EA 023775B1 20160729

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000023775b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение формулы (I) где А означает C-R ² , где R ² представляет собой водород, фтор или хлор; R ¹ представляет собой водород, фтор, хлор, метил, этил или метокси; Z представляет собой (С ₁ -С ₄ )алкил или (С ₃ -С ₆ )циклоалкил, каждый из которых может быть замещен гидрокси, или Z представляет собой гетероциклическую группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ³ представляет собой водород или гидрокси, при условии, что, если R ³ означает гидрокси, указанный гидрокси не присоединен к кольцевому атому углерода, который расположен вблизи от кольцевого атома азота, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ⁴ представляет собой водород, метил, этил, амино или аминометил, или Z представляет собой группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ⁵ представляет собой (С ₃ -С ₆ )циклоалкил или тетрагидропиранил; R ⁶ представляет собой водород или гидрокси; R ⁷ представляет собой водород или гидрокси, при условии, что, если R ⁷ означает гидрокси, указанный гидрокси не присоединен к кольцевому атому углерода, который расположен вблизи от кольцевого атома азота; Y означает О или NH, или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат и/или сольват.

2. Соединение формулы (I) по п.1, отличающееся тем, что А означает C-R ² , где R ² представляет собой водород или фтор; R ¹ представляет собой водород, фтор, хлор, метил, этил или метокси; Z представляет собой н-пропил, н-бутил или циклогексил, каждый из которых может быть замещен гидрокси, или Z представляет собой гетероциклическую группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ⁴ представляет собой метил, этил, амино или аминометил, или Z представляет собой группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ⁵ представляет собой циклопропил или тетрагидропиран-4-ил; R ⁶ представляет собой гидрокси; Y означает О, или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат и/или сольват.

3. Соединение формулы (I) по п.1 или 2, отличающееся тем, что А означает C-R ² , где R ² представляет собой водород или фтор; R ¹ представляет собой водород, фтор, метил, этил или метокси; Z представляет собой 4-гидроксибутил или 4-гидроксициклогексил, или Z представляет собой гетероциклическую группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ⁴ представляет собой метил, этил, амино или аминометил, или Z представляет собой группу формулы где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R ⁵ представляет собой циклопропил, или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат и/или сольват.

4. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что бромпирролотриазин формулы (II) где Z имеет значение, указанное в пп.1-3, сочетается с арилбороновой кислотой или эфиром формулы (III) где А и R ¹ имеют значения, указанные в пп.1-3; R ⁸ представляет собой водород или (С ₁ -С ₄ )алкил, или оба R ⁸ остатка соединены вместе с образованием -(СН ₂ ) ₂ -, -С(СН ₃ ) ₂ -С(СН ₃ ) ₂ -, -(СН ₂ ) ₃ - или -СН ₂ -С(СН ₃ ) ₂ -СН ₂ - моста, в присутствии подходящего палладиевого катализатора и основания с получением целевого соединения формулы (I) где A, Z и R ¹ имеют значения, указанные в пп.1-3, после чего, при необходимости, следует в соответствующих случаях (i) разделение соединений формулы (I) в их соответствующие энантиомеры и/или диастереомеры и/или (ii) конверсия соединений формулы (I) в их соответствующие гидраты, сольваты, соли и/или гидраты или сольваты их солей путем обработки соответствующими растворителями и/или кислотами.

5. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что бромпирролотриазин формулы (II) где Z имеет значение, указанное в пп.1-3, сначала конвертируют в соответствующую бороновую кислоту или производное эфира формулы (IV) где Z имеет значение, указанное в пп.1-3; R ⁹ представляет собой водород или (С ₁ -С ₄ )алкил, или оба R ⁹ остатка соединены вместе с образованием -(СН ₂ ) ₂ -, -С(СН ₃ ) ₂ -С(СН ₃ ) ₂ -, -(СН ₂ ) ₃ - или -СН ₂ -С(СН ₃ ) ₂ -СН ₂ - моста, которое затем сочетается с арилбромидом формулы (V) где А и R ¹ имеют значения, указанные в пп.1-3, в присутствии подходящего палладиевого катализатора и основания также с получением целевого соединения формулы (I) где A, Z и R ¹ имеют значения, указанные в пп.1-3, после чего, при необходимости, следует в соответствующих случаях (i) разделение соединений формулы (I) в их соответствующие энантиомеры и/или диастереомеры и/или (ii) конверсия соединений формулы (I) в их соответствующие гидраты, сольваты, соли и/или гидраты или сольваты их солей путем обработки соответствующими растворителями и/или кислотами.

6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического макулярного отека.

7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для производства фармацевтической композиции для лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического макулярного отека.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью ингибиторов ALK1, содержащая соединение по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат и/или сольват, а также одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно содержащая одно или более дополнительных лекарственных средств, обладающих активностью ингибиторов VEGF-опосредованного ангиогенеза или ингибиторов других сигнальных путей.

10. Фармацевтическая композиция по п.8 или 9 для лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического макулярного отека.

11. Способ лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического макулярного отека у млекопитающих, который включает введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более соединений по любому из пп.1-3 или фармацевтической композиции по п.8 или 9.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское 023775 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201490103
(22) Дата подачи заявки
2012.06.26
(51) Int. Cl.
C07D 487/04 (2006.01) A61K31/53 (2006.01) A61P27/00 (2006.01)
(54)
ГИДРОКСИМЕТИЛАРИЛЗАМЕЩЕННЫЕ ПИРРОЛОТРИАЗИНЫ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ALK1
(31) 61/503,840; 12161547.0
(32) 2011.07.01; 2012.03.27
(33) US; EP
(43) 2014.06.30
(86) PCT/EP2012/062366
(87) WO 2013/004551 2013.01.10
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАЙЕР ИНТЕЛЛЕКТУЭЛЬ ПРОПЕРТИ ГМБХ; БАЙЕР ФАРМА АКЦИЕНГЕЗЕЛЬШАФТ (DE)
(72) Изобретатель:
Клар Юрген, Фёрингер Верена, Тельзер Ёахим, Лобель Марио, Зюссмайер Франк, Ли Фолькхарт Мин-Иан, Бёттгер Михаель, Гольц Штефан, Ланг Дитер, Шлеммер Карл-Хайнц, Шланге Томас, Шалль Андреас (DE), Фу Венланг (US)
(74) Представитель:
Беляева Е.Н. (BY)
(56) ЕР-А1-1873157
WO-A2-2007061882 WO-A1-0071129
(57) Изобретение касается новых 5-[(гидроксиметил)арил]замещеннь1х пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-аминов формулы (I), способов получения указанных соединений, фармацевтических композиций, содержащих указанные соединения, и применения указанных соединений или композиций для лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом, в частности заболеваний глаз, связанных с ангиогенезом.
Настоящее изобретение касается новых 5-[(гидроксиметил)арил]замещенных пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-аминов формулы (I), способов получения указанных соединений, фармацевтических композиций, содержащих указанные соединения, и применения указанных соединений или композиций для лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом, в частности заболеваний глаз, связанных с ангиоге-незом.
Термин "ангиогенез", также называемый "неоваскуляризация", означает процесс формирования новых кровеносных сосудов. Этот процесс является частью нормального развития, а также может происходить при многих патологических состояниях, включая, например, рак, ревматоидный артрит, заживление ран после повреждения тканей, атеросклероз, псориаз и заболевания глаза.
Различные заболевания глаз, которыми обусловлена большая часть заболеваний зрения и случаев слепоты в развитых странах, характеризуются, являются следствием и/или возникают в результате хо-риоидальной, ретинальной неоваскуляризации или неоваскуляризации радужной оболочки или рети-нального отека [Campochiaro (2004), Exp. Opin. Biol. Ther. 4: 1395-1402].
Например, диабетическая ретинопатия является основной причиной слепоты при диабете 1 типа, а также может зачастую возникать при диабете 2 типа. Еще одним глазным заболеванием, которое характеризуется неоваскуляризацией, является возрастная дегенерация макулы (ВДМ). ВДМ является наиболее частой причиной потери зрения в странах Запада у пациентов в возрасте 50 и более лет, и частота случаев потери зрения, обусловленных ВДМ, возрастает с увеличением возраста пациента. Существует два типа ВДМ: влажная (неоваскулярная) и сухая (неэкссудативная, атрофическая). Влажная форма заболевания является причиной наиболее тяжелых случаев потери зрения.
Несколько других, менее распространенных, однако, тем не менее, тяжело протекающих ретинопа-тий включают хориоидальную неоваскулярную мембрану (ХНВМ), кистозный макулярный отек (КМО, который также называется "макулярный отек"), эпиретинальная мембрана (ЭРМ, макулярная складчатость) и макулярное отверстие. При ХНВМ аномальные кровеносные сосуды, идущие от сосудистой оболочки глаза, прорастают через слой сетчатки. Хрупкие новые сосуды легко разрываются; это приводит к тому, что кровь и жидкость накапливаются в слоях сетчатки. При КМО, который может развиться в результате заболевания, травмы или после хирургического вмешательства, жидкость накапливается в слоях макулы, в результате этого центральное зрение теряет четкость и искажается. ЭРМ (макулярная складчатость) - это мембрана, похожая на целлофановую пленку, которая образуется на макуле, в результате этого центральное зрение поражается и делается неясным и искаженным.
Также сюда относятся гипертрофические и атрофические изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), отслоение сетчатки, окклюзия хориоидальной вены, окклюзия вены сетчатки, роговичный ан-гиогенез, вследствие, например, кератита, трансплантации роговицы или кератопластики, роговичный ангиогенез, обусловленный гипоксией (например, в результате длительного ношения контактных линз), птеригиум, субретинальный отек и интраретинальный отек.
Было обнаружено, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является важным модулятором ан-гиогенеза, который непосредственно связан с несколькими патологическими состояниями, включая ВДМ и диабетическую ретинопатию. Более того, в отношении ВДМ было доказано, что интравитреальная инъекция анти-VEGF препаратов (ингибиторов ангиогенеза), таких как пегаптаниб, ранибизумаб или афлиберцепт, снижает хороидальный ангиогенез и пропотевание жидкости через сосуды [Gragoudas (2004), N. Engl. J. Med. 351: 2805-2816; Rosenfeld (2006), N. Engl. J. Med. 355: 1419-1431; Dixon (2009), Expert Opin. Investig. Drugs 18: 1573-1580].
Современным стандартом терапии для ВДМ является луцентис (ранибизумаб), анти-VEGF терапия. Тем не менее, лишь у 1/3 из всех пациентов с ВДМ, получавших терапию луцентис, проявляются улучшения зрения [Rosenfeld (2006), N. Engl. J. Med. 355: 1419-1431]. Таким образом, с помощью новых возможных методов антиангиогенной терапии с VEGF-независимым механизмом действия потенциально можно улучшить современный стандарт терапии при заболеваниях глаза, таких как диабетическая ретинопатия и ВДМ.
ALK1 (активин-подобная киназа-1) - это Ser/Thr-киназный рецептор TGFp семейства рецепторов, который экспрессируется преимущественно в эндотелиальных клетках и который участвует в ангиогене-зе. Члены этого семейства медиируют свою биологическую активность путем связывания лигандов с комплексом гетеротетрамерного рецептора I типа и серин/треонин киназными рецепторами II типа TpRI и TpRII и вспомогательными рецепторами III типа. TGFp, а также высокоаффинные лиганды ВМР9 и ВМР10 способны активировать ALK1 в рецепторных комплексах с BMPRII или ActRII и рецептором III типа эндоглином [Scharpfenecker (2007), J. Cell Sci. 120: 964-972]. Связывание ВМР9 с ALK1 в эндотели-альных клетках микрососудов активирует Smad1/5/8 путь [David (2007), Blood 109(5): 1953-1961]. Предполагается, что ВМР9 подавляет миграцию и рост эндотелиальных клеток. В большинстве исследований, однако, было обнаружено, что активация ALK1 рецептора стимулирует миграцию, пролиферацию и образование трубочек эндотелиальных клеток [Goumans (2002), EMBO Journal 21(7): 1743-1753; Wu (2006), Microvasc. Res. 71: 12-19].
BMP9 и BMP10 активируют ALK1 рецепторные комплексы. В эндотелиальных клетках TGFp также
способен активизировать ALK1, в то время как в большинстве типов клеток TGFp сигнализирует через ALK5. Активация ALK5 приводит к фосфорилированию Smad2/3, в то время как активация ALK1 приводит к фосфорилированию Smad1/5. Каждый сигнальный путь Smad в конце концов приводит к регуляции специфических наборов целевых генов: сигнальный путь Smad2/3 индуцирует экспрессию PAI-1 и репрессию Id-1, в то время как сигнальный путь Smad1/5 индуцирует экспрессию Smad6, Smad7 и Id-1 и снижает экспрессию PAI-1 [Deng (2006), J. Cell Biol. 134: 1563-1571; Ota (2002), J. Cell Physiol. 193:299318].
Рецептор III типа эндоглин участвует в настройке путей ALK1 и ALK5, в особенности в эндотели-альных клетках, регулируя взаимодействия лиганд-рецептор [ten Dijke (2008), Angiogenesis 11: 79-89]. Эндоглин стимулирует взаимодействие TGFp/ALK, но снижает взаимодействие TGFp/ALK5 [David
(2007), Blood 109: 1953-1961].
Мутации в эндоглине и ALK1 связаны с аутосомно-доминантным заболеванием, называемым наследственная геморрагическая телеангиэктазия (НГТ1 и НГТ2, соответственно), которое имеет характеристики заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как артериовенозная мальформация и телеанги-эктазия [Fernandez-Lopez (2006), Clin. Med. & Res. 4: 66-78]. У RIP1-Tag2 мышей, имеющих только одну функциональную копию ALK1 гена (ALK1+-), проявляется замедленное развитие опухолей и уменьшенная плотность микрососудистой сети, по сравнению с ALK1wt мышами. Подобные наблюдения были сделаны с растворимым ALK1-Fc рецепторным конструктом RAP-041, который подавлял опухолевый ангиогенез in vivo и сдерживал опухолевый рост [Cunha (2010), J. Exp. Med. 207: 85-100].
Таким образом, изобретение сильнодействующих и селективных ALK1 ингибиторов является в высшей степени желательным для дальнейшего прояснения роли ALK1 в физиологии и патологии кровеносных сосудов и для возможных способов лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом и васку-лярным ремоделированием.
В документе WO 2007/147647-А1 описаны определенные производные 3-арил-замещенного пира-золо[1,5-а]пиримидина, что было первой публикацией, где были описаны низкомолекулярные ингибиторы ALK1 киназы. Считается, что эти соединения могут применяться для лечения заболеваний, связанных с неуправляемым ростом сосудов, в частности, для лечения солидных опухолей и метастазов солидных опухолей, а также глазных заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как возрастная дегенерация
макулы.
Различные производные пирроло[2Д-Л,[1,2,4]триазин-4-амина с выраженными профилями ингиби-рования в отношении целого ряда протеин киназ раскрыты, помимо прочего, в документах WO 00/71129-A1, WO 2005/121147-А1, WO 2007/056170-А2, WO 2007/061882-А2, WO 2007/064883-A2, WO 2007/064931-А2, WO 2007/079164-А2, WO 2008/089105-А2, WO 2009/136966-A1 и WO 2010/126960-A1. В целом считается, что эти соединения могут применяться для лечения пролиферативных заболеваний и/или заболеваний, связанных с ангиогенезом. Тем не менее, ни в одной из этих публикаций ALK1 не указана как потенциально целевая киназа.
Неожиданно было обнаружено, что производные пирроло[2Д-Л,[1,2,4]триазин-4-аминов, имеющие гидроксиметиларил заместитель в 5-положении, проявляют сильное и селективное ингибирование ALK1 киназы, что делает такие соединения особенно полезными при лечении заболеваний глаз, связанных с ангиогенезом.
где А означает C-R2, где R2 представляет собой водород, фтор или хлор; R1 представляет собой водород, фтор, хлор, метил, этил или метокси;
Z представляет собой (С1-С4)алкил или (С3-С6)циклоалкил, каждый из которых может быть замещен
гидрокси, или
Z представляет собой гетероциклическую группу формулы
Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к 5-[(гидроксиметил)арил]замещенным пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-4-аминам общей формулы (I)
R3 представляет собой водород или гидрокси,
при условии, что, если R3 означает гидрокси, указанный гидрокси не присоединен к кольцевому атому углерода, который расположен вблизи от кольцевого атома азота, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
R4 представляет собой водород, метил, этил, амино или аминометил, или
Z представляет собой группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
представляет собой (С3-С6)циклоалкилили тетрагидропиранил; R6 представляет собой водород или гидрокси; R7 представляет собой водород или гидрокси,
при условии, что, если R7 означает гидрокси, указанный гидрокси не присоединен к кольцевому атому углерода, который расположен вблизи от кольцевого атома азота; Y означает О или NH.
Соединения по настоящему изобретению также могут присутствовать в форме своих солей, сольва-тов и/или сольватов своих солей.
Соединениями по настоящему изобретению являются соединения формулы (I), a также их соли, сольваты и/или сольваты солей, соединения, включенные в формулу (I) из формул, указанных ниже по тексту настоящего документа, а также их соли, сольваты и/или сольваты солей, и соединения, включенные в формулу (I), которые указаны ниже в качестве примеров вариантов осуществления изобретения, а также их соли, сольваты и/или сольваты солей, где соединения, включенные в формулу (I) и указанные ниже по тексту настоящего документа, не являются уже солями, сольватами и/или сольватами солей.
Под термином "соли" для целей настоящего изобретения предпочтительно подразумеваются фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению (см., например, S.M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19). Также сюда входят соли, которые сами по себе не пригодны для фармацевтического использования, но которые могут использоваться, например, для выделения или очистки соединений по настоящему изобретению.
Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли минеральных кислот, карбоновых кислот и сульфоновых кислот, например, соли соляной кислоты, бромисто-водородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензол-сульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.
Сольваты в контексте настоящего изобретения определяются как такие формы соединений по настоящему изобретению, которые в твердом или жидком состоянии формируют комплекс путем стехио-метрической координации с молекулами растворителя. Гидраты являются особой формой сольватов, в которых растворителем выступает вода. Гидраты являются предпочтительными сольватами в контексте настоящего изобретения.
Соединения по настоящему изобретению могут либо в силу характера центров асимметрии, либо вследствие ограниченного вращения, присутствовать в форме изомеров (энантиомеров, диастереомеров). Может присутствовать любой изомер, в котором асимметрический центр находится в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации.
Следует понимать, что в случае, когда в соединениях по настоящему изобретению присутствуют два и более центра асимметрии, зачастую возможны несколько диастереомеров и энантиомеров с представленными в качестве примера структурами, и что чистые диастереомеры и энантиомеры представляют предпочтительные вариант осуществления изобретения. Предполагается, что чистые стереоизомеры, чистые диастереомеры и энантиомеры и их смеси также включены в объем настоящего изобретения.
Геометрические изомеры по характеру заместителей относительно двойной связи или кольца могут присутствовать в цис- (= Z-) или транс- (= Е-) форме, и обе формы изомеров также включены в объем настоящего изобретения.
Все изомеры соединений настоящего изобретения, независимо от того, отдельные ли это изомеры, чистые или частично очищенные изомеры или изомеры в виде рацемической смеси, также включены в
объем настоящего изобретения. Очистка указанных изомеров и разделение указанных смесей изомеров может производиться с использованием стандартных техник, известных специалистам. Например, диа-стереомерные смеси могут быть разделены на отдельные изомеры методами хроматографии или кристаллизации, а рацематы могут быть разделены на соответствующие энантиомеры либо методами хроматографии на хиральных фазах, либо путем расщепления.
В дополнение, настоящее изобретение включает все возможные таутомерные формы соединений, описание которых приведено выше.
Если не обусловлено иное, для заместителей и радикалов, используемых по тексту настоящего описания и формулы изобретения, применяются следующие определения.
(С1-С4)алкил представляет собой неразветвленный либо разветвленный насыщенный гидроводородный радикал с 1-4 атомами углерода. Примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил.
(С3-С6)циклоалкил представляет собой моноциклический насыщенный гидроводородный радикал с 3-6 кольцевыми атомами углерода. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, цикло-гексил.
По тексту настоящего документа, для простоты, чаще употребляют единственное число существительных, но, как правило, такое употребление включает также множественное число, если прямо не обусловлено иное. Например, подразумевается, что выражение "способ лечения заболевания пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы (I)" включает одновременно лечение более одного заболевания, а также введение более одного соединения формулы
(I).
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I), где
А означает C-R2, где R2 представляет собой водород или фтор;
R1 представляет собой водород, фтор, хлор, метил, этил или метокси;
Z представляет собой н-пропил, н-бутил или циклогексил, каждый из которых может быть замещен гидрокси, или
Z представляет собой гетероциклическую группу формулы
* * *
Н • - N '
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R4 представляет собой метил, этил, амино или аминометил, или Z представляет собой группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
представляет собой циклопропил или тетрагидрофуран-4-ил;
представляет собой гидрокси; Y означает О.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I), где
А означает C-R2, где R2 представляет собой водород или фтор;
R1 представляет собой водород, фтор, метил, этил или метокси;
Z представляет собой 4-гидроксибутил или 4-гидроксициклогексил, или
Z представляет собой гетероциклическую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
представляет собой циклопропил. В отдельном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I), где
А означает C-R2, где R2 представляет собой водород или фтор.
В еще одном отдельном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I), где
А означает C-R2, где R2 представляет собой фтор; R1 представляет собой фтор.
Определения радикалов, указанные конкретно для соответствующих комбинаций радикалов, или предпочтительные комбинации радикалов могут также по желанию заменяться определениями радикалов с другими комбинациями, вне зависимости от конкретных комбинаций, указанных для радикалов. Особенно предпочтительными являются комбинации двух или нескольких вышеупомянутых предпочтительных диапазонов.
где Z имеет значение, указанное в пп.1-3, либо
[А] сочетается с арилбороновой кислотой или эфиром формулы (III)
В еще одном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к процессу получения соединений общей формулы (I), отличающемуся тем, что бромпирролотриазин формулы (II)
где А и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3;
R8 представляет собой водород или (С1-С4)алкил, или оба R8 остатка соединены вместе с образованием -(СН2)2-, -С(СН3)2-С(СН3)2-, -(СН2)3- или -СН2-С(СН3)2-СН2- моста,
в присутствии подходящего палладиевого катализатора и основания с получением целевого соединения формулы (I)
где A, Z и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3, или [В] сначала конвертируют в соответствующую бороновую кислоту или производное эфира формулы (IV)
где Z имеет значение, указанное в пп.1-3;
R9 представляет собой водород или (С1-С4)алкил, или оба R9 остатка соединены вместе с образованием -(СН2)2-, -С(СН3)2-С(СН3)2-, -(СН2)3- или -СН2-С(СН3)2-СН2- моста, которое затем сочетается с арилбромидом формулы (V)
где А и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3, в присутствии подходящего палладиевого катализатора и основания также с получением целевого соединения формулы (I)
где A, Z и R имеют значения, указанные выше,
после чего, при необходимости, следует в соответствующих случаях (i) разделение соединений формулы (I) в их соответствующие энантиомеры и/или диастереомеры, предпочтительно, с использованием методов хроматографии, и/или (ii) конверсия соединений формулы (I) в их соответствующие гидраты, сольваты, соли и/или гидраты или сольваты их солей путем обработки соответствующими растворителями и/или кислотами.
Как указано выше, синтез соединений формулы (I) может осуществляться с использованием реакции сочетания ("реакция сочетания Судзуки") между бромпирролотриазином (II) и арилборонатом или бороновой кислотой (III). Такое сочетание, как правило, осуществляется при повышенной температуре с использованием палладиевого катализатора, основания и инертного растворителя. Обзор катализаторов и реакционных условий можно встретить в литературе [см., например, S. Kotha et al., Tetrahedron 2002, 58, 9633-9695; Т. Е. Barder et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4685-4696]. Предпочтительным катализатором при такой реакции является тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0). Предпочтительным основанием является карбонат натрия, который используют в виде водного раствора. Реакция проходит в органических растворителях, инертных при таких условиях реакции, таких как 1,4-диоксан, ацетонитрил, N,N-диметилформамид (DMF) или диметилсульфоксид (DMSO), или в воде или в смеси этих растворителей. Предпочтительно реакция проходит в смеси 1,4-диоксана и воды или ацетонитрила и воды. Реакцию, как правило, осуществляют при температуре 100-250°С, предпочтительно при 120-150°С. Нагревание предпочтительно осуществляют в одномодовом микроволновом устройстве. Такие реакции обычно проходят
в атмосфере инертного газа, предпочтительно в аргоновой атмосфере.
Иногда для реакции сочетания Судзуки обратная реакционность реагентов может являться предпочтительной. Для этих целей сначала осуществляют конверсию бромпирролотриазина (II) в соответствующий эфир бороновой кислоты (IV), а затем осуществляют перекрестное сочетание с арилбромидом (V) в соответствии с одним из методов, описанных выше. Конверсию (II) в (IV) осуществляют путем металл-опосредованного борилирования.
Предпочтительным способом является палладий-катализируемая реакция борилирования по Мияу-ра [см., например, J. Takagi et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 8001-8006; T. Ishiyama et al., J. Org. Chem. 1995, 60, 7508-7510; A.L.S. Thompson et al., Synthesis 2005, 547-550]. Процедуры, реагенты и растворители для реакции перекрестного сочетания (IV) + (V) -- (I) выбирают из указанных в предыдущем разделе.
Арилбороновые кислоты (III) [R8 = Н] и арилборонаты (III) [R8 = алкил, или оба R соединяют с образованием циклического эфира бороновой кислоты, например, пинаконового эфира] являются либо коммерчески доступными, либо они могут быть получены стандартными способами из соответствующих арилгалогенидов или арилтрифлатов с использованием реакции металл-опосредованного борилирования (см. предыдущий раздел). Борилирование и последующая реакция сочетания по Судзуки могут осуществляться на двух раздельных этапах, включающих выделение и очистку промежуточного соединения (III). Альтернативно, реакция борилирования и реакция перекрестного сочетания могут проводиться в одном реакционном сосуде с использованием (III) непосредственно без выделения и очистки.
В случаях, когда в целевом соединении формулы (I) часть Z группы формирует простейшая или вторичная аминогруппа, зачастую может быть предпочтительным при реакциях борилирования и сочетания в соответствии с определением выше использовать защищенное производное такого амина в качестве исходного пирролотриазина (II) вместо свободного аминосоединения. Для этих целей могут использоваться стандартные временные аминозащитные группы, такие как ацильные группы (например, ацетил или трифторацетил) или защитные группы карбаматного типа (например, Boc-, Cbz- или Fmoc-группа). Предпочтительно используют трифторацетил или Boc-защитная группа. Подобным образом, гидрокси-функция в сочетающихся компонентах (III) и (V), соответственно, может временно блокироваться в ходе процесса, предпочтительно, как производное силилового эфира, такого как триметилсилиловый эфир или трет-бутилдиметилсилиловый эфир.
Эти защитные группы затем могут параллельно расщепляться в ходе водной обработки сочетающихся реакционных смесей, или их удаляют на последующих этапах реакции с использованием стандартных методов, известных специалистам. Получение защищенных промежуточных соединений, описанных выше, из соответствующих свободных аминов или спиртов формул (II), (III) и (V), соответственно, или из других прекурсорных соединений (см. раздел ниже) также может легко осуществляться в соответствии с процедурами, описанными в литературе [см., например, Т.\?. Greene and P. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999].
Получение соединений по настоящему изобретению может иллюстрироваться следующей схемой синтеза.
Методологии синтеза, которые могут применяться для получения бромпирролотриазинов (II), могут структурироваться в соответствии с хемотипом Z группы, присутствующей в (II). Примеры, иллюстрирующие такие различные пути, приведены ниже (см. схемы синтеза 2-6). Более подробные описания
Схема 1
процессов приведены в экспериментальном разделе, где описаны специфические промежуточные продукты и примеры соединений по настоящему изобретению.
Например, соединения формулы (II), содержащие алкил или гидроксиалкил радикал в качестве Z группы, могут быть получены с использованием реакции сочетания между бромпирролтриазином (VI) и концевым алкином формулы (VII), как ключевой этап, (схема 2). Такой тип реакции (реакцию Соногаси-ры) обычно осуществляют в присутствии системы медно-палладиевого катализатора и основания. Несколько примеров этой реакции описаны в литературе [см., например, R. Chinchilla and С. Najera, Chem. Rev. 2007, 107, 874-922]. В настоящем изобретении предпочтительным источником меди является иодид меди (I), тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) используют в качестве палладиевого катализатора, и пирролидин выступает в качестве основания, а также растворителя. Реакцию сочетания предпочтительно осуществляют при сверхвысокочастотном излучении.
Полученный в результате алкин (VIII) затем подвергают каталитической гидрогенизации, с использованием стандартного палладиевого или платинового катализатора. Предпочтительно в качестве катализатора используют оксид платины (IV), и реакция проходит в уксусной кислоте в качестве растворителя. В некоторых случаях с использованием этой процедуры получают смесь продуктов (IX) и (X), которую, так или иначе, можно легко подвергнуть сепарации с применением методов хроматографии. Последующая реакция бромирования, предпочтительно с использованием 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоина в качестве источника бромина, в инертном растворителе, таком как THF или DMF, дает целевые пирро-лотриазины (IIa) и (IIb) соответственно.
Получение исходного соединения (7-бромпирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амин (VI)) уже было описано ранее [см. документ WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение В)].
Схема 2
[т = 0 or 1,п = 1 or 2].
Прекурсоры бромпирролотриазина типа (IIc) (схема 3) могут быть получены путем реакции метал-лирования соединения (VI) с металлом, таким как магний или литий, или путем реакции обмена галоген-металл с использованием магнийорганического или литийорганического реагента. Предпочтительным металлом является магний, который вводят в (VI) путем обработки изопропилмагний бромидом в растворителе, таком как THF или диэтиловый эфир. Затем осуществляют реакцию промежуточного метал-лорганического соединения с циклоалканоном или гетероциклоалканоном (XI) [R, R' связываются с образованием циклоалкильного или гетероциклоалкильного кольца] с получением третичного спирта
(XIIa).
При дополнительном пути получения вторичных спиртов формулы (XIIb) используют реакцию
формилирования по Вильсмейеру, когда аминопирролотриазин (XIII) трансформируется в альдегид (XIV) (схема 3). Внедрение боковой цепи осуществляется путем последующего добавления соответствующего реактива Гриньяра (XV) [R" = алкил или циклоалкил] в растворителе, таком как THF или ди-этиловый эфир. В завершение, бромирование соединений (XIIa) и (XIIb), предпочтительно с использованием 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоина, в инертном растворителе, таком как THF или DMF дает целевые пирролотриазины (IIc) и (IId) соответственно.
Получение исходного соединения (пирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амин (XIII)) уже было описано ранее [см. документ WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение А)].
Схема 3
Пирролотриазины формулы (II), где Z представляет собой незамещенный циклоалкил или углерод-связанную азагетероциклил группу, могут быть получены путем дегидратации третичного спирта формулы (XIIc) в ненасыщенный карбо- или гетероцикл формулы (XVI), с использованием стандартных агентов, таких как ангидрид трифторуксусной кислоты, ангидрид трифторметансульфоновая кислоты, оксид фосфора (V), серная кислота или другие сильные кислоты (схема 4). В результате последующей каталитической гидрогенизации с использованием стандартного катализатора, такого как палладирован-ный уголь, получают насыщенный аналог формулы (XVII). Этап гидрогенизации предпочтительно осуществляют в растворителе, таком как метанол, этанол или THF, который содержит небольшое количество водной трифторуксусной кислоты. В конечном итоге, бромирование с использованием 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоина, в соответствии с описанием выше, дает целевой пирролотриазин (IIe).
Прекурсоры спиртов (XIIc) сами по себе могут быть легко получены с применением пути синтеза, описанного на схеме 3 [ср. получение соединения (XIIa)].
[D = например, СН2 или N-Boc; п = 1 или 2].
Пирролотриазины формулы (II), где Z представляет собой 1,3-тиазол-4-ил группу, могут быть получены путем металлирования соединения (VI), в соответствии с описанием выше, за которым следует реакция с хлорацетилхлоридом с получением промежуточного соединения (XVIII), а затем конденсация с использованием тиоамида или тиомочевины (XIX) [с R4 в соответствии с описанием выше], с получениям прекурсорного соединения (XX) (схема 5). Бромирование с использованием 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоина, в соответствии с описанием выше, в конечном итоге дает целевой пирролотриазин (IIf).
Схема 5
Пирролотриазины формулы (II), где Z представляет собой N-циклическую аминометил группу, могут быть получены путем реакции пирролотриазина (XIII) с формальдегидом и циклическим амином типа (XXI) в кислом растворителе, таком как уксусная кислота, или в смеси кислоты с органическим растворителем (схема 6). Бромирование полученного продукта (XXII) с использованием 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоина, в соответствии с описанием выше, дает затем целевой пирролотриазин (IIg).
(G = например, CH2 CH(OH), О или N-Вос].
Соединения формул (V), (VII), (XI), (XV), (XIX) и (XXI) являются либо коммерчески доступными, известными из литературы или могут быть получены из имеющихся в наличии исходных материалов путем адаптирования стандартных методов, описанных в литературе.
Соединения по настоящему изобретению имеют ценные фармакологические свойства и могут использоваться для предупреждения и лечения заболеваний человека и животных.
Соединения настоящего изобретения являются сильнодействующими и селективными ингибиторами ALK1. Таким образом, они могут использоваться для лечения и/или предупреждения заболеваний, связанных с ангиогенезом, в частности, заболеваний глаз, связанных с ангиогенезом.
Для целей настоящего изобретения термин "лечение" включает приостановку течения заболевания, расстройства, патологического состояния, препятствование заболеванию, улучшение состояния больного, купирование, или ремиссию заболевания, расстройства, патологического состояния, приостановление их развития или прогрессирования, и/или уменьшение их симптомов. Термин "предупреждение" или "предупреждать" включает уменьшение риска заболевания, расстройства или патологического состояния, их развития или прогрессирования и/или их симптомов или заражения таким заболеванием. Термин "предупреждение" включает профилактику. Лечение или предупреждение заболевания, расстройства или патологического состояния могут быть полными или частичными.
Заболевания глаз, связанные с ангиогенезом, лечение и/или предупреждение которых может осуществляться с использованием соединений по настоящему изобретению включают, помимо прочего, возрастную дегенерацию макулы (ВДМ), диабетическую ретинопатию, в частности, диабетический маку-лярный отек (ДМО), другие ретинопатии, такие как хороидальная неоваскуляризация (ХНВ), хориои-дальная неоваскулярная мембрана (ХНВМ), кистозный макулярный отек (КМО), эпиретинальная мембрана (ЭРМ) и макулярное отверстие, гипертрофические изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), атрофические изменения пигментного эпителия сетчатки, отслоение сетчатки, окклюзия хориои-дальной вены, окклюзия вены сетчатки, роговичный ангиогенез, вследствие, например, кератита, трансплантации роговицы или кератопластики, роговичный ангиогенез, обусловленный гипоксией (например, в результате длительного ношения контактных линз), птеригиум, субретинальный отек и интраретиналь-ный отек.
В контексте настоящего изобретения термин возрастная дегенерация макулы (ВДМ) включает как влажную форму ВДМ (или экссудативную, неоваскулярную ВДМ), так и сухую форму ВДМ (или неэкс-судативную, атрофическую ВДМ).
Соединения по настоящему изобретению дополнительно могут использоваться для лечения и/или предупреждения воспалительных заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как ревматоидный артрит, псориаз, контактный дерматит, астма, легочная гипертензия, множественный склероз, а также воспалительных заболеваний ЖКТ, таких как болезнь Крона. Соединения по настоящему изобретению также могут использоваться для лечения и/или предупреждения фиброзирующих заболеваний, таких как фиброз или цирроз.
Благодаря своему профилю активности, соединения по настоящему изобретению особенно пригодны для лечения или предупреждения заболеваний глаз, таких как возрастная дегенерация макулы (ВДМ), хороидальная неоваскуляризация (ХНВ), диабетическая ретинопатия и диабетический макулярный отек
(ДМО).
Заболевания, указанные выше, типичны для людей, однако также существуют со схожей этиологией у других животных, включая млекопитающих, и лечение этих заболеваний может осуществляться путем введения соединений по настоящему изобретению.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению соединений по настоящему изобретению для лечения и/или предупреждения заболеваний, в частности, вышеуказанных заболеваний.
Настоящее изобретение также относится к применению соединений по настоящему изобретению для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения заболеваний, в частности, вышеуказанных заболеваний.
Настоящее изобретение также относится к применению соединений по настоящему изобретению в способе лечения и/или предупреждения заболеваний, в частности, вышеуказанных заболеваний.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или предупреждения заболеваний, в частности, вышеуказанных заболеваний, с использованием эффективного количества, по меньшей мере, одного из соединений по настоящему изобретению.
Соединения по настоящему изобретению можно применять в виде отдельного фармацевтического препарата или в сочетании с одним или более дополнительными лекарственными препаратами, при условии, что такая комбинация этих веществ не приводит к появлению негативных эффектов, делающих применение такой комбинации невозможным. Такая комбинированная терапия включает применение единичной дозированной лекарственной формы, которая содержит соединение формулы (I), в соответствии с определением выше, и одно или более дополнительных лекарственных препаратов, а также применение соединения формулы (I) и каждого дополнительного лекарственного препарата в виде отдельных дозированных лекарственных форм. Например, пациент может принимать соединение формулы (I) и лекарственный препарат одновременно в виде одной пероральной дозировочной композиции, такой как таблетка или капсула, или каждое вещество может приниматься в отдельных дозированных лекарственных формах.
При использовании отдельных дозированных лекарственных форм, соединение формулы I, а также одно или более дополнительных лекарственных препаратов могут применяться фактически в одно и то же время (т.е. параллельно) или по отдельности в разное время (т.е. последовательно).
В частности, соединения по настоящему изобретению могут применяться в виде комбинированных препаратов или в виде раздельных препаратов с ингибиторами VEGF-опосредованного ангиогенеза, такими как, например, АСТВ-1003, афлиберцепт, апатиниб, акситиниб, бевацизумаб, бевасираниб, BMS-690514, бриваниб, цедираниб, СТ-322, довитиниб, Е7080, форетиниб, КН-902, линифаниб, MGCD-265, мотесаниб, OTS-102, пазопаниб, пегаптаниб, ранибизумаб, регорафениб, рубоксистаурин, сорафениб, SU-14813, сунитиниб, телатиниб, TG-100801, тивозаниб, TSU-68, вандетаниб, варгатеф, ваталаниб и XL-184, или с ингибиторами других сигнальных путей, такими как, например, ACU-4429, дисульфирам, Е-10030, фенретинид, мекамиламин, PF-04523655, сиролимус, сонепцизумаб, тандоспирон и волоциксимаб.
Таким образом, в соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, одно из соединений по настоящему изобретению и один или более лекарственных препаратов для лечения и/или предупреждения заболеваний, в частности, вышеуказанных заболеваний.
Соединения по настоящему изобретению также могут использоваться, сами по себе или в композициях) для диагностики или при проведении исследовательских работ или в качестве аналитических стандартных образцов и для других подобных целей.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, одно из соединений по настоящему изобретению и одно или более инертных нетоксичных фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, а также к их применению для вышеуказанных целей.
Соединения по настоящему изобретению могут иметь системное и/или локальное действие. Для данных целей они могут применяться с использованием соответствующих способов введения препаратов, например, перорально, парентерально, пульмонально (ингаляция), назально, лингвально, сублин-гвально, буккально, ректально, дермально, трансдермально, конъюнктивально, субконъюнктивально, через уши, интравитреально или применяться местно.
Соединения по настоящему изобретению могут применяться в таких формах для применения, которые соответствуют этим способам введения препарата.
Для перорального введения пригодны такие формы для применения, которые функционируют в соответствии с известным уровнем техники, и при использовании которых соединения по настоящему изобретению высвобождаются быстро и/или согласно модифицированной кинетике, и которые содержат соединения по настоящему изобретению в кристаллической, некристаллической форме и/или растворенной форме, такой, например, как таблетки (с покрытием или без, например, с энтеросолюбильным покрытием или с покрытием, которое практически не растворимо, или которое растворяется с задержкой и контролирует высвобождение соединения по настоящему изобретению), быстрорастворимые во рту таблетки, или капсулы, покрытые пленочной оболочкой, лиофилизаты, покрытые пленочной оболочкой, капсулы (например, твердые или мягкие желатиновые капсулы), таблетки, покрытые сахарной оболочкой, гранулы, микросферы, порошки, эмульсии, суспензии, аэрозоли или растворы.
Парентеральное введение может осуществляться без этапа всасывания (например, внутривенное введение, внутриартериальное введение, интракардиальное введение, интраспинальное введение или
интралюмбальное введение) или может включать всасывание (например, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, чрескожное или интраперитонеальное введение). Формами, пригодными для парентерального введения, являются, помимо прочего, препараты для инъекций и инфузий в форме растворов, суспензий, эмульсий, лиофилизатов или стерильных порошков.
Формы, пригодные для других путей введения, включают, например, фармацевтические формы для ингаляций (например, порошковые ингаляторы, небулайзеры), назальные капли, растворы или спреи, таблетки или капсулы для лингвального, сублингвального или буккального применения (например, пастилки, таблетки для рассасывания), суппозитории, препараты для введения в глаз и ухо (например, капли, мази), вагинальные капсулы, водные суспензии (лосьоны, смеси для взбалтывания), липофильные суспензии, мази, кремы, молочко, пастообразные составы, пены, пылевидные порошки, и трансдермаль-ные терапевтические системы (например, пластыри).
Соединения по настоящему изобретению могут быть преобразованы в перечисленные формы для применения способом известным самим по себе путем смешивания с инертными, не токсичными, фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Эти вспомогательные вещества включают, помимо прочего, носители (например, микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, маннит), растворители (например, жидкий полиэтиленгликоль), эмульгаторы (например, додецилсульфат натрия), ПАВ (например, полоксисорбитан олеат), дисперсанты (например, поливинилпирролидон), синтетические и натуральные полимеры (например, альбумин), стабилизаторы (например, антиоксиданты, такие как, например, аскорбиновая кислота), красители, например неорганические пигменты, такие как, например, оксиды железа, и вещества, исправляющие вкус и/или запах.
В принципе было доказано, что для достижения эффективных результатов предпочтительно при парентеральном применении использовать дозы приблизительно 0,001-1 мг/кг массы тела, предпочтительно, приблизительно 0,01-0,5 мг/кг массы тела. При пероральном применении типичная доза составляет приблизительно 0,01-100 мг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно 0.01-20 мг/кг массы тела, и более предпочтительно приблизительно 0,1-10 мг/кг массы тела.
Тем не менее, фактические дозировки и режимы введения активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьироваться, чтобы получить такое количество активного ингредиента, которое будет эффективным для получения желательной реакции на терапию для определенного пациента, а также состав и способ введения, которые не были бы токсичными для пациента. Таким образом, в соответствующих случаях, необходимо регулировать дозу с отклонениями от указанных количеств, в частности, в зависимости от возраста, пола, массы тела, условий питания и общего состояния здоровья пациента, пути введения препарата, индивидуальных особенностей реакции на активный ингредиент, характера препарата, и временного интервала, в течение которого происходит применение препарата. Таким образом, в некоторых случаях может быть достаточно использования количества меньше минимального количества, указанного выше, в то время как в других случаях, максимальный предел должен быть превышен. В случае, когда препарат вводят в больших количествах, рекомендуется разделять такие большие количества на несколько отдельных доз, принимаемых в течение всего дня.
Для лечения и/или предупреждения заболеваний глаз, связанных с ангиогенезом, в соответствии с описанием выше, предпочтительным путем введения соединений по изобретению является местное введение в глаз или применение системы доставки лекарственных средств внутрь глаза. Интраокулярные инъекции - еще один способ введения соединений по настоящему изобретению, который пригоден для таких целей.
Доставка лекарственных средств внутрь глаза может осуществляться путем инъекций, с использованием катетера или иного инвазивного приспособления, предназначенного для введения точно измеренного количества требующегося препарата в определенную область или ткань в глазу (например, задняя камера глаза или сетчатка). Интраокулярные инъекции могут производиться в стекловидное тело (интравитреальное введение), под слизистую оболочку глаза (субконъюнктивально), позади глазного яблока (ретробульбарное введение), в белочную оболочку глаза, под капсулу Тенона (субтеноновое введение), и может быть в форме для замедленного всасывания. Также в пределах области настоящего изобретения предусмотрены другие способы интраокулярного введения, а также участки и формы для инъекции.
Препараты, содержащие соединения по настоящему изобретению, могут быть получены способами, известными специалистам, так, чтобы обеспечивать соответствующую доставку в область позади глаза, которая может осуществляться с использованием стандартных способов введения доз, например, с использованием глазных капель, или с использованием системы доставки для контролируемого высвобождения соединений по настоящему изобретению, например, замедленного высвобождения.
Предпочтительные препаративные формы для введения в глаз соединений по настоящему изобретению включают водные растворы, суспензии или гели для таких соединений в форме жидких капель, жидких лосьонов, спреев, мазей или гелей, в смеси со вспомогательными веществами, которые пригодны для производства и применения таких форм для применения. В качестве альтернативы, соединения по настоящему изобретению могут вводиться в глаз с использованием липосом или других систем доставки
в глаз, известных специалистам.
Соответствующие дозировки могут определяться любыми подходящими способами, известными специалистам в области офтальмологии. Предпочтительно активное вещество вводится с частотой 1-4 раза в день при местном применении или с меньшей частотой при использовании систем доставки лекарственных средств. Как правило, препарат для лечения глазных заболеваний для местного применения содержит активный фармацевтический ингредиент в концентрации в диапазоне приблизительно 0,00110%.
Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью вариантов осуществления изобретения, указанных в примерах. Настоящее изобретение не ограничивается данными примерами.
В приведенных ниже тестах и примерах, если не указано иное, процентные соотношения приведены в соотношении по массе; доли также даны по массе. Отношения для растворителей, степень разбавления и концентрации, указанные для растворов жидкость/жидкость, основаны на объемном соотношении.
А. Примеры.
Сокращения и аббревиатуры:
ацетил
aq.
водный (раствор)
Вое
трет-бутоксилкарбо ни л
br.
широкий (сигнал 'Н ЯМР)
Cbz
бензилоксикарбонил
Celite(r)
зарегистрированная торговая марка диатомовой земли Celite Corp.
cone.
концентрированный
DCI
прямая химическая ионизация (масс-спектрометрия)
DCM
дихлорметан
DMF
НН-диметилформамид
DMSO
диметилсульфоксид
e.e.
Энантиомерный избыток
ионизация электронным ударом (масс-спектрометрия)
ent
энантиомер, энантиомерно чистые
eq.
эквивалентны)
ESI
ионизация методом электрораспыления (масс-спектрометрия)
ЭТИЛ
EtOAc
этилацетат
Fmoc
(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил
GC/MS
ГХ/МС (газовая хроматография с масс-спектрометрией)
час(ы)
Hal
галоген
'HNMR
'н ЯМР (спектроскопия протонным ядерным магнитным резонансом)
HPLC ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)
LC/MS ЖХ/МС (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией)
Me метил
МеОН метанол
мин. минута (минуты)
MS масс-спектрометрия
th, от теоретического (химического выхода)
PdCbWppf) [1,1 '-бис(дифенилфосфино)ферроцен] дихлорпалладий (II)
Ph фенил
гас рацемический, рацемат
Rf ТСХ - фактор удерживания
rt комнатная температура
R, время удержания (ВЭЖХ)
satd. насыщенный
TBAF фторид тетрабутиламмония
tBu трет-бутш
tert третичный
TFA трифторуксусная кислота
TFAA ангидрид трифторуксусной кислоты
THF тетрагидрофуран
TLC тонкослойная хроматография
Методы очистки с помощью препаративной HPLC. Метод 1.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: ReproSil С18, 250 ммх
30 мм; элюент А: вода/1% аммиак, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 5,01-31 мин 95% В,
31 мин 95% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 2.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: КгопшП-100А С18, 5 мкм, 250 ммх30 мм; элюент А: вода/0,05-0,5% TFA, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-5 мин 5% В, 5,01-10 мин 10% В, 10,01-20 мин 40% В, 20,01-27 мин 50% В, 27,01-40 мин 60% В, 40,01-45 мин 90% В, 45,01-60 мин 100% В; скорость потока: 15-60 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 3.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: Grom-Sil-120 ODS-4HE, 250 ммх30 мм; элюент А: вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 3.01-35 мин 98% В, 35.01-40 мин 98% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 4.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: Grom-Sil-120 ODS-4HE, 250 ммх30 мм; элюент А: вода/0.5% аммиак, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 3.01-35 мин 98% В, 35.01-40 мин 98% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 5.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: Chromatorex C18 10 мкм, 250 ммх30 мм; элюент А: вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 5.01-31 мин 90% В, 31 мин 90% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 6.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: Chromatorex С18 10 мкм, 250 ммх30 мм; элюент А: вода/0.5% TFA, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 5.01-31 мин
90% В, 31 мин 90% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм. Метод 7.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: ReproSil С18 10 мкм, 250 ммх40 мм; элюент А: вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 5,01-31 мин 95% В, 31 мин 95% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 8.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: ReproSil С18 10 мкм, 250 ммх30 мм; элюент А: вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0-3 мин 10% В, 5,01-31 мин 95% В, 31 мин 95% В; скорость потока: 50 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 9.
Устройство: Gilson Abimed HPLC, система с двойным насосом; колонка: Waters Sunfire С18 5 мкм, 250 ммх20 мм; элюент А: вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0 мин 20% В, 15 мин 60% В, 15.01-19 мин 20% В; скорость потока: 25 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Методы аналитической ВЭЖХ, ЖХ/МС и ГХ/МС.
Метод 1 (ВЭЖХ).
Прибор: Agilent 1100 с диодно-матричным детектором; колонка: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6, 150 ммх5 мм; элюент А: 0,01% TFA в воде, растворитель В: 0,01% TFA в ацетонитриле, градиент: 0-3 мин 10% В, 4-5 мин 90% В, 5.5 мин 10% В; скорость потока: 2,0 мл/мин; температура: 30°С; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 2 (ВЭЖХ).
Прибор: HP 1100 с диодно-матричным детектором; колонка: Kromasil 100 RP-18, 60 ммх2.1 мм, 3.5 мкм; элюент А: 5 мл перхлорной кислоты (70%)/л вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0 мин 2%
В, 0.5 мин 2% В, 4.5 мин 90% В, 6.5 мин 90% В, 6.7 мин 2% В, 7.5 мин 2% В; скорость потока: 0.75
мл/мин; температура: 30°С; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 3 (ВЭЖХ).
Прибор: HP 1100 с диодно-матричным детектором; колонка: Kromasil 100 RP-18, 60 ммх2.1 мм, 3.5 мкм; элюент А: 5 мл перхлорной кислоты (70%)/л вода, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0 мин 2% В, 0.5 мин 2% В, 4.5 мин 90% В, 9 мин 90% В, 9.2 мин 2% В, 10 мин 2% В; скорость потока: 0.75 мл/мин; температура: 30°С; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 4 (ЖХ/МС).
Прибор: Micromass Platform LCZ с HPLC Agilent 1100 Series; колонка: Thermo Hypersil GOLD 3 мкм, 20 ммх4 мм; элюент А: 1 л вода + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты, элюент В: 1 л ацетонитрил + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 100% А - 0.2 мин 100% А - 2.9 мин 30% А - 3.1 мин 10% А - 5.5 мин 10% А; температура: 50°С; скорость потока: 0,8 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 5 (ЖХ/МС).
Прибор: Micromass ZQ с HPLC Waters Alliance 2795/HP 1100; колонка: Phenomenex Synergi 2.5 мкм MAX-RP 100A Mercury, 20 ммх4 мм; элюент А: 1 л вода + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты, элюент В: 1 л ацетонитрил + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А - 2.5 мин 30% А - 3.0 мин 5% А - 4.0 мин 5% А; скорость потока: 2 мл/мин; температура: 50°С; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 6 (ЖХ/МС).
Прибор: Micromass Quattro Premier с Waters UPLC Acquity; колонка: Thermo Hypersil GOLD 1.9 мкм, 50 ммх1 мм; элюент А: 1 л вода + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты, элюент В: 1 л ацетонитрил + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А - 0.1 мин 90% А - 1.5 мин 10% А - 2.2 мин 10% А; температура: 50°С; скорость потока: 0.33 мл/мин; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 7 (ЖХ/МС).
Прибор: Micromass ZQ с HPLC Waters Alliance 2795; колонка: Phenomenex Synergi 2.5 мкм MAX-RP 100А Mercury, 20 ммх 4 мм; элюент А: 1 л вода + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты, элюент В: 1 л ацето-нитрил + 0.5 мл 50% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А - 0.1 мин 90% А - 3.0 мин 5% А - 4.0 мин 5% А - 4.01 мин 90% А; скорость потока: 2 мл/мин; температура: 50°С; УФ-детекция:
210 нм.
Метод 8 (ГХ/МС).
Прибор: Micromass GCT, GC6890; колонка: Restek RTX-35, 15 мх200 мкмх0.33 мкм; постоянный поток с гелием: 0.88 мл/мин; печь: 70°С; вход: 250°С; градиент: 70°С, 30°С/мин - 310°С (выдерживать 3 мин).
Метод 9 (ВЭЖХ).
Прибор: Agilent 1100 с диодно-матричным детектором; колонка: Merck Chromolith Speed ROD, 150 ммх 5 мм; элюент А: 0.01% муравьиной кислоты в воде, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0 мин 5% В, 2.5 мин 95% В, 3 мин 95% В; скорость потока: 5.0 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 210 нм.
Метод 10 (ЖХ/МС).
Прибор: Waters Acquity SQD UPLC System; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мкм, 50 ммх
1 мм; элюент A: 1 л вода + 0.25 мл 99% муравьиной кислоты, элюент В: 1 л ацетонитрил + 0.25 мл 99% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А - 1.2 мин 5% А - 2.0 мин 5% А; температура: 50°С; скорость потока: 0,40 мл/мин; УФ-детекция: 208-400 нм. Общий синтетический метод 1.
Реакция сочетания Судзуки с производными 5-бромпирроло[2,1-г][1,2,4]триазина с арилбороновой кислотой или эфирами:
5-Бромпирроло[2,1-1Г1[1,2,4]триазин А (около 0,5 ммоль), арилбороновую кислоту В (1,2 экв.) или соответствующий бороновый эфир, например диметиловый эфир бороновой кислоты или пинаконовый эфир бороновой кислоты, и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (0,1 экв.) растворили в смеси 1,4-диоксана (около 4,0 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (1,5 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 140°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения реакционную смесь фильтровали через целит, который промыли 1,4-диоксаном для того, чтобы вымыть весь органический материал. Комбинированный фильтрат выпаривают до высушивания при пониженном давлении, а осадок очищают путем препаративной HPLC с получением целевого соединения С.
Общий синтетический метод 2.
Борилирование арилбромидов и последующая реакция сочетания Судзуки с производными 5-бромпирроло[2,1-г][1,2,4]триазина без выделения промежуточных соединений арилбороновой кислоты или эфира:
Арилбромид D (приблизительно 0,5 ммоль) растворили в DMF (3 мл) в микроволновом реакционном сосуде, через раствор барботировали аргон в течение 5 мин, и добавили комплекс [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(11)-дихлорметана (0,1 экв.), ацетат калия (3 экв.) и бис-(пинаколато)диборон (1,2 экв.). Сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 130°С в течение 60 мин в одномодовом микроволновом устройстве. Затем суспензию профильтровали, фильтрат перенесли в микроволновую виалу для процесса и добавили тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (0,1 экв.), 2 M водного раствора карбоната натрия (4 экв.) и 5-бромпирроло[2,1-л^[1,2,4]триазин А (1 экв.). Виалу закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 140°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. Полученную таким образом неочищенную реакционную смесь вводят непосредственно на колонку для препаративной HPLC для сепарации и очистки целевого соединения С.
(4-Бром-2,6-дифторфенил)метанол (1,03 г, 4,62 ммоль) растворили в сухом 1,4-диоксане (10 мл). Через раствор барботировали аргон, затем добавили комплекс [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий-дихлорметан (302 мг, 0,37 ммоль, 0,08 экв.), безводный ацетат калия (907 мг, 9,24 ммоль, 2 экв.) и бис-(пинаколато)диборон (1,23 г, 4,85 ммоль, 1,05 экв.) и смесь нагревали до 130°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а растворитель удалили при пониженном давлении. К осадку добавили циклогек-сан (200 мл) и смесь активно перемешивали в течение 30 мин. Нерастворившийся материал затем удалили путем фильтрации, циклогексан отогнали и осадок очистили путем флэш-хроматографии над силика-гелем (дихлорметан/ацетонитрил градиентный). Фракции, содержащие продукт, комбинировали и выпаривали. Главное соединение было получено путем кристаллизации в виде твердого вещества буроватого цвета. Выход: 790 мг (63% от теор.).
GC-MS (метод 8): R = 5.36 мин; MS (EI): m/z (%) = 270.3 (15) [М]+.
Промежуточное соединение 2А.
[3,5-Дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]бороновая кислота
[4-({[трет-Бутил(диметил)силил]окси}метил)-3,5-дифторфенил]бороновую кислоту (19,3 г, 63,9 ммоль; неочищенный материал, полученный с использованием метода, описанного в работе Hattori, Bio-org. Med. Chem. 2006, 14, 3258-3262) растворили в 400 мл водной уксусной кислоты (66%) и перемешивали при 40°С в течение 5 ч. Затем раствор выпарили при пониженном давлении и осадок очистили с помощью флэш-хроматографии над силикагелем (градиентное элюирование, 0-2%, метанол в дихлорме-тане) с получением 3,46 г (25% от теор., LC-MS чистота 87%) главного соединения.
LC-MS (метод 7): R = 0.50 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 171.2 (100) [М-ОН]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 187.3 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 3А.
(4-Бром-2-хлорфенил)метанол
Главное соединение было получено в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2004/074270-А2 [пример А(147), этап 1].
1Н ЯМР (400 MHz, CDCl3): 5 (ppm) = 2.00 (br, 1H), 4.74 (s, 2H), 7.38 (d, 1H), 7.43 (dd, 1H), 7.53 (d,
1H).
Промежуточное соединение 4А. (4-Бром-2-метилфенил)метанол
Главное соединение было получено в соответствии с процессом, описанным в документе ЕР
1544208-А1 (справочный пример 14).
1Н ЯМР (400 MHz, CDCl3): 5 (ppm) = 1.62 (t, 3Н), 2.32 (s, 3Н), 4.64 (d, 2H), 7.23 (d, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.33 (d, 1H).
Промежуточное соединение 5А.
(5-Бромпиридин-2-ил)метанол
Метил 5-бромпиридин-2-карбоксилат (2,00 г, 9,27 ммоль) растворили в этаноле (20,0 мл). При 0°С добавили борогидрид натрия (1,05 г, 27,8 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем смесь сконцентрировали при пониженном давлении, охладили 1н. соляной кислоты, нейтрализовали твердым карбонатом калия и экстрагировали дихлорметаном. Органический слой высушили над сульфатом магния и выпарили с получением 1,57 г (90% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 6): Rt = 0.56 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 188.0 (100) [М+Н]+.
Промежуточное соединение 6А.
[6-(Гидроксиметил)пиридин-3 -ил] бороновал кислота
К раствору промежуточного соединения 5А (1,50 г, 7,98 ммоль) и бис-(пинаколато)диборона (2,23 г, 8,28 ммоль) в дегазированном DMF (120 мл) добавили в аргоновой атмосфере 1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладий(П) хлорид (292 мг, 0,40 ммоль) и ацетат калия (2,35 г, 23,9 ммоль). Смесь нагревали до 80°С в течение 18 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Суспензию фильтровали, а остаток промыли диоксаном. Комбинированные фильтраты сконцентрировали при пониженном давлении, и маслянистый осадок поместили в 50 мл этилацетата 50 мл циклогексана, а затем оставили при комнатной температуре в течение ночи. Полученный в результате осадок собрали путем фильтрации и удалили. Фильтрат выпарили, осадок снова растворили в 100 мл этилацетата и экстрагировали дважды с 50 мл воды. Водный слой сконцентрировали с получением 690 мг (56% от теор.) главного соединения, которое использовалось без дальнейшей очистки.
LC-MS (метод 6): Rt = 0.18 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 154.0 (100) [М+Н]+.
Промежуточное соединение 7А.
3 -(4-Аминопиррол[2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)проп-2-ин-1 -ол
Исходный материал 7-бромпирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амин получали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение В).
7-Бромпирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амин (1,0 г, 4,69 ммоль), иодид меди (I) (89 мг, 0,47 ммоль, 0,1 экв.) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (542 мг, 0,47 ммоль, 0.1 экв.) поместили в микроволновый реакционный сосуд и вакуумировали в течение 1 ч. Затем сосуд продули аргоном, добавили пир-ролидин (15 мл) и 2-пропин-1-ол (2,63 г, 47 ммоль, 10 экв.), и реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой, и нагревали до 85°С в течение 120 мин в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения в реакционную смесь добавили 120 мл концентрированного водного раствора хлорида аммония, который экстрагировали дважды этилацетатом. Комбинированные органические слои высушили над безводным сульфатом натрия и выпарили и осадок очистили путем флэш-хроматографии (силикагелевая колонка Biotage, этилацетат). С помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (метод 6) определили чистоту полученного продукта (222 мг), который использовали для дальнейших трансфор
маций.
HPLC (метод 2): Rt = 2.59 мин;
LC-MS (метод 6): Rt = 0.28 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 189.2 (100) [М+Н]+. Промежуточное соединение 8А и промежуточное соединение 9А. 3-(4-Аминопиррол [2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил)пропан-1-ол и 7-пропилпирроло [2,1-f] [ 1,2,4]триазин-4-амин
Промежуточное соединение 7А (444 мг, 2,36 ммоль) растворили в уксусной кислоте (18 мл) в аргоновой атмосфере. Добавили оксид платины (IV) (40 мг, 0,18 ммоль, 0,08 экв.) и смесь активно перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч в атмосфере водорода при давлении окружающей среды. Затем катализатор удалили фильтрацией, растворитель отогнали, и осадок подвергли флэш-хроматографии (силикагелевая колонка Biotage, циклогексан/этилацетат градиентный). В двух различных хроматографических фракциях были получены промежуточные соединения 8А (185 мг, 41% от теор.) и 9А (170 мг, 41% от теор.).
Промежуточное соединение 8А: HPLC (метод 2): Rt = 2.68 мин;
LC-MS (метод 4): R = 0.83 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 193.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
191.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.80 (m, 2H), 2.86 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 3.45 (m, 2H), 4.49 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.50 (br. s, 2H), 7.78 (s, 1H). Промежуточное соединение 9А: HPLC (метод 1): Rt = 3.22 мин;
LC-MS (метод 4): R = 1.23 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 177.1 (100) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
175.2 (30) [M-H]-. Промежуточное соединение 10А.
3 -(4-Амино-5 -бромпиррол[2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)пропан-1 -ол
Промежуточное соединение 8А (105 мг, 0,55 ммоль) растворили в THF (8,75 мл) и охладили до -20°С. Добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (78,1 мг, 0,5 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре -20°С в течение 1 ч. Реакцию затем охладили 0,5 мл концентрированного водного раствора дитионита натрия, нагрели до комнатной температуры и разделили между этилацетатом и водой. Органическую фазу высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали. Выход: 145 мг (98% от теор.).
HPLC (метод 1): R = 2.96 мин; HPLC (метод 2): R = 2.95 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.03 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 271.0 (100) и 273.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 269.0 (99) и 271.0 (100) [M-H]-.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.75 (m, 2H), 2.83 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.43 (m, 2H), 4.50 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.62 (s, 1H), 7.81 (s, 1H).
Промежуточное соединение 11А.
5-Бром-7-1фопилпиррол[2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-4-амин
Промежуточное соединение 9А (110 мг, 0,62 ммоль) растворили в THF (4,44 мл) и охладили до -20°С. Добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (89 мг, 0,5 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре -20°С в течение 1 ч. Реакцию затем охладили 0,5 мл концентрированного водного раствора дитионита натрия, нагрели до комнатной температуры и разделили между этилацетатом и водой. Органическую фазу высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали. Выход: 154 мг (85%, чистый, 82% от теор.).
HPLC (метод 1): R = 3.78 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.55 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 255.0 (99) и 257.2 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.91 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 1.65 (m, 2H), 2.79 (t, J = 7.6 Hz, 2H),
7-Бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-амин (1,0 г, 4,69 ммоль), иодид меди (I) (89 мг, 0,47 ммоль, 0,1 экв.) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (542 мг, 0,47 ммоль, 0.1 экв.) поместили в микроволновый реакционный сосуд и вакуумировали в течение 1 ч. Затем сосуд продули аргоном, добавили пир-ролидин (15 мл) и 3-бутин-1-ол (3,36 г, 47 ммоль, 10 экв.), реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и нагревали до 85°С в течение 120 мин в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения в реакционную смесь добавили 120 мл концентрированного водного раствора хлорида аммония и экстрагировали дважды этилацетатом. Комбинированные органические слои высушили над безводным сульфатом натрия и выпарили и осадок очистили путем флэш-хроматографии (силикагелевая колонка Biotage, этилацетат). Полученный продукт (735 мг) имел чистоту (66% (HPLC)) достаточную для дальнейших трансформаций.
HPLC (метод 2): Rt = 2.77 мин;
LC-MS (метод 4): R = 0.96 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 203.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 201.1 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 13А.
4-(4-Аминопирроло [2,1-f] [1,2,4]триазин-7-ил)бутан-1 -ол
Промежуточное соединение 12А (607 мг, 3,00 ммоль) растворили в уксусной кислоте (64 мл) и добавили оксид платины (IV) (50 мг, 0,22 ммоль, 0,07 экв.) Смесь перемешивали в течение 15 ч в атмосфере водорода при давлении окружающей среды. Затем катализатор удалили фильтрацией, фильтрат выпарили при пониженном давлении, осадок очистили путем флэш-хроматографии (силикагелевая колонка Bio-tage, этилацетат). Выход: 350 мг (57% от теор.).
HPLC (метод 2): Rt = 2.92 мин;
LC-MS (метод 4): R = 0.94 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 207.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 205.3 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 14А.
4-(4-Амино-5 -бромпирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)бутан-1 -ол
Промежуточное соединение 13А (330 мг, 1,60 ммоль) растворили в THF (26 мл) при -20°С и добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (229 мг, 0,80 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охладили концентрированным водным раствором сульфита натрия (0,5 мл). Добавили этилацетат, водный слой отделили и органический слой высушили над сульфатом натрия и испарили. Для получения 175 мг (84% от теор.) главного соединения неочищенный продукт затем очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2).
HPLC (метод 1): R = 3.13 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.23 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 285.0 (98) и 287.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 283.0 (100) и 285.0 (98) [M-H]-.
^-ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.39-1.48 (m, 2H), 1.60-1.69 (m, 2H), 3.31 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.40 (m, 2H), 4.46 (br. s, 1H), 6.61 (s, 1H), 7.82 (s, 1H).
Исходный материал пирроло[2Д-Е][1,2,4]триазин-4-амин синтезировали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение А).
Пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-амин (20,5 г, 152 ммоль) растворили в 150 мл DMF. При ледяном охлаждении по каплям добавили хлористый фосфор ил (31,3 мл, 336 ммоль) в таком объеме, что внутренняя температура не превысила 30°С. Затем смесь нагревали в течение 2 дней при 50°С. После охлаждения добавили вторую порцию хлористого фосфорила (14,2 мл, 152 ммоль), и перемешивание продолжали еще в течение 24 ч при 50°С. После охлаждения реакционную смесь медленно налили в смесь 2,0 л насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 2,0 л этилацетата. Добавили твердый бикарбонат натрия до прекращения газовыделения. Слои разделили, водный слой экстрагировали с помощью 0,5 л этилацетата, смешанные органические фазы высушили над натрия сульфатом, профильтровали и сконцентрировали. Осадок суспендировали в 100 мл диизопропилового эфира, перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем профильтровали. Высушенный осадок перемешивали в 6н. соляной кислоты (500 мл) в течение 1 ч при 50°С, а затем вылили в смесь лед/вода (1000 мл). Смесь тщательно нейтрализовали твердым бикарбонатом натрия, перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем снова профильтровали. Осадок промыли водой и лигроином с получением 20,6 г (83% от теор.) кристаллов белого цвета, которые использовали на следующем этапе без дальнейшей очистки.
Промежуточное соединение 16А.
4-Амино-5-бромпирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-карбальдегид
Промежуточное соединение 15а (20,6 г, 127 ммоль) растворили в 525 мл DMF. При 0°С добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (21,8 г, 76,2 ммоль), и смесь перемешивали в течение 1 ч при ледяном охлаждении и в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученную в результате суспензию фильтровали, а остаток промыли DMF и диэтиловым эфиром. Фильтрат удалили, а оставшиеся труднорастворимые кристаллы высушили с получением 20,0 г (65% от теор., чистота 80% путем HPLC) главного соединения. Этот материал использовали без дальнейшей очистки.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 7.42 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 10.22 (s, 1H).
Промежуточное соединение 17А.
(4-Амино-5-бромпирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)(циклопропил)метано л
Промежуточное соединение 16А (500 мг, 1,66 ммоль) суспендировали в сухом THF (30 мл). При 0°С добавили 0,5 М раствора циклопропилмагнийбромида в диэтиловом эфире (10 мл, 5,0 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавили еще одну порцию раствора Гриньяра (6,6 мл, 3,3 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре реакционную смесь охлаждали насыщенным водным раствором хлорида аммония и экстрагировали этилаце-татом (2x20 мл). Комбинированные органические слои промыли соляным раствором, высушили над сульфатом магния и сконцентрировали. Осадок очистили препаративной HPLC (метод 4). Выход: 0,14 г
(29% от теор.).
LC-MS (метод 6): R = 0.75 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 283.0 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.35 (m, 3H), 0.45 (m, 1H), 1.28 (m, 1H), 4.62 (t, 1H), 5.26 (d, 1H), 6.75 (s, 1H), 7.84 (s, 1H).
В трехгорлой колбе, объемом 50 мл, оборудованной конденсатором, термометром и капельной воронкой, продутой аргоном, получали реактив Гриньяра с использованием магниевой стружки (484 мг, 19,9 ммоль) и 4-хлортетрагидропирана (2,4 г, 19,9 ммоль) в сухом THF (14 мл). К этому раствору при 0°С добавили суспензию Промежуточного соединения 16А (1,2 г, 3,98 ммоль) в THF (20 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем ее охлаждали насыщенным водным раствором хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (2x50 мл). Органический слой промыли соляным раствором, высушили над сульфатом магния и сконцентрировали. Осадок очистили препаративной HPLC (метод 3). Выход: 0,5 г (38% от теор.).
LC-MS (метод 6): R = 0.66 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 327.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 325.1 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 19А.
8-(4-Аминопирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-7-ил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ол
Исходный материал 7-бромпирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амин получали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение В).
7-Бромпирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амин (9,20 г, 35,41 ммоль) растворили в THF (105 мл) в аргоновой атмосфере при комнатной температуре. Добавили хлортриметилсилан (9,08 мл, 7,77 ммоль, 2 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем ее охладили до 0°С и добавили 2-пропил хлорида магния (74 мл раствора 2,0 М в THF, 149 ммоль, 4,2 экв.). Смесь перемешивали в течение еще 3 ч при нагревании при комнатной температуре. Затем добавили 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-он (8,38 г, 53,12 ммоль, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали еще в течение 16 ч. Реакцию охладили смесью концентрированного водного раствора хлорида аммония и льда (1:1) до тех пор, пока значение рН не достигло 6-7. Смесь экстрагировали двумя порциями этилацетата и комбинированные органические экстракты высушили над безводным сульфатом натрия и сконцентрировали до высушивания. Главное соединение было получено путем кристаллизации из диэтилового эфира. Выход: 6,05 г (58% от теор.).
HPLC (метод 1): Rt = 2.89 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.38 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 291.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 289.4 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 20А.
Промежуточное соединение 19А (2,81 г, чистота 60%, 5,82 ммоль) растворили в пиридине (18 мл) при 0°С. Медленно добавили трифторуксусный ангидрид (2,46 мл, 3,66 г, 17,45 ммоль, 3 экв.) и реакци-
7-(1,4-Диоксаспиро[4.5]дек-7-ен-8-ил)пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-4-амин
онную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 16 ч. Растворитель отогнали и осадок разделили между водой и этилацетатом. Органический экстракт высушили над сульфатом натрия и испарили. Осадок измельчили в порошок с диэтиловым эфиром при 0°С с получением 2,95 г (чистота 92% путем HPLC, 99% от теор.) главного соединения. HPLC (метод 1): Rt = 4.55 мин;
LC-MS (метод 5): R = 2.28 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 369.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 367.1 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 21А.
7-( 1,4-Диоксаспиро [4.5] дек-8-ил)пирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-4-амин
Промежуточное соединение 20А (2,95 г, 10,8 ммоль) растворили в метаноле (1,07 мл) в аргоновой атмосфере. Добавили палладированный уголь (10%, 400 мг) и смесь активно перемешивали в течение 24 ч в атмосфере водорода при давлении окружающей среды и при комнатной температуре. Катализатор удалили путем фильтрации, а растворитель отогнали при пониженном давлении с получением 2,11 г (71% от теор.) главного соединения.
HPLC (метод 1): Rt = 3.14 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.68 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 275.3 (100) [М+Н]+. Промежуточное соединение 22А.
4-(4-Аминопирроло [2,1-fJ [1,2,4]триазин-7-ил)циклогексанон
Промежуточное соединение 21А (2,11 г, 7,69 ммоль) растворили в смеси 1 М соляной кислоты (23 мл) и метанола (6,80 мл) при 0°С и перемешивали при ледяном охлаждении в течение 3 ч. Затем отрегулировали значение рН до 6-7 путем добавления концентрированного водного раствора бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали тремя порциями дихлорметана и комбинированные органические экстракты высушили над безводным сульфатом натрия, профильтровали и выпарили. Осадок (923 мг, 52% от теор.) использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
HPLC (метод 2): Rt = 3.06 мин;
LC-MS (метод 4): R = 1.02 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 231.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 229.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.86 (ddd, 2H), 2.25-2.36 (m, 4H), 2.59 (ddd, 2H), 3.59 (m, 1H), 6.45 (d, 1H), 6.82 (d, 1H), 7.60 (br. s, 1H), 7.82 (s, 1H). Промежуточное соединение 23А.
Транс-4-(4-аминопирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)циклогексанол
Промежуточное соединение 22А (452 мг, 1,96 ммоль) растворили в THF (15 мл), и раствор охладили до 0°С. По каплям добавили раствор алюмогидрида лития (1 М в THF, 2,94 мл, 2,94 ммоль). Затем раствор перемешивали при 0°С в течение 10 мин, а потом охладили путем добавления концентрирован
ного водного раствора хлорида аммония. Смесь экстрагировали тремя порциями дихлорметана и комбинированные органические экстракты высушили над безводным сульфатом натрия, профильтровали и выпарили. Осадок (360 мг, чистота 77%, 61% от теор.) использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
HPLC (метод 1): Rt = 2.62 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.29 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 233.2 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.30 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.99 (m, 2H), 2.97 (tt, 1H), 3.45 (m, 1H), 4.60 (d, 1H), 6.39 (d, 1H), 6.79 (d, 1H), 7.53 (br. s, 2H), 7.80 (s, 1H). Промежуточное соединение 24А.
Транс-4-(4-амино-5-бромпирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)циклогексанол
Промежуточное соединение 23А (360 мг, чистота 85%, 1,19 ммоль) растворили в THF (8 мл) при -20°С и добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (188 мг, 0,66 ммоль, 0,55 экв.). Смесь перемешивали при -20°С в течение 1 ч, затем добавили 0,5 мл концентрированного водного раствора дитионита натрия, и смесь экстрагировали с использованием этилацетата. Органический экстракт высушили над безводным сульфатом натрия, профильтровали и испарили. Неочищенный продукт (463 мг, чистота 66%, 83% от теор.) использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
HPLC (метод 1): Rt = 3.22 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.03 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 311.2 и 313.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 309.2 (50) и 311.2 (40) [M-H]-. Промежуточное соединение 25А.
трет-Бутил 3 -(4-аминопирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)-3 -гидроксипиперидин-1 -карбоксилат
Исходный материал 7-бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-амин получали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение В).
7-Бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-амин (17,29 г, 81 ммоль) растворили в THF (214 мл) в аргоновой атмосфере при комнатной температуре. Добавили хлортриметилсилан (20,60 мл, 17,63 г, 162 ммоль, 2 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем ее охладили до 0°С и добавили 2-пропил хлорид магния (170 мл раствора 2,0 М в THF, 340 ммоль, 4,2 экв.). Смесь перемешивали в течение еще 3 ч при нагревании при комнатной температуре. Затем добавили трет-бутил 3-оксопиперидин-1-карбоксилат (25,00 г, 121 ммоль, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали еще в течение 16 ч. Реакцию охладили смесью концентрированного водного раствора хлорида аммония и льда (1:1) до тех пор, пока значение рН не достигло 6-7. Смесь экстрагировали двумя порциями этилацетата, и комбинированные органические экстракты высушили над безводным сульфатом натрия и сконцентрировали до высушивания. Главное соединение было получено путем кристаллизации после измельчения осадка до порошкообразного состояния с использованием диэтилового эфира (50 мл). Кристаллы промыли диэти-ловым эфиром и высушили с получением 17,20 г (64% от теор.).
HPLC (метод 2): R = 3.53 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.36 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 334.1 (100) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 332.0 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.19-1.43 (m, 9H), 1.72-1.88 (m, 2H), 2.38-2.46 (m, 1H), 3.023.20 (m, 1H), 3.44-3.96 (m, 4H), 6.58 (d, 1H), 6.81 (d, 1H), 7.82 (s, 1H).
Промежуточное соединение 26А.
rac-трет-Бутил 3 -(4-амино-5-бромпирроло [2,1-f] [ 1,2,4]триазин-7-ил)-3 -гидроксипиперидин-1 -
карбоксилат
Промежуточное соединение 25А (120 мг, 0,36 ммоль) растворили в THF (6.0 мл) при -20°С и добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (51 мг, 0,18 ммоль, 0,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 2 ч, а затем охладили концентрированным водным раствором сульфита натрия (0,5 мл). Добавили этилацетат, водный слой отделили и органический экстракт высушили над сульфатом натрия и испарили. Было получено главное соединение (148 г, 95% от теор.) в виде светло-желтого твердого вещества.
HPLC (метод 1): Rt = 4.03 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.99 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 412.0 (90) и 414.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 410.0 (100) и 412.0 (85) [M-H]-. Промежуточное соединение 27А.
трет-Бутил 5-{4-[(трифторацетил)амино]пирроло[2,1-л^[1,2,4]триазин-7-ил}-3,6-дигидропиперидин-1 (2Н)-карбоксилат
Промежуточное соединение 25А (8,32 г, 24,95 ммоль) растворили в пиридине (116 мл) при 0°С. Медленно добавили трифторуксусный ангидрид (8,81 мл, 13,10 г, 62,36 ммоль, 2,5 экв.) и реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 16 ч. Затем ее снова охладили до 0°С и добавили 150 мл диэтилового эфира. Смесь перемешивали при 0°С, в то время как главное соединение медленно выпало в осадок. В завершение продукт профильтровали и промыли диэтиловым эфиром. Фильтрат выпарили под вакуумом и осадок измельчили в порошок с диэтиловым эфиром при 0°С с получением второго сбора главного соединения после промывания диэтиловым эфиром. Оба сбора смешали с получением 7,80 г (чистота 92% путем HPLC, 76% от теор.) главного соединения в виде кристаллов желтого цвета.
HPLC (метод 1): R = 3.91 мин;
LC-MS (метод 7): R = 2.45 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 412.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 410.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.48 (s, 9H), 1.92 (m, 2H), 3.58 (m, 2H), 6.90 (d, 1H), 7.30 (d, 1H), 8.03-8.10 (m, 1H), 8.42 (s, 1H).
Промежуточное соединение 27А (7,80 г, чистота 92%, 17,54 ммоль) растворили в метаноле (400 мл). Добавили трифторукусную кислоту(6,76 мл, 10,0 г, 88 ммоль, 5 экв.), воду (3,16 мл, 175 ммоль, 10 экв.) и 10% палладированного угля (30 мг) и смесь гидрогенизировали в течение 24 ч при комнатной температуре и при давлении окружающей среды. Катализатор удалили фильтрацией, а растворитель выпарили под вакуумом. Неочищенный продукт (8,79 г, чистота 75%, количественный выход) использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
HPLC (метод 1): Rt = 3.64 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.26 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 318.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 316.4 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 29A.
7-[(ЗК)-пиперидин-3 -ил]пирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-4-амин трифторацетат
Исходный материал бензил (R)-3-(4-амино-5-бромпирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-7-ил)пиперидин-1-карбоксилата описано в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение DDD). 1,50 г, 3,49 ммоль этого материала гидрогенизировали в течение 16 ч при комнатной температуре и при давлении окружающей среды в присутствии 10% палладированного угля (30 мг) в смеси метанола (50 мл) и триф-торуксусной кислоты (2,70 мл). Затем, катализатор удалили путем фильтрации, а все летучие вещества выпарили под вакуумом с получением 1,10 г (95% от теор.) главного соединения.
HPLC (метод 2): Rt = 2.17 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.17 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 218 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.75 (m, 2H), 1.92 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 2.93 (m, 1H), 3.06 (m, 1H), 3.31 (d, 1H), 3.50 (d, 1H), 3.57 (m, 1H), 6.78 (d, 1H), 7.20 (m, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.63 (m, 1H), 8.82 (m, 1H), 9.02 (br. s, 1H).
Промежуточное соединение 30А.
трет-Бутил (3R)-3 -(4-аминопирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)пиперидин-1 -карбоксилат
Промежуточное соединение 29А (1,10 г, 5,06 ммоль) суспендировали в дихлорметане (6,60 мл), добавили триэтиламин (1,55 мл, 1,13 г, 11,14 ммоль, 2,20 экв.) и смесь перемешивали в течение 30 мин до полного растворения исходного материала. Затем добавили ди-трет-бутил дикарбонат (1,22 г, 5,57 ммоль, 1,1 экв.) и реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч. Затем, добавили 5% водной лимонной кислоты, фазы разделили, и органический слой высушили над сульфатом натрия и выпарили. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 595 мг (37% от теор.).
HPLC (метод 2): R = 4.01 мин;
LC-MS (метод 5): Rt = 1.54 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 318.1 (100) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 316.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.38 (s, 9H), 1.45 (m, 2H), 1.72 (m, 2H), 2.02 (m, 2H), 2.90 (m, 1H), 3.17 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 4.08 (m, 1H), 6.47 (d, 1H), 6.80 (d, 1H), 7.58 (br. s, 1H), 7.81 (s, 1H). Промежуточное соединение 31А.
гас -трет -Бутил 3 -(4-амино-5-бромпирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)пиперидин-1 -карбоксилат
Промежуточное соединение 28А (8,28 г, чистота 75%, 14,39 ммоль) растворили в THF (222 мл) при -20°С и добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (2,06 г, 7,19 ммоль, 0,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 2 ч, а затем охладили концентрированным водным раствором сульфита натрия (0,5 мл). Добавили этилацетат, водный слой отделили и органический экстракт высушили над сульфатом натрия и испарили. Было получено главное соединение (6,30 г, 86% от теор.) в виде светло-желтого твердого вещества.
LC-MS (метод 5): R = 2.27 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 396.0 (80) и 397.9 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 394.0 (90) и 396.0 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.35 (s, 9H), 1.40-1.44 (m, 2H), 1.71 (m, 1H), 1.98 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 6.67 (s, 1H), 7.86 (s, 1H).
Промежуточное соединение 32А.
трет-Бутил (ЗК)-3-(4-амино-5-бромпирроло[2,1-fJ [1,2,4]триазин-7-ил)пиперидин-1-карбоксилат
Главное соединение было получено способом, аналогичным способу получения рацемической смеси (промежуточное соединение 31А), с использованием промежуточного соединения в качестве исходного соединения 30А. Данные анализа были идентичны данным, приведенным для промежуточного соединения 31А.
Промежуточное соединение 33А.
1-(4-амино-5-бромпирроло [2,1-fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)-2-хлорэтанон
Данное соединение было получено в соответствии с процессом, описанным в документе WO
2007/056170-А2 (промежуточное соединение N, этап 1). HPLC (метод 1): R = 4.27 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.70 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 289.0 (75) и 290.9 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 287.0 (75) и 288.9 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 33А (100 мг, 0,35 ммоль) и тиоацетамид (30 мг, 0,40 ммоль, 1,15 экв.) растворили в 1,4-диоксане (3,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Виалу закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 130°С в течение 60 мин в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения растворитель отогнали, и осадок измельчили в порошок с ацетонитрилом и профильтровали. Фильтрат удалили. Главное соединение было выделено в виде кристаллического твердого вещества. Выход: 99 мг (92% от теор.).
HPLC (метод 1): R = 4.00 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.05 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 310.0 (90) и 312 (100) [М+Н]+. ^-ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.71 (s, 3Н), 7.20 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 8.28 (s, 1H). Промежуточное соединение 35А.
5-Бром-7-(2-этил-1,3 -тиазол-4-ил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
Промежуточное соединение 33А (100 мг, 0,35 ммоль) и тиопропионамид (32 мг, 0,36 ммоль, 1,05 экв.) нагревали с обратным холодильником в этаноле (3,0 мл) в течение 4,5 ч. После охлаждения смесь разделили между этилацетатом и водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали. Продукт высушили в вакууме с получением 91 мг (0,28 ммоль, 81% от теор.) главного соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета.
HPLC (метод 1): Rt = 4,30 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.84 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 324.2 (100) и 325.8 (98) [M+H]+. Промежуточное соединение 36А.
7-(2-Амино-1,3-тиазол-4-ил)-5-бромпирроло [2,1-fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
Промежуточное соединение 33А (100 мг, 0,35 ммоль) и тиомочевину (32 мг, 0,41 ммоль, 1,2 экв.) суспендировали в 1,4-диоксане (3 мл) в микроволновом реакционном сосуде, который затем закрыли обжимной крышкой. Смесь нагревали до 120°С в течение 60 мин в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения добавили воду, полученный в результате осадок собрали путем фильтрации и промыли диоксаном. Твердое вещество грязно-белого цвета высушили в вакууме с получением 98 мг (91% от теор.) главного соединения.
HPLC (метод 1): R = 3,19 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.25 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 310.9 (95) и 312.9 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 309.0 (100) и 310.9 (70) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 7.17 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 8.07 (s, 1H).
Промежуточное соединение 37А.
1-{4-[(4-Амино-5-бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил)метил]пиперазин-1-ил}-2,2,2-трифторэтанон
Данное соединение было получено в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (пример 416, этап 6). Промежуточное соединение 38А.
5-Бром-7-(морфолин-4-илметил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
Данное соединение было получено в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/064931-А2 (промежуточное соединение С). Промежуточное соединение 39А.
7-(Морфолин-4-илметил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пирроло[2,1-fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
К раствору промежуточного соединения 38А (5,59 г, 17,9 ммоль) и бис-(пинаколато)диборона (10,0 г, 39,4 ммоль) в дегазированном DMF (120 мл) добавили в аргоновой атмосфере 1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладий(П) хлорид (786 мг, 1,07 ммоль) и ацетат калия (7,03 г, 71,6 ммоль). Смесь нагревали до 80°С в течение 5 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Добавили трет-бутилметиловый эфир (100 мл) и суспензию профильтровали. Фильтрат выпарили при пониженном давлении до высушивания, и осадок очистили с помощью флэш-хроматографии над силикагелем (градиентное элюирование, 2-5%, метанол в дихлорметане) с получением 1,30 г (20% от теор.) главного соединения, содержащего некоторую часть соответствующего производного бороновой кислоты. Этот продукт использовали без дальнейшей очистки.
LC-MS (метод 6): Rt = 0.73 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 360.3 (30) [М+Н]+.
Промежуточное соединение 40А.
5-[4-({[трет-Бутил(диметил)силил]окси}метил)-3,5-дифторфенил]-7-(морфолин-4-илметил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 38А (200 мг, 0,64 ммоль) и [4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-3,5-дифторфенил]бороновой кислоты (314 мг, 0,77 ммоль, 74%), полученной по методу Хаттори., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3258-3262). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 110 мг (32% от теор., чистота LC-MS 92%).
LC-MS (метод 6): R = 1.18 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 490.1 (30) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 488.3 (100) [M-H]-.
Промежуточное соединение 41А.
Метил 4-[4-амино-7-(морфолин-4-илметил)пирроло[2,1-fJ [1,2,4]триазин-5-ил]-2-фторбензоат
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 38А (200 мг, 0,64 ммоль) и [3-фтор-4-(метоксикарбонил)фенил]бороновой кислоты (139 мг, 0,71 ммоль). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 80 мг (32% от теор.).
LC-MS (метод 6): R = 0.66 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 386.1 (80) [М+Н]+.
Промежуточное соединение 42А.
4-[4-Амино-7-(морфолин-4-илметил)пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил]бензальдегид
К раствору промежуточного соединения 38А (300 мг, 0,96 ммоль) в дегазированном DMF (9,0 мл) добавили (4-формилфенил)бороновую кислоту (216 мг, 1,44 ммоль), тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (111 мг, 0,1 ммоль) и 2 М водного раствора карбоната натрия (2,4 мл). Смесь нагревали до 90°С в течение 17 ч в аргоновой атмосфере, а затем охлаждали до комнатной температуры и непосредственно очищали путем препаративной HPLC (метод 3). Выход: 150 мг (46% от теор.).
LC-MS (метод 6): R = 0.44 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 338.2 (30) [М+Н]+.
Данное соединение было получено в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение О). Промежуточное соединение 44А.
1 -[(4-Аминопирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)метил]пиперидин-4-ол
4-Гидроксипиперидин (3,62 г, 35,8 ммоль) и 37% раствор формалина (2,9 г, 35,8 ммоль) растворили в уксусной кислоте (150 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. К этому раствору добавили раствор пирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-4-амина (2,0 г, 14,9 ммоль, получен в соответствии с процессом, описанным в документе 2007/056170-А2, промежуточное соединение А) в уксусной кислоте (150 мл), и смесь перемешивали при 60°С в течение 2 ч. Затем растворитель выпарили и осадок добавили в 200 мл в водный раствор бикарбоната калия с половинной концентрацией и экстрагировали с использованием 200 мл дихлорметана. Органическией слой промыли водой (2x50 мл) и удалили. Комбинированные водные слои выпарили до высушивания и осадок обработали смесью 10:1 дихлорметана и метанола (2x100 мл). Затем органические экстракты выпарили и осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 4) с получением 1,16 г (15% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 7): Rt = 0.18 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 248.3 (30) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 246.5 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.35 (br. m, 2H), 1.67 (br. m, 2H), 2.07 (t, 2H), 2.70 (br. m, 2H), 3.38 (br. m, 1H), 3.75 (s, 2H), 4.51 (br, 1H), 6.52 (d, 1H), 6.84 (d, 1H), 7.62 (br, 2H), 7.82 (s, 1H). Промежуточное соединение 45А.
1 -[(4-Амино-5-бромпирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)метил]пиперидин-4-ол
Промежуточное соединение 44А (1,10 мг, 4,45 ммоль) растворили в DMF (16,5 мл) и охладили до -20°С. 1,3-Дибром-5,5-диметилгидантоин (636 мг, 2,22 ммоль) добавляли каждые 10 мин порциями приблизительно 100 мг. Затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 1 ч, а затем непосредственно очистили препаративной HPLC (метод 4). Выход: 0,61 г (42% от теор.).
LC-MS (метод 4): Rt = 0.75 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 326.0 (30) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 324.0 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.35 (br. m, 2H), 1.67 (br. m, 2H), 2.08 (t, 2H), 2.68 (br. m, 2H), 3.39 (br. m, 1H), 3.74 (s, 2H), 4.51 (br, 1H), 6.69 (s, 1H), 7.86 (s, 1H). Промежуточное соединение 46А.
3-Пирролидинол (1,56 г, 17,9 ммоль) и 37% раствор формалина (1,45 г, 17,9 ммоль) растворили в уксусной кислоте (75 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. К этому раство-
1 -[(4-Аминопирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)метил] пирролидин-3 -ол
ру добавили раствор пирроло[2Д-г][1,2,4]триазин-4-амина (2,0 г, 14,9 ммоль) в уксусной кислоте (75 мл), и смесь перемешивали при 60°С в течение 4 ч. После выпаривания осадок добавили в 200 мл 1н. водного раствора карбоната калия и экстрагировали с использованием этилацетата (3x200 мл). Комбинированные органические слои промыли соляным раствором, высушили над сульфатом магния и сконцентрировали при пониженном давлении. Для получения 390 мг (11% от теор.) главного соединения осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 4).
LC-MS (метод 4): Rt = 0.22 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 234.2 (20) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
223.0 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.50 (br. m, 1H), 1.94 (m, 1H), 2.34 (dd, 1H), 2.44 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 2.71 (dd, 1H), 3.84 (dd, 2H), 4.15 (br, 1H), 4.65 (d, 1H), 6.52 (d, 1H), 6.83 (d, 1H), 7.61 (br, 2H), 7.82 (s, 1H).
Промежуточное соединение 47A.
1-[(4-Амино-5-бромпирроло2Д-1][1,2,4]триазин-7-ил)метил]пирролидин-3-ол
Промежуточное соединение 46А (0,9 мг, 3,86 ммоль) растворили в DMF (14,2 мл) и охладили до -20°С. 1,3-Дибром-5,5-диметилгидантоин (606 мг, 2,12 ммоль) добавляли каждые 10 мин порциями приблизительно 100 мг и перемешивание продолжали в течение 1 ч при комнатной температуре. Смесь разделили между 10% водным раствором бикарбоната калия (50 мл) и этилацетатом (100 мл).
Водный слой экстрагировали с использованием другой порции этилацетата (100 мл), а затем с использованием дихлорметана (100 мл). Комбинированные органические слои высушили над сульфатом магния и выпарили, а осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 4). Выход: 0,44 г (37% от теор.).
LC-MS (метод 6): R = 0.21 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 314.0 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.50 (br. m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.34 (dd, 1H), 2.45 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.70 (dd, 1H), 3.84 (dd, 2H), 4.15 (br, 1H), 4.65 (d, 1H), 6.71 (s, 1H), 7.86 (s, 1H). Промежуточное соединение 48А.
1 -[(4-Аминопирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7 -ил)метил]пиперидин-3 -ол
Главное соединение было получено по аналогии с промежуточным соединением 46А с использованием 3-гидроксипиперидина (1,80 г, 17,9 ммоль) в качестве стартового материала. После концентрации реакционной смеси осадок добавили в насыщенный водный раствор карбоната калия и экстрагировали с использованием 300 мл дихлорметана. Органический слой промыли соляным раствором, высушили над сульфатом магния и сконцентрировали при пониженном давлении. Для получения 650 мг (18% от теор.) главного соединения осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 4).
LC-MS (метод 6): R = 0.16 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 248.2 (60) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.99 (m, 1H), 1.37 (br. m, 1H), 1.57 (br. m, 1H), 1.74 (m, 2H), 1.88 (t, 1H), 2.68 (br. m, 1H), 2.83 (br. dd, 1H), 3.41 (br. m, 1H), 3.78 (dd, 2H), 4.54 (d, 1H), 6.52 (d, 1H), 6.84 (d, 1H), 7.61 (br, 2H), 7.82 (s, 1H).
Промежуточное соединение 49A.
По аналогии с получением промежуточного соединения 47А, главное соединение было получено из промежуточного соединения 48А (690 мг, 2,79 ммоль) с получением 348 мг (чистота LC-MS 93%, 36% от
1 -[(4-Амино-5-бромпирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)метил]пиперидин-3 -ол
теор.) продукта после очистки с помощью препаративной HPLC (метод 4).
LC-MS (метод 4): R = 0.85 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 226.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
223.9 (70) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.99 (m, 1H), 1.37 (m, 1H), 1.57 (br. m, 1H), 1.74 (m, 2H), 1.89 (m, 1H), 2.66 (br. m, 1H), 2.81 (br. m, 1H), 3.41 (br. m, 1H), 3.77 (dd, 2H), 4.54 (d, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.86
(s, 1H).
Промежуточное соединение 50А.
1-({4-Амино-5-[4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-3,5-дифторфенил]пирроло[2,1-fj [ 1,2,4] триазин-7 -и л} метил) пиперидин-3 -о л
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 49А (200 мг, 0,61 ммоль) и 4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-3,5-дифторфенил]бороновой кислоты (222 мг, 0,74 ммоль), полученной по методу Хаттори, Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3258-3262). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 153 мг (50% от теор.).
LC-MS (метод 7): R = 1.55 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 504.1 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.11 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.01 (m, 1H), 1.40 (br. m, 1H), 1.59 (br. m, 1H), 1.77 (m, 2H), 1.94 (m, 1H), 2.72 (br. m, 1H), 2.87 (br. m, 1H), 3.43 (m, 1H), 3.82 (dd, 2H), 4.55 (d, 1H), 4.74 (s, 2H), 6.75 (s, 1H), 7.18 (dd, 2H), 7.95 (s, 1H).
Промежуточное соединение 51А.
rac-трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-y 1} пирролидин-1 -карбоксилат
Получение исходного материала трет-бутил 3-(4-амино-5-бромпирроло[2Д-г][1,2,4]триазин-7-ил)пирролидин-1-карбоксилата описано в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение I).
Осуществляли реакцию сочетания этого соединения (60 мг, 0,16 ммоль) в соответствии с общим синтетическим методом 1 и промежуточного соединения 2А (47 мг, 0,17 ммоль, 1,1 экв.). Для получения 67 мг (84% от теор.) главного соединения неочищенный продукт очистили с помощью препаративной
HPLC (метод 2).
HPLC (метод 2): Rt = 4.08 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.66 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 446.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 444.3 (100) [M-H]-.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.39 (s, 9H), 2.10 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.46 (m, 1H), 3.70-3.89 (m, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.80 (s, 1H), 7.15 (m, 2H), 8.03 (s, 1H).
Промежуточное соединение 52А.
rac-трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}-3 -гидроксипиперидин-1 -карбоксилат
Промежуточное соединение 26А (148 мг, 0,35 ммоль) и (4-бром-2,6-дифторфенил)метанол (75 мг, 0,34 ммоль) соединяли в соответствии с общим синтетическим методом 2. Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 46 мг (28% от теор.).
HPLC (метод 3): R = 3.90 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.56 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 476.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 474.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.22-1.58 (m, 10H), 1.80 (m, 2H), 3.19 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 4.52 (m, 2H), 5.39 (t, 1H), 6.78 (s, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.94 (s, 1H). Промежуточное соединение 53А.
трет-Бутил 4-{4-амино-5-[4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}пиперидин-1-
карбоксилат
Исходный материал трет-бутил 4-(4-амино-5-бромпирроло[2,1-х][1,2,4]триазин-7-ил)пиперидин-1-карбоксилат получали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (пример 1, этап 3).
Осуществляли реакцию этого соединения (400 мг, 1,01 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (184 мг, 1,21 ммоль, 1,2 экв.) в соответствии с общим синтетическим методом 1. Для получения 326 мг (76% от теор.) главного соединения неочищенный продукт очистили с помощью препаративной
HPLC (метод 2).
HPLC (метод 2): Rt = 4.07 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.06 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 424.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 422.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.52-1.65 (m, 2H), 1.92-2.00 (m, 2H), 2.89 (br. s, 2H), 3.10 (m, 1H), 3.28-3.37 (m, 2H), 4.06 (d, 2H), 4.60 (s, 2H), 6.68 (s, 1H), 7.47 (s, 5H), 8.02 (s, 1H).
Промежуточное соединение 54А.
rac-трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}пиперидин-1-карбоксилат
Осуществляли реакцию с использованием общего синтетического метода 1 Промежуточного соединения 31А (200 мг, 0,39 ммоль) и промежуточного соединения 2А (138 мг, 0,51 ммоль, 1,3 экв.) с получением 130 мг (72% от теор.) главного соединения после очистки с помощью препаративной HPLC (метод 2).
HPLC (метод 3): Rt = 4.23 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.17 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 460.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 458.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.39 (s, 9H), 1.48 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 3.22 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 4.53 (s, 2H), 6.78 (s, 1H), 7.12 (m, 2H), 8.02 (s, 1H). Промежуточное соединение 55А.
трет-Бутил (3R)-3-{4-амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-7-ил}пиперидин-1-карбоксилат
Энантиомерно чистый R-изомер синтезировали путем сочетания промежуточного соединения 32А (115 мг, 0,28 ммоль) и (4-бром-2,6-дифторфенил)метанола (76 мг, 0,33 ммоль, 1,2 экв.) в соответствии с общим синтетическим методом 2. Выход: 48 мг (38% от теор.). В качестве альтернативы, главное соединение было получено путем сепарации рацемического соединения промежуточного соединения 54А (40 мг) с использованием препаративной хиральной HPLC [колонка: хиральная силикагель фаза на основе селектора поли(^-метакрилоил^-лейцин-трет-бутилшин), 250 ммх20 мм; элюент: этилацетат/изогексан 4:1; скорость потока: 20 мл/мин; УФ-детекция: 260 нм]. Выход: 20 мг (R-изомер).
Аналитическая хиральная HPLC [колонка: хиральная силикагель фаза на основе селектора поли(г\Г-метакрилоил^-лейцин-трет-бутиламин), 250 ммх4 мм; элюент: этилацетат/изогексан 4:1; скорость потока: 1 мл/мин; УФ-детекция: 260 нм]: Rt = 5.68 мин; е.е. > 99.5.
HPLC (метод 3): Rt = 4.23 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.17 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 460.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 458.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.39 (s, 9H), 1.48 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 3.22 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 4.53 (s, 2H), 6.78 (s, 1H), 7.12 (m, 2H), 8.02 (s, 1H).
Промежуточное соединение 56А.
трет-Бутил (3S)-3-{4-амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-7-ил}пиперидин-1-карбоксилат
Энантиомерно чистый S-изомер получали путем сепарации рацемического соединения промежуточного соединения 54А (40 мг) с использованием препаративной хиральной HPLC в соответствии с описанием для промежуточного соединения 55А. Выход: 19 мг (S-изомер).
Аналитическая хиральная HPLC [колонка: хиральная силикагель фаза на основе селектора поли(г\Г-метакрилоил^-лейцин-трет-бутиламин), 250 ммх4 мм; элюент: этилацетат/изогексан 4:1; скорость потока: 1 мл/мин; УФ-детекция: 260 нм]: Rt = 7,87 мин; е.е. > 99,5.
HPLC (метод 3): Rt = 4.23 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.17 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 460.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 458.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.39 (s, 9H), 1.48 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 3.22 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 4.53 (s, 2H), 6.78 (s, 1H), 7.12 (m, 2H), 8.02 (s, 1H). Промежуточное соединение 57А.
[2-Фтор-6-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил]метанол
(4-Бром-2-фтор-6-метилфенил)метанол (2,0 г, 9,13 ммоль) растворили в 1,4-диоксане (20,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде и раствор продули аргоном. Затем добавили бис-(пинаколато)диборон (2,43 г, 9,59 ммоль), 1Д"-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладий(П) хлорид (298 мг, 0,37 ммоль) и ацетат калия (1,34 г, 13,7 ммоль), реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 130°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Осадок обработали циклогексаном (100 мл) и перемешивали в течение 10 мин. Раствор профильтровали еще один раз, фильтрат выпарили и осадок очистили с использованием хроматографии (картридж с силикагелем Biotage 25M, дихлорметан при скорости потока 15 мл/мин). Фракции, содержащие главное соединение, комбинировали и выпарили, а затем путем спонтанной кристаллизации было получено главное соединение (2,18 г, 90% от теор.) в виде светло-желтого твердого вещества.
1Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.30 (s, 12H), 2.39 (s, 3H), 4.51 (m, 2H), 5.01 (t, 1H), 7.14 (d, 1H), 7.31 (s, 1H).
н3с сн.
Синтез и очистку главного соединения осуществляли аналогично с промежуточным соединением 57А с использованием (4-бром-2-этил-6-фторфенил)метанола (2,00 г, 8,58 ммоль), бис-(пинаколато)диборона (2,29 г, 9,01 ммоль), 1Д'-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладий(П) хлорида (280 мг, 0,34 ммоль) и ацетата калия (1,26 г, 12,87 ммоль) в 1,4-диоксане (20 мл). Выход: 2,16 г (90% от теор.) в виде желтых кристаллов.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.17 (t, 3Н), 1.30 (s, 12H), 2.76 (q, 2H), 4.50 (m, 2H), 5.03 (t, 1H), 7.14 (d, 1H), 7.32 (s, 1H).
Промежуточное соединение 59А.
[2-Фтор-6-метокси-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил]метанол
Синтез и очистку главного соединения осуществляли аналогично с промежуточным соединением 57А с использованием (4-бром-2-метокси-6-фторфенил)метанола (2,00 г, 8,51 ммоль), бис-(пинаколато)диборона (2,27 г, 8,90 ммоль), 1Д'-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладий(П) хлорида (278 мг, 0,34 ммоль) и ацетата калия (1,25 г, 12,76 ммоль) в 1,4-диоксане (20 мл). Выход: 1,81 г (75% от теор.) в виде желтых кристаллов.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.30 (s, 12H), 3.83 (s, 3H), 4.47 (m, 2H), 4.86 (t, 1H), 6.97 (d, 1H), 7.02 (s, 1H).
Промежуточное соединение 60А.
1 -(4-Аминопирроло [2 Д -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)циклогексанол
7-Бромпирроло[2Д-1Г1[1,2,4]триазин-4-амин (1,20 г, 5,63 ммоль) растворили в THF (25 мл) в аргоновой атмосфере при комнатной температуре. Добавили хлортриметилсилан (1,43 мл, 11,27 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем ее охладили до 0°С и добавили 2-пропил хлорид магния (11,8 мл раствора 2,0 М в THF, 23.7 ммоль), и перемешивание продолжали в течение еще трех часов, в то время как реакционной смеси дали нагреться до комнатной температуры. Затем добавили циклогексанон (0,88 мл, 8,45 ммоль), и перемешивание продолжали в течение 16 ч. Реакцию охладили смесью концентрированного водного раствора хлорида аммония и льда (1:1) до тех пор, пока значение рН не достигло 6-7. Смесь экстрагировали двумя порциями этилацетата, и комбинированные органические экстракты высушили над безводным сульфатом натрия и сконцентрировали до высушивания. Полученный таким образом продукт использовали без дальнейшей очистки (чистота ~68% путем HPLC). Выход: 1,87 г (97% от теор.).
LC-MS (метод 5): Rt = 1.10 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 233 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 231 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.28-1.33 (m, 1H), 1.42-1.50 (m, 2H), 1.58-1.63 (m, 1H), 1.671.78 (m, 4H), 2.13-2.23 (m, 2H), 6.69 (d, 1H), 7.20 (d, 1H), 8.02 (s, 1H), 8.58 (br. s, 1H), 9.00 (br. s, 1H).
Промежуточное соединение 60А (80 мг, 0,34 ммоль) растворили в THF (5,0 мл), смесь охладили до -20°С. За один раз добавили 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (49 мг, 0,17 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 1 ч. Реакцию охладили с использованием концентрированного водного раствора дитионита натрия (0,5 мл) и смесь экстрагировали с использованием этилацетата. Органический экстракт промыли соляным раствором, высушили над сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 98 мг (91% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 4): R = 1.90 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 311 (95) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 309
(90) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.20-1.33 (m, 1H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.58-1.78 (m, 5H), 2.152.23 (m, 2H), 5.01 (br. s, 2H), 6.63 (s, 1H), 7.82 (s, 1H). Промежуточное соединение 62А.
трет-Бутил {[4-(4-амино-5-бромпирроло[2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-7-ил)-1,3-тиазол-2-ил]метил}карбамат
Промежуточное соединение 33А (109 мг, 0,38 ммоль) и трет-бутил (2-амино-2-тиоксоэтил)карбамат (79 мг, 0,41 ммоль) растворили в этаноле (6,5 мл). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 20 ч. Затем смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Для получения 67 мг (42% от теор.) главного соединения в виде буровато-серого кристаллического твердого вещества осадок измельчили в порошок с ацетонитрилом.
LC-MS (метод 7): R = 1.81 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 425 (80) и 427 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 423 (50) и 425 (100) [M-H]-. Промежуточное соединение 63А.
трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3-фтор-4-(гидроксиметил)-5-метоксифенил]пирроло[2,1-л^[1,2,4]триазин-7-ил} пиперидин-1 -карбоксилат
Промежуточное соединение 31А (120 мг, 0,30 ммоль) и промежуточное соединение 59А (104 мг, 0,36 ммоль) растворили в ацетонитриле (2,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде и продули аргоном. Добавили тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (35 мг, 0,03 ммоль) и 2,0 М водного раствора карбоната натрия (0,5 мл), и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Осадок очистили с помощью флэш-хроматографии (картридж с силикагелем Biotage 25M, дихлорметан + 2-5% метанол, скорость потока 10 мл/мин) с получением 51 мг (36% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 6): R = 1.16 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 472 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
470 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.31-2.10 (m, 13H), 2.88-2.91 (m, 2H), 3.19-3.27 (m, 2H), 3.87 (s, 1H), 4.12 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.82 (t, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.83 (d, 1H), 6.90 (s, 1H), 7.92 (s, 1H). Промежуточное соединение 64А.
трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3-фтор-4-(гидроксиметил)-5-метилфенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}пиперидин-1-карбоксилат
Промежуточное соединение 31А (120 мг, 0,30 ммоль) и промежуточное соединение 57А (97 мг, 0,36 ммоль) растворили в ацетонитриле (2,0 мл) микроволновом реакционном сосуде и продули аргоном. Добавили тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (35 мг, 0,03 ммоль) и 2,0 М водного раствора карбоната натрия (0,5 мл), и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Осадок очистили с помощью флэш-хроматографии (картридж с силикагелем Biotage 25M, дихлорметан + 2-5% метанол, скорость потока 10 мл/мин) с получением 110 мг (71% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 4): R = 2.03 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 456 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 454 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.31-2.11 (m, 13H), 2.42 (s, 3H), 2.88-2.91 (m, 2H), 3.17-3.30 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 4.54 (m, 1H), 4.82 (t, 1H), 6.64 (s, 1H), 7.04 (d, 1H), 7.12 (s, 1H), 7.93 (s, 1H). Промежуточное соединение 65А.
трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3-фтор-4-(гидроксиметил)-5-метилфенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}пирро лидин-1 -карбоксилат
Исходный материал трет-бутил 3-(4-амино-5-бромпирроло[2Д-^[1,2,4]триазин-7-ил)пирролидин-1-карбоксилат синтезировали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение I).
трет-Бутил 3-(4-амино-5-бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил)пирролидин-1-карбоксилат (120 мг, 0,31 ммоль) растворили в ацетонитриле (2,2 мл) в микроволновом реакционном сосуде и продули аргоном. Добавили промежуточное соединение (100 мг, 0,38 ммоль), тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (36 мг, 0,03 ммоль) и 2,0 М водного раствора карбоната натрия (0,5 мл), и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Осадок очистили с помощью флэш-хроматографии (картридж с силикагелем Biotage 25M, дихлорметан + 2-5% метанол, скорость потока 10 мл/мин) с получением 91 мг (54% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 5): R = 2.00 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 442 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 440 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.41 (m, 9H), 2.00-2.48 (m, 2H), 3.29-3.53 (m, 3H), 3.71-3.90 (m, 2H), 4.55 (m, 2H), 4.99 (t, 1H), 6.63 (s, 1H), 7.06 (d, 1H), 7.12 (s, 1H), 7.92 (s, 1H).
Исходный материал трет-бутил 3-(4-амино-5-бромпирроло[2Д-^[1,2,4]триазин-7-ил)пирролидин-1-карбоксилат синтезировали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение I). трет-Бутил 3-(4-шино-5-бромпирроло[2Д-г][1,2,4]триазин-7-ил)пирролидин-1-карбоксилат (111 мг, 0,29 ммоль), промежуточное соединение 58А (98 мг, 0,35 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (17 мг, 0,015 ммоль) растворили в смеси ацетонитрила (2,3 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (0,53 мл) в микроволновом реакционном сосуде. После дегазации в течение 5 мин с использованием аргона реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения до комнатной температуры добавили насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и смесь экстрагировали с использованием этилацетата. Смешанные органические слои высушили над натрия сульфатом, профильтровали и сконцентрировали. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 5). Выход: 83 мг (63% от теор.).
HPLC (метод 9): Rt = 1.61 мин;
LC-MS (метод 10): R = 1.02 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 456.4 (100) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 454.4 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.22 (t, 3H), 1.41 (s, 9H), 2.1 (m, 1H), 2.80 (q, 2H), 3.30-3.43 (m, 2H), 3.44-3.51 (m, 1H), 3.78 (m, 1H), 4.55 (d, 2H), 5.00 (t, 1H), 6.68 (s, 1H), 7.09 (d, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.95
(s, 1H).
Промежуточное соединение 67A.
rac-трет-Бутил 3-{4-амино-5-[3-этил-5-фтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло-[2,1-л^[1,2,4]триазин-7-ил} пиперидин-1 -карбоксилат
Промежуточное соединение 31А (148 мг, 0,29 ммоль), промежуточное соединение 58А (98 мг, 0,35 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (17 мг, 0,015 ммоль) растворили в смеси ацетонитрила (2,3 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (0,67 мл) в микроволновом реакционном сосуде. После дегазации в течение 5 мин с использованием аргона, реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения до комнатной температуры добавили насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, и смесь экстрагировали с использованием этилацетата. Смешанные органические слои высушили над натрия сульфатом, профильтровали и сконцентрировали. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 5). Выход: 105 мг (76% от теор.).
HPLC (метод 9): RT= 1.71 мин;
LC-MS (метод 10): R = 1.08 мин; MS (ESIpos): m/z (%)= 470.4 (100) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 468.4 (75) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.22 (t, 3H), 1.38 (s, 9H), 1.50 (m, 1H), 1.65-1.90 (m, 2H), 2.06 (m, 1H), 2.80 (q, 2H), 2.98 (m, 1H), 3.20-3.43 (m, 2H), 3.8 (m, 1H), 4.08 (m, 1H), 4.55 (d, 2H), 5.02 (t, 1H), 6.65 (s, 1H), 7.07 (d, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.93 (s, 1H).
Промежуточное соединение 68А.
гас-Метил 4-{4-амино-7-[циклопропил(гидрокси)метил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-5-ил}-2-этоксибензоат
Промежуточное соединение 17А (250 мг, 0,88 ммоль), [3-метокси-4-(метоксикарбонил)фенил]бороновую кислоту (223 мг, 1,06 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (102 мг, 0,088 ммоль) растворили в смеси 1,4-диоксана (5,5 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (1,32 мл) в аргоновой атмосфере и нагревали с обратным холодильником в течение 16 ч. После этого добавили еще одну порцию тетракис-(трифенилфосфин)палладия(0) (102 мг, 0,088 ммоль) и нагревание продолжали в течение еще 24 ч. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь профильтровали, фильтрат сконцентрировали и осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 7). Выход: 130 мг (чистота 80%, 32% от теор.).
LC-MS (метод 10): R = 0.80 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 369.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
367.3 (75) [M-H]-.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.41 (m, 3H), 0.49 (m, 1H), 1.37 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 4.68 (d, 1H), 6.92 (s, 1H), 7.13 (dd, 1H), 7.22 (d, 1H), 7.77 (d, 1H), 8.05 (s, 1H). Промежуточное соединение 69А. 7-(Проп-1 -ен-2-ил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
Исходный материал 7-бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-амин получали в соответствии с процессом, описанным в документе WO 2007/056170-А2 (промежуточное соединение В).
В аргоновой атмосфере 7-бромпирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-4-амин (426 мг, 2 ммоль) и 4,4,5,5-тетраметил-2-(проп-1-ен-2-ил)-1,3,2-диоксаборолан (420 мг, 2,5 ммоль) растворили в смеси 1,2-диметоксиэтана (10 мл) и водного раствора карбоната натрия (2 М, 4 мл). Реакционную смесь дегазировали и добавили 1Д'-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладий(П) хлорид (73 мг, 0,1 ммоль). После перемешивания при 90°С в течение ночи, реакционную смесь разбавили этилацетатом (40 мл), добавили воду (10 мл) и слои разделили. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата (2x40 мл), и смешанные органические слои высушили над натрия сульфатом, профильтровали и сконцентрировали. Осадок очистили путем флэш-хроматографии (puriFlash, Interchim, циклогексан/этилацетат 1:1 до 100%, градиент этилацетата) с получением главного продукта в виде желтоватого твердого вещества. Выход: 304 мг (81% от теор.).
HPLC (метод 10): Rt = 0.83 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.57 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 175.1 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.15 (s, 3H), 5.22 (m, 1H), 6.30 (m, 1H), 6.73 (d, 1H), 6.91 (d, 1H), 7.69 (m, 1H), 7.91 (s, 1H).
Промежуточное соединение 69А (149 мг, 0,86 ммоль) растворили в смеси этанола и этилацетата (1:1, 40 мл) в аргоновой атмосфере. Добавили палладированный уголь (10%, 9,1 мг) и смесь активно перемешивали в течение 16 ч в атмосфере водорода при давлении окружающей среды и при комнатной температуре. После этого катализатор удалили путем фильтрации, а растворитель отогнали при пониженном давлении с получением 131 мг (80% от теор.) главного соединения в виде бесцветного твердого вещества. Этот продукт использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
HPLC (метод 10): R = 0.81 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.56 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 177.0 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.27 (d, 6H), 3.36 (m, 1H), 6.41 (d, 1H), 6.80 (d, 1H), 7.487.59 (m, 2H), 7.80 (s, 1H).
Промежуточное соединение 71А.
5-Бром-7-изопропилпирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-4-амин
Промежуточное соединение 70А (125 мг, 0,71 ммоль) растворили в сухом THF (21 мл) и охладили до 78°С. 1,3-Дибром-5,5-диметилгидантоин (81 мг, 0,28 ммоль) добавили двумя равными порциями. Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 1 ч, а затем оставляли для нагревания до комнатной температуры на ночь. После добавления воды (20 мл) и дальнейшего перемешивания в течение 20 мин выпавшее в осадок твердое вещество собрали фильтрацией и высушили под вакуумом. Неочищенный продукт, полученный таким образом, (209 мг, > 100% от теор.) использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
HPLC (метод 9): R = 1.35 мин.
LC-MS (метод 10): R = 0.91 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 257.0 (100) [М+Н]+. Промежуточное соединение 72А.
гас-1-(4-Амино-5-бромпирроло[2,1-fJ [1,2,4]триазин-7-ил)этанол
Промежуточное соединение 16А (500 мг, 1,66 ммоль) суспендировали в THF (10 мл) и охладили до 0°С. Добавили раствор бромметилмагния (3н. в диэтилэфире, 1,7 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. Затем добавили насыщенный водный раствор хлорида аммония и смесь экстрагировали с использованием этилацетата (2x20 мл). Комбинированные органические слои высушили над сульфатом магния, профильтровали и сконцентрировали с получением 235 мг (46% от теор.) главного продукта, который использовали на следующем этапе синтеза без дальнейшей очистки.
LC-MS (метод 5): R = 0.73 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 259.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 257.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.41 (d, 3H), 5.16 (m, 1H), 5.30 (m, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.85 (s,
1H).
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 11А (100 мг, 0,39 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (60 мг, 0,39 ммоль). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 33 мг (30% от теор.).
HPLC (метод 1): Rt = 3.47 мин; HPLC (метод 2): Rt = 3.78 мин;
LC-MS (метод 4): Rt = 0.91 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 283.2 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.71 (m, 2H), 3.31 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 7.42 (s, 4H), 7.89 (s, 1H). Пример 2.
[4-(4-Амино-7-пропилпирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-5 -ил)-2,6-дифторфенил]метанол
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 2 из промежуточного соединения 11А (118 мг, 0,46 ммоль) и (4-бром-2,6-дифторфенил)метанола (108 мг, 0,49 ммоль). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 59 мг (40% от теор.).
HPLC (метод 2): R = 3.94 мин;
LC-MS (метод 7): R = 1.47 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 319.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 317.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.95 (t, 3H), 1.71 (m, 2H), 4.52 (m, 2H), 5.26 (t, 1H), 6.64 (s, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.91 (s, 1H). Пример 3.
3-{4-Амино-5-[4-(гидроксиметил)фенил]пирроло [2,1 -f] [ 1,2,4]триазин-7-ил}пропан-1 -ол
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 10А (100 мг, 0,37 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (67 мг, 0,44 ммоль, 1,2 экв.) в соответствии с общим синтетическим методом 1. Для получения 73 мг (66% от теор.) главного соединения в виде бесцветного твердого вещества неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2).
HPLC (метод 1): Rt = 2.91 мин; HPLC (метод 2): Rt = 3.14 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.60 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 299.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 297.4 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.84 (m, 2H), 2.95 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.50 (m, 2H), 4.58 (s, 2H), 6.67 (s, 1H), 7.41 (s, 4H), 8.03 (s, 1H).
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 14А (75 мг, 0,26 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (48 мг, 0,32 ммоль). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 66 мг (80% от теор.).
HPLC (метод 2): Rt = 3.28 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.68 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 313.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 311.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.48-1.51 (m, 2H), 1.67-1.70 (m, 2H), 2.91 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.58 (s, 2H), 6.67 (s, 1H), 7.42 (s, 4H), 8.03 (s, 1H). Пример 5.
{4-Амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}(циклопропил)метанол
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 17А (125 мг, 0,44 ммоль) и промежуточного соединения 2А (114 мг, 0,53 ммоль) с использованием общего синтетического метода 1. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 73 мг (48% от теор.).
LC-MS (метод 7): R = 1.09 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 347.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 345.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.39 (m, 3H), 0.48 (m, 1H), 1.35 (m, 1H), 4.54 (d, 2H), 4.67 (m, 1H), 5.26 (m, 2H), 6.80 (s, 1H), 7.14 (m, 2H), 7.92 (s, 1H). Пример 6.
{4-Амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)метанол
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 18А (200 мг, 0,61 ммоль) и промежуточного соединения 2А (158 мг, 0,73 ммоль) с использованием общего синтетического метода 1. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 125 мг (52% от теор.).
LC-MS (метод 5): Rt = 1.29 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 391.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 389.0 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.24 (br. d, 1H), 1.36 (m, 2H), 1.68 (br. d, 1H), 2.03 (m, 1H), 2.60 (t, 2H), 3.82 (m, 2H), 4.54 (s, 2H), 4.95 (br. d, 1H), 5.28 (br, 1H), 5.33 (br, 1H), 6.73 (s, 1H), 7.14 (m, 2H), 7.93 (s, 1H).
Пример 7.
трет-4-{4-Амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}циклогексанол
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 24А (323 мг, чистота 85%, 0,88 ммоль) и промежуточного соединения 1А (286 мг, 1,06 ммоль, 1,2 экв.). Очистку неочищенного продукта осуществляли сначала с помощью флэш-хроматографии (картридж, заполненный силикагелем, Biotage, элюент дихлорметан/метанол 95:5). Дальнейшую очистку осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 72 мг (21% от теор.).
HPLC (метод 2): Rt = 3.37 мин;
LC-MS (метод 7): Rt = 1.01 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 375.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 373.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.32 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.98 (m, 2H), 2.04 (m, 2H), 3.04 (tt, 1H), 3.47 (m, 1H), 4.51 (m, 2H), 4.61 (d, 1H), 5.26 (t, 1H), 6.60 (s, 1H), 7.12 (m, 2H), 7.91 (s, 1H). Пример 8.
гас-{4-[4-Амино-7-(пирролвд(tm)
Промежуточное соединение 51А (67 мг, 0,15 ммоль) растворили в 30% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (6 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 20 мин, а затем все летучие вещества удалили путем дистилляции при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт растворили в этилацетате и промыли насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 21 мг (41% от теор.) главного соединения.
HPLC (метод 2): Rt = 2.96 мин;
LC-MS (метод 6): Rt = 0.34 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 346.1 (20) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
344.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.94 (m, 1H), 2.22 (m, 1H), 2.94 (m, 1H), 3.00-3.16 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 3.72 (m, 1H), 4.51 (s, 2H), 5.22 (br. s, 1H), 6.71 (s, 1H), 7.11 (m, 2H), 7.92 (s, 1H).
Промежуточное соединение 52А (46 мг, 0,10 ммоль) растворили в 30% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (1,5 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем все летучие вещества удалили путем дистилляции при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт растворили в этилацетате и промыли насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 20 мг (55% от теор.) главного соединения.
HPLC (метод 2): Rt = 2.94 мин;
LC-MS (метод 4): R = 1.01 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 358.1 (100) [M-H2O+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 374.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.48 (m, 1H), 1.89 (m, 2H), 2.40-2.69 (m, 2H), 2.92 (d, 1H), 3.02 (d, 1H), 3.40 (m, 1H), 4.52 (m, 2H), 5.26 (t, 1H), 5.45 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 7.13 (m, 2H), 7.94 (s, 1H). Пример 10.
{4-[4-Амино-7-(пиперидин-4-ил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-5-ил] фенил}метано л
Промежуточное соединение 53А (324 мг, 0,77 ммоль) растворили в дихлорметане (15 мл). Добавили трифторуксусную кислоту (1,5 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем добавили еще одну порцию трифторуксусной кислоты (1,5 мл), и перемешивание продолжали до тех пор, пока с помощью HPLC (метод 1) не определили полную конверсию исходного материала. Затем при пониженном давлении удалили все летучие вещества, и для получения 226 мг (91% от теор.) главного соединения осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 1).
HPLC (метод 1): R = 3.37 мин; HPLC (метод 2): R = 2.90 мин;
LC-MS (метод 4): Rt = 0.90 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 324.1 (75) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
322.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.79-1.95 (m, 2H), 2.16-2.23 (m, 2H), 3.05-3.19 (m, 2H), 3.373.52 (m, 3H), 4.56 (s, 2H), 5.49 (s, 2H), 6.66 (s, 1H), 7.43 (s, 4H), 8.03 (s, 1H), 8.39-8.50 (m, 1H), 8.65-8.69 (m,
1H).
Пример 11.
(4-{4-Амино-7-[(ЗК)-пипервдин-3-ил]пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил}-2,6-дифторфенил)метанол
Промежуточное соединение 55А (35 мг, 0,08 ммоль) растворили в 30% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (1,5 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем все летучие вещества удалили при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт растворили в этилацетате и промыли насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 18 мг (66% от теор.) главного соеди-
нения.
HPLC (метод 2): Rt = 3.10 мин;
LC-MS (метод 6): Rt = 0.55 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 360.2 (20) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
358.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.67 (m, 2H), 1.83 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.86 (m, 1H), 3.20 (d, 1H), 3.41 (m, 2H), 4.53 (m, 2H), 5.29 (t, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.11 (m, 1H), 7.94 (s, 1H).
[a]^ = +16,8° (c = 0,515, метанол). Пример 12.
(4-{4-Амино-7-[(38)-пиперидин-3-ил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-5-ил}-2,6-дифторфенил)метанол
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 56А (19 мг, 0,04 ммоль) способом, аналогичным способу, описанному для конверсии промежуточного соединения 55А в примере 11. Выход: 12 мг (81% от теор.).
Данные HPLC, LC-MS и Н-ЯМР были идентичны данным, приведенным для примера 11.
Пример 13.
{4-[4-Амино-7-(2-метил-1,3-тиазол-4-ил)пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил]фенил}метанол
Промежуточное соединение 33А (60 мг, 0,21 ммоль) и тиоацетамид (15 мг, 0,20 ммоль, 0,95 экв.) растворили в 1,4-диоксане (2 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение 4,5 ч. После охлаждения добавили 4-(гидроксиметил)фенилбороновую кислоту (38 мг, 0,25 ммоль, 1,2 экв.), тетракис
(трифенилфосфин)палладий(0) (59 мг, 0,07 ммоль, 0,25 экв.) и 2 М водного раствора карбоната натрия (0,4 мл). Смесь слегка перемешивали при 100°С в течение 16 ч. Затем добавили еще одну порцию тетра-кис-(трифенилфосфин)палладия (0) (24 мг, 0,1 экв.), и перемешивание продолжали еще в течение 4 ч при 100°С. Затем реакционную смесь профильтровали, фильтрат выпарили при пониженном давлении и осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2) с получением 28 мг (40% от теор.) главного соединения в виде кристаллов грязно-белого цвета.
HPLC (метод 1): Rt = 3.85 мин; HPLC (метод 2): Rt = 3.60 мин;
LC-MS (метод 6): R = 0.94 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 338.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 336.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.73 (s, 3H), 4.58 (s, 2H), 7.17 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.09 (s, 1H), 8.33 (s, 1H). Пример 14.
{4-[4-Амино-7-(2-метил-1,3-тиазол-4-ил)пирроло[2,1-л^[1,2,4]триазин-5-ил]-2,6-дифтор фенил } метано л
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 34А (75 мг, 0,24 ммоль) и промежуточного соединения 1А (78 мг, 0,29 ммоль, 1,2 экв.). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 27 мг (30% от теор.).
HPLC (метод 1): R = 3.79 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.03 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 374.0 (100) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 372.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.72 (s, 3H), 4.53 (s, 2H), 7.18-7.27 (m, 2H), 8.11 (s, 1H), 8.33
(s, 1H).
Пример 15.
{4-[4-Амино-7-(2-этил-1,3 -тиазол-4-ил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-5 -ил] фенил}метанол
Осуществляли реакцию промежуточного соединения 35А (91 мг, 0,28 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (51 мг, 0,34 ммоль, 1,2 экв.) в соответствии с общим синтетическим методом 1. Для получения 68 мг (69% от теор.) главного соединения в виде бесцветных кристаллов неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2).
HPLC (метод 1): R = 3.73 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.05 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 352.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 350.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.36 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 3.06 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 4.58 (s, 2H), 7.19 (s, 1H), 7.46 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.12 (s, 1H), 8.36 (s, 1H).
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 35А (34 мг, 0,11 ммоль) и промежуточного соединения 1А (34 мг, 0,13 ммоль, 1,2 экв.). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 16 мг (40% от теор.).
HPLC (метод 1): Rt = 4.04 мин;
LC-MS (метод 6): R = 1.15 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 388.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 386.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.38 (t, 3H), 3.06 (q, 2H), 4.55 (s, 2H), 7.20-7.31 (m, 3H), 8.16 (s, 1H), 8.38 (s, 1H). Пример 17.
{4-[4-Амино-7-(2-амино-1,3 -тиазол-4-ил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-5-ил] фенил}метанол
Главное соединение было получено с использованием общего синтетического метода 1 из промежуточного соединения 36А (55 мг, 0,18 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (32 мг, 0,21 ммоль). Очистку неочищенного продукта осуществляли с помощью препаративной HPLC (метод 2). Выход: 29 мг (49% от теор.).
HPLC (метод 1): Rt = 3.03 мин;
LC-MS (метод 5): R = 1.21 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 339.1 (30) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 337.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 4.58 (m, 2H), 5.75 (m, 1H), 6.93 (s, 1H), 7.05 (m, 2H), 7.43 (m, 4H), 7.55 (s, 1H), 8.08 (s, 1H). Пример 18.
{4-[4-Амино-7-(пиперазин-1 -илметил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-5-ил] фенил}метанол
Промежуточное соединение 37А (200 мг, 0,49 ммоль), 4-(гидроксиметил)фенилбороновую кислоту (90 мг, 0,59 ммоль, 1,2 экв.) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (57 мг, 0,05 ммоль, 0,1 экв.) растворили в смеси 1,4-диоксана (4,0 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (1,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 140°С в
течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь фильтровали через целит, который промыли 1,4-диоксаном для того, чтобы вымыть весь органический материал. Комбинированный фильтрат выпарили при пониженном давлении до высушивания и осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 1) с получением 75 мг (45% от теор.) главного соединения. HPLC (метод 1): Rt = 2.85 мин;
LC-MS (метод 4): Rt = 0.93 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 339.1 (30) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
337.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.38 (br. s, 4H), 2.63 (m, 4H), 3.80 (s, 2H), 4.55 (s, 2H), 5.26 (br. s, 1H), 6.60 (s, 1H), 7.39 (s, 4H), 7.90 (s, 1H). Пример 19.
{4-[4-Амино-7-(морфолин-4-илметил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-5-ил] фенил}метанол
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 38А (200 мг, 0,64 ммоль) и 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (116 мг, 0,77 ммоль, 1,2 экв.) в соответствии с общим синтетическим методом 1. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом материал растворили в нескольких мл смеси ацетонитрила и воды, добавили 2 М водного раствора карбоната натрия, и смесь перемешивали в течение 10 мин. За это время главное соединение выпало в осадок. Кристаллы выделили путем фильтрации и высушили под вакуумом с получением 95 мг (49% от теор.) бесцветного твердого вещества.
HPLC (метод 1): Rt = 3.21 мин;
LC-MS (метод 4): Rt = 0.93 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 340 (1) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 338.2 (100) [M-H]-.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.47 (m, 4H), 3.31 (s, 4H), 3.53 (t, 2H), 3.82 (s, 1H), 4.56 (d, 2H), 5.22 (t, 1H), 6.63 (s, 1H), 7.42 (s, 4H), 7.90 (s, 1H). Пример 20.
{4-[4-Амино-7-(морфолин-4-илметил)пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил]-2,6-дифторфенил}метанол
К раствору промежуточного соединения 40А (110 мг, 0,22 ммоль) в THF (2,2 мл) добавили 0,45 мл (0,45 ммоль) 1 М раствора тетрабутиламмония фторида (TBAF) в THF и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем реакционную смесь выпарили при пониженном давлении, осадок суспендировали в 3 мл метанола и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. Полученный осадок профильтровали, промыли небольшим количеством метанола и высушили под вакуумом с получением 68 мг (81% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 4): R = 1.03 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 376.0 (80) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 374.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.45 (br. m, 4H), 3.56 (t, 4H), 3.82 (s, 2H), 4.54 (d, 2H), 5.27 (t, 1H), 6.75 (s, 1H), 7.16 (m, 2H), 7.95 (s, 1H).
К суспензии промежуточного соединения 41А (65,0 мг, 0,17 ммоль) в THF (2,0 мл) добавили 0,2 мл (0,2 ммоль) 1 М раствора алюмогидрида лития в THF и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Для получения 35 мг (58% от теор.) главного соединения полученный раствор охладили водой, а затем непосредственно очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3).
LC-MS (метод 6): Rt = 0.98 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 358.1 (20) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
356.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.46 (br. m, 4H), 3.56 (t, 4H), 3.83 (s, 2H), 4.60 (d, 2H), 5.32 (t, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.27 (dd, 2H), 7.55 (t, 1H), 7.94 (s, 1H). Пример 22.
{4-[4-Амино-7-(морфолин-4-илметил)пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил]-2-хлорфенил}метанол
Промежуточное соединение 39А (200 мг, 0,56 ммоль), промежуточное соединение 3А (112 мг, 0,51 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (58 мг, 0,05 ммоль) растворили в смеси 1,4-диоксана (4,0 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (1,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 140°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3) с получением 48 мг (23% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 6): Rt = 0.53 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 374.1 (80) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
372.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.46 (br. m, 4H), 3.56 (t, 4H), 3.83 (s, 2H), 4.61 (d, 2H), 5.45 (t, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.44 (dd, 1H), 7.49 (d, 1H), 7.63 (t, 1H), 7.94 (s, 1H). Пример 23.
{4-[4-Амино-7-(морфолин-4-илметил)пирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил]-2-метилфенил}метанол
По аналогии с получением соединения в примере 28 осуществляли реакцию промежуточного соединения 39А (200 мг, 0,56 ммоль) и промежуточного соединения 4А (102 мг, 0,51 ммоль) с получением 9 мг (5% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 4): R = 1.00 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 354.3 (10) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 372.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.30 (s, 3H), 2.45 (br. m, 4H), 3.56 (t, 4H), 3.83 (s, 2H), 4.54 (d, 2H), 5.13 (t, 1H), 6.63 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.26 (d, 1H), 7.45 (d, 1H), 7.91 (s, 1H).
Пример 24.
{ 5 - [4 - Амино-7-(морфо jmH-4-га^
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 38А (200 мг, 0,64 ммоль) и промежуточного соединения 6А (147 мг, 0,96 ммоль) с использованием общего синтетического метода 1. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 4). Оставшиеся примеси удалили путем суспендирования продукта в ацетонитриле (2 мл), собрав оставшееся твердое вещество путем фильтрации. Выход: 27 мг (12% от теор.).
LC-MS (метод 4): Rt = 0.78 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 341 (10) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 339.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 2.46 (br. m, 4H), 3.56 (t, 4H), 3.84 (s, 2H), 4.62 (d, 2H), 5.46 (t, 1H), 6.73 (s, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.86 (dd, 1H), 7.95 (d, 1H), 8.56 (s, 1H). Пример 25.
1-({4-Амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}метил)пиперидин-4-ол
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 45А (200 мг, 0,61 ммоль) и промежуточного соединения 2А (159 мг, 0,74 ммоль) с использованием общего синтетического метода 1. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 103 мг (43% от теор.).
LC-MS (метод 4): Rt = 0.98 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 390.1 (60) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) =
388.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.36 (br. m, 2H), 1.68 (br. m, 2H), 2.12 (br. m, 2H), 2.75 (br. m, 2H), 3.41 (br. m, 1H), 3.79 (s, 2H), 4.51 (d, 1H), 4.54 (d, 2H), 5.27 (t, 1H), 6.72 (s, 1H), 7.15 (m, 2H), 7.94
(s, 1H).
Пример 26.
1-({4-Амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}метил)пирролидин-3 -о л
Главное соединение было получено из промежуточного соединения 47А (110 мг, 0,35 ммоль) и промежуточного соединения 2А (91,3 мг, 0,42 ммоль) с использованием общего синтетического метода 1. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3). Выход: 69 мг (52% от теор.).
LC-MS (метод 4): R = 0.25 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 376.1 (20) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.54 (m, 1H), 1.98 (m, 1H), 2.43 (br. d, 1H), 2.69 (m, 1H), 2.79 (dd, 1H), 3.93 (dd, 2H), 4.18 (br, 1H), 4.53 (d, 2H), 4.69 (d, 1H), 5.27 (t, 1H), 6.75 (s, 1H), 7.16 (m, 2H), 7.95
(s, 1H).
Пример 27.
1-({4-Амино-5-[3,5-дифтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}метил)пиперидин-3 -ол
К раствору промежуточного соединения 50А (150 мг, 0,30 ммоль) в THF (3,0 мл) добавили 0,60 мл (0,60 ммоль) 1 М раствора тетрабутиламмония фторида (TBAF) в THF и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем реакционную смесь сконцентрировали и осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 3) с получением 65 мг (56% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 7): R = 0.33 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 390.3 (100) [М+Н]+.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.02 (br. m, 1H), 1.40 (br. m, 1H), 1.60 (br. m, 1H), 1.77 (br. m, 2H), 1.95 (br. m, 1H), 2.73 (br. m, 1H), 2.88 (br. m, 1H), 3.43 (br. m, 1H), 3.83 (br. m, 2H), 4.54 (br. d, 3H), 5.27 (t, 1H), 6.74 (s, 1H), 7.15 (m, 2H), 7.95 (s, 1H).
Пример 28.
трет-4-{4-Амино-5-[3-этил-5-фтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}циклогексанол
Промежуточное соединение 24А (120 мг, 0,39 ммоль) и промежуточное соединение 58А (130 мг, 0,46 ммоль) растворили в ацетонитриле (3,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде и продули аргоном. Добавили тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (22 мг, 0,02 ммоль) и 2,0 М водного раствора карбоната натрия (0,7 мл) и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Для получения 36 мг (23% от теор.) главного соединения осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2).
LC-MS (метод 6): R = 0.82 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 385 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 383 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.24 (t, 3H), 1.28-1.38 (m, 2H), 1.46-1.54 (m, 2H), 1.94-1.97 (m, 2H), 2.01-2.05 (m, 2H), 2.82 (q, 2H), 3.03 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 4.53 (m, 2H), 4.61 (d, 1H), 5.02 (t, 1H), 6.58 (s, 1H), 7.08 (d, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.90 (s, 1H).
Пример 29.
трет-4-{4-Амино-5-[3-фтор-4-(гидроксиметил)-5-метоксифенил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-7-ил}циклогексанол
Промежуточное соединение 24А (120 мг, 0,39 ммоль) и промежуточное соединение 59А (163 мг, чистота 80%, 0,46 ммоль) растворили в ацетонитриле (2,0 мл) в микроволновом реакционном сосуде и продули аргоном. Добавили тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (45 мг, 0,04 ммоль) и 2,0 М водного раствора карбоната натрия (0,5 мл), и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат испарили. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2) с получением 6 мг (4% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 5): Rt = 1.36 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 387 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 385 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.24-1.33 (m, 2H), 1.42-1.53 (m, 2H), 1.90-1.93 (m, 2H), 2.002.04 (m, 2H), 3.04 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.48 (m, 2H), 4.60 (d, 1H), 4.83 (t, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.90 (s, 1H), 7.91 (s, 1H).
Пример 30.
{4-[4-Амино-7-(пиперидин-3-ил)пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-5-ил]-2-фтор-6-метоксифенил}метанол
Промежуточное соединение 63А (50 мг, 0,11 ммоль) растворили в 30% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (5,0 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем все летучие вещества удалили путем дистилляции при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт растворили в этилацетате и промыли насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 30 мг (76% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 6): R = 0.59 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 372 (10) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 370 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.50-2.08 (m, 4H), 2.94 (m, 2H), 3.17-3.30 (m, 3H), 3.85 (s, 3H), 4.51 (m, 2H), 4.82 (t, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.84 (d, 1H), 6.89 (s, 1H), 7.90 (s, 1H).
Промежуточное соединение 64А (110 мг, 0,21 ммоль) растворили в 30% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (5,0 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем все летучие вещества удалили путем дистилляции при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт растворили в этилацетате и промыли насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 59 мг (78% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 4): R = 1.10 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 356 (40) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 354 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.44-2.08 (m, 4H), 2.42 (s, 3H), 2.94 (m, 2H), 3.17-3.27 (m, 3H), 4.53 (m, 2H), 4.98 (t, 1H), 6.54 (s, 1H), 7.06 (d, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.90 (s, 1H). Пример 32.
{4-[4-Амино-7-(пирролидин-3 -ил)пирроло [2,1 -fj [ 1,2,4]триазин-5 -ил] -2-фтор-6-метилфенил}метанол
Промежуточное соединение 65А (90 мг, 0,17 ммоль) растворили в 30% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (5,0 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем все летучие вещества удалили путем дистилляции при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт растворили в этилацетате и промыли насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 27 мг (47% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 4): R = 1.03 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 342 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 340 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.80-2.21 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 2.78-2.81 (m, 1H), 2.85-3.02 (m, 2H), 3.22-3.27 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 4.55 (br. s, 2H), 4.98 (t, 1H), 6.63 (s, 1H), 7.06 (d, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.90 (s, 1H).
Промежуточное соединение 61А (95 мг, 0,31 ммоль) и промежуточное соединение 1А (87 мг, 0,32 ммоль) растворили в DMF (2,0 мл) микроволновом реакционном сосуде и продули аргоном. Добавили тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (35 мг, 0,03 ммоль) и 2,0 М водного раствора карбоната натрия (0,5 мл), и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения смесь профильтровали, а фильтрат непосредственно очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2) с получением 6 мг (4% от теор.) главного соединения.
LC-MS (метод 6): Rt = 1.05 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 375 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 373 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6): 5 (ppm) = 1.20-1.33 (m, 1H), 1.42-1.51 (m, 2H), 1.60-1.82 (m, 5H), 2.172.28 (m, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.76 (s, 1H), 7.17 (m, 2H), 8.02 (s, 1H). Пример 34.
(4-{4-Амино-7-[2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-ил]пирроло[2,1-1][1,2,4]триазин-5-ил}-2,6-дифторфенил)метанол
Промежуточное соединение 62А (67 мг, 0,16 ммоль), промежуточное соединение 1А (51 мг, 0,19 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (18 мг, 0,02 ммоль) и 2.0 М водного раствора карбоната натрия (0,94 мл) растворили в 1,4-диксане (2,50 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Виалу закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 140°С в течение 3 ч в одномодовом микроволновом устройстве. Затем реакционную смесь профильтровали, фильтрат разбавили ацетонитрилом и обработали диэтиловым эфиром. Полученный осадок собрали и очистили с помощью препаративной HPLC (метод 2). Полученный таким образом продукт(15 мг) затем обработали 20% раствором трифторуксусной кислоты в дихлорметане (2 мл) в течение 20 мин. Летучие вещества удалили путем дистилляции, осадок обработали концентрированным водным раствором карбоната натрия и экстрагировали с использованием этилацетата. Органический экстракт высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением главного соединения (10 мг, 13% от теор.) в виде бесцветного твердого вещества.
LC-MS (метод 4): R = 1.12 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 389 (25) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 387 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 4.24 (s, 2H), 4.53 (m, 2H), 5.30 (t, 1H), 7.18-7.23 (m, 3H), 8.11 (s, 1H), 8.40 (s, 1H).
Пример 35.
ent-{4-[4-Амино-7-(пирролидин-3-ил)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил]-2,6-дифторфенил}метанол (энантиомер 1)
Главное соединение было получено путем сепарации рацемического соединения примера 8 (54 мг) с использованием препаративной хиральной HPLC [колонка: Daicel Chiralpak AD-H, 250 ммх20 мм; элюент: изогексан/этанол 35:65; скорость потока: 20 мл/мин; УФ-детекция: 220 нм]. Выход: 12,5 мг. Аналитическая хиральная HPLC [колонка: Daicel Chiralpak AD-H, 5 мкм, 250 ммх4,6 мм; элюент: изогек-сан/этанол 50:50 + 0,2% диэтиламина; скорость потока: 1,0 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 220 нм]: R = 9.452 мин, е.е. > 99%.
HPLC (метод 9): R = 0.70 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.42 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 346.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 344.0 (100) [M-H]-. Пример 36.
ent-{4-[4-Амино-7-(пирролидин-3-ил)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил]-2,6-дифторфенил}метанол (энантиомер 2)
Главное соединение было получено путем сепарации рацемического соединения примера 8 (54 мг) с использованием препаративной хиральной HPLC [колонка: Daicel Chiralpak AD-H, 250 ммх20 мм; элю-ент: изогексан/этанол 35:65; скорость потока: 20 мл/мин; УФ-детекция: 220 нм]. Выход: 14 мг. Аналитическая хиральная HPLC [колонка: Daicel Chiralpak AD-H, 5 мкм, 250 ммх4,6 мм; элюент: изогек-сан/этанол 50:50 + 0,2% диэтиламина; скорость потока: 1,0 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 220 нм]: R = 13,695 мин, е.е. > 99%.
HPLC (метод 9): R = 0.71 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.42 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 346.1 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 344.0 (100) [M-H]-. Пример 37.
rac-{4-[4-Амино-7-(пирролидин-3 -ил)пирроло [2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил] -2-этил-6-фторфенил}метанол
Промежуточное соединение 66А (72 мг, 0,158 ммоль) растворили в дихлорметане (3,8 мл) при 0°С и добавили трифторуксусную кислоту (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 40 мин, а затем все летучие вещества удалили при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью пре
паративной HPLC (метод 6). В комбинированных фракциях, содержащих продукт, отрегулировали рН до щелочного с использованием насыщенного водного раствора карбоната натрия, и сконцентрировали до высушивания. Полученный в результате осадок суспендировали в этилацетате (50 мл) и профильтровали. Органический слой промыли соляным раствором (5 мл), высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 31 мг (56% от теор.) главного соединения. HPLC (метод 9): R = 0.81 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.55 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 356.3 (50) [M+H]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 354.2 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.23 (t, 3H), 1.84-2.24 (m, 1H), 2.81 (q, 2H), 2.80-2.99 (m, 1H), 3.00-3.72 (m, 1H), 4.56 (d, 2H), 5.00 (t, 1H), 6.68 (s, 1H), 7.09 (d, 1H), 7.14 (m, 2H), 7.92 (s, 1H). Пример 38.
rac-{4-[4-Амино-7-(пиперидин-3-ил)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил]-2-этил-6-фторфенил}метанол
Промежуточное соединение 67А (108 мг, 0,230 ммоль) растворили в дихлорметане (5,2 мл) при 0°С и добавили трифторуксусную кислоту (1,4 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 40 мин, а затем все летучие вещества удалили при пониженном давлении. Осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 6). В комбинированных фракциях, содержащих продукт, отрегулировали рН до щелочного с использованием насыщенного водного раствора карбоната натрия, и сконцентрировали до высушивания. Полученный в результате осадок суспендировали в этилацетате (50 мл) и профильтровали. Органический слой промыли соляным раствором (5 мл), высушили над безводным сульфатом натрия, а растворитель отогнали с получением 83 мг (85% от теор.) главного соединения.
HPLC (метод 9): Rt = 0.81 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.58 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 370.3 (50) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 368.3 (100) [M-H]-.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.22 (t, 3H), 1.51-1.72 (m, 2H), 2.00-2.10 (m, 1H), 2.51-2.65 (m, 2H), 2.81 (q, 2H), 2.95-3.03 (m, 1H), 3.20-3.27 (m, 1H), 4.56 (d, 2H), 5.00 (t, 1H), 6.60 (s, 1H), 7.07 (d, 1H), 7.14 (m, 2H), 7.91 (s, 1H).
Пример 39.
rac-{4-Амино-5-[3-этил-5-фтор-4-(гидроксиметил)фенил]пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-7-ил}(циклопропил)метанол
Промежуточное соединение 17А (83 мг, 0,29 ммоль), промежуточное соединение 58А (98 мг, 0,35 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (17 мг, 0,015 ммоль) растворили в смеси ацетонитрила (2,3 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (0,53 мл) в микроволновом реакционном сосуде. После дегазации в течение 5 мин с использованием аргона, реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 150°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения до комнатной температуры добавили насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и смесь экстрагировали трижды с использованием этилацетата. Смешанные органические слои высушили над натрия сульфатом, профильтровали и сконцентрировали. Для получения главного соединения осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 5). Выход: 63 мг (61% от теор.).
ВЭЖХ (метод 9): R = 1,13 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.78 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 357.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 355.3 (100) [M-H]-.
1Н ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.39 (m, 3H), 0.48 (m, 1H), 1.23 (t, 3H), 1.35 (m, 1H), 2.81 (q, 2H), 4.56 (d, 2H), 4.68 (m, 1H), 5.01 (m, 1H), 5.21 (m, 1H), 6.76 (s, 1H), 7.09 (d, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.90 (s,
1H).
Пример 40.
rac-{4-Амино-5-[4-(гидроксиметил)-3-метоксифенил]пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-7-ил}(циклопропил)метанол
Промежуточное соединение 68А (130 мг, 0,353 ммоль) растворили в тетрагидрофуране (6,9 мл) и охладили до 0°С. По каплям добавили раствор алюмогидрида лития (1 M в диэтилэфире, 0,78 мл), и реакционную смесь оставили для нагревания до комнатной температуры в течение ночи. Реакционную смесь затем охладили водой и профильтровали. Фильтрат сконцентрировали, и осадок очистили с помощью препаративной HPLC (метод 8) с получением главного соединения. Выход: 63 мг (51% от теор.).
LC-MS (метод 10): R = 0.62 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 341.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 339.1 (100) [M-H]-.
Пример 41.
ent-4-Амино-5-[4-(гидроксиметил)-3-метоксифенил]пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-7-ил}(циклопропил)метанол (энантиомер 1)
Главное соединение было получено путем сепарации рацемического соединения примера 40 (63 мг) с использованием препаративной хиральной HPLC [колонка: Daicel Chiralpak IC, 5 мкм, 250 ммх20 мм; элюент: трет-бутилметиловый эфир/метанол 85:15; скорость потока: 15 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 220 нм]. Выход: 17 мг.
Аналитическая хиральная HPLC [колонка: Daicel Chiralpak IC, 5 мкм, 250 ммх4,6 мм; элюент: трет-бутилметиловый эфир/метанол 85:15; скорость потока: 1,0 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 220 нм]: R = 4,76 мин, е.е. > 99%.
LC-MS (метод 10): R = 0,67 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 341,2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 339,1 (100) [M-H].-1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.40 (m, 3H), 0.48 (m, 1H), 1.36 (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 4.54 (d, 2H), 4.68 (m, 1H), 5.07 (t, 1H), 5.25 (d, 1H), 6.74 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 7.03 (d, 1H), 7.47 (d, 1H), 7.89 (s, 1H).
Главное соединение было получено путем сепарации рацемического соединения примера 40 (63 мг) с использованием препаративной хиральной HPLC [колонка: Daicel Chiralpak IC, 5 мкм, 250 ммх20 мм; элюент: трет-бутилметиловый эфир/метанол 85:15; скорость потока: 15 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 220 нм]. Выход: 25 мг.
Аналитическая хиральная HPLC [колонка: Daicel Chiralpak IC, 5 мкм, 250 ммх4,6 мм; элюент: трет-бутилметиловый эфир/метанол 85:15; скорость потока: 1,0 мл/мин; температура: 40°С; УФ-детекция: 220 нм]: Rt = 6,37 мин, е.е. > 99%.
LC-MS (метод 10): R = 0.67 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 341.2 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 339.1 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 0.40 (m, 3H), 0.48 (m, 1H), 1.36 (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 4.54 (d, 2H), 4.68 (m, 1H), 5.07 (t, 1H), 5.25 (d, 1H), 6.74 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 7.03 (d, 1H), 7.47 (d, 1H), 7.89 (s, 1H). Пример 43.
[4-(4-Амино-7-изопропилпирроло[2Д-1][1,2,4]триазин-5-ил)-2,6-дифторфенил]метанол
Промежуточное соединение 71А (181 мг, 0,709 ммоль), промежуточное соединение 1А (239 мг, 0,887 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (41 мг, 0,035 ммоль) растворили в смеси N,N-диметилформамида (12,5 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (1,42 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 130°С в течение 2 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь профильтровали через целит и сконцентрировали. Полученный в результате осадок растворили в этилацетате (100 мл) и промыли водой и соляным раствором (по 10 мл). Органический слой высушили над натрия сульфатом, профильтровали и сконцентрировали. Осадок очистили путем флэш-хроматографии (puriFlash, Interchim, циклогексан/этилацетат 1:1, градиент этилацетата до 100%), после чего следовала препаративная HPLC (метод 6). Фракции, содержащие продукт, смешали и отрегулировали рН до щелочного с использованием насыщенного водного раствора карбоната натрия. Растворитель (ацетонитрил) удалили и выпавший в осадок продукт собрали путем фильтрации. Выход: 69 мг (31% от теор.).
ВЭЖХ (метод 9): R = 1,35 мин;
LC-MS (метод 10): R = 0.90 мин; MS (ESIpos): m/z (%) =319.0 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 317.0 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.30 (d, 6H), 3.42 (m, 1H), 4.54 (s, 2H), 5.26 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 7.14 (m, 2H), 7.94 (s, 1H).
Промежуточное соединение 72А (230 мг, 0,743 ммоль), промежуточное соединение 2А (192 мг, 0,89 ммоль) и тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0) (86 мг, 0,074 ммоль) растворили в смеси 1,4-диоксана (4,6 мл) и 2 М водного раствора карбоната натрия (1,16 мл) в микроволновом реакционном сосуде. Реакционный сосуд закрыли обжимной крышкой и смесь нагревали до 140°С в течение 1 ч в одномодовом микроволновом устройстве. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь очистили с помощью препаративной HPLC (метод 8) с выходом 48 мг материала, который также очистили с помощью препаративной HPLC (метод 9). Выход: 11 мг (4,6% от теор.).
LC-MS (метод 5): R = 0.89 мин; MS (ESIpos): m/z (%) = 321.3 (100) [М+Н]+, MS (ESIneg): m/z (%) = 319.3 (100) [M-H]-.
1H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO): 5 (ppm) = 1.47 (d, 3H), 4.54 (m, 2H), 5.16-5.39 (m, 2H), 6.74 (s, 1H), 6.88 (m, 1H), 7.14 (m, 2H), 7.94 (s, 1H).
В. Оценка биологической активности. Сокращения и аббревиатуры:
АТСС Американская коллекция типовых культур
АТР аденозинтрифосфат
Bq беккерель
BrdU 5-бром-2-дезоксиуридин
BSA альбумин бычьей сыворотки
СНО яичник китайского хомячка
ерш число в минуту
Ct пороговый цикл
DMEM/F12 среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко /
среда F-12 (Ham's)
DMSO диметилсульфоксид
DNA ДНК
DTT дитиотреитол
EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота
ENGS MV культурная среда для капиллярных эндотелиальных клеток
FAM CFSE
FCS эмбриональная телячья сыворотка
hBMP9 костный морфогенетический фактор человека 9
HEPES 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота
HMVEC капиллярная эндотелиальная клетка (клетки) человека
НРМС гидроксипропил метилцеллюлоза
HTRF гомогенная флуоресценция с временным разрешением
HUVEC клетка (клетки) сосудистого эндотелия человека
[I] концентрация ингибитора
IC50 концентрация полумаксимального ингибирования
LDH лактатдегидрогеназа
mRNA мРНК
NADH никотинамидадениндинуклеотид
Nonidet Р40 4-этилфенокси-поли(этиленгликоль)эфир (п = 11)
PBS фосфатно-солевой буферный раствор
РЕ полиэтилен
PEG полиэтиленгликоль
РК пируваткиназа
р.о. пероралъно
qPCR количественная полимеразная цепная реакция
РНК РНК
RTL buffer буфер для лизиса RNeasy
SEQ ID NO идентификационный номер последовательности
SFM бессывороточная среда
TAMRA карбокситетраметилродамин
Tris 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол
Triton Х-100 4-отретв-октилфенокси-поли(этиленгликоль)эфирг (п = 10)
Демонстрация активности соединений по настоящему изобретению может осуществляться анализами in vitro, ex vivo и in vivo, которые хорошо известны специалистам. Например, для демонстрации активности соединений по настоящему изобретению могут использоваться следующие анализы.
В-Ы. Ферментное ингибирование in vitro с использованием сцинтилляции инкорпорированной радиоактивной метки (Flashplate анализ).
Принцип теста.
Тестовые соединения, разбавленные в DMSO, смешивают с соответствующим субстра-том/косубстратом (в настоящем документе: биотинилированный казеина и 33Р-АТР) в соответствующем тестовом буфере. Добавление целевого фермента (в настоящем документе: ALK1 киназа) запускает ферментную реакцию. Катализируемое ферментами инкорпорирование радиоактивной метки в субстрат измеряют путем сцинтилляции. Инкорпорированную радиоактивную метку отделяют от свободной радиоактивной метки путем специфического связывания биотинилированного субстрата с покрытыми стреп-тавидином микротитровальными планшетами (флэш-микропланшетами), а также с использованием этапов параллельного отмывания. Интенсивность сигнала сцинтилляции (число в минуту, cpm) пропорциональна ферментной активности. При ферментном ингибировании происходит снижение интенсивности сигнала. Значения IC50 тестовых соединений определяют путем определения cpm в сопоставлении с [I] единицами опыта.
Реакционный буфер.
Реакционный буфер содержит 50 мМ Tris pH 8.0 (Sigma), 1 мМ MnCl2 (Sigma), 0,01% Nonidet P40 (Fluka), 0,5x полная смесь ингибиторов протеаз без EDTA (Roche; содержит смесь нескольких ингибиторов протеаз для ингибирования серин- и цистеин-протеаз (но не металлопротеаз); 1 таблетка содержит такое количество ингибиторов протеаз, которого достаточно для 50 мл клеточного субстрата 50; концентрация, используемая в данном тесте соответствует 1 таблетке на 100 мл.
Другие буферы.
1) Стоп-раствор: Дульбекко PBS (PAA, Pasching, Austria), 25 мМ EDTA (Sigma), 25 мкМ ATP (Roche), 0,05% Triton X-100 (Sigma).
2) Буфер для насыщения: Дульбекко PBS (PAA, Pasching, Austria), 100 мкМ ATP (Roche), 0,2% Triton X-100 (Sigma).
3) Промывочный буфер: Дульбекко PBS (PAA, Pasching, Austria).
Ферментный раствор.
Исходный раствор ALK1 (Invitrogen, Пэйсли, Великобритания) (35,7 нг/мкл) разбавляли до
4 нг/мкл; конечная концентрация в реакции - 1 нг/мкл. Субстратный раствор.
Дефосфорилированный а-казеин (Sigma) биотинилируют в соответствии с протоколом производителя (Pierce, Бонн, Germany), в результате чего получают исходный раствор, 61,6 мкМ. Схематически, реагент EZ-Link(r) сульфо-№г!Б-биотин (сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо)гексаноат; Pierce, Бонн, Германия) добавляют в эквимолярном соотношении к а-казеину и инкубируют на льду в течение 2 ч. После этого биотиновый реагент удаляют путем диализа (2x 2 ч и в течение ночи).
Перед каждым тестом 100 мМ раствора холодного (немеченного) ATP (Roche) разбавляли 1:100. Для смеси субстратов, а-казеин разбавляли до 2,22 мкМ, в результате была получена концентрация 1 мкМ а-казеина в реакции. В качестве дополнения, добавляли холодный АТР с получением 1,11 мкМ раствора, в результате была получена конечная концентрация 500 нМ в реакции.
Радиоактивный раствор АТР.
Исходный раствор (9,25 MBq/25 мкл 33Р-АТР; Perkin Elmer, Родгау, Германия) разбавляли до 651,2 Bq/мкл. Это соответствует конечной концентрации 162,8 Bq/мкл. Раствор соединения.
Соединения растворяли в 100% DMSO (исходный раствор 10 мМ) и разбавляли до 2 мМ. Дальнейшие разбавления осуществляли поэтапно 1:3,16 в DMSO. Пошаговый протокол.
В каждую лунку 384-луночного микротитровального планшета (Greiner Bio-One, Золинген, Германия) поместили 9 мкл субстратного раствора. Добавили 1 мкл раствора соединения и 5 мкл радиоактивного раствора АТР. Ферментная реакция начинается с добавлением 5 мкл ферментного раствора. Смесь инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре, а затем останавливают реакцию путем добавления 10 мкл стоп-раствора. 384-луночные микротитровальные флэш-планшеты (Perkin Elmer, Родгау, Германия) насыщают с использованием 50 мкл насыщающего буфера на лунку в течение, по меньшей мере, 60 мин. Затем объем 20 мкл удаляют и замещают 20 мкл остановленной реакционной смеси ALK1. Связывание биотинилированного субстрата с флэш-планшетом осуществляют путем инкубирования в течение ночи при комнатной температуре. Связанный субстрат отделяют от несвязанных компонентов путем повторяющихся этапов промывки (3x50 мкл промывочного буфера на лунку). В завершение, добавляют 50 мкл промывочного буфера, и с использованием подходящего счетчика (Perkin Elmer, Родгау, Германия) производится измерение сцинтилляционного сигнала (cpm).
Значения IC50 для отдельных соединений по настоящему изобретению перечислены в табл. 1 ниже.
Таблица1
ПРИМЕР №
ALK11С5о [нМ]
2,0
2,8
4,0
1,0
1,3
2,0
4,4
5,7
8,0
1,9
5.9
4,0
5,3
2,6
ПРИМЕР №
ALKI 1С50 [нМ]
2,0
140
170
1,0
2,0
4,0
4,0
4,1
3,2
3,5
1,2
1,9
3,8
B-1b. Анализ ALK1 киназы (протокол ProQinase).
Активность ALK1 киназы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) измеряли в ProQinase GmbH (Фрайбург, Германия) путем радиометрического анализа с использованием у-33Р-АТР и казеина (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве субстрата в 96-луночных планшетах PerkinElmer FlashPlates(tm) (Бостон, Массачусетс, США). Соединения тестировали в 10 концентрациях в диапазоне от 1х10-4 М до 3х10-9 М в общем объеме 50 мкл с конечной концентрацией DMSO 1% каждый раз. Тестовые компоненты смешивали в следующем порядке:
20 мкл тестового буфера (70 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 3 мМ MgCl2, 3 мМ MnCl2, 2 мкМ ортована-дата натрия, 1,2 мМ DTT);
5 мкл у-33Р-АТР (1,0 мкМ в воде, приблизительно 6х 10 cpm на лунку);
5 мкл раствора тестового соединения (в 10% DMSO);
10 мкл раствора субстрат (200 мкг/мл, 1,0 мкг/50 мкл конечная концентрация)/фермент (4 мкг/мл, 20 нг/50 мкл = 5,5 нМ конечная концентрация) (смесь 1:1).
Реакционные смеси инкубировали при 30°С в течение 60 мин, а затем реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 2% (по объему) ортофосфорной кислоты. Затем аспирировали содержимое планшета и дважды промыли 200 мкл 0,9% (масса/объем) хлорида натрия. Инкорпорирование 33Pi определялось с использованием сцинтилляционного счетчика для микропланшетов (Microbeta, Wallac). Все анализы проводили с использованием системы BeckmanCoulter/SAGIAN(tm) Core System.
Медианные значения, полученные от неспецифического субстрата, связанного с меченной АТР, были установлены как нормальный уровень, в то время как считалось, что медианные значения, полученные в отсутствии каких-либо ингибиторов, отражают полную активность ALK1 киназы. Значение нормального уровня активности (ba) вычитали из значения полной активности (fa) value, a также из значений активности, полученных из образцов, содержащих тестовые соединения (активность тестового соединения, tca). Расчет остаточной активности в образцах, содержащих тестовые соединения, производили следующим образом:
остаточная активность (%) = 100x[(tca-ba)/(fa-ba)] Расчет остаточной активности для каждой концентрации и расчет значений IC50 производили с использованием Quattro Workflow V3.1.0 (Quattro Research GmbH, Мюнхен, Германия). Модель подбора для определения значений IC50 была следующей: "сигмоидальный ответ (переменный склон)" с параметром "верх", установленным как 100%, и "низ" - как 0%. Использовавшийся метод подбора кривой - подбор кривой методом наименьших квадратов.
В-2а. Индуцирование целевого гена Smad7. Клеточный анализ HMVEC и анализ экспрессии Taq-
Man.
Активация ALK1 рецепторов с использованием ВМР9 индуцирует Smad1/5 сигнальный путь и усиливает экспрессию целевых генов Smad6, Smad7 и Id-1. Индуцирование Smad7-MPHK в ВМР9-стимулированных эндотелиальных клетках определялось для мониторинга клеточной активности ингибиторов ALK1 киназы.
Капиллярные эндотелиальные клетки человека (HMVECadult, Cell Systems, St. Katharinen) высеивали в полную ENGS MV среду со всеми дополнительными компонентами (LifeLine Cell Technology) в 96-луночные планшеты, 10000 клеток на лунку. После инкубирования в течение 4 ч при 37°С и 7,5% СО2 во влажной камере, среду заменили минимальной средой (ENGS MV без дополнительных компонентов с 0,02% FCS). Через 16 ч к культурам добавили тестовые соединения или среды (контроль), после чего через 30 мин следовало добавление hBMP9 (R &D Systems). Среду удалили через 1-4 ч планшеты аккуратно промыли фосфатно-буферным солевым раствором, затем осуществляли лизис клеток с использованием 150 мкл на лунку охлажденного на льду RLT буфера (Qiagen).
Процедуру выделения тотальной РНК проводили с помощью реагента Trizol(r) в соответствии со спецификациями производителя (Invitrogen, США) и производили обработку DNAseI для удаления кон-таминирования геномной ДНК.
Для относительного количественного определения распределения мРНК hSmad7, тотальную РНК из каждого образца сначала осуществили обратную транскрипцию с использованием системы ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, США) в соответствии с протоколом производителя. Конечный объем довели до 200 мкл водой.
Для относительного количественного определения выбранных мРНК использовали систему Applied Bioscience ABI 7900HT Sequence Detection System в соответствии со спецификациями и протоколами производителя. Для количественного определения мРНК hSmad7 и конститутивного гена L32 осуществили реакции ПНР. Прямые и обратные праймеры и зонды для hSmad7 и L32 были созданы с использованием ПО Applied Bioscience ABI Primer Express(tm) и были синтезированы Eurogentec (Belgium). Последовательность прямого праймера hSmad7: Праймер 1 (SEQ ID NO 1). Последовательность обратного праймера hSmad7: Праймер 2 (SEQ ID NO 2). Зонд 1 (SEQ ID NO 3), помеченный FAM в качестве репор-терного красителя и TAMRA в качестве гасителя, использовали в качестве зонда для hSmad7. Последовательность прямого праймера L32: Праймер 3 (SEQ ID NO 4). Последовательность обратного праймера L32: Праймер 4 (SEQ ID NO 5). Зонд 2 (SEQ ID NO 6), помеченный FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя, использовали в качестве зонда для L32.
Список SEQ ID последовательностей:
5' -3'
SEQ ID NO 1 hSmad7 праймер 1 CCCTCCTTACTCCAGATACCC
(прямой праймер) SEQ ID NO 2 hSmad7 праймер 2 GGAGGAAGGCACAGCATCT
(обратный праймер) SEQ ID NO 3 hSmad7 образец 1 TTTTCTCAAACCAACTGCAGACTGTCC
5' - 3'
SEQ ID NO 4 L32 праймер 3 AAGTTCATCCGGCACCAGTC
(прямой праймер) SEQ ID NO 5 L32 праймер 4 TGGCCCTTGAATCTTCTACGA
(обратный праймер)
SEQ ID NO 6 L32 образец 2 CCCAGAGGCATTGACAACAGGG
В общем объеме 20 мкл на лунку были приготовлены следующие препараты: ixqPCR-MasterMix (Eurogentec, Бельгия) и hSmad7 прямые и обратные праймеры, каждый 200 нМ, 200 нМ hSmad7 FAM/TAMRA-меченный зонд 1 (SEQ ID NO 3), и 5 мкл темплатной кДНК. Соответственно, вторую смесь приготовили в общем объеме 20 мкл с использованием L32 FAM/TAMRA-меченого зонда 2 (SEQ ID NO 6) и L32 прямых и обратных праймеров, добавляемых на лунку в параллельных образцах.
Параметры термоциклирования были следующие: 2 мин при 50°С, затем 10 мин при 95°С, затем 40 циклов плавления при 95°С в течение 15 с и отжиг/вытягивание при 60°С в течение 1 мин.
Расчет относительной экспрессии.
Расчет значений Ct (пороговый цикл) производили исходя из точки перегиба кривой количества продукта ПЦР путем метода SYMBOL 68 \f "Symbol" \s 1 lACt (дельта-дельта Ct): ACt = CthSjra,^ - CtL32; относительная экспрессия = 2^15-ACt)
Расчет значений IC50 тестовых соединений производили на основе относительных уровней экспрессии Smad7 при различных концентрациях соединения. Репрезентативные значения перечислены в табл. 3 ниже.
Man.
Активность ингибиторов ALK1 in vitro тестировали путем клеточного анализа. Костный морфоге-нетический белок 9 (ВМР9) индуцирует экспрессию Smad7 мРНК в клетках сосудистого эндотелия человека (HUVEC) путем активации ALK1.
1,5x104 тонкостенных 2 HUVEC (Lonza, Базель, Швейцария) на лунку высеяли в 96-луночный планшет в среде ЕВМ-2, содержащей добавки EGM-2 и факторы роста (Lonza, СС-3156 и СС-4176). Через 4 ч среду заменили на ЕВМ-2 с 0,2% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и клетки выдерживали в течение 20 ч во влажной камере при 37°С, 5% СО2. Тестовые соединения добавляли в 11 различных концентрациях от 0 до 10000 нМ за 1 ч до стимулирования клеток в течение 3 ч рекомбинантным человеческим ВМР9 белком при 1 нг/мл (растворенным в 4 мМ соляной кислоты, 0,1% BSA при 10 мкг/мл; R &D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США, 3209ВР). Среду удалили и осуществляли лизис клеток в 100 мкл RLT буфера (Qiagen, Хильден, Германия). РНК изолировали с использованием комплекта Qiagen RNeasy 96 Kit (заказ № 74182) в соответствии с инструкциями производителя и элюировали с колонок с использованием 65 мкл воды с отсутствием рибонуклеаз. Обратную транскрипцию для количественной ОТ-ПЦР осуществляли с использованием комплекта Omniscript Kit (Qiagen, 205113) в 96-луночном планшете с отсутствием рибонуклеаз. На лунку добавили 6,8 мкл реакционного мастер-микса, содержащего 2 мкл 10x RT-буфера, 2 мкл dNTP (5 мМ каждый), 1,6 мкл случайного праймера N6 (125 мкМ), 0,25 мкл Rnase Out (40 U/мкл) и 1 мкл обратной траскриптазы Omniscript Reverse Transcriptase. После добавления 13,2 мкл смеси РНК/вода содержимое планшетов смешивали, инкубировали в течение 1 ч при
37°С, и общий объем доводили до 100 мкл в каждой лунке путем добавления 80 мкл воды с отсутствием рибонуклеаз.
Количественное определение человеческой Smad7 мРНК осуществили с помощью TaqMan с использованием Eurogentec qPCR Mastermix Plus (RT-QP2X-03-075+; Кельн, Германия) и с использованием человеческого L32 в качестве конститутивной эталонной мРНК. На количественную ПЦР добавляли 2,8 мкл праймер-микс, 10 мкл мастер-микс, 2,2 мкл воды и 5 мкл кДНК. Параметры термоциклирования были следующие: 2 мин при 50°С, затем 10 мин при 95°С, затем 40 циклов плавления при 95°С в течение 15 с и отжиг/вытягивание при 60°С в течение 1 мин.
Уровни Smad7 мРНК, индуцированной 1 нг/мл ВМР9 без добавления игнибиторов, были установлены как 100% индукция, и был произведен % ингибирования для каждого тестового соединения с этим значением. Для каждого тестового соединения каждое значение определялось в четырех параллельных анализах. Значения IC50 определяли с использованием Microsoft Excel. Использовавшийся метод подбора кривой - взвешенный неограниченный подбор, метод максимального правдоподобия.
Репрезентативные значения IC50 этого анализа перечислены в табл. 4 ниже.
Таблица 4
ПРИМЕР №
hSmad7 ICS0 [нМ]
160
120
290
140
180
290
5900
790
3100
330
500
6,6
В-3. Эффективность при систематическом применении в лазерно-индуцированной модели неова-скуляризации хороидеи (CNV).
Целью данного исследования являлось определение того, приведет ли систематическое ежедневное одноразовое интраперитонеальное введение (i.p.) тестового соединения к снижению пропотевания жидкости через сосуды и/или неоваскуляризации хороидеи в крысиной модели лазерно-индуцированной не-оваскуляризации хороидеи.
Для этих целей были отобраны 16 пигментированных серых крыс без видимых признаков дефектов глаз и произвольно разделены на две группы по восемь особей в каждой группе. В день 0 животным была сделана анестезия путем интраперитонеальной инъекции (15 мг/кг ксилазина и 80 мг/кг кетамина). После инстилляции одной капли 0,5% тропикамида, чтобы расширить зрачки, была индуцирована неова-скуляризация хороидеи путем прожигания шести отверстий размером 75 мкм в сосудистой оболочке глаза возле диска зрительного нерва в правом глазу животного с использованием светокоагуляции (аргоновый лазер, 532 нм, 150 мВт) в течение 100 мс. Тестовое соединение и контрольный препарат (носитель) (10% этанола, 90% PEG 400) вводили один раз каждый день путем интраперитонеальных инъекций (i.p.) с дозировкой тестового соединения 50 мг/кг в дни 0 и 1, а затем с дозировкой 20 мг/кг в дни 2-23. Вес тела всех животных регистрировался до начала исследований и в ходе исследований один раз каждый день.
На 21 день осуществляли ангиографию с использованием Гейдельбергского ретинального ангио-графа (HRA). После анестезии и расширения зрачков, подкожно инъецировали 10% краситель (натрия флюоресцеин), и изображения были получены через 10 мин после инъекции красителя. Оценку пропоте-вания флюоресцеина через сосуды на ангиограммах производили слепым методом двумя исследователями, по шкале от 0 (нет пропотевания) до 3 (сильное окрашивание).
На 23 день животных подвергали эвтаназии, их глаза отбирали на анализ и фиксировали в 4% рас
творе параформальдегида в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки сетчатку аккуратно сняли, сосудистую оболочку-склеру расположили на плоскости и инкубировали после блокирования с FITC-изолектин В4 антителом. Затем расположенные на плоскости препараты исследовали с использованием флуоресцентного микроскопа (Apotom) на длине волны возбуждения 488 нм. Объем патологических изменений при неоваскуляризации хороидеи оценивался путем морфометрического анализа изображений с использованием ПО Axiovision 4.6.
Для примера 11 (репрезентативного для соединений по настоящему изобретению) в этой модели были получены следующие результаты:
пропотевание жидкости через сосуды
Результат ангиографии
объем патологических изменений при неоваскуляризации хороидеи
[мкм3 х 100 000]
Пример 11
0,68 ±0,35
3,48 ±0,40
контрольный
препарат
(носитель)
1,7 ±0,32
5,83 ±0,55
В-3. Эффективность при местном применении в лазерно-индуцированной модели неоваскуляриза-ции хороидеи (CNV).
Целью данного исследования являлось определение того, приведет ли ежедневное двухразовое местное введение (глазные капли) тестового соединения к снижению пропотевания жидкости через сосуды и/или неоваскуляризации хороидеи в крысиной модели лазерно-индуцированной неоваскуляризации хо-роидеи.
Для этих целей были отобраны 65 пигментированных серых крыс без видимых признаков дефектов глаз и произвольно разделены на шесть групп по восемь особей в каждой группе (для значений n см. таблицу ниже). В день 0 животным была сделана анестезия путем интраперитонеальной инъекции (15 мг/кг ксилазина и 80 мг/кг кетамина). После инстилляции одной капли 0,5% тропикамида, чтобы расширить зрачки, была индуцирована неоваскуляризация хороидеи путем прожигания шести отверстий в сетчатке (разрыв мембраны Бруха) в одном глазу каждого животного с использованием 532 нм аргонового лазера (площадь изменений: 50 мкм; интенсивность лазерного излучения: 150 мВт; продолжительность стимула: 100 мс). Тестовые соединения и контрольный препарат (носитель) вводили местно два раза в день путем вливания малыми дозами соответствующих глазных капель в пораженный глаз.
Дозировка тестовых соединений.
В ходе всего периода наблюдения (23 дня) 10 мкл препарата глазных капель, содержащего 20 мг/мл соответствующего тестового соединения, суспендированного либо в 100% жидком парафине или в водном носителе (НРМС 15 сР 3,5%, полисорбат 80 0,5%, NaCl 0,9% в воде), вводили дважды в день в пораженный глаз с интервалом 10-14 ч. Контрольным животным местно дважды в день вводили соответствующий носитель (100% жидкий парафиновый или водный носитель). Вес тела всех животных регистрировался до начала исследований и в ходе исследований один раз каждый день.
На 21 день осуществляли ангиографию с использованием фундус-камеры для флуоресцентной ангиографии (Kowe). При этом, после анестезии и расширения зрачков, подкожно инъецировали 10% краситель (натрия флюоресцеин), изображения были получены через 2 и 10 мин после инъекции красителя. Оценку пропотевания флюоресцеина через сосуды на ангиограммах производили тремя различными исследователями, не имевшими информации о том, к какой группе принадлежат крысы (тестовое соединение либо носитель), по шкале от 0 (нет пропотевания) до 3 (сильное окрашивание).
На 23 день животных подвергали эвтаназии, их глаза отбирали на анализ и фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки сетчатку аккуратно сняли, промыли, блокировали и окрасили FITC-изолектин В4 антителом для визуализации сосудистой сети. Затем сосудистую оболочку-склеру расположили на плоскости и исследовали с использованием флуоресцентного микроскопа (Keyence Biozero) на длине волны возбуждения 488 нм. Площадь (в мкм) патологических изменений при неоваскуляризации хороидеи измеряли с использованием ПО ImageTool.
Для примеров 7 и 11 (репрезентативных для соединений по настоящему изобретению) в этой модели были получены следующие результаты:
пропотевайте
жидкости через сосуды [оценка HRA]
площадь патологических изменений при неоваскуляризации хороидеи Гмкм5 х 10 000]
Пример 7
(водный носитель; п = 9)
1,49 + 0,24
6,14 + 1,60
Пример 7
(парафиновый носитель; п = 8)
1,52 + 0,21
6,21 ±0,99
Пример 11
(водный носитель; п = 7)
1.66±0,29
5,50 ± 1.38
Пример 11
(парафиновый носитель; и = 12)
1,41+0,29
6,45 ± 1,63
контрольный препарат (водный носитель) (п = 12)
1,87 + 0,27
7,84 ± 1,09
контрольный препарат (парафиновый носитель) (п = П)
1,97 + 0,19
7,00 ± 1,00
Несмотря на то что изобретение описано в связи с конкретными вариантами осуществления, очевидно, что специалист может разработать другие варианты и разновидности изобретения, не отклоняясь от общего смысла и объема настоящего изобретения. Подразумевается, что формула изобретения включает такие варианты осуществления и аналогичные разновидности изобретения.
С. Примеры, относящиеся к фармацевтическим композициям.
Приготовление фармацевтических композиций по настоящему изобретению может быть проиллюстрировано следующим образом.
Стерильный раствор для внутривенного вливания.
С использованием стерильной воды для инъекций получают раствор (5 мг/мл) требуемого соединения по изобретению, и, при необходимости, регулируют рН. Для введения раствор разбавляют до 1-2 мг/мл стерильной 5% декстрозой и вводят в виде инфузии для внутривенного вливания в течение 60 мин.
Лиофилизированный порошок для внутривенного вливания.
Стерильный препарат можно приготовить с использованием: (i) 100-1000 мг требуемого соединения по настоящему изобретению, в виде лиофилизированного порошка, (ii) 32-327 мг/мл цитрата натрия и (ш) 300-3000 мг декстарана 40. Состав ресуспендируют при помощи стерильного солевого раствора для инъекций или 5% декстрозы до концентрации 10-20 мг/мл, затем состав далее разводится солевым раствором или 5% декстрозой до концентрации 0,2-0,4 мг/мл и вводят либо как болюс для внутривенного вливания, либо как инфузия для внутривенного вливания в течение 15-60 мин.
Суспензия для внутримышечного введения.
Для внутримышечного введения может быть приготовлен следующий раствор или суспензия: 50 мг/мл требующегося соединения по изобретению, растворимого в воде; 5 мг/мл натрий-карбоксиметилцеллюлозы; 4 мг/мл Tween 80; 9 мг/мл хлорида натрия, 9 мг/мл бензилового спирта. Твердые капсулы.
Большое количество капсул получают путем наполнения каждой стандартной твердой желатиновой капсулы, состоящей из двух частей, 100 мг порошкообразного соединения по изобретению, 150 мг лактозы, 50 мг целлюлозы и 6 мг стеарата магния.
Мягкие желатиновые капсулы.
Приготавливают смесь требуемого соединения по изобретению в легкоусваиваемом масле, таком как соевое, хлопковое или оливковое масло, и вводят ее при помощи вытеснительного насоса в жидкий желатин для образования мягких желатиновых капсул, содержащих 100 мг активного ингредиента. Капсулы промыли и высушили. Желаемое соединение по изобретению можно растворять в смеси политэти-ленгликоля, глицерина и сорбита для получения смешиваемой с водой смеси лекарственного препарата.
Таблетки.
Большое количество таблеток получают с использованием традиционной технологии, так что каждая единица дозирования содержит 100 мг требующегося соединения по изобретению, 0,2 мг коллоидного диоксида кремния, 5 мг стеарата магния, 275 мг микрокристаллической целлюлозы, 11 мг крахмала и 98,8 мг лактозы. Для улучшения вкусовых качеств, внешнего вида и стабильности или отложенного поглощения могут применяться подходящие водные или неводные покрытия.
Раствор или суспензия для местного применения в глаз (глазные капли).
Стерильный препарат может быть получен с использованием 100 мг/мл требующегося соединения по изобретению в виде лиофилизированного порошка, ресуспендированного в 5 мл стерильного физиологического раствора. В качестве консервантов могут использоваться хлорид бензалкония, тиомерсал, нитрат фенилртути или другие, подобные вещества, в количестве приблизительно 0,001-1 мас.%.
где А означает C-R2, где R2 представляет собой водород, фтор или хлор; R1 представляет собой водород, фтор, хлор, метил, этил или метокси;
Z представляет собой (С1-С4)алкил или (С3-С6)циклоалкил, каждый из которых может быть замещен гидрокси, или
Z представляет собой гетероциклическую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R3 представляет собой водород или гидрокси,
при условии, что, если R3 означает гидрокси, указанный гидрокси не присоединен к кольцевому атому углерода, который расположен вблизи от кольцевого атома азота, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
R4 представляет собой водород, метил, этил, амино или аминометил, или
Z представляет собой группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
представляет собой (С3-С6)циклоалкил или тетрагидропиранил; R6 представляет собой водород или гидрокси; R7 представляет собой водород или гидрокси,
при условии, что, если R7 означает гидрокси, указанный гидрокси не присоединен к кольцевому атому углерода, который расположен вблизи от кольцевого атома азота; Y означает О или NH,
или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат и/или сольват.
2. Соединение формулы (I) по п.1, отличающееся тем, что
А означает C-R2, где R2 представляет собой водород или фтор;
R1 представляет собой водород, фтор, хлор, метил, этил или метокси;
Z представляет собой н-пропил, н-бутил или циклогексил, каждый из которых может быть замещен гидрокси, или
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы
Z представляет собой гетероциклическую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R4 представляет собой метил, этил, амино или аминометил, или Z представляет собой группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R5 представляет собой циклопропил или тетрагидропиран-4-ил;
представляет собой гидрокси; Y означает О,
или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат и/или сольват.
3. Соединение формулы (I) по п.1 или 2, отличающееся тем, что
А означает C-R2, где R2 представляет собой водород или фтор;
R1 представляет собой водород, фтор, метил, этил или метокси;
Z представляет собой 4-гидроксибутил или 4-гидроксициклогексил, или
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы, или Z представляет собой тиазоловую группу формулы
Z представляет собой гетероциклическую группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы; R4 представляет собой метил, этил, амино или аминометил, или Z представляет собой группу формулы
где * указывает точку присоединения пирролотриазиновой группы;
представляет собой циклопропил, или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат и/или сольват.
где Z имеет значение, указанное в пп.1-3,
сочетается с арилбороновой кислотой или эфиром формулы (III)
4. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что бром-пирролотриазин формулы (II)
где А и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3;
R8 представляет собой водород или (С1-С4)алкил, или оба R8 остатка соединены вместе с образованием -(СН2)2-, -С(СН3)2-С(СН3)2-, -(СН2)3- или -СН2-С(СН3)2-СН2- моста,
в присутствии подходящего палладиевого катализатора и основания с получением целевого соединения формулы (I)
где A, Z и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3,
после чего, при необходимости, следует в соответствующих случаях (i) разделение соединений формулы (I) в их соответствующие энантиомеры и/или диастереомеры и/или (ii) конверсия соединений формулы (I) в их соответствующие гидраты, сольваты, соли и/или гидраты или сольваты их солей путем обработки соответствующими растворителями и/или кислотами.
5. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что бром-пирролотриазин формулы (II)
где Z имеет значение, указанное в пп.1-3,
сначала конвертируют в соответствующую бороновую кислоту или производное эфира формулы
(IV)
где Z имеет значение, указанное в пп.1-3;
R9 представляет собой водород или (С1-С4)алкил, или оба R9 остатка соединены вместе с образованием -(СН2)2-, -С(СН3)2-С(СН3)2-, -(СН2)3- или -СН2-С(СН3)2-СН2- моста, которое затем сочетается с арилбромидом формулы (V)
где А и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3, в присутствии подходящего палладиевого катализатора и основания также с получением целевого соединения формулы (I)
Z (I), где A, Z и R1 имеют значения, указанные в пп.1-3,
после чего, при необходимости, следует в соответствующих случаях (i) разделение соединений формулы (I) в их соответствующие энантиомеры и/или диастереомеры и/или (ii) конверсия соединений формулы (I) в их соответствующие гидраты, сольваты, соли и/или гидраты или сольваты их солей путем обработки соответствующими растворителями и/или кислотами.
6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического маку-лярного отека.
7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для производства фармацевтической композиции для лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического макулярного отека.
8. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью ингибиторов ALK1, содержащая соединение по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат и/или сольват, а также одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно содержащая одно или более дополнительных лекарственных средств, обладающих активностью ингибиторов VEGF-опосредованного ангиогенеза или ингибиторов других сигнальных путей.
10. Фармацевтическая композиция по п.8 или 9 для лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваскуляризации, диабетической ретинопатии и диабетического маку-лярного отека.
11. Способ лечения или предупреждения возрастной дегенерации макулы, хороидальной неоваску-ляризации, диабетической ретинопатии и диабетического макулярного отека у млекопитающих, который включает введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества одного или более соединений по любому из пп.1-3 или фармацевтической композиции по п.8 или 9.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023775
023775
- 1 -
- 1 -
(19)
023775
023775
- 1 -
- 1 -
(19)
023775
023775
- 1 -
- 1 -
(19)
023775
023775
- 4 -
- 3 -
023775
023775
- 4 -
023775
023775
- 7 -
- 7 -