|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ синтеза оптически чистого соединения формулы (I)  путем энантиоселективного ферментативного гидролиза рацемического, или не оптически чистого, нитрила формулы (IV)  с применением нитрилазы Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216, которая сверхэкспрессируется в другом организме, имеющем компетентную биологическую систему, в смеси органического растворителя и водного раствора, имеющего рН от 5 до 10, при концентрации от 1 до 500 г нитрила формулы (IV) на 1 л смеси растворителей, при соотношении фермент/субстрат (Ф/С) от 1/1 до 1/100, при температуре от 25 до 40°С. 2. Способ по п.1, причем организм, имеющий компетентную биологическую систему, представляет собой бактерию, содержащую перестроенную плазмиду. 3. Способ по п.2, причем бактерии, которые сверхэкспрессируют нитрилазу, применяют непосредственно в виде бактериальной взвеси или лиофилизата. 4. Способ по любому из пп.1-3, причем органический растворитель выбран из диметилсульфоксида, ДМФ, ацетона, ацетонитрила, этанола, изопропанола, ТГФ и метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ). 5. Способ синтеза по любому из пп.1-4, при котором нитрил конфигурации (R), вторичный продукт реакции  рацемизируют путем воздействия основания, чтобы образовать рацемический нитрил формулы (IV), с целью переработки в процессе ферментативного гидролиза. 6. Способ синтеза по п.5, причем основание представляет собой диазабициклоундецен (ДБУ). 7. Способ синтеза или по п.5 или 6, причем стадию рацемизации осуществляют in situ. 8. Способ синтеза по любому из пп.5-7, причем кислоту формулы (I) выделяют после одного или нескольких циклов гидролиза. 9. Способ синтеза соединения формулы (III)  исходя из нитрила формулы (IV)  который гидролизуют, чтобы образовать оптически чистую кислоту формулы (I)  в соответствии с любым из пп.1-8, которую затем превращают в оптически чистый амид формулы (XI)  восстановление которого обеспечивает соединение формулы (III). 10. Способ синтеза по п.9, при котором восстановление соединения формулы (XI), чтобы образовать соединение формулы (III), осуществляют с помощью ВН 3 , NaBH 4 или LiAlH 4 . 11. Способ синтеза солей присоединения ивабрадина с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль представлена в безводной или гидратированной форме, при котором соединение формулы (III) в соответствии с п.9 или 10 впоследствии сочетают с соединением формулы (XII)  в которой X представляет собой атом галогена, с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой в безводной или гидратированной форме. 12. Способ синтеза по п.11, причем X представляет собой атом йода. 13. Способ синтеза солей присоединения ивабрадина с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль представлена в безводной или гидратированной форме, при котором соединение формулы (III) в соответствии с п.9 или 10 впоследствии подвергают реакции восстановительного аминирования с соединением формулы (XIII) в присутствии восстанавливающего средства  в которой R 2 представляет собой группу, выбранную из СНО и CHR 3 R 4 , в которой R 3 и R 4 , каждый, представляют собой линейную или разветвленную (C 1 -C 6 )алкоксигруппу, или образуют совместно с атомом углерода, который их несет, 1,3-диоксановое, 1,3-диоксолановое или 1,3-диоксепановое кольцо с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой в безводной или гидратированной форме. 14. Способ синтеза по п.13, причем соединение формулы (III) применяют в реакции восстановительного аминирования в виде его гидрохлорида с получением ивабрадина в виде гидрохлорида. 15. Способ синтеза по п.10 или 14, причем реакцию восстановительного аминирования с соединением формулы (XIII) осуществляют в присутствии водорода при катализе палладием на угле.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ синтеза оптически чистого соединения формулы (I) путем энантиоселективного ферментативного гидролиза рацемического, или не оптически чистого, нитрила формулы (IV) с применением нитрилазы Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216, которая сверхэкспрессируется в другом организме, имеющем компетентную биологическую систему, в смеси органического растворителя и водного раствора, имеющего рН от 5 до 10, при концентрации от 1 до 500 г нитрила формулы (IV) на 1 л смеси растворителей, при соотношении фермент/субстрат (Ф/С) от 1/1 до 1/100, при температуре от 25 до 40°С. 2. Способ по п.1, причем организм, имеющий компетентную биологическую систему, представляет собой бактерию, содержащую перестроенную плазмиду. 3. Способ по п.2, причем бактерии, которые сверхэкспрессируют нитрилазу, применяют непосредственно в виде бактериальной взвеси или лиофилизата. 4. Способ по любому из пп.1-3, причем органический растворитель выбран из диметилсульфоксида, ДМФ, ацетона, ацетонитрила, этанола, изопропанола, ТГФ и метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ). 5. Способ синтеза по любому из пп.1-4, при котором нитрил конфигурации (R), вторичный продукт реакции рацемизируют путем воздействия основания, чтобы образовать рацемический нитрил формулы (IV), с целью переработки в процессе ферментативного гидролиза. 6. Способ синтеза по п.5, причем основание представляет собой диазабициклоундецен (ДБУ). 7. Способ синтеза или по п.5 или 6, причем стадию рацемизации осуществляют in situ. 8. Способ синтеза по любому из пп.5-7, причем кислоту формулы (I) выделяют после одного или нескольких циклов гидролиза. 9. Способ синтеза соединения формулы (III) исходя из нитрила формулы (IV) который гидролизуют, чтобы образовать оптически чистую кислоту формулы (I) в соответствии с любым из пп.1-8, которую затем превращают в оптически чистый амид формулы (XI) восстановление которого обеспечивает соединение формулы (III). 10. Способ синтеза по п.9, при котором восстановление соединения формулы (XI), чтобы образовать соединение формулы (III), осуществляют с помощью ВН 3 , NaBH 4 или LiAlH 4 . 11. Способ синтеза солей присоединения ивабрадина с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль представлена в безводной или гидратированной форме, при котором соединение формулы (III) в соответствии с п.9 или 10 впоследствии сочетают с соединением формулы (XII) в которой X представляет собой атом галогена, с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой в безводной или гидратированной форме. 12. Способ синтеза по п.11, причем X представляет собой атом йода. 13. Способ синтеза солей присоединения ивабрадина с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль представлена в безводной или гидратированной форме, при котором соединение формулы (III) в соответствии с п.9 или 10 впоследствии подвергают реакции восстановительного аминирования с соединением формулы (XIII) в присутствии восстанавливающего средства в которой R 2 представляет собой группу, выбранную из СНО и CHR 3 R 4 , в которой R 3 и R 4 , каждый, представляют собой линейную или разветвленную (C 1 -C 6 )алкоксигруппу, или образуют совместно с атомом углерода, который их несет, 1,3-диоксановое, 1,3-диоксолановое или 1,3-диоксепановое кольцо с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой в безводной или гидратированной форме. 14. Способ синтеза по п.13, причем соединение формулы (III) применяют в реакции восстановительного аминирования в виде его гидрохлорида с получением ивабрадина в виде гидрохлорида. 15. Способ синтеза по п.10 или 14, причем реакцию восстановительного аминирования с соединением формулы (XIII) осуществляют в присутствии водорода при катализе палладием на угле.
Евразийское 023883 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201400171
(22) Дата подачи заявки
2014.02.27
(51) Int. Cl.
C07C 62/34 (2006.01) C07C 51/08 (2006.01) C07C 217/74 (2006.01)
C07C 213/02 (2006.01) C07C 217/56 (2006.01)
C07D 223/16 (2006.01) C07B 57/00 (2006.01) C12P 7/40 (2006.01) C12P 7/42 (2006.01)
(54) СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА (78)-3,4-ДИМЕТОКСИБИЦИКЛО[4.2.0] ОКТА-1,3,5-ТРИЕН-7-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПРИМЕНЕНИЕ В СИНТЕЗЕ ИВАБРАДИНА И ЕГО СОЛЕЙ
(31) 13/51785
(32) 2013.02.28
(33) FR
(43) 2014.08.29
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЛЕ ЛАБОРАТУАР СЕРВЬЕ (FR)
(72) Изобретатель:
Педрагоза-Моро Сандрин, Лефулон
Франсуа (FR)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(56) CN-A-102249937 CN-A-101671265 WO-A1-2011138625 CN-A-101284813 WO-A1-2010023383
(57) Способ ферментативного синтеза соединения формулы (I)
Применение в синтезе ивабрадина и его солей присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой.
Настоящее изобретение относится к способу ферментативного синтеза соединения формулы (I)
(ID,
или 3-{3-[{[(78)-3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-ил]метил}(метил)амино]пропил}-7,8-диметокси-1,3,4,5-тетрагидро-2Н-3-бензазепин-2-она, его солей присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой и их гидратов.
Ивабрадин и его соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой и, в особенности, его гидрохлорид обладают весьма ценными фармакологическими и терапевтическими свойствами, в особенности брадикардическими свойствами, которые делают эти соединения пригодными для лечения или профилактики различных клинических состояний ишемии миокарда, таких как стенокардия, инфаркт миокарда и ассоциированные нарушения ритма, а также различных патологий, связанных с нарушением ритма, в частности суправентрикулярных нарушений ритма и сердечной недостаточности.
Получение и терапевтическое применение ивабрадина и его солей присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой и, в особенности, его гидрохлорида были описаны в описании к европейскому патенту ЕР 0534859.
Это патентное описание раскрывает синтез гидрохлорида ивабрадина исходя из соединения формулы (III), (78)-1-(3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-ил) N-метилметанамин
Соединение формулы (III) является ключевым промежуточным соединением в синтезе ивабрадина и его фармацевтически приемлемых солей.
В уровне техники описаны несколько способов получения соединения формулы (III).
В описании к патенту ЕР 0534859 описан синтез соединения формулы (III) путем восстановления нитрила формулы (IV)
(IV)
с помощью ВН3 в тетрагидрофуране, с последующим добавлением соляной кислоты, получая гидрохлорид рацемического амина формулы (V)
при восстановлении которого с помощью LiAlFH4 получают рацемический метилированный амин формулы (VII)
Недостатком этого способа является получение соединения формулы (III) только с очень низким выходом от 2 до 3%, исходя из рацемического нитрила формулы (IV).
Этот чрезвычайно низкий выход обусловлен низким выходом (4-5%) стадии растворения вторичного амина формулы (VII).
В описании к патенту ЕР 2166004 описано получение соединения формулы (III) путем оптического разделения рацемического нитрила формулы (IV) с применением хиральной хроматографии с получением оптически чистого нитрила формулы (IX)
который восстанавливают с помощью NaBH4 или гидролитического водорода, получая первичный амин формулы (VIII).
Затем первичный амин может быть метилирован, используя ту же самую последовательность реакции, что описана выше (превращение в карбамат с последующим восстановлением).
Таким образом, соединение формулы (III) может быть получено в ходе 5 стадий, исходя из рацемического нитрила формулы (IV), с выходом в 45,6% для стадии разделения.
Применение гидролитических ферментов нитрилазы (ЕС 3.5.5.1 в международной классификации ферментов) казалось многообещающим для того, чтобы обеспечить получение оптически чистой кислоты формулы (I), непосредственно исходя из рацемического нитрила формулы (IV) и, таким образом, снизить количество стадий получения метилированного амина формулы (III), исходя из рацемического нитрила.
Нитрил формулы (X) был описан как субстрат нитрилаз из набора для скрининга NESK-1400, который выпускается компанией Almac
Тем не менее, применение тех же самых нитрилаз на нитриле формулы (IV) (см. сравнительный пример А) показало, что они имеют низкую активность с малой селективностью, что в большинстве случаев приводит к одновременному образованию амида (активность нитрилгидратазы) и кислоты, которую трудно использовать в целях синтеза для получения промежуточных продуктов в синтезе соединения формулы (III).
Соответственно задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы найти нитрилазу, обеспечивающую энантиоселективный синтез оптически чистой кислоты формулы (I), исходя из рацемического нитрила формулы (IV), при этом сводя к минимуму образование амида.
Затем заявителем было обнаружено доказательство активности нитрилазы в различных целых микроорганизмах с преимущественным образованием кислоты формулы (I), конфигурации S. Из протестированных микроорганизмов только Rhodococcus rhodocrous обеспечил получение (S) кислоты с очень хорошей энантиоселективностью, без образования амида (см. сравнительный пример В).
Эта активность была улучшена сверхэкспрессией нитрилазы.
Удивительно, что ферментативный гидролиз с применением этой сверхэкспрессированной нитри-лазы не является энантиоселективным для субстрата формулы (X) (см. сравнительный пример С).
с применением нитрилазы Rhodococcus rhodocrous NCIMB 11216, сверхэкспрессированной в другом организме, имеющем компетентную биологическую систему, таким как бактерия, дрожжи или гриб, в смеси органического растворителя и водного раствора, имеющего рН от 5 до 10, предпочтительно
В частности, настоящее изобретение относится к способу синтеза оптически чистого соединения формулы (I)
буфера, имеющего рН от 5 до 10,
при концентрации от 1 до 500 г/л, предпочтительно от 2 до 100 г нитрила формулы (IV) на 1 л смеси растворителей,
при соотношении Ф/С от 1/1 до 1/100,
при температуре от 25 до 40°С.
В соответствии с аспектом изобретения нитрилаза сверхэкспрессуется в бактерии, содержащей перестроенную плазмиду, такой как Escherichia coli, предпочтительно Е. coli BL21(DE3), E. coli BL21(DE3)pLysS, E. coli BL21star(DE3) или Е. coli JM9(DE3).
В соответствии с аспектом изобретения органический растворитель представляет собой растворитель, полностью или частично смешиваемый с водой, такой как диметилсульфоксид, ДМФ, ацетон, аце-тонитрил, спирт, такой как этанол или изопропанол, или простой эфир, такой как ТГФ или МТБЭ.
В соответствии с другим аспектом изобретения органический растворитель не является смешиваемым с водой, например, углеводород, такой как гептан или октан.
Водный раствор предпочтительно является буферным раствором, имеющим рН приблизительно 7.
В соответствии с аспектом изобретения бактерии, которые сверхэкспрессируют нитрилазу, применяют непосредственно в способе, в виде бактериальной взвеси или лиофилизата.
Соотношение Ф/С предпочтительно составляет от 1/1 до 1/10 в случае бактериальной взвеси и от 1/10 до 1/20 в случае лиофилизата.
В соответствии с другим аспектом изобретения нитрилазу применяют в виде очищенного фермента.
Схема ферментативного гидролиза согласно изобретению является следующей:
Преимущественно нитрил конфигурации (R), вторичный продукт реакции, рацемизируют путем реакции органического основания, такого как ДБУ, или минерального основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат калия или карбонат натрия, для того чтобы переработать в процессе ферментативного гидролиза.
Если стадию рацемизации осуществляют in situ, то способ согласно изобретению представляет собой процесс динамического кинетического разделения (ДКР), который способствует получению S кислоты формулы (I) с эи в более чем 98%.
Кислоту формулы (I) предпочтительно выделяют из реакционной среды после одного или нескольких циклов ферментативного гидролиза.
Определения.
Под оптически чистым соединением следует понимать соединение, имеющее энантиомерный избыток более чем или равный 90%.
Под нитрилом, который не является оптически чистым, следует понимать нитрил, имеющий энан-тиомерный избыток менее чем 90%.
Под рацемическим нитрилом следует понимать нитрил в виде смеси двух энантиомеров в соотношении от 55:45 до 45:55.
Энантиоселективный гидролиз рацемического, или не оптически чистого, нитрила следует понимать как предпочтительный гидролиз одного из энантиомеров смеси.
Компетентную биологическую систему следует понимать как такую, которая относится к (а) биологическим видам (клетки-хозяева), чей генетический материал был модифицирован путем генетической рекомбинации, делая ее/их способными продуцировать представляющий интерес рекомбинантный белок. Экспрессионный вектор (плазмида), сконструированный для этой цели, позволяет ДНК, кодирующую соответствующий ген, переносить в клетку-хозяин, которая таким образом может эффективно (сверх)экспрессировать функциональный белок.
Другой аспект изобретения относится к способу синтеза соединения формулы (III) только в две стадии, исходя из оптически чистой кислоты формулы (I), которую превращают в оптически чистый амид формулы (XI)
(XI),
восстановление которого предпочтительно с помощью ВН3, NaBH4 или LiAlH4 на выходе давало соединение формулы (III).
в которой R2 представляет собой группу, выбранную из СНО и CHR3R4,
в которой R3 и R4, каждый, представляет собой линейную или разветвленную (C1-С6)алкоксигруппу, или образуют вместе с атомом углерода, который их несет, 1,3-диоксановое, 1,3-диоксолановое или 1,3-диоксепановое кольцо с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль находится в безводной или гидратированной форме.
Соединение формулы (III) может также применяться в реакции восстановительного аминирования в виде его соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой, предпочтительно его гидрохлорида. В этом случае ивабрадин получают непосредственно в виде гидрохлорида.
В числе фармацевтически приемлемых кислот могут быть указаны, без какого-либо ограничения, хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, малеиновая кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, щавелевая кислота, метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота и камфорная кислота.
В числе восстанавливающих средств, которые можно использовать для реакции восстановительного аминирования между соединением формулы (III) и соединением формулы (XIII), могут быть указаны, без какого-либо ограничения, соединения гидридных доноров, такие как триацетоксиборогидрид натрия или цианоборогидрид натрия, водород в присутствии катализатора, такого как палладий, платина, никель, рутений, родий или их соединения, в особенности на подложке или в форме оксидов.
Предпочтительным восстанавливающим средством для реакции восстановительного аминирования между соединением формулы (III) и соединением формулы (XIII) является водород при катализе палладием на угле.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение. Аббревиатуры.
ТФУ - трифторуксусная кислота,
ТСХ - тонкослойная хроматография,
ДБУ - диазабициклоундецен,
ДКР - динамическое кинетическое разделение,
ДМФ диметилформамид,
ДМСО - диметилсульфоксид
ОП - оптическая плотность,
Е - коэффициент энантиоселективности,
эи - энантиомерный избыток,
экв. - молярный эквивалент,
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ИПТГ - изопропил p-D-1-тиогалактопиранозид, ЛБ - культуральная среда лизогенный бульон, МеОН - метанол,
МТБЭ - метил-трет-бутиловый эфир,
оп - оптическая или энантиомерная чистота,
Ф/С соотношение - соотношение фермент/субстрат, выраженное в г/г, ЯМР - ядерный магнитный резонанс (спектроскопия), МС - масс-спектрометрия, ТГФ - тетрагидрофуран, ТМС - тетраметилсилан.
Пример 1. (78)-3,4-Диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбоновая кислота. Сверхэкспрессия нитрилазы.
Белок нитрилазы Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 описан в базах данных белков и генов.
Последовательность искомого гена перечислена под идентификатором SVA (Sequence Version Archive) "EF467367" в ENA (Европейский нуклеотидный архив) от EMBL-Bank. Эта последовательность соответствует ссылке "A4LA85" в базе данных UniProtKB/TrEMBL.
Применяли продуцирующий штамм Е. coli BL21(DE3), трансформированный экспрессирующим вектором pET28a-Nit1.
Протокол сверхэкспрессии нитрилазы описан в Applied Biochemistry and Biotechnology 2010, т. 160(2), cc. 393-400.
Трансформированные таким образом клетки применяли или непосредственно в виде бактериальной взвеси, или лиофилизировали до применения.
Ферментативный гидролиз с применением сверхэкспрессированной нитрилазы.
Клетки, трансформированные согласно указанному выше протоколу, взбалтывали при концентрации в 5.6х109 клеток/мл (1 мл культуры при ОП=1 (600 нм) соответствует 1.109 бактерий и приблизительно 10 мг бактериальной взвеси или 1.5 мг лиофилизата).
К раствору 250 мл фосфатного буфера KH2PO4/Na2HPO4 1/15 М при рН 7 добавляли 1 г лиофилиза-та из Е. coli и 500 мг (с=2 г/л, 10 мМ) 3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрила в 2%
ДМСО (5 мл).
Реакционную смесь поддерживали при 30°С с ротационным взбалтыванием при 220 об/мин в течение 6 ч.
За реакцией наблюдали посредством хирально-фазовой ВЭЖХ при условиях, допускающих определение энантиомерного избытка кислоты и нитрила: Chiralpak IB колонка 90% н-гексан 10% 2-PrOH +0.1% ТФУ
1 мл/мин 30°С 288 нм
% нитрила
эи (нитрил)
% кислота
(кислота)
превращение
6 часов
49,9
50,1
0,49
> 100
* коэффициент энантиоселективности Е = ln[1-с(1+эи(кислота))]/ln[1-с(1-эи(кислота))]. Хроматограмма хирально-фазовой ВЭЖХ через 6 ч показана на фиг. 1.
После взаимодействия в течение 6 ч реакционную смесь подкисляли с помощью 1М HCl для того, чтобы получить сильнокислый рН (рН 2) и затем экстрагировали посредством 2х 100 мл дихлорметана. Органическую фазу сливали. Вторая экстракция с применением толуола (2х100 мл) дает возможность восстановить весь продукт оставшийся в водной фазе. Органические фазы промывали насыщенным раствором NaCl и затем высушивали, используя безводный сульфат магния. После выпаривания растворителей получали сырой продукт, который очищали флеш-хроматографией на силикагелевой колонке при следующих условиях:
Тип колонки: 80 g SiOH Macherey-Nagel.
Вещество и способ: Reveleris(r).
Элюант: изократический (циклогексан + 1% уксусная кислота/этилацетат + 1% уксусная кислота
75/25).
Определение: УФ 288 нм. Скорость потока: 60 мл/мин. Результат:
нитрил (R): выход 36% (179 мг), эи (R): 96%, кислота (S): выход 39% (246 мг), эи (S): 96%.
Пример 2. 3,4-Диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрил посредством рацемизации (R) нитрила.
Перенос 100 мг (R)-(3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-ил)нитрила (0,53 ммоль), 5 мл изопропанола и 121 мг ДБУ (1,5 экв.) в колбу, оснащенную конденсатором и магнитной мешалкой. Нагревание в течение 2 ч при 65°С и затем доведение до температуры окружающей среды. Фильтрование с получением соединения, указанного в заголовке.
Пример 3. (7S)-3,4-Диметокси-N-метилбицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбоксамид.
Суспендировали (7S)-3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбоновую кислоту, полученную в примере 1 (300 мг) в ТГФ (3 мл) при температуре окружающей среды, и затем добавляли три-этиламин (200 мкл). К смеси медленно добавляли этилхлорформиат (150 мкл). Реакционную смесь осаждали (смесь I).
В другой колбе метиламин в виде 2М раствора в ТГФ (2,25 мл) взбалтывали с водой (1 мл) и три-этиламином (300 мкл). Взбалтывание поддерживали в течение 20 мин и затем полученную смесь добавляли к смеси I и взбалтывали при температуре окружающей среды в течение ночи.
Затем реакционную смесь выпаривали и очищали препаративной ВЭЖХ.
(7S)-3,4-Диметокси-N-метилбицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбоксамид получали с выходом в
1Н ЯМР (ДМСО-d6, ч. на млн/ТМС) = 2.61 (m; 3H); 3.16 (m; 2Н); 3.71 (s; 6Н); 4.05 (m; 1Н); 6.78 (s; 1H); 6.81 (s; 1H); 7.78 (br s; 1H).
Пример 4. (7S)-3,4-Диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-ил] N-метилметанамин.
Суспендировали (7S)-3,4-диметокси-N-метилбицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбоксамид, полученный в примере 3 (450 мг) в тетрагидрофуране (20 мл), и затем к реакционной смеси при температуре окружающей среды медленно добавляли 1,6 мл 2М раствора LiAlH4 в тетрагидрофуране. Наблюдали выделение газа, и реакционная смесь становилась прозрачной. Реакционную смесь нагревали в кобле с обратным холодильником в течение 30 мин.
После возвращения к температуре окружающей среды, гидролиза и затем экстрагирования этилаце-татом высушивали над MgSO4 и затем выпаривали. Полученный остаток очищали препаративной ВЭЖХ (элюант: вода/ацетонитрил/трифторуксусная кислота от 98/2/0.2 до 20/80/0.2) в течение 30 мин до получения продукта с выходом в 46%.
1Н ЯМР (ДМСО-d6, ч. на млн/ТМС) = 2.60 (m; 3H); 2.85 (m; 1Н); 3.15 (m; 1Н); 3.25 (dd; 1Н); 3.30 (m; 1Н); 3.62 (m; 1Н); 3.70 (s; 6H); 6.82 (s; 1H); 6.89 (s; 1Н); 8.48 (br s; 1H).
Пример 5. (7S)-3,4-Диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-ил] N-метилметанамин гидрохлорид.
20 мл молярного раствора BH3 в тетрагидрофуране при температуре окружающей среды добавляли к смеси 2,2 г (10 ммоль) (7S)-3,4-диметокси-N-метилбицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбоксамида, полученного в примере 3 в 45 мл тетрагидрофурана. После взбалтывания в течение 1 ч добавляли 10 мл раствора BH3 в тетрагидрофуране. После взбалтывания в течение ночи при температуре окружающей среды 20 мл этанола добавляли по каплям и смесь взбалтывали до тех пор, пока больше не выделялся газ (приблизительно 1 ч). Затем по каплям добавляли 20 мл раствора хлористо-водородной кислоты в этанол. После взбалтывания в течение 4 ч полученный осадок (1,2 г продукта, указанного в заголовке) отфильтровывали. Фильтрат концентрировали и дополнительные 0,65 г продукта, указанного в заголовке, получали переведением в твердое вещество в 80/20 смесь этилацетата/этанол.
Два осадка объединяли с получением 1,85 г продукта, указанного в заголовке (выход: 77%).
Пример 6. Гидрохлорид ивабрадина.
В автоклав загружали 5,5 кг 3-[2-(1,3-диоксолан-2-ил)этил]-7,8-диметокси-1,3-дигидро-2Н-3-бензазепин-2-она, 27,5 л этанола и 550 г палладия на угле.
Продувка азотом и затем водородом, нагревание до 55°С и затем гидрирование при этой температуре под давлением в 5 бар до поглощения теоретического количества водорода.
Затем возвращали к температуре окружающей среды и сбрасывали давление в автоклаве.
После этого добавляли 4 кг (7S)-3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-ил] N-метил-метанамина гидрохлорида, 11 л этанола, 5,5 л воды и 1 кг палладия на угле.
Продувка азотом и затем водородом, нагревание до 85°С и затем гидрирование при этой температуре под давлением в 30 бар до поглощения теоретического количества водорода.
Затем возвращали к температуре окружающей среды, продували автоклав и затем реакционную смесь отфильтровывали; растворители отгоняли и затем выделяли ивабрадина гидрохлорид кристаллизацией из смеси толуол/1-метил-2-пирролидинон.
Посредством этого получали ивабрадина гидрохлорид с выходом в 85% и с химической чистотой более чем 99%.
Сравнительный пример А. Скрининг коммерческих нитрилаз для ферментативного гидролиза 3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрила.
Исследовали вес нитрилазы (15 мг) в виде лиофилизата в пробирке и затем добавляли 4 мл 0,1М KH2PO4 буфера рН 7 и 3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрила (20 мг), растворенного в 100 мкл ДМСО.
Помещали в инкубатор при 28°С и 220 об/мин.
Скорость превращения измеряли с помощью ВЭЖХ через 24 и 72 ч.
Нитрилазы NIT 101, NIT 102, NIT 103, NIT 104, NIT 105, NIT 106, NIT 108, NIT 109, NIT 111, NIT 112 и NIT 113 (Almac) не гидролизовали нитрил через 24 ч (не было образования кислоты или амида).
Результаты, полученные с нитрилазами NIT 107, NIT 110, NIT 114 и NIT 115 (Almac) сопоставляли в таблице ниже:
Нитрил аза
72 часа
Амид
Кислота
Нитрил
N1T 107
23%
16%
61%
NIT ПО
24%
15%
61%
NIT 114
21 %
22%
57%
NIT115
47%
46%
Аналитические условия.
Phenomenex LUNA HST 50*3 колонка С18(2) 2,5 мкм от 0 до 100% В в течение 8 мин 0,8 мл/мин 40°С
А (1000 вода+25 ACN+1 ТФУ) В (1000 ACN+25 вода+1 ТФУ).
Затем нитрилазу NIT 115 использовали в другом исследовании, чтобы определить, является ли гидролиз нитрила энантиоселективным.
Нитрилазу NIT 115 (12 мг; Almac) применяли в 6 мл [2 мг/мл] буфера.
3,4-Диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрил добавляли для того, чтобы достичь его конечной концентрации в 4 мг/мл.
Энантиоселективность измеряли с помощью ВЭЖХ с применением следующих аналитических условий:
Chiralpak IC 250*4.6 колонка
30% абсолютный этанол + 0,1% ТФУ + 70% гептан + 0,1% ТФУ 1 мл/мин 30°С 288 нм.
Примечание: при этих условиях энантиомеры кислоты разделяют, но не энантиомеры нитрила. Полученная хроматограмма после реакции в течение 5 ч показана на фиг. 2. Вывод: энантиоселективность не наблюдается.
Сравнительный пример В. Скрининг нитрилаз бактериальных и грибковых штаммов для ферментативного гидролиза 3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрила.
Исследование с использованием ряда бактериальных индукторов (пропионитрил, бензонитрил, 4-бромбензонитрил) показало, что пропионитрил обеспечивает наилучшую индукцию активности нитри-лазы с 3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрилом.
Бактериальные штаммы были индуцированы с пропионитрилом при 72 мМ в течение 72 ч, и клетки ресуспендировали в 50 мл (двойной концентрации, конц. 10 мг клеток на 1 мл) 0,1 М фосфатного буфера KH2PO4/K2HPO4 рН 7.3 и 3,4-диметоксибицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрил добавляли при концентрации в 10 мМ в 2% ДМСО об./об.конечн.
Грибковые штаммы индуцировали с валеронитрилом.
Все реакционные смеси взбалтывали при 220 об/мин при 30°С в случае бактерий и при 27°С в случае грибов и наблюдали в течение 96 ч с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ и хирально-фазовой ВЭЖХ в соответствии со способами, описанными ниже:
Обращено-фазовый анализ
Phenomenex LUNA HST 50*3 колонка С18(2) 2,5 мкм от 0 до 100% В в течение 8 мин 0,8 мл/мин 40°С A (1000 вода+25 ACN+1 ТФУ) В (1000 ACN+25 вода+1 ТФУ). Хирально-фазовый анализ Chiralpak IC 250*4.6 колонка
30% абсолютный этанол + 0,1% ТФУ + 70% гептан + 0,1% ТФУ 1 мл/мин 30°С 288 нм.
Полученные результаты сопоставлены в таблице ниже
% соединений образованных через 96 часов
Микроорганизмы
Остаточный
Амид
Кислота
нитрил
Rhodococcus erythropoiis NCIMB11215
35 (S)
Rhodococcus rhodochrous
35 (S)
NCIMB11216
Rhodococcus rhodochrous
100
NCIMB11273
Rhodococcus rhodnii NCIMB11279
100
Aspergillus niger BO
<5
Aspergillus alliaceus NRRL 315
<5
Cunninghamella elegans NRRL 1392
<5
Rhizopus nigricans NRRL 1477
<5
Absidia cylindrospora MMP 1569
<5
Mortierella isabellina NRRL 1757
<5
% соединений образованных через 96 часов
Микроорганизмы
Остаточный
Амид
Кислота
нитрил
Mucor plumbeus АТСС 4740
<5
Beauveria bassiana АТСС 7159
Stibella fimetaria CBS 548-84
100
Stibella fimetaria CBS 511-67
100
Stibellafimetaria CBS 294-81
100
Сравнительный пример С. Ферментативный гидролиз бицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрила с применением сверхэкспрессированной нитрилазы Rhodococcus rhodochrous NCIMB
11216.
Посев на ЛБ+агар+канамицин, статическая инкубация при 37°С в течение 24 ч (штамм 11216 нитрилазы рекомбинантной Е. coli).
Прекультура в 5 мл ЛБ+канамицин (50 мг/л), инкубация при 37°С, 180 об/мин в течение ночи.
Культура: перенос 50 мл ЛБ и 500 мкл прекультуры в неперегороженные 250-мл колбы Эрленмейе-ра, инкубация при 28°С, 160 об/мин до ОП равна 0,6 (т.е. примерно 4 ч).
Индукция с ИПТГ (0,5 мМ), инкубация при 17°С, 160 об/мин в течение ночи (17 ч).
Определение активности: центрифугирование культур при 4°С, 6000 об/мин в течение 20 мин, ре-суспендировали взвесь в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7. Добавляли бицикло[4.2.0]окта-1,3,5-триен-7-карбонитрил (10 mM) + 2% этанол. Инкубировали при 220 об/мин, 30°С.
Заметка. Если культуры больше чем 50 мл во время центрифугирования, снимали 50 мл и осуществляли определение активности с применением взвеси 50 мл культуры.
Контроль гидролиза хиральной хроматографией: в 45 мин и 2 ч.
Клонка: Phenomenex(r) LUNA HST 50*3 С18(2) 2,5 мкм
Элюант: А +В (от 0 до 100% В в течение 8 мин)
А: 1000 вода+25 ACN+1 ТФУ
В: 1000 ACN+25 вода+1 ТФУ
0,8 мл/мин - 40°С - UV 210 нм
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ синтеза оптически чистого соединения формулы (I)
Результаты.
путем энантиоселективного ферментативного гидролиза рацемического, или не оптически чистого, нитрила формулы (IV)
(IV)
с применением нитрилазы Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216, которая сверхэкспрессируется в другом организме, имеющем компетентную биологическую систему, в смеси органического растворителя и водного раствора, имеющего рН от 5 до 10, при концентрации от 1 до 500 г нитрила формулы (IV) на 1 л смеси растворителей, при соотношении фермент/субстрат (Ф/С) от 1/1 до 1/100, при температуре
от 25 до 40°С.
2. Способ по п.1, причем организм, имеющий компетентную биологическую систему, представляет собой бактерию, содержащую перестроенную плазмиду.
3. Способ по п.2, причем бактерии, которые сверхэкспрессируют нитрилазу, применяют непосредственно в виде бактериальной взвеси или лиофилизата.
4. Способ по любому из пп.1-3, причем органический растворитель выбран из диметилсульфоксида, ДМФ, ацетона, ацетонитрила, этанола, изопропанола, ТГФ и метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ).
5. Способ синтеза по любому из пп.1-4, при котором нитрил конфигурации (R), вторичный продукт реакции
рацемизируют путем воздействия основания, чтобы образовать рацемический нитрил формулы (IV), с целью переработки в процессе ферментативного гидролиза.
6. Способ синтеза по п.5, причем основание представляет собой диазабициклоундецен (ДБУ).
7. Способ синтеза или по п.5 или 6, причем стадию рацемизации осуществляют in situ.
8. Способ синтеза по любому из пп.5-7, причем кислоту формулы (I) выделяют после одного или
восстановление которого обеспечивает соединение формулы (III).
10. Способ синтеза по п.9, при котором восстановление соединения формулы (XI), чтобы образовать соединение формулы (III), осуществляют с помощью ВН3, NaBH4 или LiAlH4.
11. Способ синтеза солей присоединения ивабрадина с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль представлена в безводной или гидратированной форме, при котором соединение формулы (III) в соответствии с п.9 или 10 впоследствии сочетают с соединением формулы (XII)
в которой X представляет собой атом галогена,
с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой в безводной или гидратированной форме.
12. Способ синтеза по п.11, причем X представляет собой атом йода.
13. Способ синтеза солей присоединения ивабрадина с фармацевтически приемлемой кислотой, указанная соль представлена в безводной или гидратированной форме, при котором соединение формулы (III) в соответствии с п.9 или 10 впоследствии подвергают реакции восстановительного аминирования с соединением формулы (XIII) в присутствии восстанавливающего средства
в которой R2 представляет собой группу, выбранную из СНО и CHR3R4,
в которой R3 и R4, каждый, представляют собой линейную или разветвленную (C1-C6)алкоксигруппу,
или образуют совместно с атомом углерода, который их несет, 1,3-диоксановое, 1,3-диоксолановое или 1,3-диоксепановое кольцо с получением ивабрадина, который затем превращают в соль присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой в безводной или гидратированной форме.
14. Способ синтеза по п.13, причем соединение формулы (III) применяют в реакции восстановительного аминирования в виде его гидрохлорида с получением ивабрадина в виде гидрохлорида.
15. Способ синтеза по п.10 или 14, причем реакцию восстановительного аминирования с соединением формулы (XIII) осуществляют в присутствии водорода при катализе палладием на угле.
14.
Ферментативный гидролиз нитрила с применением сверхэкспрессированной нитрилазы Rhodococcus rhodochrous - ВЭЖХ хроматограмма через 6 ч
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
(19)
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
(19)
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
(19)
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
(19)
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
(19)
023883
023883
- 2 -
(III).
- 1 -
(III).
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
023883
023883
- 1 -
(III).
- 1 -
(III).
023883
023883
- 4 -
- 3 -
023883
023883
- 3 -
- 3 -
023883
023883
- 3 -
- 3 -
023883
023883
- 5 -
60%.
- 4 -
023883
023883
- 7 -
- 7 -
023883
023883
- 8 -
023883
023883
- 8 -
023883
023883
- 8 -
023883
023883
- 10 -
|
