EA 023888B1 20160729

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000023888b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус с геномом флавивируса, который включает (i) одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков, выбранных из группы, состоящей из капсидного белка С, предшественника мембранного белка (prM), оболочечного или капсульного белка (Е), неструктурного белка 1 (NS1), неструктурного белка 3 (NS3) и неструктурного белка 5 (NS5), и (ii) последовательность, которая кодирует один или большее число иммуногенов вируса бешенства.

2. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят внутри последовательностей капсидного белка С генома флавивируса.

3. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят в последовательностях предшественника мембранного белка (prM) и/или оболочечного белка (Е) генома флавивируса.

4. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят в последовательностях капсидного белка (С), предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) генома флавивируса.

5. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят в последовательностях неструктурного белка 1 (NS1) генома флавивируса.

6. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанный иммуноген вируса бешенства включает иммуноген - белок G вируса бешенства или иммуногенный фрагмент этого белка.

7. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-6, в котором указанный геном флавивируса включает последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка (prM) и/или оболочечный белок (Е).

8. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому пп.1-7, в котором геном флавивируса выбран из генома вируса жёлтой лихорадки, вируса лихорадки Западного Нила, вируса клещевого энцефалита, вируса Лангат, вируса японского энцефалита, вируса лихорадки денге, последовательностей вируса энцефалита Сент-Луиса, а также химер этих вирусов.

9. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.8, в котором указанная химера включает последовательности предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) первого флавивируса, а также последовательности капсидного (С) и неструктурных белков второго флавивируса, отличающегося от первого.

10. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.9, в котором указанный первый флавивирус представляет собой вирус клещевого энцефалита или вирус Лангат.

11. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.9 или 10, в котором указанный второй флавивирус, отличающийся от первого, представляет собой вирус жёлтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила или вирус Лангат.

12. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-11, в котором указанный геном упакован в частицу, включающую последовательности предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) флавивируса, который является тем же самым или отличается от вируса генома.

13. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-12, в котором последовательности, кодирующие указанный иммуноген вируса бешенства, вставляют вместо одной или большего числа делеций или мутаций одного или большего числа белков или сочетаются в геноме с такими мутациями или делециями.

14. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-13, в котором последовательности, кодирующие указанный иммуноген вируса бешенства, вставляют в геном флавивируса в последовательности, кодирующие оболочечный белок (Е), в последовательности, кодирующие неструктурный белок 1 (NS1), в последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка (prM), межгенно между последовательностями, кодирующими оболочечный белок (Е) и неструктурный белок 1 (NS1), межгенно между последовательностями, кодирующими неструктурный белок 2В (NS2B) и неструктурный белок 3 (NS3), или в качестве бицистронной инсерции в нетранслируемой 3'-области генома флавивируса.

15. Композиция, включающая первый репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по пп.1-14 и второй репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус, отличающийся от первого, с геномом, включающим одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков, выбранных из группы, состоящей из капсидного белка С, предшественника мембранного белка (prM), оболочечного или капсульного белка (Е), неструктурного белка 1 (NS1), неструктурного белка 3 (NS3) и неструктурного белка 5 (NS5), причем один или большее число белков, кодируемых последовательностями, в которых произошла одна или большее число мутаций или делеций во втором репликационно-дефектном псевдоинфекционном флавивирусе, отличающемся от первого, отличаются от одного или большего числа белков, кодируемых последовательностями, в которых произошла одна или большее число делеций или мутаций в первом репликационно-дефектном псевдоинфекционном флавивирусе.

16. Способ индукции иммунного ответа на иммуноген вируса бешенства со стороны субъекта, включающий введение субъекту одного или большего числа репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов по любому из пп.1-14 и/или композиции по п.15.

17. Способ по п.16, в котором субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной вирусом бешенства.

18. Способ по п.16, в котором субъект имеет инфекцию, вызванную вирусом бешенства.

19. Применение репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14 или композиции по п.15 для индукции иммунного ответа на белок, закодированный в геноме флавивируса, в дополнение к источнику иммуногена.

20. Применение по п.19, в котором субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, включающего последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и/или оболочечный белок флавивируса.

21. Применение по п.19, в котором субъект имеет инфекцию, вызванную флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, включающего последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и/или оболочечный белок флавивируса.

22. Фармацевтическая композиция, включающая псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-14 или композицию по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

23. Фармацевтическая композиция по п.22, дополнительно включающая адъювант.

24. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14.

25. Способ получения репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты по п.24 в клетку, которая экспрессирует белок, соответствующий любым последовательностям, удалённым из генома репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса.

26. Способ по п.25, в котором белок экспрессируется в клетке из генома второго репликационно-дефектного флавивируса, отличающегося от первого вируса.

27. Способ по п.25, в котором белок экспрессируется из репликона.

28. Способ по п.27, в котором репликон представляет собой репликон альфа-вируса.

29. Способ по п.28, в котором альфа-вирус представляет собой вирус венесуэльского лошадиного энцефалита.

30. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус с геномом флавивируса, включающим одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков, выбранных из группы, состоящей из капсидного белка С, предшественника мембранного белка (prM), оболочечного или капсульного белка (Е), неструктурного белка 1 (NS1), неструктурного белка 3 (NS3) и неструктурного белка 5 (NS5), причем геном флавивируса содержит последовательности вируса лихорадки Западного Нила, в которых последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и последовательности, кодирующие сигнальную последовательность между капсидным белком и предшественником мембранного белка генома флавивируса, содержат последовательности, кодирующие сигнальную последовательность белков капсида/предшественника мембранного белка вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, или его вариант.

31. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.30, в котором последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса лихорадки Западного Нила замещены последовательностями, кодирующими предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита.

32. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.30 или 31, дополнительно содержащий транскрибируемый капсидный белок.

33. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.32, в котором капсидный белок представляет собой капсидный белок вируса лихорадки Западного Нила.

34. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.32, в котором капсидный белок продуцируется в упаковывающей линии клеток.

35. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.32, в котором капсидный белок закодирован в геноме второго флавивируса, содержащего одну или большее число делеций или мутаций.

36. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.30 или 31, в котором указанный вирус клещевого энцефалита представляет собой штамм Hypr.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

17. Способ по п.16, в котором субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной вирусом бешенства.

18. Способ по п.16, в котором субъект имеет инфекцию, вызванную вирусом бешенства.

23. Фармацевтическая композиция по п.22, дополнительно включающая адъювант.

24. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14.

27. Способ по п.25, в котором белок экспрессируется из репликона.

28. Способ по п.27, в котором репликон представляет собой репликон альфа-вируса.

29. Способ по п.28, в котором альфа-вирус представляет собой вирус венесуэльского лошадиного энцефалита.

Евразийское ои 023888 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. А61К39/12 (2006.01)
2016.07.29
(21) Номер заявки 201001491
(22) Дата подачи заявки 2009.03.16
(54) РЕПЛИКАЦИОННО-ДЕФЕКТНЫЕ ВАКЦИНЫ И ВАКЦИННЫЕ ВЕКТОРЫ ПРОТИВ ФЛАВИВИРУСОВ
(31) 61/069,451; 61/092,814
(32) 2008.03.14; 2008.08.29
(33) US
(43) 2011.06.30
(86) PCT/US2009/001666
(87) WO 2009/114207 2009.09.17
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
САНОФИ ПАСТЕР
БАЙОЛОДЖИКС, ЛЛС (US)
(72) Изобретатель:
Пугачев Константин В., Румянцев Александр А., Гил-Молони Мэриэнн, Клеантус Харольд (US)
(74) Представитель:
Дементьев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20070249032 US-A1-20060159704 US-A1-20040223979 WO-A1-2006086838 US-A1-20070218078 US-A1-20010046499
Shustov et al. "Production of pseudoinfectious yellow fever virus with a two-component genome", J. Virology, 2007, v. 81, p. 11737-11748; abstract
(57) Изобретение относится к репликационно-дефектным вакцинам и вакцинным векторам против флавивирусов, а также к соответствующим композициям и методам.
Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к репликационно-дефектным вакцинам и вакцинным векторам против флавивирусов, а также к соответствующим композициям и методам.
Предпосылки создания изобретения
Флавивирусы распространены по всему миру и представляют собой глобальную проблему для здоровья людей. Кроме того, флавивирусы являются значимыми патогенами в ветеринарии. К патогенным флавивирусам относятся вирус жёлтой лихорадки (ВЖЛ), вирус лихорадки денге типов 1-4 (ДЕН 1-4), вирус японского энцефалита (ВЯЭ), вирус лихорадки Западного Нила (ВЛЗН), вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и другие вирусы из серокомплекса ВКЭ, такие как вирус лихорадки кьясанурского леса (ВЛКЛ) и вирус омской геморрагической лихорадки. Разработаны вакцины против жёлтой лихорадки (ЖЛ) [живая аттенуированная вакцина (ЖАВ), вакцинный штамм 17D], японского энцефалита (ЯЭ) [инактивированные вакцины (ИНВ) и ЖАВ] и клещевого энцефалита (ИНВ). В настоящее время лицензированных вакцин для применения у человека против лихорадки денге (ДЕН) и лихорадки Западного Нила (ЛЗН) не существует. Некоторые вакцины применяются в ветеринарии. К таким вакцинам относятся вакцины против ЛЗН у лошадей (ИНВ, рекомбинантные и химерические вакцины) и ЯЭ (ИНВ и ЖАВ), которая используется для профилактики энцефалита у лошадей и мертворождения у свиней в Азии, шотландского энцефаломиелита овец (ИНВ), которая используется для профилактики неврологического заболевания у овец в Соединенном Королевстве, а также вакцина против КЭ (ИНВ), которая используется у сельскохозяйственных животных в Чешской Республике (ИНВ) (Monath and Heinz, Flaviviruses, in Fields et al. Eds., Fields Virology, 3rd Edition, Philadelphia, New York, Lippincott-Raven Publishers, 1996, p. 961-1034).
Самым важным из вирусных заболеваний человека, передающихся клещами, является клещевой энцефалит. Это заболевание эндемично для некоторых районов Европы и Северной Америки. Оно обусловливает более 10000 госпитализаций ежегодно; смертность в Европе составляет 0,5-1,5%, а в Сибири и на Дальнем Востоке достигает 6-40%. Значительная часть пациентов страдает от длительных неврологических и психиатрических последствий этой инфекции. Доказана эффективность профилактики этого заболевания с помощью инактивированных вакцин, создаваемых на клеточных культурах куриных эмбрионов. Например, вакцинация 86% населения Австрии (самый высокий показатель в Европе) привела к снижению частоты госпитализаций, примерно на 90% (Heinz and Kunz, Arch. Virol. Suppl. 18:201-205, 2004). Инактивированные вакцины дороги и требуют трёхкратного введения для первичной иммунизации. Для поддержания иммунитета требуется периодическая ревакцинация (каждые 2 года - 5 лет). Поэтому необходима менее дорогая вакцина против КЭ, которая была бы эффективной после одного-двух введений и создавала бы длительный, желательно пожизненный, иммунитет (такой как создаётся при иммунизации против ЖЛ 17D). Эта необходимость признаётся ВОЗ в качестве основного приоритета. При разработке кандидатов на звание ЖАВ против КЭ в последние несколько десятилетий посредством эмпирического или рационального ослабления родительского вируса КЭ, как такового, или путём химе-ризации ВКЭ или вируса Лангат (естественно ослабленного (аттенуированного) флавивируса, который серологически тесно связан с вирусом КЭ) с вирусом Денге 4 возникли определённые трудности. Они были связаны с проблемой остаточной вирулентности кандидатов и/или низкой иммуногенностью либо с чрезмерным ослаблением вируса (Wright et al., Vaccine, 26:882-890, 2008; Maximova et al., J. Virol. 82:5255-5268, 2008; Rumyantsev et al., Vaccine, 24:133-143, 2006; Kofler et al., Arch. Virol. Suppl. 18:191200, 2004; а также ссылки, указанные в этих источниках).
Флавивирусы - это мелкие оболочечные вирусы с РНК "плюс-цепь", которые передаются естественным хозяевам через членистоногих (комаров или клещей). Естественными хозяевами, главным образом, являются позвоночные животные, например различные млекопитающие, включая человека, а также птицы. Молекула РНК, составляющая геном флавивируса, содержит около 11000 нуклеотидов и включает в себя длинную открытую рамку считывания (ОРС). Нетранслируемые конечные области генома (3'-конец и 5'-конец) включают 120 и 500 нуклеотидов соответственно. ОРС кодирует предшественник полипротеина, который расщепляется во время и после трансляции на отдельные протеины вируса. Протеины закодированы в следующем порядке: C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5, где С (нук-леокапсидный белок), prM/М (предшественник мембранного белка и мембранный белок) и Е (капсуль-ный, или оболочечный, белок) являются структурными белками, т.е. компонентами вирусных частиц, а белки NS представляют собой неструктурные белки, которые участвуют во внутриклеточной репликации вируса. Репликация флавивирусов проходит в цитоплазме клеток хозяина. После инфицирования клеток и трансляции РНК генома вируса начинается процессинг полипротеина. Происходит транслокация (перемещение) участка полипротеина prM в просвет эндоплазматической сети (ЭПС) инфицированных клеток, а затем - транслокация участков Е и NS, которая направляется гидрофобными сигналами для белков prM, Е и NS1. N-концевые участки белков prM, Е и NS1 образуются в результате расщепления клеточной сигналазой, которая располагается в мембране ЭПС со стороны просвета. Получающиеся в результате расщепления отдельные белки остаются заякоренными в мембрану ЭПС своими С-концевыми участками. Большая часть других реакций расщепления, затрагивающих неструктурную область, осуществляется вирусной сериновой протеазой NS2B/NS3. Вирусная протеаза также отвечает за
формирование С-концевых участков зрелого белка С, который входит в состав вирионов потомства. Синтезированные молекулы РНК генома вируса и белок С образуют плотный нуклеокапсид сферической формы, который окружается клеточной мембраной, в которую погружены белки Е и prM. Зрелый белок М образуется в результате расщепления белка prM незадолго до высвобождения вирусов с помощью клеточного фермента фурина или аналогичной протеазы. Основной белок оболочки вируса, белок Е, является главной мишенью нейтрализующих антител - основного коррелята иммунитета против флавиви-русной инфекции. Другим важным элементом иммунитета является ответ со стороны вирусспецифичных цитотоксичных Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Для различных структурных и неструктурных белков флавивиру-сов описано большое число эпитопов для CD8+ и CD4+ ЦТЛ. Кроме того, ответ со стороны системы врождённого иммунитета также приводит к расщеплению вирусных частиц и участвует в регуляции развития приобретённого иммунитета и иммунологической памяти.
В дополнение к инактивированным (ИНВ) и живым аттенуированным вакцинами (ЖАВ) против флавивирусов, которые упоминались выше, разработаны и другие платформы для вакцин. Один из примеров таких платформ основан на химерических флавивирусах, которые включают нуклеокапсид вируса жёлтой лихорадки и неструктурные последовательности и белки prME других флавивирусов, к которым предполагается развитие иммунитета. Эта технология использовалась для разработки вакцины против вирусов лихорадки денге (ДЕН), японского энцефалита (ЯЭ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и энцефалита Сент-Луис (ЭСЛ) (см., например, патенты США № 6962708 и 6696281). Клинические исследования химерических флавивирусов, основанных на вирусе жёлтой лихорадки, дали многообещающие результаты.
Другая платформа для создания вакцин основана на использовании технологии псевдоинфекционных вирусов (ПИВ) (Mason et al., Virology, 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007; Widman et al., Adv. Virus. Res. 72:77-126, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine, 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008). ПИВ - это репликационно-дефектные вирусы, ослабленные делециями генома. В отличие от живых вакцин против флавивирусов, эти вирусы осуществляют только один цикл репликации в живом организме (или как вариант - ограниченное число репликационных циклов; это касается двух-компонентных конструкций, см. далее), что предоставляет определённые преимущества в плане безопасности. ПИВ также не приводят к развитию виремии и системной инфекции. Более того, в отличие от инактивированных вакцин, ПИВ имитируют инфекцию, вызванную интактными вирусными частицами, что может привести к повышению эффективности вакцины вследствие индукции выраженного ответа со стороны Т- и В-клеток, большей длительности иммунитета, а также к снижению необходимой дозы вакцины. Как и в случае интактных вирусов, вакцины на основе ПИВ являются мишенью для антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки, стимулируют колоколоподобные рецепторы (КПР) и вызывают развитие сбалансированного ответа со стороны Т-хелперов-1/Т-хелперов-2 (Тх-1/Тх-2). Кроме того, было показано, что конструкции ПИВ в клетках субстрата культивируются в большем титре, обладают слабым цитопатическим эффектом (ЦПЭ) или вообще лишены его, что позволяет организовать их производство с высоким выходом, возможностью нескольких сборов и/или размножения инфицированных клеток субстрата.
Принципы технологии ПИВ представлены на фиг. 1 и 2. Существует два варианта этой технологии. В первом варианте создаётся однокомпонентный псевдоинфекционный вирус (о-ПИВ), который характеризуется большой делецией в гене нуклеокапсидного белка С. Этот мутантный вирус не способен к образованию инфекционных вирусных частиц в здоровых клетках. Делеция не затрагивает первые ~20 кодонов белка С, которые содержат последовательность циклизации РНК, а также аналогичное число кодонов в конце белка С, которые кодируют сайт расщепления вирусной протеазой и сигнальный пептид для prM. Число о-ПИВ может увеличиваться, например, во время производства в клеточных культурах субстрата (во вспомогательных культурах), в которых происходит транскрипция белка С, например, в стабильно трансфицированных клетках, образующих белок С (или более крупные кассеты вспомогательных молекул, включающие белок С), или в клетках, содержащих репликоны альфа-вируса [например, репликон венесуэльского лошадиного энцефалита (ВЛЭ)], которые экспрессируют белок С, или другие внутриклеточные векторы экспрессии, которые экспрессируют белок С. После введения ПИВ в живой организм, например после иммунизации, эти вирусы осуществляют один цикл репликации в отсутствие транскомплементации делеции и не распространяются в окружающие клетки. В инфицированных клетках образуются пустые вирусоподобные частицы (ВПЧ), являющиеся продуктом генов prME ПИВ. Эти частицы приводят к индукции ответа со стороны нейтрализующих антител. Индукция ответа со стороны Т-клеток происходит через презентацию вирусных эпитопов с молекулами главного комплекса гисто-совместимости класса Т. Этот подход был применён к вирусу ЖЛ 17D, вирусам ЛЗН, а также химерическим вирусам ЛЗН/ЯЭ и ЛЗН/ДЕН2 (Mason et al., Virology, 351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine, 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine, 26:2762-2771, 2008; WO 2007/098267; WO 2008/137163).
Во втором варианте создаётся двухкомпонентный ПИВ (д-ПИВ) (фиг. 2). Клетки субстрата транс-фицируются двумя дефектными вирусными РНК: одной - с делецией в гене С и другой - с делецией ге
нов оболочечных белков prM и Е. Два дефектных генома дополняют друг друга, что приводит к накоплению двух типов ПИВ в клеточной культуральной среде (Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008). Как вариант, возможно раздельное производство двух ПИВ в соответствующих вспомогательных клеточных линиях и последующее смешивание с получением двух-компонентного состава. Последний вариант обладает некоторым преимуществом: существует возможность корректировки относительных концентраций двух компонентов, что приводит к увеличению им-муногенности и эффективности вакцины. Этот вид вакцины на основе ПИВ должен характеризоваться ограниченным распространением в живом организме, вследствие коинфицирования некоторых клеток в месте заражения обоими компонентами. Считается, что распространение вирусов будет самоограничивающимся, так как число клеток в тканях превышает число вирусных частиц, выделяемых первоначально коинфицированными клетками. Кроме того, для достаточного коинфицирования необходимо относительное высокое содержание частиц инфицирования (ЧИ) и считается, что клетки вне места введения вакцины не подвергаются коинфицированию (например, клетки дренирующих лимфатических узлов). Клетки, инфицированные только ПИВ ЛС, выделяют высокоиммуногенные ВПЧ. Коинфцированные клетки выделяют два вида упакованных дефектных вирусных частиц, которые также стимулируют образование нейтрализующих антител. Считается, что ограниченная инфекция проводит к более выраженному ответу со стороны нейтрализующих антител и Т-клеток, чем о-ПИВ. Для снижения вероятности рекомбинации во время производства вакцины или в живом организме, включая рекомбинацию с циркулирующими флавивирусами, вирусные последовательности в о-ПИВ и д-ПИВ могут быть модифицированы с помощью, например, замещений синонимичных кодонов, что позволит снизить гомологию нуклео-тидных последовательностей, а также мутаций комплементарной циклизации 5'-концевых и 3'-концевых элементов.
Сущность изобретения
В изобретении представлены репликационно-дефектные или дефектные псевдоинфекционные фла-вивирусы, в том числе геном флавивируса, который включает (i) одну или большее число делеций или мутаций в последовательности нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5), а также (ii) последовательности, которые кодируют один или большее число гетерологич-ных патогенов или иммуногенов, имеющих отношение к раку или аллергии. Например, делеция/мутация может затрагивать последовательности гена нуклеокапсидного белка С; последовательности генов предшественника мембранного белка (prM) и/или оболочечного белка (Е); последовательности генов предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е); последовательности неструктурного белка 1 (NS1).
Гетерологичный иммуноген может быть получен, например, из следующих патогенов: вируса бешенства (например, эпитопа белка G вируса бешенства), Borrelia burgdorferi (например, иммуногена OspA или иммуногенного фрагмента этого патогена), клеща (например, белка слюны клеща, представленного одним из следующих белков: 64TRP, Isac и Salp20 - или иммуногенными фрагментами этих белков), вируса гриппа (например, вируса гриппа М2, эпитопов гемагглютинина (ГА), или нейраминидазы (НА), или иммуногенного фрагмента этих патогенов), вируса иммунодефицита человека (например, ко-дон-оптимизированного белка ВИЧ gag, tat/nef и gp120 или иммуногенных фрагментов этих белков), вируса папилломы человека (например, нуклеокапсидных белков ВПЧ16 или ВПЧ18 L1, L2 или иммуно-генных фрагментов этих белков), респираторно-синцитиального вируса (например, гликопротеина F или G респираторно-синцитиального вируса), паразита малярии и Mycobacterium tuberculosis (см. также ниже).
К репликационно-дефектным псевдоинфекционным флавивирусам могут относиться последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка (prM) и/или оболочечный белок (Е). Кроме того, геном репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса может быть представлен геномом вируса жёлтой лихорадки, вируса Западного Нила, вируса клещевого энцефалита, вируса Лан-гат, вируса японского энцефалита, вируса лихорадки денге, вируса энцефалита Сент-Луиса, аттенуиро-ванными штаммами этих вирусов, а также химерами этих вирусов (также см. ниже). К примерам химер относятся последовательности генов предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) первого флавивируса (например, вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат) и последовательности генов нуклеокапсидного белка (С) и неструктурных белков второго флавивируса, отличающегося от первого (например, вируса жёлтой лихорадки, вируса лихорадки Западного Нила или вируса Лангат).
Геном репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса может быть упакован в частицы, включающие последовательности предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) этого же или другого флавивируса. Кроме того, последовательности, кодирующие гетерологичные иммуногены, могут быть вставлены в геном вместо делеций или мутаций в генах одного или большего числа белков, а также включаться в геном в сочетании с такими мутациями или делециями.
Последовательности, кодирующие гетерологичные иммуногены, могут быть вставлены в геномы флавивирусов в последовательности, кодирующие оболочечный белок (Е), в последовательности, коди
рующие неструктурный белок 1 (NS1), в последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка (prM), между последовательностями, кодирующими оболочечный белок (Е) и неструктурный белок 1 (NS1), между последовательностями, кодирующими неструктурный белок 2В (NS2B) и неструктурный белок 3 (NS3) и/или иметь вид бицистронной инсерции в нетранслируемой 3'-концевой области генома флавивируса.
В изобретении также представлены составы, включающие первый репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус, как это описано выше, и второй (третий, четвёртый, ...) репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус, отличающийся от первого, геном которого включает одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5). В этих составах один или большее число белков, кодируемых последовательностями, в которых произошли мутации или делеции, второго репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса, отличаются от одного или большего числа белков, кодируемых последовательностями, в которых произошли делеции, первого репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса, отличающегося от второго вируса.
В изобретении также представлены методы индукции иммунного ответа на иммуноген со стороны субъекта, которые включают введение субъекту одного или большего числа репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов и/или составов, как это описано в настоящем изобретении. В различных примерах реализации изобретения субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной этим патогеном, а также заболевания или состояния, связанного с иммуногеном, имеющим отношение к раку или аллергии. В других примерах реализации изобретения у субъекта имеется инфекция, вызванная этим патогеном, или заболевание или состояние, связанное с иммуногеном, имеющим отношение к раку или аллергии. Таким образом, изобретение включает профилактические и лечебные методы. В этих методах иммуноген может быть получен из одного из следующих патогенов: вируса бешенства, Borrelia burgdorferi, клеща, вируса гриппа, вируса иммунодефицита человека, вируса иммунодефицита обезьян, вируса папилломы человека, респираторно-синцитиального вируса, паразита малярии и My-cobacterium tuberculosis (также см. ниже). Кроме того, эти методы могут быть использованы для индукции иммунного ответа на белок, закодированный в геноме флавивируса, в дополнение к источнику им-муногена. В различных реализациях изобретения субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, который включает последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и/или оболочечный белок флавивируса. В других примерах реализации изобретения у субъекта имеется инфекция, вызванная флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, который включает последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и/или оболочечный белок фла-вивируса.
В настоящем изобретении также представлены живые, аттенуированные химерические флавивиру-сы, в том числе вирус жёлтой лихорадки, в котором последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и сигнальная последовательность между генами нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка химерического флавивируса включает гибрид сигнальных последовательностей нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка вируса жёлтой лихорадки и вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, а также варианты этих последовательностей. В различных примерах реализации изобретения сигнальная последовательность нуклеокапсидного белка/предшественника мембранного белка химерического флавивируса включает последовательности N-конечной области вируса жёлтой лихорадки и последовательности С-концевой области вирусов клещевого энцефалита или вируса Лангат (см. ниже).
В настоящем изобретении также представлены живые, аттенуированные химерические флавивиру-сы, в том числе вирус лихорадки Западного Нила, в котором последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественника мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и сигнальная последовательность между генами нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка химерического флавивируса включает гибрид сигнальных последовательностей нук-леокапсидного белка и предшественника мембранного белка вируса жёлтой лихорадки и вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, а также варианты этих последовательностей. В изобретении также представлены фармацевтические составы, включающие один или большее число флавивирусов, составов или живых аттенуированных флавивирусов, описанных в настоящем изобретении, и фармакологически приемлемый носитель или растворитель. Кроме того, составы могут включать адъюванты, или вспомогательные вещества.
В изобретении также представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, включающим одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклео
тидов, кодирующих неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) или неструктурный белок 5 (NS5).
Кроме того, в изобретении представлены молекулы нуклеиновых кислот, соответствующих геному псевдоинфекционных флавивирусов или геному живых аттенуированных флавивирусов, описанных в настоящем изобретении, а также комплементарные молекулы.
В изобретении также представлены методы получения репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов (описаны ниже), включающие введение одной или большего числа молекул нуклеиновых кислот, упомянутых выше, в клетку, которая экспрессирует белки, соответствующие последовательностям, удалённым из генома флавивирусов репликационно-дефектных псевдоинфекционных вирусов. Согласно этим методам белок может экспрессироваться клеткой из генома второго (третьего, четвёртого, ...) репликационно-дефектного флавивируса, отличающегося от первого вируса. В других примерах реализации изобретения белок экспрессируется из репликона (например, репликона альфа-вируса, такого как репликон вируса венесуэльского лошадиного энцефалита; см. ниже).
В настоящем изобретении также представлены составы из двух или большего числа репликацион-но-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов, в которых два репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивируса - это вирусы из следующей группы: (а) репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса японского энцефалита, и репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса лихорадки денге; (b) репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса жёлтой лихорадки, и репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса лихорадки денге; (с) репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат и вставленные в этот геном последовательности, кодирующие иммуноген Borrelia burgdorferi, и репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат и вставленные в этот геном последовательности, кодирующие иммуноген белка слюны клеща, или репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат со вставленными в этот геном последовательностями, кодирующими иммуноген Borrelia burgdorferi и иммуноген белка слюны клеща.
В настоящем изобретении также представлены фармацевтические композиции, включающие описанные здесь живые аттенуированные химерические флавивирусы. Кроме того, в изобретении представлены методы индукции иммунного ответа на вирус клещевого энцефалита или вирус Лангат со стороны субъекта, включающие введение этому субъекту такой фармацевтической композиции. В различных примерах реализации изобретения субъект подвержен риску заражения, однако у него нет инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита или вируса Лангат. В других примерах реализации изобретения субъект инфицирован вирусом клещевого энцефалита или вирусом Лангат.
В настоящем изобретении, кроме того, представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом флавивируса, включающего одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсуль-ный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5). Геном флавивируса в этих случаях включает последовательности вируса жёлтой лихорадки, причём последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественника мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и последовательности, кодирующие сигнальную последовательность между белками нуклеокапсида и предшественником мембранного белка генома фла-вивируса, включают гибрид последовательностей, кодирующих сигнальные последовательности белков нуклеокапсида/предшественника мембранного белка вируса жёлтой лихорадки и вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат или варианты этих последовательностей. В различных примерах последовательности, кодирующие сигнальную последовательность нуклеокапсидного белка/предшественника мембранного белка генома флавивируса, включают последовательности 5'-конечной области вируса жёлтой лихорадки и последовательности 3'-конечной области вирусов клещевого энцефалита или вируса Лангат.
Кроме того, в настоящем изобретении представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом флавивируса, включающего одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсуль-ный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5). Геном флавивируса в этих случаях включает последовательности вируса лихорадки Западного Нила, причём последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественника мембранного белка и оболо-чечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и последовательности, кодирующие сиг
нальную последовательность между белками нуклеокапсида и предшественником мембранного белка генома флавивируса, включают последовательности, кодирующие сигнальную последовательность белков нулеокапсида/предшественника мембранного белка вируса клещевого энцефалита или вируса Лан-гат, или варианты этих последовательностей.
Кроме того, в изобретении представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флави-вирусы, в том числе геном флавивируса, который включает одну или большее число делеций или мутаций в последовательности нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5), где любой белок из группы, состоящей из нуклеокапсидного белка (С) и неструктурных белков (NS), в геноме флавивируса принадлежит вирусу Лангат, а любой из предшественников мембранного белка (prM) или оболочечный белок (Е) принадлежит вирусу клещевого энцефалита.
Под термином "репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус", или "ПИВ", подразумевается флавивирус с недостаточностью репликации вследствие делеции или мутации в геноме фла-вивируса. Эта делеция или мутация может являться, например, делецией большой последовательности, такой как большая часть гена нуклеокапсидного белка, что описано в настоящем изобретении (с циклизацией оставшейся последовательности; см. ниже). В других примерах делеции подвержены последовательности, кодирующие различные белки (например, prM, Е, NS1, NS3, и/или NS5; см. ниже) или комбинации белков (например, prME или CprME). Этот вид делеции может предоставлять некоторые преимущества, если ПИВ используется в качестве вектора для введения гетерологичного иммуногена, так как делеция создаёт условия для инсерции последовательности, которая может, например, достигать размера последовательности, затронутой делецией. В других примерах реализации изобретения мутация может быть, например, точечной мутацией, что может приводить к недостаточности репликации, как это указывалось выше. Вследствие делеции или мутации геном не кодирует все белки, необходимые для создания полноценных вирусных частиц. Отсутствующие последовательности могут транскрибироваться в комплементарных клеточных линиях, созданных методами генной инженерии для экспрессии отсутствующих последовательностей (например, с помощью репликона; о-ПИВ; см. ниже), или путём коэкспрессии двух репликационно-дефектных геномов в одной клетке, когда два репликационно-дефектных генома вместе взятых кодируют все белки, необходимые для создания вирусных частиц (система д-ПИВ; см. ниже).
После введения в клетки, которые не экспрессируют комплементарные белки, геномы реплицируются и в определённых условиях образуют "вирусоподобные частицы", которые высвобождаются из клеток. Эти частицы способны покинуть клетку, обладают иммуногенностью, но не могут инфицировать другие клетки и приводить к образованию потомства. Например, в случае ПИВ с делецией последовательности, кодирующей нуклеокапсидный белок, после инфицирования клеток нуклеокапсид не экспрес-сируется, и из клеток выделяются ВПЧ, содержащие белки prME. По причине отсутствия белка нуклео-капсида ВПЧ лишены нуклеокапсида и не имеют генома (нуклеиновой кислоты). В случае д-ПИВ возможно образование ПИВ в клетках, инфицированных двумя видами ПИВ, являющимися комплементарными друг к другу в отношении образования всех необходимых белков (см. ниже).
Настоящее изобретение обладает определёнными преимуществами. Например, векторы ПИВ и ПИВ, представленные в настоящем изобретении, - сильно ослабленные вирусы, которые после введения одной-двух доз эффективно обеспечивают развитие длительного иммунитета. Более того, в отличие от инактивированных вакцин, ПИВ имитируют инфекцию, вызванную интактными вирусными частицами, что может привести к повышению эффективности вакцины вследствие индукции выраженного ответа со стороны Т- и В-клеток, большей длительности иммунитета, а также к снижению необходимой дозы вакцины. Кроме того, как и в случае интактных вирусов, вакцины на основе ПИВ являются мишенью для антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, стимулируют колоколоподобные рецепторы (КПР) и вызывают развитие сбалансированного ответа со стороны Т-хелперов-1/Т-хелперов-2 (Тх-1/Тх-2). Было показано, что конструкции ПИВ в клетках субстрата культивируются в большем титре, обладают слабым цитопатическим эффектом (ЦПЭ) или вообще лишены его, что позволяет организовать их производство с высоким выходом, возможностью нескольких сборов и/или размножения инфицированных клеток субстрата. Кроме того, векторы ПИВ, представленные в настоящем изобретении, предоставляют возможность разработки вакцин к патогенам, не являющимся флавивирусами, для которых вакцин в настоящее время не существует.
Другие свойства и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты далее при более подробном описании изобретения, в пунктах формулы изобретения и фигурах.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - схематическое изображение технологии однокомпонентных ПИВ (о-ПИВ).
Фиг. 2 - схематическое изображение технологии двухкомпонентных ПИВ (Д-ПИВ).
Фиг. 3 - схематическое изображение общего дизайна эксперимента исследования иммуногенности и эффективности ПИВ у мышей.
Фиг. 4 - схема, на которой показано сравнение иммунного ответа, вызываемого ПИВ ЛЗН (ВБ-ЛЗН - вакциной на основе вируса бешенства против лихорадки Западного Нила), и иммунного ответа, вызываемого ЖАВ против ЖЛ/ЛЗН (ХВ-ЛЗН - химерической вакциной против жёлтой лихорадки и лихорадки Западного Нила) у мышей.
Фиг. 5 - схемы, на которых представлены результаты инфицирования хомяков, иммунизированных ПИВ-ЖЛ (ВБ-ЖЛ), ЖЛ17Б, ПИВ-ЛЗН (ВБ-ЛЗН) и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН (ХВ-ЛЗН), адаптированным к хомякам штаммом Asibi (вакцины ПИВ-ЖЛ и ЖЛ17Б) и диким типом вируса ЛЗН (штамм NY99) (вакцины ПИВ-
ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН).
Фиг. 6 - таблица, в которой приведены титры вирусов ЖЛ/КЭ и ЖЛ/ЛГТ (Лангат) и описана морфология бляшек, которые получаются с указанными химерическими флавивирусами.
Фиг. 7 - таблица, в которой приведены титры ПИВ ЛЗН/КЭ и показаны примеры иммунофлуорес-ценции клеток, содержащих указанные ПИВ.
Фиг. 8 - схемы, на которых показана кинетика репликации ЖАВ ЖЛ/КЭ и ПИВ-ЛЗН/КЭ в клеточных линиях Vero и ПДХ (почек детёнышей хомяков) (ХВ-Hypr = ЖАВ ЖЛ/Hypr; ХВ-ЛГТ = ЖАВ ЖЛ/ЛГТ; ВБ-ЛЗН/ВКЭ = ПИВ-ЛЗН/ВКЭ).
Фиг. 9 - схемы, на которых показана выживаемость мышей, инфицированных внутрикожно ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ в тесте нейровирулентности (мыши ICR в возрасте 3,5 недели; ВБ-ЛЗН/Hypr = ПИВ-ЛЗН/КЭ(Hypr); ХВ-Hypr = ЖАВ ЖЛ/КЭ(Hypr); ХВ-ЛГТ = ЖАВ ЖЛ/ЛГТ).
Фиг. 10 - схемы, на которых показана выживаемость мышей, инфицированных внутрибрюшинно конструкциями ПИВ-ЛЗН/КЭ(Hypr) (ВБ-ЛЗН/Hypr), ЖАВ ЖЛ/КЭ(Hypr) (ХВ-Hypr) и ЖАВ ЖЛ/ЛГТ (ХВ-ЛГТ) и ЖЛ17Б в тесте нейровирулентности (мыши ICR в возрасте 3,5 недели).
Фиг. 11 - схемы, на которых показана заболеваемость у мышей, которую отражает динамика потери массы тела после инфицирования вирусом КЭ. Показаны результаты для групп, иммунизированных о-ПИВ-КЭ (верхняя левая часть фигуры), химерическими вирусами ЖЛ/КЭ и ЖЛ/ЛГТ (верхняя правая часть фигуры) и контрольной группы (ЖЛ 17D, человеческой убитой вакциной против КЭ и имитацией вакцины; нижняя часть фигуры).
Фиг. 12 - схематическое изображение конструкций ПИВ, которые экспрессируют белок G вируса бешенства, а также изображение упаковки конструкций с образованием псевдоинфекционного вируса и иммунизации.
Фиг. 13 - схематическое изображение инсерций, провидящих к получению жизнеспособ-ных/экспрессирующих конструкций (на примере белка G вируса бешенства).
Фиг. 14 - изображения, показывающие результат иммунофлуоресцентного анализа, и схемы, показывающие кривые роста клеток, трансфицированных указанными конструкциями ПИВ-ЛЗЩДС-G вируса бешенства, ДprM-E-G вируса бешенства и ДCprME-G вируса бешенства).
Фиг. 15 - изображения, показывающие результат иммунофлуоресцентного анализа RabG, который экпрессируется в клетках культуры Vero, трансфицированных конструкциями ПИВ (ДС-G вируса бешенства, ДprM-E-G вируса бешенства и ДС-PrM-E-G вируса бешенства).
Фиг. 16 - схематическое изображение конструкции ПИВ-ЛЗН-G вируса бешенства и изображения, на которых показано, что эта конструкция распространяется во вспомогательных клетках, но не в обычных клетках.
Фиг. 17 - схемы, на которых показана стабильность гена белка G вируса бешенства в векторах
ПИВ-ЛЗН.
Фиг. 18 - изображения, показывающих распространение однокомпонентных и двухкомпонентных вариантов ПИВ-ЛЗН-G вируса в клетках культуры Vero.
Фиг. 19 - изображения анализа иммунофлуоресценции, который показывает экспрессию полномерного белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ) (штамм А2) компонентом ДprME д-ПИВ-ЛЗН во вспомогательных клетках после трансфекции.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении представлены векторы на основе репликационно-дефектных или дефектных псевдоинфекционных вирусов (ПИВ), включающие последовательности флавивирусов, которые могут быть использованы для индукции иммунитета против гетерологичных патогенов и иммуногенов, имеющих отношение к раку или аллергии, которые вставляются в векторы, а также, возможно, против самих векторов. В изобретении также представлены составы, включающие сочетание ПИВ и/или векторов на основе ПИВ, как это описано ниже, а также методов использования таких составов для индукции иммунного ответа против вставленных последовательностей иммуногенов и/или последовательностей самих
ПИВ. Кроме того, в изобретении представлены конкретные ПИВ и живые аттенуированные химерические флавивирусы, включающие последовательности вируса клещевого энцефалита, и связанные с этими вирусами векторы, составы и методы их использования. Описание векторов на основе ПИВ, ПИВ и живых аттенуированных химерических флавивирусов, составов и методов настоящего изобретения приводится ниже.
Векторы на основе ПИВ и ПИВ.
Векторы на основе ПИВ и ПИВ, представленные в настоящем изобретении, могут основываться на одно- и двухкомпонентных ПИВ, описанные выше (см. также изобретения WO 2007/098267 и WO 2008/137163). Например, в случае однокомпонентных ПИВ, векторы на основе ПИВ и ПИВ могут включать геном, имеющий большую делецию в последовательности, кодирующей белок нуклеокапсида, и образовываться в комплементарной клеточной линии, в которой также образуется нуклеокапсидный белок (однокомпонентный ПИВ, фиг. 1 и 12). В соответствии с этим подходом делеции подвергается большая часть области генома, кодирующей нуклеокапсидный белок, что не допускает образования инфекционного потомства в обычных здоровых клеточных линиях (т.е. клеточных линиях, не экспресси-рующих последовательность нуклеокапсида) и у вакцинированных субъектов. Делеция гена нуклеокап-сида обычно не нарушает целостность последовательности РНК, необходимой для циклизации генома (т.е. последовательности, кодирующей аминокислоты в области позиций 1-26) и/или последовательности prM (предшественника мембранного белка), необходимой для созревания prM в М (мембранный белок). В определённых примерах реализации изобретения удалённые последовательности соответствуют последовательностям, кодирующим аминокислоты 26-100, 26-93, 31-100 или 31-93 белка С (нуклеокапси-да).
В клеточных линиях, экспрессирующих С или кассету CprME, может происходить размножение векторов на основе однокомпонентных ПИВ или ПИВ, которые реплицируются в таких линиях в большом количестве. Примерами клеточных линий, которые могут быть использованы для экспрессии векторов на основе однокомпонентных ПИВ и ПИВ, могут служить клеточные линии ПДХ-21 (почек детёнышей хомяков) (например, АТСС CCL-10), Vero (например, АТСС CCL-81), C7/10 и другие клетки позвоночных и комаров. В таких клетках могут экспрессироваться белок С или кассета CprME благодаря применению репликона из вирусного вектора, такого как репликон альфа-вируса (например, репликона, основанного на вирусе венесуэльского лошадиного энцефалита (ВВЛЭ), вирусе лихорадки Синдбис, вирусе леса Семлики (ВСЛ), вирусе восточного лошадиного энцефалита (ВВоЛЭ), вирусе западного лошадиного энцефалита (ВЗЛЭ) или вирусе лихорадки реки Росс). Для снижения вероятности продуктивной рекомбинации между векторами на основе ПИВ/ПИВ и комплементарными последовательностями последовательности в репликонах (кодирующие белки С, prM и/или Е) могут включать мутации нуклеоти-дов. Например, последовательности, кодирующие комплементарный белок С, могут включать ненормальную последовательность циклизации. Мутации могут соответствовать оптимизации кодона, что может предоставить дополнительное преимущество в отношении выхода ПИВ. Кроме того, в случае комплементарных клеток, экспрессирующих последовательности белка С (и кассеты CprME), может оказаться полезным включить якорную последовательность в С-концевую область белка С, включающую, например, около 20 аминокислот prM (см., например, изобретение WO 2007/098267).
Векторы на основе ПИВ и ПИВ, представленные в настоящем изобретении, также могут быть основаны на технологии двухкомпонентного генома, которая описана выше. Эта технология предполагает использование двух частичных конструкций генома, каждая из которых характеризуется дефектом экспрессии по меньшей мере одного белка, необходимого для продуктивной репликации (нуклеокапсидного или prM/Е). Однако если эти геномы присутствуют в одной и той же клетке, то это приводит к образованию всех компонентов, необходимых для создания ПИВ. В одном из примеров технологии двухкомпо-нентного генома первый компонент имеет большую делецию гена С, как это описано выше для одно-компонентных ПИВ, а второй компонент имеет делецию prM и Е (фиг. 2 и 12). В другом примере реализации изобретения первый компонент имеет делецию С, prM и Е, а второй компонент - делецию NS1 (фиг. 12). Оба компонента могут включать цис-элементы промотора, необходимые для репликации РНК, и полный набор неструктурных белков, которые образуют комплекс репликативных ферментов. Таким образом, оба дефектных генома могут включать 5'-концевую нетранслируемую область и по меньшей мере около 60 нуклеотидов (элемент 1) следующей естественной последовательности, кодирующей белок, которая составляет N-концевой фрагмент белка нуклеокапсида. За этой последовательностью может
следовать последовательность расщепления протеазой, такая, как, например, последовательность убихи-тина или протеазы 2А, специфичной к вирусу ящура, которая может сливаться с последовательностями, кодирующими белок нуклеокапсида или оболочки (prME). Кроме того, для исключения возможности рекомбинации между двумя дефектными вирусными геномами, что могло бы привести к образованию репликационно-компетентного вируса, могут использоваться искусственные кодон-оптимизированные последовательности (см., например, WO 2008/137163). Подход с двухкомпонентным геномом не требует создания клеточных линий, экспрессирующих комплементарные геномы, таких как клетки, трансформированные с помощью репликонов, как это описывалось выше для подхода с однокомпонентными ПИВ. Примерами клеточных линий, которые могут быть использованы в подходе с двухкомпонентным геномом, могут служить клеточные линии Vero (например, АТСС CCL-81), ПДХ-21 (почек детёнышей хомяков) (например, АТСС CCL-10), C7/10 и другие клетки позвоночных и комаров.
Дополнительные примеры подхода с д-ПИВ, которые могут использоваться в настоящем изобретении, основаны на использовании комплементарных геномов, включающих делеции последовательностей NS3 или NS5. Возможно использование делеции, например, в генах белков NS1, NS3 или NS5. Эта деле-ция может включать несколько сотен аминокислот в ОРС, всю последовательность определённого белка или затрагивать одну аминокислоту, инактивируя ферментную активность белка (например, активность РНК-полимеразы NS5, активность геликазы NS3 и т.д.). Кроме того, в последовательности белков NS может происходить точечное изменение аминокислоты (1 мутация, изменяющая аминокислоту, или, как вариант, большее число мутаций). Эти мутации также будут приводить к инактивации фермента. В дополнение к этому, в одной вспомогательной могут сочетаться несколько делеций Д№. Тот же гетероло-гичный ген, например, экспрессирующийся первым компонентом д-ПИВ, может экспрессироваться вместо или в сочетании с делецией(ями) во втором компоненте, увеличивая количество экспрессированного иммуногена. Следует отметить, что ёмкость вспомогательных клеток для инсерций будет возрастать пропорционально величине делеции(ий) NS. Кроме того, вместо делеции во вспомогательной клетке может вставляться другой чужеродный иммуноген (или иммуногены), что приведет к получению поливалентной вакцины.
Кроме того, для получения векторов на основе ПИВ или ПИВ, использующихся в настоящем изобретении, как это описано выше, могут применяться и другие дополнительные подходы (см., например, изобретения WO 99/28487, WO 03/046189, WO 2004/108936, US 2004/0265338, US 2007/0249032 и патент США № 7332322).
Векторы на основе ПИВ и ПИВ, описанные в настоящем изобретении, могут состоять из последовательностей одного из видов флавивирусов (например, вируса клещевого энцефалита (ВКЭ, например штамма Hypr), вируса Лангат (ЛГТ), вируса жёлтой лихорадки (ЖЛ17D), вируса лихорадки Западного Нила, вируса японского энцефалита, вируса лихорадки денге (серотипов 1-4), вируса энцефалита Сент-Луис, вируса Куньин, вируса энцефалита Росио, вируса Ильеуса, вируса центрально-европейского энцефалита, вируса сибирского энцефалита, вируса русского весеннее-летнего энцефалита, вируса лихорадки Кьясанурского леса, вируса омской геморрагической лихорадки, вируса шотландского энцефаломиелита овец, вируса Повассан, вируса Негиши, вируса Абсерратова, вируса Хансалова, вируса Апои) или могут включать последовательности двух и большего числа вирусов. Последовательности некоторых штаммов этих вирусов легкодоступны в общеизвестных базах данных последовательностей; последовательности других штаммов можно легко установить с помощью методов, известных специалистам в этой области науки. В случае векторов на основе ПИВ и ПИВ, включающих последовательности более чем одного флавивируса, последовательности могут принадлежать химерическим флавиврусам, как это описано выше (также см., например, патенты США № 6962708; 6696281; 6184024). В определённых примерах реализации изобретения химеры включают последовательности генов предшественника мембранного белка и оболочечного белка от одного флавивируса (такого как флавивирус, к которому предполагается развитие иммунитета) и последовательности генов нуклеокапсидного и неструктурных белков от другого вируса, отличающегося от первого. В отдельном примере реализации изобретения вторым вирусом является вирус жёлтой лихорадки, например вакцинным штаммом ЖЛ17D. К другим примерам относятся химеры ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ, описанные ниже. Другим примером является химера ЛГТ/КЭ, основанная на геноме вируса ЛГТ и содержащая белки prME вируса КЭ. Вакцина на основе ППИВ, основанная на этом генетическом подходе, должна обладать рядом преимуществ, поскольку вирус ЛГТ реплицируется in vitro очень эффективно и является высокоаттенуированным вирусом, иммуно-генным для людей. Таким образом, химерическая вакцина на основе ПИВ ЛГТ/КЭ, как ожидается, будет обеспечивать развитие мощного специфического иммунного ответа у человека против КЭ, в частности, вследствие включения генов prME КЭ.
Векторы, представленные в настоящем изобретении, могут иметь в своей основе ПИВ или живой аттенуированный химерический флавивирус, как это описано в настоящем изобретении (в частности, ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ; см. ниже). Использование конструкций ПИВ в качестве векторов предоставляет определённые преимущества при определённых обстоятельствах, поскольку эти конструкции при необходимости включают большие делеции, что делает эти конструкции более подходящими для размещения инсерций. Эти инсерции могут достигать размеров удалённых сегментов, не приводя к
потере репликационной активности. Таким образом, векторы на основе ПИВ могут включать очень маленькие инсерции (например, величиной в 6-10, 11-20, 21-100, 101-500 (или больше) аминокислотных остатков в сочетании с делецией ДС или другими делециями), а также относительно крупные инсерций или инсерций промежуточного размера (например, величиной в 501-1000, 1001-1700, 1701-3000 или 3001-4000 (или больше) остатков). В отличие от этого, в определённых примерах реализации изобретения может оказаться более выгодным экспрессировать относительно короткие последовательности в живых аттенуированных вирусах, особенно если инсерции произошли без соответствующей делеции. Дополнительная информация, касающаяся сайтов инсерций, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, приведена ниже. В дополнение к этому, как это будет описано далее, экспрессия иммуногенов, не принадлежащих к флавивирусам, в ПИВ и химерических флавивирусах настоящего изобретения может привести в созданию двойных вакцин, которые будут проявлять защитные иммуно-генные свойства против патогена векторного флавивируса и целевого гетерологичного иммуногена (например, патогена (такого как бактериальный, вирусный, паразитарный или грибковый патоген) или им-муногена, имеющего отношение к раку или аллергии).
Как указывалось выше, векторы на основе ПИВ и ПИВ настоящего изобретения могут включать последовательности химерических флавивирусов, например химерического флавивируса, включающего гены предшественника мембранного белка и оболочечного белка первого флавивируса (например, фла-вивируса, к которому предполагается развитие иммунитета), и гены нуклеокапсидного и неструктурных белков второго флавивируса, отличающегося от первого, такого как вирус жёлтой лихорадки (например, ЖЛ17D; см. ниже, а также патенты США № 6962708; 6696281; 6184024). Кроме того, химерические вирусы, представленные в настоящем изобретении, используемые в качестве источника для создания ПИВ или в качестве вакцины/вакцинного вектора, могут также включать одну или большее число специфичных аттенуирующих мутаций (например, мутации гена белка Е, гена белка prM, делецию в гене белка С и/или делецию в 3'-концевой нетранслируемой области генома), таких как описанные в изобретении WO 2006/116182. Например, делеция белка С или делеция в 3'-концевой нетранслируемой области генома может непосредственно затрагивать химеры ЖЛ/КЭ или ЖЛ/ЛГТ. Аналогичные делеции могут быть разработаны и введены в химерические вирусы-кандидаты на звание ЖАВ, такие как химеры, основанные на геномах ЛГТ/КЭ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ. Что касается мутаций гена белка Е, то следует указать, что могут быть разработаны и использованы аттенуирующие мутации, аналогичные описанным для химеры ЖЛ/ЛЗН в изобретении WO 2006/116182. Эти мутации основаны на кристаллической структуре белка Е (Rey et al., Nature, 375(6529):291-298, 1995). Более того, дополнительные примеры аттенуирующих мутаций гена белка Е, описанные для вируса КЭ и других флавивирусов, представлены в табл. 9. Эти мутации также могут быть введены в вирусы-кандидаты на звание химерической вакцины.
В изобретении также представлены новые, в частности, химерические флавивирусы, которые могут использоваться для создания векторов на основе ПИВ и ПИВ как векторы на основе живых аттенуиро-ванных химерических вирусов, а также как вакцины против источника предшественника мембранного белка и оболочечного белка химеры. Эти химеры включают вирус клещевого энцефалита (КЭ) или связанные с этим вирусом последовательности prME. Таким образом, химеры могут включать последовательности prME, например, от вируса КЭ штамма Hypr или вируса Лангат (ЛТТ). К нуклеокапсидным и неструктурным белкам химеры могут относиться белки вируса жёлтой лихорадки (например, ЖЛ17D) или вируса лихорадки Западного Нила (например, NY99).
Основным свойством этих химер, приведенных здесь в качестве примеров (ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ), является наличие сигнальной последовательности между генами нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка. Как показано в примерах (см. ниже), авторами было установлено, что в случае химер ПИВ на основе вируса ЖЛ наиболее выгодно использовать сигнальную последовательность, включающую последовательности вируса жёлтой лихорадки и КЭ. В одном примере реализации изобретения сигнальная последовательность включает последовательность вируса жёлтой лихорадки в N-концевой области генома (например, последовательность SHDVLTVQFLIL) и последовательность вируса С-концевой области генома вируса КЭ (например, GMLGMTIA), что приводит к получению последовательности SHDVLTVQFLILGMLGMTIA. Нами также было установлено, что в случае химер, основанных на ПИВ ЛЗН, наиболее выгодно использовать сигнальную последовательность, состоящую из сигнальной последовательности вируса КЭ (например, GGTDWMSWLLVIGMLGMTIA). В настоящем изобретении представлены химеры ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ, как ПИВ, так и ЖАВ, которые включают указанные выше сигнальные последовательности или варианты этих последовательностей, включающие замещения, делеции или инсерции 1-8, 2-7 или 4-5 аминокислот, что не оказывает значимого влияния на процессинг сигнальной последовательности. В различных примерах реализации изобретения замещения представлены "консервативными замещениями", которые характеризуются замещением одного аминокислотного остатка другим, биологически сходным остатком. К примерам консервативного замещения относятся замещения одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой или замещение полярного остатка на другой, как, например, замена аргинина на лизин (и наоборот), глутаминовой кислоты на аспарагиновую (и наоборот), глутамина на аспарагин (и наоборот) и т.д. Дополнительная информация, касающаяся химер, приведена ниже, в
разделе "Примеры". Сайты инсерции.
Последовательности, кодирующие иммуногены, могут вставляться в один или большее число различных сайтов векторов, представленных в настоящем изобретении. Относительно короткие пептиды могут получаться на поверхности гликопротеинов ПИВ и ЖАВ (например, белков prM, Е и/или белков NS1) и/или в контексте других белков (для индукции преимущественного ответа со стороны В-клеток и Т-клеток соответственно). Другие вставки, включая более крупные части чужеродных белков, а также полноценные белки, могут экспрессироваться между генами на N- и С-концевых участках полипротеина, а также бицистронно (например, в пределах ОРС под СВВР (сайтом внутреннего входа рибосом) или в пределах 3'-концевой нетранслируемой области под СВВР; см., например, изобретения WO 02/102828, WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314, а также более подробно далее по тексту). В конструкциях ПИВ имеется дополнительная возможность инсерции чужеродных последовательностей аминокислот непосредственно в место делеции(ий). Инсерции могут происходить, например, в участках ДС, ДprME, ДС-prM-E, Д№1, Д№3 и Д№5. Таким образом, в одном из примеров реализации изобретения в случае о-ПИВ и делеции компонента С (ДС) д-ПИВ последовательности, кодирующие иммуноген, могут вставляться в место удалённых последовательностей гена белка нуклеокапсида. Последовательности, кодирующие иммуноген, могут также вставляться в место удалённых последовательностей в компоненте prME ^prME) д-ПИВ. В другом примере реализации изобретения последовательности вставляются в место удалённых последовательностей конструкций ДС-prM-E или инсерции происходят в комбинации с такими делециями. Примеры таких инсерций представлены в разделе "Примеры" (см. ниже).
В случае инсерции в место делеции ПИВ они могут происходить с несколькими (например, 1, 2, 3, 4 или 5) дополнительными вектор-специфичными остатками на N- и/или С-концевом участке чужеродного иммуногена, если эта последовательность хорошо сочетается внутри рамки считывания (например, ~20 первых аминокислот и несколько последних остатков белка С, если последовательность вставляется вместо делеции ДС). Эти инсерции также могут происходить без дополнительных остатков, если чужеродный иммуноген на концах содержит широко встречающиеся в природе соответствующие элементы (например, сайты расщепления вирусной протеазой; сайты расщепления клеточной протеазой, такой как сигналаза, фурин и т.д.; аутопротеаза; терминирующий кодон и/или элементы СВВР).
Если белок экспрессируется за пределами непрерывной вирусной открытой рамки считывания (ОРС), например если векторная и невекторная последовательности разделяются сайтом внутреннего входа рибосом (СВВР), то может наблюдаться цитоплазматическая экспрессия продукта или продукт может направляться сразу по секреторному пути благодаря использованию соответствующих сигнальных/якорных сегментов. Если белок экспрессируется в пределах векторной ОРС, то к важным моментам такой экспрессии относятся отщепление чужеродного белка от образующейся полипротеиновой последовательности, а также поддержание правильной топологии чужеродного белка и вирусных белков (для обеспечения жизнеспособности вектора) относительно мембраны ЭПС, например транслокация секрети-руемых белков в просвет ЭПС, или удерживание цитоплазматических белков или белков, связанных с мембраной, в цитоплазме/в связи с мембраной ЭПС.
Рассмотренный выше подход к образованию инсерций может включать использование, например, соответствующих векторных, инсерционных или не связанных с векторами и инсерциями сигнальных и якорных последовательностей, включённых в N- или С-концы гликопротеиновых вставок. Стандартные аутопротеазы, такие как аутопротеаза вируса ящура А2 (~20 аминокислот), или убихитин (ген, содержащий ~500 нуклеотидов), или фланкирующие сайты расщепления вирусной протеазой NS2B/NS3 могут использоваться для прямого отщепления экспрессированного продукта из растущей полипептидной цепочки и для выделения чужеродного белка из полипротеина вектора, а также для обеспечения жизнеспособности конструкции. Кроме того, рост полипротеиновой цепочки может останавливаться терминирующим кодоном, например, следующим за вставкой чужеродного гена, а синтез остальных белков в конструкциях может быть начинаться благодаря включению элемента СВВР, например, СВВР вируса энцефаломиокардита, который часто используется в вирусных векторах на основе РНК. Жизнеспособные рекомбинанты могут получаться во вспомогательных клетках (или в обычных клетках в случае подхода на основе д-ПИВ). Кроме того, основные последовательности ПИВ могут быть перегруппированы, например, если это приведёт к более эффективной экспрессии чужеродного гена. Например, перегруппировка генов была применена к вирусу КЭ, в котором гены prME были перемещены к 3'-концевой области генома под контролем СВВР (Orlinger et al., J. Virol. 80:12197-12208, 2006). Транслокация генов prME и любых других генов может применяться у ПИВ - кандидатов на звание вакцины против флавивирусов, а также в векторах экспрессии, в соответствии с изобретением.
Дополнительные подробности, касающиеся различных сайтов экспрессии, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представлены ниже (см. также изобретения WO 02/102828, WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314, как указывалось выше). Последовательности, кодирующие пептиды, могут вставляться в ген оболочечного белка, который является ос
новной мишенью для нейтрализующих антител. Последовательность может вставляться в ген оболочеч-ного белка, например, в положениях, соответствующих аминокислотам 59, 207, 231, 277, 287, 340 и/или 436 оболочечного белка вируса японского энцефалита (см., например, изобретения WO
2008/115314 и WO 02/102828). Для определения соответствующих локусов в различных флавивиру-сах последовательности этих флавивирусов необходимо сопоставить с последовательностью вируса японского энцефалита. Поскольку точное соответствие может не наблюдаться, следует учитывать, что в других вирусах сайты инсерции могут отличаться, например, на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в любом направлении. Более того, учитывая определение таких сайтов в качестве допустимых для вируса ЯЭ, они также могут варьировать, например, на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в обе стороны. С помощью других методов, таких как транспозонный мутагенез (см., например, изобретения WO 02/102828 и WO 2008/036146), возможно определение и других допустимых сайтов инсерций. Инсерции могут происходить в сайтах указанных аминокислот и иметь вид инсерции у С-концевой части указанных аминокислот (т.е. между аминокислотами 51-52, 207-208, 231-232, 277-278, 287-288, 340-341 и 436-437) или происходить в месте коротких делеций (например, делеций 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот), начинающихся с указанных аминокислот (или в пределах 1-5 аминокислот по отношению к указанным позициям в обе стороны).
В дополнение к гену оболочечного белка, инсерции могут происходить в генах других вирусных белков, в том числе, например, в гене предшественника мембранного белка/гене мембранного белка и в гене неструктурного белка NS1 (см., например, изобретение 2008/036146). Например, инсерции могут происходить в последовательности, предшествующие сайту расщепления нуклеокапсидного белка/предшественника мембранного белка (например, в позициях -4, -2 или -1), или в пределах первых 50 аминокислот предшественника мембранного белка (например, в позиции 26), и/или между аминокислотами 236 и 237 неструктурного белка NS1 (или в областях, окружающих указанные последовательности, как это писано выше). В других примерах реализации изобретения инсерции могут происходить между генами. Например, инсерции могут происходить между генами белков Е и NS1 и/или между генами белков NS2B и NS3 (см., например, изобретение WO 2008/100464). В одном из примеров межгенной инсер-ции вставленная последовательность может соединяться с С-концевой частью белка Е вектора, находиться после С-концевого участка сигнальной/якорной последовательности белка Е. Также инсерция может включать С-концевую якорную/сигнальную последовательность, которая соединяется с последовательностью NS1 вектора. В другом примере межгенной инсерции вставленные последовательности, имеющие фланкирующие сайты расщепления протеазой (например, сайты расщепления ЖЛ17D), могут находиться в отдельном ограниченном сайте - в соединении NS2B/NS3 (WO 2008/100464).
В других примерах реализации изобретения последовательность может быть вставлена в контекст сайта внутреннего входа рибосом (СВВР, например СВВР вируса энцефаломиокардита), как это указывалось выше, например в 3'-нетранслируемой области генома (WO 2008/094674). В одном примере такого вектора, основанного, например, на последовательности вируса жёлтой лихорадки, кассета СВВР/-иммуноген может вставляться в сайт множественного клонирования, находящийся в 3'-нетранслируемой области генома вектора, например в место делеции (например, делеции 136 нуклеоти-дов вируса жёлтой лихорадки) после стоп-кодона полипротеина (WO 2008/094674).
Подробности, касающиеся инсерции белка G вируса бешенства и полномерного белка F респира-торно-синцитиального вируса в векторы на основе о-ПИВ и д-ПИВ, представленные в настоящем изобретении, указаны в примере 3. Принцип, описанный в примере 3, может применяться в отношении других векторов и иммуногенов, описанных в настоящем изобретении.
Иммуногены.
ПИВ (о-ПИВ и д-ПИВ), основанные на последовательностях флавивирусов и живых аттенуирован-ных (ослабленных) химерических флавивирусов (например, ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ), как это описано выше, могут использоваться в различных вариантах реализации изобретения для представления чужеродных патогенов (например, не являющихся патогенами флавивирусов, т.е. вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов) и иммуногенов, имеющих отношение к раку или аллергии. Как будет указано далее, в определённых примерах реализации изобретения может оказаться выгодным выбор в качестве мишени нескольких патогенов, которые занимают ту же экологическую нишу, например, встречающихся в одном географическом регионе. Отдельные, но не исключительные примеры таких иммуногенов представлены ниже.
В дополнение к вирусу КЭ, клещи, как известно, передают и другое распространённое заболевание - болезнь Лайма. Таким образом, в первом примере реализации изобретения ПИВ, представленные в настоящем изобретении, такие как ПИВ, включающие последовательности вирусов КЭ/ЛГТ, а также химерические флавивирусы, включающие последовательности вируса КЭ (например, ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ, ЛГТ/КЭ и ЛЗН/ЛГТ; во всех случаях, где используется вирус КЭ, возможно использование штамма Hypr этого вируса), могут использоваться как векторы для представления защитных им-муногенов причинного фактора болезни Лайма (клещевой спирохеты Borrelia burgdorferi). Эта комбинация, предназначенная для индукции иммунитета против обоих инфекционных агентов (КЭ и В.burgdorferi), обладает рядом преимуществ, поскольку КЭ и болезнь Лайма являются заболеваниями,
передающимися клещами. Подход на основе ПИВ может применяться и для химер (например, ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ или ЛЗН/ЛГТ) в соответствии с настоящим изобретением, а также для нехимерических вирусов КЭ и ЛГТ. Примером иммуногена В.burgdorferi, который может быть использован в одном из вариантов реализации настоящего изобретения, является OspA (Gipson et al., Vaccine, 21:3875-3884, 2003). Кроме того, для повышения безопасности и/или увеличения иммуногенности OspA может подвергаться мутациям, которые будут снижать вероятность аутоиммунного ответа и/или лишать его нежелательных сайтов посттрансляционной модификации в клетках позвоночных животных, такой как N-связанное гликозилирование, что может влиять на иммуногенность продукта экспрессии. Мутации, которые снижают вероятность аутоиммунного ответа, могут включать, например, мутации, описанные Willett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1303-1308, 2004. В одном из примеров реализации данного изобретения изменяется FTK-OspA, предполагаемый перекрёстно-реагирующий эпитоп для Т-клеток, Bb OspA165-173 (YVLEGTLTA), что делает его похожим на соответствующую последовательность пептида Borrelia afzelli (FTLEGKVAN). В FTK-OspA соответствующая последовательность выглядит как FTLEGKLTA. Последовательность OspA имеет следующий вид:
1 mkkyllgig] ilaliackqn vssldeknsv svdlpgemkv Ivskeknkdg kydliatvdk
61 lelkgtsdkn ngsgvlegvk adkskvklti sddlgqttie vfkedgktlv skkvtskdks 121 steekfnekg evsekiitra dgtrleytgi ksdgsgkake vlkgyvlegt Itaekttlvv 181 kegtvtiskn isksgevsve Indtdssaat kktaaJBHsgt stltitvnsk ktkdlvftke 24] ntitvqqyds ngtklegsav eitkldeikn alk
В настоящем изобретении может использоваться вся последовательность и/или иммуногенные фрагменты полномерной последовательности. К примерам таких фрагментов относятся один или большее число из следующих доменов:
домен 1 (аминокислоты 34-41),
домен 2 (аминокислоты 65-75),
домен 3 (аминокислоты 190-220) и
домен 4 (аминокислоты 250-270) (Jiang et al., Clin. Diag. Lab. Immun. 1(4):406-412, 1994).
Таким образом, например, может быть получен пептид, включающий любую одну или несколько из следующих последовательностей (которые включают вариации последовательностей, которые могут быть включены в указанные выше последовательности в любой комбинации):
LPGE/GNMK/TVGVL; GTSDKN/S/DNGSGV7T;
N/H/E1S/P/L/A/SK/NSGEV/]SЯV/AE/ALN/DDT/SD/NS/TS/TA/Q/RATKKTA/GA/KЯЛЗH/DS/A G/N/KT;SN/AGTK/NLEGS/N/K/TAVEiT/KK/TLD/K:El/LKN. В дополнение к иммуногенам В.burgdorferi, могут экспрессироваться белки слюны клещей, такие как 64TRP, Isac и Salp20, что позволит, например, создать кандидата на звание трёхвалентной специфичной вакцины (КЭ + болезнь Лайма + клещи). Кроме того, белки слюны клещей могут экспрессироваться вместо иммуногенов В.burgdorferi в векторах, содержащих последовательности вируса КЭ. Также существует большое число других белков слюны клещей, которые могут использоваться для создания вакцины против клещей, в соответствии с настоящим изобретением (Francischetti et al., Insect Biochem. Mol. Biol. 35:1142-1161, 2005). Один или несколько из этих иммуногенов могут экспрессироваться в о-ПИВ-КЭ. Как бы то ни было, также возможно применение д-ПИВ вследствие их большой ёмкости для инсерций. В дополнение к ПИВ-КЭ, в качестве векторов могут быть использованы и другие вакцины на основе ПИВ, например, для защиты от болезни Лайма и другого заболевания, вызываемого флавивиру-сами, например лихорадки Западного Нила. Экспрессия этих иммуногенов может оцениваться в клеточной культуре, а иммуногенность/защитные свойства могут изучаться на доступных животных моделях (например, как это описано Gipson et al., Vaccine, 21:3875-3884, 2003; Labuda et al., Pathog. 2(e27):0251-0259, 2006). Иммуногены и другие патогены могут аналогично экспрессироваться в дополнение к имму-ногенам возбудителя болезни Лайма и клещей, что позволит создавать кандидатов на звание поливалентной вакцины. К примерам иммуногенов слюны клещей, которые могут использоваться в качестве вариантов реализации настоящего изобретения, относятся:
64TRP(AF46917(n
MKAFFVLSLL STAALTNAAR AGRLGSDLDT FGBEHGNLYA GIERAGPRGY PGLTASIGGE VGARLOGRAG VGVSSYGVGY PSWGYPYGGY GGYGGYGGYG GYDQGFGSAY GGYPGYYGYY YPSGYGGGYG GSYGGSYGGS YTYPNVRASA GAAA
Isac (AF270496)
MRTAFTCALL AISFLGSPCS SSEDGLEQDT IVETTTQNLY ERHYRNHSGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLN HLPPVVNATW EGIRHRINKT 1PQFVKLICN FTVAMPQEFY LVYMGSDGNS DFEEDKESTG TDEDSNTGSS AAAKVTEALIIEAEENCTAH ITGWTTETPT TLEPTTESQF EAIP
Salp20 (EU008S59)
MRTALTCALL AISFLGSPCS SSEGGLEKDS BEETTTQNLY ERYYRKHPGL CGAQYRNSSH AEAVYNCTLS LLPLSVNTTW EGIRHRIMKT IPEFVNLICN FTVAMPDQFY LVYMGSNGNS YSEEDEDGKT GSSAAVQVTE QLIIQAEENC TAHITGWTTE APTTLEPTTE TQFEAIS
Более подробная информация, касающаяся ПИВ, связанных с вирусом КЭ, и ЖАВ, представлена в примере 2 (см. ниже).
В изобретении также представлены вакцины на основе векторов, в роли которых могут выступать ПИВ и ЖАВ, против других патогенов, не являющихся флавивирусами, включая вакцины с двойным действием, которые вызывают развитие защитного иммунитета как против флавивирусов (в зависимости от того, оболочечный белок какого вируса закодирован в векторе) и других патогенов, не являющихся флавивирусами (в зависимости от экпрессируемых иммунологических детерминант). Этот подход аналогичен примеру векторной вакцины на основе ПИВ против КЭ, болезни Лайма и клещей, описанному ранее. Как указывалось выше, возможно создание таких вакцин с двойным действием против широкого круга патогенов путём экспрессии вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных иммуногенов, а также иммуногенов, связанных с раком и аллергиями. В качестве отдельных, но не исключительных примеров приведём здесь описание структуры и биологических свойств кандидатов на звание вакцины на основе векторов в виде ПИВ и вирусов бешенства и респираторно-синцитиального вируса, сконструированных путём экспрессии белка G вируса бешенства и полномерного белка F РСВ в месте делеций или в сочетании с различными делениями в векторах, представленных одно- или двухкомпонентными
ПИВ.
Как показано в примерах ниже, конструкции на основе о-ПИВ могут обладать определенными преимуществами для стабильного представления относительно коротких чужеродных иммуногенов (похожих на белок OspA возбудителя болезни Лайма и белки слюны клещей), поскольку эти инсерции сочетаются с относительно короткими делениями АС. Векторы на основе двухкомпонентных ПИВ могут обладать преимуществами для стабильного представления относительно крупных иммуногенов, таких как белок G вируса бешенства и белок F РСВ, поскольку инсерции в таких векторах сочетаются, например, с большими делециями ДprME, ДCprME и ДNS1. Некоторые из компонентов д-ПИВ могут изготавливаться и использоваться как вакцины, например конструкция ПИВ-F РСВ, описанная ниже, содержащая делецию ДCprME. В этом случае вакцина вызывает развитие иммунного ответа (т.е. появление нейтрализующих антител) преимущественно против экспрессирующегося белка, но не против патогена вектора-флавивируса. В других примерах реализации изобретения возможно получение вакцины двойного действия, вызывающей развитие иммунитета против вектора и вставленного компонента. Кроме того, по причине большой ёмкости для инсерций векторов на основе ПИВ и возможности использования двухкомпо-нентных геномов векторы на основе ПИВ предлагают возможность одновременного воздействия на несколько патогенов флавивирусов, например, путём экспрессии чужеродных иммуногенов сразу двух различных флавивирусов в двух компонентах д-ПИВ.
В дополнение к белку F РСВ, белку G вируса бешенства, защитным иммуногенам возбудителя болезни Лайма и белкам слюны клещей, приведенных выше в качестве примеров чужеродных иммуноге-нов, возможна экспрессия других чужеродных иммуногенов, что может использоваться для воздействия на другие заболевания, включая, например, иммуногены вируса гриппа типов А и В. В этих примерах реализации изобретения возможно использование нескольких коротких эпитопов и/или целых генов белков вирусных частиц, таких как гены вируса гриппа А М2, НА и NA и/или гены вируса гриппа В NB или ВМ2. Более короткие фрагменты М2, NB и ВМ2, соответствующие, например, М2е или внеклеточному фрагменту М2, также могут быть использованы. В дополнение к этому возможно использование фрагментов гена НА, включая эпитопы, обозначаемые как НА0 (23 аминокислоты в длину, что соответствует месту отщепления НА). К отдельным примерам последовательностей, связанных с вирусом гриппа, которые могут быть использованы в вариантах реализации настоящего изобретения, относятся:
РАК LLKERGFFGAIAGFLE (НАО),
PAKLLKERGFFGAIAGFLEGSGC (НАО), NNATFNYTNVNP1SHIRGS (NBe),
MSLLTEVETPTRNEWGCRCNDSSD (М2е), MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD (М2е),
MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD (М2е), EVETPTRN (М2е),
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (М2е) и SLLTEVETPIRNEWGCR (М2е).
Дополнительные последовательности М2е, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают последовательности из внеклеточного домена белка ВМ2 вируса гриппа В (консенсус MLEPFQ, например LEPFQILSISGC), а также последовательности пептида М2е вируса птичьего гриппа H5N1 (MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD).
К другим примерам патогенных иммуногенов, которые могут представляться в векторах этого изобретения, относятся кодон-оптимизированные последовательности белков gag (55 кДа), gp120, gp160 ВИЧ и ВИО (вируса иммунодефицита человека и вируса иммунодефицита обезьян), гены mac239-rev/tat/nef ВИО или аналогичные гены ВИЧ, а также другие иммуногены ВИЧ; иммуногены ВПЧ (вируса папилломы человека), такие как ВПЧ16, ВПЧ18 и другие, например нуклеокапсидный белок L1, который самостоятельно формирует ВПЧ-подобные частицы, нуклеокапсидный белок L2 или его имму-нодоминантные порции (например, аминокислоты 1-200, 1-88 или 17-36), белки Е6 и Е7, которые участвуют в трансформации и иммортализации клеток млекопитающих, соединяясь и соответствующим образом мутируя (соединение двух генов приводит к образованию белка слияния, известного под названием E6E7Rb-, который примерно в 10 раз слабее вызывает трансформацию фибробластов, и мутации компонента Е7 во втором остатке делает получившийся мутированный белок слияния неспособным вызывать трансформацию) (Boursnell et al., Vaccine, 14:1485-1494, 1996). К другим иммуногенам относятся защитные иммуногены против энцефаломиокардита, ЦМВ (цитомегаловируса), ВПГ2 (вируса простого герпеса 2 типа), вирусов паразита малярии, Mycobacterium tuberculosis, вызывающей туберкулёз, Cdifficile и других известных возбудителей нозокомиальных инфекций, а также грибковых патогенов, иммуногенов рака, белков, связанных с аллергией, которые можно использовать в качестве мишеней для вакцинации.
Вставки чужеродных иммуногенов, представленные в настоящем изобретении, могут модифицироваться по различным механизмам. Например, для увеличения уровня экспрессии и удаления длинных повторов последовательностей нуклеотидов, что позволит увеличить стабильность РНК-генома векторов на основе ПИВ, применяется оптимизация кодона. Иммуногенность может быть повышена путём химе-ризации белков с известными иммуностимулирующими элементами, таким как агонисты КПР (колоко-лоподобных рецепторов), стимулирующие цитокины, компоненты системы комплемента, белки теплового шока и т.д. (например, см. обзор Immunopotentiators in Modern Vaccines, Schijns and O'Hagan Eds., 2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston).
Что касается конструкций двойных вакцин против бешенства и других заболеваний, вызываемых флавивирусами, то для применения у человека и в ветеринарии в определённых географических областях могут представлять интерес и другие комбинации, такие как сочетание КЭ + бешенство, ЖЛ + бешенство и т.д. Такие комбинации могут быть сформированы аналогично. Возможная структура конструкций экспрессии не ограничивается описанными здесь примерами. Например, делеции и инсерции могут модифицироваться, генетические элементы могут перегруппировываться, также могут использоваться другие генетические элементы, облегчающие презентацию антигена и увеличивающие иммуногенность (например, сигналы секреции, детерминанты внутриклеточного транспорта, включения или слияния с иммуностимулирующими элементами, такими как цитокины, агонисты КПР, такие как флагеллин, компоненты мультимеризации, такие как лейциновая "застёжка-молния", а также пептиды, которые увеличивают время циркуляции белка в крови; эти элементы могут происходить не от флавивирусов и не от вируса бешенства). Кроме того, такая структура может применяться для о-ПИВ и д-ПИВ - кандидатов на звание вакцины, основанных на векторных геномах других флавивирусов и экспрессирующих иммуногены других патогенов, например, патогенов, описанных в настоящем изобретении, а также других патогенов.
К другим примерам векторов на основе ПИВ и ЖАВ, представленных в настоящем изобретении, относятся комбинированные вакцины, такие как вакцина против ДЕН + вируса Чикунгунья (ЧИКВ) и ЖЛ + ЧИКВ. ЧИКВ - это альфа-вирус, эндемичный для Африки, Юго-Восточной Азии, Индийского субконтинента с островами, островов Тихого океана. Этот вирус делит экологическую/географическую нишу с вирусами ЖЛ и ДЕН1-4. Он вызывает тяжёлое заболевание, которое характеризуется выраженной болью (артритом, другими симптомами, напоминающими ДЕН) и длительными последствиями у большинства пациентов (Simon et al., Med. Clin. North Am. 92:1323-1343, 2008; Seneviratne et al., J. Travel Med. 14:320-325, 2007). К другим примерам векторов на основе ПИВ и ЖАВ, представленных в настоящем изобретении, являются ЖЛ + Эбола или ДЕН + Эбола, которые совместно циркулируют в Африке.
Иммуногены к указанным патогенам, не относящимся к флавивирусам, последствия заражения которыми хорошо известны в медицинских кругах, могут включать гликопротеин В или белок слияния рр65/IE1 ЦМВ (Reap et al., Vaccine, 25(42):7441-7449, 2007 и указанные в этом источнике ссылки), некоторые белки клещей (обзор: Skeiky et al., Nat. Rev. Microbiol. 4(6):469-476, 2006), антигены паразита ма
лярии, такие как RTS,S (преэритроцитарный белок циркумспорозоита, БЦС) и другие иммуногены (например, см. обзор: Li et al., Vaccine, 25(14):2567-2574, 2007), оболочечные белки E1 и E1 ЧИКВ (или кассеты С-Е2-Е1, Е2-Е1), структурные белки ВГС (вируса гепатита С) С-Е1-Е2, которые образуют ВПЧ (Ezelle et al., J. Virol. 76(23): 12325-12334, 2002) или другие белки, которые индуцируют ответ со стороны Т-клеток, гликопротеин GP вируса Эбола (Yang et al., Virology, 377(2):255-264, 2008).
В дополнение к иммуногенам, описанным выше, представленные здесь векторы могут включать один или несколько иммуногенов, полученных из одного или нескольких вирусов или направляющих иммунный ответ против одного или нескольких вирусов (например, вирусные целевые антигены, включающие, например, дцДНК-вирус (например, аденовирус, герпесвирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус простого герпеса 1 типа, вирус простого герпеса 2 типа, вирус простого герпеса человека 8 типа, цитоме-галовирус человека, вирус опоясывающего лишая, поксвирус); оцДНК-вирус (например, парвовирус, папилломавирус (например, Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, Е8, БПВ1 (бычий папилломавирус 1), БПВ, БПВ, БПВ, БПВ и БПВ (Из: Papillomavirus and Human Cancer, под ред. Н. Pfister (CRC Press, Inc. 1990)); Lancaster et al., Cancer Metast. Rev. p. 6653-6664, 1987; Pfister et al., Adv. Cancer Res. 48:113-147, 1987)); дцРНК-вирусы (например, реовирусы); (+)оцРНК-вирусы (например, пикорнавирус, вирус Коксаки, вирус гепатита А, полиовирус, тогавирус, вирус краснухи, флавивирус, вирус гепатита С, вирус жёлтой лихорадки, вирус лихорадки денге, вирус лихорадки Западного Нила); (-)оцРНК-вирусы (например, ор-томиксовирус, вирус гриппа, рабдовирус, парамиксовирус, вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа, рабдовирус, вирус бешенства); оцРНК-РТ-вирусы (например, ретровирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ); оцДНК-РТ-вирусы (например, гепаднавирус, вирус гепатита В). Иммуногены могут также происходить от других вирусов, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области вирусологии.
Что касается ВИЧ, то иммуногены могут получаться из любого изолята ВИЧ. Как принято в вирусологии, изоляты ВИЧ в настоящее время классифицируются на отдельные генетические подтипы. Известно, что ВИЧ-1 представлен как минимум десятью подтипами (A, B, C, D, E, F, G, H, J и K). Известно, что ВИЧ-2 представлен как минимум пятью подтипами (A, B, C, D и E). Подтип В связан с эпидемией ВИЧ у гомосексуалистов и потребителей внутривенных наркотиков из различных стран мира. Большинство иммуногенов ВИЧ-1, лабораторных адаптированных изолятов, реагентов и картированных эпитопов принадлежит к подтипу В. В африканских странах, расположенных южнее Сахары, в Индии и Китае, т.е. в областях с высокой частотой вновь выявленных случаев ВИЧ-инфекции, с ВИЧ-1 подтипа В связана лишь небольшая часть инфекций, а самым распространённым инфекционным подтипом, по-видимому, является подтип С. Таким образом, в определённых вариантах реализации этого изобретения может быть полезным использование иммуногенов ВИЧ-1 от подтипов В и/или С. Может также быть полезным включить иммуногены от различных подтипов ВИЧ (например, подтипов В и С ВИЧ-1, подтипов А и В ВИЧ-2 или комбинацию подтипов ВИЧ-1 и ВИЧ-2) в одну иммунологическую композицию. Подходящими для этого иммуногенами являются, например, ENV, GAG, POL, NEF, а также их варианты, производные и полученные из них белки слияния.
Иммуногены могут также получаться из бактерий одного или нескольких видов, а также направлять иммунный ответ против бактерий одно или нескольких видов (spp.) (например, бактериальные целевые антигены, включающие, например, Bacillus spp. (например, Bacillus anthracis), Bordetella spp. (например, Bordetella pertussis), Borrelia spp. (например, Borrelia burgdorferi), Brucella spp. (например, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis), Campylobacter spp. (например, Campylobacter jejuni), Chlamydia spp. (например, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis), Clostridium spp. (например, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Corynebacterium spp. (например, Corynebacterium diptheriae), Enterococcus spp. (например, Enterococcus faecalis, enterococcus faecum), Escherichia spp. (например, Escherichia coli), Francisella spp. (например, Francisella tularensis), Haemophilus spp. (например, Haemophilus influenza), Helicobacter spp. (например, Helicobacter pylori), Legionella spp. (например, Legionella pneumophila), Leptospira spp. (например, Leptospira intenx^NS), Listeria spp. (например, Listeria monocytogenes), Mycobacterium spp. (например, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis), Mycoplasma spp. (например, Mycoplasma pneumoniae), Neisseria spp. (например, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), Pseudomonas spp. (например, Pseudomonas aeruginosa), Rickettsia spp. (например, Rickettsia rickettsii), Salmonella spp. (например, Salmonella typhi, Salmonella typhinurium), Shigella spp. (например, Shigella sonnei), Staphylococcus spp. (например, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophytics, coagulase negative staphylococcus (например, патент США № 7473762)), Streptococcus spp. (например, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes), Treponema spp. (например, Treponema pallidum), Vibrio spp. (например, Vibrio cholerae) и Yersinia spp. (Yersinia pestis). Иммуногены могут также происходить от бактерий других видов или направлять иммунный ответ против бактерий других видов, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области микробиологии.
Иммуногены могут также получаться из паразитарных организмов одного или нескольких видов, а также направлять иммунный ответ против бактерий одно или нескольких видов (spp.) (например, парази
тарные целевые антигены, включающие, например, Ancylostoma spp. (например, A.duodenale), Anisakis spp., Ascaris lumbricoides, Balantidium coli, Cestoda spp., Cimicidae spp., Clonorchis sinensis, Dicrocoelium dendriticum, Dicrocoelium hospes, Diphyllobothrium latum, Dracunculus spp., Echinococcus spp. (например,
E. granulosus, E.multilocularis), Entamoeba histolytica, Enterobius vermicularis, Fasciola spp. (например,
F. hepatica, F.magna, F.gigantica, F.jacksoni), Fasciolopsis buski, Giardia spp. (Giardia lamblia), Gnathostoma spp., Hymenolepis spp. (например, Knana, H.diminuta), Leishmania spp., Loa loa, Metorchis spp. (M.conjunctus, M.albidus), Necator americanus, Oestroidea spp. (например, овод), Onchocercidae spp., Opisthorchis spp. (например, О.viverrini, О^И^ш, О.guayaquilensis и О.noverca), Plasmodium spp. (например, P.falciparum), Protofasciola robusta, Parafasciolopsis fasciomorphae, Paragonimus westermani, Schistosoma spp. (например, S.mansoni, S.japonicum, S.mekongi, S.haematobium), Spirometra erinaceieuropaei, Strongyloides stercoralis, Taenia spp. (например, ^saginata, Т.solium), Toxocara spp. (например, ^canis, Т.cati), Toxoplasma spp. (например, ^gondii), Trichobilharzia regenti, Trichinella spiralis, Trichuris trichiura, Trombiculidae spp., Trypanosoma spp., Tunga penetrans и/или Wuchereria bancrofti. Им-муногены могут также происходить от паразитарных организмов других видов или направлять иммунный ответ против паразитарных организмов других видов, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области паразитологии.
Иммуногены могут быть получены из опухолевых целевых антигенов или направлять развитие иммунитета против опухолевых целевых антигенов (например, опухолевых целевых антигенов). Термин "опухолевый целевой антиген" (ОЦА) может включать как антигены, связанные с опухолью (АСО), так и опухольспецифичные антигены (ОСА), когда источником антигена является опухолевая клетка. ОЦА могут быть представлены антигеном, который экспрессируется на поверхности опухолевых клеток в больших количествах, чем на нормальных клетках, а также антигеном, который экспрессируется на нормальных клетках во время эмбрионального развития. ОСА, как правило, - это антигены, уникальные для опухолевых клеток; они не экспрессируются нормальными клетками. Классификация ОЦА предполагает выделение пяти категорий в соответствии с паттерном экспрессии, функцией и генетическим происхождением: антигены рака яичек (РЯ) (например, MAGE, NY-ESO-1); антигены дифференцировки меланоцитов (например, Melan A/MART-1, tyrosinase, g100); мутационные антигены (например, MUM-1, p53, CDK-4); сверхэкспрессируемые аутоантигены (например, HER-2/neu, р53) и вирусные антигены (например, ВПЧ, ВЭБ (вирус Эпштейна-Барра)). К соответствующим ОЦА относятся, например, gp100 (Cox et al., Science, 264:716-719, 1994), MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352, 1994), gp75 (TRP-1) (Wang et al., J. Exp. Med., 186:1131-1140, 1996), тирозиназа (Wolfel et al., Eur. J.
Immunol., 24:759-764, 1994), NY-ESO-1 (WO 98/14464; WO 99/18206), протеогликан меланомы
(Hellstrom et al., J. Immunol., 130:1467-1472, 1983), антигены семейства MAGE (например, MAGE-1, 2, 3, 4, 6 и 12; Van der Bruggen et al., Science, 254:1643-1647, 1991; патент США № 6235525), антигены семейства BAGE (Boel et al., Immunity, 2:167-175, 1995), антигены семейства GAGE (например, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 182:689-698, 1995; патент США № 6013765), антигены семейства RAGE (например, RAGE-1; Gaugler et al., Immunogenetics, 44:323-330, 1996; патент США № 5939526), ^ацетилглюкозаминилтрансфераза^ (Guilloux et al., J. Exp. Med. 183:1173-1183, 1996), p15 (Robbins et al., J. Immunol. 154:5944-5950, 1995), р-катенин (Robbins et al., J. Exp. Med., 183:1185-1192, 1996), MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7976-7980, 1995), циклинзависимая киназа-4 (ЦЗК4) (Wolfel et al., Science, 269:1281-1284, 1995), p21-ras (Fossum et al., Int. J. Cancer 56:40-45, 1994), BCR-abl (Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684, 1995), p53 (Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11993-11997, 1995), p185 HER2/neu (erb-B1; Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117, 1995), рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР) (Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2, 1994), канцероэмбриогенные антигены (КЭА) (Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990, 1995), патенты США № 5756103; 5274087; 5571710; 6071716; 5698530; 6045802; ЕР 263933; ЕР 346710 и ЕР 784483; мутированные муцины, связанные с карциномой (например, продукты гена MUC-1; Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662, 1993); продукты гена EBNA вируса Эпштейна-Барра (например, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Subbay, 13:53-80, 1992); белки E7, E6 папилломавируса человека (Ressing et al., J. Immunol. 154:5934-5943, 1995); простат-специфичный антиген (PSA; Xue et al., The Prostate? 30:73-78, 1997); простат-специфичный мембранный антиген (PSMA; Israeli et al., Cancer Res. 54:1807-1811, 1994); идиотипичные эпитопы антигенов, например идиотипы иммуноглобулина или идиотипы рецептора Т-клеток (Chen et al., J. Immunol. 153:47754787, 1994); KSA (патент США № 5348887), кинезин-2 (Dietz, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 275(3):731-738, 2000), HIP-55, TGF (антиапоптотический фактор) (Toomey et al., Br. J. Biomed. Sci. 58(3):177-183, 2001), опухолевый белок D52 (Bryne et al., Genomics? 35:523-532, 1996), H1FT, NY-BR-1 (WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87 и NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY) и/или антигены рака поджелудочной железы (например, SEQ ID NO: 1288 патента США № 7473531). Иммуногены могут также происходить от других ОЦА или направлять иммунный ответ против других ОЦА, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области онкологии.
В дополнение к последовательностям специфичных иммуногенов, указанным выше, настоящее изобретение также включает применение аналогов этих последовательностей. К таким аналогам относятся последовательности, которые, например, на 80, 90, 95 или 99% совпадают с основными последовательностями или их фрагментами. К аналогам также относятся фрагменты основных последовательностей, которые включают, например, один или несколько иммуногенных эпитопов последовательностей. Кроме того, к аналогам относятся усечённые или расширенные последовательности (например, инсерции дополнительных/повторных иммунодоминантных эпитопов/эпитопов вспомогательных клеток), отличающиеся от основных последовательностей на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20 и т.д. аминокислот с одного конца или обоих концов. Усечение может приводить к удалению иммунологически незначимых или значимых последовательностей, например, в пределах известных структурных/иммунологических доменов или между доменами; также может происходить полное удаление нежелательных доменов; такие модификации могут затрагивать 21-30, 31-50, 51-100, 101-400 и т.д. аминокислот. Модификации также могут затрагивать, например, 20-400, 30-100 и 50-100 аминокислот.
Коктейли.
В изобретении также представлены составы из двух и большего числа ПИВ и/или векторов на основе ПИВ, как это описано в настоящем изобретении. Как указывалось выше, использование таких комбинаций, или коктейлей, может предоставлять преимущества для индукции иммунитета против более чем одного иммуногена и/или патогена. Это может оказаться полезным, например, при вакцинации против различных флавивирусов, эндемичных для определённого географического региона, в котором проживают вакцинируемые лица. Это также может оказаться полезным в плане введения сразу нескольких им-муногенов против одной и той же мишени.
К примерам коктейлей ПИВ, представленных в настоящем изобретении, относятся ПИВ-ЯЭ + ПИВ-ДЕН и ПИВ-ЖЛ + ПИВ-ДЕН, а также другие коктейли. В обоих этих примерах один из компонентов или оба ПИВ могут быть как одно-, так и двухкомпонентными ПИВ, как это указывалось ранее. В дополнение, в случае ПИВ-ДЕН ПИВ может включать последовательности только одного серотипа вируса лихорадки денге из группы серотипов вируса лихорадки денге 1-4. Кроме того, коктейль может включать ПИВ, экспрессирующие последовательности двух, трёх или всех четырёх серотипов. Кроме того, описанные в настоящем изобретении вакцины против вируса КЭ/Borrelia burgdorferi/белка слюны клещей (например, 64TRP, Isac, Salp20) могут быть основаны на включении различных иммуногенов в один ПИВ или живой аттенуированный вирус, а также могут быть основаны на комбинации ПИВ (или ЖАВ), каждый из которых включает один или несколько иммуногенов. Коктейли, представленные в настоящем изобретении, могут применяться в виде готовых форм или смешиваться непосредственно перед введением.
Использование, лекарственные формы и введение вакцины.
В настоящем изобретении представлены векторы на основе ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ, а также соответствующие им молекулы нуклеиновых кислот, фармацевтические или вакцинные композиции и методы их использования и получения. Векторы на основе ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ, представленные в настоящем изобретении, могут использоваться, например, в целях вакцинации для индукции иммунного ответа против вируса КЭ, других флавивирусов и/или других экспрес-сирующихся иммуногенов, как это описано в настоящем изобретении. Эти методы могут являться профилактическими; в этом случае эти средства применяются у субъектов (например, у человека или других млекопитающих), у которых в настоящее время нет инфекции, вызываемой вирусом КЭ или другими флавивирусами и/или патогенами, из которых был получен экспрессируемый иммуноген, но риск развития такой инфекции повышен. Методы также могут носить лечебный характер; в этом случае они применяются у субъектов, страдающих от инфекции, вызываемой одним или несколькими соответствующими патогенами. Кроме того, вирусы и векторы могут использоваться по отдельности или в сочетании друг с другом или с другими вакцинами. Субъекты, которые получают лечение в соответствии с методами настоящего изобретения, - это человек, а также другие представители млекопитающих (например, скот (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, козы) и домашние животные, в том числе коты и собаки).
Приготовление лекарственной формы векторов на основе ПИВ, ПИВ, векторов на основе ЖАВ и ЖАВ, представленных в настоящем изобретении, может осуществляться по стандартным методикам, принятым в фармакологии. Для приготовления вакцин возможно использование большого числа фармакологически приемлемых растворов; эти растворы при профессиональном подходе легко могут адаптироваться к настоящему изобретению (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). В двух отдельных примерах реализации настоящего изобретения препараты векторов на основе ПИВ, ПИВ, векторов на основе ЖАВ и ЖАВ приготавливаются на минимально-эссенциальной среде Эрля (МЭСЭ), содержащей 7,5% лактозы и 2,5% альбумина человеческой сыворотки, или на МЭСЭ, содержащей 10% сорбитола. В любом случае векторы ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ могут просто разводиться в физиологически приемлемом растворе, таком как стерильный солевой раствор или стерильный буферный солевой раствор.
Векторы на основе ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ, представленные в настоящем изобретении, могут применяться по методикам, принятым в медицине, а необходимое количество вирусов и
векторов легко определяется при профессиональном подходе. Необходимое количество вируса, которое следует ввести пациенту, может определяться на основании таких факторов, как, например, размер и общее состояние здоровья субъекта, которому предполагается введение вируса. Например, в случае живых аттенуированных вирусов, представленных в настоящем изобретении, вирусы могут приготавливаться в виде стерильного водного раствора, содержащего 102-108, например 103-107, инфекционных единиц (например, бляшкообразующих единиц или тканевых культуральных инфекционных доз) в определённом объеме препарата (0,1-1,0 мл). ПИВ могут вводиться в таких же дозах и в таком же объёме. Титры ПИВ, тем не менее, обычно измеряются, например, в фокусообразующих единицах, что определяется иммунологическим окрашиванием фокусов, поскольку эти дефектные конструкции, как правило, не образуют вирусоподобные частицы. Дозы могут варьировать от 102 до 108 БОЕ, а объём введения может составлять от 0,1 до 1,0 мл.
Все вирусы и векторы, представленные в настоящем изобретении, могут вводиться, например, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или перорально. В отдельных примерах реализации этого изобретения дендритные клетки активизируются при внутрикожном или чрескожном введении препарата с помощью, например, микроигл или микроабразивных устройств. Кроме того, вакцины, представленные в настоящем изобретении, могут вводиться в виде одиночной дозы или, как вариант, их введение может предполагать назначение нагрузочной дозы с последующей ревакцинацией, которая проводится, например, через 2-6 месяцев, что определяется медицинскими показаниями. Кроме того, вакцины на основе ПИВ могут назначаться путём иммунизации ДНК или РНК с использованием методов, известных в медицине (Chang et al., Nat. Biotechnol. 26:571-577, 2008; Kofler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1951-1956, 2004).
Кроме того, при введении вирусов и вакцин, представленных в изобретении, возможно применение адъювантов, известных в медицине. Адъюванты могут использоваться для усиления иммуногенности вирусов. К таким адъювантам относятся, например, липосомальные лекарственные формы, синтетические адъюванты, такие как QS21, мурамилдипептид, монофосфориллипид А, полифосфазин, олигонук-леотиды CpG или другие молекулы, которые активизируют колоколоподобные рецепторы (КПР) на поверхности клеток или на ядерной мембране внутри клетки. Несмотря на то что эти адъюванты обычно используются для усиления иммунного ответа на инактивированные вакцины, они также могут использоваться с живыми или репликационно-дефектными вакцинами. В случае живых и репликационно-дефектных вакцинам полезными могут оказаться как агонисты, так и антагонисты КПР. Кандидаты на звание вакцины могут создаваться так, чтобы экспрессировать агонисты КПР. В случае вирусов, которые поступают в организм через слизистые, например, перорально, возможно применение слизистых адъювантов, таких как термолабильный токсин Е.аэИ (LT) или мутантные производные LT. В дополнение к этому, гены, кодирующие цитокины, также обладают адъювантной активностью и могут вводиться в геном кандидатов на звание вакцины. Таким образом, гены, кодирующие определённые цитокины, такие как ГМ-КСФ, ИЛ-2 (интерлейкин-2), ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-5 и т.д., могут вводиться в геном вместе с чужеродными иммуногенами. Полученная в результате вакцина будет характеризоваться усиленным иммунным ответом или будет модулировать иммунитет в сторону преимущественного развития клеточного, гуморального ответа или ответа со стороны слизистой оболочки (например, см. обзор: Immunopo-tentiators in Modern Vaccines, Schijns and O'Hagan Eds., 2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston, и др.). Кроме того, в месте введения вакцины, как вариант, возможно применение пластыря, содержащего соответствующий адъювант в виде токсина. Токсин вызывает местное воспаление, вызывая миграцию лейкоцитов, что приводит к более выраженному иммунному ответу.
Примеры
Дополнительная информация об изобретении приведена в разделе "Примеры". В разделе "Примеры" приводится описание экспериментов, в которых исследовались ПИВ, основанные на вирусах ЛЗН, ЯЭ и ЖЛ (см., например, WO 2007/098267 и WO 2008/137163). Сначала было показано, что полученные конструкции значительно менее патогенны (по данным теста нейровирулентности у чувствительных грудных мышат; отсутствие смертельных случаев для всех исследованных доз), чем доступные ЖАВ, использовавшиеся в качестве контроля (ЖЛ17D, ЖАВ ЖЛ/ЯЭ, ЖАВ ЖЛ/ЛЗН). Авторы показали, что конструкции д-ПИВ в данной модели авирулентны, следовательно, двухкомпонентные ПИВ не вызывают неконтролируемого (неограниченного) распространения вирусов in vivo и не могут приводить к развитию клинических симптомов. Во-вторых, авторы сравнили иммуногенность и эффективность ПИВ и ЖАВ и показали, что вакцины на основе ПИВ могут вызывать развитие иммунного ответа, сравнимого с таковым для ЖАВ; таким образом, эти вакцины равноэффективны (например, это наблюдалось для пары вакцин ПИВ-ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН). Для одной из исследованных пар оказалось, что ЖАВ ЖЛ17D значимо более иммуногенен, чем ПИВ-ЖЛ. Следовательно, образование ВПЧ может различаться для разных конструкций ПИВ аналогичной структуры. Было предположено, что ПИВ-ЖЛ не приводит к образованию большого количества ВПЧ ЖЛ, в отличие от ПИВ-ЛЗН (ВПЧ ЛЗН), и что увеличенное образование ВПЧ может быть достигнуто путём генетических модификаций в соединении CprM субоптимальных конструкций ПИВ. Соединение CprM - это важная позиция в полипротеине флавивируса, которая участвует в образовании оболочки вируса и в синтезе вирусных белков (Yamshchikov and Compans,
Virology, 192:38-51, 1993; Amberg and Rice, J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Stocks and Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998). Авторы изобретения предположили, что выделение ВПЧ в клетках, инфицированных ПИВ, в отличие от образования вирусных частиц при инфицировании цельным вирусом, может усиливаться путём разъединения вирусной протеазы и сайтов расщепления сигналазой в месте соединения, а также путём применения сильного гетерологичного сигнального пептида (ТАП (тканевый активатор плазминогена) и т.д.) вместо сигнала для prM, а также путём мутагенеза сигнала для prM. Эффективность расщепления сигналазой в соединении CprM у флавивирусов низкая (Stocks and Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998), например, по прогнозам он-лайн-программы Signal P 3.0. Ожидается, что более эффективное расщепление может быть достигнуто путём анализа замещений специфичных аминокислот в области сайта расщепления с помощью Signal P 3.0 (например, как описано в заявке WO 2008/100464) с последующим включением избранных мутаций в геномы ПИВ, восстановлением потомства ПИВ и измерением выделения ВПЧ. Сигналы нефлавивирусного происхождения вставляются в геном флавивирусов по стандартным методикам. Разъединение сайтов расщепления вирусной протеазой и сигналазой может достигаться путём абляции вирусного сайта расщепления любой неконсервативной мутацией (например, RRS в С вируса ЖЛ17D до RRA, или GRS, или RSS и т.д.) или делецией всего сайта или нескольких из его 3 остатков. При необходимости, образование свободного N-концевого участка чужеродного белка может достигаться с помощью таких элементов, как аутопротеаза или терминирующий кодон, следующий за СВВР. Кроме того, нативный инициирующий кодон AUG гена белка С также может подвергаться абляции (в конструкциях, где последовательность белка С не является необходимой, например, ДС ПИВ), и AUG может размещаться перед чужеродным антигеном. Оптимизация сигналов вектора может проводиться путём случайного мутагенеза, например путём инсерции синтетической рандомизированной последовательности с последующей идентификацией жизнеспособных вариантов ПИВ с повышенной секрецией ВПЧ.
Авторы также установили, что конструкции ПИВ были гораздо более иммуногенными у хомяков при внутрибрюшинном введении, чем при подкожном. По-видимому, это связано с более направленным воздействием на антигенпрезентирующие клетки в лимфоидной ткани, которых много в брюшной полости и гораздо меньше в подкожной клетчатке. На основании этих наблюдений пришли к выводу, что эффективное воздействие ПИВ на дендритные клетки, которых много в коже, возможно при чрескожном введении вакцины, например при микроабразии кожи или внутрикожном введении с помощью микроигл (Dean et al., Hum Vaccin. 1:106-111, 2005).
Кроме того, были проведены эксперименты, подтверждающие осуществимость введения смесей, или коктейлей, различных ПИВ, как это описано в настоящем изобретении (например, ЯЭ + ДЕН и ЖЛ + ДЕН). При введении коктейлей очень важно подтвердить, что взаимодействие между одновременно назначаемыми компонентами отсутствует и что индуцируется развитие сбалансированного иммунного ответа. Для иммунизации грызунов использовались различные смеси ПИВ. Развивающийся иммунный ответ сравнивался с иммунным ответом на введение конструкций ПИВ по отдельности. Взаимодействия компонентов смеси не наблюдалось. Таким образом, применение коктейлей ПИВ вполне осуществимо. Такие составы могут иметь особое значение в географических регионах, в которых одновременно циркулируют несколько различных флавивирусов. Этот подход также может быть использован для одновременного введения нескольких вакцин на основе ПИВ против патогенов нефлавивирусного происхождения.
Более того, было показано, что после введения по меньшей мере двух доз ПИВ ответа со стороны нейтрализующих антител против пакующей оболочки вируса не развивалось (выявлялись антитела против ВПЧ, выделяющихся из инфицированной клетки). Это было показано с помощью вспомогательного компонента д-ПИВ (см. фиг. 2) ^prME), упакованного отдельно, а также путём определения нейтрализующих антител к гетерологичным пакующим оболочкам (например, к оболочке вируса ЛЗН, которая использовалась для упаковки ПИВ-ЯЭ во вспомогательных клетках, в которых транскрибируются ЛЗН-специфичные белки CprME). Последнее наблюдение подтверждает целесообразность последовательного применения различных вакцин на основе ПИВ, произведенных на универсальной пакующей клеточной линии, и последовательного применения различных рекомбинантных вакцин на основе ПИВ-векторов у одного пациента, как указывалось выше. В дополнение, авторы подтвердили прежние наблюдения, что конструкции ПИВ могут стабильно распространяться с высоким выходом in vitro и что рекомбинантного восстановления полноценных вирусных частиц после длительного и многократного пассажа в субстратных клетках не происходит (Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol. 21:1173711748, 2007).
Эти и другие аспекты изобретения обсуждаются далее в разделе "Примеры".
Пример 1. Исследования создания платформы на основе псевдоинфекционных вирусов. Аттенюирование в модели нейровирулентности (НВ) на грудных мышатах.
Материалы, использованные в исследованиях, описание которых дано ниже, характеризуются в табл. 1 и цитированных в ней литературных источниках. К таким материалам относятся о-ПИВ-ЛЗН (основанный на последовательностях вируса ЛЗН дикого типа штамма NY99), о-ПИВ-ЯЭ, о-ПИВ-ЛЗН/ЯЭ (основанный на остове вируса ЛЗН дикого типа и генах prME вируса ЯЭ дикого типа штамма Накаяма [Nakayama]), о-ПИВ-ЖЛ/ЛЗН (остов вируса ЖЛ 17D и гены prME вируса ЛЗН) и о-ПИВ-ЖЛ (основанный на последовательностях вируса ЖЛ17D). К дополнительным материалам относятся д-ПИВ-ЖЛ (д-ПИВ ЖЛ, выращенный на обычных клетках ПДХ (почек детёнышей хомяков); Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007) и двухкомпонентный д-ПИВ-ЛЗН (выращенный на обычных клетках среды Vero; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008).
Результат аттенуирования (ослабления) этих прототипов ПИВ сравнивался с ЖАВ ЖЛ 17D, химерическим вирусом ЖЛ/ЯЭ и химерическим вирусом ЖЛ/ЛЗН в тесте НВ на грудных мышатах (внутри-кожное введение вируса). Для этого использовались высокочувствительные 5-дневные мыши линии ICR. Химерические вирусы включали нуклеокапсид и неструктурные последовательности вируса желтой лихорадки и последовательности prME вируса ЯЭ или ЛЗН). Ни у одного из животных, которым вводилась конструкция ПИВ, не было выявлено клинических признаков заболевания; смертельных случаев также не было. Смертельные случаи наблюдались у животных, инфицированных ЖАВ (табл. 2). Вирус ЖЛ17D нейровирулентен для мышей всех возрастов, тогда как химерические вакцины не являются нейровиру-лентными для взрослых мышей, но могут приводить к дозозависимой смертности у более чувствительных грудных мышат (Guirakhoo et al., Virology, 257:363-372, 1999; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). В соответствии с этим 90-100% грудных мышат, которым была введена как минимум 1 БОЕ вируса ЖЛ17D, погибли. ЖАВ ЖЛ/JE и ЖЛ/ЛЗН вызывали частичную смертность при введении в значительно более высоких дозах ((> 2 log10 БОЕ и 3 log10 БОЕ соответственно), а средняя продолжительность жизни (СПЖ) у умерших животных, как и ожидалась, была выше. Таким образом, эта чувствительная модель показала, что конструкции ПИВ совершенно авирулентны (по меньшей мере в 20000-200000 раз менее нейровирулентны, чем лицензированная вакцина ЖЛ17D).
д-ПИВ ЖЛ и ЖЛ ЛЗН не приводили к появлению клинических симптомов заболевания, а смертельных случаев зарегистрировано не было. Следовательно, двухкомпонентные варианты ПИВ, которые теоретически могут распространяться в ткани мозга, вследствие коинфицирования клеток обоими компонентами, не приводили к развитию заболевания. Более того, авторы попытались определить д-ПИВ в ткани головного мозга дополнительных животных в условиях этого эксперимента. Мыши забивались на 6-й день после введения ПИВ. Титрование не выявило д-ПИВ в ткани головного мозга (головной мозг 10 и 11 мышей, которым было введено 4 log10 БОЕ д-ПИВ ЖЛ и д-ПИВ ЛЗН соответственно, гомогенизировался и титровался). Таким образом, д-ПИВ не приводят к распространению инфекции, что было бы характерно для полноценного вируса. ЖАВ ЖЛ/ЯЭ, как было показано, реплицируется в головном мозге взрослых мышей линии ICR, заражённых внутрикожно, с пиковым титром на 6-й день, составляющим вирусом ~6 log10 БОЕ/г, что протекает, однако, бессимптомно (Guirakhoo et al., Virology, 257:363-372, 1999). Коинфицирование клеток компонентами д-ПИВ, очевидно, менее эффективный процесс в плане распространения инфекции, чем инфицирование полноценным вирусом. Данные указывают на то, что репликация д-ПИВ in vivo быстро попадает под контроль врождённого иммунитета (а также приобретённого иммунитета у взрослых животных).
Иммуногенностъ/эффективностъ у мышей и хомяков.
Иммуногенность/эффективность прототипов ПИВ, описанных выше, сравнивалась с соответст-
вующими характеристиками химерических ЖАВ и вируса ЖЛ 17D на мышах и сирийских хомяках. Об-
щий принцип эксперимента показан на фиг. 3 (мыши, внутрибрюшинная иммунизация). Эксперименты
на хомяках проводились аналогично (плюс-минус несколько дней, подкожное или внутрибрюшинное
введение вирусов, дозы указаны ниже). Мыши линии ICR в возрасте 3,5 недели (группы о-ПИВ-ЛЗН и
о-ПИВ-ЖЛ, ЖАВ ЖЛ/ЛЗН и ЖЛ 17D) и мыши линии C57/BL6 (группы о-ПИВ-ЯЭ и ЖАВ ЖЛ/ЯЭ) им-
мунизировались внутрибрюшинно различными дозами конструкций ПИВ (4-6 log10 ФОН на дозу) или
химерических ЖАВ и ЖАВ (4 log10 БОЕ). Группы ПИВ-ЛЗН, ПИВ-ЯЭ и ПИВ-ЖЛ ревакцини-
ровались на 21-й день соответствующими конструкциями в дозе 5 log10 БОЕ (табл. 3). С помощью стандартного метода PRNT50 (реакции нейтрализации редукции бляшек) в сыворотке определялся уровень нейтрализующих антител против ЖАВ ЖЛ/ЛЗН или /ЯЭ, а также против вируса ЖЛ17D. ПИВ-ЛЗН индуцировал сильно выраженный ответ со стороны нейтрализующих ЛЗН-специфических антител во всех группах животных как с ревакцинацией, так и без неё, на что указывали титры PRNT50, определяемые в пулах плазмы иммунизированных животных на 20- и 34-й дни; эти титры были сравнимы с титрами в контрольной группе ЖАВ ЖЛ/ЛЗН. В соответствии с этим животные, иммунизированные ПИВ-ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН, были защищены от потенциально летального заражения вирусом ЛЗН дикого типа, которое проводилось на 35-й день (внутрибрюшинно, 270 ЛД50), чего не происходило с животными, иммунизированными имитацией вакцины (табл. 3). При определении уровня ЛЗН-нейтрализующих антител в сыворотке отдельных мышей отмечалась высокая степень однородности иммунного ответа у различных
животных (фиг. 4). Таким образом, вакцины на основе ПИВ с одним циклом репликации могут быть равны по иммуногенности и эффективности соответствующим ЖАВ. ПИВ-ЯЭ также оказались высоко-иммуногенными (у чёрных мышей), тогда как иммуногенность ПИВОЖЛ была значительно ниже, чем у контрольного вируса ЖЛ17D (мыши ICR). Тем не менее, отмечалась дозозависимая защита животных, иммунизированных ПИВ-ЖЛ (но не животных, которым вводилась имитация вакцины), после тяжёлого, потенциально летального внутрикожного заражения вирусом ЖЛ дикого типа (штамм Асиби [Asibi]) (500 ЛД50) (табл. 3). Эти данные согласуются с тем, что защитным по отношению к флавивирусной инфекции считается титр нейтрализующих антител, равный 1:10.
Контрольный вирус ЖЛ17D был высокоиммуногенным (например, на 34-й день титр PRNT50 составлял 1:1280); этот вирус мог инфицировать клетки и эффективно реплицироваться in vivo, а его оболочка является сильным иммуногеном. Следовательно, маловероятно, что низкая иммуногенность ПИВ-ЖЛ была связана с его неспособностью инфицировать клетки или реплицироваться в инфицированных клетках in vivo. Авторы изобретения считают, что низкая иммуногенность ПИВ-ЖЛ (например, по сравнению с ПИВ-ЛЗН), вероятнее всего, связана с низким уровнем образования ЖЛ-специфичных ВПЧ в клетках, инфицированных ПИВ-ЖЛ (тогда как в клетках, инфицированных ПИВ-ЛЗН, секреция ВПЧ высока). Как указывалось выше, мы предполагаем, что иммуногенность ПИВ-ЖЛ может быть значительно повышена, например, путём соответствующих модификаций соединения CprM, например путём разъединения сайтов расщепления двумя протеазами, которое происходит в этом соединении (т.е. сайтов расщепления вирусной протеазой и сигналазой), и/или применением сильного гетерологичного сигнала [например, сигнала белка G вируса бешенства или сигнала эукариотического тканевого активатора плаз-миногена (ТАП) (Malin et al., Microbes and Infection, 2:1677-1685, 2000) и др.] вместо сигнала ЖЛ для prM.
Аналогичный эксперимент был проведен на сирийских хомяках в возрасте 4,5 недели; сравнивалась иммуногенность конструкций ПИВ и контрольных ЖАВ. Животные иммунизировались подкожно исследуемыми вирусами в различных дозах (табл. 4). ПИВ-ЛЗН характеризовался высокой иммуногенно-стью, например, титр ЛЗН-специфичных антител (PRNT50) на 38-й день составлял 1:320, 1:640 и 1:1280 в группах животных, которым было введено 5, 6 и 6 (нагрузочная доза) + 5 (ревакцинация) log10 БОЕ, соответственно. Такой результат был несколько ниже, чем для контрольного ЖАВ ЖЛ/ЛЗН (доза 4 log10 БОЕ, титр > 1:2560). ПИВ-ЯЭ и ПИВ-ЖЛ индуцировали образование специфических нейтрализующих антител, титр которых был всё же ниже, чем для контрольных вирусов ЖАВ Л/ЯЭ и ЖЛ17D. Все животные, иммунизированные ПИВ-ЛЗН и ЖЛ/ЛЗН, были надёжно защищены от потенциально летального заражения ЛЗН дикого типа, на что указывало отсутствие смертельных случаев и заболеваемости (например, потери массы тела после заражения), а также отсутствие или значительное снижение уровня ви-ремии вируса ЛЗН после заражения. Животные, которым вводилась имитация вакцины, были не защищены от заражения (табл. 4). ПИВ-ЯЭ и ПИВ-ЛЗН защищали животных от последующего заражения дозозависимым образом. Эффективность защиты в этом эксперименте показана на фиг. 5. Например, у животных, которым вводилась имитация вакцины, отмечалась высокая виремия вируса ЖЛ после заражения (штамм Asibi, адаптированный к хомякам). Пик виремии отмечался на 3-ий день, титр вирусов составлял > 8 log10 БОЕ/мл (верхняя левая часть фигуры); у всех этих животных определялась потеря массы тела, одно из 4-х животных погибло (верхняя правая часть фигуры). В отличие от этого виремия была значительно более низкой или отсутствовала вообще у хомяков, иммунизированных ПИВ-ЖЛ (две дозы), несмотря на относительно низкий титр нейтрализующих антител, или вирусом ЖЛ17D; ни у одного из этих животных снижения массы тела не было. Аналогично, животные, иммунизированные ПИВ-ЛЗН или ЖАВ ЖЛ/ЛЗН, были полностью или в значительной степени защищены от виремии вируса ЛЗН после заражения, от снижения массы тела и смерти, чего не отмечалось в случае животных, которым была введена имитация вакцины. Следовательно, на второй животной модели была показана высокая иммуногенность и эффективность ПИВ.
В другом эксперименте на хомяках животные иммунизировались конструкциями ПИВ внутрибрю-шинно; всего вводилось две дозы вакцины. В табл. 5 приведены результаты сравнения иммунного ответа со стороны нейтрализующих антител (специфичных для каждой вакцины), содержание которых определялось в пулах плазмы хомяков в предыдущем эксперименте (подкожное введение вакцины), и после внутрибрюшинной иммунизации. Сравнение проводилось для ПИВ-ЛЗН, ПИВ-ЖЛ/ЛЗН, ПИВ-ЛЗН/ЯЭ и ПИВ-ЖЛ после введения первой дозы (20-21-й день) и после введения второй дозы (34-38-й день). Было выявлено чёткое влияние пути иммунизации после введения первой и второй доз вакцины. Например, после введения первой дозы ПИВ-ЛЗН при подкожной иммунизации уровень ЛЗН-специфичных антител составлял 1:40 (по данным PRNT50), тогда как при внутрибрюшинной иммунизации титр антител был значительно выше (1:320). Та же картина наблюдалась и после введения второй дозы вакцины (титры были такими же). Для других конструкций было выявлено более выраженное влияние пути иммунизации после введения первой и второй доз вакцины. Интересно, что ПИВ-ЖЛ/ЛЗН оказался высоко иммуно-генным при внутрибрюшинном введении (титр 1:320 после внутрибрюшинного введения первой дозы и 1:20 после подкожного введения первой дозы вакцины; титр 1:1280 после внутрибрюшинного введения первой дозы и 1:160 после подкожного введения второй дозы). Аналогично, было отмечено значительное
увеличение иммуногенности ПИВ-ЯЭ (например, титр ЯЭ-специфичных антител после внутрибрюшин-ного введения двух дох составлял 1:640). Таким образом, более прицельное воздействие на клетки лим-фоидной ткани, в частности, на антиген-презентирующие клетки, число которых в брюшной полости гораздо выше, чем в тканях под кожей, является важным фактором успешного применения вакцин на основе ПИВ. У человека эффективное воздействие на дендритные клетки кожи, что увеличивает амплитуду иммунного ответа, возможно при внутрикожном введении вакцины. Это предлагаемый авторами способ иммунизации ПИВ человека.
В описанных выше экспериментах также проводили определение индукции образования нейтрализующих антител против пакующих оболочек (отдельно от ответа на ВПЧ, которые закодированы в конструкциях ПИВ и выделяются инфицированными клетками). Метод PRNT50 не выявил ЛЗН-специфичных нейтрализующих антител у животных, иммунизированных 5 log10 БОЕ второго компонента д-ПИВ ЛЗН, содержащим делецию ДCprME и, таким образом, не кодирующим ВПЧ, по пакующим оболочки ЛЗН во вспомогательных клетках линии ПДХ - CprME (ЛЗН). В сыворотке животных, иммунизированных 4 log10 БОЕ второго компонента д-ПИВ ЖЛ, упакованного в оболочки ЖЛ, ЖЛ-специфичных нейтрализующих антител обнаружено не было. Две дозы ПИВ-ЖЛ/ЛЗН, упакованного в оболочку ЖЛ, не индуцировали образование ЖЛ-специфичных нейтрализующих антител. Аналогично, две дозы ПИВ-ЯЭ, упакованного в оболочку ЛЗН не индуцировали образования ЛЗН-специфичных антител. Отсутствие нейтрализующих антител против пакующих оболочек позволяет наладить производство различных вакцин ПИВ на одной (универсальной) вспомогательной клеточной линии, а также проводить иммунизацию пациента различными рекомбинантными вакцинами, основанными на одно и том же векторе, в соответствии с настоящим изобретением.
Коктейли ПИВ.
ПИВ осуществляют один цикл репликации in vivo (как вариант, возможно осуществление нескольких циклов, число которых ограниченно). Поэтому считаем, что смеси различных ПИВ могут назначаться одновременно без взаимодействия между отдельными конструкциями полученной смеси, или коктейля. Для подтверждения возможности использования вакцин на основе ПИВ в виде коктейлей иммунные ответы у мышей и хомяков против некоторых конструкций ПИВ, назначаемых в виде смесей, сравнивались с иммунными ответами против этих же конструкций, вводимых по отдельности. В обеих животных моделях были получены одинаковые результаты. Результаты эксперимента на мышах приведены в табл. 6. В пулах сыворотки от животных, которым вводилась одна или две дозы смеси ПИВ-ЯЭ + ПИВ-ЛЗН или только ПИВ-ЯЭ, определялись схожие титры ЯЭ-специфичных нейтрализующих антител (1:20 и 1:80; 1:640 и 1:160 для одной и двух доз соответственно). Аналогично, титры ЛЗН-специфичных антител при введении смеси ПИВ-ЯЭ + ПИВ-ЛЗН и только одного ПИВ-ЛЗН были похожими (1:320 и 1:640; 1:5120 и 1:5120 для одной и двух доз соответственно). Перекрёстно-специфичный ответ при введении ПИВ-ЯЭ или ПИВ-ЛЗН практически не развивался или был слабо выражен. Эти результаты также подтверждают титры антител в сыворотке отдельных животных, измеренные с помощью PRNT50. Таким образом, понятно, что вакцины на основе ПИВ могут эффективно назначаться в виде коктейлей, индуцируя развитие иммунитета против двух или большего числа патогенов флавивирусного происхождения. В дополнение следует сказать, что, как указывалось выше, различные коктейли могут включать вакцины, основанные на ПИВ нефлавивирусного происхождения, а также вакцины, основанные на ПИВ-флавивирусах и ПИВ нефлавивирусного происхождения.
Исследования in vitro.
Различные прототипы ПИВ серийно пассажировались до 10 раз во вспомогательных клетках среды ПДХ или в обычных клетках среды Vero (для д-ПИВ). Образцы, забираемые после каждого пассажа, титровались в клетках среды Vero путём иммунологического окрашивания. Конструкции размножались до высоких титров, однако рекомбинантного восстановления полноценного вируса не наблюдалось. Например, число ПИВ-ЛЗН постепенно выросло до титра 7-8 log10 БОЕ/мл во вспомогательных клетках среды ПДХ - C-prM-E (ЛЗН), содержащих репликон вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (ВЛЭ), экспрессирующий белки C-prM-E вируса ЛЗН, а число д-ПИВ ЛЗН возрастало до 8 log10 БОЕ/мл в клетках культуры Vero, причём рекомбинации не отмечалось.
Пример 2. ПИВ-КЭ.
Последовательности кандидатов на звание вакцины на основе ПИВ-КЭ могут основываться на последовательностях вируса КЭ дикого типа или серологически сходного с ним вируса Лангат (ЛГТ) (естественно аттенуированный вирус, например штамм дикого типа ТР-21 или его эмпирически аттенуиро-ванный вариант, штамм Е5) или основываться на химерических последовательностях, содержащих остов (нуклеокапсидная и неструктурные последовательности) вируса ЖЛ17D или других флавивирусов, например вируса ЛЗН, и гены белков prME вирусов КЭ, ЛГТ или других серологически близких флавиви-русов из серокомплекса вируса КЭ. Кандидаты на звание ЖАВ ДЛ/КЭ сконструированы на основе остова вируса ЖЛ17D и генов prME вируса КЭ или связанных с ним вирусов (например, вируса ЛГТ, штамм Е5), т.е. по тому же принципу, что и другие химерические вакцины на основе ЖАВ.
Конструирование прототипов вакцины ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ проводилось путём клонирования соответствующих генетических элементов в плазмиды для получения ПИВ-ЛЗН (Mason et al., Virology,
351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008) или в плазмиды для получения химерических ЖАВ (например, pBSA-AR1 - одноплазмидная версия инфекционного клона ЖАФ ЖЛ/ЯЭ; WO 2008/036146) в соответствии со стандартными методиками, принятыми в генетике. Сначала проводили компьютерную оптимизацию кодона последовательностей prM штамма Hypr вируса КЭ (номер доступа в GenBank U39292) и штамма Е5 вируса ЛГТ (номер доступа в GenBank AF253420), чтобы соответствовать предпочтительному использованию кодона в геноме человека, а также для выявления повторяющихся последовательностей, превышающих в размерах 8 нуклеотидов, для обеспечения высокой генетической стабильности вставок (при необходимости может быть выполнено дальнейшее сокращение величины повторяющихся последовательностей нуклеотидов). Гены синтезировались химически и клонировались в плазмиды для получения ПИВ-ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЯЭ. Получившиеся в результате плазмиды транскрибировались in vitro. Затем транскрипты РНК трансфицировались в соответствующие клетки (клетки культуры Vero для химерических вирусов или вспомогательные клетки ПДХ для ПИВ). Так получались образцы вируса и ПИВ.
Конструкции ЖАВ ЖЛ/КЭ.
В конструкциях ЖЛ/КЭ, содержащих гены prME штамма Hypr вируса КЭ (плазмиды р42, р45 и р59) или штамма Е5 вируса ЛГТ (плазмида Р43), сначала изучались два различных вида соединения CprM (см. фиг. 6; соединения С-prM приведены в приложении 1, и полная последовательность 5'-концевого участка, покрывающая 5'-концевую нетранслируемую область-C-prM-E-начало области NS1, приведена в приложении 2). Химера ЖЛ17D/Hypr из плазмиды р42 содержала сигнальный пептид гибрида ЖЛ17D/Hypr для белка prM, тогда как химера ЖЛ17D/Hypr из плазмиды р45 содержала сигнальный пептид гибрида ЖЛ17D/ЛЗН для белка prM (приложение 1). Первый химерический вирус создавал очень высокие титры в Р0 (сразу же после трансфекции) и Р1 (следующий пассаж в клетках культуры Vero) - до 7,9 log10 БОЕ/мл, что было в 0,5 log10 раз выше, чем титры последнего вируса; в дополнение к этому, первый вирус образовывал в клетках культуры Vero значительно большие бляшки (фиг. 6). Следовательно, использование КЭ-специфичных остатков в сигнальном пептиде для prM предоставляло значительные преимущества в росте вирусов, по сравнению с сигналом, содержащим ЛЗН-специфичные остатки. Химеры ЖЛ17D/ЛГТ из плазмид включали такой же сигнал для prM, что и вирус из плазмид р42. Эти химеры также характеризовались очень высоким титром в пассажах Р0 и Р1 (до 8,1 log10 БОЕ/мл) и образовывали крупные бляшки. Вирус, производный от вируса из плазмид р42, также образовывался в плазмидах р59, которые содержали сильную аттенуирующую мутацию, которая описывалась ранее в контексте вирусной вакцины на основе ЖАВ ЖЛ/ЛЗН, а именно 3-а.а.-делецию в гене специфичного для ЖЛ17D белка С (PSR, остатки 40-42 в начале а-спирали I; WO 2006/116182). Как и ожидалось, вирус из р59 рос в меньших титрах (5,6 и 6,5 log10 БОЕ/мл в Р0 и Р1 соответственно) и образовывались меньшие бляшки (что определялось в отдельном эксперименте с титрованием; это не отражено на фиг. 6) по сравнению с родительской химерой из плазмид р42. Эти первоначальные наблюдения о ростовых свойствах прототипов ЖАВ ЖЛ/КЭ и корреляция репликации in vitro с морфологией бляшек были подтверждены в экспериментах с кривыми роста (фиг. 8).
Конструкции ПИВ-КЭ.
Конструировались варианты ПИВ-ЛЗН/КЭ. Упакованные образцы ПИВ получались в плазмидах р39 и р40 (фиг. 7; приложение 1 для последовательности соединения CprM, приложение 3 для полной последовательности 5'-нетранслируемая концевая область-ДCprME-начало NS1). Эти образы содержали полноценные сигналы prM вирусов Hypr и ЛЗН соответственно. Оба ПИВ успешно восстанавливались и размножались во вспомогательных клетках культуры ПДХ-CprME (ЛЗН) или ПДХ-С (ЛЗН) (Mason et al., Virology, 351:432-443, 2006; Widman et al., Vaccine, 26:2762-2771, 2008). Титры образов в Р0 и P1 варианта из р39 были в 0,2-1,0 log10 раз выше, чем титры варианта из плазмид р40. В дополнение к этому, клетки культуры Vero, инфицированные вариантом р39, в иммунофлуоресцентном анализе, в котором использовались поликлональные КЭ-специфичные антитела, окрашивались ярче, чем клетки, инфицированные вариантом р40, что указывает на более эффективную репликацию (фиг. 7). Более высокая скорость репликации кандидата р39, чем кандидата р40 была подтверждена в эксперименте с кривыми роста (фиг. 8). В последнем эксперименте оба кандидата, по-видимому, лучше росли на вспомогательных клетках культуры ПДХ-С(ЛЗН), чем на клетках культуры ПДХ-CprME (ЛЗН); так, титр варианта р39 достигал ~7 log10 БОЕ/мл на 5-й день (заметьте: пиковые титры достигнуты не были). Открытие эффекта сигнала prM на скорость репликации кандидатов на звание вакцины на основе ПИВ и химерических ЖАВ, а также сравнение способности различных сигналов образовывать более эффективно реплицирующуюся и более иммуногенную конструкцию являются отличительными чертами данного подхода. Как указывалось выше, настоящее изобретение также включает использование других сигналов флавивирусов, включая сигналы с соответствующими мутациями, с разъединением сайтов расщепления вирусной про-теазой и сигналазой в соединении CprM, например, путём мутации или удаления сайта расщепления вирусной протеазой в С-концевой участке гена С, предшествующему сигналу prM, с использованием сильных сигналов нефлавивирусного происхождения (например, сигнала ТАП и др.) вместо сигнала prM, а также с оптимизацией последовательностей, расположенных дальше сайта расщепления сигналазой.
В изобретении также представлены и другие варианты ПИВ-КЭ, основанные на вирусе КЭ дикого типа (штамм Hypr) и вирусе ЛГТ (штамм дикого типа ТР21 или аттенуированный штамм Е5), а также химерические вирусы, содержащие остов вируса ЖЛ 17D и последовательности prME вирусов КЭ или ЛГТ. Вспомогательные клетки, экспрессирующие белки С, CprME и т.д. (например, КЭ-специфичные белки), необходимые для транскомплементации, могут создаваться путём трансфекции стабильной ДНК или с помощью соответствующего вектора, например репликона альфа-вируса, такого как репликон штамма ТС-83 вируса венесуэльского лошадиного энцефалита, с последующей селекцией клеток, содержащих репликон, с помощью антибиотика. В реализации изобретения на практике могут использоваться клетки культур Vero и ПДХ-21. Последняя культура - это признанный субстрат для изготовления вакцин для применения у человека; кроме того, возможно использование других клеточных линий, пригодных для создания вакцин для применения у человека или в ветеринарии. В дополнение к конструкциям о-ПИВ, возможно также создание конструкций д-ПИВ. Для получения дополнительных гарантий безопасности вакцин для человека, животных и окружающей среды в них могут водиться соответствующие модификации, включая применение дегенеративных кодонов и комплементарных мутаций в 5'- и 3'-элементов CS, что позволит снизить вероятность рекомбинаций, которые теоретически могут привести к появлению жизнеспособного вируса. После конструирования кандидаты на звание вакцины могут оцениваться in vitro на стабильность и пригодность к массовому производству и in vivo на аттенуирование и иммуногенность/эффективность. Для этого могут использоваться доступные доклинические животные модели, например, такие, как модели, использованные для создания и контроля качества вакцин против
КЭ и ЖЛ.
Нейровирулентностъ и нейроинвазивностъ конструкций ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ у мышей.
Молодые взрослые мыши линии ICR (возраст ~3,5 недели) инфицировались кандидатами на звание ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ в различных дозах; для определении нейровирулентности проводилось внутри-кожное заражение, а для определения нейроинвазивности - внутрибрюшинное заражение (позднее также определялись иммуногенность и эффективность). Животные, которым вводилось 5 log10 ФОБ ПИВ-Hypr (варианты р39 и р40) обоими способами, выживали, слабости у них также не определялось, как и у животных, которым вводилась имитация вакцины (табл. 7); таким образом, вакцины на основе ПИВ-КЭ полностью авирулентны. У мышей, заражённых внутрикожно контрольными вирусами ЖЛ 17D (1-3 log10 БОЕ), определялась дозозависимая смертность, тогда как животные, заражённые внутрибрюшинно (5 log10 БОЕ), выживали, что соответствует представлениям об отсутствии нейроинвазивности вируса ЖЛ 17D. Все животные, которым вводились различные дозы прототипов ЖАВ ЖЛ/КЭ (р42, р45, р43 и р59) (2-4 log10 БОЕ), умерли (была совершена эвтаназия умирающих животных). Эти варианты, по-видимому, менее аттенуированы, чем вирус ЖЛ 17D, например, об этом свидетельствует 100%-ная смертность и более короткая СПЖ при введении вирусов в дозе 2 log10 БОЕ - самой низкой из исследованных доз для кандидата на звание ЖАВ ЖЛ/КЭ. Фенотип ПИВ-КЭ, характеризующийся отсутствием нейровирулентности, вирулентный фенотип ЖАВ ЖЛ/КЭ и фенотип ЖЛ 17D с промежуточной вирулентностью представлены на фиг. 9, на котором показаны кривые выживания мышей после внутрикож-ного заражения. Следует отметить, что варианты р43 (гены prME вируса ЛГТ) и р59 (вариант ЖАВ ЖЛ/Hypr с делецией dC2) были менее нейровирулентными, чем конструкции ЖАВ ЖЛ/Hypr р42 и р45, на что указывает разница в СПЖ для соответствующих доз вирусов (табл. 7). В дополнение к этому, кандидаты р43 и р 59 характеризовались отсутствием нейроинвазивности, тогда как р42 и р 45 приводили к частичной смертности после внутрибрюшинного введения в дозе 5 log10 БОЕ (табл. 7; фиг. 10). Следует отметить, что, как бы то ни было, все конструкции ЖАВ ЖЛ/КЭ были значительно слабее (т.е. были ат-тенуированы), чем вирусы КЭ дикого типа, например чем вирус штамма Hypr дикого типа, который был одинаково высоко вирулентен для мышей в низких дозах при внутрикожном (ЛД50 ~0,1 БОЕ) и внутри-брюшинном введении (ЛД50 <10 БОЕ) (Wallner et al., J. Gen. Virol. 77:1035-1042, 1996; Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998; Mandl et al., J. Gen. Virol. 78:1049-1057, 1997).
Иммуногенность/эффективность конструкций ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ у мышей.
Определялся ответ со стороны КЭ-специфичных нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных одной или двумя дозами описанных выше вариантов ПИВ-КЭ или ЖАВ ЖЛ/КЭ, а также человеческой вакциной против КЭ, инактивированной в формалине (1:30 человеческой дозы) (внутрибрюшин-ная иммунизация). Затем животные заражались вирусом штамма Hypr КЭ дикого типа (500 БОЕ внутри-брюшинно); определялась заболеваемость (например, снижение массы тела) и смертность после заражения.
На 20-й день после иммунизации определялся ответ со стороны КЭ-специфичных нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных одной или двумя дозами описанных выше вариантов ПИВ-КЭ или ЖАВ ЖЛ/КЭ (см описание эксперимента в табл. 7), а также человеческой вакциной против КЭ, инакти-вированной в формалине (1:20 человеческой дозы, одна или две дозы) и контролем - имитацией вакцины ЖЛ 17D (внутрибрюшинная иммунизация). Определение антител против вируса КЭ штамма Hypr дикого типа проводилось методом PRNT50 (реакция нейтрализации редукции бляшек на 50%) (табл. 8; вторая доза указанных исследуемых вакцин вводилась на 14-й день). Проводилось определение титров антител в сыворотке отдельных животных, в пулах сыворотки от двух животных (в большинстве случаев) и в
пулах сыворотки от 4 животных для групп отрицательного контроля (ЖЛ17D и имитация вакцины). Титры антител в отдельных сыворотках, а также средние геометрические титры (СГТ) для каждой из групп приведены в табл. 8. Титры антител в исследованных образцах были сходными в пределах каждой группы, например, в группах, иммунизированных ПИВ, что указывает на высокую однородность иммунного ответа у животных. Как и ожидалось, нейтрализующих КЭ-специфичных антител в группах отрицательного контроля не определялось (группы ЖЛ17D и имитации вакцины; СГТ <1: 10); в соответствии с этим животные в этих группах оказались незащищёнными от заражения на 21-й день после иммунизации вирусом КЭ дикого типа (штамм Hypr) в высокой дозе (500 БОЕ внутрибрюшинно). Данные о смертности за ограниченный период наблюдения (9 дней после заражения; наблюдение было продолжено) представлены в табл. 8, а динамика средней массы тела после заражения, указывающая на заболеваемость, приведена на фиг. 11. Нейтрализующие антитела были выявлены в организмах убитых животных в группе вакцинного контроля; титр этих антител был особенно высок после введения двух доз вакцины (СГТ 1:1496); животные в группе 2 доз вакцины были полностью защищены от КЭ, и смертности или потери массы тела в этой группе не было (это не относится к животным из группы 1 дозы вакцины). У животных, которым была введена одна или две дозы ПИВ-Hypr р39, титр антител был очень высок (СГТ 1:665 и 1:10584); эти животные были надёжно защищены от КЭ. Это указывает на то, что введение дефектной вакцины на основе о-ПИВ-КЭ приводит к развитию бурного иммунитета. У двух животных, выживших после иммунизации химерой ЖЛ/Hypr р42 (см. табл. 7), титр антител также был высоким (СГТ 1:6085); эти животные были защищены от заражения вирусом дикого типа (табл. 8; фиг. 11).
Интересно, что ПИВ-Hypr р40 и ЖЛ/Hypr р45 оказались слабоиммуногенными (СГТ 1:15 и 1:153 для одной и двух доз и 1:68 соответственно. Как указывалось выше, эти вакцины содержали ЛЗН-специфичные последовательности в сигнале для prM, тогда как высокоиммуногенные конструкции ПИВ-Hypr р39 и ЖЛ/Hypr р42 содержали КЭ-специфичные сигнальные последовательности. В соответствии с приведенными выше данными этот результат указывает на важность правильного выбора сигнала для prM, например, КЭ-специфичного сигнала. Это позволит добиться высокого уровня репликации и выделения ВПЧ, что в рамках этого эксперимента in vivo приводило к совершенно другому иммунному ответу. Иммуногенность химер ЖЛ/ЛГТ р43 и ЖЛ/Hypr dC2 p59 была относительно низкой, что, впрочем, и ожидалось. Это объясняется использованием гетерологичной оболочки (оболочки вируса ЛГТ, отличающейся от оболочки вируса КЭ, которым проводилось заражение) и выраженным аттенуирующим эффектом делеции dC2 соответственно.
Пример 3. Экспрессия чужеродных генов.
В примерах конструкций рекомбинантных ПИВ, описанных ниже, проводилась оптимизация кодо-на (например, для эффективной экспрессии в целевой клетке-хозяине); также было проведено удаление длинных повторяющихся последовательностей нуклеотидов, что позволило увеличить стабильность вставок (размером > 8 нуклеотидов; при необходимости может быть выполнено дополнительное укорочение повторов). Затем проводился химический синтез генов. Гены клонировались в векторные плазми-ды ПИВ-ЛЗН по стандартным методам, принятым в молекулярной биологии, упакованные ПИВ восстанавливались после транскрипции in vitro и трансфекции соответствующих вспомогательных (для о-ПИВ) или обычных (для д-ПИВ) клеток.
Экспрессия белка G вируса бешенства в о-ПИВ и д-ПИВ ЛЗН.
Вирус бешенства из семейства Rhabdoviridae - это серьёзный патоген, поражающий человека и животных. Несмотря на доступность нескольких убитых вакцин, в медицине и ветеринарии существует потребность в усовершенствованных вакцинах (например, недорогих профилактических прединфекцион-ных вакцин). Гликопротеин G вируса бешенства опосредует попадание вируса в клетки и является основным иммуногеном этого вируса. Для создания ветеринарных вакцин этот гликопротеин экспрессиро-вался на различных векторах (например, Pastoret and Brochier, Epidemio. Infect. 116:235-240, 1996; Li et al., Virology, 356:147-154, 2006).
Проводилась оптимизация кодона полномерного белка G вируса бешенства (оригинальный пастеровский изолят вируса, номер доступа GenBank NC 001542). Ген синтезировался химически и вставлялся в области делеций ДС, ДprME и ДCprME в векторы ПИВ-ЛЗН (фиг. 12). Последовательности конструкций приведены в приложении 4. Общая структура конструкций представлена на фиг. 13. Полный ген белка G, содержащий свой собственный сигнальный пептид, вставлялся в рамке за геном С ЛЗН. Эта инсерция комбинировалась с делецией ДС (конструкции ДС и ДCprME) или не сочеталась с ней ^prME) и находилась за несколько остатков от сигнала prM. За последовательностью трансмембранного С-концевого якоря белка G вставлялась аутопротеаза 2А вируса ящура. Это обеспечивало отщепление С-концевого участка G от вирусного полипротеина во время трансляции. За элементом А2 вируса ящура следовал ЛЗН-специфичный сигнал для prM и гены prME-NS1-5 (в случае конструкции ДС) или сигнал для NS1 и гены NS1-5 в конструкциях ДprME и ДCprME.
Упакованные ПИВ ЛЗН(ДС)^ вируса бешенства, ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства и ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства получались в результате трансфекции во вспомогательных клетках ПДХ, дополняющих делецию вектора на основе ПИВ [содержащих репликон вируса венесуэльской лошадиной лихорадки (штамм ТС-83) и экспрессирующие структурные белки, необходимые для транс- 26
радки (штамм ТС-83) и экспрессирующие структурные белки, необходимые для транс-комплементации]. Эффективная репликация и экспрессия белка G вируса бешенства для всех трёх конструкций, которыми трансфицировались/инфицировались вспомогательные клетки ПДХ-С(ЛЗН) и/или ПДХ-CprME (ЛЗН), а также обычные клетки культуры ПДХ, подтверждались путём окрашивания с применением иммунологической метки и иммунофлуоресцентным анализом (ИФА) с помощью моноклональных антител к белку G вируса бешенства (RabG-МАЦ) (фиг. 14). Титры антител определялись в клетках культуры Vero окрашиванием с применением иммунологической метки с помощью МАЦ или поликлональных антител против вируса ЛЗН. Кривые роста конструкций в клетках ПДХ-CprME (ЛЗН) после трансфекции транскриптами РНК in vitro приведены на фиг. 14 (нижняя часть фигуры). Отмечался эффективный рост ПИВ до титров ~6 - > 7 log10 БОЕ/мл. Важно отметить, что окрашивание с помощью RabG-МАЦ и антител к ЛЗН определялись почти одинаковые титры, что представляло собой первой доказательство генетической стабильности вставки. В фиксированных без нарушения проницаемости мембраны клетках культуры Vero, инфицированных ПИВ, при окрашивании с помощью RabG-МАЦ наблюдалось выраженное окрашивание мембраны. Это говорит о том, что продукт экспрессии эффективно доставлялся к поверхности клеток (фиг. 15). Это явление считается главной предпосылкой для высокой иммуногенности экс-прессируемого белка G. Отдельные упакованные ПИВ могут распространяться в инфицированных вспомогательных клетках ПДХ, но не могут размножаться в обычных клетках, как это показано для ПИВ ЛЗЩДф-G вируса бешенства на фиг. 16. Факт отсутствия распространения в обычных клетках ПДХ говорит о том, что рекомбинантные РНК-геномы не могут неспецифически упаковываться в мембранные носители, содержащие белок G, если образуются в инфицированных клетках. Такие же результаты были получены для белка G другого рабдовируса - вируса везикулярного стоматита (ВВС), в отличие от более ранних наблюдений про неспецифическую упаковку репликона вируса леса Семлики (ВЛС), экспресси-рующего белок G ВВС (Rolls et al., Cell, 79:497-506, 1994). Это является желательной чертой с точки зрения безопасности. В противоположном случае неспецифическая упаковка может приводить к ограниченному распространению ПИВ in vivo, возможно усиливая антирабический иммунный ответ. Это явление также может предоставлять определенные преимущества, учитывая, что безопасность таких ПИВ также была продемонстрирована. Стабильность вставок гена белка G вируса бешенства в трёх ПИВ была показана путём серии пассажей во вспомогательных клетках ПДХ-CprME (ЛЗН) при высоком и низком содержании ЧИ (частиц инфицирования) (0,1 или 0,001 БОЕ на клетку). При каждом пассаже собирались клеточные супернатанты; этот материал титровался в обычных клетках (например, клетках культуры Vero) иммунологическим окрашиванием с помощью анти-ЛЗН поликлональных антител. Так определялся общий титр ПИВ. Титр частиц, содержащих ген G, определялся с помощью моноклонального антитела к белку G вируса бешенства (результаты отражены на фиг. 17 для содержания ЧИ 0,1; аналогичные результаты были получены и для содержания ЧИ 0,001). ПИВ ЛЗН(ДС)^ вирус бешенства были стабильными во всех 5 пассажах, тогда как титр ПИВ, содержащих вставки, на 6-ом пассаже начал снижаться, что указывает на нестабильность вставки. Это явление вполне ожидаемо, поскольку в этой конструкции крупная вставка гена G (~1500 нуклеотидов) сочетается с небольшой делецией ДС (~200 нуклеоти-дов), что значительно увеличивает общий размер рекомбинантного РНК-генома. В отличие от этого, в ПИВ ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства и ЛЗН(ДCprME)-G вируса бешенства вставки сочетаются со значительно большей делецией (~ 000 нуклеотидов). Поэтому в этих конструкциях вставка оставалась стабильной на протяжении всех 10 пассажей (фиг. 17). Кроме того, как можно видеть на фиг. 17, на некоторых пассажах для всех трёх ПИВ достигались высокие титры (8 log10 БОЕ/мл и выше), что является дополнительным доказательством того, что ПИВ можно легко производить в больших количествах.
После введения in vivo о-ПИВ ЛЗН(ДО)^ вируса бешенства индуцирует сильный ответ со стороны нейтрализующих антител против вирусов ЛЗН и бешенства, а также ответ со стороны Т-клеток. ПИВ ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства и ЛЗН(ДCprME)-G вируса бешенства будут индуцировать гуморальный иммунный ответ только против вируса бешенства, поскольку они не кодируют белки prME вируса ДЗН. Инфицирование конструкцией о-ПИВ ЛЗН(ДC)-G вируса бешенства можно также сочетать с введением конструкции ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства в виде д-ПИВ (см. фиг. 12), что позволит увеличить дозу экспрессируемого белка G и усилить иммунитет против обоих патогенов, вследствие ограниченного распространения вируса. Примером распространения могут служить следующие данные. Результаты титрования в клетках культуры Vero образца о-ПИВ (ПИВ ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства) и образца д-ПИВ (ПИВ ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства + ЛЗН(ДС); последний ПИВ не кодирует белок G вируса бешенства) показаны на фиг. 18. Инфицирование обычных клеток культуры Vero o-ПИВ приводило к тому, что с помощью RabG-МАЦ окрашивались лишь отдельные клетки (или небольшие скопления клеток, образованные вследствие деления клеток). В отличие от этого, после инфицирования клеток д-ПИВ наблюдались большие очаги окрашенных клеток (фиг. 18, правая часть), что являлось результатом коинфицирования ПИВ обоих типов.
Конструкция ЛЗН(ДCprME)-G вируса бешенства также может использоваться для создания д-ПИВ, если ввести эту конструкцию в геном вспомогательных клеток, в которых транскрибируются последовательности CprME (см. фиг. 12). Например, такой конструкцией может быть геном вируса ЛЗН, содержа
щий делецию одного из белков NS, например, NS1, NS3 или NS5, которые, как известно, могут быть транс-комплементарными (Khromykh et al., J. Virol. 73:10272-10280, 1999; Khromykh et al., J. Virol. 74:3253-3263, 2000). Авторы изобретения сконструировали геном ЛЗН-Д№1 (последовательность представлена в приложении 4) и получили подтверждение коинфекции конструкциями ЛЗН(ДprME)-G вируса бешенства или ЛЗН(ДCprME)-G вируса и распространения вируса in vitro с помощью метода окрашивания с применением иммунологической метки. В случаях тонких д-ПИВ во вспомогательный геном можно вставить белок G вируса бешенства, что приведёт к его экспрессии, например, в геном ЛЗН-Д№1. Это позволит увеличить количество экспрессируемого белка G вируса бешенства и в результате этого увеличить интенсивность антирабического иммунного ответа. Как в случае любых версий д-ПИВ, один имму-ноген может принадлежать одному патогену (например, белок G вируса бешенства), а другой - второму патогену, что приведёт к тройной антигенной специфичности вакцины. Как указывалось ранее, делеции Д№1 в других примерах реализации изобретения могут заменяться делециями/мутациями и/или Д№5.
Экспрессия белка F РСВ в о-ПИВ и д-ПИВ ЛЗН.
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), принадлежащий к семейству Paramyxoviridae, является одной из самых частых причин тяжёлых заболеваний дыхательных путей у маленьких детей во всём мире (Collins and Crowe, Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus, In: Knipe et al. Eds., Fields Virology, 5 ed., Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams and Wilkins, 2007:1601-1646). Белок слияния вируса - это основной вирусный антиген, который можно использовать для создания безопасной и эффективной вакцины. Чтобы избежать поствакцинального обострения РСВ-инфекции, что наблюдалось ранее для кандидата на звание формалин-инактивированной вакцины, необходимо создать сбалансированный ответ на F со стороны Тх-1/Тх-2. Этого можно добиться путём улучшения стимуляции КПР -необходимого условия для индукции образования высокоаффинных антител (Delgado et al., Nat. Med. 15:34-41, 2009). А это, в свою очередь, может быть достигнуто введением F в активный вектор на основе вируса. Ранее нами было показана способность химерических векторов на основе ЖАВ жёлтой лихорадки индуцировать развитие сильного, сбалансированного ответа со стороны Tx-1/Tx-1 in vivo против антигена вируса гриппа (WO 2008/036146). В настоящем изобретении для представления белка F и индукции оптимального иммунного ответа использовались химерическая ЖАВ и вектор на основе ПИВ жёлтой лихорадки. Для этих целей также могут использоваться и другие ЖАВ и ПИВ, описанные в настоящем изобретении.
Сначала была проведена оптимизация кодона полномерного белка F штамма А2 РСВ (номер доступа в GenBank P03420), как это описывалось ранее. Затем последовательность синтезировалась и клонировалась в плазмиды для получения О-ПИВ и д-ПИВ ЛЗН с помощью схем инсерции, приведенных на фиг. 12 и 13 для белка G вируса бешенства, с применением стандартных методов, принятых в молекулярной биологии. Точные последовательности инсерции и соседних генетических элементов представлены в приложении 5. Для трансфекции вспомогательных клеток ПДХ-CprME(ЛЗН) применялись полученные in vitro транскрипты РНК ПИВ ЛЗН(ДС)^ РСВ, ЛЗН(ДprME)-F РСВ и ЛЗН(ДprME)-F РСВ. Эффективная репликация и экспрессия белка F РСВ была продемонстрирована с помощью иммунологического окрашивания трансфицированных клеток МАЦ анти-F РСВ, как это показано для конструкции ЛЗН(ДprME)-F РСВ на фиг. 19. Присутствие упакованного ПИВ в супернатанте от транфицированных клеток (титр достигал 7 log10 БОЕ/мл) подтверждалось путём титрования в клетках культуры Vero с иммунологическим окрашиванием. Кроме того, возможно использование похожих конструкций, которые содержат модифицированный ген полномерного белка F. Например, N-концевой сигнальный пептид белка F в модифицированном белке F замещён на соответствующий сигнальный пептид белка G вируса бешенства. Эта модификация предназначена для выяснения, поможет ли использование гетерологичного сигнала увеличить скорость синтеза белка F и/или репликацию ПИВ.
Конструкции прототипа ПИВ, которые использовались в исследованиях создания платформы для вакцины
дение вирусов в различных дозах.
2 СПЖ (средняя продолжительность жизни) для умерших мышей; нп - не применимо.
делялось.
Нейровирулентность (внутрикожное введение) и нейроинвазивность (внутрибрюшинное введение) кандидатов на звание вакцины ПИВ-КЭ и ЖЛ/КЭ взрослым мышам линии ICR
плазмы.
Титры нейтрализующих антител (PRNT50) у мышей, иммунизированных внутрибрюшинно (против вируса КЭ (штамм Hypr дикого типа)), защита от заражения (наблюдение после заражения в течение 9 дней)
Иммуноген
Дом(ы)
Титр PRNTM, индивидуальные образцы
PRNTje СГТ
Смертность после
заражения (%) иа 9-й день2
ПИВ-Hypr р39, t доза
1746 (2) 1187 (2) 164 (2) 574 (2)
665
0/8 (0%)
ПИВ-Hypr р39, 2 дозы
5+5
16229(2) 12928 (2) 12927 (2) 4627 (2)
10,584
0/8 (0%)
ПИВ-Hypr р40, 1 доза
<10(2) <10(2) 18(2) 33(2)
6/8 (75%)
ПИВ-Hypr р40, 2 дозы
5+5
169(2) 638 (2) 26 (2) 192(2)
153
1/8 (12.5%)
ЖЛ/Нургр42
9210(1) 4020 (1)
6,085
0/2 (0%)
ЖЛ/ЛГТ р43
123(2) 32(2) 96(2) 45 (2)
1/8(12.5%)
ЖЛ/Hypr р45
292 (2) 16(1)
0/3 (0%)
ЖЛЯгург dC2 р59
194(2) 93(2) 45(2) 26(2)
0/8 (0%)
Убитая человеческая вакцина
1/20
19(2)
1/8(12.5%)
против КЭ, 1 доза (1 /20
<10(2)
человеческой дозы)
13(2) <10(2)
Убитая человеческая вакцина
1/20+1/20
3435 (2)
1,496
0/6 (0%)
против КЭ, 2 дозы (каждая
1267 (2)
1 /20- человеческой дозы)
770 (2)
контроль: ЖЛ 17D
<10(4) 11(4)
<10
5/8 (62.5%)
Имитация вакцины
нет
<10(4) <10(4)
<10
4/8 (50%)
'Число в скобках указывает на число мышей в каждом пуле сыворотки. 2Приведены данные о смертности за 9 дней.
Примеры опубликованных мутаций гена белка F, которые могут применяться для аттенуирования кандидата на звание химерической ЖАВ КЭ
Остаток
Домен
Комментарий
Аттенуированне
Ссылка
N52R
Петля DI- DII, возможно, участвует в движениях петли, необходимых для активизации слияния
яэ.жл
Hasegawa et al, 1992, Schlesinger et al, 1996
Е84К
Консервативная область, Е у вируса КЭ, КЖ у других вирусов, аттенюирование пассажем в клещах Ixodes ricinus^ DII содержит перекрёстно реагирующие эпитопы флавмвпрусов
Labudaetal, 1994
ES5K
Консервативная область, Е у вируса КЭ, K/R у других вирусов, аттенюирование отбором вариантов бляшек в клетках культуры Vero, Dil содержит перекрёстно реагирующие эпитопы флавявирусов
Wuetal, 1997
HI04K
В пределах высококонсервативного пептида слияния (аа 98-113), Ну КЭ, Gy других вирусов
Reyetal, 1995
LI07F
В пределах высококонсервативного пептида слияния (аа 98-113), L у всех
флавивирусов, F у аттенюированных вирусов ЯЭ
КЭ, ЯЭ, ЛЗН
Reyetal, 1995, Arroyo el al, 1999, 2004
TI23K
Петля DI-D1I, Е у вируса КЭ, А у вируса ЛКЛ
Holzmaim et al, 1997
KI26E
Петля DI-DII, К у вируса КЭ, Е у вируса Д-2
ДЕН2
Bray, 98
KI36E
Петля D1-DII, К у вируса КЭ и ЯЭ, Е у вируса Д-2
N154L(Y)
Сайт гликозилировзния, упакованный с консервативным Н 104, участвует в слиянии
ДЕН2,ДЕН4,ЖЛ
Guirakhoo et al, 1993, Pletnevetal, 1993, Kawano et al, 1993, Jennings et al, 1994
KI71E
Наружный фрагмент DI, участвующий в слиянии
Mandl, 1989, Holzmann, 1997
I173T
Наружный фрагмент DI, участвующий в слиянии
Chambers and Nickells 2001
DISIY
Петля DI-DI1
Holzmann et al, 1997
K204R
Выравнивание гиброфобного кармана, участвующее в слиянии
ДЕН1.ДЕШ
Guirakhoo etal, 2004
P272S
Высоко консервативная область, соединение одной из двух альфа-спиралей
Cecilia etal, 1991
G308N
III
Прикрепление к клетке, DKT у вируса КЭ, EGS у вируса ЛКЛ, Т-Х у
других вирусов, изменение до N создавало сайт гликозилирования у вируса шотландского энцефалита (ШЭ) и снижало вирулентность, мотив гликозилирования N-X-T/S
Jiang et al, 1993, Gao et al, 1994
S310K
III
Предполагаемый механизм прикрепления к клетке, изменение Е до G у вируса ЯЭ снижало вирулентность
Jiang etal, 1993, Gao etal, 1994, Wuetal, 1997
КЗ 1 IE
высоко консервативная область, предполагаемый механизм прикрепления к клетке
кэ.жл
Rey et al, 1995, Jennings, 1994
T333L
предполагаемый механизм прикрепления к клетке
ЖЛ, ЛГТ
Raynman et al, 1998
G334K
III
предполагаемый механизм прикрепления к клетке
Chambers and Nickells, 2001
S33SK
ill
предполагаемый механизм прикрепления к клетке
Wu et al, 1997
K336D
III
предполагаемый механизм прикрепления к клетке
Cecilia and Gould, 1991
P337D
предполагаемый механизм прикрепления к клетке
Cecilia and Gould, 1991
C36SR
111
предполагаемый механизм прикрепления к клетке
кэ.яэ
Holzman etal 1997, Hasegawa et al 1992
Y384H
Изменение до Н атг енюировало вирус КЭ, предполагаемый механизм прикрепления к клетке, -3 позиции к удалённому RGD у
Holzmann et al, 1990
вируса КЭ
V385R
консервативная область, -2 позиции к удалённому RGD у вируса КЭ, предполагаемый механизм прикрепления к клетке
Hiramatsu et al, 1996, Lobigs, 1990
G3S6R
консервативная область,-1 позиция к удалённому RGD у вируса КЭ, предполагаемый механизм прикрепления к клетке
ДЕН2, ЭМВ (Энцефалит МЕОррей-Валли)
Hiramatsu, 1996, Lobigs et al, 1990
E387R
111
консервативная область, +2 позиции к удалённому RGD у вируса КЭ, предполагаемый механизм прикрепления к клетке
ДЕН2, ЭМВ (Энцефалит Мк> ррей-Валли)
Hiramatsu, 1996, Lobigs et al, 1990
F403K.
нет
консервативная область, С-концевой регион на включён й кристаллическую структуру sE
ДЕН2, ДЕН4
Kawano etal, 1993, Bray et al, 1998
H43SY
нет
консервативная область, С-концевой регион на включён в кристаллическую структуру sE
ЛГТ
Campbell and Pletnev 2000
H496R
none
консервативная область, С-концевой регион на включён в кристаллическую структуру sE
Gritsun etal, 2001
Ссылки:
Hasegawa et al., Virology, 191(1):158-165;
Schlesinger et al., J. Gen. Virol. 1996, 77 (Pt 6):1277-1285, 1996;
Labuda et al., Virus Res. 31(3):305-315, 1994;
Wu et al., Virus Res. 51(2):173-181, 1997;
Holzmann et al., J. Gen. Virol. 78 (Pt l):31-37, 1997;
Bray et al., J. Virol. 72(2): 1647-1651, 1998;
Guirakhoo et al., Virology, 194(1):219-223, 1993;
Pletnev et al., J. Virol. 67(8):4956-4963, 1993;
Kawano et al., J. Virol. 67(11):6567-6575, 1993;
Jennings et al., J. Infect. Dis. 169(3):512-518, 1994;
Mandl et al., J. Virol. 63(2):564-571, 1989;
Chambers et al., J. Virol. 75(22): 10912-10922, 2001;
Cecilia et al., Virology, 181(l):70-77, 1991;
Jiang et al., J. Gen. Virol. 74 (Pt 5):931-935, 1993;
Gao et al., J. Gen. Virol. 75 (Pt 3):609-614, 1994;
Holzmann et al., J. Virol. 64(10):5156-5159, 1990;
Hiramatsu et al., Virology, 224(2):437-445, 1996;
Lobigs et al., Virology, 176(2):587-595, 1990;
Campbell et al., Virology, 269(1):225-237, 2000;
Gritsun et al., J. Gen. Virol. 82(Pt 7):1667-1675, 2001.
Другие варианты осуществления изобретения
Все публикации, заявки на получение патента и патенты, упомянутые в этой спецификации, включены в неё во всей полноте посредством ссылок так, как если бы каждая отдельная публикация, заявка на патент или патент были конкретно и по отдельности указаны как включенные посредством ссылки.
Для специалистов в данной области будет очевидно, что возможны различные модификации и отклонения от приведенных в настоящем изобретении описаний вирусов, векторов, композиций и методов и что эти модификации не будут выходить на рамки настоящего изобретения. Несмотря на то что изобретение было описано в связи с конкретными примерами его осуществления, следует понимать, что заявленное здесь изобретение, не ограничивается этими конкретными примерами. На самом деле, различные модификации описанных примеров осуществления настоящего изобретения, очевидные для специалистов в области медицины, фармакологии и связанных с ними областей науки, будут оставаться в рамках этого изобретения. Использование единственного числа в этом тексте не исключает возможности употребления соответствующей формы множественного числа, если контекст не указывает на обратное. Аналогично, и множественное число не исключает возможности употребления единственного числа. Другие примеры осуществления изобретения находятся в рамках следующих ниже пунктов формулы изобретения.
<223> Xaa обозначает Lys или Asn
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (8)..(8)
<223> Хаа обозначает Val или Не
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (9) . . (9)
<223> Хаа обозначает Ser или Thr
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (10).. {10)
<223> Хаа обозначает Val или Ala
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (11) . . (11)
<223> Хаа обозначает Glu или Ala
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (13).. (13)
<223> Хаа обозначает Asn или Asp
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (15)..(15)
<223> Хаа обозначает Thr или Ser
<220>
<221> СМЕШ__ПРИЗНАК
<222> (16)..(16)
<223> Хаа обозначает Asp или Asn
<220>
<221> СНЕШ_ПРИЗНАК
<222> (П)..(17)
<223> Хаа обозначает Ser или Thr
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (18)..(18)
<223> Хаа обозначает Ser или Thr
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (19)..(19)
<223> Хаа обозначает Ala, Gin, или Arg
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (25)..(25)
<223> Хаа обозначает Ala или Gly
<220>
<221> СМЕШ_ПРИЗНАК
<222> (26)..(26)
<223> Хаа обозначает Ala, Lys, или Thr
<220>
<221> СМЕШ ПРИЗНАК
Trp Asp Phe Gly Ser Ala Gly Gly Phe Leu Ser Ser He Gly Lys Ala
705 710 715 720
Leu His Thr Val Leu Gly Gly Ala Phe Asn Ser He Phe Gly Gly Val
725 730 735
Gly Phe Leu Pro Lys Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Ala Trp Leu Gly
740 745 750
Leu Asn Met Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Ser Phe Leu Leu Ala Gly
755 760 765
Val Leu Val Leu Ala Met Thr Leu Gly Val Gly Ala Asp Gin Gly Cys
770 775 780
Ala He Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu
<210> 41 <211> 2500 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 41
agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60
acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120
gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg ISO
ctccttgtca aacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaccttc 240
aagaggtgtt caaggattta tctttttctt tttgttcaac attttgactg gaaaaaagat 300
cacagcccac ctaaagaggt tgtggaaaat gctggaccca agacaaggct tggctgttct 360
aaggaaagtc aagagagtgg tggccagttt gatgagagga ttgtcctcaa ggaaacgccg 420
ttcccatgat gttctgactg tgcaattcct aattttgggc atgctgggca tgacaatcgc 480
agctacggtt cgcaaggaaa gagacggcag tacggtcata cgcgcggaag gtaaggatgc 54 0
cgctacccaa gtgagagtgg aaaatggtac ctgcgtcatt ctggccaccg acatgggctc 600
ttggtgtgat gatagccttt cttatgagtg cgtaaccata gatcaaggtg aggaacctgt 660
tgacgttgat tgcttctgcc gaaacgtgga tggggtgtat ctcgaatatg gacggtgtgg 720
taaacaagaa ggaagcagaa ccagacgctc agtgcttata ccctcccacg ctcaaggaga 780
gctgaccgga cggggacata aatggttgga gggcgactca ctccgaacac atttgacccg 840
cgtcgagggc tgggtctgga aaaatcggct gttggccctc gctatggtga cagtcgtttg 900
gctcacgctg gagtctgtgg ttactcgcgt ggcagtgctg gtggtgctcc tctgtcttgc 960
ccctgtctac gcgtccaggt gtactcattt ggaaaacaga gattttgtca ccggcaccca 1020
ggggacgact cgggtaaccc tggtgcttga actgggtggt tgcgttacta ttaccgctga 1080
gggcaaaccc tctatggatg tgtggctgga tgcaatctat caggagaatc ccgcacaaac 1140
cagggaatat tgccttcacg caaagctgtc cgatacaaag gtcgcggcta ggtgcccaac 1200
aatgggaccg gccaccctgg cggaggaaca tcagggaggt acagtgtgca aacgggacca 1260
gagtgataga ggctggggta atcactgcgg cctgttcggc aaaggaagta ttgtcgcttg 1320
cgtcaaggca gcctgtgagg ccaaaaagaa ggctactggg cacgtctatg acgccaacaa 1380
gatcgtttat acagtgaaag tggaaccaca cacaggggat tacgtggcgg ccaacgagac 1440
tcattccggt cgcaaaacgg ccagcttcac cgtgtcatcc gaaaagacca tcctcactat 1500
gggggagtat ggcgacgttt ctctgctctg ccgggtggct agcggagtcg acctggccca 1560
gacagtcatc ctggaactgg ataaaacagt tgagcatctg cctaccgctt ggcaggtgca 1620
cagggattgg tttaacgacc ttgccctgcc atggaaacat gaaggagcga gaaactggaa 1680
taatgcagag cgactcgtag aattcggtgc ccctcatgcc gtgaagatgg acgtctacaa 1740
tctgggtgat cagaccggcg ttctccttaa agctctcgct ggcgtaccag ttgcccacat 1800
cgaaggaacg aagtaccaoc tgaagtcagg ccatgtaact tgcgaggtgg gcctggagaa 1860
gttgaaaatg aaaggtctta cgtacacaat gtgtgacaag accaagttca catggaagag 1920
ggcccccaca gatagcggcc acgatactgt ggtgatggag gtgacctttt ctggaacaaa 1980
accotgcaga atacccgtgc gggctgtagc tcacggatct cccgatgtca atgttgctat 2040
gctgattaca cctaacccta ccatcgagaa taaoggtggt ggttttattg agatgcagct 2100
tccgccaggc gataacatca tctacgtggg cgaactctct taccagtggt ttcagaaagg 2160
gagttcaatt gggcgggtct tccaaaaaac gaagaaggga atcgaacgat tgacggttat 2220
cggcgagcac gcatgggatt ttggttccgc agggggattc ctgtcttcta ttggtaaggc 2280
actgcatacc gtgctggggg gcgcattcaa ttctattttc gggggcgtgg ggttcctgcc 234 0
taaactcctg ctgggagtag ccctggcctg gttgggactg aatatgcgga atccgacgat 2400
gtccatgtca ttcctcttgg ccggcgtgct tgtactggcc atgacactgg gcgttggcgc 24 60
cgatcaagga tgogccatca actttggcaa gagagagctc 2500
<210> 42
<211> 2496
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 42
tcatttagga cacacgatta actccacgta accagacgtt tagctcaacg atccgttatt 60
tgtgtaaacc taattaaaat tagcaagcaa ctcgctaatc gtctcttgac tggtcttgta 120
cagaccagca tttcgagtcc ctttttggga cccgcagtta taccatgctg ctcctcaagc 180
gaggaacagt ttgttttatt ttgttttttg ttttgtttaa cctttgtctg gacctggaag 240
ttctccacaa gttcctaaat agaaaaagaa aaacaagttg taaaactgac cttttttcta 300
gtgtcgggtg gatttctcca acacctttta cgacctgggt tctgttccga accgacaaga 360
ttcctttcag ttctctcacc accggtcaaa ctactctcct aacaggagtt cctttgcggc 420
aagggtacta caagactgac acgttaagga ttaaaacccg tacgacccgt actgttagcg 480
tcgatgccaa gcgttccttt ctctgccgtc atgccagtat gcgcgccttc cattcctacg 540
gcgatgggtt cactctcacc ttttaccatg gacgcagtaa gaccggtggc tgtacccgag 600
aaccacacta ctatcggaaa gaatactcac gcattggtat ctagttccac tccttggaca 660
actgcaacta acgaagacgg ctttgcacct accccacata gagcttatac ctgccacacc 720
atttgttctt ccttcgtctt ggtctgcgag tcacgaatat gggagggtgc gagttcctct 780
cgactggcct gcccctgtat ttaccaacct cccgctgagt gaggcttgtg taaactgggc 940
gcagctcccg acccagacct ttttagccga caaccgggag cgatacoact gtcagcaaac 900
cgagtgcgac ctcagacacc aatgagcgca ccgtcacgac caccacgagg agacagaacg 960
gggacagatg cgcaggtcca catgagtaaa ccttttgtct otaaaacagt ggccgtgggt 1020
cccctgctga gcccattggg accacgaact tgacccacca acgcaatgat aatggcgact 1080
cccgtttggg agatacctac acaccgacct acgttagata gtcctcttag ggcgtgtttg 1140
gtcccttata acggaagtgc gtttcgacag gctatgtttc cagcgccgat coacgggttg 1200
ttaccctggc cggtgggacc gcctccttgt agtccctcca tgtcacacgt ttgccctggt 1260
ctoactatct ccgaccccat tagtgacgcc ggacaagccg tttccttcat aacagcgaac 1320
gcagttccgt cggacactcc ggtttttctt ccgatgaccc gtgcagatac tgcggttgtt 1380
ctagcaaata tgtcactttc accttggtgt gtgtccccta atgcaccgcc ggttgctctg 1440
agtaaggcca gcgttttgcc ggtcgaagtg gcaoagtagg cttttctggt aggagtgata 1500
ccccctcata ccgctgcaaa gagacgagac ggcccaccga tcgcctcagc tggaccgggt 1560
ctgtcagtag gaccttgacc tattttgtca actcgtagac ggatggcgaa ccgtccacgt 1620
gtccctaacc aaattgctgg aacgggacgg tacctttgta cttcctcgct ctttgacctt 1680
attacgtctc gctgagcatc ttaagccacg gggagtacgg cacttctacc tgcagatgtt 1740
agacccacta gtctggccgc aagaggaatt tcgagagcga ccgcatggtc aacgggtgta 1800
gcttccttgc ttcatggtgg acttcagtcc ggtacattga acgctccacc cggacctctt 1860
caacttttac tttocagaat gcatgtgtta cacactgttc tggttcaagt gtaccttctc 1Э20
ccgggggtgt
ctatcgccgg
tgctatgaca
ccactacctc
cactggaaaa
gaccttgttt
1980
tgggacgtct
tatgggcacg
cccgacatcg
agtgcctaga
gggctacagt
tacaacgata
2040
cgactaatgt
ggattgggat
ggtagctctt
attgccacca
ccaaaataac
tctacgtcga
2100
aggcggtccg
ctattgtagt
agatgcaccc
gcttgagaga
atggtcacca
aagtctttcc
2160
ctcaagttaa
cccgcccaga
aggttttttg
cttcttccct
tagcttgcta
actgccaata
2220
gccgctcgtg
cgtaccctaa
aaccaaggcg
tccccctaag
gacagaagat
aaccattccg
2280
tgacgtatgg
cacgaccccc
cgcgtaagtt
aagataaaag
cccccgc &cc
ccaaggacgg
2340
atttgaggac
gaccctcatc
gggaccggac
caaccctgac
ttatacgcct
taggctgcta
2400
tacagtaagg
agaaccggcc
gcacgaacat
gaccggtact
gtgacccgca
accgcggcta
2460
gttcctacgc
ggtagttgaa
accgttctct
ctcgag
2496
<210> 43
<211> 793
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<22 3> Синтетическая Конструкция
<400> 43
Met Ser Gly Arg Lys Ala Gin Gly Lys Thr Leu
15 10
Gly Val Asn Met Val 15
Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys He Lys Gin Lys Thr Lys
20 25 30
Gin He Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gin Gly Phe He
35 40 45
Phe Phe Phe Leu Phe Asn He Leu Thr Gly Lys Lys He Thr Ala His
50 55 60
Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gin Gly Leu Ala Val
65 70 75 80
Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser
85 90 95
Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gin Phe Leu He
100 105 110
Leu Gly Met Leu Ala Cys Val Gly Ala Ala Thr Val Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Asp Gly Ser Thr Val He Arg Ala Glu Gly Lys Asp Ala Ala Thr Gin
645
650
655
Glu Met Gin Leu Pro Pro Gly Asp Asn lie He Tyr Val Gly Glu Leu
660 665 670
Ser Tyr Gin Trp Phe Gin Lys Gly Ser Ser He Gly Arg Val Phe Gin
675 680 685
Lys Thr Lys Lys Gly He Glu Arg Leu Thr Val He Gly Glu His Ala
690 695 700
Trp Asp Phe Gly Ser Ala Gly Gly Phe Leu Ser Ser lie Gly Lys Ala
705 710 715 720
Leu His Thr Val Leu Gly Gly Ala Phe Asn Ser He Phe Gly Gly Val
725 730 735
Gly Phe Leu Pro Lys Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Ala Trp Leu Gly
740 745 750
Leu Asn Met Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Ser Phe Leu Leu Ala Gly
755 760 765
Val Leu Val Leu Ala Met Thr Leu Gly Val Gly Ala Asp Gin Gly Cys
770 775 780
Ala He Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu 785 790
<210> 44
<211> 2500
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
agctaccgtg cgaaaagaac gcgacggaag caccgtgata agggctgagg gtaaggatgc 54 0
ggctacgcag gtgagagtag agaatggcac ttgcgtaata ctcgcgactg atatgggatc 600
ctggtgtgao gatagcctca gttatgaatg cgtaacaata gaccagggcg aagaacctgt 660
ggacgttgac tgtttctgta gaaatgtgga tggcgtttat ctggagtacg gccgctgtgg 720
aaaaoaggag ggctcacgaa ctcgaagatc tgtgctgatt ccaagtcacg cgcaaggaga 780
gttgaccggt agaggocaca agtggcttga aggggactca ttgaggaccc acctgactag 840
ggtggagggt tgggtttgga agaatcggtt gctcgcgctc gctatggtca ccgtcgtgtg 900
gctgacactg gagagtgtcg tgactcgggt tgctgtgttg gttgtcctcc tctgtttggc 960
cccagtgtac gcgtccaggt gtactcattt ggaaaacaga gattttgtca ccggcaccca 1020
ggggacgact cgggtaaccc tggtgcttga actgggtggt tgcgttacta ttaccgctga 1080
gggcaaaccc tctatggatg tgtggctgga tgcaatctat caggagaatc ccgcacaaac 1140
cagggaatat tgccttcacg caaagctgtc cgatacaaag gtcgcggcta ggtgcccaac 1200
aatgggaccg gccaccctgg cggaggaaca tcagggaggt acagtgtgca aacgggacca 1260
gagtgataga ggctggggta atcactgcgg cctgttcggc aaaggaagta ttgtcgcttg 1320
cgtcaaggca gcctgtgagg ccaaaaagaa ggctactggg cacgtctatg acgccaacaa 1380
gatcgtttat acagtgaaag tggaaccaca cacaggggat tacgtggcgg ccaacgagac 1440
tcattccggt cgcaaaacgg ccagcttcac cgtgtcatcc gaaaagacca tcctcactat 1500
gggggagtat ggcgacgttt ctctgctctg ccgggtggct agcggagtcg acctggccca 1560
gacagtcatc ctggaactgg ataaaacagt tgagcatctg cctaccgctt ggcaggtgca 1620
cagggattgg tttaacgacc ttgccctgcc atggaaacat gaaggagcga gaaactggaa 1680
taatgcagag cgactcgtag aattcggtgc ccctcatgcc gtgaagatgg acgtctacaa 1740
tctgggtgat cagaccggcg ttctccttaa agctctcgct ggcgtaccag ttgcccacat 1800
cgaaggaacg aagtaccacc tgaagtcagg ccatgtaact tgcgaggtgg gcctggagaa 1860
gttgaaaatg aaaggtotta cgtacacaat gtgtgacaag accaagttca catggaagag 1920
ggcccccaca gatagcggcc acgatactgt ggtgatggag gtgacctttt ctggaacaaa 1980
accctgcaga atacccgtgc gggctgtagc tcacggatct cccgatgtca atgttgctat 2040
gctgattaca cctaacccta ccatcgagaa taacggtggt ggttttattg agatgcagct 2100
tccgccaggc gataacatca tctacgtggg cgaactctct taccagtggt ttcagaaagg 2160
gagttcaatt gggcgggtct tccaaaaaac gaagaaggga atcgaacgat tgacggttat 2220
cggcgagcac gcatgggatt ttggttccgc agggggattc ctgtcttcta ttggtaaggc 2280
actgcatacc gtgctggggg gcgcattoaa ttctattttc gggggcgtgg ggttcctgoc 2340
taaactcctg otgggagtag ccctggcctg gttgggactg aatatgcgga atccgacgat 24 00
gtccatgtca ttcctcttgg ccggcgtgct tgtactggcc atgacactgg gcgttggcgc 2460 cgatcaagga tgcgccatca actttggcaa gagagagctc 2500
<210> 45
<211> 2500
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 45
tcatttagga cacacgatta actccacgta accagacgtt tagctcaacg atccgttatt 60
tgtgtaaacc taattaaaat tagcaagcaa ctcgctaatc gtctcttgac tggtcttgta 120
cagaccagca tttcgagtcc ctttttggga cccgcagtta taccatgctg ctcctcaagc 180
gaggaacagt ttgttttatt ttgttttttg ttttgtttaa cctttgtctg gacctggaag 240
ttctccacaa gttcctaaat agaaaaagaa aaacaagttg taaaactgac cttttttcta 300
gtgtcgggtg gatttctcca acacctttta cgacctgggt tctgttccga accgacaaga 360
ttcctttcag ttctctcacc accggtcaaa ctactctcct aacaggagtt cctttgcggc 420
aagggtacta caagactgac acgttaagga ttaaaacccg tacgaccgaa cacagcctcg 480
tcgatggcac gcttttcttg cgctgccttc gtggcactat tcccgactcc cattcctacg 540
ccgatgcgtc cactctcatc tcttaccgtg aacgcattat gagcgctgac tataccctag 600
gaccacactg ctatcggagt caatacttac gcattgttat ctggtcccgc ttcttggaca 660
cctgcaactg acaaagacat ctttacacct accgcaaata gacctcatgc cggcgacacc 720
ttttgtcctc ccgagtgctt gagcttctag acacgactaa ggttcagtgc gcgttcctct 780
caactggcca tctccggtgt tcaccgaact tcccctgagt aactcctggg tggactgatc 840
ccacctccca acccaaacct tcttagccaa cgagcgcgag cgataccagt ggcagcacac 900
cgactgtgac ctctcacagc actgagccca acgacacaac caacaggagg agacaaaccg 960
gggtcacatg cgcaggtcca catgagtaaa ccttttgtct ctaaaacagt ggccgtgggt 1020
cccctgctga gcccattggg accacgaact tgacccacca acgcaatgat aatggcgact 1080
cccgtttggg agatacctac acaccgacct acgttagata gtcctcttag ggcgtgtttg 1140
gtcccttata acggaagtgc gtttcgacag gctatgtttc cagcgccgat ccacgggttg 1200
ttaccctggc cggtgggacc gcctccttgt agtccctcca tgtcacacgt ttgccctggt 1260
ctcactatct ccgaccccat tagtgacgcc ggacaagccg tttccttcat aacagcgaac 1320
gcagttccgt cggacactcc ggtttttctt ccgatgaccc gtgcagatac tgcggttgtt 1380
ctagcaaata tgtcactttc accttggtgt gtgtccccta atgcaccgcc ggttgctctg 1440
agtaaggcca gcgttttgcc ggtcgaagtg gcacagtagg cttttctggt aggagtgata 1500
ccccctcata
ccgctgcaaa
gagacgagac
ggcccaccga
tcgcctcagc
tggaccgggt
1560
ctgtcagtag
gaccttgacc
tattttgtca
actcgtagac
ggatggcgaa
ccgtccacgt
1620
gtccctaacc
aaattgctgg
aacgggacgg
tacctttgta
cttcctcgct
ctttgacctt
168 0
attacgtcto
gctgagcatc
ttaagccacg
gggagtacgg
cacttctacc
tgcagatgtt
1740
agacccacta
gtctggccgc
aagaggaatt
tcgagagcga
ccgcatggtc
aacgggtgta
1800
gcttcottgc
ttcatggtgg
acttcagtco
ggtacattga
acgctccacc
cggacctctt
1860
caacttttac
tttccagaat
gcatgtgtta
cacactgttc
tggttcaagt
gtaccttctc
1920
ccgggggtgt
ctatcgccgg
tgctatgaca
ccaotacctc
cactggaaaa
gaocttgttt
1980
tgggacgtct
tatgggcacg
cccgacatcg
agtgcctaga
gggctacagt
tacaacgata
2040
cgactaatgt
ggattgggat
ggtagctctt
attgccacca
ccaaaataac
tctacgtcga
2100
aggcggtccg
ctattgtagt
agatgcaccc
gcttgagaga
atggtcacca
aagtctttcc
2160
ctcaagttaa
cccgcccaga
aggttttttg
cttcttcccc
tagcttgcta
actgccaata
2220
gccgctcgtg
cgtaccctaa
aaccaaggcg
tccccctaag
gacagaagat
aaccattccg
2280
tgacgtatgg
cacgaccccc
cgcgtaagtt
aagataaaag
cccccgcacc
ccaaggacgg
2340
atttgaggac
gaccctcatc
gggaccggao
caaccctgac
ttatacgcct
taggotgcta
2400
caggtacagt
aaggagaacc
ggccgcacga
acatgaccgg
tactgtgacc
cgcaaccgcg
2460
gctagttcct
acgcggtagt
tgaaaccgtt
ctctctcgag
2500
<210> 46 <211> 794 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 46
Met Ser Gly Arg Lys Ala Gin Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val
15 10 15
Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys He Lys Gin Lys Thr Lys
20 25 30
Gin He Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gin Gly Phe He
35 40 45
Phe Phe Phe Leu Phe Asn He Leu Thr Gly Lys Lys He Thr Ala His
50 55 60
Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gin Gly Leu Ala Val
65 70 75 80
acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg aecagaacat 120
gtotggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg 180
ctccttgtca aacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaccttc 240
aagaggtgtt caaggattta tctttttctt tttgttcaac attttgactg gaaaaaagat 300
cacagcccac ctaaagaggt tgtggaaaat gctggaccca agacaaggct tggctgttct 360
aaggaaagtc aagagagtgg tggccagttt gatgagagga ttgtcctcaa ggaaacgccg 420
ttcccatgat gttctgactg tgcaattcct aattttgggc atgctgggga tgacgatcgc 480
agctactgtg cgaagggaga gagacggctc tatggtgatc agagccgaag gtagggaogc 540
tgcgacccag gtgagggtcg aaaatggcac ctgtgttatt ctggcgaccg acatgggctc 600
ctggtgtgat gattctctgg cttatgaatg tgttactatt gatcagggtg aagagcctgt 660
ggacgtggac tgtttctgta gaggcgtcga gaaagtgacc ctggaatatg gacgatgtgg 720
ccggcgagaa ggctccagga gtcggagatc cgtgttgatc ccttcacatg cgcagcgcga 780
tctgacaggg aggggtcacc agtggctcga aggcgaagca gtcaaggccc atctgactcg 840
cgttgaaggc tgggtgtgga aaaacaaact ctttaccctt agcctggtga tggtcgcgtg 900
gctgatggta gacggactcc ttccccgcat tctcattgtt gtggtggctc tcgcgctcgc 960
ccctgcatac gcgtccaggt gtacgcacct cgaaaatcga gatttcgtca caggcgtcca 1020
aggtactacc cggctcaccc tcgtgctgga gctgggaggc tgtgtcactg ttacagccga 1080
cggaaaaoct agtctggatg tgtggctgga ctccatctat caggagagcc cggcacagac 1140
cagggagtac tgcctccacg ctaagctgac tgggacaaag gtagccgcaa gatgtcccac 1200
aatggggcct gccaccttgc ccgaggaaca ccaatccggt acggtatgca agcgagatca 1260
gtctgatcgc ggatggggga atcattgcgg cctcttcggt aaaggcagca ttgtcacttg 1320
cgtgaaggtg acatgcgagg acaagaagaa ggccacaggt catgtatatg atgtgaacaa 1380
aatcacatat accattaagg tagaaccaca tacaggggaa ttcgtggcag caaacgagac 1440
tcatagcgga cgaaagtccg cctccttcac cgtctcctcc gagaaaacaa tcctgaccot 1500
cggagactac ggogacgtat ctttgctgtg cagggtggcc agcggcgtgg accttgctca 1560
gacagtcgtg ttggccctgg acaagacaca tgagcacttg ccaacagcct ggcaggtgca 1620
cagggactgg tttaacgacc tggcgctocc gtggaaacat gacggcgctg aagcatggaa 1680
tgaggcaggg agactggtgg aatttggaac cccacacgcc gtaaagatgg acgttttcaa 1740
tcttggtgac cagacagggg tgctcctgaa atcactggcg ggcgtgcctg tagccagcat 1800
cgagggcaca aagtatcacc tgaagtctgg gcatgtaacc tgcgaagtgg gcctggaaaa 1860
gctgaagatg aaaggactta cgtacactgt ttgtgataag accaagttta catggaagcg 1920
agccccaacg gattccggcc atgataccgt cgtgatggag gttggtttct ccggcaccag 1980
accatgtaga ataccagtga gagctgtcgc ccacggtgta cccgaggtaa acgtggccat 2040
gctgattaca ccgaatccca ctatggagaa caatggcgga gggttcatcg aaatgcagct 2100
gccgcctgga gacaacatca tttatgtcgg cgacctcgat catcaatggt tccagaaagg 2160
gtcttccatc ggccgcgtcc ttcagaagac acgaaaaggc attgaaagac ttacagtcct 2220
gggcgaacat gcctgggact tcgggtcagt tggcggggta atgacaagca taggoagagc 2280
tatgcacacc gttctcggtg gggcatttaa tactctgttg ggtggcgtgg gttttcttoc 2340
gaaaatcctg ctcggtgtcg caatggcctg gcttggactg aatatgcgca atcctacact 2400
gagtatgggg tttcttctgt caggaggcct ggtcctggca atgactctgg gagtgggcgc 2460
cgatcaagga tgcgccatca actttggcaa gagagagctc 2 500
<210> 48
<211> 2500
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 48
tcatttagga cacacgatta actccacgta accagacgtt tagctcaacg atccgttatt 60
tgtgtaaacc taattaaaat tagcaagcaa ctcgotaatc gtctcttgac tggtcttgta 120
cagaccagca tttcgagtcc ctttttggga cccgcagtta taccatgctg ctcctcaagc 180
gaggaacagt ttgttttatt ttgttttttg ttttgtttaa cctttgtctg gacctggaag 240
ttctccacaa gttcctaaat agaaaaagaa aaacaagttg taaaactgac cttttttcta 300
gtgtcgggtg gatttctcca acaectttta cgacctgggt tctgttccga aocgacaaga 360
ttcctttcag ttctctcacc accggtcaaa ctactctcct aacaggagtt cctttgcggc 420
aagggtacta caagactgac acgttaagga ttaaaacocg tacgacccct actgctagcg 480
tcgatgacac gcttccctct ctctgccgag ataccactag tctcggcttc catccctgcg 540
acgctgggtc cactcccagc ttttaccgtg gacacaataa gaccgctggc tgtacccgag 600
gaccacacta ctaagagacc gaatacttac acaatgataa ctagtcccac ttctcggaca 660
cctgcacctg acaaagacat ctccgcagct ctttcactgg gaccttatac ctgctacacc 720
ggccgctctt ccgaggtcct cagcctctag gcacaactag ggaagtgtac gcgtcgcgct 78 0
agactgtccc tccccagtgg tcaccgagct tccgcttcgt cagttccggg tagactgagc 8 40
gcaacttccg acccacacct ttttgtttga gaaatgggaa tcggaccact accagcgcac 900
cgactaccat ctgcotgagg aaggggcgta agagtaacaa caocaocgag agcgcgagcg 960
gggacgtatg cgcaggtcca catgcgtgga gcttttagct ctaaagcagt gtccgcaggt 1020
tccatgatgg gccgagtggg agcacgacct cgaccctccg acacagtgac aatgtcggct 1080
gccttttgga tcagacctac acaccgacct gaggtagata gtcctotcgg gccgtgtctg 1140
gtccctcatg acggaggtgc gattcgactg accctgtttc catcggcgtt ctacagggtg 1200
ttaccccgga cggtggaacg ggctccttgt ggttaggcca tgccatacgt tcgctctagt 1260
cagactagcg cctaccccct tagtaacgcc ggagaagcca tttccgtcgt aacagtgaac 1320
gcacttccac tgtacgctcc tgttcttctt ccggtgtcca gtacatatac tacacttgtt 1380
ttagtgtata tggtaattcc atcttggtgt atgtcccctt aagcaccgtc gtttgctctg 1440
agtatcgcct gctttcaggc ggaggaagtg gcagaggagg ctcttttgtt aggactggga 1500
gcctctgatg ccgctgcata gaaacgacac gtcccaccgg tcgccgcacc tggaacgagt 1560
ctgtcagcac aaccgggacc tgttctgtgt actcgtgaac ggttgtcgga ccgtccacgt 1620
gtccctgacc aaattgctgg accgogaggg cacctttgta ctgccgcgac ttcgtacctt 1680
actccgtccc tctgaccacc ttaaaccttg gggtgtgcgg catttctacc tgcaaaagtt 1740
agaaccactg gtctgtcccc acgaggactt tagtgaccgc ccgcacggac atcggtcgta 1800
gctcccgtgt ttcatagtgg acttcagacc cgtacattgg acgcttcacc cggacctttt 1860
cgacttctac tttcctgaat gcatgtgaca aacactattc tggttcaaat gtaccttcgc 1920
tcggggttgc ctaaggccgg tactatggca gcactacctc caaccaaaga ggccgtggtc 1990
tggtacatct tatggtcact ctcgacagcg ggtgccacat gggctccatt tgcaccggta 2040
cgactaatgt ggcttagggt gatacctctt gttaccgcct cccaagtagc tttacgtcga 2100
cggcggacct otgttgtagt aaatacagcc gctggagcta gtagttacca aggtctttcc 2160
cagaaggtag ccggcgcagg aagtcttctg tgcttttccg taactttctg aatgtcagga 2220
cccgcttgta cggaccctga agcccagtca accgccccat tactgttcgt atccgtctcg 2280
atacgtgtgg caagagccac cccgtaaatt atgagacaac ccaccgcacc caaaagaagg 234 0
cttttaggac gagccacagc gttaccggac cgaacctgac ttatacgcgt taggatgtga 2400
ctcatacccc aaagaagaca gtcctccgga ccaggaccgt tactgagacc ctcacccgcg 2460
gctagttcct acgcggtagt tgaaaccgtt ctctctcgag 2500
<210> 49 <211> 791 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 49
Met Ser Gly Arg Lys Ala Gin Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val
Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys He Lys Gin Lys Thr Lys
<210> 50 <211> 2491 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 50
agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60
acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120
gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg 180
otccttgtca aacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaggtgt 240
tcaaggattt atctttttct ttttgttcaa cattttgact ggaaaaaaga tcacagccca 300
cctaaagagg ttgtggaaaa tgctggaccc aagacaaggc ttggctgttc taaggaaagt 360
caagagagtg gtggccagtt tgatgagagg attgtcctca aggaaacgcc gttcccatga 4 20
tgttctgact gtgcaattcc taattttggg catgctgggc atgacaatcg cagctacggt 4 80
tcgcaaggaa agagacggca gtacggtcat acgcgcggaa ggtaaggatg ccgctaccca 54 0
agtgagagtg gaaaatggta cctgcgtcat tctggccacc gacatgggct cttggtgtga 600
tgatagcctt tcttatgagt gcgtaaccat agatcaaggt gaggaacctg ttgacgttga 660
ttgcttctgc cgaaacgtgg atggggtgta tctogaatat ggacggtgtg gtaaacaaga 720
aggaagcaga accagacgct cagtgcttat accctcccac gctcaaggag agctgaccgg 780
acggggacat aaatggttgg agggcgactc actccgaaca catttgaccc gogtcgaggg 840
ctgggtctgg aaaaatcggc tgttggccct cgctatggtg acagtcgttt ggctcacgct 900
ggagtctgtg gttactcgcg tggcagtgct ggtggtgctc ctctgtcttg cccotgtcta 960
cgcgtccagg tgtactcatt tggaaaacag agattttgtc accggcaccc aggggacgac 1020
tcgggtaacc ctggtgcttg aactgggtgg ttgcgttact attaocgctg agggcaaacc 1080
ctctatggat gtgtggctgg atgcaatcta tcaggagaat cccgcacaaa ccagggaata 1140
ttgccttcac gcaaagctgt ccgatacaaa ggtcgcggct aggtgcccaa caatgggacc 1200
ggccaccctg gcggaggaac atcagggagg tacagtgtgc aaacgggacc agagtgatag 1260
aggctggggt aatcactgcg gcctgttcgg caaaggaagt attgtcgctt gcgtcaaggc 1320
agcctgtgag gccaaaaaga aggctactgg gcacgtctat gacgccaaca agatcgttta 1330
tacagtgaaa gtggaaccac acacagggga ttacgtggcg gccaacgaga ctcattccgg 1440
tcgcaaaacg gccagcttca ccgtgtcatc cgaaaagacc atcctcacta tgggggagta 1500
tggcgacgtt tctctgctct gccgggtggc tagcggagtc gacctggccc agacagtcat 1560
cctggaactg gataaaacag ttgagoatct gcctaccgct tggcaggtgc acagggattg 1620
gtttaacgac cttgccctgc catggaaaca tgaaggagcg agaaactgga ataatgcaga 1680
gcgactcgta gaattcggtg cccctcatgc cgtgaagatg gacgtctaca atctgggtga 1740
tcagaccggc gttctcctta aagctctcgc tggcgtacca gttgoccaca tcgaaggaac 1800
gaagtaccac ctgaagtcag gccatgtaac ttgcgaggtg ggcctggaga agttgaaaat I860
gaaaggtctt acgtacacaa tgtgtgacaa gaccaagttc acatggaaga gggcccccac 1920
agatagcggc cacgatactg tggtgatgga ggtgaccttt tctggaacaa aaccctgcag 1980
aatacccgtg cgggctgtag ctcacggatc tcccgatgtc aatgttgcta tgctgattac 2040
acctaaccct accatcgaga ataacggtgg tggttttatt gagatgcagc ttccgccagg 2100
cgataacatc atctacgtgg gcgaactctc ttaccagtgg tttcagaaag ggagttcaat 2160
tgggcgggtc ttccaaaaaa cgaagaaggg aatcgaacga ttgacggtta tcggcgagca 2220
cgcatgggat tttggttccg cagggggatt cctgtcttct attggtaagg cactgcatac 2280
cgtgctgggg ggcgcattca attctatttt cgggggcgtg gggttcctgc ctaaactcct 2340
gctgggagta gccctggcct ggttgggact gaatatgcgg aatccgacga tgtccatgtc 2400
attoctcttg gccggcgtgo ttgtactggc catgacaotg ggcgttggcg ccgatcaagg 2460
<210> 51
<211> 2491
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 51
atgcgccatc aactttggca agagagagct с 2491
tcatttagga cacacgatta actccacgta accagacgtt tagctcaacg atccgttatt 60
tgtgtaaacc taattaaaat tagcaagcaa ctcgctaatc gtctcttgac tggtcttgta 120
cagaccagca tttcgagtcc ctttttggga cccgcagtta taccatgctg ctcctcaagc 180
gaggaacagt ttgttttatt ttgttttttg ttttgtttaa cctttgtctg gacotccaca 240
agttcctaaa tagaaaaaga aaaacaagtt gtaaaactga ccttttttct agtgtcgggt 300
ggatttctcc aacacctttt acgacctggg ttctgttccg aaccgacaag attcctttca 360
gttctctcac caccggtcaa actactctcc taacaggagt tcctttgcgg caagggtact 420
acaagactga cacgttaagg attaaaaccc gtaogacccg tactgttagc gtcgatgcca 480
agcgttcctt tctctgccgt catgccagta tgcgcgcctt ccattcctac ggcgatgggt 540
tcactctcac cttttaccat ggacgcagta agaccggtgg ctgtacccga gaaccacact 600
actatcggaa agaatactca cgcattggta tctagttcca ctccttggac aactgcaact 660
aacgaagacg gctttgcaoc taccccacat agagottata cctgccacac catttgttct 720
tocttcgtct tggtctgcga gtcacgaata tgggagggtg cgagttcctc tcgactggcc 780
tgcccctgta tttaccaacc tcccgctgag tgaggcttgt gtaaactggg cgcagctccc S4 0
gacccagacc tttttagccg acaaccggga gcgataccac tgtcagcaaa ccgagtgcga 900
cotcagacao caatgagcgc accgtcacga ccacoacgag gagacagaac ggggacagat 960
gcgcaggtcc acatgagtaa accttttgtc tctaaaacag tggccgtggg tcccctgctg 1020
agcccattgg gaccacgaac ttgacccacc aacgcaatga taatggcgac tcccgtttgg 108 0
gagataccta cacaccgacc tacgttagat agtcctctta gggcgtgttt ggtcccttat 114 0
aacggaagtg cgtttcgaca ggctatgttt ccagcgccga tccacgggtt gttaccctgg 1200
ccggtgggac egcctccttg tagtccctcc atgtcacacg tttgccctgg tctcactatc 1260
tccgacccca ttagtgacgc cggacaagcc gtttccttca taacagcgaa cgcagttccg 1320
tcggacactc cggtttttct tccgatgacc cgtgcagata ctgcggttgt tctagcaaat 1380
atgtcacttt caccttggtg tgtgtcccct aatgcaccgc cggttgctct gagtaaggcc 1440
agcgttttgc cggtcgaagt ggcacagtag gcttttctgg taggagtgat accccctcat 1500
accgotgcaa agagacgaga cggcccaccg atcgcctcag ctggaccggg tctgtcagta 1560
ggaccttgac ctattttgtc aactcgtaga cggatggcga accgtccacg tgtccctaac 1620
caaattgctg gaacgggacg gtacctttgt acttcctcgc tctttgacct tattacgtct 1680
cgctgagcat cttaagccac ggggagtacg gcacttctac ctgcagatgt tagacccact 1740
agtctggccg caagaggaat ttcgagagcg accgcatggt caacgggtgt agcttccttg 1800
cttcatggtg gacttcagtc cggtacattg aacgctccac ccggacctct tcaactttta 1860
ctttccagaa tgcatgtgtt acacactgtt ctggttcaag tgtaccttct cccgggggtg 1920
tctatcgccg gtgctatgac accaotacct ccactggaaa agaccttgtt ttgggacgtc 1980
ttatgggcac gcccgacatc gagtgcctag agggctacag ttacaacgat acgactaatg 2040
tggattggga tggtagctct tattgccacc accaaaataa ctctaogtcg aaggcggtcc 2100
gctatcgtag tagatgcacc cgcttgagag aatggtcacc aaagtctttc cctcaagtta 2160
acccgcccag aaggtttttt gottcttccc ttagcttgct aactgccaat agccgctcgt 2220
gcgtacccta aaaccaaggc gtccccctaa ggacagaaga taaccattcc gtgacgtatg 2280
gcacgacccc ccgcgtaagt taagataaaa gcccccgcac cccaaggacg gatttgagga 2340
cgaccctcat cgggaccgga ccaaccctga cttatacgcc ttaggctgct acaggtacag 2400
taaggagaac cggccgcacg aacatgaccg gtactgtgac ccgcaaccgc ggctagttcc 24 60
tacgcggtag ttgaaaccgt tctctctcga g 24 91
<210> 52
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaagc ggagctccaa acaaaagaaa cgggggggaa cagactggat gagctggctg 240
ctcgtaatcg gcatgctggg catgacaatc gcagctacgg ttcgcaagga aagagacggc 300
agtacggtca tacgcgcgga aggtaaggat gccgctaccc aagtgagagt ggaaaatggt 360
acctgcgtca ttctggccac cgacatgggc tcttggtgtg atgatagcct ttcttatgag 420
tgcgtaacca tagatcaagg tgaggaacct gttgacgttg attgcttctg ccgaaacgtg 4 80
gatggggtgt atctcgaata tggacggtgt ggtaaacaag aaggaagcag aaccagacgc 54 0
tcagtgctta taccctccca cgctcaagga gagctgaccg gacggggaca taaatggttg 600
gagggcgact cactocgaac acatttgacc cgogtcgagg gctgggtctg gaaaaatcgg 660
ctgttggccc tcgctatggt gacagtcgtt tggctcacgc tggagtctgt ggttactcgc 720
gtggcagtgc tggtggtgct cctctgtctt gcccctgtct acgcgtccag gtgtactcat 780
ttggaaaaca gagattttgt caccggcacc caggggaoga ctcgggtaac cctggtgctt 840
gaactgggtg gttgcgttac tattaccgct gagggcaaac cctctatgga tgtgtggctg 900
gatgcaatct atcaggagaa tcccgcacaa accagggaat attgccttca cgcaaagccg 960
tccgatacaa aggtcgcggc taggtgccca acaatgggac cggccaccct ggcggaggaa 1020
catcagggag gtacagtgtg caaacgggac cagagtgata gaggctgggg taatcactgc 1080
ggcctgttcg gcaaaggaag tattgtcgct tgcgtcaagg cagcctgtga ggccaaaaag 1140
aaggctactg ggcacgtcta tgacgccaac aagatcgttt atacagtgaa agtggaacca 1200
cacacagggg attacgtggc ggccaacgag actcattccg gtcgcaaaac ggccagcttc 1260
accgtgtcat ccgaaaagac catcctcact atgggggagt atggcgacgt ttctctgctc 1320
tgccgggtgg ctagcggagt cgacotggcc oagacagtca toctggaact ggataaaaca 1380
gttgagcatc tgcctaccgc ttggcaggtg cacagggatt ggtttaacga ccttgccctg 1440
ccatggaaac atgaaggagc gagaaactgg aataatgcag agcgactcgt agaattcggt 1500
gcccctcatg ccgtgaagat ggacgtctac aatctgggtg atcagaccgg cgttctcctt 1560
aaagctctcg ctggcgtacc agttgcccac atcgaaggaa cgaagtaoca cctgaagtca 1620
ggccatgtaa cttgcgaggt gggcctggag aagttgaaaa tgaaaggtct tacgtacaca 1680
atgtgtgaca agaccaagtt cacatggaag agggccccca cagatagcgg ccacgatact 1740
gtggtgatgg aggtgacctt ttctggaaca aaaccctgca gaatacccgt gcgggctgta 1800
gctcacggat ctcccgatgt caatgttgct atgctgatta cacctaaccc taccatcgag 1860
aataacggtg gtggttttat tgagatgcag cttccgccag gcgataacat catctacgtg 1920
ggcgaactct cttaccagtg gtttcagaaa gggagttcaa ttgggcgggt cttccaaaaa 1980
acgaagaagg gaatcgaacg attgacggtt atcggcgagc acgcatggga ttttggttcc 204 0
gcagggggat tcctgtcttc tattggtaag gcactgcata ccgtgctggg gggcgcattc 2100
aattctattt tcgggggcgt ggggttcctg cctaaactcc tgctgggagt agccctggcc 2160
tggttgggac tgaatatgcg gaatccgacg atgtccatgt cattcctctt ggccggcgtg 2220
cttgtactgg ccatgacaot gggcgttggc gccgacactg ggtgtgccat agacatcagc 2280
<210> 54
<211> 2286
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 54
cggcaa 2286
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattcg cctcgaggtt tgttttcttt gccccccctt gtctgaccta ctcgaccgac 240
gagcattagc cgtacgaccc gtactgttag cgtcgatgcc aagcgttcct ttctctgccg 300
tca'tgccagt atgcgcgcct tccattccta cggcgatggg ttcactctoa ccttttaoca 360
tggacgcagt aagaccggtg gctgtacccg agaaccacac tactatcgga aagaatactc 420
acgcattggt atctagttcc actccttgga caactgcaac taacgaagac ggctttgcac 480
ctaccccaca tagagcttat acctgccaca ccatttgttc ttccttcgtc ttggtctgcg 540
agtcacgaat atgggagggt gcgagttcct cccgactggc ctgcccctgt atttaccaac 600
ctcccgctga gtgaggcttg tgtaaactgg gcgcagctcc cgacccagac ctttttagcc 660
gacaaccggg agcgatacca ctgtcagcaa accgagtgcg acctcagaca ccaatgagcg 720
caccgtcacg accaccacga ggagacagaa cggggacaga tgcgcaggtc cacatgagta 780
aaccttttgt ctctaaaaca gtggocgtgg gtcccctgct gagcccattg ggaccacgaa 840
cttgacccac caacgcaatg ataatggcga ctcccgtttg ggagatacct acacaccgac 900
ctacgttaga tagtcctctt agggcgtgtt tggtccctta taacggaagt gcgtttcgac 960
aggctatgtt tccagcgccg atcoacgggt tgttaccctg gccggtggga ccgcctcctt 1020
gtagtccctc catgtcacac gtttgccctg gtctcactat ctccgacccc attagtgacg 1080
ccggacaagc cgtttccttc ataacagcga acgcagttcc gtcggacact ccggtttttc 1140
ttccgatgac ccgtgcagat actgcggttg ttctagcaaa tatgtcactt tcaccttggt 1200
gtgtgtcccc taatgcaccg ccggttgctc tgagtaaggc cagcgttttg ccggtcgaag 1260
tggcacagta ggcttttctg gtaggagtga taccccctca taccgctgca aagagacgag 1320
acggcccacc gatcgcctca gctggaccgg gtctgtcagt aggaccttga cctattttgt 1380
caactcgtag acggatggog aaccgtccac gtgtccccaa ccaaattgct ggaacgggac 1440
ggtacctttg tacttcctcg ctctttgacc ttattacgtc tcgctgagca tcttaagcca 1500
cggggagtac ggcacttcta cctgcagatg ttagacccac tagtctggcc gcaagaggaa 1560
tttcgagagc gaccgcatgg tcaacgggtg tagcttcctt gcttcatggt ggacttcagt 1620
ccggtacatt gaacgctcca cccggacctc ttcaactttt actttccaga atgcatgtgt 1680
tacacactgt tctggttcaa gtgtaccttc tcccgggggt gtctatcgcc ggtgctatga 1740
caccactacc tccactggaa aagaccttgt tttgggacgt cttatgggca cgcccgacat 1800
cgagtgccta gagggctaca gttacaacga tacgactaat gtggattggg atggtagctc 1860
ttattgccac caccaaaata actctacgtc gaaggcggtc cgctattgta gtagatgcac 1920
ccgcttgaga gaatggtcac caaagtcttt ccctcaagtt aacccqccca gaaggttttt 1980
tgcttcttcc cttagcttgc taactgccaa tagccgctcg tgcgtaccct aaaaccaagg 2040
cgtcccccta aggacagaag ataaccattc cgtgacgtat ggcacgaccc cccgcgtaag 2100
ttaagataaa agcccccgca ccccaaggac ggatttgagg acgaccctca togggaccgg 2160
accaaccctg acttatacgc cttaggctgc tacaggtaca gtaaggagaa ccggccgcac 2220
gaacatgacc ggtactgtga cccgcaaccg cggctgtgac ccacacggta tctgtagtcg 2280
gccgtt 2286
<210> 55 <211> 727 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 55
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu He Gly Leu Lys Arg
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 130
ggacttaagc ggagctccaa gcaaaagaaa cgcgggggaa agacaggcat agctgtgatg 24 0
ataggcatgc tggcttgtgt cggagcagct accgtgcgaa aagaacgcga cggaagcacc 300
gtgataaggg ctgagggtaa ggatgcggct acgcaggtga gagtagagaa tggcacttgc 360
gtaatactcg cgactgatat gggatcctgg tgtgacgata gcctcagtta tgaatgcgta 420
acaatagacc agggcgaaga acctgtggac gttgactgtt tctgtagaaa tgtggatggc 430
gtttatctgg agtacggccg ctgtggaaaa caggagggct cacgaactcg aagatctgtg 540
ctgattccaa gtcacgcgca aggagagttg accggtagag gccacaagtg gcttgaaggg 600
gactcattga ggacccacct gactagggtg gagggttggg tttggaagaa tcggttgctc 660
gcgctcgcta tggtcaccgt cgtgtggctg acactggaga gtgtcgtgac tcgggttgct 720
gtgttggttg tcctcctctg tttggcccca gtgtacgcgt ccaggtgtac tcatttggaa 780
aacagagatt ttgtcaccgg cacccagggg acgactcggg taaccctggt gcttgaactg 840
ggtggttgcg ttactattac cgctgagggc aaaccctcta tggatgtgtg gctggatgca 900
atctatcagg agaatcccgc acaaaccagg gaatattgcc ttcacgcaaa gctgtccgat 960
acaaaggtcg cggctaggtg cccaacaatg ggaccggcca ccctggcgga ggaacatcag 1020
ggaggtacag tgtgcaaacg ggaccagagt gatagaggct ggggtaatca ctgcggcctg 1080
ttcggcaaag gaagtattgt cgcttgcgtc aaggcagcct gtgaggccaa aaagaaggct 1140
actgggcacg tctatgacgc caacaagatc gtttatacag tgaaagtgga accacacaca 1200
ggggattacg tggcggccaa cgagactcat tccggtcgca aaacggccag cttcaccgtg 1260
tcatccgaaa agaccatcct cactatgggg gagtatggcg acgtttctct gctctgccgg 1320
gtggctagcg gagtcgacct ggcccagaca gtcatcctgg aactggataa aacagttgag 1380
catctgccta ccgcttggca ggtgcacagg gattggttta acgaccttgc cctgccatgg 1440
aaacatgaag gagcgagaaa ctggaataat gcagagcgac tcgtagaatt cggtgcccct 1500
catgccgtga agatggacgt ctacaatctg ggtgatcaga ccggcgttct ccttaaagct 1560
otcgctggcg taccagttgc ccacatcgaa ggaacgaagt accacctgaa gtcaggccat 1620
gtaacttgcg aggtgggcct ggagaagttg aaaatgaaag gtcttacgta cacaatgtgt 1680
gacaagacca agttcacatg gaagagggcc cccacagata gcggccacga tactgtggtg 1740
atggaggtga ccttttctgg aacaaaaccc tgcagaatac ccgtgcgggc tgtagctcac 1800
ggatctcccg atgtcaatgt tgctatgctg attacaccta accctaccat cgagaataac 1860
ggtggtggtt ttattgagat gcagcttccg ccaggcgata acatcatcta cgtgggcgaa 1920
ctctcttacc agtggtttca gaaagggagt tcaattgggc gggtcttcca aaaaacgaag 1980
aagggaatcg aacgattgac ggttatcggc gagcacgcat gggattttgg ttccgcaggg 204 0
ggattcctgt cttctattgg taaggcactg cataccgtgc tggggggcgc attcaattct 2100
attttcgggg gcgtggggtt cctgcctaaa ctcctgctgg gagtagccct ggcctggttg 2160
ggactgaata tgcggaatcc gacgatgtcc atgtcattcc tcttggccgg cgtgcttgta 2220
<210> 57
<211> 2280
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 57
ctggccatga cactgggcgt tggcgccgac actgggtgtg ccatagacat cagccggcaa 2280
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattcg cctcgaggtt cgttttcttt gcgccccctt tctgtccgta tcgacactac 240
tatccgtacg accgaacaca gcctcgtcga tggcacgctt ttcttgcgct gccttcgtgg 300
cactattccc gactcccatt cctacgccga tgcgtccact ctcatctctt accgtgaacg 360
cattatgagc gctgactata ccctaggacc acactgctat cggagtcaat acttacgcat 420
tgttatctgg tcccgcttct tggacacctg caactgacaa agacatcttt acacctaccg 480
caaatagacc tcatgccggc gacacctttt gtcctcccga gtgcttgagc ttctagacac 540
gactaaggtt cagtgcgcgt tcctctcaac tggccatctc cggtgttcac cgaacttccc 600
ctgagtaact cctgggtgga ctgatcccac ctcccaaccc aaaccttctt agccaacgag 660
cgcgagcgat accagtggca gcacaccgac tgtgacctct cacagcactg agcccaacga 720
cacaaccaac aggaggagac aaaccggggt cacatgcgca ggtccacatg agtaaacctt 780
ttgtctctaa aacagtggcc gtgggtcccc tgctgagccc attgggacca cgaacttgac 840
ccaccaacgc aatgataatg gcgactcccg tttgggagat acctacacac cgacctacgt 900
tagatagtcc tcttagggcg tgtttggtcc cttataacgg aagtgcgttt cgacaggcta 960
tgtttccagc gccgatccac gggttgttac cctggccggt gggaccgcct ccttgtagtc 1020
cctccatgtc acacgtttgc cctggtctca ctatctccga ccccattagt gacgccggac 1080
aagccgtttc cttcataaca gcgaacgcag ttccgtcgga cactccggtt tttcttccga 1140
tgacccgtgc agatactgcg gttgttctag caaatatgtc actttcacct tggtgtgtgt 1200
cccctaatgc accgccggtt gctctgagta aggccagcgt tttgccggtc gaagtggcac 1260
agtaggcttt tctggtagga gtgatacccc ctcataccgc tgcaaagaga cgagacggcc 1320
caccgatcgc ctcagctgga ccgggtctgt cagtaggacc ttgaoctatt ttgtcaactc 1380
gtagacggat tttgtacttc gtacggcact gagcgaccgc cattgaacgc ctgttctggt tacctccact cctagagggc ccaccaccaa gagagaatgg ttcccttagc cctaaggaca taaaagcccc cctgacttat gaccggtact ggcgaaccgt ctcgctcttt tctacctgca atggtcaacg tccacccgga tcaagtgtac ggaaaagacc tacagttaca aataactcta tcaccaaagt ttgctaactg gaagataacc cgcaccccaa acgccttagg gtgacccgca ccacgtgtcc gaccttatta ga tgttagac ggtgtagctt cctcttcaac cttctcccgg ttgttttggg acgatacgac cgtcgaaggc ctttccctca ccaatagccg attccgtgac ggacggattt ctgctacagg accgcggctg ctaaccaaat cgtctcgctg ccactagtct ccttgcttca ttttaotttc gggtgtotat acgtcttatg taatgtggat ggtccgctat agttaacccg ctcgtgcgta gtatggcacg gaggacgacc tacagtaagg tgacccacac tgctggaacg agcatcttaa ggccgcaaga tggtggactt cagaatgcat cgccggtgct ggcacgcccg tgggatggta tgtagtagat cccagaaggt ccctaaaacc accccccgcq ctcatcggga agaaccggcc ggtatctgta ggacggtacc gccacgggga ggaatttcga eagtccggta gtgttacaca atgacaccac acatcgagtg gctcttattg gcacccgctt tttttgcttc aaggcgtccc taagttaaga ccggaccaac gcacgaacat gtcggccgtt
<210> 58 <211> 635 <212> БЕЛОК
<213> Artificial Segeunce <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 58
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
15 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu He Gly Leu Lys Gin
20 25 30
Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly He Ala Val He Val Pro Gin Ala
35 40 45
Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu Cys Phe Gly Lys Phe
50 55 60
Pro He Tyr Thr He Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro He Asp
65 70 75 80
He His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly
85 90 95
His Ala Asp Thr Gly Cys Ala He Asp He Ser Arg Gin Glu Leu Arg
610 615 620
Cys Gly Ser Gly Val Phe He His Asn Asp Val
<210> 59 <211> 2000 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 59
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaagc aaaagaagcg agggggcaag actggtatag ctgtgatcgt tcctcaggct 240
cttttgtttg tacccttgct ggtatttccc ctttgctttg gtaaatttcc tatctatacc 300
atccctgata agctcgggcc ttggagtccc attgatattc accatttgag ctgcccaaac 360
aacctcgtcg ttgaggatga agggtgcact aatcttcctg gattttccta catggagttg 420
aaagtgggct atatttcagc cattaagatg aacggcttta cttgtacagg agtcgtgacc 480
gaagccgaga catatacaaa tttcgtggga tacgtcacca ccaccttcaa gagaaaacac 540
ttccgcccaa cgcctgacgc ttgtcgggcc gcttacaact ggaagatggc aggagatcct 600
cgatatgaag aatctctgca caacecgtat cctgattacc attggctgcg gacagtcaag 660
actaccaagg agagtctggt cattatatca ccaagcgtgg ccgatcttga tccttatgat 720
agatccctgc acagtagggt ttttcctggc gggaattgta gcggtgttgc agtatcaagt 780
acotactgct ccactaacca cgactacact atatggatgc ctgagaaocc tcgactcggt 840
atgagttgcg acatttttac gaactcacgg ggcaagcggg catctaaggg gtctgaaaca 900
tgcgggtttg ttgatgagcg ggggttgtat aaatctctta aaggcgcctg taagctgaaa 960
ctctgtggcg tactggggct gcgcctgatg gacggcacat gggtggctat gcagacaagc 1020
aatgaaacaa agtggtgtcc ccctggtcag ctggttaatc tgcacgactt taggtctgac 1080
gaaatcgagc accttgtggt ggaggaaotg gtgaagaaac gcgaagagtg cctggacgca 1140
cttgagagta ttatgaccac caaatccgtt tccttcagaa gactgagcca cctgcgaaag 1200
ctggtgccag ggttcgggaa ggcttatact attttcaaca agactcttat ggaggcggat 1260
gcccattata agtcagttag gacttggaat gagataattc cctccaaagg atgtctgaga 1320
gtcggtggga gatgccaccc ccatgtcaat ggggtgttct ttaacggaat catcctggga 1380
cctgacggga aogtgctgat tcccgagatg caatcttccc ttctgcagca acacatggaa 1440
ctcctggtgt cttcagtgat acccctgatg cacccactgg ccgaccccag cactgtgttc 1500
aaaaatggcg atgaggccga agactttgtg gaagttcacc tgcccgatgt acacgaaagg 1560
atatctggag tagacctggg ccttcctaat tggggtaagt acgtgctcct gagtgcgggt 1620
gccttgaccg ctttgatgct gatcattttt ctgatgacct gctggcggag ggtgaatcgc 1680
tccgagccga cacagcacaa tctcagaggg acaggccggg aagtaagtgt gactccgcaa 174 0
tctggcaaga ttattagtag ttgggagagt tacaagtctg gaggagagac tgggttgaat 1800
tttgatctgc tcaaacttgc aggcgatgta gaatcaaatc ctggacccgc ccgggacagg I860
tccatagctc tcacgtttct cgcagttgga ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg 1920
cacgctgaca ctgggtgtgc catagacatc agccggcaag agctgagatg tggaagtgga 1980
gtgttcatac acaatgatgt 2000
<210> 60
<211> 2000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 60
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattcg ttttcttcgc tcccccgttc tgaccatatc gacactagca aggagtccga 24 0
gaaaacaaac atgggaacga ccataaaggg gaaacgaaac catttaaagg atagatatgg 300
tagggactat tcgagcccgg aacctcaggg taactataag tggtaaactc gacgggtttg 360
ttggagcagc aactcctact tcccacgtga ttagaaagac ctaaaaggat gtacctcaac 420
tttcacccga tataaagtcg gtaattctac ttgccgaaat gaacatgtcc tcagcactgg 4 80
cttcggctct gtatatgttt aaagcaccct atgcagtggt ggtggaagtt ctcttttgtg 540
aaggcgggtt gcggactgcg aacagcccgg cgaatgttga ccttctaccg tcctctagga 600
gctatacttc ttagagacgt gttgggcata ggactaatgg taaccgacgc ctgtcagttc 660
tgatggttcc tctcagacca gtaatatagt ggttcgcacc ggctagaact aggaatacta 720
totagggacg tgtcatccca aaaaggaccg cccttaacat cgccacaacg tcatagttca 780
tggatgacga ggtgattggt gctgatgtga tatacctacg gactcttggg agctgagcca 840
tactcaacgc tgtaaaaatg cttgagtgcc ccgttcgccc gtagattccc cagactttgt 900
acgcccaaac aactactcgc ccccaacata tttagagaat ttccgcggac attcgacttt 960
gagacaccgc atgaccccga cgcggactac ctgccgtgta cccaccgata cgtctgttcg 1020
ttactttgtt tcaccscaqq gggaccagtc gaccaattag acgtgctgaa atccagactg 1080
ctttagctcg tggaacacca cctccttgac cacttctttg cgcttctcac ggacctgcgt 1140
gaactctcat aatactggtg gtttaggcaa aggaagtctt ctgactcggt ggacgctttc 1200
gaccacggtc ccaagccctt ccgaatatga taaaagttgt tctgagaata cctccgccta 12 60
cgggtaatat tcagtcaatc ctgaacctta ctctattaag ggaggtttcc tacagactct 1320
cagccaccct ctacggtggg ggtacagtta ccccacaaga aattgcctta gtaggaccct 1380
ggactgccct tgcacgacta agggctctac gttagaaggg aagacgtcgt tgtgtacctt 1440
gaggaccaca gaagtcacta tggggactac gtgggtgacc ggctggggtc gtgacacaag 1500
tttttaccgc tactccggct tctgaaacac cttcaagtgg acgggctaca tgtgctttcc 1560
tatagacctc atctggaccc ggaaggatta accccattca tgcacgagga ctcacgccca 1620
cggaactggc gaaactacga ctagtaaaaa gactactgga cgaccgcctc ccacttagcg 1680
aggctcggct gtgtcgtgtt agagtctccc tgtccggccc ttcattcaca ctgaggcgtt 1740
agaccgttct aataatcatc aaccctctca atgttcagac ctcctctctg acccaactta 1800
aaactagacg agtttgaacg tccgctacat cttagtttag gacctgggcg ggccctgtcc I860
aggtatcgag agtgcaaaga gcgtcaacct cctcaagacg agaaggagag gcacttgcac 1Э20
gtgcgactgt gacccacacg gtatctgtag tcggccgttc tcgactctac accttcacct 1980
cacaagtatg tgttactaca 2000
<210> 61 <211> 1303 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 61
Mat Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu lie Gly Leu Lys Gin
20 25 30
Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly He Ala Val He Val Pro Gin Ala
35 40 45
Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu Cys Phe Gly Lys Phe
50 55 60
Pro He Tyr Thr He Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro He Asp
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 62
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaagc aaaagaagcg agggggcaag actggtatag ctgtgatcgt tcctcaggct 240
cttttgtttg tacccttgct ggtatttccc ctttgctttg gtaaatttcc tatctatacc 300
atccctgata agctcgggcc ttggagtccc attgatattc accatttgag ctgcccaaac 360
aacctcgtcg ttgaggatga agggtgcact aatctttctg gattttccta catggagttg 420
aaagtgggct atatttcagc cattaagatg aacggcttta cttgtacagg agtcgtgacc 480
gaagccgaga catatacaaa tttcgtggga tacgtcacca ccaccttcaa gagaaaacac 540
ttccgcccaa cgcctgacgc ttgtcgggcc gcttacaact ggaagatggc aggagatcct 600
cgatatgaag aatctctgca caacccgtat cctgattacc attggctgcg gacagtcaag 660
actaccaagg agagtctggt cattatatca ccaagcgtgg ccgatcttga tccttatgat 7 20
agatccctgc acagtagggt ttttcctggc gggaattgta gcggtgttgc agtatcaagt 78 0
acctactgct ccactaacca cgactacact atatggatgc ctgagaaccc tcgactcggt 840
atgagttgcg acatttttac gaactcacgg ggcaagcggg catctaaggg gtctgaaaca 900
tgcgggtttg ttgatgagcg ggggttgtat aaatctctta aaggcgcctg taagctgaaa 960
ctctgtggcg tactggggct gcgcctgatg gacggcacat gggtggctat gcagacaagc 1020
aatgaaacaa agtggtgtcc ccctggtcag ctggttaatc tgcacgactt taggtctgac 1080
gaaatcgagc accttgtggt ggaggaactg gtgaagaaac gcgaagagtg cctggacgca 1140
cttgagagta ttatgaccac caaatccgtt tccttcagaa gactgagcca cctgcgaaag 1200
ctggtgccag ggttcgggaa ggcttatact attttcaaca agactcttat ggaggcggat 1260
gcccattata agtcagttag gacttggaat gagataattc cctccaaagg atgtctgaga 1320
gtcggtggga gatgccaccc ccatgtcaat ggggtgttct ttaacggaat catcctggga 1380
cctgacggga acgtgctgat tcccgagatg caatcttccc ttctgcagca acacatggaa 1440
ctcctggtgt cttcagtgat acccctgatg cacccactgg ccgaccccag cactgtgttc 1500
aaaaatggcg atgaggccga agactttgtg gaagttcacc tgcccgatgt acacgaaagg 1560
atatctggag tagacctggg ccttcctaat tggggtaagt acgtgctcct gagtgcgggt 1620
gccttgaccg ctttgatgct gatcattttt ctgatgacct gctggcggag ggtgaatcgc 1680
tccgagccga cacagcacaa tctcagaggg acaggccggg aagtaagtgt gactccgcaa 1740
tctggcaaga ttattagtag ttgggagagt tacaagtctg gaggagagac tgggttgaat 1800
tttgatctgc
tcaaacttgc
aggcgatgta
gaatcaaatc
ctggacccgg
aggaaagacc
1860
ggtattgcag
tcatgattgg
cctgatcgcc
tgcgtaggag
cagttaccct
ctctaacttc
1920
caagggaagg
tgatgatgac
ggtaaatgct
actgacgtca
cagatgtcat
cacgattcca
1980
acagctgctg
gaaagaacct
atgcattgtc
agagcaatgg
atgtgggata
catgtgcgat
2040
gatactatca
cttatgaatg
cccagtgctg
tcggctggta
atgatccaga
agacatcgac
2100
tgttggtgca
caaagtcagc
agtctacgtc
aggtatggaa
gatgcaccaa
gacacgccac
2160
tcaagacgca
gtcggaggtc
actgacagtg
cagacacacg
gagaaagcac
tctagcgaac
2220
aagaaggggg
cttggatgga
cagcaccaag
gccacaaggt
atttggtaaa
aacagaatca
2280
tggatottga
ggaaccctgg
atatgccctg
gtggcagccg
tcattggttg
gatgcttggg
2340
agcaacacca
tgcagagagt
tgtgtttgtc
gtgctattgc
ttttggtggc
cccagcttac
2400
agctttaact
gccttggaat
gagcaacaga
gacttcttgg
aaggagtgtc
tggagcaaca
2460
tgggtggatt
tggttctcga
aggcgacagc
tgcgtgacta
tcatgtctaa
ggacaagcct
2520
accatcgatg
tgaagatgat
gaatatggag
gcggccaacc
tggcagaggt
ccgcagttat
2580
tgctatttgg
ctaccgtcag
cgatctctcc
accaaagctg
cgtgcccggc
catgggagaa
2640
gctcacaatg
acaaacgtgc
tgaoccagct
tttgtgtgca
gacaaggagt
ggtggacagg
2700
ggctggggca
acggctgcgg
actatttggc
aaaggaagca
ttgacacatg
cgccaaattt
2760
gcctgctcta
ccaaggcaat
aggaagaacc
attttgaaag
agaatatcaa
gtacgaagtg
2820
gccatttttg
tccatggacc
aactactgtg
gagtcgcacg
gaaactactc
cacacaggtt
2880
ggagccactc
aggcagggag
attcagcatc
actcctgcgg
cgccttcata
cacactaaag
2940
cttggagaat
atggagaggt
gacagtggac
tgtgaaccac
ggtcagggat
tgacaccaat
3000
gcatactacg
tgatgactgt
tggaacaaag
acgttcttgg
tccatogtga
gtggttcatg
3060
gacctcaacc
tcccttggag
cagtgctgga
agtactgtgt
ggaggaacag
agagacgtta
3120
atggagtttg
aggaaccaca
cgccacgaag
cagtctgtga
tagcattggg
ctcacaagag
3180
ggagctctgc
atcaagcttt
ggctggagcc
attcctgtgg
aattttcaag
caacactgtc
3240
aagttgacgt
cgggtcattt
gaagtgtaga
gtgaagatgg
aaaaattgca
gttgaaggga
3300
acaacctatg
gcgtctgttc
aaaggctttc
aagtttcttg
ggactcccgc
agacacaggt
3360
cacggcactg
tggtgttgga
attgcagtac
actggcacgg
atggaccttg
caaagttcct
3420
atctcgtcag
tggcttcatt
gaacgaccta
acgccagtgg
gcagattggt
cactgtcaac
3480
ccttttgttt
cagtggccac
ggccaacgct
aaggtcctga
ttgaattgga
accacccttt
3540
ggagactcat
acatagtggt
gggcagagga
gaacaacaga
tcaatcacca
ctggcacaag
3600
tctggaagca
gcattggcaa
agoctttaca
accaccctca
aaggagcgca
gagactagcc
3660
gctctaggag
acacagct-tg
ggactttgga
tcagttggag
gggtgttcac
ctcagttggg
3720
aaggctgtcc atcaagtgtt cggaggagca ttccgctcac tgttcggagg catgtcctgg 3780
ataacgc &ag gattgctggg ggctctcctg ttgtggatgg gcatcaatgc tcgtgacagg 3840
tccatagctc tcacgtttct cgcagttgga ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg 3900
cacgctgaca ctgggtgtgc catagacatc agccggcaag agctgagatg tggaagtgga 3960
<210> 63
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 63
gtgttcatac acaatgatgt ggaggcttgg atggaccggt 4000
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagtt atacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaatccg ttttcttcgc tcccccgttc tgaccatatc gacactagca aggagtccga 240
gaaaacaaac atgggaacga ccataaaggg gaaacgaaac catttaaagg atagatatgg 300
tagggactat tcgagcccgg aacctcaggg taactataag tggtaaactc gacgggtttg 360
ttggagcagc aactcctact tcccacgtga ttagaaagac ctaaaaggat gtacctcaac 420
tttcacccga tataaagtcg gtaattctac ttgccgaaat gaacatgtcc tcagcactgg 480
cttcggctct gtatatgttt aaagcaccct atgcagtggt ggtggaagtt ctcttttgtg 540
aaggcgggtt gcggactgcg aacagcccgg cgaatgttga ccttctaccg tcctctagga 600
gctatacttc ttagagacgt gttgggcata ggactaatgg taaccgacgc ctgtcagttc 660
tgatggttcc tctcagacca gtaatatagt ggttcgcacc ggctagaact aggaatacta 720
tctagggacg tgtcatccca aaaaggaccg cccttaacat cgccacaacg tcatagttca 780
tggatgacga ggtgattggt gctgatgtga tatacctacg gactcttggg agctgagcca 840
tactcaacgc tgtaaaaatg cttgagtgcc ccgttcgccc gtagattccc cagactttgt 900
acgcccaaac aactactcgc ccccaacata tttagagaat ttccgcggac attcgacttt 960
gagacaccgc atgaccccga cgcggactac ctgccgtgta cccaccgata cgtctgttcg 1020
ttactttgtt tcaccacagg gggaccagtc gaccaattag acgtgctgaa atccagactg 1080
ctttagctcg tggaacacca cctccttgac cacttctttg cgcttctcac ggacctgcgt 1140
gaactctcat aatactggtg gtttaggcaa aggaagtctt ctgactcggt ggacgctttc 1200
gaccacggcc ccaagccctt ccgaatatga taaaagttgt tctgagaata cctccgccta 1260
cgggtaatat tcagtcaatc ctgaacctta ctctattaag ggaggtttcc tacagactct 1320
cagccaccct ctacggtggg ggtacagtta ccccacaaga aattgcctta gtaggaccct 1380
ggactgccct tgcacgacta agggctctac gttagaaggg aagacgtcgt tgtgtacctt 1-3 40
gaggaccaca gaagtcacta tggggactac gtgggtgacc ggctggggtc gtgacacaag 1500
tctttaccgc tactccggct tctgaaacac cttcaagtgg acgggctaca tgtgctttcc 1560
tatagacctc atctggaccc ggaaggatta accccattca tgcacgagga ctcacgccca 1620
cggaactggc gaaactacga ctagtaaaaa gactactgga cgaccgcctc ccacttagcg 1680
aggctcggct gtgtcgtgtt agagtctccc tgtccggccc ttcattcaca ctgaggcgtt 1740
agaccgttct aataatcatc aaccctctca atgttcagac ctcctctctg acccaactta 1800
aaactagacg agtttgaacg tccgctacat cttagtttag gacctgggcc tcctttctgg 1860
ccataacgtc agtactaacc ggactagcgg acgcatcctc gtcaatggga gagattgaag 1920
gttcccttcc actactactg ccatttacga tgactgcagt gtctacagta gtgctaaggt 1980
tgtcgacgac ctttcttgga tacgtaacag tctcgttacc tacaccctat gtacacgcta 204 0
ctatgatagt gaatacttac gggtcacgac agccgaccat tactaggtct tctgtagctg 2100
acaaccacgt gtttcagtcg tcagatgcag tccatacctt ctacgtggtt ctgtgcggtg 2160
agttctgcgt cagcctccag tgactgtcac gtctgtgtgc ctctttcgtg agatcgcttg 2220
ttcttccccc gaacctacct gtcgtggtto oggtgttcca taaaccattt ttgtcttagt 2280
acctagaact ccttgggacc tatacgggac caccgtcggc agtaaccaac ctacgaaccc 2340
tcgttgtggt acgtctctca acacaaacag cacgataacg aaaaccaccg gggtcgaatg 2400
tcgaaattga cggaacctta ctcgttgtct ctgaagaacc ttcctcacag acctcgttgt 2460
acccacctaa accaagagct tccgctgtcg acgcactgat agtacagatt cctgttcgga 2520
tggtagctac acttctacta cttatacctc cgccggttgg accgtctcca ggcgtcaata 2580
acgataaacc gatggcagtc gctagagagg tggtttcgac gcacgggccg gtaccctctt 2640
cgagtgttac tgtttgcacg actgggtcga aaacacacgt ctgttcctca ccacctgtcc 2700
ccgaccccgt tgccgacgcc tgataaaccg tttccttcgt aactgtgtac gcggtttaaa 27 60
cggacgagat ggttcogtta tccttcttgg taaaactttc tcttatagtt catgcttcac 2820
cggtaaaaac aggtacctgg ttgatgacac ctcagcgtgc ctttgatgag gtgtgtccaa 2880
cctcggtgag tccgtccctc taagtcgtag tgaggacgcc gcggaagtat gtgtgatttc 2940
gaacctctta tacctctcca ctgtcacctg acacttggtg ccagtcccta actgtggtta 3000
cgtatgatgc actactgaca accttgtttc tgcaagaacc aggtagcact caccaagtac 3060
ctggagttgg agggaacctc gtcacgacct tcatgacaca cctccttgtc tctctgcaat 3120
tacctcaaac tccttggtgt gcggtgcttc gtcagacact atcgtaaccc gagtgttctc 3180
cctcgagacg tagttcgaaa ccgacctcgg taaggacacc ttaaaagttc gttgtgacag 324 0
ttcaactgca
gcccagtaaa
cttcacatct
oacttctacc
tttttaacgt
caacttccct
3300
tgttggatac
cgcagacaag
tttccgaaag
ttcaaagaac
cctgagggcg
tctgtgtcca
3360
gtgccgtgac
accacaacct
taacgtcatg
tgaccgtgcc
tacctggaac
gtttcaagga
3420
tagagcagtc
accgaagtaa
cttgctggat
tgcggtcacc
cgtctaacca
gtgacagttg
3480
ggaaaacaaa
gtcaccggtg
ccggttgcga
ttccaggact
aacttaacct
tggtgggaaa
3540
cctctgagta
tgtatcacca
cccgtctcct
cttgttgtct
agttagtggt
gaccgtgttc
3600
agaccttcgt
cgtaaccgtt
tcggaaatgt
tggtgggagt
ttcctcgcgt
ctctgatcgg
3660
cgagatcctc
tgtgtcgaac
cctgaaacct
agtcaacctc
cccacaagtg
gagtcaaccc
3720
ttccgacagg
tagttcacaa
gcctcctcgt
aaggcgagtg
acaagcctcc
gtacaggacc
3780
tattgcgttc
ctaacgaccc
ccgagaggac
aacacctacc
cgtagttacg
agcactgtcc
3840
aggtatcgag
agtgcaaaga
gcgtcaacct
cctcaagacg
agaaggagag
gcacttgcac
ЗЭ00
gtgcgactgt
gacccacacg
gtatctgtag
tcggccgttc
tcgactctac
accttcacct
3960
cacaagtatg
tgttactaca
cctccgaacc
tacctggcca
4000
<210> 64 <211> 702 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 64
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
15 10 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu He Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Ala Met Leu Ser Leu He Asp Gly Lys Gly Pro He Arg Phe Val Leu
35 40 45
Ala Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala He Ala Pro Thr Arg Ala
50 55 60
Val Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gin Thr Ala Met Lys His
65 70 75 80
Leu Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala He Asn
85 90 95
Arg Arg Ser Ser Lys Gin Lys Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly He Ala
100 105 110
Ser Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu Asn Phe Asp
625 630 635 640
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ala Arg
645 650 655
Asp Arg Ser He Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu
660 665 670
Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala lie Asp He
675 680 685
Ser Arg Gin Glu Leu Arg Cys Gly Ser Gly Val Phe lie His
<210> 65 <211> 2200 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 65
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaaga gggctatgtt gagcotgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240
gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300
tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagtttcaa gaaggaacta 360
gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaagc aaaagaagcg agggggcaag 420
actggtatag ctgtgatcgt tcctcaggct cttttgtttg tacccttgct ggtatttccc 480
ctttgctttg gtaaatttcc tatctatacc atccctgata agctcgggcc ttggagtccc 540
attgatattc accatttgag ctgcccaaac aacctcgtcg ttgaggatga agggtgcact 600
aatctttctg gattttccta catggagttg aaagtgggctr atatttcagc cattaagatg 660
aacggcttta cttgtacagg agtcgtgacc gaagccgaga catatacaaa tttcgtggga 720
tacgtcacca ccaccttcaa gagaaaacac ttccgcccaa cgcctgacgc ttgtcgggcc 7 80
gcttacaact ggaagatggc aggagatcct cgatatgaag aatctotgca caacccgtat 840
cctgattacc attggctgcg gacagtcaag actaccaagg agagtctggt cattatatca 900
ccaagcgtgg ccgatcttga tccttatgat agatccctgc acagtagggt ttttcctggc 960
gggaattgta gcggtgttgc agtatcaagt acctactgct ccactaacca cgactacact 1020
atatggatgc ctgagaaccc tcgactcggt atgagttgcg acatttttac gaactcacgg 1080
ggcaagcggg canctaaggg gtctgaaaca tgcgggtttg ttgacgagcg ggggttgtat 1140
aaatctctta aaggogcctg taagctgaaa ctctgtggcg taotggggct gcgcctgatg 1200
gacggcacat gggtggctat gcagacaagc aatgaaacaa agtggtgtcc ccctggtcag 1260
ctggttaatc tgcacgactt taggtctgac gaaatcgagc accttgtggt ggaggaactg 1320
gtgaagaaac gcgaagagtg cctggacgca cttgagagta ttatgaccac caaatccgtt 1380
tccttcagaa gactgagcca cctgcgaaag ctggtgccag ggttcgggaa ggcttatact 1440
attttcaaca agactcttat ggaggcggat gcccattata agtcagttag gacttggaat 1500
gagataatcc cctccaaagg atgtctgaga gtcggtggga gatgccaccc ccatgtcaat 1560
ggggtgttct ttaacggaat catcctggga cctgacggga acgtgctgat tcccgagatg 1620
caatcttccc ttctgcagca acacatggaa ctcctggtgt cttcagtgat acccctgatg 1680
cacccactgg ccgaccccag cactgtgttc aaaaatggcg atgaggccga agactttgtg 1740
gaagttcacc tgcccgatgt acacgaaagg atatctggag tagacctggg ccttcctaat 1800
tggggtaagt aogtgctcot gagtgcgggt gccttgaccg ctttgatgct gatcattttt 1860
ctgatgacct gctggcggag ggtgaatcgc tccgagccga cacagcacaa tctcagaggg 1920
acaggccggg aagtaagtgt gactccgcaa tctggcaaga ttattagtag ttgggagagt 198 0
tacaagtctg gaggagagac tgggttgaat tttgatctgc tcaaacttgc aggcgatgta 2040
gaatcaaatc ctggacccgc ccgggacagg tccatagctc tcacgtttct cgcagttgga 2100
ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg cacgctgaca ctgggtgtgc catagacatc 2160
agccggcaag agctgagatg tggaagtgga gtgttcatac 2200
<210> 66
<211> 2200
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 66
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattct cccgatacaa ctcggactag ctgccgttcc ccggttatgc taaacacaac 240
cgagagaacc gcaagaagtc caagtgtcgt taacgaggct gggctcgtca cgacctagct 300
acctctccac acttgtttgt ttgtcgctac tttgtggaag actcaaagtt cttccttgat 360
ccctggaact ggtcacgata gttagccgcc tcgagtttcg ttttcttcgc tcccccgttc 420
tgaccatatc gacactagca aggagtccga gaaaacaaac atgggaacga ccataaaggg 480
gaaacgaaac catttaaagg atagatatgg tagggactat tcgagcccgg aacctcaggg 540
taactataag tggtaaactc gacgggtttg ttggagcagc aactcctact tcccacgtga 600
ttagaaagac ctaaaaggat gtacctcaac tttcacccga tataaagtcg gtaattctac 660
ttgccgaaat gaacatgtcc tcagcactgg cttcggctct gtatatgttt aaagcaccct 720
atgcagtggt ggtggaagtt ctcttttgtg aaggcgggtt gcggactgcg aacagcccgg 780
cgaatgttga ccttctaccg tcctctagga gctatacttc ttagagacgt gttgggcata 840
ggactaafcgg taaccgacgc ctgtcagttc tgatggttcc tctcagacca gtaatatagt 900
ggttcgcacc ggctagaact aggaatacta tctagggacg tgtcatccca aaaaggaccg 960
cccttaacat cgccacaacg tcatagttca tggatgacga ggtgattggt gctgatgtga 1020
tatacctacg gactcttggg agctgagcca tactcaacgc tgtaaaaatg cttgagtgcc 1080
ccgttcgccc gtagattccc cagactttgt acgcccaaac aactactcgc caccaacata 1140
tttagagaat ttccgcggac attcgacttt gagacaccgc atgaccccga cgcggactac 1200
ctgccgtgta cccaccgata cgtctgttcg ttactttgtt tcaccacagg gggaccagtc 1260
gaccaattag acgtgctgaa atccagactg ctttagctcg tggaacacca cctccttgac 1320
cacttctttg cgcttctcac ggacctgcgt gaactctcat aatactggtg gtttaggcaa 1380
aggaagtctt ctgactcggt ggacgctttc gaccacggtc ccaagccctt ccgaatatga 1440
taaaagttgt tctgagaata cctccgccta cgggtaatat tcagtcaatc ctgaacctta 1500
ctctattaag ggaggtttec tacagactct cagccaccct ctacggtggg ggtacagtta 1560
ccccacaaga aattgectta gtaggaccct ggactgccct tgcacgacta agggctctac 1620
gttagaaggg aagacgtcgt tgtgtacctt gaggaccaca gaagtcacta tggggactac 1680
gtgggtgacc ggctggggtc gtgacacaag tttttacege tactccggct tctgaaacac 1740
cttcaagtgg aegggctaca tgtgctttcc tatagacctc atctggaccc ggaaggatta 1300
accccattca tgcacgagga ctcacgccca eggaactgge gaaactacga ctagtaaaaa 1860
gactactgga cgaccgcctc ccacttagcg aggctegget gtgtcgtgtt agagtctccc 1920
tgtccggccc ttcattcaca ctgaggcgtt agacegttet aataatcatc aaccctctca 1980
atgttcagac ctcctctctg acccaactta aaactagacg agtttgaacg tccgctacat 2040
cttagtttag gacctgggcg ggccctgtcc aggtatcgag agtgcaaaga gcgtcaacct 2100
cctcaagacg agaaggagag gcacttgcac gtgcgactgt gacccacacg gtatctgtag 2160
tcggccgttc tcgactctac accttcacct cacaagtatg 2200
<210> 67 <211> 868 <212> БЕЛОК
740 745 750
Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly He Asn Ala Arg Asp
755 760 765
Arg Ser He Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe
770 775 780
Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly He His Arg Gly Pro Ala
785 790 795 800
Thr Arg Thr Thr Thr Glu Ser Gly Lys Leu He Thr Asp Trp Cys Cys
805 810 815
Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Gin Thr Asp Ser Gly Cys
820 825 830
Trp Tyr Gly Met Glu He Arg Pro Gin Arg His Asp Glu Lys Thr Leu
835 840 845
Val Gin Ser Gin Val Asn Ala Tyr Asn Ala Asp Met He Asp Pro Phe
850 855 860
<210> 68
<211> 2700
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 68
Gin Leu Gly Leu 865
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240
gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300
tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagtttcaa gaaggaacta 360
gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaaac aaaagaaaag aggaggaaag 4 20
accggaattg cagtcatgat tggcctgatc gccagcgtag gagcagttac cctctctaac 480
ttccaaggga aggtgatgat gacggtaaat gctactgacg tcacagatgt catcacgatt 540
ccaacagctg ctggaaagaa cctatgcatt gtcagagcaa tggatgtggg atacatgtgc 600
gatgatacta tcacttatga atgcccagtg ctgtcggctg gtaatgatcc agaagacatc 660
gactgttggt gcacaaagtc agcagtctac gtcaggtatg gaagatgcac caagacacgc 720
cactcaagac gcagtcggag gtcactgaca gtgcagacac acggagaaag cactctagcg 780
aacaagaagg gggcttggat ggacagcacc aaggccacaa ggtatttggt aaaaacagaa 840
tcatggatct tgaggaaccc tggatatgcc ctggtggcag ccgtcattgg ttggatgctt 900
gggagcaaca ccatgcagag agttgtgttt gtcgtgctat tgcttttggt ggccccagct 960
tacagcttta actgccttgg aatgagcaac agagacttct tggaaggagt gtctggagca 1020
acatgggtgg atttggttct cgaaggcgac agctgcgtga ctatcatgtc taaggacaag 1080
cctaccatcg atgtgaagat gatgaatatg gaggcggcca acctggcaga ggtccgcagt 1140
tattgctatt tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc ggccatggga 1200
gaagctcaca atgacaaacg tgctgaccca gcttttgtgt gcagacaagg agtggtggac 1260
aggggctggg gcaacggctg cggactattt ggcaaaggaa gcattgacac atgcgccaaa 1320
tttgcctgct ctaccaaggc aataggaaga accattttga aagagaatat caagtacgaa 1380
gtggccattt ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag 1440
gttggagcca ctcaggcagg gagattcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta 1500
aagcttggag aatatggaga ggtgacagtg gactgtgaac cacggtcagg gattgacacc 1560
aatgcatact acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc 1620
atggacctca acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg 1680
ttaatggagt ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa 1740
gagggagctc tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact 1800
gtcaagttga cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag 1860
ggaacaacct atggcgtctg ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca 1920
ggtcacggca ctgtggtgtt ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgcaaagtt 1980
cctatctcgt cagtggcttc attgaacgac ctaacgccag tgggcagatt ggtcactgtc 2040
aacccttttg tttcagtggc cacggccaac gctaaggtcc tgattgaatt ggaaccaccc 2100
tttggagact catacatagt ggtgggcaga ggagaacaac agatcaatca ccactggcac 2160
aagtctggaa gcagcattgg caaagccttt acaaccaccc tcaaaggagc gcagagacta 2220
gccgctctag gagacacagc ttgggacttt ggatcagttg gaggggtgtt cacctcagtt 2280
gggaaggctg tccatcaagt gttcggagga gcattccgct cactgttcgg aggcatgtcc 2340
tggataacgc aaggattgct gggggctctc ctgttgtgga tgggcatcaa tgctcgtgac 2400
aggtccatag ctctcacgtt tctcgcagtt ggaggagttc tgctcttcct ctccgtgaac 2460
gtgcacgctg acactgggat ccaccgtgga cctgccactc gcaccaccac agagagcgga 2520
aagttgataa cagattggtg ctgcaggagc tgcaccttac caccactgcg ctaccaaact 2580 gacagcggct gttggtatgg tatggagatc agaccacaga gacatgatga aaagaccctc 2640 gtgcagtcac aagtgaatgc ttataatgct gatatgattg acccttttca gttgggcctt 2700
<210> 69
<211> 2700
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 69
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagtt atacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 130
cctgaattct cccgatacaa ctcggactag ctgccgttcc ccggttatgc taaacacaac 240
cgagagaacc gcaagaagtc caagtgtcgt taacgaggct gggctcgtca cgacctagct 300
acctctccac acttgtttgt ttgtcgctac tttgtggaag actcaaagtt cttccttgat 360
ccctggaact ggtcacgata gttagccgcc tcgagttttg ttttcttttc tcctcctttc 420
tggccttaac gtcagtacta accggactag cggtcgcatc ctcgtcaatg ggagagattg 480
aaggttccct tccactacta ctgccattta cgatgactgc agtgtctaca gtagtgctaa 540
ggttgtcgac gacctttctt ggatacgtaa cagtctcgtt acctacaccc tatgtacacg 600
ctactatgat agtgaatact tacgggtcac gacagccgac cattactagg tcttctgtag 660
ctgacaacca cgtgtttcag tcgtcagatg cagtccatac cttctacgtg gttctgtgcg 720
gtgagttctg cgtcagcctc cagtgactgt cacgtctgtg tgcctctttc gtgagatcgc 730
ttgttcttcc cccgaaccta cctgtcgtgg ttccggtgtt ccataaacca tttttgtctt 840
agtacctaga actccttggg acctatacgg gaccaccgtc ggcagtaacc aacctacgaa 900
ccctcgttgt ggtacgtctc tcaacacaaa cagcacgata acgaaaacca ccggggtcga 960
atgtcgaaat tgacggaacc ttactcgttg tctctgaaga accttcctca cagacctcgt 1020
tgtacccacc taaaccaaga gcttccgctg tcgacgcact gatagtacag attcctgttc 1080
ggatggtagc tacacttcta ctacttatac ctccgccggt tggaccgtct ccaggcgtca 1140
ataacgataa accgatggca gtcgctagag aggtggtttc gacgcacggg ccggtaccct 1200
cttcgagtgt tactgtttgc acgactgggt cgaaaacaca cgtctgttcc tcaccacctg 1260
tccccgaccc cgttgccgac gcctgataaa ccgtttcctt cgtaactgtg tacgcggttt 1320
aaacggacga gatggttccg ttatccttct tggtaaaact ttctcttata gttcatgctt 1380
caccggtaaa aacaggtacc tggttgatga cacctcagcg tgcctttgat gaggtgtgtc 1440
caacctcggt gagtccgtcc ctctaagtcg tagtgaggac gccgcggaag tatgtgtgat 1500
ttcgaacctc ttataoctct ccactgtcac ctgacacctg gtgccagtcc ctaactgtgg 1560
ttacgtatga tgcactactg acaaccttgt ttctgcaaga accaggtagc actcaccaag 1620
tacctggagt tggagggaac ctcgtcacga ccttcatgac acacctcctt gtctctctgc 1680
aattacctca aactccttgg tgtgcggtgc ttcgtcagac actatcgtaa cccgagtgtt 1740
ctccctcgag acgtagttcg aaaccgacct cggtaaggac accttaaaag ttcgttgtga 1800
cagttcaact gcagcccagt aaacttcaca tctcacttct acctttttaa cgtcaacttc I860
ccttgttgga taccgcagac aagtttccga aagttcaaag aaccctgagg gcgtctgtgt 1920
ccagtgccgt gacaccacaa ccttaacgtc atgtgaccgt gcctacctgg aacgtttcaa 1980
ggatagagca gtcaccgaag taaottgctg gattgcggtc acccgtctaa ccagtgacag 2040
ttgggaaaac aaagtcaccg gtgocggttg cgattccagg actaacttaa ccttggtggg 2100
aaacctctga gtatgtatca ccacccgtct cctcttgttg tctagttagt ggtgaccgtg 2160
ttcagacctt cgtcgtaacc gtttcggaaa tgttggtggg agtttcctcg cgtctctgat 2220
cggcgagatc ctctgtgtcg aaccctgaaa cctagtcaac ctccccacaa gtggagtcaa 2280
cccttccgac aggtagttca caagcctcct cgtaaggcga gtgacaagcc tccgtacagg 2340
acctattgcg ttcctaacga cccccgagag gacaacacct acccgtagtt acgagcactg 2400
tccaggtatc gagagtgcaa agagcgtcaa cctcctcaag acgagaagga gaggcacttg 24 60
cacgtgcgac tgtgacccta ggtggcacct ggacggtgag cgtggtggtg tctctcgcct 2520
ttcaactatt gtctaaccac gacgtcctcg acgtggaatg gtggtgacgc gatggtttga 2580
ctgtcgccga caaccatacc atacctctag tctggtgtct ctgtactact tttctgggag 2640
cacgtcagtg ttcacttacg aatattacga ctatactaac tgggaaaagt caacccggaa 27 00
<210> 70 <211> 734 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 70
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Tyr Leu
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu He Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Ala Met Leu Ser Leu He Asp Gly Lys Gly Pro He Arg Phe Val Leu
35 40 45
Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gin Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys
565 570 575
Gly Glu Pro He He Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp
580 585 590
Glu Phe Asp Ala Ser He Ser Gin Val Asn Glu Lys He Asn Gin Ser
595 600 605
Leu Ala Phe He Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala
610 615 620
Gly Lys Ser Thr Thr Asn He Met He Thr Thr He He He Val He
625 630 635 640
He Val He Leu Leu Ser Leu He Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys
645 650 655
Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gin Leu Ser Gly
660 665 670
He Asn Asn He Ala Phe Ser Asn Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
675 680 685
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ala Arg Asp Arg Ser He Ala
690 695 700
Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu phe Leu Ser Val Asn
705 710 715 720
Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala He Asp He Ser Arg Gin 725 730
<210> 71
<211> 2298
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<22 3> Синтетическая Конструкция
<400> 71
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcta tttgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240
gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300
tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagtttcaa gaaggaacta 360
gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaago aaaagaagcg agggggcgag 420
ttgctaatcc tcaaagcaaa tgcaattacc acaatcctca ctgcagtcac attttgtttt 430
gcttctggtc aaaacatcac tgaagaattt tatcaatcaa catgcagtgc agttagcaaa 540
ggctatctta gtgctctgag aactggttgg tataccagtg ttataactat agaattaagt 600
aatatcaagg aaaataagtg caatggaaca gatgctaagg taaaattgat aaaacaagaa 660
ttagataaat ataaaaatgc tgtaacagaa ttgcagttgo tcatgcaaag cacaccacca 720
acaaacaatc gagccagaag agaactacca aggtttatga attatacact caacaatgcc 780
aaaaaaacca atgtaacatt aagcaagaaa aggaaaagaa gatttcttgg ttttttgtta 840
ggtgctggat ctgcaatcgc cagtggcgtt gctgtatcta aggtcctgca cctagaaggg 900
gaagtgaaca agatcaaaag tgctctacta tccacaaaca aggctgtagt cagcttatca 960
aatggagtta gtgtcttaac cagcaaagtg ttagacctca aaaactatat agataaacaa 1020
ttgttaccta ttgtgaacaa gcaaagctgc agcatatcaa atatagaaac tgtgatagag 1080
ttccaacaaa agaacaacag actactagag attaccaggg aatttagtgt taatgcaggt 1140
gtaactacac ctgtaagcac ttacatgtta actaatagtg aattattgtc attaatcaat 1200
gatatgccta taacaaatga tcagaaaaag ttaatgtcca acaatgttca aatagttaga 1260
cagcaaagtt actctatcat gtccataata aaagaggaag tcttagcata tgtagtacaa 1320
ttaccactat atggtgttat aqatacaccc tgttggaaac tacacacatc ccctctatgt 1380
acaaccaaca caaaagaagg gtccaacatc tgtttaacaa gaactgacag aggatggtac 1440
tgtgacaatg caggatcagt atctttcttc ccacaagctg aaacatgtaa agttcaatca 1500
aatcgagtat tttgtgacac aatgaacagt ttaacattac caagtgaaat aaatctctgc 1560
aatgttgaca tattcaaccc caaatatgat tgtaaaatta tgacttcaaa aacagatgta 1620
agcagctccg ttatcacatc tctaggagcc attgtgtcat gctatggcaa aactaaatgt 1680
acagcatcca ataaaaatcg tggaatcata aagacatttt ctaacgggtg cgattatgta 1740
tcaaataaag ggatggacac tgtgtctgta ggtaacacat tatattatgt aaataagcaa 1800
gaaggtaaaa gtctctatgt aaaaggtgaa ccaataataa atttctatga cccattagta I860
ttcccctctg atgaatttga tgcatcaata tctcaagtca acgagaagat taaccagagc L920
ctagcattta ttcgtaaatc cgatgaatta ttacataatg taaatgctgg taaatccacc 1980
acaaatatca tgataactac tataattata gtgattatag taatattgtt atcattaatt 2040
gctgttggac tgctcttata ctgtaaggcc agaagcacac cagtcacact aagcaaagat 2100
caactgagtg gtataaataa tattgcattt agtaacaatt ttgatctgct caaacttgca 2160
ggcgatgtag aatcaaatcc tggacccgcc cgggacaggt ccatagctct cacgtttctc 2220
gcagttggag gagttctgct cttcctctcc gtgaacgtgc acgctgacac tgggtgtgcc 2280 atagacatca gccggcaa 2298
<210> 72
<211> 2298
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 72
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagat aaacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattct cccgatacaa ctcggactag ctgccgttcc ccggttatgc taaacacaac 240
cgagagaacc gcaagaagtc caagtgtcgt taacgaggct gggctcgtca cgacctagct 300
acctctccac acttgtttgt ttgtcgctac tttgtggaag actcaaagtt cttccttgat 360
ccctggaact ggtcacgata gttagccgcc tcgagtttcg ttttcttcgc tcccccgctc 420
aacgattagg agtttcgttt acgttaatgg tgttaggagt gacgtcagtg taaaacaaaa 480
cgaagaccag ttttgtagtg acttcttaaa atagttagtt gtacgtcacg tcaatcgttt 540
ccgatagaat cacgagactc ttgaccaacc atatggtcac aatattgata tcttaattca 600
ttatagttcc ttttattcac attaccttgt ctacgattcc attttaacta ttttgttctt 660
aatctattta tatttttacg acattgtctt aacgtcaacg agtacgtttc gtgtggtggt 720
tgtttgttag ctcggtcttc tcttgatggt tccaaatact taatatgtga gttgttacgg 780
tttttttggt tacattgtaa ttcgttcttt tccttttctt ctaaagaacc aaaaaacaat 840
ccacaaccta gacgttagcg gtcaccgcaa cgacatagat tccaggacgt ggatcttccc 900
cttcacttgt tctagttttc acgagatgat aggtgtttgt tccgacatca gtcgaatagt 960
ttacctcaat cacagaattg gtcgtttcac aatctggagt ttttgatata tctatttgtt 1020
aacaatggat aacacttgtt cgtttcgacg tcgtatagtt tatatctttg acactatctc 1030
aaggttgttt tcttgttgtc tgatgatctc taatggtccc ttaaatcaca attacgtcca 1140
cattgatgtg gacattcgtg aatgtacaat tgattatcac ttaataacag taattagtta 1200
ctatacggat attgtttact agtctttttc aattacaggt tgttacaagt ttatcaatct 1260
gtcgtttcaa tgagatagta caggtattat tttctccttc agaatcgtat acatcatgtt 1320
aatggtgata taccacaata tctatgtggg acaacctttg atgtgtgtag gggagataca 1380
tgttggttgt gttttcttcc caggttgtag acaaattgtt cttgactgtc tcctaccatg 1440
acactgttac gtcctagtca tagaaagaag ggtgttcgac tttgtacatt tcaagttagt 1500
ttagctcata aaacactgtg ttacttgtca aattgtaatg gttcacttta tttagagacg
ttacaactgt ataagttggg gtttatacta acattttaat actgaagttt ttgtctaeat
tcgtcgaggc aatagtgtag agatcctcgg taacacagta cgataccgtt ttgatttaca
tgtcgtaggt tatttttagc accttagtat ttctgtaaaa gattgcccac gctaatacat
agtttatttc cctacctgtg acacagacat ccattgtgta atataataca tttattcgtt
cttccatttt cagagataca ttttccactt ggttattatt taaagatact gggtaatcat
aaggggagac tacttaaact acgtagttat agagttcagt tgctcttcta attggtctcg
gatcgtaaat aagcatttag gctacttaat aatgtattac atttacgacc atttaggtgg
tgtttatagt actattgatg atattaatat cactaatatc attataacaa tagtaattaa
cgacaacctg acgagaatat gacattccgg tcttcgtgtg gtcagtgtga ttcgtttcta
gttgactcac catatttatt ataacgtaaa tcattgttaa aactagacga gtttgaacgt
ccgctacatc ttagtttagg acctgggcgg gccctgtcca ggtatcgaga gtgcaaagag
cgtcaacctc ctcaagacga gaaggagagg cacttgcacg tgcgactgtg acccacacgg
tatctgtagt cggccgtt
<210> 73
<211> 667
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 73
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser 15 10
Arg Ala Val Asn Met 15
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu He Gly Leu Lys Gin
20 25 30
Lys Lys Arg Gly Gly Glu Leu Leu He Leu Lys Ala Asn Ala He Thr
35 40 45
Thr He Leu Thr Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gin Asn lie
50 55 60
Thr Glu Glu Phe Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val He Thr He Glu
85 90 95
Leu Ser Asn He Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val
610 615 620
Pro Gly Pro Ala Arg Asp Arg Ser lie Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val
625 630 635 640
Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly
64 5 650 655
Cys Ala lie Asp He Ser Arg Gin Glu Leu Arg
<210> 74 <211> 2097 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 74
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggacttaagc aaaagaagcg agggggcgag ttgctaatcc tcaaagcaaa tgcaattacc 240
acaatcctca ctgcagtcac attttgtttt gcttctggtc aaaacatcac tgaagaattt 300
tatcaatcaa catgcagtgc agttagcaaa ggctatctta gtgctctgag aactggttgg 360
tataccagtg ttataactat agaattaagt aatatcaagg aaaataagtg taatggaaca 420
gatgctaagg taaaattgat aaaacaagaa ttagataaat ataaaaatgc tgtaacagaa 480
ttgcagttgc tcatgcaaag cacaccacca acaaacaatc gagccagaag agaactacca 540
aggtttatga attatacact caacaatgcc aaaaaaacca atgtaacatt aagcaagaaa 600
aggaaaagaa gatttcttgg ttttttgtta ggtgttggat ctgcaatcgc cagtggcgtt 660
gctgtatcta aggtcctgca cctagaaggg gaagtgaaca agatcaaaag tgctctacta 720
tccacaaaca aggctgtagt cagcttatca aatggagtta gtgtcttaac cagcaaagtg 780
ttagacctca aaaactatat agataaacaa ttgttaccta ttgtgaacaa gcaaagctgc 840
agcatatcaa atatagaaac tgtgatagag ttccaacaaa agaacaacag actactagag 900
attaccaggg aatttagtgt taatgcaggt gtaactacac ctgtaagcac ttacatgtta 960
actaatagtg aattattgtc attaatcaat gatatgccta taacaaatga tcagaaaaag 1020
ttaatgtcca acaatgttca aatagttaga cagcaaagtt actctatcat gtccataata 1080
aaagaggaag tcttagcata tgtagtacaa ttaccactat atggtgttat agatacaccc 1140
tgttggaaac tacacacatc ccctctatgt acaaccaaca caaaagaagg gtccaacatc 1200
aggatggtac tgtgacaatg caggatcagt atctttcttc 1260
agttcaatca aatcgagtat tttgtgacac aatgaacagt 1320
aaatctctgc aatgttgaca tattcaaccc caaatatgat 1330
aacagatgta agcagctccg ttatcacatc tctaggagcc 1440
aactaaatgt acagcatcca ataaaaatcg tggaatcata 1500
cgattatgta tcaaataaag ggatggacac tgtgtctgta 1560
aaataagcaa gaaggtaaaa gtctctatgt aaaaggtgaa 1620
cccattagta ttcccctctg atgaatttga tgcatcaata 1680
taaccagagc ctagcattta ttcgtaaatc cgatgaatta 1740
taaatccacc acaaatatca tgataactac tataattata 1300
atcattaatt gctgttggac tgctcttata ctgtaaggcc 1360
aagcaaagat caactgagtg gtataaataa tattgcattt 1920
caaacttgca ggcgatgtag aatcaaatcc tggacccgcc 1980
cacgtttctc gcagttggag gagttctgct cttcctctcc 2040
tgggtgtgcc atagacatoa gccggcaaga gctgaga 2097
tcatcaagcg gacacactcg actgtttgaa tcatcacaaa cactcctaat tgttgttaat 60
tgtgtcacgc tcgacaaaga atcgtgcttc tagagctaca gattctttgg tcctcccggg 120
ccgttctcgg cccgacagtt atacgatttt gcgccttacg gggcgcacaa caggaactaa 180
cctgaattcg ttttcttcgc tcccccgctc aacgattagg agtttcgttt acgttaatgg 240
tgttaggagt gacgtcagtg taaaacaaaa cgaagaccag ttttgtagtg acttcttaaa 300
atagttagtt gtacgtcacg tcaatcgttt ccgatagaat cacgagactc ttgaccaacc 360
atatggtcac aatattgata tcttaattca ttatagttcc ttttattcac attaccttgt 420
ctacgattcc attttaacta ttttgttctt aatctattta tatttttacg acattgtctt 480
aacgtcaacg agtacgtttc gtgtggtggt tgtttgttag ctcggtcttc tcttgatggt 540
tccaaatact taatatgtga gttgttacgg tttttttggt tacattgtaa ttcgttcttt 600
tccttttctt ctaaagaacc aaaaaacaat ccacaaccta gacgttagcg gtcaccgcaa 660
cgacatagat tccaggacgt ggatcttccc cttcacttgt tctagttttc acgagatgat 720
aggtgtttgt tccgacatca gtcgaatagt ttacctcaat cacagaattg gtcgtttcac 780
aatctggagt ttttgatata tctatttgtt aacaatggat aacacttgtt cgtttcgacg 840
tcgtatagtt tatatctttg acactatctc aaggttgttt tcttgttgtc tgatgatctc 900
taatggtccc ttaaatcaca attacgtcca cattgatgtg gacattcgtg aatgtacaat 960
tgattatcac ttaataacag taattagtta ctatacggat attgtttact agtctttttc 1020
aattacaggt tgttacaagt ttatcaatct gtcgtttcaa tgagatagta caggtattat 1080
tttctccttc agaatcgtat acatcatgtt aatggtgata taccacaata tctatgtggg 1140
acaacctttg atgtgtgtag gggagataca tgttggttgt gttttcttcc caggttgtag 1200
acaaattgtt cttgactgtc tcctaccatg acactgttac gtcctagtca tagaaagaag 1260
ggtgttcgac tttgtacatt tcaagttagt ttagctcata aaacactgtg ttacttgtca 1320
aattgtaatg gttcacttta tttagagacg ttacaactgt ataagttggg gtttatacta 1380
acattttaat actgaagttt ttgtctacat tcgtcgaggc aatagtgtag agatcctcgg 1440
taacacagta cgataccgtt ttgatttaca tgtcgtaggt tatttttagc accttagtat 1500
ttotgtaaaa gattgcccac gctaatacat agtttatttc cctacctgtg acacagacat 1560
ccattgtgta atataataca tttattcgtt cttccatttt cagagataca ttttccactt 1620
ggttattatt taaagatact gggtaatcat aaggggagac tacttaaact acgtagttat 1680
agagttcagt tgctcttcta attggtctcg gatcgtaaat aagcatttag gctacttaat 1740
aatgtattac atttacgacc atttaggtgg tgtttatagt actattgatg atattaatat 1800
cactaatatc attataacaa tagtaattaa cgacaacctg acgagaatat gacattccgg 1860
tcttcgtgtg gtcagtgtga ttcgtttcta gttgactcac catatttatt ataacgtaaa 1920
tcattgttaa aactagacga gtttgaacgt ccgctacatc ttagtttagg acctgggcgg 1980
gccctgtcca ggtatcgaga gtgcaaagag cgtcaacctc ctcaagacga gaaggagagg 2040
cacttgcacg tgcgactgtg acccacacgg tatctgtagt cggccgttct cgactct 2097
<210> 76 <211> 1327 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 76
Met Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Ser Arg Ala Val Asn Met
Leu Lys Arg Gly Met Pro Arg Val Leu Ser Leu He Gly Leu Lys Gin
20 25 30
Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser
1295 1300 1305
Val Asn Val His Ala Asp Thr Gly Cys Ala He Asp He Ser Arg
Gin Glu Leu Arg 1325
<210> 77 <211> 4100 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая Конструкция
<400> 77
gatcctaata cgactcacta tagagtagtt cgcctgtgtg agctgacaaa cttagtagtg 60
tttgtgagga ttaacaacaa ttaacacagt gcgagctgtt tcttagcacg aagatctcga 120
tgtctaagaa accaggaggg cccggcaaga gccgggctgt caatatgcta aaacgcggaa 180
tgccccgcgt gttgtccttg attggactta agcaaaagaa gcgagggggc gagttgctaa 240
tcctcaaagc aaatgcaatt accacaatcc tcactgcagt cacattttgt tttgcttctg 300
gtcaaaacat cactgaagaa ttttatcaat caacatgcag tgcagttagc aaaggctatc 360
ttagtgctct gagaactggc tggtatacca gtgttataac tatagaatta agtaatatca 420
aggaaaataa gtgtaatgga acagatgcta aggtaaaatt gataaaacaa gaattagata 480
aatataaaaa tgctgtaaca gaattgcagt tgctcatgca aagcacacca ccaacaaaca 540
atcgagccag aagagaacta ccaaggttta tgaattatac actcaacaat gccaaaaaaa 600
ccaatgtaac attaagcaag aaaaggaaaa gaagatttct tggttttttg ttaggtgttg 660
gatctgcaat cgccagtggc gttgctgtat ctaaggtcct gcacctagaa ggggaagtga 720
acaagatcaa aagtgctcta ctatccacaa acaaggctgt agtcagctta tcaaatggag 780
ttagtgtctt aaccagcaaa gtgttagacc tcaaaaacta tatagataaa caattgttac 840
ctattgtgaa caagcaaagc tgcagcatat caaatataga aactgtgata gagttccaac 900
aaaagaacaa cagactacta gagattacca gggaatttag tgttaatgca ggtgtaacta Э60
cacctgtaag cacttacatg ttaactaata gtgaattatt gtcattaatc aatgatatgc 1020
ctataacaaa tgatcagaaa aagttaatgt ccaacaatgt tcaaatagtt agacagcaaa 1080
gttactctat catgtccata ataaaagagg aagtcttagc atatgtagta caattaccac 1140
tatatggtgt tatagataca ccctgttgga aactacacac atcccctcta tgtacaacca 1200
acacaaaaga agggtccaac atctgtttaa caagaactga cagaggatgg tactgtgaca 1260
atgcaggatc agtatctttc ttcccacaag ctgaaacatg taaagttcaa tcaaatcgag 1320
tattttgtga cacaatgaac agtttaacat taccaagtga aataaatctc tgcaatgttg 1380
acatattcaa ccccaaatat gattgtaaaa ttatgacttc aaaaacagat gtaagcagct 1440
ccgttatcac atctctagga gccattgtgt catgctatgg caaaactaaa tgtacagcat 1500
ccaataaaaa tcgtggaatc ataaagacat tttetaacgg gtgcgattat gtatcaaata 1560
aagggatgga cactgtgtct gtaggtaaca cattatatta tgtaaataag caagaaggta 1620
aaagtctcta tgtaaaaggt gaaccaataa taaatttcta tgacccatta gtattcccct 1680
ctgatgaatt tgatgcatca atatctcaag tcaacgagaa gattaaccag agcctagcat 1740
ttattcgtaa atccgatgaa ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc accacaaata 1800
tcatgataac tactataatt atagtgatta tagtaatatt gttatcatta attgctgttg I860
gactgctctt atactgtaag gccagaagca caccagtcac actaagcaaa gatcaactga 1920
gtggtataaa taatattgca tttagtaaca attttgatct gctcaaactt gcaggcgatg 1980
tagaatcaaa tcctggaccc ggaggaaaga ccggtattgc agtcatgatt ggcctgatcg 2040
cctgcgtagg agcagttacc ctctctaact tccaagggaa ggtgatgatg acggtaaatg 2100
ctactgacgt cacagatgtc atcacgattc caacagctgc tggaaagaac ctatgcattg 2160
tcagagcaat ggatgtggga tacatgtgcg atgatactat cacttatgaa tgcccagtgc 2220
tgtcggctgg taatgatcca gaagacatcg actgttggtg cacaaagtca gcagtctacg 2280
tcaggtatgg aagatgcacc aagacacgcc actcaagacg cagtcggagg tcactgacag 2340
tgcagacaca cggagaaagc actctagcga acaagaaggg ggcttggatg gacagcacca 2400
aggccacaag gtatttggta aaaacagaat catggatctt gaggaaccct ggatatgccc 2460
tggtggcagc cgtcattggt tggatgcttg ggagcaacac catgcagaga gttgtgtttg 2520
tcgtgctatt gcttttggtg gccccagctt acagctttaa ctgccttgga atgagcaaca 2580
gagacttctt ggaaggagcg tctggagcaa catgggtgga tttggttctc gaaggcgaca 2640
gctgcgtgac tatcatgtct aaggacaagc ctaccatcga tgtgaagatg atgaatatgg 2700
aggcggccaa cctggcagag gtccgcagtt attgctattt ggctaccgtc agcgatctct 2760
ccaccaaagc tgcgtgcccg gccatgggag aagctcacaa tgacaaacgt gctgacccag 2820
cttttgtgtg cagacaagga gtggtggaca ggggctgggg caacggctgc ggactatttg 2880
gcaaaggaag cattgacaca tgcgccaaat ttgcctgctc taccaaggca ataggaagaa 2940
ccattttgaa agagaatatc aagtacgaag tggccatttt tgtccatgga ccaactactg 3000
tggagtcgca cggaaactac tccacacagg ttggagccac tcaggcaggg agattcagca 3060
tcactcctgc ggcgccttca tacacactaa agcttggaga atatggagag gtgacagtgg 3120
actgtgaacc acggtcaggg attgacacca atgcatacta cgtgatgact gttggaacaa 3180
agacgttctt ggtccatcgt gaagtactgt gtggaggaac agcagtctgt gatagcattg ccattcctgt ggaattttca gagtgaagat ggaaaaattg tcaagtttct tgggactccc acactggcac ggatggacct taacgccagt gggcagattg ctaaggtcct gattgaattg gagaacaaca gatcaatcac caaccaccct caaaggagcg gatcagttgg aggggtgttc cattccgctc actgttcgga tgttgtggat gggcatcaat gaggagttct gctcttcotc tcagccggoa agagctgaga
<210> 78
<211> 4100
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая Конструкция <400> 78
ctaggattat gctgagtgat atctcatcaa gcggacacac tcgactgttt gaatcatcac 60
aaacactcct aattgttgtt aattgtgtca cgctcgacaa agaatcgtgc ttctagagct 120
acagattctt tggtcctccc gggccgttct cggcccgaca gttatacgat tttgcgcctt 180
acggggcgca caacaggaac taacctgaat tcgttttctt cgctcccccg ctcaacgatt 240
aggagtttcg Cttacgttaa tggtgttagg agtgacgtca gtgtaaaaca aaacgaagac 300
cagttttgta gtgacttctt aaaatagtta gttgtacgtc acgtcaatcg tttccgatag 360
aatcacgaga ctcttgacca accatatggt cacaatattg atatcttaat tcattatagt 420
tccttttatt cacattacct tgtctacgat tccattttaa ctattttgtt cttaatctat 480
ttatattttt acgacattgt cttaacgtca acgagtacgt ttcgtgtggt ggttgtttgt 540
tagctcggtc ttctcttgat ggttccaaat acttaatatg tgagttgtta cggttttttt 600
ggttacattg taattcgttc ttttcctttt cttctaaaga accaaaaaac aatccacaac 660
ctagacgtta gcggtcaccg caacgacata gattccagga cgtggatctt ccccttcact 720
tgttctagtt ttcacgagat gataggtgtt tgttccgaca tcagtcgaat agtttacctc 780
aatcacagaa ttggtcgttt cacaatctgg agtttttgat atatctattt gttaacaatg 840
gataacactt gttcgtttcg acgtcgtata gtttatatct ttgacactat ctcaaggttg 900
ttttcttgtt gtctgatgat ctctaatggt cccttaaatc acaattacgt ccacattgat 960
gtggacattc gtgaatgtac aattgattat cacttaataa cagtaattag ttactatacg 1020
gatattgttt actagtcttt ttcaattaca ggttgttaca agtttatcaa tctgtcgttt 1080
caatgagata gtacaggtat tattttctcc ttcagaatcg tatacatcat gttaatggtg 1140
atataccaca atatctatgt gggacaacct ttgatgtgtg taggggagat acatgttggt 1200
tgtgttttct tcccaggttg tagacaaatt gttcttgact gtctcctacc atgacactgt 1260
tacgtcctag tcatagaaag aagggtgttc gactttgtac atttcaagtt agtttagctc 1320
ataaaacact gtgttacttg tcaaattgta atggttcact ttatttagag acgttacaac 1380
tgtataagtt ggggtttata ctaacatttt aatactgaag tttttgtcta cattcgtcga 1440
ggcaatagtg tagagatcct cggtaacaca gtacgatacc gttttgattt acatgtcgta 1500
ggttattttt agcaccttag tatttctgta aaagattgcc cacgctaata catagtttat 1560
ttccctacct gtgacacaga catccattgt gtaatataat acatttattc gttcttccat 1620
tttcagagat acattttcca cttggttatt atttaaagat actgggtaat cataagggga 1680
gactacttaa actacgtagt tatagagttc agttgctctt ctaattggtc tcggatcgta 1740
aataagcatt taggctactt aataatgtat tacatttacg accatttagg tggtgtttat 1800
agtactattg atgatattaa tatcactaat atcattataa caatagtaat taacgacaac 1860
ctgacgagaa tatgacattc cggtcttcgc gtggtcagtg tgattcgttt ctagttgact 1920
caccatattt attataacgt aaatcattgt taaaactaga cgagtttgaa cgtccgctac 1980
atcttagttt aggacctggg cctcctttct ggccataacg tcagtactaa ccggactagc 2040
ggacgcatcc tcgtcaatgg gagagattga aggttocctt ccactactac tgccatttac 2100
gatgactgca gtgtctacag tagtgctaag gttgtcgacg acctttcttg gatacgtaac 2160
agtctcgtta cctacaccct atgtacacgc tactatgata gtgaatactt acgggtcacg 2220
acagccgacc attactaggt cttctgtagc tgacaaccac gtgtttcagt cgtcagatgc 2280
agtccatacc ttctacgtgg ttctgtgcgg tgagttctgc gtcagcctco agtgaetgtc 2340
acgtctgtgt gcctctttcg tgagatcgct tgttcttccc ccgaacctac ctgtcgtggt 2400
tccggtgttc cataaaccat ttttgtctta gtaoctagaa ctccttggga cctatacggg 24 60
accaccgtcg gcagtaacca acctacgaac cctcgttgtg gtacgtctct caacaoaaao 2520
agcacgataa cgaaaaccac cggggtcgaa tgtcgaaatt gacggaacct tactcgttgt 2580
etctgaagaa ccttcctcac agacctcgtt gtacccacct aaaccaagag cttccgctgt 2640
cgacgcactg atagtacaga ttcctgttcg gatggtagct acacttctac tacttatacc 2700
tccgccggtt ggaccgtctc caggcgtcaa taacgataaa ccgatggcag tcgctagaga 2760
ggtggtttcg acgcacgggc cggtaccctc ttcgagtgtt actgtttgca cgactgggtc 2820
gaaaacacac gtctgttcct caccacctgt ccccgacccc gttgccgacg octgataaac 2880
cgtttccttc gtaactgtgt acgcggttta aacggacgag atggttccgt tatccttctt 2940
ggtaaaactt tctcttatag ttcatgcttc accggtaaaa acaggtacct ggttgatgac 3000
aoctoagcgt gcctttgatg aggtgtgtcc aacctcggtg agtccgtccc tctaagtcgt 3060
agtgaggacg ccgcggaagt atgtgtgatt tcgaacctct tatacctctc cactgtcacc 3120
tgacacttgg tgccagtccc taactgtggt tacgtatgat gcactactga caaccttgtt 3180
tctgcaagaa ccaggtagca ctcaccaagt acctggagtt ggagggaacc tcgtcacgac 3240
cttcatgaca cacctccttg tctctctgca attacctcaa actccttggt gtgcggtgct 3300
tcgtcagaca ctatcgtaac ccgagtgttc tccctcgaga cgtagttcga aaccgacctc 3360
ggtaaggaca ccttaaaagt tcgttgtgac agttcaactg cagcccagta aacttcacat 3420
ctcacttcta cctttttaac gtcaacttcc cttgttggat accgcagaca agtttccgaa 3480
agttcaaaga accctgaggg cgtctgtgtc cagtgccgtg acaccacaac cttaacgtca 3540
tgtgaccgtg cctacctgga acgtttcaag gatagagcag tcaccgaagt aacttgctgg 3600
attgcggtca cccgtctaac cagtgacagt tgggaaaaca aagtcaccgg tgccggttgc 3660
gattccagga ctaacttaac cttggtggga aacotctgag tatgtatcac cacccgtctc 3720
ctcttgttgt ctagttagtg gtgaccgtgt tcagaccttc gtcgtaaccg tttcggaaat 3780
gttggtggga gtttcctcgc gtctctgate ggcgagatcc tctgtgtcga accctgaaac 3840
ctagtcaacc tccccacaag tggagtcaac ccttccgaca ggtagttcac aagcctcctc 3900
gtaaggcgag tgacaagcct ccgtacagga cctattgcgt tcctaacgac ccccgagagg 3960
acaacaccta cccgtagtta cgagcactgt ccaggtatcg agagtgcaaa gagcgtcaac 4020
ctcctcaaga cgagaaggag aggcacttgc acgtgcgact gtgacccaca cggtatctgt 4 080
agtcggccgt tctcgactct 4100
Приложение 2
CV-TBEV Нург с YFVfTBEV химерным сигналом (р42) (SEQ ID NOS: 40-42)
V AGTAAAJCCT GTGTGCTMT TGAGGTGCAT TGGTCTGCAA ATCGAGTTGC TAGGCAATAA ACACATTTGG АТТААТТТТА ATCGTTCGTT GAGCGATTAG TCATTTAGGA CACACGATTA ДСГССАСдТА АССАСАСЭТТ TAGCTCAACG ATCCGTTATT TGTGTAAACC TAATTAAAAT TAGCAAGCAA CTCGCTAATC 5" OTR
С protein
H S G R KAQG HTL G V N M V Я R Q V R SLS W К I К 101 CAGAGAACTG ACCAQAACAT GTCTGGTCGT AAAGCTCAGG GAAAAACCCT GGGOGTCAAT ATGGTACGAC GAGGAGTTOG CTCCTTGTCA AACAAAATAA GTCTCTTGAC TGGTCTTGTA CAGACCAGCA TTTCGAGTCC CTTTTTGGGA CCOGCAGTTA TACCATGCTG CTCCTCAAGC GACGAACAGT TTGTTTTATT
С protein
¦ QKT KQ1 G N R P GPS RGV Q G F I FFF LFN I L T G К К I Z01 ААСААААААС AAAACAAATT GGAAACAGAC CTGGACCTTC AAGAGGTGTT CAABGATTTA TCTTTTTCTT TTTGTTCAAC ATTTTGACTG GAAAAAAGAT TTGTplTTTG TTTTGTTTAA CCTTTGTCTG GACCTGGAAG TTCTCCACAA GTTCCTAAAT AGAAAAAGAA AAACAAQTTG TAAAACTGAC CTTTTTTCTA
С protein
- T A H LKRL WKM LDP RQGL AVL RKV KRVV ASL HRG 201 CACAGCOCAC CTAAAOAGGT TGTGGAAAAT GCTGOACCCA AGACAAGGCT TGGCTGTTCT AAGOAAAGTC AAGAfiAGTGG TGQCCAGTTT GATGAGAGGA GTGTCGGGTG GATTTCTCCA ACACCTTTTA CGACCTGQGT TCTGTTCCGA ACCGACAAGA TTCCTTTCAG TTCTCTCACC ACCGGTCAAA CTACTCTCCT YF17D partial signal
TBEV partial signal
С protein prM protein
LSSR 1СЙК 3HD VLTV Q F L Г -L G M L G M T I A A T V R К Б R
401 TTGTCCTCAA GGAAACGCCG TTCCCATGAT GTTCTGACTO TGCAATTCCT AATTTTGGaC ATGCTGGGCA TGACAATOGC AGCTACGGTT CGCAAGGAAA
AftCAGGAGTT CCTTTGCGGC AAGGGTACTA CAAGACTGAC ACGTTAAGGA TTAAAACCCG TACGACCCGT ACTOTTAGCG TCGATGCCAA GCGTTCCTTT
prM protein
• DGS ТУГ HASG К D A ATQ VHVE MGT С V I LATE HGS 501 GAGACGGCAG TACGGTCATA CGCGCGGAAO GTAAGGATGC CGCTACCCAA GTGAGAG7GG AAAATGGTAC CTGOGTCATT CTGGCCACCG ACATGGGCTC CTCTGCCGTC ATGCCAGTAT GCGCGCCTTC CATTCCTACG GCGATGGGTT CACTCTCACC TTTTACCATG GACGCAGTAA GACCGGTGGC TGTACCCGAG
prt* pro t* In
'WCS DSLS VEC VTI DQGE EPV DVD С F С R N V D G V Y fiOl TTGGTGTOAT GATAGCCTTT CTTATGfiGTG CGTAACCATA GATCAAGGTG AGGAACCTGT TGACGTTGAT TGCTTCTQCC GAAACGTGGA TGGGGTGTAT AACCACACTA CTATCGGAAA GAATACTCAC GCATTGGTAT CTAGTTCCAC TCCTTGGACA ACTGCAACTA ACGAAGACGG CTTFJCACCT ACCCCACATA
ргн protein
LEYS R С G К Q. В GSRT RRS V L I P S H A Q G Б LTG RGHK ¦701 CTCGAATATG GACGGTGTGG TAAACAAGAA GGAAGCAGAA CCAGACGCTC AGTGCTTATA CCCTCCCACG CTCAAGGAGA GCTGACCGGA CGGGGACATA
GAGCTTATAC CTGCCACACC ATTTGTTCTT CCTTCGTCTT GGTCTGCGAG TCACGAATAT GGGAGGGTGC GAGTTCCTCT CGACTGGCCT GCCCCTGTAT
prM protein
- W L E CDS LRTH LTR VEG WVWK Ы" R L LAL AMVT V V W 301 AATGGTTGGA GGGCGACTCA CTCCGAACAC ATTTGACCCG CGTCGAGGGC TGGGTCTGGA AAAATCGGCT GTTGGCCCTC GCTATGGTGA CAGTCGTTTtJ
TTACCAACCT CCCGCTGAGT GAGGCTTGTG TAAACTGGGC GCAGCTCCCG ACCCAGACCT TTTTAGC.CGA CAACCGGGAG CGATACCACT GTCAGCAAAC
Hypr E protein
prM protein
¦LTL E S V V TRV AVL VVLL CLA P V. Y ASRC THL EMH 901 GCTCACGCTG GAGTCTGTGG TTACTGGCGT GGCAGTGCTG GTGGTGCTCC TCTGTCTTGC CCCTGTCTAC GCGTCCAGGT GTACTCATTT GGAAAACAGA CGAGTGCGAC CTCAGACACC AATGAGCGCA CCGTCACGAC CACCACGAGG AGACAGAACG GGGACAGATG CGCAGGTCCA CktGAGTAAA CCTTTTGTCT
НурГ E protein
DFVT GTQ GTT RVTL VLE LGG CVTI TAB GKP SMDV 1001 GATTTTGTCA CCGGCACCCA GGGGACGACT CGGGTAACCC TGGTGCTTGA ACTGGGTGGT TGCGTTACTA TTACCGCTGA GGGCAAACCC TCTATGGATG CTAAAACAGT GOCCGTGGGT CCCCTGCTGA GCCCATTGGG ACCACGAACT TGACCCACCA ACGCAATGAT AATGGCGACT CCCGTTTGGG AGATACCTAC
Hypr E protein
-WLt> A I Y QEWP AQT REY С L H A KLS DTK VAAR CPT 1101 TGTGGCTGGA TGCAATCTAT CAGGAGAATC CCGCACAAAC CAGfSGAATAT TGCCTTCACG CAAAGCTGTC CGATAXZAAAG GTCGCGGCTA GGTGCCCAAC ACACCGACCT ACGTTAGATA GTCCTCTTAS GGCGTGfTTdt GTCCCTTATA ACGGAAGTGC GTTTCGACAG GCTATGTTTC CAGCGCCGAT CCACGGGTTG
Hypr E protein
-MGP ATtiA ВЕК QGG TVCK RDQ SDR GWGH HCG LFG 1201 AATGGGACCG GCCACCCTGG CGGAGGAACA TCAGGGAGGT ACAGTGTGCA AACGGGACCA GAGTGATAGA GGCTGGGGTA ATCACTGCGG CCTGTTCGGC TTACCCTGGC CGGTGGGACC GCCTCCTTGT AGTCCCTCCA TGTCACACGT TTGCCCTGGT CTCACTATCT CCGACCCCAT TAGTGACGCC GGACAAGCCG
Hypr E protein
KGSI VAC VKA А С Б А К К К ATG Н V Y D АЫК IVY TVKV 1301 AAAGGAAGTA TTGTCGCTTG CGTCAAGGCA GCCTGTGAGG CCAAAAAGAA GGCTACTGGG CACGTCtATG ACGCCAACAA GATCGTTTAT ACAGTGAAAG TTTCCTTCAT AACAGCGAAC GCAGTTCCGT CGGACACTCC GGrTTTTTCTT CCGATGACCC GTGCAGATAC TGCGGTTGTT CTAGCAAATA TGTCACTTTC
Hypr E protein
- EPH TGD Y V A A NET HSG RKTA SpT VSS EKTI L T M 1401 TGGAACCACA CACAGGGGAT TACGTGGCGQ CGAACGAGAC TCATTCCGGT CX3CAAAACGG CCAGCTTCAC CGTGTCATCC GAAAAGACCA TCCTCACTAT ACCTTGGTGT GTGTCCCCTA ATGCACCGCC GGTTGCTCTG AGTMGGCCA GCGTTTTGCC GGTCGAAGTG GCACAGTAGG СГГТТСТССТ AGGAGTGATA
Hypr E protein
-GEY GOVS Ь L С HVA SGVD LAO TV1 LELD KTV EHL 1501 GGGGGAGTAT GGCGACGTTT CTCTGCTCTO CCGGGTGGCT AGCGGAGTCG ACCTGGCCCA GACAGTCATC CTGGftACTGG ATAAAACAGT TGAGCATCTG CCCCCTCATA CCGCTGCAAA GASACGAGAC GGCCCACCGA TCGCCTCAGC TGGACCGGGT CTGTCAGTAG GACCTTGACC TATTTTGTCA ACTCGTAGAC
Hypr E protein
PTAH Q V Я RDW FHDL ALP WKH E G A &. UW" ПАЕ RLVE 1601 CCTACCGCTT GGCAGGTGCA CAGGGATTGG ITTfAACGACC TTGCCCTGCC ATGGAAACAT GAAGGAGCGA GAAACTGGAA TAATGCAGAG CGACTCGTAG
GGATGGCGAA CCGTCCACGT GTCCCTAACC AAATTGCTGG AACGGGACGG TACCTTTGTA CTTCCTCGCT CTTTGACCTT ATTACGTCTC GCTGAGCATC
Hypr E protein
- F G. А РИА VKHD V Y Ы LGD OTGV LLK ALA GVPV AKl 1701 AATTCGGTGC CCCTCATGCC GTGAAGATGG ACGTCTACAA TCTGOGTGAT CAGACCGGCG TTCTCCTTAA AGCTCTCGCT GGCGTACCAG TTGCCCACAT
TTAAGCCACG GGGAGTACGG CACTTCTACC TGCAGATGTT AGACCCACTA GTCTGGCCGC AAGAGGAATT TCGAGAGCGA CCGCATGGTC AACGGGTGTA
Hypr E proteia
¦ E G T К Y E L К S G KVT CEVG LEK LKH KGLT If T M С ? К 1801 CGAAGGAACG AAGTACCACC TGAAGTCAGG CCATGTAACT TGCGAGGTGG GCCTGGAGAA GTTGAAAATG AAAGGTCTTA CGTACACAAT GTGTGACAAG GCTTCCneC TTCiTG5"Sa ACtTCAGTCC OGTACATTGA ACGCTCCACC CGGACCTCTT CAACTTTTAC TTTCCAGAAT GCATGTGTTA CACACTGTTC
Hypr E protein
TKPT W К ft APT 0 S G Я DTV V M E V T F S OTK P С R IPVR 1901 ACCAAGTTCA CATGGAAGAG GGCCCCCACA GATACCQGCC ACGATACTGT GGTGATOGAG GTGACCTTTT CTGGAACAAA ACCCTGCAGA ATACCCGTGC TGGTTCAAGT GTftCCTTCTC CCGGGGGTGT CTATCGCCGG TGCTATGACA CCACTACCTC CACTGGAAAA GACCTTGTTT TGGGACGTCT TATGGGCACG
Hypr E protein
• A V A HGS PDVS V A M LIT P N P T TEN BGG G F I E HDL 2001 GGGCTGTAGC TCACGGATCT CCCGATGTCA ATGTTGCTAT GCTGATTACA CCTAACCCTA. CCATCGAGAA TAACGGTGGT GGTTTTATTG AGATGCAGCT CCCGAGATCG AGTGCCTAGA GGGCTACAGT TACAACGATA CGACTAATST GGATTGGGAT GGTAGCTCTT ATTGCCACCA ССАДААТААС TCTACGTCGA
Hypr E protein
¦PPG D M I I Y V G ELS Y Q N F Q К G SSI G R V F Q К T KKG
2101 TCCGCCAGGC GATAACATCA TCTACGTGGG CGAACTCTCT TACCAGTGGT TTCAGAAAGG GAGTTCAATT GGGCGGGTCT TCCAAAAAAC GAAQAAOGGA
AfiQCGGTCCG CTATTGTAGT MATGCACCC GCTTGAGAGA ATGGTCACCA AAGTC5TTCC CTCAAGTTAA CCCOCCCASA ABGTTTTTTG CTTCTTCCCT
Hypr E protein
IEEL TVI GEH A W D F GSA GGF T.SST G К A LHT V L G G 2201 ATCOAACGAT TaACGGTTAT CGGCGAOCAC GCATGGGATT TTGSTTCCGC AGGGGGATTC CTGTCTTCTA TTGGTAAGGC ACTGCATACC GTGCTGGGGG TAGCTTGCTA ACTCCCAATA GCCGCTCGTG CGTACCCTAA AACCAAGGCG TCCCCCTAAG GACAGAAGAT AACCATTCCG TGACGTATGG CACGACCCCC
Hypr В protein
¦ APK SIF GGVG Ftp К L L LGVA LA W LGL N M R N PTM
2301 GCGCATTCAA ТГСТАТТТТС QQGGGCGTGG 0GTTCCTCCC TAAACTCCTG CTGGGAGTAG CCCTGGCCTG GTTGGGACTG AATATGCGGA ATCCGACGAT
CGCGTAAGTT AAGAIAAAAG CCCCCGCACC CCAASGACGQ ATTTGAGGAC GACCCTCATC GGGACCGGAC CAACCCTGAC TTATACGCCT TAGGCTGCTA
Hypr E protein
BS1 gene ot YF17E
-SMS FLLA GVL V L A MTLG VGA DQG С A I Ы FGK R E L 2401 GTCCATGTCA TTCCTCTTGG CCGGCGTGCT TGTACTGGCC ATGACACTGG GDGTTGGCGC CGATCAAGGA TGCGCCATCA ACTTTGGCAA GAGAGAGCTC CAGGTACAGT AAGGAGAACC GGCCGCACGA ACATGACCGG TACTGTGACC CGCAACCGCG GCTAGTTCCT ACGCGGtAGT TGAAACCGTT CTCTCTCGAG
CV-7BEV Hypr с YFV/WNV химерный сигналом (p45) (SEQ ID NOS: 43-45)
S 1 DTR
1 AGTAAATCCT GTQTGCTAAT TGAGGTGCAT TGSTCTGCAA ATCGAGTTGC TAGGCAATAA ACACATTTGG АТТААТТТТА ATCGTTCGTT GAGCGATTAG TCATTTAGGA CACACGATTA ACTOCACGTA ACCAGACGTT TAGCTCAACG ATCCGTTATT TGTGTAAACC TAATTAAAAT TAGCAAGCAA CTCGCTAATC 5' OTR
С protein YFJ7D
M SGR KAQG KTL G V Ы M V R К G V R S L S NK1K 101 CAGAGAACTG ACCAGAACAT GTCTGGTCGT AAAGCTCAGG GAAAAACCCT GGGCGTCAAT ATGGTACGAC GAGGAGTTCG СТССГТОТСА AACAAAATAA GTCTCTTGAC TGGTCrrGTA CAGACCAGCA TTTCGAGTCC CTTTTTGGGA CCCGCAGTTA TACCATGCTG CTCCTCAAGC GAGGAACAGT ТТвТТТТАТТ
С protein YF17D
¦ QKT К Q I GURP e "S RGV QGFt F F F LFM ILTG К К I 201 ААСААААААС AAAACAAATT OQAAACAGAC CTGGACCTTC AAOAGGTGTT CAAGGATTTA ГСТТТТТСТТ TTTGTTCAAC ATTTTGACTG GAAAAAAGAT TTGTTTTTTG TTTTGTTTAA CCTTTGTCTG GACCTGGAAG TTCTCCACAA GTTCCTAAAT AGAAAAAGAA AAACAAGTTG TAAAACTGAC CTTTTTTCTA
С protein YP17D
¦ T A H LKRL MKM LDP RQGL AVL R К V KRVV ASL MRG
301 CACAGCCCAC CTAAAGAGGT TGTGGAAAAT GCTGGACCCA AGACAAGGCT TGGCTGTTCT AAGGAAAGTC AAGAGAGTGG TOGCCAOTTT GATOASAGGA
GTGTCGGGTG GATTTCTCCA ACACCTTTTA CGACCTGGGT TCTGTTCCGA ACCGACAAGA TTCCTTTCAG TTCTCTCACC ACCGGTCAAA CTACTCTCCT
С protein YP17D WHV partial signal
YF 17D partial signal Hypr prM protein
LSSR KRR SHD VLTV QFL ILG MLAC VGA A T V RKER 401 TTGTCCTCAA GGAAACGCCG TTCCCATGAT G3TCTGACTG TGCAATTCCT AATTTTGGGC ATGCTGGCTT GTGTCGGAGC AGCTACCGTG CGAAAAGAAC AACAGOAeTT CCTTTGCGGC AAGGCTACTA CAAGACTGAC ACGTTAAGGA TTAAAACCCG TACGACCGAA CACAGCCTCG TCGATGSCAC GCTTTTCTTC
Hypr ргн protein
¦ DGS TVI RAEG KDA A T Q VRVE HGT CVI LATD MGS 501 GCGACGGAAG CACCGTGATA AGGGCTGAGG GTAAGGATGC GGCTACGCAG GTGAGAGTAG AGAATGGCAC TTGCGTAATA CTCSCGACTG ATATGGGATC CGCTGCCTTC GTGGCACTAT TCCCGACTCC CATTCCTACG CCGATGCGTC CACTCTCATC TCTTACCGTG AACGCATTAT GAGCGCTGAC TATACCCTAG
Hypr prM protein
¦ И С D DSLS Y E С VTI DOGE EPV DVD CFCR N V D GVY 601 CTGGTGTGAC GATAGCCTCA GTTATGAATG CGTAACAATA GACCAGGGCG AAGAACCTGT GGACGTTGAC TGTTTCTGTA GAAATGTGGA TGGCGTTTAT GACCACACTG CTATCGCAGT CAATACTtAC GCATTGTTAT CTGGTCCCGC TTCTTGGACA CCTGCAACTG ACAAAGACAT CTTTACACCt ACCGCAAATA
Hypr prM protein
LEYG R С G KQE GSRT RRS VLI PEHA QGE LTG RGHK 701 CTGGAGTACG GCCGCTGTGG AAAACAGGAG GGCTCACGAA CTCGAAGATC TGTGCTGATT CCAAGTCACG CGCAAGGAGA OTTGACCGGT AGAGGCCACA GACCTCATGC CGGCGACACC TTTTGTCCTC CCGAGTGCTT GAGCTTCTAG ACACGACTAA GGTTCAGTGC GCGTTCCTCT CAACTGGCCA TCTCCGGTGT
Hypr prM protein
- WLE GDS LRTH LTR VEG WVWK HRL LAL A H V T VVW 801 AGTGGCTTGA AGGGGACTCA TTGAGGACCC. ACCTGACTAG GGTGGAGGGT TGGGTTTGGA AGAATCGGTT GCTCGCGCTC GCTATGGTCA CCGTCGTGTG TCACCGAACT TCCCCTGAGT AACTCCTGGG TGGACTGATC CCACCTCCCA ACCCAAACCT TCTTAGCCAA CGAGCGCGAG CGATACCAGT GGCAGCACAC Hypr prM protein
Hypr E protein
'LTL S S V 4 TRV AVL VVLL CLA PVY A SRC THL EUR 901 GCTGAOiCTG GAGAGTCTCG TGACTCGGGT TGCTGTGTTG GTTGTCCTCC TCTGTTTGGC ССХУМЗТСТАС GCGTCCAGGT GTACTCATTT GGAAAACAGA CGACTGTGAC CTCTCACAGC ACTGAGCCCA ACGACACAAC CAACAGGAGG AGACAAACCe GGGTCACATG CGCAGGTCCA CATGAGTAAA CCTTTTGTCT
Hypr E protein
DFVT GTQ GTT RVTL VLE LGG CVT1 TAE GKP SMDV
1001 GATTTTGTCA CCGOCACCCA GGGGACGACT CGGGTAACCC TGGTGCTTGA ACTGGGTGGT TGCGTTACTA TTACCGCTGA GGGCAAACCC TCTATGGATG
CTAAAACAGT (3GCCGTGGGT CCCCTGCTGA GCCCATTGGG ACCACGAACT TGACCCACCA ACGCAATGAT AATGGCGACT CCCGTTTGGG AGATACCTAC
Hypr E protein
¦ WLD A I Y QEHP AQT KEY CLHA KtiS DTK V A A R CPT 1101 TGTGGCTGGA TGCAATCTAT. CAGGAGAATC COGCACAAAC CAGGGAATAT TGCCTTCACS CAAAGCTGTC CGATACAAAG GTCGCGGCTA GGTGCCCAAC ACACCGACCT ACGTTAGATA GTCCTCTTAG GGCGTGTTTG GTCCCTTATA ACGGAAGTGC GTTTCGACAG GCTATGTTTC CAGCGCCGAT CCACGGGTTG
Hypr E protein
- M G P А Т L A ЕЕН QGG Т V С К RDQ SDR GWGH HCG LPS 1201 AATGGGACCG GCCACCCTGG CGGAGGAACA TCAGGGAGGT ACAGTGTGCA AACCGGACCA GAGTGATAGA GGCTGGGGTA ATCACTGCGG CCTGTTCGGC TTACCCTGGC CGGTGGGACC GCCTCCTTGT AGTCCCTCCA TGTCACACGT TTGCCCTGGT CTCACTATCT CCGACCCCAT TAGTGACGCC GGACAAGCCG
Hypr E protein
KGSI VAC V К А А С E А К К К ATG KVYD АЫК IVY T V К V 1301 AfiAGGAAGTA TTGTCGCTTG CGTCAAGGCA GCCTGTGAGG CCAAAAAGAA GGCTACTGGG CACGTCTATG ACGCCAACAA GATCGTTTAT ACAGTCAAAG ТТТССТГСАТ AACAGCGAAC GCAGTTCCGT CGGACACTCC GGTTTTTCTT CCGATGACCC GTGCAGATAC TGCGGTTGTT CTAGCAAATA TGTCACTTTC
Hypr E protein
• EPH TGD Y V А А НЕТ HS <3 RKTA S F T VSS E К T I LTH 1401 TGGAACCACA CACAGGGGAT TACGTGGCGG CCAACGAGAC TCATTCCGGT CGCAAAACGG CCAGCTTCAC CGTGTCATCC GAAAAGACCA TCCTCACTAT ACCTTGGTGT GTGTCCCCTA ATGCACCGCC GGTTGCTCTG AGTAAGGCCA GCGTTTTGCC GQTCGAAGTG GCACAGTAGG CTTTTCTGGT AGGAGTGATA
Hypr E protein
•GEY GDVS LLC R V A SQVD LAO TVI LELD К T V EHL
1501 GGGGGAGTAT GGCGACGTTT CTCTGCTCTG CCGGGTGGCT AGCGGAQTCG ACCTGGCCCA GACAGTCATC CTGGAACTGG ATAAAACAGT TGAGCATCTG
CCCCCTCATA CCGCTGCAAA GAGACGAGAC GGCCCACCGA TCGCCTCAGC TCGACCGGGT CTGTCAGTAG GACCTTGACC TATTTTGTCA ACTCGTAGAC
нург E protein
РТА" QVH REW FMDL ALP W it H BGAR НИН О A E RLVE
1601 CCTACCGCTT GGCAGGTGCA CAGGGATTGG TTTAACGACC TTGCCCTGCC ATGGAAACAT GAAGGAGCGA GAAACTGGAA TAATGCAGAG CGACTCGTAG
GGATGGCGAA CCGTCCACGT GTCCCTAACC AAATTGCTGG AACGGGACGG TACCTTTGTA CTTCCTCGCT CTTTGACCTT ATTACGTCTC GCTGAGCATC
Hypr E protein
• FGA PHA VKMD V Y И LGD QTGV LLK ALA GVPV A H I 1701 AATTCGGTGC CCCTCATGCC GTGAAGATGG ACGTCTACAA TCTGGGTGAT CAGACCGGCG ГГСТССТТАа AGCTCTCGCT GGCGTACCAG TTGCCCACAT TTAAGCCACG GGGAGTACGG CACTTCTACC TGCAGATGTT AGACCCACTA GTCTGGCCGC AAGAGGAATT TCGAGAGCGA CCGCATGGTC AACGGGTGTA
Hypr E protein
•EOT К У Л L KSG HVT CEVG LEK L SC M KGLT YTH CDK 1801 CGAAGGAACG AAGTACCACC TGAftGTCAGG CCATGTAACT TGCGAGGTGG GCCTQGAGAA OTTGAAAATG AAAGGTCTTA CGTACACAAT GTGTGACAAG GCTTCCTTGC TTCATGGTGG ACTTCAGTCC GGTACATTOA ACGCTCCACC CGGACCTCTT CAACTTTTAC TTTCCAGAAT GCATGTGTTA CACACTGTTC
Hypr E protein
TKFT WKR APT DSGH DTV V M E VTFS G T К P С ft IPVR 1901 ACCAAGTTCA CATGGAAGAG GGCCCCCACA GATAGCGGCC ACGATACTGT GGTGATGGAG GTGACCTTTT CTGGAACAAA ACCCTGCAGA ATACCCGTGC TGGTTCAAGT GTACCTTCTC CCGGGGGTGT CTATCGCCGG TGCTATGACA CCACTACCTC CACTGGAAAA GACCTTGTTT TGGGACGTCT TATGGGCACG
Hypr E protein
A V A HGS PDVH V A M LIT РЯРТ I E N HGG GFIE M Q L 2001 GGGCTGTAGC TCACGGATCT CCCGATGTCA ATGTTGCTAT GCTGATTACA CCTAACCCTA CCATCGAGAA TAACGGTGGT GGTTTTATTG AGATGCAGCT CCCGACATCG AGTGCCTAGA GGGCTACAGT TACAACGATA CGACTAATGT GGATTGGGAT GGTAGCTCTT ATTGCCACCA CCAAAATAAC TCTACGTCGA
Hypr E protein
¦PPG DNII YVG ELS YQWF QKG SSI GRVF QKT KKG 2101 TCCGCCAGGC GATAACATCA TCTACGTGGG CGAACTCTCT TACCAGTGGT TTCAGAAAGG GAGTTCAATT GGGCGGGTCT TCCAAAAAAC GAAGAAGGGA AGOCGGTCCG CTATTGTAGT AGATGCACCC GCTTGAGAGA ATGGTCACCA AAGTCTTTCC CTCAAGTTAA CCCGCCCAGA AGGTTTTTTG CTTCTTCCCT
Hypr E protein
IERL TVI GBH А И D F G S A GGF LSSI GKA ЬИТ VLGG 2201 ATCGAACGAT TGACGGTTAT CGGCGAGCAC GCATGGGATT TTGGTTCCGC AGGGGGATTC CTGTCTTCTA TTGGTAAGGC ACTGCATACC GTGCTGGGGG TAGCTTGCTA ACTGCCAATA GCCGCTCGTG CGTACCCTAA AACCAAGGCG TCCCCCTAAG GACAGAAGAT AACCATTCCG TGACGTATGG CACGACCCCC
Hypr В protein
- АРМ SIF GGVG FLP KLL L G V A LAW LGL NMRH PTM
23 01 GCGCATTCAA ТТСТАГПТС GGGGGCGTGG GGTTCCTCCC TAAACTCCTG CTGGGAGTAG CCCTGGCCTG GTTGGGACTG AATATGCGGA AfCCGACGAT
CGCGTAAGTT AAGATAAAAG CCCCCGCACC CCAAGGACGG ATTTGAGGAC GACCCTCATC GGGACCGGAC CAACCCTGAC TTATACGCCT TAGGCTGCTA
Hypr E protein
NS1 gene of YF17D
SMS FLLA GVL V L A MTLG VGA DQG С A I № FGK REL 2-101 GTCCATGTCA TTCCTCTTGG CCGGCGTGCT TGTACTGGCC ATGACACTGG GCGTTGGCGC CGATCAAGGA TGCGCCATCA ACTTTGGCAA GAGAGAGCTC CAGGTACAGT AAGGAGAACC GGCCGCACGA ACATGACCGG TACTGTGACC CGCAACCGCG GCTAGTTCCT ACGCGGTAGT TGAAACCGTT CTCTCTCGAG
CV-LGTV E5 c YFV/TBEV химерным сигналом (P43) (SEQ ID NOS: 4S-43)
5 < tJTR
i AGTAAATCCT GTGTGCTAAT TGAGSTOCAT TGGTCTGCAA ATCGfiGTTGC TAGGCAATAA ACACATTTGG ATTAATTTTA ATCGTTCGTT GAGCGATTAG TCATTTAGGA CACACGATTA ACTCCACGTA ACCAGACGTT TAGCTCAACG ATCCGTTATT TGTGTAAACC TAATTAAAAT TAGCAAGCAA CTCGCTAATC S1 UTR
С protein YF17D
M SGR К A Q G К T L G V M MVftR G V R SLS ЫК1К 101 CAGAGAACTG ACCAGAACAT GTCTGGTCGT AAAGCTCAGG GAAAAACCCT GGGCGTCAAT ATGGTACGAC GAGGAGTTCG CTCCTTGTCA AACAAAATAA GTCTCTTGAC TGGTCTTGTA CAGACCAGCA TTTCGAGTCC CTTTTTGGGA CCCGCAGTTA TACCATGCTG CTCCTCAAGC GAGGAACAGT ГГСТТТТАГТ
С protein YF17D
• QKT KQI CHRP GPS RGV QGFI FFF LFM ILTG К К I 201 ААСААААААС AAAACAAATT GGAAACAGAC CTGGACCTTC AAflAGGTGTT CAAGGATTTA TCTTTTTCTT TTTGTTCAAC ATTTTGACTG GAAAAAAGAT TTGT/TTTTTG TTTTGTTTAA CCTTTGTCTG GACCTGGAAG TTCTCCACAA GTTCCTAAAT AGAAAAAGAA AAACAAGTTG TAAAACTGAC СТТТТТТСТА
С protein VF17D
-TAH LKRL HKM Ь D P R Q G L AVL RKV KRVV ASL MRG
301 CACAGCCCAC CTAAAGAGGT TGTGGAAAAT GCTGGACCCA AGACAAGGCT TGGCTGTTCT AAGGAAAGTC AAGAGAGTGG TGGCCAGTTI GATGAGAGGA
GTGTCGGGTG GATTTCTCCA ACACCTTTTA CGACCTGGGT TCTGTTCCGA ACCGACAAGA TTCCTTTCAG TTCTCTCACC ACCGGTCAAA CTACTCTCCT
С protein YF170 TBEV partial signal
YF 17D partial signal prM protein Langat EE
LSSK KRR SHD VLTV ^FL 1 L Q HLGM T I A A T V RfcfiR 401 TTGTCCTCAA GGAAACGCCG TTCCCATGAT GTTCTGACTG TGCAATTCCT AATTTTGGGC ATGCTDGGGA TGACGATCGC AGCTACTGTG CGAAGOGAGA AACAGGAGTT CCTTTGCGOC AAGGGTACTA CAAGACTGAC ACGTTAAGGA TTAAAACCCG TACGACCCCT ACTGCTAGCG TCGATGACAC GCTTCCCTCT
prM protein Lirtgat ES
¦ DGS HVI RAEG RDA ATQ VRVE HGT CVT LATD HGS 501 GAGACGGCTC TATGGTGATC AGAGCCGAAG GTAGGGACGC TQCGACCCAG GTGAGGGTCG AAAATGGCAC CTGTGTTATT CTGGCGACCG ACATGGGCTC CTCTGCCGAG ATACCACTAG TCTCQSCTTC CATCCCTGCG ACGCTGGGTC CACTCCCAGC TTTTACCGTG GACACAATAA GACCGCTGGC TGTACCCGAG
prM protein Langat E5
¦ W С D D S L A YEC VTI DQGE EPV DVD CFCE GVE KVT 603. CTGGTGTGAT GATTCTCTGG CTTATGAATG TGTTACTATT GATCAGGGTG AAGAGCCTGT GGACGTGGAC TGTTTCTGTA GAGGCGTCGA GAAAGTGACC GACCACACTA CTAAGAGACC GAATACTTAC ACAATGATAA CTAGTCCCAC TTCTCGGACA CCTGCACCTG ACAAAGACAT CTCCGCAGCT CTTTCACTGG
prM protein Langat Ё5
LEYG RCG R R E GSRS R R S VLI PSHA QRD LTG RGHQ 701 CTGGAATATG GACGATGTGG CCGGCGAGAA GGCTCCAGGA GTCGGAGATC CGTGTTGATC CCTTCACATG CGCAGCGCGA TCTGACAGGG AGGGGTCACC
GACCTJATAC CTGCTACACC GtSeCGCTOT CCeAGGTCCT CAGCCTCTAG GCACAACTAG GGAAGTGTAC GCGTCGCGCT AGACTGTCCC TCCCCAGTGG
prM protein Langat E5
• W L E GEA V К A H LTR VEG VTVWK KKL F T t, SLVM VAW
eoi AGTGGCTCGA AGGCGAAGCA GTCAAGGCOC ATCTGACTCG CGTTGAAGGC TGGGTGTGGA AAAACAAACT CTTTACCCTT AGCCTGGTGA TGGTCGCGTG
TCACCGAGCT TCCGCTTCGT CAGTTCCGGG TAGACTGAGC GCAACTTCCG ACCCACACCT TTTTGTTTGA GAAATGGGAA TCGGACCAGT ACCAGCGCAC prM protein Langat E5
В protein Langat E5
' L M V DGLL PR I LIV VVAL ALA PAY A S R С THL EMR 901 GCTOATGGTA GACGGACTCC TTCCCCGCAT TCTCATTGTT GTGGTGGCTC TCGCGCTCGC CCCTGCATAC GCGTCCAGGT GTACGCACCT CGAAAATCGA CGACTACCAT CTGCCTGAGG AAGGQGCGTA AGAGTAACAA CACCACCGAG AGCGCGAGCG GGGACGTATG CGCAGGTCCA CATGCGTGGA GCTTTTAGCT
E protein Langat E5
DFVT GVQ GTT RLTL VLB L GG CVTV TAD G К P SLDV 1001 GATTTCGTCA CAGGCGTCCA AGGTACTACC CGGCTCACCC TCGTGCTGGA GCTGGGAGGC TGTGTCACTG TTACAGCCGA CGGAAAACCT AGTCTGGATG CTAAAGCAGT GTCCGCAGGT TCCATGATGG GCCGAGTOGG AGCACGACCT CGACCCTCCG ACACAGTGAC AATGTCGGCT GCCTTTTGGA TCAGACCTAC
E protein Langat ЕБ
¦WLD S I Y QESP AQT R E Y С L, К A KLT G T JC V A A R CPT 1101 TGTGGCTGGA CTCCATCTAT CAGCAGAGCC CGGCACAGAC CAGGGAGTAC TGCCTCCACG CTAAGCTGAC TGGGACAAAG GTAGCCGCAA GATGTCCCAC
ACACCGACCT GAGGTAGATA GTCCT/CTCGG> GCCGTGTCTG GTCCCTCATG ACGGAGGTGC QATTCGACTG ACCCTGTTTC CATCGGCGTT CTACAGGGTG
E protein Langat E5
-MGP ATLP НЕЕ Q S G TVCK RDQ SDR <3 W G N HCG LFG 1201 AATGGGGCCT GCCACCTTGC CCGAGGAACA CCAATCCOGT ACGGTATGCA AGCGAGATCA GTCTGATCGC GGATGGGGGA ATCATTGCGG CCTCTTCGGT
TTACCCCGGA CGGTGGAACG GGCTCCTTGT GGTTAGGCCA TGCCATACGT TCGCTCTAGT CAGACTAGCG CCTACCCCCT TAGTAACGCC GGAGAAGCCA
E protein Langat ES
KGSI VTC V К V TCBD К К К A T G HVYD V N К I Т Y TIKV 1Э01 AAAGGCAGCA TTGTCACTTG CGTGAAGGTG ACATGOGAGG ACAAGAAGAA GGCCACAGGT CATGTATATG ATCTGAACAA ААТСАСАГАТ ACCATTAAGG TTTCCGTCGT AACAGTGAAC GCACTTCCAC TGTACGCTCC TGTTCTTCTT CCGGTGTCCA GTACATATAC TACACTTGTT TTAGTGTATA TGGTAATTCC
E protein Langat ES
- EPH T G E FVAA NET HSG RKSA SFT V ? S E К- T I LTL
1401 TAGAACCACA TACAGGGGAA TTCGTOGCAG CAAACGAGAC TCATAGCGGA CGAAAGTCCG CCTCCTTCAC CGTCTCCTCC GAGAAAACAA TCCTGACCCT ATCTTGGTGT ATGTCCCCTT AAGCACCGTC GTTTGCTCTG AGTATCGCCT GCTTTCAGGC GGAGGAAGTG GCAOAGGAGG CTCTTTTGTT AGGACTGGGA
E protein Langat E5
-GDY GOVS LLC R V A SGVD LAO T V V L A L D К T H EHL 1501 CGGAGACTAC GGCGACGTAT CTTTGCTGTG CAGGGTGGCC AGCGGCGTGG ACCTTGCTCA GACAGTCGTG I^TGGCOCTGG ACAAGACACA TGAGCACTTG GGCTCTGATG CCGCTGCATA GAAAOGACAC GTCCCACCGG TCGCCGCACC TGGAACGAGT CTGTCAGCAC AACCGGGACC TGTTCTGTGT ACTCGTGAAC
E protein Langat ES
РТАМ Q V H R D W FHDL ALP WKH DGAE AWH EAG RLVE 1601 CCAACAGCCT GGCAGGTGCA CAGGGACTGG TTTAACGACC TGGCGCTCCC GTGGAAACAT GACGGCGCTG AAGCATGGAA TGAGGCAGGG AGACTGGTGG
GGTTGTCGGA CCfiTCCACGT GTCCCTGACC AAATTGCTGG ACCGCGAGGG CACCTTTGTA CTGCCGCGAC TTCGTACCTT ACTCCGTCCC TCTGACCACC
E protein Langat E5
- FfiT РИА VKMD VFS LGD QTGV LLK SLA GVPV ASI 17CI AATTTGGAAC CCCACACGCC GTAAAGATCG ACGTTTTCAA TCTTGGTGaC CAQACAGGGG TGCTCCTGAA ATCACTGGOG GGCGTGCCTG TAGCCAGCAT TTAAACCTTG GGGTGTGCGG CATTTCTACC TGCAAAAGTT AGAACCACTG GTCTGTCCCC ACGAGGACTT TAGTGACCGC CCGCACGGAC ATCGGTCGTA
Б protein Langat H5
•ЈGT XYHL KEG HVT CEVG LEK LKM XGLT YTV СГК 1E01 CGAGGGCACA AAGTATCACC TGAAGTCTGG QCATGTAACC I'GCC-AAGTGO 6CCTGGAAAA GCTGAAGATG AbAGGftCTTA CGTACACTGT TTGTGATAAG GCTCCCGTGT TTCATAGTGG ACTTCAGACC CGTACATTGG ACGCTTCACC CGGACCTTTT CGACTTCTAC TTTCCTGAAT GCATGTGACA AACACTATTC
Б protein Langat ES
TKFT HKR APT DSGH DTV VME V Q F В QTR PCS JPVR
1Э01 ACCAAGTTTA CATGGAAGCG AGCCCCAACG GATTCCGGCC ATGATACCGT CGTGATGGAG GTTGGTTTCT CCGGCACCAG ACCATGTAGA ATACCAGTGA TGGTTCAAAT GTACCTTCGC TCGGGGTTGC CTAAGGCCoe TACTATGGCA GCACTACCTC CAACCAAftfift GGCCGTGGTC TGGTACATCT TATGGTCACT
E protein Langat E5
¦ A V A H G V PEVM UAM LIT PUPT KBW HQG GFIE M Q L 2001 GAGCTGTCGC CCACGGTGTA CCCGAGGTAA ACGTGGCCAT GCTGATTACA CCGAATCCCA CTATGGAGAA CAATGGCGGA GGGTTCATCG AAATGCAGCT CTCGACAGCG GGTGCCACAT GGGCTCCATT TGCACCGGTA CGACTAATGT GGCTTAGGGT GATACCTCTT GTTACCGCCT CCCAAGTAGC TTTACGTCGA
E protein Langat E5
¦PPG DNI1 YVG DLD BQKF flKG SSI GRVL QKT RKG 21Q1 GCCGCCTGGA GACAACATCA TTTATGTCGG CGACCTCGAT CATCAATGGT TCCAGAAAGG GTCTTCCATC GGCCGCGTCC TTCAGAAGAC ACGAAAAGGC CGGCGGACCT CTGTTGTAGT AAATACAGCC GCTGGAQCTA GXAGTTACCA AGGTCTTTCC CAGAAGGTAG CCGGCGCAGG AAGTCTTCTG TGCTTTTCCG
E protein Langat E5
TEEL TVL GEH AWDF GSV G G V K TSI GRA MHT VLGG 2201 ATTGAAftSAC TTACJ"STCCT GGGCGAACAT QCCTGGGACT TCGGGTCAGT TGGCGGGGTA ATGACAAGCA TAGGCAGAGC TATGCACACC GTTCTCGGTG TAACTTTCTG AATGTCAGGA CCCGCTTGTH CGGACCCTGA AGCCCAGTCA ACCGCCCCAT TACTGTTCGT ATCCGTCTCG ATACGTGTGG CAAGAGCCAC
E protein Langat ES
- AFN T L L GGVG FLF KIL LGVA MAW LGL NHRK PTL 2301 GGGCATTTAA TACTCTGTTG QGTGGCGTGG GTTTTCTTCC GAAAATCCTG CTCGGTGTCG CARTGGCCTG GCTTGGACTG AAIATGCGCA ATCCTACACT CCCGTAAATT ATGAGACAAC CCACCGCACC CAAAAGAAGG CTTTTAGGAC GAGCCACAGC GTTACCGGAC CGAACCTGAC TTATACGCGT TAGGATGTGA E protein LSngat S5
KS1 gene of YF17D
¦SMG FLLS GGL VLA MTLG VGA DQG CAIW FGK REL 24C1 GAGTATOGGG ТТТСТТСТЗТ CAGGAGGCCT GGTCCTGGCA ATGACTCTGG GAGTGGGCGC CGATCAAGGA TGCGCCATCA ACTTTGGCAA GAGAGAGCTC CTCATACCCC AAAGAAGACA GTCCTCCGGA CCAGGACCGT TACTGAGACC CTCACCCGCG GCTAGTTCCT ACGCGGTAGT TEAAACCGTT CTCTCrCGAG
CV-TBEVHypr с УРУЯВЕУ химерным сигналом и dC2 делецией е с белке (р59) (SEQ ID NOS: 49-Б1)
5 ' UTE.
1 AGTAAATCCT GTGTGCTAAT TGAGGTGCAT TGGTCTGCAA ATCGAGTTGC TAGGCAATAA ACACATTTGG ATTAATTTTA ATCGTTCGTT GAGCGATTAG TCATTTAGGA CACACGATTA ACTCCACGTA ACCAGACGTT TAGCTCAACG ATCCGTTATT TGTGTAAACC TAATTAAAAT TAGCAAGCAA CTCGCTAATC
S' DTR
С protein
M S G R К A 0 G KTL GVH M V R R GVR SLS ЫК1К 101 CAGAGAACTG ACCAGAACAT OTCTGGTCGT AAAGCTCAGG GAAAAACCCT GGGCGTCAAT ATGGTACGAC GAGGAGTTCG CTCCTTGTCA AACAAAATAA GTCTCTTGAC TGGTCTTGTA CAGACCAGCA TTTCGAGTCC CTTTTTGGGA CCCGCAGTTA TACCATGCTG CTCCTCAAGC GAGGAACAGT TTGTTTTA'TT
dC2 deletion (PSE)
С protein
¦ QKT KQI GMRP G G V 0 G F IFFF L F N ILT G К К I ТАН 201 ААСААААААС AAAACAAATT GGAAACAGAC CTGGAGGTGT TCAAGGATTT ATCTTTTTCT TTTTGTTCAA CATTTTGACT GGAAAAAAGA TCACAGCCCA TTGTTTTTTG TTTTGTTTAA CCTTTGTCTG GACCTCCACA AGTTCCTAAA TAGAAAAAGA AAAACAAGTT GTAAAACTGA CCTTTTTTCT AGTGTCGGGT
С protein
-LKR LWKK LDP RQG L A V L RKV К E V VASL M R G LSS
301 CCTAAAGAGG TTGTGGAAAA TGCTGGACCC AAGACAAGGC TTGGCTGTTC TAAGGAAAGT CAAGAGAGTG. GTGGCCAGTT TGATGAGAGG ATTGTCCTCA
GGATTTCTCC AACACCTTTT ACGACCTGGG TTCTGTTCCG AACCGACAAG ATTCCTTTCA GTTCTCTCAC CACCGGTCAA ACTACTCTCC TAACAGGAGT
YF17D partial signal
TBEV partial signal
С protein Hypr prM protein
RKRH SHD V L T VQFL ILG MLG HTIA ATV RKE RDGS 401 AGGAAACGCC GTTCCCATGA TGTTCTGACT GTGCAATTCC TAATTTTGGG CATGCTGGGC ATGACAATCG CAGCTACGGT TCGCAAGGAA AGAGACGGCA TCCTTTGCGG CAAGGGTACT ACAAGACTGA CACGTTAAGG ATTAAAACCC GTACGACCCG TACTGTTAGC GTCGATGCCA AGCGTTCCTT TCTCTGCCGT
Hypr prM protein
- TVI RAE GKDA A T Q VRV ЕНОТ CV1 LAT DMGS WCD 501 GTAOGGTCAT ACGCGCGGAA GGTAAGGATG CCGCTACCCA AGTGAGAGTG GAAAATGGTA CCTGCGTCAT TCTGGCCACC GACATGQQCT CTTGGTGTGA CATGCCAGTA TGCGCGCCTT CCATTCCTAC GGCGATGGGT TCACTCTCAC CTTTTACCAT GGACGCAGTA AGACCGGTGG CTGTACCCGA GAACCACACT
Hypr prM protein
¦DSL SiEC VTI DQG EEPV DVD CFC RNVD G V I LEY 601 TGATAGCCTT TCTTATGAGT GCGTAACCAT AGATCAAGGT GAGGAACCTG TTGACGTTGA TTGCTTCTGC CGAAACGTGG ATGGGGTGTA TCTCGAATAT ACTATCGGAA AGAATACTCA CGCATTGGTA TCTAGTTCCA CTCCTTGGAC AACTGCAACT AACGAAGACG GCTTTGCACC TACCCCACAT AGAGCTTATA
Hypr ptrt protein
GRCG ROE GSR TRRS VLI PSK AQGE LTG R G Я К W L E 701 GGACGGTGTG GTAAACAAGA AGGAAGCAGA ACCAGACGCT CAGTGCTTAT ACCCTCCCAC GCTCAAGGAG AGCTGACCGG ACGGGGACAT AAATGGTTGG CCTGCCACAC САТТТвГТСТ TCCTTCGTCT TGGTCTGCGA GTCACGAATA TGGGAGGGTG CGAGTTCCTC TCGACTGGCC TGCCCCTGTA TTTACCAACC
Hypr prM protein
- GDS LRT HLTR. VEG Я V W KHRL LAL AMV T V V W LTL 801 AGGGCGACTC ACTCOGAACA CATTTGACCC GCGTCGAGGG CTGeGTCTGG AAAAATCGGC TGTTGGCCCT CGCTATGGTG ACAGTCGTTT GGCTCACGCT TCCCGCTGAG TGAGGCTTGT GTAAACTGGG CGCAGCTCCC GACCCAGACC TTTTTAGCCG ACAACCGGGA GCGATACCAC TGTCAGCAAA CCGAGTGCGA
Hypr E protein
Hypr prM protein
•ESV VTRV AVL VVL LCLA PVY ASR CTHL E N R DFV 901 GGAGTCTGTG GTTACTCGCG TGGCAGTGCT GGTGGTGCTC CTCTGTCTTG CCCCTGTCTA CGCGTCCAGG TGTACTCATT TGGAAAACAG AGATTTTGTC
CCTCAGACAC CAATGAGCGC ACCGTCACGA CCACCACGAG GAGACAGAAC GGGGACAGAT GCGCAGGTCC ACATGAGTAA ACCTTTTGTC TCTAAAACAG
Hypr E protein
T G T Q GTT R V T LVLE LGG С V T ITAE G К F SMD V W L D 1001 ACCGGCACCC AGGGGACGAC TCGGGTAACC CTGGTGCTTG AACTGGGTGG TTGCGTTACT ATTACCGCTG AGGGCAAACC CTCTATGGAT GTGTGGCTGG TGGCCGTGGG TCCCCTGCTG AGCCCATTGG GACCACGAAC TTGACCCACC AACGCAATGA TAATGGCGAC TCCCGTTTGG GAGATACCTA CACACCGACC
Hypr E protein
- A I У Q E H P A Q T R E Y CLH А К L S DTK V A A RCPT MGP 1101 ATGCAATCTA TCAGGAGAAT CCCGCACAAA CCAGGGAATA TTGCCTTCAC GCAAAGCTGT CCGATACAAA GGTCGCGGCT AGGTGCCCAA CAATGGGACC TACGTTAGAT AGTCCTCTTA GGGCGTGTTT GGTCCCTTAT AACGGAAGTG CGTTTCGACA GGCTATGTTT CCAGCGCCGA TCCACGGGTT GTTACCCTGG
Hypr Б protein
•ATL AEEH QGG TVC KRDQ SDR GHG N H С G LFG KGS 1201 QGCCACCCTG GCGGAGGAAC ATCAGGGAGG TACAGTGTGC AAACGGGACC AGAGTGATAG AGGCTGGGGT AATCACTGCG GCCTGTTCGG CAAAGGAAGT CCGGTGGGAC CGCCTCCTTG TAGTCCCTCC ATGTCACACG TTTGCCCTGG TCTCACTATC TCCGACCCCA TTAGTGACGC CGGACAAGCC GTTTCCTTCA
Hypr E protein
IVAC V К А АСЕ А К К К A T G H V Y DAHK IVY T V К V E P H 1301 ATTGTCGCTT GCGTCAAGGC AGCCTGTGAG GCCAAAAAGA AGGCTACTGG GCACGTCTAT GACGCCAACA AGATCGTTTA TACAGTGAAA GTGGAACCAC TAACAGCGAA CGCAGTTCCG TCGGACACTC аМГГТТТСТ TCCGATGACC CGTGCAGATA CTGCGGTTGT TCTAGCAAAT ATGTCACTTT CACCTTGGTG
Hypr E pTotein
• TGD Y V A ABET HSG RKT ASFT VSS EKT I L T M GEY 1401 ACACAGGGGA TTACGTGGCG GCCAACGAGA CTCATTCCGG TCGCAAAACG GCCAGCTTCA CCGTGTCATC CGAAAAGACC ATCCTCACTA TGGGGGAGTA TGTGTCCCCT AATGCACCGC CGGTTGCTCT GAGTAAGGCC AGCGTTTTGC CGGTCGAAGT GGCACAGTAG GCTTTTCTGG TAGGAGTGAT ACCCCCTCAT
Hypr E protein
•GDV SLLC R V A SGV D L A Q. TVI LEI. DKTV EHL РТА 1501 TGGCGACGTT TCTCTGCTCT GCCGGGTGGC TAGCGGAGTC GACCTGGCCC AGACAGTCAT CCTGGAACTG GATAAAACAG TTGAGCATCT GCCTACCGCT ACCGCTGCAA AGAGACGAGA CGGCCCACCG ATCGCCTCAG CTGGACCGGG TCTGTCAGTA GX3ACCTTGAC CTATTTTGTC AACTCGTAGA CGGATGGCGA
Hypr 5 protein
HQVH RDH .FND LALP W К Я EGA R H W H H A E RLV EFGA
1S01 TGGCAGGTGC ACAGGGATTG GTTTAACGAC CTTGCCCTGC CATGGAAACA TGAAGGAGCG AGAAACTGGA ATAATGCAGA GCGACTCGTA GAATTCGGTG
ACCGTCCACG TGTCCCTAAC CAAATTGCTG GAACGGGACG GTACCTTTGT ACTTCCTCGC TCTTTGACCT TATTACGTCT CGCTGAGCAT CTTAAOCCAC
Hypr E protein
• РИА VKM D V Y N LGD QTG VLLK ALA GVP VABI EGT 1701 CCCCTCATGC CGTGAAGATQ GACGTCTACA ATCTGGGTGA TCAGACCGGC GTTCTCCTTA AAGCTCTCGC TGGCGTACCA GTTGCCCACA TCGAAGGAAC GGGGAGTACG GCACTTCTAC CTGCAGATGT TAGACCCACT AGTCTGGCCG CAAGAGGAAT TTCGAGAGCG ACCGCATGGT CAACGGGTGT AGCTTCCTTG
Hypr E protein
• К Y H LKSG HVT CEV GLEK LKM KGL TYTM CDK TKF 1801 GAAGTACCAC CTGAAGTCAG GCCATGTAAC TTGCGAGGTG GGCCTGGAGA AGTTGAAAAT GAAAGGTCTT ACGTACACAA TGTGTGACAA GACCAAGTTC CTTCATGGTG GACTTCAGTC CGGTACATTG AACGCTCCAC CCGGACCTCT TCAACTTTTA CTTTCCAGAA TGCATGTGTT ACACACTGTT CTGGTTCAAG
Hypr E protein
TWKR APT DSG HDTV V И E VTF SGTK PCR IPV R A V A 1901 ACATGGAAGA GGGCCCCCAC AGATAGCQGC CACGATACTG TGGTGATGGA GGTGACCTTT TCTGGAACAA AACCCTGCAG AATACCCGTG CGGGCTGTAG TGTACCnCT CCCGGGGGTG TCTATCGCCG GTGCTATGAC ACCACTACCT CCACTGGAAA AGACCTTGTT TTGGGACGTC TTATGGGCAC GCCCGACATC
Hypr E protein
HGS PDV NVAM LIT PHP TIEM MGG GF I Б M Q L PPG
prM Hypr
STVI R A E GKD A A T Q. V R V ? N G TCVI L A T DMG SWCD 301 AGTACGGTCA TACGCGCGGA AGGTAAGGAT GCCGCTACCC AAGTGAGAGT GGAAAATOGT ACCTGCGTCA TTCTGGCCAC CGACATGGGC TCTTGGKJTG TCATGCCAGT ATGCGCGCCT TCCATTCCTA CGGCGATGGG TTCACTCTCA CCTTTTACCA TGGAC3CAGT AAGACCGGTG GCTGTACCCG AGAACCACAC
prM Hypr
¦ DSL S Y E CVTI D g G SEP VDVD С P С RHV D G v Y LEY 401 ATGATAGCCT TTCTTATGAG TGCGTAACCA TAGATCAAGG TGAGGAACCT GTTGACGTTG ATTGCTTCTG CCGAAACGTG GATGGGGTGT ATCTCGAATA TACTATCGGA AAGAATACTC ACGCATTGGT ATCTAGTTCC ACTCCTTGGA CAACTGCAAC TAACGAAGAC GGCTTTGCAC CTACCCCACA TAGAGCTTAT
prM Hypr
- G R С GKOE G SR TRR SVLI PSH A Q G E L T G RGH К W L 501 TGGACGGTGT GGTAAACAAG AAGGAAGCAG AACCAGACGC TCAGTGCTTA TACCCTCCCA CGCTCAAGGA GAGCTGACCG GACGGGGACA TAAATGGTTG ACCTGCCACA CCATTTGTTC TTCCTTCGTC TTGGTCTGCG AGTCACGAAT ATGGGAGGGT GCGAGTTCCT CTCGACTGGC CTGCCCCTGT ATTTACCAAC
prM Hypr
EGDS L R T HLT RVEG KVW К H R LLAL A M V TVV WLTL SOI GAGGGCGACT CACTCCGAAC ACATTTGACC CGCGTCGAGG GCTGGGTCTG GAAAAATCGG CTGTTGGCCC TCGCTATGGT GACAGTCGTT TGGCTCACGC CTCCCGCTGA GTGAGGCTTG TGTAAACTGG GCGCAGCTCC CGACCCAGAC CTTTTTAGCC GACAACCGGG AGOGATACCA CTGTCAGCAA ACCGAGTGCG
E Hypr
prM Hypr
ESV VTE V A V L VVL LCL APVY ASR CTH LEJJR DFV 701 TSGAGTCTGT GGTTACTCGC GTGGCAGTGC TGGTGGTGCT CCTCTGTCTT GCCCCTGTCT ACGCGTCCAG GTGTACTCAT TTGGAAAACA GAGATTTTGT ACCTCAGACA CCAATGAGCG CACCGTCACG ACCACCACGA GGAGACAGAA CGGGGACAGA TGCGCAGGTC CACATGAGTA AAGCTTTTGT CTCTAAAACA
E Hypr
•TGT QGTT R V T LVL ELGG CVT I T A EGKP SMD V W L 801 CACCGGCACC CAGGGGACGA CTCGGGTAAC CCTGGTGCTT GAACTGGGTG GTTGCGTTAC TATTACCGCT GAGGGCAAAC CCTCTATGGA TGTGTGGCTG GTGGCCQTGG GTCCCCTGCT GAGCCCATTG GGACCACGAA CTTGACCCAC CAACGCAATG ATAATGGCGA CTCCCGTTTG GGAGATACCT ACACACCGAC
E Hypr
DAXY Q E H PAQ TREY С L H А К L SI> TK V A A RCP TMGP 901 GATGCAATCT ATCAGGAGAA TCCCOCAGAA ACCAGGGAAT ATTGCCTTCA CGCAAAGCTG TCCGATACAA AGGTOGCGSC TAGGTGCCCA ACAATGGGAC CTACGTTAGA TAGTCCTCTT AGGGCGTGTT TGGTCCCTTA TAACGGAAGT GCGTTTCGAC AGGCTATGTT TCCAGCGCCG ATCCACGGGT TGTTACCCTG
E Hypr
• ATL A E E HQGG TVC KRD Q S D R G И G KHC GLFG KGS 1001 CGGCCACCCT GGCGGAGGAA CATCAGGGAG GTACAGTGTG CAAACGGGAC CAGAGTGATA GAGGCTGGGG TAATCACTGC GGCCTGTTCG GCAAAGGAAG GCCGGTGGGA CCGCCTCCTT GTAGTCCCTC CATGTCACAC GTTTGCCCTG GTCTCACTAT CTCCGACCCC ATTAGTGACG CCGGACAAGC CGTTTCCTTC
E Hypr
¦IVA CVKA А СЕ А К К KATG HVY OAH К Г V Y TVS VEP 1101 TATTGTCGCT TGCGTCAAOG CAGCCTGTGA GGCCAAAAAG AAGGCTACTG GGCACGTCTA TGACGCCAAC AAGATCGTTT ATACAGTGAA AGTGGAACCA ATAACAGCGA ACGCAGTTCC GTCGGACACT CCGGTTTTTC TTCCGATGAC CCGTGCAGAT ACTGCGGTTG TTCTAGCAAA TATGTCACTT TCACCTTGGT
E Hypr
HTGD Y V A AME THSG R К T ASF TVSS E К T ILT MGEY 1201 CACACAGGGG ATTACGTQGC GGCCAACGAG ACTCATTCCG GTCGCAAAAC GGCCAGCTTC ACCGTGTCAT CCGAAAAGAC CATCCTCACT ATGGGGGAGT GTGTGTCCCC TAATGCACCG CCGGTTGCTC TGAGTAAGGC CAGCGTTTTG CCGGTCGAAG TGGCACAGTA GGCTTTTCTG GTAGGAGTGA TACCCCCTCA
E Hypr
• GDV SLL CRVA SGV D L A QTVI LEL DKT VEHL РТА 1301 ATGGCGACGT TTCTCTGCTC TGCCGGGTGG CTAGCGGAGT CGACCTGGCC CAGACAGTCA TCCTGGAACT GGATAAAACA GTTGAGCATC TGCCTACCGC TACCGCTGCA AAGAGACGAG ACGGCCCACC GATCGCCTCA GCTGGACCGG GTCTGTCAGT AGGACCTTGA CCTATTTTGT CAACTCGTAG ACGGATGGCG
E Hypr
•WOV HRDM FHD LAL PHKH EGA R N И ИВАЕ R I, V EFG 14 01 TTGGCAGGTG CACAGGGATT GGTTTAACGA CCTTGCCCTe CCATGGAAAC ATGAAGGAGC GAGAAACTGG AATAATGCAG AGCGACTCGT AGAATTCGGT AACCGTCCAC GTGTCCCTAA CCAAATTGCT GGAACGGGAC GGTACCTTTG TACTTCCTCG CTCTTTGACC TTATTACGTC TCGCTGAGCA TCTTAAGCCA
Ё Hypr
APHA V К M DVY HLGD QTG V L L К A L A GVP V A H IEGT 1501 GCCCCTCATG CCGTGAAGAT GGACGTCTAC AATCTQGGTG ATCAGACCGG CGTTCTCCTT AAAGCTCTCS CTGGCGTACC AGTTGCCCAC ATCGAAGGAA CGGGGAGTAC GGCACTTCTA CCTGCAGATG TTAGACCCAC TAGTCTGGCC GCAAGAGGAA TTTCGAGAGC GACCGCATGG TCAACQQGTG TAGCTTCCTT
E Hypr
' К Y И L К S GHVT CEV G L E К L К M KGL TYT KCDK TKF 1601 CGAAGTACCA CCTGAAGTCA GGCCATGTAA CTTGCGAGGT GGGCCTGGAG AAGTTGAAAA TGAAAGGTCT TACGTACACA ATGTGTGACA AGACCAAGTT GCTTCATGGT GGACTTCAGT CCGGTACATT GAACGCTCCA CCCGGACCTC TTCAACTTTT ACTTTCCAGA ATGCATGTGT TACACACTGT TCTGGTTCAA
E Hypr
¦TWK RAPT DSG HDT VVME VTF SGT К ?> С R I P V RAV 1701 CACATGGAAG AGGGCCCCCA CAGATAGCGG CCACGATACT GTSGTGATGG AGGTOACCTT TTCTGGAACA AAACCCTGCA GAATACCCGT GCGGGCTGTA GTGTACCTTC TCCCGGGGGT GTCTATCGCC GGTGCTATGA CACCACTACC TCCACTGGAA AAGACCTTGT TTTGGGACGT CTTATGGGCA CGCCCGACAT
E Hypr
AHGS PDV H V A MLIT PHP TIE NHGG GFI EMQ LPPG 1B01 GCTCACGGAT CTCCCGATGT CAATGTJGCT ATGCTGATTA CACCTAACCC TACCATCGAG AATAACGGTG GTGGTTTTAT TGAGATGCAG CTTCCGCCAG CGAGTGCCTA GAGGGCTACA GTTACAACGA TACGACTAAT GTSGATTGGG ATGGTAGCTC TTATTGCCAC CACCAAAATA ACTCTAOGTC GAAGGCGGTC
E Hypr
- DHI IYV GELS YQW F Q К GSSI GRV FQK TKKG IER 1901 GCOATAACAT CATCTACGTG GGCGAACTCT CTTACCAGTG GTTTCAGAAA GGGAGTTCAA TTGGGCGGGT CTTCCAAAAA AOGAAGAAGG GAATCOAACG CGCTATTGTA GTAGATGCAC CCGCTTGAGA GAATGGTCAC CAAAGTCTTT CCCTCAAGTT SACCCGCCCA GAAGGTTTTT TGCTTCTTCC CTTAGCTTGC
E Hypr
¦LTV IGEH AMD FGS AGGF LSS IGK ALHT VLG GAF 2001 ATTGACOGTT ATCGGCGAGC ACGCATGGGA TTTTGGTTCC GCAGGGGGAT TCCTGTCTTC TATTGGTAAG GCACTGCATA CCGTGCTGGG GGGCGCATTC TAACTGCCAA TAGCOGCTCG TGCGTACCCT AAAACCAAGG CGTCCCCCTA AGGACAGAAG ATAACCATTC CGTGACGrAT GGCACGACCC CCCGCGTAAG
E Hypr
KSIF GGV GFL PKLL LGV ALA WLGL В M R NPT BSMS
2101 AATTCTATTT TCGGGGGCGT GGGGTTCCTG ССТААДСТОС TGCTGGGAGT AGCCCTGGCC TGGTTGGGAC TGAATATGCG GAATCCGACG ATGTCCATGT
TTAAGATAAA AGCCCCCGCA CCCCAAGGAC GGATTTGAGG ACGACCCTCA TCGGGACCGG ACCAACCCTG ACTTATACGC CTTAGGCTGC TACAGGTACA
E Hypr
WHV USl protein
- FLL A G V LVLA MTL G V G ADTG CAI DIS RQ 2201 CATTCCTCTT GGCCGGCGTG CTTGTACTGG CCATGACACT GGGCGTTGGC GCCGACACTG GGTGTGCCAT AGACATCAGC CGSCAA GTAAGQAGAA CCGGCCGCAC GAACATGACC GGTACTGTGA CCCGCAACCG CGGCTGTGAC CCACACGGTA TCTGTAGTCG GCCGTT
PIV-WN/TBEV Hypr с WNV (tm)(tm)*n(tm) (P40) (SEQ ID NOS: 55-57)
deleted С
5' OTR
M S
1 AGTAGTrCGC CTGTGTGAGC TGACAAACTT AGTAGTeTTT GTGAGGATTA ACAACAATTA ACACAGTGCG AQCTGTTTCT TAGCACGAAG ATCTCGATGT TCATCAAGCG GACACACTCG ACTCTTTGAA TCATCACAAA CACTCCTAAT TGTTGTTAAT TQTGTCACGC TCGACAAAGA ATCGTGCXTC TAGAGCTACA
HMV deleted С
¦ К К P GOP GKSR A V Y L t К R G M P R V L S L 1 G Ь К R S S К 101 CTAAGAAACC AGGAGSGCCC GGCAAGAGCC QOGCTGTCTA TTTGCTAAAA CGCGGAATGC CCCeCSTGTT вТССТТвАТТ GGACTTAAGC GGAGCTCCAA GATTCITTGG TOCTCCCGGG CCGTTCTCSS CCCGACAGAT AAACGATTTT GCGCCTTACG GGGCGCACAA CAGGAACTAA CCTGAATTCG CCTCGAGGTT
MHV signal
mrr deleted с рги Hypr
¦ О. К X EGGK TGI A V M IGML ACV G A A TVRK ERC GST 201 GCAAAAGAAA CGCGGGQGAA AGACAGGCAT AGCTGTGATG ATAGGCATGC TG3CTTGTGT CGGAGCAGCT ACCGTGCGAA AAGAACGCSA CGGAAGCACC CGTTTTCTTT GCGCCCCCTT TCTGTCCGTA TCGACACTAC TATCCGTACG ACCGAACACA GCCTQGTCGA TGGCACGCTT TTCTTGCGCT GCCTTCGTGG
prM Hypr
V I ft A В 6 К D A A TQVK V В И Q T С VILA ТЕМ GSH С D D S 3 01 GTGATAAGGG CTGAGGGTAA GGATGCGGCT ACGCAGGTGA GAGTAGAGAA TGGCACTT6C GTAATACTCG CSACTGATAT GGGATCCTGG TGTGACGATA САСТАТГССС GACTCCCATT CCTACGCCGA TOCGTCCACT CTCATCTCTT ACCGT5AACG CATTATQAGC GCTGACTATA CCCTAGGAOC ACACTGCTAT
prM Hypr
• LSI В С V TIED GEE PVB VDCP С В " VDG VYLB Y G К 101 GCCTCAGTTA TGAATGCGTA ACAATAGACC AGGGCGAAGA ACCTGTCGAC GTTGACTGTT TCTGTAGAAA ТвТвСАТвЙС GTTTATCTGG AGTACGGCCG CGGAGTCAAT ACTTACGCAT TOTTATCTSG TCCCGCTTCT TGGACACCTG CAACTGACAA ABACATCTTT ACACCTADCG CAAATAGACC TCATGCCGGC
prM Hypr
¦CaK QEGS R T R RSV LIPS H A 0 GEL T G R G К К И LEG
$01 CTGTGGAAAA CAGGAGGGCT CACGAACTCG AAGATCTGTG CTGATTCCAA GTCACGCGCA AGGAGAGTTG ACCGGTAGAS GCCACAAGTG GCTTGAAGGG
GACACCTTTT GTCCTCCCGA GTGCTTOAGC TTCTAGACAC GACTAASGTT CAGTGCGCGT TCCTCTCAAC TOGCCATCTC CGGTGTTCAC CGAACTTCCC
prM Eypr
&SLR THL TRV EGWV ИКН RLL A L A M VTV VUL TLBS 601 GACTCATTGA GGACCCACCT GACTAGGGTG GAGGGTTGGG TTTGGAAGAA TCGGTTGCTC GCGCTCGCTA TGGTCACCGT CGTGTGGCTG ACACTQGAGA CTGAGTAACT CCTGGGTGGA СТвАТСССАС CTCCCAACCC AAACCTTCTT AGCCAACGAG CGCGAGCGAT ACCAGTGGCA GCACACCGAC TGTSACCTCT
В Hypr
prM Hypr
VVT RVA VLVV LLC LAP VYAS ЕСТ HLE NRDF VTG
701 GTGTCGTGAC TCGGGTTGCT GTGTTGGTTG TCCTCCTCTG TTTGGCCCCA GTGTACGCGT CCAGGTGTAC TCATTTGGAA AACAGAGATT TTGTCACCGG CACAGCACTG AGCCCAACGA CACAACCAAC AGGAGGAGAC AAACCGGGGT CACATGCGCA GGTCCACATG AGTAAACCTT TTGTCTCTAA AACAGTGGCC
E Hypr
-TQG T T R V T L V L E L GGCV TIT AEG KPSK DVW LDA EOl CACCCAGGGG ACGACTCGGG TAACCCTGGT GCTTGAACTG GGTGGTTGCG TTACTATTAC CGCTGAGGGC AAACCCTCTA TGGATGTGTG GCTGGATGCA GTGGGTCCCC TGCTGAGCCC ATTGGGACCA CGAACTTGAC CCACCAACGC AATGATAATG GCGACTCCCG TTTGGGAGAT ACCTACACAC CGACCTACGT
R Hypr
I Y Q E H P A QTR EYCL H А К LSD TKVA ARC P T M GPAT
Э01 ATCTATCAGG AGAATCCCGC ACAAACCAGG GAATATTGCC TTCACGCAAA GCTGTCCGAT ACAAAGGTCG CGGCTAGGTG CCCAACAATG GGACCGGCCA
TAGATAGTCC TCTTAGGGCG TGTTTGGTCC CTTATAACGG AAGTGCGTTT CGACAGSCTA TGTTTCCAGC GCCGATCCAC GGGTTGTTAC CCTGGCCGGT
E Hypr
- LAE EHQ GGTV CKR DQS DKGW G N H CGL F G К G SIV 1001 CCCTGGCGGA GGAACATCAG GGAGGTACAG TGTGCAAACQ GGACCAGAGT GATAGAGGCT GGGGTAATCA CTGCGGCCTG TTCGGCAAAG GAAGTATTGT GOGACCGCCT CCTTGTAGTC CCTCCATGTC ACACGTTTGC CCTGGTCTCA CTATCTCCGA CCCCATTAGT GACGCCGGAC AAGCCGTTTC CTTCATAACA
E Hypr
•ACV К А А С E А К К К A TGHV YDA N К I VYTV К V E PHT 1101 CGCTTGCGTC AAOGCAGCCT GTGAGGCCAA AAAGAAGGCT ACTGGGCACG TCTATGACGC CAACAAGATC GTTTATACAG TGAAAGTGGA ACCACACACA GCGAACGCAG TTCCGTCGGA CACTCCGGTT TTTCTTCCGA TGACCCGTGC AGATACTGCG GTTGTTCTAG CAAATATGTC ACTTTCACCT TGGTGTGTGT
В Hypr
GDYV А.А В ETH SGRK T A S FTV SSEK TIL T И G EYGD 1201 GGGGATTACG TGGCGGCCAA CGAGACTCAT TCCGGTCGCA AAACGGCCAG CTTCACCGTG TCATCCGAAA AGACCATCCT CACTATGGGG GAGTATGGCG CCCCTAATGC ACCGGCGGTT GCTCTGAGTA AGQCCAGCGT TTTGCCGGTC GAAGTGGCAC AGTAGGCTTT TCTGGTAGGA GTGATACCCC CTCATACCGC
E Hypr
¦ VSL LCR VASG VDL AQT-VILE LDK TVE HLPT A W Q 1301 ACGTTTCTCT GCTCTGCOGG GTGGCTAGCG GAGTO3ACCT GGCCCAGACA GTCATCCTGG AACTGGATAA AACAGTTGAG CATCTGCCTA CCGCTTGGCA TGCAAAGAGA CGAGACGGCC CACCGATCGC CTCAGCTGGA CCGGGTCTGT CAGTAGGACC TTGACCTATT TTGTCAACTC GTAGACGGAT GGCGAACCGT
E Hypr
- V H ft DHFK DLA L.PW KHBG ARB WBN AERL VEF GAP 1401 GGTGCACAGG GATTGGTTTA ACGACCTTGC CCTGCCATGG AAACATGAAG GAGCGAGAAA CTGGAATAAT GCAGAGCGAC TCGTAGAATT CGGTGCCCCT CCACGTGTCC CTAACCAAAT TGCTGGAACG GGACGGTACC TTTGTACTTC CTCGCTCTTT GACCTTATTA CGTCTCGCTG AGCATCTTAA GCCACGGGGA
E Hypr
К A V К MDV YHL GDOT GVL LKA LAGV PVA HIE GTKY 1501 CATGCCGTGA AGATGGACGT CTACAATCTG GGTGATCAGA CCGGCGTTCT CCTTAAAGCT CTCGCTGGCG TACCAGTTGC CCACATCGAA GGAACGAAGT GTACGGCACT TCTACCTGCA GATGTTAGAC CCACTAGTCT GGCCGCAAGA GGAATTTCGA GAGCGACCGC ATGGTCAACG GGTGTAGCTT CCTTGCTTCA
E Hypr
- HLK SGH VT CE VGL EKL KMKG LTY TMC DKTK FTW 1S01 ACCACCTGAA GTCAGGCCAT GTAACTTGCG AGGTGGGCCT GGAGAAGTTG AAAATGAAAG OTCTTACGTA CACAATGTGT GACAAGACCA AGTTCACATG TGGTGGACTT CAGTCCGGTA CATTGAACGC TCCACCCGGA CCTCTTCAAC TTTTACTTTC CAGAATGCAT GTGTTACACA CTGTTCTGGT TCAAGTGTAC
E Hypr
- К R A PTDS GHt> IVV MEVT FSG TKP CRIP V R A V A H 1701 GAAGAGGGCC CCCACAGATA GCGGCCACGA TACTGTGGTG ATGGAGGTGA CCTTTTCTGG AACAAAACCC TGCAGAATAC CCGTGCGGGC TGTAGCTCAC CTTCTCCOGG GGGTGTCTAT CGCCGGTGCT ATGACACCAC TACCTCCACT GGAAAAGACC TTGTTTTGGG ACGTCTTATG GGCACGCCCG ACATCGAGTG
E Hypr
GSPD V N V A M L ITPK P T I EHH GGGF I E M Q L P PGDM 1601 GGATCTCCCG ATGTCAATGT TGCTATGCTG ATTACACCTA ACCCTACCAT GGAGAATAAC GGTGGTGGTT TTATTGAGAT GCAGCTTCCG CCAGGCGATA CCTAGAGGGC TACAGTTACA ACGATACGAC TAATGTGGAT TGGGATGGTA GCTCTTATTG CCACCACCAA AATAACTCTA CGTCGAAGGC GGTCCGCTAT
E Hypr
- I I Y VOE LSYQ WFQ KGS SIGR VFQ KTK KGIE RLT 1901 ACATCATCTA CGTGGGCGAA CTCTCTTACC AGTGGTTTCA GAAAGGGAGT TCAATTGGGC GGGTCTTCCA AAAAACGAAG AAGGGAATCG AACGATTGAC TGTAGTAGAT GCACCCGCTT GAGAGAATGG TCACCAAAGT CTTTCCCTCA AGTTAACCCG CCCAGAAGGT TTTTTGCTTC TTCCCTTAGC TTGCTAACTG
г Hypr
¦WIG EHAW DFG SAG GFLS SIG KAL HTVL GGA PKS 2001 GGTTATCGGC GAGCACGCAT GGGATTTTGG TTCCGCAGGG GGATTCCTGT CTTCTATTGG TAAGGCACTG CATACCGTGC TGGGGGGOGC ATTCAATTCT CCAATAGCCG CTCGTGCGTA СССТААЙАСС AAGGCGTCCC CCTAAGGACA GAAGATAACC ATTCCGTSAC QTATGGCACG ACCCCCCGCG TAAGTFAAGA
E Hypr
IFGG VGF L P К LLLG VAL AWL GLNM RKP TMS MSFL 2101 ATTTTCGGGG GCGTGGGGTT CCTGCCTAAA CTCCTGCTGG GAGTAGCCCT GGCCTGGTTG GGACTGAATA TGCGGAATCC GACGATGTCC ATGTCATTCC TAAAAGCCCC CGCACCCCAA GGACGGATTT GAGGACGACC CTCATCGGGA CCGGACCAAC CCTGACTTAT ACGCCTTAGG CTGCTACAGG TACAGTAAGG E Hypr
WSV NS1 protein
• LAG VLV LAMT LGV GAD TGCA I D I SRQ 2201 TCTTGGCCGG CGTGCTTGTA CTGGCCATGA CACTGGGCGT TGGCGCCGAC ACTGGGTGTG CCATAGACAT CAGCCGGCAA AGAACCGGCC GCACGAACAT GACCGGTACT GTGACCCGCA ACCGCGGCTG TGACCCACAC GGTATCTGTA GTCGGCCGTT
Приложение 3
Конструкции, экспрессирующие G белок вируса бешенства. WN (ДСргМЕ) - последовательность (частичная) ПИВ бешенства. (SEQ ID NO: 58-60)
N-certnimi* of с
-EEL
V К К R EEC
L D A L E S I MTT
К S V SFHR LSH
L R К
GGAGGAACTG CCTCCTTGAC
GTGAAGAAAC CACTTCTTTG
GCGAAGAGTG CGCTTCTCAC
CCTGGACGCA CTTGAGAGTA TTATGACCAC GGACCTGCGT GAACTCTCAT AATACTGGTG ftabies-G protein
CAAATCCGTT TCCTTCAGAA GACTGAGCCA GTTTAGGCAA AGGAAGTCTT CTGACTCGGT
CCTGCGAAAG GGACGCTTTC
L V P G F G К
A Y T
Г F N И TLM EAD
A tf Y К SVR TttN
E I I 1
CTGGTGCCAG GACCACGGTC
GGTTCGGGAA CCAAGCCCTT
GGCTTATACT CCGAATATGA
ATTTTCAACA AGACTCTTAT GGAGGCGGAT TAAAAGTTGT TCTGAGAATA CCTCCGCCTA
Rabifis-G protein
GCCCATTATA AGTCAGTTAG GACTTGGAAT CGGGTAATAT TCAGTCAATC CTCAACCTTA
GAGATAATTC CTCfftTTAAG
¦ E К G
С L В
VGGR CHF HVH GVFF N G I ILG PDGN VLt
CCTCCAAAGG ATG7CTGAGA GOAGGTTTCC TACAGACTCT
GTCGGTGGGA CAGCCACCCT
GATGCCACCC CCATGTCAAT GGGGTGTTCT CTACGGTGGG GGTACAGTTA CCCCACAAGA
Rsbies-G protein
TTAACGGAAT CATCCTGGGA CCTGACGGGA AATTGCCTTA GTAGGftCCCT GGACTGCCCT
ACGTGCTGAT TGCACGACTA
-РЕМ
Q S S L LOO
HME LLVS SVI
P1M BFLA DPS
T V F
TCCCGAGATG AGGGCTCTAG
CAATCTTCCC GTTAGAAGGG
TTCTGCAGCA AAGACGTCGT
ACACATGGAA CTCCTGGTGT CTTCAGTGAT TGTGTACCTT GAGGACCACA GAAGTCACTA Rabies-G protein
ACCCCTGATG CACCCACTGG CCGACCCCAG TGGGGAGTAC GTGGGTGACC GGCTGGGGTC
CACTGTGTTC GTGACACHAG
К H G D E А Ё
D F V
EVKL PDV HER
I S G V DLG LPN
W G К 1
AAAAATGGCG TTTTTACCGC
ATGAGGCCGA AGACTTTGTG TACTCCGGCT TCTGAAACAC
GAAGTTCACC TGCCCGATGT ACACGAAAGG CTTCAAGTGG ACGGGCTACA TGTGCTTTCC Rabies-G protein
ATATCTGGAG TAGACCTGGG CCTTCCTAAT TATAGACCTC ATCTGGACCC GGMGGATTA
TGGGSTAAGT ACCCCATTCA
¦ V L L
SAG
ALTA LHL IIF LMTC W R P. V N R SEPT Q К N
ACGTGCTCCT TGCACGAGGA
GAGTGCGGGT CTCACGCCCA
GCCTTGACCG CGGAACTGGC
CTTTGATGCT GATCATTTTT CTGATGACCT GAAACTACGA CTAGTAAAAA GACTACTGGA Rabies-G protein
GCTGGCGGAG GGTGAATCGC TCCGAGCCGA CGACCGCCTC CCACTTAGCG AGGCTCGGCT
CACAGCACM GTGTCGTGTT
FMCft
* L R G
TORE V S V
TPQ SGKI ISS
WES TKSG GET
G L H
TCTCAGAGGG AGAGTCTCCC
ACAGGCCGGG TGTCCGGCCC
AAGTAAGTGT ТТСДТТСАСА
GACTCCGCAA TCTGGCAAGA TTATTAGTAG CTGAGGCGTT AGACCGTTCT AATAATCATC preNSl signal
TTGGGAGAGT TACAAGTCTG GAGGAGAGAC ААСССТСТСА ATGTTCAGAC CTCCTCTCTG
TGGGTTGAAT ACCCAACTTA
FMDV 2A
N51 signal
FULL К L A
G Ь V
ESHF GPA RDR
S I A L TFL A V G
G V L I
TTTGATCTGC TCAAACTTGC AAACTAGACG AGTTTGAACG N31 sign?!
AGGCGATGTA TCCGCTACAT
GAATCAAATC CTGGACCCGC CCGGGACAGG CTTAGTTTAG GACCTGGGCG GGCCCTGTCC
TCCATAGCtC TCACGTTTCT CGCAGTTGGA GGAGTTCTGC AGGTATCGAG AGTGCAAAGA GCGTCAACCT CCTCAAGACG
i, в с ass
TCTTCCTCTC CGTGAACHTG CACGCTGACA CTGGGTGTGC CATAGACATC AGCCGGCAAG AGCTGAGATG TGGAAGTGGA GTGTTCATAC ACflATGATGT AGAAGGAGAG GCACTTGGAC GTGCGACTGT GACCCACACG GTATCTGTAG TCGGCCGTTC TCGACTCTAC ACCTTCACCT CACAAGTATG TGTTACTACA
WN (ДС)-последователыюсть (частичная) ПИВ бешенства G (SEQ ID NO: 61-63)
Rabies-G protein T P Q S G К I
WES YKSG GET
TCTCAGAGGG ACAGGCCGGG AAGTAAGTGT GACTCCGCAA TCTGGCAAGA TTATTAGTAG TTGGGAGAGT TACAAGTCTG GAGGAGAGAC TGGGTTGAAT AGAGTCTCCC TGTCCGGCCC TTCATTCACA CTGAGGCGTT AOACCCTTCT AATAATCATC AACCCTCTCA ATGTTCAGAC CTCCTCTCTG ACCCAACTTA
C/prM signal
FMDV 2Л LA GOV
TTTGATCTGC TCAAACTTGC AGGCGATGTA GAATCAAATC CT3GACCCGG AGGAAMRCC GGTATTGCA6 TCATGATTGG CCTGATCGCC TGCGTftGGAG AAACTAGACG AGTTTGAACG TCCGCTACAT CTTAGTTTAG GACCTGGGCC TCCTTTCTGG CCATAACGTC AGTACTAACC GGACTAGCGG ACGCATCCTC C/prti signal
PIM V N A
MSK DKP T I D V КМЦ ЦМЕ A ft N Ь A E V R S Y С Y L A TVS
2501 TCATGTCTAA GGACAAGCCT ACCATCGATG TGAAGATGAT GAATATGGAG GCGGCCAACC TGGCAGAGGT CCGCAGTTAT TGCTATTTGG CTfiCCGTCAG AGTACftGATT CCTGTTCCGA TGGTAGCTAC ACTTCTACTA CTTATACCTC CGCCGGTTGG ACCGTCTCCA GGCGTCAATA ACGATAAACC GATGGCAGTC
DLS T К A A CPA MGE AHND К R A OPA FVCR QGV VDR
2601 CGATCTCTCC ACCAAAGCTG CGTGCCCGGC CATGGGAGAA GCTCACAATG ACAAACGTGC TGACCCAGCT TTTGTGTGCA GACAAGGAGT GGTGGACAGG GCTAGP.GAGG TGGTTTCGAC GCACGGGCCG GTACCCTCTT CGAGTGTTAC TGTTTGCACG ACTGGGTCGA AAACACACGT CTGTTCCTCA CCACCTGTCC
G W G N GCG L F G К G S 1 DTC А К F ACST К A I G R T ILKE
2Ш GGCTGGGGCA ACGGCTGCGG ACTATTTCGC AAAG-GAAGCA TTGACACATG CGCCAAATTT GCCrGCTCTA CCAAGGCAAT AGGAAGAACC АТГТТСАААС CCGACCCCGT TGCCGACGCC TGATAAACCG TTTCCTTCGT AACTGTGTAC GCGGTTTAAA CGGACGAGAT GGTTCCGTTA TCCTTCTTGG TAAAACTTTC
NIK YEV AIFV HGP TTV ESNG NYS TQV GATQ A G Ft
1301 AGAATATCAA GTACGAAGTG GCCATTTTTG TCCATGGACC AACTACTGTG GAGTCGCACG GAAACTACTC CRCACAGGTT GGAGCCACTC AGGCAGGGAG TCTTATAGTT CATGCTTCAC CGGTAAAAAC AGGTACCTGG TTGATGACAC CTCAGCGTGC CTTTGATGAG GTGTGTCCAA CCTCGGTGAG TCCGTCCCTC
FSI TPAA PSY TLK LGEY GEV TVD CEPR SGI OTN
2401 ATTCAGCATC ACTCCTGCGG CGCCTTCATA CACACTAAAG CTTGGAGAAT ATGGAGAGGT GACAGTGGAC TGTGAACCAC GGTCAGGGAT TGACACCAAT TAAGTCGTAG TGAGGACGCC GCGGAAGTAT GTGTGATTTC GAACCTCTTA TACCTCTCCA CTGTCACCTG ACACTTGGTG CCAGTCCCTA ACTGTGGTTA
A Y Y V MTV GTK TFLV HRE WPM DLNL PWS SAG STVH
3001 GCATACTACG rGATGACTGT rGGAACAAAG ACGTTCTTGG TCCATCGTGA GTGGTTCAK GACCTCAACC TCCCTTGGAG CAGTGCTGGA AGTACTGTGT CGTATGATGC ACTACTGACA ACCTTGTTTC TGCAAGAACC AGGTAGCACT CACCftAGTAC CTGGAGTTGG AGGGAACCTC GTCACGACCT TCA7GACACA
R N R ETL HEFE EPH A T К QSVI ALG SQE GAX.H Q A L
3101 GGAGGAACAG AGAGACGTTA ATGGAGTTTG AGGAACCACA CGCCACGAAG CAGTCTGTGA TAGCATTGGG CTCACAAGAG GGAGCTCTGC ATCAAGCTTT CCTCCTTGTC TCTCTGCAAT TACCTCAAAC TCCTTGGTGT GCGGTGCTTC GTCAGACACT ATCGTAACCC GAGTGTTCTC CCTCGAGACG TAGTTCGAAA
A G A IPVE FSS N T V KLTS G H L К С К VKHE KLQ LKG
3201 GGCTGGAGCC ATTCCTGTGG AATTTTCAAG CAACACTGTC AAGTTGACGT CGGGTCATTT GAAGTGTAGA GTGAAGATGG AAAAATTGCA GTTGAAGGGA CCGACCTCGG TAAGGACACC TTAAAAGTTC GTTGTGACAG TTCAACTGCA GCCCAGTAAA CTTCACATCT СДСТТСТАСС TTTTTAACGT CAACTTCCCT
TTYG VCS К A F KFtG T P A DTG H G T V VLE LQY TGTD
3301 ACAACCTATG GCGTCTGTTC AAAGGCTTTC AAGTTTCTTG GGACTCCCGC AGACACAGGT CACGGCACTG TGGTGTTGGA ATTGCAGTAC ACTGGCACGG TGTTGGATAC CGCAGACAAG TTTCCGAAAG TTCAAAGAAC CCTGAGGGCG TCTGTGTCCA GTGCCGTGAC AcCACAACCT TAACGTCATG TGACCGTGCC
G P С KVP IS5V A S L HDL TPVG R L V TVH PFVS VAT
34 01 ATGGACCTTG CAAAGTTCCT ATCTCGTCAG TGGCTTCAlT GAACGACCTA ACGCCAGTGG GCAGATTGCT CACTGTCAAC CC3TTTGTTT CAGTGGCCAC TACCTGGAAC GTTTCAAGGA TAGAGCAGTC ACCGAAGTAA CTTGCTGGAT TGCGGTCACC CGTCTAACCA GTGACAGTTG GGAAAACAAA GTCACCGGTG
ANA KVLI ELE PPF GDSY IVV G R G EQQI ЫНЦ H H К
3501 GGCCAACGCT AAGGTCCTGA TTGAATTGGA ACCACCCTTT GGAGACTCAT ACATAGTGGT GGGCAGAGGA GAACAACAGA TCAATCACCA CTGGCACAAG
CCGGTTGCGA TTCCAGGACT ААСТТААССТ TGGTGGGAAA CCTCTGAGTA TGTATCftCCA CCCGTCTCCT СТТ6ТГСТСТ AGTTAGTGGT GACCGTGTTC
SGSS IGK AFT TTLK GAG RLA ALGD TAW DFG SVGG
3601 TCTGGAAGCA GCATTGGCAA AGCCTTTACA ACCACCCTCA AAGGAGCGCA GAGACTAGCC GCTCTACSGSG ACACAGCTTG GGACTrTGGA TCAGTTGGAG AGACCTTCGT CGTAACCGTT TCGGAAATGT TGGTGGGAGT TTCCTCGCGT CTCTGATCGG CGAGATCCTC TGTGTCGAAC CCTGAAACCT AGTCAACCTC
V F T SVG К" A V H Q V F GGA FRSL FGG MSW ITQG LLG
3T01 GGGTGTTCAC CTCAGTTGGG AAGGCTGTCC ATCAAGTGTT CGGAGGAGCA TTCCGCTCAC TGTTCGGAGG CATGTCCTGG ATAACGCAAG GATTGCTGGG CCCACAAGTG GAGTCAACCC TTCCGACAGG TAGTTCACAA GCCTCCTCGT AAGGCGAGTG ACAAGCCTCC GTACAGGACC TATTGCGTTC CTAACGACCC
ALL LHMG I N A R D R SlAL T F L A V G GVLL FLS VHV
JBOl GGCTCTCCTG TTGTGGATGG GCATCAATGC TCGTGACAGG TCCATAGCTC 7CACGTTTCT CGCAGTTGGA GGAGTTCTGC TCTTCCTCTC CGTGAACGTG CCGAGAGGAC ААСАССТАСС CGTAGTTACG AGCACTGTCC AGGTftTCGAG AGTGCAAAGA GCGTCAACCT CCTCAAGACG AGAAGGAGAG GCACTTGCAC E
NS1
HADT GCA ID! SRQE LRC Q S Q VPIH KDV BAH N E Я Y
3901 CACGCTOAC* CTGGGTGTOC CATAQACATC AGCCGGCAAG AGCTQAGATQ TGGAAGTGGA GTGTTCATAC ACAATGATGT GGAGBCTTGG ATGGACCGGT GTQCGACTGT GACCCACftCG OTATCTOTAG TCGGCCGTTC TCGACTCTAC ЛССТТСАССТ CACAAGTATG TGTTACTACA ССТСОЗААСС TACCTGGCCA
WN (АргМЕ)-последовательность (частичная) ПИВ бешенства G (SEQ ID NO: 64-66)
5" UTR
AGTAGTTCGC CTGTOTaAQC TGACAAACTT AGTAGTGTTT GTGAtiGATTA ACAACAATTA ACACAQTGCG AGCTCTTTCT TAGCAOGAAG ATCTCGATGT TCATCAAGCG OACACACTCG ACTGTTTGAA TCATCACAAA CACTCCTAAT TGTTGTTAAT TGTCTCAOGC TCGACAAAGA ATCGTGCTTC TAGAGCTACA
С protein
KP GGP GKSR A V ? L L К ROMP
G L К fi A M L
CTAAGAAACC AOGAOGQCCC MCAAGAGCC OGGCTOTCTA TTWCTAAAA COCtHAATGC CCCGOQTGTT gTCCTTGATT OGACTTAAGA aSGCTftrGTT GATTCTTTGG TCCTCCCGGG CCOTTCTCGG CCCGACAGAT AAAOQATTTT GCOCCTTACG GQGOSCACAA. CAIMAACTAA CCTQAATTCT CCOOATACAA
с protein
F V L A L L A
P T R A V
SAGCCTGATC GACOGCAAGG GGCCAATACG ATTTGTGTTO GCTCTCTTGG CGTTCTTtAG GTTCACAOCA ATTGCTOCGA CCCGAGCAGT QCtOQATCGA CTCGGACTAG CTGCCGTTCC CCQ3TTATGC TAAAGACAAC CGAGAGAACC GCAAGAAQTC СААОГОТСОТ TAACQAOQCT QOTClMTCA OGACCTAQCT
с protein
к; н ь и s p к
О T L T
TOOAGAGGTG TGAACAAACA AACAOCGATG AAACAOCTTC TGACJTTTCAA GAAGGAACTA GGGftCCTTGA CCAOTGCTAT CAATCO0CGG AGCTCAAAGC AOCTCTCCAC ACTTGTTTGT TTOTCGCTAC TtTGTGCAAS АСТСАДА <31Т CTTCCTTGAT СССТЭОААСГ GQTCACGAITL GTTAQCOGCC TCGAGTTTdG
С protein protein
febiea-J signal
GGAGTTCTGC TCTTCCTCTC CGTGAACGTG CACGCTGACA CTGGGTGTGC CATAGACATC AGCCGGCAAG AGCTGAGATG TGGAAGTGGA GTGTTCATAC CCTCAAGACG AGAAGGAGAG GCACTTGCAC GTGCGACTGT GACCCACACG GTATCTGTAG TCGGCCGTTC TCGACTCTAC ACCTTCACCT CACAAGTATG
PIV-WNV хелпвр 4NS1 (SEQ ID NOS: 67-69)
S' UTR
H S
1 AGTAGTTCGC CTGTGTGAGC TGACAAACTT AGTAGTGTTT GTGAOGATTA ACAACAATTA ACACAGTOCG AGCTGTTTCT TAGCACGAAG ATCTCGATGT TCATCAAGCG GACACACTCG ACTGTTTGAA TCATCACAAA CACTCCTAAT TGTTGTTAAT TGT3TCACGC TCGACAAAGA ATCGTGCTTC TAGAGCTACA
¦ К К F GOP 6 К S R A V N M L К ROMP R V L S L I OLKR AML 101 CTAAGAAACC AQQAGGGCCC GGCAAGAGCC GGGCTGTCAA TATGCTAAAA CGOGGAATGC CCOGCGTGTT GTCCTTGATT GGACTTAAGA GGGCTATGTT GATTCTTTGG TCCTCCCGGG CCGTTCTCGG CCCGACAGTT ATACGATTTT GCGCCTTACG GHGCOCACAA CAQBAACTAA CCIGAAITCT CCCGATACAA
•SLI DdKG PIR FVL ALLA FFR FTA 1APT ft A V LDH 201 GAGCCTGATC SACGGCBAGG GGCCAATACG ATTT3rSTTG GCTCTCTTQG CGTTCTTCAG GTTCACAGCA ATT3CTC0GA CCCGAGCAGT GCTGOATCGA CTCGGACTAG CTGCCGTTCC CCGGTTATGC TAAACACAAC CGAGAGAACC GCAAGAAGTC CAAGTOTCGT TAACGAflGCT GGGCTCGTCA CGACCTAGCT
W R G V NKQ ТАМ К H L L S F К KEL GTLT SAT N R R SSKO 301 TGGAGAGGTG TGAACAAACA AACAGCQATG АААСАССТГС TGAGTTTCAA GAAGGAACTA GGGAOCTTGA CCAGTGCTAT CAATCGGCGG AGCTCAAAAC ACCTCTCCAC ACTTGTTTGT TTGTOGCTAC TTTGTGGAAD ACTCAAAGTT CTTCCTTGAT CCCTGGAACT GGTCAOGATA GTTAGCCGCC TCGAGTTTTG
Signal p*ptide
С ргИ
• К Ж R G G К T О I A VMJ GLI A S V G A V T LSH F Q G К V К Я 401 AAAASAAAAG AGGAGGAAAG ACOGGAATTG CAGTCATGAT TGGCCTCRTC GCCfVGCGTAG GAGCAOTTAC CCTCTCTAAC TTCCAAGGGA AGGTGATGAT TTTICTTTTC TCCTCCTTTC тетсСГТААС аГСАОТАСТА ACCOOACTAG CGGTCGCATC CTCGTCAATG GGAGAGATTG AAGGTTCCCT ТССДСГАСТА.
ргИ
¦TVM A T D V TDV ITI P T A A GKM LCI VRAM D V G Y M С SOI GACGGTAAAT ВСТАСГЭАСв TCACASATSI CATCACGATT CCAACAGCTG СТОЗАААВАА CCTATGCATT GTCAGAQCAA TGGATGTGGG ATACATGTGC CTGCCATTTA CGATGACTOC AGT3TCTACA GTAGTGCTAA GGTTGTCGAC GACCTTTCTT GGATACGTAA CAGTCTCGTT ACCTACACCC TATGTACACG
DDTI TYE CPV LSAG NOP EDI DCWC TKS A V I V R Г G 601 GATGATACTA TCACTTATGA ATGCCCAGTG CTQTCGGCTG GTAATGATCC AGAAGACATC OACTGTTOGT GCACAAAGTC AGCAGTCTAC GTCAGGTATG CTACTATGAT AGTGAATACT TACSGGTCAC GACASCCGAC CATTACTAGG TCTTCTGTAG CXGACAACCA CGTGTTTCAG TCGTCAGATG CAGTCCATAC
prM
< RCT KTR ESRR SRR SLT V Q T H GES TLA Ы К К G A W M 701 GAAGATGCAC CAAGACACGC CACTCAAGAC GCAGTCGGAG GTCACTGACA GTGCAGACAC ACGGAGAAAG CACTCTAGCG AACAAGAAGG GGGCTTGGAT CTTCTACGTG GTTCTGTGCG STQAGTTCTG CGTCASCCTC" CAGTGACTGT CAOGTCTGTG TGCCTCTTTC CTGAGATCCC TTGTTCTKC CCCGAACCTA
prM
¦ D S T KATR YLV К T 13 S w t L КНР G Y A L V A A VIG WML 801 GOACACCACC AAGGCCACAA GGTATTTGGT AAAAACAGAA TCATGGATCT TGAGGAACCC TGGATATGCC CTGGTGGCAG CCGTCATraG TTGGATGCTT CCTGTCGTGC TTCCGGTSTT CCATAAACCA TTTTTGTCTT AGTACCTAGA ACTCCTTCGG ACCTATACGG GACCACCGTC GGCAGTAACC AAOCTACSAA
prM
GSHT MQR VVF VVLL I.LV АРА YSFN CLG MSH R D F L Э01 GGSAGCAACA CCATGCASAG AGTTGTGTTT GTCGTGCTAT TGCTTTTGGT GGCCCCAOCT TACAGCTTTA ACTGCCTTGG AATGAGCAAC AGAGACTTCT CCCTCGTTGT GGTACGTCTC TCAACACAAA CAGCACGATA AOGAAAACCA CCGGGGTCGA ATGTCGAAAT TGACGGAACC TTACTCSTTC TCTCTGAAGA
F.GV SGA TWVD LVL EGD SCVT IMS KDK PT1D VKH 1001 TGGAAGGAGT GTCTGGAGCA ACATGGGTGG ATTTGGTTCT CGAAGGCGAC AGCTGOGTGA CTATCATGTC TAAGGACAAG CCTACCATCG ATGTGAAGAT ACCTTCCTCA CAGACCTCGT TGTACCCACC TAAACCAAGA GGTTCCSCTG TCGACGCACT GATAGTACAG ATTCCTGTTC GGATGGTAGC ТАСЛСТТСТА
¦ И Ы И EAAM LAE VRS YCYL ATV SDL STKA ACP АИО 1101 GATGAATATG GAGGCGGCCA ACCTGGCAGA GGTCCGCAGT TATTGCTATT TGGCTACCGT CAGCGATCTC TCCACCAAAG CTGCGTGCCC GGCCATGGGA CTACTTATAC CTCCGCCGGT TGGACCGTCT CCAGGCGTCA ATAACGATAA ACCGATGGCA GTCGCTAGAG AGGTGGTTTC GACGCACGGG CCGGTACCCT
? A H N DKR A D P AFVC RQG 7 V D RGWG NGC GLF G К G S 1201 GAADCTCACA ATGACAAACG TGCTGACCCA GCTTTTGTGT GCAGACAAGQ AGTGGTGGAC AGGGGCTGGG OCAACGGCTG CGGftCTATTT GGCAAAGGAA CTTCGAGTOT TACTG-TTTSC ACS3ACTGGST CGAAAACACA CGTCTGTTCC TCACCACCTG TCCCCGACCC CGTTGCCGAC GOCTOATAAA ССаттТССТТ
• IDT С А К FACS TKA IGR TILK ENI KYE VAIF VUG
1301 GCATTGACSM: ATGCGCICAAA TTTGCCTGCT CTACCAAGGC AATAGGAAGA ACCATTTTGA AAGAGAATAT CAAGTACGAA GTGGCCATTT TTGTCCATGG
CGTAACTGTG TACGCGGTTT AAACGGACSA GATGGTrcCG TTATCCTTCT TGGTAAAACT TTCTCTTATA GTTCATGCTT CACCGGTAAA AACAGGTACC
-PTT VESH GUY S T KLGE YGH VTV DCEP HSG IDT NAVY VMT VGT KTFL 1501 AAGCTTGGAG AATATGGAGA GGTtJACAGTG GACTGTGAAC CACGGTCAGG GATTOACACC AATGCATACT ACGTOATGAC TGTTGGAACA AAGACGTTCT TTCGAACCTC TTATACCTCT CCACTGTCAC- CTGACACTTG GTGCCAGTCC CTAACTGTGG TTACGTATGA TGCACTACTG ACAACCTTGT TTCTGCAAGA
¦ V H R EMF MDLH LPN SSA GSTV MRH RET LHEF ВЕР 1601 TGGTCCATCG TGAGTGGTTC ATGGACCTCA ACCTCCCTTG GAGCAGTGCT GGAAGTACTG TGTGGAGGAA CAGAGAGAOG TTAATGGAGT TTGAGGAACC ACCAGGTAGC ACTCACCAAG TACCTGGAOT TGGAGGGAAC CTCGTCACGA CCTTCATGAC ACACCTCCTT GTCTCTCTGC AATTACCTCA AACTCCTTGG
¦ИАТ KQSV IAL GSC; BGAL HOA LAG AIPV EPS S Ы T 1701 ACACGCCACG AAGCAGTCTG TGATAGCATT GGGCTCaCAA GAGGGAGCTC TGCATCAAGC TTTGGCTGGA GCCATTCCTG TGGAATTTTC AAGCAACACT TGTGCGGTGC TTCGTCAGAC ACTATCGTAA CCCGAGTGTT CTCOCTCGAG ACGTAGTTCG AAACCGACCT CGGTAAGGAC ACCTTAAAAG TTCGTTGTGA
VKIJT SGH LKC RVKM EKL Q L К GTTY GVC SKA F fC F L 1801 GTCAAGTTGA CGTCGGGTCA TTTGAAGTGT AGAGTGAAGA TGGAAAAATT GCAGTTGAAfl GGAACAACCT ATGGCGTCTG TTCAAftGGCT ТТСАВДТТТС CAGTTCAACT GCAGCCCAGT AAACTTCACA TCTCftCTTCT АССТТТПГАА СЯТСААСТТС CCTTtSTTGGA TACCOCAGAC AAGTTTCCGA AAGTTCAAAG
¦ GTP A D T GHGT V V L Б L Q Y Т G T D G p С К V PISS VAS Д901 TTGGGACTCC CGCAGACACA GGTCACGGCA CTGTQGTGTT GGAATTGCAG TACACTGGCA CGGATGGACC TTGCAAAGTT CCTATCTCGT CAGTGGCTTC AACCCTGAGG GCGTCTGTGT CCAGTGCCGT GACACCACAA CCTTAACGTC ATGTGACCGT GCCTACCTGG AACGTTTCAA GGATAGAGCA GTCACCGAAG
• L N D LTPV GRL V T V N P F V SVA TAB А К V L I E L EPP 2001 ATTGAACGAC CTAACGCCAG TGGGCAGATT GGTCACTGTC AftCCCTTTTG TTTCAGTGGC CACGGCCAAC GCTAAGGTCC TGATTGAATT GGAACCACCC TAACTTGCTG GATK5CGGTC ACCCGTCTAA CCAGTGACAG TTGGGAAAAC AAAGTCACCG GTGCCGGTTG CGATTCCAQG ACTAACTTAA CCTTCGTGGG
FGDS Y I V VGR G E Q Q ТИН HHH KSGS SIG К A 7 TTTL 2101 TTTGGAGACT CATACATAGT GGTGGGCAGA GGAGAACAAC AGATCAATCA CCACTGGCAC AAGTCTGGAA GCAGCATTGG CAAAGCCTTT ACAACCACCC AAACCTCTGA GTATGTATCA CCACCCGTCT CCTC1TGTTG TCTAGTTAGT GGTGACCGTG TTCAGACCTT CGTCGTAACC GTTTCGGAAA TOTTGGTGGG
• KGA QRL A A L G DTA WDF GSVG GVF TSV GKAV H Q V 2201 TCAAAGGA3C GCAGAGACTA GCCGCTCTAG GAGACACAGC TTGGGACTTT GGATCAGTTG GAGGGGTGTT САССТСАСГТ GGGAAGGCTG TCCATCAAGT AGTTTCCTCG CGTCTCTGAT CGGCGAGATC CTCTGTGTCG AACCCTOAAA CCTAGTCAAC CTCCCCACAA GTGGAGTCAA CCCTTCCGAC AGGTAGTTCA
- F G G ft. F E S L F G G M ? W I T Q G L L GAL L L W M GIN A R D 2301 GTrCGGAGGA GCATTCCGCT CACTGTTOGG AGGCATGTCC TGGATAACGC AAGGATTGCT GGGGGCTCTC CTGTTGTGGA TGGGCATCAA TGCTCGTGAC CAAGCCTCCT CGTAAGGCGA GTGACAAGCC TCCGTACAGG ACCTATTGCG TTCCTAACGA CCCCCGAGAG GACAACACCT ACCCGTAGTT ACHAGCACTG
deleted MSI
RSIA LTF LAV GGVL LFL SVH VHAD TGI HRG PATR 2401 ACJGTCCATAQ CTCTCACGTT TCTCGCAGTT GGAGGAGTTC TGCTCTTCCT CTCCGTGAAC GTGCACGCTG ACACTGGGAT CCACCGTGQA CCTGCCACTC TCCAGGTATC QftQAGTGCAA AGAGCGTCAA CCTCCTCAAG ACGAGAAGGA OAGGCACTTG CACOTGCGAC TGTGACCCTA OGTGGCACCT GQACGGTGAG
deleted HE1
-TTT ESQ KLlT D W С CRS CTLP PLR Y Q T DSGC W Y G
25 01 ОСАОСЛСCftC W3AGAGCGGA AAQTTGATAA. CAGATTGGTG CTGCAKSAGC TGCACCTTAC CACCACTGCG СГАССАААСТ OACAGCGGCT GTTGGTATGG
CGTGGTGGTG TCTCTCQCCT TTCAACTATT GTCTAACCAC GACGTCCTCQ ACGTGGAATG GTGGTGACGC GATGGTTTGA CTGTCGCCGA CAACCftTACC
deleted N51
US 2 A
¦ M E I R P Q К H D В К T L V Q S G V H A YNA DNID PFQ LGL
2601 TATGGAGATC AGACCACAGA GACATGATGA AAAGACCCTC GTGCAGTCAC AftGTGAATGC TTATAATGCT GATATGATTG ACCCTTTTCA GTTGGGCCTT ATACCTCTAG TCTGGTGTCT CTGTACTACT TTTCTGGGAG CACGTCAGTG TTCACTTACG AATATTACGA CTATACTAAC TGGGAAAAGT CAACCCGGAA
Приложение 4
PIV-WNV(AprME)/RSV-F (SEQ ID NO: 70-72)
С protein
5* UTR
M 5
1 AGTASTTCGC CTGTGTGAGC TGACAAACTT AGTAGTGTTT GTGAGGATTA ACAACAATTA ACACAGTCCG AGCTGTTTCT TAGCACGAAG ATCTCGATGT TCATCAAGCG GACACACTCG ACTGrTTGAA TCATCACAAA CACTCCTAAT TGTTGTTAAT TGTGTCACGC TOGACAAAGA ATCGTGCrTC TAGAGCTACA
С proteiD
¦ К К P GGf GKSR ATI L L К RGMP RVL SLI GLKR А К L 101 CTAAGAAACC AGGAGGGCCC GGCAAGAGCC GGGCTGTCTA TTTGCTAAAA OGCGGAA1GC CCCGCGTGTT GTCCTTGATT GGACTTAAGA GGGCTATGTT GATTCTTTSG TCCTCCCGGG CCGTTCTOGG CCCGACAGAT AAACGATTTT GCGCCTTACG GGGCGCACAA CAGGAACTAA CCTGAATTCT CCCGATACAA
С protein
¦SLI DGRG PIP F V L ALLS FFR FTA IAPT SAV LDR 201 GAGOCTCATC GACGGCAAGG GGCCAATACG ATTTGTGTTG GCTCTCTTGG CGTTCTTCAG GTTCACAGCA ATTGCTCOGA CCCGAGCAGT GCTGGATCGA CTCGGACTAG CTGCCGTTCC CCGGTTATGC ТАДАСАСААС CGAGAGAACC GCAAGAAGTC CAAGTGTCGT TAACGAGGCT GGGCTCGTCA CGACCTAGCT
SS3 cleavage
С protein
WRGV NKQ ТАИ KHLL SFK KEL GTLT SA1 HRR SSKQ 301 TGGAGAGGTG TGAACABACA AACAGCGATG AAACACCTTC TGAGTTTCAA GAAOGAACTA GOQACCTTGA CCAGTGCTAT CAATCGGCOG AGCTCAAAGC ACCTCTCCAC ACTTGTTTCT TTGTCGCTAC TTTGTGGAAG ACTCAAAGTT CTTCCTTGAT CCCTGGAACT GGTCACGATA GTTAGCCGCC TOGAGTTTCG
F signal
MS3 cleavage Fl
KKR ? G В LLIL КАЫ AIT TILT A V T F С F А Э G Q HIT 401 AAAAGAAGCG AGOGGGCGAG TTGCTAATCC TCAAA3CAAA TGCAATTACC АСДАТССТСА CTGCAGTCAC ATTTTGTTTT GCTTCTGGTC AAAACATCAC
TTTTCnCGc TCCCCCGCTC AACGATTAGG AGTTTOGTTT ACGTTAATGG TGTTAGGAGT GACGTCAGTG TAAAACAAAA CGAAOACCAG TTTTGTAGTG
¦ E E F YQST CSA V S К GYLS ALR T G W Y Г S V 1 Г I ELS 501 TGAAGAATTT TATCAATCAA CATGCAGTCC AGTTAGCAAA GGCTATCTTA GTGCTCTGAG AACTGGTTGG TATACCAGTC TTATAACTAT AGAATTAAGT ACTTCTTAAA ATAGTTAGTT GTACGTCACG TCAATCGITT CCGATAGAAT CACGAGACTC TTSACCAACC ATATGGTCAC AATATTGATA TCTTAATTCA
NliCE К С N G T DAKV ? L I К Q ? L D К Y К N A VTE LOLL
€01 AATATCAAGG AAAATAAGTG TAATGGAACA GATGCTAAGG TAAAATTGAT AAAACAAGAA TTAGATAAAT ATAAAAATGC TGTAACAGAA TTGCAGTTGC TTATAGTTCC TTTTATTCAC ATTACCTTCT CTACGATTCC All'T'lAACTA TTTTGTTCTT AATCTATTTA TATTTTTACG ACATTGTCTT AACGTCAACG
- HQS TPP TKHR A R R ELP RFMH If T L H"A KKTB VTL 701 TCATGCAAAG CACACCACCA ACAAACAATC GAGCCAGAAG AQAACTACCA AGGTTTATGA ATTATACACT CAACAATGCC AAAAAAACCA ATGTAACATT AGTACGTTTC GTGTBGTGGT TGTTTGTTAG CTCGGTCTTC TCTTGATGGT TCCAAATACT TAATATGTGA GTTGTTACGG TTTTTTTGGT TACATTGTAA Fl
¦ Б К К ft К R R FLG FLL GVGS A I A SGV AVSK VLH LEG 801 AAGCAAGAAA AGGAAAAGAA GATTTCTTGG TTTTTTGTTA GGTGTTGGAT CTGCAATCGC CAGTGGCGTT GCTGTATCTA AGGTCCTGCA CCTAGAAGGG TTOGTTCTTT TCCTTTTCTT CTAAAGAACC AAAAAACAAT CCACAACCTA GACGTTAGCG GTCACCGCAA CGACATAGAT TCCAGGACGT GGATCTTCCC
В V Я К IKS ALL STHX AVV SLS NGVS VLT S К V LDLK 901 GAAGTGAACA AGATCAAAAG TGCTCTACTA TCCACAAACA AGGCTGTAGT CAGCTTATCA AATGGAGTTA GTGTCTTAAC CAGCAAAGTG TTAGACCTCA CTTCACTTGT TCTAGTTTTC ACGAGATGAT AQGTGTTTST TCCGACATCA GTCGAATAGT TTACCTCAAT CACAGAATTG GTCGTTTCAC AATCTGGAGT
¦ KYI DKQ LLPI V N К QSC SISN IET VIE FQQK N H R
1001 AAAACTATAT AGATAAACAA TTGTTACCTA TTGTGAACAA GCAAAGCTGC AGCATATCAA ATATAGAAAC TGTSATAGAG TTCCAACAAA AGAACAACAG
TTTTGATATA TCTATTTCTT AACAATGGAT AACACTT6TT CGTTTCGACG TCGTATAGTT TATATCTTTG ACACTATCTC AAGGTTCTTT TCTTGTTGTC
•LLE ITRE FSV HAG VTTP VST Y M L TKSE LLS LIT) HOI ACTACTAGAG ATTACCAGGG AATTTAGTGT TAATGCAGGT GTAACTACAC CTGTAAGCAC TTACATGTTA ACTAATAGTG AATTATTGTC ATTAATCAAT TGATGATCTC TAATGGTCCC TTAAATCACA ATTACGTCCA CATTGATGTG GACATTOGTG AATGTACAAT TGATTATCAC TTAATAACAG TAATTAQTTA
DMPI TWD QKK LMSH NVQ IVR QQSY SIM SII KEEV 1201 GATATGCCTA TAACAAATGA TCAGAAAAAG TTAATGTCCA ACAATGTTCA AATAGTTAGA CAGCAAAGTT ACTCTATCAT GTCCATAATA AAAGAGGAAG CTATACGGAT ATTGTTTACT AGTCTTTTTC AATTACAGGT TGTTACAAGT TTATCAATCT GTCGTTTCAA TGAGATAGTA CAGGTATTAT TTTCTCCTTC
¦ LAY VVQ LPLY GVI DTP CWKL HTS PLC TTKT KEG
1301 TCTTAGCATA T3TAGTACAA TTACOACTAT ATGGTGTTAT AGATACACCC TGTTGGAAAC TACAGACATC CCCTCTATGT ACAACCAACA CAAAAGAAGG
AGAATCGTAT ACATCATGTT AATGGTGATA ТАССДСААТА TCTATGTGGG ACAACCTTTG ATGTGTGTAG GOGAGATACA TGTTGGTTGT GTTTTCTTCC
¦SHI CLTR TOR GWY CDMA GSV SFF PQAE TCK VQS 1101 GTCCAACATC TGTTTAACAA GAACTGACAG AGGATGGTAC TGTGACAATG CAGGATCAGT ATCTTTCTTC CCACAAGCTG AAACATGTAA AGTTCAATCA CAGGTTGTAG ACAAATTGTT CTTGACTGTC TCCTACCATG ACACK3TTAC GTCCTAGTCA TAGAAAGAAG GGTGTTCGAC TTTGTACATT TCAAGTTAGT
NRVF CDT MRS LTLP SEI BLC HVDI FMP KYD CKIM
1S01 AATCGAGTAT TTTG'TGACAC AATGAACAGT TTAACATTAC CAAGTGAAAT AAATCTCTGC AATGTTGACA TATTCAACCC CAAATATGAT TGTAAAATTA
TTAGCTCATA AAACACTGTG TTACTTGTCA AATTGTAATG ОТГСАСТТТА TTTAGAGACG TTACAACTGT ATAAGTTGGG GTTTATACTA ACATTTTAAT
¦ TSK TDV $ S S V ITS LGA IVSC YGK.TKC TASK KMR' 1601 TGACTTCAAA AACAGAIGTA AGCAGCTCCG TTATCACATC TCTAGGAGCC ATTGTGTCA.T GCTATGGCAA AACTAAATGT ACASCATCCA ATAAAAATCG ACTGAAGrrT TTGTCTACAT TCGTCGAGGC AATAGTGTAG AGATCCTCGG TAACACAGTA CGATACCGTT TTGATTTACA TGTCGTAGGT TATTTTTAGC
•Gil RTFS NGC D Y V SMKG HOT VSV GKTL YYV Ы К Q П01 TGGAATCATA AAGACATTTT CTAAOGGGTG CGATTATGTA TCAAATAAAG GGATGGACAC TGTGTCTGTA GGTAACACAT TATATTATGT AAATAAGCAA АССТТАЙТАТ TTCTGTAAAA GATTGCCCAC GCTAATACAT AGTTTATTTC CCTACCTGTG ACACAGACAT CCATTGTGTA АТАТДАТАСА TTTATTCGTT
EGKS L У V KGE PIIN FYD PLV FPSD EFD ASI SQVH 1S01 GAAGGTAAAA GTCTCTATGT AAAAGGTGAA CCAATAATAA ATTTCTATGA CCCATTAGTA TTCCCCTCTG ATGAATTTGA TGCATCAATA TCTCAAGTCA
СГТССАТТТТ CAGAGATACA ТТТТССЛСТТ GGTTATTATT TAAASATACT GGGTAATCAT AAGGGGAGAC TACTTAAACT ACGTAGTTAT AGAGTTCAGT
ТН Domain
- E К I NQS L А Г I F-K5 D g I, " L fl N V NAG К 5 T THIM ITT ACGAGAAGAT TAACCAGAGC CTAGCATTTA TTCGTAAATC OGATGAATTA TTACATAATG TAAATGCTSG tAAATCCACC ACAAATATCA TGATAACTAC TGCTCTTCTA ATTGGTCTCG GATCGTAAAT AAGCATTTAC; GCTACTTAAT AATGTATTAC ATTTAGGACC ATTTAGGT9G TGTTTATAGT ACTATTGATG TM Domain
Cytoplasmic Tail
pre E/fiSi signal
domain of KNV E {split)
- Cytoplasmic Tail
QLSG TVS IAF SHNF DLL KLA GDVE ЈNP GPA RDF.S CAACTGAGTG GTATAAATAA TATTGCATTT AGTAACAATT TTGATCTGCT CAAACTTGCA GGCGATSTAG AATCAAATCC TGGACCCGCC CGGGACAGGT GTTGACTCAC CATATTTATT ATAACGTAAA TC^TTGTTAA AACTAGACGA GTTTGAACGT CCGCTACATC TTAGTTTAGG ACCTGGGCGG GCCCTGTCCA
ТгалernemiDrane domain of WHV E (split)
• I A L TFL AVGG V L 1> FLS VHVK ADT OCA IDIS ft Q CCATAGCTCT САсеГтТСТС GCAGTTGGAG GAGTTCTGCT OTCCTCTCC GTGAACGTGC ACGCTGACAC TGCGTGTGCC ATAGACATCA GCCGGCAA GGTATCQAGA GTCCAAAGAG CGTCAACCTC CTCAAGAOGA GAAGGAGAGG CACTTGCACG TGCGACTGTG ACCCACACGG TATCTGTAGT CGGCCGTT
PtV-WNV(ACprME)"SV-F (SEQ ID NOS: 73-75)
deleted С protein
1 AGTAGTTCGC CTGTSTGAGC ТвАЕАААСТТ AGTAGTSTTT GTGAGGATTA ACAACAATTA ACRCAGTGCG. ASCTfiTTTCT TASCACSAAG ATCTCGATGT TCATCAAGCG OACACAqTCG ACTGTTTSAA ТСАТСАСДАА CACTCCTAAT TGTTGTTAAT TGTGTCACGC TCGACAAAGA ATCGTGCTTC TAGAGCTACA
deleted С protein
US3 cleavage
- К К P GGP G К S R A V N MLK RGMP R V L SLI GLKQ К К R -
101 CTAAGAAACC AGGAGGGCCC GGCAAGAGCC GGGCTGTCAA TATGCTAAAA CGCGGAATGC CCCGCGTGTT GTCCTTGATT GGACTTAAGC AAAAGAAGCG GATTCTTTGG TCCTCCCGGG CCGTTCTCGG CCCGACAGTT ATACGATTTT GCGCCTTACG GGGCGCACAA CAGGAACTAA CCTGAATTCG TTTTCTTCGC P signal
HS3 cleavage Fl
- G G ? LLIL RAH AIT TILT AVT FCF A5GC; HIT EEF AGGGGGCGAG TTGCTAATCC TCAAAGCAAA TGCAATTACC ACAATCCTCA CTGCAGTCAC ATTTTGTTTT GCTTCTGGTC AAAACATCAC TGAAGAATTT TCCCCCGCTC AACGATTAGG AGTTTCGTTT ACGTTAATGG TGTTAGGAGT GACGTCAGTG TAAAACAAAA CGAAGACCAG TTTTGTAGTG ACTTCTTAAA
YOST CSA V S К GYLS A L R T G И YTSV ITI ELS HIKE TATCAATCAA CATGCAGTGC ASTTAGCAAA GGCTATCTTA GTGCTCTGAG AACTGGTTGG TATACCAGTG TTATAACTAT AGAATTAAGT AATATCAAGG ATAGTTASTT GTACGTCACG TCAATCGTTT CCGATAGAAT CACGAGACTC TTCACCAACC ATATGGTCAC AATATTGATA TCTTAATTCA TTATAGTTCC
¦ HKC HGT DAKV К L I KQE LDKY X N A V TE LQLL MQ3 AAAATAAGTG TAATGGAACA GATGCTAAGG TAAAATTGAT AAAACAAGAA TTAGATAAAT ATAAAAATGC TGTAACAGAA TTGCAGTTGC TCATGCAAAG TTTTATTCAC ATTACCTTGT CTACGATTCC ATTTTAACTA TTTTGTTCTT AATCTATTTA TATTTTTACG ACATTGTCTT AACGTCAACG AGTACGTTTC
CACACCACCA ACAAACAATC GAGCCAGAAG AGAACTACCA AGGTTTATGA ATTATACACT CAACAATGCC AAAAAAACCA ATGTAACATT AAGCAAGAAA GTGTGGTGGT TGTTTGTTAG CTOGGTCTTC TCTTGATGGT ТССАДАТАСТ TAATATGTGA GTTGTTACGG TTTTTTTGGT TACATTGTAA TTCGTTCTTT Fl
RKRR FLG FLL GVGS A I A SGV AVSK VLH LEG EVHK AGGAAAAGAA GATTTCTTGG TTTTTTGTTA GGTQTTGGAT CTGCAATCGC CAGTGGCGTT GCTGTATCTA AGGTCCTGCA CCTAGAAGGG GAAGTGAACA TCCTTTTCTT CTAAAGAACC AAAAAACAAT CCACAACCTA GACGTTAGCG GTCACCGCAA OGACATAGAT TCCAGGACGT GGATCTTCCC CTTCACTTGT
¦ IKS ALL STHK AVV S L S Ы G V S VLT SKV LDLK N Y I ¦ AGATCAAAAG TGCTCTACTA TCCACAAACA AGGCTGTAGT CAGCTTATCA AATGGAGTTA GTGTCTTAAC CAGCAAAGTG TTAGACCTCA AAAACTATAT TCTAGTTTTC ACGAGATGAT AGGTGTTTGT TCCGACATCA GTCGAATAGT TTACCTCAAT CACAGAATTG GTCGTTTCAC AATCTGGAGT TTTTGATATA
- D К Q LLPI VNK QSC S I 5 H IET VIE FQQK HNR LLE AGATAAACAB. TTGTTACCTA TTGTGAACAA GCAAAGCTGC AGCATATCAA ATATAGAAAC TGTGATAGAG TTCCAACAAA AGAACAACAG ACTACTAGAG TCTATTTCTT AACAATGGAT AACACTTGTT CGTTTCGACG TCGTATAGTT TATATCTTTG ACACTATCTC AAGGTTGTTT TCTTGTTGTC TGATGATCTC
ITRE FSV NAG VTTP VST У M L THSE LLS LIS DMPI ATTACCAGGG AATTTAGTGT TAATGCAGGT GTAACTACAC CTGTAAGCAC TTACATGTTA ACTAATAGTG AATTATTGTC ATTAATCAAT GATATGCCTA TAATGGTCCC TTAAATCACA ATTACGTCCA CATTGATGTG GACATTCGTG AATGTACAAT TGATTATCAC TTAATAACAG TAATTAGTTA CTATACGGAT
T M D QKK LMSH N V Q I V R OQSY SIM SII К E E V LAY-TAACAAATGA TCAGAAAAAG TTAATGTCCA ACAATGTTCA AATAGTTAGA CAGCAAAGTT ACTCTATCAT GTCCATAATA AAAGAGGAAG TCTTAGCATA ATTGTTTACT AGTCTTTTTC AATTACAGGT TGTTACAAGT ТТАТСДАТСГ GTCGTTTCAA TGAGATAGTA CAGGTATTAT TTTCTCCTTC AGAATCGTAT
L P
H T S
L С
T T M
1101 TGTAGTACAA TTACCACTA.T ATGGTGTrAT AGATACACCC TGTTGGAAAC TACACACATC CCCTCTATGT ACAACCAACA CAAAAGAAGG GTCCAftCATC ACATCATGTT AATGGTGATA TACCACAATA TCTATGTGGG ACAACCTTTG ATGTGTGTAG GGGAGATACA TGTTGGTTGT GTTTTCTTCC CAGGTTGTAG
CLTR T D R GMY CDMA GSV SFF PQAE TCK VQS N R V F 12 01 TGTTTAACAA GAACTGACAG AGGATGGTAC TGTGACAATG CAGGATCAGT АТСТТТСТТС CCACAAGCTG AAACATGTAA AGTTCAATCA AATCGAGTAT ACAAATTGTT CTTGACTGTC TCCTACCATG ACACTGTTAC GTCCTAGTCA TAGAAAGAAG GGTGTTCGAC TTTGTACATT TCAAGTTAGT TTAGCTCATA
- CDT MHS LTLP SEI N L С HVDI F M P KYD CKIM T S К -1301 TTTGTGACAC AATGAACAGT TTAACATTAC CAAGTGAAAT AAATCTCTGC AATGTTGACA TATTCAACCC CAAATATGAT TGTAAAATTA TGACTTCAAA AAACACTGTG TTACTTGTCA AATTGTAATG GTTCACTTTA TTTAGAGACG TTACAACTGT ATAAGTTGGG GTTTATACTA АСАТТГТААТ ACTGAAGTTT
¦TDV SSSV ITS LGA IVSC YGK TKC TASM KHR G I I 1401 AACAGATGTA AGCAGCTCCG TTATCACATC TCTAGGAGCC ATTGTGTCAT GCTATOGCAA AACTAAATGT ACAGCATCCA ATAAAAATCG TGGAATCATA
TTGTCTACAT TCGTCGAGGC AATAGTGTAG AGATCCTCGG TAACACAGTA CGATACCGTT TTGATTTACA TGTCGTAGGT TATTTTTAGC ACCTTAGTAT
KTFS NGC D ? V SNKG M D T VSV GUTL YYV Ы К Q E G К S
X501 AAGACATTTT CTAACGGGTG CGATTATGTA TCAAATAAAG GGATGGACAC TGTGTCTGTA GGTAACACAT TATATTATGT AAATAAGCAA GAAGGTAAAA TTCTGTAAAA GATTGCCCAC GCTAATACAT AGTTTATTTC CCTACCTGTG ACACAGACAT CCATTGTGTA ATATAATACA TTTATTCGTT CTTCCATTTT
¦ L.YV KGE P I I И FYD FLV FPSD EFD AST SQVfi E R I -
1601 GTCTCTATGT AAAAGGTGAA CCAATAATAA ATTTCTATGA CCCATTAGTA TTCCCCTCTG ATGAATTTGA TGCATCAATA TCTCAAGTCA ACGAGAAGAT
CAGAGATACA TTTTCCACTT GGTTATTATT TAAAGATACT GGGTAATCAT AAGGGGAGAC TACTTAAACT ACGTAGTTAT AGAGTTCAQT TGCTCTTCTA
Til Domain
-HQS LAFI RKS DEL L H N V HAG К S T TNIM ITT III TAACCAGAGC CTAGCATTTA TTCGTAftATC CGATGAATTA TTACATAATG TAAATGCTGG ГАААТССАСС ACAAATATCA TGATAACTAC TATAATTATA
ATTGGTCTCG GATCQTAAAT AAGCATTTAG GCTACTTAAT AATGTATTAC ATTTACGACC ATTTAGGTGG TGTTTATAGT ACTATTGATG ATATTAATAT
ТМ Domain
Cytoplasmic Tail
Vliv ILL SLI AVGL L L Y СКА RSTP VTL SKD QLSG
GTGATTATAG TAATATTGTT ATCATTAATT GCTGTTGGAC TGCTCTTATA CTGTAAGGCC AGAAGCACAC CAGTCACACT AAGCAAAGAT CAACTGAGTG
CACTAATATC АТТАТААСАА TAGTAATTAA CGACAACCTG ACGAGAATAT GACATTCCGG TCTTCGTGTG GTCAGTGTGA TTCGTTTCTA GTTGACTCAC
FMDV 2A
Cytoplasmic Tail
membrane domain of WUv ? Isplic) pre E/NSI signal
• INN I A F S N N F PLL KLA G D V E SfifP G P A ROBS IAL GTATAAATAA TATTGCATTT AGTAACAATT TTGATCTGCT CAAACTTGCA GGCGATGTAG AATCAAATCC TGGACCCGCC CGGGACAGGT CCATAGCTCT CATATTTATT ATAACGTAAA TCATTGTTAA AACTAGACGA GTTTGAACGT CCGCTACATC TTAGTTTAGG ACCTGGGCGG GCCCTGTCCA GGTATCGAGA Transmembrane domain of WHV E (split)
HS1
•TFL A V G G V L L FLS V N V H ADT GCA IDIS RQE LR
CACGTTTCTC GCAGTTGGAG GAGTTCTGCT CTTCCTCTCC GTGAADGTGC ACGCTGACAC TGGGTGTGCC ATAGACATCA GCCGGCAAGA GCTGAGA
GTGCAAAGAG CCTCAACCTC CTCAAGACGA GLAAGGAGAGG CACTTGCACG TGCGACTGTG ACCCACftOGG TATCTGTAGT DGBCCGTTCT CGACTCT
PiV-WNV(AC)/RSV-F (SEQ ID NOS: 76-78)
1 GATCCTAATA CGACTCACTA TAGAGTAETT CGCCT3TGTG AGCTGACAAA CTTAGTAGTG TTTGTGAGGA TTAACAACAA TTAACACAGT GCGAGCTGTT CTSOSAIXAT GCTGAGTOAT ATCTCATCAft GOGGACACAC TOSACTGTTT GAATCATCAC AAACACTCCT AATTGTTGTT AATTGTGTCA CGCTCGACAA
N-cerrninus of С
M SKK F G G PGKS R A V N M L KRGK P St V LSI.
TCTTAGCACG AAGATCTCGA TGTCTAAGAA ACCAGGAGGG CCCGGCAAGA GCCGGGCTGT CAATATGCTA AAACGOGGAA TGCCCCGCGI вИв1ССГИ5
AGAATCGTGC TTCTAGAGCT ACASATTCTT TGGTCCTCCC GGGCCGTTCT CGGCCCGACA GTTATACGAT TTTGCGCCTT ACGGOGCGCA CAACAGGAAC
H-terminus of С p signal
HS3 cleavage
IGLfc QKK RGG ELLI LKA N A I TTIL TAV TFC FASG ATTGGACTTA AGGAAAAGAA GCGAGGGGGC GAGTTGCTAA TCCTCAAAGC AAATGCAATT ACCACAATCC TCACTGCAGT CACATTTTGT TTTGCTTCTG TAACCreAAT TCGTTTTCTT CGCTCCCCCG CTCAACGATT AGGAGITTCG TTTACGTTAA TGGTCTTAGG AGTGACGTCA GTCTAAAACA AAACGAAGAC
¦ QUI TEE FY <}S TCS AVS KGYL SAL RTG H Y T S VIT GTCAAAACAT CACTGAAGAA TTTTATCAAT CAAEATGCAG TSCAGTTAGC AAAGGCTATC TTAGTGCTCT GAaAACTGST TGGTATACCA GTETTATAAC CAGTTTTGTA GTGACTTCTT AAAATAGTTA GTTGTACGTC ACGTCAATCG TTTCCGATAG AATCACOAGA CTCTTGACCA ACCATATGGT CACAATATTG
E L
SHI
E К
А К
К L
TATAGAATTA AGTAATATCA AGGAAAATAA GTGTAATGGA ACAGATGCTA AGGTAAAATT GATAAAACAA GAATTAGATA AATATAAAAA TCCTGTAACA ATATCTTAAT TCATTATAGT ТССГТТТАТТ CACATTAGCT TQTCTACGAT ТССАТПТАА CTATTTTGTT CTTAATCTAT ттаТАТТТТТ ACGACATK3T
BLQL LMQ STP PTMB RAH REL PRPM BYT LHM ARKT GAATTGCAGT TGCTCATGCA AAGCACACCA CCAACAAACA ATCGAGCCAG AAGAGMCTA CCAAGGTTTA TGAATTATAC ACTCAACAAT GCCAAAAAAA CTTAACGTCA ACGAGTACGT TTCGTOTGGT GGTTGTTTGT TAGCTO3GTC TTCTCTTGAT GGTTCCAAAT ACTTAATATG TGAGTTGTTA CGGTTTTTTT
- HVT LSK IRKS RFL GFL LGVG SAI ASG VAVS К V L
CCAATGTAAC ATTAAGCAAG AAAAQGAAAA QAAGATTTCC TTAGGTGTTG GATCTGCAAT OGCCAGTGGC GTTGCTGTAT CTAAGGTCCT
QGTTACATTG TAATTCGTTC TTTTCCTTTT CTTCTAAAGA ACCAAAAAAC ААГССАСААС CTAQACGTTA GCGGTCACCG CAACGACATA GATTCCAGGA
-HLE GEVH К I К SAL LSTK KAV VSL SNGV SVL TSK GCACCTAGAA GGGGAAGTGA ACAAGATCAA AAQTGCTCTA CTATCCACAA ACAAGGCTGT AGTCAGCTTA TCAAATGGAG TTAGTGTCTT AACCAGCAAA CGTGGATCTT ССССТГСАСТ TGTTCTAGTT TTCACGAGAT GAIAGGTGTI TGTTCCGACA TCAGTCGAAT AGTTTACCTC AATCACAGAA TIGGTCGTTT
к H
SOI GTGTTAGfi.CC TCAAAAACTA TATAGATAAA CAATfGTTAC CTATTGTGAA CAAGCAAAGC TGCAGCATAT CAAATATAGA AACTGTGATA GAGTTCCAAC CACAATCTGG AGTTTTTGAT ATATCTATTT GTTAACAATG GATAACACTT GTTCGTTTCG ACGTCGTATA GTTTATATCT TTGACACTAT CTCAAGGTTG
¦ К Я N R L L EITH EFE VMA GVTT P V S T Y M LTMS ELL 901 AAAAGAACAA CAGACTACTA GAGATTACCA GGGAATTTAG TGTTAATGCA GGTGTAACTA CACCTGTAAG CACTTACATG TTAACTAATA GTGAATTATT TTTTCTTGTT GTCTGATGAT CTCTAATGGT CCCTTAAATC ACAATTACGT CCACATTGAT GTGGACATTC GTGAATGTAC AATTGATTAT CACTTAATAA
-SLI WDMF 1ТЫ D Q it KLMS Ы И V Q I V RQQ5 Y S I MSI 1001 GTCATTAATC AATGATATGC CTATAACAAA TGATCAGAAA AAGTTAATGT CCAACAATGT TCAAATAGTT AGACAGCAAA GTTACTCTAT CATGTCCATA CAGTAATTAG TTACTATACG CATATTGTTT ACTAGTCTTT TTCAATTACA GGTTGTTACA AGTTTATCAb TCTGTCGTTT CAATGAGATA GTACAGGTAT
IKEE V L A YVV QLPL У G V IDT PCWK. LHT SPL СТТЯ 1101 ATAAAAGAGG AAGTCTTAGC ATATGTAGTA CAATTACCAC TATATGGTGT TATAGATACA CCCTGTTGGA AACTACACAC ATCCCCTCTA TGTACAACCA TATTTTCTCC TTCAGAATCG TATACATCAT GTTAATGGTG ATATACCACA ATATCTATGT GGGACAACCT TTGATGTGTG TAGGGGAGAT ACATGTTGGT
• TKE G S H ICLT К. T D ROW Y С С Ы AGS V S F FPQA ETC 1201 ACACAAAAGA AGGGTCCAAC ATCTGTTTAA CAAGAACTGA CAGAGGATGG TACTGTGACA ATGCAGGATC AGTATCTTTC TTCCCACAAG CTGAAACATG
TGTGTTTTCT TCCCAGGTTG TAGACAAATT GTTCTTGACT GTCTCCTACC ATGACACTGT TACGTCCTAG TCATAGAAAG AAGGGTGTTC GACTTTGTAC
• К V Q SHRV FCD ТМЫ SLTL PSE I Ы L CHVD IFH PKY 1301 TAAAGTTCAA TCAAATCGAG TATTTTGTGA CACAATGAAC AGTTTAACAT TACCAAGTGA AATAAATCTC TGCAATGTTG ACATATTCAA CCCCAAATAT
ATTTCAAGTT AGTTTAGCTC ATAAAACACT GTGTTACTTG TCAAATTGTA ATGGTTCACT TTATTTAGAG ACGTTACAAC TGTATAAGTT GGGGTTTATA
DCKI И T S KTD VSSS V I T SLG A I V S CYG КТК CTAS 1401 GATTGTAAAA TTATGACTTC AAAAACAGAT GTAAGCAGCT CCGTTATCAC ATCTCTAGGA GCCATTGTGT CATGCTATGG CAAAACTAAA TGTACAGCAT CTAACATTTT AATACTGAAG TTTTTGTCTA CATTCGTCGA GGCAATAGTG TAGAGATCCT CGGTAACACA GTACGATACC GTTTTGATTT ACATGTCGTA
¦ К К H- R G I IKTF EWG С D Y V S N К GMD TVS V О N T L Y Y 1S01 ССААТАДААА TCGTGGAATC ATAAAGACAT TTTCTAACGG GTGCGATTAT GTATCAAATA AAGGGATGGA CACTGTGTCT GTAGGTAACA CATTATATTA
GGTTATTTTT AGCACCTTAG TATTTCTQTA AAAGATTGCC CACGCTAATA CATAGTTTAT TTCCCTACCT GTGACACAGA CATCCATTGT GTAATATAAT
• V H К QEGK SLY V К G BPlI HFY D P L V F P S DBF D ft S 1601 TGTAAATAAG CAAGAAGGTA AAAGTCTCTA TGTAAAAGGT GAACCAATAA ТААДТТТСТА TGACCCATTA GTATTCCCCT CTGATGAATT TGATQCATCA ACATTTATTC GTTCTTCCAT TTTCAGAGAT ACATTTTCCA CTTGGTTATT ATTTAAAGAT ACTGGGTAAT CATAAGGGGA GACTACTTAA ACTACGTAGT
TH Domain
ISQV NEK I N Q SLAP IRK SDE LLHN VNA GKS T T N I • 1701 ATATCTCAAG TCAACGAGAA GATTAACCAG AGCCTAGCAT TTATTOGTAA ATCCGATGAA ТТАТТАСАТА ATGTAAATGC TGGTAAATCC ACCACAAATA
TATAGAQTTC A#TTGCTCTT CTAATTGGTC TCGGATCGTA AATAAGCATT TAGGCTACTT AATAATGTAT TACATTTACG ACCATTTAGG TGGTGTTTAT
TM Domain
Cytoplasmic Tail
H IT Til IVII VIL LS L IAVG LLL Y С fc ARST P V T
1801 TCATGATAAC TACTATAATT ATAGTGATTA TAGTAATATT GTTATCATTA ATTGCTGTTG GACTGCTCTT ATACTGTAAG GCCAGAAGCA CACCAGTCAC ASTACTATTG ATCATATTAA TATCACTAAT ATCATTATAA CAATAGTAAT TAACGACAAC CTGACGAGAA TATGACATTC CGGTCTTCGT GTGGTCAGTG
FMDV 2A
Cytoplasmic Tail
¦ L S К D Q L S GIN N I A FSBH FPL LKL A G D V ESB PGP 1901 ACTAAGCAAA GATCAACTGA GTGGTATAAA TAATATTGCA TTTAGTAACA ATTTTGATCT GCTCAAACTT GCAGOCGATG TAGAATCAAA TCCTGGACCC TGATTCGTTT CTAGTTGACT CACCATATTT АТТАТААОЗТ AAATCATTGT TAAAACTAGA CGAGTTTOAA CGTCCGCTAC ATCTTAGTTT AGGACCTGGG
prM
C/prM signal
GGKT G I A V M I GLIA CVG AVT LSNF Q G К VMM TVMA
2001 GGAGGAAAGA CCGGTATTGC AGTCATGATT GGCCTGATCG CCTGCGTAGG AGCAGTTACC CTCTCTAACT TCCAAGGGAA GGTGATGATG ACGGTAAATG
CCTCCTTTCT GGCCATAACG TCAGTACTAA CCGGACTAGC GGACGCATCC TCGTCAATGG GAGAGATTGA AGG-TTCCCTT CCACTACTAC TGCCATTTAC
prM
¦ T D V T D V ITIP T A A G К И LCIV RAM DVG Y M С D DTI 2101 CTACTGACGT CACAGATGTC ATCACGATTC CAACAGCTGC TGGAAAGAAC CTATOCATTG TCAGAGCAAT GGATGTGGGA TACATGTGCG ATGATACTAT GATGACTGCA GTGTCTACAG TAGTGCTAAG GTTGTCGACG ACCTTTCTTG GATACGTAAC AGTCTCGTTA CCTACACCCT ATGTACACGC TACTATGATA
prM
• T Y E С P V L SAG HDP SDID СИС TKS AVYV RYG ЕСТ 2201 CACTTATGAA TGCCCAGTGC TGTCGGCTGG TAATGATCCA GAAGACATCG ACTGTTGGTG CACAAAGTCA GCAGTCTACG TCAGGTATGG AAGATGCACC GTGAATACTT ACGGGTCACG ACAGCCGACC ATTACTAGGT CTTCTGTAGC TGACAACCAC GTGTTTCAGT CGTCAGATGC AGTCCATACC TTCTACGTGG
prM
KTRH SRR SRR S LTV QTH GES TLAH KKG AWM DSTK 2301 AAGACACecC ACTCAAGACG CAGTCGGAGG TCACTGACAG TGCAGACACA CGGAGAAAGC ACTCTAGCGA ACAAGAAGGG GGCTTGGATG GACAGCACCA TTCTGTGCGG TGAGTTCTGC GTCAGCCTCC AGTGACTGTC ACGTCTGTGT OCCTCTTTCG TGAGATCGCT TGTTCTTCCC CCGAACCTAC CTGTCGTGGT
prM
¦ ATR YLV KTES MIL RHP GYAL V A A VIG WMLG SHT 2401 AGGCCACAAG GTATTTGGTA AAAACAGAAT CATGGATCTT GAGGAACCCT GGATATGCCC TGGTGGCAGC CGTCATTGGT TGGATGCTTG GGAGCAACAC TCCGGTGTTC CATAAACCAT TTTTGTCTTA GTACCTAGAA CTCCTTGGGA CCTATACGGG ACCACCGTCG GCAGTAACCA ACCTACGAAC CCTCGTTGTG
prM
. M Q Я VVFV V* L L L L V A P А У SPN CLG MSNR DPI BGV 2501 CATGCACAGA GTTGTGTTTG TCCTSCTMT GCTTTTGGTG GCCCCAGCTT ACAGCTTTAA CTGCCTTGGA A3GAGCAACA GAGACTTCTT GGAAGGAGTG GTACGTCTCT CAACACAAAC AGCACGATAA CGAAAACCAC OGGGGTCGAA TGTCGAAATT GACQGAACCT TACTOGTTGT CTCTGAAGAA CCTTCCTCAC
ргИ
SCAT WVD IVL EGDS CVT IMS KDKP TID V К M ИНИЕ 2601 TCTGGAGCAA CATGGGTGGA TTTQGTTCTC GAAGGCGACA GCTGCGTGAC TATCATGTCT AAGGACAAGC CTACCATCGA TOTGAAGATC AT3AATATGG AGACCTCGTT GTACCCACCT AAACCAAGAG CTTCOGCTGT CGACGCACTG ATAGTACAGA TTCCTGTTCG GATGGTAGCT ACACTTCTAC TACTTATACC
• А А К LAE VRSY CYL A T V SDLS TKA ACP A H G E A H N 2701 AGGCGGCCAA CCTGGCAGAG GTCOGCAGTT ATTGCTATTT GGCTACCGTC AGCGATCTCT CCACCAAAGC TGCGTGCCCG GCCATGGGAG AAGCTCACAA TCCGCCGGTT GGACCGTCTC CAGGCGTCAA TASCGATAAA CCGATGGCAG TCGCTAGAGA GGTGGTTTCG ACGCACGGOC CGGTACCCTC TTCGAGTGTT
• D К R A D P A F V С R Q G VVDR G W G ft G С G L F G KGS IDT 2801 TGACAAACGT QCTGACCCAG CTTTTGTGTG CAGACAAGGA GTGGTGGACA GGGGCTGGGG CAACGGCTGC GGACTATTTG GCAAAGGAAG CATTGACACA ACreTTTGCA CGACTGGGTC GAAAACACAC GTCTGTTCCT CACCACCTGT CCCCCACCCC GTTGCCGACG CCTGATAAAC CGTTTCCTTC GTAACTGTGT
С А К F ACS T X A I Q R T ILK EHI К Y E V AIF VHG PTTV 2901 TGCGCCAAAT TTGCCTGCTC TACCAAGGCA ATAGGAAGAA CCATTTTGAA AGAGAATATC AAGTACGAAG TGGCCATTTT TOTCCATGGA CCAACTACTG ACGCGGTTTA AACGGACGAG ATGGTTCCGT TATCCTTCTT GGTAAAACTT TCTCTTATAG TTCATGCTTC ACCQGTAAAA ACAGGTACCT GGTTGATGAC
ESH G N Y STQ.V GAT QAG RFSI TPA APS Y T L К LGE 3001 TGGAGTCGCA CGGAAACTAC TCCACACAGG TTGGAGCCAC TCAGGCAGGG AGATTCAGCA TCACTCCTGC GGCGCCTTCA TACACACTAA AGCTTGGAGA ACCTCAGCGT GCCTTTGATG AGGTGTGTCC AACCTCGGTG AGTCCGTCCC TCTAAGTCGT AGTGAGGACG CCGCGGAAGT ATGTGTGATT TCGAACCTCT
¦ Y G E V T V В CEP RSG 1DTH AYY VHT VGTK TFL VHR 3101 ATATGGAGAG GTGACAGTGG ACTGTGAACC ACGGTCAGGG ATTGACACCA ATOCATACTA CGTGATGACT GTTGGAACAA AGACGTTCTT GGTCCATCGT TATACCTCTC CACT3TCACC TGACACTTGG TGCCAGTCCC TAACTGTGGT TACGTATGAT GCACTACTGA CAACCTTGTT TCTGCAAGAA CCAGGTAGCA
EWFM D L " 1 P W SSAG STV W S N RETL МЕР ВЕР HATK 3201 GAGTGGTTCA TGGACCTCAA CCTCCCTTGG AGCAGTGCTG GAAGTACTGT GTGGAGGAAC AGAGAGACGT TAATGGAGTT TGAGGAAOCA CACGCCACGA CTCACCAAGT ACCTOGAGTT GGAGGGAACC TCGTCACGAC CTTCATGACA CACCTCCTTG TCTCTCTGCA ATTACCTCAA ACTCCTTGGT GTGCGGTGCT
¦QSV I A L GS(JE OAL H О A LAGA IPV EPS SNTV KLT 330 2 AGCAGTCTGT GATAGCSTTG GGCTCACAAC AGGGAGCTCT GCATCAAGCT TTGGCTGGAG CCATTCCTGT GGAATTTTCA AGCAACACTG TCAAGTTGAC TCGTCAGACA CTATCGTAAC CCGAGTGTTC TCCCTCGAGA CGTAGTTCGA AACCGACCTC GGTAAGGACA CCTTAAAAGT TCGTTGTGAC AGTTCAACTG
¦SGH LKCR V К M EKL QLKG T T Y GVC SKAF KFL GTP 3401, GTCGGGTCAT TTGAAGTGTA GAGTGAAGAT GGAAAAATTG CAGTTGAAGG GAACAACCTA TGGCGTCTGT TCAAAGGCTT TCAAGTTTCT TGGGACTCCC CAGCCCAGTA AACTTCACAT CTCACTTCTA ССТГТТТААС GTCAACTTCC CTTGTTGGAT ACCGCAGACA AGTTTCCGAA AGTTCAAAGA ACCCTGAGGG
ADTG HGT VVL ELQY TGT DGP CKVP ISS VAS L Ы D L 3501 GCA3ACACAG GTCACGGCAC TGTGGTGTTG GAATTGCAGT ACACTGGCAC GGATGGACCT TGCAAAGTTC CTATCTCGTC AGTGGCTTCA TTGAACGACC CGTCTGP3TC CAGTGCCX3TG ACACCACAAC CTTAACGTCA TOTGACCGXG CCTACCTGGA ACGTTTCAAfi GATAlGAGCAlC TCACCGAAGT AACTTGCTGG
• TPV GRL V T V N PFV SVA TANA KVL IEL EPPF GDS 3601 TAACGCCAGT GGGCAGATTG GTCACTGTCA ACCCTTTTGT TTCAGTGGCC ACGGCCAACG CTAAGGTCCT GATTGAATTG OAACCACCCT TTGGAGACTC ATTGCGGTCA CCOGTCTAAC CAGTGACAGT TGGGAAAACA AAGTCACCGG TGCCGGTTGC GATTCCAGGA CTAACTTAAC CTTGGTGGGA AACCTCTGAG
¦YIV VGRG SQQ I N H В W H К SGS SIG KAFT TTL KGA 3 701 ATACATAGTC GTGGGCAGAG GAGAACAACA GATCAATCAC CACTGGCACA AGTCTGGAAG CAGCATTGGC AAAGCCTTTA CAACCACCCT CAAAGGAGCG TATGTATCAC CACCCGTCTC CTCTTGTTGT CTAGTTAGTG GTGACCGTGT TCAGACCTTC GTCGTAACCG TTTCGGAAAT GTTGGTGGGA GTTTCCTCGC
QRLA ALG D T A WDFG SVG GVF TSVG К A V HQV F G О A 3 601 CAGAGACTAG CCGCTCTAGG AGACACAGCT TGGGACTTTG GATCAGTTGG AGGGGTGTTC ACCTCAGTTG GGAAGGCTGT CCATCAAGTG TTCGGAGGAG GTCTCTGATC GGCGAGATCC TCTGTGTCGA ACCCTGAAAC CTAGTCAACC TCCCCACAAG TGGAGTCAAC CCTTCCGACA GGTAGTTCAC AAGCCTCCTC
• FRS LFG GMSH ITQ GLL GALL LWM GIW ARDR SIA 3 501 CATTCCGCTC ACTGTTCGGA GGCATGTCCT GGATAACGCA AGGATTGCTG GGGGCTCTCC TGTTGTGGAT QGGCATCAAT GCTCGTGACA GGTCCATAGC GTAAGGCGAG TGACAAGCCT CCGTACAGGA CCTATTGCGT TCCTAACGAC CCCCGAGAGG ACAACACCTA CCCGTAGTTA CGAGCACTGT CCAGGTATCG
NS1
-LTF LAVG GVL LFL SVWV HAD TGC AIDI SRQ ELR 4 001 TCTCACGTTT CTCGCAGTTG GAGGAGTTCT GCTCTTCCTC TCCGTGAACG TGCACGCTGA CACTGGGTGT GCCATAGACA TCAGCCGGCA AGAGCTGAGA AGAGTGCAAA GAGCGTCAAC CTCCTCAAGA CGAGAAGGAG AGGCACTTGC ACGTGCGACT GTGACCCACA CGGTATCTGT AGTCGGCCGT TCTCGACTCT
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус с геномом флавивируса, который включает (i) одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков, выбранных из группы, состоящей из капсидного белка С, предшественника мембранного белка (prM), оболочечного или капсульного белка (Е), неструктурного белка 1 (NS1), неструктурного белка 3 (NS3) и неструктурного белка 5 (NS5), и (ii) последовательность, которая кодирует один или большее число иммуногенов вируса бешенства.
2. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят внутри последовательностей капсидного белка С генома флавивируса.
3. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят в последовательностях предшественника мембранного белка (prM) и/или оболочечного белка (Е) генома флавивируса.
4. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят в последовательностях капсидного белка (С), предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) генома флавивируса.
5. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанные одна или большее число делеций или мутаций происходят в последовательностях неструктурного белка 1 (NS1) генома флавивируса.
6. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.1, в котором указанный им-муноген вируса бешенства включает иммуноген - белок G вируса бешенства или иммуногенный фрагмент этого белка.
7. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-6, в котором указанный геном флавивируса включает последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка (prM) и/или оболочечный белок (Е).
8. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому пп.1-7, в котором геном флавивируса выбран из генома вируса жёлтой лихорадки, вируса лихорадки Западного Нила, вируса клещевого энцефалита, вируса Лангат, вируса японского энцефалита, вируса лихорадки денге, последовательностей вируса энцефалита Сент-Луиса, а также химер этих вирусов.
9. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.8, в котором указанная химера включает последовательности предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) первого флавивируса, а также последовательности капсидного (С) и неструктурных белков второго флави-вируса, отличающегося от первого.
10. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.9, в котором указанный первый флавивирус представляет собой вирус клещевого энцефалита или вирус Лангат.
11. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.9 или 10, в котором указанный второй флавивирус, отличающийся от первого, представляет собой вирус жёлтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила или вирус Лангат.
12. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-11, в котором указанный геном упакован в частицу, включающую последовательности предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) флавивируса, который является тем же самым или отличается от вируса генома.
13. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-12, в котором последовательности, кодирующие указанный иммуноген вируса бешенства, вставляют вместо одной или большего числа делеций или мутаций одного или большего числа белков или сочетаются в геноме с такими мутациями или делециями.
14. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-13, в котором последовательности, кодирующие указанный иммуноген вируса бешенства, вставляют в геном флавиви-руса в последовательности, кодирующие оболочечный белок (Е), в последовательности, кодирующие неструктурный белок 1 (NS1), в последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка (prM), межгенно между последовательностями, кодирующими оболочечный белок (Е) и неструктурный белок 1 (NS1), межгенно между последовательностями, кодирующими неструктурный белок 2В (NS2B) и неструктурный белок 3 (NS3), или в качестве бицистронной инсерции в нетранслируемой 3'-области генома флавивируса.
15. Композиция, включающая первый репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавиви-рус по пп.1-14 и второй репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус, отличающийся от первого, с геномом, включающим одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков, выбранных из группы, состоящей из капсид-ного белка С, предшественника мембранного белка (prM), оболочечного или капсульного белка (Е), неструктурного белка 1 (NS1), неструктурного белка 3 (NS3) и неструктурного белка 5 (NS5), причем один
10.
или большее число белков, кодируемых последовательностями, в которых произошла одна или большее число мутаций или делеций во втором репликационно-дефектном псевдоинфекционном флавивирусе, отличающемся от первого, отличаются от одного или большего числа белков, кодируемых последовательностями, в которых произошла одна или большее число делеций или мутаций в первом репликаци-онно-дефектном псевдоинфекционном флавивирусе.
16. Способ индукции иммунного ответа на иммуноген вируса бешенства со стороны субъекта, включающий введение субъекту одного или большего числа репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов по любому из пп.1-14 и/или композиции по п.15.
17. Способ по п.16, в котором субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной вирусом бешенства.
18. Способ по п.16, в котором субъект имеет инфекцию, вызванную вирусом бешенства.
19. Применение репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14 или композиции по п.15 для индукции иммунного ответа на белок, закодированный в геноме флави-вируса, в дополнение к источнику иммуногена.
20. Применение по п.19, в котором субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, включающего последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и/или оболочечный белок флави-вируса.
21. Применение по п.19, в котором субъект имеет инфекцию, вызванную флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, включающего последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и/или оболочечный белок флавивируса.
22. Фармацевтическая композиция, включающая псевдоинфекционный флавивирус по любому из пп.1-14 или композицию по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
23. Фармацевтическая композиция по п.22, дополнительно включающая адъювант.
24. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14.
25. Способ получения репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса по любому из пп.1-14, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты по п.24 в клетку, которая экспресси-рует белок, соответствующий любым последовательностям, удалённым из генома репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса.
26. Способ по п.25, в котором белок экспрессируется в клетке из генома второго репликационно-дефектного флавивируса, отличающегося от первого вируса.
27. Способ по п.25, в котором белок экспрессируется из репликона.
28. Способ по п.27, в котором репликон представляет собой репликон альфа-вируса.
29. Способ по п.28, в котором альфа-вирус представляет собой вирус венесуэльского лошадиного энцефалита.
30. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус с геномом флавивируса, включающим одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков, выбранных из группы, состоящей из капсидного белка С, предшественника мембранного белка (prM), оболочечного или капсульного белка (Е), неструктурного белка 1 (NS1), неструктурного белка 3 (NS3) и неструктурного белка 5 (NS5), причем геном флавивируса содержит последовательности вируса лихорадки Западного Нила, в которых последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и последовательности, кодирующие сигнальную последовательность между капсидным белком и предшественником мембранного белка генома флавивируса, содержат последовательности, кодирующие сигнальную последовательность белков капсида/предшественника мембранного белка вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, или его вариант.
31. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.30, в котором последовательности, кодирующие предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса лихорадки Западного Нила замещены последовательностями, кодирующими предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита.
32. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.30 или 31, дополнительно содержащий транскрибируемый капсидный белок.
33. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.32, в котором капсидный белок представляет собой капсидный белок вируса лихорадки Западного Нила.
34. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.32, в котором капсидный белок продуцируется в упаковывающей линии клеток.
35. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.32, в котором капсидный белок закодирован в геноме второго флавивируса, содержащего одну или большее число делеций или мутаций.
36. Репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус по п.30 или 31, в котором указан-
ный вирус клещевого энцефалита представляет собой штамм Hypr.
Принцип однокомпонентного псевдоинфекционного вируса (ПИВ) (о-ПИВ; одиночный цикл репликации in vivo)
С (ген нуклеокапсидного белка) ргМ (ген предшественника мембранного белка) Е (ген капсульного белка) NS (гены неструктурных белков)
Принцип двухкомпонентного псевдоинфекционного вируса (ПИВ) (д-ПИВ; ограниченное распространение in vivo)
Иммуногенность/эффективность: общий принцип дизайна эксперимента (на мышах) Дизайн эксперимента на мышах
ПИВ-ЛЗН (псевдоинфекционный вирус лихорадки Западного Нила) индуцирует однотипные реакции гуморального иммунитета у мышей
ПИВ-ЖЛ (псевдоинфекционный вирус жёлтой лихорадки) и ПИВ-ЛЗН (псевдоинфекционный вирус лихорадки Западного Нила) предотвращают виремию и заболеваемость хомяков после инфицирования вирусом
Средняя масса тела после
Виремиа после ннфиинрования
Вирусы ЖЛ/КЭ (жёлтой лихорадки/клещевого энцефалита)
Конструкции ПИВ-ВЛЗН/КЭ (псевдоинфекционных вирусов ¦ лихорадки Западного Нила/клещевого энцефалита)
вирусов
Гены ргМ-Е (предшественника мембранного белка и капсульного белка)
Титр вируса Р0 log,* БОЕ/ml
Титр Р1
log10 БОЁ/mi
Окрашивание с использованием иммунной метки - мышиной гипериммунной асцитической жидкости к сс-весенне-летнему энцефалиту
С-хелперы СргМЕ-хелперы
С-хелперы СргМЕ-хелперы
Штамм Нург (сигнал ВКЭ -вируса клещевого энцефалита) <р39)
7,2 6,7
6,9 77,1
Штамм Нург (сигнал ВЛЗН - вируса лихорадки Западного Нила) (р40)
6,7 6,0
5,9 66,9
Фиг. 7
Кинетика репликации живого вируса жёлтой лихорадки/клещевого энцефалита и репликационно-дефективного варианта ПИВ-ВЛЗН/КЭ (псевдоинфекционных вирусов - вирусов лихорадки Западного Нила/клещевого энцефалита) в клеточных субстратах
Выживаемость мышей после внутрикожного инфицирования ПИВ-КЭ (псевдоинфекционным вирусом клещевого энцефалита) и конструкциями ВЖХ/КЭ (вируса жёлтой лихорадки/клещевого энцефалита) в тесте нейровирулентности (мыши линии ICR в возрасте 3,5 недели)
Выживаемость мышей после внутрибрюшинного инфицирования ПИВ-КЭ
(псевдоинфекционным вирусом клещевого энцефалита) и конструкциями ВЖХ/КЭ (вируса жёлтой лихорадки/клещевого энцефалита) в тесте нейроинвазивности (мыши линии ICR в возрасте 3,5 недели)
4 6
Дни после инфицирования
Выживаемость после внутрибрюшинного инфицирования 5log1(
Заболеваемость после инфицирования вирусом клещевого энцефалита (КЭ) за 9 дней после инфицирования
Заболеваемость после инфицирования, группы ЖЛ/Нург нлн лихорадки Ляигат
Примеры конструкций псевдоинфекционного вируса, экспрессирующего чужеродные антигены (G-белок вируса бешенства)
С (ген нуклеокапсидного белка)
Эффективная экспрессия RABG на плазматической мембране клеток культуры Vero Содержание частиц инфицирования (ЧИ) 0,1,2 дня после инфицирования, образец фиксирован в 4% параформальдегиде (ПФА), мембраны клеток непроницаемы
Делеция Делеция Делеция
ДС-бешенство G ДРгМ-Е-бешенство G ДС-РгМ-Е-бешенство G
Антитела 1АЬ (фирма Abeam) к вирусу бешенства, 1:5000, 2-3 часа при комнатной температуре, антитела 2АЬ (фирма Abeam) - антимышиные IgG, 1:1000, 1 час при комнатной температуре Увеличение в 40 раз, выдержка 40 мс
Фиг. 15
Распространение ПИВ-бешенства G в клетках-хелперах, отсутствие распространения в обычных клетках
Аналогично экспрессировался VSV G, распространения в обычных клетках не отмечалось (клетки линий VER, ВНК), и инфекционного материала в супернатантах не было.
С (ген нуклеокапсидногО белка) ргМ (ген предшественника мембранного белка) Е (ген капсульного белка) NS (гены неструктурных белков)
Стабильность гена белка G вируса бешенства в векторах ПИВ-ЛЗН Пассажи в клетках-хелперах BHK-C-prM-E, Mol 0,1; титрование в клетках линии Vero методом окрашивания с использованием иммунной метки
Сравнение распространения одно- и двухкомпонентных вариантов
ПИВ-бешенства в клетках культуры Vero
Одна вакцина RV-WN (ДргМЕ )/RabG Вакцина RV-WN (ДргМЕ )/RabG + вакцина RV-WN
Пример экспрессии полномерного белка F РСВ (респираторно-синтициального вируса) (штамм А2): окрашивание с использованием иммунной метки клеток-хелперов после трансфекции
Контрольные клетки-хелперы почек детёнышей ПИВ-ВЛЗН ДргМЕ - F респираторно-
хомяков (ВЛЗН С-ргМ-Е) синтициального вируса (РСВ), 3 дня после
Клетки, окрашенные с помощью моноклональных антител к F РСВ, ДАФИ
трансфекции
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023888
023888
- 1 -
- 1 -
023888
023888
- 1 -
- 1 -
023888
023888
- 4 -
- 3 -
023888
023888
- 25 -
023888
Таблица 1
023888
- 29 -
- 28 -
023888
Таблица 1
023888
- 29 -
- 28 -
023888
Таблица 1
023888
- 29 -
- 30 -
023888
023888
- 31 -
- 31 -
023888
Таблица 8
023888
Таблица 8
- 32 -
- 32 -
023888
Таблица 9
023888
Таблица 9
- 33 -
- 33 -
023888
023888
- 34 -
- 34 -
023888
023888
- 35 -
- 35 -
023888
023888
- 36 -
- 36 -
023888
023888
- 40 -
- 40 -
023888
023888
- 41 -
- 41 -
023888
023888
- 56 -
- 56 -
023888
023888
- 56 -
- 56 -
023888
023888
- 59 -
- 59 -
023888
023888
- 59 -
- 59 -
023888
023888
- 60 -
- 60 -
023888
023888
- 119 -
- 119 -
023888
023888
- 120 -
- 120 -
023888
023888
- 123 -
- 123 -
023888
023888
- 123 -
- 123 -
023888
023888
- 132 -
- 132 -
023888
023888
- 132 -
- 132 -
023888
023888
- 135 -
- 135 -
023888
023888
- 146 -
- 146 -
023888
023888
- 148 -
- 148 -
023888
023888
- 148 -
- 148 -
023888
023888
- 150 -
- 150 -
023888
023888
- 150 -
- 150 -
023888
023888
- 150 -
- 150 -
023888
023888
- 150 -
- 150 -
023888
023888
- 152 -
- 152 -
023888
023888
- 155 -
- 155 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 156 -
- 156 -
023888
023888
- 162 -
- 162 -
023888
023888
- 163 -
- 163 -
023888
023888
- 164 -
- 164 -
023888
023888
- 165 -
- 165 -
023888
023888
- 165 -
- 165 -
023888
023888
- 166 -
- 166 -
023888
023888
- 168 -
- 168 -
023888
023888
- 169 -
- 169 -
023888
023888
- 170 -
- 170 -