EA 023793B1 20160729

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000023793b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Применение молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере один свободный конец и часть двухцепочечной ДНК размером 24-200 п.о. с меньше чем 60% идентичностью по последовательности любому гену в человеческом геноме для приготовления лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермической обработкой.

2. Применение по п.1, в котором молекула нуклеиновой кислоты имеет одну из следующих формул: где N является деоксинуклеотидом, n является целым числом от 15 до 195, подчеркнутая N относится к нуклеотиду, имеющему или не имеющему модифицированный фосфодиэфирный каркас, L' является линкером, С является молекулой, обеспечивающей энодоцитоз, выбранной из числа липофильной молекулы или лиганда, который направлен на клеточный рецептор, обеспечивающий рецептор-опосредованный эндоцитоз, L является линкером, m и p независимо равны 0 или 1.

3. Применение по п.1 или 2, в котором молекула нуклеиновой кислоты имеет одну из следующих формул: где подчернутый нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему фосфотиоатный или метилфосфонатный каркас, связанную L' выбирают из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадеокситимидилата (Т4) и 2,19-бис(фосфор)-8-гилдаза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана; m равно 1, a L является карбоксамидоолигоэтиленгликолем, С выбирают из группы, состоящей из одно- или двухцепочечных жирных кислот, таких как октадецил и диолеил, холестерин, токоферол, фолиевая кислота, сахара, такого как галактоза и манноза, и их олигосахарида, пептида, такого как RGD и бомбезина и белка, такого как интегрин, предпочтительно холистерина.

4. Применение по любому из пп.1-3, в котором молекула, облегчающая эндоцитоз, является холестерином.

5. Применение по любому из пп.1-4, в котором молекулу нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из

6. Применение по любому из пп.1-5, в котором молекула нуклеиновой кислоты является

7. Применение по любому из пп.1-6, в котором гипертермическая обработка включает температуру по меньшей мере 41°С, предпочтительно по меньшей мере 42°С.

8. Применение по любому из пп.1-7, в котором гипертермическую обработку осуществляют микроволновым излучением (РЧА), ультразвуком, инфракрасными лучами, наночастицами или нанотрубками, индукционным нагревом, магнитной гипертермией, перфузией или инфузией предварительно нагретой жидкости, такой как кровь, внутрибрюшинно нагретый поток или прямое применение нагрева.

9. Применение по любому из пп.1-8, в котором рак является солидным раком, предпочтительно выбранным из саркомы, меланомы, рака головы и шеи, почки, яичника, поджелудочной железы, простаты, щитовидной железы, легкого, пищевода, молочной железы, мочевого пузыря, прямой кишки, печени, шейки матки, эндометрия и перитонеального рака, более предпочтительно рака печени и перитонеального рака.

10. Применение по любому из пп.1-9, где р равно 1, а молекула нуклеиновой кислоты используется в комбинации с эндосомолитическим агентом, предпочтительно хинолин эндосомолитическим агентом, более предпочтительно хлорохином или гидроксихлорохином.

11. Применение по любому из пп.1-10, где молекула нуклеиновой кислоты используется совместно с лучевой терапией и/или противоопухолевой химиотерапией.

12. Применение по п.11, где противоопухолеваия химиотерапия представляет собой обработку ДНК-повреждающим противоопухолевым агентом, либо прямо, либо опосредованно.

13. Применение по п.12, в котором ДНК-повреждающий противоопухолевый агент выбирают из группы, состоящей из ингибитора топоизомераз I или II, агента, перекрестно сшивающего ДНК, ДНК-алкилирующего агента, антиметаболического агента и ингибиторов митотического веретена.

14. Применение по любому из пп.1-10, где молекула нуклеиновой кислоты не используется совместно с лучевой терапией и/или противоопухолевой химиотерапией.

15. Применение по любому из пп.1-10, где молекула нуклеиновой кислоты не используется в комбинации с лучевой терапией и/или противоопухолевой химиотерапией с ДНК-повреждающим противоопухолевым агентом.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

4. Применение по любому из пп.1-3, в котором молекула, облегчающая эндоцитоз, является холестерином.

5. Применение по любому из пп.1-4, в котором молекулу нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из

6. Применение по любому из пп.1-5, в котором молекула нуклеиновой кислоты является

Евразийское ои 023793 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201301336
(22) Дата подачи заявки 2012.05.25
(51) Int. Cl. C12N15/113 (2010.01) A61K31/713 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) A61K31/00 (2006.01) C12N15/115 (2010.01) A61P 35/00 (2006.01)
(54) ЛЕЧЕНИЕ РАКА КОМБИНАЦИЕЙ МОЛЕКУЛ ДНК, ИМИТИРУЮЩИХ ДВУХНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ, И ГИПЕРТЕРМИИ
(31) 11305650.1
(32) 2011.05.27
(33) EP (43) 2014.04.30
(86) PCT/EP2012/059799
(87) WO 2012/163814 2012.12.06
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭНСТИТЮ КЮРИ; ДНА ТЕРАПЬЮТИКС (FR)
(72) Изобретатель:
Дютре Мари, Сунь Дзиань-Шен,
Девён Флавьен (FR)
(74) Представитель:
Бадаева Т.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к способу лечения рака, который включает комбинированную обработку молекулой нуклеиновой кислоты, имитирующей двухнитевые разрывы, и гипертермией.
Область техники
Изобретение относится к области онкологии.
Предшествующий уровень техники
Гипертермия является одним из наиболее клинически применимых агентов, усиливающих эффективность противоракового лечения разного вида. Гипертермия является видом лечения, при котором ткань организма подвергают воздействию высоких температур для повреждения и уничтожения раковых клеток или для того, чтобы сделать раковые клетки более чувствительными к воздействию облучения и к некоторым противоопухолевым лекарственным средствам (циклофосфамид, доксорубицин, цисплатин, этопозид, ифосфамид, гемцитабин, интерферон-альфа, викристин, карбоплатин, оксалиплатин). Как правило, гипертермия не используется отдельно. Исследования были сосредоточены на лечении множества типов рака, включая саркому, меланому, рак головы и шеи, мозга, легких, пищевода, молочной железы, мочевого пузыря, прямой кишки, печени, шейки матки и перитонеального мезотелия. Однако точный механизм действия гипертермии неясен.
В WO 2010/082821 и Krawczyk et al. (2011, Proc Natl Acad Sci) сообщается, что умеренная гипертермия ингибирует гомологичную рекомбинацию (HR) и индуцирует деградацию BRCA2. Гомологичная рекомбинация представляет собой один из путей репарации двухцепочечного разрыва (DSB). Известно, что BRCA2 участвует в процессе рекомбинационной репарации двухцепочечного разрыва (DSB) и что ингибиторы PARP эффективы в уничтожении BRCA2-дефектных раковых клеток молочной железы. Таким образом, авторы установили, что агент, индуцирующий DSB, может использоваться для лечения рака с одновременным ингибированием BRCA2 (а затем и гомологичной рекомбинации) с помощью гипертермии. Они также предложили дополнительно использовать в данной комбинации ингибитор PARP. PARP вовлечен в детекцию и передачу сигналов при разрывах одноцепочечных ДНК- (SSB) ферментативному аппарату, вовлеченному в репарацию SSB. И наконец, эти авторы отмечали, что наблюдаемое в результате гипертермии повышение чувствительности к лучевой терапии является специфичным для гомологичной рекомбинации, так как этот эффект не наблюдался в клетках, дефектных по гомологичной рекомбинации (Rad54-/-).
Даже если лечение злокачественного новообразования с помощью гипертермии продвигается вперед, все еще остается потребность в разработке улучшенных способов лечения рака с использованием гипертермии.
Сущность изобретения
Авторы с удивлением обнаружили, что в отличие от того, что было показано Krawczyk et al, и того, что известно о ДНК-зависимой протеинкиназе DNA-PK), эффект гипертермии не специфичен для пути гомологичной рекомбинации при репарации DSB. В частности, молекулы нуклеиновой кислоты, имитирующие двухцепочечные разрывы, называемые молекулами "Dbait", можно использовать при лечении злокачественных новообразований в комбинации с гипертермией. Молекулы "Dbait" действуют посредством гиперактивации ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK), вовлеченной в путь негомологичного соединения концов при репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSB), не вызывая при этом каких-либо дополнительных повреждений ДНК в клетках (WO2005/040378; WO2008/034866; Quanz et al, 2009, Clinical Cancer Research 15:1308; Quanz et al., 2009, PLoS ONE 4:e6298; Dutreix et al., 2010, Mut. Res. 704:182). Неожиданно оказалось, что ингибирование репарации ДНК с помощью DNA-PK-ингибитора NU7026 не повышает чувствительность к гипертермии и предотвращает сенсибилизацию "Dbait". Таким образом, сенсибилизация "Dbait" требует активации киназы DNA-PK и действует независимо от ингиби-рования реперации ДНК при DSB. Они также продемонстрировали, что, как неожиданно оказалось, противоопухолевый эффект комбинации молекул "Dbait" с гипертермией может наблюдаться даже в отсутствии любого агента, индуцирующего DSB. Кроме того, наблюдаемый эффект комбинации, по-видимому, является синергическим эффектом, а также зависимым от дозы "Dbait".
Таким образом, настоящее изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один свободный конец и двухцепочечный участок ДНК длиной 24-200 п.о., последовательность которого идентична менее чем на 60% любому гену в геноме человека, для применения в комбинации с гипертермической обработкой при лечении рака.
где N представляет собой дезоксинуклеотид, n является целым числом от 15 до 195, подчеркнутая N относится к нуклеотиду, содержащему или не содержащему модифицированный фосфодиэфирный каркас, L' представляет собой линкер, С представляет собой молекулу, облегчающую эндоцитоз, предпочти-
Более предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты имеет одну из следующих формул:
тельно выбранную из липофильной молекулы и лиганда, который направленно воздействует на клеточный рецептор, позволяя рецептору опосредовать эндоцитоз, L представляет собой линкер, m и р, независимо друг от друга представляют собой целое число 0 или 1.
Более конкретно, молекула нуклеиновой кислоты имеет одну из следующих формул:
где подчеркнутый нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему фосфоротиоатный или метил-фосфонатный каркас, связанная L' выбрана из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокси-тимидилата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана; m представляет собой 1, и L представляет собой карбоксамидоолигоэтиленгликоль, С выбрана из группы, состоящей из одноцепочечных или двухцепочечных жирных кислот, таких как октадекановая кислота и диолеолиловая кислота, из холестерина, токоферола, фолиевой кислоты, сахара, такого как галактоза и манноза, и из их олигосахаридов, пептида, такого как RGD и бомбезин, и белка, такого как интегрин, предпочтительно, холестерин.
Более предпочтительно, молекула, облегчающая эндоцитоз, представляет собой холестерин.
Предпочтительно, если гипертермическая обработка охватывает температуру по меньшей мере 41°С, предпочтительно по меньшей мере 42°С. В некоторых случаях гипертермическую обработку осуществляют с помощью микроволн (РЧА), ультразвука, инфракрасных лучей, наночастиц или нанотрубок, индуцирующих нагревание, магнитной гипертермии, перфузии или инфузии предварительно нагретых жидкостей, таких как кровь, внутрибрюшинного нагретого потока, гипертермии, индуцированной лекарственным средством, или прямым применением нагревания.
Предпочтительно, если рак представляет собой твердую опухоль, предпочтительно выбранную из саркомы, меланомы и рака головы и шеи, почек, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, щитовидной железы, легкого, пищевода, молочной железы, мочевого пузыря, ободочной и прямой кишки, печени, шейки матки и рака эндометрия и брюшины, более предпочтительно, печени и брюшины.
В конкретном воплощении р равно 1 (т.е. конъюгированная молекула Dbait), a молекула нуклеиновой кислоты используется в комбинации с эндосомолитическим агентом, предпочтительно, хинолино-вым эндосомолитическим агентом, более предпочтительно, с хлорохином или гидроксихлорохином. Еще более предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты используется в комбинации с хлорохином.
В некоторых случаях молекула нуклеиновой кислоты может использоваться в комбинации с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или противоопухолевой химиотерапией. Предпочтительно, если противоопухолевая химиотерапия представляет собой лечение с помощью противоопухолевого агента, разрушающего ДНК либо прямо, либо опосредованно. Более предпочтительно, если ДНК-разрушающий противоопухолевый агент выбран и группы, состоящей из ингибитора топоизомераз I или II, ДНК-кросслинкера, ДНК-алкилирующего агента, антиметаболического агента и ингибиторов митоти-ческих веретен.
В ином случае, молекула нуклеиновой кислоты не используется в комбинации с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или с противоопухолевой химиотерапией. Предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты не используется в комбинации с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или с противоопухолевой химиотерапией с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. "Dbait32Hc" индуцирует синергическую токсичность при объединении с гипертермией.
Трансформированные фибробласты MRC5 и клетки рака толстой кишки НТ29 либо не обрабатывали, либо трансфецировали "Dbait8H" (1,25 мг/л) или "Dbait32Hc" (1,25 мг/л) в присутствии или в отсутствии DNA-PK-ингибитора NU7026 (50 цМ). Через 5 ч клетки подвергали воздействию гипертермии при 43°С в течение 1 ч. Смертность клеток измеряли с помощью трипанового синего через 48 ч. Представлено среднее значение процента клеточной смерти ± стандартное отклонение из 5 независимых экспериментов. **, р <0,01; ***, р <0,001 с критерием Стьюдента.
Фиг. 2. "DT01" усиливает противоопухолевые эффекты радиочастотной абляции.
Группам голых мышей NMR1 в правый бок имплантировали п.к. 107 опухолевых клеток НТ29. Мышей обрабатывали РЧА (2 мин при 42°С на периферии опухоли) (n=13), "DT01" (4 локальных инъекции 6 мг) (n=14), или одновременно РЧА и 4 инъекции "DT01" (n=11). Необработанные мыши, несущие опухоль (n=11), служили в качестве контролей. На панели А показаны характерные изображения внешнего вида опухолей перед обработкой (день 0), затем через 4 дня и через 12 дней (день 4 и день 12, соответственно). Полоса: 1 см. На панели В показана более высокая супрессия опухолевого роста у мышей, обработанных комбинированной обработкой РЧА+"DT01". За мышами наблюдали до момента умерщв
ления, когда опухоли достигали 2000 мм3. Во всех экспериментах опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с цифровой индикацией 3 раза в неделю. Объемы опухолей рассчитывали с использованием следующей формулы: длина х ширина х ширина / 2. На панели С показано повышение выживаемости мышей, обработанных комбинированной обработкой РЧА+"DT01". Логарифмический ранговый критерий: Необработанные против РЧА (р <0,001, RR 0,30);
"DT01" + РЧА против РЧА (р <0,05 RR 0,41).
Фиг. 3. Гистологический анализ эффектов от обработок.
Группам голых мышей NMR1 (семь-восемь мышей на группу) имплантировали в правый бок п.к. 107 опухолевых клеток НТ29. Мышей обрабатывали с помощью РЧА (2 минуты при 42°С на периферии опухоли), DT01 (2 локальные инъекции 6 мг), или одновременно РЧА и "Dbait". Необработанные мыши, несущие опухоль, служили в качестве контролей. Мышей умерщвляли через 72ч после обработки РЧА, и вырезали опухоли для гистологического анализа. На панели А показано клеточное распределение про-лиферирующих, дегенеративных и некротических клеток в четырех экспериментальных группах. На панели В показана количественная оценку митоза (среднее значение на опухоль в 5 областях с увеличением х 40) в четырех экспериментальных группах. Планки погрешности указывают SEM (стандартная ошибка среднего). Образцы, обработанные с помощью РЧА вместе с "DT01", демонстрировали значительно более крупные области некроза и дегенеративных клеток, меньшие области пролиферирующих клеток и меньшее количество митозов по сравнению с обработкой РЧА или DT01 отдельно. Критерий Стьюдента: *, р <0,05; ***, р <0,001.
Таблица 1. Данные по исследованию выживаемости и патологии Исследования выживаемости и патологии осуществляли, как описано в разделе материалы и методы. Завершенные ответы заключались в полной регрессии опухоли через 10 дней после обработки РЧА. Частичные ответы заключались в 30%-уменьшении, по меньшей мере, самого большого диаметра опухоли. Для патологического исследования результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение молекул "Dbait" в комбинации с гипертермией при лечении рака вызывает большой интерес. Фактически, эти результаты являются неожиданными в свете предполагаемой специфичности гипертермии для пути гомологичной рекомбинации DBS-репарации или в свете того, что известно для DNA-PK в контексте гипертермии.
Фактически в научной литературе роль DNA-PK исследовали в радиосенсибилизации (Zeng ZC et al. World J Gastroenterol 2002; 8:797-803; Woudstra EC et al. Radiat Res. 1999, 152:214-218; Dynlacht JR et al. J Cell Physiol. 2003, 196:557-64.). Авторы пришли к выводу, что DNA-PK не играют никакой важной роли в усилении клеточной радиосенсибилизации с помощью гипертермии, и радиосенсибилизация с помощью гипертермии может быть достигнута независимо от Ku80 или статуса DNA-PK в клетках. Таким образом, они заключили, что Ku80 или DNA-PK и, следовательно, негомологичное соединение концов при DSB не играют никакой важной роли в усилении клеточной радиосенсибилизации с помощью гипертермии.
Авторы изобретения также продемонстрировали, что, как неожиданно оказалось, противоопухолевый эффект комбинации молекул "Dbait" с гипертермией может наблюдаться даже в отсутствии любого агента, индуцирующего DSB. Более конкретно, авторы изобретения продемонстрировали как in vitro так и in vivo, что комбинация молекул "Dbait" и гипертермии имеет особую привлекательность при лечении рака. Фактически, наблюдали синергический эффект, выражающийся в уничтожении раковых клеток комбинацией молекул "Dbait" и гипертермии. Классические ингибиторы киназной активности DNA-PK, такие как NU7026, который ингибирует репарацию соединения негомологичных концов (Veuger et al, 2004, Oncogene, 23, 7322-7329), не индуцируют сенситизацию гипертермии (фиг. 1). Активность "Dbait", вовлеченная в гипертермическую сенсибилизацию, непосредственно зависит от киназной активности DNA-PK, до тех пор, пока она не блокируется с помощью NU7026. Комбинированная обработка гипертермией и "Dbait" показала существенное влияние на степень выживаемости мышей. Фактически, если при лечении с использованием отдельно гипертермии или молекул "Dbait" через 50 дней лечения выживаемость составляла менее чем 30%, то пул, подвергнутый лечению с помощью комбинации, демонстрировал выживаемость 80% (фиг. 2С). При комбинированном лечении наблюдались стабилизация или даже уменьшение размера опухоли. Гистология опухолей, вырезанных через 3 дня после обработки, показала, что опухоли, подвергнутые лечению с помощью комбинации, демонстрировали более высокую стадию разрушения (стадии дегенерации и некроза), чем опухоли, подвергнутые лечению с помощью отдельно гипертермии или молекул "Dbait" (фиг. 3).
На основе этих наблюдений настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, необязательно противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий агент, и фармацевтически приемлемый носитель для применения в комбинации с гипертермией при лечении рака; фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, b) эндосомолитический агент, как описано ниже, необязательно с)
противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий агент, и d) фармацевтически приемлемый носитель для применения в комбинации с гипертермией при лечении рака;
фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в комбинации с гипертермией при лечении злокачественных новообразований, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, b) эндосомолитический агент, как описано ниже, и с) фармацевтически приемлемый носитель, для применения в комбинации с гипертермией при лечении злокачественных новообразований, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
продукту или к набору реактивов, содержащему а) молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, и необязательно b) противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий агент, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака в комбинации с гипертермией, и необязательно с лучевой терапией или с радиоизотопной терапией;
продукту или к набору реактивов, содержащему а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, b) эндосомолитический агент, как описано ниже, и необязательно с) противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий агент, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака в комбинации с гипертермией, и необязательно в комбинации с лучевой терапией или с радиоизотопной терапией;
продукту или к набору реагентов, содержащему а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, и b) эндосомолитический агент, как описано ниже, в виде объединенного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака в комбинации с гипертермией, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для применения при лечении рака в комбинации с гипертермией, и в комбинации с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или в комбинации с использованием противоопухолевого агента, предпочтительно ДНК-разрушающего противоопухолевого агента;
фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, и b) эндосомолитический агент, как описано ниже, для применения при лечении рака в комбинации с гипертермией, и в комбинации с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или в комбинации с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента;
применению фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для применения в производстве лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией; или для повышения эффективности лечения рака с помощью гипертермии или для усиления чувствительности опухоли к гипертермии;
применению фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для применения в производстве лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией и с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или в комбинации с использованием противоопухолевого агента, предпочтительно, ДНК-разрушающего противоопухолевого агента; или для повышения эффективности лечения рака гипертермией и лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или противоопухолевым агентом, предпочтительно, ДНК-разрушающим противоопухолевым агентом; или для усиления чувствительности опухоли к гипертермии, лучевой терапии, радиоизотопной терапии и/или к противоопухолевому агенту, предпочтительно, к ДНК-разрушающему противоопухолевому агенту;
применению фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для применения в производстве лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS; или для повышения эффективности лечения рака с использованием гипертермии без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS; или для усиления чувствительности опухоли к гипертермии без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с ис
пользованием агента, индуцирующего DBS;
применению фармацевтической композиции, включающей конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией и в комбинации с обработкой эндосомолитическим агентом, как описано ниже;
применению фармацевтической композиции, включающей конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией и с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или с противоопухолевым агентом, предпочтительно, ДНК-разрушающим противоопухолевым агентом, и с использованием эндосомолитического агента, как описано ниже;
применению фармацевтической композиции, включающей конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано ниже, для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с эндосомолитическим агентом, как описано ниже, и с гипертермией, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией, и с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или с противоопухолевой химиотерапией, предпочтительно с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, для производства лекарственного средства для повышения эффективности лечения рака с использованием гипертермии или для усиления чувствительности опухоли к гипертермии;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, для производства лекарственного средства для повышения эффективности лечения рака с использованием гипертермии и лучевой терапии, радиоизотопной терапии и/или противоопухолевой химиотерапии, предпочтительно, с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента; или для повышения чувствительности опухоли к гипертермии, объединенной с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или противоопухолевой химиотерапией, предпочтительно, с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, для производства лекарственного средства для повышения эффективности лечения рака с использованием гипертермии, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS; или для усиления чувствительности опухоли к гипертермии, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапии и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно какой-либо противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, с) противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий противоопухолевый агент, и d) фармацевтически приемлемый носитель для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, с) противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий противоопухолевый агент и d) фармацевтически приемлемый носитель для производства лекарственного
средства для лечения рака в комбинации с гипертермией и с лучевой терапией, радиоизотопной терапией и/или противоопухолевой химиотерапией, предпочтительно с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента;
применению фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, b) эндосомолитиче-ский агент, как описано ниже, с) противоопухолевый агент, предпочтительно, ДНК-разрушающий противоопухолевый агент, и d) фармацевтически приемлемый носитель для производства лекарственного средства для лечения рака в комбинации с гипертермией, но без какой-либо лучевой терапии, какой-либо радиоизотопной терапией и какой-либо противоопухолевой химиотерапии, конкретно, противоопухолевой химиотерапии с использованием агента, индуцирующего DBS;
способу лечения рака у нуждающегося в этом объекта, который включает i) введение эффективного количества фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемого носителя и, ii) воздействие на злокачественные клетки указанного объекта с помощью гипертермии перед стадией i), одновременно с ней или после стадии i); индуцируя, тем самым, смерть раковых клеток;
способу лечения рака у нуждающегося в этом объекта, причем способ включает i) введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемого носителя и, ii) воздействие на злокачественные клетки указанного объекта с помощью гипертермии перед стадией i), одновременно с ней или после стадии i); индуцируя, тем самым, смерть раковых клеток; необязательно способ дополнительно включает введение указанному объекту терапевтически эффективного количества противоопухолевого агента, предпочтительно ДНК-разрушающего противоопухолевого агента или радиоизотопного агента; в ином случае или дополнительно способ также включает воздействие на злокачественные клетки указанного агента лучевой терапии; в ином случае, способ не включает введения какого-либо противоопухолевого лекарственного средства, конкретно, какого-либо агента, индуцирующего DBS, и радиоизотопного агента, и не включает воздействия на злокачественные клетки указанного объекта лучевой терапии;
способу лечения рака у нуждающегося в этом объекта, причем способ включает i) введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, b) эндосомолитического агента, как описано ниже, и с) фармацевтически приемлемого носителя и, ii) воздействие на злокачественные клетки указанного объекта с помощью гипертермии перед стадией i), одновременно с ней или
после стадии i); индуцируя, тем самым, смерть раковых клеток; необязательно способ дополнительно включает введение указанному объекту терапевтически эффективного количества противоопухолевого агента, предпочтительно ДНК-разрушающего противоопухолевого агента или радиоизотопного агента; альтернативно или дополнительно способ также включает воздействие на злокачественные клетки указанного агента лучевой терапии; в ином случае, способ не включает введения какого-либо противоопухолевого лекарственного средства, конкретно, какого-либо агента, индуцирующего DBS, и радиоизотопного агента, и не включает воздействия на злокачественные клетки указанного объекта лучевой терапии;
способу повышения эффективности лечения рака с использованием гипертермии или способу усиления чувствительности опухоли к гипертермии у нуждающегося в этом объекта, причем способ включает i) введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, и b) фармацевтически приемлемый носитель и, ii) воздействие на злокачественные клетки указанного объекта с помощью гипертермии перед стадией i), одновременно с ней или после стадии i); индуцируя, тем самым, смерть раковых клеток; необязательно способ дополнительно включает введение указанному объекту терапевтически эффективного количества противоопухолевого агента, предпочтительно ДНК-разрушающего противоопухолевого агента или радиоизотопного агента; в ином случае или дополнительно способ также включает воздействие на злокачественные клетки указанного агента лучевой терапии; в ином случае, способ не включает введения какого-либо противоопухолевого лекарственного средства, конкретно, какого-либо агента, индуцирующего DBS, и радиоизотопного агента, и не включает воздействия на злокачественные клетки указанного объекта лучевой терапии;
способу повышения эффективности лечения рака с использованием гипертермии или способу усиления чувствительности опухоли к гипертермии у нуждающегося в этом объекта, причем способ включает i) введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей а) конъюгированную молекулу "Dbait" или шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе, b) эндосомолитический агент, как описано ниже, и с) фармацевтически приемлемый носитель и, ii) воздействие на злокачественные клетки указанного объекта с помощью гипертермии перед стадией i), одновременно с ней или после стадии i); индуцируя, тем самым, смерть раковых клеток; необязательно способ дополнительно включает введение указанному объекту терапевтически эффектив
ного количества противоопухолевого агента, предпочтительно ДНК-разрушающего противоопухолевого агента или радиоизотопного агента; в ином случае или дополнительно способ также включает воздействие на злокачественные клетки указанного агента лучевой терапии; в ином случае, способ не включает введения какого-либо противоопухолевого лекарственного средства, конкретно, какого-либо агента, индуцирующего DBS, и радиоизотопного агента, и не включает воздействия на злокачественные клетки указанного объекта лучевой терапии.
Термины "набор реагентов", "продукт" или "объединенный препарат", при использовании в данном документе, предпочтительно определяют "набор, состоящий из частей" в том смысле, что партнеры по комбинации, определенной выше, могут быть дозированы независимо, или при использовании различных фиксированных комбинаций с отличными количествами партнеров по комбинации, т.е. одновременно или в различные моменты времени. Части указанного набора могут затем, например, вводиться одновременно или в хронологическом порядке, то есть в различные моменты времени и с равными или различными временными интервалами для любой части указанного набора. Соотношение суммарных количеств вводимых партнеров по комбинации в объединенном препарате может варьировать. Партнеры по комбинации могут вводиться одним и тем же путем или различными путями.
В контексте изобретения термин лечение служит для обозначения лечебных, симптоматичных и профилактических лечебных мероприятий. Фармацевтические композиции, наборы реагентов, продукты и объединенные препараты по изобретению могут использоваться для людей с имеющимся раком или с опухолью, включая раннюю или позднюю стадию прогрессии рака. Фармацевтические композиции, наборы реактивов, продукты и комбинированные препараты по изобретению необязательно полностью излечивают пациента, который имеет рак, но они будут задерживать или замедлять прогрессию или предотвращать прогрессию заболевания, улучшая, таким образом, состояние пациента. Конкретно, фармацевтические композиции, наборы реактивов, продукты и объединенные препараты по изобретению уменьшают развитие опухолей, уменьшает опухолевую массу, осуществляют регрессию опухоли у млекопитающего-хозяина и/или предотвращает появление метастазов и рецидив рака. При лечении рака фармацевтическую композицию по изобретению вводят в терапевтически эффективном количестве.
Под "терапевтически эффективным количеством" понимают количество фармацевтической композиции по изобретению, которое предотвращает, устраняет или уменьшает вредные эффекты рака у млекопитающих, включая человека, индивидуально или в комбинации с другими активными ингредиентами фармацевтической композиции, набора реактивов, продукта или комбинированного препарата. Понятно, что вводимые дозы могут быть адаптированы специалистами в данной области в соответствие пациенту, способу введения и т.д.
Во всех случаях, когда по всему данному описанию "лечение рака" или подобное упоминается со ссылкой на фармацевтическую композицию по изобретению, то это означает: а) способ лечения рака, причем указанный способ включает введение фармацевтической композиции по изобретению объекту, нуждающемуся в таком лечении; b) применение фармацевтической композиции по изобретению для лечения рака; с) применение фармацевтической композиции по изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака; и/или d) фармацевтическая композиция по изобретению для применения в лечении рака.
Фармацевтические композиции, рассматриваемые в данном документе, могут включать фармацевтически приемлемый носитель дополнительно к активному ингредиенту(ам). Подразумевается, что термин "фармацевтически приемлемый носитель" охватывает любой носитель (например, подложку, вещество, растворитель, и т.д.), который не препятствует эффективности биологической активности активных ингредиентов и который не токсичен по отношению к хозяину, которому вводится. Например, для парентерального введения активные соединения могут быть включены в состав в виде стандартной лекарственной формы для инъекций в комбинации с носителями, такими как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде растворов в фармацевтически совместимых растворителей или в виде эмульсий, суспензий или дисперсных растворов в подходящих фармацевтических растворителях или носителях, или в виде пилюль, таблеток или капсул, которые содержат твердые носители, как известно в данной области. Составы по настоящему изобретению, подходящий для перорального введения, может быть представлен в форме дискретных единиц в виде капсул, саше, таблеток или пастилок, каждая из которых содержит определенное количество активного ингредиента; в форме порошка или гранул; в форме раствора или суспензии в водном жидком растворе или в безводном жидком растворе; или в форме эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле. Составы, подходящие для парентерального введения, обычно включают стерильный водный или неводный препарат активного ингредиента, который предпочтительно является изотоническим по отношению к крови реципиента. Каждый такой состав также может содержать другие фармацевтически совместимые и нетоксичные вспомогательные агенты, такие как, например, стабилизаторы, антиоксиданты, связующие агенты, красители, эмульгаторы, или ароматизаторы. Составы по настоящему изобретению включают активный ингредиент совместно и фармацевтически совместимым носителем, а также необязательно другие терапевтические ингредиенты. Носитель должен быть "совместимым" в смысле того, что он совместим с други
ми ингредиентами составов и не должен быть вредным по отношению к реципиенту. Фармацевтические композиции предпочтительно применяются с помощью инъекции или внутривенной инфузии подходящих стерильных растворов или в виде пероральной дозировки с помощью желудочно-кишечного тракта. Методы безопасного и эффективного введения большинства из этих химиотерапевтических агентов известны специалистам в данной области. Кроме того, введение описано в стандартной научной литературе.
При использовании в данном документе термин "противоопухолевая химиотерапия" или "химиотерапия" относится к противоопухолевому терапевтическому лечению с использованием химических или биохимических веществ, конкретно с использованием одного или нескольких антинеопластических агентов. Конкретно термин также включает гормональную терапию и иммунотерапию. Термин "гормональная терапия" относится к лечению рака, имеющему своей целью блокировать, добавить или удалить гормоны. Например, при раке молочной железы женские гормоны эстроген и прогестерон могут стимулировать рост раковых клеток молочной железы. Поэтому этим пациентам прописывают гормональную терапию для блокирования эстрогена и неполный список часто используемых для этого лекарственных средств включает: Тамоксифен, Фарестон, Аримидекс, Аромазин, Фемара, Золадекс/Лурпон, Мегейс и Галотестин. Термин "иммунотерапия" относится к терапевтической обработке рака с использованием ресурсов иммунной системы для отторжения рака. Терапевтическая обработка стимулирует иммунную систему пациента для атаки злокачественных опухолевых клеток.
Молекулы "Dbait"
Молекулы "Dbait" были подробно описаны в патентных заявках РСТ WO 2005/040378, WO 2008/034866 и WO 2008/084087, содержание которых включено в данный документ с помощью ссылкой.
Молекулы "Dbait" могут быть определены рядом характеристик, необходимых для их терапевтической активности, таких как их минимальная длина, присутствие по меньшей мере одного свободного конца и присутствие двухцепочечного участка, предпочтительно, двухцепочечного участка ДНК. Как будет описано ниже, важно заметить, что точная нуклеотидная последовательность молекул "Dbait" не влияет на их активность. Кроме того, молекулы "Dbait" могут содержать модифицированный и/или синтетический каркас.
Предпочтительно молекулы "Dbait" имеют происхождение, отличное от человеческого (т.е., их нуклеотидная последовательность и/или конформация (например, шпилька) не существуют как таковые в человеческой клетке), наиболее предпочтительно, если молекулы "Dbait" имеют синтетическое происхождение. Поскольку последовательность молекул "Dbait" играет маленькую роль, если она вообще имеется, молекулы "Dbait" предпочтительно не имеют достаточной степени гомологии или идентичности последовательности с известными генами, промоторами, энхансерами, последовательностями, расположенными в 5'- или 3'- областях, экзонами, нитронами и так далее. Другими словами молекулы "Dbait" идентичны менее чем 80 или 70%, даже менее чем 60 или 50% последовательности любого гена в человеческом геноме. Способы определения идентичности последовательности хорошо известны в данной области и включают, например, "Blast". Молекулы "Dbait" не гибридизуются в жестких условиях с человеческой геномной ДНК. Типичные жесткие условия таковы, что они дают возможность отличить полностью комплементарные нуклеиновые кислот от частично комплементарных нуклеиновых кислот.
Кроме того, последовательность молекул "Dbait" предпочтительно лишена CpG для того, чтобы избежать хорошо известные опосредованные toll-подобными рецепторами иммунологические реакции.
Длина молекул "Dbait" может варьировать при условии, что она будет достаточна для того, чтобы позволить соответствующее связывание комплекса белка Ku, включающего белки Ku и DNA-PK. Было продемонстрировано, что длина молекул "Dbait" должна быть выше, чем 20 п.о., предпочтительно, около 32 п.о., для гарантии связывания с таким комплексом Ku и возможности активации DNA-PK. Предпочтительно, молекулы "Dbait" включают около 20-200 п.о., более предпочтительно 24-100 п.о., еще более предпочтительно 26-100, и наиболее предпочтительно, около 24-200, 25-200, 26-200, 27-200, 28-200, 30200, 32-200, 24-100, 25-100, 26-100, 27-100, 28-100, 30-100, 32-200 или 32-100 п.о.. Например, молекулы "Dbait" включают около 24-160, 26-150, 28-140, 28-200, 30-120, 32-200 или 32-100 п.о.. Под "п.о." подразумевается, что молекула включает дввухцепочечный участок указанной длины.
В конкретном воплощении молекулы "Dbait", имеющие двухцепочечный участок по меньшей мере из 32 п.о., или около 32 п.о., включают ту же нуклеотидную последовательность, что и "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5). В некоторых случаях молекулы "Dbait" имеют такой же нуклеотидный состав, что и у "Dbait32", "Dbait32Ha", "Dbait32Hb", "Dbait32Hc" или "Dbait32Hd", но их нуклеотидные последовательности различны. Далее молекулы "Dbait" включают одну цепь двухцепочечного участка, содержащего 3 А, 6 С, 12 G и 11 Т. Предпочтительно, последовательность молекул "Dbait" не содержит никаких динуклеотидов CpG.
В ином случае двухцепочечный участок включает по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотидов "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb"
(SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5). В более предпочтительном
воплощении, двухцепочечный участок состоит из 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклео
тидов "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5).
"Dbait" должна иметь по меньшей мере один свободный конец, который имитирует DSB. Указанный свободный конец может быть или свободным тупым концом или 5'-/3'- выступающим концом. "Свободный конец" относится в данном документе к молекуле нуклеиновой кислоты, конкретно к двухцепо-чечному участку нуклеиновой кислоты, имеющему 5'-конец и 3'-конец, или имеющему или 3'-конец, или 5'-конец. В некоторых случаях, один из 5'- и 3'-концов может использоваться для конъюгации молекулы "Dbait" или может быть связан, например, с блокирующей группой, или с 3'-3' нуклеотидной связью.
В конкретных воплощениях молекулы "Dbait" содержат два свободных конца и могут быть линейными. Соответственно, молекулы "Dbait" также могут представлять собой двухцепочечную молекулу с двумя свободными концами и имеющую нуклеотидную последовательность "Dbait32" (SEQ ID No 1),
"Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5).
В другом конкретном воплощении они содержат только один свободный конец. Предпочтительно молекулы "Dbait" представлены шпилечными нуклеиновыми кислотами с двухцепочечным ДНК-стеблем и петлей. Петля может представлять собой нуклеиновую кислоту или другие химические группы, известные специалисту в данной области, или их смеси. Нуклеотидный линкер может включать от 2 до 10 нуклеотидов, предпочтительно 3, 4 или 5 нуклеотидов. Ненуклеотидные линкеры, в частности, включают основной нуклеотид, полиэфир, полиамин, полиамид, пептид, углевод, липид, полиуглевод или другие полимерные соединения (например, олигоэтиленгликоли, такие как содержащие от 2 до 10 этиленгли-кольных элементов, предпочтительно, 4, 5, 6, 7 или 8 этиленгликольных единиц). Предпочтительный линкер выбран из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетраокситимидилата (Т4) и других линкеров, таких как 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекан. Соответственно в конкретных воплощениях молекулы "Dbait" могут представлять собой шпилечную молекулу, имеющую двухцепочечный участок или стебель, включающий по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотида "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID
No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5), и петлю, которая является гексаэти-
ленгликольным линкером, тетраокситимидилатным линкером (Т4) или 2,19-бис(фософоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадеканом. В более предпочтительном воплощении, эти молекулы "Dbait" могут содержать двухцепочечный участок, состоящий из 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотидов "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5).
Молекулы "Dbait" предпочтительно включают 2'-дезоксинуклеотидный каркас и необязательно включают один или несколько (2, 3, 4, 5 или 6) модифицированных нуклеотидов и/или нуклеиновых оснований, отличных от аденина, цитозина, гуанина и тимидина. Соответственно, молекулы "Dbait" по существу представляют собой ДНК-структуру. Конкретно, двухцепочечный участок или стебель молекул "Dbait" состоит из дезоксирибонуклеотидов.
Предпочтительные молекулы "Dbait" включают один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или групп на конце одной цепи или на концах каждой из цепей, конкретно с целью их защиты от деградации. В особенно предпочтительных воплощениях свободные концы молекул "Dbait" защищены одним, двумя или тремя модифицированными фосфодиэфирными каркасами на конце одной или каждой цепи. Предпочтительные химические группы, конкретно модифицированный фосфодиэфир-ный каркас, включают фосфоротиоаты. В ином случае, предпочтительные "Dbait" содержат 3'-3' нуклео-тидную связь или нуклеотиды с метилфосфонатным каркасом. Другие модифицированные каркасы хорошо известны в данной области и включают фосфороамидаты, морфолино-нуклеиновую кислоту, нуклеиновую кислоту, связанную мостиком 2'-0,4'-С метилен/этилен, пептидонуклеиновую кислоту (ПНК), и короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные межсахарные связи или короткоцепочечные гете-роатомные или гетероциклические межсахарные связи различной длины или любые модифицированные нуклеотиды, известные специалисту. В первом воплощении молекулы "Dbait" имеют свободные концы, защищенные одним, двумя или тремя модифицированными фосфодиэфирными каркасами на конце одной цепи или каждой цепи, более предпочтительно, тремя модифицированными фосфодиэфирными каркасами (конкретно, фосфоротиоатным или метилфосфонатным) по меньшей мере на 3'-конце, но еще более предпочтительно на обоих, 5'- и 3'-концах.
В наиболее предпочтительном воплощении молекула "Dbait" представляет собой шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую двухцепочечный участок ДНК или стебель из 32 п.о. (например, с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No 1-5, конкретно, SEQ ID No 4) и петля, связывающая две цепи двухцепочечного участка ДНК или стебель, включающий или состоящий из линкера, выбранного из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокситимидилата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана, причем свободные концы двухце-почечного участка ДНК или стебля (т.е. напротив петли) имеют три модифицированных фосфодиэфир-ных каркаса (в частности, фосфоротиоатные межнуклеотидные связи).
Указанные молекулы синтезированы посредством химического синтеза, полубиосинтеза или био
синтеза, любого способа амплификации с последующими любыми способами экстракции и получения и любой химической модификацией. Предлагаются линкеры, которые приспособлены для включения при стандартном химическом синтезе нуклеиновых кислот.
Более предпочтительно, если молекулы "Dbait" изготовляют специально разработанным конвергентном синтезом: две комплементарные цепи получают с помощью стандартного химического синтеза нуклеиновых кислот с включением соответствующих линкерных предшественников, после их очистки они ковалентно конденсируются вместе.
В некоторых случаях молекулы "Dbait" могут быть конъюгированы с молекулами, облегчающими эндоцитоз или поглощение клетками.
В частности, молекулы, облегчающие эндоцитоз или клеточное поглощение, могут быть липофиль-ными молекулами, такими как холестерин, одноцепочечные или двухцепочечные жирные кислоты, или лиганды, которые направленно воздействуют на клеточный рецептор, давая возможность рецептору опосредовать эндоцитоз, такие как фолиевая кислота и фолатные производные или трансферрин (Goldstein et al. Ann. Rev.
Cell Biol. 1985 1:1-39; Leamon & Lowe, Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 5572-5576.). Молекула также может быть токоферолом, сахаром, таким как галактоза и манноза, и их олигосахариды, пептидом, таким как RGD и бомбезин, и белки, такие как интегрин. Жирные кислоты могут быть насыщенными или ненасыщенными и представлены в виде С4-С28, предпочтительно, в виде С14-С22, еще более предпочтительно, в виде C18, как например, олеиновая кислота или стеариновая кислота. Конкретно, жирные кислоты могут быть октадециловыми или диолеоиловыми. Жирные кислоты могут быть обнаружены в виде двухцепочечной формы с соответствующим линкером, таким как глицерин, фосфатидилхолин или этаноламин, или связаны вместе посредством линкеров, используемых для прикрепления к молекуле "Dbait". При использовании в данном документе подразумевается, что термин "фолат" относится к фола-ту и к производным фолата, включая производные птероевой кислоты и аналоги. Аналоги и производные фолиевой кислоты, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в частности анти-фолаты, дигидрофолаты, тетрагидрофолаты, фолиновую кислоту, птерополиглутаминовую кислоту, 1-деаза, 3-деаза, 5-деаза, 8-деаза, 10-деаза, 1,5-деаза, 5,10 дидеаза, 8,10-дидеаза, и 5,8-дидеазафолаты, ан-тифолаты и производные птероевой кислоты. Дополнительные фолатные аналоги описаны в US2004/242582. Соответственно, молекула, облегчающая эндоцитоз, может быть выбрана из группы, состоящей из одноцепочечных или двухцепочечных жирных кислот, фолатов и холестерина. Более предпочтительно, если молекула, облегчающая эндоцитоз, выбрана из группы, состоящей из диолеоила, ок-тадецила, фолиевой кислоты и холестерина. В наиболее предпочтительном воплощении молекула "Dbait" конъюгирована с холестерином.
Молекулы, облегчающие эндоцитоз, конъюгированы с молекулами "Dbait", предпочтительно посредством линкера. Любой линкер, известный в данной области, может использоваться для ковалентного присоединения молекулы, облегчающей эндоцитоз, с молекулами "Dbait". Например, WO09/126933 обеспечивает всеобъемлющий обзор стандартных линкеров, страницы 38-45. Линкер может быть в частности алифатической цепью, полиэфиром, полиамином, пептидом, углеводом, липидом, полиуглеводородом или другими полимерными соединениями (например, олигоэтиленгликоли, такие как те, что имеют от 2 до 10 этиленгликольных единиц, предпочтительно, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 этиленгликольных единиц, еще более предпочтительно, 6 этиленгликольных единиц), а также включая любые связи, которые могут быть разрушены посредством химическим или ферментативным способом, как например, дисульфидная связь, защищенная дисульфидная связь, кислото-чувствительная связь (например, гидразоновая связь), эфирная связь, ортоэфирная связь, фосфонамидная связь, биорасщепляемая пептидная связь, азо-связь или альдегидная связь. Такие расщепляемые линкеры подробно описаны в WO2007/040469, страницы 12-14, в WO2008/022309, страницы 22-28.
В конкретном воплощении, молекула "Dbait" может быть связана с одной молекулой, облегчающей эндоцитоз. В ином случае, несколько молекул, облегчающих эндоцитоз (например, две, три или четыре), могут быть присоединены к одной молекуле "Dbait".
В конкретном воплощении линкер между молекулой, облегчающей эндоцитоз, конкретно, холестерин, и молекула "Dbait" представляет собой CO-NH-(CH2-CH2-O)n, где n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно n выбрано из группы, состоящей из 3, 4, 5 и 6. В особо конкретном воплощении, линкер представляет собой СО-NH-(CH2-CH2-O)4 (карбоксамидо-триэтиленгликоль). Линкер может быть связан с молекулами "Dbait" в любом соответствующем положении, которое не модифицирует активности молекул "Dbait". В частности, линкер может быть связан на 5'-конце, на 3'-конце или в петле, если молекула "Dbait" является шпилькой. Однако в случае шпилечной молекулы "Dbait" авторы изобретения обнаружили, что холестерин, связанный с молекулой "Dbait" посредством линкера по ее 5'-концу, является более эффективным, чем холестерин, связанный с молекулой "Dbait" посредством линкера в петле. Таким образом, в предпочтительном воплощении предлагаемая конъюгированная молекула "Dbait" представляет собой молекулу "Dbait", имеющую шпилечную структуру, и является конъюгиро-ванной с молекулой, облегчающей эндоцитоз, предпочтительно посредством линкера по ее 5'-концу.
В другом конкретном воплощении линкер между молекулой, облегчающей эндоцитоз, конкретно,
холестерином и молекулой "Dbait" представляет собой диалкил-дисульфид {например, (CH2)r-S-S-(CH2)s, где r и s представляют собой целые числа от 1 до 10, предпочтительно от 3 до 8, например, 6}.
В наиболее предпочтительном воплощении конъюгированная молекула "Dbait" представляет собой шпилечную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую двухцепочечный участок ДНК или стебель из 32 п.о. (например, с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No 1-5, конкретно, SEQ ID No 4) и петля, связывающая две цепи двухцепочечного участка ДНК или стебель, включающий или состоящий из линкера, выбранного из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокси-тимидилата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана, причем свободные концы двухцепочечного участка ДНК или стебля (т.е. напротив петли) имеют три модифицированных фосфодиэфирных каркаса (конкретно, фосфоротиоатные межнуклеотидные связи), и причем указанная молекула "Dbait" конъюгирована с холестерином по ее 5'-концу, предпочтительно посредством линкера (например, карбоксамидоолигоэтиленгликоля, карбоксамидотриэтиленгликоля).
Молекула "Dbait" или шпилечная молекула нуклеиновой кислоты, конъюгированная или нет, также может быть описана с помощью следующей формулы:
где N представляет собой нуклеотид, п представляет собой целое число выше, чем 14, подчеркнутое N обозначает нуклеотид, имеющий или нет модифицированный фосфодиэфирный каркас, L' представляет собой линкер, С представляет собой молекулу, облегчающую эндоцитоз, L представляет собой линкер, m и p, независимо представляют собой целое число 0 или 1. В Формуле (II) и (III), C-Lm соответственно связан с 5'-концом или с 3'-концом нуклеотида. В Формуле (I-III), C-Lm предпочтительно связан с L' посредством дисульфидной связи (S-S). Когда молекула является конъюгированной, р равно 1. Предпочтительно, если подчеркнутое N относится к нуклеотиду, имеющему модифицированный фосфоди-эфирный каркас.
В предпочтительных воплощениях, молекула формулы (I), (II) или (III) имеет одну или несколько из следующих свойств:
N представляет собой дезоксинуклеотид, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из А (аденин), С (цитозин), Т (тимин) и G (гуанин), и выбран так, чтобы избежать появления CpG-динуклеотида и иметь менее чем 80 или 70%, даже еще менее, чем 60 или 50% идентичности последовательности с любым геном в геноме человека; и/или,
n представляет собой целое число от 15 до 195, предпочтительно от 19-95, более предпочтительно от 21 до 95, и еще более предпочтительно от 27 до 95. В особенно предпочтительном воплощении п равно 27; и/или,
подчеркнутое N относится к нуклеотиду, имеющему или нет фосфоротиоатный или метилфосфо-натный каркас, более предпочтительно, фосфоротиоатный каркас; предпочтительно, подчеркнутое N относится к нуклеотиду, имеющему модифицированный фосфодиэфирный каркас; и/или,
связанную L' выбирают из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокситимидиналата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксоннадекана; и/или,
m равно 1 и L представляет собой карбоксамидо-полиэтиленгликоль, более предпочтительно, кар-боксамидотриэтиленгликоль; и/или,
С выбирают из группы, состоящей из холестерина, одноцепочечных или двухцепочечных жирных кислот, таких как октадециловая, олеиновая кислота, диолеоиловая или стеариновая кислота, или лиган-да (включающего пептид, белок, аптамер), который направленно воздействует на клеточный рецептор, такой как фолиевая кислота, токоферол, сахара, такого как галактоза и манноза, и их олигосахаридов, пептида, такого как RGD и бомбезин, и белка, такого как трансферрин и интегрин, предпочтительно представляя собой холестерин;
Предпочтительно, C-Lm представляет собой триэтиленгликольны линкер (10-О-[1-пропил-3-^ карбамоилхолестерил]триэтиленгликольный радикал.
В предпочтительном воплощении конъюгированная молекула "Dbait" или шпилечная молекула нуклеиновой кислоты имеет следующую формулу:
С-Ц NNNN- NNNN-(N)n-N ([Г)
с тем же определением, что и в формулах (I), (II), (II) и (III) для N, N, n, L, L', С и т.
В предпочтительном воплощении, NNNN-(N)n-N включает по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26,
28, 30 или 32 смежных нуклеотидов "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5) или состоит из 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 смежных нуклеотидов "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb"
(SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5). В конкретном воплощении
NNNN-(N)n-N включает или состоит из "Dbait32" (SEQ ID No 1), "Dbait32Ha" (SEQ ID No 2), "Dbait32Hb" (SEQ ID No 3), "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4) или "Dbait32Hd" (SEQ ID No 5), более предпочтительно "Dbait32Hc" (SEQ ID No 4).
Соответственно конъюгированная молекула "Dbait" или шпилечная молекула нуклеиновой кислоты может быть выбрана из группы, состоящей из:
с NNNN-(N)"-N, представляющей собой SEQ ID No 1
-(Lm-C)p
TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA
(la)
(Па) (Ша)
(lb) (lib)
(Illb)
(Ic) (He)
(IHc)
(Id) (Hd)
(НИ)
ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-^
.ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-
ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT
(C_L )p ¦ TGCGTGCСCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA
с NNNN-(N),,-N, представляющей собой SEQ ID No 2
CGTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC-^\
GCATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG L
(OL )p CGTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC
" GCATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG.
CGTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC (C-L ){> -- GCATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG.
с NNNN-(N)"-N, представляющей собой SEQ ID No 3
GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTAGGCACAGC- CGATCCGAACAAACGACCCAACATCCGTGTCG-^ L
(C-L )p - GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTAGGCACAGC-. ,
m CGATCCGAACAAACGACCCAACATCCGTGTCG-1
GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTAGGCACAGC
jC_L |p CGATCCGAACAAACGACCCAACATCCGTGTCG-
c NNNN-(N)n-N, представляющей собой SEQ ID No 4
GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT.
.GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-
GCT GTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA- ,
|C_L jp CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-^ 1
с NNNN-(N)n-N, представляющей собой SEQ ID No 5
с тем же определением, что и в формулах (I), (II), (II') и (III) для L, L', С, р и m.
В предпочтительных воплощениях молекула формул (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) и (IIIe), предпочтительно, формул (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe), имеет одну или несколько из следующих характеристик:
подчеркнутый нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему или нет фосфоротиоатный или ме-тилфосфонатный каркас, более предпочтительно, фосфоротиоатный каркас; предпочтительно, подчеркнутый нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему фосфоротиоатный или метилфосфонатный каркас, более предпочтительно, фосфоротиоатный каркас; и/или,
связанную L' выбирают из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокситимидиналата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксоннадекана; и/или,
m равно 1 и L представляет собой карбоксамидо-полиэтиленгликоль, более предпочтительно, кар-боксамидотриэтиленгликоль; и/или,
р равно 1; и/или,
С выбирают из группы, состоящей из холестерина, одноцепочечных или двухцепочечных жирных кислот, таких как октадециловая, олеиновая кислота, диолеоиловая или стеариновая кислота, или лиган-да (включающего пептид, белок, аптамер), который направленно воздействует на клеточный рецептор, такой как фолиевая кислота, токоферол, сахара, такого как галактоза и манноза, и их олигосахаридов, пептида, такого как RGD и бомбезин, и белка, такого как трансферрин и интегрин, предпочтительно представляя собой холестерин.
Предпочтительно, C-Lm представляет собой триэтиленгликольный линкер (10-О-[1-пропил-3-№ карбамоилхолестерил]триэтиленгликольный радикал.
В конкретном воплощении молекулы "Dbait" или шпилечной молекулы нуклеиновой кислоты формул (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) и (IIIe), предпочтительно формул (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe), L' предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокситимидилата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана.
В конкретном воплощении молекулы "Dbait" или шпилечной молекулы нуклеиновой кислоты формул (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) и (IIIe), предпочтительно формул (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe), с С, представляющей собой холестерин, C-Lm представляет собой радикал
В предпочтительном воплощении конъюгированная молекула "Dbait" или шпилечная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), и (IIe), где C-Lm представляет собой радикал
и где L' предпочтительно выбрана из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадезокситими-дилата (Т4) и 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана, более предпочтительно 2,19-бис(фосфоро)-8-гидраза-1-гидрокси-4-окса-9-окосононадекана.
В особенно предпочтительном воплощении молекула "Dbait" или шпилечная молекула нуклеиновой кислоты имеет следующую формулу:
.GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-
где C-Lm представляет собой радикал
Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению молекулы "Dbait", как описано выше, к фармацевтической композиции, включающей ее и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, для применения в комбинации с гипертермией при лечении рака, совместно или без лучевой терапии и/или радиоизотопной терапии и/или противоопухолевой химиотерапии, предпочтительно с использованием ДНК-разрушающего противоопухолевого агента, как подробно описано ниже.
Гипертермия
Гипертермия является типом лечения, при котором ткань организма подвергают высоким температурам для повреждения и уничтожения раковых клеток или для того, чтобы сделать раковые клетки более чувствительными к воздействию и некоторым противоопухолевым лекарственным средствам. Существует множество хорошо известных специалистам в данной области способов, с помощью которых может доставляться тепло.
Гипертермия может быть локальной гипертермией, применяемой к опухоли, региональной гипертермией, применяемой к ткани, органу или его части, или гипертермией всего организма. Лечение с использованием гипертермии может быть "жестким" или "мягким".
Подразумевается, что под "жесткой гипертермией" понимают высокие температуры от 50 до 100°С, предпочтительно от 60 до 100°С, применяемые внутри опухоли для индукции необратимого повреждения митохондриальных и цитозольных ферментов клеток, чтобы привести к термальному разрушению опухоли.
Подразумевается, что под "мягкой гипертермией" понимают температуры, равные тем, что являются естественными высокими температурами. Мягкая гипертермия представляет собой температуру тела и, следовательно, температуру раковых клеток, составляющую по меньшей мере, 40°С, предпочтительно от 40 до 42°С, более предпочтительно, около 41°С. Подразумевается, что под "умеренной гипертермией" понимают методы нагревания раковых клеток до температуры, составляющей, по меньшей мере, 41°С, предпочтительно интервал 41-47°С, более предпочтительно 42-45°С. Подразумевается, что под термином "высокая гипертермия" понимают методы нагревания раковых клеток до температуры, составляющей, по меньшей мере, 50°С. Высокая гипертермия применяется только в виде локальной гипертермии.
Гипертермия может быть осуществлена различными способами, хорошо известными в данной области. Например, обработку с использованием гипертермии осуществляют с помощью микроволн (РЧА), ультразвука (например, фокусированного ультразвука (FUS или HIFU)), инфракрасных лучей, наноча-стиц или нанотрубок, индуцирующих нагревание, магнитной гипертермии, перфузии или инфузии предварительно нагретых жидкостей, таких как кровь, внутрибрюшинно нагреваемого потока, гипертермии, индуцированной лекарственным средством, или с помощью прямого применения нагревания.
Локальная гипертермия состоит из нагревания очень маленькой области, предпочтительно, опухоли. В данном контексте, целью является уничтожение опухоли без нанесения других повреждений. Нагревание может применяться с помощью энергии микроволн, радиочастот, ультразвука или путем применения магнитной гипертермии. В данном контексте гипертермия представляет собой гипертермию от умеренной до высокой. В зависимости от локализации опухоли, нагревание может применяться к поверхности тела (т.е., поверхностная гипертермия), в естественных полостях тела или глубже в ткани посредством применения игл или зондов (т.е., внутренняя гипертермия). В предпочтительном воплощении гипертермия представляет собой радиочастотную абляцию опухоли.
Региональная гипертермия состоит из нагревания части тела, такой как орган, его части, конечности и т.д. В данном контексте гипертермия представляет собой умеренную гипертермию для предохранения органа или конечности и для ослабления опухолевых клеток. Региональная гипертермия может осуществляться с помощью того же способа, что и локальная гипертермия с уменьшенной интенсивностью иди периодом. В ином случае, может использоваться перфузия или инфузия предварительно нагретой жидкости, такой как кровь или внутрибрюшинная жидкость. В некоторых случаях, когда гипертермию объединяют с противоопухолевой химиотерапией, к предварительно нагретой жидкости может быть добавлен противоопухолевый агент. Например, с целью лечения перитонеального рака может использоваться непрерывная гипертермическая брюшинная перфузия (СНРР).
Гипертермия всего тела проводится с целью лечения метастазирующего рака. Прямое применение
нагревания может проводиться путем оставления пациента в горячей комнате или путем оборачивания его в горячие одеяла. Гипертермия, индуцированная с помощью лекарственного средства, относится к способу, при котором лекарственное средство вводится объекту, чтобы помочь пациенту вызвать лихорадку. Например, лекарственное средство может препятствовать теплопередаче на периферию, повышать скорость метаболизма, вызывать клеточный или гуморальный иммунный ответ, имитировать эндогенный пироген, или повреждать ткани. Кроме того, гипертермия всего тела может проводиться с помощью метода гипертермиии под инфракрасным куполом.
Эндосомолитический агент
Конъюгированные молекулы "Dbait" или шпилечные молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно используются в данном документе в комбинации с эндосомолитическим агентом (например, хло-рохином, фузогенными липидами или пептидами и т.д.). Фактически лечение с помощью эндосомолити-ческого агента облегчает высвобождение конъюгированных молекул из эндосом. Конкретно, эндосомо-литические агенты способны воздействовать на лизис эндосомы в ответ на изменение рН, и инкапсулирующий или упаковывающий компонент способен упаковывать терапевтический агент для доставки клеточным или субклеточным компонентам. Эндосомолитическое вещество, которое включает в частности хинолиновые соединения, особенно 4-аминохинолин и 2-фенилхинолиновые соединения и их амино-, тио-, фенил-, алкил-, винил- и галогенпроизводные, фузогенные липиды, пептиды или белки.
В предпочтительном воплощении эндосомолитический агент представляет собой низкомолекулярное соединение. Основной эндосомолитический агент может быть выбран из группы, состоящей из хинина, хлорохина, гидроксихлорохинов, амодиахинов (камохины), амопирохинов, примахинов, мефлохи-нов, нивахинов, галофантринов, хинон-иминов и их комбинации. Предпочтительные эндосомолитиче-ские агенты представляют собой хинолиновые эндосомолитические агенты, включающие в частности перечисленные ниже соединения под их химическими названиями: 7-хлор-4-(4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин(хлорохин); 7-хлоро-4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино) хинолин (гидроксихлорохин); 7-фтор-4-(4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин; 4-(4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин; 7-хлор-4-(4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин(десметилхлорохин); 7-фтор-4-(4-диэтиламино-1-бутиламино)хи-нолин); 4-(4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин; 7-хлор-4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин; 7-фтор-4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин; 4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-бутиламино)хинолин; 7-хлоро-4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хино-лин; 7-фторо-4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин; 4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(1-карбокси-4-диэтиламино-1-метилбутиламино)хинолин; 7-фторо-4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хинолин; 4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хино-лин; гидроксихлорохин фосфат; 7-хлоро-4-(4-этил-(2-гидроксиэти-1)амино-1-бутиламино)хинолин(де-сметилгидроксихлорохин); 7-фторо-4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-бутиламино)хинолин; 4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-бутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-бутиламино)хинолин; 7-хлоро-4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)-амино-1-бутиламино)хинолин; 7-фторо-4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)-амино-1-бутиламино)хинолин; 4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-бутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)-амино-1-бутиламино)хинолин; 7-хлоро-4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хи-нолин; 7-фторо-4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хинолин; 4-(1-карбок-си-4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хинолин; 7-гидрокси-4-(1-карбокси-4-этил-(2-гидроксиэтил)амино-1-метилбутиламино)хинолин; 8-[(4-аминопентил)амино-6-метоксидигидрохлорид хинолин; 1-ацетил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин; 8-[(4-аминопентил)амино]-6-метоксихинолиндигидрохло-рид; 1-бутирил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин; 3-хлоро-4-(4-гидрокси-альфа, альфа'-бис(2-метил-1-пирролидинил)-2,5-ксилидинохинолин, 4-[(4-диэтиламино)-1-метилбутиламино]-6-метоксихинолин; 3-фторо-4-(4-гидрокси-альфа, альфа'-бис(2-метил-1-пирролидинил)-2,5-ксилидинохинолин, 4-[(4-диэтил-амино)-1-метилбутиламино]-6-метоксихинолин; 4-(4-гидрокси-альфа,альфа'-бис(2-метил-1-пирролиди-нил)-2,5-ксилидинохинолин; 4-[(4-диэтиламино)-1-метилбутил-амино]-6-метоксихинолин; 3,4-дигидро-1-(2Н)-хинолинкарбоксиальдегид; 1,1'-пентаметилен дихинолеиниум дииодид; 8-хинолинол сульфат и их амино, альдегид, карбоксил, гидроксил, галоген, кето, сульфгидрил и винил производные и аналоги. Другие агенты описаны в Naisbitt et al. (1997, J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893) и в US 5,736,557. В более предпочтительном воплощении эндосомолитический агент может быть выбран из группы, состоящей из хлорохина, гидроксихлорохина, десметилхлорохина, гидроксихлорохин фосфата и десметилгид-роксихлорохина, предпочтительно он представляет собой хлорохин или гидроксихлорохин, более предпочтительно, хлорохин.
В другом воплощении, эндосомолитический агент представляет собой фузогенный липид, пептид или белок. Фактически, в данной области известно множество фузогенных липидов, пептидов или белков. Например, фузогенные липиды, пептиды или белки раскрыты в следующих патентных заявках: WO 10057160, US 2007/0293449, US 2006/0051405, WO 10053489, WO 09126933. В частности, в WO
09/126933 фузогенные липиды, пептиды и белки описаны на страницах 23-29.
ДНК-повреждающая обработка
В дополнение к молекулам "Dbait" и гипертермии, и эндосомолитическому агенту, если молекулы "Dbait" конъюгированы, лечение также может включать обработку противоопухолевыми препаратами, предпочтительно с использованием ДНК-повреждающего агента или лучевой терапии.
Лечение с использованием повреждения ДНК может представлять собой лучевую терапию, химиотерапию с использованием повреждающего ДНК агента или их комбинацию. Обработка, повреждающая ДНК, относится к обработке, индуцирующей разрывы в цепях ДНК, предпочтительно относительно специфично в раковых клетках.
Разрыв цепей ДНК может быть достигнут с использованием ионизирующего излучения (лучевая терапия). Лучевая терапия включает, в частности, у-излучение, рентгеновское излучение и/или направленную доставку радиоизотопов к опухолевым клеткам. Другие типы лучевой терапии включают микроволны и УФ-излучение. Другие способы лучевой терапии также рассматриваются в настоящем изобретении.
Разрыв цепей ДНК может быть достигнут с помощью радиоизотопной терапии, в частности, путем введения радиоизотопа, предпочтительно, радиоизотопа направленного воздействия. Направленное воздействие может быть осуществлено с помощью химических свойств изотопа, такого как радиоактивный йод, который специфично абсорбируется щитовидной железой в тысячу раз лучше, чем другим органами. В ином случае направленное воздействие может быть осуществлено путем присоединения радиоизотопа к другой молекуле, имеющей свойства направленного воздействия, такой как гаптен или антитело. Может использоваться любой из ряда радиоактивных изотопов, включающих в частности Индий-111, Лютеций-171, Висмут-212, Висмут-213, Астат-211, Медь-62, Медь-64, Медь-67, Итрий-90, Йод-125, Йод-131, Фосфор-32, Фосфор-33, Скандий-47, Серебро-111, Галлий-67, Празеодимий-142, Самарий-153, Тер-бий-161, Диспрозий-166, Гольмий-166, Рений-186, Рений-188, Рений-189, Свинец-212, Радий-223, Акти-ний-225, Железо-59, Селен-75, Мышьяк-77, Стронций-89, Молибден-99, Родий-105, Палладий-109, Пра-зеодимий-143, Прометий-149, Эрбий-169, Иридий-194, Золото-198, Золото-199 и Свинец-211.
ДНК-повреждающий противоопухолевый агент выбран и группы, состоящей из ингибитора топои-зомераз I или II, агента, перекрестно сшивающего ДНК, ДНК-алкилирующего агента, антиметаболического агента и ингибиторов митотического веретена.
Ингибиторы топоизомераз I и/или II включают в частности этопосид, топотекан, камптотецин, ири-нотекан, амсакрин, интоплицин, антрациклины, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, идарубицин и митоксантрон. Ингибиторы Топоизомеразы I и II включают в частности интоплецин.
Агенты, перекрестно сшивающие ДНК, включают, в частности, цисплатин, карбоплатин и оксапла-
тин.
Антиметаболические агенты блокируют ферменты, ответственные за синтез нуклеиновых кислот или включаются в ДНК, что ведет к появлению некорректного генетического кода и в результате приводит к апоптозу. Некоторые примеры антиметаболических агентов включают, без ограничения перечисленным, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозин дезаминазы, а более конкретно, Метотрексат, Флоксуридин, Цитарабин, 6-Меркаптопурин, 6-Тиогуанин, Флударабин фосфат, Пентостатин, 5-Фторурацил, Гемцитабин и Капецитабин.
ДНК-повреждающие противоопухолевые агенты могут представлять собой алкилирующие агенты, включающие, в частности, азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомо-чевину, соли металлов и триазены. Некоторые примеры этих агентов включают Урацил иприт, Хлорме-тин, Циклофосфамид (CYTOXAN(R)), Ифосфамид, Мелфалан, Хлорамбуцил, Пипоброман, Триэтилен-меламин, Триэтилентиофосфорамин, Бусульфан, Кармустин, Ломустин, Фотемустин, цисплатин, карбо-платин, оксаплатин, тиотепа, Стрептозоцин, Дакарбазин, и Темозоломид.
Ингибиторы митотического веретена включают в частности паклитаксел, доцетаксел, винорелбин, ларотаксел (также называемый XRP9881; "Sanofi-Aventis"), XRP6258 ("Sanofi-Aventis"), BMS-184476 ("Bristol-Meyer-Squibb"), BMS-188797 ("Bristol-Meyer-Squibb"), BMS-275183 ("Bristol-Meyer-Squibb"), ортатаксел (также называемый IDN 5109, BAY 59-8862 или SB-T-101131; "Bristol-Meyer-Squibb"), RPR
109881A ("Bristol-Meyer-Squibb"), RPR 116258 ("Bristol-Meyer-Squibb"), NBT-287 ("TAPESTRY"), PG-
паклитаксел (также называемый СТ-2103, РРХ, паклитаксел полиглумекс, паклитаксел полиглутамат или Ксиотакс(tm)), АБРАКСАН(r) (также называемый Наб-Паклитаксел; "ABRAXIS BIOSCIENCE"), Тесетак-сел (также называемый DJ-927), IDN 5390 ("INDENA"), Таксопрексин (также называемый докозагекса-новая кислота-паклитаксел; "PROTARGA"), DHA-паклитаксел (также называемый Таксопрексин(r)), и МАС-321 ("WYETH"). Также см. обзор Hennenfent & Govindan (2006, Annals of Oncology, 17, 735-749).
Рак или опухоли, подлежащие лечению Термины "рак", "раковый" или "злокачественный" относятся к или описывают физиологического состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают лейкоз, лимфому, бластому, карциному и саркому. Более конкретные примеры рака включают хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый лимфобласт
ный лейкоз с филадельфийской хромосомой (Ph+ALL), плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, глиому, желудочно-кишечный рак, почечный рак, рак яичника, рак печени, колоректальный рак, эндометриальный рак, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, рак шейки матки, рак желудка, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, карциному толстой кишки, рак головы и шеи, желудочный рак, герминому, детскую саркому, синоназальную лимфому естественных киллеров, множественную миелому, острый миелогенный лейкоз, мастоцитоз и любой симптом, ассоциированный с мастоцитозом.
"Лейкоз" относится к прогрессирующим злокачественным заболеваниям кровеобразующих органов и в целом характеризуется нарушенной пролиферацией и развитием лейкоцитов и их предшественников в крови и костном мозге. Лейкоз в целом клинически классифицируется на основании (1) длительности и характера заболевания - острый или хронический; (2) типа вовлеченных в заболевание клеток; миелоид-ный (миелогенный), лимфоидный (лимфогенный) или моноцитарный; и (3) увеличения или не увеличения количества аномальных клеток в крови - лейкемический или алейкемический (сублейкемический). Лейкоз включает, например, острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз, алейкемический лейкоз, лейкоцитемический лейкоз, базофильный лейкоз, лейкоз бластных клеток, бычий лейкоз, хронический миелолейкоз, гематодермию, эмбриональный лейкоз, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, волосатоклеточный лейкоз, гемобластный лейкоз, гемоци-тобластный лейкоз, гистиоцитарный лейкоз, недифференцированный бластный лейкоз, острый моноци-тарный лейкоз, лейкопенический лейкоз, лимфолейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфогенный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лимфобластную лимфому, тучноклеточный лейкоз, мегака-риоцитарный лейкоз, микромиелобластный лейкоз, моноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, мие-лоидный лейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз по типу Негели, плазмаклеточный лейкоз, плазмацитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, лейкоз с клетками Ридера, лейкоз по типу Шиллинга, недифференцированный бластный лейкоз, сублейкемический лейкоз и лейкоз с недифференцированными клетками. В определенных аспектах в настоящем изобретении предлагается лечение хронического миелоидного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза и острого лимфобластного лейкоза, положительного по Филадельфийской хромосоме (Ph+ ALL).
Различные типы рака также включены в объем настоящего изобретения, включая, без ограничения перечисленным, следующие: карциному в том числе мочевого пузыря (в том числе ускоренный и метастатический рак мочевого пузыря), молочной железы, толстой кишки (включая колоректальный рак), почек, печени, легкого (в том числе мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого), яичника, предстательной железы, яичек, мочеполового тракта, лимфатической системы, прямой кишки, гортани, поджелудочной железы (включая экзокринной рак поджелудочной железы), пищевода, желудка, желчного пузыря, шейки матки, щитовидной железы и кожи (включая плоскоклеточный рак); гемопоэтические опухоли лимфойдного ряда, в том числе лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома, лимфома Ходжкина, неход-жкинская лимфома, волосатоклеточный лейкоз, гистиоцитарная лимфома и лимфому Беркитта; гемопо-этические опухоли миелоидного происхождения, включая острый и хронический миелогенные лейкозы, миелодиспластический синдром, миелоидный лейкоз, и промиелоцитарный лейкоз, опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитома, нейробластома, глиома и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому рабдомиосаркому и остеосаркому, другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциномы; меланому, злокачественную меланому неоперабельной стадии III или IV, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, глиому, желудочно-кишечный рак, рак почки, рак яичников, рак печени, рак толстой кишки, рак эндометрия, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак желудка, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди, рак толстой кишки и рак головы и шеи, ретинобластому, рак желудка, опухоли половых клеток, костный рак, опухоли костей, злокачественную фиброзную гистиоцитому кости взрослых; злокачественную фиброзную гистиоцитому кости детей, саркому, саркому у детей, синоназальную лимфому естественных киллеров, неоплазий, плазмацитомы; миелодиспластические синдромы; нейробластомы, опухоль половых клеток яичка, внутриглазную меланому, миелодиспластические синдромы; миелодиспластиче-ские/миелопролиферативные заболевания, синовиальную саркому. Кроме того, расстройства, включая пигментную крапивницу, мастоцитозы, такие как диффузный кожный мастоцитоз, солитарную мастоци-тома человека, а также мастоцитому собак и некоторые редкие подтипы, такие как буллезный, эритро-дермический и телеангиэктатический мастоцитозы, мастоцитоз с ассоциированным гематологическим расстройством, такой как миелопролиферативный или миелодиспластический синдром, или острый лейкоз, миелопролиферативное расстройство, связанное с мастоцитозом, лейкоз тучных клеток, в дополнение к другим видам рака. Другие типы рака, также включенные в рамки этого перечня заболеваний, включают, без ограничения перечисленным, следующие: карциному, в том числе мочевого пузыря, уро
телиальную карциному, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, яичка, в частности, тестикулярные семино-мы, и кожи; плоскоклеточный рак; злокачественную стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта ("GIST"); гемопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, включая лейкоз, острый лимфоцитар-ный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточный лейкоз и лимфому Беркитта; гемопоэтические опухоли миелоидного происхождения, в том числе острые и хронические миелогенный лейкоз и промие-лоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркома и рабдомио-саркома; другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитома, нейробластома, глиома и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосар-кому и остеосаркому, и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиномы, фолликулярный рак щитовидной железы, тератокарциномы, резистентностная к химиотерапии несеминомная опухоль половых клеток, и саркома Капоши, и любые их метастазы.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретениярак может быть солидной опухолью. Раке также может быть раком крови. Например, рак может быть саркомой и остеосаркомой, такой как саркома Капоши, саркома Капоши, связанная со СПИД, меланома, в частности, увеальная меланома, и рак головы и шеи, почки, яичника, поджелудочной железы, простаты, щитовидной железы, легкого, пищевода, молочной железы, мочевого пузыря, ободочной и прямой кишки, печени и желчных протоков, матки, аппендикса и шейки матки, рак яичка, желудочно-кишечный рак, рак эндометрия и перитонеальный рак. Предпочтительно, раком может быть саркома, меланома, в частности, увеальная меланома, и рак головы и шеи, почки, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, щитовидной железы, легкого, пищевода, молочной железы, мочевого пузыря, ободочной и прямой кишки, печени, шейки матки, рак эндометрия и перитонеальный рак. В весьма конкретном воплощении, злокачественное новообразование может быть перитонеальным раком или раком печени. В конкретном воплощении рак может быть большой карциномой печени и метастазами в печени, в честности в комбинации с радиочастотной абляцией (РЧА). В другом частном воплощении, рак может быть перитонеальным канцероматозом, в частности в комбинации с гипертермической перитонеальной химиотерапией (HIPEC).
Фармацевтические композиции и продукты, наборы или комбинированные препараты, описанные в изобретении, могут быть пригодны для ингибирования роста солидных опухолей, уменьшения опухолевого объема, предотвращения метастатического распространения опухолей, и роста или развития микрометастазов. Фармацевтические композиции и продукты, наборы и комбинированные препараты, описанные в изобретении, подходят, в частности, для лечения пациентов с плохим прогнозом или с радио- или химиоустойчивыми опухолями.
Режим, дозировки и пути введения
Эффективная дозировка каждого из партнеров комбинации, использованных в комбинированном препарате изобретения, может варьировать в зависимости от конкретного использованного соединения или фармацевтической композиции, режима введения, состояния, подвергаемого лечению, тяжести состояния, подвергаемого лечению. Таким образом, режим дозировки комбинированного препарата изобретения выбирают в соответствии с множеством факторов, включая путь введения и статус пациента. Лечащий врач, клинический врач или ветеринар обычной квалификации может определить и прописать эффективное количество одиночных активных ингредиентов, требуемого для предотвращения, противодействия или торможения прогрессирования данного состояния.
Требуется определенная схема, на основе кинетики доступности активных ингредиентов в целевых участка, для точного достижения нужной концентрации активных ингредиентов в определенном диапазоне, который дает эффективность без токсичности.
Гипертермическая обработка может быть применена перед, одновременно с или после введения молекул "Dbait". Более предпочтительно, если гипертермию применяют после введения молекул "Dbait", предпочтительно в период между 5 мин и 24 ч, более предпочтительно - между 1 и 6 ч.
Путь введения для молекул "Dbait" может быть пероральным, парентеральным, внутривенным, внутриопухолевым, подкожным, внутричерепным, внутриартериальным, местным, ректальным, транс-дермальным, интрадермальным, назальным, внутримышечным, интраперитонеальным, внутрикостным и т.п. В предпочтительном воплощении, молекулы "Dbait" вводят или инъецируют около опухолевого(ых) участка(ов) которые подлежат лечению. В конкретном воплощении, если рак, подлежащий лечению, является перитонеальным карциноматозом, молекулы "Dbaits" могут быть доставлены с помощью капно-перитонеума. В другом конкретном воплощении, если рак, подлежащий лечению, является гепатомой, молекулы "Dbait" могут быть доставлены внутривенно, перорально или внутриартериальной инъекцией и эмболизацией. В дополнительном воплощении, если рак, подлежащий лечению, является меланомой, молекулы "Dbait" могут быть доставлены подкожной и внутривенной инъекцией. Другим предпочтительным путем введения является внутриопухолевая инъекция.
Если молекулы "Dbait" конъюгируются, эндосомататолитический агент и конъюгированные молекулы "Dbait" могут быть введены одним и тем же путем или двумя различными путями. Путь введения
для эндосомолитического агента, предпочтительно, хлорохина или гидроксихлорохина, более предпочтительно, хлорохина, может быть пероральным, парентеральным, внутривенным, внутриопухолевым, подкожным, внутричерепным, внутриартериальным, местным, ректальным, трансдермальным, внутри-кожным, назальным, внутримышечным, интраперитонеальным, внутрикостным и т.п. В конкретном воплощении, эндосомолитический агент, предпочтительно, хлорохин или гидроксихлорохин, более предпочтительно, хлорохин, вводится пероральным путем или интраперитонеальным путем, предпочтительно, пероральным путем. Преимущество коинъекции или местной инъекции заключается в том, что отсутствует необходимость в подборе фармакологического профиля в плазме.
В первом предпочтительном воплощении с конъюгированной молекулой "Dbait", режим обработки включает стадию предварительной обработки пациента эндосомолитическим агентом, предпочтительно хлорохином, перед началом обработки коньюгированными молекулами "Dbait" или шпилечными молекулами нуклеиновых кислот. Например, когда эндосомолитический агент вводят около опухолевого сайта, подлежащего лечению (например, местное введение), он может быть введен одновременно или, по меньшей мере, за около 1, 2, 3, 4 или 5 ч перед введением конъюгированных молекул "Dbait" или шпилечных молекул нуклеиновых кислот, предпочтительно за от около одного часа до трех часов, более предпочтительно за около два часа. В ином случае при введении эндосомолитического агента систематическим введением, его можно вводить дольше перед введением конъюгированных молекул "Dbait" или шпилечных молекул нуклеиновых кислот и более длительной обработкой, предпочтительно в течение периода от около одного до трех часов перед введением конъюгированных молекул "Dbait" или шпилечных молекул нуклеиновых кислот, более предпочтительно в течение период около двух недель. После введения конъюгированных молекул "Dbait" или шпилечных молекул нуклеиновых кислот, обработка эндосомолитическим агентом может быть продолжена при условии введения холестерин-конъюгированных молекул "Dbait" или шпилечных молекул нуклеиновых кислот. В ином случае обработка эндосомолитическим агентом также может быть закончена.
Если в комбинации с молекулой "Dbait" используется ДНК-повреждающий противоопухолевый агент, ДНК-повреждающий противоопухолевый агент и молекулы "Dbait" могут быть введены одним путем или разными путями. Путь введения для ДНК-повреждающего противоопухолевого агента может быть пероральным, парентеральным, внутривенным, внутриопухолевым, подкожным, внтричерепным, внутриартериальным, местным, ректальным, чрескожным, внутрикожным, назальным, внутримышечным, внутрикостным и т.п.
В конкретном воплощении, ДНК-повреждающий противоопухолевый агент подлежит введению пе-роральным путем, а молекулы "Dbait" могут быть введены внутриопухолевой инъекцией, подкожной инъекцией, внутриперитонеальной инъекцией, внутривенной инъекцией, или перооральным путем, предпочтительно внутриопухолевой, подкожной или интраперитонеальной инъекцией или пероральным путем, а еще предпочтительней - внутриопухолевой или подкожной инъекцией.
Молекулы "Dbait" или шпилечные молекулы нуклеиновых кислот вводятся перед и/или одновременно с и/или после облучения и/или введения ДНК-повреждающего противоопухолевого агента, более предпочтительно перед и/или одновременно с облучением и/или введением ДНК-повреждающего противоопухолевого агента. Облучение и/или введение ДНК-повреждающего противоопухолевого агента осуществляют так, чтобы молекулы "Dbait" присутствовали в опухолевых клетках, когда применяется облучение или когда ДНК-повреждающий противоопухолевый агент достигает опухолевых клеток. Лечащий врач, клинический врач или ветеринар обычной квалификации может определить режим на основании активных ингредиентов, кинетики достижения ими целевых сайтов или их фармакокинетических профилей в плазме. Предварительные результаты указывают на то, что молекулы "Dbait" остаются активными в течение одного дня.
В конкретном предпочтительном воплощении с конъюгированной молекулой "Dbait" режим обработки включает стадию предварительной обработки пациента эндосомолитическим агентом, предпочтительно хлорохином или гидроксихлорохином, более предпочтительно хлорохином, перед началом лечения конъюгированными молекулами "Dbait" или шпилечными молекулами нуклеиновых кислот. После этого в начале обработки конъюгированными молекулами "Dbait" или шпилечными молекулами нуклеиновых кислот или после обработки конъюгированными молекулами "Dbait" или шпилечными молекулами нуклеиновых кислот должно быть осуществлено облучение или должен быть введен ДНК-повреждающий противоопухолевый агент. Например, через 3-24 часа после начала обработки конъюги-рованными молекулами "Dbait" надо применить облучение или надо ввести ДНК-повреждающий противоопухолевый агент. ДНК-повреждающий противоопухолевый агент и конъюгированные молекулы "Dbait" также могут быть введены одновременно.
После начала обработки лучевой терапией или ДНК-повреждающим противоопухолевым агентом, обработка молекулами "Dbait" может продолжаться до тех пор, пока применяется лучевая терапия или вводится ДНК-повреждающий противоопухолевый агент. В ином случае, обработка молекулами "Dbait" также может быть закончена.
Эффективная дозировка молекул "Dbait", использованная вместе с гипертермией, может варьировать в зависимости от режима введения, состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, подле
жащего лечению. Таким образом, режим дозировки молекул "Dbait" выбирают в соответствии с множеством факторов, включая путь введения и статус пациента. Лечащий врач, клинический врач или ветеринар обычной квалификации легко может определить и прописать эффективное количество молекул "Dbait", требуемое для предотвращения, противодействия или торможения прогрессирования рака.
Например, при местном введении (например, когда используется внутриопухолевое или подкожное введение) эффективное количество молекул "Dbait" составляет по меньшей мере 0,01 мг на 1 см3 опухоли, предпочтительно 0,1-40 мг на 1 см3 опухоли, наиболее предпочтительно 1-20 мг на 1 см3 опухоли. Эффективное количество может быть введено в ежедневном протоколе обработки (например, 5 дней в неделю, в течение от 3 до 6 последовательных недель или 3 раза в неделю в течение от 3 до 6 последовательных недель). В ином случае эффективное количество по меньшей мере 0,1 мг на 1 см3 опухоли, предпочтительно 0,1-40 мг на 1 см3 опухоли, наиболее предпочтительно 1-20 мг на 1 см3 опухоли, может быть введено, например, в еженедельном протоколе обработки в течение 3-6 последовательных недель. Если используются другие пути введения, специалист в данной области может адаптировать количество в целях получения эффективного количества молекул "Dbait" в опухоли по меньшей мере 0,01 мг на 1 см3 опухоли, предпочтительно 0,1-40 мг на 1 см3 опухоли, наиболее предпочтительно 1-20 мг на 1 см3 опухоли, в частности в ежедневном протоколе обработки или в еженедельном протоколе обработки. Например, для системного пути эффективное количество или единица дозировки молекул "Dbait" может составлять от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 4 до 40 мг. Соответственно, для системного пути эффективное количество или единичная дозировка молекул "Dbait" может составлять от 0,06 до 0,6 мг/кг пациента. Конечно, дозировка и режим могут быть адаптированы специалистом в данной области с учетом режимов химиотерапии и/или лучевой терапии.
Для эндосомолитического агента, в частности для хлорохина или гидроксихлорохина, более предпочтительно для хлорохина, эффективная дозировка эндосоматического агента, используемого в комбинированном препарате, наборе или продукте изобретения, может варьировать в зависимости от режима введения, состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, подлежащего лечению. Таким образом, режим дозирования эндосомолитического агента выбирают в соответствии с множеством факторов, включая путь введения и статус пациента. Лечащий врач, клинический врач или ветеринар обычной квалификации легко может определить и прописать эффективное количество эндосомолитического агента, требуемого для предотвращения, противодействия или торможения прогрессирования рака, в частности в комбинации с конъюгированными молекулами "Dbait" В конкретном воплощении, если используется пероральный путь и если известно, что выбранный эндосомолитический агент применим при лечении или профилактике малярии, эндосомолититческий агент, в частности хлорохин и гидроксихлорохин, более предпочтительно хлорохин, используется в такой же дозировке и в том же режиме, что и при лечении или профилактике малярии. Например, если выбранным эндосомолититческим агентом является хлоро-хин или гидроксихлорохин, более предпочтительно хлорохин, хлорохин или гидроксихлорохин может быть введен в количестве 100-600 мг в день, предпочтительно 200-400 мг в день, более предпочтительно около 300 мг в день, единожды, дважды, трижды или четырежды в неделю. В конкретном воплощении хлорохин или гидроксихлорохин могут быть введены в количестве около 100 мг в день в течение одной или двух недель или около 300 мг, дважды в неделю в течение одной или двух недель. В другом конкретном воплощении, если предполагается местное введение, например, подкожный или внутриопухоле-вый путь, эндосомолитический агент, в частности хлорохин или гидроксихлорохин, более предпочтительно хлорохин, могут быть использованы в количестве 100-300 мг.
Для лучевой терапии может быть использован любой известный в данной области режим лучевой терапии, в частности стереотаксическое облучение (например, 15 Гр) или фракционированное облучение. Применение фракционированного облучения может быть особенно эффективно, например, облучение может быть применено каждый день или каждые 2-5 дней, предпочтительно каждые 3-4 дня, в течение одной, двух, трех, четырех, пяти или шести недель. Облучение может составлять от 1 до 10 Гр, предпочтительно от 2 до 5 Гр, в частности, 2, 3, 4 или 5 Гр. Например, может рассматриваться фракционированное облучение 15x2 Гр в течение 6 недель, или 4 по 6x5 Гр течение двух недель. В предпочтительном воплощении предусмотренная лучевая терапия является протоколом с 4 облучениями 5 Гр в течение двух недель. Были протестированы различные режимы или условия комбинированного лечения рака облучением и молекулами "Dbait" показавшие, что радиосенситизацию опухолей зависит от доз молекулам "Dbait", но не от доз облучения.
Для химиотерапии эффективная дозировка ДНК-повреждающего противоопухолевого агента, использованного в комбинированном препарате, наборе или продукте изобретения или в комбинации с композицией изобретения могут варьировать в зависимости от конкретного использованного ДНК-повреждающего противоопухолевого агента, режима введения, состояния, подвергаемого лечению, тяжести состояния, подвергаемого лечению. Таким образом, режим дозировки ДНК-повреждающего противоопухолевого агента выбирают в соответствии с множеством факторов, включая путь введения и статус пациента. Лечащий врач, клинический врач или ветеринар обычной квалификации легко может определить и прописать эффективное количество ДНК-повреждающего противоопухолевого агента, требуемого для предотвращения, противодействия или торможения прогресса рака.
Обработка может включать один или несколько циклов, например, от двух до десяти циклов, в частности, два, три, четыре или пять циклов. Циклы могут быть непрерывные или раздельные. Например, каждый цикл отделен периодом времени от одной до восьми недель, предпочтительно от трех до четырех недель.
Более того, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут описаны в представленных ниже примерах, которые должны рассматриваться как иллюстрирующие и не ограничивающие.
Примеры Результаты
"Dbait32Hc" демонстрируют синергическую цитотоксичностъ при объединении с гипертермией in vitro. Во-первых, авторы протестировали клетки MRC5 и НТ29, обрабатываемые "Dbait32Hc" или "Dbait8H", трансфекционным контролем без воздействия на DNA-PK, затем подвергли в течение 1 ч гипертермии при 43°С и зафиксировали через 1 ч. Для оценки релевантности добавления "Dbait32Hc" к РЧА, авторы осуществили анализ с трипановым синим для измерения индуцированной обработкой клеточной смерти. После обработки "Dbait32Hc", культуры MRC5 и НТ29 подвергали гипертермии, при 41 или 43°С в течение 1 ч и оценивали клеточную смерть через 48 ч (фиг. 1). Этот тест показал, что когда клетки подвергли обработке умеренным температурным сдвигом, клеточная смерть не индуцировалась сама по себе. Добавление "Dbait8H", неактивной молекулы "Dbait" не изменяет клеточное выживание, тогда как добавление "Dbait32Hc" перед температурным сдвигом инициирует 30-50% смертность. Эффект сильно зависел от DNA-PK поскольку добавление NU7026 упраздняет термосенситизацию.
Гистопатологический анализ митоза и некроза опухолей
Мышиные модели с ксенотрансплантацией в бок НТ29 использовали для проведения РЧА, DT01 и объединенных обработок. В данном исследовании внутриопухолевые и подкожные инъекции DT01 проводили за 24 и 5 ч перед обработками. Для оценки эффективности острого лечения гистологические срезы больших обработанных опухолей делали через 72 ч после обработки. Окрашивание хематоксилином-эозином проводили для анализа тканевой структуры, васкуляризации, площади некроза и индекса митоза (фиг. 3 и табл. 1).
Таблица 1
Препараты, обработанные РЧА (совместно с "DT01" или без) демонстрировали в зоне обработки участки коагулятивного некроза, включая атипичные дегенеративные малые клетки с гиперхроматическим иррегулярным ядром, эозинофильной цитоплазмой, и низкой митотической скоростью (фиг. 3). Морфология этих дистрофичных клеток подтверждает механизм некробиоза по сравнению с активным, пролиферирующим компонентом. Участки, обработанные РЧА вместе с "DT01" (2 местных инъекции по 6 мг каждая), демонстрировали значимо большие участки некроза и дегеративных дистрофичных клеток по сравнению с обработкой РЧА отдельно (р=0,0008), хотя необработанные препараты демонстрировали незначительные площади спонтанного некроза, особенно в случае больших опухолей. Более того, для образцов, обработанных РЧА вместе с DT01, меньшие площади опухоли казались жизнеспособными, главным образом на периферии (р <0,05), с меньшим митотическим индексом (р <0,05). 3/8 образцов не демонстрировали жизнеспособной опухоли через 72 ч.
В заключении необходимо отметить, что, как показано на фиг. 3, образцы, обработанные РЧА с DT01, демонстрируют значимо большие площади некроза и дегенеративных клеток, меньшие площади пролиферирующих клеток и меньшее число митозов по сравнению с обработкой РЧА отдельно или DT01 отдельно.
DT01 усиливает противоопухолевый эффект РЧА и общее выживание.
Как показано на фиг. 2, обработка либо РЧА, либо "DT01" отдельно дает умеренный противоопухолевый ответ по сравнению с отсутствием обработки. Комбинированная терапия с РЧА и DT01 дает си-нергическое снижение опухолевого роста по сравнению обработкой РЧА отдельно или DT01 отдельно.
С РЧА и DT01, группа комбинированной терапии имеет повышенную выживаемость по сравнению с необработанными животными, животными, обработанными РЧА отдельно и "DT01" отдельно (фиг. 2С и таблица 1). Мыши, обработанные комбинацией 'ТЗТОГ'-РЧА имели значимо более длительное выжива
ние по сравнению с обработанными РЧА отдельно (медианное выживание: 57 против 40 дней, р <0,001), хотя РЧА отдельно улучшало выживание по сравнению с контролями (медианное выживание: 40 против
28 дней, р <0,001).
Для оценки эффективности обработок, обработки проводили на (больших) ксенотрансплантирован-ных опухолях гомогенных размеров. Местные инъекции 6 мг молекул DT01 проводили раз в день, в течение 4 последовательных дней (всего, соответственно, 24 мг). Обработки РЧА осуществляли через 5 ч после третьей инъекции DT01. На 1 и 4 дни после обработки плацебо и РЧА получали стандартизованные изображения опухолей (фиг. 2А). Здесь, было подтверждено, что DT01 отдельно индуцирует некроз опухолей по сравнению с обработкой плацебо. Обработка РЧА отдельно инициирует коагуляционный некроз, что показано черными некротическими участками. Однако, когда РЧА применяли отдельно, площадь РЧА-индуцированного поражения была ограничена и не распространялась на весь объем опухоли. С другой стороны, добавление DT01 к обработке РЧА позволяла коагуляционному некрозу распространиться на весь объем опухоли.
В заключение необходимо отметить, что как показано на фигуре 2, выживание мышей растет, когда животные получают DT01 перед РЧА.
Материалы и методы Клеточная культура
Клеточные линии MRC5 (человеческий трансформированный фибробласт, АТСС (Манассас, Вирджиния)) и НТ29 (человеческая аденокарцинома толстой кишки, АТСС (Манассас, Вирджиния)) использовали для исследований на культивируемых клетках. Клеточную линию НТ29 выращивали в полной среде DMEM ("Gibco"), обогащенной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ATGC), стрептомицином (100 мг.мл-1, "Invitrogen") и пенициллином (100 мг.мл-1, "Invitrogen"). Клетки поддерживали при 37°С в атмосфере с 5% СО2 при 100% влажности.
Молекулы "Dbait"
Все молекулы "Dbait" синтезировали способом автоматического твердофазного олигонуклеотидно-го синтеза ("Eurogentec"). Следует отметить, что для in vitro исследований использовали "Dbait32Hc", комплексированные с PEI, в то время как для преклинических исследованиях использовали холестерин-связанную форму "DT01" в из-за высокой токсичности PEI на организм.
In vitro обработка тепловым шоком и тесты с трипановым синим.
Клетки трансфецировали инкубацией с 2,5 цг "Dbait" комплексированной с 11 кДа PEI (Poly +) в 800 цл среды (в шестилуночных планшетах) в течение 5 ч. Один наномоль "Dbait32Hc" (молекулярная масса 20 153) имеет массу -20 цг. В конце трансфекции "Dbait" трансфекционные среды удаляли и заменяли полной средой DMEM, предварительно нагретой при 37°С. Сразу после осуществляли тепловой шок в "Isotemp" от "Fisher Scientific" при 43°С в течение 1 часа. Затем клетки инкубировали в нормальных условиях в течение 48 ч. Клеточную надосадочную жидкость и трипсинизированный осадок смешивали для подсчета мертвых плавающих клеток. Затем суспензию смешивали с трипановым синим для получения 0,4% раствора трипанового синего. Окрашенные клетки и общее количество клеток подсчитывали в камере Малассе. Рассчитанный процент неокрашенных клеток представляет собой процент жизнеспособных клеток.
Животная модель и обработка (опухолевого препарата)
Шестинедельных самок голых мышей NMRI получили из "Janvier" (Ле-Женест-Сент-Иль, Франция). Животных размещали в лаборатории, по меньшей мере, за 1 неделю до начала экспериментов. Содержали по 6 животных на клетку в контролируемых условиях циклов света и темноты (12 ч : 12 ч), относительной влажности (55%), и температуры (21°С). Корм и вода были доступны ad libitum. Опухоли человеческой аденокарциномы толстой кишки НТ29 индуцировали инъекцией 80 мышам подкожно 107 опухолевых клеток в правый бок.
Дизайн преклинического эксперимента
Опухоли человеческой аденокарциномы толстой кишки НТ29 ксенотрансплантировали 75 взрослым самкам голых мышей. Когда объемы опухолей достигали 200-700 мм3 (средний объем: 483+146 мм3), мышей включали в одну их групп обработки или контроля. Мышей обрабатывали РЧА отдельно, "Dbait" посредством местных инъекций отдельно, комбинацией "DT01" и РЧА, или оставляли необработанными. 31 мышь забили на 3 день для гистопатологического анализа, а 49 остальных отслеживали до забоя, когда опухоли достигли 2000 мм3. Во всех экспериментах опухоли измеряли с помощью цифрового штангенциркуля каждые 3 дня. Объемы опухолей рассчитывали с использованием следующей формулы: длина x ширина x ширина / 2. Местный комитет по этике проведения экспериментов на животных дал разрешение на все эксперименты.
Радиочастотная абляция опухолей
РЧА осуществляли с помощью генератора "Radionics Cool-tip RF" (системная радиочастота), в условиях анастезии изофураном. Зонд для РЧА, состоящий из полого электрода 15 калибра "Cosman RF" ("Cosman Medical, inc", Бурлингтон, США), вставляли в опухоль. Мощность (в ваттах) контролировали вручную до достижения целевой температуры. Температуру абляции отслеживали подкожной термопа
рой, периферически помещенной на опухоль. Периферийную температуру поддерживали между 42 и 44°С в течение 2 мин (схема неполной абляции). В сочетании с "Dbait" РЧА была исполнена на третий день обработки.
Обработка "DT01"
Ежедневную обработку DT01 осуществляли одной внутриопухолевой инъекцией (2 мг/животное) и двумя подкожными инъекциями в противоположных участках, в 55 мм от края опухоли (2 мг/на каждое животное).
Планы двух протоколов использовали для последовательной ежедневной обработки "DT01": 2 дневная обработка для гистопаталогического анализа и 4-дневная обработка для исследования по выживанию (общая доза 12 и 24 мг, соответственно). В сочетании с РЧА "DT01" вводили за 5 ч перед абляцией, на второй или третий день обработки DT01 в течение 2-дневной или 4-дневной обработки, соответственно.
Гистологический анализ
Через три дня после обработки РЧА, животных умерщвляли и вырезали опухоли. Опухоли фиксировали в формалине с нейтральным буфером, заливали в парафин. 7 мкм срезы срезали и окрашивали гематоксилином, эозином, сафраном (HES). Степень некроза (указанную повышенным размером клеток, нечеткими клеточными границами, эозенофильной цитоплазмой, утратой или конденсацией ядра, или связанным воспалением) выражается долей (%) площади поверхности среза ткани, проанализированной как некротической. Количество митотических клеток и апоптотических клеток оценивали из соответствующих ненекротических областей из ~1000 клеток, проанализированных при высоком разрешении.
Статистический анализ
Статистические анализы осуществляли с помощью программного обеспечения "StatEL" ("ad Science"). Общие кривые выживания наносили на график из оценок Каплан-Мейер и сравнивали. Непараметрический логарифмический ранговый критерий использовали для сравнений, из-за того, что данные не следовали нормальному распределению. Клеточные смерти в культуре сравнивали с помощью критерия Стьюдента.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере один свободный конец
и часть двухцепочечной ДНК размером 24-200 п.о. с меньше чем 60% идентичностью по последователь-
ности любому гену в человеческом геноме для приготовления лекарственного средства для лечения рака
в комбинации с гипертермической обработкой.
2. Применение по п.1, в котором молекула нуклеиновой кислоты имеет одну из следующих формул:
где N является деоксинуклеотидом, n является целым числом от 15 до 195, подчеркнутая N относится к нуклеотиду, имеющему или не имеющему модифицированный фосфодиэфирный каркас, L' является линкером, С является молекулой, обеспечивающей энодоцитоз, выбранной из числа липофильной молекулы или лиганда, который направлен на клеточный рецептор, обеспечивающий рецептор-опосредованный эндоцитоз, L является линкером, m и p независимо равны 0 или 1.
3. Применение по п.1 или 2, в котором молекула нуклеиновой кислоты имеет одну из следующих формул:
TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA.
(Ше)
где подчернутый нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему фосфотиоатный или метилфосфо-натный каркас, связанную L' выбирают из группы, состоящей из гексаэтиленгликоля, тетрадеокситими-дилата (Т4) и 2,19-бис(фосфор)-8-гилдаза-1-гидрокси-4-окса-9-оксононадекана; m равно 1, a L является карбоксамидоолигоэтиленгликолем, С выбирают из группы, состоящей из одно- или двухцепочечных жирных кислот, таких как октадецил и диолеил, холестерин, токоферол, фолиевая кислота, сахара, такого как галактоза и манноза, и их олигосахарида, пептида, такого как RGD и бомбезина и белка, такого как
интегрин, предпочтительно холистерина.
4. Применение по любому из пп.1-3, в котором молекула, облегчающая эндоцитоз, является холестерином.
5. Применение по любому из пп.1-4, в котором молекулу нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из
7. Применение по любому из пп.1-6, в котором гипертермическая обработка включает температуру по меньшей мере 41°С, предпочтительно по меньшей мере 42°С.
8. Применение по любому из пп.1-7, в котором гипертермическую обработку осуществляют микроволновым излучением (РЧА), ультразвуком, инфракрасными лучами, наночастицами или нанотрубками, индукционным нагревом, магнитной гипертермией, перфузией или инфузией предварительно нагретой жидкости, такой как кровь, внутрибрюшинно нагретый поток или прямое применение нагрева.
9. Применение по любому из пп.1-8, в котором рак является солидным раком, предпочтительно выбранным из саркомы, меланомы, рака головы и шеи, почки, яичника, поджелудочной железы, простаты, щитовидной железы, легкого, пищевода, молочной железы, мочевого пузыря, прямой кишки, печени, шейки матки, эндометрия и перитонеального рака, более предпочтительно рака печени и перитонеально-го рака.
10. Применение по любому из пп.1-9, где р равно 1, а молекула нуклеиновой кислоты используется в комбинации с эндосомолитическим агентом, предпочтительно хинолин эндосомолитическим агентом, более предпочтительно хлорохином или гидроксихлорохином.
11. Применение по любому из пп.1-10, где молекула нуклеиновой кислоты используется совместно с лучевой терапией и/или противоопухолевой химиотерапией.
12. Применение по п.11, где противоопухолеваия химиотерапия представляет собой обработку ДНК-повреждающим противоопухолевым агентом, либо прямо, либо опосредованно.
13. Применение по п.12, в котором ДНК-повреждающий противоопухолевый агент выбирают из группы, состоящей из ингибитора топоизомераз I или II, агента, перекрестно сшивающего ДНК, ДНК-алкилирующего агента, антиметаболического агента и ингибиторов митотического веретена.
14. Применение по любому из пп.1-10, где молекула нуклеиновой кислоты не используется совместно с лучевой терапией и/или противоопухолевой химиотерапией.
15. Применение по любому из пп.1-10, где молекула нуклеиновой кислоты не используется в комбинации с лучевой терапией и/или противоопухолевой химиотерапией с ДНК-повреждающим противоопухолевым агентом.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023793
- 1 -
023793
- 1 -
023793
- 1 -
023793
- 1 -
023793
- 4 -
023793
- 28 -