируса натуральной оспы и/или инфекционных организмов, способных инфицировать людей и инерировать CD4+ клетки памяти человека, специфичные к такому инфекционному организму, после начала инфекции. В вариантах осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, включают пептиды, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% или еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны природному пептиду, связывающе
муся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, полученному или являющемуся производным от Clostridium tetani, вируса гепатита Б, вируса герпеса человека, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса Эпштейна-Барра (EBV), вируса оспы птиц, вируса кори, вируса саркомы Рауса (RSV), цитомегаловируса (CMV), вируса ветряной оспы (VZV), вируса эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусов человека, вируса натуральной оспы и/или инфекционных организмов, способных инфицировать людей и инерировать CD4+ клетки памяти человека, специфичные к такому инфекционному организму, после начала инфекции. В вариантах осуществления А, В и С выбирают так, чтобы обеспечивать оптимальный иммунный ответ с помощью общих подходов, изложенных в примерах 1-6 ниже.
В определенных вариантах осуществления для данных целей, таких как облегчение обработки, составления и/или для улучшенной доставки в пределах биологической системы, может быть желательным повышение водорастворимости пептида, связывающегося с МНС II. С этой целью повышение гидро-фильности может быть достигнуто путем добавления гидрофильных N- и/или С-концевых аминокислот, путем добавления или модификации аминокислотных последовательностей между сайтами связывания или путем создания замен на аминокислоты сайта связывания. Повышение гидрофильности, например, можно измерить посредством оценки в баллах более низкого GRAVY, Grand Average of Hydropathy (общее среднее гидрофобности). По возможности, на создание предполагаемых модификаций можно оказывать влияние с тем, чтобы избежать или ограничить возможные отрицательные воздействия на связывающую способность.
Одним возможным путем модификации является добавление аминокислот не сайта связывания на основе аминокислот, находящихся рядом с сайтом связывания-эпитопом, особенно если такие фланкирующие аминокислоты будут повышать среднюю или местную гидрофильность пептида. То есть, если сайт связывания-эпитоп в его нативной расширенной последовательности фланкирован гидрофильными аминокислотами с N и/или С-концевой стороны, то сохранение некоторых из этих фланкирующих гидрофильных аминокислот в пептиде может повысить его водорастворимость. В отсутствие фланкирующих последовательностей, которые вероятно повышали бы растворимость, или в случае необходимости дальнейшего повышения гидрофильности можно осуществить ненативные дополнения, в идеальном случае на основе схожести с нативной последовательностью. Аминокислотную схожесть можно оценить по показателям, таким как матрицы Blosum 45 или РАМ 250, или другими средствами, известными в области техники. Например, если у эпитопа бал GRAVY составляет -1,0 и ему предшествует на N-конце нативная аминокислотная последовательность EASF (GRAVY = 0,075), то удлинение пептида с включением EASF будет снижать бал GRAVY. Альтернативно, одна или несколько замен в указанной предшествующей последовательности EASF, таких как А на S, S на N или F на Y (например, EASY GRAVY = -0,95), или укорачивание и замена (например, NY, GRAVY = -2,4) могут также дать повышенную гидро-фильность.
В некоторых случаях может быть предпочтительным снижение водорастворимости пептида, например, для улучшения удерживания в гидрофобной матрице транспортера. В таких случаях можно осуществить добавления и замены, подобные описанным выше, но с уменьшением гидрофильности.
Дополнительно может быть благоприятным регулирование суммарного заряда пептида в одном или нескольких значениях рН. Например, минимальную растворимость можно наблюдать при pI (рН изо-электрической точки) пептида. В случае, где было бы желательно иметь пониженную растворимость при рН 7,4 и повышенную растворимость при рН 3,0, можно осуществить модификации или добавления к аминокислотной последовательности для достижения pI 7,4 и для достижения значительного положительного суммарного заряда при рН 3,0. В случае основного пептида добавление кислых остатков, таких как Е или D, или замена K на Е являются иллюстративными модификациями, которые могут уменьшить
pI.
Биологическую или химическую стабильность пептида можно также повысить путем добавления или замены аминокислот или модификации концевых групп с помощью методов, известных в области техники. Примеры включают, но без ограничений, амидирование и ацетилирование и могут также включать замены, такие как замещение С-концевой Q (Gln) на L или другую аминокислоту, менее чувствительную к перегруппировке.
В вариантах осуществления данное изобретение направлено на композиции, включающие полипептид, последовательность которого включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из аминокислотных последовательностей, изложенных как SEQ ID NO: 146, и предпочтительно на полипептид, связывающийся с молекулой МНС II, который описан в других разделах данного документа
NNFTVSFWLRVPKVSASHLET (SEQ ID ЫО:1) (21, ТТ317557(950969));
TLLYVLFEV (SEQ ID N0:2) (9, AdVhex64950(913-921)); ILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:3) (15, TT27213 (830-84Ш ; QSIALSSLMVAQAIPLVGEL (SEQ ID H0:4) (20, DT 52336(331
(SEQ ID N0:5) (30,
AdVTT830);
ID N0:7) (35,
ID N0:8) (35,
(SEQ ID N0:9) (27,
(SEQ ID N0:10) (29,
(SEQ ID N0:11) (29,
(SEQ ID N0:12) (29,
(SEQ ID N0:13) (32,
N0:14) (32,
(35,
TT632DTt-3);
QSIALSSLMVAQAIPLVpmglpIDKISDVSTIVPYIGPALNI (SEQ ID N0:26) (43, DTt-3pTT632);
IDKISDVSTIVPYIGPALNIpmglpQSIALSSLMVAQAIPLV (SEQ ID N0:27) (43, TT632pDTt-3) ,-
YVKQNTLKLAT (SEQ ID N0:28) (11, minX);
CYPYDVPDYASLRSLVASS (SEQ ID N0:29) (19, 7430);
NAELLVALENQHTI (SEQ ID N0:30) (14, 31201t);
TSLYVRASGRVTVSTK (SEQ ID N0:31) (16, 66325);
EKIVLLFAIVSLVKSDQICI (SEQ ID N0:32) (20, ABW1) ;
QILSIYSTVASSLALAIMVA (SEQ ID N0:33) (20, ABW2);
MVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSI (SEQ ID N0:34) (24, ABP);
EDLIFLARSALILRGSV (SEQ ID N0:35) (17, AAT) ;
CSQRSKFLLMDALKLSIED (SEQ ID N0:36) (19, AAW);
IRGFVYFVETLARSICE (SEQ ID N0:37) (14, IRG);
TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (SEQ ID N0:38) (21, TFE);
LIFLARSALILRkvsvrNAELLVALENQHTI (SEQ ID N0:39) (31, AATk3120t);
NAELLVALENQHTIkvs vrLIFLARSALILR (SEQ ID N0:40) (31, 3120tkAAT);
ILSIYSTVASSLALAIkvsvrLIFLARSALILR (SEQ ID N0:41) (33, ABW2kAAT) ;
LIFLARSALILRkvsvrlLSIYSTVASSLALAI (SEQ ID N0:42) (33, AAT1CABW2) ;
LIFLARSALILRkvsvrCSQRSKFLLMDALKL (SEQ ID N0:43) (32, AATkAAW);
CSQRSKFLLMDALKbkvsvrLIFLARSALILR (SEQ ID N0:44) (32, AAWkAAT);
TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL IRGFVYFVETLARSICE (SEQ ID N0:45) (38, TFEIRG) (SEQ ID N0:103); ИЛИ
IRGFVYFVETLARSICE TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (SEQ ID N0:46) (38, IRGTFE) (SEQ ID N0:104).
Пептиды по данному изобретению, в особенности пептиды, связывающиеся с МНС II, можно получить с помощью ряда традиционных методик. В определенных вариантах осуществления пептиды можно получить искусственно с помощью стандартных способов, таких как синтез на твердой подложке с помощью смол Меррифилда или подобных смол. Его можно осуществить с помощью или без аппарата,
разработанного для такого синтеза.
В альтернативных вариантах осуществления с целью экспрессии пептидов по данному изобретению, в особенности пептидов, связывающихся с МНС II, можно использовать методики, связанные с рекомбинацией. В таких вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую полную последовательность пептида (и последовательность линкера, если возможно) клонируют в вектор экспрессии, который будет транскрибироваться при трансфекции в клеточную линию. В вариантах осуществления вектор экспрессии может включать плазмиду, ретровирус или аденовирус, среди прочих. ДНК для пептида (и линкерной группы, если присутствует) можно выделить с помощью стандартных подходов молекулярной биологии, например с помощью полимеразной цепной реакции с получением фрагмента ДНК, который затем очищают и клонируют в вектор экспрессии и трансфицируют в клеточную линию. Дополнительные методики, пригодные для практического осуществления данного изобретения, можно найти в Current Protocols in Molecular Biology 2007 by John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Cold Spring Harbor.
Получение рекомбинантных пептидов по данному изобретению можно осуществить несколькими способами с использованием клеток из различных организмов, например, клеток СНО, клеток насекомых (например, для бакуловирусной экспрессии), Е. coli и т.д. Кроме того, с целью получения оптимальной трансляции белка последовательность нуклеиновой кислоты можно модифицировать с включением ко-донов, которые обычно используются в организме, производными которого являются клетки. SEQ ID NO: 1-46 включают примеры последовательностей, полученных или являющихся производными от столбнячного токсина, дифтерийного токсина и пептидов аденовируса, a SEQ ID NO: 47-68 включают аналогичные последовательности ДНК на основе предпочтительной частоты использования кодона для людей и Е. coli. С помощью ДНК, которая оптимизирована под частоту использования кодона у конкретных видов, можно сделать возможной оптимальную продукцию рекомбинантного белка. Кодоновые частоты можно оптимизировать для использования у людей с помощью данных по частотам, таких как те, что доступны из записей о различных частотах использования кодонов. Одной такой записью является База данных частот использования кодона (Codon Usage Database). Y. Nakamura et al., "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000." Nucl. Acids Res. 28, 292
(2000).
В вариантах осуществления композиции по данному изобретению включают нуклеиновую кислоту, которая кодирует пептид, приведенный в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать А, В или С или их комбинацию. Нуклеиновой кислотой может быть ДНК или РНК, такая как и РНК. В вариантах осуществления композиции по данному изобретению включают комплементарную цепь, такую как комплементарная цепь с полной длиной, или вырожденную последовательность (вследствие вырожденности генетического кода) любых из приведенных в данном документе нуклеиновых кислот.
В вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует А-х-В, где х представляет собой амидный линкер или пептидный линкер, А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и В включает второй пептид, связывающийся с МНС II. Кроме того, в вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует А-х-В-у --С, где х представляет собой шидный линкер или пептидный линкер, у представляет собой амид-ный линкер или пептидный линкер, А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и С включает третий пептид, связывающийся с МНС II.
Определенные представляющие интерес последовательности приведены ниже. Нативная последовательность представляет собой композицию 1 (С1). Наилучшая последовательность человека на основе частоты использования кодона человека представляет собой композицию 2 (С2). Превращения выполнили с помощью The Sequence Manipulation Suite: программы JavaScript для анализа и форматирования последовательностей ДНК и белка. Biotechniques 28:1102-1104. http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html
ТТ950: HNFTVSFWLRVPKVSASHLET (SEQ ID N0:1) CI:
aataattttaccgttagcttttggttgagggttcctaaagtatctgctagtcatttagaa (SEQ ID N0:47) AF154828 250-309 C2(человека):
aacaacttcaccgtgagcttctggctgagagtgcccaaggtgagcgccagccacctgg agacc (SEQ ID N0:48)
AdV: TLLYVLFEV (SEQ ID N0:2)
CI: acgcttctctatgttctgttcgaagt (SEQ ID N0:49) FJ025931 20891-20917 C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtg (SEQ ID N0:50) TT830: ILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:3)
CI: attttaatgcagtatataaaagcaaattctaaatttataggtata (SEQ ID N0:51)
X06214 2800-2844 C2(человека):
Atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:52)
DT: QSIALSSLMVAQAIPLVGEL (SEQ ID N0:4) CI:
caatcgatagctttatcgtctttaatggttgctcaagctataccattggtaggagagcta (SEQ ID N0:53)
FJ858272 1066-1125
C2(человека):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagc tg (SEQ ID N0:54)
Химерные эпитопы:
AdVTT950: TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET (SEQ ID N0:5) C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaacaacttcaccgtgagcttctggctgagag
cccaaggtgagcgccagccacctggagacc (SEQ ID N0:55)
AdVTT830: TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:6) C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgatcctgatgcagtacatcaaggccaacagca
ttcatcggcatc (SEQ ID N0:56)
TT830 DT: ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL (SEQ ID
N0:7)
C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccc
agcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg (SEQ ID N0:57)
DT TT830i QSIALSSLMVAQAIPLVGEL ILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID
N0:8)
C2(человека):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagc
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:58)
TT830DTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:9) C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccc
agcagcctgatggtggcccag (SEQ ID N0:59)
DT trunc TT830: QSIALS SLMVAQAIILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:10)
C2(человека):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatcatcctgatgcagtaca
aaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:60)
Прогнозируемые химерные универсальные эпитопы, расщепляемы катепсином
AdVpmglpTT830: TLLYVLFEVPMG.LPILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:11)
CI (Ecoli):
accctgctgtatgtgctgtttgaagtgccgatgggcctgccgattctgatgcagtata
aaagcgaacagcaaatttattggcatt (SEQ ID N0:61) C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgcccatgggcctgcccatcctgatgcagtaca
aaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:62)
AdVkvsvrTT830: TLLYVLFEVKVS. VRILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:12)
CI (Ecoli) :
accctgctgtatgtgctgtttgaagtgaaagtgagcgtgcgcattctgatgcagtata
aaagcgaacagcaaatttattggcatt (SEQ ID N0:63) C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaaggtgagcgtgagaatcctgatgcagtaca
aaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:64)
TT830pmglpDTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIPMG.LPQSIALSSbMVAQ (SEQ ID N0:13)
CI (ECOli):
attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattccgatgggcctgc
cagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag (SEQ ID N0:65) C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccccatgggcctgc
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag (SEQ ID N0:66) TT830kvsvxDTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIKVS.VRQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:14)
CI (Ecoli):
attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattaaagtgagcgtgc
cagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag (SEQ ID N0:67) C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatcaaggtgagcgtga
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag (SEQ ID NO:68)
В вариантах осуществления пептидный линкер включает сайт расщепления лизосомальной протеа-зой (например, сайт расщепления катепсином). В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептидный линкер, включает последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную как SEQ ID NO: 69 или 70, ее вырожденную цепь или комплементарную цепь.
ccgatgggcctacca (SEQ ID N0:69) aaggtctcagtgagaac (SEQ ID UO:70)
В вариантах осуществления А, В и/или С, которые кодируются нуклеиновой кислотой по данному изобретению, по меньшей мере на 70% идентичны природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR. А, В и/или С, кодируемые нуклеиновой кислотой, в определенных вариантах осуществления предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% или все еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR. Предпочтительно такие нуклеиновые кислоты кодируют пептид, который связывается с молекулой МНС класса II.
В вариантах осуществления нуклеиновая кислота, следовательно, включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 60% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует природный пептид, связывающийся с HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% или все еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична нуклеиновой кислоте, которая кодирует природный пептид, связывающийся с HLA-DP, HLA-DQ или HLA-DR.
Процент идентичности можно рассчитать с помощью различных общедоступных инструментов программного обеспечения, разрабатываемых NCBI (Bethesda, Мэриленд), которые можно получить че
рез Интернет (ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/).
Иллюстративные инструменты включают систему BLAST, доступную на http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov. Попарное выравнивание и выравнивание ClustalW (установка матрицы BLOSUM30), а также анализ гидрофобности Кайта-Дулиттла можно получить с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей MacVector (Oxford Molecular Group). Комплементарные цепи Уотсона-Крика (включая комплементарные цепи полной длины) вышеупомянутых нуклеиновых кислот также охватываются данным изобретением.
Также в данном документе приведены нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с любой из нуклеиновых кислот, приведенных в данном документе. Для идентификации родственных последовательностей нуклеиновых кислот с выбранным процентом идентичности можно использовать стандартные процедуры гибридизации нуклеиновых кислот. Используемое в данном документе выражение "жесткие условия" относится к параметрам, которые известны в области техники. Такие параметры включают соль, температуру, длину зонда и т.д. Количество полученных в результате несовпадений оснований при гибридизации может находиться в диапазоне от около 0% ("высокая жесткость") до приблизительно 30% ("низкая жесткость"). Одним примером условий с высокой жесткостью является гибридизация при 65°С в буфере для гибридизации (3.5Х SSC, 0,02% фиколл, 0,02% поливинилпирролидон, 0,02% бычий сывороточный альбумин, 2,5 мМ NaH2PO4 (рН 7), 0,5% SDS, 2 мМ EDTA). SSC представляет собой 0,15 М хлорид натрия/0,015 М цитрат натрия, рН 7; SDS представляет собой додецилсульфат натрия; и EDTA представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту. После гибридизации мембрану, на которую перенесли, например, нуклеиновую кислоту промывают в 2Х SSC при комнатной температуре и затем в 0,1-0,5Х SSC/0,1X SDS при температурах до 68°С.
В вариантах осуществления нуклеиновую кислоту можно функционально соединить с промотором. Экспрессию в прокариотических хозяевах можно осуществить с помощью прокариотических регулятор-ных участков. Экспрессию в эукариотических хозяевах можно осуществить с помощью эукариотических регуляторных участков. Такие участки в основном будут включать промоторный участок, достаточный для непосредственной инициации синтеза РНК. В вариантах осуществления нуклеиновая кислота может дополнительно включать последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, в зависимости от природы хозяина. Сигналы, регулирующие транскрипцию и трансляцию, могут быть получены или они являются производными от вирусных источников, таких как ретровирус, аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вакуолизирующий обезьяний вирус или подобное.
В вариантах осуществления нуклеиновую кислоту вводят в вектор, способный интегрировать необходимые последовательности в хромосому клетки-хозяина. Для оптимального синтеза иРНК также могут быть необходимы дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.
В вариантах осуществления нуклеиновую кислоту встраивают в плазмидный или вирусный вектор, способный к автономной репликации в хозяине-реципиенте. Для этой цели можно задействовать любой из ряда разнообразных векторов, таких как прокариотические и эукариотические векторы. Эукариотиче-скими векторами могут быть вирусные векторы. Например, и не с целью ограничения, вектором может быть поксвирусный вектор, вектор на основе вируса герпеса, аденовирусный вектор или любой из ряда ретровирусных векторов. Вирусные векторы включают либо ДНК-, либо РНК-вирусы с целью инициации экспрессии ДНК-вставки или РНК-вставки.
Вектор или другой конструкт можно ввести в соответствующую клетку-хозяина посредством любого из ряда подходящих способов, т.е. трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, осаждением фосфата кальция, прямой микроинъекцией и т.п. Дополнительно ДНК или РНК можно напрямую ввести инъекцией в клетки или можно заставить пройти через клеточные мембраны после прикрепления к микрочастицам или наночастицам, таким как синтетические на-нотранспортеры, приведенные в данном документе.
D. Применения пептида по данному изобретению: композиции и способы
Следует понимать, что композиции согласно данному изобретению могут быть изготовлены любым подходящим способом, и данное изобретение никоим образом не ограничивается композициями, которые могут быть получены с использованием способов, описанных в данном документе. Выбор подходящего способа может потребовать внимания к свойствам конкретных присоединяемых фрагментов.
Композиции по данному изобретению могут вводиться с помощью различных способов их введения, в том числе, но не ограничиваясь, парентерально (например, подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрикожно); перорально; трансназально, трансмукозально, ректально; офтальмологически или трансдермально.
Композиции и способы, описываемые в данном документе, можно применять для индукции, усиления, супрессии, вызова или повторного вызова иммунного ответа. Композиции и способы, описываемые в данном документе, можно применять при профилактике и/или лечении состояний, таких как разновидности рака, инфекционные заболевания, метаболические расстройства, дегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, иммунологические заболевания или других рас
стройств и/или состояний. Композиции и способы, описываемые в данном документе, также можно применять для лечения зависимости, например зависимости от никотина или наркотического средства. Композиции и способы, описываемые в данном документе, можно также применять для профилактики и/или лечения состояния, возникшего в результате воздействия токсина, вредного вещества, токсина из окружающей среды или другого опасного вещества. Композиции и способы, описанные в данном документе, можно также использовать для индукции или усиления пролиферации Т-клеток или продукции цитоки-нов, например, если приведенные в данном документе композиции вводят в контакт с Т-клетками in vivo или in vitro.
В варианте осуществления композиции по данному изобретению можно вводить вместе с конъю-гатными или неконъюгатными вакцинами. В вариантах осуществления композиции по данному изобретению могут быть ковалентно или нековалентно связаны с пептидом или белком транспортера или с одним или несколькими антигенами. Пригодные транспортеры включают белки-транспортеры, которые, как известно, пригодны в конъюгатных вакцинах, включая, но без ограничений, столбнячный токсин (ТТ), дифтерийный анатоксин (DT), нетоксичный мутант дифтерийного токсина, CRM197, комплекс белков наружной мембраны из N. meningitidis группы В и гемоцианин лимфы улитки (KLH). Другие транспортеры могут включать синтетические нанотранспортеры, описанные в других местах в данном документе, и другие транспортеры, которые могут быть общеизвестны.
Конъюгацию можно осуществить с помощью традиционных методик ковалентной или нековалент-ной конъюгации. Подходящие методики для использования композиций по данному изобретению в таких конъюгированных или традиционных вакцинах включают, но без ограничений, в целом описанные в MD Lairmore et al., "Human T-lymphotropic virus type 1 peptides in chimeric and multivalent constructs with promiscuous T-cell epitopes enhance immunogenicity and overcome genetic restriction. " J. Virol. Oct; 69(10): 6077-89 (1995); CW Rittershause et al., "Vaccine-induced antibodies inhibit CETP activity in vivo and reduce aortic lesions in a rabbit model of atherosclerosis". Arterioscler Thromb Vase Biol. Sep; 20 (9): 2106-12 (2000); MV Chengalvala et al., "Enhanced immunogenicity of hepatitis В surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid." Vaccine. Mar 5; 17 (9-10): 1035-41 (1999). NK Dakappagari et al., "A chimeric multi-human epidermal growth factor receptor-2 В cell epitope peptide vaccine mediates superior antitumor responses". J. Immunol. Apr 15; 170(8): 4242-53 (2003); J.T. Garrett et al. "Novel engineered trastuzumab con-formational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu". J. Immunol. Jun
1; 178(11): 7120-31 (2007).
В других вариантах осуществления композиции по данному изобретению можно объединить с антигеном или традиционной вакциной в наполнителе с образованием инъецируемой смеси. Смеси могут быть получены с использованием традиционных фармацевтических методик производства и приготовления смесей для получения пригодных лекарственных форм. Методики, пригодные для применения в практическом осуществлении данного изобретения, можно найти в ряде источников, включая, но без ограничений, M.F. Powell et al., Vaccine Design, 1995, Springer-Verlag publ.; или L.C. Paoletti et al. eds., Vaccines: from Concept to Clinic. A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccines for Human Use 1999 CRC Press publ.
В вариантах осуществления композиции по данному изобретению можно применять в комбинации с синтетическими нанотранспортерами. Ряд разнообразных синтетических нанотранспортеров может использоваться согласно данному изобретению. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры являются сферами или сфероидами. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры являются плоскими или пластинчатыми. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры являются кубами или кубовидными. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры являются овалами или эллипсами. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры являются цилиндрами, конусами или пирамидами.
Часто желательно применение популяции синтетических нанотранспортеров, которая является относительно однородной с точки зрения размера, формы и/или состава так, чтобы каждый синтетический нанотранспортер имел сходные свойства. Например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% синтетических нанотранспортеров может иметь минимальный размер или максимальный размер, который попадает в пределы 5, 10 или 20% от среднего диаметра или среднего размера синтетических нанотранспортеров. В некоторых вариантах осуществления популяция синтетических нанотранспортеров может быть гетерогенной по отношению к размеру, форме и/или составу.
Синтетические нанотранспортеры могут быть сплошными или полыми и могут содержать один или несколько слоев. В некоторых вариантах осуществления каждый слой имеет уникальный состав и уникальные свойства по отношению к другому слою(ям). В качестве неисключающего примера синтетические нанотранспортеры могут иметь структуру ядро/оболочка, где ядро является одним слоем (например, полимерное ядро) и оболочка является вторым слоем (например, липидный бислой или монослой). Синтетические нанотранспортеры могут содержать несколько разных слоев.
В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут факультативно содержать один или несколько липидов. В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранс-портер может включать липосому. В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранспор
тер может включать липидный бислой. В некоторых вариантах осуществления синтетический на-нотранспортер может включать липидный монослой. В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранспортер может включать мицеллу. В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранспортер может включать ядро, включающее полимерную матрицу, окруженную липидным слоем (например, липидный бислой, липидный монослой и т.д.). В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранспортер может содержать неполимерное ядро (например, металлическая частица, квантовая точка, керамическая частица, костная частица, вирусная частица, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д.), окруженное липидным слоем (например, липидный бислой, липидный монослой
и т.д.).
В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут включать один или несколько полимеров. В некоторых вариантах осуществления такой полимер может быть окружен покрывающим слоем (например, липосома, липидный монослой, мицелла и т.д.). В некоторых вариантах осуществления различные элементы синтетических нанотранспортеров могут быть сшиты с полимером.
В некоторых вариантах осуществления иммуноактивная поверхность, нацеливающий фрагмент, олигонуклеотид и/или другой элемент могут быть ковалентно соединены с полимерной матрицей. В некоторых вариантах осуществления ковалентное соединение опосредовано линкером. В некоторых вариантах осуществления иммуноактивная поверхность, нацеливающий фрагмент, олигонуклеотид и/или другой элемент могут быть нековалентно соединены с полимерной матрицей. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуноактивная поверхность, нацеливающий фрагмент, олигонуклеотид и/или другой элемент могут быть инкапсулированы внутри, окружены и/или диспергированы по полимерной матрице. Альтернативно или дополнительно, иммуноактивная поверхность, нацеливающий фрагмент, олигонуклеотид и/или другой элемент могут быть соединены с полимерной матрицей гидрофобными взаимодействиями, взаимодействиями зарядов, ван-дер-Ваальсовыми силами и т.д.
Множество разнообразных полимеров и способов образования полимерных матриц из них являются общеизвестными. В основном полимерная матрица содержит один или несколько полимеров. Полимеры могут быть природными или неприродными (синтетическими) полимерами. Полимеры могут быть гомополимерами или сополимерами, содержащими два или более мономеров. С точки зрения последовательности сополимеры могут быть статистическими, блок-сополимерами или состоять из комбинации статистических и блоковых последовательностей. Как правило, полимеры в соответствии с настоящим изобретением являются органическими полимерами.
Примеры полимеров, подходящих для применения в данном изобретении, включают, но не ограничиваясь, полиэтилены, поликарбонаты (например, поли(1,3-диоксан-2он)), полиангидриды (например, поли(себациновый ангидрид)), полипропилфумераты, полиамиды (например, поликапролактам), поли-ацетали, простые полиэфиры, сложные полиэфиры (например, полилактид, полигликолид, сополимер лактида и гликолида, поликапролактон, полигидроксикислота (например, полиф-гидроксиалканоат))), сложные поли(ортоэфиры), полицианоакрилаты, поливиниловые спирты, полиуретаны, полифосфазены, полиакрилаты, полиметакрилаты, полимочевины, полистиролы и полиамины, полилизин, сополимеры полилизина с PEG и поли(этиленимин), сополимеры поли(этиленимин)а и PEG.
В некоторых вариантах осуществления полимеры в соответствии с данным изобретением включают полимеры, которые были одобрены к применению для людей Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), 21 C.F.R. § 177.2600, включая, но не ограничиваясь, сложные полиэфиры (например, полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот) полика-пролактон, поливалеролактон, поли(1,3-диоксан-2он)); полиангидриды (например, поли(себациновый ангидрид)); простые полиэфиры (например, полиэтиленгликоль); полиуретаны; полиметакрилаты; поли-акрилаты и полицианоакрилаты.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть гидрофильными. Например, полимеры могут содержать анионные группы (например, фосфатную группу, сульфатную группу, карбоксилат-ную группу); катионные группы (например, группу четвертичного амина) или полярные группы (например, гидроксильную группу, тиоловую группу, аминогруппу). В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранспортер, содержащий гидрофильную полимерную матрицу, образует гидрофильное окружение внутри синтетического нанотранспортера. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть гидрофобными. В некоторых вариантах осуществления синтетический нанотранспортер, содержащий гидрофобную полимерную матрицу, образует гидрофобное окружение внутри синтетического нанотранспортера. Выбор гидрофильности или гидрофобности полимера может оказать влияние на природу материалов, которые включены (например, пришиты) в синтетический нанотранспортер.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы одним или несколькими фрагментами и/или функциональными группами. Различные фрагменты или функциональные группы могут быть использованы в соответствии с данным изобретением. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы с помощью полиэтиленгликоля (PEG), углеводов и/или ациклических полиацеталей, производных полисахаридов (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). Определенные варианты осуществления можно осуществить с помощью общих идей патента США № 5543158, Gref и соавт. или публикации заявки WO 2009/051837, Von Andrian и соавт.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы липидными или жирнокислотными группами. В некоторых вариантах осуществления жирнокислотная группа может быть одной или несколькими из масляной, капроновой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристи-новой, пальмитиновой, стеариновой, арахидиновой, бегеновой или лигноцериновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления жирнокислотная группа может быть одной или несколькими из пальмито-леиновой, олеиновой, вакценовой, линолевой, а-линолевой, у-линолевой, арахидоновой, гадолеиновой, арахидоновой, эйкозапентаеновой, докозагексаеновой или эруковой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть сложными полиэфирами, включающими сополимеры из звеньев молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты и сополимеры лактида и гликолида, собирательно называемые в данном документе "PLGA"; и гомополимерами, включающими звенья гликолевой кислоты, упомянутые в данном документе как "PGA", и звенья молочной кислоты, такие как поли^-молочная кислота, поли-D-молочная кислота, поли^^-молочная кислота, поли^-лактид, поли-D-лактид и поли-D,L-лактид, собирательно называемые в данном документе "PLA". В некоторых вариантах осуществления образцы сложных полиэфиров включают, например, полигидроксикислоты; сополимеры PEG и сополимеры лактида и гликолида (например, сополимеры PLA-PEG, сополимеры PGA-PEG, сополимеры PLGA-PEG и их производные). В некоторых вариантах осуществления сложные полиэфиры включают, например, по-ли(капролактон), сополимеры поли(капролактона) и PEG, сополимер L-лактида и L-лизина, по-ли(сложный эфир серина), поли(сложный эфир 4-гидрокси^-пролина), поли[а-(4-аминобутил)^-гликолевая кислота] и их производные.
В некоторых вариантах осуществления полимер может быть PLGA. PLGA является биосовместимым и биоразлагаемым сополимером молочной кислоты и гликолевой кислоты, и различные формы PLGA характеризуются соотношением молочная кислота:гликолевая кислота. Молочная кислота может быть L-молочной кислотой, D-молочной кислотой или D,L-молочной кислотой. Скорость разложения PLGA можно регулировать путем изменения соотношения молочная кислота:гликолевая кислота. В некоторых вариантах осуществления PLGA, который будет использоваться в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется соотношением молочная кислота:гликолевая кислота приблизительно 85:15, приблизительно 75:25, приблизительно 60:40, приблизительно 50:50, приблизительно 40:60, приблизительно 25:75 или приблизительно 15:85.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть одним или несколькими акриловыми полимерами. В определенных вариантах осуществления акриловые полимеры включают, например, сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, сополимеры метилметакрилата, этоксиэтилме-такрилаты, цианоэтилметакрилат, сополимер аминоалкилметакрилата, поли(акриловую кислоту), по-ли(метакриловую кислоту), сополимер алкиламида метакриловой кислоты, поли(метилметакрилат), по-ли(ангидрид метакриловой кислоты), метилметакрилат, полиметакрилат, сополимер поли(метил-метакрилата), полиакриламид, сополимер аминоалкилметакрилата, сополимеры глицидилметакрилата, полицианоакрилаты и комбинации, содержащие один или несколько из вышеприведенных полимеров. Акриловый полимер может включать полностью полимеризованные сополимеры сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты с низким содержанием групп четвертичного аммония.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть катионными полимерами. В целом, катионные полимеры могут конденсировать и/или защищать отрицательно заряженные цепи нуклеиновых кислот (например, ДНК или ее производных). Аминосодержащие полимеры, такие как поли(лизин) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; и Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), по-ли(этиленимин) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297) и по-ли(амидоамин)овые дендримеры (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; и Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) являются положительно заряженными при физиологическом рН, образуют ионные пары с нуклеиновыми кислотами и опосредуют трансфекцию в ряде клеточных линий. В вариантах осуществления синтетические на-нотранспортеры по данному изобретению могут не включать (или могут исключать) катионные полимеры.
В некоторых вариантах осуществления полимерами могут быть разлагаемые сложные полиэфиры с катионными боковыми цепями (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633 и Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Примеры данных сложных полиэфиров включают сополимер L-латида и L-лизина (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010), поли(сложный эфир серина) (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), поли(сложный эфир 4-гидрокси^-пролина) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; и Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633) и поли(сложный эфир 4-гидрокси^-пролина) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; и Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc,
121:5633).
Свойства этих и других полимеров и способы их получения хорошо известны в данном уровне техники (см., например, патенты США №№ 6123727, 5804178, 5770417, 5736372, 5716404, 6095148,
5837752, 5902599, 5696175, 5514378, 5512600, 5399665, 5019379, 5010167, 4806621, 4638045 и 4946929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; и Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). В целом, ряд способов синтеза определенных подходящих полимеров описаны в Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; и в патентах США №№ 6506577, 6632922,6686446 и 6818732.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть линейными или разветвленными полимерами. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть дендримерами. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть в основном сшиты друг с другом. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть в основном свободны от сшивок. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, не подвергаясь этапу сшивания. Далее следует понимать, что синтетические нанотранспортеры по данному изобретению могут включать в себя блок-сополимеры, привитые сополимеры, сочетания, смеси и/или ад-дукты любого из вышеуказанных и других полимеров. Специалистам в данной области техники будет понятно, что полимеры, перечисленные в данном документе, представляют собой примерный, не являющийся исчерпывающим, список полимеров, которые могут быть применены в соответствии с данным изобретением.
В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут не содержать полимерный компонент. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут содержать металлические частицы, квантовые точки, керамические частицы и т.д. В некоторых вариантах осуществления неполимерные синтетические нанотранспортеры являются агрегатами неполимерных компонентов, таких как агрегат атомов металла (например, атомов золота).
В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут факультативно содержать один или несколько амфифильных элементов. В некоторых вариантах осуществления амфи-фильный элемент может способствовать получению синтетических нанотранспортеров с повышенной стабильностью, улучшенной однородностью или повышенной вязкостью. В некоторых вариантах осуществления амфифильные элементы могут быть соединены с внутренней поверхностью липидной мембраны (например, липидного бислоя, липидного монослоя и т.д.). Многие амфифильные элементы, известные в данном уровне техники, подходят для применения при создании синтетических нанотранспортеров в соответствии с данным изобретением. Такие амфифильные элементы включают, но не ограничиваясь, фосфоглицериды; фосфатидилхолины; дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC); диолеилфосфатидилэта-ноламин (DOPE); диолеилоксипропилтриэтиламмоний (DOTMA); диолеилфосфатидилхолин, холестерин, эфиры холестерина; диацилглицерол; диацилглицеролсукцинат; дифосфатидилглицерол (DPPG); гександеканол, жирные спирты, такие как полиэтиленгликоль (PEG); полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, поверхностно-активные жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота или олеиновая кислота, жирные кислоты, моноглицериды жирных кислот, диглицериды жирных кислот, амиды жирных кислот; сорбитантриолеат (SPAN(r) 85) гликохолат; сорбитанмонолаурат (SPAN(r) 20); полисорбат 20 (Tween(r) 20); полисорбат 60 (Tween(r) 60); полисорбат 65 (Tween(r) 65) ; полисорбат 80 (Tween(r) 80); поли-сорбат 85 (Tween(r) 85); полиоксиэтиленмоностеарат; суфрактин; полоксомер; сорбитановый эфир жирной кислоты, такой как сорбитантриолеат, лецитин; лизолецитин; фосфатидилсерин; фосфатидилинози-тол; сфингомиелин; фосфатидилэтаноламин (цефалин); кардиолипин; фосфатидная кислота; церебрози-ды; дицетилфосфат; дипальмитоилфосфатидилглицерол; стеариламин, додециламин; гексадециламин, ацетилпальмитат; глицеринрицинолеат; гексадецилстеарат; изопропилмиристат; тилоксапол; по-ли(этиленгликоль) 5000-фосфатидилэтаноламин; поли(этиленгликоль) 400-моностеарат; фосфолипиды, синтетические и/или природные детергенты, имеющие высокие поверхностно-активные свойства; дезок-сихолаты; циклодекстрины, хаотропные соли; средства для образования пар ионов и их комбинации. Компонент амфифильного элемента может быть смесью различных амфифильных элементов. Специалистам в данном уровне техники будет понятно, что это - примерный, не являющийся исчерпывающим, перечень веществ с поверхностно-активным действием. Любой амфифильный элемент может быть использован при создании синтетических нанотранспортеров, которые будут применены в соответствии с данным изобретением.
В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры могут факультативно включать один или несколько углеводов. Углеводы могут быть природными или синтетическими. Углевод может быть производным природного углевода. В определенных вариантах осуществления углевод включает моносахарид или дисахарид, включая, но не ограничиваясь, глюкозу, фруктозу, галактозу, ри-бозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, маннозу, ксилозу, арабинозу, глюкуроновую кислоту, галактуроновую кислоту, маннуроновую кислоту, глюкозамин, галактозамин и нейраминовую кислоту. В определенных вариантах осуществления углевод является полисахаридом, включая, но не ограничиваясь, пуллулан, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипролилметилцеллю
лозу (НРМС), гидроксицеллюлозу (НС), метилцеллюлозу (МС), декстран, циклодекстран, гликоген, гид-роксиэтилкрахмал, каррагинан, гликон, амилозу, хитозан, N,O-карбоксиметилхитозан, альгин и альгино-вую кислоту, крахмал, хитин, инулин, конджак, глюкоманнан, пустулан, гепарин, гиалуроновую кислоту, курдлан и ксантан. В вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры по данному изобретению не включают (или конкретно исключают) углеводы, такие как полисахарид. В определенных вариантах осуществления углевод может включать производное углевода, такое как сахарный спирт, включая, но без ограничения, манит, сорбит, ксилит, эритрит, мальтит и лактит.
Композиции согласно данному изобретению могут включать синтетические нанотранспортеры или вакцинные конструкты по данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем. Композиции могут быть изготовлены с использованием традиционных методик фармацевтического производства и смешивания для получения пригодных лекарственных форм. В варианте осуществления синтетические нанотранспортеры по данному изобретению являются суспендированными в стерильном солевом растворе для инъекций вместе с консервантом. В вариантах осуществления типичные композиции по данному изобретению могут включать наполнители, которые могут включать неорганические или органические буферы (например, натриевые или калиевые соли фосфата, карбоната, ацетата или цитрата) и средства регулирования рН (например, соляная кислота, гидроксид натрия или калия, соли цитрата или ацетата, аминокислоты и их соли), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол), поверхностно-активные вещества (например, полисорбат 20, полисорбат 80, полиок-сиэтилен 9-10, нонилфенол, дезоксихолат натрия), стабилизаторы раствора и/или крио/лио-стабилизаторы (например, сахароза, лактоза, маннит, трегалоза), средства осмотического регулирования (например, соли или сахара), антибактериальные средства, (например, бензойная кислота, фенол, гента-мицин), противовспенивающие средства (например, полидиметилсилозон), консерванты (например, ти-мерозал, 2-феноксиэтанол, EDTA), полимерные стабилизаторы и средства регулирования вязкости (например, поливинилпирролидон, полоксамер 488, карбоксиметилцеллюлоза) и вспомогательные растворители (например, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол).
Пептиды, связывающиеся с МНС II, по данному изобретению могут быть инкапсулированы в синтетические нанотранспортеры с помощью ряда способов, включая, но без ограничений, С. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:821 (2006). Можно применять другие способы, пригодные для инкапсулирования материалов, таких как пептиды, в синтетические нанотранспортеры, включая без ограничения способы, раскрытые в патенте Соединенных Штатов № 6632671, Unger, 14 октября 2003 г. В другом варианте осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, могут быть адсорбированы на поверхности синтетических нанотранспортеров, как в целом описано у М. Singh et al., "Anionic microparticles are a potent delivery system for recombinant antigens from Neisseria meningitidis serotype B". J. Pharm. Sci. Feb; 93(2): 273-82 (2004).
В вариантах осуществления композиции по данному изобретению могут включать антигены и/или адъюванты. В вариантах осуществления вакцины по данному изобретению могут включать композиции по данному изобретению вместе с антигенами и/или адъювантами. В других местах в данном документе отмечены различные типы антигенов и/или адъювантов, пригодных для осуществления на практике данного изобретения. Как упоминалось в других местах в данном документе, пептиды, связывающиеся с МНС II, композиций по данному изобретению могут быть ковалентно или нековалентно пришиты к антигенам и/или адъювантам, или они могут быть смешаны с антигенами и/или адъювантами. Общие методики пришивания и смешивания материалов упомянуты в других местах в данном документе; такие методики можно приспособить для пришивания или смешивания пептидов, связывающихся с МНС II, композиций по данному изобретению к или с антигенами и/или адъювантами. Для подробных описаний возможных способов ковалентной конъюгации см. Hermanson G.T. "Bioconjugate Techniques", 2nd Edition Published by Academic Press, Inc., 2008. Кроме ковалентного присоединения сшивание можно осуществить с помощью адсорбции на предварительно образованный транспортер, такой как синтетический на-нотранспортер, или с помощью инкапсуляции во время образования транспортеров, таких как синтетический нанотранспортер. В предпочтительном варианте осуществления пептиды, связывающиеся с МНС II, композиций по данному изобретению пришиты к синтетическим нанотранспортерам, которые также пришиты к антигенам и/или адъювантам.
Синтетические нанотранспортеры могут быть получены с помощью ряда разнообразных способов, известных в данной области техники. Например, синтетические нанотранспортеры могут быть образованы способами, такими как нанопреципитация, потоковая фокусировка с использованием жидкостных каналов, распылительная сушка, испарение растворителя однокомпонентных и двухкомпонентных эмульсий, экстракция растворителем, разделение фаз, размалывание, микроэмульсионные процедуры, микросборка, наносборка, жертвенные слои, простая и комплексная коацервация, и другими способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Альтернативно или дополнительно, были описаны синтезы в водных и органических растворителях для монодисперсных полупроводниковых,
проводящих, магнитных, органических и других наноматериалов (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; и Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). В литературе описаны дополнительные способы (см., например Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; и Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755, а также патенты США №№ 5578325 и 6007845).
При необходимости можно пришить различные материалы посредством инкапсуляции в синтетические нанотранспортеры с помощью ряда способов, включая, но без ограничений, С. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); С Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8- 21 (2006). Можно применять другие способы, пригодные для инкапсулирования материалов, таких как оли-гонуклеотиды, в синтетические нанотранспортеры, включая без ограничения способы, раскрытые в патенте Соединенных Штатов № 6632671, Unger, 14 октября 2003 г.
В определенных вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры получают с помощью процесса нанопреципитации или распылительной сушки. Условия, используемые при получении синтетических нанотранспортеров, могут быть изменены для получения частиц нужного размера или свойств (например, гидрофобность, гидрофильность, внешняя морфология, "липкость", форма и т.д.). Способ получения синтетических нанотранспортеров и используемые условия (например, растворитель, температура, концентрация, скорость потока воздуха и т.д.) могут зависеть от материалов, которые будут связаны с синтетическими нанотранспортерами, и/или композиции полимерной матрицы.
Если частицы, получаемые любым из указанных выше способов, имеют диапазон размеров за пределами необходимого диапазона, то можно отсортировать частицы по размеру с помощью, например, сита.
Следует понимать, что композиции согласно данному изобретению могут быть изготовлены любым подходящим способом, и данное изобретение никоим образом не ограничивается композициями, которые могут быть произведены с использованием способов, описанных в данном документе. Выбор подходящего способа может потребовать внимания к свойствам конкретных присоединяемых фрагментов.
В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры по данному изобретению получают в стерильных условиях или стерилизуют на заключительном этапе. Это может гарантировать, что полученная композиция стерильна и неинфекционна, тем самым, повышая безопасность по сравнению с нестерильными композициями. Это обеспечивает важные меры безопасности, особенно когда субъекты, получающие синтетические нанотранспортеры по данному изобретению, имеют иммунные дефекты, страдают от инфекции и/или восприимчивы к инфекции. В некоторых вариантах осуществления синтетические нанотранспортеры по данному изобретению могут быть лиофилизированными и храниться в суспензии или как лиофилизированный порошок в зависимости от подхода к приготовлению состава в течение длительного периода без потери активности.
Композиции по данному изобретению могут вводиться с помощью различных способов введения, в том числе, но не ограничиваясь, парентерально (например, подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрикожно); перорально; трансназально, трансмукозально, ректально; офтальмологически или транс-дермально.
Е. Примеры
Данное изобретение будет легко понято на основе следующих примеров, которые включены лишь с целью иллюстрации определенных аспектов и вариантов осуществления данного изобретения, а не в качестве ограничений.
Специалисты в данной области техники признают, что различные адаптации и модификации вышеописанных вариантов осуществления можно сконфигурировать без отступления от объема и сущности данного изобретения. Другие подходящие методики и способы, известные в уровне техники, могут применяться специалистом в данной области во многих конкретных способах и в свете описания данного изобретения, описанного в данном документе.
Следовательно, нужно понимать, что данное изобретение можно осуществлять на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Предполагается, что вышеприведенное описание является иллюстративным, а не ограничивающим. После изучения вышеприведенного описания специалистам в данной области будут очевидны многие другие варианты осуществления. Объем данного изобретения, таким образом, следует определять на основе прилагаемой формулы изобретения наряду с полным объемом эквивалентов, на которые предоставляет право данная формула изобретения.
Пример 1. Создание универсальных пептидов памяти.
С целью создания химерных пептидов осуществили прогноз эпитопа класса II с помощью инструментов для прогноза эпитопа Т-клеток Immune Epitope Database (IEDB) (http://www.immuneepitope.org/). Для каждого пептида инструмент для прогноза дает процентильный ранг для каждого из трех способов (ARB, SMMalign и Sturniolo). Ранжирование осуществили путем сравнения балла пептида с баллами
пяти миллионов случайных 15 мономерных звеньев полимера из базы данных SWISSPROT. Медиану процентильных рангов для трех способов затем использовали для создания ранга для консенсусного способа. Пептиды, подлежащие оценке с помощью консенсусного способа, можно создать с помощью последовательностей, которые являются производными или получены из различных источников, включая инфекционные организмы, способные инфицировать людей и создавать CD4+ клетки памяти человека, специфичные для такого инфекционного организма, после начала инфекции. Примеры таких инфекционных организмов упомянуты в других местах в данном документе.
В конкретном варианте осуществления отдельные эпитопы белка или пептида выбирали из столбнячного токсина, дифтерийного токсина или аденовируса и анализировали с целью идентификации прогнозируемых эпитопов HLA-DR и HLA-DP. Для анализа всего белка спрогнозированные эпитопы HLA-DR выбирали на основе консенсусного ранжирования (спрогнозированные связующие с высоким сродством) и широкого охвата среди аллелей HLA-DR. Кроме того, выбирали эпитопы, которые представляли собой спрогнозированные связующие с высоким сродством к HLA-DP0401 и DP0402. Эти 2 аллеля DP выбрали по причине того, что они обнаруживаются с высоким процентом в популяции в Северной Америке (примерно 75%). На основании результатов от отдельных эпитопов в определенных вариантах осуществления создали химерные пептиды, которые давали бы прогнозируемый наиболее широкий охват и связывание с высоким сродством. См. фиг. 15-16. Как показано на фиг. 5, можно создать композиции, имеющие форму А-х-В, которые обладают более широким прогнозируемым охватом и связыванием с более высоким сродством, чем композиции, имеющие только А или В, но не оба сразу.
В некоторых случаях вставили сайты расщепления катепсином в месте соединения пептидов. Синтезировали химерные пептиды (GenScript) и ресуспендировали в воде для применения.
Несмотря на то, что вышеупомянутый вариант осуществления применяли для получения оптимизированных композиций, которые включали пептиды, связывающиеся с HLA-DR и HLA-DP, те же методики можно применять для получения оптимизированных композиций, которые включают пептиды, связывающиеся с HLA-DQ.
Пример 2. Оценка сердцевинной аминокислотной последовательности.
Эпитопы, специфичные как к HLA-DP, так и к HLA-DR, оценили с помощью анализа с последовательным укорочением на сердцевинные связывающие эпитопы. У некоторых эпитопов были обнаружены общие сердцевинные аминокислотные последовательности, избирательные к конкретному белку HLA класса II. Примером этого являются общие сердцевинные связывающие структуры, которые, как было обнаружено, составляют надтип связывающей специфичности пептида с HLA-DP4 (3). Вероятно, что эти сердцевинные аминокислоты поддерживают структурную конфигурацию, которая делает возможным связывание с высоким сродством. В результате можно заместить аминокислоты несердцевинной области с похожими химическими свойствами без ингибирования способности к связыванию с классом II (4). Это можно экспериментально показать с помощью анализа замещений и затем программ для прогноза связывания с эпитопом. С целью осуществления анализа были введены замещения отдельных аминокислот и определено связывание с прогнозируемым сродством с классом II с помощью инструмента для прогноза связывания с Т-клетками IEDB (см. фиг. 20).
В данном случае показаны два примера, где в части А замещения до 70% в аденовирусном эпитопе не нарушали сродство связывания с DP4. Часть В иллюстрировала замещения до 70% в эпитопе столбнячного токсина, которые не ингибировали его прогнозируемое связывание с HLADR0101 или HLADR0404, которые являются типичными представителями аллелей DR. Соответственно, создание химерного пептида с высоким сродством с широким охватом HLA посредством модификации аминокислотных последовательностей не нарушало способность пептида связываться с МНС II. Кроме того, улучшенное прогнозируемое сродство пептида можно получить путем замещения аминокислот, как продемонстрировано в данном примере.
Несмотря на то, что вышеупомянутый вариант осуществления применяли для представления в качестве примера оптимизированных композиций, которые включали пептиды, связывающиеся с HLA-DR или HLA-DP, те же техники можно применять для получения оптимизированных композиций, которые включают пептиды, связывающиеся с HLA-DQ.
Ссылки:
1. Truncation analysis of several DR binding epitopes. О'Sullivan D, Sidney J, Del Guercio MF, Colon SM, Sette A. J Immunol. 1991 Feb 15; 146 (4)-.1240-6 .
2. Adenovirus hexon T-cell epitope is recognized by most adults and is restricted by HLA DP4, the most common class II allele. Tang J, Olive M, Champagne K, Flomenberg N, Eisenlohr L, Hsu S, Flomenberg P. Gene Ther. 2004 Sep;11(18):1408-15.
3. HLA-DP4, the most frequent HLA II molecule, defines a new supertype of peptide-binding specificity.Castelli FA, Buhot C, Sanson A, Zarour H, Pouvelle-Moratille S, Nonn C, Gahery-Segard Hf Guillet JG, Menez A, Georges B, Maillere B. J Immunol. 2002 Dec 15;169(12):6928-34.
4. Prediction of CD4(+) T cell epitopes restricted to HLA-DP4 molecules. Busson M, Castelli FA, Wang XF, Cohen WM, Charron D, Menez A, Maillere B. J Immunol Methods. 2006 Dec 20;317(1-2):144-51
Пример 3. Оценка пептида.
Композиции по данному изобретению, включающие пептиды с химерными эпитопами, оценили на (1) силу вторичного иммунного ответа; (2) частоту вторичного иммунного ответа по сравнению со случайной выборочной совокупностью из популяции (N=20); и (3) частоту антиген-специфичных Т-клеток памяти у особей (N=20).
Силу отдельных эпитопов и химерных эпитопов оценивали посредством стимуляции in vitro PBMC человека пептидами в течение 24 ч и затем анализа клеток проточной цитометрией. Активированные центральные CD4 Т--клетки памяти имеют фенотип CD4+ CD45RAlow CD62L+ IFN-y+. Для оценки частоты в популяции специфических вторичных ответов на выбранные эпитопы оценивали 20 доноров периферической крови на индукцию экспрессии цитокинов.
Кратко: цельную кровь получили от Research Blood Components (Кембридж). Кровь разбавили 1:1 фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и затем 35 мл наслоили сверху 12 мл среды фикол-пак премиум (GE Healthcare) в 50 мл пробирке. Пробирки крутили при 1400 об/мин в течение 30 мин и РВМС переходной фазы собрали, разбавили в PBS с 10% эмбриональной телячей сыворотки (FCS) и крутили при 1200 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в среде для заморозки клеток (от Sigma) и сразу же поставили на заморозку при -80°С на ночь. Для долговременного хранения клетки перенесли в жидкий азот. При необходимости клетки оттаивали (водяная баня, 37°С) и ресуспендировали в PBS с 10% FCS, осаждали кручением и ресуспендировали до 5х106 клеток/мл в среде для культивирования (RPMI [cellgro]), дополненной 5% инактивированной нагреванием сывороткой человека (Sigma), 1-глутамином, пенициллином и стрептомицином).
Для оценок вторичного иммунного ответа Т-клеток памяти клетки культивировали в 24-лунковых планшетах с 4 мкМ пептида по данному изобретению (полученных от GenScript) при 37°С 5%СО2 в течение 2 ч. Затем добавили один микролитр брефелдина А (Golgiplug, BD) на 1 мл среды для культивирования и клетки вернули в 37°С инкубатор на 4-6 ч. Затем клетки перенесли в инкубатор (5% CO2) с более низкой температурой (27°С) на ночь и затем подвергли анализу с использованием проточной цитомет-рии. Определение активированных Т-клеток памяти проводили путем инкубации клеток с CD4-FITC, CD45RA-PE, CD62L-Cy7PE (BD) с последующей пермеабилизацией мембраны и фиксацией (BD). Внутриклеточную экспрессию интерферона-у определяли с помощью моноклональных антител с АРС к ин-терферону-у (BioLegend). Затем проанализировали 200000-500000 клеток с помощью проточного цито-метра FACSCalibre и программного обеспечения Cellquest. Клетки оценивали положительными, если они были CD4+, CD45RAmedium, CD62Lhigh и IFN-у положительными.
Иллюстративный пример данных по проточной цитометрии, демонстрирующих активацию химерных пептидов, показан на фиг. 1, а сводка всех данных показана на фиг. 2.
Данные демонстрируют: (1) химерные пептиды по данному изобретению активируют большее количество центральных Т-клеток памяти, чем отдельные пептиды, а химерный пептид TT830pmglpDTt (который содержит сайт расщепления катепсином) давал более высокий ответ; (2) химерные пептиды по данному изобретению вызывают вторичный иммунный ответ у большего числа людей, чем отдельные пептиды, при этом у 20/20 доноров TT830pmglpDTt - положительный (фиг. 3); (3) химерный пептид
TT830pmglpDTt, который содержит сайт расщепления катепсином, является более активным, чем его отдельные компоненты (ТТ830 и DT) сами по себе, и лучше, чем пептид, который идентичен за исключением того, что без сайта расщепления (TT830DT), позволяя предположить, что добавление сайта расщепления катепсином в химерные пептиды по данному изобретению может обеспечить усиленный вторичный иммунный ответ; (4) данные подтверждают прогностический анализ эпитопа Т-клеток, показанный на фиг. 15. Анализ спрогнозировал, что химерные пептиды, состоящие как из ТТ830, так и из DT эпитопов (TT830DTt), будут обеспечивать наивысшую связывающую способность среди широкого диапазона аллелей HLA-DR, а включение сайта расщепления катепсином (TT830pmglpDTt) усиливало ответ. Добавление ТТ839 или ТТ950 к DP-специфичному эпитопу AdV не повышало количество положительных иммунокомпетентных клеток по сравнению с эпитопом AdV самим по себе. Высокое сродство и широкий охват AdVTT830 был вследствие образования неоэпитопа на стыке AdV и ТТ830. Несмотря на то, что они могут давать прогнозы высокого сродства, неоэпитопы не будут индуцировать вторичный ответ памяти у иммунизированных особей. Включение сайта расщепления катепсином между эпитопами уничтожает неоэпитоп. В одном случае вставка сайта расщепления катепсином уничтожает активность эпитопа AdV (AdVpTT830), возможно вследствие изменения конформации, делая эпитоп неудобным для связывания с классом II.
Пример 4. Тестирование Т-клеток памяти, активированных пептидом.
Ранние центральные Т-клетки памяти экспрессируют множество цитокинов (IL-2, TNF-а, IFN-y) при повторной активации конкретными пептидами, в то время как коммитированные эффекторные Т-клетки памяти, как полагают, избирательно экспрессируют IL-4 в случае коммитированных эффектор-ных ТН2 памяти, и IFN-y в случае коммитированных эффекторных ТН1 памяти. Статус активированных пептидом Т-клеток памяти тестировали с помощью многоцветного анализа внутриклеточных цитокинов совместных культур дендритных клеток/CD4 клеток.
Моноциты периферической крови человека выделили с помощью отрицательного отбора по магнитным бусинам (Dynal) и культивировали в присутствии GM-CSF и IL-4 в течение 1 недели с целью индукции дифференцировки в дендритные клетки. Аллогенные CD4 Т-клетки выделили с помощью разделения с магнитными бусинами (Dynal) и совместно культивировали в присутствии DC в присутствии или отсутствии пептида. Протокол стимуляции и анализа с этой точки идентичен таковому для РВМС, который описан выше в примере 2.
Стимуляция пептидами TT830DT (SEQ ID NO: 7) и TT830pDTt (TT830pmglpDTTrunc или SEQ ID
NO: 13) приводила к повышенной экспрессии TNF-а и IFN-y, но не IL-4 (фиг. 4, 5). Многоцветная проточная цитометрия показала, что как у TT830DT-, так и у TT830pDTt-обработанных РВМС была индуцированная пептидом коэкспрессия TNF-а и IFN-y, но не коэкспрессия TNF-a и IL-4 (фиг. 6), позволяя предположить, что ранние центральные клетки памяти активированы.
Сконструировали ряд химерных пептидов, которые содержали последовательность из DP4-специфичного аденовирусного эпитопа, наряду с эпитопами HLA-DR из ТТ и DT с или без катепсиновых линкеров между эпитопами (фиг. 8). Как описано ранее, клетки культивировали в 24-лунковых планшетах с 4 мкМ пептида по данному изобретению (полученными от GenScript) при 37°С и 5% СО2 в течение 2 ч. Затем добавили 1 мкл брефелдина А (Golgiplug, BD) на 1 мл среды для культивирования и клетки вернули в 37°С инкубатор на 4-6 ч. Затем клетки перенесли в инкубатор (5% CO2) с более низкой температурой (27°С) на ночь и затем подвергли анализу с использованием проточной цитометрии. Определение активированных Т-клеток памяти проводили путем инкубации клеток с CD4-FITC, CD45RA-PE, CD62L-Cy7PE (BD) с последующей пермеабилизацией мембраны и фиксацией (BD). Внутриклеточную экспрессию интерферона-у определяли с помощью моноклональных антител с АРС к интерферону-у (Bi-oLegend). Затем проанализировали 200000-500000 клеток с помощью проточного цитометра FACSCalibre и программного обеспечения Cellquest. Клетки оценивали положительными, если они были CD4+, CD45RAmedium, CD62Lhigh и IFN-y положительными. Анализ 4 доноров на вторичный иммунный ответ Т-клеток памяти показал, что отдельные пептиды и гетеродимерные пептиды без сайта расщепления ка-тепсином давали более слабый ответ по сравнению с ответом доноров на гетеротримерные пептиды (AdVkDTt, AdVkTT950), которые содержали сайт расщепления катепсином "kvsvr". Кроме того, гетерот-римерный пептид (TT830DTAdV), содержащий эпитопы AdV, DT и ТТ также демонстрировал вторичный иммунный ответ у всех 4 доноров.
Пример 5. Модификации пептидов, связывающихся с МНС II, для коррекции физических свойств.
Ряд модифицированных TT830pDTt (SEQ ID NO: 13) последовательностей создали для того, чтобы изменить пептидные свойства, как показано на фиг. 7. Основной объем и природа этих типов модификаций были описаны в других разделах данного документа. Начальными целями модификации пептидов были: 1) улучшить водорастворимость (более низкий GRAVY-Grand Average of Hydropathicity (общее среднее гидрофобности), 2) изменить pI посредством модификаций N-концевых и/или С-концевых аминокислот, 3) модифицировать внутреннее сцепление (PMGLP для расщепления катепсином S) и модифицировать как внешнее, так и внутреннее сцепление. 4) понять важность процессинга пептида в эндосо-мальном компартменте посредством модификации сайта связывания катепсина S путем изменения рас
щепления катепсином В или создания альтернативного процесса дробления пептида.
Кроме того, создали вариации последовательности AdVkDT для изменения гидрофобности пептида и уменьшения pI до почти нейтрального рН. Провели добавление последовательностей к N-концу отчасти по сходству с нативной аминокислотной последовательностью, предшествующей N-концу у эпитопа, являющегося производным от AdV
AdVkDTdl EESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQK (30), pl=6,6-
7,l(seq 71)
AdVkDTd2 ESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQKE (30), pl=6,6-7,l(seq 72)
AdVkDTd3 KESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQE (30), pl=6,6-7,l(seq 73)
Показаны результаты для вариантов AdVkDT (SEQ ID NO: 71-73) (фиг. 10). Во всех экспериментах от 3 различных доноров варианты AdVkDT (SEQ ID NO: 71-73) индуцировали сильный вторичный иммунный ответ по сравнению с непростимулированным (NS) контролем.
Пример 6. Конкретные пептиды памяти гриппа.
В качестве примера композиции, оптимизированной под конкретного отдельного патогена, по данному изобретению идентифицировали общие эпитопы HLA-DR, которые были высококонсервативными у гриппа типа А, гриппа типа А и В или гриппа типа А, В и С (фиг. 11 и 12) с помощью программы Blast и нуклеотидной базы данных Национального института здравоохранения (NIH) с http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi в сочетании с прогнозированием эпитопа класса II с помощью инструментов для прогнозирования эпитопов Т-клеток по базе данных Immune Epitope Database (IEDB) (http://www.immuneepitope.org/). Результаты прогноза Т-клеточных эпитопов для отдельных эпитопов и химерных эпитопов показаны на фиг. 17-19, и химерные эпитопы со спрогнозированным высоким сродством протестировали на способность вызывать ответ Т-клеток памяти. Кратко: РВМС культивировали в 24-лунковых планшетах с 4 мкМ пептида при 37°С 5% CO2 в течение 2 ч. Затем добавили брефелдин А и клетки вернули в 37°С инкубатор на 4-6 ч. Затем клетки перенесли в инкубатор (5% CO2) с более низкой температурой (27°С) на ночь и затем подвергли анализу с использованием проточной цитометрии. Определение активированных Т-клеток памяти проводили путем инкубации клеток с CD4-FITC, CD45RA-PE, CD62L-Cy7PE (BD). Затем проанализировали 200000-500000 клеток с помощью проточного цитометра FACSCalibre и программного обеспечения Cellquest. Клетки оценивали положительными, если они были CD4+, CD45RAmedium, CD62Lhigh и IFN-y положительными. Отдельные эпитопы
Химерные пептидные последовательности гриппа показаны на фиг. 11. Вторичный иммунный ответ Т-клеток памяти от 5 доноров РВМС показан на фиг. 12. Вторичный иммунный ответ Т-клеток памяти был положительным для химерных эпитопов AAWkAAT, AATkABW2, 3120tkAAT и ABW2kAAT, но не был таковым у нехимерного рестриктированного общего эпитопа HLA-DR ABW9 Н5. Эти данные демонстрируют, что четыре химерных консервативных эпитопа по данному изобретению, содержащие специфичные для гриппа пептиды, активны при индукции вторичного иммунного ответа памяти.
Пример 7. Составы с синтетическим нанотранспортером (возможный пример).
Резиквимод (называемый R848) синтезирован в соответствии с синтезом, приведенным в примере 99 патента США № 53 89640 Gerster и соавт. Коньюгат PLA-PEG-никотин получен в Selecta Biosciences с помощью традиционного коньюгационного подхода. PLA получают полимеризацией с раскрытием цикла с использованием D,L-лактида (MB = примерно 15-18 кДа). Структуру PLA подтверждают методом ЯМР. Поливиниловый спирт (MB = 11-31 кДа, 85% гидролизованный) приобретен у VWR scientific. Их используют для приготовления следующих растворов:
1. Резиквимод в метиленхлориде, 7,5 мг/мл.
2. PLA-PEG-никотин в метиленхлориде, 100 мг/мл.
3. PLA в метиленхлориде, 100 мг/мл.
4. Пептид в воде, 10 мг/мл, при этом пептид имеет последовательность
ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ (SEQ ID NO. 13).
5. Поливиниловый спирт в воде, 50 мг/мл.
Раствор № 1 (0,4 мл), раствор № 2 (0,4 мл), раствор № 3 (0,4 мл) и раствор № 4 (0,1 мл) объединяют в небольшой емкости и смесь обрабатывают ультразвуком при 50% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250. К этой эмульсии добавляют раствор № 5 (2,0 мл), и обработка ультразвуком при 35% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250 формирует вторую эмульсию. Ее добавляют в стакан с водой (30 мл) и данную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч с образованием наночастиц. Часть дисперсии нанотранспортеров (1,0 мл) разбавляют водой (14 мл) и концентрируют ее центрифугированием в устройстве для фильтрования центрифугированием Amicon Ultra с мембраной с пороговым значением 100 кДа. Когда объем составил приблизительно 250 мкл, добавляют воду (15 мл) и частицы снова концентрируют до 250 мкл с использованием устройства Amicon. Вторую промывку фосфатно-солевым буфером (рН 7,5, 15 мл) производят таким же образом и окончательный концентрат разбавляют до общего объема 1,0 мл фосфатно-солевым буфером. Это, как ожидается, даст конечную дисперсию нанотранспортеров с концентрацией приблизительно 2,7 мг/мл.
Пример 8. Составы с синтетическим нанотранспортером (возможный пример).
Резиквимод (называемый R848) синтезирован в соответствии с синтезом, приведенным в примере 99 патента США № 5389640 Gerster и соавт. Коньюгат PLA-PEG-никотин получен на Selecta Biosciences. PLA получают полимеризацией с раскрытием цикла с использованием D,L-лактида (MB = примерно 1518 кДа). Структуру PLA подтверждают методом ЯМР. Поливиниловый спирт (MB = 11-31 кДа, 85% гид-ролизованный) приобретен у VWR scientific. Их используют для приготовления следующих растворов:
1. Коньюгат PLA-R848, 100 мг/мл, в метиленхлориде.
2. PLA-PEG-никотин в метиленхлориде, 100 мг/мл.
3. PLA в метиленхлориде, 100 мг/мл.
4. Пептид в воде, 12 мг/мл, при этом пептид имеет последовательность
TLLYVLFЕVNNFTVSFWLRVPKVSASHLЕТ (SEQ ID NO: 5).
5. Поливиниловый спирт в воде, 50 мг/мл.
Раствор № 1 (0,25-0,75 мл), раствор № 2 (0,25 мл), раствор № 3 (0,25-0,5 мл) и раствор № 4 (0,1 мл) объединяют в небольшой емкости и смесь обрабатывают ультразвуком при 50% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250. К этой эмульсии добавляют раствор № 5 (2,0 мл) и обработка
ультразвуком при 35% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250 формирует вторую эмульсию. Ее добавляют в стакан с раствором фосфатного буфера (30 мл) и данную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч с образованием наночастиц. Для промывки частиц часть дисперсии наночастиц (7,0 мл) переносят в центрифужную пробирку и крутят при 5300 г 1 ч, су-пернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 7,0 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Повторяют процедуру цинтрифугирования и осадок ресуспендируют в 2,2 мл фосфатно-солевого буферного раствора для ожидаемой конечной дисперсии наночастиц приблизительно 10 мг/мл.
Пример 9. Коньюгация композиций по данному изобретению с транспортерным белком (возможный пример).
Пептид (SEQ ID NO: 5) модифицируют дополнительными Gly-Cys на С-конце для коньюгации с транспортерным белком, CRM197 через тиоловую группу на С-концевом Cys. CRM197 представляет собой нетоксичный мутант дифтерийного токсина с одной аминокислотной заменой в ее основной последовательности. Глицин, присутствующий в аминокислотном положении 52 молекулы, заменяют глута-миновой кислотой посредством изменения одного кодона нуклеиновой кислоты. В связи с этим изменением у белка отсутствует АДФ-рибозилтрансферазная активность, и он становится нетоксичным. У него молекулярный вес 58408 Да.
Свободные аминогруппы CRM197 бромацетилируют посредством реакции с избытком сложного N-гидроксисукцинимидного эфира бромуксусной кислоты (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури). CRM197 (15 мг) растворяют в 1,0М NaHCO3 (pH 8,4) и охлаждают льдом. Раствор сложного N-гидроксисукцинимидного эфира бромуксусной кислоты (15 мг в 200 мкл диметилформамида (DMF) медленно добавляют к раствору CRM197 и раствор слегка помешивают при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч. Полученный бромацетилированный (активированный) белок затем очищают диа-фильтрацией посредством диализа с мембраной с 10000 MWCO. Степень бромацетилирования определили по реакции активированного CRM197 с цистеином с последующим аминокислотным анализом и количественным определением полученного карбоксиметилцистеина (CMC).
Бромацетилированный CRM197 растворяют в 1М натрий карбонатном/бикарбонатном буфере с рН 9,0 и хранят при 2-8°С в атмосфере аргона. Раствор пептида (TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASH-LET-G-C (SEQ ID NO: 107; модифицированная SEQ ID NO: 5)) (10 мг) в 1 М натрий карбонатном/бикарбонатном буфере при рН 9,0 добавляют к раствору бромацетилированного CRM197 и смесь помешивают при 2-8°С в течение 15-20 ч. Оставшиеся бромацетильные группы затем кэпируют 20-кратным молярным избытком N-ацетилцистеамина в течение 4-8 ч при 2-8°С. Полученный коньюгат пептид-CRM197 затем очищают при комнатной температуре диафильтрацией на мембране с 10000 MWCO посредством диафильтрации против 0,01 М натрий фосфатного буфера/0,9% NaCl, рН 7,0. Собирают ретентат, коньюгат пептид-CRM197, и анализируют на содержание белка (анализ по Лоури или колориметрический микроанализ с использованием ВСА), с помощью SDS-PAGE, с помощью аминокислотного анализа или на иммуногенность у мышей.
Пример 10. Смесь композиций по данному изобретению с традиционной вакциной, включающей антиген (возможный пример).
PLA получают полимеризацией с раскрытием цикла с использованием D,L-лактида (MB = приблизительно 15-18 кДа). Структуру PLA подтверждают методом ЯМР. Поливиниловый спирт (MB = 11-31 кДа, 87-89% гидролизованный) приобретен у VWR scientific. Это используют для приготовления следующих растворов:
1. PLA в метиленхлориде, 100 мг/мл.
2. PLA-PEG в метиленхлориде, 100 мг/мл.
3. Пептид в водном растворе, 10 мг/мл, при этом пептид имеет последовательность SEQ ID NO: 91.
4. Поливиниловый спирт в воде или фосфатном буфере, 50 мг/мл.
Раствор № 1 (0,5-1,0 мл), раствор № 2 (0,25-0,5 мл) и раствор № 3 (0,05-0,3 мл) объединяют в стеклянной пробирке под давлением и смесь обрабатывают ультразвуком при 50% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250. К этой эмульсии добавляют раствор № 4 (2,0-3,0 мл) и обрабатывают ультразвуком при 30% амплитуды в течение 40-60 с с помощью Branson Digital Sonifier 250, формируя вторую эмульсию. Ее добавляют в стакан с раствором фосфатного буфера (30 мл) и данную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч с образованием нанотранспортеров. Для промывки частиц часть дисперсии нанотранспортеров (27,0-30,0 мл) переносят в центрифужную пробирку и крутят с 21000 г 45 мин, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 30,0 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Процедуру центрифугирования повторяют и осадок ресуспендируют в 8,1-9,3 мл фосфатно-солевого буферного раствора.
4 мл аликвоту суспендированных синтетических нанотранспортеров центрифугируют для осаждения синтетических нанотранспортеров. Удаляют супернатант и добавляют 0,5 мл суспензии трехвалентной вакцины вируса гриппа Fluarix(r). Комбинированную вакцину перемешивают для ресуспендирования нанотранспортеров и полученную суспензию хранят при -20°С до использования.
Пример 11. Пришивание композиций по данному изобретению к золотым нанотранспортерам (возможный пример).
Этап 1. Образование золотых нанотранспортеров (AuNC): водный раствор 500 мл 1 мМ HAuCl4 нагревают до возврата флегмы в течение 10 мин при интенсивном помешивании в 1 л круглодонной колбе, оснащенной холодильником. Затем к перемешиваемому раствору быстро добавляют 50 мл раствора 40 мМ тринатрия цитрата. Полученный темно-винно-красный раствор кипятят в течение 25-30 мин и отводят тепло, раствор охлаждают до комнатной температуры. Затем раствор фильтруют через 0,8 мкм мембранный фильтр с получением раствора AuNC. AuNC характеризуют с помощью спектроскопии в видимой области и трансмиссионной электронной микроскопии. AuNC составляют приблизительно 20 нм в диаметре, копированные цитратом с пиком поглощения 520 нм.
Этап 2. Непосредственная конъюгация пептида с AuNC: C-концевой пептид из примера 9 (пептид SEQ ID NO: 5, содержащий С-концевой цистеин) пришивают к AuNC следующим образом: 145 мкл раствора пептида (10 мкМ в 10 мМ карбонатном буфере с рН 9,0) добавляют к 1 мл копированных цитратом золотых нанотранспортеров с диаметром 20 нм (1,16 нМ) с получением молярного соотношения тиола к золоту 2500:1. Смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 1 ч, чтобы позволить завершиться обмену тиола с цитратом на золотых нанотранспортерах. Затем конъюгат пеп-тид-AuNC очищают центрифугированием при 12000 г в течение 30 мин. Удаляют супернатант и осадок, содержащий пептид-AuNC, ресуспендируют 1 мл инъекционной воды для дальнейшего анализа и биопробы.
Пример 12. Синтетические нанотранспортеры с использованием модифицированных композиций примера 5.
Резиквимод (называемый R848) синтезировали в соответствии с синтезом, предоставленным в примере 99 патента США № 5389640 Gerster и соавт., и конъюгировали с PLGA с образованием PLGA-R848 с использованием амидного линкера. PLGA (IV 0,10 дл/г) и PLA (IV 0,21 дл/г) приобрели у Lakeshore Biomaterials. Конъюгат PLA-PEG-никотин получили в Selecta Biosciences с помощью традиционного конъюгационного подхода. Поливиниловый спирт (MB = 11-31 кДа, 87-89% гидролизованный) приобрели у JT Baker.
Их используют для приготовления следующих растворов:
1. PLGA-R848 в метиленхлориде, 100 мг/мл.
2. PLA-PEG-никотин в метиленхлориде, 100 мг/мл.
3. PLA в метиленхлориде, 100 мг/мл.
4. Пептид, 10 мг/мл, в растворе, состоящем из 10% DMSO, 50% молочной кислоты, Фармакопея США, и 40% воды, при этом пептид имеет последовательность
EESTLLYVLFEVKVSVRQSIALSSLMVAQK (SEQ ID NO: 71)
5. Поливиниловый спирт в фосфатном буфере с рН 8, 50 мг/мл.
Раствор № 1 (0,5 мл), раствор № 2 (0,25 мл) и раствор № 3 (0,25 мл) объединили и добавили раствор № 4 (0,25 мл) в небольшой сосуд и смесь обрабатывали ультразвуком при 50% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250. К этой эмульсии добавили раствор № 5 (2,0 мл). Смесь обработали ультразвуком при 30% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250 с образованием второй эмульсии. Затем эту эмульсию добавили в 50 мл стакан с перемешиванием, содержащий 70 мМ раствор фосфатного буфера с рН 8 (30 мл), и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч с образованием синтетических нанотранспортеров.
Для промывки синтетических нанотранспортеров часть дисперсии синтетических нанотранспорте-ров (27,5 мл) перенесли в 50 мл центрифужную пробирку и крутили при 9500 об/мин (13800 г) 1 ч при 4°С, супернатант удалили, а осадок ресуспендировали в 27,5 мл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). Повторили процедуру отмывки на основе центрифугирования и осадок ресуспендировали в 8,5 г фосфатно-солевого буферного раствора для заданной концентрации дисперсии синтетических на-нотранспортеров 10 мг/мл. Осуществили гравиметрическое определение действительной концентрации и концентрацию затем довели PBS до 5 мг/мл.
Иммуногенность состава синтетических нанотранспортеров определили с помощью исследования с прививкой мышей C57BL6. Прививки осуществляли подкожно в задние лапы не подвергнутых какому-либо воздействию мышей C57BL6 (5 мышей на группу) согласно схеме с примированием антигеном на день 0 и последующими стимулами на дни 14 и 28. На каждую прививку в целом вводили инъекцией 100 мкг нанотранспортеров, 50 мкг на каждую заднюю конечность. Сыворотку крови собрали на 26, 40, 55 и 67 дни. Титры антител к никотину определяли для сыворотки крови как величины ЕС50. Контрольные группы привили похожим образом с использованием синтетического нанотранспортера с тем же полимерным составом, включая известный мышиный пептид, связывающийся с МНС II, (овальбумин 323-339 амид) в качестве положительного контроля или без какого-либо пептида, связывающегося с МНС II. Данные показаны на фиг. 13.
Пример 13. Синтетические нанотранспортеры с использованием композиций по данному изобретению.
PLGA (5050 DLG 2,5А, IV 0,25 дл/г) приобрели у Lakeshore Biomaterials. Конъюгат PLA-PEG-
никотин был получен на Selecta Biosciences. Поливиниловый спирт (MB = 11-31 кДа, 87-89% гидролизо-ванный) был приобретен у JT Baker.
Их используют для приготовления следующих растворов:
1. PLGA в метиленхлориде, 100 мг/мл.
2. PLA-PEG-никотин в метиленхлориде, 100 мг/мл.
3. Пептид, 4 мг/мл, в растворителе, состоящем из 10% DMSO в воде, при этом пептид имеет последовательность ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ (SEQ ID NO: 13).
4. Поливиниловый спирт в фосфатном буфере с рН 8, 50 мг/мл.
Раствор № 1 (0,375 мл) и раствор № 3 (0,125 мл) объединили и разбавили 0,50 мл метиленхлорида перед тем, как добавили раствор № 3 (0,25 мл), в небольшом сосуде и смесь обрабатывали ультразвуком при 50% амплитуды в течение 40 с с помощью Branson Digital Sonifier 250. К этой эмульсии добавили раствор № 4 (3,0 мл). Смесь обработали ультразвуком при 30% амплитуды в течение 60 с с помощью Branson Digital Sonifier 250 с образованием второй эмульсии. Затем эту эмульсию добавили в 50 мл стакан с перемешиванием, содержащий 70 мМ раствор фосфатного буфера с рН 8 (30 мл), и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч с образованием синтетических нанотранспортеров.
Для промывки частиц часть дисперсии синтетических нанотранспортеров (29 мл) перенесли в 50 мл центрифужную пробирку и крутили при 9500 об/мин 45 мин при 4°С, супернатант удалили, а осадок ре-суспендировали в 27,5 мл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). Повторили процедуру отмывки на основе центрифугирования и осадок затем ресуспендировали в 4,4 г PBS для заданной концентрации дисперсии синтетических нанотранспортеров 10 мг/мл. Осуществили гравиметрического определение действительной концентрации и концентрацию затем довели в PBS до 5 мг/мл.
Иммуногенность состава синтетических нанотранспортеров определили с помощью исследования с прививкой мышей BALB/c. Синтетические нанотранспортеры смешали с раствором мышиного активного адъюванта CpG, PS-1826 сразу после инъекции. Прививание осуществляли подкожно в задние лапы не подвергнутым какому-либо воздействию мышам BALB/c (5 мышей на группу) согласно схеме с прими-рованием антигеном на день 0 и последующими стимулами на дни 14 и 28. На каждую прививку в целом вводили инъекцией 100 мкг синтетических нанотранспортеров и 20 мкг PS-1826, разделенных поровну между задними конечностями. Сыворотку крови собрали на 26 и 40 дни. Титры антител к никотину определяли для сыворотки крови как величины ЕС50. Контрольные группы привили похожим образом с использованием синтетических нанотранспортеров с похожим полимерным составом, с синтетическими нанотранспортерами положительного контроля, включающими известный мышиный пептид, связывающийся с МНС II, (овальбумин 323-339 амид) и нанотранспортером отрицательного контроля без пептида, связывающегося с МНС П. Результаты показаны на фиг. 14.
Arg Gin Ser lie Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gin Lys
20 25 30
<210> 128 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический полипептид <400> 123
Glu His Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Lys Val Ser Val Arg
15 10 15
Gin Ser lie Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gin Lys Glu
<210> 129 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетический полипептид <400> 129
Lys Glu His Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Lys Val Ser Val
15 10 15
Arg Gin Ser lie Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gin Glu
20 25 30
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция для индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающая синтетические нанотранспортеры, содержащие А-х-В, и фармацевтически приемлемый наполнитель,
где х включает линкер;
где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR;
где В включает второй пептид, связывающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR, и
где А и В не имеют 100% идентичности друг с другом.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где синтетические нанотранспортеры дополнительно включают
А-х-В-у-С;
где у может включать линкер или может не включать линкер;
где С включает третий пептид, связывающийся с МНС II, и при этом третий пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; и
где А, В и С не имеют 100% идентичности друг с другом.
3. Фармацевтическая композиция по п.2, в которой
(a) х и/или у включают линкер, который включает амидный линкер, дисульфидный линкер, сульфидный линкер, линкер на основе 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола, линкер на основе сложного тиоло-вого эфира, гидразидный линкер, иминовый линкер, линкер на основе тиомочевины, амидиновый линкер или аминовый линкер; или
(b) х и/или у включают линкер, включающий пептидную последовательность, сайт расщепления лизосомальной протеазой, биоразлагаемый полимер, линкер на основе замещенного или незамещенного алкана, алкена, замещенной или незамещенной ароматической или гетероциклической группы, рН-чувствительный полимер, гетеробифункциональные линкеры или спейсер на основе олигомерного гликоля; или
(c) у не включает линкер, а А-х-В и С включают смесь, присутствующую в композиции.
4. Фармацевтическая композиция для индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающая
одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, например ДНК или РНК, которые кодируют А-х-В или А-х-В-у-С, где, если присутствует более чем одна выделенная нуклеиновая кислота, выделенные нуклеиновые кислоты вместе используют в указанной композиции, и
где х включает амидный линкер или пептидный линкер, и/или у включает амидный линкер или пептидный линкер, или не включает линкер, необязательно где х представляет собой: (а) пептидный линкер, который включает сайт расщепления лизосомальной протеазой;
где А включает первый пептид, связывающийся с МНС II, и при этом первый пептид, связываю
щийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR;
где В включает второй пептид, связьгоающийся с МНС II, и при этом второй пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR,
где у может включать линкер или может не включать линкер;
где С включает третий пептид, связывающийся с МНС II, и при этом третий пептид, связывающийся с МНС II, включает пептид, который по меньшей мере на 70% идентичен природному пептиду, связывающемуся с HLA-DP, природному пептиду, связывающемуся с HLA-DQ, или природному пептиду, связывающемуся с HLA-DR; и
где А, В и С не имеют 100% идентичности друг с другом.
5. Фармацевтическая композиция по п.4, в которой: (а) х или у представляет собой пептидный линкер, который включает сайт расщепления лизосомальной протеазой; (b) у не является линкером, и А-х-В и С кодируются двумя или более отдельными выделенными нуклеиновыми кислотами в композиции, где необязательно (i) х представляет собой амидный линкер или пептидный линкер, и А-х-В и С кодируются отдельными выделенными нуклеиновыми кислотами в композиции, или (ii) х представляет собой амид-ный линкер или пептидный линкер, и А-х-В и С кодируются одной и той же выделенной нуклеиновой кислотой в композиции; или (с) у не является линкером, и А-х-В и С кодируются одной и той же выделенной нуклеиновой кислотой в композиции.
6. Фармацевтическая композиция по п.4 или 5, включающая одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, которые являются комплементарными полноразмерными цепями упомянутых выделенных нуклеиновых кислот.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, необязательно (а) где по меньшей мере часть А-х-В или А-х-В-у-С композиции по любому из пп.1-6 присутствует на поверхности синтетического нанотранспортера; (b) где по меньшей мере часть А-х-В или А-х-В-у-С композиции по любому из пп.1-6 инкапсулирована синтетическим нанотранспортером; и/или (с) дополнительно включающая один или несколько антигенов.
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где А-х-В включает полипептид, последовательность которого включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из следующих аминокислотных последовательностей (представленных как SEQ ID NO: 1-46):
NNFTVSFWLRVPKVSASHLET (SEQ ID N0:1) (21, TT317557(950969));
TLLYVLFEV (SEQ ID N0:2) (9, AdVhex64950 (913-921) ) ,-ILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:3) (15, TT27213(830-841)); QSIALSSLMVAQAIPLVGEL (SEQ ID N0:4) (20, DT 52336(331-350)> ;
TLLYVLFEVNNFTVS FWLRVPKVSASHLET (SEQ ID N0:5) (30, AdVTT950);
TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:6) (24, AdVTT830); ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL (SEQ ID N0:7) (35, TT830DT);
QSIALSSLMVAQAIPLVGELILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:8) (35, DTTT83 0);
ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:9) (27,
TT83 ODTtrunc);
QSIALSSLMVAQAI ILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:10) (29, DTtruncTT8 3 0);
TLLYVLFEVPMGLPILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:11) (29, AdVpmglpiTT830);
TLLYVLFEVKVSVRILMQYIKANSKFIGI (SEQ ID N0:12) (29, AdVkvsvrTT830);
ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ (SEQ ID NO: 13) (32, TT830pmglpDTTrunc);
ILMQYIKANS KFIGIKVSVRQSIALS SLMVAQ (SEQ ID N0:14) (32, TT830kvsvrDTTruncl);
TLLYVLFEVQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:15) (21, AdVDTt);
TLLYVLFEVpmglpQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:16) (26, AdVpDTt);
TLLYVLFEVkvSvrQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:17) (26, AdVkDTt);
TLLYVLFEVpmg lpNNFTVS FWLRVPKVSASHLET (SEQ ID NO: 18) (35, AdVpTT950)/
TLLYVLFEVkvsvrNNFTVSFWLRVPKVSASHLET (SEQ ID N0:19) (35, AdVkTT9 5 0);
ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQTLLYVLFEV (SEQ ID N0:20) (36, TT830DTtAdV);
TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ (SEQ ID N0:21) (36, AdVTT8 3 ODTt);
QSIALSSLMVAQAIPLV (SEQ ID N0:22) (17, DTt-3);
IDKISDVSTIVPYIGPALNI (SEQ ID N0:23) (20, TT632);
QSIALSSLMVAQAIPLVIDKISDVSTIVPYIGPALNI (SEQ ID N0:24) (37, DTt-3TT632);
IDKISDVSTIVPYIGPALNIQSIALSSLMVAQAIPLV {SEQ ID N0:25) (37, TT632DTt-3);
QS IALS SLMVAQAIPLVpmglp IDKISDVSTIVPYIGPALNI (SEQ ID N0:26) (43, DTt-3pTT632);
IDKISDVSTIVPYIGPALNIpmglpQSIALSSLMVAQAIPLV (SEQ ID N0:27) (43, TT632pDTt-3);
YVKQNTLKLAT (SEQ ID N0:28} (11, minX);
CYPYDVPDYASLRSLVASS (SEQ ID N0:29) (19, 7430);
NAELLVALENQHTI (SEQ ID N0:30) (14, 31201t);
TSLYVRASGRVTVSTK (SEQ ID N0:31) (16, 66325);
EKIVLLFAIVSLVKSDQICI (SEQ ID N0:32) (20, ABW1);
QILSIYSTVASSLALAIMVA (SEQ ID N0:33) (20, ABW2);
MVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSI (SEQ ID NO:34) (24, ABP);
EDLIFLARSALILRGSV (SEQ ID N0:35) (17, AAT);
CSQRSKFLLMDALKLSIED (SEQ ID N0:36) (19, AAW);
IRGFVYFVETLARSICE (SEQ ID N0:37) (14, IRG);
TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (SEQ ID N0:38) (21, TFE);
LIFLARSALILRkvsvrNAELLVALENQHTI (SEQ ID N0:39) (31, ААТкЗ12 01) ;
NAELLVALENQHT IkvsvrLIFLARSALILR (SEQ ID N0:40) (31, 3120tkAAT);
ILSIYSTVASSLALAIkvsvrLIFLARSALILR (SEQ ID N0:41) (33, ABW2kAAT);
LIFLARSALILRkvsvxILSIYSTVASSLALAI (SEQ ID N0:42) (33, AATkABW2);
LIFIARSALILRkvs vrCSQRSKFLLMDALKL (SEQ ID N0:43) (32, AATkAAW);
CSQRSKFLLMDALKLkvsvrLIFLARSALILR (SEQ ID NO: 44) (32, AAWkAAT);
TFEFTSFFYRYGFVANFSMELIRGFVYFVETLARSICE (SEQ ID N0:45) (38, TFEIRG); или
IRGFVYFVETLARSICETFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (SEQ ID NO:46> (38, IRGTFE);
где необязательно
(a) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична любой из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46; или
(b) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность любой одной из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46.
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.4-6, включающая выделенную нуклеиновую ки-
слоту, которая кодирует полипептид, последовательность которого включает аминокислотную последо-
вательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из аминокислотных последовательно-
стей, представленных как SEQ ID NO: 1-46, где необязательно:
(a) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична любой из аминокислотных последовательностей, представленных как
SEQ ID NO: 1-46;
(b) последовательность полипептида включает аминокислотную последовательность любой из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-46.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, включающая выделенную нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной полноразмерной цепью упомянутой выделенной нуклеиновой кислоты.
11. Фармацевтическая композиция по п.9 или 10, где последовательность выделенной нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 60% идентична любой одной из следующих последовательностей нуклеиновых кислот (представленных как SEQ ID
NO: 47-68):
ТТ950 NNFTVSFWLRVPKVSASHLET
CI:
aataa1111accg11age1111ggttgagggttссtaaagtatсtgctagtca111agaa (SEQ ID N0:47) AF154828 250-309 C2(человека):
aacaacttcaccgtgagcttctggctgagagtgcccaaggtgagcgccagccacctgg agacc(SEQ ID N0:48) AdV TLLYVLFEV
CI: acgcttctctatgttctgttcgaagt (SEQ ID N0:49)
FJ025931 20891-20917
C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtg (SEQ ID N0:50) TT830: ILMQYIKANSKFIGI
CI: attttaatgeagtatataaaagcaaattctaaatttataggtata (SEQ ID NO:51)
X06214 2800-2844 C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:52)
DT: QS I AL S S LMVAQAIPLVGEL
CI;
caatcgatagctttatcgtctttaatggttgctcaagctataccattggtaggagagcta (SEQ ID N0:53)
FJ858272 1066-1125
C2 (человека):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagc tg (SEQ ID N0:54)
AdVTT950: TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET
C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaacaacttcaccgtgagcttctggctgagag tgcccaaggtgagcgccagccacctggagacc (SEQ ID N0:55)
AdVTT830: TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI
C2(человека);
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgatcctgatgcagtacatcaaggccaacagca agttcatcggcatc (SEQ ID N0:56)
TT830 DT: ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL C2 (человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccc tgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg (SEQ ID N0:57) DT TT830: QSIALSSLMVAQAIPLVGBLILMQYIKANSKFIGI C2 (человека) :
cagagc at с gc с с tgage age с t gatggtggc с caggee at с с с с с tggtgggcgage tgatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:58) TT830DTtrunC: ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ
C2(человека);
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccc tgagcagcctgatggtggcccag (SEQ ID N0:59)
DTtrunc TT830: QSIALSSLMVAQAIILMQYIKANSKFIGI
C2(человека):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatcatcctgatgcagtaca tcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:60)
AdVjMnglpTT830 : TLLYVLFEVPMG. LPILMQYIKANSKFIGI CI (ECQli):
accctgctgtatgtgctgtttgaagtgccgatgggcctgccgattctgatgcagtata ttaaagcgaacagcaaatttattggcatt (SEQ ID N0:61) C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgcccatgggcctgcccatcctgatgcagtaca tcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:62)
AdVkvsvrTT830 : TLLYVLFEVKVS. VRILMQYIKANSKFIGI CI (Ecoli):
accctgctgtatgtgctgtttgaagtgaaagtgagcgtgcgcattctgatgcagtata
aaagcgaacagcaaatttattggcatt (SEQ ID N0:63) C2(человека):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaaggtgagcgtgagaatcctgatgcagtaca tcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (SEQ ID N0:64)
TT830pmglpDTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIPMG. LPQSIALSSLMVAQ CI (Ecoli):
attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattccgatgggcctgc cgcagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag (SEQ ID N0:65) C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccccatgggcctgc cccagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag (SEQ ID N0:66)
TT830kvevrD!trunc: ILMQYIKANSKFIGIKVS.VRQSIALSSLMVAQ CI (Ecoli):
attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattaaagtgagcgtgc gccagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag (SEQ ID N0:67) C2(человека):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatcaaggtgagcgtga gacagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag (SEQ ID N0:68);
где необязательно
(a) последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 70% идентична любой из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных как SEQ ID NO: 47-68; или
(b) последовательность выделенной нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты любой из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных как SEQ ID NO: 47-68.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, включающая выделенную нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной полноразмерной цепью упомянутой выделенной нуклеиновой кислоты.
13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где природный пептид, связыюающийся с HLA-DP, DQ или DR, включает пептидную последовательность, полученную или происходящую из Clostridium tetani, вируса гепатита Б, вируса герпеса человека, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса Эпштейна-Барра, вируса оспы птиц, вируса кори, вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, вируса эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусов человека, вируса натуральной оспы или инфекционных организмов, способных инфицировать людей и генерировать CD4+ клетки памяти человека, специфичные к инфекционному организму, после начала инфекции.
14. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где каждый из А и В или А, В и С содержит: (а) пептидные последовательности, полученные или происходящие из различных инфекционных организмов; или (b) пептидные последовательности, полученные или происходящие из идентичных инфекционных организмов; или (с) пептиды, имеющие различные репертуары, связывающиеся с МНС II.
15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где (а) А, х или В или (b) А, х, В, у или С содержит последовательность или химические модификации, которые повышают водорастворимость А-х-В или А-х-В-у-С соответственно, где последовательность или химические модификации включают добавление гидрофильных N- и/или С-концевых аминокислот, гидрофобных N- и/или С-концевых аминокислот, замещение аминокислот для достижения pI приблизительно 7,4 и достижения суммарного положительного заряда при приблизительно рН 3,0 и замещение аминокислот, восприимчивых к перегруппировке.
16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-12, где первый и/или второй пептид, связывающийся с МНС II, и/или третий пептид, связывающийся с МНС II, имеет длину, находящуюся в диапазоне (а) от 5 до 50 мономерных звеньев полимера; (b) от 5 до 30 мономерных звеньев полимера; (с) от 6 до 25 мономерных звеньев полимера.
17. Лекарственная форма для индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающая:
(a) композицию по пп.1-16 и необязательно антиген; необязательно, где по меньшей мере часть А-х-В или А-х-В-у-С композиции присутствует на поверхности синтетического нанотранспортера или инкапсулирована синтетическим нанотранспортером; или
(b) вакцину, включающую композицию по любому из пп.1-16 и необязательно (i) антиген или (ii) адьювант.
18. Лекарственная форма по п.17, где природный пептид, связывающийся с HLA-DP, DQ или DR, включает пептидную последовательность, полученную или происходящую из Clostridium tetani, вируса гепатита Б, вируса герпеса человека, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса Эпштейна-Барра, вируса оспы птиц, вируса кори, вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, вируса эпидемического паротита, Corynebacterium diphtheria, аденовирусов человека, вируса натуральной оспы или инфекционных организмов, способных инфицировать людей и генерировать CD4+ клетки памяти человека, специфичные к инфекционному организму, после начала инфекции.
19. Лекарственная форма по любому из пп.17-18, где каждый из А и В или А, В и С содержит: (а) пептидные последовательности, полученные или происходящие из различных инфекционных организмов; или (b) пептидные последовательности, полученные или происходящие из идентичных инфекционных организмов; или (с) пептиды, имеющие различные репертуары, связывающиеся с МНС II.
20. Лекарственная форма по любому из пп.17-19, где (а) А, х или В или (b) А, х, В, у или С содержит последовательность или химические модификации, которые повышают водорастворимость А-х-В или А-х-В-у-С соответственно, где последовательность или химические модификации включают добав
18.
ление гидрофильных N- и/или С-концевых аминокислот, гидрофобных N- и/или С-концевых аминокислот, замещение аминокислот для достижения pI приблизительно 7,4 и достижения суммарного положительного заряда при приблизительно рН 3,0 и замещение аминокислот, восприимчивых к перегруппировке.
21. Лекарственная форма по любому из пп.17-20, где первый и/или второй пептид, связывающийся с МНС II, и/или третий пептид, связывающийся с МНС II, имеет длину, находящуюся в диапазоне (а) от 5 до 50 мономерных звеньев полимера; (b) от 5 до 30 мономерных звеньев полимера; (с) от 6 до 25 мономерных звеньев полимера.
22. Способ индукции, усиления, супрессии, вызова и/или повторного вызова иммунного ответа, включающий введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 или лекарственной формы по любому из пп.17-21 субъекту.
21.
21.
Варианты TT8J0pDTl
Исходная молекула
ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ Предлагаемые пептиды
1. N- и С-концсвое добавление-1 SKNILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQK
2. N- н С-концевое добавленне-2 SKNILHQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQKE
3. N- и С-концевое добавление-3
KNILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQK
4. N- и С-ковцевое добавление-4
КШ LHQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQKE
GRAVY .797
.372
.268
.406
297
5. ПЭГ для повышения растворимости
ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ-Пэгилированный
6. Линкер с Н-связью
ILMQYIKANSKFIGITSGTSQSIALSSLMVAQ .625
7. Линкер растворимости
ILMQYIKANSKFIGIGEGDDQS IALS SLMVAQ .378
8. Пептид Delta 2аа TT + TEL (Ser для защиты от pyrogln) SQYIKANS KFIGITELQS IALS SLMVAQ .662
9. Сцепление с катепсином В
ILMQYI KANSKFIGI KKQSIALS SLMVAQ .538
10. Сцепление с катепсином В с N- н С-концевым добавлением KNILMQYI KANSKFIGI KKQSIALSSLMVAQKE 0.02
11. Дисульфидный линкер
ILMQYIKANSKFIGIC CQSIALS SLMVAQ .812
S S
12. Гндразоновый линкер (кислотно-чувствительное растепление)
ILMQYIKANSKFIGI (NHNR2+ СОСК2) QS IALSSLMVAQ
Фиг. 7
Процент CD4+/ CD45RAlow/ CD62Lhigh центральных Т-клеток памяти (16 доноров) у аденовирусных AdVkDTt вариантов
Варианты AdVkDTt:
Аминокислотные добавления с созданием гидрофильного AdVkDTt для создания наночастиц
AdVkDTdl EESTLLYvXFEVkvsvrQSIAbSSLMVAQK (30), pi = AdVkDTd2 ESTLLXVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQKE (30), pi = AdVkDTd3 KESTLLYVLPEVkvsvrQSIALSSLMVAQE (30). pi = AdVkDTd4 EEHTbLTVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQK (30), pi = AdVkOTdS EHTLLYVLFEVkvsvrQS IALS SLMVAQKE (30), pi: AdVkDTd6 KEHTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQE (30), pi:
% T памяти v CD4CP45RA1QW
.98
AdVkDTdl
2.12
AdVkDTd2
2.44
AdVkDTd3
1.72
AdVkDTt
7.08
Экой
.52
234
2.31
1.96
632
ЭкспЗ
.49
136
.86
.39
123
Фиг. 10
Титр антител к никотину, создаваемый композициями и синтетическими наноносителями по данному изобретению
ЮОООООг-"
Охват популяции по Европе с HLA-DR к прогнозируемым простым и химерным эпитопам
Аллель HLA-DRB1
0101
0301
0401
0404
0405
0701
0802
1101
1302
1501
ПГл1уП.ФСПЩ%
(иио26,4Р/о) ,
8.00
1.93
1.43
4.25
031
2.24
0.12
2.94
3.13
2.09
Элитоп
Коисенсусный процентильвый ранг
ТТ950
2.8
mm.
. "Л
v-w
ТТ830
2.2
0.6
0.9
0.1
65 гя
0.57
3.0
2.6
AdVTT950
2.8
ijjp
1.2
1.6
1.3
0.3
0.8
2.5
AdVTTMO
2.2
-64
2.0
0.4
0.27
0.9
0.1
2.9
0.8
0.37
TT830DT
024
1.3
1.5
0.6
0.8
0.9
0.1
2.0
0.7
DTTT830
OS?
0.6
0.9
0.1
2.9
0.8
0.37
TT830DTtrunc
024
1.3
1.5
0.6
0.8
0.9
0.1
2.0
0.7
DTtruncTT630
0.57
0.8
2.0
0.49
0.9
0.1
2.9
0.8
0.37
Фиг. 15
Охват популяции по Европе с HLA-DR к прогнозируемым простым и химерным эпитопам
Аллель HLA-DRB1
0101
0301
0401
0404
0405
0701
0802
1101
1302
1501
Гкэт"эт. налога, %
8.00
1.93
1.43
425
0.31
2.24
0.12
2.94
3.13
2.09
Эпитоп
2.01
3.7
3.3
&ЙН1
DTt-3
2.8
2,01
3.7
2.8
ТТ632
.74
4.45
1.1
DTt-3TT632
75"
2.01
3.7
1.1
TT6320Tt-3
3.5
.55
1.24
3.3
1.1
DTt-3pTT"2
2.01
3,7
3,3
1.1
TT632pDTt-3
li§S
ЩЁШ 3.7
2.01
3.7
3.3
1.1
Фиг. 16
Фиг. 17
Фиг. 18
Фиг. 19
Аминокислотная замена без потери прогнозируемой способности связывания с классом II
Часть А AdV
TLLYVLFEV TLLYVLFEL TLLYLLFEL TLLFLLFEL
% ИД. Коисенсусный процентильный ранг
HLADPA1*01~DPB1'0401 100% 4.71 90% 1.67 80% 2.43 70% 4.42
Часть В
ТТ830-841 HLADR0101 HLADR0404
ILMQYIKANSKFIGI 100% 4.80 3.S7
ILMQYIKANSKFLGL 90% 3.90 2.55
IIMQYIKAHSKFLGL 80% 1.98 2.84
IIMQYIRAHSRPLOL 70% 4.20 2.29
Фиг. 20
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023897
- 1 -
023897
- 1 -
023897
- 4 -
023897
- 18 -
023897
- 19 -
023897
- 35 -
023897
- 51 -
023897
- 54 -
023897
- 55 -
023897
- 57 -
023897
- 58 -
023897
- 62 -
023897
- 63 -
023897
- 63 -