EA 023886B1 20160729

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000023886b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Аналог глюканоподобного пептида 2 (GLP-2), представленный общей формулой II где R ¹ представляет собой водород, C _1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; Х2 представляет собой Gly, Ala или Sar; Х3 представляет собой Glu или Asp; Х5 представляет собой Ser или Thr; Х6 представляет собой Phe или Pro; Х7 представляет собой Ser или Thr; Х8 представляет собой Asp или Ser; Х9 представляет собой Glu или Asp; X10 представляет собой Met, Leu, Nle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту; X11 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr; X12 представляет собой Thr или Lys; X13 представляет собой Ile, Glu или Gln; Х14 представляет собой Leu, Met или Nle; X15 представляет собой Asp или Glu; X16 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr; X17 представляет собой Leu или Glu; X18 представляет собой Ala или Aib; X19 представляет собой Ala или Thr; Х20 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr; Х21 представляет собой Asp или Ile; Х24 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr; Х28 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr; Х31 представляет собой Pro, Ile или делетирована; Х32 представляет собой Thr или делетирована; Х33 представляет собой Asp, Asn или делетирована; R ² представляет собой NH ₂ или ОН; Z ¹ и Z ² независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 1-10 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met и Orn; или фармацевтически приемлемая соль или его производное.

2. Аналог GLP-2 по п.1, где аналог GLP-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности GLP-2 дикого типа (1-33), и обладает биологической активностью, вызывающей увеличение массы кишечника in vivo.

3. Аналог GLP-2 по п.1 или 2, где аналог GLP-2 также включает одно или более замещение в сравнении с GLP-2(1-33) дикого типа в позициях Х3, Х5, Х7 и/или Х10.

4. Аналог GLP-2 по п.1, где указанные замещения в позиции X10 представляют собой Leu, NIe или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту, такую как Met(O) или Met(O) ₂ .

5. Аналог GLP-2, представленный общей формулой III где R ¹ представляет собой водород, С _1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; Х8 представляет собой Asp или Ser, предпочтительно Asp; X11 представляет собой Ser или Ala; X15 представляет собой Glu или Asp, предпочтительно Glu; X16 представляет собой Ser или Ala; Х20 представляет собой Ser или Ala; Х24 представляет собой Ser или Ala; Х28 представляет собой Ser или Ala; или его фармацевтически приемлемая соль или его производное.

6. Аналог GLP-2 по п.1, который представляет собой

7. Аналог GLP-2 по любому из пп.1-5, где аналог GLP-2 обладает способностью увеличивать рост тканей в тонком кишечнике по сравнению с толстой кишкой.

8. Аналог GLP-2 по п.7, где каждый из X11 и X16 независимо выбран из Ala и Ser и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala, Ser, Gly или Thr.

9. Аналог GLP-2 по п.8, где X11 и Х16 оба Ala и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala, Ser, Gly или Thr.

10. Аналог GLP-2 по п.8, где X11 и Х16 оба Ala и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala и Ser.

11. Аналог GLP-2 по п.7, включающий одну из следующих комбинаций остатков в позициях X11, Х16, Х20, Х24 и Х28:

12. Аналог GLP-2 по п.7, представляющий собой

13. Аналог GLP-2 по любому из предшествующих пунктов, где интервалы потенциального образования водородных связей (НВР) для отдельных позиций 11, 16, 20, 24 и 28 для аналогов GLP-2 составляют независимо 0 ≤ HBP _{11, 16, 20, 24, 28} ≤ 2.

14. Аналог GLP-2 по п.13, где интервал НВР для позиций 11 и 16 НВР _{11, 16} =0, а для позиций 20, 24 и 28 интервал НВР независимо составляет 0 ₅ ≤ НВР _{20, 24, 28} ≤ 2.

15. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая химиотерапевтические препараты и включающая аналог GLP-2 по любому из предшествующих пунктов или его соль в смеси с носителем.

16. Фармацевтическая композиция для лечения рака по п.15, где аналог GLP-2 представляет собой фармацевтически приемлемую аддитивную соль кислоты.

17. Фармацевтическая композиция для лечения рака по п.15 или 16, представляющая собой жидкость, подходящую для введения посредством инъекции или инфузии, или депосостав.

18. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника.

19. Применение по п.18, где заболевания желудка или кишечника представляют собой язвенные заболевания, синдром Золлингера-Эллисона, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.

20. Применение по п.18, где заболевания желудка или кишечника представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химиотерапевтических агентов.

21. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии.

22. Применение по п.21, где побочными эффектами химиотерапии являются диарея, абдоминальные спазмы, рвота или структурные и функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии.

23. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).

24. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики состояний, вызванных недостаточностью питания.

25. Применение по п.24, где состояния, вызванные недостаточностью питания, представляют собой кахексию или анорексию.

26. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аналог GLP-2 по любому из пп.1-14.

27. Вектор экспрессии, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по п.26 в комбинации с регуляторными последовательностями для управления его экспрессией.

28. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.27.

29. Способ получения аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, включающий культивирование клеток-хозяев по п.28 в условиях, подходящих для экспрессии аналога GLP-2, и выделение полученного таким образом аналога GLP-2.

30. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.26 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).

31. Применение вектора экспрессии по п.27 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).

32. Применение клетки-хозяина по п.28 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).

33. Способ лечения заболеваний желудка или кишечника у нуждающегося пациента введением эффективного количества аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулы нуклеиновой кислоты по п.26, вектора экспрессии по п.27 или клетки-хозяина по п.28.

34. Способ по п.33, где заболевания желудка или кишечника представляют собой язвенные заболевания, синдром Золлингера-Эллисона, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.

35. Способ по п.33, где заболевания желудка или кишечника представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты или повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химиотерапевтических агентов.

36. Способ лечения или предотвращения побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулы нуклеиновой кислоты по п.26, вектора экспрессии по п.27 или клетки-хозяина по п.28.

37. Способ по п.36, где побочными эффектами химиотерапии являются диарея, абдоминальные спазмы, рвота или структурные или функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии.

38. Способ лечения у новорожденных нарушений кишечной функции, ожирения, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV), у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулы нуклеиновой кислоты по п.26, вектора экспрессии по п.27 или клетки-хозяина по п.28.

39. Терапевтический набор, включающий лекарственный препарат для химиотерапии рака и аналог GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулу нуклеиновой кислоты по п.26, вектор экспрессии по п.27 или клетку-хозяина по п.28.

40. Терапевтический набор по п.39, где указанный лекарственный препарат для химиотерапии рака и аналог GLP-2, молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии или клетка-хозяин представлены, каждый, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

41. Фармацевтическая композиция, включающая лекарственный препарат для химиотерапии рака и молекулу нуклеиновой кислоты по п.26, вектор экспрессии по п.27 или клетку-хозяина по п.28 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

6. Аналог GLP-2 по п.1, который представляет собой

9. Аналог GLP-2 по п.8, где X11 и Х16 оба Ala и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala, Ser, Gly или Thr.

10. Аналог GLP-2 по п.8, где X11 и Х16 оба Ala и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala и Ser.

11. Аналог GLP-2 по п.7, включающий одну из следующих комбинаций остатков в позициях X11, Х16, Х20, Х24 и Х28:

12. Аналог GLP-2 по п.7, представляющий собой

28. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.27.

Евразийское 023886 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки
200900667
(22) Дата подачи заявки 2007.11.08
(51) Int. Cl. C07K14/605 (2006.01) A61K38/26 (2006.01)
(54) СЕЛЕКТИВНЫЕ АНАЛОГИ ГЛЮКАГОНПОДОБНОГО ПЕПТИДА-2 (GLP-2)
(31) PA 2006 01456; 60/859,313
(32) 2006.11.08; 2006.11.15
(33) DK; US
(43) 2010.06.30
(86) PCT/GB2007/004273
(87) WO 2008/056155 2008.05.15
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЗЕАЛАНД ФАРМА А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Ларсен Бьярн Дюе, Петерсен Иветт Миата (DK)
(74) Представитель:
Шилан К.А. (RU)
(56) US-A-5789379 WO-A-9739031
DACAMBRA M.P. ET AL.: "Structural determinants for activity of glucagon-like peptide-2", BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY EASTON, PA, US, vol. 39, no. 30, 1 August 2000 (2000-08-01), pages 8888-8894, XP002293748, ISSN: 0006-2960, cited in the application, abstract
WO-A-2006117565
(57) Описаны аналоги GLP-2, включающие одно или более замещение по сравнению с h[Gly2]GLP-2, обладающие свойством увеличивать селективно ткани тонкого/толстого кишечника и желудка/толстого кишечника. В частности, описанные здесь предпочтительные аналоги GLP-2 включают замещение в одной или более позициях (11, 16, 20, 24) и/или 28 последовательности дикого типа GLP-2, необязательно в комбинации с дополнительными замещениями в позиции 2 и в одной или более позициях (3, 5, 7) и (10) и/или делетирование одной или более аминокислоты с (31) по (33) и/или присоединение к N-концу или С-концу стабилизирующей пептидной последовательности. Аналоги, в частности, используют для профилактики или лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и для снижения побочных эффектов химиотерапии.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к селективным аналогам глюкагонподобного пептида-2 (GLP-2) и их медицинскому применению, например, в профилактике или лечении желудочно-кишечных заболеваний и для снижения побочных эффектов химиотерапии и/или лучевой терапии.
Уровень техники, предшествующий изобретению
GLP-2 представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот, вьщеляющийся в посттрансляционном процессинге проглюкагона в кишечных L энтероэндокринных клетках и определенных областях ствола головного мозга. Он секретируется совместно с глюкагоноподобным пептидом-1(GLP-1), оксин-томодулином и глицентином в ответ на прием нутриента.
GLP-2 индуцирует значительный рост эпителиальной ткани слизистой оболочки тонкого кишечника посредством стимуляции пролиферации стволовых клеток в криптах и ингибирования апоптоза на ворсинках (Drucker et al. Proc. Natl. Acad. Sel. Acad. Sci USA, 1996, 93:7911-6). GLP-2 также ингибирует эвакуацию из желудка и секрецию кислоты желудочного сока (Wojdemann et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999, 84:2513-7), усиливает функцию интестинального барьера (Benjamin et al. Gut. 2000, 47:112-9), стимулирует транспорт гексозы в кишечнике путем повышения регуляции переносчиков глюкозы (Cheese-man, Am J. Physiol. 1997, R1965-71) и увеличивает ток крови в кишечнике (Guan et al. Gastroenterology. 2003, 125, 136-47).
GLP-2 связывается с G-белок сопряженным рецептором, принадлежащим к классу II семейства глюкагона-секретина (1). Рецептор GLP-2 локализован только в тонком кишечнике, толстой кишке и желудке, участках, известных, как ответственные за GLP-2 (Yusta et al. Gastroenterology. 2000, 119:744-55). Однако остается неясным механизм стимуляции клетки-мишени рецептора GLP-2 в желудочно-кишечном тракте и плохо понятны внутриклеточные медиаторы прямого направления, сопряженные с рецептором GLP-2.
Демонстрация специфических и благоприятных эффектов GLP-2 в тонком кишечнике вызвала сильный интерес к использованию GLP-2 для лечения кишечных заболеваний или поражений (Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65). Кроме того, было выявлено на целом ряде преклинических моделей повреждений кишечника, включая энтериты, индуцированные химиотерапией повреждения, вызванные ишемией-реперфузией, колиты, вызванные сульфатом декстрана, и генетические модели воспалительных заболеваний кишечника, что GLP-2 предотвращает или снижает повреждения эпителиальных тканей слизистой (Sinclair and Drucker, Physiology 2005:357-65).
Кроме того, экспрессия м-РНК GLP-2R в желудке (Yusta et al., 2000) совместно с наблюдением, что GLP-2 снижает перистальтику желудка и секрецию желудочного сока (Meier et al., 2006), обеспечивает вполне достаточное доказательство того, что желудок прямо или косвенно ответственен за GLP-2. Тем не менее, применение GLP-2 или аналога GLP-2 в условиях, характеризующихся повреждением выстилки желудка, все еще не изучено.
GLP-2 секретируется, как пептид из 33 аминокислот с следующей последовательностью H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-He-Leu-Asp-
Asn-l^u-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Tф-I^u-Ilc-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH.
Инактивация человеческого GLP-2 (3-33) ферментом DPP IV происходит за счет быстрого отщепления у аланина в положении 2 NH2 группы. Эта быстрая ферментативная деградация GLP-2 (1-33) в дополнение к почечному клиренсу ведет к тому, что период полужизни для пептида составляет около 7 мин (Tavares et al., Am. J. Physyol. Endocrinol. Metab. 278:E134-E139, 2000).
В патенте США 5994500 (Drucker et al.) описываются антагонисты GLP-2 и их воздействие на рост тканей желудочно-кишечного тракта. Предполагалось, что антагонисты входят в состав фармацевтических препаратов, используемых для лечения гиперплазии или индуцирования гипоплазии. В патенте США 5994500 структура GLP-2 млекопитающих была изменена мутациями, такими как замещения и делеции.
В патентах США 6184208, 5789379 и 6184201 описываются аналоги GLP-2 и их медицинское применение. Все аналоги получены замещениями и/или делециями в человеческом GLP-2.
DaCambra et al. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894) описывают структурные детерминанты активности GLP-2. Примерами таких детерминант являются Phe6 и Thr5, которые отвечают за связывание и активацию рецептора GLP-2.
В WO 97/39031 описан аналог GLP-2 [Gly2]GLP-2, где аланин в позиции 2 был замещен глицином с получением пептида, устойчивого к расщеплению DPPIV. Замещение аланина приводит к росту стабильности и активности пептида. Патентная заявка описывает использование аналога GLP-2 при лечении заболеваний, связанных с воспалением и разрушением эпителия слизистой оболочки кишечника. Последние включают все виды резекции тонкого кишечника, воспалительные заболевания кишечника, му-козиты, вызванные химиотерапией, и повреждения, вызванные ишемией.
В WO 02/066511 описаны аналоги GLP-2, имеющие продленный период полужизни in vivo, и их применение в качестве лекарственных средств при лечении желудочно-кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника.
WO 01/41779 описывает использование h[Gly2]GLP-2 для профилактики ингибирования апоптоза, индуцированного химиотерапией, и стимуляции способности клеток к выживанию. Все цитированные здесь ссылки введены в полном объеме.
Многие ученые предлагали применение GLP-2 или аналогов GLP-2 для лечения различных заболеваний. Однако все еще существует потребность в улучшенных и стабильных аналогах GLP-2.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение, в частности, относится к аналогам GLP-2, которые включают одно или более замещение по сравнению с диким типом GLP-2 и которые обладают улучшенной биологической активностью in vivo и/или улучшенной химической стабильностью, например, определяемой пробой на стабильность in vitro. В частности, предпочтительные аналоги GLP-2 по настоящему изобретению включают неконсервативные замещения в одной или более позициях 8, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 20, 21, 24 и/или 28 последовательности GLP-2 дикого типа, необязательно в комбинации с дополнительными консервативными или не консервативными замещениями в позиции 2 (как указано во введении) и одной или более в позициях 3, 5, 7 и 10 и/или замещениями или делецией одной или более аминокислот, соответствующих позициям с 31 по 33 последовательности GLP-2 дикого типа, и необязательно дополнением N-конца или С-конца, стабилизирующим пептидную последовательность. Дополнительно аналоги GLP-2 по настоящему изобретению могут включать консервативные замещения одной или более аминокислот, соответствующих позициям 9, 14 и 15. Также и к аналогам, имеющим улучшенную химическую стабильность и/или биологическую активность, настоящее изобретение также относится к соединениям, обладающим способностью увеличивать рост тканей в тонком кишечнике по сравнению с толстой кишкой и, наоборот, в частности, включая модификацию одной или более позиций Asn 11, и/или Asn 16, и/или Arg20, и/или Asn24, и/или Gln28 последовательности GLP-2 дикого типа.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, представленному общей формулой I
R'-z'-His-xi-xs-Giy-xs-xe-xT-xs-x^xio-xii-x^-xn-xu-xis-xie-xn-
XI8 -XI9-Х20-Х21 -Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2S
где R1 представляет собой водород, С1-4алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или три-фторацетил;
Х2 представляет собой Gly, Ala или Sar; Х3 представляет собой Glu или Asp; Х5 представляет собой Ser или Thr;
Х6 представляет собой Phe или Pro или консервативное замещение; Х7 представляет собой Ser или Thr;
Х8 представляет собой Asp или Ser или консервативное замещение; Х9 представляет собой Glu или Asp или консервативное замещение;
X10 представляет собой Met, Leu, Nle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту; X11 представляет собой Y1;
X12 представляет собой Thr или Lys или консервативное замещение; X13 представляет собой Ile, Glu или Gln или консервативное замещение; X14 представляет собой Leu, Met или Nle или консервативное замещение; X15 представляет собой Asp или Glu или консервативное замещение; X16 представляет собой Y2;
X17 представляет собой Leu или Glu или консервативное замещение; X18 представляет собой Ala или Aib или консервативное замещение; X19 представляет собой Ala или Thr или консервативное замещение; Х20 представляет собой Y3;
Х21 представляет собой Asp или Ile или консервативное замещение;
Х24 представляет собой Y4;
Х28 представляет собой Y5;
Х31 представляет собой Pro, Ile или делетирована;
Х32 представляет собой Thr или делетирована;
Х33 представляет собой Asp, Asn или делетирована;
представляет собой NH2 или ОН; где Z1 и Z2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 1-10 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met и Orn; и гидропатический профиль (HPP) остатков X11, Х16, Х20, Х24, Х28 формулы I рассчитывают как
HPP = Ehpixi I + hpiX]6 + hpi Х20 + hpix24 + hpbas> -10,
где Y1, Y2, Y4 и Y5, каждый, могут быть выбраны из группы, состоящей из Asn, Asp, Glu, Gln, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met или Phe; и
Y3 может быть выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Glu, G1n, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met или Phe;
при условии, что когда Х20 представляет собой Arg, то X11 представляет собой Ser, X16 представляет собой Ala, X24 представляет собой Ala, X28 представляет собой Ala и Z2 представляет собой Lys,
или фармацевтически приемлемой соли или его производному.
В одном варианте воплощения настоящее изобретение включает аналог глюкагон-подобного пептида 2 (GLP-2), как описано выше, где НРР > -4.
В другом варианте воплощения настоящее изобретение включает аналог глюкагон-подобного пептида 2 (GLP-2), как описано выше, где НРР > 0.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, представленному общей формулой II
R'-Z'-His- Х2 -X3-Gly-X5- Х6 -Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-
Ala- Х19-Х20- Х21 -Phe-Ile-X24-Trp-Leu- Ile -X28-Thr-Lys-X31 -X32-X33-Z2-R2,
где R1 представляет собой водород, С1-4алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или три-фторацетил;
Х2 представляет собой Gly, Ala или Sar; Х3 представляет собой Glu или Asp; Х5 представляет собой Ser или Thr; Х6 представляет собой Phe или Pro; Х7 представляет собой Ser или Thr; Х8 представляет собой Asp или Ser; Х9 представляет собой Glu или Asp;
X10 представляет собой Met, Leu, Vle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту;
X11 представляет собой Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr или Val;
X12 представляет собой Thr или Lys;
X13 представляет собой Ile, Glu или Gln;
X14 представляет собой Leu, Met или Vle;
X15 представляет собой Asp или Glu;
X16 представляет собой Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr или Val; X17 представляет собой Leu или Glu; X18 представляет собой Ala или Aib; X19 представляет собой Ala или Thr;
Х20 представляет собой Asn, Arg, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr или Val; X21 представляет собой Asp или Ile;
X24 представляет собой Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr или Val; X28 представляет собой Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr или Val; X31 представляет собой Pro, Ile или делетирована; X32 представляет собой Thr или делетирована; Х33 представляет собой Asp, Asn или делетирована;
представляет собой NH2 или ОН;
Z1 и Z2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 1-10 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met и Orn;
или фармацевтически приемлемой соли или его производному.
При условии, что когда Х20 представляет собой Arg, то X11 представляет собой Ser, X16 представляет собой Ala, X24 представляет собой Ala, X28 представляет собой Ala и Z2 представляет собой Lys. В одном варианте настоящее изобретение включает аналог GLP-2, как описано выше, где X11 представляет собой Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr или Val; X16 представляет собой Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr или Val; X20 представляет собой Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr или Val; X24 представляет собой Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr или Val; X28 представляет собой Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr или Val.
В другом аспекте настоящее изобретение включает аналог GLP-2, как описано выше, где
X11 представляет собой Ala, Ile, Leu, Phe или Val;
X16 представляет собой Ala, Ile, Leu, Phe или Val;
Х20 представляет собой Ala, Ile, Leu, Phe или Val;
Х24 представляет собой Ala, Ile, Leu, Phe или Val;
Х28 представляет собой Ala, Ile, Leu, Phe или Val.
В другом варианте настоящее изобретение включает аналог GLP-2, как описано выше, где аналог GLP-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности GLP-2 дикого типа (1-33), и обладает биологической активностью, вызывающей увеличение
массы кишечника in vivo.
В другом варианте настоящее изобретение включает аналог GLP-2 с более чем одним замещением (т.е. имеет более чем одно замещение относительно последовательности дикового типа, приведенной выше) в позициях X11, X16, Х20, Х24 и/или Х28 и/или одно или более указанное замещение в комбинации с одним или более замещением в позициях Х3, Х5, Х7 и/или X10.
В другом варианте настоящее изобретение включает аналог GLP-2 с замещениями в позиции Х10, представляющей собой Leu, NIe, или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту, такую как Met(O) или Met(O)2. Следовательно, дополнительно или в качестве алтернативы к уже указанным замещениям аналог GLP-2 может иметь в позиции X10 Leu, NIe, или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту, такую как Met(O) или Met(O)2.
В других вариантах настоящего изобретения аналог GLP-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности GLP-2 дикого типа (1-33), приведенную в описании уровня техники, более предпочтительно по меньшей мере на 63% идентичную последовательности, более предпочтительно по меньшей мере на 66% идентичную последовательности и еще более предпочтительно по меньшей мере на 69% идентичную последовательности. "Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" в отношении полипептидных последовательностей GLP-2 определяется, как процентное соотношение аминокислотных остатков в испытуемой последовательности, идентичных аминокислотным остаткам последовательности GLP-2 дикого типа после выравнивания последовательностей и введения пробела, при необходимости, с достижением максимального процента идентичности последовательности, при этом какое-либо консервативное замещение не учитываются, как часть идентичности последовательности. Выравнивание последовательности может быть осуществлено специалистом в данной области техники с использованием технологий, хорошо известных из предшествующего уровня техники, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST2 или Align, см.:
Altschul et al. (Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996);
http://blast.wustl/ed u/blast/READM E, html) или Pearson et al. (Genomics, 46, 24, 36, 1997) и http://molbiol.soton.ac.uk/compute/aliqn.html для программы Align.
Процент идентичности последовательности, использованный здесь и в соответствии с настоящим изобретением, определен с использованием этих программ и их стандартных настроек. Как правило, специалист в данной области техники может легко определить подходящие параметры для определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания полной длины сравниваемых последовательностей.
В другом варианте настоящего изобретения аналог GLP-2, как описано выше, включает более чем одно замещение (т.е. имеет более чем одно замещение относительно последовательности дикового типа, приведенной выше) в позициях Х3, Х5, Х7, X11, X16, Х20, Х24, Х28, Х31, Х32 и/или Х33.
В другом варианте настоящего изобретения аналог GLP-2, как описано выше, включает одно или более замещение, выбранную из X11, X16, Х20, Х24, Х28, представляющую собой Ile, Ala, Leu, Phe или Val; и аминокислотные остатки в позициях Х31, Х32 и Х33 необязательно делетированы, или его фармацевтически приемлемую соль или его производное.
В другом варианте настоящего изобретения аналог GLP-2, как описано выше, включает замещение (т.е. имеет замещение относительно последовательности дикового типа, приведенной выше) в одной или
более из позиций X11, X16, Х20, Х24 и/или Х28.
В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения аналог GLP-2 или его фармацевтически приемлемая соль или его производное, как описано выше, приведены в табл. 1 или 2.
Rl-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-Xl 1-Thr- Ile -Leu-X15-X16-Leu-Ala-
Ala-X20-Asp-Phe- lie -X24-Trp-Leu- Ile -X28-Thr-Lys- Ile -Thr-Asp-NH2,
где R1 представляет собой водород, С1-4алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или три-фторацетил;
Х8 представляет собой Asp или Ser, предпочтительно Asp;
X11 представляет собой Ser, Ala, Glu, Lys или Asn;
X15 представляет собой Glu или Asp, предпочтительно Glu;
X16 представляет собой Ser, Ala или Glu;
Х20 представляет собой Ser, Ala или Glu;
Х24 представляет собой Ser, Ala или Glu; и
Х28 представляет собой Ser, Ala, Gln или Glu;
или его фармацевтически приемлемой соли или его производному.
Интересующие соединения по настоящему изобретению (формула I) описаны в следующей таблице, где указанные соединения могут быть модифицированы на N-конце, как описано для R1 в формуле III, и включают фармацевтически приемлемую соль или производное.
В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, представленному общей формулой III
ZP2263
His-Gly-Glu-Gly-Set-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-AIa-Зег-Азр-РЬе-Пе-Зег-Тф-Ьеи-Пе-Зег-ТЪг-Ьув-Пе-ТЬг-Азр^Н!
ZP2264
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2266
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-GIu-Leu-Glu-Thr-Ue-Leu-Glu-Glu-Leu-Ala-Ala-Glu-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Glu-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2267
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Glu -Asp-Phe-Ile- Ala -Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2268
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-lle-Ser^-Leu-I]e-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2269
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Lys-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2270
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-LeuN-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-lle-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2272
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-GIu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-lle-Ser-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
ZP2242
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala -Leu-Aia-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp- Lys- OH
Дополнительные соединения по настоящему изобретению показаны в табл. 1 ниже.
Настоящее изобретение относится к соединениям, которые обладают способностью преимущественно усиливать рост ткани тонкого кишечника по сравнению с тканями толстой кишки. В частности, описанные здесь эксперименты показывают, что определенные замещения в позициях X11, и/или X16, и/или Asn20, и/или Х24, и/или Х28 последовательности GLP-2 дикого типа обеспечивают при введении тестируемым животным преимущественно увеличение массы тонкого кишечника по сравнению с массой толстой кишки. Эти полученные результаты свидетельствуют о том, что эти соединения, приведенные в качестве примера, могут быть использованы для лечения состояний, когда преимуществом является эффект усиления роста тканей тонкого кишечника, в то время как рост тканей толстой кишки снижен или в условиях, когда ткани тонкого кишечника повреждены, а толстой кишки интактны.
Следовательно, соединения, являющиеся предпочтительными для роста тканей тонкого кишечника, как правило, включают одно или более замещение (т.е. относительно последовательности дикого типа, приведенной выше) в позициях 11, 16, 20, 24 и/или Х28 GLP-2 дикого типа. Такие соединения могут являться причиной селективного роста тканей тонкого кишечника по сравнению с тканями толстой кишки. Они могут быть использованы при состояниях, вызванных неблагоприятным воздействием, или в состояниях, относящихся к проблемам тонкого кишечника.
Предпочтительно такие соединения, оказывающие селективне воздействие на рост ткани тонкого кишечника, включают замещение (т.е. относительно последовательности дикого типа, приведенной выше) более чем в одной позиции X11, X16, Х20, Х24 и/или Х28. Таким образом, соединения, оказывающие селективное воздействие на рост ткани тонкого кишечника, могут включать более чем одно замещение X11, представляющий собой Ser, X16, представляющий собой Ala, X20, Х24, представляющий собой Ala, X28, представляющий собой Ala, X31, представляющий собой Ile, Х32, представляющий собой Thr, и Х33, представляющий собой Asp. Аминокислотные остатки в позициях Х31, Х32 и Х33 необязательно могут быть делетированы.
В соединениях, оказывающих селективное воздействие на рост ткани тонкого кишечника каждый из X11, X16, Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr. Например, каждый из X11 и X16 независимо может представлять собой Ala или Ser, и Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr.
Например, X11 и X16 может представлять собой Ala; Х20, Х24 и Х28 независимо могут собой Ala, Ser, Gly или Thr.
Например, X11 и X16 оба могут представлять собой Ala; Х20, Х24 и Х28 все независимо могут представлять собой Ala или Ser.
Следует понимать, что другие комбинации остатков, выходящие за пределы этих основных критериев, также могут обеспечивать селективность к тканям тонкого кишечника.
Предпочтительные комбинации остатков в позициях X11, Х16, Х20, Х24 и Х28 включают
Ser/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Ala/Ala/Ser, Ser/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ser/Ala/Ala; Ser/Ala/Ala/Ala/Ala; Ser/Ala/Arg/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ala/Ala/Ala.
Соединения, приведенные в качестве примеров, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост в тонком кишечнике, включают
ZP2264, ZP2268, ZP2242, ZP2272, ZP2411, ZP2380, ZP2384, ZP2398,
ZP2417, ZP2423, ZP2385, ZP2399, ZP2418, ZP2381, ZP2420 и ZP2397.
Также настоящее изобретение включает соединения, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост в желудке по сравнению с толстой кишкой. Следовательно, они могут быть использованы при повреждениях желудка или состояниях, связанных с желудком.
Предпочтительно такие соединения, оказывающие селективное воздействие на рост ткани желудка, включают замещения (т.е. относительно последовательности дикого типа, приведенной выше) более чем в одной позиции X11, X16, Х20, Х24 и/или Х28. Аминокислотные остатки в позициях Х31, Х32 и Х33 необязательно могут быть делетированы.
Например, в соединениях, оказывающих селективное воздействие на рост ткани желудка, X11 может представлять Leu, Phe или Lys. X16 может представлять Leu, Phe или Lys. Х20 может представлять Ala или Ser. Х24 может представлять Ala, Ser или Lys. Х28 может представлять Ala, Ser или Lys.
Например, X11 и X16 независимо могут представлять Leu или Phe, X24 и Х28 независимо могут представлять Lys или Ser, и Х20 может представлять Ser.
Например, X11 и X16 независимо могут представлять Leu или Phe, и Х20, Х24 и Х28 могут представлять Ser.
Следует понимать, что другие комбинации остатков, выходящие за пределы этих основных критериев, также могут обеспечивать селективность к тканям желудка.
Предпочтительные комбинации остатков в позициях XII, Х16, Х20, Х24 и Х28 включают Lys/Lys/Lys/Lys/Lys; Phe/Phe/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ala/Ala/Ala: и Leu/Leu/Ser/Ser/Ser.
Соединения, приведенные в качестве примеров, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост желудка, включают ZP2400, ZP2412, ZP2396, ZP2395, ZP2394 and ZP2401.
Предпочтительно аналог GLP-2 сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 70% по сравнению с начальным уровнем чистоты по меньшей мере в одном тесте на деградацию, описанном ниже в примере 7. Кроме того, или в качестве альтернативы, он сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 60% по сравнению с начальной чистотой в растворе HCl 0,1 М после 12 дней. Кроме того, или в качестве альтернативы, он сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 70% по сравнению с начальной чистотой в растворе NH4HCO3 0,1 М после 6 дней.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогам GLP-2, как описано выше, имеющим по меньшей мере 1 нМ EC50 и, следовательно, определенным как агонисты GLP-2. Соединения по настоящему изобретению были проанализированы, как описано в примере 9. На фиг. 5 в качестве примера показан агонист GLP-2 ZP2264 ЕС50.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей аналог GLP-2, как описано здесь, или его соль, или производное в смеси с носителем. В предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения композиция является фармацевтически приемлемой композицией, и носитель является фармацевтически приемлемым носителем. Аналог пептида GLP-2 может представлять собой фармацевтически приемлемую аддитивную соль кислоты аналога GLP-2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аналога GLP-2, как описано здесь, в качестве фармацевтической композиции, рецептурный состав которой представлен в жидкой форме, подходящей для инъекций или вливаний, или в такой форме, что позволяет медленное выделение указанного GLP-2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, как описано здесь, или его соли для применения в лечении.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению аналога GLP-2, как описано выше, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики желудочно-кишечных заболеваний.
В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к применению аналога GLP-2, или его соли, или производного для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики желудочно-кишечных заболеваний, таких как лечение у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза и состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV). Например, желудочно-кишечные заболевания включают: язвенные заболевания, синдром Золлингера-Эллисона, гастриты, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона и
язвенные колиты), брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютено-вого заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, синдром раздраженного кишечника, связанный с диареей, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.
В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к применению аналога GLP-2, как описано выше, где указанные желудочно-кишечные заболевания представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты или повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов.
Настоящее изобретение относится к применению аналога GLP-2, как описано здесь, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии.
Указанные побочные эффекты химиотерапии или лучевой терапии представляют собой диарею, абдоминальные спазмы и рвоту или структурные и функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии.
Настоящее изобретение относится к применению аналога GLP-2, как описано здесь, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики у новорожденных, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).
Настоящее изобретение также относится к терапевтическому набору, включающему химиотерапев-тические препараты для лечения рака, и аналог GLP-2 по настоящему изобретению, каждый необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Два терапевтических агента могут быть упакованы раздельно (например, в отдельных емкостях) для раздельного введения или могут входить в состав одной композиции. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химиотерапевтические препараты для лечения рака, и аналог GLP-2 по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Для пациентов с неоплазией слизистой желудочно-кишечного тракта или с повышенным риском возникновения неоплазии слизистой желудочно-кишечного тракта желательно выбирать соединение, которое снижает или упраздняет риск возникновения побочных эффектов, таких как стимуляция или обострение неоплазии слизистой желудочно-кишечного тракта. Например, при выборе соединения для лечения пациента с неоплазией толстой кишки (как доброкачественной, так и злокачественной) или при риске развития неоплазии толстой кишки, может быть более приемлемым выбор соединения, селективного к тканям тонкого кишечника относительно тканей толстой кишкой, чем неселективного соединения, или соединения, которое является селективным к тканям толстой кишки относительно тканей тонкой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аналогов GLP-2 для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики недостаточности или нарушения питания, например, состояний, таких как сидром атрофии, такой как катехия или анорексия.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аналог GLP-2, описанный здесь.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную последовательность нуклеиновой кислоты, необязательно в комбинации с последовательностями, направляющими экспрессию, и клеткам-хозяевам, трансформированным векторами экспрессии. Предпочтительно клетки-хозяева способны экспрессировать и секретировать аналог GLP-2. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения аналога GLP-2, способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессирования аналога GLP-2, и очистку полученного таким образом аналога GLP-2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению, вектору экспрессии по настоящему изобретению или клетке-хозяину, способной экспрессировать и секретировать аналог GLP-2 по настоящему изобретению для применения в терапии. Следует понимать, что нуклеиновая кислота, вектор экспрессии и клетки-хозяева могут использоваться для лечения любого из описанных здесь заболеваний, которое может лечиться аналогами GLP-2. Ссылки на терапевтические композиции, содержащие аналог GLP-2 по настоящему изобретению, или введение аналога GLP-2 по настоящему изобретению должны включать в свой объем введение нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки-хозяина по настоящему изобретению, за исключением тех случаев, когда в контексте предусмотрено иное.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетке-хозяину, как описано здесь для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики желудочно-кишечных заболеваний или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, лечение у новорожденных, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения желудочно-кишечных заболеваний у пациента, нуждающегося в нем, введением эффективного количества нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению. Примеры желудочно-кишечных
заболеваний приведены выше.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у пациентов, нуждающихся в этом, способ включает введение эффективного количества нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики недостаточности или нарушения питания, например, состояний, таких как сидром атрофии, такой как катехия или анорексия, способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению.
Варианты воплощения настоящего изобретения будут описаны более детально путем приведения примеров и не ограничиваются ссылкой на прилагаемые фигуры.
Описание фигур
Фиг. 1. Изменение относительной массы тонкого кишечника по сравнению с контролем, обработанным носителем, при введении следующих указанных соединений [Gly2]GLP-2 и соединений ZP2264, ZP2266-ZP2268 (800 нмоль/кг, один раз в день, в течение 3 дней). Относительная масса тонкого кишечника показана, как 100% у животных, обработанных носителем. *: Р <0,05, по сравнению с носителем, $: Р <0,05 по сравнению с обработанными [Gly2]GLP-2.
Фиг. 2. Изменение относительной массы тонкого кишечника по сравнению с контролем, обработанным носителем, при введении следующих указанных соединений [Gly2]GLP-2 и соединений ZP2242, ZP2269 и ZP2272 (800 нмоль/кг, один раз в день, в течение 3 дней). Относительная масса тонкого кишечника показана, как 100% у животных, обработанных носителем. *: Р <0,05, по сравнению с носителем, $: Р <0,05 по сравнению с обработанными [Gly2]GLP-2.
Фиг. 3. Изменение соотношения массы тонкого кишечника/массе толстой кишки у животных, обработанных введением следующих соединений ZP2264, ZP2266-ZP2268 (800 нмоль/кг, один раз в день в течение 3 дней) по сравнению с животными, обработанными [Gly2]GLP-2. Относительная масса тонкого кишечника (SI) показана, как 100% у животных, обработанных носителем. $: Р <0,05 по сравнению с обработанными [Gly2]GLP-2.
Фиг. 4. Измение соотношения массы тонкого кишечника/массе толстой кишки у животных, обработанных введением следующих соединений ZP2242, ZP2269, ZP2272 и ZP2271 (800 нмоль/кг, один раз в день в течение 3 дней) по сравнению с животными, обработанными [Gly2]GLP-2. Относительная масса тонкого кишечника (SI) показана, как 100% у животных, обработанных носителем. $: Р <0,05 по сравнению с обработанными [Gly2]GLP-2.
Фиг. 5. In vitro скрининг ZP2264 агониста рецептора GLP-2 рекомбинантно экспрессированного в клетках ВНК-21. IC50 ZP2264 составил 3,55 Е-12, что соответствует значениям агонистов.
Фиг. 6. Индекс чувствительности тканей тонкого кишечника/толстой кишки к ZP соединениям, селективным к тканям тонкого кишечника.
Фиг. 7. Индекс чувствительности тканей желудка/толстой кишки к ZP соединениям, селективным к тканям тонкого кишечника.
Фиг. 8. Индекс чувствительности тканей тонкого кишечника/толстой кишки не селективных ZP соединений.
Детальное описание изобретения
Определения.
Если не указанно иное, то следующие определения относятся к специальным терминам, использованным в приведенном ниже описании.
В описании и формуле изобретения использованы традиционный однобуквенный и трехбуквенный коды, как для обозначения природных аминокислот, так и для других а-аминокислот, таких как саркозин (Sar), норлейцин (Vle) и а-аминоизомасляная кислота (Aib). Все аминокислотные остатки в пептидах по настоящему изобретению являются предпочтительно L формами. Однако также могут присутствовать D формы аминокислот.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "консервативное замещение" означает, что аминокислотный остаток, находящийся в определенной позиции последовательности нативного GLP-2 пептида человека, замещен аминокислотным остатком, принадлежащим к той же группе (II II, III, IV, V, 1, 2, 3), как приведено в следующей таблице:
III
Используемый в описании настоящего изобретения термин "неконсервативное замещение" означает любое другое замещение аминокислотного остатка последовательности нативного GLP-2 пептида человека, например, такое как замещение не белковой аминокислотой (Sar, NIe, Aib) или замещение аминокислотой, не принадлежащей к той же группе.
Для описания полученного в результате гидропатического профиля одной стороны альфа-спирали авторы настоящего изобретения заменили гидропатический индекс (hpix) для отдельных аминокислот, описанный Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. (1982), 157, 105-132. В настоящем изобретении интересующая спираль определена аминокислотными позициями X11-Х16-Х20-Х24-Х28.
Гидропатический индекс (HPI) отдельных аминокислот описан с использованием гидропатического индекса HPI, введенного и определенного Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. (1982), 157, 105-132. Показатели HPI для отдельных аминокислот:
Аминокислота
hpi-индекс
4,5
4,2
3,8
2,8
2,5
1,9
1,8
-0,4
-0,7
-0,9
-0,8
-1,3
-1,6
-3,2
-3,5
-3,5
-3,5
-3,5
-3,9
-4,5
Полученный гидропатический профиль (НРР) остатков X11, X16, Х20, Х24, Х28 формулы I рассчитан, как
HPP = ? hpixi 1 + hpiXi6 + hpix20 + hpix24 + hpbas
НРР > -10, НРР > -4,
НРР > 0,
Yl, Y2, Y4 и Y5 могут быть выбраны независимо друг от друга из группы:
Asn, Asp, Glu, Gin, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met или Phe.
Y3 может быть выбран из группы:
Asn, Asp, Glu, Gin, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, He, Val, Met или Phe.
Для соединения, селективного к тканям тонкого кишечника, для всех критериев НРР > -10, -4 или 0, желательно, чтобы HPI для позиций 11 и 16 независимо представлял собой -0, 8 < HPI < 3,8, например, -0,8 < HPI < 2,8, такой как HPI = 1,8.
Для позиций 20, 24 и 28 желательно, чтобы HPI независимо представлял собой -0,8 < HPI20; 24; 28 < 1,8, например, -0,8 < HPI20; 24; 28 < 1,8, такой как HPI20; 24; 28 = -0,8.
Следовательно, остатки в каждой из позиций X11, X16, Х20, Х24 и Х28 независимо могут представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr.
Например, каждый из X11 и X16 независимо может представлять собой Ala или Ser; Х20, Х24 и Х28 может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr. Например, X11 и X16 может представлять собой Ala; Х20, Х24 и Х28 может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr.
Предпочтительные комбинации в позициях XII, Х16, Х20, Х24 и Х28 могут включать Ala/Ala/Ala/Ser/Ser, Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ata/AIa/Thr/Ser/Ser и Ala/Ala/GIy/Ser/Ser.
Для соединения, селективного к тканям желудка, по всем критериям НРР > -10, -4 или 0, желательно, чтобы HPI для позиций 11 и 16 независимо представлял собой -3,9 < HPI11} 16 < 3,8. Например, HPIn> 16 может составлять 2,8 < HPI11} 16 < 3,8 или HPIn> 16 может составлять -3,9.
Для позиций 20, 24 и 28 желательно, чтобы HPI независимо представлял собой -3,9 < HPI20> 24j 28 < 1,8. Например, HPI20> 24j 28 может составлять -0,8 < HPI20> 24j 28 < 1,8 или HPI20> 24j 28 может составлять -3,9.
Следовательно, остаток в позиции X11 может представлять собой Leu, Phe или Lys.
Остаток в позиции X16 может представлять собой Leu, Ser, Phe, Lys или Thr.
Остаток в позиции Х20 может представлять собой Ala, Ser, Leu, Gly или Thr.
Остаток в позиции Х24 может представлять собой Ala, Ser, Lys, Glu, Gly или Thr.
Остаток в позиции Х28 может представлять собой Ala, Ser, Lys, Gin, Gly или Thr.
Например, X11 и X16 независимо могут представлять собой Leu или Phe, X24 и Х28 независимо могут представлять собой Ala или Ser.
Предпочтительные соединения по настоящему изобретению обладают по меньшей мере одной GLP-2 биологической активностью, а именно вызывают рост тканей кишечника или желудка. Это может быть оценено in vivo опытами, например, как описано в примерах, в которых масса кишечника или его части определена после теста на животных, получавших или подвергшихся воздействию аналога GLP-2.
Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению имеют одно или более аминокислотное замещение, де-лецию, инверсию или дополнение по сравнению с нативным GLP-2, как описано выше. Это определение также включает синонимы терминов миметики GLP-2 и/или агонисты GLP-2. Кроме того, аналоги по настоящему изобретению дополнительно могут иметь химическую модификацию по одной или более боковой группе аминокислот, а-углеродных атомов, по концевой аминогруппе или концевой группе кар-боновой кислоты. Химические модификации включают без ограничения введение химических молекул, создание новых связей и делетирование химических молекул. Модификации по боковым группам аминокислот включают без ограничения ацилирование е-аминогрупп лизина, N алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоксильных групп глутаминовой кислоты или аспарогиновой кислоты и деамидирование глутамина или аспарагина. Модификации по амино концу включают без ограничения дезаминирование, алкилирование низшим алкилом по N-концу, алкилирование низшим диал-килом по N-концу и N-ацильные модификации. Модификации концевой карбоксильной группы включают без ограничения амид, образование низшего алкил амида, диалкил амида и модификации с получением эфира низших алкилов. Предпочтительно здесь низшим алкилом является С1-С4-алкил. Кроме того, одна или более боковая группа или концевая группа могут быть защищены протективными группами, известными специалисту в области химии пептидов. Альфа-углерод аминокислоты может быть моно-или диметилированным.
Представленная здесь стабильная к окислению Met-замещенные аминокислоты означает замещение, выбранное из группы, состоящей из Met(O) (метионинсульфоксида), Met(O)2 (метионинсульфона), Val, Ile, Asn, Glx (Glu или Gln), Tyr, Phe, Trp и предпочтительно Leu, Vle, Ala, Ser и Gly.
Следует понимать, что пептиды по настоящему изобретению также могут быть в форме соли или другого производного. Соли включают фармацевтически приемлемые соли, такие как аддитивные соли кислоты и основные соли. Примеры аддитивных солей кислоты включают хлористоводородные соли, соли лимонной кислоты и соли уксусной кислоты. Примеры основных солей включают соли, в которых катион выбран из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочно-земельных металлов, таких как кальций, и ионов аммония *N(R3)3(R4), где R3 и R4 независимо обозначают необязательно замещенный ^^алтал, необязательно замещенный С2-6алкенил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в "Remingtons Pharmaceutical Sciences", 17 edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 и более поздних изданиях и в the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology.
Другие производные аналогов GLP-2 по настоящему изобретению включают координационный комплекс с ионами металла, такого как Mn2+ и Zn2+, эфирами, такими как in vivo гидролизуемые эфиры, свободными кислотами или основаниями, гидратами, пролекарствами или липидами. Эфиры могут быть образованы между гидроксильными или карбоксильными группами, присутствующими в соединении и подходящей карбоновой кислотой или спиртом, участвующим в реакции, с использованием технологий, хорошо известных из предшествующего уровня техники. Производные соединений, такие как пролекар-ства, представляют собой одно из исходных соединений, поддающееся превращению in vivo или in vitro. Как правило, по меньшей мере, одна из биологических активностей соединения будет снижена в проле
карственной форме соединения и может быть активирована конверсией из пролекарства с выделением из него соединения или метаболита. Примеры пролекарств включают использование защитных групп, которые могут быть делетированы in situ, с выделением активного соединения или служат для игибирова-ния клиренса лекарственного препарата in vivo.
Присутствующие Z1 и Z2, каждая независимо, представляют собой пептидную последовательность из 3-20 или 4-20 аминокислотных остатка, например, в пределах 4-15, более предпочтительно в пределах 4-10, в частности в пределах 4-7 аминокислотных остатка, например, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатка, таких как 6 аминокислотных остатков. Каждый из аминокислотных остатков в пептидных последовательностях Z может быть независимо выбран из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met, Orn. Предпочтительно аминокислотный остаток выбран из Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn и Met, также как и аминокислотные остатки, входящие в формулу I, как описано в WO 01/04156, например, Dbu (2,4-диаминомасляная кислота) или Dpr (2,3-диаминопропионовая кислота), более предпочтительно Glu, Lys и Met, особенно Lys. Выше приведенные аминокислоты могут быть как в D-, так и в L-форме, но предпочтительно выше приведенные аминокислоты имеют L-форму. Особенно предпочтительны последовательности Z, представляющие собой последовательности из четырех, пяти или шести последовательных остатков лизина и особенно из шести последовательных остатков лизина. Примеры последовательностей Z приведены в WO 01/04156.
В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения Z1 отсутствует. В таких случаях Z2 может как присутствовать, так и отсутствовать.
Аналоги GLP-2, имеющие по меньшей мере 1 нМ EC50, определяют, как агонисты GLP-2. Настоящее изобретение включает следующие пептиды дополнительно к описанным ниже в экспериментальной части.
Наиболее предпочтительные соединения по настоящему изобретению включают ZP2264, ZP2267,
ZP2268 и ZP2270.
Исследование стабильности.
Специалист в данной области техники способен разработать подходящие методы (например, количественные методы) для обнаружения продуктов деградации аналогов GLP-2, например, на основе методов, описанных здесь ниже. Деградация может представлять собой окисление, гидролиз и дезамидирова-ние, в зависимости от идентичности и положения аминокислот в любом из приведенных аналогов GLP-2 и условий, таких как уровень рН раствора и температура. Соединения могут быть классифицированы по химической стабильности, когда соединения выдерживают в жестких условиях (например, в условиях, подобных вызывающим деградацию) и затем исследованы на содержание остаточных пептидов. Кроме того, знания, приобретенные в отношении основных продуктов деградации, образующихся в жестких условиях, будут важны для последующей разработки аналитического метода.
Количественный анализ определения аналогов GLP.
Специалист в данной области техники также способен разработать методы (например, количественные методы) для определения аналогов GLP в сложных средах или растворах (например, плазма, моча, тканевый гомогенат, клеточный гомогенат, слюна или им подобные) для исследования абсорбции, распределения, метаболизма и выделения аналогов GLP после введения млекопитающим или как части функциональных исследований клеточных систем in vitro.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения количественный анализ может основываться на антителах, полученных против аналогов GLP или их фрагментов. Антитела, полученные от иммунизированных животных, могут быть использованы для количественных анализов. В одном из примеров прямой сэндвич ELISA может быть проведен с использованием первого антитела, имеющего сродство к одной части молекулы, иммобилизованного в многолуночном планшете. Затем образец вносят в лунки, и аналог GLP связывается первым антителом. Связанный аналог GLP затем узнается вторым антителом, имеющим сродство к другой части GLP. Второе антитело может быть мечено ферментом (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или бета-галактозидазой) или радиоизотопом. Количество связанного аналога GLP затем может быть определено введением колориметрического субстрата или прямым подсчетом источников радиоизлучения или сцинтилляцией. В качестве альтернативы, количество связанного аналога GLP может быть определено косвенно с помощью добавления меченого антитела, имеющего сродство ко второму антителу. Концентрация в образце может быть оценена по отклику, полученному из кривой внешнего стандарта, включающей известные количества аналога GLP. В качестве альтернативы, антитела могут быть использованы для проведения прямого конкурентного иммунноанализа, где антитело, специфичное к аналогу GLP, иммобилизовано на многолуночном планшете, после чего образец выдерживают в лунках с определенной концентрацией меченого аналога GLP. Метка может представлять собой фермент, флуорофор, радиоизотоп или биотин и детектироваться с использованием, например, субстратов (например, колориметрически, флурометрически или хемилюминесцентно), специфичных для ферментов, сцинтилляции или авидина, связанного с ферментом, с последующим определением, как описано выше. Количество связанного меченого аналога GLP может быть определено подходящим способом и концентрацию аналога GLP, присутствующего в образце, устанавливают по отклику, полученному из кривой внешнего стандарта, как описано выше.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения количественный анализ может быть основан на методе жидкостной хромато-масс-спектрометрии. По такой схеме отклик от исследуемого фрагмента, специфичного для аналога GLP, получают при фрагментации исходного соединения, индуцированной столкновением с инертным газом (He или Ar). Перед фрагментацией компоненты образца могут быть разделены с использованием обращено-фазовой хроматографии или образец может быть инжектирован непосредственно в масс-спектрометр. При необходимости, образец может быть подвергнут предварительной обработке (т.е. введению ингибиторов протеазы, осаждению белков, твердофазной экстракции, иммуноаффинной экстракции и т.п.). Концентрация аналога GLP, присутствующего в образце, устанавливается по отклику кривой внешнего стандарта, как описано выше, потенциально после уточнения отклика с использованием внешнего стандарта, идентичного исследуемому аналогу GLP.
Получение специфических антител.
Специфические антитела против аналогов GLP или их фрагменты могут быть получены в млекопитающих и выделены из сыворотки. Аналоги GLP или их фрагменты могут быть использованы для иммунизации кроликов, мышей или других млекопитающих как непосредственно с адъювантом, так и аналоги GLP или их фрагменты могут быть химически связаны с молекулой-носителем (т.е. гемоцианином лимфы улитки, овальбумином, альбумином и т.п.) и инъецированы с адъювантом. Инъекции могут быть повторены с интервалом 2-4 недели, увеличенным для улучшения сродства и селективности антител. По-ликлональные антитела могут быть выделены непосредственно из сыворотки. Для получения монокло-нальных антител В клетки, выделенные из иммунизированных животных, предпочтительно мышей, должны быть слиты с опухолевыми клетками с получением антителопродуцирующих гибридом. Скрининг и селекция подходящих клонов и антител могут быть осуществлены с использованием как иммунизированных аналогов GLP, так и их пептидов с последующим определением меченых антител. В качестве альтернативы, скрининг и селекция могут основываться на иммобилизированных антителах с последующей детекцией меченных с помощью аналогов GLP или их фрагментов. В любых случаях метка может представлять собой радиоизотоп, фермент, флуорофор или биотин, и детектироваться (например, колориметрически, флурометрически или хемилюминесцентно) с помощью, например, субстратов, специфических для ферментов, сцинтилляции или авидина, связанного с ферментом, с последующим определением, как описано выше.
Синтез аналогов GLP-2.
Аналоги по настоящему изобретению предпочтительно синтезируют посредством твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. В этом контексте приводится ссылка на WO 98/11125 и в том числе Fields, G.B. et al., 2002.
Таким образом, аналоги GLP-2 могут быть синтезированы многочисленными путями, включая, например, способ, который включает:
(a) синтез пептида посредством твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза и выделение полученного таким образом синтетического пептида; или
(b) если пептид сконструирован из природных аминокислот, кодирующая конструкция нуклеиновой кислоты экспрессирует пептид в клетке-хозяине, который выделяют из культуры клетки-хозяина или
(c) если пептид сконструирован из природных аминокислот, проводят in vitro бесклеточную экспрессию конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и выделяют продукты экспрессии или
комбинация способов (а), (b) и (с) с получением фрагментов пептида с последующим связыванием фрагментов с получением пептида и выделением пептида.
Таким образом, для некоторых аналогов по настоящему изобретению предпочтительно использование генно-инженерных технологий. Это возможно в тех случаях, когда пептид достаточно большой (или получен как слитая конструкция) и когда пептид состоит только из природных аминокислот, которые могут быть транслированы из РНК в живых организмах.
Фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, представляют собой важные химические продукты для рекомбинантной генной технологии. Следовательно, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог GLP-2 по настоящему изобретению, где пептид предпочтительно включает природные аминокислоты. Фрагменты нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляют собой как фрагменты ДНК, так и фрагменты РНК.
Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению обычно встраивают в подходящие векторы, чтобы получить клонирующие или экспрессионные векторы, несущие фрагменты нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Детали, касающиеся конструкции указанных векторов настоящего изобретения, будут описаны ниже в рамках трансформированных клеток и микроорганизмов. Векторы, в зависимости от цели и способа применения, могут находиться в форме плазмид, фагов, космид, мини-хромосом или вируса, а также важным вектором является депротеинизированная ДНК, которая экспрессируется в определенных клетках исключительно транзиентно. Предпочтительные клонирующие и экспрессионные векторы (плазмидные векторы) настоящего изобретения способны к автономной репликации, обеспечивая, таким
образом, высокое число копий в целях высокого уровня экспрессии или высокого уровня репликации для последующего клонирования.
Общая схема вектора настоящего изобретения включает следующие функционально связанные элементы в 5' 3' направлении: промотор, регулирующий экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей лидер-ный пептид, обеспечивающий секрецию указанного фрагмента (во внеклеточное пространство или, по возможности, в периплазму) или лидерный пептид для разнообразных целей, например, для комбинированной секреции, в качестве тэга для аффинной очистки, для ферментативного процессинга с целью коррекции пептида, а также для интеграции в мембрану полипептидного фрагмента; фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид настоящего изобретения; и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая терминатор. При работе с векторами экспрессии в штаммах-продуцентах или клеточных линиях, в целях генетической стабильности трансформированной клетки, предпочтительно, чтобы вектор, вводимый в клетку-хозяина, интегрировался в геном клетки-хозяина.
Векторы настоящего изобретения используются для трансформации клеток-хозяев в целях продукции модифицированного пептида настоящего изобретения. Такие преобразованные клетки, которые также являются частью изобретения, могут быть культивируемыми клетками или линиями клеток, используемыми для получения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов по настоящему изобретению, или использоваться для получения пептидов по настоящему изобретению с помощью рекомбинантных технологий.
Предпочтительные трансформированные клетки по настоящему изобретению представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии (такого вида как Escherichia (напр. E.coli), Bacillus (напр. Bacillus subtilis), Salmonella или Mycobacterium (предпочтительно непатогенных видов, напр. М. bovis БЦЖ), дрожжи (такого вида как Saccharomyces cerevisiae) и простейшие. В качестве альтернативы трансформированные клетки могут происходить из многоклеточного организма, т.е. указанными клетками могут являться клетки гриба, клетки насекомого, клетки растения или клетки млекопитающих. Также интерес представляют клетки, полученные от человека, сравните описание клеточных линий и векторов ниже. В целях клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка являлась способной к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения используются клетки, экспрес-сирующие нуклеиновый фрагмент; причем указанные клетки могут использоваться как для мелкомасштабного, так и для крупномасштабного производства пептидов по настоящему изобретению.
При получении пептида по настоящему изобретению посредством трансформированных клеток, желательно, хотя и необязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо презентировался на поверхности трансформированной клетки.
При выделении эффективной клетки-продуцента предпочтительно на ее основе получать устойчивую линию клеток, которая несет вектор по настоящему изобретению и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид. Предпочтительно, указанная устойчивая линия клеток сек-ретирует или несет пептид по настоящему изобретению, облегчая, таким образом, его очистку.
В основном плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые происходят из совместимых с клеткой-хозяином видов, используются в совокупности с хозяевами. Вектор обычно несет участок репликации, а так же маркерные последовательности, которые обеспечивают фенотипический отбор трансформированных клеток. Например, E.coli обычно трансформируют, используя pBR322 (хотя существует ряд других полезных плазмид) плазмиду, полученную из E.coli spp. (см., например, Bolivar et al., 1977). Плазмида pBR322 несет гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, что обеспечивает, таким образом, простой способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR, или другая микробная плазмида или фаг, должна также содержать, или должна быть модифицирована таким образом, чтобы содержать промоторы, которые могут использоваться прокариоти-ческим микроорганизмом для экспрессии.
Промоторы, обычно используемые в конструировании прокариотической рекомбинантной ДНК, включают р-лактамазную (пенициллиназные) систему, систему на основе лактозного промотора (Chang et al., 1978; ltakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979), a также систему на основе триптофанового (trp) промотора (Goeddel et al., 1979; ЕР 0036776 А). Хотя указанные промоторы используются наиболее часто, были открыты и использовались другие микробные промоторы, причем была опубликована подробная информация относительно их нуклеотидных последовательностей, что позволяет специалисту в данной области техники функционально объединить их с плазмидными векторами (Siebwenlist et al., 1980).
В дополнение к прокариотическим, эукариотическим микробам, также могут использоваться культуры дрожжей и промотор, который должен обеспечивать регулируемую экспрессию. Saccharomyces cerevisiae или обычные хлебопекарные дрожжи являются наиболее распространенными среди эукарио-тических микроорганизмов, хотя доступны и множество других штаммов. Для экспрессии в Saccharomy-ces, например, обычно используют плазмиду YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Указанная плазмида уже содержит ген trpl, который является селективным марке
ром для мутантного штамма дрожжей, неспособного расти на среде без триптофана, например, АТСС № 44076 или РЕР4-1 (Jones, 1977). Присутствие trpl мутации, как особенности генома дрожжевой клетки-хозяина, обеспечивает эффективную возможность для обнаружения трансформированных клеток по росту в отсутствии триптофана.
Подходящие последовательности промотора в дрожжевых векторах включают промоторы для 3-фосфоглицерат киназы (Hitzman et al., 1980) или других гликолитических ферментов (Hess et al., 1968; Голландия et al., 1978), таких, как енолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируватки-наза, триозафосфат изомераза, фосфоглюкоизомераза и глюкокиназа. При конструировании подходящих экспрессионных плазмид, в экспрессионный вектор также включены терминальные последовательности, связанные с 3'-концом экспрессируемых генов, в целях обеспечения полиаденилирования мРНК и тер-минации.
Другими промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции, контролируемой условиями роста, являются промоторные области алкоголь дегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, связанных с метаболизмом азота, а также вышеуказанной глицераль-дегид-3-фосфат дегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящим является любой плазмидный вектор, включающий функционирующие в дрожжах последовательности промотора, начала репликации и терминатора.
В дополнение к микроорганизмам, в качестве организмов-хозяев могут также использоваться культуры клеток, полученные из многоклеточных организмов. В принципе, может быть получена любая клеточная культура, в независимости от того, является ли она культурой клеток позвоночных или беспозвоночных. Тем не менее, больший интерес вызывают клетки позвоночных, и размножение позвоночного организма в культуре (культуре ткани) в последние годы ставшей стандартной методикой (Tissue Culture, 1973). Примерами таких полезных линий клеток-хозяев являются клетки VERO и HeLa, линии яйцеклеток китайских хомячков (СНО), а также клетки W138, ВНК, COS-7293, Spodoptera frugiperda (SF) (коммерчески доступные как полные системы экспрессии от, например, Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, США и от Invitrogen), линия S2 клеток D. melanogaster, доступная от Invitrogen PO Box 2312, 9704 СН Groningen, The Netherlands, и линии клеток MDCK.
Экспрессионные векторы для таких клеток обычно включают (в случае необходимости) начало репликации, промотор, располагающийся перед экспрессируемым геном, наряду с любыми необходимыми участками связывания рибосомы, участками сплайсинга РНК, участками полиаденилирования и последовательностями терминатора транскрипции.
Функции регулирования в векторах экспрессии для использования в клетках млекопитающих часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используются промоторы, полученные из вируса полиомы, аденовируса 2, и наиболее часто из вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40). Ранние и поздние промоторы вируса SV40 особенно полезны, так как оба легко могут быть получены из вируса в виде фрагмент, который также содержит начало репликации вируса SV40 (Fiers et al., 1978). Также могут использоваться меньшие или большие фрагменты SV40, если в них включена последовательность размером около 250 п.н., идущая от сайта HindIII до сайта BgII, расположенных в начале репликации вируса. Далее также возможно, и чаще предпочтительно, использовать промоторные или регу-ляторные последовательности, обычно связанные с последовательностью желаемого гена, если такие регуляторные последовательности совместимы с системами клеток-хозяев.
Начало репликации может обеспечиваться либо конструкцией вектора, чтобы включать экзогенное начало репликации, которое может быть получено из SV40 или другого вируса (напр. вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита, коровьего вируса папилломы), либо может обеспечиваться механизмом хромосомной репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клетки-хозяина, то последнее обычно является достаточным.
Чтобы получить приемлемые уровни продукции в процессе рекомбинантного производства, может быть выгодным приготовить аналоги в виде слитых белков, или путем сшивания пептида с последовательностью, которая может служить аффинным тэгом (для простоты очистки), и/или имеющих в составе многократные повторы пептида. Указанные методы требуют присутствия подходящего сайта расщепления для пептидазы, тем не менее, специалист в данной области техники будет знать, как создать основные генетические конструкции.
После получения с помощью рекомбинантных технологий, пептиды настоящего изобретения могут быть очищены методами, известными в уровне техники, включая многостадийную хроматографию (ионообменные, гель-фильтрационные и аффинные хроматографические методы).
В качестве альтернативы, в бесклеточных системах in vitro могут быть получены пептиды, состоящие из природных аминокислот. Это особенно целесообразно в тех случаях, когда пептиды могут быть токсичны для предполагаемых клеток-хозяев. Таким образом, настоящее изобретение также рассматривает использование бесклеточной трансляции/экспрессии in vitro для получения пептидов по настоящему изобретению. В связи с этим приведена ссылка на коммерчески доступные наборы in vitro трансляции, материалы, и техническую документацию от, например, Ambion Inc, 2130 Woodward, Остин, ТХ 78744
1832, США.
Наконец, доступные методы могут быть, конечно, скомбинированы, с целью получения, например, полусинтетических аналогов. В связи с этим, пептидные фрагменты получают, используя, по крайней мере, 2 отдельных стадии или метода, сопровождаемых лигированием указанных фрагментов для получения конечного пептидного продукта.
Фармацевтические композиции и введение.
Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению или их соли или производные, могут входить в состав фармацевтических композиций, подготовленных к хранению или введению, которые при этом включают терапевтически эффективную дозу пептида GLP-2 по настоящему изобретению, или его соль или производное, в фармацевтически приемлемом носителе.
Терапевтически эффективная доза соединения по настоящему изобретению будет зависеть от пути введения, вида обрабатываемого млекопитающего и физических особенностей определенного исследуемого млекопитающего. Указанные факторы и их отношение к определению указанной дозы известны квалифицированным специалистам, обладающим медицинскими навыками. Указанная доза и способ введения могут быть разработаны таким образом, чтобы достичь оптимальной эффективности и обеспечить доставку пептида в толстую кишку, но будут зависеть при этом от таких факторов как вес, питание, параллельное лечение, а также от других факторов, известных квалифицированным специалистам, обладающим медицинскими навыками.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в которой аналог GLP-2, или его соль присутствует в дозировке, эффективной для терапии или профилактики желудочных и кишечных расстройств.
Фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению, имеющих кислотную группу, могут быть образованы с использованием органических и неорганических оснований. Подходящие соли, образованные с основаниями, включают
такие соли металлов, как соли щелочных или щёлочноземельных металлов, например, соли натрия, калия или магния; соли аммония и соли таких органических аминов, как морфолин, тиоморфолин, пиперидин, пирролидин, моно-, ди- или тринизший алкиламин (например, этил-трет-бутил-, диэтил-, диизо-пропил-, триэтил-, трибутил- или диметилпропиламин), или моно-, ди- или тригидрокси низший алкила-мин (например, моно-, ди- или триэтаноламин). Также могут быть образованы внутренние соли. Аналогичным образом, когда соединение по настоящему изобретению включает основную группу, соответствующие соли могут быть образованы с использованием органических и неорганических кислот. Например, могут быть образованы соли со следующими кислотами: уксусной, пропионовой, молочной, лимонной, винной, янтарной, фумаровой, малеиновой, малоновой, миндальной, яблочной, фталевой, хлороводородной, бромоводородной, фосфорной, азотной, серной, метансульфоновой, нафталинсульфоновой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой и камфорсульфоновой, а так же с другими известными фармацевтически приемлемыми кислотами. Также могут быть образованы соли присоединения аминокислот с такими аминокислотами, как лизин, глицин или фенилаланин.
Квалифицированному специалисту, обладающему медицинскими навыками, будет очевидно, что "терапевтически эффективная доза" пептидов или фармацевтических композиций по настоящему изобретению изменится в зависимости от возраста, веса и от вида млекопитающего, подвергнутого терапии, от конкретных использованных соединений, специфического способа введения, а также желаемых эффектов и терапевтических показаний. Поскольку перечисленные факторы и их связь с определением указанной дозы известны в медицине, то определение терапевтически эффективных уровней дозировки, и, собственно, дозы, необходимой для достижения желаемого результата профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний, описанных здесь, а так же другие медицинские показания, раскрытые здесь, будут находиться в компетенции специалиста в данной области техники.
В настоящем изобретении "терапевтически эффективное количество" является таким количеством, которое уменьшает симптомы данного состояния или патологии, и которое предпочтительно нормализует физиологические ответы у индивидуума с указанным состоянием или патологией. Уменьшение симптомов или нормализация физиологических ответов могут быть определены с использованием стандартных методов из уровня техники и могут меняться у индивидуума с указанным состоянием или патологией. В одном аспекте терапевтически эффективное количество одного или более аналогов GLP-2 или фармацевтической композиции, включающей один или более указанных аналогов GLP-2 является тем количеством, которое восстанавливает измеряемый физиологический параметр, в основном, до значения параметра у индивидуума без указанного состояния или патологии (предпочтительно до + 30%, более предпочтительно до + 20%, и еще более предпочтительно, до 10% значения параметра).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, введение соединений или фармацевтической композиции по настоящему изобретению начинают при более низких уровнях дозировки, с увеличением уровней дозировки до достижения желаемого эффекта профилактики/лечения, соответствующего медицинским показаниям, таким как желудочно-кишечные заболевания. Это определило бы их терапевтически эффективное количество. Для пептидов по настоящему изобретению, одного или как части фармацевтической композиции, такие дозы могут находиться в пределах от около 0.01 до 100 мг/на 1 кг
массы тела, в пределах от около 0.01 до 10 мг/на 1 кг массы тела, например 10-100 мкг/на 1 кг массы тела.
Для терапевтического применения выбранный аналог GLP-2 объединяют с носителем, фармацевтически приемлемым для введения пептида выбранным способом. В соответствии с целями настоящего изобретения периферийные парентеральные способы введения включают внутривенные, внутримышечные, подкожные и внутрибрюшинные способы введения. Определенные соединения, используемые в настоящем изобретении, также могут быть пригодными для введения орально, ректально, назально или через нижние дыхательные пути. Указанные способы введения являются так называемыми непарентеральными способами введения. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает аналог GLP-2 по настоящему изобретению, или его соль или производное и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители представляют собой носители, используемые традиционно с лекарствами на основе пептидов, такие как разбавители, наполнители и т.п. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического использования хорошо известны из предшествующего уровня техники, и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Например, могут использоваться, стерильный солевой и фосфат-но-солевой буферы при слегка кислом или физиологическом рН. Буферными агентами могут быть фосфат, цитрат, ацетат, трис-(гидроксиметил)аминометан (TRIS), №трис-(гидрокисметил)метил-3-аминопропансульфоновая кислота (TAPS), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин, являющийся предпочтительным буфером, аргинин, лизин или ацетат, или их смеси. Предпочтительные значения рН буферов находятся в диапазонах рН 4-8, рН 6.5-8, более предпочтительно рН 7-7.5. В состав фармацевтической композиции могут быть включены такие консерванты, как пара-, мета- и орто-крезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбино-вая кислота, пропановая кислота, эфиры п-гидроксибензойной кислоты. В состав фармацевтической композиции могут быть включены стабилизаторы, которые предотвращают окисление, дезамидирование, изомеризацию, рацемизацию, циклизацию, гидролиз пептидов, такие как, например, аскорбиновая кислота, метионин, триптофан, EDTA, аспарагин, лизин, аргинин, глутамин и глицин. В состав фармацевтической композиции могут быть включены стабилизаторы, предотвращающие агрегацию, образование волокон и преципитацию, такие как додецилсульфат натрия, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллю-лоза, циклодекстрин. В состав фармацевтической композиции также могут быть включены органические модификаторы для солюбилизации или предотвращения агрегации, такие как этанол, уксусная кислота или ацетаты. В состав фармацевтической композиции могут быть включены изотонические агенты, такие как соли, например, хлорид натрия или наиболее предпочтительные из углеводов, например, декстроза, маннитол, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси.
В фармацевтическую композицию могут входить детергенты, такие как Tween 20, Tween 80, SDS, полоксамеры, например, плюроник F-68, плюроник F-127. В фармацевтическую композицию могут входить красители и даже ароматизаторы. В другом варианте воплощения настоящего изобретения в фармацевтическую композицию может входить фармацевтически приемлемая аддитивная соль кислоты аналога пептида GLP-2. Могут быть использованы суспендирующие агенты. В фармацевтическую композицию для лиофилизации лиофилизируемого продукта могут входить органические модификаторы, такие как этанол, третичный бутиловый спирт, 2-пропанол, глицерин, полиэтиленгликоль. В фармацевтическую композицию для лиофилизации могут входить агенты-наполнители и изотонические агенты, такие как соль, например, хлорид натрия, углеводы, например, декстроза, маннитол, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси, аминокислоты, например, глицин, глютамат или инертные носители, такие как цистеин, лецитин или сывороточный альбумин человека или их смеси.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены и применены в виде таблеток, капсул или эликсиров для орального введения; суппозиториев для ректального введения; предпочтительно стерильных растворов или стерильного порошка или суспензии для введения инъекцией и т. п. Доза и способ введения могут быть подобраны для достижения оптимального эффекта, но зависят от таких факторов, как вес, диета, сопутствующее лечение и другие факторы, которые известны специалисту в области медицины.
При парентеральном введении, таком как, например, внутривенное и подкожное, ежедневно инъецируемые фармацевтические композиции могут быть получены в традиционных формах, таких как водные растворы или суспензии; лиофилизованные формы, твердые формы или суспензии или эмульсии, подходящие для восстановления жидкостью непосредственно перед инъекцией.
Разбавители для восстановления лиофилизованного продукта могут представлять собой подходящие буферы из выше приведенного списка, воду, физиологический раствор, декстрозу, маннитол, лактозу, трегалозу, сахарозу, лецитин, альбумин, глютамат натрия, цистеина гидрохлорид или воду для инъекций с введением детергентов, таких как Tween 20, Tween 80, полоксамеры, например, плюроник F-68 или плюроник F-127, полиэтиленгликоль и/или с введением консервантов, таких как пара-, мета- и орто-крезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензил-бензоат, сорбиновая кислота, пропионовая кислота, эфиры п-гидроксибензойной кислоты, и/или с введением органического модификатора, такого как этанол, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная
кислота и их соли.
Кроме того, если требуется, инъецируемые фармацевтические композиции могут включать незначительное количество нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или рН забуферивающие агенты. Могут быть использованы вещества, усиливающие абсорбцию (например, ли-посомы, детергенты и органические кислоты).
В одном варианте воплощения настоящего изобретения получают соединения для введения инфу-зией, например, в качестве жидких питательных добавок для пациентов, получающих общую парентеральную нутритивную терапию (например, новорожденные или пациенты, страдающие кахексией или анорексией) или инъекцией, например, подкожно, интраперитонеально или внутривенно и, таким образом, примененные в виде водных растворов в стерильной и апирогенной форме и необязательно забуфе-ренных до физиологически допускаемого рН, например, слабо кислый или физиологический рН. Состав для внутримышечного введения может быть основан на растворах или суспензиях в растительном масле, например, масле канолы, кукурузном масле или соевом масле. Эти масла в основе составов могут быть стабилизированы антиоксидантами, например, ВНА (бутилированный гидроксианизол) и ВНТ (бутили-рованный гидрокситолуол).
Таким образом, пептидные соединения по настоящему изобретению могут быть введены с носителями, такими как дистиллированная вода или физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, 5% растворы декстрозы или масел. Растворимость аналога GLP-2 может быть повышена, если требуется, введением усилителя растворимости, такого как детергенты и эмульгаторы.
Водный носитель или носитель может быть добавлен для применения в инъекциях с желатином, который служит для пролонгированного действия аналога GLP-2 в месте инъекции или рядом с ним для его медленного выделения при желаемом местном воздействии. В качестве альтернативы могут быть использованы такие желирующие агенты, как гиалуроновая кислота, которые также могут быть использованы в качестве агентов, замедляющих всасывание.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A) L-гистидин, растворенный в воде, с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ;
B) маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ; и
C) уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, и более предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A) L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ L-гистидин;
B) L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C) маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ; и
D) уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A) L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;
B) L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C) маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ; и
D) уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наибо
лее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает
A) L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ L-гистидина;
B) L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C) маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ; и
D) уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A) L-гистидин, растворенный в воде, с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;
B) L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C) маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ; и
D) уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A) N-ацетат, растворенный в воде, с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;
B) маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению также могут входить в состав композиции для медленного высвобождения из имплантируемого устройства для пролонгированного и замедленного выделения пептида аналога GLP-2. Такие составы замедленного выделения могут быть в форме пластыря, расположенного на внешней поверхности тела. Примеры составов замедленного выделения включают композиции биологически совместимых полимеров, таких как полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, сиаловая кислота, силикат, коллаген, липо-сомы и т.п. Составы замедленного выделения могут быть особенно полезны, когда требуется обеспечить высокую местную концентрацию аналога GLP-2 по настоящему изобретению.
Аналог GLP-2, прошедший стерильную фильтрацию, может быть помещен в ампулу, или емкость в количестве, оказывающем трофическое воздействие на кишечник. Емкость или ампула может содержать
аналог GLP-2 в качестве состава, готового для введения, и необходимый носитель. В качестве альтернативы, емкость или ампула может содержать пептид GLP-2 в таких формах, как лиофилизованная форма, подходящая для восстановления в подходящем носителе, таком как стерильная вода или физиологический раствор, забуференный фосфатом.
В качестве альтернативы инъектируемым составам, аналог GLP-2 может входить в композицию, вводимую другим способом. В соответствии со стандартной фармацевтической практикой могут быть получены композиции лекарственных форм для орального введения, такие как таблетки, капсулы и т.п. Согласно настоящему изобретению аналог GLP-2 вводят для лечения индивидуумам для оказания положительного влияния на рост тканей тонкого кишечника.
Лекарственные формы для назального введения могут иметь в своем составе усилители, такие как хитозан или детергенты, такие как Tween 20, Tween 80, полоксамеры, например, плюроник F-68 или плюроник F-127; Brij 35, Brij 72, кремофор EL.
Пептидные соединения по настоящему изобретению могут применяться, как по отдельности, так и в комбинации с соединениями, обладающими противовоспалительным воздействием. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения предположили, что комбинированное лечение может усилить положительные эффекты лечения аналогом пептида по настоящему изобретению.
Терапевтическая дозировка и режим, наиболее подходящие для лечения пациента, конечно, варьируют в зависимости от лечимого заболевания или состояния и зависят от веса и других параметров пациента. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы считают, что дозы в показателях мкг/кг и длительность или частота повторяемости лечения позволяют получить терапевтически эффективные результаты, такие как, статистически значимое повышение, в частности, массы тонкого кишечника. В некоторых примерах терапевтический режим может включать введение поддерживающей дозы, подходящей для предотвращения тканевой регрессии, что случается после прекращения проводимого лечения. Дозировка и режим, наиболее подходящие для применения человеком, могут быть определены по результатам, полученным в настоящем изобретении, и могут быть подтверждены проведением собственно клинических испытаний.
Эффективная дозировка и протоколы лечения могут быть определены традиционными способами, начиняя с низкой дозы на лабораторных животных и повышая дозировку с проведением мониторинга воздействия и систематически варьируя схему приема. При определении оптимальной дозы для конкретного субъекта должны быть приняты во внимание различные факторы. Такие факторы известны специалисту в данной области.
Дозировка пептида GLP-2 для человека по настоящему изобретению в одном варианте воплощения настоящего изобретения может составлять от около 10 мкг/кг массы тела/день до около 10 мг/кг/день, предпочтительно от около 50 мкг/кг/день до около 5 мг/кг/день и наиболее предпочтительно от около 100 мкг/кг/день до около 1 мг/кг/день.
Медицинские показания.
Пептиды по настоящему изобретению применяют в качестве фармацевтических агентов для профилактики или лечения индивидуума, страдающего заболеваниями желудочно-кишечного тракта, включая пищевод верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, введением эффективного количества аналога GLP-2 или его соли, как описано здесь. Заболевания желудочно-кишечного тракта включают язвы любой этиологии (например, пептические язвы, синдром Золлингера-Эллисона, язвы, обусловленные инфекциями или другими патогенами), нарушения пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченной тонкой кишки, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, (болезнь Крона и язвенные колиты), брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или целиакии), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, диарею и воспаления слизистой оболочки, обусловленные химиотерапией и/или лучевой терапией.
Для пациентов с неоплазией слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта или повышенным риском неоплазии слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, желательно выбирать соединение, такое, чтобы снизить риск или избежать риска возникновения побочных эффектов, таких как стимуляция или осложнения неоплазии слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Например, при выборе соединения для лечения пациента с неоплазией толстой кишки (доброкачественной или злокачественной) или риском развития неоплазии толстой кишки, более подходящим является соединение селективное к тканям тонкого кишечника, относительно тканей к толстой кишки, по сравнению с не селективным соединением или соединением селективным к тканям толстой кишки, относительно тканей тонкого кишечника.
Как было указанно выше, как правило, кандидатами для лечения настоящими аналогами GLP-2 являются индивидуумы, которые будут ощущать положительное воздействие от увеличения массы тонкого кишечника и последствий и/или поддержания нормальной структуры слизистой тонкого кишечника и ее функции. Конкретные состояния, которые могут быть вылечены аналогом GLP-2, включают различные формы спру, включая глютеновое спру, которое является результатом токсической реакции на альфа-глиадин из-за нагревания и может быть результатом глютеновой энтеропатии или целиакии, и отмечает
ся значительная потеря ворсинок тонкого кишечника; тропические спру являются результатом инфекции и отмечается частичное уплощение ворсинок; гипогаммаглобулемические спру, наблюдаемые, как правило, у пациентов с общим неклассифицируемым иммунодефицитом или гипогаммаглобулемией, и отмечается значительное понижение высоты ворсинок. Терапевтическая эффективность лечения аналогом GLP-2 может быть проконтролирована кишечной биопсией для исследования морфологии ворсинок, оценкой поглощения питательных веществ, не инвазивным определением проницаемости кишечника, прибавкой в весе пациента или улучшением симптомов, связанных с этими состояниями.
Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве фармацевтических агентов для профилактики и лечения расстройств желудка, включая язвы любой этиологии (например, пептические язвы, синдром Золлингера-Эллисона, язвы, обусловленные инфекциями или другими патогенами).
Другие состояния, которые могут лечиться аналогами GLP-2 по настоящему изобретению или для которых аналоги GLP-2 могут быть использованы в качестве профилактического средства, включают в дополнение к выше приведенным лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов.
Аналоги GLP-2 также могут быть применены для лечения нарушений питания, например, кахексии и анорексии.
Конкретный вариант воплощения настоящего изобретения относится к применению пептидов по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения повреждений кишечника и его дисфункции. Стволовые клетки слизистой оболочки тонкого кишечника по существу подвержены цитотоксическому воздействию химиотерапии из-за быстрой пролиферации (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). Введение агонистов пептида GLP-2 по настоящему изобретению может усилить воздействие на кишечные крипты и быстро обеспечить рост новых клеток для замещения поврежденного кишечного эпителия, вызванного химеотерапией и/или лучевой терапией. Конечная цель, достигаемая введением пептидов по настоящему изобретению, снижение заболеваемости, связанной с повреждениями желудочно-кишечного тракта у пациентов, получающих химиотерапию, при этом повышается устойчивость к более агрессивной химиотерапии, лучевой терапии и комбинации химиотерапии, лучевой терапии. Сопутствующая профилактика или терапевтическое лечение могут быть проведены в соответствии с настоящим изобретением у пациентов, получающих лучевую терапию, или тех, кто будет ее получать.
Желудочно-кишечные мукозиты после химиотерапии против рака представляют собой большую проблему, которая по существу не решается моментально, но может быть снята поэтапно. Исследования, проведенные с использованием противоопухолевых цитостатических препаратов 5-FU и иринотекана показали, что химиотерапевтический эффект этих лекарственных препаратов, главным образом, оказывает неблагоприятное воздействие на структурную целостность и функцию тонкого кишечника, при этом толстая кишка менее чувствительна и отвечает, главным образом, повышенным образованием слизи. (Gibson et al., J. Gastroenterol Hepatol Sep; 18(9): 1095-110, 2003; Tamaki et al., J. Int Med Res. 31(1):6-16,
2003).
Новые аналоги GLP-2 по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и/или лечения повреждения желудочно-кишечного тракта и побочных эффектов химиотерапевтических агентов. Это потенциально важное терапевтическое применение может быть проведено на сегодняшний день с использованием химиотерапевтических агентов, таких как, но без ограничений: 5-FU, альтрета-мин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, крисантаспас, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, док-сорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, флюороурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идару-бицин, ифосфамид, иринотекан, липосомальный доксорубицин, лейковорин, ломустин, мельфалан, мер-каптопурин, месна, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксель, пеметрексет, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексед, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тиотепа, тиогуа-нин, топотекал, треосульфан, винбластин, винкристин, виндесин, и винорелбин.
Предполагается, что пептиды по настоящему изобретению могут быть применены в способе лечения новорожденных введением эффективного количества аналога GLP-2 или его соли. Осложнения при вскармливании новорожденных, связанные с недоразвитостью желудочно-кишечного тракта, могут быть преодолены применением агонистов пептида по настоящему изобретению.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения описан способ лечения состояний, обусловленных DPP-IV (дипептидилпептидаза-IV), введением пациенту при необходимости эффективного количества аналога GLP-2 или его соли. Такие заболевания включают состояния, при которых фермент DPP-IV вырабатывается в повышенном количестве.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть получена для замедленного выделения указанного аналога GLP-2 или его соли, или производного, как описано выше.
Примеры
Следующие примеры предназначены для пояснения предпочтительных аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Общий пептидный синтез. Приборы и стратегия синтеза.
Пептиды синтезировали ступенчато в полиэтиленовой емкости, оборудованной полипропиленовым фильтром для фильтрации, с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонильной группы (Fmoc), в качестве N-a-амино защитной группы, как стандартно используемой группы для защиты боковых цепей.
Растворители.
ДМФА ^^-диметилформамид, Riedel de-Haen Germany) очищали с помощью колонки, загруженной высокоэффективной катионобменной смолой (Lewatit S 100 МВ/Н strong acid, Bayer AG Leverkusen, Germany) и исследовали перед использованием на наличие свободных аминов путем добавления 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (Dhbt-OH), при наличии свободных аминов происходит окрашивание в желтый цвет (Dhbt-O-анион). Растворитель DCM (дихлорметан, чда, Riedel de-Haen, Germany) использовали непосредственно без предварительной очистки. Ацетонитрил (HPLC-grade, Lab-Scan, Dublin Ireland) использовали непосредственно без предварительной очистки.
Аминокислоты.
Fmoc-защищенные аминокислоты были получены от Advanced ChemTech (ACT). Сшивающие агенты.
Сшивающий агент диизопропилкарбодиимид (DIC) был получен от Riedel de-Haen, Germany. Твердые подложки.
Пептиды синтезировали на смолах TentaGel S 0,22-0,31 ммоль/г. TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc (Rapp полимер, Germany) использовали в случаях, когда был предпочтительным амидиро-ванный по С-концу пептид, в то время как TentaGel S РНВ, TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc использовали, когда была предпочтительной свободная С-концевая карбоксильная группа.
Катализаторы и другие реагенты.
Диизопропилэтиламин (DIEA) был получен от Aldrich, Germany, пиперидин и пиридин от Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany. Этандитиол был получен от Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany. 3,4-Дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (Dnbt-ОН), 1-гидроксибензотриазол (HOBt) (HOAt) были получены от Fluka, Switzerland. Уксусный ангидрид был получен от Fluka.
Процедуры сшивания.
Аминокислоты сшивали посредством получения in situ HObt или HOAt эфиров из соответствующей N-a-защищенной аминокислоты и HObt или HOAt с DIC в DMF. Степень ацилирования проверяли с использованием нингидринового теста, выполненного при 80°С, в целях предотвращения Fmoc-депротекции (Larsen,B. D. и Holm, A., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9).
Депротекция N-a-защитной группы(Fmoc).
Снятие Fmoc-группы выполняли обработкой 20% пиперидином в DMF (1x5 и 1x10 мин.), с последующей отмывкой с использованием DMF (5x15 мл, по 5 мин. каждая), пока после добавления Dhbt-OH к слитому DMF не переставал обнаруживаться желтый цвет.
Сшивание HOBt-эфиров.
3 экв. N-a-защищенных аминокислот растворяли в DMF с 3 экв. HObt и 3 экв. DIC, после чего полученный раствор добавляли к смоле.
Снятие пептида кислотой со смолы.
Пептиды снимали со смолы путем обработки 95%-ным (по объему) водным раствором трифторук-сусной кислоты (TFA, Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany) или 95%-ым (по объему) раствором TFA с 5% этандитиола при комнатной температуре в течение 2 ч. Профильтрованные смолы промывали 95%-ным водным раствором TFA, после чего фильтраты и промывки выпаривали при пониженном давлении. Остаток промывали эфиром и лиофильно высушивали от водной уксусной кислоты. Неочищенный лио-фильно высушенный продукт анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и идентифицировали масс-спектрометрией (MS).
Ступенчатый пептидный синтез на смоле TentaGel (PEG-PS).
Смола TentaGel (1 г, 0.23-0.24 ммоль/г) была помещена в полиэтиленовую емкость, оборудованную полипропиленовым фильтром для фильтрации. После набухания в DMF (15 мл), смолу обработали 20% раствором пиперидина в DMF для делетирования начальной Fmoc группы либо на линкере TentaGel S RAM, либо на первой аминокислоте на смоле TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc. Смола была высушена и промыта DMF, пока после добавления Dhbt-OH к слитому DMF не переставал обнаруживаться желтый цвет. Аминокислоты в соответствии с последовательностью были присоединены в виде Fmoc-защищенных HObt эфиров (3 эк.), как описано выше. Сшивание проводилось в течение 2 ч, если не указано другое. Смола была высушена и промыта DMF (5x15 мл, 5 мин каждый), чтобы удалить избыток реагента. Степень ацилирования была проверена с помощью нингидринового теста, как описано выше. После завершения синтеза смола с пептидом была промыта DMF (3x15 мл, по 5 мин), DCM (3x15 мл, по
1 мин), и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин), после чего высушена в вакууме. Пептид был снят со смолы, как описано ранее, после чего неочищенный пептид был проанализирован и очищен, как описано ниже.
Параметры ВЭЖХ.
Градиент ВЭЖХ-анализ проводили с использованием ВЭЖХ-системы Hewlett Packard HP 1100, состоящей из насоса для четырехкомпонентных смесей HP 1100, автосэмплера HP 1100, колоночного термостата HP 1100 и HP 1100 многоволнового детектора. Для управления прибором и снятия данных использовали Hewlett Packard Chemstation с программным обеспечением для ЖХ (rev. A.06.01). Использовались следующие колонки и система ВЭЖХ буферов:
Колонка: VYDAC 238TP5415, С-18, 5 мм, 300 А 150x4.6 мм;
Буферы: А: 0,1% TFA в MQV; В: 0,085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN;
Градиент: 0-1,5 мин 0% В;
1,5-25 мин 50% В;
25-30 мин 100% В;
30-35 мин 100% В;
35-40 мин 0% В;
Поток 1 мл/мин, температура 40°С, УФ-детекция: I = 215 нм. ВЭЖХ очистка пептида.
Неочищенные пептидные продукты очищали с помощью PerSeptive Biosystems VISION Workstation. Для управления прибором и получения данных использовали программу VISION 3.0. Использовали следующую колонку и систему ВЭЖХ буферов:
Колонка: Kromasil KR 100 А, 10 мм С-8, 250x50.8 мм;
Буферная система: Буферы: А: 0,1% TFA в MQV; В: 0,085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN; Градиент: 0-37 мин 0-40% В;
Поток 35 мл/мин, УФ-детекция: I = 215 нм и 280 нм. Масс-спектрометрия.
Пептиды растворяли в суперградиенте метанола (Labscan, Dublin, Ireland), деионизированной воды (Millipore, Bedford, MA) и муравьиной кислоты (Merck, Damstadt, Germany) (50:50:0,1 по об.) до концентраций в диапазоне 1-10 мг/мл. Растворы пептидов (20 мл) анализировали в режиме положительной поляризации ESI-TOF-MS с использованием масс-спектрометра LCT (Micromass, Manchester, UK) с точностью ±0.1 m/z.
Общая стратегия синтеза.
Во всех синтезах сухую смолу TentaGel-S-Ram (1г, 0.22-0.31 ммоль/г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации. После набухания в DMF (15мл), смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF, чтобы обеспечить присутствие непротонированных аминогрупп на смоле. Смолу высушивали и отмывали DMF, пока после добавления Dhbt-OH к слитому DMF не переставал обнаруживаться желтый цвет. Аминокислоты в соответствии с последовательностью пептида присоединяли в виде Fmoc-защищенных HOBt эфиров (3 эк.), как описано выше. Если иное не определено, то сшивку продолжали в течение 2 ч. Смолу высушивали и промывали в DMF (5x15 мл, по 5 мин каждый цикл) для того, чтобы удалить лишний реактив. Степень ацилирования проверяли нингид-риновым тестом, выполненным при 80°С. После окончания синтеза пептида, смолу промывали DMF (3x15 мл, по 5 мин каждый цикл), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый цикл) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый цикл) и высушивали в вакууме. После чего пептид снимали со смолы, как описано выше, лиофильно высушивали.
После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано выше, пептид собирали и идентичность пептида подтверждали с помощью ES-MS. Эта процедура использовалась для синтеза всех пептидов, приведенных в качестве примеров далее ниже.
Синтезируемые соединения.
Используя вышеупомянутые методы, соединения с 2264 по 2424 (и эталонное соединение 1559 (H-[Gly2]hGLP-2-OH) синтезировали, как описано выше (табл. 1).
Пример 1. Синтез соединения 2264.
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala*Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-AJa-Ala-Asp-
Phe-Ile-Ala^-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2HaTentaGel S RAM.
Сухой TentaGel S RAM (0,2 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в "множественном пептидном син
тезе на смоле TentaGel" до окончания сшивки N-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной N-концевой Fmoc группы, пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, получали 413 мг пептида с чистотой более чем 93%, идентичность пептида подтверждали MS (полученная масса 3488,13, расчетная масса 3487,79). Пример 2. Синтез соединения 2268.
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-
8ег-А8р-РЬеЛ1е-8ег-Тф-Ьеи-11е-8ег-Тпг-ЬуБ-11е-ТЬг-Аф-МН2 на TentaGel S RAM.
Сухой TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc (0,2 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в "множественном пептидном синтезе на смоле TentaGel" до окончания сшивки N-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной N-концевой Fmoc группы, пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, получали 132 мг пептида с чистотой более чем 91%, идентичность пептида подтверждали MS (полученная масса 3535,88, расчетная масса 3535,77).
Пример 3. Синтез соединения 2264 (Lys6).
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-
Asp-Phe-Ile-Ala-T^-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-> M2 на
TentaGel S RAM-Lys(Boc)- Fmoc.
Сухой TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc (0,2 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в "множественном пептидном синтезе на смоле TentaGel" до окончания сшивки N-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной N-концевой Fmoc группы, пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, собирали пептидный продукт с чистотой более чем 90%, идентичность пептида подтверждали MS (полученная масса 4256,40, расчетная масса 4256,36).
Пример 4. Синтез соединения 2268 (Lys6).
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-
Зег-Азр-РЬе-Ие-Зег-Тф-Ьеи-Ие-Зег-ТЬг-Ьуз-Ие-ТЬг-Азр-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-ННг на TentaGel S RAM-Lys(Boc)- Fmoc.
Сухой TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc (0,24 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в "множественном пептидном синтезе на смоле TentaGel" до окончания сшивки N-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной N-концевой Fmoc группы, пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, собирали пептидный продукт с чистотой более чем 90%, идентичность пептида подтверждали MS (полученная масса 4304,10, расчетная масса
4304,34).
Пример 5. Синтез соединения 2264 (ацетат).
Противоионный обмен трифторацетата на ацетат соединения 2264.
Очищенный синтезированный пептид соединения 2264 выделяют, как трифторацетат в присутствии трифторуксусной кислоты (0,1% по объему) в буферах ВЭЖХ, используемых для очистки неочищенного синтезированного пептида.
Для того чтобы поменять трифторацетатный противоион на ацетатный, раствор пептида пропускали через колонку, нагруженную высокоэффективной ионообменной основной смолой (Dowex 1x8). Соединение 2264Т растворяли в воде. Раствор пропускали через колонку, содержащую высокоэффективную ионообменную основную смолу (Dowex 1x8; емкость 1,33 мэк/мл смолы). Затем смолу промывали водой, после чего собранный элюат лиофилизировали, получив в результате ацетат с чистотой более
90%.
Пример 6. Синтез соединения 2264 С (хлорид).
Противоионный обмен трифторацетата (Tfa) на хлорид (Cl-) соединения 2264.
Соединение 2264Т растворяли в 0,1 М соляной кислоте, и результирующий раствор лиофилизиро-вали. Осадок растворяли в воде и снова лиофилизировали с получением хлорида с чистотой более 90%. Дополнительно в табл. 2 приведены селективные соединения аналогов GLP-2.
соединение
HPI
3,8
3,8
3.8
3.8
3,8
- 1,4
- 1,4
¦ 1,4
- 1,4
- 1,4
1,2
1.2
1,2
1.2
1,2
1.2
1,2
1,2
1,2
-20
- 18
- 18
- 16
С Кб
соединение
12 13
23 24
26 27
30 31
HPI
Т 1
1 L
L I
К 1
Кб 19
Т 1
1 F
L 1
К 1
Кб 14
Т 1
I V
L I
К 1
Кб 21
Т I
I I
L 1
К 1
Кб 22,5
Т 1
1 S
L I
К I
Кб 5,2
Т !
I S
L I
К 1
Кб 6,6
Т !
1 S
L I
К I
Кб 6
Т 1
1 S
L I
К I
Кб 3,2
Т 1
I G
L I
К 1
Кб 2,4
Т [
1 G
L 1
К I
Кб 6,4
Т 1
1 G
L 1
К I
Кб 7,8
Т I
1 G
1. 1
К 1
Кб 7,2
Т I
1 G
L 1
К 1
Кб 4,4
Т 1
I S
L 1
К 1
К.6 1,2
Т [
1 А
L 1
К 1
Кб 6,4
Т [
1 S
L 1
К 1
Кб 6,4
Т 1
I А
L [
К 1
Кб 6.4
Т I
1 S
L t
К 1
Кб 3,8
Т 1
I S
L 1
К I
Кб 3,8
Т [
I А
L I
К 1
Кб 3,8
Пример 7. Исследование относительной химической стабильности.
Соединения, приведенные в табл. 3, растворяли в 0,1 М HCl до номинальной концентрации 0,5 мМ. Образцы инкубировали в течение 7 дней при 40°С в темноте и затем разводили до номинальной концентрации 0,2 мг/мл и анализировали на ОФ-ВЭЖХ на чистоту первоначального основного пика и с помощью LC-MS для подтверждения идентичности по массе главного пика и основных продуктов деградации.
Соединения анализировали в номинальной концентрации 0,2 мг/мл на ОФ-ВЭЖХ и LC-MS на колонке Phenomenex Gemini С18, 3 мкм, 110 А, 3x150 мм с мобильной фазой 0,1% TFA в MQW и в MeCN ступенчато от 25 до 48% MeCN в течение 39 мин. Со скоростью потока 0,400 мл/мин. Термостат колонки установлена на температуру 50°С, температура автодозатора составляет 4°С и УФ детектировании при длине волны 220 нм. Результаты по очистке приведены в табл. 3.
Таблица 3
* Элюированный на фазе промывки при аналитической ОФ-ВЭЖХ.
Повторный/дублированные данные, приведены в примере 7 с модифицированным способом аналитической ОФ-ВЭЖХ. Repeated data shown in example 7 with a modified analytical RP-HPLC method.
Четыре соединения (ZP2264, ZP2267, ZP2268 и ZP2272) элюировали позднее на стадии промывки при использовании аналитического способа и эксперимент повторяли с этими четырьмя соединениями при использовании модифицированного способа, как описано далее.
Пример 8. Исследование химической стабильности.
Соединения, приведенные в табл. 4, растворяли в 0,1 М HCl до номинальной концентрации 0,25 мМ. Образцы инкубировали в течение 2 дней при 40°С в темноте и затем разводили до номинальной концентрации 0,2 мг/мл и анализировали на ОФ-ВЭЖХ на чистоту первоначального основного пика и с помощью LC-MS для подтверждения идентичности по массе главного пика и основных продуктов деградации.
Соединения анализировали в номинальной концентрации 0,2 мг/мл на ОФ-ВЭЖХ и LC-MS на колонке Phenomenex Gemini С18, 3 мкм, 110 А, 3x150 мм с мобильной фазой 0,1% TFA в MQW и в MeCN ступенчато от 25 до 80% MeCN в течение 39 мин. Со скоростью потока 0,400 мл/мин. Термостат колонки установлена на температуру 50°С, температура автодозатора составляет 4°С и УФ-детектировании при длине волны 220 нм. Результаты по очистке приведены в табл. 4.
Пример 9. In vitro скрининг агониста рецептора GLP-2 рекомбинантно экспрессированного в клетках ВНК-21*.
Скрининг проводили с использованием клеток BHK-21 транзиентно трансфицированных рецептором GLP-2 и CRE-luciferase reporter gene construct. Доза-зависимые кривые и показатели ЕС50 определяли с использованием семи концентраций в пределах от 10 fM до 10 нМ и трехкратным повтором каждой концентрации. Контрольные пептиды использовали на всех пластинах.
*) Тест проводили с использованием AMRI Будапешт, Венгрия.
Материалы и методы.
Материалы и используемые клетки:
Колбы для выращивания культуры тканей Nunc или Greiner; 10 см ТС чашки Петри Nunc или Greiner (Nunc 172931); 96-луночные пластины Nunc или Greiner для продукта (Nunc 167008);
Клетки ВНК-21 (С13);
Белые 96-луночные пластины (PerkinElmer 6005680); Глубоко-луночные пластины для разведения (Nunc 278752); Glasgow MEM (Sigma G5154);
DMEM свободный от фенолового красного (Invitrogen/Gibco 31053-028); Фетальная телячья сыворотка (FCS, Invitrogen/Gibco Zealand batch); Незаменимые аминокислоты (100x) (Invitrogen/Gibco 11140-035);
200 мМ глютамин (100x) (Invitrogen/Gibco 25030-024);
Пенициллин/Стрептомицин (100x) (Invitrogen/Gibco 15140-122); Пируват натрия (100x) (Invitrogen/Gibco 11360-039);
D-PBS (Invitrogen/Gibco 14190-094);
1х раствор трипсин-EDTA (Invitrogen/Gibco 25300-054); Opti-MEM (Invitrogen/Gibco 31985-047); Липофектамин 2000 (Invitrogen 11668-027); CRE-luc вектор (Zealand batch); hGLP2R вектор (Zealand batch);
10% (масса/объем) стерильный BSA в DMEM (Sigma 05488); 10 мМ (200x) IBMX в DMEM (Sigma 15879); Набор LucLite (Perkin Elmer 6016911);
Topseal-A (Perkin Elmer 6005185). Среды и буферы.
Ростовая среда для клеток BHK-21 (С13):
Glasgow MEM+ 2 мМ глютамина (1:100) + 10% FCS + 1% NEAA + 1% Пен/Стреп + 1 мМ пирувата натрия (1:100).
Свободная от антибиотиков трансфекционная среда для клеток ВНК-21(С13): Glasgow MEM + 2 мМ глютамина (1:100) + 1% NEAA + 1 мМ пирувата натрия (1:100). Пост-трансфекционная среда для клеток BHK-21(d3):
Glasgow MEM + 2 мМ глютамина (1:100) + 0.2% FCS + 1% NEAA + 1% Пен/Стреп + 1 мМ пирувата натрия (1:100).
Раствор для покрытия: D-PBS + 1% BSA. Буфер для растворения пептидов: D-PBS + 0.1% BSA. Буфер для стимуляции:
DMEM свободный от фенолового красного + 2 мМ глютамина (1:100) + 50 мкМ IBMX + 0,3% BSA. Протокол скрининга пептиждов трансфецированных клеток BHK-21 (С13).
Клетки ВНК-21 высевали на 10см ТС-чашки Петри и вьфащивали до 70-80% слияния. Затем среду заменяли свободной от сыворотки трансфекционной средой. ДНК (7,5мкг вектора, кодирующего рецептор hGLP-2 и 7,5мкг вектора CRE-люциферазы) и липофектамин 2000 разводили в OptiMEM, комбинировали и добавляли к клеткам через 20-30 мин. Клетки инкубировали в термостате при температуре 37°С, 5%СО2 в течение 4 часов, трипсинизировали и повторно высевали 35000 клеток на лунку в 96-луночную пластину. Клетки инкубировали в течение ночи в полноростовой среде для экспрессии трансгенов. Все пластины, использованные для получения разведенных растворов аналогов GLP-2, предварительно покрывали 1% BSA в физиологическом растворе с фосфатным буфером в течение 2 ч и сушили в течение ночи. Аналоги GLP-2 растворяли в PBS/0,1% BSA до 250 мкМ и разводили в две стадии от 10 мкМ до 100 нМ соответственно в среде свободной от фенолового красного и сыворотки, содержащей ингибитор фосфодиэстеразы и 0,3% BSA (стимулирующий буфер). Далее, аналоги GLP-2 разводили сериями в том же самом стимулирующем буфере до концентраций от 10 нМ до менее 10 fM. Исходная активность контролировалась только стимулирующим буфером. Эти растворы предварительно нагревали до температуры 37°С в течение 30 мин. Клетки промывали предварительно нагретым до температуры 37°С стимулирующим буфером и инкубировали 100 мкл предварительно нагретых разведениях пептидов и осуществляли контроль в течение 5 часов при температуре 37°С, 5% СО2. Субстрат фермента LucLite/лизисный буфер получали незадолго до окончания инкубирования. В каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата LucLite, и измеряли свечения на подходящем устройстве (например, Wallac Victorll). Показатели ЕС5 получали на основе исходных данных, отвечающих требованиям четырех параметров логистического уравнения (Microcal Origin 5.0 или GraphPad 4).
Результаты приведены в табл. 5.
Таблица 5
Скрининг аналогов GLP-2 в клетках, экспрессирующих рецептор GLP-2 ZPID 2263 2264 2266 2267 2268 2269 2270 2272 2242 рЕС50 10,84 11,5 9,253 10,87 11,21 10,04 10,23 11,27 12,41 SEM 0,1929 0,2419 0,2272 0,3139 0,2239 0,09546 0,1449 0,1668 0,1971
Заключение. Результаты ясно указывают, что все соединения являются агонистами GLP-2.
Пример 10. Тест in vivo на стимуляцию роста тканей кишечника на самцах мышей C57BL.
Способность соединений по настоящему изобретению (ZP2264, ZP2266, ZP2267, ZP2268, ZP2242, ZP2269, ZP2270, ZP2272 и ZP2242) селективно стимулировать массу тонкого кишечника по сравнению с массой толстой кишки на самцах мышей C57BL. Индивидуальные группы (n=6-10) мышей получали 800 нмоль/кг каждого соединения, подкожно, дважды в день в течение трех дней последовательно. Для сравнения другие группы животных получали или эквимолярные дозы [Gly2]GLP-2 или носитель (физиологический раствор, забуференный фосфатом, рН 7,4) в таком же режиме дозировки. Через 24 ч после получения последней дозы соединения мышей умертвляли и тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) извлекали и взвешивали для определения воздействия на массу тонкого кишечника.
Для корректировки небольших различий массы тела (BW), массу органов тонкой кишки и толстой кишки выражали по отношению к массе тела. Не селективное указанное соединение [Gly2]GLP-2 показало стимуляцию роста желудочно-кишечного тракта для пищевода, желудка, тонкой кишки и толстой кишики и оценивали различия в росте, индуцированном соединениями, индекс чувствительности тканей тонкого кишечника-толстой кишки к соединению X рассчитывали, как:
(Тонкий кишечник/Толстая кишка)х (Тонкий кишечник/Толстая кишка)[шу2рц> -2%
Соединения с индексом чувствительности тканей тонкого кишечника-толстой кишки составляющие более чем или эквивалентные 1,10 рассматривали, как селективные к тканям тонкого кишечника.
Результаты.
Воздействие тестируемых соединений по настоящему изобретению определяли, исходя из способности пептидов селективно увеличивать массу тонкого кишечника по сравнению с массой толстой кишки. На фиг. 1 и 2 показана относительная масса тонкого кишечника при введении следующих указанных
соединений, [Gly2]GLP-2 и ZP2264, ZP2266, ZP2267, ZP2268, ZP2242, ZP2269 и ZP2272 по сравнению с
контролем, обработанным носителе. На фиг. 3 и 4 показано воздействие тестируемых соединений на соотношение массы тонкого кишечника к массе толстой кишки по сравнению с таковым при обработке указанным соединением [Gly2]GLP-2. Соотношение массы тонкого кишечника к массе толстой кишки у животных, получавших [Gly2]GLP-2, было принято за 100%. Тестируемые соединения, селективные к тканям тонкого кишечника, исходя из расчета индекса чувствительности тканей тонкого кишечника
толстой кишки по сравнению с таковым при обработке указанным соединением [Gly2]GLP-2, приведены в табл. 6. У животных, получавших [Gly2]GLP-2, индекс чувствительности тканей тонкого кишечника-толстой кишки был принят за 1. Воздействие тестируемых соединений на массу тонкого кишечника и толстой кишки по сравнению с указанным соединением [Gly2]GLP-2 приведено в табл. 7. У животных, получавших [Gly2]GLP-2, масса тонкого кишечника и толстой кишки бала принята за 100%.
Таблица 6
Список индекса чувствительности тестируемых соединений тканей тонкого кишечника - толстой кишки по сравнению с указанным соединением [Gly2]GLP-2. HT: не определяли. *: Р <0,05 по сравнению с
[Gly2]GLP-2
Индекс селективности
ТОНК.КИШ.- ТОСТ. киш.
Позиции 1 2 3 4 5 6 7 * 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Указанное соединение [Gly^GLP^
HCD0SFSDEMN7ILDNLAARDF1NWLIQTKI TD ОН
1,00±0.02
Соединения, селективные для тонкого кишечника
ZP2264 HGEGSFSDELAT1LEALAAADFIAWLIATKI TD NH! ZP2268 Н G Е G S FSDELAT I LDNLAARDF 1 SWL 1 STK 1 Т D NH2
|.15±0,03*
Пример 11. Тест in vivo на стимуляцию роста тканей кишечника на самцах мышей C57BL.
Способность дополнительных соединений селективно стимулировать массу тонкого кишечника по сравнению с массой толстой кишки на самцах мышей C57BL. Использовали протокол аналогичный описанному выше в Примере 10 за исключением того, что ежедневно вводили 200 нмоль/кг каждого соединения. Индивидуальные группы (n=6-10) мышей получали 200 нмоль/кг каждого соединения, подкожно, дважды в день в течение трех дней последовательно. Другие группы животных получали эквимолярные дозы [Gly2]GLP-2 (указанное соединение) или носитель (физиологический раствор, забуференный фосфатом, рН 7,4; отрицательные контроли) в таком же режиме дозировки. Через двадцать четыре часа после получения последней дозы соединения мышей умертвляли и тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) извлекали и взвешивали для определения воздействия на массу тонкого кишечника
Как показано на фиг. 6, соединения ZP2380, ZP2381, ZP2384, ZP2385, ZP2397, ZP2398, ZP2399, ZP2411, ZP2417, ZP2418, ZP2420, ZP2423, по настоящему изобретению способны селективно увеличивать массу тонкого кишечника относительно массы толстой кишки.
Пример 12. Тест in vivo на стимуляцию роста тканей желудка на самцах мышей C57BL.
Воздействие тестируемых соединений по настоящему изобретению определяли, исходя из способности пептидов селективно увеличивать массу желудка по сравнению с контролем, обработанным носителем. Способность соединений по настоящему изобретению (ZP2395, ZP2396, ZP2400, ZP2412, ZP2394 и ZP2401) селективно стимулировать массу желудка относительно массы толстой кишки на самцах мышей C57BL. Индивидуальные группы (n=6-10) мышей получали 200 нмоль/кг каждого соединения, подкожно, дважды в день в течение трех дней последовательно. Для сравнения другие группы животных получали или эквимолярные дозы [Gly2]GLP-2 или носитель (физиологический раствор, забуференный фосфатом, рН 7,4) в таком же режиме дозировки. Через 24 ч после получения последней дозы соедине
ния мышей умертвляли желудок и тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) извлекали и взвешивали для определения воздействия на массу тонкого кишечника. Для корректировки небольших различий массы тела (BW), массу органов желудка выражали по отношению к массе тела. На фиг. 7 показано, что соединения 2Р2395, ZP2396, ZP2400, ZP2412, ZP2414, ZP2416, ZP2394 и ZP2401 способны селективно увеличивать массу желудка относительно массы толстой кишки.
Указанное соединение [Gly2]GLP-2, не показало стимуляции массы желудка, при этом номера ZP соединений увеличивающих массу желудка по отношению с массой тела приведены на (фиг. 7). Оценку различий в росте, индуцированном соединениями ZP по сравнению с [Gly2]GLP-2, индекс чувствительности тканей желудка-толстой кишки к соединению X рассчитывали, как:
(Желудок/Толстая 1шшка)х/Желудок/Толстая гашка^ш^ры^^
Соединения с индексом чувствительности тканей желудка-толстой кишки, составляющие более чем или эквивалентные 1,05 рассматривали, как селективные относительно тканей желудка.
Соединения ZP2267, ZP2386, ZP2404, ZP2413, ZP1415, ZP2402, ZP2403, ZP2382, ZP2266, ZP2378, ZP2414, ZP2416, ZP2424, ZP2379, ZP2269 не селективны к тканям тонкого кишечника, толстой кишки или желудка (фиг. 8).
В табл. 8 суммированы данные, полученные по примерам 10-12.
2424
0,88
0,93
2416
0,97
1,04
2379
0,91
1,02
2269
97,4
94,7
99,8
1,03
1,05
специф.
пептид.
2400
106
106
111
1,00
1,05
2412
106
0,95
1,07
2396
104
102
117
1,02
1,15
2395
1,01
1,16
2394
105
109
1,09
1,14
2401
107
1,11
1,22
Пептиды, спецфич. к желудку
2242
111,7
106,6
99,6
1,05
0,93
2411
117
111
106
1,05
0,95
2380
108
102
1,06
0,96
2384
128
118
100
1,08
0,85
2268
123,6
112,5
87,4
1,10
0,78
2398
108
102
1,11
1,05
2420
112
101
1,11
0,89
2417
119
106
1,12
0,85
2272
118,1
104,7
0,92
2423
123
109
1,13
0,86
2264
125,7
109,5
1,15
0,79
2385
110
1,16
0,98
2399
119
103
115
1,16
1,12
2418
117
100
1,17
0,91
2381
123
104
1,18
0,88
2397
122
101
109
1,21
1,08
Специфич. к тонк. киш
2263
2270
Данные показывают, что интервал HPI для отдельных позиций 11, 16, 20, 24 и 28 для аналогов GLP-2, специфичных к тонкому кишечнику, будут независимы для позиций 11 и 16 по меньшей мере -0,8 < HPI <3,8, или предпочтительно -0,8 < HPI < 2,8, или более предпочтительно HPI = 1,8.
Для позиций 20, 24 и 28 интервал HPI должен быть для отдельных позиций независимо по меньшей мере -0,8 < HPI20> 24j 28 < 1,8 или предпочтительно < -0,8 HPI20 < 1,8 и более предпочтительно HPI24> 28 < -0,8.
Возможные замещения амино паттернов для пептидов селективных к тканям тонкого кишечника согласно интервалам HPI приведены в табл. 10.
Следовательно, каждый из X11, X16, Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr. В частности, каждый из X11 и X16 независимо может представлять собой Ala или Ser, и Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr. Например, X11 и X16 оба могут представлять собой Ala, и Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или
Thr.
Пример 14. Воздействие HPI на специфичность тканей желудка.
В табл. 11 приведены данные HPI для пептидов GLP-2 специфичных для тканей желудка согласно индексу чувствительности тканей желудка/тканей тонкого кишечника.
Данные показывают, что интервал HPI для отдельных позиций 11, 16, 20, 24 и 28 для аналогов GLP-2 специфичных к желудку будут независимы для позиций 11 и 16 по меньшей мере -3,9 < HPI1116 < 3,8 или предпочтительно 2,8 < HPIn> 16 < 3,8 или HPI11j 16 = 3,9 и для позиций 20,24 и 28 HPI должен/может независимо составлять по меньшей мере -3,9 < HPI20> 24j 28 < 1,8 или предпочтительно -0,8 < HPI20> 24j 28 < 1,8 или HPI20> 24j 28 = -3,9.
Возможные замещения амино паттернов для пептидов селективных к тканям тонкого кишечника согласно интервалам HPI приведены в табл. 12.
Следовательно, соединениями специфичными к тканям желудка являются:
X11 может представлять собой Leu, Phe или Lys;
Х16 может представлять собой Leu, Phe или Lys;
Х20 может представлять собой Ala или Ser;
Х24 может представлять собой Ala, Ser или Lys;
Х28 может представлять собой Ala, Ser или Lys.
Например, X11 и X16 независимо может представлять собой Leu или Phe; Х20, Х24 и Х28 может представлять собой Ser.
Воздействие потенциального образования водородных связей (НВР) на специфичность рецептора.
Как было указано выше, специфичность рецептора аналогов GLP-2 также была обнаружена под действием влияния to be governed потенциального образования водородных связей by the hydrogen bonding potential указанных выше позиций 11, 16, 20, 24 и 28.
Потенциальное образование водородных связей (НВР) были введены/рассмотрены и определены для отдельных аминокислот W.D. Stein, "The movement of molecules across cell membranes"; Academic Press N.Y. 1967, p. 65-125, и обеспечивают/придают данными цепочкам аминокислот для образования водородных связей.
НВР для отдельных аминокислот приведены в табл. 13.
Пример 15. Воздействие потенциального образования водородных связей (НВР) на специфичность тканей желудка.
Воздействие потенциального образования водородных связей (НВР) на специфичность тканей желудка.
Примеры аналогов специфичных к тканям желудка приведены в табл. 14.
Согласно таблице интервалы НВР для отдельных позиций 11, 16, 20, 24 и 28 для аналогов GLP-2 специфичных к тканям желудка будут независимы для всех позиций по меньшей мере 0 < HPI11> 16j 20j 24j 28 < 2. В соотвествии с интервалами НВР возможные замещения амино паттернов приведены в табл. 15.
Предпочтительные специфичные к тканям желудка аналоги представляют собой аналоги GLP-2 с ин-тевалами НВР для позиций 11 и 16 HBP11} 16 = 0 и для позиций 20, 24 и 28 независимо 0 < НВР20> 24> 28 < 2. Определенными соединениями специфичными к тканям желудка являются: X11 может представлять собой Leu, Phe или Lys; X16 может представлять собой Leu, Phe или Lys; Х20 может представлять собой Ala или Ser; Х24 может представлять собой Ala, Ser или Lys; Х28 может представлять собой Ala, Ser или Lys.
Например, X11 и X16 независимо может представлять собой Leu или Phe, X24 и Х28 может представлять собой Lys или Ser, Х20 может представлять Ser. Например, X11 и X16 независимо может представлять собой Leu или Phe, Х20, Х24 и Х28 может представлять собой Ser.
Пример 16. Воздействие потенциального образования водородных связей (НВР) на специфичность тканей тонкого кишечника.
Также было обнаружено, что аналоги GLP-2 специфичные к тканям тонкого кишечника отвечают параметрам, таким как, потенциальное образование водородных тканей выше указанных конкретных позиций 11, 16, 20, 24 и 28. НВР для отдельных аминокислот, приведенных в табл. 16.
Согласно таблице интервалы НВР для отдельных позиций 11, 16, 20, 24 и 28 для аналогов GLP-2 специфичных к тканям тонкого кишечника будут независимы для всех позиций по меньшей мере
0 < HBPn, 16, 20, 24, 28 < 2.
Предпочтительные аналоги имеют интервал НВР для позиции 11 и 16 НВРП, 16 = 0 и позиции 20, 24, и 28 имеют независимые интервал НВР 0 < HPI20, 24, 28 < 2.
Более предпочтительные аналоги GLP-2 показывающие специфичность к тканям тонкого кишечника представляют собой пептиды с интервалом НВР для позиции 11 и 16 НВРП, 16 = 0, НВР20 = 0-2 и НВР24, 28 = 2. Определенные образцы замещений приведены в табл. 17.
Следовательно, соединениями, селективными к тканям тонкого кишечника, являются каждое из X11, Х16; Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr. Например, каждое из X11 и X16 независимо может представлять собой Ala или Ser, и Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr. Например, X11 и Х16 оба могут представлять собой Ala, и Х20, Х24 и Х28 независимо может представлять собой Ala, Ser, Gly или Thr.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается описанием и конкретными вариантами воплощения настоящего изобретения, поскольку на их базе могут быть получены эквивалентные варианты и модификации. Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения иллюстрируют его, но не ограничивают. В варианты воплощения настоящего изобретения могут быть внесены различные изменения, без отклонения от цели и объема настоящего изобретения. Все цитируемые здесь документы введены ссылкой.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Аналог глюкано подобно го пептида 2 (GLP-2), представленный общей формулой II R'-Z'-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xll-X12-X13-X14-X15-X16-X17-
X18-X19-X20-X21-Phe-Ik-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R25
где R1 представляет собой водород, 01-4алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или три-фторацетил;
Х2 представляет собой Gly, Ala или Sar; Х3 представляет собой Glu или Asp; Х5 представляет собой Ser или Thr; Х6 представляет собой Phe или Pro; Х7 представляет собой Ser или Thr; Х8 представляет собой Asp или Ser; Х9 представляет собой Glu или Asp;
X10 представляет собой Met, Leu, Nle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту;
X11 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr;
X12 представляет собой Thr или Lys;
X13 представляет собой Ile, Glu или Gln;
Х14 представляет собой Leu, Met или Nle;
X15 представляет собой Asp или Glu;
X16 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr;
X17 представляет собой Leu или Glu;
X18 представляет собой Ala или Aib;
X19 представляет собой Ala или Thr;
Х20 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr;
Х21 представляет собой Asp или Ile;
Х24 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr;
Х28 представляет собой Ala, Gly, Ser или Thr;
Х31 представляет собой Pro, Ile или делетирована;
Х32 представляет собой Thr или делетирована;
Х33 представляет собой Asp, Asn или делетирована; представляет собой NH2 или ОН;
Z1 и Z2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 1-10 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met и Orn;
или фармацевтически приемлемая соль или его производное.
2. Аналог GLP-2 по п.1, где аналог GLP-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности GLP-2 дикого типа (1-33), и обладает биологической активностью, вызывающей увеличение массы кишечника in vivo.
3. Аналог GLP-2 по п.1 или 2, где аналог GLP-2 также включает одно или более замещение в сравнении с GLP-2(1-33) дикого типа в позициях Х3, Х5, Х7 и/или Х10.
4. Аналог GLP-2 по п.1, где указанные замещения в позиции X10 представляют собой Leu, NIe или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту, такую как Met(O) или Met(O)2.
5. Аналог GLP-2, представленный общей формулой III
Rl-His-Gly-GIu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-Xl 1-Thr- Ile -Leu-X15-X16-Leu-Ala-
Ala-X20-Asp-Phe- Ile -X24-Trr> Leu- Ile -X28-Thr-Lys- Ile -Thr-Asp-NH2,
где R1 представляет собой водород, С1-4алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или три-фторацетил;
Х8 представляет собой Asp или Ser, предпочтительно Asp; X11 представляет собой Ser или Ala;
X15 представляет собой Glu или Asp, предпочтительно Glu; X16 представляет собой Ser или Ala; Х20 представляет собой Ser или Ala; Х24 представляет собой Ser или Ala; Х28 представляет собой Ser или Ala;
или его фармацевтически приемлемая соль или его производное.
6. Аналог GLP-2 по п.1, который представляет собой
2263 H-HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITD- NH2
2264 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD- NH2
2267 H-HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITD- NH2
2268 H-HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD- NH2
2272 H-HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD- NH2
7. Аналог GLP-2 по любому из пп.1-5, где аналог GLP-2 обладает способностью увеличивать рост тканей в тонком кишечнике по сравнению с толстой кишкой.
8. Аналог GLP-2 по п.7, где каждый из X11 и X16 независимо выбран из Ala и Ser и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala, Ser, Gly или Thr.
9. Аналог GLP-2 по п.8, где X11 и Х16 оба Ala и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala, Ser, Gly или Thr.
10. Аналог GLP-2 по п.8, где X11 и Х16 оба Ala и Х20, Х24 и Х28 независимо выбраны из Ala и Ser.
11. Аналог GLP-2 по п.7, включающий одну из следующих комбинаций остатков в позициях X11, Х16,Х20,Х24иХ28:
Ser/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/AIa/Ala/ALa/Ser, Ser/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Ala/Ser/Ala; Ala/AWSer/Ala/Ala; Ser/Ala/AIa/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala;
Ala/Ala/Ala/Ala/Ala.
12. Аналог GLP-2 по п.7, представляющий собой
12.
H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD-NH2 [ZP2264]7 H-HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD-NH2[ZP2268]T H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH [ZP2242]; H-HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD-NH2 [ZP2272]? H-HGEGSFSDELATILEALAAADFISWLIATKITDKKKKKK-NH2 [ZP2411]; H-HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 [ZP2380]5 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWL1STKITDKKKKKK-NH2 [ZP2384]; H-HGEGSFSDELSTILEALAASDFISWLISTKITD-NH2 [ZP2398], H-HGEGSFSDELATILEALAASDF1AWLIATKITD-NH2 [ZP2417]; H-HGEGSFSDELATILEALAASDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 [ZP2423]; H-HGEGSFSDELSTILEALAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 [ZP2385]T H-HGEGSFSDELATILESLAASDFISWLISTKITD-NH2 [ZP2399]; H-HGEGSFSDELATILEALAAADFISWLIATK.ITD-NH2 [ZP2418], H-HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 [ZP2381 ]; H-HGEGSFSDELSTILEALAAADFIAWLIATKITD-NH2 [ZP2420] or H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLISTKITD-NH2 [ZP2397].
13. Аналог GLP-2 по любому из предшествующих пунктов, где интервалы потенциального образования водородных связей (НВР) для отдельных позиций 11, 16, 20, 24 и 28 для аналогов GLP-2 составляют независимо 0 < HBP11? 16j 20j 24j 28 < 2.
14. Аналог GLP-2 по п.13, где интервал НВР для позиций 11 и 16 НВРП> 16=0, а для позиций 20, 24 и 28 интервал НВР независимо составляет 05 < НВР20> 24> 28 < 2.
15. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая химиотерапевтические препараты и включающая аналог GLP-2 по любому из предшествующих пунктов или его соль в смеси с носителем.
16. Фармацевтическая композиция для лечения рака по п.15, где аналог GLP-2 представляет собой фармацевтически приемлемую аддитивную соль кислоты.
17. Фармацевтическая композиция для лечения рака по п.15 или 16, представляющая собой жидкость, подходящую для введения посредством инъекции или инфузии, или депосостав.
18. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника.
19. Применение по п.18, где заболевания желудка или кишечника представляют собой язвенные заболевания, синдром Золлингера-Эллисона, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.
20. Применение по п.18, где заболевания желудка или кишечника представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химиотерапевтических агентов.
21. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии.
22. Применение по п.21, где побочными эффектами химиотерапии являются диарея, абдоминальные спазмы, рвота или структурные и функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии.
23. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).
24. Применение аналога GLP-2 по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики состояний, вызванных недостаточностью питания.
25. Применение по п.24, где состояния, вызванные недостаточностью питания, представляют собой кахексию или анорексию.
26. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аналог GLP-2 по любому из пп.1-14.
27. Вектор экспрессии, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по п.26 в комбинации с регуляторными последовательностями для управления его экспрессией.
28. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.27.
29. Способ получения аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, включающий культивирование клеток
13.
хозяев по п.28 в условиях, подходящих для экспрессии аналога GLP-2, и выделение полученного таким образом аналога GLP-2.
30. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.26 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-
IV).
31. Применение вектора экспрессии по п.27 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).
32. Применение клетки-хозяина по п.28 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудка или кишечника, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных с нарушениями кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV).
33. Способ лечения заболеваний желудка или кишечника у нуждающегося пациента введением эффективного количества аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулы нуклеиновой кислоты по п.26, вектора экспрессии по п.27 или клетки-хозяина по п.28.
34. Способ по п.33, где заболевания желудка или кишечника представляют собой язвенные заболевания, синдром Золлингера-Эллисона, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глю-тенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.
35. Способ по п.33, где заболевания желудка или кишечника представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты или повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химиотерапевтических агентов.
36. Способ лечения или предотвращения побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулы нуклеиновой кислоты по п.26, вектора экспрессии по п.27 или клетки-хозяина по п.28.
37. Способ по п.36, где побочными эффектами химиотерапии являются диарея, абдоминальные спазмы, рвота или структурные или функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии.
38. Способ лечения у новорожденных нарушений кишечной функции, ожирения, остеопороза или состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV), у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества аналога GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулы нуклеиновой кислоты по п.26, вектора экспрессии по п.27 или клетки-хозяина по п.28.
39. Терапевтический набор, включающий лекарственный препарат для химиотерапии рака и аналог GLP-2 по любому из пп.1-14, молекулу нуклеиновой кислоты по п.26, вектор экспрессии по п.27 или клетку-хозяина по п.28.
40. Терапевтический набор по п.39, где указанный лекарственный препарат для химиотерапии рака и аналог GLP-2, молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии или клетка-хозяин представлены, каждый, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
41. Фармацевтическая композиция, включающая лекарственный препарат для химиотерапии рака и молекулу нуклеиновой кислоты по п.26, вектор экспрессии по п.27 или клетку-хозяина по п.28 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
31.
31.
31.
31.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023886
- 1 -
(19)
023886
- 1 -
(19)
023886
- 1 -
(19)
023886
- 4 -
023886
- 32 -
023886
- 33 -
023886
- 42 -
- 45 -