|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Применение композиции, содержащей полисахаридную фракцию, полученную из вида Boswellia, для понижающей регуляции/ингибирования PGE2. 2. Применение по п.1, где указанную композицию вводят субъекту, нуждающемуся в этом. 3. Применение по п.2, где субъект представляет собой животное, включая людей. 4. Применение по любому из пп.1, 2 или 3, где указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Применение композиции, содержащей полисахаридную фракцию, полученную из вида Boswellia, для понижающей регуляции/ингибирования PGE2. 2. Применение по п.1, где указанную композицию вводят субъекту, нуждающемуся в этом. 3. Применение по п.2, где субъект представляет собой животное, включая людей. 4. Применение по любому из пп.1, 2 или 3, где указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты.
Евразийское 023717 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201001254
(22) Дата подачи заявки
2010.09.01
(51) Int. Cl.
A61K36/32 (2006.01) A61K 9/00 (2006.01) A61P29/00 (2006.01)
(54) ПРИМЕНЕНИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОНИЖАЮЩЕЙ РЕГУЛЯЦИИ/ИНГИБИРОВАНИЯ PGE2
(31) 61/309,481
(32) 2010.03.02
(33) US
(43) 2012.02.28
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МАДЖИД МУХАММЕД (US)
(72) Изобретатель:
Маджид Мухаммед (US), Пандей Анджали, Бани Саранг (IN)
(74) Представитель:
Харин А.В., Котов И.О. (RU) (56) US-A1-20080275117
YOON T. et al., "Anti-inflammatory activity of methylene chloride fraction from Glehnia littoralis extract via suppression of NF-kappa В and mitogen-activated protein kinase activity". J. Pharmacol Sci. 2010 Jan; 112(1):46-55, реферат, [он-лайн]. Medline PMID: 20093788
US-A1-20030186932
US-B2-7582314
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей полисахаридную фракцию, полученную из вида Boswellia, для понижающей регуляции ингибирования PGE2.
Предшествующий уровень техники
Выживание невозможно без тонкой регуляции иммунной системы. Продуцирование провоспали-тельных цитокинов является критическим физиологическим процессом для управления иммунным и метаболическим ответами в процессе развития, регенерации тканей, заживления, травмы или инфекции и для защиты человеческих организмов от кровотечения, ишемии, рака и сепсиса. Контролируемое продуцирование провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (IL), фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), запускает благоприятные воспалительные ответы, которые стимулируют локальную коагуляцию для сдерживания инфекции и повреждения ткани (Ulloa and Tracey, 2005). Однако неограниченное продуцирование этих цитокинов более опасно, чем исходное повреждение, и является одной из основных причин заболеваемости и смертности человека. Одним из наиболее впечатляющих примеров этого процесса является "тяжелый сепсис", ведущая причина смерти в отделениях интенсивной терапии и одна из основных причин смерти в развитых обществах (Martin et al., 2003). Тяжелый сепсис характеризуется очень интенсивным продуцированием провоспалительных цитокинов, что вызывает системное воспаление, сердечно-сосудистую дисфункцию и летальную полиорганную недостаточность (Van der Poll and Lowry, 1995; Hotchkiss and Karl, 2003; Rice and Bernard, 2005). Этот эффект иллюстрируют исследования, показывающие, что нейтрализация провоспалительных цитокинов (моноклональные антитела анти-TNF и антагонисты рецепторов IL-1) оказалась успешной при воспалительных состояниях, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, анкилозирующий спондилоартрит и псориаз (Feldmann, 2002; Ulloa and Tracey, 2005; Rutgeerts et al., 2006; Ulloa and Messmer, 2006)
Кроме цитокинов, другие медиаторы, такие как гистамин, простагландины, лейкотриены, брадики-нин и т.д., также играют роль в воспалении. Таким образом, они служат в качестве маркеров и полезны при диагностике болезненных состояний, в частности, при тех состояниях, где они присутствуют на повышенных уровнях. Следовательно, регуляция этих маркеров существенна для точного контроля иммунной системы.
Смолистая камедь Boswellia serrata (семейство Burseraceae), известная как "Dhup", индийский ладан или индийская ароматическая смола, имеет долгую историю применения в религиозных обрядах и в парфюмерии. На применения индийского ладана для здоровья, давно известные в аюрведических традициях, обратили внимание в западном мире за последние тридцать лет, что привело в результате к распространенным применениям стандартизованных экстрактов выделяемых веществ смолистой камеди. Такие экстракты используют в качестве ингредиентов в пищевых добавках и в косметике для поддержания здорового старения. Наиболее популярным применением в пищевых добавках являются продукты, поддерживающие здоровье суставов, для поддержания нормальной функции и подвижности суставов.
Полученные недавно научные данные все больше подтверждают эффекты Boswellia serrata для здоровья. Как сообщают, типично выделяемые вещества ароматической смолы Boswellia serrata содержат сесквитерпеновые эфирные масла (8-12 мас.%), полисахариды (45-60 мас.%) и высшие терпеноиды (2535 мас.%). Биомаркерные компоненты смолистой камеди представляют собой группу пентациклических тритерпеновых соединений, известных как босвелловые кислоты.
Показано, что босвелловые кислоты ингибируют фермент 5-липоксигеназу, который катализирует образование провоспалительных лейкотриенов из арахидоновой кислоты. В дополнение к данному механизму босвелловые кислоты также снижают активность фермента человеческой лейкоцитарной эластазы (HLE). Это двойное действие уникально для босвелловых кислот (Safayhi, H. et al., 1997). Поскольку образование лейкотриенов и высвобождение HLE одновременно возрастают в результате стимуляции ней-трофилов при ряде заболеваний человека на базе воспаления и гиперчувствительности, в целом считают, что описанная блокада двух провоспалительных ферментов босвелловыми кислотами и их полезные эффекты на белки комплемента и активность, стабилизирующую мастоциты, могла бы быть обоснованием полезных для здоровья эффектов Boswellia, документированных во множестве доклинических и клинических исследований. Экстракты смолистой камеди Boswellia serrata являются в целом смолистыми по природе, и биомаркерные босвелловые кислоты (липофильные соединения) нерастворимы в воде.
В US 2003/0186932 описана водорастворимая биологически активная фракция, выделенная из выделяемого вещества смолистой камеди Boswellia serrata. В этом документе, кроме того, раскрыто, что комбинация этой фракции и босвелловых кислот в равных соотношениях (1:1) показала аддитивный эффект, но не показала синергический эффект на противоартритную активность.
В US 7582314 описан способ лечения индивидуума, пораженного псориазом, путем введения композиции, содержащей босвелловые кислоты и элементный селен.
В US 2008/0275117 описан способ лечения артрита путем применения композиции, содержащей босвелловые кислоты и/или их ацетаты в количестве выше, чем 65%. Также указано, что эта композиция дополнительно содержит полисахариды и н-октилацетат, инценсол, ацетат инценсола, линалол, борнеол, камфен, элемен, кариофиллен, оксид инценсола, ацетат оксида инценсола или их комбинацию.
Настоящее изобретение охватывает композицию, содержащую фракцию босвелловой кислоты и
полисахаридную фракцию, полученные из вида Boswellia, проявляющую усиление при понижающей регуляции/ингибировании провоспалительных маркеров.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей полисахаридную фракцию, полученную из вида Boswellia, для понижающей регуляции/ингибирования PGE2.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - эффект множества доз фракции босвелловой кислоты, полученной из вида Boswellia, на внеклеточное определение TNF-a и IL-1 р in vivo в сыворотке обработанных мышей balb/c;
фиг. 2 - эффект множества доз полисахаридной фракции, полученной из вида Boswellia, на внеклеточное определение TNF-a и IL-1P in vivo в сыворотке обработанных мышей balb/c;
фиг. 3 - эффект множества доз композиции на внеклеточное определение TNF-a и IL-1P in vivo в сыворотке обработанных мышей balb/c.
фиг. 4 - эффект множества доз фракции босвелловой кислоты, полученной из вида Boswellia, на внеклеточное определение NO in vivo в сыворотке обработанных мышей balb/c;
фиг. 5 - эффект множества доз полисахаридной фракции, полученной из вида Boswellia, на внеклеточное определение NO in vivo в сыворотке обработанных мышей balb/c;
фиг. 6 - эффект множества доз композиции на внеклеточное определение NO in vivo в сыворотке обработанных мышей balb/c;
фиг. 7 - сравнительная противоартритная активность (профилактическая) фракции босвелловой кислоты, полисахаридной фракции и композиции при воспалительном артрите, индуцированном Mycobac-terium tuberculli, у крыс (инъекция в лапу);
фиг. 8 - экспрессия TNF-альфа в надосадочной жидкости из гомогената ткани артритной лапы при воспалительном артрите, индуцированном Mycobacterium tuberculli, у крыс, обработанных фракцией босвелловой кислоты, полисахаридной фракцией и композицией при возрастающих уровнях дозы;
фиг. 9 - экспрессия PGE2 в надосадочной жидкости из гомогената ткани артритной лапы при воспалительном артрите, индуцированном Mycobacterium tuberculli, у крыс, обработанных фракцией босвел-ловой кислоты, полисахаридной фракцией и композицией при возрастающих уровнях дозы;
фиг. 10 - экспрессия LTB4 в надосадочной жидкости из гомогената ткани артритной лапы при воспалительном артрите, индуцированном Mycobacterium tuberculli, у крыс, обработанных фракцией бос-велловой кислоты, полисахаридной фракцией и композицией при возрастающих уровнях дозы;
фиг. 11 - эффект фракции босвелловой кислоты, полисахаридной фракции и композиции на внутриклеточную экспрессию IFNy путем проточной цитометрии в спленоцитах животных с воспалительным артритом, индуцированным Mycobacterium tuberculli;
фиг. 12 - противоартритная активность (терапевтическая) фракции босвелловой кислоты, полисаха-ридной фракции и композиции (эффективная доза) при воспалительном артрите, индуцированном Myco-bacterium tuberculli, у крыс (инъекция в лапу);
на фиг. 13 показано сравнение растворимости в воде фракции босвелловой кислоты и композиции по настоящему изобретению;
фиг. 14 - блок-схема, показывающая стадии получения композиции по настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей полисахаридную фракцию, полученную из вида Boswellia, для понижающей регуляции/ингибирования PGE2. Согласно предпочтительному воплощению композицию, содержащую полисахаридную фракцию необязательно вместе с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, вводят субъекту, нуждающемуся в этом.
Еще в одном другом воплощении настоящего изобретения полисахаридную фракцию получают из вида Boswellia.
Еще в одном другом воплощении настоящего изобретения субъект представляет собой животное, включая людей.
Настоящее изобретение представляет усовершенствование по сравнению с существующими общепринятыми экстрактами Boswellia, обеспечивая изготовителей лучше растворимым в воде вариантом с усиленным потенциалом поддержания здоровья суставов. Композиция дает возможность получить уникальный профиль высвобождения активных ингредиентов. Полисахаридная фракция из смолистой камеди Boswellia serrata обладает биологической активностью и растворима в воде. Полисахаридная фракция усиливает полезную для здоровья роль босвелловых кислот в экстракте, как выявлено в исследованиях in vitro и in vivo, на уровнях выше ожидаемых исключительно для аддитивности.
Камедь Boswellia экстрагируют этанолом и обрабатывают этанольный экстракт кислотой - основанием с последующим промыванием водой с получением фракции босвелловой кислоты. Гексановый остаток (масляную фракцию), полученный в этом процессе, отбрасывают. Выжимки, остающиеся после экстракции камеди Boswellia этанолом, экстрагируют дистиллированной водой и осаждают спиртом с получением полисахаридной фракции.
Полисахаридная фракция содержит галактозу, арабинозу, D-глюкуроновую кислоту и 4-O
метилглюкуроноарабиногалактан.
Композиция может необязательно содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, выбранные из группы, включающей антиадгезивы, связующие агенты, покровные вещества, разрыхлители, наполнители и разбавители, корригенты, красители, агенты, способствующие скольжению, смазывающие агенты, консерванты, сорбенты, подсластители и их комбинации.
Композицию по настоящему изобретению включают в лекарственные формы, выбранные из группы, включающей жидкость, пастилки, лепешки, порошок, гранулу, капсулу, таблетку, пластырь, гель, эмульсию, крем, лосьон, средство для чистки зубов, капли, суспензию, сиропы, эликсиры, фитоцевтиче-ские и нутрицевтические препараты.
Композиция была протестирована на ее потенциал для ингибирования/понижающей регуляции/снижения уровней провоспалительных маркеров, таких как TNF-a, ИЛ-р, оксид азота, ИФН-у, PGE2
и LTB4.
TNF-a (фактор некроза опухоли альфа) представляет собой цитокин, вовлеченный в системное воспаление, и стимулирует реакцию острой фазы. Регуляция продуцирования TNF вовлечена в ряд заболеваний человека, а также рак. Она играет очень важную роль в патогенезе септического шока, индуцированного ЛПС.
IL-1 р является одним из наиболее сильных провоспалительных цитокинов, вовлеченных как в физиологические иммунные ответы, так и в развитие различных иммунопатологических расстройств. Проверка уровней IL-1 р полезна при мониторинге и диагностике различных заболеваний, включая воспалительные, иммунологические и костные заболевания.
Оксид азота.
Соответствующие уровни продуцирования оксида азота важны при защите органа, такого как печень, от ишемического повреждения. Однако пролонгированные уровни продуцирования NO приводят в результате к прямой тканевой токсичности и вносят вклад в сосудистый коллапс, связанный с септическим шоком. Хроническая экспрессия NO связана с различными карциномами и воспалительными состояниями, включая ювенильный диабет, рассеянный склероз, артрит и неспецифический язвенный колит.
Вследствие понижающей регуляции/снижения цитокинов или других медиаторов композиция находит потенциальное применение при лечении различных заболеваний/расстройств, проявляющих их повышенные уровни, таких как артрит, неспецифический язвенный колит, воспалительный кишечный синдром (ВКС), астма (дыхательные расстройства) и т.д.
Изобретение дополнительно конкретизировано с помощью приведенных ниже примеров. Однако эти примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Оценка биологической активности.
Исследование острой безопасности.
Исследования острой пероральной токсичности проводили, следуя указаниям OECD No.423 [указания Организации экономического сотрудничества и развития OECD для тестирования химических веществ. Guideline 423, способ определения острой пероральной токсичности - класса острой токсичности, утвержден 22 марта 1996 г.] у мышей. Животных наблюдали индивидуально периодически в течение первых 24 ч, уделяя особое внимание в течение первых 4 ч, а затем ежесуточно, суммарно в течение 14 суток, одновременно. Однократная доза 2000 мг/кг р.о. композиции, вводимая перорально каждой группе самок мышей, не показала какого-либо изменения в массовом общем поведении этих подопытных животных. Также оценивали однократную дозу 5000 мг/кг р.о. Ни смертности, ни какого-либо изменения в нормальном поведении подопытных животных по сравнению с контрольной группой носителя не наблюдали при данной высокой пероральной дозе.
Исследования in vitro.
Пример 1. Внутриклеточная оценка in vitro TNF-a в нейтрофилах мышей.
Тестируемые вещества подвергали исследованию in vitro, где проводили исследования проточной цитометрии для определения эффекта многократных доз фракции босвелловых кислот, полисахаридной фракции и композиции по изобретению на внутриклеточную экспрессию цитокина TNF-a в нейтрофилах мышей, выделенных из цельной крови с помощью градиента Гистопак.
Клетки стимулировали ЛПС и инкубировали с тестируемыми веществами в градиенте концентраций (мкг/мл) в течение 3 ч в СО2 инкубаторе. К клеткам добавляли пермеабилизирующий раствор, а затем их инкубировали в течение 10 мин. Затем клетки метили конъюгированным моноклональным антителом против мышиного TNF-a, и следующую инкубацию 30-минутной продолжительности проводили в темноте. После отмывки физиологическим раствором, забуференным фосфатом, образцы считывали непосредственно на проточном цитофлуориметре BD-Cantoll (Beckton-Dickinson Biosciences, CA, USA). Запуск флуоресценции был установлен на параметр FL1 селектированных популяций нейтрофилов (10000 случаев), и компенсацию флуоресценции, анализ данных и представление данных проводили, используя программное обеспечение Cell Quest Pro. [Clara, В., R.C Arancha, G.M. Andre's, P. Atanasio, A. Julia, and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-a-secreting cells using direct immunofluorescence
surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264:77-87] [Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani, Subhash С. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-a cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 2009, 19391943]. Ha основании результатов, приведенных в табл. 1-3 (исследования проточной цитометрии), понятно, что композиция проявляла максимальный ингибиторный эффект на секрецию цитокина TNF-a в мышиных изолированных нейтрофилах в ответ на стимулятор ЛПС по сравнению с фракцией босвелло-вой кислоты и полисахаридной фракцией отдельно. Нейтрофилы, обработанные in vitro концентрациями 25, 50, 100, 200, 400 и 800 мкг/мл фракции босвелловых кислот, полисахаридной фракции и композиции, проявляли 30,52, 29,31 и 59,83% подавления TNF-a при уровне дозы 200 мкг/мл соответственно. Эти данные четко свидетельствуют о том, что композиция при одном и том же уровне дозы проявляет повышенную активность при подавлении TNF-a по сравнению с отдельными фракциями.
Таблица 1
Эффект множества доз фракции босвелловой кислоты, полученной из вида Bоswellia, на экспрессию внутриклеточного TNF-a в нейтрофилах мыши
Исследования in vivo.
Пример 2. Внеклеточное определение in vivo TNF-a, IL-1 бета и оксида азота (NO) в сыворотке от обработанных мышей.
Самцов мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель держали при 22±2°С при световом цикле 12/12 ч. Мыши получали пероральную обработку 100, 200, 400 мг/кг различных тестируемых веществ (мас./об.), то есть фракции босвелловой кислоты, полисахаридной фракции и композиции по настоящему изобретению, в течение 6 суток с последующей внутривенной инъекцией 1 мг/кг ЛПС согласно способу, описанному Brieva et al. 2001 [Brieva A., Guerrero A., Alonso-Lebrero J.L. and Pivel J.P. 2001, Inmunoferon, a gly-coconjugate of natural origin, inhibits LPS-induced TNF-a production and inflammatory responses. International. Immunopharmacology 1, 1979-1987]. В каждой группе использовали шесть мышей и эксперименты проводили в трех повторах. Продуцирование TNF-a, IL-1 бета и оксида азота оценивали с помощью коммерческих наборов для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (R &D Systems) в сыворотке от каждой подопытной группы обработанных мышей через 90 мин после инъекции ЛПС. Ролипрам в дозе 30 мг/кг использовали в качестве стандартного лекарственного средства. Сбор сыворотки и измерения выявили значительное снижение в уровнях сывороточного TNF-a, IL-1 бета и NO, что позволяет предположить широкую независимую от вида эффективность in vivo для фракции босвелловой кислоты, полисахаридной фракции и композиции при контроле воспалительного ответа. Все вместе эти данные позволяют предположить регуляторную роль композиции в ответ на повышенную концентрацию ЛПС в крови не только в уровне продуцирования TNF-a, но это было дополнительно подтверждено более значительно сниженными уровнями IL-1 бета, другого провоспалительного цитокина, и NO у мышей после провокационной пробы ЛПС, чем наблюдали для фракции босвелловой кислоты и полисахаридной фракции отдельно (фиг. 1-6). Ролипрам при уровне дозы 30 мг/кг использовали в качестве стандартного лекарственного средства для наблюдения аутентичности и воспроизводимости схемы эксперимента.
Чтобы показать, что композиция действует при болезненном состоянии, было проведено нижеописанное исследование. Болезненным состоянием, выбранным для исследования, является артрит.
Пример 3. Индуцированный адъювантом развивающийся воспалительный артрит.
В исследовании использовали крыс линии Вистар в возрасте 12-14 недель, масса тела 140-160 г, в группах по 6. Всех животных содержали в пластмассовых клетках при 22±2°С при световом цикле 12 ч света/темноты и свободном доступе к гранулированному корму и воде. Тестируемые вещества вводили перорально один раз в сутки на протяжении всего эксперимента. Во всех экспериментах содержали контрольную группу (которой вводили носитель), тогда как другая группа получала стандартное лекарственное средство ацетилсалициловую кислоту (АСК), вводимую раз в сутки, для сравнения и аутентичности/надежности теста. Все исследование проводили после получения одобрения от ведомственного Комитета по этике исследований на животных, и все животные, используемые в экспериментальной работе, получали гуманный уход. Вычисляли среднее и стандартную ошибку среднего (СО) для каждой группы, и результаты выражали в процентах ингибирования по сравнению с контрольной группой. Значимость определяли статистически путем применения t-критерия Стьюдента.
Адъювантный артрит индуцировали путем подподошвенной инъекции 0,05 мл свежеприготовленной суспензии (5,0 мг/мл) убитых паром Mycobacterium tuberculosis в жидком вазелине [Newbould В.В. Chemotherapy of arthritis induced in rats by mycobacterial adjuvant. Br J. Pharmacol. 1963; 21:127-36]. Объем
инъецированных лап определяли количественно до инъекции адъюванта и на 14 сутки после нее и измеряли с помощью дифференциальной модели измерения объема LE 7500N, Panlab, Испания.
Фракция босвелловой кислоты, полисахаридная фракция и композиция показали дозозависимое ин-гибирование отека при уровне дозы 200 мг/кг перорально (фиг. 7 и табл. 4). Композиция показала активность высокой значимости 48% ингибирования отека по сравнению с контролем индуцированного My-cobacterium tuberculli воспалительного артрита у крыс.
Таблица 4
Сравнительная противоартритная активность (профилактическая) фракции
босвелловой кислоты, полисахаридной фракции и композиции по настоящему
изобретению при индуцированном Mycobacterium tuberculli воспалительном
артрите у крыс (инъекция в лапу)
Пример 4. Гомогенизация ткани лапы с развивающимся воспалительным артритом на сутки 14.
Перед гомогенизацией для каждого анализа замороженную лапу, содержащую костную ткань, взвешивали и разбивали на кусочки на сухом льду. Ткани лапы добавляли к 4 мл/г ткани буфера для экстракции, содержащего 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 1 мг/мл апротинина и 0,05% Твин 20 в физиологическом растворе, забуференном фосфатом. Ткани гомогенизировали на льду гомогенизатором Polytron, и гомогенат центрифугировали при 5000 g в течение 15 мин. Надосадочные жидкости хранили при -80°С до анализа [Anjali Pandey, Sarang Bani, Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues; Cytokine 49 (2010) 114-121].
Количественное определение TNF-a, PGE2 и LTB4 в надосадочной жидкости гомогената ткани.
Образцы на сутки 14 от различных групп животных готовили для анализа цитокиновых медиаторов, как описано выше. TNF-a, PGE2 и LTB4 определяли, используя имеющиеся в продаже наборы, основанные на методах сэндвич-анализа и конкурентного анализа ELISA (R &D Systems, MN, USA), в соответствии с инструкциями изготовителя. Все определения концентрации цитокинов проводили с помощью колориметрического измерения при 450 нм на считывающем устройстве для планшетов ELISA (Multiskan, Thermo Electron Corporation, MA, USA) путем интерполяции со стандартной кривой [Anjali Pandey, Sarang Bani, Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues; Cytokine 49 (2010) 114-121] [Magari K., Mi-yata S., Ohkubo Y., Mutoh S. Inflammatory cytokine levels in paw tissues during development of rat collagen-induced arthritis: effect of FK506, an inhibitor of T cell activation. Inflamm. Res. 2004; 53:469-74]. Фракция босвелловой кислоты показала значимое снижение TNF-a и LTB4, но отсутствие эффекта на PGE2 у животных, пораженных артритом. Полисахаридная фракция показала умеренное снижение уровней TNF-a и PGE2 при отсутствии значимого ингибирования LTB4, тогда как композиция значимо дозозави-симо снижала уровни TNF-a, PGE2 и LTB4, показывая максимальное ингибирование при пероральной
дозе 200 мг/кг (фиг. 8-10).
Обнаружение того, что полисахаридная фракция проявляла ингибиторный эффект на PGE2, является неожиданным открытием настоящего изобретения и, следовательно, является новым. На основании настоящего исследования очевидно, что только одна полисахаридная фракция или в комбинации с бос-велловыми кислотами полезна при ингибировании PGE2 на умеренных уровнях в отличие от других лекарственных средств, известных в данной области техники, обладающих побочными эффектами за счет высоких уровней ингибирования PGE2.
Пример 5. Внутриклеточное обнаружение IFN-у с помощью проточной цитометрии в спленоцитах.
Этиологическая причина артрита четко не установлена, но кумулятивные данные позволяют предположить, что опосредованные Т-клетками аутоиммунные ответы играют критическую роль в его патогенезе [Panayi G.S. T cell-dependent pathways in rheumatoid arthritis. Cur Opin. Rheumatol. 1977; 9:236-40]. Для повышения специфичности терапий артрита акцент сдвинут на направленность на цитокины. По-видимому, IFN-продуцирующие клетки Th1 являются стержневыми в развитии артрита как у людей, так и в животных моделях [Garra О. Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T helper cell subsets. Immunity 1998; 8:275-83]. Таким образом, недавние терапевтические стратегии сфокусированы на модулировании ответа Th1 клеток. Фармакодинамические исследования указывают на модулирование Th1/Th2 как на возможный механизм действия цитокиновой терапии при многих болезненных состояниях [Lissoni P., Malugani F., Malysheva О. Neuroimmunotherapy of untreatable metastatic solid tumors with subcutaneous low-dose, interleukin-2, melatonin and naltrexone, modulation of interleukin-2-induced antitumor immunity by blocking the opoid system. Neuroendocrinol Lett, 2002; 23: 341-4] [Tabata N., Tagami H., Terui T. Dehydroepiandrosterone may be one of the regulators of cytokine production in atopic dermatitis. Arch Der-matol Res, 1997; 289: 410-4]. Cell mediated immune responses play an important role during the development of arthritis [Waksman B.H., Pearson C.M., Sharp J.T. Studies of arthritis and another lesions induced in rats by injection of mycobacterial adjuvant-II: evidence that the disease is a disseminated immunologic response to exogenous antigen. J. Immunol., 1960; 85:403-17], и ингибирование этого ответа, в частности IFN-у, продуцируемого CD4+ Т-клетками, проявляет сильную корреляцию композиции, обладающей противоартритной активностью. Композиция проявляла дозозависимое ингибирование IFN-у, продуцируемого CD4+ Т-клетками.
Селезенки собирали от животных всех подопытных групп в асептических условиях в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS, Sigma) до получения гомогенной клеточной суспензии, и эритроциты лизировали лизирующим раствором FACS. После центрифугирования (380 g при 4°С в течение 10 мин) осажденные клетки промывали три раза в ФСБ (фосфатно-солевой буфер) и ресуспендировали в полной среде [RPMI 1640 с добавлением 12 мМ Hepes (pH 7,1), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% ФТС (фетальная телячья сыворотка)]. Число клеток считали гемоцитометром методом исключения красителя трипанового синего. Жизнеспособность клеток превышала 95%. Кратко, спленоциты высевали в 96-луночный микротитрационный планшет с плоским дном (Nunc) при 2х106 клеток/мл. После 3 суток лимфоциты селезенки окрашивали 5 мкл ФЭ (фикоэрит-рин), конъюгированного антитела против мышиного IFN-у, и инкубировали в течение 30 мин при 4°С в присутствии 1 мкл пермеабилизирующего раствора FACS. Анализ проводили на проточном цитофлуо-риметре (BD, LSR), используя программное обеспечение Cell Quest Pro [Anjali Pandey, Sarang Bani, Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxy-chavicol in adjuvant induced arthritic tissues; Cytokine 49 (2010) 114-121]. Авторы изобретения культивировали спленоциты с флуорохромами для оценки внутриклеточного содержания цитокинов. Предсказуемо авторы изобретения отметили более высокий процент экспрессии 26,74% IFN-у в контрольной группе артрита. Для выяснения характеристик подгрупп лимфоцитов, продуцирующих цитокины, относящиеся к IFN-у, авторы изобретения исследовали клетки, продуцирующие IFN-у, среди CD4+ Т-клеток. Авторы изобретения отметили достаточно более низкий уровень внутриклеточного IFN-у для спленоцитов, обработанных фракцией босвелловых кислот, полисахаридной фракцией и композицией в возрастающих дозах. Максимальное подавление наблюдали в группе, обработанной композицией в дозе 200 мг/кг р.о.
(фиг. 11).
Пример 6. Адъювантный установленный воспалительный артрит.
Артрит индуцируют инъекцией убитых Mycobacterium tuberculosis в масле в подподошвенную область левой задней лапы, как упомянуто выше. Заболевание развивается в течение первых 14 суток. В течение этого периода никакие лекарственные средства не дают. Начиная с суток 15, лекарственные средства вводят животным перорально вплоть до суток 28. Данный тест показывает терапевтический потенциал тестируемого вещества при установленном артрите [Newbould, В.В., 1969. The pharmacology of fenclozic acid 2-(-4-chlorophenyl) theazol-4-ylactic acid: I.C.I. 54,450; Myalex: a new compound with antiinflammatory, analgesic and anti-pyretic activity, British Journal of Pharmacology, 35,189-197]. Абсолютное ингибирование отека наблюдали у животных, обработанных фракцией босвелловой кислоты, полисаха-ридной фракцией и композицией по настоящему изобретению. Однако композиция показала наиболее значительный эффект (абсолютное ингибирование отека) у крыс с установленным артритом (фиг. 12).
Таким образом, результаты в целом указывают на то, что композиция по настоящему изобретению проявляет значительно большее ингибирование мишеней, чем фракция босвелловой кислоты и полиса-харидная фракция отдельно. Максимальный эффект in vitro был при 100 и 200 мкг/мл, а максимальный эффект in vivo был при дозе 100 и 200 мг/кг массы тела животного/р.о./ежесуточная обработка подопытных животных.
Композиция предлагается в дозировке вплоть до 500 мг, от 2 до 3 раз в сутки индивидууму, нуждающемуся в этом.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Фиг. 3
1. Применение композиции, содержащей полисахаридную фракцию, полученную из вида Boswellia, для понижающей регуляции/ингибирования PGE2.
2. Применение по п.1, где указанную композицию вводят субъекту, нуждающемуся в этом.
3. Применение по п.2, где субъект представляет собой животное, включая людей.
4. Применение по любому из пп.1, 2 или 3, где указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023717
023717
- 1 -
- 1 -
(19)
023717
023717
- 1 -
- 1 -
(19)
023717
023717
- 2 -
- 1 -
(19)
023717
023717
- 4 -
- 3 -
023717
023717
- 8 -
023717
023717
- 8 -
023717
023717
- 11 -
- 11 -
|
