|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ получения вируса, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток, которые не были трансфицированы экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для получения смеси клеток, при этом клетки-хозяева и клетки, добавляемые после трансфекции, относятся к одной и той же клеточной линии; и (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса. 2. Способ получения вируса, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток MDCK по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток MDCK, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам MDCK (i) для получения смеси клеток MDCK; и (iii) культивирования смеси клеток MDCK с целью продуцирования вируса. 3. Способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для получения смеси клеток, при этом клетки-хозяева и клетки, добавляемые после трансфекции, относятся к одной и той же клеточной линии; (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса; и (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii). 4. Способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток MDCK по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток MDCK, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам MDCK (i) для получения смеси клеток MDCK; (iii) культивирования смеси клеток MDCK с целью продуцирования вируса; и (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii). 5. Способ по п.1 или 3, в котором клеткой-хозяином является клетка VERO, PER.C6 или MDCK. 6. Способ по пп.2, 4 или 5, в котором клетка MDCK принадлежит клеточной линии MDCK 33016 (DSM ACC2219). 7. Способ по любому из пп.1-6, в котором клетки культивируют в суспензии. 8. Способ по любому из пп.1-6, в котором клетки культивируют адгезивно. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором вирусом является вирус с фрагментированным геномом. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором вирусом является РНК-вирус с отрицательно заряженной нитью. 11. Способ по п.10, в котором вирусом является вирус гриппа. 12. Способ по любому из пп.1-9, в котором вирусом является вирус с двухцепочечной РНК. 13. Способ по п.12, в котором вирусом является ротавирус. 14. Способ по любому из пп.1-8 или 12, в котором вирусом является вирус с нефрагментированным геномом. 15. Применение вируса, полученного способом по любому из пп.3-6, для получения вакцины.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ получения вируса, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток, которые не были трансфицированы экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для получения смеси клеток, при этом клетки-хозяева и клетки, добавляемые после трансфекции, относятся к одной и той же клеточной линии; и (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса. 2. Способ получения вируса, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток MDCK по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток MDCK, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам MDCK (i) для получения смеси клеток MDCK; и (iii) культивирования смеси клеток MDCK с целью продуцирования вируса. 3. Способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для получения смеси клеток, при этом клетки-хозяева и клетки, добавляемые после трансфекции, относятся к одной и той же клеточной линии; (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса; и (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii). 4. Способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии: (i) трансфекции культуры клеток MDCK по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток MDCK, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам MDCK (i) для получения смеси клеток MDCK; (iii) культивирования смеси клеток MDCK с целью продуцирования вируса; и (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii). 5. Способ по п.1 или 3, в котором клеткой-хозяином является клетка VERO, PER.C6 или MDCK. 6. Способ по пп.2, 4 или 5, в котором клетка MDCK принадлежит клеточной линии MDCK 33016 (DSM ACC2219). 7. Способ по любому из пп.1-6, в котором клетки культивируют в суспензии. 8. Способ по любому из пп.1-6, в котором клетки культивируют адгезивно. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором вирусом является вирус с фрагментированным геномом. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором вирусом является РНК-вирус с отрицательно заряженной нитью. 11. Способ по п.10, в котором вирусом является вирус гриппа. 12. Способ по любому из пп.1-9, в котором вирусом является вирус с двухцепочечной РНК. 13. Способ по п.12, в котором вирусом является ротавирус. 14. Способ по любому из пп.1-8 или 12, в котором вирусом является вирус с нефрагментированным геномом. 15. Применение вируса, полученного способом по любому из пп.3-6, для получения вакцины.
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
023811
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201270577
(22) Дата подачи заявки
2010.10.20 (51) Int. Cl. C12N 7/02 (2006.01)
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНСТРУКЦИИ, КОДИРУЮЩЕЙ ВИРУСНУЮ РНК
(31) 61/279,487
(32) 2009.10.20
(33) US
(43) 2012.12.28
(86) PCT/IB2010/054752
(87) WO 2011/048560 2011.04.28
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Дормитцер Филип, Кайнер Бьерн, Суфафифат Пирада, Франти Майкл, Мейсон Питер (US), Улендорфф Дженнифер, Матросович Михаил (DE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) WHITELEY A. ET AL.: "Generation of candidate human influenza vaccine strains in cell culture - rehearsing the European response to an H7N1 pandemicthreat", INFLUENZA AND OTHER RESPIRATORY VIRUSES, OXFORD [U.A.]: WILEY-BLACKWELL, vol. 1, no. 4, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 157-166, XP002512639, ISSN: 1750-2659, DOI: DOI: 10.1111/ J. 1750-2659, 2007, 00022. X* abstract page 159 WO-A2-2005062820
KOUDSTAAL W. ET AL.: "Suitability of PER.C6 <(> R) cells to generate epidemic and pandemic influenza vaccine strains by reverse
genetics", VACCINE, ELSEVIER LTD., GB, vol. 27, no. 19, 28 April 2009 (2009-04-28), pages 2588-2593, XP026066866, ISSN: 0264-410X, DOI:
DOI:10.1016/J .VACCINE. 2009.02.033 [retrieved on 2009-02-20] paragraph [2.4.1], paragraph [02.5]
US-Al-2008124803 WO-Al-2010046335
SUPHAPHIPHAT PIRADA ET AL.: "Human
RNA Polymerase I-Driven Reverse Genetics for
Influenza A Virus in Canine Cells", JOURNAL
OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 84, no. 7, 1 April 2010 (2010-04-01), pages 3721-3725, XP009136769, ISSN: 0022-538X, DOI: DOI: 10. 1128/JVI. 01925-09 [retrieved on 2010-01-13] * abstract page 3723 - page
3724
ZHANG XIANGMIN ET AL.: "A one-plasmid system to generate influenza virus in cultured chicken cells for potential use in influenza vacci
ne", JOURNAL OF VIROLOGY SEP 2009 LNKD-
PUBMED:19587040, vol. 83, no. 18, September 2009 (2009-09), pages 9296-9303, XP002615609, ISSN: 1098-5514 the whole document
NEUMANN G. ET AL.: "Reverse genetics for
the control of avian influenza.", AVIAN DISEASES ,
vol. 47, no. Special Issue, 2003, pages 882-887,
XP002615610, ISSN: 0005-2086 the whole document
(57) Изобретение относится к способу получения вируса с помощью конструкции, кодирующей вирусную РНК. Способ заключается в спасении вируса с помощью метода обратной генетики, в котором клетки добавляют после трансфекции. Вирус, полученный указанным способом, может быть использован для приготовления вакцины.
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США 61/279487, поданной 20 октября 2009 г., полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области обратной генетики. Кроме того, оно относится к изготовлению вакцин для защиты против различных вирусов.
Уровень техники изобретения
Обратная генетика обеспечивает возможность рекомбинантной экспрессии и манипулирования с РНК-вирусами в клеточной культуре. Это мощный инструмент в вирусологии и изготовлении вакцин, потому что он обеспечивает возможность быстрого получения рекомбинантных вирусов (включая реас-сортанты) и/или их мутации. Способ включает трансфекцию клеток-хозяев одной или более экспресси-онными конструкциями, которые кодируют вирусный геном, и изолирование вируса из клеток.
Один недостаток спасения вирусов с помощью обратной генетики состоит в том, что процесс является неэффективным и зачастую приводит к неудовлетворительному урожаю вирусов. Таким образом, в данной области остается потребность в предоставлении альтернативных и более эффективных способов обратной генетики.
Сущность предпочтительных вариантов осуществления
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что низкая эффективность методов обратной генетики может быть значительно улучшена посредством трансфекции клеток конструкцией (конструкциями) обратной генетики, а впоследствии добавления дополнительных клеток к трансфицированным клеткам. Авторы изобретения предполагают, что наблюдаемое повышение эффективности является следствием того, что трансфекция является вредной для клеток. Таким образом, любые спасаемые вирусы необходимо распространять в больные клетки или ждать до тех пор, пока вирус не переместится в здоровые клетки. Это приведет к потере жизнеспособных вирусов. Добавление клеток к трансфицированным клеткам-хозяевам обеспечивает возможность размножения спасаемого вируса на субстрате здоровых клеток, что значительно повышает урожай вирусов.
В одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ получения вируса, включающий стадии (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для предоставления смеси клеток и (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса.
В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для предоставления смеси клеток; (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса; (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii), и необязательно (v) получения готовой формы вакцины, содержащей вирус.
Обратная генетика.
Обратная генетика может применяться для получения широкого спектра РНК-вирусов, включая РНК-вирусы с положительно заряженной нитью [1,2], РНК-вирусы с отрицательно заряженной нитью [3,4] и вирусы с двухцепочечной РНК [5]. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ продуцирования рекомбинантного вируса, в котором вирус получают с применением способа обратной генетики настоящего изобретения.
Известные системы обратной генетики включают экспрессированные молекулы ДНК, которые кодируют молекулы необходимой вирусной РНК (вРНК) из промоторов pol I, промоторов бактериальной РНК-полимеразы, промоторов полимеразы бактериофагов и т.д. Кроме того, там, где вирусу требуются определенные белки для формирования заразного вируса, системы также предоставляют данные белки, например система дополнительно включает молекулы ДНК, которые кодируют вирусные белки таким образом, что экспрессия обоих типов ДНК приводит к сборке целого заразного вируса.
Когда обратная генетика применяется для экспрессии вРНК, квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что четкое расположение элементов последовательности по отношению друг к другу является важнейшим для полимеразы для инициирования репликации. Вот почему важно, чтобы молекула ДНК, кодирующая вирусную РНК, правильно располагалась между промотором pol I и стоп-кодоном, но данное позиционирование вполне по силам тем, кто работает с системами обратной генетики.
В целом, обратная генетика подходит для экспрессирования любых вирусов, которые, как известно, требуют продуцирования геномной РНК во время своего жизненного цикла. Данные вирусы включают, но без ограничения, РНК вирусы с положительно заряженной нитью и с отрицательно заряженной нитью РНК, такие как вирусы, описанные ниже. Предпочтительно вирусом является ортомиксовирус, например вирус гриппа. Кроме того, методы изобретения подходят для несегментированных, а также сегментированных вирусов.
Когда вирусом является вирус с положительно заряженной нитью РНК, этого часто оказывается достаточно для трансфицирования клетки экспрессионной конструкцией, содержащей вирусный геном.
Например, трансфекция плазмид, содержащих геном полиовируса, приводила к выделению заразного полиовируса [1,2]. Обратная генетика для РНК-вирусов с отрицательно заряженной нитью предъявляет больше сложностей, так как антисмысловая вирусная РНК обычно является незаразной и требует РНК-полимеразу для завершения жизненного цикла. Таким образом, вирусную полимеразу необходимо обеспечивать либо в виде белка, либо в виде гена для экспрессии белка in situ.
Когда для инфекционности вирусу требуется белок, по большей части предпочтительно использовать двунаправленные экспрессионные конструкции, поскольку это уменьшает общее количество экс-прессионных конструкций, требуемых клетке-хозяину. Таким образом, способ изобретения может использовать по меньшей мере одну двунаправленную экспрессионную конструкцию, в которой ген или кДНК расположен между расположенным выше промотором pol II и расположенным ниже неэндогенным промотором pol I. Транскрипция гена или кДНК из промотора pol II продуцирует кэппированную положительно полярную вирусную мРНК, которая может быть транслирована в белок, тогда как транскрипция из неэндогенного промотора pol I продуцирует отрицательно полярную вРНК. Двунаправленная экспрессионная конструкция может представлять собой двунаправленный вектор экспрессии.
Для того чтобы продуцировать рекомбинантный вирус, клетка должна экспрессировать все сегменты вирусного генома, которые являются необходимыми для сборки вириона. ДНК, клонированная в экс-прессионные конструкции настоящего изобретения, предпочтительно обеспечивает всю вирусную РНК и белки, но возможно также использовать вирус-помощник для предоставления некоторой части РНК и белков, хотя предпочтительными являются системы, в которых вирус-помощник не используется. Когда вирусом является несегментированный вирус, это обычно может быть достигнуто посредством использования единственной экспрессионной конструкции в способе изобретения несмотря на то, что экспрессия вирусного генома несегментированных вирусов с применением более чем одной экспрессионной конструкции также находится в пределах объема изобретения. Когда вирусом является сегментированный вирус, вирусный геном обычно экспрессируется с применением более чем одной экспрессионной конструкции способом по изобретению. Также предусматривается, однако, комбинирование одного или более сегментов или даже всех сегментов вирусного генома на единственной экспрессионной конструкции.
Способы изобретения, в частности, подходят для получения штаммов реассортантных вирусов. Способ может использовать манипулирование плазмидами in vitro для создания комбинаций вирусных сегментов с целью облегчения манипулирования кодирующими или некодирующими последовательностями в вирусных сегментах, для выведения мутаций и т.д. Применение системы экспрессии для получения штаммов реассортантных вирусов является предпочтительным, поскольку это может значительно сократить время, необходимое для получения исходного реассортантного вируса, который является особенно полезным в ситуациях, когда необходимо быстрое получение вакцины для противодействия эпидемии. Таким образом, является предпочтительным, что способ данного аспекта изобретения использует одну или более экспрессионных конструкций, которые экспрессируют вирусные гены из или полученные из по меньшей мере двух различных штаммов дикого типа.
Также может применяться экспрессионная конструкция, которая приводит к экспрессии акцессорного белка в клетке-хозяине. Например, может быть предпочтительным экспрессирование невирусной сериновой протеазы (например, трипсина) как части системы обратной генетики.
Экспрессионные конструкции.
Экспрессионные конструкции, кодирующие молекулы вирусной РНК, для применения в изобретении могут быть любыми экспрессионными конструкциями, широко используемыми в данной области для спасения вирусов.
Применяемые экспрессионные конструкции могут быть однонаправленными или двунаправленными экспрессионными конструкциями. Когда клетка-хозяин экспрессирует более чем один трансген (будь то одинаковые или различные экспрессионные конструкции), возможно использование однонаправленной и/или двунаправленной экспрессии.
Двунаправленные экспрессионные конструкции содержат по меньшей мере два промотора, которые двигают экспрессию в различных направлениях (т.е. как от 5' к 3', так и от 3' к 5') от одинаковой конструкции. Два промотора могут быть функционально связаны с различными цепочками одной и той же двухцепочечной ДНК. Предпочтительно одним из промоторов является промотор pol I, и по меньшей мере одним из других промоторов является промотор pol II. Это является полезным, поскольку промотор pol I может применяться для экспрессирования некэппированной кРНК, тогда как промотор pol II может применяться для транскрипции мРНК, которые впоследствии могут транслироваться в белки, таким образом обеспечивая одновременную экспрессию РНК и белка из одной и той же конструкции.
Экспрессионная конструкция (будь то однонаправленная или двунаправленная) будет, как правило, включать транскрипцию стоп-кодона РНК. Стоп-кодоном может быть эндогенный стоп-кодон или стоп-кодон, который не является эндогенным для клетки-хозяина. Подходящие стоп-кодоны будут очевидными для специалистов в данной области и включают, но без ограничения, стоп-кодон транскрипции РНК-полимеразой I, стоп-кодон транскрипции РНК-полимеразой II и рибозимы. Кроме того, экспрессионные конструкции могут содержать один или более сигналов полиаденилирования для мРНК, в частности в
конце гена, экспрессию которого контролирует промотор pol II.
Промоторы pol I и pol II, применяемые в экспрессионных конструкциях, могут быть получены из организма такого же таксономического порядка, что и клетка-хозяин, в которой экспрессируется экс-прессионная конструкция. В качестве альтернативы, промоторы могут быть получены из организма иного таксономического порядка, чем клетка-хозяин. Термин "порядок" относится к традиционной таксономической классификации, и примерами порядков являются приматы, грызуны, плотоядные, сумчатые, китообразные и т.д. Люди и шимпанзе относятся к одному и тому же таксономическому порядку (приматы), но люди и собаки находятся в различных порядках (приматы vs. плотоядных).
В способах изобретения клетка-хозяин может быть трансфицирована по меньшей мере двумя, по меньшей мере тремя, по меньшей мере четырьмя, по меньшей мере пятью, по меньшей мере шестью, по меньшей мере семью, по меньшей мере восемью, по меньшей мере девятью, по меньшей мере десятью, по меньшей мере одиннадцатью или по меньшей мере двенадцатью экспрессионными конструкциями.
Экспрессионная конструкция может представлять собой вектор, такой как плазмида или другая эписомная конструкция.
Данные векторы будут, как правило, включать в себя по меньшей мере одну бактериальную и/или эукариотическую точку начала репликации. Кроме того, вектор может включать в себя селектируемый маркер, который обеспечивает возможность для отбора у прокариотических и/или эукариотических клеток. Примерами подобных селектируемых маркеров являются гены, придающие свойство устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин или канамицин. Вектор может дополнительно включать в себя один или более сайтов множественного клонирования для содействия клонированию последовательности ДНК.
В качестве альтернативы, экспрессионная конструкция может быть линейной экспрессионной конструкцией. Подобные линейные экспрессионные конструкции, как правило, не будут содержать каких-либо последовательности амплификации и/или селекции. Однако, линейные конструкции, включающие в себя такую последовательности амплификации и/или селекции, также находятся в пределах объема правовых притязаний настоящего изобретения. Пример способа с применением подобных линейных экс-прессионных конструкций для экспрессии вируса гриппа описан в ссылке 6.
Экспрессионные конструкции изобретения могут быть созданы с применением методов, известных в данной области. Данные методы были описаны, например, в ссылке 7. Когда экспрессионная конструкция является линейной экспрессионной конструкцией, становится возможно линеаризовать ее перед введением в клетку-хозяин, используя единственный сайт рестрикционной эндонуклеазы. В качестве альтернативы, возможно удаление экспрессионной конструкции из вектора с применением по меньшей мере двух сайтов рестрикционной эндонуклеазы. Кроме того, также возможно получение линейной экспрес-сионной конструкции посредством ее амплифицирования с применением метода амплификации нуклеиновой кислоты (например, посредством ПЦР).
Когда клеткой, в которой происходит экспрессия, является клетка собаки, такая как клеточная линия MDCK, кодирующие белок участки могут быть оптимизированы для экспрессии у собак, например, с применением промотора из гена дикого типа собаки или из вируса собаки, и/или с использованием кодо-на, более подходящего для клеток собаки, чем для клеток людей. Например, при том, что гены человека слегка благоприятствуют UUC в качестве кодона для Phe (54%), в клетках собаки предпочтение является более сильным (59%). Аналогичным образом, при том, что не существует основного предпочтения для Ile-кодонов в клетках человека, 53% кодонов собаки используют AUC для Ile. Вирусы собак, такие как собачий парвовирус (ss ДНК-вирус), также могут предоставить указание для оптимизации кодона, например 95% Phe-кодонов в последовательностях собачьего парвовируса являются UUU (vs. 41% в геноме собаки), 68% Ile-кодонов являются AUU (vs. 32%), 46% Val-кодонов являются GUU (vs. 14%), 72% Pro-кодонов являются CCA (vs. 25%), 87% Tyr-кодонов являются UAU (vs. 40%), 87% His-кодонов являются CAU (vs. 39%), 92% Gln-кодонов являются САА (vs. 25%), 81% Glu-кодонов являются GAA (vs. 40%), 94% Cys-кодонов являются UGU (vs. 42%), только 1% Ser-кодонов являются UCU (vs. 24%), ССС никогда не используется для Phe, и UAG никогда не используется в качестве стоп-кодона. Таким образом, кодирующие белок гены могут быть созданы более похожими на гены, природа которых уже оптимизирована для экспрессии в клетках собаки, тем самым облегчая экспрессию.
Трансфекция.
"Трансфекция" относится к введению ДНК в клетку. Экспрессионные конструкции могут быть введены в клетки-хозяева с применением любых методик, известных квалифицированным специалистам в данной области. Например, они могут быть введены в клетки-хозяева посредством применения электро-порации, диэтиламиноэтилдекстрана, осаждением фосфата кальция, липосом, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами. Обратная генетика наиболее часто практикует применение липосомально-го способа, например, с использованием реагента для трансфекции Lipofectamin(tm). Способы изобретения не ограничиваются трансфекцией липосомами, но, однако, ожидается, что работают одинаково хорошо наряду с другими методами трансфекции.
Клетки можно добавлять к трансфицированным клеткам-хозяевам в любое время вплоть до 72 ч после трансфекции.
Например, клетки можно добавлять немедленно после трансфекции, через 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч или 72 ч после трансфекции. По большей части, максимальное время, через которое клетки добавляют после трансфекции, будет соответствовать максимальному времени, в течение которого трансфицированные клетки могут выжить.
Период "после трансфекции" начинается, как только ДНК вводят в клетки-хозяева в культуре. Момент времени, в который вводят ДНК, будет варьировать в связи с различными факторами, например, применяемой клеточной линией, способом трансфекции или температурой, при которой выполняют трансфекцию. Квалифицированный специалист может легко определить время, используя стандартные методы. Например, параллельно могут быть проведены несколько экспериментов, в которых клетки трансфицируют конструкциями обратной генетики при сходных условиях за исключением того, что трансфекцию останавливают в различные моменты времени. Если ДНК введена в клетку-хозяин, то может быть образован по меньшей мере один вирус. Таким образом, квалифицированный специалист может оценить наличие вируса, например, посредством определения количества бляшкообразующих единиц с применением стандартных анализов. Первым моментом времени, после которого по меньшей мере одна бляшкообразующая единица (БОЕ) может быть обнаружена, является момент времени, когда ДНК вводят в клетку-хозяин.
В качестве альтернативы, период, после которого клетки добавляют к трансфицированным клеткам, может быть определен от начала трансфекции. Началом трансфекции является момент времени, в который экспрессионная конструкция (экспрессионные конструкции), кодирующая вирусную молекулу (вирусные молекулы), контактирует с культурой клеток-хозяев. Таким образом, клетки могут быть добавлены к трансфицированным клеткам в любое время вплоть до 96 ч после начала трансфекции, например 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 или 96 ч. Тогда как момент времени "после трансфекции" и момент времени "от начала трансфекции" измеряют относительно различных начальных точек, абсолютное время, когда клетки добавляют к инфицированным клеткам, может быть таким же. Например, если введение ДНК в клетки-хозяева в культуре занимает 1 ч, а клетки добавляют через 30 мин после введения ДНК, тогда клетки должны быть добавлены через 90 мин от начала трансфекция или через 30 мин после трансфекции.
Количество клеток, которые добавляют после трансфекции, будет по большей части варьировать в зависимости от количества клеток, которые применяют в качестве клеток-хозяев для трансфекции, а также от размера сосуда для клеточной культуры, который применяется для трансфекции. Количество клеток, которое можно было бы применить в способах по изобретению, может быть легко определено квалифицированным специалистом. Например, способы изобретения могут быть выполнены при сходных условиях в нескольких параллельных экспериментах, за исключением того, что количество клеток, которые добавляют, различно. Количество клеток, которое дает наиболее высокий урожай вирусов, может применяться в дополнительных экспериментах. Например, когда в качестве стартовой культуры для трансфекции с Lipofectamin(tm) применяют приблизительно 6х105 клеток, может быть добавлено приблизительно 4х105 клеток.
Клетки, которые добавляют после трансфекции, обеспечивают субстрат для репликации на нем спасаемого вируса. Таким образом, клетки могут быть незараженными клетками, что означает, что клетки, в пределах определенного времени (например, 48 ч), перед тем, как их применяют в методах изобретения, не заражены вирусом или трансфицированы экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную РНК. Клетки, которые заражены вирусом, например вирусом Эпштейна-Барр, являются пригодными для использования в настоящем изобретении для их иммортализации. Подобным образом, трансфициро-ванные клетки могут применяться в способах настоящего изобретения, обеспечивая, что трансфекция не наступит в ближайшее время (т.е. в пределах 48 ч) перед применением клеток в способах настоящего изобретения.
Когда спасаемому вирусу требуется наличие протеазы для инфекционности, будет преимуществом добавление протеазы вместе с клетками после трансфекции. Например, вирус гриппа требует активности сериновой протеазы, подобно трипсину, для заражения. Таким образом, когда способ изобретения применяется для спасения вируса гриппа, сериновая протеаза может быть добавлена в то же самое время, что и клетки, после трансфекции. В качестве альтернативы, протеаза может быть добавлена перед добавлением клеток к трансфицированным клеткам или после него.
Клетки.
Настоящее изобретение может использоваться с любыми эукариотическими клетками, которые могут продуцировать интересующий вирус. Как правило, в изобретении будет применяться клеточная линия, хотя в качестве альтернативы можно применять, например, первичные клетки. Как правило, клетка будет принадлежать млекопитающим. Пригодные клетки млекопитающих включают, но без ограничения, клетки хомяковых, крупного рогатого скота, приматов (включая людей и обезьян) и собак. Могут применяться различные типы клеток, такие как почечные клетки, фибробласты, клетки сетчатки, легочные клетки и т.д. Примерами подходящих клеток хомяковых являются клеточные линии, имеющие названия ВНК21 или HKCC. Пригодными клетками обезьян являются, например клетки африканской зеленой мартышки, например почечные клетки, как в клеточной линии Vero [8-10]. Пригодными клетками
собак являются, например почечные клетки, такие как в клеточных линиях CLDK и MDCK.
Кроме того, подходящие клетки включают, но без ограничения: СНО; 293Т; ВНК; MRC 5; PER.C6 [11]; FRhL2; WI-38 и т.д. Пригодные клетки являются широко доступными, например, из Американской коллекции типовых клеточных культур (АТСС) [12], из хранилища клеток Coriell [13], или из Европейской коллекции типовых клеточных культур (ЕСАСС). Например, АТСС поставляет множество различных клеток Vero под каталоговыми номерами CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 и CRL-1587, и она поставляет клетки MDCK под каталоговым номером CCL 34. PER.C6 доступна из ЕСАСС под номером хранения 96022940. Клетки MDCK, Vero и PER.C6 широко применяются для получения вирусов и вследствие этого каждая из данных клеточных линий особенно подходит для использования со способами настоящего изобретения.
Предпочтительными клетками (особенно для выращивания вирусов гриппа) для использования в изобретении являются клетки MDCK [14-16], полученные из клеток Мадин-Дарби почек собак. Первоначальные клетки MDCK доступны от АТСС, как CCL 34. Предпочтительно, чтобы использовались производные данных клеток или производные других клеток MDCK. Производные клеток MDCK описаны, например, в ссылке 14, которая раскрывает клетки MDCK, которые приспособлены для выращивания в суспензионной культуре ('MDCK 33016' или '33016-PF', хранящихся как DSM АСС 2219; см. также ссылку 14). Кроме того, ссылка 17 раскрывает MDCK-производные клетки, которые растут в суспензии в не содержащей сыворотку культуре ('В-702', хранящиеся как FERM ПН-7449). Применяемая клеточная линия MDCK может быть онкогенной. Также предусматривается использование не онкогенных клеток MDCK. Например, ссылка 18 раскрывает не онкогенные клетки MDCK, включая 'MDCK-S' (АТСС РТА-6500), 'MDCK-SF100' (АТСС РТА-6501), 'MDCK-SF102' (АТСС РТА-6502) и 'MDCK-SF103' (АТСС РТА-6503). Ссылка 19 раскрывает клетки MDCK с высокой подверженностью заражению, включая клетки 'MDCK.5F1' (АТСС CRL 12042).
Клетки, которые используют для трансфекции, и клетки, которые добавляют после трансфекции, могут относиться к одному и тому же или к различным типам клеток. Например, экспрессионные конструкции можно трансфицировать в клетки MDCK, а добавленными клетками могут быть клетки Vero или наоборот. Еще одним примером могут быть методы, когда экспрессионные конструкции трансфицируют в один штамм клеток MDCK, a добавленные клетки относятся к другому штамму MDCK. Данный подход является предпочтительным, когда спасаемый вирус растет наилучшим образом в клеточной линии, которую нельзя легко трансфицировать. В данном аспекте вирус можно трансфицировать в клетки, которые являются более легко трансфицируемыми, но впоследствии могут быть размножены в клеточной линии, которая лучше подходит для вирусной репликации. Однако, в целом предпочтительно использовать ту же самую клеточную линию (например, клетки MDCK 33016), что и клетка-хозяин как для трансфекции, так и для последующего добавления клеток, так как это имеет преимущество, например, что можно избежать конкурентного давления культурной селекции или различных условий для клеточных культур. Также для трансфекции и/или для добавления после трансфекции в качестве клеток-хозяев возможно использовать смесь более чем одного клеточного типа.
Предпочтительно, чтобы избежать обычного источника заражений клетки культивируют в отсутствии сыворотки. Квалифицированным специалистам в данной области известны различные не содержащие сыворотку среды для эукариотической клеточной культуры (например, среда Исков, ультра СНО среда (BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)). Кроме того, может быть использована не содержащая белок среда (например, PF-CHO (JRH Biosciences)). С другой стороны, клетки для репликации также могут быть культивированы в общепризнанной содержащей сыворотку среде (например, среде MEM или DMEM с 0,5-10% фетальной телячьей сыворотки).
Клетки-хозяева и клетки, которые добавляют, могут находиться в адгезивной культуре или в суспензионной культуре. Например, клетки, которые используют для трансфекции, могут быть адгезивными клетками, и клетки, которые добавляют после трансфекции, также могут быть адгезивными клетками. Когда клетки, которые добавляют после трансфекции, являются адгезивными клетками, будет очевидно, что будет необходимо извлекать клетки из сосуда для культивирования, в котором они растут перед их добавлением к трансфицированным клеткам. Это может быть достигнуто, например, с помощью серино-вой протеазы типа трипсина. Также возможно использовать суспензионные клетки в качестве клеток-хозяев для трансфекции, а адгезивные клетки - для добавления после трансфекции и наоборот.
Способы изобретения обычно используют на практике при температурах, которые широко применяются в данной области для конкретного используемого способа трансфекции. Например, когда для трансфекции используют липосомы, первоначально реакция трансфекции может быть инкубирована при комнатной температуре, когда сперва добавляют комплекс ДНК/липосома (например, в течение приблизительно 30 мин), с последующим инкубированием приблизительно при 37°C в течение установленного периода времени (например, приблизительно 24 ч). Способы изобретения могут быть реализованы на практике с любым способом трансфекции, известные в данной области, и, вследствие этого, квалифицированным специалистам известны температуры, при которых необходимо проводить трансфекцию. В качестве альтернативы, также можно найти подходящие температуры для инкубирования за счет проведения нескольких экспериментов по трансфекции параллельно при сходных условиях, за исключением
варьирования температуры инкубирования во время трансфекции. Количество спасаемых вирусов является показателем эффективности трансфекции и может быть определено посредством анализа полученного количества БОЕ, как описано выше. Температура, которая приводит к наибольшему количеству БОЕ, может быть использована для трансфекции.
Температура, при которой клетки добавляют к трансфицированным клеткам, и температура, при которой инкубируют полученную в результате смесь клеток, может быть такой же или иной по сравнению с температурой, используемой во время трансфекции. Температура может зависеть от клеточной линии, используемой для добавления после трансфекции, и может также варьировать с вирусом, который спасают с применением методов изобретения. Подходящие температуры для выращивания отдельных клеточных линий или спасения конкретных вирусов известны в данной области, однако, и квалифицированный специалист вследствие этого может легко установить подходящие температуры. Например, клеточные линии млекопитающих типа клеточных линий Vera, Per.C6 и MDCK обычно выращивают при температуре между 36 и 38°C или приблизительно 37°C. Данную температуру также выбирают для спасения многих вирусов, хотя некоторые вирусы типа гриппа могут быть спасены даже при температуре, равной приблизительно 33°C, так как это может привести к более хорошей антигенности полученного в результате вируса [20]. Подходящие температуры могут также быть установлены посредством проведения нескольких экспериментов по трансфекции параллельно при сходных условиях, за исключением варьирования температуры инкубирования после трансфекции. Температура, которая приводит к наибольшему количеству БОЕ, может применяться после трансфекции. Подходящие методы для анализа БОЕ были описаны выше в связи с исследованиями по установлению температур, которые можно применять во время трансфекции.
Получение вирусов.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии (i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК; (ii) добавления клеток к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для предоставления смеси клеток; (iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса; и (iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii) и необязательно (v) получения готовой формы вакцины, содержащей вирус.
Когда в данном аспекте изобретения в качестве культуры хозяина используют клетки, известно, что условия для клеточной культуры (например, температура, плотность клеток, значение pH и т.д.) варьируют в широком диапазоне в зависимости от клеточной линии и используемого вируса и могут быть приспособлены к требованиям применения. Вследствие этого, следующая информация представляет собой исключительно рекомендации.
Как упоминалось выше, клетки предпочтительно культивируют в не содержащей сыворотку или не содержащей белок среде.
Размножение клеток можно проводить в соответствии с методами, известными квалифицированным специалистам в данной области. Например, клетки можно культивировать в перфузионной системе с применением обычных поддерживающих методов типа центрифугирования или фильтрации. Более того, клетки можно размножать согласно изобретению в подпитываемой системе перед заражением. В контексте настоящего изобретения систему для культивирования называют подпитываемой системой, в которой клетки первоначально культивируют в подпитываемой системе, и истощение питательных веществ (или части питательных веществ) в среде компенсируют посредством регулируемой подачи концентрируемых питательных веществ. Может быть предпочтительно доводить значение pH среды в процессе размножения клеток перед заражением до значения между pH 6,6 и 7,8 и в частности до значения между pH 7,2 и 7,3. Культивирование клеток предпочтительно проходит при температуре между 30 и 40°C. На стадии (iii) клетки предпочтительно культивируют при температуре между 30 и 36°C, или между 32 и 34°C, или приблизительно при 33°C. Это особенно предпочтительно, когда способ изобретения применяют для получения вируса гриппа, так как было показано, что инкубирование зараженных клеток в данном температурном диапазоне приводит к продуцированию вируса, что приводит к повышению эффективности при получении готовой формы вакцины [20].
Во время культивирования перед заражением парциальное давление кислорода можно доводить предпочтительно до значения между 25 и 95% и, в частности, до значения между 35 и 60%. Значения парциального давления кислорода, приведенные в контексте изобретения, основаны на насыщении воздуха. Заражение клеток происходит при клеточной плотности, предпочтительно равной приблизительно 8-25х105 клеток/мл в подпитываемой системе или предпочтительно приблизительно 5-20х106 клеток/мл в перфузионной системе. Клетки можно заражать вирусной дозой (значение MOI, "множественность заражения"; соответствует количеству вирусных единиц на клетку во время заражения) между 10-8 и 10, предпочтительно между 0,0001 и 0,5.
Вирус можно выращивать на клетках в адгезивной культуре или в суспензии. Могут применяться культуры на микроносителях. Культуры на микроносителях считаются адгезивными культурами. Также клетки могут быть приспособлены для выращивания в суспензии.
Способы согласно изобретению также включают сбор и отделение вирусов или белков, ими выра
батываемых. Во время отделения вирусов или белков клетки выделяют из культурной среды с помощью стандартных методов типа сепарации, фильтрации или ультрафильтрации. Затем вирусы или белки концентрируют согласно методам, достаточно известным квалифицированным специалистам в данной области, типа градиентного центрифугирования, фильтрации, преципитации, хроматографии и т. д., а затем очищают. Также предпочтительно согласно изобретению, что вирусы инактивируют во время или после очистки. Инактивация вируса может проходить, например, с помощью р-пропиолактона или формальдегида в любой момент в пределах процесса очистки.
Вирусы, изолированные согласно изобретению, также можно выращивать на яйцах на стадии (iii). В существующем стандартном способе выращивания вируса гриппа для вакцин используются оплодотворенные SPF куриные яйца с очисткой вирусов от содержимого яиц (аллантойсная жидкость). Также возможно пропускать вирус через яйца и впоследствии размножать его в клеточной культуре.
Вирусы.
Способы изобретения могут быть реализованы на практике с любым вирусом, который может быть экспрессирован в клетке с помощью обратной генетики. Подобные вирусы могут быть сегментированными или несегментированными вирусами. Кроме того, вирус может представлять собой РНК-вирус с положительно заряженной нитью или РНК-вирус с отрицательно заряженной нитью. Вирус также может представлять собой вирус с двойной нитью РНК.
Когда вирусом является РНК-вирус с отрицательно заряженной нитью, вирус может быть из семейства, выбранного из группы, состоящей из парамиксовирусов, пневмовирусов, рабдовирусов, филовиру-сов, борнавирусов, ортомиксовирусов, буньявирусов или аренавирусов. Кроме того, вирус может быть вирусом из рода, выбранного из группы, состоящей из парамиксовируса, ортомиксовируса, респировиру-са, морбилливируса, рубулавируса, генипавируса, авилавируса, пневмовируса, метапневмовируса, вези-куловируса, лиссавируса, эфемеровируса, циторабдовируса, неклеорабдовируса, нивирабдовируса, вируса Марбурга, вируса Эбола, бомвируса, вируса гриппа A, вируса гриппа B, вируса гриппа C, тоготовиру-са, изавируса, ортобуньявируса, хантавируса, наировируса, флебовируса, тосповируса, аренавируса, офиовируса, тенуивируса или дельтавируса. В конкретных вариантах осуществления РНК-вирус с отрицательно заряженной нитью выбран из группы, состоящей из вируса Сендай, вируса Мислес, мампс-вируса, вируса Хендра, вируса болезни Ньюкасла, респираторного синцитиального вируса человека, птичьего пневмовируса, вируса везикулярного стоматита Индиана, вируса бешенства, вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, вируса некротической желтухи салата, вируса желтой карликовости картофеля, вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, марбургвируса озера Виктория, эболавируса Заира, вируса болезни Борна, вируса гриппа, тоготовируса, вируса инфекционной анемии лососевых, буньямверавируса, вируса Хантаан, вируса Дугбе, вируса лихорадки долины Рифт, вируса бронзовости томата, вируса лимфоцитарного хориоменингита, вируса шелушения коры цитрусовых, вируса полосатой пятнистости риса и вируса гепатита дельта. В предпочтительных вариантах осуществления вирусом является вирус гриппа (см. ниже).
Когда вирусом является РНК-вирус с положительно заряженной нитью, вирус может быть из семейства, выбранного из группы, состоящей из артеривирусов, коронавирусов, пикорнавирусов и рониви-русов. Кроме того, вирусом может быть вирус из рода, выбранного из группы, состоящей из артеривиру-са, коронавируса, энтеровируса, торовируса, оквируса, риновируса, гепатовируса, кардиовируса, афтови-руса, пареховируса, эрбовируса, кобувируса и тесковируса. В конкретных вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из вируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), по-лиовируса, энтеровируса человека A (HEV-A), энтеровируса человека B (HEV-B), энтеровируса человека С, энтеровируса человека D, вируса гепатита A и риновируса человека A и B.
Когда вирусом является вирус с двухцепочечной РНК, вирус может быть из семейства, выбранного из группы, состоящей из бирнавирусов, цистовирусов, гиповирусов, партитивирусов, реовирусов и тоти-вирусов. Кроме того, вирусом может быть вирус из рода, выбранного из группы, состоящей из аквабир-навируса, авибирнавируса, энтобирнавируса, цистовируса, партитивируса, криптовируса-альфа, крипто-вируса-бета, аквареовируса, колтивируса, циповируса, фудживируса, иднореовируса, микреовируса, ор-бивируса, ортореовируса, оризавируса, фитореовируса, ротавируса и сидорнавируса.
Предпочтительными вирусами для использования с изобретением являются ротавирусы. Обратная генетика с данными вирусами в настоящее время является затруднительной в результате низкой эффективности спасения вируса, и вследствие этого способы изобретения могут улучшить спасение данного вируса.
Настоящее изобретение также особенно подходит для вирусов, которые подвергаются быстрой мутации и когда рекомбинантный подход обеспечивает возможность для более быстрого выделения вируса, который можно затем дополнительно размножать для получения подходящих вакцин. Вследствие этого, в еще одном предпочтительном варианте осуществления вирусом является грипп.
Вирусы гриппа.
Вирусы гриппа особенно подходят для использования в способах настоящего изобретения, особенно вирусы гриппа A и вирусы гриппа В, поскольку обратная генетика для данного вируса хорошо охарактеризована. Вирусы гриппа представляют собой сегментированные РНК-вирусы с отрицательно за
ряженной нитью. Вирусы гриппа A и B имеют восемь сегментов, тогда как вирус гриппа С имеет семь. Вирусу требуется по меньшей мере четыре вирусных белка (PB1, PB2, РА и нуклеопротеин) для инициирования репликации и транскрипции.
Обратная генетика для вирусов гриппа A и B может быть реализована на практике с 12 плазмидами для экспрессирования четырех необходимых белков и всех восьми сегментов генома. Однако, чтобы уменьшить количество конструкций, множество кассет транскрипции РНК-полимеразы I (для синтеза вирусной РНК) может быть заключено на единственной плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 сегментов вРНК гриппа), и множество кодирующих белок областей с промоторами РНК полимеразы II на еще одной плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 транскриптов мРНК гриппа) [21]. Также является возможным включение одного или более сегментов вРНК гриппа под контролем промотора pol I и одного или более кодирующих белки гриппа областей под контролем еще одного промотора, в частности промотора pol II, на той же плазмиде. Как описано выше, это предпочтительно осуществляют, используя двунаправленные плазмиды. Предпочтительные аспекты способа ссылки 21 включают: (а) РВ1, РВ2 и РА мРНК-кодирующе области на единственной плазмиде; и (b) все 8 кодирующих вРНК сегментов на единственной плазмиде. Включение сегментов нейраминидазы (NA) и гемагглютинина (HA) на одной плазмиде и шесть других сегментов на еще одной плазмиде является особенно предпочтительным, так как нарождающиеся штаммы вируса гриппа обычно имеют мутации в сегментах NA и/или HA. Вследствие этого, в данном варианте осуществления необходимо заменить только вектор, содержащий последовательность HA и NA.
Предпочтительные системы экспрессии для вирусов гриппа A кодируют сегменты генома, полученные из множества различных штаммов дикого типа. Система может кодировать 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) сегментов генома из штамма PR/8/34 (A/Puerto Rico/8/34), но обычно он/они не будут включать сегмент PR/8/34 НА и обычно не будут включать сегмент PR/8/34 NA. Таким образом, система может кодировать по меньшей мере один из сегментов NP, M, NS, PA, PB1 и/или РВ2 (возможно все шесть) из PR/8/34.
Другие подходящие системы экспрессии для вирусов гриппа A могут кодировать 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) сегментов генома из вируса гриппа АА/6/60 (A/Ann Arbor/6/60), но обычно он/они не будут включать сегмент АА/6/60 НА и обычно не будут включать сегмент АА/6/60 NA. Таким образом, система может кодировать по меньшей мере один из сегментов NP, M, NS, PA, PB1 и/или РВ2 (возможно все шесть) из АА/6/60.
Система может кодировать 1 или более сегментов генома из штамма A/California/4/09, например сегмент НА и/или сегмент NA. Таким образом, например, сегмент гена НА может кодировать гемагглю-тинин H1, который более тесно связан с SEQ ID NO: 1, чем с SEQ ID NO: 2 (т.е. имеет более высокую степень идентичности последовательности по сравнению с SEQ ID NO: 1, чем с SEQ ID NO: 2 с применением одного и того же алгоритма и параметров). SEQ ID NO: 1 и 2 идентичны на 80%. Аналогичным образом ген NA может кодировать нейраминидазу N1, которая более тесно связана с SEQ ID NO: 3, чем с SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 3 и 4 идентичны на 82%.
Системы экспрессии для вирусов гриппа В могут кодировать сегменты генома, полученные из множества различных штаммов дикого типа. Система может кодировать 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) сегментов генома из вируса гриппа АА/1/66 (B/Ann Arbor/1/66), но обычно он/они не будут включать сегмент AA/I/66 НА и обычно не будут включать сегмент АА/1/66 NA. Таким образом, система может кодировать по меньшей мере один из сегментов NP, M, NS, PA, PB1 и/или РВ2 из АА/1/66.
Вирусные сегменты и последовательности из штаммов A/PR/8/34, АА/6/60, АА/1/66, A/Chile/1/83 и A/Califomia/04/09 широко доступны. Их последовательности доступны на базах данных общего пользования, например, GI:89779337, GI:89779334, GI:89779332, GI:89779320, GI:89779327, GI:89779325, GI:89779322, GI:89779329.
Система обратной генетики для вируса гриппа может включать экспрессионную конструкцию, которая приводит к экспрессии акцессорного белка в клетке-хозяине. Например, это может быть предпочтительно для экспрессии невирусной сериновой протеазы (например, трипсина).
Вакцина.
В одном аспекте в изобретении использован вирус, полученный согласно методам изобретения для получения вакцин.
Вакцины (особенно для вируса гриппа) по большей части основаны либо на живом вирусе, либо на инактивированном вирусе. Инактивированные вакцины могут быть основаны на целых вирионах, "расщепленных" вирионах или на очищенных поверхностных антигенах. Антигены могут также быть представлены в виде виросом. Изобретение может применяться для изготовления любых из данных типов вакцины.
Когда используется инактивированный вирус, вакцина может включать в себя целый вирион, расщепленный вирион или очищенные поверхностные антигены (для гриппа, включая гемагглютинин и, обычно, также включая нейраминидазу). Химическое средство для инактивирования вируса включает обработку эффективным количеством одного или более из следующих агентов: детергентов, формальдегида, р -пропиолактона, метиленового синего, псоралена, карбоксифуллерена (С60), бинарного этилами
на, ацетилэтиленимина или их комбинаций. В данной области известны нехимические методы вирусной инактивации, такие как, например, УФ свет или гамма излучение.
Вирионы могут быть собраны из содержащих вирусы текучих сред, например аллантойсной жидкости или клеточного культурного супернатанта, с помощью различных методов. Например, процесс очистки может включать зональное центрифугирование с использованием раствора с линейным градиентом сахарозы, который содержит детергент для разрушения вирионов. Затем антигены могут быть очищены после необязательного разбавления посредством диафильтрации.
Расщепленные вирионы получают посредством обработки очищенных вирионов детергентами (например, этиловым эфиром, полисорбатом 80, дезоксихолатом, три-^бутилфосфатом, Triton X-100, Triton N101, цетилтриметиламмония бромидом, Tergitol NP9 и т.д.) для получения препаратов субвибрионов, включая "Tween-эфирный" процесс расщепления. Методы расщепления вирусов гриппа, например, хорошо известны в данной области, например, см. ссылки 22-27, и т. д. Расщепление вируса обычно проводят посредством разрушения или фрагментирования целого вируса, будь то заразного или незаразного с помощью разрушающей концентрации расщепляющего агента. Разрушение приводит к полной или частичной солюбилизации вирусных белков, изменяя целостность вируса. Предпочтительными расщепляющими агентами являются неионные и ионные (например, катионные) поверхностно-активные вещества, например алкилгликозиды, алкилтиогликозиды, ацилсахара, сульфобетаины, бетаины, полиокси-этиленалкилэфиры, ^^диалкил-глюкамиды. Hecameg, алкилфенокси-полиэтоксиэтанолы, NP9, соединения четвертичного аммония, саркозил, СТАВ (цетилтриметиламмоний бромиды), три^-бутилфосфат, Cetavlon, соли миристилтриметиламмония, липофектин, липофектамин и DOT-MA, октил- или нонилфе-нокси полиоксиэтанолы (например, поверхностно-активные вещества Triton, такие как Triton X-100 или Triton N101), полиоксиэтиленовые сложные эфиры сорбитана (поверхностно-активные вещества Tween), полиоксиэтиленовые эфиры, полиоксиэтиленовые сложные эфиры и т.д. В одной подходящей методике расщепления используются последовательные воздействия натрия дезоксихолата и формальдегида, и расщепление может происходить во время первоначальной очистки вириона (например, в растворе с градиентом плотности сахарозы). Таким образом, процесс расщепления может включать очистку содержащего вирион материала (для удаления невирионного материала), концентрацию собранных вирионов (например, используя способ адсорбции, такой как адсорбция CaHPO4), отделение целых вирионов от невирионного материала, расщепление вирионов с применением расщепляющего агента на стадии центрифугирования в градиенте плотности (например, используя градиент сахарозы, который содержит расщепляющий агент, такой как натрия дезоксихолат), а затем фильтрацию (например, ультрафильтрацию) для удаления нежелательных материалов. Расщепленные вирионы могут быть эффективно ресус-пендированы в растворе изотонического натрия хлорида, содержащего буферный раствор натрия фосфата. Примерами расщепленных противогриппозных вакцин являются продукты BEGRIVAC(tm), FLUAR-IX(tm), FLUZONE(tm) и FLUSHIELD(tm).
Способ изобретения может также быть использован для получения живых вакцин. Подобные вакцины обычно получают посредством очистки вирионов из содержащих вирионы текучих сред. Например, текучие среды могут быть очищены посредством центрифугирования и стабилизирования буфером (например, содержащим сахарозу, калия фосфат и мононатрия глутамат). В настоящее время доступны различные формы вакцины против вируса гриппа (например, см. главы 17 и 18 ссылки 28). Живые вирусы включают продукт Medlmmune FLUMIST(tm) (тривалентный живой вирус).
Очищенные вакцины с поверхностным антигеном против вируса гриппа включают в себя поверхностные антигены гемагглютинин и, как правило, также нейраминидазу. Способы получения данных белков в очищенном виде хорошо известны в данной области. Продукты FLUVIRIN(tm), AGRIPPAL(tm) и INFLUVAC(tm) являются субъединичными противогриппозными вакцинами.
Еще одной формой инактивированного антигена является виросома [29] (не содержащие нуклеиновую кислоту вирусоподобные липосомальные частицы). Виросомы могут быть получены посредством солюбилизации вируса детергентом с последующим удалением нуклеокапсида и восстановлением мембраны, содержащей вирусные гликопротеины. Альтернативный способ получения виросом включает добавление вирусных мембранных гликопротеинов к избыточным количествам фосфолипидов для снабжения липосом вирусными белками в их мембране.
Вирус может быть аттенуированным. Вирус может быть чувствительным к температуре. Вирус может быть адаптирован к холоду. Данные три признака особенно полезны при использовании в качестве антигена живых вирусов.
НА является основным иммуногеном в существующих в настоящее время инактивированных противогриппозных вакцинах, и дозы вакцины стандартизированы посредством ссылки на уровни НА, измеряемые, как правило, посредством SRID. Существующие вакцины, как правило, содержат приблизительно 15 мкг НА на штамм, хотя могут применяться более низкие дозы, например, для детей, или в пандемических ситуациях, или при применении адъюванта. Используются частичные дозы, такие как 1/2 (т.е. 7,5 мкг НА на штамм), 1/4 и 1/8, при этом имеются более высокие дозы (например, 3х или 9х дозы [30,31]). Таким образом вакцины могут содержать между 0,1 и 150 мкг НА на штамм гриппа, предпочти
тельно между 0,1 и 50 мкг, например 0,1-20, 0,1-15, 0,1-10, 0,1-7,5, 0,5-5 мкг и т.д. Отдельные дозы содержат, например, приблизительно 45, приблизительно 30, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 7,5, приблизительно 5, приблизительно 3,8, приблизительно 3,75, приблизительно 1,9, приблизительно 1,5 и т.д. на штамм.
Для живых вакцин дозирование измеряют с помощью полуинфицирующей дозы культуры ткани (TCID50), а не содержанием НА, причем обычной является TCID50, составляющая между 106 и 108 (предпочтительно между 106'5-107'5) на штамм.
Штаммы гриппа, применяемые с изобретением, могут иметь естественный НА, который обнаружен в вирусе дикого типа, или модифицированный НА. Например, известно модифицирование НА для удаления детерминант (например, гипербазовых областей вокруг сайта расщепления НА1/НА2), которые являются причиной сильной патогенности вируса для видов птиц. Использование обратной генетики облегчает подобные модификации.
Штаммы вируса гриппа для использования в вакцинах изменяются от сезона к сезону. В периоды между пандемиями вакцины как правило включают два штамма гриппа A (H1N1 и H3N2) и один штамм гриппа В, и обычными являются тривалентные вакцины. Изобретение может также использовать пандемические штаммы вирусов (т.е. штаммы, к которым получатель вакцины и в целом человеческая популяция не подвергались иммунологическому воздействию, в частности вируса гриппа А), такие как штаммы подтипа Н2, Н5, Н7 или Н9, и противогриппозные вакцины для пандемических штаммов могут быть моновалентными или могут быть основаны на нормальной тривалентной вакцине, дополненной пандемическим штаммом. Однако, в зависимости от сезона и от природы антигена, включенного в вакцину, изобретение может защищать против одного или более НА подтипов H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16. Изобретение может защищать против одного или более NA подтипов N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 или N9 вируса гриппа А.
Подходя для иммунизации против штаммов в период между пандемиями, композиции изобретения особенно полезны для иммунизации против пандемических или потенциально пандемических штаммов. Характеристиками штамма гриппа, которые придают ему потенциал вызывать пандемическую вспышку, являются: (а) он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютининами в распространяющихся в настоящее время человеческих штаммах, т.е. штамме, который не был замечен в человеческой популяции на протяжении десятилетия (например, Н2), или совсем не был замечен в человеческой популяции (например, Н5, Н6 или Н9, которые вообще были обнаружены только в популяциях птиц), так что человеческая популяция не подвергалась иммунологическому воздействию против гемагглютинина штамма; (b) он способен передаваться горизонтально в человеческой популяции; и (с) он является патогенным для людей. Вирус с гемагглютинином типа Н5 является предпочтительным для иммунизации против пандемического гриппа, такого как штамм H5N1. Другие возможные штаммы включают H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 и H7N7 и любые другие потенциально появляющиеся пандемические штаммы. Изобретение особенно полезно для защиты против потенциальных пандемических вирусных штаммов, которые могут или распространились из нечеловеческой животной популяции на людей, например штамм гриппа H1N1, происходящий от свиней. Тогда изобретение подходит для вакцинации людей, а также животных, не являющихся людьми.
Другими штаммами, антигены которых могут быть полезно включены в композиции, являются штаммы, которые устойчивы к противовирусной терапии (например, устойчивые к осельтамивиру [32] и/или занамавиру), включая резистентные пандемические штаммы [33].
Композиции изобретения могут включать антиген (антигены) из одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа A и/или вирус гриппа В. Когда вакцина содержит более чем один штамм гриппа, различные штаммы, как правило, выращивают раздельно и смешивают после того, как вирусы собраны и приготовлены антигены. Таким образом процесс изобретения может включать стадию смешивания антигенов из более чем одного штамма гриппа. Типичной является тривалентная вакцина, включающая антигены из двух штаммов вируса гриппа A и одного штамма вируса гриппа В. Полезной является также четырехвалентная вакцина [34], содержащая антигены из двух штаммов вируса гриппа А и из двух штаммов вируса гриппа B либо трех штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В.
Фармацевтические композиции.
Композиции вакцины, изготовленные согласно изобретению, являются фармацевтически приемлемыми. Они обычно включают компоненты в дополнение к антигенам, например, они, как правило, включают один или более фармацевтический носитель (носители) и/или эксципиент (эксципиенты). Как описано ниже, также могут быть включены адъюванты. Подробное обсуждение данных компонентов предоставлено в ссылке 35.
Композиции вакцины по большей части будут находиться в водной форме. Однако, некоторые вакцины могут находиться в сухой форме, например в форме твердых веществ для инъекций или высушенных или полимеризованных препаратов на пластыре.
Композиции вакцины могут включать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Является предпочтительным, однако, чтобы вакцина, по существу, не содержала (т.е. менее чем 5 мкг/мл)
ртутного материала, например не содержала тиомерсал [26, 36]. Вакцины, не содержащие ртуть, являются более предпочтительными. В качестве альтернативы соединениям ртути может быть включен а-токоферол сукцинат [26]. Не содержащие консерванты вакцины являются особенно предпочтительными.
Для регулирования тоничности является предпочтительным включение физиологической соли, такой как натриевая соль. Натрия хлорид (NaCl), который может присутствовать между 1 и 20 мг/мл, является предпочтительным. Другие соли, которые могут присутствовать, включают калия хлорид, калия дигидрофосфат, динатрия фосфат дигидрат, магния хлорид, кальция хлорид и т.д.
Композиции вакцины будут по большей части иметь осмоляльность, составляющую между 200 и 400 мОсм/кг, предпочтительно между 240-360 мОсм/кг и будет более предпочтительно попадать в пределы диапазона 290-310 мОсм/кг. Как предварительно сообщалось, осмоляльность не имеет влияния на боль, обусловленную вакцинацией [37], но сохранение осмоляльности в данном диапазоне является, тем не менее, предпочтительным.
Композиции вакцины могут включать один или более буферов. Типичные буферы включают фосфатный буфер; трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (особенно с адъ-ювантом гидроксидом алюминия) или цитратный буфер. Буферы будут, как правило, включены в диапазоне 5-20 мМ.
pH композиции вакцины по большей части будет составлять между 5,0 и 8,1 и более типично между 6,0 и 8,0, например 6,5 и 7,5 или между 7,0 и 7,8. Вследствие этого, процесс изобретения может включать стадию регулирования pH нерасфасованной вакцины перед упаковыванием.
Композиция вакцины предпочтительно является стерильной. Композиция вакцины является предпочтительно апирогенной, например содержащей <1 EU (единица эндотоксина, стандартное измерение) на дозу и предпочтительно <0,1 EU на дозу. Композиция вакцины предпочтительно не содержит глютен.
Композиции вакцины изобретения могут включать детергент, например поверхностно-активное вещество полиоксиэтиленовый сложный эфир сорбитана (известный как "Tweens"), октоксинол (такой как октоксинол-9 (Triton X-100) или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), цетилтриметил аммония бромид ("СТАВ"), или натрия дезоксихолат, особенно для вакцины с расщепленным или поверхностным антигеном. Детергент может присутствовать только в следовых количествах. Таким образом, вакцина может включать менее чем 1 мг/мл каждая из октоксинол-10 и полисорбат 80. Другими оставшимися компонентами в следовых количествах могут быть антибиотики (например, неомицин, канамицин, по-лимиксин В).
Композиция вакцины может включать материал для единственной иммунизации или может включать материал для многократных иммунизации (т.е. "многодозовый" набор). В многодозовых компоновках предпочтительным является включение консерванта. В качестве альтернативы (или в дополнение) к включению консерванта в многодозовых композициях, композиции могут содержаться в контейнере, имеющем асептическое приспособление для извлечения материала.
Противогриппозные вакцины, как правило, вводят в объеме дозировки, равном приблизительно 0,5 мл, хотя детям можно вводить половинную дозу (т.е. приблизительно 0,25 мл).
Композиции и наборы предпочтительно хранят между 2 и 8°C. Их нельзя замораживать. В идеале, их надо защищать от прямого света.
Клетка-хозяин ДНК.
Когда вирус изолирован и/или растет на клеточной линии, общепринятой практикой является минимизация количества остаточной клеточной линии ДНК в итоговой вакцине, для того чтобы минимизировать любую онкогенную активность ДНК.
Таким образом, композиция вакцины, приготовленная согласно изобретению, предпочтительно содержит менее чем 10 нг (предпочтительно менее чем 1 нг и более предпочтительно менее чем 100 нг) остаточной ДНК клетки-хозяина на дозу, хотя следовые количества ДНК клетки-хозяина могут присутствовать.
Предпочтительным является, чтобы средняя длина любой остаточной ДНК клетки-хозяина составляла менее чем 500 пн, например менее чем 400 пн, менее чем 300 пн, менее чем 200 пн, менее чем 100 пн и т. д.
Загрязнение ДНК может быть устранено в процессе получения вакцины с применением стандартных методик очистки, например хроматографии и т. д. Удаление остаточной ДНК клетки-хозяина может быть усилено посредством нуклеазной обработки, например за счет использования ДНКазы. Удобный способ уменьшения загрязнения ДНК клетки-хозяина раскрыт в ссылках 38 и 39 с включением двухста-дийной обработки, сперва применяя ДНКазу (например, Benzonase), которая может быть использована во время вирусного роста, а затем катионный детергент (например, СТАВ), который может быть использован во время разрушения вириона. Обработка алкилирующим агентом, таким как р-пропиолактон, также может быть применена для удаления ДНК клетки-хозяина, и преимущественно также может быть использована для инактивирования вирионов [40].
Адъюванты.
Композиции изобретения могут преимущественно содержать адъювант, функция которого может
быть связана с усилением иммунных ответов (гуморального и/или клеточного), вызываемых у субъекта, который получает композицию. Предпочтительные адъюванты включают эмульсии типа масло в воде. Известны различные подобные адъюванты, и они обычно содержат по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, при этом масло (масла) и поверхностно-активное вещество (вещества) являются биоразлагаемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Масляные капли в эмульсии по большей части составляют менее чем 5 мкм в диаметре, и в идеале имеют субмикронный диаметр, причем данные малые размеры достигаются с помощью микрофлюидайзера для предоставления стабильных эмульсий. Капли с размером менее чем 220 нм являются предпочтительными, так как они могут быть подвергнуты стерилизации фильтрацией.
Эмульсия может включать в себя такие масла, как масла животных (такие как рыба) или растительных источников. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Примерами ореховых масел являются арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, наиболее широко доступные. Может применяться масло жожоба, например, полученное из бобов жожоба. Масла семян включают подсолнечное масло, масло семян хлопчатника, масло из семян подсолнечника, масло из семян кунжута и тому подобное. В зерновой группе наиболее легко доступным является кукурузное масло, но также может использоваться масло других хлебных злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и тому подобное. Сложные эфиры жирных кислот с 6-10 атомами углерода глицерола и 1,2-пропандиола, хотя не встречаются в природе в маслах семян, могут быть приготовлены посредством гидролиза, разделения и эстерефикации соответствующих материалов, начиная с масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих преобразуются в ходе обмена веществ и вследствие этого могут использоваться при практической реализации данного изобретения. Методики разделения, очистки, омыления и другие средства, необходимые для получения чистого масла из животных источников, хорошо известны в данной области. Большая часть рыб содержат метаболизируемые жиры, которые легко могут быть восстановлены. Например, жир печени трески, жир печени акулы и китовый жир, такой как спермацетовый, являются примерами некоторых из жиров рыб, которые могут быть использованы в данном изобретении. Ряд жиров с разветвленными цепями синтезированы биохимически в виде изопрено-вых звеньев с 5 атомами углерода и в общем называются терпеноиды. Жир печени акулы содержит разветвленные, ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19, 23-гексаметил-2,6,10,14,18, 22-тетракозагексаен, который является особенно предпочтительным для данного изобретения. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также является предпочтительным жиром. Рыбные жиры, включая сква-лен и сквалан, являются легко доступными из коммерческих источников или могут быть получены с помощью методов, известных в данной области. Еще одним предпочтительным жиром является а-токоферол (см. ниже).
Могут применяться смеси масел.
Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по их 'HLB' (гидрофильно-липофильному балансу). Предпочтительные поверхностно-активные вещества изобретения имеют HLB, равный по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, а более предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение может применяться с поверхностно-активными веществами, включая, но без ограничения: поверхностно-активные вещества в виде полиоксиэтиленовых сложных эфиров сорбита (широко известные как Tween), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), про-пиленоксида (РО) и/или бутиленоксида (ВО), продаваемые под торговым названием DOWFAX(tm), такие как линейные ЕО/РО блок-сополимеры; октоксинолы, которые могут варьировать в виде ряда повторяющихся этокси (окси-1,2-этандиил) групп, при этом октоксинол-9 (Triton X-100, или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особый интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGE-PAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенол этоксилаты, такие как серии NP Tergitol(tm); полиоксиэтиленовые жирные эфиры, производные лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известных как поверхностно-активные вещества Brij), такие как триэтиленгликоль монолауриловый эфир (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (широко известные, как SPAN), такие как сорбитан триолеат (Span 85) и сорбитан монолаурат. Предпочтительными являются неионные поверхностно-активные вещества. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются Tween 80 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат), Span 85 (сорбитан триолеат), лецитин и Triton X-100.
Можно применять смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Tween 80/Span 85. Также подходит комбинация полиоксиэтиленового сложного эфира сорбитана, такого как полиоксиэтилено-вый сорбитан моноолеат (Tween 80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100). Еще одна подходящая комбинация включает лаурет 9 плюс полиоксиэтиленовый сложный эфир сорбитана и/или октоксинол.
Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (мас.%) составляют: полиоксиэти-леновые сложные эфиры сорбитана (такие как Tween 80) от 0,01 до 1%, в частности приблизительно 0,1%; октил- или нонилфенокси полиоксиэтанолы (такие как Triton X-100, или другие детергенты в серии Triton) от 0,001 до 0,1%, в частности от 0,005 до 0,02%; полиоксиэтиленовые эфиры (такие как лаурет 9)
от 0,1 до 20%, предпочтительно от 0,1 до 10% и, в частности, от 0,1 до 1% или приблизительно 0,5%.
Когда вакцина содержит расщепленный вирус, предпочтительным является, чтобы он содержал свободное поверхностно-активное вещество в водной фазе. Это является преимуществом, так как свободное поверхностно-активное вещество может оказывать "расщепляющее действие" на антиген, разрушая за счет этого любые нерасщепленные вирионы и/или агрегаты вирионов, которые иначе могут присутствовать. Это может улучшить безопасность вакцин с расщепленными вирусами [41].
Предпочтительные эмульсии имеют средний размер капель, составляющий <1 мкм, например <750, <500, <400, <300, <250, <220, <200 нм или менее. Данные размеры капель в целях удобства могут быть достигнуты с помощью таких методик, как микрофлюидизация.
Конкретные адъюванты эмульсии масло-в-воде, подходящие для изобретения, включают, но без ограничения:
субмикронную эмульсию сквалена, Tween 80 и Span 85. Композиция эмульсии по объему может составлять приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5% Span 85. В терминах массы, данные соотношения составляют 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Данный адъювант известен как 'MF59' [42-44], который более подробно описан в Главе 10 ссылки 45 и главе 12 ссылки 46. Эмульсия MF59 преимущественно содержит ионы лимонной кислоты, например, 10 мМ буфера цитрата натрия;
эмульсию сквалена, DL-а-токоферола и полисорбата 80 (Tween 80). Эмульсия может содержать физиологический раствор с фосфатным буфером. Она может также включать Span 85 (например, 1%) и/или лецитин. Данные эмульсии могут иметь от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% Tween 80, и массовое соотношение сквален:токоферол составляет предпочтительно <1, так как это обеспечивает более стабильную эмульсию. Сквален и Tween 80 могут быть представлены объемным соотношением, составляющим приблизительно 5:2 или с массовым соотношением, составляющим приблизительно 11:5. Одна подобная эмульсия может быть изготовлена посредством растворения Tween 80 в PBS для предоставления 2% раствора, затем перемешивания 90 мл данного раствора со смесью (5 г DL-a-токоферола и 5 мл сквалена), затем микрофлюидизации смеси. Полученная в результате эмульсия может иметь субмикронные масляные капли, например, со средним диаметром между 100 и 250 нм, предпочтительно приблизительно 180 нм. Эмульсия может также включать 3-дез-O-ацилированный монофосфори-ловый липид A (3d-MPL). Еще одна подходящая эмульсия данного типа может включать, на человеческую дозу, 0,5-10 мг сквалена, 0,5-11 мг токоферола и 0,1-4 мг полисорбата 80 [47];
эмульсию сквалена, токоферола, и детергента Triton (например, Triton X-100). Эмульсия может также содержать 3d-MPL (см. ниже). Эмульсия может содержать фосфатный буфер;
эмульсию, содержащую полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Triton (например, Triton X-100) и токоферол (например, а-токоферола сукцинат). Эмульсия может содержать данные три компонента с массовым соотношением, составляющим приблизительно 75:11:10 (например, 750 мкг/мл поли-сорбата 80, 110 мкг/мл Triton X-100 и 100 мкг/мл а-токоферола сукцината), и данные концентрации должны включать любую долевую составляющую данных компонентов из антигенов. Эмульсия может также содержать сквален. Эмульсия может также содержать 3d-MPL (см. ниже). Водная фаза может содержать фосфатный буфер;
эмульсию сквалана, полисорбата 80 и полоксамера 401 ("Pluronic(tm) L12T"). Эмульсия может быть получена в виде готовой формы в физиологическом растворе с фосфатным буфером, pH 7,4. Данная эмульсия является подходящей средой для доставки для мурамил-дипептидов, и используется с треонил-MDP в адъюванте "SAF-1 [48] (0,05-1% Thr-MDP, 5% сквалана, 2,5% Pluronic L121 и 0,2% полисорбата 80). Ее также можно использовать без Thr-MDP, как в адъюванте "AF" [49] (5% сквалана, 1,25% Pluronic LI 21 и 0,2% полисорбата 80). Предпочтительной является микрофлюидизация;
эмульсию, содержащую сквален, водный растворитель, гидрофильное неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтиленовый алкил эфир (например, полиоксиэтиленовый (12) кетостеарил эфир) и гидрофобное неионное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида, такой как сорбитана монолеат или 'Span 80'). Эмульсия предпочтительно является термообратимой и/или имеет по меньшей мере 90% масляных капель (по объему) с размером меньше, чем 200 нм [50]. Эмульсия может также включать одно или более из: алдитола; криозащитного агента (например, сахара, такого как додецилмальтозид и/или сахароза); и/или алкилполигликозида. Эмульсия может содержать агонист TLR4 [51]. Подобные эмульсии могут быть лиофилизированы;
эмульсию сквалена, полоксамера 105 и Abil-Care [52].
Итоговая концентрация (масса) данных компонентов в содержащих адъюванты вакцинах составляет 5% сквалена, 4% полоксамера 105 (плюронилового полиола) и 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 диметикон; каприловый/каприновый триглицерид);
эмульсию, имеющую от 0,5-50% масла, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионного поверхностно-активного вещества. Как описано в ссылке 53, предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфати-дилглицерол, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Преимущественными являются суб
микронные размеры капель;
субмикронную эмульсию типа масло в воде неметаболизируемого масла (такого как легкое, минеральное масло) и по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества (такого как лецитин, Tween 80 или Span 80). Могут содержаться аддитивы, такие как сапонин QuilA, холестерин, сапонин-липофильный конъюгат (такой как GPI-0100, описанный в ссылке 54, получаемый за счет добавления алифатического амина в дезацилсапонин через карбоксиловую группу глюкуроновой кислоты), диме-тилдиоктадециламмоний бромид и/или ^^диоктадецил-^^бис (2-гидроксиэтил)пропандиамин;
эмульсию, в которой сапонин (например, Quil А или QS21) и стерол (например, холестерин) связаны в виде спиралевидных мицелл [55];
эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт, и неионное гидрофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или полиоксиэтилен- полиоксипропилен блок-сополимер) [56];
эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный гидрофильный этоксилированный жирный спирт, и неионное липофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен) [56].
В некоторых вариантах осуществления эмульсия может быть смешана с антигеном без подготовки, во время доставки, и таким образом адъювант и антиген можно содержать раздельно в упакованной или распределенной вакцине, готовой для приготовления конечного лекарственного состава во время использования. В других вариантах осуществления эмульсию смешивают с антигеном во время изготовления, и таким образом композицию упаковывают в форме жидкой добавки в качестве адъюванта. Антиген по большей части будет в водной форме так, что вакцину в итоге получают посредством перемешивания двух жидкостей. Объемное отношение двух жидкостей для перемешивания может варьировать (например, между 5:1 и 1:5), но по большей части составляет приблизительно 1:1. Когда в описаниях выше приведены концентрации компонентов конкретных эмульсий, данные концентрации обычно предназначены для неразбавленной композиции, и концентрация после перемешивания с раствором антигена таким образом будет меньше.
Упаковка композиций вакцины.
Подходящие контейнеры для композиций изобретения (или компонентов набора) включают ампулы, шприцы (например, одноразовые шприцы), назальные спреи и т.д. Данные контейнеры должны быть стерильными.
Когда композиция/компонент находится в ампуле, ампулу предпочтительно изготавливают из стеклянного или пластмассового материала. Ампулу предпочтительно стерилизуют перед добавлением в нее композиции. Чтобы избежать проблем с чувствительными к латексу пациентами, ампулы предпочтительно герметично закрывают безлатексной пробкой, и предпочтительным является отсутствие латекса во всех упаковочных материалах. Ампула может включать единичную дозу вакцины или она может включать более чем одну дозу ("многодозовая" ампула), например 10 доз. Предпочтительные ампулы изготавливают из бесцветного стекла.
Ампула может иметь колпачок (например, наконечник Луэра), выполненный таким образом, чтобы в колпачок можно было вставлять предварительно наполненный шприц, содержимое шприца можно было вытолкнуть в ампулу (например, для восстановления в ней лиофилизированного материала), и содержимое ампулы можно было вернуть назад в шприц. После извлечения шприца из ампулы затем можно прикрепить иглу, и композицию можно ввести пациенту. Колпачок предпочтительно помещают внутри клапана или крышки, таким образом, чтобы клапан или крышку необходимо было удалить перед тем, чтобы можно было получить доступ к крышке, ампула может иметь колпачок, который обеспечивает возможность асептического извлечения ее содержимого, особенно для многодозовых ампул.
Когда компонент упаковывают в шприц, шприц может иметь прикрепленную к нему иглу. Если игла не прикреплена, отдельная игла может поставляться со шприцом для сборки и использования. Подобная игла может быть заключена в чехол. Предпочтительными являются безопасные иглы. Типичными являются иглы 1-дюймовая 23-го калибра, 1-дюймовая 25-го калибра и 5/8-дюймовая 25-го калибра. Шприцы могут быть снабжены отрывными этикетками, на которых могут быть напечатаны номер партии, год гриппа и дата истечения срока годности содержимого, для облегчения ведения записей. Поршень в шприце предпочтительно имеет стопор для предотвращения случайного удаления поршня во время аспирации. Шприцы могут иметь латексный резиновый колпачок и/или поршень. Одноразовые шприцы содержат единственную дозу вакцины. Шприц по большей части будет иметь защитный колпачок для герметизации кончика перед креплением иглы, при этом защитный колпачок предпочтительно изготавливают из бутилкаучука. Если шприц и игла упакованы раздельно, то иглу предпочтительно оснащают бутилкаучуковой защитой. Предпочтительными шприцами являются шприцы, продаваемые под торговым названием "Tip-Lok"(tm).
Контейнеры могут быть маркированы, чтобы показать объем половины дозы, например, для облечения введения детям. Например, шприц, содержащий дозу 0,5 мл, может иметь отметку, показывающую объем 0,25 мл.
Когда используют стеклянный контейнер (например, шприц или ампулу), то предпочтительным яв
ляется использовать контейнер, изготовленный из боросиликатного стекла, а не из известково-натриевого стекла.
Набор или композиция может быть упакована (например, в одной и той же коробке) с аннотацией, содержащей подробности о вакцине, например, инструкции для введения, подробности об антигенах в вакцине, и т.д. Инструкции могут также содержать предупреждения, например, иметь доступный подготовленный раствор адреналина в случае анафилактической реакции в результате вакцинации и т.д.
Методы лечения и введение вакцины.
Изобретение предоставляет вакцину, изготовленную согласно изобретению. Данные композиции вакцины подходят для введения человеку или субъектам-животным, не являющимся человеком, таким как свиньи, и изобретение предоставляет способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий стадию введения композиции изобретения субъекту. Изобретение также предоставляет композицию изобретения для использования в качестве лекарственного средства, и предоставляет применение композиции изобретения для изготовления лекарственного средства для усиления иммунного ответа у субъекта.
Иммунный ответ, усиленный посредством данных методов, и применения будут по большей части включать гуморальный иммунный ответ, предпочтительно защитный гуморальный иммунный ответ. Методы оценки гуморальных иммунных ответов, нейтрализующей способности и защиты после вакцинации против вируса гриппа хорошо известны в данной области. Исследования на людях показали, что титры антител против гемагглютинина вируса гриппа человека коррелируют с защитой (титр образца сыворотки торможения геммаглютинации, составляющий приблизительно 30-40, обеспечивает приблизительно 50% защиту от заражения гомологичным вирусом) [57]. Гуморальные иммунные ответы как правило измеряются посредством торможения геммаглютинации, посредством микронейтрализации, посредством одномерной радиальной иммунодиффузии (SRID), и/или посредством одиночного радиального гемолиза (SRH). Данные методики исследования хорошо известны в данной области.
Композиции изобретения могут быть введены различными путями. Наиболее предпочтительным способом иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в руку или ногу), но другие пригодные способы включают подкожную инъекцию, интраназальный [58-60], пероральный [61], интрадер-мальный [62,63], чрескожный, трансдермальный [64], и т.д. Вакцины, приготовленные согласно изобретению, могут быть использованы для лечения как детей, так и взрослых. Противогриппозные вакцины в настоящее время рекомендованы для использования в иммунизации детей и взрослых, с возраста, равного 6 месяцев. Таким образом субъект-человек может иметь возраст менее чем 1 год, 1-5 лет, 5-15 лет, 1555 лет или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительные субъектами для получения вакцины являются пожилые люди (например, возраста > 50 лет, > 60 лет и предпочтительно > 65 лет), юные (например, возраста <5 лет), госпитализированные субъекты, сотрудники службы здравоохранения, личный состав вооруженных сил и военный персонал, беременные женщины, хронически больные, страдающие иммунодефицитом субъекты, субъекты, которые получили противовирусное соединение (например, соединение осельтамивир или зенамивир; см. ниже) за 7 дней до получения вакцины, люди с аллергией на яйца и люди, путешествующие за границу. Однако вакцины пригодны не только для данных групп, и могут быть использованы более широко для населения. Для пандемических штаммов, предпочтительным является введение всем возрастным группам.
Предпочтительные композиции изобретения удовлетворяют 1, 2 или 3 критериям эффективности СРМР. У взрослых (18-60 лет), данными критериями являются: (1) серопротекция > 70%; (2) сероконвер-сия > 40%; и/или (3) повышение GMT, составляющее > 2,5 раза, у пожилых людей (> 60 лет), данными критериями являются: (1) серопротекция > 60%; (2) сероконверсия > 30%; и/или (3) повышение GMT, составляющее > 2 раза. Данные критерии основаны на открытых исследованиях по меньшей мере с 50 пациентами.
Лечение может проходить в режиме однократных инъекций или в режиме многократных инъекций. Многократные дозы могут быть использованы в программе первичной иммунизации и/или в программе бустер-иммунизации. В режиме многократных доз различные дозы могут быть даны одними теми же или различными способами, например, а парентеральная первичная и слизистая повторная доза, слизистая первичная и парентеральная повторная доза, и т.д. Введение более чем одной дозы (как правило двух доз) особенно полезно для пациентов, не подвергавшихся иммунологическому воздействию, например, для людей, которые ранее никогда не получали противогриппозную вакцину, или для вакцинации против нового подтипа НА (как при пандемических вспышках). Многократные дозы, как правило, будут вводить по меньшей мере с интервалом в 1 неделю (например, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 6 недель, приблизительно 8 недель, приблизительно 10 недель, приблизительно 12 недель, приблизительно 16 недель и т.д.).
Вакцины, получаемые с помощью изобретения, могут быть введены пациентам, по существу, в то же самое время (например, во время одной и той же медицинской консультации или визита к работнику здравоохранения или в центр вакцинации), как и другие вакцины, например, по существу, в то же самое время, как и вакцина против кори, вакцина против паротита, вакцина против коревой краснухи, тривак-цина против кори, паротита и коревой краснухи, вакцина против ветряной оспы, тетравакцина против
кори, паротита, коревой краснухи и ветряной оспы, вакцина против дифтерии, противостолбнячная вакцина, противококлюшная вакцина, вакцина КДС, конъюгированная вакцина против H.influenzae типа b, инактивированная полиовирусная вакцина, вакцина против вируса гепатита В, менингококковая конъю-гированная вакцина (такая как четырехвалентная вакцина А-C-W135-Y), вакцина против респираторного синцитиального вируса, пневмококковая конъюгированная вакцина и т.д. Введение, по существу, в одно и то же время как пневмококковой вакцины, так и/или менингококковой вакцины является особенно полезным у пожилых пациентов.
Аналогичным образом, вакцины изобретения могут быть введены пациентам, по существу, в то же самое время (например, во время одной и той же медицинской консультации или визита к работнику здравоохранения), что и противовирусное соединение, и в частности противовирусное соединение, активное против вируса гриппа (например, осельтамивир и/или зенамивир). Данные противовирусные препараты включают ингибиторы нейраминидазы, такие как (3К,4К^)-4-ацетилшино-5-амино-3(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая ксилота или 5-(ацетиламино)-4-[(аминоиминоэтил)-амино]-2,6-ангидро-3,4,5-тридезокси-D-глицеро-D-галактонон-2-эноновая кислота, включая их сложные эфиры (например, сложные этиловые эфиры) и их соли (например, фосфатные соли). Предпочтительные противовирусным препаратом является (3R,4R,5S)-4-ацетиламино-5-амино-3(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота, сложный этиловый эфир, фосфат (1:1), также известный как осельтамивир фосфат
(TAMIFLU(tm)).
Общая часть.
Термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий", например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительное, например X+Y.
Слово "по существу" не исключает "полностью", например, композиция, которая "по существу не содержит" Y может полностью не содержать Y. При необходимости, слово "по существу" может быть исключено из определения изобретения.
Термин "приблизительно" в отношении числового значения х является необязательным и означает, например, х±10%.
Если конкретно не оговорено, процесс, включающий стадию перемешивания двух или более компонентов, не требует какого-либо конкретного порядка перемешивания. Таким образом, компоненты можно перемешивать в любом порядке. Когда имеется три компонента, то два компонента можно соединить друг с другом, а затем комбинацию можно соединить с третьим компонентом и т.д.
Когда в культуре клеток используют животные материалы (а конкретно крупного рогатого скота), их следует получать из источников, которые не содержат трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSR), а в частности не содержат губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE). В общем, предпочтительно культивировать клетки при полном отсутствии материалов животного происхождения.
Когда соединение вводят в организм в виде части композиции, то данное соединение в качестве альтернативы может быть заменено подходящим пролекарством.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - схематичное представление варианта осуществления настоящего изобретения; суспензию клеток MDCK 33016 (культивированных в CDM) высевали на планшете с 6 лунками А (в не содержащей сыворотку среде или DMEM+5% FBS); В: совместная трансфекция MDCK 33016; С: промывание 2х, замена на не содержащую сыворотку DMEM, + trypzean, +/- свежие, незараженные клетки MDCK, D: вирус
RG.
Фиг. 2 - эффективность спасения вируса гриппа в клетках MDCK 33016 с использованием основы PR8-A/CA; у - ось показывает титр инфекции (FFU/мл); незаштрихованные прямоугольные диаграммы показывают результаты с PR8-A/CA и 5% сывороткой, а заштрихованные прямоугольные диаграммы показывают результаты с PR8-A/CA и без сыворотки; А обозначает, что добавляли свежие незараженные клетки; В обозначает, что не добавляли свежие незараженные клетки.
Фиг. 3 - эффективность спасения вируса гриппа в клетках MDCK 33016 с использованием основы A/WSN/33; ось у показывает титр инфекции (FFU/мл); незаштрихованные прямоугольные диаграммы показывают результаты с WSN и 5% сывороткой, а заштрихованные прямоугольные диаграммы показывают результаты с WSN и без сыворотки; А обозначает, что добавляли свежие незараженные клетки; В обозначает, что не добавляли свежие незараженные клетки.
Фиг. 4 - эффективность спасения вируса гриппа в клетках MDCK 33016 с использованием основы PR8-WSN, ось у показывает FFU/мл; незаштрихованные прямоугольные диаграммы показывают результаты с PR8-WSN и 5% сывороткой, а заштрихованные прямоугольные диаграммы показывают результаты с PR8-WSN и без сыворотки; А обозначает, что добавляли свежие незараженные клетки; В обозначает, что не добавляли свежие незараженные клетки.
Варианты осуществления изобретения
Спасение вируса.
Клетки MDCK 33016 культивировали в суспензии в среде CDM при температуре, равной 37°C. За
день перед трансфекцией 6х 105 клеток/лунку посеяли на планшете с 6 лунками CELL-BIND(tm) в 2 мл среды DMEM с 5% FCS. В параллельном эксперименте клетки посеяли в отсутствии FCS. Клетки инкубировали при 37°C в течение ночи.
На следующий день посеянные клетки трансфицировали реагентом для трансфекции Lipofec-tamine(tm) LTX Plus, используя протокол производителя. Кратко, 1 мкг каждой плазмиды (PA, PB1, РВ2, NP, NS, М, НА, NA плюс TMPRSS2) разбавляли в 500 мкл не содержащей сыворотку среды DMEM. 10 мкл реагента Plus добавляли непосредственно в разбавленную ДНК. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, после чего к ней добавляли 25 мкл Lipofectamin. Затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Вслед за инкубированием, к клеткам по каплям добавляли комплекс реагент для трансфекции:ДНК. Впоследствии клетки инкубировали при 37°C в течение 24 ч.
Вслед за инкубированием, среду аспирировали из клеток, а в каждую лунку добавляли суспензию 4х105 клеток MDCK 33016 в не содержащей сыворотку среде DMEM, заключающей в себе Trypzean(tm) с разбавлением 1:2000 (1 мг/мл исходного раствора). В параллельном эксперименте к трансфицированным клеткам добавляли только Trypzean(tm) с разбавлением 1:2000 (1 мг/мл исходного раствора), т.е. без добавления клеток. Затем клетки инкубировали при 37°C еще в течение 48 ч или до тех пор, пока клетки не были лизированы, после чего определяли вирусный титр с применением формирующего фокус исследования.
Формирующие фокус исследования.
Незараженные клетки MDCK высевали с плотностью, равной 6,25х104 клеток/лунку, на планшете с 48 лунками в 500 мкл DMEM с 10% FCS. На следующий день клетки заражали вирусами в объеме, равном 100-150 мкл в течение 2 ч при 37°C. Клетки заражали вирусами с различными разбавлениями. Через два часа после заражения среду аспирировали и в каждую лунку добавляли 500 мкл DMEM с 10% FCS. Клетки инкубировали при 37°C до следующего дня.
Через 24 ч после заражения среду аспирировали, а клетки промывали один раз PBS. В каждую лунку добавляли 500 мкл ледяного 80% ацетона в PBS с последующим инкубированием при 4°C в течение 30 мин. Смесь ацетона аспирировали, и клетки промывали один раз PBST (PBS + 0,1% Tween). В каждую лунку добавляли 500 мкл 2% BSA в PBS с последующим инкубированием при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин. 500 мкл анти-NP с разбавлением 1:6000 добавляли в блокирующем буфере с последующим инкубированием при RT в течение 2 ч. Раствор антител аспирировали, и клетки промывали два раза PBST. Вторичные антитела (козьи антимышиные) добавляли с разбавлением 1:2000 в 500 мкл блокирующего буфера, и планшет инкубировали при RT в течение 2 ч. Раствор антител аспирировали, и клетки промывали три раза PBST. В каждую лунку добавляли 500 мкл KPL True Blue и инкубировали в течение 10 мин. Реакцию останавливали посредством аспирирования True-Blue и промывания один раз dH2O. Воду аспирировали, а клетки оставляли сохнуть.
Результаты.
Результаты формирующего фокус исследования с тремя различными вирусными основами показаны на фиг. 2-4. Результаты показывают эффективность спасения вируса с добавлением и без добавления клеток через 24 ч после заражения. Как можно видеть, во всех случаях эффективность спасения вируса повышалась трехкратно в экспериментах, когда клетки добавляли через 24 ч после трансфекции по сравнению с экспериментами, когда клетки не добавляли. Данное повышение эффективности можно видеть со всеми исследованными вирусными основами как в условиях с содержанием сыворотки, так и в условиях без содержания сыворотки.
Должно быть понятно, что изобретение было описано исключительно в качестве примера, и модификации могут быть сделаны, оставаясь в то же время в пределах объема правовых притязаний и сущности изобретения.
Ссылки
[1] Racaniello and Baltimore (1981) Science 214:916-919
> J. Virol 73(11):9679-9682. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:
[2] Kaplan et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 84
8428.
[3] Fodor et al. (19
[4] Hoffmann et al
11411-11416.
[5] Kobayashi et al. (2007) Cell Host Microbe 19; 1(2)
141-57.
Molecular Cloning:
[6] WO2009/000891.
[7] Sambrook et al
ed. ,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
[10 [11 [12 [13 [14 [15 [16 [17 [18 [19 [20 [21 16825-9. [22 [23 [24 [25 [26 [27 [28
101-110.
Bruhl et al. (2000) Vaccine 19: 1149-58. Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21. http://www.atcc.org/ http://locus. umdn j . edu/ WO97/37000.
Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.
Halperin et al. (2002) Vaccine 20: 1240-7.
EP-A-1260581 (WO01/64846).
WO20O6/071563.
WO20O5/113758.
WO97/37001.
Neumann et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:
Plotkins & Orenstein). 4th edition,
WO02/28422. WO02/067983. WO02/074336. WO01/21 151. WO02/097072. WO2005/113756. Vaccines, (eds. 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.
[29] Huckriede et al. (2003) Methods Enzymol 373:74-91.
[30] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173: 1467-70.
[31] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.
Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190(9): 1627-30. [33] Le et al (2005) Nature 437(7062): 1108. [34] WO2008/068631.
[35] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[36] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96. [37] Nony et al (2001) Vaccine 27:3645-51. [38] EP-B-0870508. [39] US 5948410. [40] WO2007/052163. [41] WO2007/052061 WO90/14837.
[43] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2: 197-203.
[44] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.
Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell 5 Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-x).
[46] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan. [47] WO2008/043774.
[48] Allison s Byars (1992) Res Immunol 143:519-25. [49] Hariharan et al (1995) Cancer Res 55:3486-9. [50] US-2007/014805. [51] US-2007/0191314.
[52] Suli et al. (2004) Vaccine 22(25-26):3464-9.
[53] WO95/11700.
[54] US patent 6,080,725.
[55] WO2005/097181.
[56] WO2006/113373.
[57] Potter 4 Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.
[58] Greenbaum et al (2004) Vaccine 22:2566-77.
[59] Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-
[60 [61 [62
[63 [64
Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30.
Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9.
Halperin et al. (1979) Am J.Public Health 69: 1247-
Herbert et al (1979) J Infect Dis 140:234-8. Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6.
Список последовательностей
<110> NOVARTIS AG
<120> УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ СПОСОБЫ ОБРАТНОЙ ГЕНЕТИКИ ДЛЯ СПАСЕНИЯ ВИРУСОВ
<130> P055736WO
<14 0> РСТ/1В2010/ <141> 2010-10-20
<150> USSN 61/279,487 <151> 2009-10-20
<160> 4
<170> SeqWin2010, version 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа А
<400> 1
Met Lys Ala lie Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
Ala Asp Thr Leu Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn lie Ala Gly Trp He Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr He
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
He Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu He Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr He Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly He His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gin Gin Ser Leu
195 200 205
He Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gin Asn Ala He Asp Glu He Thr Asn Lys Val Asn Ser Val He
385 390 395 400
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu He Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg He Tyr
515 520 525
Gin He Leu Ala He Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
lie Gly Met Ala Asn Leu He Leu Gin He Gly Asn He He Ser He
20 25 30
Trp He Ser His Ser He Gin Leu Gly Asn Gin Asn Gin He Glu Thr
35 40 45
Cys Asn Gin Ser Val He Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gin
50 55 60
Thr Tyr Val Asn He Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gin Ser Val
65 70 75 80
Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly
85 90 95
Trp Ala He Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg He Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val He Arg Glu Pro Phe He Ser Cys Ser Pro Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gin Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr He Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro He Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly He Asn Trp Leu Thr
180 185 190
He Gly He Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly He He Thr Asp Thr He Lys Ser Trp Arg Asn Asn He Leu
210 215 220
Arg Thr Gin Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225 230 235 240
Val Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gin Ala Ser Tyr Lys He Phe
245 250 255
Arg He Glu Lys Gly Lys He Val Lys Ser Val Glu Met Asn Ala Pro
260 265 270
Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu He
275 280 285
Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
Ser Phe Asn Gin Asn Leu Glu Tyr Gin He Gly Tyr He Cys Ser Gly
305 310 315 320
He Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp He Gly Arg Thr Lys Ser He Ser Ser Arg
355 360 365
Asn Gly Phe Glu Met He Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
Asn Asn Phe Ser He Lys Gin Asp He Val Gly He Asn Glu Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gin His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys He Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu He Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr He Trp Thr Ser Gly Ser Ser He Ser Phe Cys Gly Val
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Thr He Asp Lys
<210> 4
<211> 470
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа A
<400> 4
Met Asn Pro Asn Gin Lys He He Thr He Gly Ser He Cys Met Thr
15 10 15
He Gly He He Ser Leu He Leu Gin He Gly Asn He He Ser He
20 25 30
Trp Val Ser His Ser He Gin Thr Gly Ser Gin Asn His Thr Gly He
35 40 45
Cys Asn Gin Arg He He Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn Gin
50 55 60
Thr Tyr Val Asn lie Asn Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Lys Asp Thr
65 70 75 80
Thr Ser Val Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro He Arg Gly
Trp Ala He Tyr Ser Lys Asp Asn Ser He Arg He Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val He Arg Glu Pro Phe He Ser Cys Ser His Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gin Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ser
145 150 155 160
Cys Pro He Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr
180
185
190
Gly
195
Ser
Gly
Pro
Asp
200
Gly
Ala
Val
Ala
Val 205
Lys
Tyr
Asn
Gly 210
Thr
Glu
Thr 215
Lys
Ser
Trp
220
Lys
Arg
Leu
Arg 225
Thr
Gin
Glu
Ser
Glu 230
Cys
Val
Cys
Val
Asn 235
Gly
Ser
Cys
Phe
Thr 240
Met
Thr
Asp
Gly 245
Pro
Ser
Asn
Gly
Pro 250
Ala
Ser
Tyr
Arg
He 255
Phe
Lys
Glu
Lys 260
Gly
Lys
Thr
Lys 265
Ser
Glu
Leu
Asp 270
Ala
Pro
Asn
Ser
His
275
Tyr
Glu
Glu
Cys
Ser 280
Cys
Tyr
Pro
Asp
Thr
285
Gly
Thr
Val
Met
Cys 290
Val
Cys
Arg
Asp
Asn
295
Trp
His
Gly
Ser
Asn
300
Arg
Pro
Trp
Val
305
Phe
Asn
Gin
Asn
Leu 310
Asp
Tyr
Gin
Gly 315
Tyr
Cys
Ser
Gly
320
Val
Phe
Gly
Asp
Asn
325
Pro
Arg
Pro
Lys
Asp
330
Gly Lys
Gly
Ser
Cys 335
Asp
Pro
Val
Thr
Val
340
Asp
Gly
Ala
Asp
Gly 345
Val
Lys
Gly
Phe
Ser 350
Tyr
Arg
Tyr
Gly
Asn 355
Gly
Val
Trp
Gly 360
Thr
Lys
Ser
Asn 365
Ser
Ser
Arg
Lys
Gly
370
Phe
Glu
Met
Trp
375
Asp
Pro
Asn
Gly
Trp 380
Thr
Asp
Thr
Asp
Ser
385
Asn
Phe
Leu
Val
Lys
390
Gin
Asp
Val
Val
Ala
395
Met
Thr
Asp
Trp
400
Gly
Tyr
Ser
Gly
405
Phe
Val
Gin
His
Pro 410
Glu
Leu
Thr
Gly
Leu 415
Asp
Cys
Met
Arg
420
Cys
Phe
Trp
Val
Glu 425
Leu
Val
Arg
Gly Arg 430
Pro
Glu
Gly
Thr 435
Thr
Val
Trp
Thr
Ser
440
Gly
Ser
Ser
Ser 445
Phe
Cys
Val
Asn 450
Ser
Asp
Thr
Ala
Asn 455
Trp
Ser
Trp
Pro
Asp 460
Gly Ala
Glu
Leu
Pro 465
Phe
Thr
Asp
Lys 470
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения вируса, включающий стадии:
(i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, ко-
дирующей вирусную молекулу РНК;
(ii) добавления клеток, которые не были трансфицированы экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для получения смеси клеток, при этом клетки-хозяева и клетки, добавляемые после трансфек-ции, относятся к одной и той же клеточной линии; и
(iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса.
2. Способ получения вируса, включающий стадии:
(i) трансфекции культуры клеток MDCK по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК;
(ii) добавления клеток MDCK, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам MDCK (i) для получения смеси клеток
MDCK; и
(iii) культивирования смеси клеток MDCK с целью продуцирования вируса.
3. Способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии:
(i) трансфекции культуры клеток-хозяев по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК;
(ii) добавления клеток, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам-хозяевам со стадии (i) для получения смеси клеток, при этом клетки-хозяева и клетки, добавляемые после трансфекции, относятся к одной и той же клеточной линии;
(iii) культивирования смеси клеток с целью продуцирования вируса; и
(iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii).
4. Способ получения вируса для изготовления вакцины, включающий стадии:
(i) трансфекции культуры клеток MDCK по меньшей мере одной экспрессионной конструкцией, кодирующей вирусную молекулу РНК;
(ii) добавления клеток MDCK, которые не были трансфицированы, кодирующей вирусную молекулу РНК, примененной в стадии (i), к трансфицированным клеткам MDCK (i) для получения смеси клеток
MDCK;
(iii) культивирования смеси клеток MDCK с целью продуцирования вируса; и
(iv) очистки вируса, полученного на стадии (iii).
5. Способ по п.1 или 3, в котором клеткой-хозяином является клетка VERO, PER.C6 или MDCK.
6. Способ по пп.2, 4 или 5, в котором клетка MDCK принадлежит клеточной линии MDCK 33016 (DSM ACC2219).
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором клетки культивируют в суспензии.
8. Способ по любому из пп.1-6, в котором клетки культивируют адгезивно.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором вирусом является вирус с фрагментированным геномом.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором вирусом является РНК-вирус с отрицательно заряженной нитью.
11. Способ по п.10, в котором вирусом является вирус гриппа.
12. Способ по любому из пп.1-9, в котором вирусом является вирус с двухцепочечной РНК.
13. Способ по п.12, в котором вирусом является ротавирус.
14. Способ по любому из пп.1-8 или 12, в котором вирусом является вирус с нефрагментированным геномом.
15. Применение вируса, полученного способом по любому из пп.3-6, для получения вакцины.
023811
023811
- 1 -
- 1 -
023811
023811
- 1 -
- 1 -
023811
023811
- 1 -
- 1 -
023811
023811
- 1 -
- 1 -
023811
023811
- 4 -
- 3 -
023811
023811
- 17 -
304.
- 18 -
023811
023811
- 17 -
304.
- 18 -
023811
023811
- 19 -
304.
- 18 -
023811
023811
- 19 -
304.
- 18 -
023811
023811
- 20 -
- 20 -
023811
023811
- 21 -
- 21 -
023811
023811
- 21 -
- 21 -
023811
023811
- 22 -
- 22 -
|
