[RU]

1. Способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ , включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (PhtX) человеку, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.

2. Способ по п.1, где концентрация свободного Zn ²⁺ или Mn ²⁺ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.

3. Способ по п.1, где концентрация Zn ²⁺ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.

4. Способ по любому из пп.1-3, где уровни Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.

5. Способ по любому из пп.1-4, где человек страдает от стресса.

6. Способ по любому из пп.1-5, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.

7. Способ по любому из пп.1-6, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.

8. Способ по п.7, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.

9. Применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка PhtX в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ , где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.

10. Применение по п.9, где концентрация Zn ²⁺ или Mn ²⁺ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.

11. Применение по п.9, где концентрация Zn ²⁺ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.

12. Применение по любому из пп.9-11, где уровни Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или крови.

13. Применение по любому из пп.9-12, где человек страдает от стресса.

14. Применение по любому из пп.9-13, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.

15. Применение по любому из пп.9-14, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.

16. Применение по п.15, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ , включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (PhtX) человеку, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.

2. Способ по п.1, где концентрация свободного Zn ²⁺ или Mn ²⁺ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.

3. Способ по п.1, где концентрация Zn ²⁺ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.

4. Способ по любому из пп.1-3, где уровни Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.

5. Способ по любому из пп.1-4, где человек страдает от стресса.

6. Способ по любому из пп.1-5, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.

7. Способ по любому из пп.1-6, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.

8. Способ по п.7, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.

9. Применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка PhtX в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ , где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.

10. Применение по п.9, где концентрация Zn ²⁺ или Mn ²⁺ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.

11. Применение по п.9, где концентрация Zn ²⁺ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.

12. Применение по любому из пп.9-11, где уровни Zn ²⁺ и/или Mn ²⁺ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или крови.

13. Применение по любому из пп.9-12, где человек страдает от стресса.

14. Применение по любому из пп.9-13, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.

15. Применение по любому из пп.9-14, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.

16. Применение по п.15, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.

---

Евразийское
патентное
ведомство
023702
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201290689
(22) Дата подачи заявки 2011.03.08
(51) Int. Cl.
A61K39/09 (2006.01) A61P31/04 (2006.01)
(54)
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИНФЕКЦИИ STREPTOCOCCUS PNEUMONIA И ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКА PhtX
(31) 1003920.4
(32) 2010.03.09
(33) GB
(43) 2013.08.30
(86) PCT/EP2011/053485
(87) WO 2011/110570 2011.09.15
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ГЛАКСОСМИТКЛАЙН БАЙОЛОДЖИКАЛС С.А. (BE)
(72) Изобретатель:
Деноэль Филипп, Эрман Филипп Винсент (BE), Лабб Стив (CA), Пулман Ян, Риу Стефан (BE)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(56) WO-A2-0037105 WO-A2-0039299 WO-A1-2009012588 WO-A1-0114421 WO-A2-0198334 WO-A2-03054007 WO-A2-0222168
OGUNNIYI ABIODUN D. ET AL.: "Pneumococcal histidine triad proteins are regulated by the Zn2+-dependent repressor AdcR and inhibit complement deposition through the recruitment of complement factor H", FASEB JOURNAL, vol. 23, no. 3, March 2009 (2009-03), pages 731-738, XP002638845, ISSN: 0892-6638, abstract
LOISEL E. ET AL.: "AdcAII, A New Pneumococcal Zn-Binding Protein Homologous with ABC Transporters: Biochemical and Structural Analysis", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 381, no. 3, 5 September 2008 (2008-09-05), pages 594-606, XP023315419, ISSN: 0022-2836, DOI: DOI:10.1016/J.JMB.2008.05.068 [retrieved on 2008-06-03], abstract
(57) В настоящем изобретении раскрыт способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn2+ и/или Mn2+, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (PhtX) человеку, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. В изобретении также раскрыто применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка PhtX в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения такой инфекции.
Настоящая заявка относится к области вакцин и иммуногенных композиций, обеспечивающих защиту от стрептококкового заболевания, и, в частности, к способам лечения заболевания, обусловленного Streptococcus pneumoniae, с использованием вакцин, содержащих белки семейства полигистидиновой триады (polyhistidine triad family), и, в частности, к способам лечения с использованием этих вакцин и иммуногенных композиций.
Предшествующий уровень техники
Streptococcus pneumoniae является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности от инфекций во всем мире, приводя к широкому спектру инфекционных заболеваний, таких как средний отит, пневмония, бактериемия и менингит {Hausdorff, 2005, McCullers, 2001}. Появление антибиотикорези-стентных штаммов этого микроорганизма дополнительно подчеркивает необходимость обеспечения эффективной профилактической вакцинации {Lynch, III, 2005, Bridy-Pappas, 2005}.
Современные вакцины состоят из наборов капсульных полисахаридов пневмококков, основанных на эпидемиологически доминантных серотипах, возможно конъюгированных с белком-носителем {Da-gan, 2004, Fedson, 2004, Mbelle, 1999, Smart, 1987}. Тем не менее, вакцинные композиции не включают все серотипы данного микроорганизма, что может иметь особое значение в определенных географических областях, где доминируют другие серотипы {Dagan, 1992}. Кроме того, можно ожидать, что применение серотип-специфичных вакцин может со временем привести к положительной селекции не входящих в вакцины серотипов {Nunes, 2008, Singleton, 2007}.
Альтернативный способ включает разработку вакцин, обеспечивающих иммунитет против антигенов, общих для всех пневмококков. Среди множества возможных вариантов следует отметить семейство белков полигистидиновой триады (polyhistidine triad family, Pht-семейство), ограниченное родом Streptococcus, включающее несколько перспективных кандидатов, высококонсервативных у всех разновидностей пневмококков {Hamel, 2004, Zhang, 2001} и являющихся мишенями антител у инфицированных индивидов, а также обеспечивающих защитный эффект при заражении иммунизированных мышей {Beghetto, 2006}. Исходно о данном семействе белков независимо сообщили три группы, используя три разных обозначения: Pht (для пневмококковой гистидиновой триады (pneumococcal histidine triad)) {Adamou, 2001}, Php (для пневмококкового гистидинового белка (pneumococcal histidine protein)) {Zhang, 2001} и BVH {Hamel, 2004}. Для этих белков характерен мотив "гистидиновая триада", НххНхН, повторяющийся в их аминокислотных последовательностях пять-шесть раз. Описано четыре представителя данного семейства: PhtA (BVH-11-3), PhtB (PhpA/BVH-11) и PhtD (BVH-11-2), идентичность последовательностей которых достигает 81%, и PhtE (BVH-3), отличающийся от трех других белков, идентичность которого указанным трем белкам достигает лишь 35%. Он является более крупным белком, единственным белком Pht-семейства с шестью повторами мотива "гистидиновая триада". В исследованиях иммунизации на мышах было показано, что все представители Pht-семейства позволяют обеспечить высокий уровень защиты от последующего инфицирования пневмококками нескольких различных штам-мов/серотипов {Adamou, 2001, Hamel, 2004, Ogunniyi, 2007, Wizemann, 2001, Zhang, 2001}.
Несмотря на их возможное значение при вакцинации против S. pneumoniae, биологическая функция этих белков пока не установлена. Результаты экспериментов с применением мечения антителами и проточной цитометрии продемонстрировали, что Pht-белки расположены на поверхности инкапсулированной бактерии {Hamel, 2004}, что подтверждает их значение в качестве мишени при вакцинации. По результатам инсерционного мутагенеза с мечеными вставками (signature-tagged mutagenesis) было сделано предположение, что PhtA, PhtB и PhtD вовлечены в легочную вирулентность {Hava, 2002}, без дальнейшего указания их биологической функции. Также было сделано предположение, что, помимо других предполагаемых функций, они могут нейтрализовать С3b-компонент комплемента {Hostetter, 1999, Ogunniyi, 2009}, что подразумевает их противодействие фагоцитозу. Кроме того, предполагают, что они играют роль при адгезии. Действительно, было сообщено о генетической связи phtD и Imb {Panina, 2003}, где Imb кодирует предполагаемый ламининовый белок адгезии {Spellerberg, 1999}. В завершение, ввиду большого количества гистидиновых остатков в гистидиновых триадах было высказано предположение, что Pht-белки могут быть вовлечены в связывание ДНК и/или металлов {Adamou, 2001}. Конкретнее, в некоторых исследованиях была показана связь Pht-семейства и цинка. Действительно, в расположенных ближе к 3'-концу областях генов pht были обнаружены сайты связывания AdcR, описанные как транскрипционные факторы, регулирующие проникновение цинка в клетку {Panina, 2003}. Кроме того, кристаллическая структура части PhtA указывает на присутствие ионов цинка, связанных с доменом, содержащим гистидиновые триады {Riboldi-Tunnicliffe, 2005}. Тем не менее, не ясно, является ли связывание или транспорт цинка функцией этих белков, или вместо этого цинк играет конформацион-ную или функциональную роль.
Важными аспектами белков-кандидатов для использования в вакцинах, которые необходимо рассмотреть, являются уровень их экспрессии и связанная с этим регуляция, их распространенность, а также вариабельность их последовательности. По этой причине, авторы изобретения рассмотрели эти различные аспекты Pht-белков.
Streptococcus pneumoniae является причиной различных болезненных состояний, приводя к разным заболеваниям в зависимости от места размножения популяции пневмококков. При проникновении S.
pneumoniae в кровоток развивается септицемия, в то время как при размножении S. pneumoniae в легком развивается пневмония. S. pneumoniae является также важным патогеном при инфекциях, приводящих к среднему отиту. S. pneumoniae может также проникать в спинномозговую жидкость, приводя к развитию менингита.
Существует потребность в разработке усовершенствованных пневмококковых вакцин, способных обеспечить иммунитет против конкретных пневмококковых заболеваний и оптимальную защиту от определенной формы пневмококкового заболевания.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn2+ и/или Mn2+, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (PhtX) человеку, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.
В одном воплощении предложенного способа концентрация свободного Zn2+ или Mn2+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.
В другом воплощении предложенного способа концентрация Zn2+ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.
В еще одном воплощении предложенного способа уровни Zn2+ и/или Mn2+ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.
В других воплощениях предложенного способа человек страдает от стресса, нескольких бактериальных инфекций или хронической бактериальной инфекции, причем в более предпочтительном воплощении хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.
Согласно настоящему изобретению также предложено применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка PhtX в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn2+ и/или Mn2+, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.
В одном воплощении предложенного применения концентрация Zn2+ или Mn2+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.
В другом воплощении предложенного применения концентрация Zn2+ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.
В еще одном воплощении предложенного применения уровни Zn2+ и/или Mn2+ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.
В других воплощениях предложенного применения человек страдает от стресса, нескольких бактериальных инфекций или хронической бактериальной инфекции, причем в более предпочтительном воплощении хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Структура генов pht у Streptococcus pneumoniae, серотип 4, штамм TIGR4. kbp - тысяча пар оснований (т.п.о.); bp - пара оснований (п.о.).
Фиг. 2. Промоторсодержащие 3'-области генов pht. (а) Ген phtE, (б) ген phtA, (в) ген phtB, (г) ген Imb, (д) ген yfnA. Области -35 и -10 подчеркнуты двойной линией, сайты начала транскрипции выделены жирным шрифтом и обозначены символом предполагаемые сайты связывания рибосом (rbs) подчеркнуты, и открытые рамки считывания обозначены стрелками, указывающими направление транскрипции, над последовательностью, показанной жирным шрифтом. Цифры, приведенные слева, соответствуют положениям в последовательностях с регистрационными номерами в GenBank AY569979 (а, г и д) и AY569980 (б и в).
Фиг. 3. Последовательности Rho-независимых терминаторов транскрипции генов pht и ptsI. (а) Ген phtE, (б) ген phtB, (в) ген phtD, (г) ген phtA и (д) ген pstI. Стоп-кодоны подчеркнуты жирным шрифтом, терминаторные области подчеркнуты, и последовательности, подчеркнутые прерывистой линией, обозначают шпилечные области (hairpin region) терминаторов. Открытые рамки считывания обозначены стрелками, указывающими направление транскрипции, над последовательностью, показанной жирным шрифтом. В (а) область, выделенная курсивом (ген phtF; предполагаемый стартовый кодон подчеркнут двойной линией), на 78% идентична первой 481 паре оснований (п.о.) гена phtE. Тем не менее, подчеркнутые стоп-кодоны по существу предотвращают трансляцию гена. Цифры соответствуют положениям в последовательностях с регистрационными номерами в GenBank AY569979 (а и в) и AY569980 (б, г и д).
Фиг. 4. Анализы pht-транскриптов полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). (а) 1% агарозный гель, на котором показаны продукты ОТ-ПЦР, причем исходная РНК выделена из клеток, культивированных до середины логарифмической фазы роста. Дорожки 1-8 соответствуют областям 1-8 на схематическом изображении (б). Продукты ОТ-ПЦР, показанные на дорожках 1-8, были получены с использованием пар праймеров, фланкирующих соответствующие области, показанные на схеме. Длина каждого предполагаемого продукта ОТ-ПЦР указана в скобках. bp - п.о.
Фиг. 5. Иммуноблоттинг бактериальных экстрактов с применением электрофореза в полиакрила
мидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Для исследования экстрактов, полученных от штамма с мутацией четырех генов PhtABDE- (А), мутантного штамма PhtE- (Б), мутантного штамма PhtD- (В), мутантного штамма PhtB- (Г), мутантного штамма PhtA- (Д) и штамма дикого типа (Е), использовали антитело против PhtD. Расположение полос различных Pht-белков показано справа, и отметка молекулярной массы показана в левой части изображения.
Фиг. 6. Кривые роста штамма дикого типа 4/CDC и мутантных Pht-дефицитных штаммов в среде MS (а). Также определяли кривые роста штаммов дикого типа, PhtD-дефицитного штамма и штамма с мутацией четырех pht-генов в среде MS самой по себе или с Zn2+, 200 мкМ (б), Mn2+, 200 мкМ (в), или Fe2+, 200 мкМ (г). На каждом графике показаны результаты одного эксперимента, отражающего результаты трех экспериментов. OD546 - оптическая плотность при 546 нм.
Фиг. 7. Бактериальные клетки WU2 культивировали с 30 мкМ ^^№,№-тетракис(2-пиридилме-тил)этилендиамина (TPEN), хелатора цинка, или без него. Затем, перед анализом клеток проточной ци-тометрией, их обрабатывали антителами против PhtB/D (а), против PhtE (б), против PhtD/E (в) или против полисахарида 3 типа (г) с последующей обработкой вторичным козьим противомышиным антителом, конъюгированным с AlexaFluor. В качестве контролем клетки инкубировали с вторичным конъюгиро-ванным антителом. Показаны репрезентативные диаграммы, полученные сортировкой клеток с возбуждением флуоресценции (FACS, FACS-диаграммы), в разных условиях.
Фиг. 8. Вестерн-блоттинг. Проводили SDS-PAGE экстрактов, полученных из целых клеток, с последующим иммуноблоттингом. Девять разных штаммов обрабатывали поликлональным антителом против PhtD (а) и 8 штаммов обрабатывали поликлональным антителом против PhtE (б). Показаны маркеры молекулярной массы (М).
Фиг. 9. Сравнение сигнальных последовательностей представителей семейства PhtX. В закрашенных областях указаны аминокислоты, консервативные у по меньшей мере 2/3 представителей семейства
PhtX.
Фиг. 10. Выживаемость мышей после летального интраназального заражения S. pneumoniae. Перед заражением пневмококковым штаммом типа 3/43 мышей (n = 20 на группу) иммунизировали PhtD, PhtA, PhtB, PhtE, все с адъювантом AS02, или AS02 самим по себе (контроль). Статистические анализы проводили с применением логарифмического рангового критерия в сравнении с контролем: PhtD, р = 0,0126; PhtA, р = 0,0103; PhtB, p = 0,0038; PhtE, р = 0,0033.
Фиг. 11. Уровни антител после иммунизации. А) Мышей иммунизировали системно CbpA, PspA или PhtD, все с адъювантом AS02. Б) Мышей иммунизировали интраназально CbpA, PspA или PhtD, все с адъювантом LT. В обоих случаях образцы крови получали на 42 сутки и уровни специфичных антител измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA). IgG - иммуноглобулин G; GMT - среднегеометрические титры; CI -доверительный интервал.
Фиг. 12. Выживаемость мышей после летального интраназального заражения S. pneumoniae. Перед заражением пневмококковыми штаммами типа 2/D39 (А), типа 3/43 (Б) или типа 4/CDC (В) мышей иммунизировали CbpA, PspA, PhtD, все с адъювантом AS02, или AS02 самим по себе (контроль). Статистические анализы проводили с применением логарифмического рангового критерия в сравнении с контролем: (A) CbpA, p = 0,0002; PspA, p = 0,0001; PhtD, р = 0,0009; (Б) CbpA, p = 0,885; PspA, p = 0,184; PhtD, p = 0,027; (В) CbpA, p = 0,825; PspA, p = 0,538; PhtD, p < 0,0001.
Фиг. 13. Эффективность вакцин в модели колонизации носоглотки S. pneumoniae. Перед интрана-зальным заражением пневмококковым штаммом 2/D39 мышей Balb/c иммунизировали PhtD, PhtA, PhtB, PhtE или LT самим по себе (контроль). На 2 и 6 сутки после заражения проводили подсчет бактериальных колоний в назальных смывах, получая результаты в форме десятичного логарифма среднего числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Каждая точка соответствует одной мыши. Черными горизонтальными линиями показаны средние геометрические значения. Пунктирной линией показан предел обнаружения (0,84). Статистические анализы проводили для каждых суток отдельно с применением дисперсионного анализа (ANOVA). Показаны все значимые отличия от контроля. * р < 0,05; ns - незначимо.
Фиг. 14. Эффективность вакцин в модели колонизации носоглотки S. pneumoniae. Перед интрана-зальным заражением пневмококковым штаммом 2/D39 (A), 4/CDC (Б) или 6B/CDC (В) мышей Balb/c иммунизировали CbpA, PspA, PhtD, PsaA или LT самим по себе (контроль). На 2 и 6 сутки после заражения проводили подсчет бактериальных колоний в назальных смывах, получая результаты в форме десятичного логарифма среднего числа КОЕ. Каждая точка соответствует одной мыши. Пунктирной линией показан предел обнаружения (0,84). Черными горизонтальными линиями показаны средние геометрические значения. Статистические анализы проводили для каждых суток отдельно с применением ANOVA. Показаны все значимые отличия от контроля. * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001; ns - незначимо.
Фиг. 15. Эффективность вакцин в модели колонизации легких S. pneumoniae. Перед заражением умеренно вирулентным пневмококковым штаммом 19F/2737 мышей CBA/J иммунизировали PhtD с адъ-ювантом AS02 или AS02 самим по себе (контроль). На 3, 4 или 5 сутки после заражения извлекали легкие и бактериальную нагрузку оценивали подсчетом колоний (КОЕ). Каждая точка соответствует одной мыши. Пунктирной линией показан предел обнаружения (2). Черными горизонтальными линиями показаны средние геометрические значения. Группы сравнивали посредством ANOVA2 по трем суткам с по
следующим применением критерия подлинной значимости Тьюки (Tuckey-HSD). p < 0,0001.
Подробное описание изобретения
Zn2+ и Mn2+ присутствуют в организме человека как в свободной, так и в связанной форме. Связанные Zn2+ или Mn2+ связаны с белками, такими как альбумин, и ими представлено большинство этих ионов. С другой стороны, в биологических жидкостях, таких как кровь, лимфа, интерстициальная жидкость или спинномозговая жидкость, присутствует небольшое количество свободного Zn2+ или Mn2+. Термин "связанный" относится к ионам, прочно связанным с белками, такими как альбумин. Термин "свободный" относится к ионам, не являющимся прочно связанными с белками, такими как альбумин. Такие свободные ионы более доступны для S. pneumoniae.
В целях данного изобретения термин "достаточно низка для повышающей регуляции экспрессии по меньшей мере одного белка PhtX" означает, что уровень Zn2+ и/или Mn2+ (связанного и/или свободного):
а) ниже уровня, обычно обнаруживаемого в соответствующей области человеческого тела, таким
образом, что уровень экспрессии по меньшей мере одного белка PhtX у S. pneumoniae, присутствующего
в этом организме, выше уровня экспрессии по меньшей мере одного белка PhtX у S. pneumoniae, обна-
руженного в соответствующей области тела в нормальных условиях (то есть, у индивида со средними
уровнями Zn2+ или Mn2+); или
б) ниже уровня, обнаруживаемого в областях тела с высокой доступностью Zn2+, таким образом, что
уровень экспрессии по меньшей мере одного белка PhtX у S. pneumoniae, присутствующего в этой облас-
ти, выше уровня экспрессии по меньшей мере одного белка PhtX у S. pneumoniae, обнаруженного в об-
ласти тела с высокой доступностью Zn2+ у того же индивида.
В одном воплощении снижен уровень связанного Zn2+. В одном воплощении снижен уровень свободного Zn2+.
К ситуации (а) может привести снижение общих уровней Zn2+ и/или Mn2+, в то время как к ситуации (б) может привести инфекция, обусловленная S. pneumoniae, развивающаяся в области со сравнительно низкими уровнями Zn2+ и/или Mn2+.
Белок PhtX является представителем семейства белков гистидиновой триады. Возможно, белок PhtX представляет собой полноразмерный белок, но может представлять собой фрагмент белка, или фрагмент, или слитый белок, содержащий по меньшей мере один фрагмент или полноразмерный белок PhtX. Белок PhtX, экспрессированный в S. pneumoniae, будет представлять собой полноразмерный белок, однако белок PhtX, вводимый пациенту-человеку, возможно, представляет собой полноразмерный белок PhtX, фрагмент белка PhtX или слитый белок, содержащий по меньшей мере один белок PhtX или его фрагмент.
В одном воплощении белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. В одном воплощении белок PhtX представляет собой PhtD.
Настоящее изобретение относится к белкам, являющимся представителями семейства полигисти-диновой триады (Pht), их фрагментам или слитым белкам. Белки PhtA, PhtB, PhtD или PhtE могут иметь аминокислотную последовательность, на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, раскрытой в WO 00/37105 или WO 00/39299 (например, аминокислотной последовательности PhtD в положениях 1-838 или 21-838 SEQ ID NO:4 из WO 00/37105).
Семейство полигистидиновой триады (Poly Histidine Triad family, Pht-семейство) включает белки PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. Для этого семейства характерны последовательность липидирования, два домена, разделенные областью, богатой пролином, и несколько гистидиновых триад, возможно вовлеченные в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативную активность, 3-5 суперспиральных областей, консервативный N-конец и гетерогенный С-конец. Эти белки присутствуют у всех исследованных штаммов пневмококков. Сходные белки также обнаружены у других стрептококков и нейссерий. Тем не менее, следует понимать, что термины Pht А, В, D и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных выше или ниже ссылках, а также к их естественным (и искусственным) вариантам, имеющим последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные указанным белкам. Возможно, процент идентичности составляет по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97%.
Что касается белков PhtX, то PhtA раскрыт в WO 98/18930, и его также называют Sp36. Как указано выше, он является белком семейства полигистидиновой триады и содержит сигнальный мотив LXXC II типа. PhtD раскрыт в WO 00/37105, и его также называют Sp036D. Как указано выше, он также является белком семейства полигистидиновой триады и содержит сигнальный мотив LXXC II типа. PhtB раскрыт в WO 00/37105, и его также называют Sp036B. Другим представителем семейства PhtB является полипептид, разрушающий С3-компонент комплемента, раскрытый в WO 00/17370. Этот белок также принадлежит к семейству полигистидиновой триады и содержит сигнальный мотив LXXC II типа. Например, иммунологически функциональным эквивалентом является белок Sp42, раскрытый в WO 98/18930. Укороченный PhtB (приблизительно 79 кДа) раскрыт в WO 99/15675, и его также считают представителем семейства PhtX. PhtE раскрыт в WO 00/30299, и его называют BVH-3. При упоминании в данном описании любого Pht-белка это означает, что могут быть использованы иммуногенные фрагменты Pht-белка или их слитые конструкции. Например, упоминание белка PhtX включает иммуногенные фрагменты любого Pht-белка или их слитые конструкции. Упоминание PhtD или PhtB также является ссылкой на
слитые конструкции PhtDE или PhtBE, которые можно обнаружить, например, в WO 0198334.
Способ лечения или применение по изобретению могут включать введение полноразмерного белка PhtX, фрагмента белка PhtX или слитого белка, содержащего по меньшей мере 1 или 2 фрагмента белков PhtX. При использовании фрагментов Pht-белков (в отдельности или как часть слитого белка), каждый фрагмент, возможно, содержит один или более мотивов "гистидиновая триада" и/или суперспиральных областей таких полипептидов. Мотив "гистидиновая триада" представляет собой часть полипептида, имеющую последовательность НххНхН, где Н представляет собой гистидин и х представляет собой аминокислоту, отличную от гистидина. Суперспиральная область представляет собой область, предсказанную алгоритмом "Coils" в Lupus, A et al (1991) Science 252; 1162-1164. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент включает один или более мотивов "гистидиновая триада", а также по меньшей мере одну суперспиральную область. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 мотивов "гистидиновая триада" (возможно, с натив-ной Pht-последовательностью между 2 или более триадами или с внутритриадной последовательностью, более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентичной нативной пневмококковой внутритриадной Pht-последовательности, например внутритриадной последовательности PhtD, показанной в SEQ ID NO:4 из WO 00/37105). В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3 или 4 суперспиральные области. В одном воплощении Pht-белок, раскрытый здесь, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на N-конце), встречающиеся в природе варианты Pht-белка и иммуногенные фрагменты Pht-белка (например, фрагменты, описанные выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15, 20, 30, 40, 50, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности из WO 00/37105 (SEQ ID N0:4, 6, 8 или 10) или WO 00/39299 (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 14), способные приводить к развитию иммунного ответа, специфичного в отношении указанной аминокислотной последовательности из WO 00/37105 или WO 00/39299). В одном воплощении белок PhtX представляет собой фрагмент, описанный в WO 09/12588, например, содержащий последовательности SEQ ID NO:2, 3 или 4 или состоящий из них.
В частности, при использовании здесь термин "PhtD" включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на N-конце), встречающиеся в природе варианты PhtD и иммуноген-ные фрагменты PhtD (например, фрагменты, описанные выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности PhtD из WO 00/37105 или WO 00/39299, способные приводить к развитию иммунного ответа, специфичного в отношении указанной аминокислотной последовательности PhtD из WO 00/37105 или WO 00/39299 (например, для PhtD, SEQ ID NO:4 из WO 00/37105 или SEQ ID NO:14 из WO 00/39299). Все формы PhtD, указанные выше, могут быть использованы в настоящем изобретении.
В одном воплощении концентрация свободного Zn2+ в крови составляет менее 10 нМ, 7 нМ, 5 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 700 пМ, 500 пМ, 300 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 70 пМ, 50 пМ, 30 пМ, 20 или 10 пМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Zn2+ может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с использованием абсорбционного спектрофотометра с графитовой кюветой (GF-AAS) или с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра Vista AX-CCD для одномоментной атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES).
В одном воплощении изобретения концентрация связанного и свободного Zn2+ в крови составляет менее 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 или 0,1 мг/л или менее 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 мкМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Zn2+ может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с использованием абсорбционного спектрофотометра с графитовой кюветой (GF-AAS) или с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра Vista AX-CCD для одномоментной ICP-AES.
В одном воплощении изобретения концентрация свободного Mn2+ в крови составляет менее 10 нМ, 7 нМ, 5 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 700 пМ, 500 пМ, 300 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 70 пМ, 50 пМ, 30 пМ, 20 пМ или 10 пМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Mn2+ может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра Vista AX-CCD для одномоментной ICP-AES.
В одном воплощении изобретения концентрация связанного и свободного Mn2+ в крови составляет менее 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 или 0,1 мг/л или менее 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,2 или 0,1 мкМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Mn2+ может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра Vista AX-CCD для одномоментной ICP-AES.
Предложенный способ лечения или предотвращения направлен против S. pneumoniae, размножаю- 5
щегося в легком пациента, для лечения или предотвращения пневмонии. В одном воплощении концентрация свободного Zn2+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 или 1 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже. В одном воплощении концентрация свободного Mn2+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 или 1 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже. Возможно, уровень Zn2+ или Mn2+ измеряют в образце ткани, в случае чего концентрация Zn2+ (или Mn2+) в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 или 0,1 мкМ, как измерено в ткани легкого Сходным образом, уровень ионов в образце ткани может быть измерен атомно-абсорбционной спектроскопией, например, с использованием спектрометра Vista AX-CCD для одномоментной ICP-AES.
В одном воплощении изобретения уровни Zn2+ и/или Mn2+ у пациента-человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или крови
"Снижение уровней" означает, что уровень Zn2+ и/или Mn2+, как измерено анализом бронхиального лаважа или крови, ниже среднего для человека.
Согласно изобретению пациент-человек, подлежащий лечению белком PhtX, страдает от дефицита Zn2+ и/или Mn2+. То есть уровень Zn2+ и/или Mn2+ составляет менее 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 1% уровня, обычного для данной биологической жидкости, например сыворотки крови, спинномозговой жидкости, интерстициальной жидкости, бронхиального лаважа.
В одном воплощении пациент-человек страдает от стресса. В организме пациента, страдающего от стресса, снижены уровни Zn2+ и/или Mn2+, например, в крови, интерстициальной жидкости, спинномозговой жидкости и/или лимфе.
В одном воплощении уровни Zn2+ и/или Mn2+ в организме пациента-человека снижены из-за предшествующей инфекции, вызванной бактериальным штаммом, например штаммом S. pneumoniae, N. meingitidis, H. influenzae, S. aureus, S. epidermidis, C. difficile, стрептококка группы А, стрептококка группы В и/или М. catarrhalis. Возможно, предшествующая инфекция представляет собой хроническую бактериальную инфекцию.
В одном воплощении введение белка PhtX, например PhtD, предназначено для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, в форме септицемии, бактериемии, менингита, среднего отита или пневмонии.
В способе или применении по изобретению также возможны полезные комбинации белка PhtX с другими антигенами. Под комбинациями понимают, что иммуногенная композиция содержит все белки следующих комбинаций, либо в форме белков-носителей, либо в форме свободных белков, либо в форме смесей белков-носителей и свободных белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено ниже, оба белка могут быть использованы в качестве белков-носителей, или оба белка могут присутствовать в форме свободных белков, или оба белка могут присутствовать в форме белка-носителя и в форме свободного белка, или один белок может присутствовать в форме белка-носителя и свободного белка, в то время как другой белок присутствует только в форме белка-носителя или только в форме свободного белка, или один белок может присутствовать в форме белка-носителя, и другой белок может присутствовать в форме свободного белка. Аналогичные варианты возможны в комбинации трех белков. Комбинации включают, без ограничения, PhtD + NR1xR2, PhtD + химерные или слитые белки "NR1xR2 - С-концевая часть Sp91", PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + химерные или слитые белки "NR1xR2 - С-концевая часть Sp91", PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Возможно, NR1xR2 (или R1xR2) имеет происхождение из CbpA или PspC. Возможно, он имеет происхождение из CbpA. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как PhtD + NR1xR2 + Ply и PhtA + NR1xR2 + PhtD. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtDE в форме белков-носителей. В другом воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtDE в форме свободных белков. В одном воплощении комбинация белков включает PhtD и пневмоли-зин или PhtD и детоксифицированный пневмолизин. В одном воплощении в способе или применении по изобретению используют комбинацию PhtD, детоксифицированного пневмолизина и по меньшей мере одного капсульного сахарида S. pneumoniae, предпочтительно конъюгированного с белком-носителем.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению раскрыта иммуногенная композиция, содержащая белок PhtX и по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 1,5, 16, 17, 18 или 20 конъюгатов капсуль-ных сахаридов S. pneumoniae, содержащих сахариды разных серотипов S. pneumoniae. В таком воплощении по меньшей мере один сахарид конъюгирован с белком PhtX, таким как PhtD, или его слитым белком, и иммуногенная композиция способна приводить к развитию эффективного иммунного ответа против белка PhtX, например PhtD. В другом аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 или 20 конъюгатов капсульных сахаридов S. pneu-moniae, содержащих сахариды разных серотипов S. pneumoniae, и белок PhtX, например PhtD, в форме свободного или неконъюгированного белка.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин. Предпочтительно, пневмолизин детоксифицирован, например, химической обработкой или мутацией по меньшей
мере одной аминокислоты.
Согласно настоящему изобретению также раскрыта иммуногенная композиция, содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент и/или адъювант.
Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут содержать адъюванты, особенно если иммуногенные композиции предназначены для использования у пожилых людей, а также для использования у детей. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидрата окиси алюминия, или фосфат алюминия, или квасцы, но также могут представлять собой соли других металлов, такие как соли кальция, магния, железа или цинка.
Возможно, адъювант выбран таким образом, чтобы он приводил к развитию ответа преимущественно TM-типа. Такие высокие уровни цитокинов TM-типа обычно способствуют развитию клеточно-опосредованных иммунных ответов на данный антиген, в то время как высокие уровни цитокинов Th2-типа обычно способствуют развитию гуморальных иммунных ответов на антиген.
Различие иммунных ответов Th1- и Tr^-ram не является абсолютным. В действительности у индивида будет развиваться иммунный ответ, описываемый как ответ преимущественно TM-типа или преимущественно Th^-ram. Тем не менее, часто удобно рассматривать семейства цитокинов аналогично их описанию в клонах мышиных CD4+ Т-клеток по Mosmann и Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Традиционно, ответы TM-типа связывают с образованием Т-лимфоцитами цитокинов интерферона-у (IFN-у) и интерлейкина-2 (IL-2). Образование других цитокинов, таких как IL-12, часто непосредственно связанных с развитием иммунных ответов TM-типа, происходит не в Т-клетках. В отличие от этого, ответы Th^-ram связаны с секрецией интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-10 (IL-10). Подходящие системы адъюван-тов, стимулирующие преимущественно TM-ответ, включают монофосфориллипид А или его производное (или, в целом, детоксифицированный липид А, см., например, WO 2005107798), в частности, 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (получение которого описано в GB 2220211 А), и комбинацию монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидратом окиси алюминия) или эмульсией типа "масло в воде". Такие комбинации содержат антиген и 3D-MPL в одних и тех же структурах в форме частиц, что позволяет осуществлять более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. В исследованиях было показано, что 3D-MPL способен дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В1].
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где реактогенность QS21 снижена холестерином, как раскрыто в WO 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, содержащая QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа "масло в воде", описана в WO 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой QS21. Композиция может также содержать эмульсию типа "масло в воде" и токоферол (WO 95/17210). Неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды (WO 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (WO 0226757 и WO 03507822) также приводят к развитию ответа преимущественно TM-типа и являются подходящими для использования в настоящем изобретении.
Было предложено, что адъюванты в форме эмульсий типа "масло в воде" сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843В), кроме того, комбинации эмульсий типа "масло в воде" и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Описаны другие адъюванты в форме масляных эмульсий, такие как эмульсии типа "вода в масле" (US 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии типа "вода в масле в воде" (US 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют масляные эмульсионные системы (в частности, при включении токолов) с получением адъювантов и композиций по настоящему изобретению.
В одном воплощении масляная эмульсия (например, эмульсии типа "масло в воде") дополнительно содержит эмульгатор, такой как TWEEN 80, и/или стерин, такой как холестерин.
В одном воплощении масляная эмульсия (возможно, эмульсия типа "масло в воде") содержит мета-болизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как а-токоферол (и, возможно, как сквален, так и а-токоферол), и, возможно, эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Tween 80. Также может быть включен стерин (например, холестерин).
Способ получения эмульсий типа "масло в воде" хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно такой способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностно-активным веществом, таким как раствор PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор)/TWEEN80(tm), с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники будет ясно, что способ, включающий двукратное прохождение смеси через иглу шприца, будет подходящим для гомогенизации небольших объемов жидкости. Сходным образом, специалист в данной области техники может адаптировать способ эмульгирования в микрофлюидизаторе
(установка M110S Microfluidics, максимум 50 прохождений, на протяжении периода времени продолжительностью 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (0,6 МПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85 МПа))) для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть проведена путем рутинных экспериментов, включающих определение параметров получаемой эмульсии до получения продукта с необходимым диаметром масляных капель.
В эмульсии типа "масло в воде" масло и эмульгатор должны быть в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, забуференный фосфатом физиологический раствор.
Размер масляных капель в стабильной эмульсии типа "масло в воде", возможно, составляет менее 1 мкм, может быть большей частью в диапазоне 30-600 нм, возможно, большей частью приблизительно 30500 нм в диаметре и, возможно, большей частью 150-500 нм в диаметре, и, в частности, приблизительно 150 нм в диаметре, как измерено фотонно-корреляционной спектроскопией. В этом отношении 80% масляных капель по числу должны быть в указанных диапазонах, возможно, более 90% и, возможно, более 95% масляных капель по числу входят в указанные диапазоны размеров. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно входят в диапазон от 0,5 до 20% или от 2 до 10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если присутствует, от 2 до 10% а-токоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорби-танмоноолеат. Возможно, соотношение масло (например, сквален):токол (например а-токоферол) составляет 1 или менее, поскольку это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Также может присутствовать эмульгатор, такой как Tween80 или Span 85, в количестве приблизительно 1%. В некоторых случаях может быть полезным, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
Примеры эмульсионных систем описаны в WO 95/17210, WO 99/11241 и WO 99/12565, в которых раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, а-токоферола и TWEEN 80, возможно, содержащие иммуностимуляторы QS21 и/или 3D-MPL.
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения адъювант по изобретению может дополнительно содержать другие иммуностимуляторы, такие как липополисахарид (LPS) или его производные и/или сапонины. Примеры других иммуностимуляторов описаны здесь и в "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы для защиты или лечения восприимчивого к инфекции млекопитающего посредством введения указанной вакцины системным способом введения или через слизистые оболочки. Эти способы введения могут включать внутримышечные (в/м), внутрибрюшинные (в/б), внутрикожные (в/к) или подкожные (п/к) инъекции или введение через слизистые оболочки пищеварительной, дыхательной, мочеполовой системы. Возможно интраназальное (и/н) введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку это позволяет эффективнее предотвращать носительство пневмококков в носоглотке, ослабляя таким образом инфекцию на ее наиболее ранней стадии). Несмотря на то, что вакцину по изобретению можно вводить в форме однократной дозы, ее компоненты можно также вводить совместно одновременно или раздельно (например, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить отдельно, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов друг с другом). Возможно, при любом или всех различных введениях для совместного введения может присутствовать TM-адъювант. Помимо одного способа введения возможно применение 2 разных способов введения. Например, сахариды или конъюгаты сахаридов могут быть введены внутримышечно (или внутрикожно), а бактериальные белки могут быть введены интраназально (или внутрикожно). Кроме того, первичные дозы вакцин по изобретению могут быть введены внутримышечно, а повторные дозы - интраназально.
Содержание белковых антигенов в вакцине будет обычно в диапазоне 1-100 мкг, возможно, 5-50 мкг, например в диапазоне 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъектам может быть проведена одна или несколько повторных иммунизации через подходящие промежутки времени.
Изготовление вакцин, в целом, описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fuller-ton, патент США № 4235877.
Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизированными. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, используемого в качестве аморфного лиопротектора, такого как сахароза, трегалоза, глюкоза, манноза, мальтоза или лактоза. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, используемого в качестве аморфного лиопротектора и наполнителя, обеспечивающего лучшую структуру лиофилизата, такого как глицин или маннит. Присутствие кристаллического наполнителя позволяет сократить циклы лиофи-лизации при высокой концентрации соли. Примеры таких смесей для использования при лиофилизации иммуногенных композиций или вакцин по изобретению включают сахарозу/глицин, трегалозу/глицин, глюкозу/глицин, маннозу/глицин, мальтозу/глицин, сахарозу/маннит, трегалозу/маннит, глюкозу/маннит,
маннозу/маннит и мальтозу/маннит. Возможно, молярное соотношение двух компонентов обычно составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или 1:6. Возможно, иммуногенные композиции по изобретению содержат реагенты для лиофилизации, описанные выше.
Указанные выше стабилизирующие агенты и смеси стабилизирующих агентов могут дополнительно содержать полимер, способный повышать температуру стеклования (Tg') композиции, такой как по-ливинилпирролидон (ПВП), гидроксиэтилкрахмал или декстран, или полимер, используемый в качестве кристаллического наполнителя, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, с молекулярной массой от 1500 до 6000, и декстран.
Несмотря на то что иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, в одном воплощении настоящего изобретения описанные вакцины вводят внутри-кожно (в/к). Человеческая кожа содержит наружную "роговую" кутикулу, называемую роговым слоем и расположенную над эпидермисом. Под этим эпидермисом расположен слой, называемый дермой, который в свою очередь расположен над подкожной тканью. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и, в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с несколькими дополнительными преимуществами. Внутрикожная вакцинация с использованием описанных здесь вакцин является дополнительным аспектом настоящего изобретения.
Обычная методика внутрикожной инъекции, "способ Манту", включает стадии очистки кожи и затем ее натяжения одной рукой с введением иглы небольшого размера (26-31 размера) под углом 10-15° срезом вверх. После погружения среза иглы основание иглы опускают и проводят дальше в кожу, осторожно приподнимая ее. Затем очень медленно вводят жидкость с образованием на поверхности кожи пузыря или припухлости, после чего иглу медленно извлекают.
Недавно были описаны устройства, разработанные специально для внутрикожного или чрескожно-го введения жидких агентов, например устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, а также безыгольные инъекционные устройства, описанные, например, в WO 01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать обычные шприцы и иглы или устройства, разработанные для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или трансдермальные пластыри (WO 97/48440; WO 98/28037); или устройства, накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, WO 98/20734; WO 98/28037).
Авторы изобретения подразумевают, что при использовании здесь термины "содержащий", "содержать" и "содержит" могут в каждом случае быть заменены терминами "состоящий из", "состоять из" и "состоит из", соответственно.
Описанные здесь воплощения, относящиеся к "вакцинным композициям" по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к "иммуногенным композициям" по изобретению, и наоборот.
Все ссылки или заявки на патенты, приведенные в описании данной заявки на патент, включены сюда посредством ссылки.
Для лучшего понимания данного изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и их не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Методы Животные
Самок мышей OF1 и CBA/J, использованных в данном исследовании, приобретали у Charles River laboratories (Lyon, France). Мышей Balb/c получали от Harlan (Horst, The Netherlands). Все эксперименты и исследования проводили в GlaxoSmithKline Biologicals (GSK, Rixensart, Belgium) в соответствии с бельгийскими национальными руководствами по проведению экспериментов на животных.
Бактериальные штаммы и условия культивирования
Штамм 2/D39 был любезно предоставлен JC Paton (University of Adelaide, Australia). Штаммы 4/CDC и 6B/CDC были получены из Центра по контролю и профилактике заболеваний США (Center for Disease Control and Prevention, CDC), и штамм 19F/2737 был получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Штамм 3/43 был предоставлен Е. Yourassowski (Brugmann Hospital, University of Brussel, Belgium).
Штамм S. pneumoniae TIGR4 {Tettelin, 2001} был любезно предоставлен Andrew Camilli (Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA). Штамм WU2 был любезно предоставлен David E. Briles (University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama, USA). Штамм типа 4 был получен из CDC (Center for Disease Control & Prevention).
Пневмококки культивировали обычным способом в бульоне Тодда-Гевитта (Todd-Hewitt) (THB, Difco) с 0,5% (мас./об.) дрожжевого экстракта при 37°С/8% СО2. По необходимости добавляли эритромицин и/или спектиномицин (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium) в концентрации 0,2 и 250 мкг/мл соответ
ственно.
Штаммы Escherichia coli DH5a и JM109 (Gibco BRL, Life Technology) выращивали в бульоне Лу-риа-Бертани (LBT, Difco) с 1,5% (мас./об.) бактоагара (Difco) или без него при 37°С на протяжении 16 часов. По необходимости в питательную среду добавляли эритромицин или спектиномицин в концентрации 100 мкг/мл.
Для исследования распространенности Pht-белков помимо 23 собственных штаммов и штаммов Pneumococcal Molecular Epidemiology Network (PMEN), 34 изолята были предоставлены TJ Mitchell (Scotland), 6 - RE Gertz (USA), 2 - AB Brueggemann (UK), и 9 изолятов были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС).
Антигены
CbpA (или PspC) представлял собой укороченный рекомбинантный белок, как описано в Brookes-Walter et al. J. Infect.Dis. 67; 6533-6542 (1999), и был любезно предоставлен JC Paton. Данный белок был сконструирован из последовательности штамма D39 и, таким образом, принадлежит к группе А. PspA (группа 2) и PsaA представляют собой рекомбинантные белки, имеющие происхождение от штамма 2/D39, Ogunniyi et al. Infect. Immun. 68; 3028-3033 (2000), и оба были предоставлены J.C. Paton.
Обработка и анализ ДНК
Плазмидную ДНК Escherichia coli получали с использованием набора Plasmid Midi Purification Kit или Plasmid Mini Purification Kit (Qiagen Benelux, Venlo, The Netherlands). Очистку продуктов ПЦР проводили с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit, и очистку расщепленной ДНК проводили в 1% (мас./об.) агарозном геле с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Рестрикта-зы и лигазы получали от New England BioLabs (Westburg, Leusden, Belgium). Для каждой реакции ПЦР в этих исследованиях использовали систему Expand High Fidelity System (Roche, Mannheim, Germany). Все коммерческие продукты использовали в условиях, рекомендованных поставщиками.
Секвенирование ДНК проводили с использованием набора Big Dye Terminator Sequencing Kit на автоматическом ДНК-секвенаторе от Applied Biosystems (модель 3100) (Applied Biosystems Inc., Forster City, CA, USA). Анализы последовательностей проводили с использованием программного обеспечения MacVector V6.5 (Oxford Molecular Ltd., Madison) или программного обеспечения Vector NTI 7.1 (Informax) и последовательности сравнивали с доступной геномной последовательностью S. pneumoniae TIGR4 (www.tigr.org) {Peterson, 2001}.
Выделение геномной ДНК S. pneumoniae
Хромосомную ДНК каждого штамма получали путем сбора клеток, культивированных до образования сплошного слоя в течение ночи, из одной или двух густо засеянных чашек с кровяным агаром в 1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl; 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); рН 7,8). Суспензию бактерий центрифугировали в микроцентрифуге в течение 5 мин на максимальной скорости и осадок ресуспендировали в 75 мкл буфера ТЕ. Лизаты клеток получали последовательным добавлением 20 мкл лизоцима (100 мг/мл) и 20 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубацией при 37°С на протяжении 45 мин. Затем добавляли 500 мкл лизирующего буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 0,14 М NaCl; 0,1 М цитрата натрия; 1 мМ ЭДТА, рН 8,0; 0,1% (мас./об.) дезоксихолата натрия) и проводили инкубацию в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце этого периода инкубации к свежему лизату добавляли 250 мкл ацетата аммония (7,5 мМ, рН 7,7) и проводили инкубацию в течение 10 мин на льду. Вязкую ДНК выделяли дважды с использованием смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и осаждали в изопропиловом спирте. Полученную ДНК отмывали 70% (об./об.) этанолом и ресуспендировали в 50 мкл буфера ТЕ, содержащего 0,6 мкл РНКазы А (10 мг/мл). Суспензии ДНК хранили при 4°С.
Выделение РНК
Для оценки экспрессии генов в различных фазах роста (ранней логарифмической, оптическая плотность при 600 нм (OD600) = 0,3; поздней логарифмической, OD600 = 0,9; стационарной, OD600 = 1,2) выделяли общую РНК из пневмококков, культивированных от начальной OD600 0,01 в бульоне Тодда-Гевитта с дрожжевым экстрактом (THY) до соответствующей OD600. Клетки центрифугировали и ресуспендиро-вали в свободной от РНКаз трис-ЭДТА, содержащей 6 мг лизоцима на мл и 1 мг дезоксихолата натрия на мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации проводили выделение РНК с использованием набора QIAGEN RNeasy Mini Kit, следуя инструкциям изготовителя. Кон-таминирующую геномную ДНК элиминировали инкубацией образцов РНК с 1 единицей ДНКазы I на мкг РНК в течение 1 ч при 37°С, с последующей инактивацией ДНКазы 2,5 мМ ЭДТА в течение 10 мин при 65°С. Общее количество РНК определяли с использованием набора Ribogreen(r) RNA Quantification Kit (Molecular Probes), следуя инструкциям изготовителя.
Быстрая амплификация 5'-конца комплементарной ДНК (кДНК) (RACE)
Для определения сайтов начала транскрипции применяли способ Ranasinghe & Hobbs {Ranasinghe, 1998}. Кратко, для синтеза первой цепи комплементарной ДНК (кДНК) на основании общей РНК использовали праймер, специфичный в отношении 3'-конца гена phtE с обратной транскриптазой Superscript II (Invitrogen), следуя инструкциям изготовителя. Затем добавляли РНКазу А на 1 ч при комнатной температуре для образования у гибрида "кДНК-РНК" тупых 3'-концов. Гибрид вводили в плазмиду pKS
(Stratagene), обработанную рестриктазой EcoRV, с использованием Т4-ДНК-лигазы (инкубация в течение ночи, 16°С). Проводили ПЦР для амплификации 5'-конца с использованием другого обратного праймера, специфичного в отношении 3'-конца гена phtE, и праймера, специфичного в отношении pKS-специфичного промотора Т7. Для идентификации "+1"-основания проводили секвенирование области соединения pKS и кДНК.
Определение терминаторов транскрипции
Определение терминаторов проводили с использованием пакета программного обеспечения Wisconsin Sequence Analysis Package, версии 10.1 (Genetics Computer Group), на основании способа Brendel & Trifonov {Brendel, 1984}.
ОТ-ПЦР
ОТ-ПЦР-исследования проводили следующим образом. РНК (2 мкг) сначала денатурировали в течение 5 минут при 65°С в смеси, содержащей 10 мкМ обратного праймера, специфичного в отношении 3'-конца гена, и 20 единиц RNaseOut в общем объеме 10 мкл. Затем проводили реакцию обратной транскрипции, добавляя 5 мМ дитиотреитола, 1 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), 15 единиц обратной транскриптазы Thermoscript (Invitrogen), однократный буфер для синтеза кДНК и стерильную воду, свободную от РНКаз, до объема 20 мкл. Смесь для обратной транскрипции инкубировали при 56-58°С в течение 1 ч с последующей денатурацией обратной транскриптазы в течение 5 мин при 85°С. РНК-цепь гибридов "РНК-кДНК" разрушали инкубацией раствора для обратной транскрипции при 37°С в течение 20 мин с 1 единицей РНКазы Н. Реакцию ПЦР проводили с 2 мкл кДНК с использованием разных прямых праймеров, специфичных в отношении 5'-конца гена, и обратных праймеров, специфичных в отношении 3'-конца гена, использованных для реакции обратной транскрипции (конечные концентрации 0,5 мкМ), 0,2 мМ dNTP, реакционного буфера для Taq-ДНК-полимеразы, 2,5 единиц Taq-ДНК-полимеразы (Amersham Biosciences) и стерильной воды до объема 50 мкл. ПЦР-цикл состоял из начальной денатурации при 94°С в течение 5 мин с последующими 25-30 циклами, включающими денатурацию при 94°С в течение 15-30 секунд, отжиг при 55°С (phtE, phtD) или 63°С (phtB, D, А) в течение 15-30 с и элонгацию при 72°С в течение 1 мин, и, в завершение, конечной стадии элонгации при 72°С в течение 5-7 мин. Для исключения ДНК-контаминации в процессе получения РНК в ПЦР также включали отрицательный контроль, состоящий из РНК без реакции обратной транскрипции. Разделение продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1% (мас./об.) агарозном геле и визуализировали их окраской бромидом этидия.
Получение Pht-мутантов
Векторы для получения мутантов конструировали из векторов pGEM-T (Promega Benelux, Leiden, the Netherlands), проходящих репликацию в E.coli, но не в S. pneumoniae. Они содержат рекомбинантные зоны, соответствующие 3'-и 5'-областям pht-генов, подлежащих удалению, амплифицированные посредством ПЦР и расположенные вокруг генов антибиотикорезистентности (праймеры и сайты рестрикции, использованные для конструирования векторов для получения мутантов, могут быть предоставлены по требованию). Для получения мутанта, дефицитного по четырем pht-генам, необходимо было использовать два разных гена антибиотикорезистентности для сочетания делеции в двух разных локусах (локусе phtD/phtE и локусе phtA/phtB). Для локуса phtD/phtE был выбран ген резистентности к эритромицину (ermB), амплифицированный из производного вектора pJDC9. Для локуса phtA/phtB был выбран ген резистентности к спектиномицину (ген aad(9)), выделенный из плазмиды pR350 (любезно предоставленный
J Paton).
Клонирование проводили в штаммах Е. coli DH5a или JM109 с использованием различных сконструированных плазмид и бактерии высевали на агар Луриа-Бертани (LB-агар) с соответствующими антибиотиками. Трансформацию Е. coli плазмидной ДНК проводили стандартными способами с использованием клеток, обработанных CaCl2 {Hanahan, 1985}.
Штамм S. pneumoniae 4/CDC готовили к трансформации двумя последовательными стадиями культивирования перед ресуспендированием в среде СТМ (10 г/л казаминовых кислот; 5 г/л триптона; 5 г/л NaCl; 10 г/л дрожжевого экстракта; 0,4 М K2HPO4; 20% глюкозы; 30 мг/мл глутамина; 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,1 М CaCl2; рН 7,8), разделением на аликвоты и заморозкой в 15% глицерине. Полученные аликвоты использовали для трансформации. После разморозки добавляли CSP-1 или CSP-2 (100 нг/мл в среде СТМ) для индукции компетентности и бактерии культивировали при 37°С. Для оптимизации компетентности выбирали разные временные точки (5, 10, 15 и 20 мин). После добавления 1 мкг вектора для получения мутантов клетки инкубировали при 32°С в течение 30 мин со встряхиванием и последующей инкубацией в течение 2-4 ч при 37°С и 5% СО2. В завершение, бактерии высевали на кровяной агар с подходящими антибиотиками. Для получения штамма с мутацией четырех генов проводили трансформацию штамма с нокаутированными генами PhtD и PhtE (PhtD, E-KO) плазмидой, приводящей к дефициту белков PhtA и PhtB с применением такого же протокола, как протокол, описанный выше.
SDS-PAGE и вестерн-блоттинг
Суспензии убитых нагреванием бактерий получали сбором клеток, культивированных до образования сплошного слоя в течение ночи, из 5 густо засеянных чашек с кровяным агаром в 1 мл стерильного
PBS (0,14 М NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, рН 7,2) с последующей стадией инкубации при 56°С в течение 45 мин. Затем к суспензиям убитых нагреванием бактерий добавляли буфер для образцов (60 мМ "Trizma base", 1% (мас./об.) додецилсульфата натрия (SDS), 10% (об./об.) глицерина, 0,01% (мас./об.) бромфенолового синего, 2% (об./об.) р-меркаптоэтанола). Препараты кипятили в течение 5 минут, центрифугировали в микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 2 мин и разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с SDS (SDS-PAGE), как описано Laemmli {Laemmli, 1970}. Проводили электрофоретический перенос белков из акриламидных гелей на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad, Richmond, CA), как описано Towbin {Towbin, 1979}. Мембраны обрабатывали мышиным поликлональным антителом против PhtD, с последующей обработкой козьим противомышиным IgG, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Promega Benelux). Меченные ферментом полосы визуализировали с использованием субстратной системы с нитросиним тетразолием/5-бром-4-хлор-3-
индолфосфатом (NBT/BCIP).
Рост культур в ионодефицитной среде
Штамм дикого типа 4/CDC и соответствующие мутантный штамм PhtD- и штамм с мутацией четырех pht-генов культивировали в разных условиях дефицита или добавления ионов в синтетической среде с заданным химическим составом (среде MS) {SICARD, 1964}. В среду MS добавляли возрастающие концентрации, альтернативно, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+ или Zn2+. Проводили мониторинг оптической плотности при 600 нм в течение логарифмической фазы роста и в стационарной фазе. Результаты сравнивали с результатами, полученными для штамма дикого типа.
Штамм дикого типа WU2 культивировали с Zn-специфичным хелатором ^^№,№-тетракис(2-пиридилметил)этилендиамином (TPEN) или без него для определения эффекта дефицита цинка на экспрессию pht-генов на уровне РНК (посредством ОТ-ПЦР) и белка (проточной цитометрией).
Проточная цитометрия
Бактерии WU2 выращивали в ТНВ с 0,5% дрожжевого экстракта при 37°С, 8% СО2 до достижения логарифмической фазы роста. Альтернативно, в среду добавляли 30 мкМ TPEN, хелатора цинка. После центрифугирования бактериальные осадки ресуспендировали в растворе, содержащем моноклональные антитела против PhtE, против PhtB/D, против PhtD/E или против полисахарида 3 типа в качестве контроля. Через 2 ч при 4°С растворы центрифугировали, бактериальные осадки отмывали в PBS с 2% BSA перед их инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим противомышиным вторичным антителом, конъюгированным с AlexaFluor(tm) (Molecular Probes) в PBS с 2% BSA. После отмывки клетки фиксировали в 0,25% формальдегиде в PBS и проводили FACS-анализ. Отмечали медиану поверхностной флуоресценции.
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией
Проводили выделение общей РНК из штамма D39, культивированного до оптической плотности приблизительно 0,5 (середины логарифмической фазы роста) с использованием набора RNeasy(tm) Midi Kit (Qiagen) и определяли ее количество с использованием набора Quant-iT(tm) RiboGreen(tm) RNA Assay Kit (Invitrogen). Проводили двукратную обработку образцов (1 мкг) 1,5 мкл свободной от РНКаз ДНКазы RQ1 (Promega) в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали путем добавления 1 мкл реагента "DNase STOP" с последующей инкубацией в течение 10 мин при 65°С. Первую цепь кДНК получали с использованием обратной транскриптазы Superscript(tm) II (Invitrogen), случайных праймеров (Invitrogen) и рекомбинантного ингибитора рибонуклеаз RNasin(tm) (Promega). ПЦР в реальном времени проводили при объеме реакционной смеси 50 мкл с использованием набора TaqMan(tm) PCR Core Reagents Kit (Applied Biosystems) согласно описаниям изготовителя. Использовали следующие праймеры и зонды: gyrB,
GGGAAATAGCGAAGTGGTCAAG (прямой), GGAATCGGAGAAGGCTTCAC (обратный) и TTAC-CAATCGCCTCTTC (зонд); phtD, CCCATGCGGACAATATTCG (прямой), TGACTGCGTTCCTGCTTCTG (обратный), CGTTTAATCTCTTCTTTTGT (зонд).
Все анализы проводили дважды (от культуры до количественной ПЦР) и относительную транскрипцию генов анализировали способом 2-ЛЛСТ (Livak & Schmittgen, 2001) с использованием gyrB в качестве внутреннего контроля и РНК, выделенной от бактерий, культивированных в ТНВ самом по себе, в качестве калибратора.
Определение распространенности Pht-белков
Для отбора репрезентативных штаммов S. pneumoniae анализировали их популяционную структуру в соответствии с генотипами штаммов, определенными мультилокусным секвенированием-типированием (MLST, Multi-Locus Sequence Type; www.mlst.net). На основании типа последовательности изолята (ST, Sequence Type), определенного согласно MLST, определяли основные клональные линии. Для каждой группы определяли репрезентативный штамм для анализа распространенности, который проводили вестерн-блоттингом цельных бактериальных экстрактов с поликлональными антителами против PhtD (перекрестно-реактивными в отношении А, В и D) или против PhtE и посредством ПЦР геномной ДНК пневмококков с использованием праймеров, специфичных в отношении PhtA, В, D или Е.
Секвенирование ДНК для анализа консервативности PhtD
ДНК 107 штаммов, отобранных на основании MLST, амплифицировали посредством ПЦР с исполь
зованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении PhtD. Полученные 107 последовательностей выравнивали с использованием программы ClustalX и их идентичность вычисляли с использованием программы Superneedle (процент идентичности = 100 х (число идентичных оснований/длина наиболее короткой последовательности)). Пример 1
Характеристика pht-генов Геномная структура pht-генов
В предыдущей работе секвенирование ДНК перекрывающихся клонов из геномной библиотеки штамма S. pneumoniae SP64 {Hamel, 2004} и ПЦР-анализы позволили определить геномную структуру pht-генов и расположенных рядом с ними генов у штамма 6В этого типа. Гены phtA и phtB, а также гены phtD и phtE, были расположены попарно. BLAST-анализы на интернет-сайте TIGR (www.tigr.org) {Peterson, 2001} показали, что в геноме S. pneumoniae TIGR4 эти два тандема генов расположены на расстоянии приблизительно 161 т.п.о. друг от друга и что их геномная структура идентична наблюдаемой у штамма SP64 (фиг. 1). Такая же структура pht-генов была также обнаружена у штамма 4/CDC и у штамма WU2, за исключением того, что у последнего отсутствует ген phtA (данные не показаны). Секвенирова-ние областей ДНК штамма TIGR4, расположенных рядом с pht-генами, подтвердило последнее наблюдение (данные не показаны). Дополнительный анализ продемонстрировал, что у штамма TIGR4, выбранного для дальнейшего исследования, гены phtA и phtB были разделены 157 п.о., в то время как гены phtD and phtE были разделены 209 п.о.
Со стороны тандема phtD-phtE на 7 п.о. ближе к 3'-концу от гена phtD был обнаружен ген с последовательностью, на 72% аналогичной Imb-генам стрептококков групп А и В, кодирующим ламинин-связывающие белки (регистрационные номера AAK34689 {Ferretti, 2001} и AAD13796 {Spellerberg, 1999}, соответственно) (фиг. 1). Продукт этого гена был также недавно обозначен AdcAII и описан как цинк-связывающий белок, подобный АВС-переносчику {Loisel, 2008}. Открытая рамка считывания (ORF) длиной 1392 п.о., расположенная на 142 п.о. ближе к 3'-концу от гомолога гена Imb, кодирует белок, последовательность которого на 64% аналогична белку-переносчику метаболитов YfnA Bacillus sub-tilis (регистрационный номер D69814) и на 81% аналогична предполагаемой аминокислотной пермеазе S. pyogenes (регистрационный номер AAK33157) {Ferretti, 2001, Kunst, 1997}. Через 226 п.о. после стоп-кодона гена phtE была обнаружена последовательность, на 79% идентичная первой 481 п.о. гена phtE (предполагаемый ген phtF) (фиг. 1). Кроме того, эта последовательность на 72% идентична генам phtA, В
и D.
Со стороны тандема phtA-phtB на 253 п.о. ближе к 3'-концу от гена phtA была обнаружена ORF длиной 1332 п.о., последовательность которой на 73% аналогична гену ptsl Streptococcus salivarius (регистрационный номер Р30299) {Gagnon, 1992} (фиг. 1). У штамма TIGR4 в этом гене был сдвиг рамки считывания, который авторы изобретения секвенировали в сравнении с геном ptsl, обнаруженным в последовательности целого генома (регистрационный номер AAK75285). В непосредственной близости от обеих пар генов, ближе к 5'-концу, функциональные ORF не были обнаружены.
Пример 2
Транскрипционная структура pht-генов
Геномная организация pht-генов позволила предположить возможность координированной транскрипции тандемных генов. По этой причине для изучения данной гипотезы были проведены дополнительные исследования. Сначала были идентифицированы предполагаемые промоторы и сайты связывания рибосом pht-генов. 5'-RACE гена phtE позволила установить его сайт инициации транскрипции, на основании чего была выведена промоторная область. Было обнаружено, что сайт инициации транскрипции (+1) расположен на 96 оснований ближе к 3'-концу от сайта инициации трансляции гена phtE, ближе к 5'-концу от типичных для S. pneumoniae сайтов связывания РНК-полимеразы (-10) и (-35) {Morrison, 1990} и ближе к 3'-концу от сайта связывания рибосом (фиг. 2а). Сходная структура последовательностей была обнаружена ближе к 3'-концу от генов phtA, phtB и yfnA, указывая на присутствие предполагаемых промоторов (фиг. 2б, в и д). Тем не менее, ввиду очень небольшого расстояния между геном Imb и геном phtD (7 п.о.) промоторная последовательность последнего не была идентифицирована. С другой стороны, ближе к 3'-концу от гена Imb была обнаружена последовательность, идентичная (-35)-последовательностям других pht-генов (фиг. 2г). Сайты связывания рибосом наблюдали на 5-7 п.о. ближе к 3'-концу от всех стартовых кодонов.
Также были идентифицированы сайты терминации транскрипции pht-генов и расположенных рядом с ними генов. Компьютерный анализ предсказанных вторичных структур матричной РНК (мРНК) позволил предположить присутствие терминатор-подобных структур типа "стебель-петля" на 3'-концах генов. Было возможным образование шпилечных структур с расчетными значениями свободной энергии диссоциации (AG) -9,4, -27,0, -16,8 и -21,6 ккал/моль (-39,48, -113,4, -70,56 и -90,72 кДж/моль) для генов phtB, phtD, phtA и ptsl, соответственно, как определено способом Turner et al. (1988) {Turner, 1988} (фиг. 3). Действительно, терминатор, идентифицированный для гена phtD был идентичен терминатору, описанному на интернет-сайте TIGR для ORF SP1003, соответствующей гомологу гена phtD (www.tigr.org). Группа TIGR не идентифицировала терминаторы транскрипции для других pht-генов или генов, распо
ложенных рядом с ними, что, возможно, отражает различия алгоритмов, использованных в обоих исследованиях. Большинство шпилек заканчивались несколькими остатками Т, что типично для прокариоти-ческих терминаторов транскрипции {Rosenberg, 1979}, и были расположены в пределах 70 п.о. ближе к 5'-концу от стоп-кодонов (фиг. 3). Интересно, что последовательность терминатора phtE -4,7 ккал/моль (-19,74 кДж/моль)) была расположена на 1867 п.о. ближе к 5'-концу от его стоп-кодона и гена phtF, ORF которого содержит внутрирамочные стоп-кодоны, предотвращающие его трансляцию (фиг. 3а). Ближе к 5'-концу от гена yfnA и Imb терминаторные последовательности не были идентифицированы.
Геномная структура позволила предположить, что ген phtE может быть частью оперона, состоящего из генов yfnA, Imb, phtD, phtE и phtF. Тем не менее, 5'-RACE (фиг. 2а) и идентификация терминаторов (фиг. 3а) показали, что ген phtE был первым геном, транскрибируемым при образовании бицистронной мРНК, состоящей из генов phtE и phtF, что было подтверждено ОТ-ПЦР. При ОТ-ПЦР были амплифици-рованы области от phtE до phtF (фиг. 4а, дорожки 4 и 6), в то время как при использовании пары прайме-ров, специфичных в отношении области, расположенной между генами phtD и phtE, продукт амплификации не был получен (фиг. 4а, дорожка 5), что указывает на терминацию транскрипции ближе к 5'-концу от гена phtD (фиг. 3в).
Как показано на фиг. 4а (дорожки 1-3), ОТ-ПЦР позволяла амплифицировать области от yfnA до phtD. Более того, Loisel et al. {Loisel, 2008} продемонстрировали, что помимо yfnA, Imb и phtD этот транскрипт phtD также кодирует два гена, расположенные ближе к 3'-концу от гена yfnA (ccdA, вовлеченный в биосинтез цитохрома с, и spr0904, сходный с тиоредоксином). Интересно, что идентификация предполагаемого промотора ближе к 3'-концу от гена Imb (фиг. 2г) позволила предположить сочетанную транскрипцию генов phtD и Imb.
Результаты, полученные для генов phtB и phtA, продемонстрировали, что транскрипция этих генов происходит с образованием моноцистронных мРНК, как было предложено после идентификации промоторов (фиг. 2б и в) и сайтов терминации (фиг. 3б и г). Анализ транскрипционной структуры генов phtA и phtB посредством ОТ-ПЦР с использованием phtB-специфичных праймеров выявил phtB-специфичный ампликон (фиг. 4а, дорожка 7). При ОТ-ПЦР с праймерами, амплифицирующими область между генами phtA и phtB (фиг. 4а, дорожка 8), продукт амплификации не был получен, что указывает на моноцис-тронную структуру генов phtA и phtB. Идентификация сайтов терминации (фиг. 3д) показала, что транскрипция гена ptsl происходит с образованием моноцистронной мРНК, и это также подтвердило, что ген phtA не является частью полицистронного транскрипта.
Пример 3
Конструирование и использование штаммов с мутациями pht-генов Характеристика мутантных штаммов
Конструировали мутантные штаммы PhtA-, PhtB-, PhtD-, PhtE- и штамм с мутацией четырех генов PhtABDE-. Для оценки точности рекомбинации выделяли геномную ДНК мутантных штаммов и секве-нировали рекомбинантные области (данные не показаны). Кроме того, проводили фенотипическую характеристику мутантных штаммов иммуноблоттингом с использованием мышиного поликлонального антитела против PhtD (фиг. 5). Это антитело распознавало все четыре изотипа Pht-белков. Тем не менее, полосы PhtE были менее выраженными, подтверждая более выраженную дивергенцию этого Pht-белка от трех других.
Влияние различных ионов на рост бактерий
Рост штамма с мутацией четырех pht-генов в среде MS был значительно ослаблен по сравнению с ростом штамма дикого типа и различных штаммов с мутацией одного pht-гена (фиг. 6а). При добавлении в среду Fe2+, Zn2+ или Mn2+ в концентрации до 200 мкМ рост штамма дикого типа и PhtD-дефицитного мутантного штамма был несколько усилен (скорость роста по сравнению со средой MS самой по себе 96130%). В отличие от этого, рост штамма с мутацией четырех генов менялся очень сильно. В то время как добавление 200 мкМ Fe2+ в среду MS приводило к усилению роста лишь на 25,3% (фиг. 6г), та же концентрация Zn2+ или Mn2+ повышала способность штамма с мутацией четырех генов к росту до уровня дикого типа (фиг. 6б, в). Это соответствует увеличению скорости роста до 92,3% по сравнению со скоростью роста в среде MS самой по себе. Тем не менее, это повышение скорости роста было отсроченным, и его можно было видеть только после инкубации в течение ночи, поскольку в первые часы культивирования скорость роста не менялась. Добавление Mg2+ в концентрации 200 мкМ не приводило к полному восстановлению роста, как в случае с Zn2+ или Mn2+, но сходное увеличение скорости роста наблюдали при добавлении в среду MS 1 мг/мл Mg2+ (данные не показаны). Добавление Cu2+ в высоких концентрациях было токсичным для штаммов дикого типа и мутантных штаммов (данные не показаны).
Пример 4
Эффект снижения концентрации цинка на экспрессию pht-генов
При добавлении в культуральную среду хелатора цинка TPEN уровень экспрессии Pht-белков был повышен, как определено при проточной цитометрии (фиг. 7а, б, в). В качестве контроля при использовании антитела против полисахарида 3 типа в тех же условиях сниженной концентрации цинка средняя флуоресценция не менялась (фиг. 7г). На уровне РНК посредством ОТ-ПЦР можно было измерить по- 14
вышение уровня транскрипции гена phtE в условиях сниженной концентрации цинка до 25 раз (данные не показаны).
Кроме того, проводили количественную ОТ-ПЦР с использованием мРНК, выделенной от пневмококкового изолята (штамма D39), культивированного либо в ТНВ, либо в ТНВ с 25 мкМ TPEN. Концентрация добавленного в среду хелатора была субоптимальной, как было определено в предварительных экспериментах, то есть, TPEN не предотвращал рост (что наблюдали при концентрации TPEN, достаточно высокой для хелатирования всех ионов в среде), но замедлял его (данные не показаны). Добавление TPEN в среду приводило к повышению уровня экспрессии мРНК гена phtD в 4,84 раза. Добавление 25 мкМ ZnSO4 в ТНВ с TPEN снижало экспрессию мРНК гена phtD до уровня, подобного наблюдаемому в среде самой по себе, что позволяет предположить, что из всех ионов, которые может хелатировать TPEN (Zn, Mn, Cd, Co, Ni, Cu, Mg, Ca), Zn оказывает наибольшее влияние на уровень экспрессии гена phtD.
Пример 5
Распространенность Pht-белков пневмококков
Исследовали в общей сложности 74 штамма (включая 23 штамма PMEN и собственных штамма). В этой группе репрезентативных штаммов были представлены 18 клональных линий, 46 штаммов (61%) с 27 разными ST принадлежали к 3 основным клональным группам (1, 11 и 23), были представлены 56 разных ST, среди которых лучше других были представлены 81, 90, 124, 156, 162 и 199 (22 штамма), и были представлены 27 разных серотипов, среди которых лучше других были представлены серотипы 19F, 6В, 3 и 23F (47% всех штаммов).
Посредством ПЦР геномной ДНК авторы изобретения обнаружили гены, кодирующие белки PhtD, PhtE, PhtB и PhtA, у 100, 97, 81 и 62% штаммов соответственно. Было обнаружено, что пятьдесят четыре процента штаммов имели в своем геноме четыре pht-гена. При иммуноблоттинге с поликлональными антителами против PhtD белок PhtD был обнаружен у всех штаммов. Сходным образом, другие Pht-белки были обнаружены при иммуноблоттинге у всех штаммов, имеющих соответствующие гены. Следует отметить, что ввиду наибольшей генетической дивергенции PhtE его выявление было более эффективным при использовании поликлонального антитела, полученного специально против PhtE (фиг. 8). Было обнаружено несколько особенных Pht-белков, таких как PhtE меньшего размера (менее 10 кДа) у 6 изоля-тов и еще меньшего размера (менее 20 кДа) у 8 штаммов. Сходным образом, было обнаружено, что 4 штамма продуцируют укороченный PhtA (фиг. 8), ген которого при ПЦР не был обнаружен. Интересно, что эти 4 штамма также экспрессировали укороченный PhtE массой 20 кДа. По меньшей мере, секвени-рование локуса phtA/B phtB-отрицательных штаммов выявило, что единственный присутствующий в данном локусе ген представляет собой гибрид генов phtA и phtB или phtA и phtD.
Интересно, что анализ последовательностей продемонстрировал, что сигнальная последовательность, кодируемая pht-генами, специфична для каждого представителя Pht-семейства. Действительно, специфичная сигнальная последовательность одного представителя Pht-семейства отличается от сигнальной последовательности другого представителя Pht-семейства по меньшей мере в одном положении (см. табл. 1).
Затем была предпринята попытка определить возможную связь профиля экспрессии Pht-белков с генотипом/серотипом изолята. Среди проанализированных штаммов все изоляты серотипов 2, 4, 14, 6В и 7F имели 4 Pht-белка и все изоляты серотипов 3, 9, 19F и 22F не имели PhtA или имели укороченный
PhtA.
Что касается возможной связи MLST-генотипа и профиля экспрессии Pht-белков, удалось установить следующее. Укороченный PhtE массой 10 кДа был обнаружен главным образом в группе генотипа ST 199. Эта группа включает штаммы серотипов 19F, 19А, 15А, 1 и 6А. Укороченный PhtE массой 20 кДа наблюдали у 8 изолятов, все из которых принадлежали к одной клональной линии (группа 1), но имели разные серотипы (9, 19А, 19F, 14). В заключение, штаммы без PhtA присутствовали в разных кло-нальных линиях. Таким образом, существенной связи отсутствия PhtA с генотипом не было установлено.
Пример 6
Консервативность PhtD
При исследовании распространенности Pht-белков было обнаружено, что PhtD присутствует у всех исследованных штаммов пневмококков, что характеризует его как лучший белок Pht-семейства для включения в вакцину. Поэтому было сочтено необходимым определить степень консервативности его последовательности у разных штаммов пневмококков. Для этого проводили секвенирование ДНК.
По результатам анализа 107 штаммов (на основании MLST-классификации) было определено, что длина PhtD варьирует от 831 до 853 аминокислот при молекулярной массе приблизительно 100 кДа. Было обнаружено, что PhtD высококонсервативен у всех 107 исследованных штаммов и только 1 последовательность содержала стоп-кодон, приводивший к синтезу укороченного белка (штамм 4/75). У всех штаммов богатая пролином область содержала 13-15 пролинов (у 7 штаммов - только 11-13 пролинов). В последовательности PhtD были обнаружены короткие вариабельные области длиной менее 4 аминокислот.
Обсуждение
Pht-белки являются перспективными кандидатами на включение в вакцину против инфекционных
пневмококковых заболеваний. Поэтому было необходимо исследовать регуляцию экспрессии этих белков для лучшего понимания их роли в патогенезе пневмококковых заболеваний.
Анализ генома показал, что четыре гена-гомолога расположены тандемами. Также было подтверждено присутствие пятого, хотя и укороченного, представителя семейства pht-генов ближе к 5'-концу от гена phtE, что подтверждает результаты предшествующего исследования {Adamou, 2001}. По-видимому, такое уменьшение длины является консервативным, поскольку такая же структура была обнаружена в геноме штамма S. pneumoniae R6 (регистрационный номер AAK99714) {Hoskins, 2001}.
Исследование, проведенное авторами изобретения, показало, что тандемная структура pht-генов не связана с их бицистронной транскрипцией. В исследованных условиях ни один из этих генов не проходил транскрипцию совместно с его соседним родственным pht-геном. Результаты анализов промоторов и терминаторов хорошо коррелировали с результатами обычных ОТ-ПЦР-исследований. Авторы изобретения показали, что все гены phtB, phtA и phtE имеют отдельные предполагаемые промоторы и что транскрипция с образованием мРНК, вероятно, заканчивается вскоре после прохождения соответствующих стоп-кодонов. С другой стороны, наблюдали особенности гена phtD. Действительно, в исследованиях in-silico промоторы для phtD не были идентифицированы. Вместо этого, были идентифицированы промоторы, но не терминаторы транскрипции, для генов Imb и yfnA, двух генов, расположенных ближе к 3'-концу от phtD, что, вероятно, указывало на расположение этих генов в оперонной системе. Это подтверждает полученные недавно данные о возможной экспрессии phtD в большой оперонной системе вместе с 4 генами, расположенными ближе к 3'-концу от него {Loisel, 2008}. Тем не менее, тот факт, что промотор был идентифицирован для yfnA и для Imb, указывает на возможное начало транскрипции в этих местах, что означает возможность образования phtD-содержащих транскриптов разной длины. Кроме того, ближе к 3'-концу от гена Imb был идентифицирован сайт связывания adcR {Loisel, 2008, Panina, 2003}, что указывает на возможность существования цинк-регулируемого бицистронного транскрипта Imb и phtD, как было предложено другими авторами. Исследования Spellerberg et al. {Spellerberg, 1999} показали, что транскрипция гена Imb стрептококков группы В (GBS) происходит совместно с геном, продукт которого имеет последовательность, на 67% аналогичную первым 225 (phtE) и первым 228 (phtA, phtD и phtB) аминокислотам продуктов pht-генов (регистрационный номер AF062533). Сходную структуру генома также наблюдали в геноме стрептококков группы A (GAS) {Ferretti, 2001}. Кроме того, было высказано предположение, что совместная транскрипция Imb и phtD может указывать на функциональную связь с вовлечением продукта гена phtD в адгезию и инвазию пневмококков {Panina, 2003}.
Интересно отметить возможность транскрипции гена phtD с образованием полицистронной мРНК с теми двумя генами, yfnA и Imb, которые могут быть вовлечены в транспортную и специфичную связывающую активности, соответственно. Действительно, предполагают, что YfnA у S. pneumoniae {Hoskins, 2001} и гомологичные белки у В. subtilis {Yamamoto, 1997}, S. pyogenes {Ferretti, 2001} и S. mutans {Aj-dic, 2002} являются переносчиками аминокислот и представителями суперсемейства пермеаз. Что касается белка Lmb, он был описан как цинк-связывающий белок, похожий на АВС-переносчик {Loisel, 2008}, и как предполагаемый ламининсвязывающий белок {Spellerberg, 1999}. Действительно, этот белок демонстрирует сходство с семейством адгезинов, известных как Lral, исходно обнаруженных у стрептококков ротовой полости {Jenkinson, 1994}, но затем описанных у других стрептококков и родов {Cockayne, 1998}. Было высказано предположение, что Lral-подобные белки вовлечены в колонизацию человеческого эпителия стрептококками и их последующую инвазию в кровоток {Eisner, 2002}. Неясно, почему гены yfnA, Imb и phtD объединены в оперонную систему. Согласно одной вероятной гипотезе, эти три белка необходимы в один и тот же момент бактериального цикла, например, для инвазии или роста, при этом их функции могут быть не связаны друг с другом. Тем не менее, определение роли Pht-белков может обеспечить некоторые обоснования такой геномной ассоциации. Можно предположить, что внутривидовое сходство Pht-белков указывает на их взаимозаменяемые функции. Возможно, эти белки выполняют сходные функции посредством их гомологичных областей, и, в то же время, обладают разными активностями, даже на разных стадиях развития бактерии. Результаты, полученные авторами изобретения при иммуноблоттинге белковых экстрактов от различных Pht-дефицитных мутантных штаммов, сконструированных авторами изобретения, показывают, что повышение уровня экспрессии продуктов оставшихся pht-генов не может компенсировать потерю гена. Это свойство было также недавно описано на уровне РНК с применением ОТ-ПЦР {Ogunniyi, 2009}.
Как уже упомянуто, все Pht-белки содержат мотивы ''гистидиновая триада'' {Adamou, 2001, Hamel, 2004, Zhang, 2001}, которые, согласно предположениям, вовлечены в связывание металлов. Представляет интерес обсуждение возможного участия этих мотивов в связывании цинка, особенно с получением кон-формационно функциональных Pht-белков {Panina, 2003}. Эти же авторы также выдвинули гипотезу, что среда со сниженной концентрацией цинка может индуцировать экспрессию Pht-белков и способствовать колонизации и инвазии стрептококков. В связи с этим авторы изобретения провели эксперименты с культивированием штамма дикого типа и Pht-дефицитных штаммов в различных условиях со сниженной и более высокой концентрацией ионов. В минимальной синтетической среде штамм дикого типа и PhtD-дефицитный штамм росли медленнее, чем в обогащенной среде LB, однако в минимальной среде почти не наблюдали рост Pht-дефицитного штамма с мутацией четырех генов. Удивительным образом, при до
бавлении Zn2+ или Mn2+, и это было особенно заметно при концентрациях в диапазоне 20-200 мкМ, происходило усиление роста штамма с мутацией четырех генов до уровня дикого типа. Тем не менее, результаты, полученные авторами изобретения, показывают, что этот эффект на рост штамма с мутацией четырех генов был отсроченным, по сравнению со штаммом дикого типа.
Помимо подтверждения необходимости Zn2+ и Mn2+ для роста бактерий эти наблюдения доказывают важную роль Pht-семейства в проникновении Zn2+ и Mn2+ в бактериальные клетки. Наблюдаемый авторами изобретения факт, что снижение концентрации Zn2+ индуцирует синтез белков Pht-семейства de novo, является еще одним аргументом, подтверждающим тесную взаимосвязь Pht-белков и Zn2+. Механизм этой регуляции, вероятно, включает белок AdcR, регулирующий проникновение цинка в S. pneu-moniae. Действительно, ближе к 3'-концу от генов phtA, phtB и phtE и оперона Imb-phtD были обнаружены предполагаемые сайты связывания белка AdcR {Panina, 2003}. Связывание AdcR, индуцируемое в условиях высокой концентрации Zn2+, ингибирует транскрипцию зависимых от него генов. В условиях непосредственного или косвенного дефицита цинка, приводящего к снижению внутриклеточной концентрации этого металла, происходит ослабление обусловленной AdcR репрессии {Brenot, 2007, Claverys, 2001}. В противоположность этим данным и наблюдениям авторов изобретения в настоящем исследовании, недавно было сообщено о том, что добавление цинка в культуральную среду приводит к синтезу Pht-белков {Ogunniyi, 2009}. Тем не менее, два использованных способа отличались тем, что в настоящем исследовании цинк удаляли из среды с высокой концентрацией цинка, в то время как Ogunniyi et al. добавляли цинк в среду с низкой концентрацией цинка. Будет обоснованным предположение, что регуляция синтеза Pht-белков происходит колоколообразным образом в определенном диапазоне концентраций цинка. Кроме того, эффекты высокой концентрации цинка, наблюдаемые Ogunniyi et al. {Ogunniyi, 2009}, приводящие к повышению экспрессии Pht-белков, могут иметь небольшое значение in vivo, поскольку концентрации свободного цинка в организме человека крайне низки.
В 1997 г. Dintilhac et al. {Dintilhac, 1997a} сделали вывод исходя из результатов проведенного ими исследования, что помимо Psa, описанного как Mn^-пермеаза ABC-типа, и Adc, Zn2+-пермеазы ABC-типа, должен существовать третий переносчик, способный переносить как Zn2+, так и Mn2+. Возможно, эту функцию выполняют Pht-белки или ламининсвязывающий белок. Результаты, полученные авторами изобретения, указывают на другую роль Pht-белков. Тот факт, что штамм дикого типа и PhtD-дефицитный штамм могли расти в минимальной среде в отсутствие Zn2+ и Mn2+, действительно очень интересен. Кроме того, также очень интересно наблюдение задержки восстановления роста штамма с мутацией четырех генов при добавлении в минимальную среду Zn2+ или Mn2+. Эти наблюдения можно объяснить, если предположить, что Pht-белки действуют как белки, связывающие Zn2+ и Mn2+, функцией которых является хранение и накопление этих двухвалентных катионов. При помещении штамма дикого типа и PhtD-дефицитного штамма в минимальную среду они могли начать расти сразу, благодаря ионам, обеспеченным Pht-белками ранее, при культивировании бактерий в обогащенной среде. В отличие от этого, штамм с мутацией четырех pht-генов не был способен сохранять эти ионы в благоприятных условиях и затем не мог расти в обедненной среде. При добавлении в минимальную среду избытка Zn2+ или Mn2+ было необходимо некоторое время для захвата этих ионов специфичными металлопермеазами, поскольку их захват из культуральной среды происходил случайным образом, без содействия Pht-белков. Это может объяснить задержку, необходимую для начала роста штамма с мутацией четырех pht-генов в таких условиях. Более того, возможная связывающая функция Pht-белков согласуется с присутствием пяти-шести катион-связывающих доменов.
В случае подтверждения этот предполагаемый механизм хранения можно рассматривать как средство регулирования у бактерий гомеостаза цинка и, возможно, марганца. Ионы металлов, таких как цинк и марганец, являются необходимыми микроэлементами. Тем не менее, их избыток потенциально вреден для бактерий, поскольку они могут конкурировать с другими элементами как кофакторами некоторых ключевых ферментов. По этой причине бактериям необходимо регулировать гомеостаз металлов, и авторы изобретения предполагают, что это основная функция Pht-семейства. Такая система регуляции позволит S. pneumoniae выжить в условиях ограниченной доступности ионов, например, на начальных стадиях процесса колонизации носоглотки человека {Bunker, 1984, Harlyk, 1997}.
Существование полицистронных транскриптов, содержащих PhtD, можно объяснить необходимостью Zn2+ или Mn2+ для функционирования Lmb, представителя семейства Lral, и YfnA. Отчасти для подтверждения этого положения, было высказано предположение, что Mn2+ необходим для адгезии, обусловленной семейством белков Lral, ключевого фактора вирулентности {Dintilhac, 1997b, Papp-Wallace, 2006}. Кроме того, в других условиях было показано, что связывание ламинина с Zn2+ повышает аффинность связывания ламинина с ламинин-связывающими белками {Ancsin, 1996, Bandyopadhyay, 2002}. Таким образом, можно предположить, что PhtD необходим Lmb для обеспечения присутствия Zn2+ при взаимодействии Lmb и ламинина, которое усиливает связывание с тканями хозяина. Регуляция гомеоста-за цинка Pht-белками позволяет также объяснить, почему эти белки связаны с ингибированием С3Ь (Hostetter, 1999 41 /id; Ogunniyi, 2009 98 /id). Действительно, цинк является регулятором расщепления С3Ь фактором I в присутствии фактора Н {Blom, 2003}. Контролируя концентрацию цинка в бактериальной среде, Pht-белки могут посредством этого способствовать ингибированию С3Ь в некоторых обстоя
тельствах, что требует дальнейшего изучения.
По этой причине, нейтрализуя белки Pht-семейства, иммунная система может лишать бактерий возможности накапливать и использовать ионы, что, по-видимому, необходимо для процесса инвазии. Следовательно, результаты, полученные авторами изобретения, подтверждают, что Pht-белки являются перспективными кандидатами на включение в вакцины против пневмококковых инфекций. Оценка возможности использования различных представителей Pht-семейства в качестве антигенов для пневмококковых вакцин была проведена ранее {Adamou, 2001, Hamel, 2004, Ogunniyi, 2007, Zhang, 2001}. После открытия PhtA, PhtB и PhtD исследовали их способность обеспечивать защиту от нескольких пневмококковых изолятов у мышей {Adamou, 2001}. Было обнаружено, что PhtD является Pht-белком, обеспечивающим защиту от наибольшего числа изолятов, в то время как иммунизация PhtA была эффективна против меньшего числа исследованных штаммов. Это согласуется с результатами настоящего исследования, показывающими, что PhtA экспрессирован у 62% пневмококковых штаммов, в то время как PhtD присутствует у 100%. Несмотря на успешное использование в двух исследованиях, способность PhtB обеспечивать перекрестный иммунитет неизвестна, поскольку его оценивали только против одного штамма {Adamou, 2001, Zhang, 2001} Тем не менее, поскольку авторы изобретения обнаружили его у 81% штаммов, можно ожидать, что обеспечиваемый им перекрестный иммунитет не будет оптимальным Что касается PhtE, этот белок обнаружен у 97% штаммов, что может указывать на перекрестный иммунитет против широкого спектра штаммов Тем не менее, этот Pht-белок идентичен трем другим Pht-белам лишь на 32%, и его С-концевая область, наиболее иммуногенная и консервативная, специфична для PhtE Эта область PhtE, присутствующая у других Pht-белков, недоступна для антител {Adamou, 2001, Hamel, 2004} Следовательно, PhtD, присутствующий у всех исследованных штаммов, имеющий аминокислотную последовательность, высококонсервативную среди пневмококков, и также демонстрирующий перекрестную реактивность с PhtA и PhtB, является лучшим вариантом
Пример 7
Иммунизация Pht-белками обеспечивает защиту в мышиной модели летального интраназального заражения пневмококками
Для оценки защиты, обеспечиваемой представителями Pht-семейства при интраназальном заражении мышей пневмококками, проводили внутримышечную (в/м) иммунизацию самок мышей OF1 (в возрасте четырех недель, n = 20 на группу) на 0 и 14 сутки 1 мкг PhtD, PhtA, PhtB или PhtE, включенных в композицию с адъювантной системой AS02, состоящей из эмульсии типа ''масло в воде'', дополненной 3-де-О-ацилированным-4'-монофосфориллипидом A (MPL) и QS21 (Garcon et al Expert Rev Vaccines 6, 723739 (2007). Контрольным животным вводили только AS02. На 28 сутки проводили интраназальное заражение мышей пневмококковым штаммом типа 3/43 (105 КОЕ в 50 мкл). Смертность отмечали в течение 10 суток после заражения.
В других экспериментах сравнивали вакцинацию 1 мкг PhtD, 10 мкг PspA и 10 мкг CbpA. Все антигены включали в композицию с адъювантной системой AS04, состоящей из солей алюминия с MPL (Gar-con et al Expert Rev Vaccines 6, 723-739 (2007). Внутримышечные иммунизации проводили на 0, 14 и 28 сутки. Контрольных животных вакцинировали только адъювантом На 42 сутки проводили интраназаль-ное заражение мышей S. pneumoniae типа 4/CDC (5 х 106 КОЕ), типа 2/D39 (2 х 105 КОЕ) или типа 3/43 (105 КОЕ) в 50 мкл. Смертность отмечали в течение 10 суток после заражения. Данные о выживаемости анализировали логарифмическим ранговым критерием Мантеля-Гензеля (Mantel-Haenszel).
Результаты показывают, что вакцинация любым из использованных Pht-белков позволила выжить приблизительно 60% мышей, в то время как в контрольной группе выжили лишь 20% животных (фиг.
10).
В последующих экспериментах другие группы животных вакцинировали тремя разными антигенами пневмококков, PspA, CbpA и одним белком Pht-семейства, а именно PhtD. Оценивали интенсивность гуморального ответа и проводили заражение животных тремя разными штаммами пневмококков через две недели после последней иммунизации. Выживаемость мышей отмечали для всех комбинаций антиген/штамм.
Полученные уровни антител зависели от антигена (фиг. 11А). Вакцинация 1 мкг PhtD приводила к более высоким титрам антител, чем вакцинация 10 мкг CbpA или PspA. Тем не менее, степень защиты от летального интраназального заражения штаммом 2/D39, от которого имеют происхождение CbpA и PspA, была сходной для трех использованных антигенов при выживаемости приблизительно 70% (Фиг. 12А). Различия, обусловленные антигенами, были подтверждены при использовании других штаммов. Действительно, вакцинация PhtD позволила выжить 60% и 80% мышей после заражения штаммами 3/43 и 4/CDC, соответственно. В отличие от этого, CbpA и PspA не обеспечивали защиту или обеспечивали очень слабую защиту при заражении типами 3 и 4. Таким образом, PhtD был единственным антигеном, способным обеспечивать защиту от трех исследованных штаммов.
Пример 8
Иммунизация Pht-белками защищает мышей от колонизации носоглотки S. pneumoniae Для оценки способности иммунизации против PhtD предотвращать средний отит применяли исследование колонизации носоглотки. В нескольких исследованиях была показана связь колонизации носо
глотки и среднего отита. Bogaert et al. Lancet Infect. Dis. 4(3); 144-154 (2004) показали, что частота колонизации обычно выше при инфекциях дыхательных путей и среднем отите. Действительно, пневмококковое заболевание не возникает без предшествующей и/или сопутствующей колонизации носоглотки гомологичным штаммом (Grey et al. J. Infect. Dis. 142; 923-933 (1980), Syrjanea et al. Paediatr. Infect. Dis. J. 24; 801-806 (2005)).
Проводили интраназальную иммунизацию мышей Balb/c (в возрасте четырех недель; n = 10 на группу) на 0, 14 и 28 сутки 5 мкг PhtD, PhtA, PhtB или PhtE с 0,2 мкг лабильного токсина (LT) E. coli в качестве адъюванта (за исключением последней иммунизации). Другой эксперимент с тем же протоколом (схемой введения и дозами) заключался в сравнении PhtD с CbpA, PsaA и PspA. Контрольным мышам вводили LT сам по себе. На 42 сутки проводили интраназальное заражение мышей 7 х 104 КОЕ штамма типа 6B/CDC, типа 4/CDC или типа 2/D39. Заражения проводили с использованием небольшого объема бактериального инокулята (10 мкл). Проводили подсчет бактериальных колоний в назальных смывах, полученных на 2 и 6 сутки после заражения. Назальные смывы получали путем введения 500 мкл PBS в носовую полость анестезированных мышей. Затем для подсчета бактериальных колоний 100 мкл назального смыва разводили в десять раз в бульоне Тодда-Гевитта. 10 мкл полученного раствора высевали на кровяной агар Difco(tm), дополненный дефибринированной стерильной овечьей кровью и ген-тамицином (3 мкг/мл). Для распределения образца чашки Петри наклоняли и подсчет колоний проводили после инкубации в течение ночи при 37°С. После нормализации все данные, полученные при подсчете колоний, сравнивали посредством ANOVA и затем, при значимых различиях согласно ANOVA, апостериорным критерием Даннетта (Dunnett).
Для оценки защитного действия вакцинации против носительства пневмококков в носоглотке проводили интраназальную иммунизацию мышей Balb/c разными Pht-белками перед их заражением штаммом 2/D39 тем же способом введения. Как можно видеть на фиг. 13, несмотря на то, что только вакцинация PhtD или PhtE обеспечивала существенную защиту при заражении штаммом 2 типа, снижение бактериальной нагрузки в носоглотке вакцинированных животных могли обеспечить все представители Pht-семейства. Ввиду лучшего эффекта PhtD в данной модели этот представитель Pht-семейства был выбран для дальнейших экспериментов, заключающихся в сравнении PhtD с другими белками пневмококков. Таким образом, мышей иммунизировали разными антигенами пневмококков, включая PhtD, и затем заражали штаммом типа 2, типа 4 или типа 6В.
Аналогично наблюдениям после системной иммунизации гуморальные ответы, полученные после интраназальной иммунизации, зависели от антигена (фиг. 11Б). В частности, CbpA приводил к более низким титрам антител, чем PspA и PhtD. Тем не менее, степень защиты, обеспечиваемая CbpA, против гомологичного штамма 2/D39 была сходна со степенью защиты, обеспечиваемой PspA и PhtD (фиг. 14А).
При использовании типа 4/CDC для заражения только иммунизация PhtD могла защитить животных от колонизации носоглотки, в то время как иммунизация CbpA, PsaA или PspA статистически не отличалась от контроля LT (фиг. 14Б). В завершение, заражение типом 6B/CDC не выявило каких-либо различий в защите на 2 сутки после заражения при иммунизации животных CbpA, PspA или PhtD (фиг. 14В). В этом отношении, по-видимому, только PsaA является менее эффективным. На 6 сутки после заражения статистически значимых отличий между группами не было. Тем не менее, подробное изучение результатов, полученных для PhtD, выявило, что большинство животных были защищены от колонизации носоглотки и что неблагоприятное статистическое заключение, вероятно, было обусловлено лишь наличием двух аномальных значений. В завершение, PhtD был единственным антигеном, способным обеспечить определенную защиту от трех штаммов, использованных в данной модели колонизации носоглотки.
Пример 9
Иммунизация PhtD защищает мышей от колонизации легких S. pneumoniae
Данная модель была взята из Briles et al. J. Infect. Dis. 188; 339-348 (2003). Проводили внутримышечную иммунизацию самок мышей CBA/J (в возрасте четырех недель; n = 30 на группу) на 0, 14 и 28 сутки 3 мкг PhtD с адъювантом AS02. На 42 сутки проводили интраназальное заражение мышей 2 х 107 КОЕ/50 мкл S. pneumoniae 19F/2737. Контрольным мышам вводили только адъювант. Бактериальную нагрузку определяли подсчетом колоний в легких, полученных на 3, 4 и 5 сутки после заражения. После нормализации все данные, полученные при подсчете колоний, сравнивали посредством ANOVA и затем, при значимых различиях согласно ANOVA, апостериорным критерием Даннетта.
Мышей CBA/J, линию, восприимчивую к пневмококковым инфекциям, вакцинировали PhtD перед их заражением умеренно вирулентным бактериальным штаммом 19F. Такой протокол позволяет индуцировать очаговую пневмонию без генерализованного сепсиса. После заражения число жизнеспособных бактерий в легких оценивали на 3, 4 и 5 сутки.
Было показано, что вакцинация PhtD значительно (более чем на 95%) снижала бактериальную нагрузку в легких по сравнению с плацебо (фиг. 15а). Эффективность вакцинации PhtD была особенно очевидна при анализе числа мышей без колонизации, поскольку до 80% вакцинированных мышей оставались свободными от бактерий на 5 сутки, по сравнению с 10% в контрольной группе (фиг. 15б).
Ссылки
1. Adamou J.E., Heinrichs J.H., Erwin A.L., et al. Identification and characterization of a novel family of pneumococcal proteins that are protective against sepsis. Infect. Immun. 69(2), 949-958 (2001).
2. Ajdic D., McShan W.M., McLaughlin R.E., et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99(22), 14434-14439 (2002).
3. Ancsin J.B., Kisilevsky R. Laminin interactions important for basement membrane assembly are promoted by zinc and implicate laminin zinc finger-like sequences. J. Biol. Chem. 271(12), 6845-6851 (1996).
4. Bandyopadhyay K., Karmakar S., Ghosh A., Das P.K. High affinity binding between laminin and lam-inin binding protein of Leishmania is stimulated by zinc and may involve laminin zinc-finger like sequences. Eur. J. Biochem. 269(6), 1622-1629 (2002).
5. Beghetto E., Gargano N., Ricci S., et al. Discovery of novel Streptococcus pneumoniae antigens by screening a whole-genome X-display library. FEMS Microbiol. Lett. 262(1), 14-21 (2006).
6. Blom A.M., Kask L., Ramesh B., Hillarp A. Effects of zinc on factor I cofactor activity of C4b-binding protein and factor H. Arch. Biochem. Biophys. 418(2), 108-118 (2003).
7. Brendel V., Trifonov E.N. A computer algorithm for testing potential prokaryotic terminators. Nucleic Acids Res. 12(10), 4411-4427 (1984).
8. Brenot A., Weston B.F., Caparon M.G. A PerR-regulated metal transporter (PmtA) is an interface between oxidative stress and metal homeostasis in Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol. 63(4), 1185-1196
(2007).
9. Bridy-Pappas A.E., Margolis M.B., Center K.J., Isaacman D.J. Streptococcus pneumoniae: description of the pathogen, disease epidemiology, treatment, and prevention. Pharmacotherapy 25(9), 1193-1212 (2005).
10. Bunker V.W., Hinks L.J., Lawson M.S., Clayton B.E. Assessment of zinc and copper status of healthy elderly people using metabolic balance studies and measurement of leucocyte concentrations. Am. J. Clin. Nutr. 40(5), 1096-1102 (1984).
11. Claverys J-P. A new family of high-affinity ABC manganese and zinc permeases. Res. Microbiol. 152(3-4), 231-243 (2001).
12. Cockayne A., Hill P.J., Powell N.B.L., Bishop K., Sims C., Williams P. Molecular cloning of a 32-kilodalton lipoprotein component of a novel iron-regulated Staphylococcus epidermidis ABC transporter. Infect.
Immun. 66(8), 3767-3774 (1998).
13. Dagan R., Engelhard D., Piccard E., Englehard D. Epidemiology of invasive childhood pneumococcal infections in Israel. The Israeli Pediatric Bacteremia and Meningitis Group. JAMA 268(23), 3328-3332 (1992).
14. Dagan R., Kayhty H., Wuorimaa T., et al. Tolerability and immunogenicity of an eleven valent mixed carrier Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide-diphtheria toxoid or tetanus protein conjugate vaccine in Finnish and Israeli infants. Pediatr. Infect. Dis. J. 23(2), 91-98 (2004).
15. Dintilhac A., Alloing G., Granadel C., Claverys J-P. Competence and virulence of Streptococcus pneumoniae: Adc and PsaA mutants exhibit a requirement for Zn and Mn resulting from inactivation of putative ABC metal permeases. Mol. Microbiol. 25(4), 727-739 (1997a).
16. Dintilhac A., Claverys J-P. The adc locus, which affects competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae, encodes an ABC transporter with a putative lipoprotein homologous to a family of streptococcal adhesins. Res. Microbiol. 148(2), 119-131 (1997b).
17. Eisner A., Kreikemeyer B., Braun-Kiewnick A., Spellerberg B., Buttaro B.A., Podbielski A. Involvement of Lsp, a member of the Lral-lipoprotein family in Streptococcus pyogenes, in eukaryotic cell adhesion and
internalization. Infect. Immun. 70(9), 4859-4869 (2002).
18. Fedson D.C. and Musher D.M. Pneumococcal polysaccharide vaccines. In: Vaccines, edited by Plotkin SA and Orenstein WA, Philadelphia, PA:Elsevier, Inc, 2004, p. 529-588.
19. Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D., et al. Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98(8), 4658-4663(2001).
20. Gagnon G., Vadeboncoeur C., Levesque R.C., Frenette M. Cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of the ptsl gene encoding enzyme I of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase transport system from Streptococcus salivarius. Gene 121(1), 71-78 (1992).
21. Hamel J., Charland N., Pineau I., et al. Prevention of pneumococcal disease in mice immunized with conserved surface-accessible proteins. Infect. Immun. 72(5), 2659-2670 (2004).
22. Hanahan D. Plasmid transformation by Simanis. In: DNA cloning, edited by Glover DM, London:IRL Press, 1985, p. 109-135.
23. Harlyk C., Mccourt J., Bordin G., Rodriguez A.R., van der Eeckhout A. Determination of copper, zinc and iron in broncho-alveolar lavages by atomic absorption spectroscopy. J. Trace Elem. Med. Biol. 11(3), 137142 (1997).
24. Hausdorff W.P., Feikin D.R., Klugman K.P. Epidemiological differences among pneumococcal sero-
types. Lancet Infect. Dis. 5(2), 83-93 (2005).
25. Hava D.L., Camilli A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45(5), 1389-1405 (2002).
26. Hoskins J., Alborn W.E., Jr., Arnold J., et al. Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae
25.
strain R6. J. Bacteriol. 183(19), 5709-5717 (2001).
27. Hostetter M.K. Opsonic and nonopsonic interactions of C3 with Streptococcus pneumoniae. Microb.
Drug Resist. 5(2), 85-89 (1999).
28. Jenkinson H.F. Cell surface protein receptors in oral streptococci. FEMS Microbiol. Lett. 121(2), 133140 (1994).
29. Kunst F., Ogasawara N., Moszer I., et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390(6657), 249-256 (1997).
30. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227(5259), 680-685 (1970).
31. Loisel E., Jacquamet L., Serre L., et al. AdcAII, a new pneumococcal Zn-binding protein homologous with ABC transporters: biochemical and structural analysis. J. Mol. Biol. 381(3), 594-606 (2008).
32. Lynch J.P., III, Zhanel G.G. Escalation of antimicrobial resistance among Streptococcus pneumoniae: implications for therapy. Semin. Respir. Crit Care Med. 26(6), 575-616 (2005).
33. Mbelle N., Huebner R.E., Wasas A.D., Kimura A., Chang I., Klugman KP. Immunogenicity and impact on nasopharyngeal carriage of a nonavalent pneumococcal conjugate vaccine. J. Infect. Dis. 180(4), 1171-1176
(1999).
34. McCullers J.A., Tuomanen E.I. Molecular pathogenesis of pneumococcal pneumonia. Front Biosci. 6,
D877-D889 (2001).
35. Morrison D.A., Jaurin B. Streptococcus pneumoniae possesses canonical Escherichia coli (sigma 70) promoters. Mol. Microbiol. 4(7), 1143-1152 (1990).
36. Nunes S., Sa-Leao R., Pereira L.C., de Lencastre H. Emergence of a serotype 1 Streptococcus pneumo-niae lineage colonising healthy children in Portugal in the seven-valent conjugate vaccination era. Clin. Micro-biol. Infect. 14(1), 82-84 (2008).
37. Ogunniyi A.D., Grabowicz M., Briles D.E., Cook J., Paton J.C. Development of a vaccine against invasive pneumococcal disease based on combinations of virulence proteins of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 75(1), 350-357 (2007).
38. Ogunniyi A.D., Grabowicz M., Mahdi L.K., et al. Pneumococcal histidine triad proteins are regulated by the Zn2+-dependent repressor AdcR and inhibit complement deposition through the recruitment of complement factor H. FASEB J. 23(3), 731-738 (2009).
39. Panina E.M., Mironov A.A., Gelfand M.S. Comparative genomics of bacterial zinc regulons: enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100(17), 9912-9917 (2003).
40. Papp-Wallace K.M., Maguire M.E. Manganese transport and the role of manganese in virulence. Annu. Rev. Microbiol. 60, 187-209 (2006).
41. Peterson J.D., Umayam L.A., Dickinson T., Hickey E..K, White O. The Comprehensive Microbial Resource. Nucleic Acids Res. 29(1), 123-125 (2001).
42. Ranasinghe C., Hobbs A.A. A simple method to obtain the 5' ends of mRNA sequences by direct ligation of cDNA-RNA hybrids to a plasmid vector. Technical Tips Online 3(1), 128-132 (1998).
43. Riboldi-Tunnicliffe A., Isaacs N.W., Mitchell T.J. 1.2 A crystal structure of the S. pneumoniae PhtA
histidine triad domain a novel zinc binding fold. FEBS Lett. 579(24), 5353-5360 (2005).
44. Rosenberg M., Court D. Regulatory sequences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Annu. Rev. Genet. 13, 319-353 (1979).
45. SICARD A.M. A new synthetic medium for Diplococcus pneumoniae, and its use for the study of reciprocal transformation at the amiA locus. Genetics 50, 31-44 (1964).
46. Singleton R.J., Hennessy T.W., Bulkow L.R., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvac-cine serotypes among alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA 297(16), 1784-1792 (2007).
47. Smart L.E., Dougall A.J., Girdwood R.W.A. New 23-valent pneumococcal vaccine in relation to pneumococcal serotypes in systemic and non-systemic disease. J. Infect. 14(3), 209-215 (1987).
48. Spellerberg B., Rozdzinski E., Martin S., et al. Lmb, a protein with similarities to the Lral adhesin family, mediates attachment of Streptococcus agalactiae to human laminin. Infect. Immun. 67(2), 871-878 (1999).
49. Tettelin H., Nelson K.E., Paulsen I.T., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science 293(5529), 498-506 (2001).
50. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 76(9), 4350-4354 (1979).
51. Turner D.H., Sugimoto N., Freier S.M. RNA structure prediction. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17, 167-192 (1988).
52. Wizemann T.M., Heinrichs J.H., Adamou J.E., et al. Use of a whole genome approach to identify vaccine molecules affording protection against Streptococcus pneumoniae infection. Infect. Immun. 69(3), 15931598 (2001).
53. Yamamoto H., Uchiyama S,. Nugroho F.A., Sekiguchi J. A 23.4 kb segment at the 69-70° region of the Bacillus subtilis genome. Microbiology 143 (Pt 4), 1317-1320 (1997).
44.
54. Zhang Y., Masi A.W., Barniak V., Mountzouros K., Hostetter M.K., Green BA. Recombinant PhpA protein, a unique histidine motif-containing protein from Streptococcus pneumoniae, protects mice against intra-nasal pneumococcal challenge. Infect. Immun. 69(6), 3827-3836 (2001).
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<160> НОМЕР SEQ ID NO: 19
<170> ПРОГРАМНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: FastSEQ для Windows Version 4.0
<210> SEQ ID NO:1
<211> ДЛИНА: 180
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:1
tcttttttag aaaaacgtaa cagaaacttg acaaaagtaa ttttaaatag taaactattt 60 actggttaat taaatggtta aataaccggt ttagaaaact atttaataaa gtaaaagaag 120 ttgagaaaaa acttcatcat ttattgaaat gagggattta tgaaatttag taaaaaatat 180
<210> SEQ ID NO:2
<211> ДЛИНА: 170
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ^^т(tm))!^
<400> SEQ ID NO:2
aaaattcttg acaagttgga tatttaggag taaactatta accagttaag taatagagag 60 gagtttctgc aatttagaaa tgaattgcaa ctagaaatat caaatagaaa gagagtttcg 120 atgaaaatta ataagaaata ccttgttggt tctgcggcag ctttgatttt 170
<210> SEQ ID NO:3
<211> ДЛИНА: 120
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:3
ttcttgacaa gcaatattaa aaagagtaaa ctattaacta gttaattaac cggtttatta 60 ctttatagtg aatcaaatat acttaagaaa agaggaaaga atgaaaatta ataaaaaata 120
<210> SEQ ID NO:4
<211> ДЛИНА: 108
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:4
ctaaaaatat cttgacagat taaattttca ggagtagaat atttactagt taattaaagg 60 ttaaggagtt gttcatgaag aaacaaaatt tatttttagt cctgttaa 108
<210> SEQ ID NO:5
<211> ДЛИНА: 120
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:5
gttacggtag tcagattttt ttagaaaaac attttataaa tattcacata tctcctatat 60 ttatggtaaa atagaattat cagtttattt tggagtcaaa gatgaatata tttagaacaa 120
<210> SEQ ID NO:6 <211> ДЛИНА: 30
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:6
atctgatctc atagcgtaag gaatagcagt 30
<210> SEQ ID NO:7
<211> ДЛИНА: 180
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:7
aattatgaaa tttaaaaaga aatatatagc agctggatct gttgttatcc tttccttaag 60 tctgtgtgtt tatgctctga accaacatag ctaacaggcc aatacagata aaaatcgtgt 120 ttcatatgta aacagtaata aagacactaa gaagactgaa aatttgactc cagactaggt 180
<210> SEQ ID NO:8
<211> ДЛИНА: 131
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:8
tcagttaggt taagggagga tatattatta aggtagatgg aaagtattat gtttacctta 60 aagatcaagc tcatgcagaa aatgtacgaa caaaagatga aatcaatcgc caaaaacaag 120 aacatggtaa a 131
<210> SEQ ID NO:9
<211> ДЛИНА: 70
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:9
tagcgccctt caacaagaaa aggaaaatgc tgagcaagat cctcagacac ttgtactcta 60 tcaaaaactc 70
<210> SEQ ID NO: 10
<211> ДЛИНА: 133
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:10
aaactattgg ctttattaaa ggagagtaag taaaggtagc agcattttct aactcctaaa 60 acaggatagg agaacgggaa aacgaaaaat gagagcagaa tgtgagttct agttctcatt 120 tttttcatga aat 133
<210> SEQ ID NO: 11
<211> ДЛИНА: 113
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:11
aaagaaagtc aaccggctcc tatacagtag taaaatgaat ggagcatatt ttatggagaa 60 gtaacctttc gtgttacttc tcttttttag aaaaacgtaa cagaaacttg aca 113
<210> SEQ ID NO: 12
<211> ДЛИНА: 104
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:12
agtaaggaaa aaataaacta atgaaaaatg aaagtctcga taaagaggct ttcattttta 60
ttatgtatat atgtaaaatt cttgacaagc aatattaaaa agag 104
<210> SEQ ID NO: 13
<211> ДЛИНА: 66
<212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:13
acgttaattt tgattaatcg aaaagtccct gcaactcagt tacagggatt tttttgatat 60 tttaaa 66
<210> SEQ ID NO: 14 <211> ДЛИНА: 19
<212> ТИП: ПРТ
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:14
Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Leu Val Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ser Val
<210> SEQ ID NO: 15 <211> ДЛИНА: 19
<212> ТИП: ПРТ
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:15
Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Thr Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Val
<210> SEQ ID NO: 16 <211> ДЛИНА: 19
<212> ТИП: ПРТ
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:16
Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Val Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Val
<210> SEQ ID NO: 17 <211> ДЛИНА: 19
<212> ТИП: ПРТ
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:17
Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Ser Val
<210> SEQ ID NO: 18 <211> ДЛИНА: 19
<212> ТИП: ПРТ
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:18
Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Val Ala Gly Ser Val Ala Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Ser Val
<210> SEQ ID NO: 19 <211> ДЛИНА: 20
<212> ТИП: ПРТ
<213> ОРГАНИЗМ:S.pneumoniae
<400> SEQ ID NO:19
Met Lys Phe Ser Lys Lys Tyr Ile Ala Ala Gly Ser Ala Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn2+ и/или Mn2+, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (PhtX) человеку, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD
и PhtE.
2. Способ по п.1, где концентрация свободного Zn2+ или Mn2+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.
3. Способ по п.1, где концентрация Zn2+ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.
4. Способ по любому из пп.1-3, где уровни Zn2+ и/или Mn2+ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.
5. Способ по любому из пп.1-4, где человек страдает от стресса.
6. Способ по любому из пп.1-5, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.
7. Способ по любому из пп.1-6, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.
8. Способ по п.7, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.
9. Применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка PhtX в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Zn2+ и/или Mn2+, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE.
10. Применение по п.9, где концентрация Zn2+ или Mn2+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.
11. Применение по п.9, где концентрация Zn2+ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.
12. Применение по любому из пп.9-11, где уровни Zn2+ и/или Mn2+ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или крови.
13. Применение по любому из пп.9-12, где человек страдает от стресса.
14. Применение по любому из пп.9-13, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.
15. Применение по любому из пп.9-14, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.
16. Применение по п.15, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.
10.
10.
10.
10.
10.
8 -
3 сутки
4 сутки
5 сутки
7 -
(среднее число КОЕ)
6 -
о *
° i
3 -
2 -
- <ЕШ &В - -OV
- <жшэ-•
PhtD Контроль
PhtD Контроль Антигены
PhtD Контроль
Фиг. 15
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023702
023702
- 1 -
- 1 -
023702
023702
- 1 -
- 1 -
023702
023702
- 1 -
- 1 -
023702
023702
- 1 -
- 1 -
023702
023702
- 1 -
- 1 -
023702
023702
- 1 -
- 1 -
023702
023702
- 4 -
- 3 -
023702
023702
- 4 -
023702
023702
- 7 -
- 7 -
023702
023702
- 13 -
023702
023702
- 16 -
- 16 -
023702
023702
- 23 -
- 23 -
023702
023702
- 25 -
- 25 -
023702
023702
- 26 -
- 26 -
023702
023702
- 29 -
- 29 -