|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Конструкция рекомбинантной ДНК для индуцирования стерильности в трансгенном растении, которое экспрессирует указанную рекомбинантную конструкцию ДНК, где указанная рекомбинантная конструкция ДНК содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК, содержащую: (a) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый эндогенной зрелой мкРНК, которая специфически экспрессируется либо в мужской репродуктивной ткани, либо в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения; и (b) матричную РНК, кодирующую белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, где экспрессия указанной эндогенной зрелой мкРНК супрессирует экспрессию указанного белка либо в мужской репродуктивной ткани, либо женской репродуктивной ткани, таким образом индуцируя стерильность в указанном трансгенном растении при нанесении на него указанного гербицида. 2. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 3. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 4. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК расположен, по меньшей мере, в пределах одной из следующих областей: (a) 5'-нетранслируемой области указанной матричной РНК; (b) 3'-нетранслируемой области указанной матричной РНК и (c) кодирующей области указанной матричной РНК. 5. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК представляет собой по меньшей мере одну мкРНК, выбранную из группы, состоящей из или где указанная эндогенная зрелая мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:184, 187, 190, 193, 196, 297, 302, 314, 319, 323, 328, 333, 338. 6. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный экзогенный участок распознавания мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19, 20-175, 185, 188, 191, 194, 197, 200-296, 298-301, 303-313, 315-318, 320-322, 324-327, 329-332, 334-337 и 339-343. 7. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный промотор представляет собой конститутивный промотор. 8. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетил-кофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы. 9. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный гербицид выбран из группы, состоящей из глифосата, дикамбы, глуфосината, сульфонилкарбамидов, имидазолинонов, бромоксинила, 2,2-дихлорпропионовой кислоты, ингибиторов ацетолактатсинтазы, циклогександиона, арилоксифеноксипропионата, сульфонамидных гербицидов, триазиновых гербицидов, 5-метилтриптофана, аминоэтилцистеина, пиридазиноновых гербицидов, циклопропилизоксазоловых гербицидов, ингибиторов протопорфириногеноксидазы и гербицидов, содержащих арилоксиалканоатную группу. 10. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.8, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу. 11. Индуцибельно стерильное трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию рекомбинатной ДНК по п.1, где стерильность указанного трансгенного растения индуцируется нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение. 12. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 13. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 14. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, выбранное из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, хлопка и сои. 15. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.12, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу. 16. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.15, где (а) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR393, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens СР4, или (b) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR156j, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, или (с) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR395, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4. 17. Способ получения гибридных семян из индуцибельно стерильного трансгенного растения по п.11, причем (а) эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени, или (b) указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где женская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее женской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени. 18. Способ по п.17, где указанное индуцибильно стерильное трансгенное растение и указанное нормально фертильное растение представляют собой (а) растения кукурузы, (b) растения сои, (с) растения хлопка или (d) растения пшеницы. 19. Способ по п.17, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением глифосата на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением с получением гибридного семени. 20. Способ индуцирования стерильности трансгенного растения, экспрессирующего конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, включающий нанесение гербицида на трансгенное растение, причем указанный гербицид наносят в количестве, достаточном для индуцирования стерильности в указанном трансгенном растении. 21. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 22. Обладающее мужской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.21. 23. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 24. Обладающее женской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.23. 25. Способ по п.20, где указанный гербицид представляет собой системный гербицид. 26. Способ по п.20, где белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетилкофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы. 27. Способ по п.20, где указанное трансгенное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сои, хлопка и пшеницы.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула: 1. Конструкция рекомбинантной ДНК для индуцирования стерильности в трансгенном растении, которое экспрессирует указанную рекомбинантную конструкцию ДНК, где указанная рекомбинантная конструкция ДНК содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК, содержащую: (a) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый эндогенной зрелой мкРНК, которая специфически экспрессируется либо в мужской репродуктивной ткани, либо в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения; и (b) матричную РНК, кодирующую белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, где экспрессия указанной эндогенной зрелой мкРНК супрессирует экспрессию указанного белка либо в мужской репродуктивной ткани, либо женской репродуктивной ткани, таким образом индуцируя стерильность в указанном трансгенном растении при нанесении на него указанного гербицида. 2. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 3. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 4. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК расположен, по меньшей мере, в пределах одной из следующих областей: (a) 5'-нетранслируемой области указанной матричной РНК; (b) 3'-нетранслируемой области указанной матричной РНК и (c) кодирующей области указанной матричной РНК. 5. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК представляет собой по меньшей мере одну мкРНК, выбранную из группы, состоящей из или где указанная эндогенная зрелая мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:184, 187, 190, 193, 196, 297, 302, 314, 319, 323, 328, 333, 338. 6. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный экзогенный участок распознавания мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19, 20-175, 185, 188, 191, 194, 197, 200-296, 298-301, 303-313, 315-318, 320-322, 324-327, 329-332, 334-337 и 339-343. 7. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный промотор представляет собой конститутивный промотор. 8. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетил-кофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы. 9. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный гербицид выбран из группы, состоящей из глифосата, дикамбы, глуфосината, сульфонилкарбамидов, имидазолинонов, бромоксинила, 2,2-дихлорпропионовой кислоты, ингибиторов ацетолактатсинтазы, циклогександиона, арилоксифеноксипропионата, сульфонамидных гербицидов, триазиновых гербицидов, 5-метилтриптофана, аминоэтилцистеина, пиридазиноновых гербицидов, циклопропилизоксазоловых гербицидов, ингибиторов протопорфириногеноксидазы и гербицидов, содержащих арилоксиалканоатную группу. 10. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.8, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу. 11. Индуцибельно стерильное трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию рекомбинатной ДНК по п.1, где стерильность указанного трансгенного растения индуцируется нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение. 12. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 13. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 14. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, выбранное из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, хлопка и сои. 15. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.12, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу. 16. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.15, где (а) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR393, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens СР4, или (b) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR156j, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, или (с) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR395, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4. 17. Способ получения гибридных семян из индуцибельно стерильного трансгенного растения по п.11, причем (а) эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени, или (b) указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где женская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее женской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени. 18. Способ по п.17, где указанное индуцибильно стерильное трансгенное растение и указанное нормально фертильное растение представляют собой (а) растения кукурузы, (b) растения сои, (с) растения хлопка или (d) растения пшеницы. 19. Способ по п.17, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением глифосата на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением с получением гибридного семени. 20. Способ индуцирования стерильности трансгенного растения, экспрессирующего конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, включающий нанесение гербицида на трансгенное растение, причем указанный гербицид наносят в количестве, достаточном для индуцирования стерильности в указанном трансгенном растении. 21. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 22. Обладающее мужской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.21. 23. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 24. Обладающее женской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.23. 25. Способ по п.20, где указанный гербицид представляет собой системный гербицид. 26. Способ по п.20, где белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетилкофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы. 27. Способ по п.20, где указанное трансгенное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сои, хлопка и пшеницы. Евразийское 023885 (13) B1 патентное ведомство (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ (45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29 (21) Номер заявки 200801074 (22) Дата подачи заявки 2006.09.20 (51) Int. Cl. C12N15/63 (2006.01) C12N15/82 (2006.01) C12N15/87 (2006.01) C12N15/90 (2006.01) A01H1/00 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) A01H 5/10 (2006.01) (54) КОНСТРУКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ СТЕРИЛЬНОСТИ В ТРАНСГЕННОМ РАСТЕНИИ, СТЕРИЛЬНЫЕ ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ СЕМЯН (31) 60/726,106; 60/836,246 (32) 2005.10.13; 2006.08.07 (33) US (43) 2008.10.30 (86) PCT/US2006/036847 (87) WO 2007/047016 2007.04.26 (71) (73) Заявитель и патентовладелец: МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ, ЭлЭлСи (US) (72) Изобретатель: Аллен Эдвардс, Гилбертсон Ларри А., Хумард Нэнси М., Хуанг Шихшиех, Ивашута Сергей И., Робертс Джеймс К. (US) (74) Представитель: Медведев В.Н., Павловский А.Н. (RU) (56) MANSOOR et al. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends Plant Sci. 09 October 2006, Vol. 11, No. 11, pages 559-565, see pages 562-563 WANG et al. Control of Root Cap Formation by MicroRNA-Targeted Auxin Response Factors in Arabidopsis. Plant Cell. August 2005, Vol. 17, pages 2204-2216, see pages 2205-2212 MALLORY et al. MicroRNA-Directed Regulation of Arabidopsis AUXIN RESPONSE FACTOR17 is Essential for Proper Development and Modulates Expression of Early Auxin Response Genes. Plant Cell. May 2005, Vol. 17, pages 1360-1375, see pages 1361-1367 MILLAR et al. The Arabidopsis GAMYB-Like Genes, MYB33 and MYB65, Are MicroRNA-Regulated Genes That Redundantly Facilitate Anther Development. Plant Cell. March 2005, Vol. 17, pages 705-721, see pages 706-716 (57) Данное изобретение предусматривает способы получения искусственных гибридных семян. Также раскрываются специфические микро-РНК и сайты узнавания микро-РНК, применимые для того, чтобы сообщить культурному растению (сельскохозяйственной культуре) индуцибельную стерильность, и конструкция рекомбинантной ДНК, включающие такие сайты узнавания экзогенной микро-РНК. Область техники Изобретение относится к способам получения гибридных семян и выведенных стерильных трансгенных растений и молекулярным конструкциям, применимым в таких способах. Предпосылки создания изобретения Гибридные семена, т.е семена, полученные гибридизацией или перекрестным оплодотворением близкородственных растений, можно выращивать в потомство гибридных растений, обладающих "гибридной силой" (гетерозисом), или желаемой (заданной) комбинацией признаков, которых нет ни у одного из родительских растений (которые обычно являются растениями инбредных линий). Гибридные растения могут проявлять более высокие хозяйственно-ценные характеристики, включая оптимизацию растения по размеру, выходу, питательному составу, устойчивости к заболеванию, устойчивости к гербицидам, к стрессу (тепловому, холодовому стрессу, засухе, к воздействию питательных веществ, к солевому стрессу), климатической адаптации и другим желательным признакам. Для высокоэффективного получения гибридных семян требуется, чтобы перекрёстное опыление преобладало над самоопылением. Основным ограничением в прогнозировании производства гибридных семян многих сельскохозяйственных культур является отсутствие простых, надёжных и экономичных методов создания стерильности (бесплодности) по меньшей мере у одного родителя (в частности, у мужского родителя, получая мужскую стерильность растения, в то же время женские гаметы остаются ин-тактными и доступными для опыления пыльцой подходящего "донора"). Мужская стерильность также годится там, где нежелательно распространение пыльцы, например с домашнего растения к его диким родственникам, или если нежелательно оплодотворение цветов, например декоративных цветов, которые вырождаются после опыления. Мужскую стерильность можно получать, например, физически удаляя органы, содержащие мужские гаметы. У некоторых видов это является эффективным, хотя трудоёмким и, следовательно, дорогим процессом (например, удаление метёлок (соцветий) у кукурузы). У других видов такая физическая кастрация затруднена из-за (соцветий) у кукурузы. У других видов такая физическая кастрация затруднена из-за анатомии растений. Альтернативные методы без применения ручной или физической кастрации могли бы дать значительную экономию. Также были описаны химические гематоциды как способ получения растений, обладающих мужской стерильностью. Обычно такой химический гематоцид является гербицидом, который при нанесении его на растение в соответствующей стадии развития или перед половым созреванием растения способен убивать или эффективно прекращать развитие мужских гамет растения, оставляя женские гаметы растения или, по меньшей мере, их значительную часть, способную подвергаться перекрёстному опылению. Например, методом генетической инженерии (рекомбинантной ДНК) создают устойчивость кукурузы к глифозату (патент США № 5554798), а применение гербицида глифозата (N-фосфонометилглицина) в качестве гематоцида и трансгенные растения, вегетативные органы и женские гаметы которых толерант-ны к глифозату, а мужские гаметы чувствительны к глифозату, раскрываются в патенте США 4735649 и в опубликованной международной патентной заявке РСТ WO 99/46396 A2. Однако уровни глифозата, необходимые для гибели большинства мужских гамет, но при этом оставляющие достаточное число женских гамет, всё ещё способных к оплодотворению, часто приводят к остановке роста или к хлорозу растений. Таким образом, основной недостаток применения глифозата в качестве гаметоцида, и это обычно справедливо для большинства химических гематоцидов, это фитотоксические побочные эффекты, являющиеся результатом недостаточной селективности в отношении гамет. Промышленное производство гибридных семян с применением химических гематоцидов ограничено, прежде всего, отсутствием селективности к гаметам в целом. Соединения, обладающие некоторой селективностью при нацеливании гамет в более высокой степени, чем вегетативные ткани, обычно являются неселективными относительно пола разрушаемых гамет. Поэтому методы повышения селективности химического гематоцида были бы в высшей степени желательны. Даже более желательны были бы методы, которые предусматривают первое родительское растение со стерильными мужскими гаметами, а второе родительское растение со стерильными женскими гаметами, тем самым гарантируется, что полученные семена являются результатом гибридизации двух родительских растений, а не результатом самооплодотворения. Это изобретение предусматривает способы получения гибридных семян и, кроме того, предусматривает конструкции рекомбинантной ДНК, хромосомы трансгенных растений, клетки, растения и семена, содержащие такие конструкции, применимые в этих методах. Конструкции рекомбинантной ДНК, хромосомы трансгенных растений, клетки, растения и семена и методы их применения для получения гибридных семян позволяют создать значительно улучшенный способ применения гербицидов в качестве химических гематоцидов. Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению включают экзогенный участок распознавания мкРНК, способствующий тому, чтобы экспрессия матричной РНК, кодирующей белок, придающий толерантность к гербициду, регулировалась микроРНК, эндогенной для растения, в котором транскрибируется конструкция рекомбинантной ДНК. Микро-РНК (микро-РНК) представляют собой РНК, не кодирующие белки, обычно состоят примерно из 19-25 нуклеотидов (обычно около 20-24 нуклеогидов в растениях), которые направляют расще пление в транс-положение целевых транскриптов, негативно регулируя экспрессию генов, участвующих в различных путях регуляции и развития (Bartel (2004) Cell, 116: 281-297). В некоторых случаях микро-РНК служат для того, чтобы направлять синхронное процессирование первичных транскриптов siPHK (см. Alien et al. (2005) Cell, 121: 207-221). Некоторые гены микро-РНК (MIR гены) идентифицированы и общедоступны в базе дан-ных("miRBase", доступна он лайн по адресу: microma.sanger.ac.uk/sequences). Заявители раскрывают новые MIR гены, зрелые микро-РНК и сайты распознавания (узнавания) микро-РНК в патентной заявке США 11/303745, поданной 15 декабря 2005 г. Дополнительные MIR гены и зрелые микро-РНК описаны также в опубликованных патентных заявках США 2005/0120415 и 2005/144669А1. Сообщалось, что MIR гены встречаются в межгенных областях как в изолированном виде, так и в виде кластеров в геноме, но могут также локализоваться, полностью или частично, внутри нитронов или других генов (как белок-кодирующих, так и не кодирующих белок). Последний обзор, посвященный биогенезу микро-РНК, см. Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol, 6: 376-385. Транскрипция MIR генов может происходить, по меньшей мере, в некоторых случаях под стимулирующим контролем собственного промотора MIR гена. Транскрипция MIR, вероятно, в целом опосредуется РНК-полимеразой II (см., например, Aukerman and Sakai (2003) Plant Cell, 15: 2730-2741; Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18: 2237-2242) и, следовательно, могут быть восприимчивы к способам сайленсинга генов, которые применяются в других генах, транскрибируемых с помощью полимеразы II. Первичный транскрипт (который является полицистронным) называемый "pri-микро-РНК", молекула-предшественник микро-RNA, которая может быть довольно большой (несколько тысяч нуклеиновых оснований) и содержит одну или более локальных двухцепо-чечных областей или "шпилек", а также обычный 5' "кэп" и полиаденилированный хвост мРНК. См., например, фиг. 1 в Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol, 6: 376-385. Полагают, что в растительных клетках молекулы предшественника микро-РНК процессируют, главным образом, в ядре. В растениях микро-РНК и siPHK образуются с помощью различных DICER-подобных (DCL) ферментов, и, как полагают, в Arabidopsis для образования зрелой микро-РНК требуется нуклеарный DCL фермент (Xie et al. (2004) PLoS Biol., 2: 642-652). Другие обзоры, относящиеся к биогенезу и функции микроРНК, см., например, в Bartel (2004) Cell, 116: 281-297; Murchison and Hannon (2004) Curr. Opin. Cell Biol, 16: 223-229 и Dugas and Bartel (2004) Curr. Opin. Plant Biol, 7: 512-520. Таким образом, микроРНК можно описывать в терминах РНК (например, РНК последовательность зрелой микро-РНК или РНК молекулы miRNA предшественника), или в терминах ДНК (например, последовательность ДНК, соответствующая РНК последовательности зрелой микро-РНК, или последовательность ДНК, кодирующая MIR ген или фрагмент MIR гена, или микро-РНК предшественник). По оценкам семейства MIR генов составляют 1%, по меньшей мере, некоторых геномов, и они способны влиять на экспрессию или регулировать экспрессию примерно трети всех генов (см., например, Tomari et al. (2005) Curr. Biol, 15: R61-64; G. Tang (2005) Trends Biochem. Sci., 30: 106- 14; Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol, 6: 376-385). Так как микро-РНК являются важньми регуляторными элементами в эукариотах, включая животных и растения, трансгенная супрессия микро-РНК могла бы, например, привести к пониманию важных биологических процессов или сделала бы возможными манипуляции некоторыми путями обмена (например, регуляция клеточной дифференцировки, пролиферации и апопто-за), применимыми, например, в биотехнологии. См., например, O'Donnell et al. (2005) Nature, 435: 839843; Cai et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 5570-5575; Morris and McManus (2005) Sci. STKE, pe41 (stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans;2005/297/pe4Lpdf). Гены микроРНК (MIR) имеют идентифицирующие признаки, включая сохранение среди вида растений, устойчивую структуру "скобку" (сложенную на себя, с конъюгацией "в себе" (foldback, FB)) и процессирование специфического дуплекса микро-РНК/микро-РНК* с помощью Dicer- подобных ферментов (Ambros et al. (2003) RNA, 9: 277-279). Эти признаки используют для идентификации микро-РНК и их соответствующих генов в растениях (Xie et al. (2005) Plant Physiol, 138: 2145-2154; Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell, 14: 787-799; Reinhart et al. (2002) Genes Dev., 16: 1616-1626; Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16: 2001-2019). Общедоступные гены микроРНК перечислены (каталогизированы) в miRBase (Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441). Микро-РНК экспрессируются в очень специфических типах клеток в Arabidopsis (см., например, Kidner and Martienssen (2004) Nature, 428: 81-84, Millar and Gubler (2005) Plant Cell, 17: 705-721). Супрессию можно ограничить стенкой, краем или другой границей между типами клеток, и полагают, что она требуется для соответствующего формирования изображения и описания типа клеток (см., например, Palatnik et al. (2003) Nature, 425: 257-263). Найдено, что супрессия (подавление) маркерного гена GFP, содержащего сайт узнавания эндогенной miR171, ограничивает экспрессию специфическими клетками в трансгенном Arabidopsis (Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18: 2237-2242). Сайты узнавания микро-РНК установлены во всех областях мРНК, включая 5' нетранслируемую область, кодирующую область и 3' нетранслируемую область, указывая, что положение микро-РНК целевого сайта относительно кодирующей последовательности необязательно влияет на супрессию (см., например, Jones-Rhoades and Bartel (2004). Mol. Cell, 14: 787-799, Rhoades et al. (2002) Cell, 110: 513-520, Allen et al. (2004) Nat. Genet., 36: 1282-1290, Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16: 2001-2019). Зрелые микро-РНК, раскрываемые в данном описании, процессируют при использовании MIR генов, которые обычно относятся к классическим (каноническим) семействам, сохраняющимся (консервативным) в видах растений, состоящих в дальнем родстве. Эти MIR гены и кодируемые ими зрелые микро-РНК применимы также, например, для модификации путей развития (эволюционных путей), например, за счёт влияния на дифференцировку или морфогенез клеток (см., например, Palatnik et al. (2003), Nature, 425: 257-263; Mallory et al. (2004) Curr. Biol, 14: 1035-1046), чтобы служить в качестве источников последовательностей для генно-инженерных (искусственных) микро-РНК, которые создают с целью сделать молчащими последовательности, отличные от транскриптов, на которые нацелены природные микро-РНК последовательности (см., например, Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18: 2237-2242; см. также опубликованные патентные заявки США 2004/3411 А1 и 2005/0120415), и для стабилизации дц(двухцепочечной)РНК. Сам по себе ген MIR (или его нативные 5' или 3' нетранслируемые области, или его нативный промотор, или другие элементы, участвующие в его транскрипции) применим в качестве целевого гена (гена-мишени) для супрессии генов (например, методами по настоящему изобретению), когда желательна супрессия микро-РНК, кодируемой MIR геном. Промоторы MIR генов могут иметь очень специфические паттерны экспрессии (например, специфические в отношении клеток, тканеспеци-фические или специфические во времени) и поэтому они применимы в рекомбинантных конструкциях для индукции такой специфической транскрипции последовательности ДНК, с которой они функционально связаны. Данное изобретение предусматривает способы получения гибридных семян с применением конструкций рекомбинантной ДНК, включающих сайты узнавания, соответствующие новым зрелым микро-РНК, имеющим специфические паттерны экспрессии в сельскохозяйственных культурах (хлебных злаках). Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению транскрибируются в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду. Эти конструкции применимы для получения и применения трансгенных растительных хромосом, клеток, трансгенных растений и семян трансгенных растений, включая выведенные (индуцируемо) стерильные трансгенные растения, применимые, например, для получения гибридных семян. Сущность изобретения В одном аспекте данное изобретение предусматривает способ получения искусственных гибридных семян, включающий следующие стадии: (а) предоставление (создание) индуцибельно стерильного, трансгенного первого растения, содержащего в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (i) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани первого родительского растения; и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду, причём зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) скрещивание первого родительского растения со вторым родительским растением в условиях, в которых стерильность индуцирована в первом родительском растении, при этом получают искусственные гибридные семена. В другом аспекте данное изобретение предусматривает способ получения гибридных семян, включающий стадии: (а) предоставления (создания) первого родительского растения, включающего трансгенное растение, выращенное из клетки первого трансгенного растения, содержащей в своём геноме первую конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (i) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый первой зрелой микро-РНК, и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к первому гербициду, причём первая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани первого родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в мужской репродуктивной ткани, а стерильность мужских гамет (мужская стерильность) первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) предоставления второго родительского растения, включающего трансгенное растение, выращенное из клетки второго трансгенного растения, содержащей в своём геноме вторую конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (i) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность ко второму гербициду, причём вторая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани второго родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в женской репродуктивной ткани, а стерильность женских гамет (женская стерильность) второго родительского растения индуцируется нанесением второго гербицида на второе родительское растение; (в) нанесения первого гербицида и второго гербицида на родительские растения, тем самым индуцируется мужская стерильность в первом растении и женская стерильность во втором родительском растении; (г) скрещивания первого и второго родительских растений, отличающегося тем, что семяпочка первого родительского растения опыляется пыльцой второго родительского растения, при этом получа ют гибридные семена. В независимом аспекте данное изобретение предусматривает индуцибельно стерильное трансгенное растение, содержащее в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду; причём зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется нанесением гербицида на первое растение. Ещё в одном аспекте данное изобретение предусматривает конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду. Другие конкретные варианты изобретения раскрываются в нижеприведённом подробном описании. Краткое описание фигур На фиг. 1А схематически изображены неограничивающие конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению, описанные в примере 1. Для применения в опосредуемой Agrobacterium трансформации растительных клеток в каждую конструкцию обычно включают по меньшей мере одну границу Т-ДНК. Эти конструкции включают промоторный элемент ("pro"), интрон, фланкированный с одной или с обеих сторон не кодирующей белок ДНК, оптимальным терминаторным элементом ("ter"), по меньшей мере один элемент супрессии первого гена ("GSE" или "GSE1") для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена (гена-мишени) и, необязательно, может включать по меньшей мере один элемент супрессии второго гена ("GSE2") для супрессии по меньшей мере одного второго целевого гена, по меньшей мере один элемент экспрессии гена ("GEE") для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес гена или обоих представляющих интерес генов. В вариантах изобретения, содержащих элемент экспрессии гена, этот элемент экспрессии гена может прилегать (извне) к интрону. В одной модификации этого варианта изобретения (не показана) элемент супрессии гена (встроенный в интрон, фланкированный с одной или с обеих сторон не кодирующей белок ДНК) расположен 3' к терминатору. В других конструкциях по изобретению (не показаны) элемент супрессии гена (не встроенный в интрон) расположен 3' к терминатору (см. пример 22). На фиг. 1В схематически представлены примеры конструкций рекомбинантной ДНК, отличные от конструкций рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению. Эти конструкции могут содержать элемент супрессии гена, который прилегает к интрону или расположен между двумя отдельными нитронами (другими словами, не встроен в единственный интрон), или может содержать элемент экспрессии гена, включающий элемент супрессии гена, встроенный в ин-трон, фланкированный с обеих сторон кодирующей белок ДНК (например, кодирующие белок экзоны, которые составляют элемент экспрессии гена). На фиг. 2 изображены различные неограничивающие примеры элементов экспрессии гена и транскрибируемых экзогенных ДНК, применимые в конструкциях рекомбинантной ДНК по изобретению, описанные в примере 1. Если они показаны в виде одноцепочечных транскриптов (фиг. 2А-2Е), то эти примеры традиционно изображают направление транскрипции 5' к 3' (слева направо), причём стрелками показана антисмысловая последовательность (стрелки указывают налево) или смысловая последовательность (стрелки указывают направо). Если они изображены в виде двухцепочечных (антипараллельных) транскриптов (фиг. 2F и 2G), то показано 5' и 3' направления транскрипции. Сплошными, пунктирными и точечными линиями показаны последовательности, которые нацелены на различные целевые гены. Эти элементы супрессии генов и транскрибируемые экзогенные ДНК могут включать ДНК, которая включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, или ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2А); ДНК, которая включает по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, или ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2В); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования двухцепочечной РНК, и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2С); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования единичной двухнитевой (двухцепочечной) РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2D); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования множественных двойных нитей (цепей )РНК и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные сегменты смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловые сегменты ДНК и множественные смысловые сегменты ДНК расположены последовательно в виде обращенных (инвертированных) повторов (фиг. 2Е); и ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, или ДНК, которая включает нуклеотиды из siPHK (фиг. 2F). На фиг. 2F изображены различные неограничивающие конфигурации двухнитевых РНК (днРНК), которые могут считываться при использовании вариантов элементов супрессии генов и транскрибируемых экзогенных ДНК, применимых в конструкциях рекомбинантных ДНК по изобретению. Когда образуется такая днРНК, она может подавлять один или более целевых генов и может образовывать единичную двухнитевую РНК или множественные двойные нити РНК, или единичный "стебель" или множество "стеблей" днРНК. Когда образуется множество "стеблей" днРНК, они могут располагаться в конфигурациях "головка молотка" или "клеверный лист". Спейсерная ДНК необязательна и может включать последовательность, с которой считывается РНК (например, большую петлю антисмысловой последовательности целевого гена (гена-мишени) или аптамера), которая предполагает вторичную структуру или трёхмерную конфигурацию, придающую транскрипту заданный признак, такой как повышенная устойчивость, повышенный период полужизни in vivo, или клеточная или тканевая специфичность. На фиг. 3 представлены уровни экспрессии указанных зрелых микро-РНК в различных тканях кукурузы, подробно описанные в примере 2. На фиг. 4 представлен неограничивающий пример транскрибируемой последовательности ДНК, включая сайт узнавания экзогенной микро-РНК, нацеленная на хлоропласт (хлоропласт-направленная) TIC809 с сайтом распознавания микро-РНК (показан жирным шрифтом), расположенным 3' нетрансли-руемой области (SEQ ID NO. 176), подробно описанная в примере 3. Также показана транслируемая аминокислотная последовательность. На фиг. 5 представлен неограничивающий пример транскрибируемой последовательности ДНК, включая сайт узнавания экзогенной микро-РНК, не нацеленная на хлоропласты TIC809 с сайтом распознавания микро-РНК (показан жирным шрифтом), расположенным 3' нетранслируемой области (SEQ ID NO. 177), подробно описанная в примере 3. Также показана транслируемая аминокислотная последовательность. На фиг. 6 показана сильная и специфическая экспрессия в эндосперме микроРНК miR167g (SEQ ID NO. 178), клонированной при использовании эндосперма кукурузы, как подробно описано в примере 4. Нозерн-блоты РНК из тканей кукурузы (LH59) гибридизовали с меченным на конце 22-мерным зондом ЗНК (LNA, закрытая нуклеиновая кислота) зрелой miR167, специфическим к SEQ ID NO. 178 (фиг. 6А), или с зондом из ~400 п.о., специфическим к гену miR167g (фиг. 6В). Профиль транскрипции в тканях кукурузы подтверждается результатами Нозерн-блоттинга (фиг. 6С); транскрипт, соответствующий miR167g, многокопийно и специфично экспрессируют в ткани эндосперма (копийность классифицируют следующим образом: > 5000, высокая копийность, 97я процентиль; 700-5000, умеренная копийность, 20я процентиль; 400-700, средняя копийность; 200-400, низкая копийность; <200, не обнаруживается). Избранные сокращения: "DAP" или "DA", дни после опыления; "WK", цельное зерно; "endo" ("эндо"), эндосперм. На фиг. 7 изображена частичная аннотационная (поясняющая) карта, включающая местоположения генов miR167a и miR167g и зрелых микро-РНК, и промоторных элементов (например, ТАТА боксов), геномного кластера, внутри которого были идентифицированы промоторные последовательности miR167g, как подробно описано в примере 4. Сокращения: "PBF" проламин-бокс-связывающий фактор; "ARF" ауксин-отвечающий (ауксин-связывающий) фактор; "NIT2", активатор азот-связанных генов; "LYS14", элемент, который связывается с UASLYS, "апстрим" (5') активирующий элемент, сообщающий Lys14- и адипат (адипинат)-семиальдегидзависимую активацию и кажущуюся репрессию; "GLN3", элемент, который связывает последовательность активации азот-5' глутаминсинтетазы. На фиг. 8 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 8A изображена "скобочная" структура "foldback" (конъюгации "в себе", FB) SEQ ID NO. 186, ожидаемого (прогнозируемого) предшественника микро-РНК для SEQ ID NO. 184; зрелая микро-РНК находится в области оснований 106-126, соответствующей микро-РНК* в области оснований 156-175, и также найдено, что другая мно-гокопийная микро-РНК находится в области оснований 100-120 в стебле fold-back (FB, конъюгация в себе) структуры. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 8В изображён профиль транскрипции в тканях сои для предшественника микро-РНК SEQ ID NO. 186. На фиг. 8С изображён профиль транскрипции в тканях сои для прогнозируемой мишени, полифенолоксидазы (SEQ ID NO. 200), для зрелой микро-РНК (SEQ ID NO. 184). На фиг. 9 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 9А изображена скобочная FB-структура SEQ ID NO. 189, ожидаемого (прогнозируемого) предшественника микро-РНК для SEQ ID NO. 187; зрелая микро-РНК находится в области оснований 163-183, а микро-РНК* в области оснований 18-63. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 9В изображён профиль транскрипции в тканях сои для прогнозируемой мишени, полифенолоксидазы (SEQ ID NO. 251), для зрелой микро-РНК (SEQ ID NO. 187). На фиг. 10 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 10А изображена FB-структура SEQ ID NO. 192, ожидаемого (прогнозируемого) предшественника микро-РНК для SEQ ID NO. 190; зрелая микро-РНК находится в области оснований 87-107, а микро-РНК* в области оснований 150-169. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 11 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 11А изображена FB-структура SEQ ID NO. 195, ожидаемого (прогнозируемого) предшественника микро-РНК для SEQ ID NO. 193 зрелая микро-РНК находится в области оснований 61-81, а микро-РНК* в области оснований 109-129. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 12 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 12А (вверху) изображена FB-структура SEQ ID NO. 198, одного из прогнозируемых предшественников микро-РНК для SEQ ID NO. 196; зрелая микро-РНК находится в области оснований 157-178, а микро-РНК* в области оснований 72-93. На фиг. 12А (внизу) изображена FB-структура SEQ ID NO 199, другого из прогнозируемых предшественников микро-РНК для SEQ ID NO. 196; зрелая микро-РНК находится в области оснований 123144, а микро-РНК* в области оснований 58-79. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 12В (вверху) изображён профиль транскрипции в тканях сои для предшественника микро-РНК SEQ ID NO. 198. На фиг. 12В (внизу) изображён профиль транскрипции в тканях сои для предшественника микро-РНК SEQ ID NO. 199. На фиг. 13 и 14 изображены профили транскрипции последовательностей набора зондов, как было определено, эти зонды включают гены микро-РНК (представленные в табл. 6), они особенно применимы в способах по настоящему изобретению и имеют желаемые паттерны экспрессии, а именно, в женской репродуктивной ткани (фиг. 13) или в мужской репродуктивной ткани (фиг. 14), как подробно описано в примере 6. Подробное описание изобретения Если не указано иначе, все используемые технические и научные термины имеют значение, общепринятое среди специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Как правило, применяемая номенклатура и методы получения или лабораторные методы, описанные ниже, общеизвестны и обычно применяются в технике. Для этих процессов применяются традиционные методы, такие как методы, представленные в уровне техники и различных общих ссылках. Если не указано иначе, нуклеотидные последовательности в тексте данного описания представлены так, что они читаются слева направо, в направлении от 5' к 3'. Если термин употребляется в единственном числе, заявители также рассматривают аспекты изобретения, описываемые множественным числом этого термина. Если имеются различия между терминами и определениями, даваемыми в ссылочных материалах, вводимых в качестве ссылок, термины в данной заявке имеют определяемое значение. Другие применяемые технические термины имеют обычное в уровне техники значение, приводимое в качестве примеров в различных технических словарях. Заявители не предполагают ограничивать механизм или способ действия. Ссылка на это даётся только в целях иллюстрации. Способ получения семян искусственных гибридов Первый аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения искусственных гибридных семян, включающий стадии: (а) предоставления (создания) индуцибельно (выведенного) стерильного, трансгенного первого родительского растения, содержащего в своём геноме конструкцию рекомби-нантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани первого родительского растения; и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к первому гербициду, причём зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) скрещивания первого родительского растения со вторым родительским растением в условиях, в которых стерильность индуцирована в первом родительском растении, при этом получают семена искусственных гибридов. Растения. Способ по данному изобретению включает предоставление индуцибельно (выведенного) стерильного трансгенного растения, пригодного в качестве родительского растения, которое предпочтительно является сельскохозяйственной культурой (хлебным злаком), размножающейся семенами, таким как культуры, описанные ниже под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений". Неограничивающие примеры предпочтительных растений включают кукурузу, рис, пшеницу, овёс, ячмень, рожь, тритикале, просо, сорго, квиною, ширицу, гречиху, кормовые злаки, дернообразующие злаки, люцерну, хлопок, сафлор красильный, подсолнечник, сою, канолу, рапс, лён, арахис, бобы, горох, чечевицу, люцерну, латук, спаржу (аспарагус), артишок, сельдерей, морковь, хрен, капусту, горчицу, брокколи, цветную капусту, брюссельскую капусту, турнепс, кольраби, огурцы, дыни, тыкву обыкновенную, тыкву зимнюю, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, шнитт-лук, томаты, баклажаны, перец, физалис, свёклу, мангольд, шпинат, декоративные растения и лесные деревья. Особенно предпочтительные растения включают кукурузу, рис, пшеницу, хлопок, сафлор, сою, канолу и рапс. В особенно предпочтительном варианте изобретения способ применим для семян искусственных гибридов кукурузы. Стерильность. Под "стерильностью" понимают неспособность успешно продуцировать жизнеспособные посевные семена. Мужская стерильность включает, например, неспособность давать мужские гаметы (например, зрелые всхожие пыльцевые зёрна), способные оплодотворять женские гаметы, или неспособность продуцировать мужские репродуктивные структуры (например, пыльники, тычинки, тычиночные нити), необходимые для того, чтобы мужские гаметы были способны нормально оплодотворять женские гаметы. Женская стерильность включает, например, неспособность давать женские гаметы, способные оплодотворяться мужскими гаметами, или неспособность давать полностью развившиеся семена (жизнеспособные или стерильные), или неспособность давать жизнеспособные посевные семена, способные прорастать и развиваться в нормальное растение потомственного поколения. Репродуктивная ткань. В вариантах индуцибельно стерильного трансгенного растения, в которых стерильность представляет собой мужскую стерильность, репродуктивная ткань представляет собой мужскую репродуктивную ткань. Мужская репродуктивная ткань включает любую ткань, необходимую для развития мужских гамет до фертильности (т.е. способную оплодотворять женскую гамету), например, пыльцу или мужские гаметы на любой стадии развития, пыльники, тычинки, тычиночные нити, метёлки и другие участки мужских цветков, питательные ткани и другие структуры, связанные со способностью мужского родительского растения оплодотворять женское родительское растение. В вариантах индуцибельно стерильного трансгенного растения, в которых стерильность представляет собой женскую стерильность, репродуктивная ткань представляет собой женскую репродуктивную ткань. Женская репродуктивная ткань включает любую ткань, необходимую для развития женских гамет до фертильности (т.е. способная оплодотворяться мужской гаметой, более предпочтительно способная давать полностью развившееся семя (либо жизнеспособное, либо стерильное), а во многих вариантах изобретения наиболее предпочтительно,имеющая способность давать жизнеспособное посевное семя, способное прорастать и развиваться в нормальное растение потомственного поколения). Женская репродуктивная ткань включает, например, семяпочки или женские гаметы на любой стадии развития, шёлк (совокупности столбиков), пестики и другие участки женских цветков, семенные оболочки, плоды, главные оси цветоносного побега или стержни початка или другие питательные, поддерживающие или защитные ткани, и любые другие структуры, связанные со способностью (содействующие способности) женского родительского растения оплодотворяться мужским родительским растением, давать полностью развившееся семя или давать жизнеспособное посевное семя. В некоторых вариантах изобретения стерильность приводит к невозможности оплодотворённой семяпочки развиться в жизнеспособное семя, а "репродуктивная ткань" относится к оплодотворённой семяпочке (например, зигота или зародыш на любой стадии развития, или материнские ткани, необходимые для развития оплодотворённой яйцеклетки в семя, такие как эндосперм или другие питательные ткани). Зрелая микро-РНК. Под "зрелой микро-РНК" понимают малую РНК ("микроРНК"), процессируе-мую из предшественника микро-РНК (например, при-микро-РНК или пре-микро-РНК), способную распознавать и связываться со специфической последовательностью ("сайтом распознавания (узнавания) микро-РНК) внутри РНК транскрипта и направлять отщепление этого транскрипта. Предпочтительные зрелые микро-РНК включают зрелые микро-РНК, которые специфически экспрессируются в репродуктивной ткани растения. В неограничивающем варианте изобретения зрелая микро-РНК представляет собой микро-РНК сельскохозяйственной культуры, такая как микро-РНК кукурузы или микро-РНК сои. Неограничивающие примеры микро-РНК, применимых в данном изобретении, приводятся в демонстрационных примерах и включают, но без ограничения, микро-РНК, идентифицируемые в табл. 1, 2, 3, 4, 5 и 6, включающих микро-РНК, имеющие последовательности SEQ ID NO. 297, SEQ ID NO. 302, SEQ ID NO. 314, SEQ ID NO. 319, SEQ ID NO. 323, SEQ ID NO. 328, SEQ ID NO. 333 или SEQ ID NO. 338. Сайты распознавания (узнавания) зрелой микро-РНК. С конструкции рекомбинантной ДНК считы-вается РНК, включающая один или более сайтов узнавания микро-РНК, которые могут представлять собой одну или более копий того же самого сайта узнавания микро-РНК экзогенной микро-РНК или одну или более копий различных сайтов узнавания экзогенной микро-РНК. Сайт узнавания экзогенной микро-РНК может локализоваться в любом месте в транскрибированной РНК, причём если отсутствует зрелая микро-РНК, транскрипция даёт матричную РНК, транслируемую в заданный белок, устойчивый (толерантный) к гербициду, а если зрелая микро-РНК присутствует, зрелая микро-РНК связывается с РНК транскриптом и подавляет экспрессию матричной РНК. Один или более сайтов узнавания экзогенной микро-РНК может находиться в кодирующих областях или в некодирующих областях матричной РНК. В различных вариантах изобретения сайт узнавания экзогенной микро-РНК расположен по меньшей мере в одной из нижеприведённых областей: (а) области 5' к кодирующей последовательности матричной РНК; (б) области (3') к кодирующей РНК; и (в) в матричной РНК. В предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере один сайт узнавания микро-РНК расположен в 3' нетранслируемой области матричной РНК. В различных вариантах изобретения конструкция рекомбинантной ДНК дополнительно включает по меньшей мере один элемент, выбранный из (а) растительного промотора; (б) элемента супрессии генов; (в) интрона; (г) элемента экспрессии гена; (д) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом; (е) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом, и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию целевой последовательности, характеризующуюся тем, что регуляция зависит от конформа-ции регуляторной РНК, а на конформацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНК аптамера; и (ж) по меньшей мере одной Т- ДНК границы. Эти дополнительные элементы подробно описаны ниже под заголовком "Индуцибельно (выведенные) стерильные трансгенные растения, содержащие конструкцию рекомбинантной ДНК". Любой сайт узнавания микро-РНК, который узнаётся зрелой микро-РНК, имеющей заданный паттерн экспрессии (а именно, специфическую экспрессию в мужской или женской репродуктивной ткани), применим в вариантах данного изобретения. Для специфического подавления экспрессии белка в заданной комбинации репродуктивных тканей можно использовать многочисленные сайты узнавания микро-РНК. Например, конструкция рекомбинантной ДНК может включать многочисленные сайты узнавания, причём каждый из них узнаётся микро-РНК со специфической экспрессией в различной мужской (или женской) репродуктивной ткани (например, микро-РНК, экспрессирующаяся в пыльце, и микро-РНК, экспрессирующаяся в метёлке (султане)). Селекцию (отбор) подходящей зрелой микро-РНК или соответствующего ей сайта узнавания микро-РНК проводят методами, известными специалистам в данной области техники, включая методы, подробно проиллюстрированные в демонстрационных примерах, приведённых в данном описании. Методы включают клонирование зрелой микро-РНК или предшественников микро-РНК (пре-микро-РНК и при-микро-РНК) при использовании цельного растения, или семян, или отобранных тканей, идентификация микро-РНК с помощью биоинформационного анализа, Саузерн-блоттинг микро-РНК или предшественника микро-РНК, определение паттернов экспрессии промотора микро-РНК и т.д. В неограничивающих вариантах изобретения сайт узнавания микро-РНК распознаётся зрелой микро-РНК, образованной с помощью "скобочной" (FB) структуры MIR последовательности, идентифицируемой в табл. 1-6; особенно предпочтительны сайты узнавания микро-РНК, распознаваемые зрелыми микро-РНК, идентифицируе-мымиОщепление целевого РНК транскрипта и последующая супрессия целевой РНК зависит от спаривания оснований между зрелой микро-РНК и сайтом её узнавания родственной микро-РНК. Поэтому по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК создают таким образом, чтобы его последовательность имела достаточную комплементарность со зрелой микро-РНК, что способствует узнаванию и связыванию зрелой микро-РНК. В растениях комплементарность последовательности микро-РНК и сайта её узнавания, как правило, является высокой, например абсолютная комплементарность 19, 20 или 21 из 21 нуклеотида (в случае зрелой микро-РНК протяжённостью 21 нуклеотид), т.е. комплементарность примерно 90% или выше. Аналогичная степень комплементарности предпочтительна для сайтов узнавания микро-РНК растений любой длины (например, 20, 21, 22, 23 и 24 нуклеотида). Требования к последовательностям для связывания микро-РНК с сайтом узнавания и методы предсказания связывания микро-РНК с данной последовательностью обсуждаются, например, в Llave et al. (2002) Science, 297: 20532056; Rhoades et al. (2002) Cell, 110: 513-520; Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell, 14: 787-799; Schwab et al. (2005) Developmental Cell, 8: 517-527 и Xie et al. (2005) Plant Physiol, 138: 2145-2154. При создании (проектировании) сайта узнавания микро-РНК, а также его точного местоположения в матричной РНК или рядом с (непосредственно прилегающий к) матричной РНК также предпочтительно избегать последовательностей с нежелательными признаками, таких последовательностей, кодирующих нежелательные полипептиды, как описано ниже в разделе под заголовком "Целевые гены". При создании (проектировании) матричной РНК в качестве трансгена, который должен экспрессироваться, если нежелательна супрессия с помощью зрелой микро-РНК, избегают случайного введения сайта узнавания микро-РНК. Специфическая экспрессия. Под "специфически экспрессируется в репродуктивной ткани" понимают, что зрелая микро-РНК транскрибируется (считывается) в репродуктивной ткани на уровне, достаточном для того, чтобы микро-РНК могла специфически подавлять (супрессия) экспрессию белка в репродуктивной ткани, то- есть, практически подавлять экспрессию белка, придающего толерантность к гербициду, в репродуктивной ткани, но существенно не подавлять экспрессию того же самого белка в тканях, отличных от репродуктивных тканей. Существенное (практическое) подавление экспрессии включает подавление экспрессии по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 50, по меньшей мере на 60, по меньшей мере на 70, по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 98% по сравнению с экспрессией в контрольных клетках (а именно, в клетках, которые включают аналогичную конструкцию рекомбинантной ДНК, например конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую ту же самую матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду, но не включающую сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, специфически экспрессирующейся в репродуктивной ткани растения). В предпочтительных вариантах изобретения зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани до степени, достаточной для того, чтобы вызвать стерильность репродуктивной ткани при нанесении (применении) гербицида. Специалист в данной области техники понимает, что в определённых случаях толерантности к гербициду можно адекватно достичь при умеренных или даже низких уровнях экспрессии белка, способствующего толерантности к гербициду. Следовательно, ни то, чтобы зрелая микро-РНК полностью отсутствовала в тканях, отличных от репродуктивной ткани, ни то, чтобы экспрессия белка, сообщающего толерантность к гербициду, полностью подавлялась в репродуктивной ткани, не является необходимым условием. Белок, сообщающий толерантность к гербициду. Можно использовать любой белок, сообщающий растению толерантность (устойчивость) к гербициду. Во многих вариантах изобретения гербицид является системным гербицидом. Неограничивающие примеры гербицидов, применимых в аспектах данного изобретения, включают гербициды глифосат, дикамбу, глюфосинат, сульфонилмочевины, имидазолино-ны, бромоксинил, далапон, циклогександионы, ингибиторы протопорфириноген оксидазы и изоксафлу-тол. Неограничивающие примеры белков, сообщающих толерантность к глифосату, включают 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу ("EPSPS" или "aroA", см. патенты США №№ 5627061, 5633435, 6040497 и 5094945), глифосат оксидоредуктазу ("GOX", см. патент США № 5463175), глифосат декар-боксилазу (см. опубликованную патентную заявку США 2004/0177399), глифосат N-ацетилтрансферазу ("GAT", см. опубликованную патентную заявку США 2003/0083480) или любой другой ген, который сообщает резистентность к глифосату. Один особенно предпочтительный вариант изобретения представляет собой "epsps-cp4" или 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из Agrobacterium tumefaciens штамма СР4; в патенте США №5633435 раскрываются нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности epsps-cp4, трансформирующие векторы, содержащие этот ген, и методы получения резистентных к глифосату растений. Неограничивающие примеры белков, сообщающих толерантность к другим гербицидам, включают дикамба-монооксигеназу, которая придает устойчивость к ауксиноподоб-ным гербицидам, таким как дикамба (см. опубликованные патентные заявки США 2003/0115626, 2003/0135879); фосфинотрицин ацетилтрансферазу ("pat" или "bar"), которая придаёт толерантность к фосфинотрицину или глюфосинату (см. патенты США №№ 5646024, 5561236, 5276268, 5637489 и 5273894; см. также европейскую патентную заявку ЕР 275957); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты, которая придаёт толерантность к 2,2-дихлорпропионовой кислоте ("Dalapon", "Далапон") (см. опубликованную патентную заявку РСТ WO 99/27116); синтазу ацетогидроксикислоты или ацетолактат-синтазу, которая придаёт толерантность к ингибиторам ацетолактатсинтазы, таким как сульфонилмоче-вина, имидазолинон, тиазолпиримидин, пиримидилоксибензоаты и фталид (см. патенты США №№ 6225105, 5767366, 4761373, 5633437, 6613963, 5013659, 5141870, 5378824 и 5605011); галоарилнитрилазу ("Bxn"), которая придаёт толерантность к бромоксинилу (см. патент США № 4810648; см. также опубликованные патентные заявки РСТ WO 89/00193 и WO 87/04181 A1); модифицированную ацетил-кофермент А карбоксилазу, которая придаёт толерантность к циклогександиону ("сетоксидим") и ари-локсифеноксипропионату ("галоксифоп") (см. патент США № 6414222); дигидроптероатсинтазу ("sul I"), которая придаёт толерантность к сульфонамидным гербицидам (см. патенты США №№ 5597717, 5633444 и 5719046); полипептид 32 кДа фотосистемы II ("psbA"), который придаёт толерантность к триа-зиновым гербицидам (see Hirschberg et al. (1983) Science, 222: 1346-1349); антранилатсинтазу, которая придаёт толерантность к 5-метилтриптофану (см. 4581847); синтазу дигидропиколиновой кислоты ("dap А"), которая придаёт толерантность к аминоэтилцистеину (см. опубликованную патентную заявку WO 89/11789); фитоин десатуразу ("crtI" которая придаёт толерантность к гербицидам ряда пиридазинона, таким как норфлуразон (см. опубликованную японскую патентную заявку JP 06343473); гидроксифенил-пируватдиоксигеназу, которая придаёт толерантность к гербицидам-производным циклопропилизоксазо-ла (см. патент США 6268549; также см. опубликованную патентную заявку РСТ WO 96/38567); модифицированную протопорфириноген оксидазу I ("protox"), которая придаёт устойчивость к ингибиторам протопорфириноген оксидазы (см. патент США 5939602); арилоксиалканоат диоксигеназу ("AAD-1"), которая придаёт толерантность к гербициду, содержащему арилоксиалканоатный фрагмент (см. опубликованную патентную заявку РСТ WO 05/107437), примеры таких гербицидов включают феноксиауксины (такие как 2,4-D и дихлорпроп), пиридилоксиауксины (такие как флуроксипир и триклопир), арилокси-феноксипропионаты (АОРР), ингибиторы ацетил кофермент-А карбоксилазы (АССазы), (такие как га-локсифоп, квизалофоп и диклофоп) и ингибиторы 5-замещённой феноксиацетат протопорфириноген ок-сидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Комбинации родительских растений. Способ по изобретению можно осуществлять, используя различные комбинации первых родительских растений и вторых родительских растений. Во многих вариантах этого способа второе родительское растение толерантно к первому гербициду; например, второе ро дительское растение содержит в своём геноме трансген, сообщающий толерантность к первому гербициду. Данное изобретение охватывает варианты способа, отличающиеся тем, что: (а) репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуци-бельной мужской стерильностью, а второе родительское растение является растением с нормальной фер-тильностью; или (б) репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение является растением с женской стерильностью; или (в) репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью; или (г) репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение является растением с нормальной фертильностью; или (д) репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение является растением с мужской стерильностью; или (е) репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью. В одном варианте воплощения способа репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение представляет собой растение с индуцибельной женской стерильностью, причём трансгенное второе родительское содержит в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани второго родительского растения, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую второй белок, сообщающий толерантность ко второму гербициду; причём вторая зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию второго белка в женской репродуктивной ткани, и при этом женская стерильность второго родительского растения индуцируется при нанесении второго гербицида на второе родительское растение. В другом варианте репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение представляет собой растение с индуцибельной мужской стерильностью, причём трансгенное второе родительское растение содержит в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани второго родительского растения, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую второй белок, сообщающий толерантность ко второму гербициду; причём вторая зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию второго белка в мужской репродуктивной ткани, и при этом мужская стерильность второго родительского растения индуцируется при нанесении второго гербицида на второе родительское растение. В этих вариантах изобретения первая и вторая матричные РНК могут быть идентичными или могут быть различными. В этих вариантах изобретения первый гербицид и второй гербицид могут быть идентичными или могут быть различными. В некоторых случаях по меньшей мере один гербицид из первого гербицида и второго гербицида представляет собой (включает) системный гербицид. В предпочтительных вариантах изобретения по меньшей мере один гербицид из первого гербицида и второго гербицида представляет собой (включает) по меньшей мере один гербицид, выбранный из группы, состоящей из глифосата, дикамбы, глюфоси-ната, сульфонилмочевин, имидазолинонов, бромоксинила, 2,2-дихлорпропионовой кислоты, ингибиторов ацетолактата, циклогександиона, арилоксифеноксипропионата, сульфонамидных гербицидов, триа-зиновых гербицидов, 5-метилтриптофана, аминоэтилцистеина, гербицидов производных перидазинона, гербицидов производных циклопропилизоксазола, ингибиторов протопорфириноген оксидазы и гербицидов, содержащих в качестве фрагмента арилалкилоксиалканоат. В одном варианте способа первое родительское растение является индуцибельно стерильным трансгенным растением, содержащим в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани растения, и (ii) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в мужской репродуктивной ткани, и при этом мужская стерильность трансгенного растения индуцируется при нанесении гербицида на растение, а второе родительское растение является растением с нормальной фертиль-ностью. Для индукции мужской стерильности второго родительского растения гербицид, предпочтительно, наносят по схеме, которая приводит к тому, что неспособность первого родительского растения продуцировать мужские гаметы (или мужские репродуктивные структуры), необходимые для нормального опыления (оплодотворения) второго родительского растения. В таких вариантах изобретения второе родительское растение обычно толерантно к тому же гербициду, который используют для индукции мужской стерильности первого родительского растения, и, следовательно, первое и второе родительские растения можно обрабатывать одним и тем же гербицидом предпочтительно одновременно (например, совместно в поле). Скрещивание первого и второго родительских растений даёт семена, которые являются результатом опыления первого родительского растения вторым родительским растением. В другом варианте способа первое родительское растение является индуцибельно стерильным трансгенным растением, содержащим в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани растения, и (ii) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в женской репродуктивной ткани или в оплодотворённой женской зародышевой клетке, и при этом женская стерильность трансгенного растения индуцируется при нанесении гербицида на растение, а второе родительское растение является растением с нормальной фертильностью. Для индукции женской стерильности первого родительского растения гербицид предпочтительно наносят по схеме, которая приводит, например, к неспособности первого родительского растения продуцировать женские гаметы, способные оплодотворяться, или к неспособности давать полностью развившиеся семена (либо жизнеспособные, либо стерильные), либо к неспособности жизнеспособных посевных семян прорастать и развиваться в нормальное растение потомственного поколения. В таких вариантах изобретения второе родительское растение обычно толерантно к тому же гербициду, который используют для индукции женской стерильности первого родительского растения, и, следовательно, первое и второе родительские растения можно обрабатывать одним и тем же гербицидом предпочтительно одновременно. Скрещивание первого и второго родительских растений даёт семена, которые являются результатом опыления второго родительского растения первым родительским растением. Другой аспект изобретения предусматривает способ получения искусственных гибридных семян, включающий стадии: (а) предоставления (создания) первого растения, являющегося трансгенным растением, выращенным из первой трансгенной растительной клетки (например, из первой трансгенной клетки кукурузы), содержащей в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый первой зрелой микро-РНК, и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к первому гербициду, причём первая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется белка в мужской репродуктивной ткани первого родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в мужской репродуктивной ткани, а мужская стерильность первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) предоставления второго родительского растения, являющегося трансгенным растением, выращенным из второй трансгенной растительной клетки (например, из второй трансгенной клетки кукурузы), содержащей в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность ко второму гербициду, причём вторая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется белка в женской репродуктивной ткани второго родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в женской репродуктивной ткани, а женская стерильность второго родительского растения индуцируется нанесением второго гербицида на второе родительское растение; (в) нанесения первого гербицида и второго гербицида на родительские растения, тем самым индуцируется мужская стерильность в первом растении и женская стерильность во втором родительском растении; (г) скрещивания первого и второго родительских растений, отличающегося тем, что семяпочки первого родительского растения опыляются пыльцой второго родительского растения, при этом получают искусственные гибридные семена (например, семена искусственной гибридной кукурузы). При практическом применении любого из этих способов для получения гибридных семян термин "выращенный" относится к выращиванию трансгенного растения прямой регенерацией из первой трансгенной растительной клетки или к выращиванию трансгенного растения, потомка регенерированного трансгенного растения. Способы прямой регенерации трансгенного растения из трансгенной растительной клетки или к выращиванию трансгенных растений потомственного поколения (включая потомство растения инбредной линии и потомство растения гибридной линии) общеизвестны в уровне техники и описаны в разделе под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений". Вторая матричная РНК может быть такой же, как первая матричная РНК, или может отличаться от первой матричной РНК. В различных вариантах изобретения первая матричная РНК и вторая матричная РНК (а) идентичны; или (б) различны и кодируют разные сегменты белка; (в) различны и кодируют сегменты разных белков. В предпочтительных вариантах изобретения первая и вторая матричные РНК (либо одинаковые, либо различные) сообщают толерантность к одному и тому же гербициду, что делает удобным обработку поля смешанных первого и второго родительских растений единственным гербицидом; при необходимости гербицид наносят один или более раз, чтобы вызвать (индуцировать) мужскую стерильность первого родительского растения и женскую стерильность второго родительского растения. В некоторых случаях первая матричная РНК кодирует первый белок, придающий толерантность к гербициду, а вторая матричная РНК кодирует второй, отличный, белок, придающий толерантность к тому же самому гербициду; в неограничивающем примере первый и второй белки выбирают из группы (включающей 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, глифосат-ацетилтрансферазу и глифосат-декарбоксилазу), в которой все белки сообщают толерантность к глифосату. В других вариантах изобретения первый и второй родительские растения, оба, содержат в своём геноме ДНК, кодирующую два белка, каждый из которых придаёт толерантность к одному или к двум гербицидам, это способствует тому, что поле как с первым, так и со вторым родительскими растениями следует обрабатывать двумя гербицидами (одновременно или по отдельности). В различных вариантах способа первый гербицид и второй гербицид (а) идентичны или (б) различны (причём первый и второй родители предпочтительно толерантны как к первому, так и ко второму гербицидам). Применяются такие схемы нанесения гербицидов, при которых достигается индуцируемая (инду-цибельная) стерильность предпочтительно без снижения выхода или без других нежелательных результатов. Время нанесения гербицидов регулируют таким образом, чтобы индуцировать стерильность. В аналогичном примере найдено, что в линия трансгенного хлопка (RR1445), содержащая EPSPS под контролем FMV 35S конститутивного промотора, наблюдается высокая экспрессия EPSPS в большинстве вегетативных клеток, но низкая экспрессия EPSPS в некоторых типах мужских репродуктивных тканей (материнские клетки пыльцы, мужские гаметофиты и тапетум); нанесение глифосата после стадии четвёртого листа вызывает мужскую стерильность (см. Chen et al. (2006) Plant Biotechnol J., 4: 477-487, опубликовано ранее 7 июня 2006 г., doi:10.1111/j.l467-7652.2006.00203.x). В предпочтительных вариантах изобретения способ применим для получения неприродных (искусственных) гибридных семян сельскохозяйственных растений, размножающихся семенами, таких, которые описаны в разделе под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений", например, такие как кукуруза, рис, пшеница, овёс, ячмень, рожь, тритикале, просо, сорго, квиноя, ширица (амарант), гречиха, кормовые злаки, дернообразующие злаки, люцерна, хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канола, рапс, лён, арахис, бобы, горох, чечевица, латук, спаржа (аспарагус), артишок, сельдерей, морковь, хрен, капуста, горчица, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, турнепс, кольраби, огурцы, дыни, тыква обыкновенная, тыква зимняя, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, шнитт-лук, томаты, баклажаны, перец, физалис, свёкла, мангольд, шпинат, декоративные растения и лесные деревья. В особенно предпочтительном варианте изобретения неприродные (искусственные) гибридные семена представляют собой семена кукурузы. Неприродные (искусственные) гибридные семена, получаемые в результате деятельности человека, включая любой из вариантов способа, конкретно заявляются далее. Трансгенные растения с индуцибельной стерильностью, содержащие конструкцию рекомбинантной ДНК. Независимый аспект данного изобретения включает индуцибельно стерильные трансгенные растения, содержащие в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения, и (б) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется путём нанесения гербицида на растение. В одном варианте изобретения репродуктивная ткань представляет собой мужскую репродуктивную ткань, а стерильность является мужской стерильностью. В другом варианте изобретения репродуктивная ткань представляет собой женскую репродуктивную ткань, а стерильность является женской стерильностью. Ещё в одном варианте изобретения репродуктивная ткань включает оплодотворённую семяпочку, а стерильность к неспособности оплодотворённой семяпочки развиться в жизнеспособное семя. В предпочтительных вариантах изобретения индуцибельно стерильные трансгенные растения представляют собой сельскохозяйственные растения, размножающихся семенами, например, кукуруза, рис, пшеница, овёс, ячмень, рожь, тритикале, просо, сорго, квиноя, ширица (амарант), гречиха, кормовые злаки, дернообразующие злаки, люцерна, хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канола, рапс, лён, арахис, бобы, горох, чечевица, латук, спаржа, артишок, сельдерей, морковь, хрен, капуста, горчица, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, турнепс, кольраби, огурцы, дыни, тыква обыкновенная, тыква зимняя, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, шнитт-лук, томаты, баклажаны, перец, физалис, свёкла, мангольд, шпинат, декоративные растения и лесные деревья. Конструкции рекомбинантной ДНК. Индуцибельно стерильное трансгенное растение, предусматриваемое данным изобретением, содержит в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения, и (б) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в репродуктивной тка ни, а стерильность трансгенного растения индуцируется путём нанесения гербицида на растение. Эта конструкция рекомбинантной ДНК применима для получения хромосом, клеток, семян трансгенного растения и растений, содержащих такую конструкцию, каждый из них в особенности применим для получения гибридных семян. В различных вариантах изобретения, включая варианты индуцибельно стерильного трансгенного растения, конструкция рекомбинантной ДНК дополнительно включает по меньшей мере один элемент, выбранный из (а) растительного промотора; (б) элемента супрессии генов; (в) интрона; (г) элемента экспрессии гена; (д) ДНК, с которой считывается РНК аптамер, способный связываться с лигандом; (е) ДНК, с которой считывается РНК аптамер, способный связываться с лигандом, и ДНК, с которой считы-вается регуляторная РНК, способная регулировать экспрессию целевого гена, характеризующуюся тем, что регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию регуляторной РНК алло-стерически влияет состояние связывания РНК аптамера; и (ж) по меньшей мере одной Т-ДНК границы. Эти дополнительные элементы (например, терминаторы и спейсерная ДНК) подробно описаны ниже в разделах под заголовками "Промоторы", "Элементы супрессии генов", "Интроны", "Элементы экспрессии генов", "Аптамеры", "Лиганды", "Регуляторная ДНК", "Т-ДНК-границы", "Терминаторы" и "Спейсерная ДНК" и в других местах данного описания. Неограничивающие примеры того, как эти различные элементы можно расположить, представлены на фиг. 1 и 2. Методы создания и применения конструкций рекомбинантной ДНК по изобретению для получения трансгенных растительных клеток, содержащих конструкции рекомбинантной ДНК, и трансгенных растений, семян и полученных из них растений потомственного поколения и для анализа влияния транскрипции конструкций рекомбинантной ДНК подробно описаны в разделах под заголовками "Получение и применение конструкций рекомби-нантной ДНК", "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений" и в других местах данного раскрытия. Промоторы. Обычно конструкции рекомбинантной ДНК включают промотор, функционально связанный с транскрибируемой ДНК. Подходящим промотором является любой промотор, способный транскрибировать ДНК в растительной клетке, в которой желательна транскрипция. Неконститутивные промоторы, пригодные для применения с конструкциями рекомбинантной ДНК по изобретению, включают пространственно специфические промоторы, специфические во времени промоторы и индуцибель-ные промоторы. Пространственно специфические промоторы могут включать органелло-, клеточно-, ткане- или органоспецифические промоторы, функциональные в растениях (например, пластидспецифи-ческий, корнеспецифический, пыльцаспецифический или семяспецифический промотор для подавления экспрессии первой целевой РНК в пластидах, корнях, пыльце или семенах соответственно). Во многих случаях особенно пригоден семяспецифический, эмбрионоспецифический, алейроноспецифический или эндоспермоспецифический промотор. Специфические во времени промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию промотировать экспрессию во время определённых стадий развития в процессе роста или репродуктивного цикла астения, или в различное время дня или ночи, или в различное время года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами (например, экзогенными или синтетическими химическими веществами, а также эндогенными феромонами или другими молекулами (соединениями), передающими сигнал) или условиями окружающей среды, таким как, но без ограничения, биотический или абиотический стресс (например, недостаток воды или засуха, жара, холод, высокие или низкие количества питательных веществ или соли, избыточные или недостаточные уровни света или сельскохозяйственный вредитель или патогенная инфекция). Промотор со специфический экспрессией может также включать промоторы, которые обычно конститутивно экс-прессируются, но с разной степенью или "силой" экспрессии, включая промоторы, обычно рассматриваемые как "сильные промоторы" или как "слабые промоторы". Так как сайт узнавания микро-РНК обеспечивает тканеселективную регуляцию экспрессии матричной РНК, во многих предпочтительных вариантах изобретения промотор является просто конститутивным промотором. Неограничивающие конкретные примеры промоторов, применимых в растениях, включают, наряду с другими, промотор опалинсинтазы, выделенный из Т-ДНК Agrobacterium, и промотор вируса мозаики цветной капусты 35S, a также расширенные (усовершенствованные) промоторные элементы или химерные промоторные элементы, например расширенный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, связанный с энхансерным элементом (интрон белка теплового шока 70 кукурузы). Многие специфически экспрессирующие промоторы, функциональные в растениях и применимые в аспектах изобретения, известны в уровне техники. Например, в патентах США 5837848; 6437217 и 6426446 раскрываются "корнеспецифические" промоторы; в патенте США 6433252 раскрывается промотор L13 олеозина кукурузы; в опубликованной патентной заявке США 2004/0216189 раскрывается промотор гена ядра растений, кодирующий локализованную в пластиде альдолазу; в патенте США 6140078 раскрываются солеин-дуцибельные промоторы; в патенте США 6294714 раскрываются светоиндуцибельные промоторы; в патенте США 6252138 раскрываются патоген-индуцибельные промоторы; и в опубликованной патентной заявке США 2004/0123347 A1 раскрываются дефицит-индуцибельные промоторы. Промоторный элемент может включать нуклеотидные последовательности, которые не являются природными промоторами или промоторными элементами или их гомологами, но которые могут регу лировать экспрессию гена. Примеры таких "геннезависимых" регуляторных последовательностей могут включать природные или искусственно созданные последовательности РНК, которые содержат лиганд-связывающую область или аптамер и регуляторную область (которая может быть цис-действующей или транс-действующей). См., например, Isaacs et al. (2004) Nat. Biotechnol, 22: 841-847; Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23: 337-343; Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol, 5: 451-463; Davidson and Ellington (2005) Trends Biotechnol, 23: 109-112; Winkler et al. (2002) Nature, 419: 952-956; Sudarsan et al. (2003) RNA, 9: 644- 647; и Mandal and Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol, 11: 29-35. Такие "риборегуляторы" можно выбирать или создавать (проектировать) для конкретной пространственной или временной специфичности, например для регуляции трансляции экзогенного гена только в присутствии (или в отсутствие) данной концентрации подходящего лиганда. Элементы супрессии генов. Элемент супрессии гена может представлять собой транскрибируемую ДНК любой подходящей длины и обычно включает по меньшей мере около 19-27 нуклеотидов (например, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида) для каждого целевого гена, который предполагает подавить конструкция рекомбинантной ДНК. Во многих вариантах изобретения элементы супрессии генов включают более 23 нуклеотидов (например, более примерно 30, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 300, примерно 500, примерно 1000, примерно 150, примерно 2000, примерно 3000, примерно 4000 или примерно 5000 нуклеотидов) для каждого целевого гена, который предполагает подавить конструкция рекомбинантной ДНК. Целевые гены описаны в разделе под заголовком "Целевые гены (гены-мишени)". Подходящие элементы супрессии генов, применимые для конструкций рекомбинантной ДНК по изобретению, включают по меньшей мере один элемент (и в некоторых вариантах изобретения несколько элементов), выбранных из группы, состоящей из (а) ДНК, которая включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по отношению по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного целевого гена; (б) ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сег- мента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена; (в) ДНК, которая включает по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена; (г) ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена; (д) ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования двухцепочечной (двухтяжевой, двухни- тевой) РНК и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмы- словым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и по мень- шей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по мень- шей мере одного первого целевого гена; (е) ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования единичной двухцепочечной РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена; (ж) ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования множественных двойных цепей РНК и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по мень- шей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные смысло- вые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного пер- вого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловой сегменты ДНК и множествен- ные смысловые сегменты ДНК расположены последовательно в виде обращенных (инвертированных) повторов; (з) ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, предпочтительно микро-РНК растений; (и) ДНК, которая включает нуклеотиды из siPHK; (к) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер (ДНК, с которой считывается РНК аптамер), способный связываться с лигандом; и (л) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом, и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию по меньшей мере одного первого целевого гена, причём регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на кон-формацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНК аптамера. Нелимитирующие изображения этих элементов супрессии генов показаны на фиг. 2. Любой из этих элементов супрессии генов, вне зависимости от того, транскрибируется ли он в единичную двухцепочеч-ную РНК или во множественные двухцепочечные РНК, можно создать таким образом, чтобы подавлять более одного целевого гена, включая, например, более одного аллеля целевого гена, многих целевых генов (или множественных сегментов по меньшей мере одного целевого гена) единственного вида или целевых генов различных видов. Аптамеры, регуляторная РНК и лиганды описаны ниже в разделах под соответствующими заглавиями. Антисмысловые сегменты ДНК. В одном варианте изобретения по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, включает последовательность ДНК, антисмысловую или комплементарную, по меньшей мере, к сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и может включать множественные антисмысловые сегменты ДНК, т.е. множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. Множественные антисмысловые сегменты ДНК могут включать последовательность ДНК, антисмысловую или комплементарную ко многим сегментам по меньшей мере одного первого целевого гена или ко многим копиям сегмента по меньшей мере одного первого целевого гена или к сегментам многих первых целевых генов или к любой их комбинации. Множественные антисмысловые сегменты ДНК могут быть слиты в химеру, например, включающую последовательности ДНК, антисмысловые к множественным сегментам одного или более первых целевых генов и слитые вместе. Антисмысловая последовательность ДНК, антисмысловая или комплементарная (т.е. может образовывать пары оснований Уотсона-Крика), по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 85%, или по меньшей мере примерно на 90%, или по меньшей мере примерно на 95% комплементарна, по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. В одном предпочтительном варианте изобретения последовательность ДНК, антисмысловая или комплементарная, по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена примерно на 95-100% комплементарна, по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. Если по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, степень компле-ментарности может быть, но не обязательно, идентичной для всех множественных антисмысловых сегментов ДНК. Смысловые сегменты ДНК. В другом варианте изобретения по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, включает последовательность ДНК, которая соответствует (т.е. имеет последовательность, идентичную или практически идентичную), по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена и может включать множественные смысловые сегменты ДНК, т.е. множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который соответствует (т.е. имеет последовательность, идентичную или практически идентичную) по меньшей мере одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. Множественные смысловые сегменты ДНК могут включать последовательность ДНК, которая представляет собой или которая соответствует множественным сегментам по меньшей мере одного первого целевого гена, или множественным копиям сегмента по меньшей мере одного первого целевого гена, или сегментам множественных первых целевых генов, или любой их комбинации. Множественные смысловые сегменты ДНК могут быть слиты в химеру, т.е. могут включать последовательности ДНК, соответствующие множественным сегментам одного или более первых целевых генов и слитые вместе. Смысловая последовательность ДНК, которая соответствует, по меньшей мере, сегменту целевого гена предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 85%, или по меньшей мере примерно на 90%, или по меньшей мере примерно на 95% идентична, по меньшей мере, сегменту целевого гена. В одном предпочтительном варианте изобретения последовательность ДНК, которая соответствует, по меньшей мере, сегменту целевого гена примерно на 95-100% идентична, по меньшей мере, сегменту целевого гена. Если по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК включает множественные смысловые сегменты ДНК, степень идентичности последовательностей может быть, но не обязательно, идентичной для всех множественных смысловых сегментов ДНК. Множественные копии. Если элемент супрессии генов включает множественные копии антисмысловой или смысловой последовательности ДНК, эти множественные копии могут быть расположены последовательно в виде тандемных повторов. В некоторых вариантах изобретения эти множественные копии могут быть расположены конец-в-конец, т.е. в виде непосредственно связанных тандемных повторов. В некоторых вариантах изобретения эти множественные копии (дубликаты) могут быть расположены последовательно в виде прерывных тандемных повторов, в которых один или более сегмент спейсер-ной ДНК может прилегать к одной или более множественных копий. Тандемные повторы, либо непосредственно связанные, либо прерывные, либо их комбинация могут включать множественные копии единичной антисмысловой или множественные копии единичной смысловой последовательности ДНК в последовательном (сериальном) расположении или могут включать множественные копии более одной антисмысловой последовательности ДНК или более одной смысловой последовательности ДНК, расположенные последовательно (сериально). Двухнитевая (двухцепочечная, двухтяжевая) РНК. В тех вариантах изобретения, в которых элемент супрессии генов включает либо по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного целевого гена, либо по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного целевого гена, РНК, считываемая либо по меньшей мере с одной антисмысловой, либо по меньшей мере с одной смысловой ДНК может стать двухнитевой под действием РНК-зависимой РНК-полимеразы. См., например, патент США № 5283184. В других вариантах изобретения элемент супрессии генов может включать ДНК, которая считыва-ется в РНК, для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования двухните-вой РНК и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного целевого гена (как описано выше в разделе под заголовком "Антисмысловые сегменты ДНК"), и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (как описано выше в разделе под заголовком "Смысловые сегменты ДНК"). Такой элемент супрессии генов может дополнительно включать сегменты спейсерной ДНК. Каждый по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК является комплементарным по меньшей мере к части смыслового сегмента ДНК, чтобы способствовать образованию двухнитевой РНК за счёт внутримолекулярной гибридизации по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК и по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК. Такая комплементарность между антисмысловым сегментом ДНК и смысловым сегментом ДНК может являться, но необязательно, 100%- ной комплементарностью; в некоторых вариантах изобретения эта комплементарность может составлять по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%. Двухнитевая РНК может быть в виде единственного "стебля" днРНК (области спаривания оснований между смысловой и антисмысловой нитями) или может иметь множественные "стебли" днРНК. В одном варианте изобретения элемент супрессии гена может включать ДНК, которая считывается в РНК для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования преимущественно единичной двухнитевой РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые представляют собой по меньшей мере один сегмент по меньшей мере одного первого целевого гена; множественные серийные антисмысловые и множественные серийные смысловые сегменты могут образовывать единичный "стебель" двухнитевой РНК или множественные "стебли", расположенные последовательно (с не содержащей спаренных оснований спейсерной ДНК или без такой спейсерной ДНК, разделяющей множественные "стебли"). В другом варианте изобретения элемент супрессии генов включает ДНК, которая считы-вается в РНК для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования множественных днРНК "стеблей" РНК, и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловые сегменты ДНК и множественные смысловые сегменты ДНК расположены в виде ряда "стеблей" днРНК (таких, но без ограничения, как "обращенные повторы"). Такие множественные днРНК "стебли" можно далее располагать в виде ряда или кластеров с образованием тандемных обращенных повторов или структур, похожих на очертания "головки молотка" или "клеверного листа". Любой из этих элементов супрессии генов может дополнительно включать сегменты спейсерной ДНК, находящиеся внутри "стебля" днРНК (например, в виде спейсера между множественными антисмысловыми или смысловыми сегментами ДНК или в виде спейсера между образующими пары оснований антисмысловым сегментом ДНК и смысловым сегментом ДНК), или вне "стебля" двухнитевой РНК (например, в области петли, разделяющей пару обращенных повторов). В тех случаях, когда образующие пары оснований антисмысловой и смысловой сегменты ДНК имеют разную длину, более длинный сегмент может играть роль спей-сера. На фиг. 2 проиллюстрированы возможные варианты этих конструкций супрессии генов по изобретению. Микро-РНК. В другом варианте изобретения элемент супрессии генов может включать ДНК, которая содержит нуклеотиды из miPHK (микро-РНК), т.е. последовательность ДНК, которая соответствует микро-РНК, нативной для представляющих интерес вируса или эукариот (включая растения и животных, в особенности беспозвоночных), или последовательность ДНК, образованную из такой нативной микро-РНК, но модифицированную включением нуклеотидных последовательностей, которые не соответствуют нативной микро-РНК. Хотя до настоящего времени не сообщалось о микро-РНК в грибах, микро-РНК грибов, если они существуют, также пригодны для применения в данном изобретении. Один предпочтительный вариант изобретения включает элемент супрессии генов, содержащий ДНК, которая включает нуклеотиды из вирусной или растительной микро-РНК. В неограничивающем примере нуклеотиды из микро-РНК могут включать ДНК, которая содержит нуклеотиды, соответствующие петле нативной микро-РНК, и нуклеотиды, выбираемые из последовательности целевого гена. В другом неограничивающем примере нуклеотиды из микро-РНК могут включать ДНК, образованную при использовании последовательности предшественника микро-РНК, или нуклеотиды, соответствующие областям нативной микро-РНК, и нуклеотиды, выбранные из ряда последовательностей целевого гена таким образом, что сохраняется общая структура (например, расположение ошибочных спариваний в структуре стебля пре-микро-РНК), чтобы содействовать процессированию пре-микро-РНК в зрелую микро-РНК. Ещё в одном варианте изобретения элемент супрессии гена может включать ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК и способна индуцировать или направлять синхронное отщепление эндогенного транскрипта в трансдействующие siPHK, как описано Allen et al. (2005) Cell, 121: 207-221. Таким образом, ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, может включать последовательность природных микро-РНК или предшественника микро-РНК, синтетическую последовательность или и ту и другую. siPHK. Ещё в одном варианте изобретения элемент супрессии генов может включать ДНК, которая включает нуклеотиды малой интерферирующей РНК (siPHK). siPHK может представлять собой одну или более нативных siPHK (таких как siPHK, выделенные из нетрансгенных эукариот или из трансгенных эукариот) или может представлять собой одну или более ДНК последовательностей, которые, по прогнозам, обладают siPHK активностью (например, используя средства прогностического анализа, известные в уровне техники, см., например, Reinolds et al. (2004) Nature Biotechnol, 22: 326-330). Многие нативные или предсказанные последовательности siPHK можно соединять в химерную последовательность siPHK для супрессии генов. Такая ДНК, которая включает нуклеотиды siPHK, предпочтительно включает по меньшей мере 19 нуклеотидов, а в некоторых вариантах изобретения предпочтительно включает по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23 или по меньшей мере 24 нуклеотида. В других вариантах изобретения ДНК, которая включает нуклеотиды siPHK, может содержать значительно больше 21 нуклеотида, например более примерно 50, примерно 100, примерно 300, примерно 500, примерно 1000, примерно 3000 или примерно 5000 нуклеотидов или более. Целевые гены (гены- мишени). Элемент супрессии генов можно создать таким образом, чтобы подавлять любой первый целевой ген. В некоторых вариантах изобретения конструкция дополнительно включает элемент супрессии второго гена для супрессии по меньшей мере одного второго целевого гена, причём элемент супрессии второго гена прилегает к интрону. Любой целевой ген, первый или второй, может включать единичный ген или часть единичного гена, супрессия которого планируется или может включать, например, множественные последовательные сегменты целевого гена, множественные непоследовательные сегменты целевого гена, множественные аллели целевого гена или множественные целевые гены одного или более видов. Целевой ген может быть транслируемой (кодирующей) последовательностью, или может быть не-кодирующей последовательностью (такой как некодирующая регуляторная последовательность), или и той, и другой и может включать по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из целевого гена эукариот, целевого гена неэукариот, последовательности ДНК предшественника микро-РНК и промотора микро-РНК. Целевой ген может быть нативным (эндогенным) для клетки (например, клетки растения или животного), в которой транскрибируется конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению, или может быть нативной для вредителя или возбудителя заболевания (патогенного организма) у растения или животного, в котором транскрибируется конструкция. Целевой ген может быть любым экзогенным геном, таким как трансген в растении. Целевой ген может быть нативным геном, на который нацелена супрессия, с конкурентной экспрессией экзогенного трансгена или без неё, например, путём включения элемента экспрессии генов в ту же самую конструкцию рекомбинантной ДНК или в отдельные конструкции рекомбинантной ДНК. Например, может быть желательным заместить нативный ген на экзогенный трансгенный гомолог. Целевой ген может включать единственный участок единственного гена, супрессия которого намечена или может включать, например, множественные последовательные сегменты целевого гена, множественные непоследовательные сегменты целевого гена, множественные аллели целевого гена или множественные целевые гены одного или более видов. Последовательность целевого гена может включать любую последовательность любого вида (включая, но без ограничения, не-эукариоты, такие как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения, и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек. Один аспект изобретения предусматривает конструкции рекомбинантной ДНК, в которых целевой ген является экзогенным для растения, в которое нужно транскрибировать конструкцию, но эндогенным для вредителя растения или патогенов (возбудителей заболеваний) растения (например, для вирусов, бактерий, грибов, оомицетов, и беспозвоночных, таких как насекомые, нематоды и моллюски). Целевой ген может включать множественные целевые гены или множественные сегменты одного или более генов. В одном предпочтительном варианте изобретения целевой ген или гены представляет(ют) собой ген или гены беспозвоночного вредителя или патогена растения. Эти конструкции рекомбинантной ДНК, пригодные для получения трансгенных растений, устойчивых к одному или более вредителей или патогенов растений, например устойчивых к нематоде, такой как соевая нематода или яванская галловая нематода, или к насекомому-вредителю. Целевой ген может представлять собой транслируемую (кодирующую) последовательность, или некодирующую последовательность (такую как некодирующая регуляторная последовательность), или ту и другую. Неограничивающие примеры целевого гена включают нетранслируемую (некодирующую) последовательность, такую как, но без ограничения, 5' нетранслируемые области, промоторы, энхансеры или другие некодирующие области транскрипции, 3' нетранслируемые области, терминаторы и интроны. Целевые гены включают гены, кодирующие микро-РНК, малые интерферирующие РНК, РНК компоненты рибосом или рибозимов, малые ядерные РНК и другие некодирующие РНК (см., например, некоди-рующие РНК последовательности, доступные в Интернете на сайте rfam.wustl.edu4 Erdmann et al. (2001) Nucleic Acid Res., 29: 189-193; Gottesman (2005) Trends Genet., 21: 399-404; Griffith-Jones et al. (2005) Nucleic Acid Res., 33: 121-124). Конкретным примером целевого гена является сайт узнавания микро-РНК (т.е. сайт на нити РНК, с которым связывается зрелая микро-РНК и индуцирует расщепление). Другим конкретным примером целевого гена является последовательность предшественника микро-РНК, натив-ной для вредителя или патогена трансгенного растения, т.е. первичный транскрипт, кодирующий микро-РНК или РНК интермедиаты, процессированные при использовании первичного транскрипта (например, ограниченные ядром при-микро-РНК или пре-микро-РНК, которые могут направляться (экспортироваться) из ядра в цитоплазму). См., например, Lee et al. (2002) EMBO Journal, 21: 4663-46704; Reinhart et al. (2002) Genes & Dev., 16: 1616- 1626; Lund et al. (2004) Science, 303: 95-98bb Millar and Waterhouse (2005) Funct. Integr Genomics, 5: 129-135. Целевые гены могут также включать транслируемую (кодирующую) последовательность генов, кодирующих факторы транскрипции, и гены, кодирующие ферменты, участвующие в биосинтезе или катаболизме представляющих интерес молекул (таких, но без ограничения, как аминокислоты, жирные кислоты и другие липиды, сахара и другие углеводы, биологические полимеры, и вторичные метаболиты, включая алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, нерибосомные пептиды, и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения). Во многих предпочтительных вариантах изобретения целевой ген представляет собой незаменимый ген вредителя или патогена растения. Незаменимые гены включают гены, необходимые для развития вредителя или патогена в фертильный репродуктивный взрослый организм. Незаменимые гены включают гены, сайленсинг или супрессия которых приводит к смерти организма (как взрослого, так и на любой стадии развития, включая гаметы) или к неспособности организма успешно репродуцироваться (например, к стерильности мужского или женского родителя или летальности зиготы, зародыша или личинки). Описание незаменимых генов нематод имеется, например, в Kemphues K. "Essential Genes" (December 24, 2005), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook. 1.57.1, доступном в Интернете он лайн на сайте www.wormbook.org. Неограничивающие примеры незаменимых генов нематод включают основной белок спермы, РНК-полимеразу II и хитинсинтазу (см., например, опубликованную патентную заявку США US 20040098761 А1); другие независимые гены соевой нематоды представлены в патентной заявке США 11/360355, поданной 23 февраля 2006 г. Описание генов насекомых общедоступно в базе данных генома дрозофилы (Drosophila) (он лайн в Интернете на сайте flybase.bio.indiana.edu/). Функцию большинства предсказанных генов дрозофилы (Drosophila) анализировали скринингом РНК-интерференции клеточных культур, в результате было идентифицировано 438 незаменимых генов; см. Boutros et al. (2004) Science, 303: 832-835, и данные, представленные он лайн в Интернете на сайте www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1. Описание незаменимых генов бактерий и грибов приводится в базе данных незаменимых генов ("DEG", находится на сайте tubic.tju.edu.cn/deg/); см. Zhang et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32: D271-D272. Беспозвоночные вредители растений включают, но без ограничения, вредные нематоды, вредные моллюски (слизни и улитки) и вредные насекомые. Представляющие интерес патогены растений включают грибы, оомицеты, бактерии (например, бактерии, которые вызывают пятнистость листьев, бактериальный ожог, корневой рак и бактериальный вилт), молликуты и вирусы (например, вирусы, которые вызывают мозаику, исчерченность вдоль жилок листа, крапинки, пятнистость или аномальный рост). См. также в G.N. Agrios, "Plant Pathology" (Fourth Edition), Academic Press, San Diego, 1997, 635 pp., описание грибов, бактерий, молликутов ("мягкокожих") (включая микоплазмы и спироплазмы), вирусов, нематод, паразитических высших растений и жгутиковых простейших, каждый из которых является представляющим интерес вредителем или патогеном растений. См. также постоянно обновляемый свод данных о вредителях и патогенах растений и вызываемых ими заболеваниях в "Common Names of Plant Diseases" Американского фитопатологического общества (APS), составляемый Комиссией по стандартизации обычных названий болезней растений Американского фитопатологического общества (Committee on Standardization of Common Names for Plant Diseases of The American Phytopathological Society), 1978-2005, на сайте www.apsnet.org/onlme/common/top.asp. Неограничивающие примеры грибковых патогенов растений, представляющих особый интерес, включают, например, грибки, которые вызывают мучнистую росу, ржавчину, пятнистость и завядание листьев, выпревание, корневую гниль, гниль корневой шейки, гниль коробочек хлопчатника, рак стеблей, рак побегов, поражение сосудов, головню или плесень, включая Fusarium spp., Phakospora spp., Rhi-zoctonia spp., Aspergillus spp., Gibberella spp., Pyricularia spp. и Alternaria spp.. Конкретные примеры грибковых патогенов растений включают Phakospora pachirhizi (азиатская ржавчина сои), Puccinia sorghi (бурая ржавчина кукурузы), Puccinia polysora ("южная ржавчина кукурузы), Fusarium oxysporum и другие Fusarium spp., Alternaria spp., Penicillium spp., Rhizoctonia solani, Exserohilum turcicum (гельминтоспори-озная пятнистость листьев кукурузы), Bipolaris maydis (глазковая пятнистость листьев кукурузы), Usti-lago maydis (пузырчатая головня кукурузы), Fusarium graminearum (Gibberella zeae), Fusarium verticil-liodes (Gibberella moniliformis), F. proliferatum (G. fujikuroi var. intermedia), F. subglutinans (G. subglutinans), Diplodia maydis, Sporisorium hold- sorghi, Colletotrichum graminicola, Setosphaeria turcica, Aureobasidium zeae, Sclerotinia sclerotiorum и различные виды грибов, приведённые в табл. 4 и 5 в патенте США 6194636. Неограничивающие примеры патогенов растений включают патогены, ранее отнесённые к грибам, но позднее классифицированные как оомицеты. Конкретные примеры представляющих интерес патогенов растений класса оомицетов включают представителей рода Pythium (например, Pythium aphanidermatum) и Phytophthora (e. g., Phytophthora infestans, Phytophthora sojae) и организмы, которые вызывают мучнистую росу (например, Peronospora farinosa). Неограничивающие примеры бактериальных патогенов включают микоплазмы, которые вызывают желтуху, и спироплазмы, такие как Spiroplasma kunkelii, которая вызывает карликовость злаков, эубакте-рии, такие как Pseudomonas avenae, Pseudomonas andropogonis, Erwinia stewartii, Pseudomonas syringae pv. syringae, Xylella fastidiosa и различные виды бактерий, приведённые в табл. 3 в патенте США 6194636. Неограничивающие примеры представляющих интерес вирусных патогенов растений включают вирус карликовой мозаики кукурузы (MDMV), вирус мозаики сахарного тростника (SCMV, ранее MDMV штамма В), вирус полосатой мозаики пшеницы (WSMV), вирус хлорозной карликовости кукурузы (MCDV), вирус жёлтой карликовости ячменя (ВЖКЯ, BYDV), вирус верхушки грозди бананов (BBTV) и различные вирусы, приведённые в табл. 2 в патенте США 6194636. Беспозвоночные вредители, представляющие особый интерес, в особенности, но без ограничения, в южном полушарии (включая Южную и Центральную Америку), включают тлю, блошку длинноусую, совку ночницу (spodoptera Noctuidea), колорадского жука, Lygus spp., любые полужесткокрылые (клопы, Hemiptera или Heteroptera) или равнокрылые (Homoptera), любые чешуекрылые (бабочки, Lepidoptera), любые жесткокрылые (жуки, Coleoptera), нематоды, совки, совки хлопковые американские, "походные (ратные) черви", точильщики, листовёртки и т.д. Членистоногие (Arthropoda) вредители, специально охватываемые данным изобретением, включают различные виды совок, включая совку Agrotis repleta, совку ипсилон (Agrotis ipsilon), совку Anicla ignicans, "зернистую" совку (Feltia subterranea), "gusano aspero" (жёсткого червяка, Agrotis malefida); средиземноморскую огнёвку мельничную (Anagasta kuehniella), мукоеда (Catliartus quadricollis), земляную блошку (Chaetocnema spp), огнёвку рисовую (Corcyra cephalonica), блошку длинноусую (божью коровку или "коровку Святого Антония" ("vaquita de San Antonio") (Diabotica speciosa), огнёвку сахарного тростника (Diatraea saccharalis), кукурузного точильщика (Elasmopalpus lignosellus), клопа (Euschistus spp.), хлопковую совку (Helicoverpa zed), мукоеда крошечного (Laemophloeus minutus), пяденицу травяную (Mods latipes), мукоеда суринамского (Oryzaephilus suri-namensis), огнёвку мучную (Pyralis farinalis), огнёвку амбарную южную (Plodia interpunctella), тлю кукурузную листовую (Rhopalosiphum maidis), земляного щитника или подземного клопа ("chinche sub-terranea, Scaptocoris castanea), тлю злаковую обыкновенную (Schizaphis graminum), каландрина (долгоносика кукурузного, Sitophilus zeamais), моль зерновую (Sitotroga cerealella), совку травяную (Spodoptera frugiperda), козявку мавританскую (Tenebroides mauritanicus), клещика паутинного двухпятнистого (Tetranychus urticae), хрущака каштанового (Tribolewn castaneum), совку Alabama argillacea, долгоносика хлопкового (Anthonomus grandis), тлю хлопковую (Aphis gossypii), табачную (хлопковую) белокрылку (Bemisia tabaci), различные виды трипсов (Frankliniella spp.), хлопковую совку (Helicoverpa zed), тлю хлебную ("oruga bolillera")(например, Helicoverpa geletopoeon), совку Heliothis virescens, щитника (Nezara viridula), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella), совку малую (Spodoptera exigua), клеща паутинного (Tetranychus spp.), трипе табачный (Thrips tabaci), белокрылку тепличную (Trialeurodes vaporarium), совку Anticarsia gemmatalis, пятнистого кукурузного жука, или "astilo moteado" (Astylus atromacu-latus), "oruga de la alfalfa" ("гусеница люцерны", Colias lesbia), каштанового клопа ("chinche marron") или клопа с усиками ("chinche de los cuernos") (Dichelops furcatus), "alquiche chico" (Edessa miditabunda), нарывников (Epicauta spp.), "barrenador del brote" (сверлильщика побегов) (Epinotia aporema), "oruga verde del yuyo Colorado" ("зелёную травяную гусеницу) (Loxostege bifidalis), корневые нематоды (Meloidogyne spp.), "oruga cuarteadora" (Mods repanda), южные формы щитников (Nezara viridula), "chinche de la alfalfa" (люцерного клопа) (Piezodorus guildinii), зелёного вредителя клевера (Plathypena scabrd), соевую пяденицу (Pseudoplusia includens), пяденицу подсолнечника "isoca medidora del girasol" (Rachiplusia пи), жёлтую медведицу (Spilosoma Virginian), желто-полосатых "походных (ратных) червей" (Spodoptera ornithogalli), различных долгоносиков (семейство Curculionidae), различных проволочников (семейство Elateridae) и различных личинок хруща (семейство Scarabaeidae). Вредители класса нематод, конкретно охватываемые данным изобретением, включают нематод кукурузы (Belonolaimus spp., Trichlodorus spp., Longidorus spp., Dolichodorus spp., Anguina spp., Pratylenchus spp., Meloidogyne spp., Heterodera spp.), сои (Heterodera gly-cines, Meloidogyne spp., Belonolaimus spp.), бананов (Radopholus similis, Meloidogyne spp., Helicotylenchus spp.), сахарного тростника (Heterodera sacchari, Pratylenchus spp., Meloidogyne spp.), апельсинов (Tylen-chulus spp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.), кофе (Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.), кокосовой пальмы (Bursaphelenchus spp.), томатов (Meloidogyne spp., Belonolaimus spp., Nacobbus spp.), винограда (Meloidogyne spp., Xiphinema spp., Tylenchulus spp., Criconemella spp.), лимона и лайма (Tylenchulus spp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.), какао (Meloi-dogyne spp., Rotylenchulus reniformis), ананаса (Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Rotylenchulus reniformis), папайи (Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis), грейпфрута (Tylenchulus spp., Radopholus spp. Be-lonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.) и кормовых бобов (Meloidogyne spp.). Целевые гены вредителей могут включать гены беспозвоночных для основного белка спермы, аль-фа-тубулина, бета-тубулина, вакуолярной АТФазы, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы, РНК по-лимеразы II, хитинсинтазы, цитохромов, микро-РНК, предшественников микро-РНК, промоторов микро-РНК, а также другие гены, такие как гены, раскрываемые в опубликованной патентной заявке США 2006/0021087 A1, патентной заявке PCT/US 05/11816 и в табл. II опубликованной патентной заявки США 2004/0098761 A1. Целевые гены патогенов могут включать гены вирусных факторов инициации трансляции, вирусных репликаз, микро-РНК, предшественников микро-РНК, тубулина грибов, вакуолярной АТФазы грибов, хитинсинтазы грибов, MAP-киназ грибов, Pad Tyr/Thr фосфатазы грибов, ферментов, участвующих в транспорте (переносе) питательных веществ (например, переносчиков аминокислот или сахаров), ферментов, участвующих в биосинтезе клеточных стенок грибов, кутиназ, ферментов биосинтеза меланина, полигалактоуроназ, пектиназ, пектинлиаз, целлюлаз, протеаз, гены, которые взаимодействуют с генами авирулентности растений, и другие гены, участвующие в инвазии и репликации патогена в инфицированном растении. Таким образом, необязательно, чтобы целевой ген был эндогенным для растения, в котором транскрибируется конструкция рекомбинантной ДНК. Конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению можно транскрибировать в растении и использовать для супрессии гена патогена или вредителя, которые могут заражать растение. Конкретные нелимитирующие примеры подходящих целевых генов включают также гены аминокислот катаболических ферментов (таких, но без ограничения, как ген LKR/SDH кукурузы, кодирующий лизин-кетоглутарат редуктазу (LKR) и сахаропин-дегидрогеназу (SDH), и его гомологи), гены кукурузы, гены, участвующие в синтезе жирных кислот (например, гены растительных микросомных десатураз жирных кислот и растительных ацил-АПБ(АСР)-тиоэстераз, такие, но без ограничения, как гены, раскрываемые в патентах США №№ 6426448, 6372965 и 6872872), гены, участвующие в многостадийных путях биосинтеза, где они могут представлять интерес в качестве регуляторов уровня одного или более интермедиатов, такие как гены, кодирующие ферменты для биосинтеза полигидроксиалканоатов (см., например, патент США 5750848); и гены, кодирующие регуляторные белки клеточного цикла, такие как белки с активностью, подобной активности ингибитора циклинзависимых киназ (CDK) (см., например, гены, раскрываемые в Международной опубликованной патентной заявке WO 05007829 A2). Целевые гены могут включать гены, кодирующие нежелательные белки (например, аллергены или токсины) или ферменты для биосинтеза нежелательных соединений (например, компонентов с нежелательным запахом или вкусом). Так, в одном варианте изобретения предусматривается трансгенное растение или ткань такого растения, улучшенные за счёт супрессии аллергенных белков или токсинов, например арахис, соя или зерно пшеницы с пониженной аллергенностью. Целевые гены могут включать гены, участвующие в созревании фруктов, такие как полигалактуроназа. Целевые гены могут включать гены, у которых экспрессия предпочтительно ограничена конкретной клеткой или тканью или стадией развития или в которых экспрессия предпочтительно является транзиторной, другими словами, когда не обязательна конститутивная или общая супрессия или супрессия, которая распространяется на многие ткани. Так, другие примеры подходящих целевых генов включают гены, кодирующие белки, которые, экспрессируясь в трансгенных растениях, делают трансгенные растения устойчивыми к вредителям или патогенам (см., например, гены холестериноксидазы, раскрываемые в патенте США № 5763245); гены, экспрессия которых индуцируется вредителями или патогенами; и гены, которые могут индуцировать или восстанавливать фертильность (см., например, гены barstar/barnase, описанные в патенте США № 6759575). Можно создать такие конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению, чтобы они более специфически подавляли целевой ген, этого можно добиться, включая в элемент или элементы супрессии области, практически неидентичные последовательности нецелевого гена. Нецелевые гены могут включать любой ген, который не предполагается подвергать сайленсингу (делать молчащим) или подавлять либо в растении, в котором осуществляется транскрипция конструкции рекомбинантной ДНК, либо в организме, который может контактировать с РНК, считываемой с конструкции рекомбинантной ДНК. Нецелевая последовательность гена может включать любую последовательность любого вида (включая, но без ограничения, не-эукариоты, такие как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения, и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек). В одном варианте изобретения целевой ген представляет собой ген, эндогенный для данного вида, такого как данное растение (такое, но без ограничения, как растения, имеющие важное сельскохозяйственное или промышленное значение, включая однодольные и двудольные), а нецелевой ген может представлять собой, например, ген нецелевого вида, такого, как другой вид растения, или ген вируса, гриба, бактерии, беспозвоночного или позвоночного, даже человека. Неограничивающим примером является пример, в котором элемент супрессии гена создаётся для супрессии целевого гена, который является геном, эндогенным для единичного вида (например, для западного кукурузного жука, Diabrotica virgifera virgifera LeConte), но не подавляет нецелевой ген, такой как гены родственного, даже близкородственного, вида (например, северный кукурузный жук, Diabrotica barberi Smith и Lawrence, или блошка одиннадцатиточечная - "южный кукурузный жук", Diabrotica undecipunctata). В других вариантах изобретения (например, где желательно подавлять целевой ген во многих видах) может быть желательным создать элемент супрессии генов для супрессии последовательности целевого гена, общей для многих видов, в которой нужно сделать молчащим целевой ген. Так, можно выбрать элемент супрессии гена, который специфичен к одному таксону (например, специфичен к роду, семейству или даже к большему таксону, такому как тип, например, членистоногих), но не к другим ток-сонам (например, к растениям, или позвоночным, или млекопитающим). В одном неограничивающем примере данного варианта изобретения элемент супрессии гена для сайленсинга гена можно выбирать таким образом, чтобы нацеливаться на патогенные грибы (например, Fusarium spp.), но не нацеливаться на какую-либо последовательность полезных грибов. В другом неограничивающем примере данного варианта изобретения элемент супрессии для сай-ленсинга гена кукурузного жука (длинноусой блошки) можно выбрать таким образом, чтобы он был специфичен ко всем членам рода Diabrotica. В другом примере данного варианта изобретения такой нацеленный на Diabrotica элемент супрессии генов можно выбрать таким образом, чтобы он не был нацелен на какую-либо последовательность полезных жуков (например, хищных коровок, общеизвестных как божьи коровки) или полезных млекопитающих других видов. Степень специфичности РНК, необходимая для сайленсинга целевого гена, зависит от различных факторов. Например, РНК для сайленсинга целевого гена включает двухнитевую РНК (днРНК), и, следовательно, факторы могут включать размер меньших днРНК фрагментов, которые, как ожидается, образуются под действием Dicer-белка или Dicer-подобных белков, и относительную значимость уменьшения возможности (потенциала) днРНК подавлять нецелевые гены. Например, когда предполагается, что фрагменты днРНК будут иметь размер 21 пар оснований, особенно предпочтительный вариант изобретения включает РНК для сайленсинга целевого гена, который кодирует области, практически неидентичные последовательности нецелевого гена, такие как области внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 21 нуклеотид, соответствие наблюдается меньше чем у 21 (например, меньше чем у 21, или меньше чем у 20, или меньше чем у 19, или меньше чем у 18, или меньше чем у 17) из 21 соседнего нуклеотида последовательности нецелевого гена. В другом варианте изобретения области, практически неидентичные нецелевой генной последовательности, включают области, внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 19 нуклеотидов, соответствие наблюдается меньше чем у 19 (например, меньше чем у 19, или меньше чем у 18, или меньше чем у 17, или меньше чем у 16) из 19 соседних нуклеотидов последовательности нецелевого гена. В некоторых вариантах изобретения может быть желательно создать РНК для сайленсинга целевого гена таким образом, чтобы она включала области, предсказанные как области, при использовании которых не образуются нежелательные полипептиды, например, скринингом РНК для сайленсинга целевого гена на последовательности, которые могут кодировать известные нежелательные полипептиды, или их близкие гомологи. Нежелательные полипептиды могут включать, но без ограничения, полипептиды, гомологичные известным аллергенным полипептидам, и полипептиды, гомологичные известньм полипептидным токсинам. Общедоступные последовательности, кодирующие такие нежелательные теоретически аллергенные пептиды, находятся в базе данных аллергенов исследовательской программы по пищевым аллергенам и ресурсам (FARRP) (на сайте allergenonline.com) или в базах данных "Биотехнологические сведения о пищевой безопасности" (Biotechnology Information for Food Safety) (на сайте www.iit.edu/~sgendel/fa.htm) (см. также, например, Gendel (1998) Adv. Food Nutr. Res., 42: 63-92). Нежелательные последовательности могут также включать, например, полипептидные последовательности, аннотированные как известные токсины или как возможные или известные аллергены и содержащиеся в находящихся в открытом доступе базах данных, таких как GenBank, EMBL, SwissProt и другие, которые можно искать с помощью системы ввода Entrez (www.ncbi.nih.gov/Entrez). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально аллергенных пептидных последовательностей включают соевый белок глицинии, олеозин и агглютинин в арахисе, глютенины в пшенице, казеин, лактальбумин и лактоглобу-лин в коровьем молоке и тропомиозин в различных моллюсках и ракообразных (allerjgenonline.com). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально токсических пептидов включают столбнячный токсин tetA Clostridium tetani, диарейные токсины Staphylococcus aureus, и яды, такие как конотоксины из Conus spp. и нейротоксины в земноводных и рептилиях (www.ncbi.nih.gov/Entrez). В одном неограничивающем примере проводят скрининг РНК для сайленсинга целевого гена с це лью выяснить транскрибируемые последовательности, кодирующие полипептиды с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином в пределах 8 соседних аминокислот, или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот; такой скрининг (контроль, просеивание) осуществляют во всех возможных рамках считывания в обоих направлениях, в потенциальных открытых рамках считывания, которые начинаются с AUG (ATG в соответствующей ДНК), или во всех возможных рамках считывания вне зависимости от того, начинаются они с AUG (или ATG) или нет. Если наблюдается "попадание" или совпадение, т.е. если идентифицируется последовательность, которая кодирует потенциальный полипептид с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином на протяжении (в пределах) 8 соседних аминокислот (или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот), нуклеотидные последовательности, соответствующие совпадению, можно обойти, избегнуть, их можно исключить или модифицировать при выборе последовательностей, которые следует использовать в РНК для сайленсинга целевого гена. Обход, исключение или модификацию нежелательной последовательности можно осуществить любым методом, известным специалистам в данной области техники. В некоторых случаях в результате получают новые последовательности, которые, как полагают, не существуют в природе. Например, обойти некоторые последовательности (избегнуть их) можно, соединяя вместе "чистые" последовательности в новые "химерные" последовательности для применения в качестве РНК для сайленсинга целевого гена. Так как РНК для сайленсинга целевого гена включает двухнитевую РНК (днРНК), заявители признают, что при сайленсинге генов, опосредуемых некоторыми днРНК, в случае отсутствия абсолютного соответствия последовательностей днРНК возможен эффективный сайленсинг генов. Например, было показано, что несоответствия (ошибочные нуклеотиды) близ центра комплементарного сайта микро-РНК оказывают более сильное влияние на сайленсинг гена под действием микро-РНК, чем далее (более дис-тально) локализованные несоответствия (несоответствующие, ошибочные нуклеотиды). См., например, фиг. 4 в Mallory et al. (2004) EMBO J., 23: 3356-3364. В другом примере сообщалось, что как положение несоответствующих (ошибочных) пар оснований, так и идентичность нуклеотидов, образующих ошибочное спаривание, влияют на способность данной siPHK заставить молчать целевой ген, и что ошибочные спаривания аденозин-цитозин, помимо неоднозначно соответствующей (гипотеза "качелей") пары оснований G:U, вполне допускались (см. Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: 1671-1677). Таким образом, последовательность днРНК, которая включается в РНК для сайленсинга целевого гена, не обязательно должна всегда быть на 100% идентична заданному целевому гену, но обычно предпочтительно степень идентичности последовательности с последовательностью заданного целевого гена должна быть значительной, а именно составлять примерно 95%, примерно 90%, примерно 85%, примерно 80%. Специалист в данной области техники сможет понять всю важность с учётом скрининга на области, предсказанные как области, более высокоспецифические к целевому гену, или предсказанные как области, которые не образуют нежелательные полипептиды, связанные с важностью других критериев, таких как, но без ограничения, процент идентичности последовательности с заданным целевым геном или предсказанная эффективность данной последовательности в сайленсинге гена. Например, может быть желательным, чтобы РНК для сайленсинга целевого гена была активна в нескольких видах, и тогда специалист в данной области техники может определить, что более важно включить в РНК для сайленсинга целевого гена области, специфические для нескольких представляющих интерес видов, и менее важно проводить скрининг на области, предсказанные как области с более высокой эффективностью сайленсинга гена, или на области, предсказанные как области, генерирующие нежелательные полипептиды. РНК-аптамеры. Нуклеотидные аптамеры представляют собой нуклеотидные молекулы, которые связываются с лигандом по механизму связывания, который, прежде всего, не основан на спаривании оснований по Уотсону-Крику (в противоположность, например, спариванию оснований, происходящему между комплементарными, антипараллельными нуклеотидными нитями с образованием двухнитевой (двухцепочечной) нуклеотидной структуры). См., например, Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818822. Нуклеотидный аптамер обычно включает первичную нуклеотидную последовательность, которая позволяет аптамеру образовывать вторичную структуру (например, образование структур стебель-петля), способствующую связыванию аптамера с его лигандом. Связывание аптамера с его лигандом предпочтительно является специфическим, позволяющим аптамеру сделать различие между двумя или более молекул, сходных по структуре (см., например, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol.,23: 337-343). Апта-меры, применимые в данном изобретении, могут, однако, быть одновалентными (связывание с единичным лигандом) или мультивалентным (связывание более чем с одним отдельным лигандом, например, связывание одного элемента с двумя или более различных лигандов). См., например, Di Giusto and King (2004) J. Biol. Chem., 279: 46483-46489, где описывается дизайн и конструкция мультивалентных аптаме-ров кольцевой ДНК. Аптамеры, применимые в данном изобретении, могут включать ДНК, РНК, нуклеотидные аналоги (например, пептид-нуклеиновые кислоты), замкнутые нуклеиновые кислоты, химически модифицированные нуклеиновые кислоты или их комбинации. См., например, Schmidt et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32: 5757-5765, который описывает замкнутые нуклеотидные аптамеры. В предпочтительном варианте изобретения аптамер представляет собой РНК-аптамер. В особенно предпочтительном варианте изобретения аптамер получают транскрипцией в растении. Примеры аптамеров можно найти, например, в общедоступной базе данных аптамеров на сайте aptamer.icmb.utexas.edu (Lee et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32(1): D95-100). Аптамеры можно создавать для данного лиганда различными методами, известными в уровне техники, включая in vitro селекцию или методы направленной эволюции. См., например, "SELEX" ("систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением"), метод, описанный Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505-510, Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818-822, Ellington and Szostak (1992) Nature, 355: 850-852, селекцию бифункциональных РНК-аптамеров методом химерного SELEX, описанную Burke and Willis (1998), RNA, 4: 1165-1175, селекцию с применением лигандов, связанных с магнитными частицами, описанную Murphy et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:e110, автоматизированный SE-LEX, описанный Eulberg et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33(4):e45, и метод типа SELEX для получения аптамеров к рекомбинантным молекулам, экспрессирующимся на клеточной поверхности, описанный Ohuchi et al. (2005) Nucleic Acid Symposium Series, 49: 351-352. Селекцию можно начинать, используя случайный пула РНК, используя частично структурированного пула РНК (см., например, Davis and Szos-tak (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 11616-11621), или пул вырожденных РНК (см., например, Geiger et al. (1996) Nucleic Acids Res., 24: 1029-1036). Модели вторичной структуры, фолдинг и поведение при гибридизации для данной последовательности РНК можно предсказать, используя алгоритмы, например, описанные Zuker (2003) Nucleic Acids Res., 31: 3406-3415. Таким образом, аптамеры для данного лиганда можно создать de novo, используя подходящий отбор (селекцию). Один неограничивающий пример дизайна и селекции аптамеров подробно описан в Weill et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32: 5045-5058, который описывает выделение различных АТФ-связывающих аптамеров и вторичную селекцию аптамеров, которые связывают кордицептин (3'-дезоксиаденозин). Другой неограничивающий пример дизайна ап-тамера дан в статье Huang and Szostak (2003) RNA, 9: 1456-1463, в которой описывается in vitro эволюция новых аптамеров с новыми специфичностями и новые вторичные структуры из исходного аптамера. Лиганды. Лиганды, применимые в данном изобретении, могут включать аминокислоты или их биосинтетические или катаболические интермедиаты, пептиды, белки, гликопротеины, липопротеины, углеводы, жирные кислоты и другие липиды, стероиды, терпеноиды, гормоны, нуклеиновые кислоты, ароматические соединения, алкалоиды, природные продукты или синтетические соединения (например, красители, фармацевтические вещества, антибиотики, гербициды), неорганические ионы и металлы, короче говоря, любые молекулы (или фрагменты молекулы), которые могут узнаваться и связываться вторичной структурой нуклеиновой кислоты по механизму, прежде всего, не основанному, на спаривании оснований по Уотсону-Крику. Таким образом, узнавание и связывание лиганда и аптамера аналогично узнаванию и связыванию антигена и антитела или эффектора биологического ответа и рецептора. Лиганды могут включать единичные молекулы (или часть (фрагмент) молекулы) или комбинацию двух или более молекул (или фрагментов молекул) и могут включать один или более макромолекулярных комплексов (например, полимеры, липидные бислои, липосомы, клеточные мембраны или другие клеточные структуры или поверхности клеток). См., например, статью Plummer et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: 56025610, в которой описывается селекция аптамеров, которые связываются со сложной поверхностью низкомолекулярных белков; Zhuang et al. (2002) J. Biol. Chem., 277: 13863-13872, где описывается ассоциация рецепторных белков средней кишки насекомых с липидными рафтами, которая влияет на связывание эндотоксинов Bacillus thuringiensis насекомых; и Homann and Goringer (1999) Nucleic Acids Res., 27: 20062014, где описаны аптамеры, которые связываются с живыми трипаносомами. Неограничивающие примеры специфических лигандов включают витамины, такие как кофермент B12 и тиамин-пирофосфат, флавин-мононуклеотид, гуанин, аденозин, S-аденозилметионин, S-адонозилгомоцистеин, кофермент А, лизин, тирозин, дофамин, глюкозамин-6-фосфат, кофеин, теофил-лин, антибиотики, такие как хлорамфеникол и неомицин, гербициды, такие как глифосат и дикамба, белки, включая вирусные оболочечные белки или оболочечные белки фага, эпидермальные или поверхностные белки пищеварительного тракта насекомых, и РНК, включая вирусную РНК, транспортные РНК (тРНК), рибосомную РНК (рРНК), и РНК-полимеразы, такие как РНК-зависимая РНК полимераза (RdRP). Лиганды, пригодные для применения в данном изобретении, включают рецепторные белки щёточной каймы средней кишки насекомых, которые узнаются эндотоксинами Bacillus thuringiensis насекомых. См., например, статьи Knight et al. (1995) J. Biol. Chem., 270: 17765- 17770, и Gill et al. (1995) J. Biol Chem., 270: 27277-27282, в которых описывается выделение, идентификация и клонирование примеров таких рецепторных белков; Gomez et al. (2001) J. Biol. Chem., 276: 28906-28912, и Daniel et al. (2002) Appl. Env. Microbiol, 68: 2106-2112, где описаны методы идентификации связывающих эпитопов таких рецепторных белков и методы изучения их аффинности связывания; Jurat-Fuentes and Adang (2001) Appl. Env. Microbiol, 67: 323-329, и Jurat-Fuentes et al. (2001), Appl. Env. Microbiol, 67: 872-879, где описываются анализы эндотоксин-рецепторного связывания, включающие измерение связывания везикул на мембране микроворсинок щёточной каймы с эндотоксином либо методами мембранных блотов, либо методом поверхностного плазмонного резонанса. Другие примеры подходящих лигандов, с которыми связываются РНК-аптамеры по изобретению, включают стероидные рецепторы, такие как эстрогеновые ре цепторы, андрогеновые рецепторы, ретиноидные рецепторы и экдистероидные (ecdysone) рецепторы (см., например, Saez et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 14512-14517. Если лиганды представляют собой рецепторные молекулы или рецепторные комплексы, РНК-аптамеры по изобретению могут, необязательно, действовать как антагонисты или как агонисты. Один класс РНК-аптамеров, применимых в изобретении, представляет собой "термовыключатели" ("термопереключатели", thermoswitches), которые не связывают лиганд, но чувствительны к нагреванию, другими словами, конформация аптамера определяется температурой. См., например, Box 3 в работе Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5: 451-463. Аптамер можно описывать с помощью его состояния связывания, т.е. тем, связан ли (или не связан) аптамер с соответствующим лигандом. Сайт связывания (или трёхмерный(е) домен или домены связывания) аптамеры можно описывать как занятые или незанятые лигандом. Аналогично, популяцию данного аптамера можно описывать частью популяции, которая связана или не связана с лигандом. Аффинность аптамера к его лиганду можно описывать с точки зрения скорости ассоциации (связывания) аптамера с лигандом и скорости диссоциации лиганда от аптамера, например, равновесной константой ассоциации (K) или соответствующей ей константой аффинности (Ka), что общеизвестно в уровне техники. Эти скорости можно определять методами, аналогичными общепринятым методам определения кинетики связывания лигандов и рецепторов или антигенов и антител, такими, но без ограничения, как анализы равновесного состояния, конкурентные анализы, поверхностный плазмонный резонанс и прогностические модели. Аффинность аптамера к лиганду может быть отобрана, например, в процессе in vitro развития аптамера или может быть дополнительно модифицирована с помощью изменений в первичной последовательности аптамера, где такие изменения можно проводить, руководствуясь расчётами энергии связывания или с помощью алгоритмов, например, описанных Zuker (2003) Nucleic Acids Res., 31: 3406-3415 или Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23: 337-343. Состояние связывания аптамера предпочтительно, по меньшей мере частично, определяет вторичную структуру (например, образование двухнитевых или однонитевых областей) и трёхмерную конформацию аптамера. В вариантах изобретения, в которых транскрибируемая ДНК дополнительно включает ДНК, которая считывается в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию целевой последовательности, состояние связывания аптамера аллостерически влияет на конформацию регуляторной РНК и, следовательно, на способность регуляторной РНК регулировать экспрессию целевой последовательности. В одном предпочтительном варианте изобретения аптамер (считываемая РНК) фланкирован ДНК, которая транскрибируется в РНК, способную образовывать двухнитевую РНК (днРНК). В некоторых из этих вариантов изобретения днРНК процессирует по PHKi (siPHK или микро-РНК) механизму, при этом аптамер отщепляется от остального транскрипта. В других, особенно предпочтительных вариантах изобретения две области транскрибируемой РНК, фланкирующие аптамер, образуют между собой "стебель", по меньшей мере частично, двухнитевой РНК, причём аптамер служит в качестве "спейсера" или "петли" в структуре "стебель-петля"; предполагается, что такое расположение повышает стабильность или период полужизни транскрипта аналогично тому, что наблюдается для ДНК (см., например, Di Giusto and King (2004) J. Biol. Chem., 279: 46483-46489). Трансгенные растения, содержащие в своём геноме ДНК, которая считывается в такие аптамеры, имеющие повышенную устойчивость, особенно желательны, например, там, где аптамер функционирует, ингибируя или убивая патоген или вредитель трансгенного растения. Регуляторная РНК. Во многих вариантах изобретения транскрибируемая ДНК дополнительно включает ДНК, с которой считывается регуляторная РНК, способная регулировать экспрессию целевой последовательности, причём регуляция целевой последовательности зависит от конформации регулятор-ной РНК, а на конформацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНК-аптамера. Такие комбинации аптамера с доменом регуляторной РНК общеизвестны как "рибо-переключатели" (riboswitches). Регуляторная РНК обычно расположена в направлении 3' аптамера, но два домена могут перекрываться; см., например, Najafi-Shoushtary and Famulock (2005) RNA, 11: 1514-1520, где описывается рибозим со структурой "FB", который включает аптамерный домен и конкурентно регулируется флавин-мононуклеотидом и олигонуклеотидом. комплементарным аптамерному домену. В некоторых вариантах изобретения рекуляторная РНК функционально связана с целевой последовательностью и действует "в цис". В других вариантах изобретения регуляторная РНК не связана функционально с целевой последовательностью и действует "в транс". Можно выбрать любую целевую последовательность, включая одну или более целевых последовательностей, выбранных из гена, нативного для трансгенного растения по изобретению, трансгена в трансгенном растении и гена, нативного для вредителя или патогенна трансгенного растения. Целевая последовательность может включать последовательность, которая экспрессирует ген, представляющий интерес (например, РНК, кодирующую белок), или последовательность, которая подавляет ген, представляющий интерес (например, РНК, которая процессирует в siPHK или микро-РНК, которая, в свою очередь, подавляет ген, представляющий интерес). Целевая последовательность может являться транслируемой (кодирующей) последовательностью или может быть некодирующей последовательностью (такой как некодирующая регуляторная последовательность) или и той, и другой. Целевая последова тельность может включать по меньшей мере одну эукариотическую целевую последовательность, по меньшей мере одну неукариотическую целевую последовательность или и ту, и другую. Целевая последовательность может включать любую последовательность любого вида (включая, но без ограничения, не-эукариот, таких как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночных, таких как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночных, таких как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек). Подходящие целевые последовательности подробнее описаны в качестве "целевых генов" под заголовком "Целевые гены". В вариантах изобретения, относящихся к рибопереключателям, включающим аптамер и регулятор-ную РНК, рибопереключатели регулируют экспрессию целевой последовательности по соответствующему механизму. Один нелимитирующий механизм представляет собой транскрипционную регуляцию с помощью лигандзависимого образования характерного "стебля" терминатора (за структурой удлинённый стебель-петля обычно следует отрезок из 6 или более остатков U), который обусловливает прерывание транскрипции РНК-полимеразой, например, до образования полноразмерной мРНК. В "off-рибопереключателях" (рибовыключателях") при недостатке лиганда несвязанный аптамерный домен содействует образованию "антитерминаторного стебля", который предупреждает образование характерного стебля терминатора и, следовательно, способствует тому, чтобы происходила транскрипция; поэтому состоянием по умолчанию является состояние "on" (включение) (т.е. транскрипция протекает нормально), и следует добавить лиганд для того, чтобы выключить "рибопереключатель". В "on" рибоперек-лючателях (riboswitches), которые используют этот механизм, аптамерный домен должен быть в связанной (занятой лигандом) конформации, способствующей образованию "антитерминаторного стебля" и разрешающей транскрипцию. Другим механизмом является регуляция трансляции, в которой связывание лиганда вызывает структурные изменения в полноразмерных мРНК и, тем самым, позволяет рибосомам связываться (или предупреждает связывание рибосом) с сайтом связывания рибосом (RBS); образование стебля "анти-анти-RBS" и стебля "анти-RBS" также является взаимно исключающим. В "on" рибоперек-лючателях (riboswitches), которые используют этот механизм, отсутствие лиганда способствует образованию анти-анти-RBS и, следовательно, структурно "свободной" RBS, с которой может связываться рибосома. Также возможна комбинация как транскрипционной, так и трансляционной регуляции. Подробно механизмы регуляции обсуждаются в Mandel and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5: 451-463. В некоторых вариантах изобретения регуляторные РНК включают рибозим, например саморасщепляющийся рибозим, рибозим со структурой "головка молотка" или рибозим со структурой "шпильки". Некоторые варианты изобретения, относящиеся к регуляторной РНК, включают последовательность РНК, которая комплементарна или практически комплементарна целевой последовательности. Одним неограничивающим примером является пример, в котором регуляторная РНК включает антисмысловой сегмент, комплементарный или практически комплементарный целевой последовательности. См., например, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol, 23: 337-343, где регуляторная РНК включает как антисмысловой сегмент, комплементарный целевой последовательности, так и смысловой сегмент, комплементарный антисмысловому сегменту, причём антисмысловой сегмент и смысловой сегмент способны гибридизоваться друг с другом с образованием внутримолекулярной двухнитевой РНК. В некоторых вариантах изобретения регуляция целевой последовательности включает спаривание оснований регуляторной РНК и целевой последовательности по Уотсону-Крику (например, в вариантах изобретения с транс- действием, см., например, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23: 337-343). В частности, в таких вариантах с трансдействием подходящие целевые последовательности включают целевые гены, описанные под заголовком "Целевые гены". Представляющая интерес целевая последовательность может стать более специфической мишенью, если создать регуляторную РНК, включающую области, практически неидентичные нецелевой последовательности. Нецелевые последовательности могут включать любой ген, экспрессия которого предпочтительно не модифицируется, либо в растении, транскрибирующем конструкцию рекомбинатной ДНК, либо в организмах, которые могут контактировать с РНК, считываемой с конструкции рекомбинантной ДНК. Нецелевая последовательность может включать любую последовательность из любого вида (включая, но без ограничения, неэукариоты, такие как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек). В одном варианте изобретения предусматривается трансгенное растение, имеющее в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую транскрибируемую ДНК, содержащую ДНК, с которой считывается РНКК-аптамер, способный связываться с лигандом, причём конструкция сообщает химически индуцируемую или супрессируемую мужскую стерильность или фертильность гибридизации. В предпочтительных примерах используется рибопереключатель (riboswitch), содержащий аптамер, который связывает лиганд, представляющий собой уже зарегистрированное (запатентованное) соединение, например, улучшенный гербицид. В неограничивающем примере трансгенное растение, содержащее (ук рывающее) ген мужской стерильности под контролем промотора, специфического к особям мужского пола, и "off" рибопереключатель глифосата, проявляет мужскую стерильность, если не наносится глифо-сат. Напротив, трансгенное растение, "укрывающее" ген мужской стерильности под контролем промотора, специфического к особям мужского пола, и "on" рибопереключатель глифосата, проявляет мужскую стерильность только при нанесении глифосата. Одним из применений по изобретению является создание активируемой лигандом устойчивой к гербициду системы для сохранения идентичности генов ("генный замок"), а также для сохранения устойчивого к гербициду самосевного контроля. В одном варианте изобретения последовательность ДНК, кодирующая "on" рибопереключатель встраивается в кассету экспрессии, содержащую целевую последовательность "СР4", селективный маркер, придающий резистентность к глифосату, epspsK^ (5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза из Agrobacterium tumefaciens штамма СР4), для экспрессии СР4 в трансгенных растениях в зависимости от условий. Трансгенные растения, "укрывающие" регулируемую рибопереключателем СР4 кассету, экспрессируют СР4 только в присутствии лиганда, который наносится (например, с помощью спрея для листьев) на растение в виде специализированного (патентованного) препарата глифосата, содержащего лиганд. После нанесения обладающий гербицидным действием препарат глифосата активирует транскрипцию/трансляцию СР4 и придаёт трансгенному растению резистентность к глифосату. Трансгенные растения чувствительны к аналогам препаратов глифосата (джене-рикам), которые не содержат лиганд. Аналогично, этот подход можно применять к любым другим комбинациям гена устойчивости к гербициду/гербицида, например к комбинации дикамба-разрушающая оксигеназа/дикамба или к комбинации: ген устойчивости к антибиотику/антибиотик. В другом варианте изобретения целевая последовательность представляет собой ген, эндогенный для данного вида, такого как данное растение (такое, но без ограничения, как важные с точки зрения сельского хозяйства или промышленности растения, включая однодольные и двудольные), а нецелевая последовательность может представлять собой, например, ген нецелевого вида, такого как растение другого вида или ген вируса, гриба, бактерии, беспозвоночного или позвоночного, даже человека. Одним неограничивающим примером является пример, в котором желательно создать либо аптамер, либо регу-ляторную РНК, либо и то, и другое, чтобы модифицировать экспрессию целевой последовательности, которая представляет собой ген, эндогенный для единственного вида (например, для западного кукурузного жука, Diabrotica virgifera virgifera LeConte), но не модифицировать экспрессию нецелевой последовательности, такой как последовательности генов родственного, даже близкородственного вида (таких, например, как северный кукурузный жук, Diabrotica barberi Smith и Lawrence или блошка одиннадцатиточечная - "южный кукурузный жук", Diabrotica undecipunctata). В других вариантах изобретения (например, где целесообразно модифицировать экспрессию целевой последовательности в нескольких видах) может потребоваться создать аптамер, или регуляторную РНК, или и то, и другое для модификации экспрессии общей для нескольких видов целевой последовательности, экспрессию которой следует модифицировать. Так, можно выбирать аптамер или регулятор-ную РНК или и то, и другое, специфические к одному таксону (например, специфические к роду, семейству или даже большему таксону, такому как тип, например, членистоногих), но не к другим токсонам (например, к растениям, или позвоночным, или млекопитающим). В одном неограничивающем примере данного варианта изобретения регуляторную РНК можно выбирать таким образом, чтобы нацеливаться на патогенные грибы (например, Fusarium spp.), но не нацеливаться на последовательность какого-либо гена полезных грибов (например, полезных почвенных микоризных грибов). В другом неограничивающем примере данного варианта изобретения аптамер, или регуляторную РНК, или и то, и другое можно выбирать таким образом, чтобы они были специфичны ко всем членам рода Diabrotica. Например, можно так выбрать регуляторную РНК, включающую нацеленный на Diabrot-ica элемент супрессии генов (например, антисмысловую РНК, двухнитевую РНК, микро-РНК или тан-демные РНК повторы), чтобы она не была нацелена на какую-либо последовательность полезных жуков (например, хищных коровок, общеизвестных как божьи коровки) или полезных млекопитающих других видов. Степень специфичности регуляторной РНК, включающей элемент супрессии генов (например, антисмысловую РНК, двухнитевую РНК, микро-РНК или тандемные РНК повторы), необходимая для супрессии целевой последовательности, зависит от различных факторов. Например, если элемент супрессии гена включает двухнитевую РНК (днРНК), факторы могут включать размер меньших днРНК фрагментов, которые, как ожидается, образуются под действием Dicer, и относительную значимость уменьшения возможности (потенциала) днРНК подавлять нецелевые гены. Например, когда предполагается, что фрагменты днРНК будут иметь размер 21 пара оснований, особенно предпочтительный вариант изобретения может включать последовательность регуляторной РНК, способную образовывать днРНК и кодировать области, практически неидентичные нецелевой последовательности, такие как области внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 21 нуклеотид, соответствие наблюдается меньше чем для 21 (например, меньше чем для 21, или меньше чем для 20, или меньше чем для 19, или меньше чем для 18, или меньше чем для 17) из 21 соседнего нуклеотида нецелевой последовательности. В другом варианте изобретения области, практически неидентичные нецелевой генной по- 26 следовательности, включают области, внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 19 нуклеотидов, соответствие наблюдается меньше чем нецелевого 19 (например, меньше чем нецелевого 19, или меньше чем нецелевого 18, или меньше чем нецелевого 17, или меньше чем нецелевого 16) из 19 соседних нуклеотидов последовательности нецелевого гена. В некоторых вариантах изобретения может быть целесообразным создать аптамер, регуляторную РНК или и то, и другое, включающие области, предсказанные как области, при использовании которых не образуются нежелательные полипептиды, например, скринингом аптамера, регуляторной РНК, или и того, и другого, на последовательности, которые могут кодировать известные нежелательные полипептиды, или их близкие гомологи. Нежелательные полипептиды включают, но без ограничения, полипептиды, гомологичные известным аллергенным полипептидам, и полипептиды, гомологичные известным полипептидным токсинам. Общедоступные последовательности, кодирующие такие нежелательные теоретически аллергенные пептиды, находятся в базе данных аллергенов исследовательской программы по пищевым аллергенам и ресурсам (FARRP) (на сайте allergenonline.com) или в базах данных "Биотехнологические сведения о пищевой безопасности" (Biotechnology Information for Food Safety) (на сайте www.iit.edu/~sgendel/fa.htm) (см. также, например, Gendel (1998) Adv. Food Nutr. Res., 42: 63-92). Нежелательные последовательности могут также включать, например, полипептидные последовательности, аннотированные как известные токсины или как возможные или известные аллергены и содержащиеся в находящихся в открытом доступе базах данных, таких как GenBank, EMBL, SwissProt и другие, которые можно искать с помощью системы ввода Entrez (www.ncbi.nih.gov/Entrez). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально аллергенных пептидных последовательностей включают соевый белок глицинии, олеозин и агглютинин в арахисе, глютенины в пшенице, казеин, лактальбумин и лактоглобу-лин в коровьем молоке и тропомиозин в различных моллюсках и ракообразных (allergenonline.com). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально токсических пептидов включают столбнячный токсин tetA Clostridium tetani, диарейные токсины Staphylococcus aureus, и яды, такие как конотоксины из Conus spp. и нейротоксины в земноводных и рептилиях (www.ncbi.nih.gov/Entrez). В одном неограничивающем примере можно проводить скрининг предполагаемых аптамера, регу-ляторной РНК, или и того, и другого с целью выяснить транскрибируемые последовательности, кодирующие полипептиды с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином в пределах 8 соседних аминокислот, или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот; такой скрининг (контроль, просеивание) можно осуществлять во всех возможных рамках считывания в обоих направлениях, в потенциальных открытых рамках считывания, которые начинаются с ATG, или во всех возможных рамках считывания вне зависимости от того, начинаются они с ATG или нет. Если наблюдается "попадание" ("hit") или совпадение, т.е. если идентифицируется последовательность, которая кодирует потенциальный полипептид с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином на протяжении (в пределах) 8 соседних аминокислот (или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот), последовательности ДНК, соответствующие совпадению, можно обойти, избегнуть, их можно исключить или модифицировать при выборе последовательностей, которые следует использовать в аптамере, регуляторной РНК или в обоих. Обход, исключение или модификацию нежелательной последовательности можно осуществить любым методом, известным специалистам в данной области техники. В некоторых случаях в результате получают новые последовательности, которые, как полагают, не существуют в природе. Например, обойти некоторые последовательности (избегнуть их) можно, соединяя вместе "чистые" последовательности в новые "химерные" последовательности для применения в элементе супрессии генов. Если регуляторная РНК включает двухнитевую РНК (днРНК) для сайленсинга целевого гена, заявители признают, что в некоторых случаях сайленсинга генов, опосредуемых днРНК, при отсутствии абсолютного соответствия последовательностей днРНК возможен эффективный сайленсинг генов. Например, было показано, что несоответствия (ошибочные нуклеотиды) близ центра комплементарного сайта микро-РНК оказывают более сильное влияние микро-РНК на сайленсинг гена, чем далее (более дистально) локализованные несоответствия (несоответствующие, ошибочные нуклеотиды). См., например, фиг. 4 в Mallory et al. (2004) EMBO J., 23: 3356-3364. В другом примере сообщалось, что как положение несоответствующих (ошибочных) пар оснований, так и идентичность нуклеотидов, образующих ошибочное спаривание, влияют на способность данной siPHK заставить молчать целевую последовательность, и что ошибочные спаривания аденозин-цитозин, помимо неоднозначно соответствующей (гипотеза "качелей") пары оснований G:U, вполне допускались (см. Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: 1671-1677). Таким образом, регуляторная РНК, которая включает двухнитевую РНК, не обязательно должна всегда быть на 100% идентична заданной целевой последовательности, но обычно предпочтительно степень идентичности последовательности с последовательностью заданного целевого гена должна быть значительной, а именно составлять примерно 95%, примерно 90%, примерно 85% или примерно 80%. Специалист в данной области техники сможет понять всю важность с учётом скрининга на области, предсказанные как области, более высокоспецифические к первой целевой последовательности, или предсказанные как области, которые не образуют нежелательные полипептиды,связанную с важностью других критериев, таких как, но без ограничения, процент идентичности последовательности с за- 27 данной первой целевой последовательностью, или предсказанная эффективность данной последовательности в сайленсинге гена. Например, может быть целесообразно, чтобы данная регуляторная РНК, которая включает двухнитевую РНК, для сайленсинга гена была активна в нескольких видах, и тогда специалист в данной области техники может определить, что важнее включить в регуляторную РНК области, специфические для нескольких представляющих интерес видов, и менее важно проводить скрининг на области, предсказанные как области с более высокой эффективностью сайленсинга гена, или на области, предсказанные как области, генерирующие нежелательные полипептиды. Во многих вариантах изобретения клетка трансгенного растения содержит в своём геноме рекомби-нантную ДНК, включающую транскрибируемую ДНК, в том числе (а) ДНК, с которой считывается РНК-аптамер, способный связываться с лигандом, и (б) ДНК, с которой считывается регуляторная РНК, способная регулировать экспрессию целевой последовательности, причём регуляция зависит от конформа-ции регуляторной РНК, а на конформацию указанной регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания указанного РНК-аптамера. В этих вариантах изобретения приводит в результате к специфическому изменению экспрессии целевой последовательности, которое может выражаться в повышении или понижении экспрессии, в зависимости от дизайна рекомбинантной ДНК. В одном варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к повышению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания. В другом варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к снижению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания. Некоторые варианты изобретения характеризуются "аутоиндуцибельностью" ("самоиндуцируемо-стью"). В одном таком варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к повышению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания, при этом повышение экспрессии влечёт за собой уровень лиганда, достаточный для сохранения повышения экспрессии. В другом варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к понижению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания, при этом понижение экспрессии влечёт за собой уровень лиганда, достаточный для сохранения понижения экспрессии. Таким образом, другим аспектом изобретения является способ модификации экспрессии представляющего интерес гена в растительной клетке, включающий транскрибирование в клетке трансгенного растения по изобретению, или в растении, или растении потомственного поколения, или семени, или другой растительной ткани, полученных из такой клетки трансгенного растения, рекомбинантной или гетерологичной ДНК, которая считывается в (а) РНК-аптамер, способный связываться с лигандом, и (б) регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию целевой последовательности, при этом регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию указанной регуляторной РНК алло-стерически влияет состояние связывания указанного РНК-аптамера, а экспрессия представляющего интерес гена модифицируется по сравнению с экспрессией в отсутствие транскрипции конструкции реком-бинантной ДНК. Интроны. Термины "интрон" или "интронная последовательность" по данному описанию обычно обозначают некодирующую ДНК- последовательность природного гена, которая в конструкциях реком-бинантной ДНК по данному изобретению сохраняет свою нативную (естественную) способность подвергаться эксцизии (вырезаться) из пре-мРНК-транскриптов, например нативные интронные последовательности, ассоциированные с РНК-областями, кодирующими белки, причём нативные интроны подвергаются сплайсингу, способствуя тому, что экзоны собираются в зрелые мРНК до того, как РНК покинет ядро. Такой вырезаемый (подлежащий удалению, эксцизии) интрон имеет 5' сайт сплайсинга и 3' сайт сплайсинга. Интроны могут самосплайсирующиеся и несамосплайсирующиеся (т.е. требующие для сплайсинга ферменты или сплайсосомы) и могут подвергаться селекции на различную эффективность сплайсинга. Интроны, пригодные для применения в конструкциях по изобретению, могут представлять собой вирусные интроны (например, Yamada et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22: 2532-2537), эукариотические интроны (включая интроны животных, грибов и растительные интроны), архебактериальные или бактериальные интроны (например, Belfort et al. (1995) J. Bacteriol, 177: 3897-3903) или любые природные или искусственные (см., например, Yoshimatsu and Nagawa (1989) Science, 244: 1346-1348) последовательности ДНК с интроноподобной функциональностью в растении, в котором должна считываться конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению. Хотя в практике применения данного изобретения в качестве хозяина для включённой ДНК может использоваться практически любой интрон, особенно предпочтительными являются интроны, повышающие экспрессию в растении, или интроны, образованные из 5' нетранслируемой лидерной последовательности. Если конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению применяется для трансформации растения, особенно предпочтительными могут быть интроны из растительных источников. Примеры особенно предпочтительных растительных интронов включают интрон актина 1 риса (I-Os-Act1) (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol., 12: 3399- 3406; McElroy et al. (1990) Plant. Cell., 2: 163-171), интрон белка теплового шока кукурузы (I-Zm-hsp70) (U.S. Patents 5593874 and 5859347) и интрон алкогольдегидрогеназы кукурузы (I-Zm- adh1) (Callis et al. (1987) Genes Dev., 1: 1183-1200). Другие примеры интронов, пригод ных для применения в изобретении, включают 5' лидерную последовательность, или "омега" лидер вируса табачной мозаики (Gallie and Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20: 4631-4638), интрон Shrunken-1 (Sh-1) (Vasil et al. (1989) Plant Physiol, 91: 1575-1579), интрон сахарозосинтазы кукурузы (Clancy and Hannah (2002) Plant Physiol, 130: 918-929), интрон белка теплового шока 18 (hspl8) intron (Silva et al. (1987) J. Cell. Biol., 105: 245) и интрон белка теплового шока протяжённостью 82 кДа (hsp82) (Semrau et al. (1989) J. Cell. Biol., 109, p. 39A, и Mettler et al. (May 1990) N.A.T.O. Advanced Studies Institute on Molecular Biology, Elmer, Bavaria). Элементы экспрессии генов. Конструкции рекомбинантной ДНК могут дополнительно включать элемент экспрессии генов. Любой ген или любые гены, представляющий(ие) интерес, может(могут) экс-прессироваться при использовании элемента экспрессии генов, включающего кодирующую или некоди-рующую последовательность или и ту, и другую, и включать природные последовательности или искусственные или химерные последовательности или и те, и другие. Если элемент экспрессии генов кодирует белок, такие конструкции предпочтительно включают функциональный терминаторный элемент для содействия транскрипции и трансляции элемента экспрессии генов. В вариантах, включающих индуци-бельно стерильные трансгенные растения, элемент экспрессии генов может включать или может дополнять матричную РНК, кодирующую белок толерантности к гербициду. В вариантах изобретения, в которых конструкция рекомбинантной ДНК содержит интрон, конструкция может дополнительно включать элемент экспрессии генов для экспрессии по меньшей мере одного гена, представляющего интерес, причём элемент экспрессии генов прилегает к интрону. В других вариантах изобретения конструкция рекомбинантной ДНК включает интрон, в который встроен элемент супрессии гена и элемент экспрессии генов для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес гена, причём элемент экспрессии генов также расположен внутри интрона; в таких случаях элемент экспрессии генов может быть функционально связан с функциональным терминаторным элементом, который сам по себе также находится внутри интрона. Представляющий интерес ген, который предстоит экспрессировать с помощью элемента экспрессии генов, может включать по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из эукариотического целевого гена, неэукариотического целевого гена и ДНК последовательности предшественника микро-РНК. Представляющий интерес ген может включать единичный ген или множество генов (таких как множество копий единичного гена, множество аллелей единичного гена или множество генов, включающих гены различных видов). В одном варианте изобретения элемент экспрессии генов может включать пептидные последовательности, способные к аутогидролизу, например последовательности, расположенные между множественными последовательностями (дубликатами), кодирующими один или более полипептидов (см., например, 2А и "2А-подобные" саморасщепляющиеся последовательности различных видов, включая вирусы, трипаносомы и бактерии, раскрываемые Donnely et at. (2001), J. Gen. Virol., 82: 1027-1041). В другом варианте изобретения элемент экспрессии генов может включать рибосомные "skip" (пропуск) последовательности, например, расположенные между множеством последовательностей, кодирующих один или более полипептидов (см., например, рибосомные "skip" последовательности афтовируса ящура (FMDV) 2A, раскрываемые Donnely et al. (2001), 7. Gen. Virol., 82: 1013-1025). Представляющий интерес ген может включать любую кодирующую или некодирующую последовательность из любого вида (включая, но без ограничения, неэукариотов, таких как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек. Неограничивающие примеры некодирующей последовательности, которую надо экспрессировать при использовании элемента экспрессии генов, включают, но без ограничения, 5' нетранслируемые области, промоторы, энхансеры или другие некодирующие транскрипционные области, 3' нетранслируемые области, терминаторы, интроны, микро-РНК, ДНК последовательности предшественника микро-РНК, малые интерферирующие РНК, РНК компоненты рибосом или рибозимов, малые ядерные РНК и другие некодирующие РНК. Неограничивающие примеры представляющего интерес гена дополнительно включают, но без ограничения, транслируемую (кодирующую) последовательность, например гены, кодирующие факторы транскрипции, и гены, кодирующие ферменты, участвующие в биосинтезе или катаболизме соединений, представляющих интерес (таких как аминокислоты, жирные кислоты и другие липиды, сахара и другие углеводы, биологические полимеры, и вторичные метаболиты, включая алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, нерибосомные пептиды, и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения). Представляющий интерес ген может являться геном, нативным для растения, в котором надо транскрибировать конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, или может являться ненативным геном. Представляющий интерес ген может представлять собой маркерный ген, например селективный маркерный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам, грибам или гербицидам, или маркерный ген, кодирующий легкодетектируемый признак (например, фитоинсинтаза или другие гены, сообщающие конкретный пигмент растению), или ген, кодирующий детектируемую молекулу, такую как флуоресцентный белок, люцифераза, или уникальную полипептидную или нуклеотидную метку ("тег", хвост), детектируемый методами обнаружения белков или нуклеотидов соответственно). Селективные маркеры являются представляющими интерес генами с конкретной полезностью при идентификации успешного процессирования конструкции по изобретению. В некоторых вариантах изобретения создают такие конструкции рекомбинантной ДНК, чтобы они подавляли по меньшей мере один эндогенный или экзогенный ген и чтобы одновременно экспрессирова-ли по меньшей мере один экзогенный ген. В одном неограничивающем примере конструкция рекомби-нантной ДНК включает элемент супрессии генов для супрессии эндогенного гена (кукурузы) лизин-кетоглутарат редуктазы/сахаропин-дегидрогеназы (LKR/SDH), элемент экспрессии генов для экзогенного (бактериального) белка синтазы дигидропиколиновой кислоты и ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения, и (б) матричную РНК, кодирующую epsps-CP4, причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию epsps-CP4 в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется путём нанесения глифосата на растение. Такая конструкция особенно пригодна для получения кукурузы с повышенными уровнями лизина и общей толерантностью к глифосату, причём стерильность кукурузы индуцируется нанесением глифосата в подходящий(ие) период(ы) развития. В другом неограничивающем примере конструкция рекомбинантной ДНК включает элемент супрессии гена для супрессии гена западного кукурузного жука и ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения, и (б) матричную РНК, кодирующую epsps-CP4, причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию epsps-CP4 в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется путём нанесения глифосата на растение. Такая конструкция особенно пригодна для получения кукурузы с устойчивостью к западному кукурузному жуку и общей толерантностью к глифосату, причём стерильность кукурузы индуцируется нанесением глифосата в подходящий(ие) период(ы) развития. Т-ДНК границы. Т-ДНК границы относятся к ДНК последовательностям или областям ДНК, которые определяют начало и конец Agrobacterium Т-ДНК (ДНК опухоли) и действует в цис, перенося Т-ДНК в геном растения с помощью опосредуемой Agrobacterium трансформации (см., например, Hooykaas and Schilperoort (1992) Plant Mol. Biol., 19: 15-38). Различные варианты изобретения включают конструкцию рекомбинантной ДНК без Т-ДНК границ, с единственной Т-ДНК границей или более чем с одной Т-ДНК границей. Например, в вариантах изобретения, где конструкция рекомбинантной ДНК включает интрон, в который включён элемент супрессии генов, интрон предпочтительно локализован между парой Т-ДНК границ, которые могут представлять собой набор левой и правой Т-ДНК границ, набор двух левых Т-ДНК границ или набор двух правых Т-ДНК границ. В другом варианте изобретения конструкция рекомбинантной ДНК включает единственную Т-ДНК границу, заключённый в интрон элемент супрессии генов и по меньшей мере один элемент супрессии гена. Терминаторы. Многие варианты изобретения, в частности те, в которых конструкция рекомбинант-ной ДНК создана таким образом, чтобы транскрибировать матричную РНК, включают как промоторный элемент, так и функциональный терминаторный элемент, который содержит функциональный сигнал полиаденилирования и сайт полиаденилирования, что позволяет РНК, транскрибируемой с конструкции рекомбинантной ДНК, становиться полиаденилированной и процессироваться для транспорта в цитоплазму. В общих вариантах изобретения, описанных под заголовком "Конструкции рекомбинантной ДНК, включающие сайты узнавания микро-РНК", функциональный терминаторный элемент может присутствовать или отсутствовать. В вариантах изобретения, в которых функциональный терминаторный элемент отсутствует, по меньшей мере, отсутствует либо функциональный сигнал полиаденилирования, либо функциональный сайт полиаденилирования. В других вариантах изобретения отсутствует 3' нетрансли-руемая область. В этих случаях конструкция рекомбинантной ДНК считывается в виде неполиаденили-рованной РНК и предпочтительно не переносится (не транспортируется) в цитоплазму. Спейсерная ДНК. Сегменты спейсерной ДНК теоретически могут включать любую ДНК (такую, но без ограничения, как транслируемую ДНК последовательность, кодирующую представляющий интерес ген, транслируемую ДНК последовательность, кодирующую маркерный или репортёрный ген; транскрибируемую ДНК из интрона, который в процессе транскрипции может вырезаться из образующейся в результате транскрибирующейся РНК; транскрибируемую ДНК последовательность, кодирующую РНК, которая образует структуру, такую как петля или стебель, или аптамер, способный связываться со специфическим лигандом; сплайсируемую ДНК, такую как интроны и самосплайсирующиеся рибозимы; транскрибируемую ДНК, кодирующую последовательность для детекции гибридизации, амплификации или секвенирования нуклеотидов; и их комбинацию). Спейсерная ДНК может, например, прилегать к элементу экспрессии генов, может находиться между участками элемента экспрессии генов или между различными элементами экспрессии генов. В некоторых вариантах изобретения сама спейсерная ДНК представляет собой смысловую или антисмысловую последовательность целевого гена. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения РНК, транскрибируемая со спейсерной ДНК (например, большая петля антисмысловой последовательности целевого гена или аптамер) предполагает вторичную структуру или трёхмерную конфигурацию, которая придаёт транскрипту заданный признак, такой как повышенная стабильность, повышенный период полужизни in vivo, или клеточную или тканевую специфичность. Получение и применение конструкций рекомбинантной ДНК. Конструкции рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению можно получать любым методом, подходящим для предполагаемого применения, с учётом, например, требуемой экспрессии и пригодности для применения в растении, в которое конструкция должна быть транскрибирована. Общие методы получения и применения конструкций ДНК и векторов общеизвестны в уровне техники и подробно описаны, например, в справочниках и в руководствах по лабораторному практикуму, включая Sambrook and Russel, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (third edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001. Пример подходящего метода построения конструкций ДНК и векторов для трансформации раскрывается в опубликованной патентной заявке США 2004/0115642 А1. Конструкции ДНК можно также создавать ("строить") методом GATEWAY(tm) клонирования (от Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), в котором используется сайт-специфическая реакция клонирования рекомбиназы LR системы Интеграза/att векторной конструкции бактериофага лямбда вместо рестриктаз и лигаз. Реакция LR клонирования раскрывается в Патентах США 5888732 и 6277608 и в опубликованных патентных заявках 2001/283529, 2001/282319 и 2002/0007051. В инструкции по технологии GATEWAY(tm) клонирования, которая также поставляется Invitrogen, даются чёткие указания по стандартному клонированию любой заданной ДНК в вектор, содержащий функциональные элементы экспрессии в растительных тканях. В другом альтернативном способе сборки вектора используется лиганд-независимое клонирование, раскрываемое Aslandis et al. (1990) Nucleic Acids Res., 18: 6069- 6074 и Rashtchian et al. (1992) Biochem., 206: 91-97, при котором фрагмент ДНК с однонитевыми 5' и 3' концами лигируют в заданный вектор, который затем можно амплифициро-вать in vivo. В некоторых вариантах изобретения последовательность ДНК конструкции рекомбинантной ДНК включает последовательность, которая оптимизирована по кодону для растения, в котором должна экс-прессироваться конструкция рекомбинантной ДНК. Например, конструкция рекомбинантной ДНК, которая должна экспрессироваться в растении, может иметь всю её последовательность или участки последовательности (например, первый элемент супрессии гена или элемент экспрессии генов), оптимизирован-ную(ой) по кодону для экспрессии в растении методами, известными в уровне техники. См., например, в патенте США 5500365 описание оптимизации по кодону для растений; см. также De Amicis and Marchetti (2000) Nucleic Acid Res., 28: 3339-3346. Трансгенные растительные клетки и трансгенные растения Дополнительный аспект данного изобретения предусматривает трансгенную растительную клетку, имеющую в своём геноме любые конструкции рекомбинантной ДНК, обеспечиваемые данным изобретением. Кроме того, предусматривается трансгенное растение, содержащее трансгенную растительную клетку по данному изобретению. Трансгенное растение по изобретению включает растения на любой стадии развития и включает регенерированное растение, полученное из трансгенных растительных клеток, заявляемых в данном описании, или растение потомственного поколения (которое может быть потомственным растением инбредной или гибридной линии) регенерированного растения, или семена такого трансгенного растения. Также предусматриваются и заявляются трансгенные семена, имеющие в своём геноме любую из конструкций рекомбинантной ДНК, предоставляемых данным изобретением. Один вариант изобретения включает трансгенное растение, имеющее в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрес-сируется в репродуктивной ткани растения (т.е. растения, полученного из трансгенной растительной клетки); и (б) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду, причём зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения, полученного из трансгенной растительной клетки, индуцируется путём нанесения глифосата на растение. Трансгенная растительная клетка может быть выделенной растительной клеткой (например, отдельные растительные клетки или клетки, выращенные в или на искусственной культуральной среде), или может быть растительной клеткой в недифференцированной ткани (например, каллюс или любое скопление (агрегация) растительных клеток). Трансгенная растительная клетка может быть растительной клеткой по меньшей мере в одной дифференцированной ткани, выбранной из группы, состоящей из листа (например, черешок и пластинка), корня, стебля (например, клубень, корневище, столон, луковица и клубнелуковица), ножки (например, ксилема, флоэма), дерева, семени, плода (например, орех, зерно, сочный плод) и цветка (например, тычинка, тычиночная нить, пыльник, пыльца, плодолистик, пестик, завязь, семяпочка). Трансгенная растительная клетка или трансгенное растение по изобретению может быть любой подходящей представляющей интерес растительной клеткой или любым подходящим представляющим интерес растением. Данное изобретение охватывает как транзиторно трансформированные, так и ста бильно трансформированные растительные клетки. Стабильно трансформированные трансгенные клетки являются особенно предпочтительными. Во многих предпочтительных вариантах изобретения трансгенное растение представляет собой фертильное (плодоносящее) трансгенное растение, семена которого можно собирать, и данное изобретение заявляет далее трансгенные семена таких трансгенных растений, причём семена предпочтительно также содержат рекомбинантную конструкцию по данному изобретению. Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений Если конструкцию рекомбинантной ДНК используют для получения трансгенной растительной клетки, трансгенного растения или трансгенных семян по данному изобретению, трансформация может включать любые общеизвестные и обоснованные методы и композиции. Методы, подходящие для трансформации растений, включают фактически любой метод и метод, которым ДНК можно ввести в клетку, таким как прямая (непосредственная доставка) ДНК (например, ПЭГ-опосредованной трансформацией протопластов, электропорацией, встряхиванием с нитями карбида кремния и акселерацией покрытых ДНК частиц), трансформация, опосредованная агробактериями (Agrobacterium), с помощью вирусных и других векторов и т.д. Одним из ггоедпочтительных методов трансформации растений является бомбардировка микрочастицами, например, как проиллюстрировано в патентах США 5015580 (соя), 5550318 (кукуруза), 5538880 (кукуруза), 6153812 (пшеница), 6160208 (кукуруза), 6288312 (рис) и 6399861 (кукуруза) и 6403865 (кукуруза). Другим предпочтительным способом трансформации растений является трансформация, опосредованная Agrobacterium (агробактерией). В одном предпочтительном варианте изобретения трансгенную растительную клетку по изобретению получают трансформацией с помощью Agrobacterium, содержащей бинарную Ti плазмидную систему, причём Agrobacterium несёт первую Ti плазмиду и вторую, химерную плазмиду, содержащую по меньшей мере одну Т-ДНК границу дикого типа Ti плазмиды, промотор, функциональный в трансформируемой растительной клетке и функционально связанный с конструкцией супрессии гена по изобретению. См., например, бинарную систему, описанную в патенте США 5159135. См. также De Framond (1983) Biotechnology 1: 262-269; и Hoekema et al., (1983) Nature, 303: 179. В такой бинарной системе меньшую плазмиду, содержащую Т- ДНК границу или границы, удобно конструировать и манипулировать в подходящем альтернативном хозяине, таком как Е. coli, а затем перенести в Ag-robacterium. Методы опосредованной Agrobacterium трансформации растений, в особенности сельскохозяйственных растений, включают, например методы, раскрываемые в патентах США 5004863, 5159135 и 5518908 (хлопок); 5416011, 5569834, 5824877 и 6384301 (соя); 5591616 (кукуруза); 5981840 (кукуруза); 5463174 (китайская капуста). Аналогичные методы сообщались для многих видов растений как двудольных, так и однодольных, включая, среди прочих, арахис (Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep., 15: 653); спаржу (Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 84: 5345); ячмень (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol, 104: 37); рис (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology, 6: 10; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep., 7: 379; пшеницу (Vasil et al. (1992) Bio/Technology, 10: 667; Becker et al. (1994) Plant J., 5: 299), люцерну (Masoud et al. (1996) Transgen. Res., 5: 313); и томаты (Sun et al. (2006) Plant Cell Physiol, 47: 426-431). См. также в опубликованной патентной заявке 2003/0167537 А1 описание векторов, способов трансформации и получение тросформированных растений Arabidopsis thaliana, где факторы транскрипции конститутивно экспрессируются промотором CaMV35S. Трансгенные растительные клетки и трансгенные растения можно также получать трансформацией другими векторами, такими, но без ограничения, как вирусные векторы (например, потивирус гравировки табака (TEV), вирус полосатой мозаики ячменя (BSMV), и вирусы, цитируемые в монографии Edwardson and Christie, "The Potyvirus Group: Monograph No. 16,1991, Agric. Exp. Station, Univ. of Florida), плазмиды, космиды, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), ВАС (бактериальные искусственные хромосомы) или любой другой подходящий клонирующий вектор, которые применяют с соответствующим протоколом трансформации, например, бактериальной инфекцией (например, с Agrobacterium, как описано выше), бинарньми бактериальными искусственными хромосомными конструкциями, прямой доставкой ДНК (например, ПЭГ-опосредованная трансформация, абсорбция ДНК, опосредуемая осушением/ингибированием, электропорация, встряхивание с нитями карбида кремния и бомбардировка микрочастицами). Специалист в данной области техники поймёт, что для получения устойчивых трансгенных растений из любых видов растений, представляющих интерес, можно применять и модифицировать различные методологии трансформации. Методы трансформации для получения трансгенных растительных клеток и трансгенных растений, содержащих стабильно интегрированную рекомбинантную ДНК, на практике предпочтительно применяют в тканевой культуре на средах и в контролируемых условиях. Термин "среды" относится к различным питательным смесям, которые используют для выращивания клеток in vitro, т.е. вне интактного живого организма. Реципиентные клетки-мишени включают, но без ограничения, клетки меристемы, кал-люс, незрелые клетки эмбриона или части эмбриона и гаметические клетки, такие как клетки микроспор, пыльцы, спермы и яйцеклетки. Любая клетка из которой можно регенерировать фертильное растение, рассматривается как реципиентная клетка, применимая в практике изобретения. Каллюс можно "инициировать" из различных тканевых источников, включая, но без ограничения, культивирование верху шечных меристем, микроспор и т.п. Клетки, способные к пролиферации в виде каллюса, могут служить в качестве реципиентных клеток для генетической трансформации. Практические методы трансформации и материалы для получения трансгенных растений по данному изобретению (например, различные среды и реципиентные клетки- мишени, трансформация незрелых эмбрионов и последующая регенерация фер-тильных трансгенных растений) раскрываются, например, в патентах США 6194636 и 6232526 и в опубликованной патентной заявке США 2004/0216189. В обычной практике трансформации ДНК вводят только в очень малый процент клеток-мишеней в любом эксперименте по трансформации. Маркерные гены обычно применяют для создания эффективной системы идентификации таких клеток, которые стабильно трансформируются, получая и интегрируя в свои геномы трансгенную ДНК-конструкцию. Предпочтительные маркерные гены обеспечивают селективные маркеры, которые придают резистентность селективному агенту, такому как антибиотик или гербицид. Любой из антибиотиков или гербицидов, к которому может быть резистентна растительная клетка, может быть полезным агентом для селекции. Потенциально трансформируемые клетки экспонируются с селективным агентом. В популяцию жизнеспособных клеток входят обычно те клетки, в которые придающий резистентность ген интегрируется и в которых он экспрессируется на уровне, достаточном для того, чтобы способствовать жизнеспособность клеток. Клетки можно дополнительно проверять, чтобы подтвердить стабильную интеграцию рекомбинантной ДНК. Широко используемые селективные маркерные гены включают такие гены, придающие резистентность к антибиотикам, таким как канами-цин или парамомицин (nptII), гигромицин В (aph IV) и гентамицин (аас3 и аасС4), или резистентность к гербицидам, таким как глюфосинат (EPSPS). Примеры применимых селективных маркерных генов и агентов селекции приводятся в патентах США 5550318, 5633435, 5780708 и 6118047. Можно также использовать просеиваемые (подвергаемые скринингу) маркерные или репортёрные гены, которые придают способность визуально идентифицировать трансформанты. Неограничивающие примеры применимых "просеиваемых" маркеров включают, например, ген, экспрессирующий белок, который придаёт обнаруживаемый цвет, действуя на хромогенный субстрат (например, р-глюкуронидаза (GUS) (uidA) или люцифераза (luc)), или которые можно обнаружить сами по себе, такие как зелёный флуоресцентный белок (GFP) (gfp) или иммуногенная молекула. Специалисты в данной области техники понимают, что многие другие полезные маркеры или репортёры пригодны для применения. Обнаружение или измерение результирующего изменения экспрессии целевого гена (или конкурентной экспрессии представляющего интерес гена), полученного путём транскрипции рекомбинантной конструкции в трансгенном растении по изобретению, можно проводить любьми подходящими методами, включая методы обнаружения белков (например, Вестерн-блот, ELISA и другие иммунохимические методы), измерение ферментативной активности или методы обнаружения нуклеотидов (например, Сау-зерн-блот гибридизация, Нозерн-блот гибридизация, ПЦР гибридизация, RT-ПЦР гибридизация, флуоресцентная in situ гибридизация). Такие методы общеизвестны рядовому специалисту в данной области техники, о чём свидетельствуют многочисленные доступные справочники; см., например, Joseph Sam-brook and David W. Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (third edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001; Frederick M. Ausubel et al. (editors) "Short Protocols in Molecular Biology" (fifth edition), John Wiley and Sons, 2002; John M. Walker (editor) "Protein Protocols Handbook" (second edition), Humana Press, 2002; и Leandro Pena (editor) "Transgenic Plants: Methods and Protocols", Humana Press, 2004. Другие подходящие методы обнаружения (детекции) и измерения результирующего изменения экспрессии целевого гена (или конкурентной экспрессии представляющего интерес гена), полученного путём транскрипции рекомбинантной ДНК в трансгенном растении по изобретению, включают измерение (определение) любого другого признака, который является прямым или косвенным показателем экспрессии целевого гена (или конкурентной экспрессии представляющего интерес гена) в трансгенном растении, в котором транскрибируется рекомбинантная ДНК, по сравнению с трансгенным растением, в котором рекомбинантная ДНК не транскрибируется, например, ощутимые или микроскопические морфологические признаки, скорости роста, выход, темпы размножения и восполняемость, устойчивость к вредителям или патогенам, или устойчивость к биотическому или абиотическому стрессу (например, к воздействию засухи, к солевому стрессу, недостатку питательных веществ, тепловому или холодовому стрессу). В таких методах могут применяться непосредственные измерения фенотипического признака или косвенные анализы (например, в растениях, эти анализы включают анализы частей растения, такие как анализы листа или корня с целью определения толерантности к абиотическому стрессу). Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению можно объединять с другой рекомбинантной ДНК для того, чтобы придать дополнительные признаки (например, в случае трансформированных растений признаки, включающие устойчивость к гербициду, устойчивость к вредителям, толерантность к прорастанию на холоде, толерантность к засухе и т.п.), например, экспрессируя или супрессируя другие гены. Конструкции для согласованного понижения или повышения экспрессии генов раскрываются в опубликованной патентной заявке США 2004/0126845 A1. Семена трансгенных фертильных растений можно собирать и использовать для выращивания поколений следующих генераций, включая гибридные генерации, трансгенных растений по данному изобретению, которые содержат конструкцию рекомбинантной ДНК в своём геноме. Так, помимо прямой (не посредственной) трансформации растения при использовании конструкции рекомбинантной ДНК, трансгенные растения по изобретению можно получать скрещиванием первого растения, имеющего рекомби-нантную ДНК, со вторым растением, не содержащим этой конструкции. Например, рекомбинантную ДНК можно вводить в растение линии, которая восприимчива к трансформации, для получения трансгенного растения, которое можно скрещивать с растением второй линии для того, чтобы осуществить интрогрессию рекомбинантной ДНК в получающееся в результате потомство. Трансгенное растение по изобретению с одной рекомбинантной ДНК (влияющей на изменение экспрессии целевого гена) можно скрещивать с линией растения, имеющей другую рекомбинантную ДНК, придающую один или более дополнительных признаков (таких, но без ограничения, как устойчивость к гербициду, устойчивость к вредителю или болезни, устойчивость к "экологическому стрессу", модифицированное содержание питательных веществ и улучшение выхода), с целью получения потомства растения, имеющего рекомби-нантную ДНК, которая сообщает как заданное поведение при экспрессии целевой последовательности, так и дополнительный(ые) признак(и). Обычно при такой селекции с объединением признаков трансгенное растение, являющееся "донором" дополнительного признака, представляет собой мужскую линию, а трансгенное растение, несущее основные признаки, представляет собой женскую линию. Потомство, полученное в результате такого скрещивания, разделяется таким образом, что некоторые растения несут ДНК обоих родительских признаков, а некоторые несут ДНК одного родительского признака; такие растения можно идентифицировать с помощью маркеров, ассоциированных с родительской рекомбинантной ДНК. Растения-потомки, несущие ДНК обоих родительских признаков, можно снова многократно скрещиваться с женской родительской линией, например обычно 6-8 генераций, давая растение-потомка практически с тем же генотипом, что и одна начальная трансгенная родительская линия, но с рекомбинантной ДНК другой трансгенной родительской линии. Ещё один аспект изобретения представляет собой трансгенное растение, выращенное из трансгенного семени по изобретению. Данное изобретение рассматривает трансгенные растения, выращенные непосредственно из трансгенного семени, содержащего рекомбинантную ДНК, так же как поколения генераций растений, включая инбредную и гибридную линии растений, полученные скрещиванием трансгенного растения, выращенного непосредственно из трансгенного семени, со вторым растением, не выращенным из того трансгенного семени. Скрещивание может включать, например, следующие стадии: (а) засевают семена первого родительского растения (например, нетрансгенного или трансгенного) и второго родительского растения, трансгенного по изобретению; (б) выращивают семена первого и второго родительских растений, получая растения, которые яв- ляются цветоносными; (в) опыляют цветок первого родителя пыльцой второго родителя и (г) собирают семена родительского растения, несущего опылённый цветок. Часто бывает нужна интрогрессия рекомбинантной ДНК в элитные сорта, например, обратным скрещиванием, для переноса конкретного желательного признака из одного источника инбредному или другому растению, у которого отсутствует этот признак. Это можно осуществлять, например, сначала скрещивая старшее инбредное растение ("А") (рекуррентный родитель) с донорным инбредным растением ("В"), которое несёт подходящий(е) ген(ы) данного признака, например конструкцию, полученную по данному изобретению. Проводят селекцию потомства от этого скрещивания, сначала проверяя, чтобы в полученном потомстве заданный признак был перенесён от нерекуррентного родителя "В", а затем отобранное потомство снова скрещивают со старшим рекуррентным родителем "А". Через пять или более поколений обратного скрещивания с селекцией заданного признака потомки являются гемизиготными по локусам, регулирующим перенос признака, но подобными старшему родителю по большинству генов или почти по всем остальным генам. Последнее поколение обратного скрещивания подвергают самоопылению с целью получить потомство, которое представляет собой "чистопородную селекцию" по пе-ренесённому(ым) гену(генам), т.е. одному или более трансформационных событий. С помощью ряда селекционных манипуляций отобранную ДНК конструкцию можно переместить из одной линии в совершенно другую линию без необходимости в дальнейших рекомбинаций. Таким образом, можно получить инбредные растения, которые являются действительной селекцией по одной или более ДНК конструкций. Скрещивая различные инбредные растения, можно получать большое количество различных гибридов с различными комбинациями ДНК конструкций. Таким образом, можно получать растения, которые обладают заданными агротехническими свойствами, часто ассоциирующимися с гибридами (гетерозис, "гибридная сила"), а также с желательными (заданными) характеристиками, придаваемыми одной или более ДНК конструкций. Для того чтобы способствовать интрогрессии одной или более ДНК конструкций по изобретению из одного генетического фона в другой, можно использовать генетические маркеры. Маркерная селекция имеет преимущества перед обычным разведением, так как её можно применять, чтобы избежать ошибок, вызванных фенотипической изменчивостью. Кроме того, генетические маркеры могут предоставить данные об относительной доле элитной зародышевой плазмы в отдельном потомке конкретного скрещива ния. Например, когда растение с заданным признаком, которое в остальном не имеет агротехнически привлекательного генетического фона, скрещивают с элитным партнёром, можно использовать генетические маркеры для селекции потомства, которое не только обладает представляющим интерес признаком, но также содержит относительно большую долю заданной зародышевой плазмы. Таким образом, число генераций, требующееся для интрогрессии одного или более признаков в конкретный генетический фон, сводится к минимуму. Полезность маркерной селекции при разведении трансгенных растений по настоящему изобретению, а также типы полезных молекулярных маркеров, такие, но без ограничения, как SSR и SNP, обсуждаются в опубликованной патентной заявке WO 02/062129 и в опубликованных патентных заявках США 2002/0133852, 2003/0049612 и 2003/0005491. В некоторых трансгенных растительных клетках по изобретению может быть целесообразно параллельно экспрессировать (или подавлять) представляющий интерес ген, в то же время регулируя экспрессию целевого гена. Так, в некоторых вариантах изобретения трансгенное растение содержит рекомби-нантную ДНК, дополнительно включающую элемент экспрессии (или супрессии) генов для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес гена, а на регуляцию экспрессии целевого гена предпочтительно влияет одновременная экспрессия (или супрессия) по меньшей мере одного представляющего интерес гена в трансгенном растении. Таким образом, как представлено в данном описании, трансгенные растительные клетки или трансгенные растения по данному изобретению можно получать любым из подходящих методов транзиторной или стабильной или неинтегративной трансформации, известных в уровне техники или раскрываемых в данном описании. Конструкции рекомбинантной ДНК можно транскрибировать в любой растительной клетке или ткани или в целом растении на любой стадии развития. Трансгенные растения можно получать из любого однодольного или двудольного растения, такого, но без ограничения, как растения, представляющие промышленный или сельскохозяйственный интерес, такие как сельскохозяйственные растения (в особенности сельскохозяйственные растения, пригодные дли пищи человека или животных), деревья, дающие древесину или целлюлозу, овощные растения, фруктовые растения и декоративные растения. Неограничивающие примеры представляющих интерес растений включают зерновые сельскохозяйственные растения (такие как пшеница, овёс, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, кви-ноя, ширица, гречиха); кормовые злаки (такие как кормовые травы и кормовые двудольные, включая люцерну, вику, клевер и т.п.); масленичные растения (такие как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, ка-нола, рапс, лён, арахис и масленичная пальма);орехи (такие как грецкий орех, кэшью, лещина, пекан, миндаль и т.п.); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, маслины, сахарную свёклу, чай и кофейное дерево; деревья, дающие древесину и целлюлозу; овощные сельскохозяйственные культуры, такие как бобовые (например, бобы, горох, чечевица, люцерна, арахис), латук, спаржу (аспарагус), артишок, сельдерей, морковь, хрен, капусту (например капусту огородную, капусту кормовую, горчицу, и другую листовую капусту, брокколи, цветную капусту, брюссельскую капусту, турнепс, кольраби), съедобные виды семейства тыквенных (например, огурцы, дыни, тыкву обыкновенную, тыкву зимнюю), съедобный луковые растения (например, лук, чеснок, лук- порей, лук- шалот, шнитт- лук), съедобные представители семейства паслёновых (например, томаты, баклажаны, картофель, перец, физалис) и съедобные представители семейства маревых (например, свёкла, мангольд, шпинат, квиноя, ширица (амарант)); фруктовые сельскохозяйственные культуры, такие как яблони, груши, цитрусовые (например, апельсины, лайм, лимон, грейпфрут и др.), косточковые плодовые деревья (например, абрикос, персик, слива, нектарин), бананы, ананас, виноград, киви, папайя, авокадо и ягоды; и декоративные растения, включая декоративные цветущие растения, декоративные деревья и кустарники, декоративные дернообразующие растения и декоративные травы. Предпочтительные двудольные включают, но без ограничения, канолу, хлопок, картофель, квиною, ширицу, гречиху, сафлор, сою, сахарную свёклу и подсолнечник, более предпочтительными являются соя, канола и хлопок. Предпочтительные однодольные включают, но без ограничения, пшеницу, овёс, ячмень, кукурузу, рожь, тритикале, рис, декоративные и кормовые травы, сорго, просо и сахарный тростник, более предпочтительно, кукурузу, пшеницу и рис. Конечной задачей трансформации растений является получение растений, полезных для человека. В связи с этим трансгенные растения по изобретению можно применять теоретически для любых целей, важных для садовода или потребителя. Например, можно собирать само трансгенное растение, или собирать трансгенные семена трансгенного растения с целью посадить их, или можно получать продукты из трансгенного растения или его семян, такие как масло, крахмал, этанол или другие продукты брожения, корм животным или продукты питания человека, фармацевтические вещества и различные промышленные продукты. Например, кукурузу широко используют в пищевой промышленности и для получения кормов, а также в технических целях. Более подробное обсуждение применения кукурузы можно найти, например, в патентах США №№ 6194636, 6207879, 6232526, 6426446, 6429357, 6433252, 6437217 и 6583338 и в опубликованных патентных заявках РСТ WO 95/06128 и WO 02/057471. Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает товарные продукты, получаемые при использовании трансгенной растительной клетки, трансгенного растения или трансгенных семян по настоящему изобретению, включая, но без ограничения, собранные листья, корни, побеги, клубни, стебли, плоды, семена или другие части растения, муку, масла, экстракты, продукты ферментации или расщепления (гидролиза), дроблёное или цельное зерно или семена растения, или любой пищевой или непищевой продукт, включая такие товарные продукты, получаемые при использовании трансгенной растительной клетки, трансгенного растения или трансгенных семян по настоящему изобретению. Обнаружение одной или более нуклеотидных последовательностей конструкций рекомбинантной ДНК по данному изобретению в одном или более товаров или товарных продуктов, рассматриваемых в данном описании, является de facto доказательством того, что товар или товарный продукт содержит трансгенную растительную клетку, трансгенное растение или трансгенные семена по настоящему изобретению или получены при использовании трансгенной растительной клетки, трансгенного растения или трансгенных семян по настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах изобретения трансгенное растение, имеющее в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК по данному изобретению, имеет по меньшей мере один дополнительный изменённый признак по сравнению с растением, в котором отсутствует конструкция рекомбинантной ДНК, этот признак выбран из группы признаков, состоящей из (а) повышенной толерантности к абиотическому стрессу; (б) повышенной толерантности к биотическому стрессу; (в) модифицированного состава первичных метаболитов; (г) модифицированного состава вторичных метаболитов; (д) модифицированного состава микроэлементов, каротиноидов или витаминов; (е) повышенного выхода; (ж) повышенной способности усваивать азот или другие питательные вещества; (з) модифицированных агротехнических характеристик; (и) модифицированных характеристик роста и репродукции и (к) улучшенных характеристик для сбора урожая, хранения и обработки. В особенно предпочтительных вариантах изобретения трансгенное растение характеризуется повышенной толерантностью к абиотическому стрессу (например, толерантностью к недостатку воды или засухе, тепловому, холодовому стрессу, неоптимальным уровням питательных веществ или соли, неоптимальным уровням освещённости) или к биотическому стрессу (например, перенаселению, аллелопатии или скарификации); модифицированным составом первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода); модифицированным составом вторичных метаболитов (например, алкалоидов, терпеноидов, поликетидов, нерибосомных пептидов и вторичных метаболитов смешанного биосинтетического происхождения); модифицированным составом микроэлементов (например, железа, цинка), каротиноидов (например, р-каротина, ликопена, лютеина, зеаксантина или других каротиноидов и ксантофиллов) или витаминов (например, токоферолов); повышенным выходом (например, повышенным выходом в отсутствие стресса или повышенным выходом в условиях биотического или абиотического стресса; повышенной способностью усваивать азот или другие питательные вещества; модифицированными агротехническими характеристиками (например, замедленное созревание; замедленное старение; более ранняя или более поздняя спелость; повышенная толерантность к тени; повышенная устойчивость к полеганию корней и стеблей; повышенная устойчивость к разрыву (green snap) стеблей; модифицированная реакция на световой день); модифицированными характеристиками роста и репродукции (например, преднамеренная карликовость; преднамеренная мужская стерильность, пригодная, например, в методиках по улучшенной гибридизации; повышенная скорость вегетативного роста; улучшенное прорастание; повышенная мужская или женская фертильность); улучшенными свойствами для сбора урожая, хранения и обработки (например, повышенная устойчивость к вредителям при хранении, повышенная устойчивость к разломам (повреждениям), большая привлекательность для потребителя) или любой комбинацией этих признаков. В одном предпочтительном варианте изобретения трансгенные семена или семена, образуемые трансгенным растением, имеют модифицированный (изменённый) состав первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода), модифицированный состав вторичных метаболитов (например, алкалоидов, терпеноидов, поликетидов, нерибосомных пептидов и вторичных метаболитов смешанного биосинтетического происхождения), модифицированный состав микроэлементов (например, железа, цинка), каротиноидов (например, р-каротина, ликопена, лютеина, зеаксантина или других каротиноидов и ксантофиллов) или витаминов (например, токоферолов), улучшенные свойства для сбора урожая, хранения и обработки или их комбинацию. Например, может быть целесообразно модифицировать содержание аминокислот (например, лизина, метионина, триптофана или тотальный белок), масла (например, композицию жирной кислоты или общее масло), углевода (например, простых сахаров или крахмалов), микроэлементов, каротиноидов или витаминов в семенах или в сельскохозяйственных культурах (например, в каноле, хлопчатнике, сафлоре, сое, сахарной свёкле, пшенице, кукурузе или рисе) предпочтительно в комбинации с улучшенными характеристиками сбора, хранения или обработки и, тем самым, получить улучшенные семена для применения в виде корма животным или пищу человека. В другом примере может быть желательно изменить уровни нативных компонентов трансгенного растения или семян трансгенного растения, например уменьшить уровни белков с низкими уровнями лизина, метионина или триптофана или повысить уровни заданной аминокислоты или жирной кислоты, или понизить уровни аллергенного белка или гликопротеина (например, аллергенов в арахисе, включая ara h1, аллергены пшеницы, включая глиадины и глютенины, аллергены сои, включая Р34 аллерген, глобулины, глицинины и конглицинины) или токсического метаболита (например, циано-генных гликозидов в маниоке, паслёновых алкалоидов у представителей семейства паслёновых). Примеры Пример 1. В этом примере иллюстрируются неограничивающие примеры конструкций рекомбинантной ДНК для супрессии по меньшей мере одного целевого гена; эти конструкции, созданные таким образом, чтобы включать сайт узнавания микро-РНК, способствуют экспрессии элемента супрессии генов в специфических тканях. На фиг. 1А схематически изображены неограничивающие примеры конструкций рекомбинантной ДНК по изобретению для супрессии по меньшей мере одного целевого гена. Эти конструкции включают по меньшей мере один элемент супрессии генов ("GSE" или "GSE1") для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена, причём элемент супрессии первого гена включён в интрон, фланкированный с одной стороны или с обеих сторон не кодирующую белок ДНК. Эти конструкции используют ин-трон (во многих вариантах изобретения предпочтительным является интрон, образованный из 5' не-транслируемой области, или интрон, повышающий экспрессию) для доставки элемента супрессии генов, когда не требуется присутствие каких-либо кодирующих белок экзонов (кодирующей последовательности). Конструкции могут, необязательно, включать по меньшей мере один второй элемент супрессии генов ("GSE2") для супрессии по меньшей мере одного второго целевого гена, по меньшей мере один элемент экспрессии генов ("GEE") для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес гена (который может представлять собой кодирующую или некодирующую последовательность или и ту, и другую) или оба. В вариантах изобретения, содержащих необязательный элемент экспрессии генов, этот элемент экспрессии генов может быть расположен вне интрона (например, прилегая к нему). В некоторых вариантах изобретения интрон, содержащий первый элемент супрессии гена, расположен 3' к терминатору. Для того чтобы более чётко отличать конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению (содержащие по меньшей мере один элемент супрессии генов, включённый в единичный интрон, фланкированный с одной стороны или с двух сторон ДНК, не кодирующей белок) от примеров из предыдущего уровня техники, на фиг. 1 схематически изображены примеры конструкции рекомбинантной ДНК по предыдущему уровню техники. Эти конструкции могут содержать элемент супрессии гена, который прилегает к интрону, фланкированному последовательностью, кодирующей белок, или расположен между двумя отдельными нитронами (причём элемент супрессии гена не включён ни в один из двух отдельных интронов), или могут включать элемент экспрессии генов, включающий элемент супрессии генов, включённый в интрон, фланкированный множественными экзонами (например, экзонами, включающими последовательность, кодирующую белок). На фиг. 2 представлены различные неограничивающие примеры элементов супрессии генов и транскрибируемых экзогенных ДНК, применимых в конструкциях рекомбинантной ДНК по изобретению. При изображении в виде единственной нити (цепи) (фиг. 2А-2Е) эти последовательности обычно даны в направлении транскрипции от 5' к 3'; стрелками показана антисмысловая последовательность (стрелки указывают налево) или смысловая последовательность (стрелки указывают направо). Эти элементы супрессии генов и транскрибируемые экзогенные ДНК могут включать ДНК, которая включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, или ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2А); ДНК, которая включает по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, или ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2В); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования двухнитевой (двухцепочечной) РНК и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2С); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования единичной двухнитевой (двухцепочечной) РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2D); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счёт образования множественных двойных цепей РНК и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловые сегменты ДНК и множественные смысловые сегменты ДНК расположены последовательно в виде обращенных (инвертированных) повторов (фиг. 2Е); и ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, или ДНК, которая включает нуклеотиды из siPHK (фиг. 2F). На фиг. 2F изображены различные неограничивающие конфигурации двухнитевых РНК (днРНК), которые могут считываться при использовании вариантов элементов супрессии генов и транскрибируемых экзогенных ДНК, применимых в конструкциях рекомбинантных ДНК по изобретению. Когда образуется такая двухнитевая РНК, она может подавлять один или более целевых генов и может образовывать единичную двухнитевую РНК или множественные двойные нити (цепи) РНК, или единичный "стебель" или множество "стеблей" двухнитевой РНК. Когда образуется множество "стеблей" двухнитевой РНК, они могут располагаться в конфигурациях "головка молотка" или "клеверный лист". В некоторых вариантах изобретения двухнитевые "стебли" могут образовывать "псевдоузел" (например, где спейсер-ная или петлевая РНК одного двухнитевого стебля образует часть второго двухнитевого стебля); см., например, изображения структуры псевдоузла в статье Staple and Butcher (2005) PLoS Biol., 3(6): e213. Спейсерная ДНК (расположенная между областями днРНК или прилегающая к ним) необязательна, но обычно содержится и, как правило, включает ДНК, которая не соответствует целевому гену (хотя в некоторых вариантах изобретения может включать смысловую или антисмысловую ДНК целевого гена). Спейсерная ДНК может включать последовательность, с которой считывается однонитевая РНК или, по меньшей мере, частично двухнитевая РНК (такая как в структуре "целующиеся стебель-петля"), или РНК, которая предполагает вторичную структуру или трёхмерную конфигурацию (например, большую петлю антисмысловой последовательности целевого гена или аптамер), придающую транскрипту заданный признак, такой как повышенная устойчивость, повышенный период полужизни in vivo, или клеточную или тканевую специфичность. Пример 2. В данном примере описывается один неограничивающий способ определения потенциальной полезности сайта узнавания микро-РНК с помощью определения паттерна экспрессии микро-РНК. Полезно знать распределение экспрессии данной микро-РНК в пространстве или во времени, например, для создания рекомбинантных конструкций, которые должны экспрессироваться в пространстве или во времени специфическим образом. В данном примере раскрываются паттерны экспрессии микро-РНК кукурузы и приводятся последовательности сайтов узнавания для этих микро-РНК, которые пригодны для включения в конструкции рекомбинантной ДНК, используемые в кукурузе и других растениях. Тотальную РНК выделяют из растений кукурузы LH244, используя тризол (Invitrogen, Carlsbad, CA). Используют семь стадий развития, включая корни и меристемы ростков из проростков, молодые (V1-V2) и взрослые листья (V7-V8), междоузлие стебля, метёлку перед осыпанием и незрелые (примерно, 1") початки. Пять микрограмм тотальной РНК анализируют на 17% PAGE-Urea, как описано Allen et al. (2004) Nat. Genet., 36: 1282-1290. Блоты гибридизуют с зондами-ДНК олигонуклеотидами, которые являются антисмысловыми к последовательности малой РНК и меченными на конце гамма 32Р- АТФ с помощью Optikinase (USB). Используемые зонды и их соответствующие последовательности представлены в табл. 1. SEQ ГО NO. Последовательность микро- РНК GTGCTCACTCTCTTCTGTCA miR156, miRI57 TAGAGCTCCCTTCAATCCAAA miR159 TGGCATCCAGGGAGCCAGGCA miR 160 CTGGATGCAGAGGTTTATCGA miR162 TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA miR164 GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA miR166 TAGATCATGCTGGCAGCTTCA miR 167 TTCCCGACCTGCACCAAGCGA miR 168 TCGGCAAGTCATCCTTGGCTG miR 169 GATATTGGCGCGGCTCAATCA miR171 CTGCAGCATCATCAAGATTCT miR172 GGCGCTATCCCTCCTGAGCTT miR390 GATCAATGCGATCCCTTTGGA miR393 TGGGGTCCTTACAAGGTCAAGA TAS3 5'D7(+) GGAGGTGGACAGAATGCCAA miR394 GAGTTCCCCCAAACACTTCAC miR39S CATCAACGCTGCGCTCAATGA miR397 CGGGGGCGACCTGAGAACACA miR398 AGCCAGGGAAGAGGCAGTGCA miR408 Результаты показаны на фиг. 3. Один зонд (SEQ ID NO. 1) гибридизуют со зрелыми РНК из двух семейств (miR156 и miR157). Индивидуальные зрелые микро-РНК экспрессируются с различными уровнями экспрессии в специфических клетках или тканях. Например, Zm-miR390 не экспрессируется или экспрессируется только с низкими уровнями экспрессии, в корне и взрослом листе. Пример 3. В этом неограничивающем примере описываются конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению, применимые для подавления (супрессии) экспрессии целевой РНК в специфической клетке многоклеточных эукариот, или полученной из многоклеточных эукариот, такой как растительная клетка, животная клетка, и способы их применения. Конструкции включают промотор, функционально связанный с ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, экспрессирующейся в специфической клетке многоклеточного эукариота, и целевую РНК, которую надо подавлять в специфической клетке, причём указанная целевая РНК должна экспрессироваться в клетках многоклеточного эукариота, отличных от специфической клетки. Сильные конститутивные промоторы, которые экспрессируются почти во всех растительных клетках (например, САМС 35S, OsAct), идентифицированы, но сильные пространственно специфические (клеточно- или тканеспецифические) или специфические во времени промоторы охарактеризованы значительно хуже. Для ограничения экспрессии целевой РНК или трансгена в специфический тип клетки или ткани в отсутствие сильного клеточно- или тканеспецифического промотора может быть целесообразно подавлять в выбранных клетках или тканях экспрессию транскрипта под контролем конститутивного промотора. Данное изобретение предусматривает способы, в которых используются последовательности узнавания эндогенных микро-РНК для подавления экспрессии конститутивно экспрессирующейся целевой РНК в специфических клетках. Способы по изобретению делают возможным пространственно или во времени специфический посттранскрипционный контроль экспрессии целевой РНК, транскрипция которой управляется неспецифическим (например, конститутивным) промотором. Способы по изобретению позволяют, например, ограниченную экспрессию гена, транскрибируемого при использовании конститутивного промотора или промотора с экспрессией вне заданного(заданных) типа(типов) клеток или тканей. Ограниченная экспрессия может быть ограниченной в пространстве или во времени, например ограниченной специфическими типами тканей или клеток или их группой (файлами), или конкретными стадиями развития, репродукции, роста или временем года. Если микро-РНК экспрессируется в конкретных условиях (например, в условиях биотического стресса, таких как перенаселение, взаимодействие с аллелопатическими веществами или нашествие вредителей, или в условиях абиотического стресса, например, под воздействием тепла или холода, засухи, питательных веществ, тяжёлых металлов или в условиях солевого стресса), соответствующий сайт узнавания микро-РНК можно использовать для условно (определяемой условиями) специфической супрессии, т.е. для подавления целевой РНК в конкретных условиях. Например, Zm-miR162 слабо экспрессируется в корнях кукурузы (см. пример 2 и фиг. 3), поэтому создавая конструкцию экспрессии, включающую сайт узнавания экзогенной микро-РНК162, прилегающий к или внутри конститутивно экспрессирующей целевой РНК, можно ограничить накопление целевого РНК транскрипта во всех клетках кукурузы, за исключением корней. Этот способ имеет полезность для любого применения экспрессии генов в многоклеточных эукариотах (растениях и животных), если ограниченная экспрессия желательна в клетках, в которых экспрессируется данная зрелая микро-РНК. В многоклеточных эукариотах, включая растения, микро-РНК (miPHK) регулируют эндогенные ге ны по механизму посттрансляционного расщепления, которые может быть пространственно или во времени специфическим. Настоящее изобретение предусматривает способы, с помощью которых присоединение сайта узнавания микро-РНК к конститутивно экспрессирующемуся трансгену можно использовать для ограничения экспрессии трансгена в клетки, в которых отсутствует комплементарная зрелая микро-РНК, или они удалены от клеток, экспрессирующих, комплементарную зрелую микро-РНК, либо в пространстве, либо во времени (включая условия). Операции с этими сайтами узнавания микро-РНК в новых транскриптах, введённых в трансгенные растительные клетки и трансгенные растения, полученные из этих клеток, применимы для изменения паттерна экспрессии нового трансгена. В альтернативном способе имеющийся сайт узнавания (нативной или экзогенной) микро-РНК подвергают мутации (например, с применением химического мутагенеза) в достаточной степени, чтобы понизить или предупредить расщепление (см. Mallory et al. (2004) Curr. Biol., 14: 1035-1046). Таким образом целевую РНК последовательность с заданными эффектами, например увеличенный размер листьев или семян, можно экспрессировать с уровнями, более высокими, чем в присутствии сайта узнавания на-тивной или экзогенной микро-РНК. Один вариант изобретения представляет собой замену нативного гена созданным (рекомбинантным) гомологом, где нативная микро-РНК мутировала или даже удалена, т.е. менее чувствительным к расщеплению при использовании данной микро-РНК. Один вариант способа по изобретению представляет собой введение по меньшей мере одного сайта узнавания экзогенной микро-РНК (обычно последовательности из 21 нуклеотида) в 5' или в 3' нетранс-лируемые области целевой РНК или внутри целевой РНК. Если целевая РНК включает кодирующую последовательность, по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК можно ввести в кодирующую область целевой РНК. Это приводит к пониженной экспрессии целевой РНК в клеточных и тканевых типах, которые экспрессируют соответствующую зрелую микро-РНК. Включение сайта узнавания, соответствующего зрелой микро-РНК, в целевой РНК транскрипт позволяет модулировать экспрессию целевой РНК таким образом, что даже под контролем конститутивного промотора целевая РНК экс-прессируется только в выбранных клетках или тканях или в течение выбранных временных периодов. Это делает возможным как высоких уровней экспрессии, получаемых с применением сильных конститутивных промоторов, так и ограничение такой экспрессии в пространстве или во времени. Можно использовать любой сайт узнавания микро-РНК предпочтительно в том случае, когда определено, что экспрессия целевой РНК соответствует заданной экспрессии или супрессии целевой РНК. Известны многие сайты узнавания микро-РНК. См., например, Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell., 14: 787-799, Rhoades et al. (2002) Cell., 110: 513-520, Allen et al. (2004) Nat. Genet., 36: 1282-1290). См. также в Интернете базу данных ASPR (Gustafson et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: D6379-D640). Неограничивающие примеры сайтов узнавания микро-РНК, применимые в конструкциях и способах по изобретению, включают примеры, приведённые в табл. 2, где указаны последовательности указанного семейства микро-РНК и распределение среди "всех растений" (т.е. низших растений, однодольных и двудольных), однодольных и/или двудольных. Ниже даются виды растений, у которых была идентифицирована микро-РНК, и применяемые сокращения: Arabidopsis thaliana (At), Glycine max (Gm), Gossypium hirsutum (Gh), Hordeum vulgare (Hv), Lycopersicum esculentum (Le), Lotus comiculatus вар. japonicus (синоним "Lotus japonicus") (Lj), Medicago truncatula (Mt), Mesembryanthemum crystallinum (Mc), Oryza sativa (Os), Pennisetum glaucum (Pg), Phaseolus vulgaris (Pv), Populus tremula (Pt), Saccharum officinarum (So), Sorghum bicolor (Sb), Theobroma cacao (Tc), Triticum aestivum (Та), Vitis vinifera (Vv) и Zea mays (Zm). SEQ ID NO. 1 Сайт узнавания микро- РНК | Послсдовательяостъ сайта узнавания Семейство га iR156 последовательность сайта узнавания - все растения AUE27370 GUOCUCUCUCUCUUCUOUCA А11в5Э!б0 CUGCUCUCUCUCUUCUGUCA At2g33810 UUGCUUACUCUCUUCUQUCA At3gl5270 CCGCUCUCUCUCUUCUGUCA Семейство miR 159 последовательность сайта узиавання - все растения At5g06100 UGGAGCUCCCUUCAUUCCAAU А12е2б9б0 UCGAGUUCCCUUCAUUCGAAU Al4g26930 AUGAGCUCUCUUCAAACCAAA AEg26950 UGGAGCUCCCUUCAUUCCAAG А(2к324б0 UAGAGCOUCCUOCAAACCAAA At3j> 60460 UGGAGCUCCAUUCGAUCCAAA At5jtf5020 AGCAGCUCCCTJUCAAACCAAA PvMYB CAGAGCUCCCUUCACUCCAAU VvMYB UGGAGOJCCCUaCACUCCAAU HVMYB33 UGGAGCTCCCUUCAOTCCAAG OsMYB33 TJGGAGCUCCCUUUAAUCCAAU Семе йство miR! 60 целевые последовательности - все растения AUg77e50 UGGCAUGCAGGGAGCCAGGCA At2g28350 AGGAAUACAGGGAGCCAGGCA At4s30080 GGGUUUACAGOGAOCCAOGCA OsARF AGGCAUACAGGGAGCCAGGCA LjARP AAGCATJACAGGGAGCCAGGCA Семейство miR161 целевые последовательности Arabidopsis At5g4U70 ACCUGAUGUAAUCACUUUCAA Atlg06580 CCCGGAUGUAAUCACXTUUCAG Atlg63150 UUGUUACUUUCAAUGCAUUGA At5gl6640 CCCUGAUGUAUUUACXTUUCAA Atl ?62590 UAGUCACGUUCAAUGCAUUGA Atlg62670 CCCUGAUGUAUaCACVJUUCAG Atlg62860 CCCUGAUGUUGUUACUUUCAG Atl ?62910 UAGUCACUUUCAGCGCATJUGA Atlg62930 UCCAAAUGUAGUCACUUUCAG Atl ?63080 UCCAAAUGUAOUCACUUtrCAA АЦЯ63130 UCCAAAUGUAGUCACUUUCAG Atlg63400 UCCAAAUGUAGUCACUUUCAA AUg63230 UUGUAACUUUCAGUGCAUUGA АйЕбЗЗЗО UAGUCACGUUCAAUGCAUUGA Atlg63630 UUOUUACUUUCAGUGCAUUGA Atls64580 CCCUGAUGUUGUCACUUUCAC At2g41720 UUGTJUACUUACAAUGCAUUGA AUg63070 UAGUCUUUUUCAACGCAUUGA Семейство nolRl62 целевые последовательности -однодольны* и двудольные Atl ?01040 CUGGAUGCAGAGGUAUUAUCGA PtDCU aJGGAtraCAGAGGUCUUAUCGA OsDCLl CUOOAUGCAGAGXroUUUAUCGA Семейство miR163 целевые последовател ьиоств - Arabidopsis Atl 866700 AUCGAGUUCCAAGUCCUCtroCAA Atlg66720 AUCGAGUUCCAGGUCCUCUUCAA AI3g44860 AUCGAGUUCCAAGUUUUCTJUCAA Семейство miR164 целевые последовательности -однодольные и двудольные AUe56010 AGCACGUACCCUGCUUCUCCA At5g07680 UUUACGUGCCCUGCUUCUCCA AtSg53950 AGCACGUGOCCUGUUUCUCCA Аб?б1430 UCUACGUGCCCUGCUUCUCCA At5g396I0 CUCACOUGACCOQCUUCVCCG OsNACl CGCACGUGACCUOCUUCUCCA MtNAC CUUACGUGUCCUGCUUCUCCA GraNAC COTACGUGCCCUGCTJUCnCCA LeNAC GCCACaUGCACUGCUUCUCCA Семейство mlRl65/166 целевые последовательности - все растения Atlg30490 UUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG At5g60690 CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG Atlg52150 CUGGAAUGAAGCCUGGUCCGG PtHDZTPffi CCGGGAUOAAGCCUGOTCCGG Семейство mlR167 целевые последовательности -однодольные н двудольные AUg30330 GAGAUCAGGCUGGCAGCUUGU At5 §37020 UAGAUCAGGCUGGCAGCUUGTJ OsARF6 AAGAUCAGGCUGGCAGCUUGU Сеиейство miR168 целевые последовательности - все растения Atlg48410 UUCCCGAGCUGCAUCAAGCUA Семейство miR169 целевые последовательности - все растения Atlgl7590 AAGGGAAGUCAUCCUUGGCTJG AUg54160 ACGGGAAGUCAUCCUUGGCUA At J872830 AGGGGAAGUCAUCCUUGGCUA At3g05690 AG <^AMUCAUCUUUGGCUCA At3g20910 GCGGCAAUUCAUUCUUGGCUU At5gl2840 CCGGCAAAUCAUUCUUGGCUU At3gl4020 AAGGGAAGUCAUCCUUGGCUA ZmHAP2 GITGGCAACUCAUCCUUGGCUC VvHAP2 UGGGCAAOTCAUOCtTWSGCTJU osHAPa AUGG^^UCAUCCUUGGCUTJ GmHAP2 UAGGGAAGUCATJCCUUGGCUC GhHAP2 CUGGGAAGUCAUCCUUGGCUC Семейство iniR170/171 целевые последовательности - вое растения At2g45160 GAUAUUGGCGCGGCUCAAUCA Сеиейство mlR172 целевые последовательности - все растения At4g36920 CUGCAGCAUCAUCAGGAUUCU At2g28550 CAGCAGCAUCAUCAGGAUUCU At5g60120 AUGCAGCATJCATJCAGGATJUCU At5g67180 UGGCAGCAUCAUCAGGAUUCU At2g39250 UUGUAGCAUCAUCAaGAUOCC At3g54990 UUOCAGCAUCAUCAGGATJUCC Семейство miR319 целевые последовательности - все растения 100 At4gl8390 CAGGGGGACCCUUCAGUCCAA 101 Atlg53230 GAGGGGUCCCCUUCAGUCCAU 102 At3gl5030 GAGGGGUCCCCUUCAGUCCAG 103 At2g31070 AAGGCGUACCCUUCAGUCCAG 104 Atlg30210 UAGGGGGACCCUXICAGUCCAA 105 OsPCP5 GAGGOGACCCCUUCAGUCCAG 106 OsPCF8 UCGGGGCACACUUCAGUCCAA Семейство mlR393 целевые последовательности -однодольные и двудольные 107 Atlgl2820 AAACAAUGCGAUCCCUUUGGA 108 At4g03190 AGACCAUGCGAUCCCUUUGGA 109 Al3g23690 GGUCAGAGCGAUCCCWUGGC At3g62980 AGACAATJGCGAUCCCUUUGGA Семейство mlR394 целевые последовательности -однодольные и двудольные Atlg27340 GGAGGUUGACAGAAXJGCCAAA Семейство miR395 целевые последовательности -однодольные и двудольные 112 At5g43780 GAGUUCCUCCAAACACUUCAU 113 At3g22890 GAGUUCCUCCAAACUCUUCAU 114 AtSglOlSO AAGTJUCUCCCAAACACUUCAA Семейство mlR396 целевые последовательности -однодольные я двудольные 115 At2g22840 UCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA 116 At2g364O0 CCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA 117 At4g24150 UCOUUCAAGAAAGCAUGTJGGAA 118 At2g4S4S0 ACGUUCAAGAAAGCUUGUGGAA 119 At3g52910 CCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA Семейство miR397 целевые последовательности -однодольные и двудольные 120 At2g29130 AAUCAAUGCUGCACUCAAUGA 121 At2g38080 AGUCAACGCUGCACUUAAUGA 122 At2g60020 AAUCAAUGCUGCACUUAAUGA Семейство miH39d целевые последовательности -однодольные и двудольные 123 AtlgO8830 AAGGGGUTJUCCUGAGAUCACA 124 At2g28190 UGCGGGUGACCUGGGAAACAUA 125 At3gl5640 AAGGUGUGACCUGAGAAUCACA Семейство miR173 целевые последовательности - Arabidopsis 126 AITASIa GUGAUUUUUCUCAACAAGCGAA 127 AlTASlc GUGAUUUUUCUCUACAAGCGAA 128 AtTAS2 GUGAUUUUUCUCUCCAAGCGAA Семейства miR399 целевые последовательности -однодольные и двудольные 129 At2g33770 UAGGGCAUAUCUCCUUUGGCA 130 At2g33770 TJUGGGCAAAUCUCCUUUGGCA 131 At2g33770 UCGAGCAAAUCUCCUUUGGCA 132 At2g33770 UAGAGCAAAUCUCCUUUGGCA 133 At2g33770 UAGGGCAAAUCUUCUUUGGCA 134 OsEiUBC UAGGGCAAAUCUCCUUUGGCA 135 OsB2UBC CUGGGCAAAUCUCCUUUGGCA OsEZTJBC UCGGGCAAAUCUCCUUUGGCA 137 OsBZUBC CCGGGCAAAUCUCCUUUGGCA 138 P(E2UBC GCGGGCAAAUCUUCUUUGGCA 139 MtE2UBC AAGGGCAAAUCUCCUUUGGCA 140 TaE2TJBC UAGGGCAAAUCUCCUUUGGCG 141 TaE2UBC CUGGGCAAAUCUCCUUUGGCG 142 TaE2UBC UUCGGCAAAUCUCCUUUGGCA Семейство miR403 целевые последовательности - двудольные 143 Atlg31280 GGAGUUUGUGCGUGAAUCUAAU SBO Ю NO. j Сайт узнавания микро- РНК | Последовательность сайта узнавания Сеиейство m)R390 целевые последовательности - все растения 144 At3gl7185 CUUGUCUAUCCCUCCUGAGCUA 145 SbTASS UAUGUCUAUCCCUUCUGAGCUG 146 SoTAS3 иАШиОТАисССШСиОАОСиА 147 ZmTAS3 UAUGUCUAUCCCUUCUGAGCUG 148 OsTAS3 UCGGUCUAUCCCUCCUGAGCUG 149 PgTAS3 UUAGUCUAUCCCUCCUGAGCUA 150 VvTAS3 AUUGCCUAUCCCUCCUGAGCUG 151 TcTAS3 CCUUGCUAUCCCUCCUGAGCUG 152 LeASR CUUGUCUAUCCCUCCUGAGCUG 153 ZmTAS3 CCCUUCUAUCCCUCCUGAGCUA 154 P1TAS3 CUUGUCUAUCCCUCCUGAGCUA 155 OeTAS3 CCCUUCUAUCCCUCCUGAGCUA 156 TaTAS3 CCCUUCUAUCCCUCCUGAGCUA 157 HvTAS3 CCUUUCUAUCCCUCCUGAGCUA 158 CCUGUCUAUCCCUCCUGAGCUA 159 MoTAS3 UGUGUCUAUCCCUCCUGAGCUA Сем !Йство m!R447 целевые последовательности 'Arabidopsis At5g60760 UGACAAACAUCUCGUCCCCAA 161 At3g45090 UGACAAACAUCUCGUUCCUAA Семейство miR408 целевые последовательности -однодольные и двудольные 162 At2g02850 CCAAGGGAAGAGGCAGUGCAU 163 At2g30210 ACCAGUGAAGAGGCUGUGCAG 164 At2g47020 GCCAGGGAAGAGGCAGU GCAU 165 At5g05390 GCCGGUGAAGAGGCUGUGCAA 166 At5g0713O GCCGGUGAAGAGGCUGUGCAG TAS3 ta- siPHK целевые последовательности - однодольные н двудольные 167 At2g33S60a AGGGUCUUGCAAGGUCAAGAA 168 At5g60450a AAGGUCUUGCAAGGUCAAGAA 169 OsARB3-Iike GAGGUCUUGCAAGGUCAAGAA 170 OsARF2-liko ACGGUCUUGCAAGGUCAAGAA TAS1/TAS2 целевые последовательности -Arabidopsis tholiaw 171 Atgl2770 AGAACUAGAGAAAGCAUUGGA 172 Atgl2T70 AGAGUAAGAUGGAGCUUGAUA 173 Atl "63130 AGAUGGUGGAAAUGGGAUAUC 174 Atlg63230 UUGUUGAUCGUAUGGUAGAAG 17S Atlg62930 GGUAUUCGAGUAUCUGCAAAA Таким образом, ожидается, что трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию рекомбинантной ДНК, которая под контролем конститутивного промотора (например, 35S промотора) транскрибируется в РНК, содержащую сайт узнавания Zm-miR390 и целевую РНК, продемонстрирует супрессию (подавление) экспрессии целевой РНК в корне и во взрослом листе по сравнению с экспрессией в других тканях. В другом примере Zm-miR172 экспрессируется с высокими уровнями в стебле и не экспрессируется или экспрессируется только с низкими уровнями в других тканях. Ожидается, что трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию, которая под контролем сильного конститутивного промотора (например, CaMV 35S промотора) транскрибируется в РНК, содержащую сайт узнавания Zm-miR172 и целевую РНК, будет экспрессировать целевую РНК с более высокими уровнями в тканях, отличных от стебля (где экспрессия целевой РНК будет подавляться). Для иллюстрации применения конструкций и способов по изобретению для контроля экспрессии представляющего интерес гена в качестве самого представляющего интерес гена или в качестве имитатора (суррогата) представляющего интерес гена применяют маркерный (репортёрный) ген. Например, если требуется экспрессия маркерного гена (например, зелёного флуоресцентного белка, GFP) в ткани кукурузного стебля или незрелого початка, в кассету экспрессии GFP включают miR156 целевой сайт и экспрессируют в стабильно трансгенном растении под контролем промотора CaMV 35S. В других тканях (например, корнях, листьях и метёлке) экспрессию GFP подавляют. "Супрессионный" фенотип можно ограничить очень специфическими типами клеток в супрессируемых тканях, при этом в соседних клетках наблюдается экспрессия или градиент экспрессии GFP непосредственно рядом с клетками, экспрес-сирующими зрелую miR156. В другом примере сильный конститутивный промотор применяют для того, чтобы осуществить (вызвать) экспрессию инсектицидного белка Bacillus thuringiensis или белкового фрагмента ("Bt"), в которой сайт узнавания для микро-РНК, экспрессирующейся специфически в пыльце, включён в конструкцию, что приводит к сильной экспрессии Bt в тканях растения за исключением пыльцы. Одним специфическим неограничивающим примером способа является включение сайта узнавания, по меньшей мере, одной микро-РНК, которая не экспрессируется (или экспрессируется только с низкими уровнями) в корнях, в конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую целевую РНК, экспрессия которой желательна только в корнях. Всё ещё может потребоваться применение сильного конститутивного промотора (например, усиленного 35S), но экспрессия целевой РНК теперь ограничена клетками, кото рые не экспрессируют соответствующую зрелую микро-РНК. Конкретным примером такого подхода является сайт узнавания пи(микро)РНК162 кукурузы, miPHK164 кукурузы или miPHK390 кукурузы (или любой их комбинации) в конструкции рекомбинантной ДНК для экспрессии инсектицидного белка Bacillus thuringiensis или фрагмента белка ("Bt", см., например, инсектицидные последовательности Bacillus thuringiensis и способы их применения, раскрываемые в патенте США 6953835 и в предварительной патентной заявке США No. 60/713111, поданной 31 августа 2005 года) в качестве целевой РНК, например, в конструкции, включающей кассету экспрессии e35S/Bt/hsp17. Эти микро-РНК(например, микро-РНК162, микро-РНК164 или микро-РНК390) практически не экспрессируются в корнях кукурузы, но экспресси-руются в большинстве остальных тканей. Включение одного или более этих сайтов узнавания в кассету экспрессии снижает экспрессию транскриптов в большинстве тканей, отличных от корня, но поддерживает высокие уровни экспрессии целевой РНК Bt в корнях, что желательно для контроля за вредителями, такими как западный кукурузный жук. В аналогичных вариантах изобретения в конструкцию включают комбинации сайтов узнавания различных микро-РНК, чтобы получить заданный паттерн экспрессии в одной или более специфических тканей. Неограничивающие конкретные примеры транскрибируемой ДНК последовательности, включающей сайт узнавания экзогенной микро-РНК, показаны на фиг. 4 и 5. На фиг. 4 изображён хлоропластна-правленная TIC809 с сайтом узнавания микро-РНК162 (жирным шрифтом), расположенным в 3' нетранс-лируемой области (SEQ ID No. 176). На фиг. 5 изображена ненацеленная TIC809 с сайтом узнавания микро-РНК164 (жирным шрифтом), расположенным в 3' нетранслируемой области (SEQ ID No. 177). Пример 4. В данном примере описана идентификация гена MIR сельскохозяйственных культур с тканеспеци-фической экспрессией и идентификация промотора miR гена. Более конкретно, в данном примере описывается транскрипционное профилирование как неограничивающий способ идентификации микро-РНК, специфически экспрессирующейся в женской репродуктивной ткани (эндосперме), а также идентификация промоторной последовательности miR167 кукурузы с эндосперм-специфической экспрессией. Сайт узнавания, соответствующий этой микро-РНК, применим, например, для получения трансгенных растений с индуцибельной женской стерильностью по данному изобретению. Найдено, что член семейства генов MIR167 (SEQ ID NO. 178) составляет около четверти популяции малой РНК, клонированной из развивающегося эндосперма кукурузы. Чтобы определить, действительно ли единственный член семейства генов MIR167 отвечает за наблюдаемую сильную экспрессию в эндосперме, несколько генов MIR167 анализируют методом RT-ПЦР. Девять последовательностей Zea mays MIR167 стебель-петля найдены в общедоступном реестре ("miRBase", на сайте mi-croma.sanger.ac.uk/sequences), перечисленные как miR167a по miR167i. Тканеспецифическую RT-ПЦР проводят для некоторых последовательностей Z. mays miR167, используя ген-специфические праймеры для синтеза первой нити кДНК, а затем проводят ПЦР с парами ген-специфических праймеров. Экспрессия miR167g является сильной и тканеспецифической к эндосперму (15, 20 дней после опыления). Для того чтобы определить, действительно ли miR167g в большом количестве эксрессируется в эндосперме, готовят Нозерн-блоты кукурузы (LH59). Блот готовят с меченным на конце 22-мерным LNA зондом зрелой miR167 (фиг. 6А), разрезают на полоски и снова гибридизуют с ~400 п.о. miR167g ген-специфическим зондом (фиг. 6В). Сильный сигнал, наблюдаемый в эндосперме, показывает, что miR167g в значительной степени ответственна за повышенную экспрессию в эндосперме. Транскрипционное профилирование тканей кукурузы подтверждает результаты, полученные Нозерн-блоттингом (фиг. 6С); транскрипт, соответствующий miR167g, в большом количестве и специфически экспрессирует в ткани эндосперма. Общедоступная, зарегистрированная в GenBank кДНК последовательность из 804 пар оснований (аннотированная как "ZM_BFb0071I20.r ZM_BFb Zea mays кДНК 5', мРНК последовательность") и имеющая регистрационный номер DR827873.1 (GI: 71446823) ссылкой вводится в данное описание. Эта последовательность включает сегмент (SEQ ID NO. 178), соответствующий зрелой miR167g. Используя открытую последовательность проводят биоинформационный анализ на собственной геномной последовательности кукурузы. Идентифицируют, что геномный кластер длиной 4.75 тыс. н.о., включающий последовательность инбредной линии В73 кукурузы, содержит прогнозированные последовательности генов для miR167 и miR167g. Область, протяжённостью 486 пар оснований между двумя генами MIR.167, идентифицируют как имеющую гомологию экспрессирующейся последовательности хвоста (метки) (EST). Мотивы в промоторе идентифицируют в 3'-5' последовательностях обоих (miR167a и miR167g) предсказанных транскриптах. Область из 1682 пар оснований (SEQ ID NO. 179) между предсказанными miR167a и miR167g транскриптами и меньшая область из 674 пар оснований (SEQ ID NO. 180) между EST и предсказанным miR167g транскриптом идентифицируют как промоторные последовательности miR167g. Субпопуляции этих последовательностей (например, по меньшей мере около 50, около 100, около 150, около 200, около 250 или около 300 нуклеотидов из SEQ ID NO. 179 или SEQ ID NO. 180 или фрагменты по меньшей мере из примерно 50, примерно 100, примерно 150 и примерно 200 соседних нуклеотидов, идентичных по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% сегменту SEQ ID NO. 179 или SEQ ID NO. 180) также применимы в качестве промоторов; их промо торные эффекты можно продемонстрировать методами, хорошо известными в уровне техники (например, управление экспрессией маркерного гена, такого как ген люциферазы или зелёного флуоресцентного белка). Аннотированная карта, включающая местоположения генов miR167a и miR167g и зрелых микро-РНК и промоторных элементов (например, ТАТА боксов) этого геномного кластера, показана на фиг. 7. На аннотированной карте показано также местоположение мотивов ауксин-зависимого фактора (ARF) или ауксин-зависимых элементов с последовательностью TGTCTC (SEQ ID NO. 181), которые показывают, что ауксин может регулировать экспрессию miR167g. Зрелые микро-РНК miR167 комплементарны ARF6 и ARF8 (которые кодируют активирующие ARF) и, как предполагают, регулируют гомеостаз ауксина; см., например, Rhoades et al. (2002) Cell., 110: 513-520, Bartel and Bartel (2003) Plant Physiol, 132:709-717, Ulmasov et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 5844-5849, и Mallory et al. (2005) Plant Cell., 17: 1360-1375. Помимо промоторных последовательностей miR167g (SEQ ID NO. 179 и SEQ ID NO. 180), идентифицированных при использовании инбредной линии кукурузы В73, две дополнительных промоторных последовательности miR167g (SEQ ID NO. 182 и SEQ ID NO. 183) амплифицируют при использовании инбредной линии кукурузы LH244. 3' концы SEQ ID NO. 182 и SEQ ID NO. 183 определяют экспериментально с помощью 5' RACE (быстрая амплификация кДНК концов, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) miR167g. 5' конец последовательности из 768 пар оснований (SEQ ID NO. 182) соответствует концу общедоступной в GenBank последовательности кДНК из 481 пар оснований (аннотированной как "QCG17c03.yg QCG Zea mays кДНК клон QCG17c03, последовательность мРНК") и имеющей регистрационный номер CF035345.1 (GL32930533). 5' конец последовательности из 407 пар оснований (SEQ ID NO. 183) соответствует концу общедоступной в GenBank последовательности кДНК из 746 пар оснований (аннотированной как "MEST991A06.T7-1 UGA-ZmSAM-XZ2 Zea mays кДНК, последовательность мРНК") и имеющей регистрационный номер DN214085.1 (GI: 60347112). Промоторные последовательности miR167g, miR167g ген, зрелые микро-РНК miR167g и сайт узнавания miR167g (примеры которых включены в табл. 6, см. ниже) по данному описанию имеют различную полезность, описанную в другом месте в данном раскрытии. В частности, miR167g промотор применим в качестве эндосперм-специфического промотора и может использоваться, например, для замены промотора кукурузы В32. В другом случае (другая полезность) последовательность miR167g или зрелую miR167g (или её предшественника) создают таким образом, чтобы подавлять целевой ген, в особенности, если супрессия должна быть эндосперм-специфической. Сайт узнавания miR167g применим, например, в конструкциях экспрессии гена, если ген нужно экспрессировать в тканях, отличных от эндосперма, и в особенности полезен для получения трансгенных растений с индуцибельной женской стерильностью в соответствии с изобретением. Пример 5. Современные критерии для идентификации микро-РНК придают особое значение сохранению (консервации) микро-РНК во всём виде и поэтому было охарактеризовано мало неконсервативных или видоспецифических микро-РНК в растениях. В данном примере описаны неограничивающие методы идентификации микро-РНК, их паттерн экспрессии в ткани, их соответствующие сайты узнавания и примеры мишеней. Пять новых неконсервативных последовательностей микро-РНК и соответствующие MIR последовательности идентифицируют при использовании библиотеки на основе фракционированной по величине кДНК, созданной из листьев сои. Критерии идентификации микро-РНК включают: (1) клонированную 21-нт малую РНК и возможную микро-РНК* (нить, соответствующая микро-РНК) с меньшим относительным содержанием, (2) локализация дуплекса микро-РНК/микро-РНК* полностью внутри короткой несовершенной "скобочной" (FB) структуры, (3) получение микро-РНК из не кодирующего белок транскрипта РНК Pol II, и (4) присутствие комплементарного целевого сайта в кодирующем гене; см. Ambros et al. (2003) RNA, 9: 277-279. Малые РНК экстрагируют из адаптер-содержащих необработанных последовательностей и определяют их нити. Этот набор последовательностей фильтруют, удаляя последовательности малых РНК, которые являются вирусными, тРНК, рРНК, РНК из хлоропластов и митохондрий и трансген, получают отфильтрованный набор из 381633 предполагаемых микро-РНК последовательностей. Малые РНК, происходящие не из вышеописанных источников и не гомологичные известным микро-РНК, картируют относительно кДНК последовательности сои. Для картированных кДНК последовательностей с низким содержанием кодирующих белки последовательностей фрагмент кДНК последовательности длиной около 250 нуклеотидов, содержащий предполагаемую микро-РНК, делают складчатым, используя алгоритм RNA Folder. "Скобочную" (гибридизованную "в себе", FB) структуру изучают, проверяя, действительно ли малая РНК локализована в стебле и действительно ли экстенсивно (но не абсолютно) комплементарная малая РНК в меньшем количестве локализована на противоположной стороне стебля. Потенциальные мишени малой РНК предсказаны на основе модифицированных правил Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell., 14: 787-799, и Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33: W701-704. в табл. 3* приводятся пять новых неконсервативных микро-РНК, клонированных из ткани листа сои, и для каждой соответствующая микро-РНК* и предшественник при-микро-РНК; относительное содержание ("относ. сод.") дано как число раз (частоту встречаемости), которое встречается последовательность всего в 381633 последовательностях. Таблица 3 микро- РНК микро- РНК* предшественник микро- РНК SEQ 1D NO. последовательность относ сод. SEQ ID NO. последовательность OTHOC СОД. SEQ ID NO. 18-1 UGAOACCAAAUGAOCAGC UGA 94123 185 GCUGCUCAUCUGU UCUCAGG 186 187 UAGAAGCUCCCCAUGUUC UCA 7259 188 GAGCAUGGGUAAC UUCUAU 189 190 UGUUGCGGGUAUCUUUGC etc 4127 191 GGCGUAGAUCCCC ACAACAG 192 193 UGCGAGUGUCUUCGCCUC UGA 3778 194 GGAGGCGUAGAUA CUCACACC 19S 196 UUGCCGAUUCCACCCAUU CCUA 3773 197 GCUGCUCAUCUGU UCUCAGG 198,199 Для каждой новой микро-РНК сои "скобочная" (гибридизованная "в себе", FB) последовательно-сти(ей) предшественников микро-РНК предсказана с помощью алгоритма ("RNAFolder", на основе фол-динга РНК, имеется на сайте www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/RNAfold.htmn), а транскрипционный профиль предшественника микро-РНК, если он имеется в распоряжении, представлен в табл. 4. Примеры предсказанных мишеней (сайтов узнавания) в сое и их определённый паттерн экспрессии определены для двух микро-РНК (SEQ ID NO. 184 и SEQ ID NO. 187). Таблица 4 микро- РНК SEQ ID NO. предшественник микроРНК fold-back структура предшественника микро- РНК транскрипцией ный профиль предшественни ка микро-РНК предсказанная G. max целевая (сайт узнавания) последовательность предсказанный целевой паттерн экспрессии 184 186 см Фигуру 8А см Фигуру 8В полифенолоксидаза (SEQID NO. 200) см Фигуру 8С 187 189 см. Фигуру 9А полифенолоксидаза (SEQ1DNO.201) см Фигуру 9В 190 192 см. Фигуру 10 193 195 см. Фигуру 11 196 198,199 см. Фигуру 12А см. Фигуру 12В Кроме того, целевые (сайт узнавания) последовательности для каждой зрелой микро-РНК идентифицируют, используя собственные ("MRTC") базы данных для сои, приведённые в табл. 5. Число ошибочных спариваний нуклеотидов между каждым сайтом узнавания и соответствующей последовательностью зрелой микро-РНК составляет 1-6, сюда входят гэпы или "пропущенные" нуклеотиды. Например, гэп находится между нуклеотидами 7 и 8 в каждой из последовательностей SEQ ID NO. 220, SEQ ID NO. 221, SEQ ID NO. 223, SEQ ID NO. 224 и SEQ ID NO. 225. микро- РНК SEQ ID NO. 184 микро- РНК последовательность (3'-> 5') I AGUCGACGAGUAAACCAGAGC Глипт nun питая (сайт узнавания SEQ ID NO, Обозначение MRTC Лоаагтацяя мнщеии (сайга узнавания Целевая (сайтузнаяшния) последовательность Балл Несовпадения 202 MRT3847_253S79C2 153 -173 ucagcugcucaucuguucuca 2D3 MRT3847JM392C5 402-422 cca^cuflcucauuuggucacu ZD4 MRT38*7_41382G3 118 • 138 ucagcucuucuuuuggucucu 205 MRT3847_319840G1 408 - 428 ucagcuacugaucuggucuca 206 MRT3847_326146C.l 117-137 ucagcuguuecuuuguucucu 207 MRT3847.39543C6 768-788 ucagcuguuccuuuguucacu 208 MRT3847_253942C-4 1837-1857 guagcuucucamuggucuua 209 ШТ3847_260486С.4 124-144 uuagcugcuacuucgEUcucu 210 MRT3847J10S20C.2 357-377 uuagaugcuuguuuegucuuu mlRNA SEQ Ш NO. 187 roJRNA sequence 0'-"5') ACUCUUOUACCCCUCGAAGAU Глицин mm целевая (сайг узнавания) SEQ ID NO. Обозначение MRTC Локализация нишена (сайга узнавания Целевая(сайт узнавания) последовательность Балл Несовпадения 211 MRT3847_303349C.l 435 - 45S ugagaacaugeeeaeccucua 1JS 212 MRT3847_14S93C.fi 1133-1153 agaggacauggggagauucua 213 MKT3847J41913C.3 1111-1131 agaggacauggggaggoucua 214 MRT3847J2439C.4 1142-1162 ugagaacaugggaaucuucua 21S MB,T3847_187197C5 689 - 709 aaagaacauggggagccucua 2.5 MRT3847_33448C5 1047-1067 ugagaacaueeg^^auuucua 25 n 217 MRT3347.39693C6 305-325 ugugaagguireKKagcuucuu 2.5 218 MRT3847_50432GS 89-109 ggagaacaugcagagcuacag 219 MRT3847_95417C.l 308 - 328 ugagaaacuggggagcuirouc 220 MRT3847_U5705G2 82-101 ugagaacuggugagctrucug шире-РНК SEQ ID NO. 187 микро- РНК последовательность (31-"?) ACUCUUOUACCCCUCQAAOAU Глицин max целевая (сайг узнавания SEQ ID NO. Обозначение MRTC Локализация мишени (сайп узнавания Целевая (сайт узнавания) последовательность Балл Несовпадения 221 MRT3847_182S67C.l 143 -162 ugaguacuggggagcuucuc |3_ 222 MRT3847_184995C.l 16-36 ugagagcauggguaaoracua 223 MRT3S47_253437C4 141-160 ngagcacaggggegcuuouc 224 MRT3847_293395C2 294-313 ugagcacuggggagcuucuc 225 MRT3847_63S12C6 321-340 ugagcacuggggagcuucuc 226 MRT3847_64829C.6 1087 - U07 ugagaacaugggaaciumcua 227 MRT3847_80470C.3 15-35 ugagagcauggguaacuucua 228 MRT3847_136444C,5 312-332 ugagaaccugguaagcuucug 229 MRT3847_231S76C.l 360 - 380 ugagaacaucgaaagcuucuu 230 MRT3847J63317C.1 90-110 ugaggacaaggggagcuuaug 231 MRT3847_304409C.l 217-237 cuaaaacauggggagcuucuu 232 MRT3847_247o82C,3 1287-1307 ugaggaaauagggaguuucug 233 MRT3847_251D48C2 280-300 ugagaacanagugagDamuu 234 MRT3847"270705G2 575 - 595 uaggaucguggggagcuucuc 235 MRT3847_304509C.2 592-612 uaggaucguggggagcuucuc 236 MET3847_62S76C.4 540-560 uaggaucguggggagcuucuc 237 MRT3847_67153C3 661-681 gaugaauauggggagumieua микро* РНК SEQ ID NO. 190 микро- РНК последовательность (У-'S'I сисх^шшшАисмосошет Глицин плах целевая (сайт узнавания SEQ ID N0. Обозначение MRTC Локализация мишени {сайга узнавания Целевая (сайт узнавания) последовательность Балл Носовпаде ния 238 MRT3847"106868C.2 318-338 ggggcaaggacauccgcaacg 239 MRT3847_307036G1 171 -191 aaggcaaaguu^cccgcgacg 240 MRT3847_308816C,2 719-739 gaggcaaagaugcgagcaacg 241 MKT3847_624SG3 584 - 604 gcggcaaagauacucacaacc 242 MBT3S47_104943C2 177-197 aacgcaaagagaccuEuaaca 243 MRT3847_29a510Ci 181-201 aaggcaaagaugccagcgacg 244 MRT3847_294I84G2 1090-1110 gagccaaagagacccgugacg 245 MRT3847_321797G1 847 - 867 aaggcauagauagucgcagca 246 MRT3847_63653C5 1096-1116 aaggcaaagaugccaficaaug 247 MRT3847_9362C2 481-501 uagggaaagauacauguaaca 248 MRT3847_112761C3 331-351 ga^gcaaagmiguucgcaaug 249 MB.T3847_249731C_ 515-535 caggcaaagaugucugcaauu 250 MR.T3847_313052C.l 253-273 uagguauggauacuugcaaca 251 MRT3847_3180S2C.l 123 -143 aaggcaaagcugccogcgaug микро-РНК SEQ ID МО. 193 микро- РНК последовательность (З1-5') ASUCUCCCCUUCUGUQAQCmJ Глицин max цвлевая (сайтуэнаваиия SEQIDN0. Обозначение MRTC Локализация мишнн (сайта узнавания Целевая (самтуаиаваиия) последовательность Балл Несовпадения 233 MRT3847_160536G3 182-202 ucaggggaggagacacucgca L_L_ 253 MRT3847_2900I7C.2 304 - 324 uuagaggcaaagacacucguc 254 MRT3S47_97323C.l SS-75 ucagaggagaagauacucgug 255 MRT3847_182887C.l 43-63 ucagaggagaagacacgcgca 256 MKT3847_290275C2 177 -197 ucagaggggaagacacacgcu 257 MRT3S47_2963I2C2 155-175 ucagaggggaagacacacgcu uH- 258 MRT3847_29225202 171 -191 ucagaggugaggacacacgcu 2.5 259 MRT3847_206250C.l 306 - 326 ccagaggcggaugcauucgca 260 MRT3847_240825O3 436-456 acagaggcagggacacuugca 261 MRT3847_2S0458C2 776 - 796 ^cagaggugaagaagcuugca 262 MRT3847_36461G4 87-107 uuagaggagaggauacucgcg 263 MRT3 &47_48749C4 715-735 gcagaggugaagaagcimgca 264 MRT3S47_97362C.3 566 - 586 ucagaggcaaagauacccgca 265 MET3847J20647C^ 143-163 uuagaggggaagacacgcgcu 266 MRT3847_219382C.l 147 -167 ucagaggggaagacacccgug 267 MRT3847J243I96C3 73-93 ucagaggcuaagagacmigua 268 MRT3S47_248880C.3 760 - 780 ucagaggggaagacacgcgug 269 MRT3847_25201G4 173 -193 ucagaggggaagacacccgug 270 MRT3847J264S5SC.4 212-232 ucaflagjfggaagacacacguu 271 MRT3847_28447C6 142-162 uoagaggggaagacacaoguu 272 MRT3847_32431C4 59-79 ucaggggugaagacacacgua 273 №T3847_99343G1 116-136 ucagaggggaagacacccgug 274 MRT3847J10811C2 273 ¦ 293 ucagaaacgaagacgcucguu 27S ШТ3847.240622С.2 92-112 uccgaggggaagauacucguu 276 MRT3847_254863C2 17S -195 uccgaggggaagauacucguc 277 MRT3S47_2SS345C3 113 -133 uccgaggggaagauacucguc 278 MRT3847_257424C1 378 - 398 gcagaggcuguggcacucgca 279 MRT3847J8012C4 56-76 uuagaggcgaggaoacacguu 280 MRT3847_6951C6 306 - 326 uccgaggagaagauacucguu 281 MRT3847_263266C4 163-183 ucaguggcgaaggcguucgnc 282 MRT3847_272810C2 502-522 uuagaggugauggcacucgug иикро-PHKSEQ ID N0,196 мига"- РНК последовательность (3'^5'| А1гссииАСхХАсхяшА(юа1т) Глицин max целевая (сайт узнавания SEQIDNO. Обозначение MRTC Лоолизация мишени (свита узнавания Целевая (сайт узнавания) поспедоаатепыюсть Балл несовпадения 283 MRT3847_302750C1 259-280 ggggaauggguggaaaoggoaa 284 MRT3B47_136115C3 661-682 ugggaaug^gugggaugggnaa 285 MRT3847_235247C2 694 - 715 ugggaaugggugggauggguaa 286 MRT3847_21031C3 1364-1385 auggaacugguggaauuggcaa 2.5 287 MRT3847"297070C2 280 - 301 egggaaagguuggaauuggcaa 2.5 288 MRT3847_248343C3 392 - 413 uaggaauggguggaumiugcaa 289 MRT3847_207469C2 1-20 ggaaugggoggcgugggcaa 290 MET3847_216295C.4 537 - 558 caggaaaggggggaguuggcaa 291 MRT3847_287795C2 141-162 uagcaauggguuggauegguga 292 MRT3847_302511C2 35-56 guugaauggeuenaauuKgaaa 293 MRT3847_312620C.l 46-67 guugaauggguggaauuggaaa 294 MRT3847_20416C.2 679 - 700 aaggaauugggggaauugguac 295 MRT3847_297209C.l 289 - 310 cacgaguggggggaaucggcgg 296 MRT3847_6639G4 195-216 guggaauggguggucuugguaa Пример 6. В данном примере описываются неограничивающие методы идентификации микро-РНК для применения при получении трансгенных растений с индуцибельной стерильностью, используемой в способах по данному изобретению. Конкретнее, микро-РНК, имеющие паттерн экспрессии в заданных тканях (например, мужских или женских репродуктивных тканях) идентифицируют, используя данные по оценке транскрипционного профиля (ТхР). Одна общая методика идентификации микро-РНК, имеющих паттерн экспрессии в заданных тканях (например, мужских или женских репродуктивных тканях), включает стадии: (а) создания начальной miR последовательности, включающей область стебель-петля, например, из miR последовательностей, доступных в базе данных "miRBase" (на сайте microrna.sanger.ас.uk/sequences); (б) применения алгоритмов для анализа последовательностей, таких как BLAST, хорошо известного в уровне техники (см. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol, 215: 403-410), для идентификации гомологичных или идентичных последовательностей (например, из собственных последовательностей на наборах зон- дов на микрочипах, полученных с целой геномной ДНК кукурузы); и (в) анализа транскрипционных профилей гомологичных последовательностей набора зондов, иден- тифицированных на стадии (б), и идентификации микро-РНК, имеющих паттерн экспрессии в заданных тканях (а именно, мужских или женских репродуктивных тканях). Предпочтительно добавляют четвёртую стадию: (г) для гомологичных последовательностей набора зондов, которые, как найдено, имеют заданные транскриционные профили, подтверждение идентификации микро-РНК гена либо выравниванием последовательности стебель-петля начальной последовательности (исходной) микро-РНК с последовательностью набора зондов, или, для потенциально новых микро-РНК, определение последовательности, прогнозируемо складывающейся в структуру стебель-петля, характерную для микро-РНК. Также предпочтительно включать необязательную стадию, в которой проводится одно или более BLAST сравнений с дополнительными наборами данных для последовательностей, отличных от набора данных для последовательностей набора зондов (перед стадией (б), см. выше), способствующее дальнейшей идентификации зондов, которые попадают вне предсказанной области гена микро-РНК; мнимые позитивы, например, вследствие совпадений (пар) в базе(ах) данных дополнительных последовательностей, которые включают некорректно сплайсированные контиги, идентифицируют по отсутствию в них признаков микро-РНК, таких как соответствующая "скобочная" (гибридизованная "в себе", FB) структура, и удаляют. Вышеуказанный метод применяют для собственных данных транскрипционного профилирования для кукурузы. На фиг. 13 и 14 изображены транскрипционные профили последовательностей набора зондов, которые идентифицируют как включающие микро-РНК гены, имеющие заданные паттерны экспрессии, а именно, в женской репродуктивной ткани (фиг. 13) или в мужской репродуктивной ткани (фиг. 14). Определено, что некоторые гены микро-РНК и примеры их соответствующих сайтов узнавания применимы для получения трансгенных растений с индуцибельной стерильностью (табл. 6). Два члена семейства miR166, miR166b и miR166d имеют общую последовательность идентичной зрелой микроРНК и соответствующих сайтов узнавания, но у них различные паттерны экспрессии, а именно miR166b экспрессируется только в эмбрионе, a miR166d экспрессируется в семяпочке, эмбрионе, шёлке (пестичных столбиках) и корне; таким образом, для получения растений с индуцибельной женской стерильностью предпочтительной является miR166b. Одним особенно предпочтительным вариантом микро-РНК, применимой для получения растений с индуцибельной женской стерильностью, является эндосперм-специфическая miR166g кукурузы (SEQ ID NO. 307) с дополнительным или без дополнительного G на 3' конце; варианты изобретения, имеющие дополнительный нуклеотид G на 3' конце, представляют собой 22-меры, заканчивающиеся GG, и имеют соответствующие сайты узнавания, которые также предпочтительно являются 22-мерами, где нуклеотид, добавляемый к 5' концу, предпочтительно не является ошибочно спаренным (т.е. не является С). Помимо полезности этих и аналогичных микро-РНК и их соответствующих сайтов узнавания для получения и применения индуцибельно стерильных трансгенных растений, промоторы этих зрелых микро-РНК применимы для управления экспрессией трансгена, для которого желательна специфическая экспрессия в репродуктивной ткани, например промотор miR166g применим для управления эндосперм-специфической экспрессией. Применимые для растений с индуцибвльной женской стерильностью miR гомолог Зрелая микро- РНК Сайт(ы) узнавания микро- РНК Паттерн экспрессии miR156j UGACAGAAGAGAGAGAGCACA (SEQ ГО NO. 2971 GUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ Ш NO. 298) Семяпочка/ раннее зерно GUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ ID NO. 299) UUGCUUAaJCUCUUCUGUCA (SEQ П) NO. 300) CCGOJCUCUCUCUUCUaUCA (SEQ ГО NO. 301) miR159c CUUGGAUUGAAGGGAGCUCCU (SEQ ГО NO. 302) UGGAGCUCCCUUCAUUCCAAU (SEQ ID NO. 303) Семяпочка! раннее зерно UCGAOUUCCCTJUCAUUCCAAU (SEQ ГО NO. 304) AUGAOCUCUCUUCAAACCAAA (SEQ П> NO, 305) UGGAGCUCCCUUCAUUCCAAG (SEQ Ш NO. 306) UAQAGCOUCCUUCAAACCAAA (SEQ ГО NO. 307) UOGAGCUCCAUUCGAUCCAAA (SEQ ГО NO. 308) AOCAGCUCCCUUCAAACCAAA (SEQ ID NO. 309) CAGAOCUCCCUUCACUCCAAU (SEQ Ш NO. 310) UGGAGCUCCCUUCACUCCAAU (SEQ ID NO. 311) UGGAGCUCCCUUCACUCCAAG (SEQ ID NO. 312) UGGAGCUCCCUUUAAUCCAAU (SEQ ID NO. 313) пиШббЬ UCGGACCAGGCUUCATJUCCCC {SEQTON0.314) UUGGGAUGAAOCCUGGUCCGG (SEQ ID NO. 31S) Эмбрион CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ГО NO. 316) CUGGAAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ID NO. 317) CCGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ID N0.31(c) raiRloSd UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC (SEQ Ш NO. 314) UUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ГО NO. 315) Эибриоч/нкя-почк CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ Ш NO. 316) CUGGAAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ П) NO. 317) CCGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ГО NO. 318) mfflJ67g UGAAGCUGCCAOCAUGAUCUG (SEQ Ш NO. 319) GAGAUCAGGCUGGCAGCUUGU (SEQ ID NO. 320) Энарслери UAGAUCAGGCUGGCAGCUUGU (SBQIDN0.321) AAGAUCAGGCUGOCAGCUUGU (SEQ ID NO. 332) Применимые для растений с индуцибельной мужской стерильностью miR гомолог Зрелая микро- РНК Сайт(ы) узнавания микро- РНК Паттерн экспрессии miR15ft UGACAGAAGAGAGUGAGCAC (SEQIDNO.323) GUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ Ш NO. 324) Пыльца CUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ ГО NO. 325) UUGCUUACUCUCUUCUGUCA (SEQ ГО NO. 326) CCGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ ID NO. 327) тШбОЪ-НЬ UGCOJGGCUCCCUGUAUGCCA {SEQ DD NO. 328) UGOCAUGCAOGGAOCCAGGCA (SEQ ГО NO. 329) Пыльца AGGAAUACAGGGAGCCAGGCA {SEQ ID NO. 330) GGGUUUACAGGGAGCCAGGCA (SEQ ГО NO. 331) AGGCAUACAGGGAGCCAGOCA (SEQ ID NO. 332) miR393a UCCAAAGGGAUCGCAUTJGAUCU (SEQ ГО NO. 333) AAACAAUGCGAUCCCUUUGGA (SEQ ID NO. 334) Пыльца AGACCAUGCGAUCCCUUUGGA (SEQ ГО NO. 335) GGUCAGAGCGAUCCCUUUGGC (SEQ Ш NO. 336) AGACAAUGCGAUCCCUUUGGA (SEQ B> NO. 337) mtR396a UUCCACA-GCOTUOrUGAACUG (SEQ Ш NO. 338) UCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA (SEQ Ш NO. 339) Пыльца CCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA (SEQ ID NO. 340) UCGUUCAAGAAAGCAUGUGGAA (SEQ ID NO. 341) ACGUUCAAGAAAGCUUGUGGAA (SEQ ID NO. 342) CCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA (SEQ ID NO. 343) Пример 7. Этот пример является неограничивающим примером методов создания конструкции рекомбинантной ДНК, применимой для получения индуцибельно стерильного трансгенного растения, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду; причём зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется нанесением гербицида на растение. Неограничивающий пример метода создания сайта узнавания микро-РНК для применения в такой конструкции рекомбинантной ДНК иллюстрируется в данном описании, причём растением является кукуруза, а белком, придающим толерантность к гербициду, является 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза; аналогичные методы применимы для других растений и с другими белками. Этот метод включает стадии: (а) селекции уникальной целевой последовательности по меньшей мере из 18 нуклеотидов, специ- фической к матричной РНК, кодирующей 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS). Один путь представляет собой поиск с помощью программы BLAST (например, в базах данных как кДНК кукуру- зы, так и геномной ДНК) с целью идентификации EPSPS ортологов и любых потенциальных пар для не- родственных генов, тем самым избегается случайный сайленсинг нецелевых последовательностей; (б) анализа матричной РНК на нежелательные последовательности (например, пары для последова- тельностей нецелевого вида, в особенности животных) и оценки в баллах каждого потенциального 19- мерного сегмента на содержание GC по шкале Рейнольдса (Reynolds score, см. Reynolds et al. (2004) Na- ture Biotechnol, 22: 326-330) и функциональную асимметрию, характеризующуюся отрицательной вели- чиной разницы свободной энергии ("AAG") (см. Khvorova et al. (2003) Cell., 115: 209-216). Предпочти- тельно выбирают 19-меры, имеющие все или большинство следующих характеристик: (1) баллы по Рей- нольдсу > 4, (2) содержание GC примерно от 40 примерно до 60%, (3) отрицательная величина AAG, (4) концевой аденозин, (5) отсутствие участков из 4 или более стоящих рядом одинаковых нуклеотидов; (6) расположение около 3' конца целевого гена. Предпочтительно несколько (3 или более) 19-меров выби- рают для тестирования; (в) определения обратного комплемента выбранных 19-меров для применения при получении син- тетической 21-мерной микро-РНК; дополнительный нуклеотид в положении 20 предпочтительно соот- ветствует (спарен с) выбранной целевой последовательности, а нуклеотид в положении 21 предпочти- тельно выбирают так, чтобы он был неспаренным, чтобы предупредить переход; (г) проверки синтетических микро-РНК, например, в анализе Nicotiana benthamiana на транзитор- ную экспрессию и целевую репрессию (подавление) микро-РНК; (д) клонирования наиболее эффективных микро-РНК в конструкцию для стабильной трансформа- ции кукурузы (см. разделы под заголовками "Получение и применение конструкций рекомбинантной ДНК" и "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений"). Пример 8. В этом примере описано получение индуцибельно стерильных трансгенных растений и их применение для получения гибридных семян. Конкретнее, в данном примере описано получение гибридных семян кукурузы из трансгенного родительского растения с индуцибельной мужской стерильностью и из трансгенного родительского растения с индуцибельной мужской стерильностью, причём стерильность индуцируется нанесением гербицида глифосата на родительские растения. Конструкции рекомбинантной ДНК создаются таким образом, чтобы транскрибироваться в (а) сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрес-сируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок (5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу), придающий толерантность к гербициду (глифосату); причём зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется нанесением гербицида на растение. Каждая конструкция рекомби-нантной ДНК включает последовательность, которая транскрибируется в матричную РНК (с которой считывается матричная РНК), кодирующую 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из Agrobacterium tumefaciens штамм СР4 ("EPSPS- СР4"), ATGCTTCACGGTGCAAGCAGCCGTCCAGCAACTGCTCGTAAGTCCTCTGGTCTTTCT GGAACCGTCCGTATTCCAGGTGACAAGTCTATCTCCCACAGGTCCTTCATGTTTGGA GGTCTCGCTAGCGGTGAAACTCGTATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATC AACACTGGTAAGGCTATGCAAGCTATGGGTGCCAGAATCCGTAAGGAAGGTGATAC TTGGATCATTGATGGTGTTGGTAACGGTGGACTCCTTGCTCCTGAGGCTCCTCTCGA TTTCGGTAACGCTGCAACTGGTTGCCGTTTGACTATGGGTCTTGTTGGTGTTTACGAT TTCGATAGCACTTTCATTGGTGACGCTTCTCTCACTAAGCGTCCAATGGGTCGTGTG TTGAACCCACTTCGCGAAATGGGTGTGCAGGTGAAGTCTGAAGACGGTGATCGTCT TCCAGTTACCTTGCGTGGACCAAAGACTCCAACGCCAATCACCTACAGGGTACCTAT GGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCAACACCCCAGGTAT CACCACTGTTATCGAGCCAATCATGACTCGTGACCACACTGAAAAGATGCTTCAAG GTTTTGGTGCTAACCTTACCGTTGAGACTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATCCGTC TTGAAGGTCGTGGTAAGCTCACCGGTCAAGTGATTGATGTTCCAGGTGATCCATCCT CTACTGCTTTCCCATTGGTTGCTGCCTTGCTTGTTCCAGGTTCCGACGTCACCATCCT TAACGTTTTGATGAACCCAACCCGTACTGGTCTCATCTTGACTCTGCAGGAAATGGG TGCCGACATCGAAGTGATCAACCCACGTCTTGCTGGTGGAGAAGACGTGGCTGACT TGCGTGTTCGTTCTTCTACTTTGAAGGGTGTTACTGTTCCAGAAGACCGTGCTCCTTC TATGATCGACGAGTATCCAATTCTCGCTGTTGCAGCTGCATTCGCTGAAGGTGCTAC CGTTATGAACGGTTTGGAAGAACTCCGTGTTAAGGAAAGCGACCGTCTTTCTGCTGT CGCAAACGGTCTCAAGCTCAACGGTGTTGATTGCGATGAAGGTGAGACTTCTCTCGT CGTGCGTGGTCGTCCTGACGGTAAGGGTCTCGGTAACGCTTCTGGAGCAGCTGTCGC TACCCACCTCGATCACCGTATCGCTATGAGCTTCCTCGTTATGGGTCTCGTTTCTGAA AACCCTGTTACTGTTGATGATGCTACTATGATCGCTACTAGCTTCCCAGAGTTCATG GATTTGATGGCTGGTCTTGGAGCTAAGATCGAACTCTCCGACACTAAGGCTGCTTGA (SEQ ID NO. 344). Для удобства клонирования каждая конструкция рекомбинантной ДНК включает также спейсерную последовательность 3' нетранслируемой области (3' UTR), расположенную между матричной РНК и терминатором, TgagctcAAGAATTCGAGCTCGGTGTACCggatccTCTAGCTAG (SEQ ID NO. 345), с сайтами рестрикции SacI и BamHI, показанными строчными буквами), что делает возможной инсерцию сайта узнавания микро-РНК между сайтами рестрикции SacI и BamHI. Конструкция рекомбинантной ДНК для индуцибельной мужской стерильности включает последовательность TgagctcAAGAATTCGAAGACAATGCGATCCCUUUGGAGCTCGGTACCggatccTCTAG CTAG (SEQ ID NO. 346, с сайтами рестрикции SacI и BamHI, показанными строчными буквами), которая содержит синтетический сайт узнавания микро-РНК (подчёркнут), созданный так, чтобы его распознавала miR393, которая с высоким уровнем экспрессируется в пыльце (см. пример 6) и является членом сравнительного малого семейства микро-РНК (что уменьшает возможность того, что другие члены того же самого семейства микро-РНК будут подавлять EPSPS-CP4 в тканях, отличных от пыльцы). Конструкция рекомбинантной ДНК для индуцибельной женской стерильности включает последовательность TgagctcAAGAATTCGATCCGCTTTCTCTCTTCTGTCAGCTCGGTACCggatccTCTAGCTAG (SEQ ID NO. 347, с сайтами рестрикции SacI и BamHI, показанными строчными буквами), которая содержит синтетический сайт узнавания микро-РНК (подчёркнут), созданный так, чтобы его распознавала miR156j, которая с высоким уровнем экспрессируется в семяпочке и раннем зерне (см. пример 6). Этот сайт узнавания микро-РНК включает уникальное основание в положении 14, которое предпочтительно может соответствовать (пара) целевой последовательности с целью повышения специфичности узнавания miR156j. Спаривание с 3' концом микро-РНК уменьшается (относительно эндогенных мишеней), повышая специфичности узнавания miR156j. Это уменьшает вероятность того, что другие члены семейства miR156 будут подавлять EPSPS-CP4 в тканях, отличных от семяпочки и раннего зерна. Каждую из двух конструкций рекомбинантной ДНК (индуцибельной мужской стерильности и ин-дуцибельной женской стерильности) по отдельности трансформируют в кукурузу, как описано в разделе под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений". Коротко говоря, вектор для трансформации растения получают для каждой конструкции рекомбинант-ной ДНК, как описано в разделе под заголовком "Получение и применение конструкций рекомбинантной ДНК", и применяют для трансформации растительной ткани кукурузы, используя опосредуемую Agro-bacterium трансформацию и селекцию с глифосатом. Трансгенные растения, полученные в результате каждого события трансгенной инсерции, выращивают до созревания и потомственные семена получают обычным самоопылением или скрещиванием (как описано в разделе под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений"). Потомственные семена включают другие рекомбинантные ДНК для придания дополнительных признаков (например, в случае трансформированных растений признаки, включающие устойчивость к гербицидам, устойчивость к вредителям, толерантность к прорастанию на холоде, толерантность к недостатку влаги и т.п.). Из этих потомственных семян выбирают трансгенные семена для выращивания в первое родительское растение (содержащее в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК для индуцибельной мужской стерильности) и трансгенные семена для выращивания во второе родительское растение (содержащее в своём геноме конструкцию рекомбинантной ДНК для индуцибельной женской стерильности). Делают смешанные посадки в поле при соотношении трансгенных семян кукурузы, имеющих конструкцию для индуцибельной мужской стерильности, к трансгенным семенам, имеющим конструкцию для индуцибельной женской стерильности примерно от 1:4 примерно до 1:10. Трансгенные семена кукурузы оставляют прорастать, при этом получают первые родительские растения, которые включают мужскую стерильность (т.е. родительские растения, которые должны опыляться), и вторые родительские растения с индуцибельной женской стерильностью (т.е. опыляющие родительские растения). На соответст-вующей(их) стадии(ях) развития растения на первое и второе родительские растения наносят гербицид глифосат, распыляя его в количестве, эффективно индуцирующем мужскую стерильность в первых родительских растениях и женскую стерильность во вторых родительских растениях. Семена, собранные в поле, являются гибридными семенами, полученными из семяпочек первого родительского растения, которые опылялись пыльцой второго родительского растения. Все материалы и способы, раскрываемые и заявляемые в данном описании, можно получать и использовать без лишних экспериментов, как указано в вышеприведённом раскрытии. Хотя материалы и способы по данному изобретению описаны в виде предпочтительных вариантов изобретения и иллюстрирующих примеров, специалисту в данной области техники ясно, что в материалы и способы можно вносить изменения, не отступая от изобретательского замысла, сущности и объёма изобретения. Полагаем, что все такие аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, соответствуют сущности, объёму и замыслу изобретения, определяемым прилагаемой формулой изобретения. accaggccct gaccctggcc aagtacttcc agggcgccat cgacggcagc accctgaggt 480 tcgacttcga gaaggcgtta cagatcgcca acgacatccc gcaggccgcg gtggtcaaca 540 ccctgaacca gaccgtccag caggggaccg tccaggtcag cgtcatgatc gacaagatcg 600 tggacatcat gaagaatgtc ctgtccatcg tgatagacaa caagaagttt tgggatcagg 660 tcacggctgc catcaccaac accttcacga acctgaacag ccaggagtcg gaggcctgga 720 tcttctatta caaggaggac gcccacaaga cgtcctacta ttacaacatc ctcttcgcca 780 tccaggacga agagacgggt ggcgtgatgg ccacgctgcc catcgccttc gacatcagtg 840 tggacatcga gaaggagaag gtcctgttcg tgaccatcaa ggacactgag aattacgccg 900 tcaccgtcaa ggcgatcaac gtggtccagg cactccagtc tagcagggat tctaaggtgg 960 ttgatgcgtt caaatcgcca cggcacttac cccggaagag gcataagatt tgctctaact 1020 cgtgatgact gctggatgca gaggtattat cgatgcgttt ggacgtatgc tcattcaggt 1080 tggagccaat ttggttgatg tgtgtgcgag ttcttgcgag tctgatgaga catctctgta 1140 ttgtgtttct ttccccagtg ttttctgtac ttgtgtaatc ggctaatcgc caacagattc 1200 ggcgatgaat aaatgagaaa taaattgttc tgattttgag tg 1242 <210> 177 <211> 956 <212> ДНК <213> Искуственная последовательность <220> <223> синтетическая конструкция <400> 177 acacgctgac aagctgactc tagcagatcc tctagaacca tcttccacac actcaagcca 60 cactattgga gaacacacag ggacaacaca ccataagatc caagggaggc ctccgccgcc 120 gccggtagaa gtgatcaacc atggccttct tcaaccgggt gatcaccctc acggtgccgt 180 cgtcagacgt ggtcaactac tcggagatct accaggtggc tcctcagtat gtcaaccagg 240 ccctgaccct ggccaagtac ttccagggcg ccatcgacgg cagcaccctg aggttcgact 300 tcgagaaggc gttacagatc gccaacgaca tcccgcaggc cgcggtggtc aacaccctga 360 accagaccgt ccagcagggg accgtccagg tcagcgtcat gatcgacaag atcgtggaca 420 tcatgaagaa tgtcctgtcc atcgtgatag acaacaagaa gttttgggat caggtcacgg 480 ctgccatcac caacaccttc acgaacctga acagccagga gtcggaggcc tggatcttct 540 attacaagga ggacgcccac aagacgtcct actattacaa catcctcttc gccatccagg 600 acgaagagac gggtggcgtg atggccacgc tgcccatcgc cttcgacatc agtgtggaca 660 tcgagaagga gaaggtcctg ttcgtgacca tcaaggacac tgagaattac gccgtcaccg 720 tcaaggcgat caacgtggtc caggcactcc agtctagcag ggattctaag gtggttgatg 780 cgttcaaatc gccacggcac ttaccccgga agaggcataa gatttgctct aactcgtgat 840 gaatgtacgt gccctgcttc tccatctgca tgcgtttgga cgtatgctca ttcaggttgg 900 agccaatttg gttgatgtgt gtgcgagttc ttgcgagtct gatgagacat ctctgt 956 <210> 178 <211> 22 <212> ДНК <213> Zea mays <400> 178 tgaagctgcc agcatgatct gc <210> 179 <211> 1683 <212> ДНК <213> Zea mays <400> 179 atgtattgct gatgacgctg tccatctgca tgcttttttc ctgacttgtg agaaccgtcg tggaggcacg cagtacgttt ctactggttg catgcatggg ctatcacatg tacaatgaaa ctgccaatta aatatattgc ttggagttcg acagagaaga cgtccctacc tatctgtctg cttcgaagac actgatagga ggttaccact tactcatgca ctagtgtagg gtcttatgtt tatatatata tatacacaaa tgcaggtggg ggaccccggc ccaagctata ggtaggcagt ggccactgtt gatgtaggct actgtagtaa acatcagtgt gtggattcag cgttatttga tacagttcgt agagaacact cgccttcttg tttttttgct gcaactttga gaaagataga 60 cgctgctatg gtgtatggtt gtgtgctgca gattttggat 120 acggacccct gcacacagta cgtgagacga tcgaggagga 180 tgttctcgat ctctgctaca gcatgtcatc ttaattaagc 240 tgaggattat tcatcgctaa gtttccatgt acgtagcata 300 taggcaaata gcctagacgt tcttctcatg acgaccatgt 360 aggtagtaaa cctcaagtac tgatagccat taattcttgg 420 tcgaaaagac atgtatagaa tactgatcgt ctgatcatat 480 tctctaccaa agtgggctac agtacgttag ctagctgtct 540 tgtttgatta caagtccaac ggaaccactt gactgcatac 600 agaaaaaaaa ttgcattttc aaattcgaac cccaagtcgt 660 cataaccagg tgggataaca aacatattaa tcgatctgca 720 agggctacac agattacaga tgcagtgcat agaacctaat 780 cctcccccgg tggacaataa aaaaaatcca gtttccaagc 840 ccagagcggt ggtcttgtca ctttcttact tccaaaacca 900 ggctggctgg ctcatgtgcc acagttgctg ttcgttatta 960 ggacgggcgc cagaatttca gatctcggta cgtatgctgt 1020 acaccgtaat aatgctctcc agcagattgt gaattgtgaa 1080 atttataatg cagacgttat gtttacatag tttagtttaa 1140 aatgggagat aagatagaag agatagaatg agtaattggc ttattgtgca aaacactgtt tttccatata gtggagtttt agatagcaaa tcgtgtatat ggtcgtgcaa atattatata aaatttgaaa taggagacac agttgataat tctacgctct actactagtt catcggatgc gttagcgtgc cactcctcat agtgcaatcc gtcagccgca cggctccagt ccactccagt agctccgaaa ggcttatcct tgcaacaaac atcgtacgaa aatggatcga aatgcaacaa ataaaaaagg gcatcaaaat г(tm) " mqc tm <210> 180 <211> 674 <212> ДНК <213> Zea mays <400> 180 acgtatgctg tgtggattca gcgttatttg aacaccgtaa tgaattgtga atacagttcg tagagaacac tatttataat gtttagttta aaatgggaga taagatagaa gagatagaat aatcgtgcat attattgtgc aaaacactgt ttttccatat gacgagagag cagatagcaa atcgtgtata tggtcgtgca gcaaaactcc gaaatttgaa ataggagaca cagttgataa cggcggactg cactactagt tcatcggatg cgttagcgtg ttgtacgtac tagtgcaatc cgtcagccgc acggctccag gcgtcacctc cagctccgaa aggcttatcc ttgcaacaaa ggacaaaaga aaatggatcg aaatgcaaca aataaaaaag gtgagcgaga cgttggcctc cccatcccat atatatatag ttcaattcat tcct <210> 181 <211> 6 <212> ДНК <213> Искуственная последовательность <220> <223> синтетическая конструкция <400> 181 tgtctc <210> 182 <211> 768 <212> ДНК <213> Zea mays <400> 182 tcagcgttat ttgaacaccg taaagcctct ccggcagatt gtgaatacac agttgtggag 60 aacgctattt ataacgcaga cactatttat aatgcagatg tgtaaaagtg aaatttaaaa 120 tagtagatga gataggagag atagaatgag taaactgctg gagagcaaat cgtgcatatg 180 atcgtgcaaa acaccgtttt tcgtagagtg aagtttaaaa tagcaggtga gagagtagat 240 aggatgagta agctgatgga gagcaaatat tgtatatacg tggtcggtgc aatagagtga 300 aatttgaaat aactgacaca gttttggtgc gtggaaatag acgaggataa ttctagtgca 360 atccgcactg ccagtggacc ccgcccgacg ataattctac gcacgggcgg cgcactgcac 420 tactagttca tcgatcggat gcgttagcgt gcccctcctc atattgtttc cttgtacgta 480 ctagtgcaat ccgtcagccg cacggctcca gtccactcca gtccagcaac agcgtcacct 540 ccagctccga aaggcttatc cttgcaacaa acatcgtacg aaaaaggcgc aggaaaarga 600 aaagtgtcga aatacgacat aaaaaaagca tcaaaatacg ctgcgagtga gygagacatt 660 ggcctcccca tcccatatat atatagctat agctayccct cggttcttca attcatctat 720 cccccgctct ctccatctct ctaccctttc tctctctcgg atagctag 768 <210> 183 <211> 674 <212> ДНК <213> Zea mays <400> 183 tttgaaataa ctgacacagt tttggtgcgt ggaaatagac gaggataatt ctagtgcaat 60 ccgcactgcc agtggacccc gcccgacgat aattctacgc acgggcggcg cactgcacta 120 ctagttcatc gatcggatgc gttagcgtgc ccctcctcat attgtttcct tgtacgtact 180 agtgcaatcc gtcagccgca cggctccagt ccactccagt ccagcaacag cgtcacctcc 240 agctccgaaa ggcttatcct tgcaacaaac atcgtacgaa aaaggcgcag gaaaargaaa 300 agtgtcgaaa tacgacataa aaaaagcatc aaaatacgct gcgagtgagy gagacattgg 360 cctccccatc ccatatatat atagctatag ctayccctcg gttcttc 407 ggcguagauc cccacaacag <210> 192 <211> 434 <212> РНК <213> Glycine max <400> 192 aacacuaggg uuugcauucc uccuuuagcc gcaacccaua uucuaagcuu ccuuucuccu 60 acuguucugu gucgggccag caaaacuguu gcggguaucu uugccucuga aggaaaguug 120 ugccuauuau uauggcuuau ugcuuuagug gcguagaucc ccacaacagu uaugcuugca 180 cugccuuuug ucuccgagac uaacaaauuu gauuguaugu ucucuuguug cuaaacuuuu 240 gauuuugacc cgaacugcau gaggcaugaa aguuucauag ugguucaacc acaguaaaau 300 aggaugguca guuuaugucu ggguuuuaua agaauuuuua gaucugucuu gauuacugga 360 ccauuggaug aacacccugu ugguguugaa aaaguagcuu cagccuucug gaugugguua 420 ugagcuuucg augc 434 <210> 193 <211> 21 <212> РНК <213> Glycine max <400> 193 ugcgaguguc uucgccucug a <210> 194 <211> 21 <212> РНК <213> Glycine max <400> 194 ggaggcguag auacucacac с <210> 195 <211> 439 <212> ДНК <213> Glycine max <400> 195 aattagggtt ctctggtcct cccgcccccg gtgctggcat tctcaagcca gtgaaatcgg tgcgagtgtc ttcgcctctg agagagatac tatgagatct caagcctcgg aggcgtagat actcacacct ctttttctgg ctatctcacc actgctcttt tccgccgggg cacgaaggtc cttcgcctca ccaaatttcg ttctttaaat ttcacctata tatgtgtata tttttaataa taataattag gtttaaaggg aaaaaaagtc gcttcttaat cctttattca ttgtatgcag aacgatttga ttcgtgatga taatgtatgg atctgtatag tcggttgctc tagtatccaa taatttgatt tctaacaaat taatatgtag tggccttctt ggacatgaaa aaaatJcttg aaattgggtt gttaggtta 180 240 300 360 420 439 <210> 196 <211> 22 <212> РНК <213> Glycine max <400> 196 uugccgauuc cacccauucc ua <212> РНК <213> Glycine max <400> 197 gcugcucauc uguucucagg <210> 198 <211> 495 <212> ДНК <213> Glycine max <400> 198 gactagatgt gaatgtgatt catattcata gagagagaaa gggaaaggga gaagagcttg aggaagtgat gggagatggg agggtcggta aagaatatat ctgagactcg actcaatctc gatctctctc agtgttgtgt tgttttgttt atccttttgc cgattccacc cattcctatg atttccttcg gttcctctct ttccactctc ctctccgctc tttcctcttg ttatggtaag cacctttctt cttcagatct gctctttata ccatacactt attatagatc taagttttta tggaccttaa ctatcttcct tgatctctta ttaattttaa ccgctctctc tttgttgctg gacatgttac ttcaagataa caaattgctt ttttattttt catcttttct ctcgttctct tgtttaaggt ttctataaat catcgatgag atacctataa taatatactt attacagaca 120 180 240 300 360 420 <210> 199 <211> 825 <212> ДНК tccgacgtca ccatccttaa cgttttgatg aacccaaccc gtactggtct catcttgact 840 ctgcaggaaa tgggtgccga catcgaagtg atcaacccac gtcttgctgg tggagaagac 900 gtggctgact tgcgtgttcg ttcttctact ttgaagggtg ttactgttcc agaagaccgt 960 gctccttcta tgatcgacga gtatccaatt ctcgctgttg cagctgcatt cgctgaaggt 102 gctaccgtta tgaacggttt ggaagaactc cgtgttaagg aaagcgaccg tctttctgct 108 gtcgcaaacg gtctcaagct caacggtgtt gattgcgatg aaggtgagac ttctctcgtc 114 gtgcgtggtc gtcctgacgg taagggtctc ggtaacgctt ctggagcagc tgtcgctacc 120 cacctcgatc accgtatcgc tatgagcttc ctcgttatgg gtctcgtttc tgaaaaccct 126 gttactgttg atgatgctac tatgatcgct actagcttcc cagagttcat ggatttgatg 132 gctggtcttg gagctaagat cgaactctcc gacactaagg ctgcttga 136 <210> 345 <211> 42 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220> <223> синтетическая конструкция <400> 345 tgagctcaag aattcgagct cggtaccgga tcctctagct ag 42 <210> 346 <211> 63 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220> <223> синтетическая конструкция <400> 346 tgagctcaag aattcgaaga caatgcgatc ccuuuggagc tcggtaccgg atcctctagc 60 tag 63 <210> 347 <211> 63 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220> <223> синтетическая конструкция <400> 347 tgagctcaag aattcgatcc gctttctctc ttctgtcagc tcggtaccgg atcctctagc 60 tag 63 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Конструкция рекомбинантной ДНК для индуцирования стерильности в трансгенном растении, которое экспрессирует указанную рекомбинантную конструкцию ДНК, где указанная рекомбинантная конструкция ДНК содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК, содержащую: (a) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый эндогенной зрелой мкРНК, которая специфически экспрессируется либо в мужской репродуктивной ткани, либо в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения; и (b) матричную РНК, кодирующую белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, где экспрессия указанной эндогенной зрелой мкРНК супрессирует экспрессию указанного белка либо в мужской репродуктивной ткани, либо женской репродуктивной ткани, таким образом индуцируя стерильность в указанном трансгенном растении при нанесении на него указанного гербицида. 2. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 3. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 4. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК расположен, по меньшей мере, в пределах одной из следующих областей: (a) 5'-нетранслируемой области указанной матричной РНК; (b) 3'-нетранслируемой области указанной матричной РНК и (c) кодирующей области указанной матричной РНК. 5. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК представляет собой по меньшей мере одну мкРНК, выбранную из группы, состоящей из miR156, raiR157, miR159, miR160, miR161, miR162, raiR163, miR164, miR165, miR166, miR167, miR16S, miR169, miR170, raiRX7i, miR172, miR173, miR319, miR390, miR393, TAS3 5'D7( + ), miR394, miR395, miR396, miR397, raiR398, miR399, miR403, miR408, miR447, TAS3, TAS1, TAS2, miR156j, miR159c, miR166b, miRl66d, miRX67g, miR156i, miR160b-like, miR393a, miR396a, или где указанная эндогенная зрелая мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:184, 187, 190, 193, 196, 297, 302, 314, 319, 323, 328, 333, 338. 6. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный экзогенный участок распознавания мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19, 20-175, 185, 188, 191, 194, 197, 200-296, 298-301, 303-313, 315-318, 320-322, 324-327, 329-332, 334-337 и 339-343. 7. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный промотор представляет собой конститутивный промотор. 8. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной кар-боксилазы ацетил-кофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпи-руватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигена-зы. 9. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный гербицид выбран из группы, состоящей из глифосата, дикамбы, глуфосината, сульфонилкарбамидов, имидазолинонов, бромоксинила, 2,2-дихлорпропионовой кислоты, ингибиторов ацетолактатсинтазы, циклогександиона, арилоксифенокси-пропионата, сульфонамидных гербицидов, триазиновых гербицидов, 5-метилтриптофана, аминоэтилци-стеина, пиридазиноновых гербицидов, циклопропилизоксазоловых гербицидов, ингибиторов протопор-фириногеноксидазы и гербицидов, содержащих арилоксиалканоатную группу. 10. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.8, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу. 11. Индуцибельно стерильное трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию рекомбинат-ной ДНК по п.1, где стерильность указанного трансгенного растения индуцируется нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение. 12. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 13. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 14. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, выбранное из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, хлопка и сои. 15. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.12, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу. 16. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.15, где (а) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR393, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens СР4, или (b) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR156j, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, или (с) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR395, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefa- ciens CP4. 17. Способ получения гибридных семян из индуцибельно стерильного трансгенного растения по п.11, причем (а) эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени, или (b) указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где женская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее женской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени. 18. Способ по п.17, где указанное индуцибильно стерильное трансгенное растение и указанное нормально фертильное растение представляют собой (а) растения кукурузы, (b) растения сои, (с) растения хлопка или (d) растения пшеницы. 19. Способ по п.17, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением глифосата на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением с получением гибридного семени. 20. Способ индуцирования стерильности трансгенного растения, экспрессирующего конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, включающий нанесение гербицида на трансгенное растение, причем указанный гербицид наносят в количестве, достаточном для индуцирования стерильности в указанном трансгенном растении. 21. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность. 22. Обладающее мужской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.21. 23. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность. 24. Обладающее женской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.23. 25. Способ по п.20, где указанный гербицид представляет собой системный гербицид. 26. Способ по п.20, где белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетилкофермента А, дигид-роптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидро-дипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы. 27. Способ по п.20, где указанное трансгенное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сои, хлопка и пшеницы. 18. 18. 651 TGGQATCAGGTCACQGCTGCсATcACcAAcACCTTC ACGAAcCTGAACag 700 189 WDQVTAAITHT7TNLNS 205 701 cCAgGAgTCgGAGgccTGGATCTTCTATTAcAAgGAgGACGCCCACAAQA 750 206 Q E S E A W I FYYKEDAHKT 222 751 CGTCcTAcTAt TAcAACATC СТСТГС G С с АТС С AGGACGAAGAGACGGG t 800 223 SYYYMILFAXQDEETG 238 8Q1 GGcSiraTGGCcACgcrTOCCCATC^^ 850 239 GVMATLP3APDISVDIE 255 851 GAAgGAgAAgGTCCTGTTCQTgACcATOAAGGACACTCAGAATTACGCCG 900 256 KEKVLFVTJKDTENYAV272 901 TCACCQTCAAGOC^TCJiACGTGQTcCAGeC^C^ 950 273 TVKATUVVQALQSSRD 28B 951 TCTAAGGTGGTTGATG^^TTCAAATCtjCC aCGGCACTTACCCCGGAAQAG 1000 289 SKVVDAFKSPRHLPRKR305 1001 GC ATAMATTTGCTCTAACTCGtgatgAc ЬдвТввАТбСЫШЗОТКПОТ 1050 306 HKICSMS** HHipo-PHK1S2 сайта 1051 COfctgcfiftttSflacgtAtgctcattcaggttggagccoatttggttgatg 1100 1101 tg-tgtgcgagttcttgcgagtccgattjag-acatctctgtattgtgtttct 1150 1151 tteeccagtgttttctgtacttgtgtaatcggctaa.tcgccaaeae*tte 1200 1201 ggcgatgaataaatgagaaataaattgttctgattttgagtg 1242 - i 1 1 1 -i Фиг. 4 1 1.. i 1 1 1 ACACGCTGAcaagatGACTCTAGcapatCctctagaaccatcttccacac 50 51 actcaagccacactattggagaacacacagggacaacacaccBtaaGATC 100 101 CAAGGGAGGCOTCCGCCGCCGCCGGTAQAA <^3ATCAACcATGgccTTCT 150 M A F P 6 4750 п.о. Фиг. 7 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2 023885 023885 - 1 - - 1 - (19) 023885 023885 - 1 - - 1 - (19) 023885 023885 - 1 - - 1 - (19) 023885 023885 - 2 - - 1 - (19) 023885 023885 - 1 - - 1 - (19) 023885 023885 - 4 - - 3 - 023885 023885 023885 023885 - 28 - - 28 - 023885 Таблица 1 023885 - 39 - - 38 - 023885 Таблица 2 023885 Таблица 2 - 41 - - 41 - 023885 023885 - 42 - - 42 - 023885 023885 - 44 - - 44 - 023885 023885 Таблица 5 - 47 - - 48 - 023885 023885 Таблица 5 - 47 - - 48 - 023885 023885 Таблица 5 - 49 - - 48 - 023885 Таблица 6 023885 - 51 - - 50 - 023885 Таблица 6 023885 - 51 - - 50 - 023885 Таблица 6 023885 - 51 - - 52 - 023885 023885 - 53 - - 53 - 023885 023885 - 55 - - 55 - 023885 023885 - 71 - - 71 - 023885 023885 - 71 - - 71 - 023885 023885 - 87 - - 87 - 023885 023885 - 90 - - 90 - 023885 023885 - 91 - - 91 - 023885 023885 - 91 - - 91 - 023885 023885 - 92 - - 92 - 023885 023885 - 93 - - 93 -
|