|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Антитело против CD127, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 и 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки: (1) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5, (2) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6, (3) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7. 2. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:13 (1А11.H3 V H ). 3. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь, как указано в SEQ ID NO:114 или SEQ ID NO:118. 4. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:121 или SEQ ID NO:123. 5. Антитело по любому из пп.1-4, содержащее вариабельную область легкой цепи, как указано в SEQ ID NO:22. 6. Антитело по любому из пп.1-5, содержащее легкую цепь, как указано в SEQ ID NO:115. 7. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:13, и вариабельную область легкой цепи, как указано в SEQ ID NO:22. 8. Антигенсвязывающий белок, содержащий следующие гипервариабельные участки: (1) CDRH1, как указано в SEQ ID NO:2, (2) CDRH2, как указано в SEQ ID NO:3, (3) CDRH3, как указано в SEQ ID NO:4, 132, 133, 134, 135, 136 или 137, (4) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5, (5) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6, (6) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7, где указанный антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127. 9. Антигенсвязывающий белок по п.8, содержащий следующие гипервариабельные участки: (1) CDRH1, как указано в SEQ ID NO:2, (2) CDRH2, как указано в SEQ ID NO:3, (3) CDRH3, как указано в любой из SEQ ID NO:132, 133, 134, 135, 136 или 137, (4) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5, (5) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6, (6) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7. 10. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний или расстройств, в которые вовлечены патогенетические аутореактивные Т-клетки, содержащая антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий белок по п.8 или 9 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. 11. Применение антитела по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающего белка по п.8 или 9 в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Антитело против CD127, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 и 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки: (1) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5, (2) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6, (3) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7. 2. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:13 (1А11.H3 V H ). 3. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь, как указано в SEQ ID NO:114 или SEQ ID NO:118. 4. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:121 или SEQ ID NO:123. 5. Антитело по любому из пп.1-4, содержащее вариабельную область легкой цепи, как указано в SEQ ID NO:22. 6. Антитело по любому из пп.1-5, содержащее легкую цепь, как указано в SEQ ID NO:115. 7. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:13, и вариабельную область легкой цепи, как указано в SEQ ID NO:22. 8. Антигенсвязывающий белок, содержащий следующие гипервариабельные участки: (1) CDRH1, как указано в SEQ ID NO:2, (2) CDRH2, как указано в SEQ ID NO:3, (3) CDRH3, как указано в SEQ ID NO:4, 132, 133, 134, 135, 136 или 137, (4) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5, (5) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6, (6) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7, где указанный антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127. 9. Антигенсвязывающий белок по п.8, содержащий следующие гипервариабельные участки: (1) CDRH1, как указано в SEQ ID NO:2, (2) CDRH2, как указано в SEQ ID NO:3, (3) CDRH3, как указано в любой из SEQ ID NO:132, 133, 134, 135, 136 или 137, (4) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5, (5) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6, (6) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7. 10. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний или расстройств, в которые вовлечены патогенетические аутореактивные Т-клетки, содержащая антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий белок по п.8 или 9 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. 11. Применение антитела по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающего белка по п.8 или 9 в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием.
Евразийское
патентное
ведомство
023700
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201290589
(22) Дата подачи заявки
2011.01.26
(51) Int. Cl. C07K16/28 (2006.01)
(54) СБ127-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ
(31) 61/299,010
(32) 2010.01.28
(33) US
(43) 2013.05.30
(86) PCT/US2011/022507
(87) WO 2011/094259 2011.08.04
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Керби Айан (GB), Тейлор Александр Х. (US), Уэбб Томас Мэттью (GB), Сюэ
Юй (US)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(56) US-A1-20090226442 US-A1-20100016556 US-A1-20030229208 US-A1-20050025763 US-A1-20100040616 US-A1-20020142359 US-A1-20080226621 US-A1-20070066798
(57) В изобретении предложены антигенсвязывающие белки, которые связываются с человеческим рецептором IL-7 (CD127). Антигенсвязывающие белки представляют собой типичные антитела и полезны в лечении заболеваний или расстройств у людей, в особенности аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим белкам, в частности иммуноглобулинам, которые специфически связываются с а-цепью человеческого рецептора IL-7 (CD127). Изобретение также относится к способам лечения заболеваний или расстройств с использованием указанных белков, фармацевтическим композициям, содержащим указанные белки, и способам их изготовления. Другие аспекты настоящего изобретения будут понятны из нижеприведенного описания.
Предшествующий уровень техники
Рассеянный склероз (РС) представляет собой хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание, поражающее центральную нервную систему. Полагают, что при РС инфильтрирующие воспалительные иммунокомпетентные клетки вовлечены в деструкцию олигодендроцитов, представляющих собой клетки, обеспечивающие образование и поддержание жирового слоя, известного как миелиновая оболочка. РС приводит к истончению или полной потере миелина. При потере миелина нейроны больше не могут эффективно проводить электрические сигналы, что ведет к многочисленным неврологическим дисфункциям. У индивидов, страдающих от РС, происходит образование аутореактивных Т-клеток, участвующих в формировании воспалительных очагов вдоль миелиновой оболочки нервных волокон. Спинно-мозговая жидкость пациентов, страдающих от активного РС, содержит активированные Т-клетки, инфильтрирующие ткань головного мозга и приводящие к характерным воспалительным очагам с разрушением миелина. Несмотря на то что симптомы рассеянного склероза и течение заболевания отличаются у разных людей, существуют три формы заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий РС, вторичный прогрессирующий РС и первичный прогрессирующий РС.
На ранних стадиях РС воспалительные атаки происходят в течение коротких интервалов острого повышения активности заболевания. За этими эпизодами следуют периоды восстановления и ремиссии. В периоде ремиссии происходит рассасывание местного отека в очагах в нервной системе, иммуноком-петентные клетки становятся менее активными или неактивными, и происходит ремиелинизация аксонов клетками, образующими миелин. Проведение сигналов по нервам улучшается, и нетрудоспособность, вызванная воспалением, становится менее тяжелой или полностью исчезает. Эту фазу заболевания называют рецидивирующе-ремиттирующим РС (РРРС). Тем не менее, полного заживления всех очагов не происходит. Некоторые сохраняются в форме "хронических" очагов, обычно имеющих демиелинизиро-ванную центральную область без иммунокомпетентных клеток. С течением времени происходит гибель большей части клеток в центре таких очагов, хотя воспаление часто продолжается на их краях. Возможна хорошая адаптация головного мозга к потере некоторых нейронов, и постоянной нетрудоспособности может не быть на протяжении многих лет. Тем не менее, более 50% пациентов с РС в конечном счете переходят в стадию прогрессивного ухудшения, называемую вторичным прогрессирующим РС (ВПРС). На этой стадии базисные лекарственные средства больше не оказывают эффекта на течение заболевания, и нетрудоспособность пациентов постоянно ухудшается. Разрушение нейронов, начиная с ранних стадий при естественном течении РС, позволяет предположить, что прогрессирующая нетрудоспособность при ВПРС может быть результатом накопленной потери нейронов, которая в конечном счете превышает компенсаторные возможности головного мозга. Первичный прогрессирующий РС представляет собой тип рассеянного склероза без рецидивов, но при котором в течение периода продолжительностью несколько лет происходит постепенная потеря физических и когнитивных функций.
Цель лечения пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом состоит в снижении частоты и тяжести рецидивов (и, посредством этого, предотвращении обострений), а также в предотвращении или задержке начала прогрессирующей фазы заболевания. Для достижения этой цели, особенно раньше, использовали иммуномодулирующие или иммуносупрессивные лекарственные средства, но они никогда не имели широкого признания ввиду ограниченной эффективности и значительной токсичности. Например, были успешно проведены крупные рандомизированные контролируемые исследования с интерфероном бета-1а, интерфероном бета-Ш и ацетатом глатирамера.
Как измененные аутоиммунные Т-клеточные ответы, так и дисфункция регуляторной сети иммунной системы играют важную роль при аутоиммунных патологических состояниях человека, таких как РС и ревматоидный артрит (Kuchroo et al., (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:101-123; Sospedra and Martin (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 683-747; Toh and Miossec (2007) Curr. Opin. Rheumatol. 19:284-288).
Несмотря на то что этиология и патогенез РС остаются неизвестными, его обычно рассматривают как аутоиммунное патологическое состояние, при котором, как полагают, аутореактивные Т-клетки, обладающие патогенным потенциалом, такие как TH1- и TH^-mre'riai, играют важную роль. Существуют доказательства активации этих эффекторных Т-клеток in vivo при развитии заболевания, и ими обусловлено воспаление в центральной нервной системе (ЦНС). Также существуют доказательства того, что эти Т-клетки опосредуют разрушение клеток, экспрессирующих миелин, в очагах при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ) и РС в активной фазе заболевания. С другой стороны, у пациентов с РС присутствует недостаточность регуляторных Т-клеток (T^-клеток), в норме сдерживающих патогенные ТН1- и ^17-^^^, что также способствует отклонению иммунной системы к провоспали-тельному состоянию.
Три независимые группы недавно сообщили результаты обширного сканирования генома на пред
мет однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в общей сложности у 17947 доноров с или без РС. После сканирования 334923 SNP они обнаружили высокозначимую связь (в целом, р = 2,9 х 10-7) несинонимичного кодирующего SNP в альфа-цепи человеческого рецептора IL-7 (IL-7Ra) и восприимчивости к РС. Данный SNP соответствует замене Т на С в экзоне 6 CD 127 (также известного как IL-7Ra). Эта замена увеличивает вероятность пропуска экзона 6 при сплайсинге РНК, что приводит к образованию растворимой формы CD127. Кроме того, экспрессия РНК CD127 и IL-7 в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) пациентов с РС существенно выше, чем в СМЖ пациентов с другими неврологическими расстройствами.
Известно, что IL-7 и рецептор IL-7 (IL-7R) играют важную роль в развитии и гомеостазе Т-клеток и В-клеток, главным образом в тимусе. Действительно, клетки стромы тимуса, фетальный тимус и костный мозг являются местами образования IL-7. Рецептор IL-7 состоит из двух субъединиц, CD127 и общей цепи (гамма-цепи или yc), общей для рецепторов интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-4 (IL-4), интер-лейкина-9 (IL-9), интерлейкина-15 (IL-15) и интерлейкина-21 (IL-21).
CD127 также известен как альфа-рецептор IL-7 (IL-7Ra) и р90 IL-7R. Человеческий CD127 (регистрационный номер Swiss-Prot P16871) имеет в общей сложности 459 аминокислот (20 в сигнальной последовательности). Он содержит внеклеточную область из 219 аминокислот, трансмембранную область из 25 аминокислот и внутриклеточную область из 195 аминокислот. Нумерация остатков в CD 127, как она использована здесь (например, для описания эпитопов антител), основана на полноразмерном белке, включая остатки сигнальной последовательности. CD127 может существовать в четырех изоформах, изоформа Н20 (регистрационный номер Swissprot P16871-1) имеет следующую аминокислотную последовательность (включая сигнальную последовательность).
MTILGTTFGM VFSLLQWSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSF SCYSQLEVNG SQHSLTCAFE DPDVNTTNLE FEICGALVEV KCLNFRKLQE IYFIETKKFL LIGKSNICVK VGEKSLTCKK IDLTTIVKPE APFDLSVIYR EGANDFVVTF NTSHLQKKYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTH VNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP ILLTISILSF FSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP ESFLDCQIHR VDDIQARDEV EGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVWTPES FGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDC RESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 1)
CD127 также обнаружен в рецепторе лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP). Рецептор TSLP представляет собой гетеродимер CD 127 и фактора 2, подобного рецепторам цитокинов (CRLF2, cytokine receptor-like factor 2).
Связывание IL-7 с IL-7R активирует множество сигнальных метаболических путей, включая активацию Янус-киназ (JAK-киназ) 1 и 3, что приводит к фосфорилированию и активации трансдуктора сигналов и активатора транскрипции 5 (STAT-5). Этот метаболический путь является ключевым для выживания развивающихся в тимусе предшественников Т-клеток, поскольку активация STAT-5 необходима для индукции антиапоптотического белка Bcl-2 и предотвращения проникновения проапоптотического белка Bax в митохондрии. Другим опосредованным IL-7R метаболическим путем является активация фосфатидилинозитол-3-киназы (PB-киназы), приводящая к фосфорилированию проапоптотического белка Bad и его накоплению в цитоплазме. Экспрессия CD127 происходит в покоящихся периферических Т-клетках и Т-клетках памяти. Механизм регуляции выживания и гомеостаза Т-клеток посредством IL-7 и источник IL-7 на периферии не полностью ясны. Кроме того, его возможная роль в дифференци-ровке и функционировании патогенных Т-клеток при аутоиммунном заболевании мало изучена и в значительной степени неизвестна. Существует несколько сообщений, позволяющих предположить, что IL-7 может способствовать патогенезу аутоиммунных заболеваний.
Недавно Liu и коллеги (Liu et al., (2010) Nature Medicine 16:191-197) описали роль IL-7 в выгживании и росте ТН17. Мышиные антитела против CD127 (включающие антитела против CD127 1А11 и 6А3) и их роль в лечении РС и других аутоиммунных заболеваний описаны в заявке РСТ № PCT/US2009/053136.
Желательно выделить и разработать дополнительные моноклональные антитела, которые связываются с и/или ингибируют биологическое действие человеческого CD127. Такие антитела могут быть терапевтически полезны в лечении РС и других воспалительных и аутоиммунных заболеваний и расстройств, особенно заболеваний и расстройств, в которые вовлечены патогенные клетки ТН17.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предложены антигенсвязывающие белки, которые специфически связываются с CD127. Антигенсвязывающие белки могут быть использованы в терапевтических способах, в частности в лечении или предотвращении заболеваний, в которые вовлечены патогенные клетки TH17. Антигенсвя-зывающие белки могут связываться с CD127 и ингибировать, например нейтрализовать, биологическую функцию CD127.
В первом аспекте изобретения предложены антигенсвязывающие белки, такие как антитела, которые содержат от одного до шести из следующих гипервариабельных участков или их вариантов:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4 или в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
(1)
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7.
В еще одном аспекте изобретения предложены антигенсвязывающие белки, такие как антитела, которые содержат от одного до шести из следующих гипервариабельных участков или их вариантов:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:39,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:40,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:41,
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:42,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:43,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:44.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, возможно химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Антитело может содержать один или более чем один CDR (гипервариабельный участок) (из SEQ ID N0:2-7 или 39-44 из донорного антитела) в скелете акцепторного антитела. Скелет акцепторного антитела может представлять собой человеческое антитело.
В одном аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4 или в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 66, остатка фенилаланина, метионина, изолейцина, лейцина или валина в положении 69, и остатка валина, аргинина, аланина или лейцина в положении 71 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация в соответствии с Кабат).
В одном воплощении гуманизированное антитело содержит лейцин в положении 69. В одном воплощении гуманизированное антитело содержит валин в положении 71. В одном воплощении гуманизированное антитело содержит лейцин в положении 69 и валин в положении 71. В одном воплощении гуманизированное антитело содержит лизин в положении 66, лейцин в положении 69 и валин в положении 71. За исключением вышеупомянутых точечных мутаций, вариабельная область тяжелой цепи может иметь последовательность скелетной человеческой генеративной вариабельной области. Например, в одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи происходит из IGHV12 человеческой скелетной
области (SEQ ID N0:116).
Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложено антитело, содержащее один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4 или в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
в скелетной области VH, где скелетная область VH происходит из человеческой генеративной скелетной области VH и содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 66, остатка фени-лаланина, метионина, изолейцина, лейцина или валина в положении 69, и остатка валина, аргинина, ала-нина или лейцина в положении 71 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация в соответствии с Ка-бат). В одном воплощении человеческая скелетная область VH представляет собой человеческую скелетную область IGHV1_2(SEQ ID N0:116).
Антитело по изобретению может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1 (SEQ ID N0:2) и CDRH3 (SEQ ID N0:4); CDRH2 (SEQ ID N0:3) и CDRH3 (SEQ ID N0:4); CDRH1 (SEQ ID N0:2) и CDRH2 (SEQ ID N0:3); или CDRH1 (SEQ ID N0:2), CDRH2 (SEQ ID N0:3) и CDRH3 (SEQ ID N0:4). Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи любой из SEQ ID N0:10-17 (с 1A11.H0 VH по 1A11.H7 VH). В одном воплощении гуманизированное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID N0:13 (1A11.H3 VH). В любом из этих воплощений CDRH3 с SEQ ID N0:4 может быть замещен CDRH3, как указано в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137. Альтернативно, вариабельная область тяжелой цепи с SEQ ID N0:13 может содержать одну или более чем одну замену, выбранную из N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bI и F100bV (Кабат). В еще одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131. В одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи образует пару с вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:16.
В настоящем изобретении также предложено антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5,
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6,
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 45,
остатка пролина в положении 46, остатка триптофана в положении 47, остатка валина в положении 58, остатка валина в положении 60, остатка серина в положении 70, и остатка тирозина или фенилаланина в положении 71 вариабельной области легкой цепи (нумерация в соответствии с Кабат).
В одном воплощении антитело содержит остаток пролина в положении 46. В одном воплощении антитело содержит остаток тирозина в положении 71. В одном воплощении антитело содержит остаток пролина в положении 46 и остаток тирозина в положении 71.
Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1 (SEQ ID N0:5) и CDRL3 (SEQ ID N0:7); CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7); CDRL1 (SEQ ID N0:5)
и CDRL2 (SEQ ID N0:6); или CDRL1 (SEQ ID N0:5), CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7).
Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи любой из SEQ ID N0:18-27 (с 1A11.L0 VK по 1A11.L9 VK). В одном воплощении антитело содержит вариабельную область легкой цепи с SEQ ID N0:22 (1А111,4 VK).
В еще одном аспекте изобретения предложено антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4 или в любом из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 66, остатка фенилаланина, метионина, изолейцина, лейцина или валина в положении 69 и валина, аргинина, аланина или лейцина в положении 71 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация в соответствии с Кабат);
и вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5,
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6,
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 45, остатка пролина в положении 46, остатка триптофана в положении 47, остатка валина в положении 58, остатка валина в положении 60, остатка серина в положении 70 и остатка тирозина или фенилаланина в положении 71 вариабельной области легкой цепи (нумерация в соответствии с Кабат).
Антитело может содержать любую комбинацию CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, включающую от одного CDR тяжелой цепи и одного CDR легкой цепи, до всех шести указанных CDR (т.е. все 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи). В одном воплощении антитело содержит все шесть из CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3.
В одном из воплощений антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4 или в любом из SEQ ID N0:133-SEQ ID N0:138,
и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5,
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6,
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7,
где антитело дополнительно содержит остаток лейцина в положении 69 вариабельной области тяжелой цепи и остаток пролина в положении 46 вариабельной области легкой цепи.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:13 (1А11.Ю VH) или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID N0:13, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:22 (1A11.L4 VK) или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID N0:22.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:114 или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID N0:114 или SEQ ID N0:118. В конкретных воплощениях тяжелая цепь содержит одну или более чем одну замену, выбранную из N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bI и F100bV (Кабат). В одном воплощении антигенсвя-зывающий белок содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID
N0:115 или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID N0:115. В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:114 или 118, или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID N0:114 или 118, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:115 или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID N0:115. Конкретное воплощение содержит антигенсвязывающий белок, имеющий аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:118 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID
N0:115.
В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, который содержит одну или более чем одну из:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2, или вариант этого CDR,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3, или вариант этого CDR,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4, или вариант этого CDR, или CDRH3, как указано в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5, или вариант этого CDR,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6, или вариант этого CDR,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7, или вариант этого CDR,
дополнительно содержащий скелетную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере один из следующих остатков:
(а) Val, Ile или Gly в положении 2,
(б) Leu или Val в положении 4,
(в) Leu, Ile, Met или Val в положении 20,
(г) Cys в положении 22,
(д) Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24,
(е) Gly в положении 26,
(ж) Trp или Tyr в положении 47,
(з) Ile, Met, Val или Leu в положении 48,
(и) Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69,
(к) Arg, Val, Ala или Leu в положении 71,
(л) Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78, (м) Leu или Met в положении 80, (н) Tyr или Phe в положении 90, (о) Cys в положении 92,
(п) Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94,
и/или скелетную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере один из следующих остатков:
(р) Ile в положении 2,
(с) Leu в положении 4,
(т) Cys в положении 23,
(у) Trp в положении 35,
(ф) Tyr в положении 36,
(х) Tyr или Phe в положении 71,
(ц) Cys в положении 88,
(ч) Phe в положении 98,
где антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127.
Антигенсвязывающий белок может содержать любую комбинацию CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, включающую от одного CDR до шести из указанных CDR (SEQ ID N0:2-7). В одном из воплощений антигенсвязывающий белок содержит все шесть из указанных CDR (SEQ ID N0:2-
7).
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит как области скелетной области тяжелой цепи, так и скелетной области легкой цепи, как описано выше.
В одном воплощении, антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, возможно гуманизированное или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.
Один или более чем один вариант CDR этого аспекта по изобретению может содержать:
(а) вариант CDRH1 (SEQ ID N0:2), где:
1) остаток тирозина в положении 32 заменен на изолейцин, гистидин, фенилаланин, треонин, аспа-рагин, цистеин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;
2) остаток треонина в положении 33 заменен на тирозин, аланин, триптофан, глицин, лейцин или
валин;
3) остаток метионина в положении 34 заменен на изолейцин, валин или триптофан и/или
4) остаток аспарагина в положении 35 заменен на гистидин, глутаминовую кислоту, глутамин, се-рин, тирозин или треонин;
(б) вариант CDRH2 (SEQ ID N0:3), где:
1) остаток лейцина в положении 50 заменен на аргинин, глутаминовую кислоту, триптофан, тирозин, глицин, глутамин, валин, аспарагин, лизин или аланин;
2) остаток изолейцина в положении 51 заменен на лейцин, валин, треонин, серин или аспарагин;
3) остаток аспарагина в положении 52 заменен на аспарагин, лейцин, серин или тирозин;
4) остаток тирозина в положении 53 заменен на аланин, глицин, серин, лизин, треонин или аспара-
гин;
5) аспарагин в положении 54 заменен на серин, треонин, лизин, аспарагин или глицин;
6) валин в положении 56 заменен на тирозин, аргинин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глицин, серин или аланин; и/или
7) серин в положении 58 заменен на лизин, аспарагин, треонин, аргинин, глицин, фенилаланин или тирозин;
(в) вариант CDRH3 (SEQ ID N0:4), где валин в положении 102 заменен на тирозин, гистидин, изо-
лейцин, серин, аспарагиновую кислоту или глицин;
(г) вариант CDRL1 (SEQ ID N0:5), где:
1) серин в положении 29 заменен на валин; и/или
2) метионин в положении 33 заменен на лейцин; и/или
(д) вариант CDRL3 (SEQ ID N0:7), содержащий одну или более чем одну из следующих замен:
1) глутамин в положении 89 заменен на лейцин;
2) глутаминовая кислота в положении 90 заменена на глутамин;
3) триптофан в положении 91 заменен на тирозин; и/или
4) тирозин в положении 93 заменен на серин или аргинин. Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную область тяжелой цепи любой из SEQ ID N0:10-17 (с 1А11.Н0 VH по 1A11.H7 VH) или вариабельную область тяжелой цепи любой из SEQ ID N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131. В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID N0:13 (1А11.Ю VH). Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную область легкой цепи любой из SEQ ID N0:18-27 (1A11.L0 VK по 1A11.L9 VK). В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID N0:22 (1А11Х4 VK).
В конкретном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID N0:13 (1А11.Ю VH) и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID N0:22 (1A11.L4 VK). В еще одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь с SEQ ID N0:114 или SEQ ID N0:118, в частности SEQ ID N0:118, и легкую цепь с SEQ ID N0:115. Тяжелая цепь может дополнительно содержать любую из следующих замен: N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bl и F100bV (Кабат).
В еще одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит одну или более чем одну точечную мутацию в CDRH3, и где антигенсвязывающий белок обладает более высокой связывающей аффинностью в отношении IL-7R по сравнению с антигенсвязывающим белком, лишенным указанной мутации. Например, в одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит CDRH3, как указано в SEQ ID N0:132-137. В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131.
В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, как изложено в:
(а) SEQ ID N0:11,
(б) SEQ ID N0:12,
(в) SEQ ID N0:13,
(г) SEQ ID N0:14,
(д) SEQ ID N0:15,
(е) SEQ ID N0:16,
(ж) SEQ ID N0:17,
(з) SEQ ID N0:121,
(и) SEQ ID N0:123,
(к) SEQ ID N0:125,
(л) SEQ ID N0:127,
(м) SEQ ID N0:129,
(н) SEQ ID N0:131,
или вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий 70% или большую идентичность одной из SEQ ID N0:11-17, где антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127.
В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи имеет 75% или большую, 80% или боль
шую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность одной из SEQ ID N0:11-17.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в SEQ ID N0:13, или вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий 70% или большую, 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность SEQ ID N0:13.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок имеет тяжелую цепь, имеющую 70% или большую, 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность SEQ ID N0:115 или SEQ ID N0:118.
В одном воплощении тяжелая цепь или вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой один из вариантов из SEQ ID N0:11-17, 121, 123, 125, 127, 129, 131, и где степень вариации состоит из одного или более чем одного из:
1) Val, Ile или Gly в положении 2,
2) Leu или Val в положении 4,
3) Leu, Ile, Met или Val в положении 20,
4) Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24,
5) Trp или Tyr в положении 47,
6) Ile, Met, Val или Leu в положении 48,
7) Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69,
8) Arg, Val, Ala или Leu в положении 71,
9) Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78,
10) Leu или Met в положении 80,
11) Tyr или Phe в положении 90 и
12) Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен легкой цепи, как изложено в:
(а) SEQ ID N0:19,
(б) SEQ ID N0:20,
(в) SEQ ID N0:21,
(г) SEQ ID N0:22,
(д) SEQ ID N0:23,
(е) SEQ ID N0:24,
(ж) SEQ ID N0:25,
(з) SEQ ID N0:26,
(и) SEQ ID N0:27,
или вариабельный домен легкой цепи, имеющий 70% или большую идентичность одной из SEQ ID N0:19-27, где антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен легкой цепи, как указано в SEQ ID N0:22, или вариабельный домен легкой цепи, имеющий 70% или большую идентичность SEQ ID N0:22.
В одном воплощении вариабельный домен легкой цепи имеет 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность одной из SEQ ID N0:19-27.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, имеющую 70% или большую, 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность SEQ ID N0:115.
В настоящем изобретении рассмотрено любое образование пар описанных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. Таким образом, в одном воплощении изобретения также предложен антигенсвя-зывающий белок, содержащий любую из следующих комбинаций вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи:
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:11 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:12 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID
N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:13 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:14 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:15 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:16 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:17 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:121 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:123 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:125 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или боль
шую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:127 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:129 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27); или
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:131 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27).
В одном из воплощений антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность последовательности, изложенной в SEQ ID N0:13, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность последовательности, изложенной в SEQ ID N0:22.
В одном из воплощений антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в SEQ ID N0:13, и вариабельный домен легкой цепи, как указано в SEQ ID N0:22.
В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2, или вариант этого CDR,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3, или вариант этого CDR,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4, или вариант этого CDR, или CDRH3, как указано в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5, или вариант этого CDR,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6, или вариант этого CDR,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7, или вариант этого CDR,
где по меньшей мере один из указанных CDR представляет собой вариант CDR, и где указанный антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит, по меньшей мере, CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6, или его вариант. В одном воплощении, антигенсвязывающий белок содержит, по меньшей мере, CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4, или вариант этого CDR. Вариант CDR согласно этому аспекту изобретения может содержать:
(а) вариант CDRH1 (SEQ ID N0:2), где:
1) остаток тирозина в положении 32 заменен на изолейцин, гистидин, фенилаланин, треонин, аспа-рагин, цистеин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;
2) остаток треонина в положении 33 заменен на тирозин, аланин, триптофан, глицин, лейцин или валин;
3) остаток метионина в положении 34 заменен на изолейцин, валин или триптофан и/или
4) остаток аспарагина в положении 35 заменен на гистидин, глутаминовую кислоту, глутамин, се-рин, тирозин или треонин;
1)
(б) вариант CDRH2 (SEQ ID N0:3), где:
1) остаток лейцина в положении 50 заменен на аргинин, глутаминовую кислоту, триптофан, тирозин, глицин, глутамин, валин, аспарагин, лизин или аланин;
2) остаток изолейцина в положении 51 заменен на лейцин, валин, треонин, серин или аспарагин;
3) остаток аспарагина в положении 52 заменен на аспарагин, лейцин, серин или тирозин;
4) остаток тирозина в положении 53 заменен на аланин, глицин, серин, лизин, треонин или аспара-
гин;
5) аспарагин в положении 54 заменен на серин, треонин, лизин, аспарагин или глицин;
6) валин в положении 56 заменен на тирозин, аргинин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глицин, серин или аланин; и/или
7) серин в положении 58 заменен на лизин, аспарагин, треонин, аргинин, глицин, фенилаланин или тирозин;
(в) вариант CDRH3 (SEQ ID N0:4), где валин в положении 102 заменен на тирозин, гистидин, изо-
лейцин, серин, аспарагиновую кислоту или глицин;
(г) вариант CDRL1 (SEQ ID N0:5), где:
1) серин в положении 29 заменен на валин; и/или
2) метионин в положении 33 заменен на лейцин; и/или
(д) вариант CDRL3 (SEQ ID N0:7), содержащий одну или более чем одну из следующих замен:
1) глутамин в положении 89 заменен на лейцин;
2) глутаминовая кислота в положении 90 заменена на глутамин;
3) триптофан в положении 91 заменен на тирозин; и/или
4) тирозин в положении 93 заменен на серин или аргинин.
В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий:
1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:2, или вариант его CDR,
2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:3, или вариант его CDR,
3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:4 или вариант его CDR, или CDRH3, как указано в любой из SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137,
в скелетной области вариабельного домена тяжелой цепи, которая содержит по меньшей мере один
из:
из:
(а) Val, Ile или Gly в положении 2,
(б) Leu или Val в положении 4,
(в) Leu, Ile, Met или Val в положении 20,
(г) Cys в положении 22,
(д) Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24,
(е) Gly в положении 26,
(ж) Trp или Tyr в положении 47,
(з) Ile, Met, Val или Leu в положении 48,
(и) Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69,
(к) Arg, Val, Ala или Leu в положении 71;
(л) Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78; (м) Leu или Met в положении 80; (н) Tyr или Phe в положении 90;
(0) Cys в положении 92;
(п) Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:5, или вариант его CDR,
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:6, или вариант его CDR,
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:7, или вариант его CDR
в скелетной области вариабельного домена легкой цепи, которая содержит по меньшей мере один
(а) Ile в положении 2,
(б) Leu в положении 4,
(в) Cys в положении 23,
(г) Trp в положении 35,
(д) Tyr в положении 36,
(е) Tyr или Phe в положении 71,
(ж) Cys в положении 88,
(з) Phe в положении 98;
где антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127. Вариант CDR по этому аспекту изобретения может содержать:
(а) вариант CDRH1 (SEQ ID N0:2), где:
1) остаток тирозина в положении 32 заменен на изолейцин, гистидин, фенилаланин, треонин, аспа-рагин, цистеин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;
2) остаток треонина в положении 33 заменен на тирозин, аланин, триптофан, глицин, лейцин или валин;
3) остаток метионина в положении 34 заменен на изолейцин, валин или триптофан и/или
4) остаток аспарагина в положении 35 заменен на гистидин, глутаминовую кислоту, глутамин, се-рин, тирозин или треонин;
(б) вариант CDRH2 (SEQ ID N0:3), где:
1) остаток лейцина в положении 50 заменен на аргинин, глутаминовую кислоту, триптофан, тирозин, глицин, глутамин, валин, аспарагин, лизин или аланин;
2) остаток изолейцина в положении 51 заменен на лейцин, валин, треонин, серин или аспарагин;
3) остаток аспарагина в положении 52 заменен на аспарагин, лейцин, серин или тирозин;
4) остаток тирозина в положении 53 заменен на аланин, глицин, серин, лизин, треонин или аспара-
гин;
5) аспарагин в положении 54 заменен на серин, треонин, лизин, аспарагин или глицин;
6) валин в положении 56 заменен на тирозин, аргинин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глицин, серин или аланин и/или
7) серин в положении 58 заменен на лизин, аспарагин, треонин, аргинин, глицин, фенилаланин или тирозин;
(в) вариант CDRH3 (SEQ ID N0:4), где валин в положении 102 заменен на тирозин, гистидин, изо-
лейцин, серин, аспарагиновую кислоту или глицин;
(г) вариант CDRL1 (SEQ ID N0:5), где:
1) серин в положении 29 заменен на валин; и/или
2) метионин в положении 33 заменен на лейцин; и/или
(д) вариант CDRL3 (SEQ ID N0:7), содержащий одну или более чем одну из следующих замен:
1) глутамин в положении 89 заменен на лейцин;
2) глутаминовую кислоту в положении 90 заменен на глутамин;
3) триптофан в положении 91 заменен на тирозин и/или
4) тирозин в положении 93 заменен на серин или аргинин.
В одном воплощении антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, возможно гуманизированное или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.
В еще одном аспекте изобретения предложено антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:39,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:40,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:41,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: валина в положении 24, тирозина в положении 27, серина в положении 28, изолейцина в положении 29, треонина в положении 30, метио-нина в положении 48, глицина в положении 49, изолейцина в положении 67, серина в положении 68, аргинина в положении 71, треонина в положении 73 и фенилаланина в положении 78 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация по Кабат).
В одном воплощении антитело содержит по меньшей мере один, два, три, четыре или все пять из остатков тирозина в положении 27, треонина в положении 30, метионина в положении 48, изолейцина в положении 67 и аргинина в положении 71.
Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1 (SEQ ID N0:39) и CDRH3 (SEQ ID N0:41); CDRH2 (SEQ ID N0:40) и CDRH3 (SEQ ID N0:41); CDRH1 (SEQ ID N0:39) и CDRH2 (SEQ ID N0:40); или CDRH1 (SEQ ID N0:39), CDRH2 (SEQ ID N0:40) и CDRH3 (SEQ ID N0:41). Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи любой из SEQ ID N0:48-56 (с 6A3IGHV461.H1 VH по 6A3IGHV461.H9) или SEQ ID N0:58-68 (c 6A3IGHV3-33.H1 VH по 6А3
IGHV3-33.H11).
В настоящем изобретении также предложено антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:42
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:43
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:44, где антитело дополнительно содержит:
(а) один или оба остатка глутамина в положении 45 и остаток лизина в положении 70 вариабельной
области легкой цепи или
(б) один или более чем один из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в по-
ложении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в
положении 104 (нумерация по Кабат).
В одном воплощении антитело содержит как остаток глутамина в положении 45, так и остатка ли
зина в положении 70. В еще одном воплощении антитело содержит каждый из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в положении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в положении 104.
Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1 (SEQ ID N0:42) и CDRL3 (SEQ ID N0:44); CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3 (SEQ ID N0:44); или CDRL1 (SEQ
ID N0:42) и CDRL2 (SEQ ID N0:43); или CDRL1 (SEQ ID N0:42), CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3
(SEQ ID N0:44). Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи любой из SEQ ID N0:70-72 и 138 (6A3.L1 VK, 6A3.L2 VK, 6A3.L3 VK и 6A3.L27 VK).
В еще одном аспекте изобретения предложено антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:39,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:40,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:41,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: валина в положении 24, тирозина в положении 27, серина в положении 28, изолейцина в положении 29, треонина в положении 30, метио-нина в положении 48, глицина в положении 49, изолейцина в положении 67, серина в положении 68, аргинина в положении 71, треонина в положении 73 и фенилаланина в положении 78 вариабельной области тяжелой цепи, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:42,
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:43,
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:44, где антитело дополнительно содержит:
(а) один или оба остатка глутамина в положении 45 и остаток лизина в положении 70 вариабельной
области легкой цепи или
(б) один или более чем один из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в по-
ложении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в
положении 104 (нумерация по Кабат).
Антитело может содержать любую комбинацию CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3, включая от одного CDR тяжелой цепи и одного легкой цепи до всех шести указанных CDR.
В одном из воплощений антитело содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID N0:39,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID N0:40,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID N0:41,
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID N0:42,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID N0:43,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID N0:44,
где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из:
(а) валина в положении 24, тирозина в положении 27, серина в положении 28, изолейцина в поло-
жении 29, треонина в положении 30, метионина в положении 48, глицина в положении 49, изолейцина в
положении 67, серина в положении 68, аргинина в положении 71, треонина в положении 73 и фенилала-
нина в положении 78 вариабельной области тяжелой цепи; и/или
(б) : а) по меньшей мере одного из остатка глутамина в положении 45 и остатка лизина в положении
70 вариабельной области легкой цепи или
б) одного или более чем одного из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в положении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в положении 104 (нумерация по Кабат).
Настоящее изобретение охватывает образование любой пары описанных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи. Таким образом, в одном воплощении изобретения также предложен антигенсвя-зывающий белок, содержащий любую из следующих комбинаций вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи:
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:47 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:48 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или боль- 12
шую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:49 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72, SEQ ID N0:73 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72, SEQ ID N0:73 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:50 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:51 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:52 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:53 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:54 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:55 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:56 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:57 (или последовательность, имеющую 75% или
большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:58 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:59 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:60 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:61 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:62 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:64 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:64 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:65 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:66 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138);
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:67 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138); и
вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:68 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID N0:72 или SEQ ID N0:138).
В конкретном воплощении предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID N0:53, 54 55 или 56, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID N0:138.
Связывающий белок может представлять собой антитело, в частности гуманизированное или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.
В еще одном аспекте изобретения предложено химерное антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID N0:28 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID N0:29, или вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID N0:73 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID N0:74.
Антигенсвязывающий белок по изобретению может не ингибировать сигнализацию, опосредованную TSLP. В одном воплощении антигенсвязывающий белок не ингибирует сигнализацию, опосредованную TSLP.
В изобретении также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антигенсвязываю-щий белок по настоящему изобретению. В одном воплощении изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот SEQ ID N0:30-38, SEQ ID N0:75-113, SEQ ID N0:119-120 и SEQ ID N0:122, 124, 126, 128 и 130. В настоящем изобретении также предложен экспрессирующий вектор, содержащий определенную здесь молекулу нуклеиновой кислоты, и рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая определенный здесь экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор может содержать молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с любой одной или более чем одной из SEQ ID N0:30-38, SEQ ID N0:75-113, и SEQ ID N0:119-120 и SEQ ID N0:122, 124, 126, 128 и 130. В одном воплощении экспрессирующий вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий белок, как описано ранее. В еще одном воплощении изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая экспрессирую-щий вектор, как описано ранее. В еще одном воплощении изобретения предложено антитело, экспресси-рующееся клеткой-хозяином, как описано ранее.
В изобретении также предложен способ продуцирования антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению, при котором осуществляют стадию культивирования клетки-хозяина, как определено выше, и выделения антигенсвязывающего белка.
В изобретении также предложены антитело или антигенсвязывающий белок по изобретению, которые экспрессируются клеткой-хозяином, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.
В изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязываю-щий белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
В изобретении также предложен способ лечения субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием, при котором осуществляют стадию введения субъекту антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению.
В изобретении также предложен способ лечения субъекта, страдающего заболеванием, в которое вовлечены патогенные клетки ТН17, при котором осуществляют стадию введения субъекту антигенсвя-зывающего белка по настоящему изобретению.
В изобретении также предложен способ лечения субъекта, страдающего заболеванием, ассоциированным с повышающей регуляцией экспрессии IL-17, при котором осуществляют стадию введения субъекту антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению.
В частности, аутоиммунное или воспалительное заболевание, в которые вовлечены патогенные клетки ТН17, или заболевание, ассоциированное с повышающей регуляцией экспрессии IL17, может представлять собой рассеянный склероз (MS), системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит, болезнь Бехчета или астму. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению будет полезен в способе лечения рассеянного склероза. Здесь описаны другие заболевания, которые можно лечить путем введения антигенсвязывающих белков по изобретению.
В изобретении также предложен описанный здесь антигенсвязывающий белок для применения в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием; заболеванием, в которое вовлечены патогенные клетки ТН17; или заболеванием, ассоциированным с повышающей регуляцией эскпрессии IL17.
В изобретении предложено применение описанного здесь антигенсвязывающего белка в изготовлении лекарственного средства для использования в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием; заболеванием, в которое вовлечены патогенные клетки ТН17; или заболеванием, ассоциированным с повышающей регуляцией эскпрессии IL17.
Другие аспекты и воплощения изобретения будут понятны из следующего подробного описания. Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 демонстрирует комплементзависимую цитотоксичность моноклонального антитела mAb 1A11 H3L4 против IL7R на клетки HEK293, экспрессирующие ML-7R.
Фиг. 2 демонстрирует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность гуманизированного mAb 1A11 H3L4 против IL7R и Fc-деактивированного mAb против IL7R (1А11 H3L4Fc) на клетки HEK293, экспрессирующие ML-7R, в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови.
Фиг. 3А и 3В демонстрируют ингибирование со стороны 1А11 H3L4 вызванного IL-7 фосфорили-рования STAT5 в человеческих мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), полученных из двух различных доноров.
Фиг. 4A-4D демонстрируют ингибирование со стороны 1А11 H3L4 вызванного IL-7 продуцирования IL-17 в дифференцированных человеческих клетках Th17 (у четарех различных доноров).
Фиг. 5А-5Е демонстрируют отсутствие влияния 1А11 H3L4 на TSLP-индукцию TARC (хемокин, регулируемый тимусом и при активации).
Подробное описание изобретения
Сигнализация, опосредованная IL-7/IL-7R, крайне необходима для выживания и размножения ком-митированных TH17-клеток и у мышей, и у людей, в то время как ее роль в дифференцировке TH17-клеток несущественна по сравнению с ролью IL-6 (Liu et al., (2010) Nature Medicine 16:191-197). Неожиданно оказалось, что эффект антагонизма в отношении IL-7R на иммунную систему in vivo высокоселективен при ЭАЭ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит), модели рассеянного склероза на животных, и влияет на TH17-клетки и, в меньшей степени, TH1-клетки, преимущественно с фенотипом клеток памяти, и не влияет на Tj^-клетки. Эта селективность, по-видимому, играет важную роль в восстановлении соотношения патогенных ^П-клеток и T^-клеток антагонизмом в отношении IL-7R при ЭАЭ и обусловливает эффективность лечения.
Роль сигнализации, опосредованной IL-7/IL-7R, при выживании и размножении ^П-клеток обеспечивает убедительное объяснение эффективности лечения с использованием антагонизма в отношении IL-7R при аутоиммунных заболеваниях человека, таких как РС. Нейтрализация IL-7 или антагонизм в отношении IL-7R, вероятно, имеют уникальные терапевтические преимущества. С одной стороны, лечение обладает селективностью, которая позволяет отличать патогенные TH1- и TH17-клетки от T^-клеток и неродственных иммунокомпетентных клеток. С другой стороны, дополнительные терапевтические преимущества антагонизма в отношении IL-7R включают его селективный эффект на выживание и размножение дифференцированных ^П-клеток, в отличие от дифференцировки TH17-клеток. Вероятно, направленное воздействие на поддержание коммутированных ^П-клеток in vivo, а не на дифференци-ровку ^П-клеток более эффективно в терапевтическом контексте. Таким образом, ингибирование сигнализации, опосредованной рецептором IL-7, обеспечивает перспективное терапевтическое вмешательство для лечения аутоиммунных или воспалительных заболеваний.
Используемый здесь термин "сигнализация, опосредованная IL-7R" обозначает биологический эффект, обусловленный рецепторным комплексом IL-7, связанным с его лигандом, IL-7. Таким образом, сигнализация, опосредованная IL-7R, включает одно или более чем одно, или все из индуцированного IL-7 фосфорилирования STAT-5, индуцированного IL-7 размножения TH17-клеток и индуцированного IL-7 выживания Tн17-клеток, но не обязательно ограничивается ими.
Мышиные антитела 1А11 и 6А3 описаны в заявке на патент № PCT/US2009/053136 (W02010/017468). Эти антитела специфически связываются с альфа-цепью человеческого рецептор IL-7, CD127 (SEQ ID N0:1). Вариабельные домены этих антител описаны в SEQ ID N0:8 и 9 (VH, VK 1А11 соответственно) и SEQ ID N0:45 и 46 (VH, VK 6A3 соответственно).
В настоящем изобретении предложены антигенсвязывающие белки, содержащие один или более чем один из гипервариабельных участков (CDR) 1А11 или 6А3 и их вариантов. Антигенсвязывающие
белки могут связываться с IL-7R и нейтрализовать сигнализацию, опосредованную им. В одном из воплощений изобретения предложены гуманизированное антитела, содержащие от одного до шести CDR мышиных антител 1А11 или 6А3 (донорное антитело) в человеческом акцепторном антителе.
Используемый здесь термин "антигенсвязывающий белок" относится к антителам, фрагментам антитела и другим белковым конструкциям, таким как домены, которые способны связываться с CD127. В одном воплощении антигенсвязывающий белок представляет собой антитело.
Используемый здесь термин "антитело" в самом широком смысле относится к молекулам, имеющим иммуноглобулиноподобный домен, и включает моноклональное, рекомбинантное, поликлональное, химерное, гуманизированное, биспецифическое и гетероконъюгатное антитела; единичный вариабельный домен, доменное антитело, антигенсвязывающие фрагменты, иммунологически эффективные фрагменты, одноцепочечные Fv, диатела, Tandabs(tm) и т.д. (обзор альтернативных форматов "антитела" смотри в Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23, No. 9, 1126-1136).
Фраза "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену ан-тигенсвязывающего белка (VH, VHH, VL), который специфически связывается с антигеном или эпитопом независимо от различия вариабельной области или домена.
"Доменное антитело" или "dAb" можно рассматривать как "единичный вариабельный домен", который способен к связыванию с антигеном. Единичный вариабельный домен может представлять собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела других видов, таких как грызуна (например, как раскрыто в W0 00/29004), усатой акулы и камелид-ные VHH dAb. Камелидные VHH представляют собой полипептиды единичного вариабельного домена иммуноглобулина, полученные из видов, включая верблюда, ламу, альпака, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела, имеющие тяжелую цепь, но естественным образом лишенные легких цепей. Такие VHH домены могут быть гуманизированы в соответствии со стандартными способами, имеющимися в области техники, и такие домены также рассматривают, как "доменные антитела" в соответствии с изобретением. При использовании здесь, "VH" включает камелидные VHH домены.
Используемый здесь термин "домен" относится к свернутой белковой структуре, сохраняющей свою третичную структуру независимо от остальной части белка. Как правило, домены являются ответственными за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без утраты функции оставшейся части белка и/или домена. "Единичный вариабельный домен" представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более чем одна петля заменена на последовательности, не характерные для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые усечены или содержат N- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена. Домен может связываться с антигеном или эпитопом независимо от различия вариабельной области или домена.
Антигенсвязывающий фрагмент также может быть создан в результате перегруппировки одного или более чем одного CDR с белковыми скелетами, такими как домены, не относящимися к антителам. Белковый скелет или домен, не относящийся к антителам, представляет собой белковый скелет или домен, подвергнутый белковой инженерии для обеспечения связывания с лигандом, отличающимся от его природного лиганда, например домен, который представляет собой производное скелета, выбранного из CTLA-4 (цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4, Evibody); липокалина, белковых молекул, таких как Z-домен белка А (аффитело, SpA), А-домена (авимер/Maxibody); белков теплового шока, таких как GroEl (бактериальный шаперонин, относящийся к семейству белков теплового шока 60) и GroES (кошаперонин GroEL); трансферрина (trans-body); белков-анкириновых повторов (DARPin); пептидного аптамера; лектинового домена С-типа (тетранектин); человеческого у-кристаллина и человеческого уби-квитина (аффилины); PDZ доменов; скорпионовых токсинов, доменов человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца; и фибронектина (аднектин); которые подвергнуты белковой инженерии для обеспечения связывания с лигандом, отличающимся от соответствующего природного лиганда.
CTLA-4 (цитотоксического Т-лимфоцитарный антиген 4) представляет собой CD28-семейство рецепторов, экспрессирующихся в основном на CD4+ Т-клетках. Их внеклеточный домен имеет складку Ig, подобную вариабельному домену. Петли, соответствующие CDR антитела, могут быть заменены на гете-рологическую последовательность, придающей отличающиеся связывающие свойства. Молекулы CTLA-4, сконструированные таким образом, что обладают отличающимися специфичностями связывания, также известны как эвитела. Дополнительную информацию смотри в Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).
Липокалины представляют собой семейство внеклеточных белков, которые переносят небольшие гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они обладают жесткой вторичной структурой р-складки с множеством петель по открытому концу канонической структуры, которая может быть сконструирована таким образом, чтобы связываться с различными антигенами
мишенями. Антикалины имеют размер от 160 до 180 аминокислот и являются производными липокали-нов. Дополнительную информацию смотри в Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 и
US20070224633.
Аффитело представляет собой скелет, происходящий из белка А Staphylococcus aureus, который может быть сконструирован таким образом, чтобы связываться с антигеном. Домен состоит из трехспи-рального узелка из приблизительно 58 аминокислот. Библиотеки получают путем рандомизации поверхностных остатков. Дополнительную информацию смотри в Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) и
ЕР1641818А1.
Авимеры представляют собой мультидоменные белки, происходящие из семейства А-доменного скелета. Нативные домены из приблизительно 35 аминокислот заимствуют определенную связанную дисульфидными мостиковыми связями структуру. Разнообразие создается путем перетасовки природной вариации, демонстрируемой семейством А-доменов. Дополнительную информацию смотри в Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) и Expert 0pinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007).
Трансферрин представляет собой мономерный сывороточный переносящий гликопротеин. Транс-феррины могут быть сконструированы таким образом, чтобы связывать различные антигены-мишени, путем встраивания пептидных последовательностей, таких как один или более чем один CDR, в экспонированную поверхностную петлю. Примеры сконструированных трансферриновых скелетов включают Trans-body. Дополнительную информацию смотри в J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
Сконструированные белки с анкириновыми повторами (DARPin) представляют собой производные анкирина, которые представляют собой семейство белков, опосредующих присоединение интегральных белков мембраны к цитоскелету. Единичный анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, состоящий из двух а-спиралей и р-складки. Они могут быть сконструированы таким образом, чтобы связывать различные антигены-мишени путем: рандомизации остатков в первой а-спирали и р-складки каждого из повторов; или вставки пептидных последовательностей, таких как один или более чем один из CDR. Их связывающая поверхность может быть увеличена путем увеличения количества модулей (способ аффинного созревания). Дополнительную информацию смотри в J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) и J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) и US20040132028A1.
Фибронектин представляет собой скелет, который может быть сконструирован таким образом, чтобы связываться с антигеном. Аднектины состоят из скелета из природной аминокислотной последовательности 10-го домена из 15 повторяющихся единиц человеческого фибронектина тип III (FN3). Три петли по одному концу р-сэндвича могут быть сконструированы таким образом, чтобы дать аднектину возможность специфически распознавать интересуемые терапевтические мишени. Дополнительную информацию смотри в Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, W02005056764 и
US6818418B1.
Пептидные аптамеры представляют собой комбинаторные распознающие молекулы, которые состоят из белка константного скелета, как правило, тиоредоксина (TrxA), который содержит связанную вариабельную пептидную петлю, встроенную в активный сайт. Дополнительную информацию смотри в
Expert 0pin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).
Микротела происходят из встречающихся в природе микробелков длиной 25-50 аминокислот, которые содержат 3-4 цистеиновых мостика; примеры микробелков включают KalataB1 и конотоксин и нот-тины (knottins). Микробелки имеют петлю, которая может быть сконструирована таким образом, что включает до 25 аминокислот, не влияя на общее складывание микробелка. Дополнительную информацию по сконструированным ноттиновым доменам смотри в W02008098796.
Другие связывающие домены включают белки, которые используются в качестве скелета для придания отличающихся свойств связывания с антигеном-мишенью, включая человеческий у-кристаллин и человеческий убиквитин (аффилины), домены человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца, PDZ-домены Ras-связывающего белка AF-6, скорпионовые токсины, (харибдотоксин), обзор лектиновых доменов С-типа (тетранектинов) содержится в главе 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) и Protein Science 15:14-27 (2006). Связывающие домены по настоящему изобретению могут быть получены из любого из этих альтернативных белковых доменов и любой комбинации CDR по настоящему изобретению, привитых к домену.
Антигенсвязывающий фрагмент или иммунологически эффективный фрагмент может содержать частичные вариабельные последовательности тяжелой или легкой цепи. Фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. Альтернативно, фрагменты имеют длину по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 100 аминокислот.
Используемый в настоящем описании термин "специфически связывает" в отношении антигенсвя-зывающих белков означает, что антигенсвязывающий белок связывается с CD127 при отсутствии или несущественном связывании с другими (например, неродственными) белками - т.е. описанные здесь ан-тигенсвязывающие белки и антитела могут специфически связываться с CD127. Тем не менее, термин не исключает тот факт, что антигенсвязывающие белки могут также обладать перекрестной реактивностью в отношении CD127 других видов, таких как мышиные CD127, CD127 яванского макака (Масаса fascicu
laris) или игрунки. В одном воплощении антигенсвязывающий белок связывается как с CD127 яванского макака, так и игрунки. Описанные здесь антигенсвязывающие белки могут связываться с человеческим CD127 с по меньшей мере в 2, 5, 10, 50, 100 или 1000 раз большей аффинностью по сравнению со связыванием с CD127 других видов.
Связывающая аффинность или равновесная константа диссоциации (KD) взаимодействия антигенсвязывающий белок-CD127 может составлять 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше. Альтернативно KD может составлять от 5 до 10 нМ; или от 1 до 2 нМ. KD может составлять от 1 до 500 пМ или от 500 пМ до 1 нМ. Связывающую аффинность антигенсвязывающего белка определяют при помощи константы скорости ассоциации (ka) и константа скорости диссоциации (kd) (KD = kd/ka). Связывающая аффинность может быть измерена при помощи BIAcore(tm), например, путем захвата антигена при помощи CD127, связанного с чипом СМ5, путем связывания с первичным амином и захвата антитела на этой поверхности. Способ BIAcore(tm), описанный в примере 4, может быть использован для измерения связывающей аффинности. Альтернативно, связывающая аффинность может быть измерена при помощи F0RTEbio, например, путем захвата антигена при помощи CD127, связанного с иглой СМ5, путем связывания с первичным амином и захвата антитела на этой поверхности.
kd может составлять 1х10-3 с-1 или меньше, 1х10-4 с-1 или меньше, или 1х10-5 с-1 или меньше. kd может составлять от 1х10-5 до 1х10-4 с-1; или от 1х10-4 до 1х10-3 с-1. Медленная kd может приводить в результате к медленной диссоциации комплекса антигенсвязывающий белок-лиганд и улучшенной нейтрализации лиганда.
Специалисту в данной области техники понятно, термин "производное" предназначен для определения не только источника в смысле физического происхождения материала, а также определяет материал, который структурно идентичен материалу, но который не происходит из референсного источника. Такие "остатки, обнаруженные в донорном антителе" не обязательно должны быть очищены из донорно-го антитела.
Под выделенным подразумевают, что молекула, такая как антигенсвязывающий белок, извлечена из окружающей среды, в которой ее можно обнаружить в природе. Например, молекула может быть очищена от вещества, с которым она обычно существует в природе. Например, антигенсвязывающий белок может быть очищен по меньшей мере до 95, 96, 97, 98 или 99%, или больше относительно культураль-ных сред, содержащих антигенсвязывающий белок. Антигенсвязывающие белки и антитела по настоящему изобретению могут представлять собой выделенные антигенсвязывающие белки и антитела.
"Химерное антитело" относится к типу сконструированного антитела, которое содержит встречающиеся в природе вариабельные области (легкой цепи и тяжелой цепи), происходящие из донорного антитела, в ассоциации с константными областями легкой и тяжелой цепи, происходящими из акцепторного антитела.
"Гуманизированное антитело" относится к типу сконструированного антитела, имеющего один или более чем один CDR, происходящий из отличного от человеческого донорного иммуноглобулина, где оставшиеся происходящие из иммуноглобулина фрагменты молекулы, происходят из одного или более чем одного человеческого иммуноглобулина(ов). Дополнительно, остатки, поддерживающие скелет, могут быть изменены для сохранения связывающей аффинности (смотри, например, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Подходящее человеческое акцепторное антитело может быть выбрано из обычной базы данных, например базы данных KABAT(r), базы данных Los Alamos и Swiss Protein database (Швейцарской белковой базы данных), по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностям донорного антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией со скелетными областями донорного антитела (на аминокислотной основе), может быть подходящим для получения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной скелетной области тяжелой цепи для встраивания донорных CDR. Подходящее акцепторное антитело, способное предоставлять константные или вариабельные скелетные области легкой цепи, может быть выбрано аналогичным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не обязательно должны происходить из того же самого акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описаны несколько путей продукции таких гуманизированных антител; смотри, например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
Термин "донорное антитело" относится к антителу, которое вносит вклад в аминокислотные последовательности его вариабельных доменов, один или более чем один CDR или другие функциональные фрагменты или его аналоги с первым партнером иммуноглобулином. Таким образом, донор обеспечивает область, кодирующую измененный иммуноглобулин, и в результате экспрессирует измененное антитело, обладающее антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерной для до-норного антитела.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу, гетерологичному донорному антителу, которое предоставляет все (или любой фрагмент) аминокислотные последовательности, кодирующие его скелетные области тяжелой и/или легкой цепи, и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи, первому иммуноглобулиновому партнеру. Человеческое антитело может представлять собой акцептор
ное антитело.
Используемые здесь термины "VH" и "VL" относятся соответственно к вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающего белка. VK также используется для обозначения вариабельного домена легкой цепи.
"CDR" определены как аминокислотные последовательности гипервариабельного участка антиген-связывающего белка. Они представляют собой гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. В вариабельном фрагменте иммуноглобулина имеются три CDR (или гипервариабельных участка) тяжелой и три CDR легкой цепи. Таким образом, используемый здесь термин "CDR" относится ко всем трем CDR тяжелой цепи, всем трем CDR легкой цепи, всем CDR тяжелой и легкой цепи, или по меньшей мере двух CDR.
В данном описании, если не указано иное, аминокислотные остатки в последовательностях вариабельного домена и последовательностях полноразмерного антитела пронумерованы в соответствии с правилами нумерации по Кабат. Аналогично, термины "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" использованы в примерах в соответствии с правилами нумерации по Кабат. Дополнительную информацию смотри в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).
Специалисту в данной области техники понятно, что существуют правила альтернативной нумерации аминокислотных остатков в последовательностях вариабельного домена и последовательностях полноразмерного антитела. Также существуют альтернативные правила нумерации последовательностей CDR, например, изложенные в Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883. Структура и белковый фолдинг антитела может означать, что другие остатки рассматриваются как часть последовательности CDR, и это понятно специалистам в данной области техники. Таким образом, используемый здесь термин "соответствующий CDR" относятся к последовательности CDR с использованием любого правила нумерации, например, изложенного в табл. 1.
Другие правила нумерации последовательности CDR, доступные специалистам, включают способы "AbM" (University of Bath) и "контакт" (University College London). Минимальная перекрывающаяся область с использованием по меньшей мере двух способов из Кабата, Chotia, AbM и контактного способа может быть определена с получением "минимальной связывающей единицы". Минимальная связывающая единица может представлять собой субфрагмент CDR.
В табл. 1 ниже представлено одно определение с использованием каждого из правил нумерации для каждого CDR или связывающей единицы. Схема нумерации по Кабат использована в табл. 1 для нумерации аминокислотной последовательности вариабельного домена. Следует отметить, что некоторые из определений CDR могут варьировать в зависимости от использованных конкретных публикаций.
Таблица 1
CDR по Кабат
CDR no Chotia
CDR no AbM
CDR в соответствии с контактным способом
Минимальная связывающая единица
31-35/35A/35B
26-32/33/34
26-35/35A/35B
30-35/35А/35В
31-32
50-65
52-56
50-58
47-58
52-56
95-102
95-102
95-102
93-101
95-101
24-34
24-34
24-34
30-36
30-34
50-56
50-56
50-56
46-55
50-55
89-97
89-97
89-97
89-96
89-96
Использованный здесь термин "антигенсвязывающий сайт" относится к сайту на антигенсвязы-вающем белке, который способен специфически связываться с антигеном. Он может представлять собой единичный домен (например, эпитопсвязывающий домен) или одноцепочечные Fv (ScFv) домены, или он может представлять собой спаренные VH/VL домены, которые могут быть обнаружены на обычном антителе.
Используемый здесь термин "эпитоп" относится к фрагменту антигена, который контактирует с конкретным связывающим доменом антигенсвязывающего белка. Эпитоп может быть линейным, содержащим, по существу, линейную аминокислотную последовательность антигена. Альтернативно, эпитоп может быть конформационным или дискретным. Например, конформационный эпитоп содержит аминокислотные остатки, которым требуется элемент структурного ограничения. Дискретный эпитоп содержит аминокислотные остатки, разделенные другими последовательностями, т.е. не представляет собой непрерывную последовательность в первичной последовательности антигена. В контексте третичной и четвертичной структуры остатки дискретного эпитопа достаточно близки друг к другу, чтобы связываться с антигенсвязывающим белком.
Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин "идентичный" или "идентичность последовательности" указывает на степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или двумя аминокислотными последовательностями, и, если требуется при оптимальном совмещении и сравнении с подходящими вставками или делециями.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных положений/общее число положений в 100 раз), принимая во внимание число брешей и длину каждой бреши, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять, используя математический алгоритм, как описано ниже.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить, используя программу GAP в пакете программ GCG, используя матрицу NWSgapdna.CMP и вес бреши 40, 50, 60, 70 или 80, и вес длины бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотид-ными или аминокислотными последовательностями можно также определить, используя алгоритм Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу веса остатков РАМ120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить, используя алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), который включен в программу GAP пакета программ GCG, используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ250 и вес бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В одном из способов полинуклеотидная последовательность может быть идентична описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:30-39, SEQ ID N0:76-105), то есть быть идентична на 100%, или она может включать определенное целое число нук-леотидных изменений по сравнению с референсной последовательностью, например по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична. Такие изменения выбраны из по меньшей мере одной из нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставки, и где указанные изменения могут находиться в 5'- или 3'-концевых положениях референсной нуклеотидной последовательности или где либо еще между этими концевыми положениями вперемежку или по отдельности среди нуклеотидов в референсной последовательности, или в одной или более чем одной смежных группах в пределах референсной последовательности. Количество нуклеотидных изменений определяют, умножая общее количество нуклеотидов в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:30-39, SEQ ID N0:76-105) на числовой процент соответствующей идентичности в процентах (деленной на 100) и вычитая это произведение из указанного общего количества нуклеотидов в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:30-39, SEQ ID N0:76-105), или
Пп ^ Xn - (Xn • У),
где nn представляет собой количество нуклеотидных изменений, xn представляет собой общее количество нуклеотидов в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:30-39, SEQ ID N0:76-105), и у представляет собой 0,50 для 50%, 0,60 для 60%,
0,70 для 70%, 0,75 для 75%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,98 для 98%, 0,99
для 99% или 1,00 для 100%, • представляет собой символ оператора умножения, и где любой нецелочисленный результат произведения xn и у округляют в меньшую сторону к ближайшему целому числу, после чего его вычитают из xn
Аналогично, полипептидная последовательность может быть идентична описанной здесь референс-ной полипептидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:1-29, SEQ ID N0:40-75), которая идентична на 100%, или она может включать в себя определенное целое число аминокислотных замен по сравнению с референсной последовательностью, так что % идентичности составляет менее 100%, как, например, по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, или 99% идентичности. Такие изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставки, и где указанные изменения могут находиться в амино- или карбокси-концевых положениях референсной полипептидной последовательности или где-либо вразброс еще между этими концевыми положениями или по отдельности среди аминокислот в ре-ференсных последовательностях или в одной или более чем одной смежных группах в пределах рефе-ренсной последовательности. Количество аминокислотных изменений для данного % идентичности определяют, умножая общее количество аминокислот в полипептидной последовательности, кодируемой в описанной здесь полипептидной референсной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:1-29, SEQ ID N0:40-75), на числовой процент соответствующей идентичности в процентах (деленной на 100) и затем вычитая это произведение из указанного общего количества аминокислот в описанной здесь ре-ференсной полипептидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:1-29, SEQ ID N0:40-75), или
Па ^ Ха - (Ха • У),
где na представляет собой количество аминокислотных изменений, ха представляет собой общее количество аминокислот в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, SEQ ID N0:1-29, SEQ ID N0:40-75), и у представляет собой 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70
для 70%, 0,75 для 75%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,98 для 98%, 0,99 для
99% или 1,00 для 100%, • представляет собой символ оператора умножения, и где любой нецелочисленный результат произведения ха и у округляют в меньшую сторону к ближайшему целому числу, после чего его вычитают из ха.
Процент идентичности может быть определен для полноразмерной последовательности или любых ее фрагментов; и с или без каких-либо вставок или делеций.
Каждый из терминов "пептид", "полипептид" и "белок" относится к молекуле, содержащей два или более чем два аминокислотных остатка. Пептид может быть мономерным или полимерным.
В данной области техники признано, что некоторые аминокислотные замены рассматривают как "консервативные". Аминокислоты делятся на группы на основе общих свойств боковых цепей, и замены в группах, которые сохраняют всю или по существу всю связывающую аффинность антигенсвязывающе-го белка по изобретению рассматривают как консервативные замены, смотри табл. 2 ниже.
Таблица 2
Боковая цепь
Члены
Гидрофобные
met, ala, val, leu, ile
Нейтральные гидрофильные
cys, ser, thr
Кислые
asp, glu
Основные
asn, gin, his, lys, arg
Остатки, которые влияют на ориентацию цепи
gly, pro
Ароматические
trp, tyr, phe
В настоящем изобретении предложен антигенсвязывающий белок, которых связывается с CD127 и содержит CDRH3 SEQ ID N0:4; вариант этого CDRH3, или CDRH3 с SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137. Антигенсвязывающий белок может специфически связываться с CD127 и также может нейтрализовать активность IL-7R.
В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит CDRH2 SEQ ID N0:3; или вариант этого CDRH2. Антигенсвязывающий белок может специфически связываться с CD127 и может также нейтрализовать активность IL-7R.
Антигенсвязывающий белок может содержать дополнительно к описанным выше последовательностям CDRH3 или CDRH2 один или более чем один CDR, или все CDR, в любой комбинации, выбранные из CDRH1 (SEQ ID N0:2), CDRH2 (SEQ ID N0:3), CDRH3 (SEQ ID N0:4, или любой из с SEQ ID N0:132-SEQ ID N0:137), CDRL1 (SEQ ID N0:5), CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7); или вариант любого из указанных CDR.
Например, антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:4) и CDRH1 (SEQ ID N0:2) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:4) и CDRH2 (SEQ ID N0:3) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH1 (SEQ ID N0:2) и CDRH2 (SEQ ID N0:3) и CDRH3 (SEQ ID N0:4) или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать CDRL1 (SEQ ID N0:5) и CDRL2 (SEQ ID N0:6) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRL1 (SEQ ID N0:5), CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7) или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:4) и CDRL3 (SEQ ID N0:7) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:4), CDRH2 (SEQ ID N0:3) и CDRL3 (SEQ ID N0:7) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:4), CDRH2 (SEQ ID N0:3), CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7) или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH1 (SEQ ID N0:2), CDRH2 (SEQ ID N0:3), CDRH3 (SEQ ID N0:4), CDRL1 (SEQ ID N0:5), CDRL2 (SEQ ID N0:6) и CDRL3 (SEQ ID N0:7). Альтернативно, может присутствовать вариант CDR, или CDRH3 SEQ ID N0:4 может быть заменен на любой
из CDR SEQ ID N0:132-137.
В настоящем изобретении предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит CDRH3 SEQ ID N0:41; или вариант этого CDRH3. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать активность IL-7R.
В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит CDRH2 SEQ ID N0:40; или вариант этого CDRH2. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать активность IL-7R.
Антигенсвязывающий белок может содержать дополнительно к описанным выше последовательностям CDRH3 или CDRH2 один или более чем один CDR, или все CDR, в любой комбинации, выбранные из CDRH1 (SEQ ID N0:39), CDRH2 (SEQ ID N0:40), CDRH3 (SEQ ID N0:41), CDRL1 (SEQ ID N0:42),
CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3 (SEQ ID N0:44); или вариант любого из указанных CDR.
Например, антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:41) и CDRH1 (SEQ ID N0:40) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:41) и CDRH2 (SEQ ID N0:40) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH1 (SEQ ID N0:39) и CDRH2 (SEQ ID N0:40), и CDRH3 (SEQ ID N0:41) или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать CDRL1 (SEQ ID N0:42) и CDRL2 (SEQ ID N0:43) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3 (SEQ ID N0:44) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRL1 (SEQ ID N0:42), CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3 (SEQ ID N0:44) или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:41) и CDRL3 (SEQ ID N0:44) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:41), CDRH2 (SEQ ID N0:40) и CDRL3 (SEQ ID N0:44) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH3 (SEQ ID N0:41), CDRH2 (SEQ ID N0:40), CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3 (SEQ ID N0:44) или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать CDRH1 (SEQ ID N0:39), CDRH2 (SEQ ID N0:40), CDRH3 (SEQ ID N0:41), CDRL1 (SEQ ID N0:42), CDRL2 (SEQ ID N0:43) и CDRL3 (SEQ ID N0:44). Альтернативно, может присутствовать вариант CDR.
В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит соответствующий CDRH3 последовательности вариабельного домена SEQ ID N0:8, или вариант этого CDRH3 в скелетной области человеческого акцепторного антигенсвязывающего белка. Антигенсвязывающий белок может нейтрализовать активность CD127. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.
Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать один или более чем один, или все из соответствующих CDR, выбранных из последовательности вариабельного домена SEQ ID N0: 8 и/или
SEQ ID N0: 9, или вариант его CDR.
В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который специфически связывается с CD127 и содержит соответствующий CDRH3 последовательности вариабельного домена SEQ ID N0:45, или вариант этого CDRH3 в скелетной области человеческого акцепторного антигенсвя-зывающего белка. Антигенсвязывающий белок может нейтрализовать активность CD127. Антигенсвязы-вающий белок может представлять собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.
Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать один или более чем один, или все из соответствующих CDR, выбранных из последовательности вариабельного домена SEQ ID N0:45 и/или SEQ ID N0:46, или вариант этого CDR.
Например, антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH3 и соответствующий CDRH1 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH3 и соответствующий CDRH2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH1, соответствующий CDRH2 и соответствующий CDRH3 или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRL1 и соответствующий CDRL2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRL2 и соответствующий CDRL3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRL1, соответствующий CDRL2 и соответствующий CDRL3 или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH3 и соответствующий CDRL3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH3, соответствующий CDRH2 и соответствующий CDRL3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH3, соответствующий CDRH2, соответствующий CDRL2 и соответствующий CDRL3 или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий CDRH1, соответствующий CDRH2, соответствующий CDRH3, соответствующий CDRL1, соответствующий CDRL2 и соответствующий CDRL3 или их варианты.
Соответствующие CDR могут быть определены в соответствии со способами Кабата (1987), Chotia (1989), AbM или контактным способом. Определение каждого из способов можно найти в табл. 1 и может быть применено к референсному вариабельному домену тяжелой цепи (SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:45) и референсному вариабельному домену легкой цепи (SEQ ID N0:9 и SEQ ID N0:46) для определения соответствующего CDR.
В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит связывающую единицу H3, содержащую остатки 95-101 по Кабат SEQ ID N0:8, или вариант H3.
Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческий, гуманизированный или химерный антигенсвязывающий белок, такой как антитело.
Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать одну или более чем одну или все связывающие единицы, выбранные из Н1, содержащие остатки 31-32 по Кабат SEQ ID N0:8, Н2, содержащие остатки 52-56 по Кабат SEQ ID N0:8, L1, содержащие остатки 30-34 по Кабат SEQ ID N0:9, L2, со
держащие остатки 50-55 по Кабат SEQ ID N0:9, и L3, содержащие остатки 89-96 по Кабат SEQ ID N0:9; или вариант связывающей единицы.
В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит связывающую единицу H3, содержащую остатки 95-101 по Кабат SEQ ID N0:45, или вариант H3. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческий, гуманизированный или химерный антигенсвязывающий белок, такой как антитело.
Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать одну или более чем одну или все связывающие единицы, выбранные из Н1, содержащие остатки 31-32 по Кабат SEQ ID N0:45, Н2, содержащие остатки 52-56 по Кабат SEQ ID N0:46, L1, содержащие остатки 30-34 по Кабат SEQ ID N0:46, L2, содержащие остатки 50-55 по Кабат SEQ ID N0:46, и L3, содержащие остатки 89-96 по Кабат SEQ ID N0:46; или вариант связывающей единицы.
Например, антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу H3 и связывающую единицу Н1 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу H3 и связывающую единицу Н2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н1, связывающую единицу Н2 и связывающую единицу H3 или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу L1 и связывающую единицу L2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу L2 и связывающую единицу L3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу L1, связывающую единицу L2 и связывающую единицу L3 или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу H3 и связывающую единицу L3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу H3, связывающую единицу Н2 и связывающую единицу L3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу H3, связывающую единицу Н2, связывающую единицу L2 и связывающую единицу L3 или их варианты.
Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н1, связывающую единицу Н2, связывающую единицу H3, связывающую единицу L1, связывающую единицу L2 и связывающую единицу L3 или их варианты.
Вариант CDR или вариант связывающей единицы включает аминокислотную последовательность, модифицированную по меньшей мере по одной аминокислоте, где указанная модификация могут быть химической или представлять собой частичное изменение аминокислотной последовательности (например, не более чем по 10 аминокислотам), где модификация дает варианту возможность сохранять биологические характеристики немодифицированной последовательности. Например, вариант представляет собой функциональный вариант, которые связывается с CD127. Частичное изменение аминокислотной последовательности CDR может осуществляться путем делеции или замены от одной до нескольких аминокислот, или путем добавления или вставки от одной до нескольких аминокислот, или путем их комбинации (например, по не более чем 10 аминокислотам). Такой вариант CDR или вариант связывающей единицы может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных замен, добавлений или делеций в любой комбинации в аминокислотной последовательности. Такой вариант CDR или вариант связывающей единицы может содержать 1, 2 или 3 аминокислотных замены, вставки или делеции в любой комбинации в аминокислотной последовательности. Замены аминокислотных остатков могут представлять собой консервативные замены, например замену одной гидрофобной аминокислоты на альтернативные гидрофобные аминокислоты. Например лейцин может быть заменен на валин или изолейцин.
CDR L1, L2, L3, H1, H2 и H3 имеют тенденцию структурно демонстрировать одну из ограниченного количества конформаций основной цепи (канонических). Конкретный класс канонической структуры CDR определяется как длиной CDR, так и упаковкой петли, определяемой остатками, располагающимися в ключевых положениях как CDR, так и скелетных областях (остатки, определяющие структуру, или SDR). Martin and Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815) разработали автоматический способ для определения "ключевого остатка" канонической матрицы. Кластерный анализ используют для определения канонических классов для наборов CDR, и канонические матрицы затем идентифицируют путем анализа скрытой гидрофобности, водородсвязывающих остатков и консервативных глицинов и пролинов. CDR последовательностей антитела могут быть распределены по каноническим классам путем сравнения последовательностей с матрицами ключевых остатков и оценки каждой матрицы с использованием матриц идентичности или сходства.
На основе канонического класса антитела 1А11 H3L4 (SEQ ID N0:13 (1А11.Ю VH) или SEQ ID N0:22 (1A11.L4 VK)) связывание функционального антитела может быть предсказано таким образом, чтобы поддерживалось в присутствии следующих замен CDR, где аминокислоты перед номером по Ка-бат представляют собой исходную аминокислотную последовательность, а аминокислотная последовательность в конце номера по Кабат представляют собой замещенные аминокислоты:
канонические CDRH1:
Y32I, Y32H, Y32F, Y32T, Y32N, Y32C, Y32E, Y32D T33Y, ТЗЗА, T33W, T33G, T33L, T33V M34I, M34V, M34W
N35E, N35H, N35Q, N35S, N35Y, N35T канонические CDRH2:
L50R, L50E, L50W, L50Y, L50G, L50Q, L50V, L50N, L50K, N50A
151L, 151V, 151Т, 151S, 151N
N52D, N52L, N52S, N52Y
Y53A, Y53G, Y53S, Y53K, Y53T, Y53N
N54S, N54T, N54K, N54D, N54G
V56Y, V56R, V56E, V56D, V56G, V56S, V56A
S58K, S58N, S58T, S58D, S58R, S58G, S58F, S58Y
канонические CDRH3:
V102Y, V102H, V102I, V102S, V102D, V102G
канонические CDRL1:
S29V
M33L
канонические CDRL3:
Q89L E90Q W91Y
Y93S, Y93R
Таким образом, антигенсвязывающий белок может содержать или не содержать любую из вышеприведенных замен в положении CDR. Может иметь место множество замен на вариант CDR, на соответствующий CDR, на связывающую единицу, на вариабельную область тяжелой или легкой цепи, на тяжелую или легкую цепь и на антигенсвязывающий белок, и таким образом любая комбинацию замен может присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению, при условии, что каноническая структура CDR сохраняется.
Для того чтобы избежать неопределенности, вышеописанные замены не следует рассматривать как ограничивающие возможные замены в CDR, которые могут быть осуществлены при сохранении функционального антитела против CD127.
Антигенсвязывающий белок, содержащий описанный CDR, соответствующий CDR, вариант CDR, связывающие единицы или вариант связывающих единиц, могут демонстрировать силу связывания с CD127, о чем свидетельствует ЕС50 (средняя эффективная концентрация), в пределах 10 крат, или в пределах 5 крат относительно силы, продемонстрированной 1А11с (химера, VH - SEQ ID N0:28, VK - SEQ ID N0:29) или 6A3c (химера, VH - SEQ ID N0:74, VK - SEQ ID N0:75). Сила связывания с CD127 может быть продемонстрована различными способами, такими как связывающая аффинность (например, при помощи BIAcore), или ЕС50 (например, при помощи анализа ELISA (иммуноферментный анализ)).
Как обсуждалось выше, конкретный класс канонической структуры CDR определяется как длиной CDR, так и упаковкой петли, определяемой остатками, располагающимися в ключевых положениях как CDR, так и областях скелетной области. Таким образом, дополнительно к CDR, представленному в SEQ ID N0:2-6, варианте CDR, соответствующему CDR, связывающим единицам или их вариантам замены могут быть произведены по остаткам скелетной области антигенсвязывающего белка по изобретению на основе канонического класса при сохранении функционального антитела. Последние могут включать (с использованием нумерации Кабата):
тяжелая цепь: V, I или G в положении 2; L или V в положении 4; L, I, M или V в положении 20; С в положении 22; Т, А, V, G или S в положении 24; G в положении 26; I, F, L или S в положении 29; W в положении 36; W или Y в положении 47; I, М, V или L в положении 48; I, L, F, М или V в положении 69; V, A, R или L в положении 71; A, L, V, Y или F в положении 78; L или М в положении 80; Y или F в положении 90; С в положении 92; и/или R, K, G, S, Н или N в положении 94; и/или
легкая цепь: I, L или V в положении 2; V, Q, L или Е в положении 3; М или L в положении 4; С в положении 23; W в положении 35; Y, L или F в положении 36; S, L, R или V в положении 46; Y, H, F или K в положении 49; Y или F в положении 71; С в положении 88; и/или F в положении 98.
Любое из вышеописанных положений скелетной области, любая их комбинация или все из вышеописанных положений скелетной области могут присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению. Может существовать множество вариантов канонических положений скелетной области на вариабельную область тяжелой или легкой цепи, на тяжелую или легкую цепь и на антигенсвязывающий белок, и, таким образом, любая комбинация может присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению, при условии, что сохраняется каноническая структура скелетной области.
Например, вариабельная скелетная область тяжелой цепи может содержать V в положении 2, L в положении 4, V в положении 20, С в положении 22, А в положении 24, G в положении 26, F в положении 29, W в положении 36, W в положении 47, М в положении 48, L в положении 69, R в положении 71, А в положении 78, М в положении 80, Y в положении 90, С в положении 92, и R в положении 94, и, например, вариабельная скелетная область легкой цепи может содержат I в положении 2, L в положении 4, С в положении 23, W в положении 35, Y в положении 36, F в положении 71, С в положении 88, Е в положении 90 и Y в положении 93.
Описанные здесь один или более чем один из CDR, соответствующий CDR, вариант CDR или связывающая единица могут присутствовать в контексте человеческой скелетной области, например, в качестве гуманизированного или химерного вариабельного домена.
Гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи может содержать CDR, представленный в SEQ ID N0:2-4, или SEQ ID N0:39-41; вариант этого CDR; соответствующий CDR; связывающие единицы!; или их варианты, в скелетной области акцепторного антитела, имеющего 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую или 100% идентичность в скелетных областях с последовательностью человеческого акцепторного вариабельного домена в SEQ ID N0:116.
Гуманизированный вариабельный домен легкой цепи может содержать CDR, представленный в SEQ ID N0: 5-7 или SEQ ID N0:42-44; вариант этого CDR; соответствующий CDR; связывающие единицы или их варианты в скелетной области акцепторного антитела, имеющего 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую или 100% идентичность в скелетных областях с последовательностью человеческого акцепторного вариабельного домена в SEQ ID N0:117.
В изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из любой из SEQ ID N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 или 131. Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную областью легкой цепи, выбранную из любой из SEQ ID N0:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. Любые вариабельные области тяжелой цепи могут быть комбинированы с любыми вариабельными областями легкой цепи. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать CD127.
В изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с CD127 и содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из любой из SEQ ID N0:48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69. Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную область легкой цепи, выбранную из любой из SEQ ID N0:70, 71, 72, 73 или 138. Любые вариабельные области тяжелой цепи могут быть комбинированы с любыми вариабельными областями легкой цепи. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать CD127.
Вариабельная область тяжелой цепи антитела может иметь 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую или 100% идентичность любой из SEQ ID N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 или 131; или SEQ ID N0:48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69.
Вариабельная область легкой цепи антитела может иметь 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую, или 100% идентичность любой из SEQ ID N0:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27; или SEQ ID N0:70, 71,
72, 73 или 138.
Процентная идентичность вариантов SEQ ID N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 121, 123, 125, 127, 129 или 131 может быть определена по полноразмерной последовательности.
Вариабельная область тяжелой цепи антитела может представлять собой вариант любой из SEQ ID N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 или 131, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию.
Вариабельной область легкой цепи антитела может представлять собой вариант любой из SEQ ID N0:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию;
Например, описанные выше канонический CDR и канонические замены остатков в скелетной области могут также быть представлены в вариантах вариабельной области тяжелой или легкой цепи как варианты последовательностей, которые по меньшей мере на 75% идентичны или которые содержат до 30 аминокислотных замен.
В еще одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи антитела может представлять собой
вариант любой из SEQ ID N0: 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68
или 69, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию. Вариабельная область легкой цепи антитела может представлять собой вариант любой из SEQ ID N0: 70, 71, 72 или 73, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию.
Например, описанные выше канонический CDR и канонические замены остатков в скелетной области могут также быть представлены в вариантах тяжелой или легкой цепи как варианты последовательности, которые по меньшей мере на 75% идентичны или которые содержат до 30 аминокислотных замен.
Любые вариабельные области тяжелой цепи по изобретению могут быть комбинированы с подходящей человеческой константной областью. Любые вариабельные области легкой цепи по изобретению могут быть комбинированы с подходящей константной областью.
В изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который специфически связывается с CD127 и содержит любую из следующих комбинаций вариабельного домена тяжелой цепи и легкой цепи: 1A11.H3.L4 (SEQ ID N0:13 и SEQ ID N0:22), или антигенсвязывающий белок, которых имеет вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 75% идентичность с SEQ ID N0:13, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий по меньшей мере 75% идентичность с SEQ ID N0:22. Антиген-связывающий белок может также нейтрализовать CD127.
Описанные выше антигенсвязывающие белки, например варианты с частичным изменением последовательности путем химической модификации и/или вставки, делеции или замены одного или более чем одного аминокислотного остатка, или варианты с 75% или большей, 80% или большей, 85% или большей, 90% или большей, 95% или большей, 98% или большей, или 99% или большей идентичностью с любой из описанных выше последовательностей, могут демонстрировать силу связывания с CD127, что продемонстрировано при помощи ЕС50 или BIAcore, в пределах 10 крат или в пределах 5 крат относительно силы, продемонстрированной 1А11 или 6A3. Эффективность связывания с CD127 может быть продемонстрована при помощи ЕС50, путем осуществления анализа ELISA или при помощи связывающей аффинности, осуществляемой посредством BIAcore.
Авторы настоящего изобретения также определили экспериментально, что некоторые положения в CDRH3 могут быть замещены, что приводит в результате к уменьшенной связывающей аффинности (т.е. более сильному связыванию). Такие аналоги CDRH3 изложены в табл. 4. Обнаружено, что замены в положениях N98 и F100b (нумерация Кабата) особенно эффективны для увеличения аффинности. Конкретные замены включают N98D, N98E, F100bE, F100bl и F100bV. Последовательности CDRH3, демонстрирующие эти замены, представляют собой SEQ ID N0:132, 133, 134, 135, 136 и 137 соответственно.
В настоящем изобретении рассмотрено включение таких замен в любое из описанных здесь антител.
В одном воплощении антитело по изобретению имеет остаток W (Trp) в положении 100.
Может быть желательно модифицировать эффекторную функцию антигенсвязывающего фрагмента, например, для усиления ADCC (опосредованной антителами клеточной цитотоксичности) или CDC, периода полувыведения и т.п.
В одном воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению могут быть Fc деактивирован-ными. Один из путей для осуществления деактивации Fc включает замену остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация в соответствии с индексом EU (Евросоюза)) константной области тяжелой цепи. Альтернативно, антигенсвязывающий белок может быть с активным Fc и не включать замену аланина в положениях 235 и 237.
Антигенсвязывающий белок может иметь период полувыведения по меньшей мере 6 ч, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 9 суток у людей in vivo, или в мышиной животной модели.
Антигенсвязывающий белок может быть получен у крысы, мыши, примата (например, яванского макака, игрунки или человекообразных обезьян) или человека. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. Антигенсвязывающий белок может содержать константную область, которая может иметь любой изотип или подкласс. Константная область может иметь изотип IgG, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или их варианты. Константная область антигенсвязывающего белка может представлять собой IgG1.
Мутационные изменения в Fc эффекторной области антитела могут быть использованы для изменения аффинности взаимодействия между FcRn и антителом для того, чтобы изменить оборот антитела. Период полувыведения антитела может быть увеличен in vivo. Последнее может быть благоприятно для популяций пациентов, поскольку максимальные дозы и максимальные частоты введения доз могут быть достигнуты в результате поддержания IC50 (средней ингибирующей концентрации) in vivo в течение более длительных периодов времени. Fc эффекторная функция антитела может быть удалена полностью или частично, поскольку может быть нежелательно уничтожать клетки, экспрессирующие CD127. Это удаление может приводить в результате к увеличению профиля безопасности.
Антигенсвязывающий белок, содержащий константную область, может обладать уменьшенной ADCC и/или активацией комплемента, или эффекторной функцией. Константный домен может содержать деактивированную естественным путем константную область изотипа IgG2 или IgG4, или константную область мутантного IgG1. Примеры подходящих модификаций описаны в ЕР0307434. Один из путей для достижения деактивации Fc включает замену остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация в соответствии с индексом EU (Евросоюза)) константной области тяжелой цепи.
Антигенсвязывающий белок может содержать одну или более чем одну модификацию, выбранную из мутантного константного домена, таким образом, что антитело обладает усиленными эффекторными функциями/ADCC и/или активацией комплемента. Примеры подходящих модификаций описаны в Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276:6591-6604, Lazar et al. PNAS (2006) 103:4005-4010 и US6737056, W02004063351 и W02004029207.
Антигенсвязывающий белок может содержать константный домен с измененным профилем глико-зилирования таким, что антигенсвязывающий белок обладает усиленными эффекторными функциями/ADCC и/или активацией комплемента. Примеры подходящих способов продукции антигенсвязывающего белка с измененным профилем гликозилирования описаны в W02003/011878, W02006/014679 и ЕР1229125.
Полипептид CD127, с которым связывается антигенсвязывающий белок, может представлять собой рекомбинантный полипептид, и может содержать внеклеточный домен (ECD), возможно слитый с другим белком, такой как домен Fc, или может содержать полноразмерный белок CD127. CD127 может находиться в растворе или может быть присоединен к твердой поверхности. Например, CD127 может быть присоединен к шарикам, такие как магнитные шарики. CD127 может быть биотинилирован. Молекула биотина, конъюгированная с CD127, может быть использована для иммобилизации CD127 на твердой поверхности путем связывания биотинстрептавидина на твердой поверхности.
В настоящем изобретении также предложена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанный здесь антигенсвязывающий белок. Молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, кодирующую (1) один или более чем один CDRH, вариабельную последовательность тяжелой цепи или полноразмерную последовательность тяжелой цепи; и (2) один или более чем один CDRL, вариабельную последовательность легкой цепи или полноразмерную последовательность легкой цепи, с (1) и (2) на такой же молекуле нуклеиновой кислоты. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанный здесь антигенсвязывающий белок, может содержать последовательности, кодирующие (а) один или более чем один CDRH, вариабельную последовательность тяжелой цепи, или полноразмерную последовательность тяжелой цепи; или (б) один или более чем один CDRL, вариабельную последовательность легкой цепи, или полноразмерную последовательность легкой цепи, с (а) и (б) на отдельных молекулах нуклеиновой кислоты.
Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи, может содержать SEQ ID N0:30-36. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, может содержать SEQ ID N0:10-113.
Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи, может содержать SEQ ID N0:75-96. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, может содержать SEQ ID N0:97-100.
В настоящем изобретении также предложен экспрессирующий вектор, содержащий описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты. Также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая описанный здесь экспрессирующий вектор.
Описанный здесь антигенсвязывающий белок может продуцироваться в подходящей клетке-хозяине. Способ продуцирования антигенсвязывающего белка, как описано здесь, может включать стадию культивирования описанной здесь клетки-хозяина и выделения антигенсвязывающего белка. Реком-бинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин может содержать по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, где указанная экспрессирующая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка и дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь описанного здесь антигенсвязывающе-го белка. Альтернативно, рекомбинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуциро-ванная клетка-хозяин может содержать по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, где первая экспрессирующая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь описанного здесь анти-генсвязывающего белка, и дополнительно содержит вторую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка. Стабильно трансформированная клетка-хозяин может содержать вектор, содержащий одну или более чем одну экспрессирующую кассету, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка. Например, такие клетки-хозяева могут содержать первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий тяжелую цепь.
Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего. Примеры таких клеточных линий включают СНО или NS0. Клетка-хозяин может представлять собой клетку-хозяина, отличную от человеческой. Клетка-хозяин может представлять собой неэмбрио
нальную клетку-хозяина. Клетка-хозяин может быть выращена в культуральных средах, например бессывороточных культуральных средах. Антигенсвязывающий белок может быть секретирован клеткой-хозяином в культуральные среды. Антигенсвязывающий белок может быть очищен по меньшей мере до 95% или больше (например 98% или больше) от указанных культуральных сред, содержащих антиген-связывающий белок.
В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая антиген-связывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно предложен набор, содержащий фармацевтическую композицию вместе с указаниями по применению. Для удобства набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с инструкциями по применению.
Структуры антител.
Интактные антитела.
Легкие цепи антител позвоночных животных можно отнести к одному из двух типов, названных каппа и лямбда на основе аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей человеческие антитела могут принадлежать к пяти отличающимся классам IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA могут быть дополнительно разделены на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; и IgA1 и IgA2. Видовые варианты существуют у мыши и крысы, имеющей, по меньшей мере, IgG2a, IgG2b.
Более консервативные фрагменты вариабельной области названы скелетными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов интактных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, связанные тремя CDR. CDR в каждой цепи находится рядом с областями FR и вместе с CDR другой цепи вносит вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител.
Константные области непосредственно не вовлечены в связывание антител с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие в зависимой от антитела клеточноопосре-дованной цитотоксичности (ADCC), фагоцитоз путем связывания с Fcy рецептором, скорость полувыведения/клиренса через неонатальный Fc рецептор (FcRn) и комплементзависимая цитотоксичность через C1q компонент каскада комплемента.
Сообщалось, что константная область IgG2 человека, по существу, лишена способности активировать комплемент классическим путем или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксич-ность. Сообщалось, что константная область IgG4 лишена способности активировать комплемент классическим путем и только слабо опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность. Антитела, по существу, лишенные этих эффекторных функций, могут быть названы "нелитическими" антителами. Может быть желательно уменьшать эффекторную функцию антитела по изобретению, возможно до той степени, при которой антитело, по существу, не обладает эффекторной функцией. В одном воплощении антитело по изобретению является не литическим. В одном воплощении антитело по изобретению, по существу, не обладает эффекторной функцией. Антитело может быть конъюгировано или не конъюгиро-вано с другой молекулой, например молекулой, предназначенной для модификации эффекторной функции, такой как цитотоксическая группировка или радиоактивная группировка. В одном воплощении антитело не конъюгировано с другой молекулой, такой как радиоактивная метка или цитотоксическая молекула. В этом воплощении антитело достигает своего функционального действия путем блокирования природного биологического взаимодействия, нежели чем путем прямого действия, уничтожающего клетки.
Человеческие антитела.
Человеческие антитела могут быть получены при помощи множества способов, известных специалистам в данной области техники. Человеческие антитела могут быть получены при помощи гибридом-ного способа с использованием клеточных линий человеческой миеломы или мышь-человеческой гете-ромиеломы, смотри Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) и Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker Inc., 1987). Альтернативные способы включают применение фаговых библиотек или трансгенных мышей, в обоих из которых используются репертуары человеческих вариабельных доменов (смотри Winter G., (1994), Annu. Rev. Immunol 12,433-455, Green L.L.
(1999) , J. Immunol, methods 231, 11-23).
В настоящее время имеется несколько штаммов трансгенных мышей, в которых локусы мышиного иммуноглобулина заменены сегментами генов человеческих иммуноглобулинов (смотри Tomizuka K.,
(2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M. (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez M.J., 1997, Nature Genetics, 15, 146-156). После антигенной стимуляции такие мыши способны продуцировать спектр человеческих антител, из которых могут быть выбраны интересующие антитела.
Для получения человеческих антигенсвязывающих белков (и их фрагментов) можно использовать технологию фагового дисплея, смотри McCafferty (1990) Nature, 348, 552-553 и Griffiths A.D. et al. (1994)
EMB0 13: 3245-3260.
Способ аффинного созревания (Marks; Biotechnol. (1992) 10, 779-783) может быть использован для улучшения связывающей аффинности, где аффинность первичного человеческого антитела улучшается путем последовательного замещения вариабельных доменов Н- и L-цепи встречающимися в природе вариантами и отбора на основе улучшенных связывающих аффинностей. В настояще время также из- 29
вестны варианты этого способа, такие как "эпитопный импринтинг", смотри, например W0 93/06213; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res 21, 2265-2266. Химерные и гуманизированные антитела.
Химерные антитела типично получают с использованием способов рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующую антитела (например, кДНК), выделяют и секвенируют с использованием обычных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими Н- и L-цепи антител). Клетки гибридомы служат в качестве типичного источника такой ДНК. После выделения ДНК помещают в экпрессирующие векторы, который затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как E. coli, клетки C0S, клетки СНО или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, с обеспечением синтеза антитела. ДНК может быть модифицирована путем замены кодирующей последовательности человеческих L- и Н-цепей на соответствующие нечеловеческие (например, мышиные) Н и L константные области; смотри, например, Morrison (1984) PNAS 81,
6851.
Значительное уменьшение иммуногенности может быть достигнуто путем прививания только CDR нечеловеческих (например, мышиных) антител ("донорные" антитела) на человеческий скелет ("акцепторный скелет") и константные области с образованием гуманизированных антител (смотри Jones et al. (1986) Nature 321, 522-525 и Verhoeyen M. et al. (1988) Science 239, 1534-1536). Тем не менее, само по себе прививание CDR может не приводить в результате к полному сохранению антигенсвязывающих свойств, и часто обнаруживают, что некоторые остатки скелета (иногда называемые "обратные мутации") донорного антитела не обязательно должны сохраняться в гуманизированной молекуле, если существенная антигенсвязывающая аффинность должна быть восстановлена (смотри Queen С. et al. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Со et al. (1991) Nature 351, 501-502). В этом случае из базы данных выбирают человеческие вариабельные области, демонстрирующие наибольшую гомологию последовательности с нечеловеческим донорным антителом, для того, чтобы обеспечить человеческий скелет (FR). Выбор человеческих FR может быть осуществлен из человеческих консенсусных или индивидуальных человеческих антител. Когда необходимо, тогда ключевые остатки донорного антитела замещаются в человеческом акцепторном каркасе для сохранения конформаций CDR. Компьютерное моделирование антитела может быть использовано для того, чтобы способствовать идентификации таких структурно важных остатков, смотри W099/48523.
Альтернативно, гуманизация может быть достигнута способом "маскировки". Статистическим анализом уникальных человеческих и мышиных вариабельных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов было выявлено, что точные паттерны открытых остатков различны в человеческих и мышиных антителах, и наиболее характерные поверхностные положения строго предпочтительны для малого числа различных остатков (смотри Padlan Е.А. et al.; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 и Pedersen J.T. et al. (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). Таким образом, можно уменьшить иммуногенность нечеловеческого Fv путем замены презентируемых остатков в его скелетной области, которые отличаются от обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку антигенность белка может коррелировать с доступностью поверхности, замена поверхностных остатков могут быть достаточной для того, чтобы сделать мышиный вариабельные домен "невидимый" для человеческой иммунной системы (смотри также Mark G.E. et al. (1994) в Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, p. 105-134). Этот способ гуманизации назван "венированием", поскольку только поверхностные антитела изменяются, тогда как поддерживающие остатки остаются ненарушенными.
Таким образом, возможно снижение иммуногенности Fv-фрагмента от источника, не являющегося человеком, заменой открытых остатков в его скелетных областях, отличающихся от остатков, обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку может быть установлена корреляция между анти-генностью белка и доступностью поверхности, замена поверхностных остатков может быть достаточной для того, чтобы мышиная вариабельная область была "невидима" для иммунной системы человека (смотри также Mark G.E. et al. (1994) в Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, p. 105-134). Этот способ гуманизации называют "маскировкой", поскольку изменяют только поверхность антитела без изменения поддерживающих остатков. Другие альтернативные подходы включают подходы, приведенные в W004/006955, и методику Humaneering(tm) (Kalobios), в которой применяют бактериальные экспрессирующие системы и продуцируют антитела, близкие по последовательности к антителам зародышевой линии человека (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, January 2007, San Diego,California).
Биопецифические антигенсвязывающие белки.
Биспецифический антигенсвязывающий белок представляет собой антигенсвязывающий белок, обладающий связывающими специфичностями в отношении по меньшей мере двух отличающихся эпито-пов. Способы получения таких антигенсвязывающих белков известны в области техники. Традиционно, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на коэкспрессии двух пар Н-цепь^-цепь иммуноглобулина, где две Н-цепи обладают отличающимися связывающими специфичностями, смотри Millstein et al. (1983) Nature 305 537-539, W093/08829 и Traunecker et al. (1991) EMB0 10, 3655-3659. Ввиду случайной сортировки Н- и L-цепей, получают потенциальную смесь десяти отличающихся
структур антител, из которых только одна обладает желаемой связывающей специфичностью. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов, обладающих желаемыми связывающими спе-цифичностями, с константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, областей СН2 и CH3. Область СН1, содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, может присутствовать по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующую эти слияния, и, если желательно, L-цепь, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы, и затем котрансфицируют в подходящий организм хозяина. Можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех цепей в один экспрессирующий вектор. В одном из подходов биспецифическое антитело состоит из Н-цепи, обладающей первой связывающей специфичностью, с одной стороны, и пары H-L-цепь, обеспечивающей вторую связывающую специфичность, с другой стороны, смотри W094/04690. Также смотри Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121, 210. Антигенсвязывающие фрагменты.
У фрагментов, лишенных константной области, отсутствует способность активировать комплемент классическим путем или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Традиционно такие фрагменты получают протеолитическим расщеплением интактных антител, например расщеплением под действием папаина (смотри, например, W0 94/29348), но они могут быть получены непосредственно из рекомбинантным образом трансформированных клеток хозяина. Для получения ScFv смотри Bird et al., (1988) Science, 242, 423-426. Кроме этого, антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием ряда описанных ниже инженерных методик.
По-видимому, Fv-фрагменты характеризуются более низкой энергией взаимодействия между двумя их цепями, чем фрагменты Fab. Для стабилизации ассоциации VH- и Vi^-доменов они были соединены с помощью пептидов (Bird et al., (1988) Science 242, 423-426, Huston et al., PNAS, 85, 5879-5883), дисуль-фидных мостиков (Glockshuber et al. (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) и мутаций "knob in hole" (Zhu et al. (1997), Protein Sci., 6, 781-788). ScFv-фрагменты могут быть получены при помощи способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, смотри Whitlow et al. (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 и Huston et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10, 195-217. ScFv могут быть получены в бактериальных клетках, таких как Е. coli, или в эукариотичеоких клетках. Одним из недостатков ScFv является моновалентность продукта, которая исключает наличие повышенной авидности, обусловленной поливалентным связыванием, и их короткий период полувыведения. Попытки преодоления этих проблем включают получение бивалентных (ScFv')2 из ScFv, содержащих дополнительный С-концевой цистеин, посредством химического сочетания (Adams et al. (1993) Can. Res. 53, 4026-4034 и McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) или в результате спонтанной сайт-специфической димеризации ScFv, содержащих неспаренный С-концевой остаток цистеина (смотри Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biophys. 26, 187-204). Альтернативно, можно заставить ScFv образовывать мультимеры, укорачивая пептидный линкер между 3 и 12 остатками с образованием "диател", смотри Holliger et al. (1993) PNAS 90: 6444-6448. Дальнейшее уменьшение размеров линкера может приводить к образованию тримеров ScFV ("трител", смотри Kortt et al. (1997) Protein Eng., 10, 423-433) и тетрамеров ("тетрател", смотри Le Gall et al. (1999) FEBS Lett., 453, 164-168). Конструирование бивалентных молекул ScFv также может быть осуществлено посредством генетического слияния с димеризующими белок мотивами с образованием "миниантител" (смотри Pack et al. (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) и "минител" (смотри Hu et al. (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061). Тандемы ScFv-ScFv ((ScFv)2) также могут быть получены путем соединения двух ScFv-единиц с использованием третьего пептидного линкера, смотри Kurucz et al. (1995) J. Immol. 154, 45764582. Биспецифические диатела могут быть получены посредством нековалентного объединения двух одноцепочечных продуктов слияния, состоящих из Vu-домена одного антитела, соединенного коротким линкером с V^-доменом другого антитела, смотри Kipriyanov et al. (1998), Int. J. Can. 77, 763-772. Стабильность таких биспецифических диател может быть повышена посредством введения дисульфидных мостиков или мутаций "knob in hole", как описано выше, или посредством образования одноцепочечных диател (ScDb), в которых два гибридных ScFv-фрагмента соединены через пептидный линкер, смотри Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods, 226, 179-188. Тетравалентные биспецифические молекулы могут быть получены, например, в результате слияния ScFv-фрагмента с CH3-доменом молекулы IgG или с Fab-фрагментом через шарнирную область, смотри Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15, 159163. Альтернативно, тетравалентные биспецифические молекулы созданы в результате слияния биспе-цифических одноцепочечных диател (смотри Alt et al., (1999) FEBS Lett. 454, 90-94). Тетравалентные биспецифические молекулы меньших размеров также могут быть образованы посредством димеризации либо тандемов ScFv-ScFv с линкером, содержащим мотив спираль-поворот-спираль (DiBi миниантитела, смотри Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432, 45-49), либо одноцепочечных молекул, содержащих четыре вариабельных домена (VH и VL) антитела в ориентации, предотвращающей внутримолекулярное спаривание (тандемное диатело, смотри Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56). Биспецифические P(ab')2-фрагменты могут быть созданы посредством химического соединения Fab'-фрагментов или в результате гетеродимеризации через лейциновые застежки (смотри Shalaby et al., (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 и Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553). Кроме этого, возможно получение отдельных VH- и ^-доменов, смотри US 6248516; US 6291158; US 6172197.
Гетероконъюгатные антитела.
Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител, полученных с использованием любого удобного способа перекрестного связывания; смотри, например, US 4676980. Другие модификации.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут содержать другие модификации для усиления или изменения их эффекторных функций. Предполагается, что используемый здесь термин "эффекторная функция" относится к одному или более чем одному зависимому от антитела ответу в виде опосредованной антителами клеточной цитотоксической активности (ADCC) и ответу в виде комплемен-тзависимой цитотоксической активности (CDC), Fc-опосредованному фагоцитозу и рециркуляции антитела через FcRn рецептор. Для антитела IgG эффекторные функции, включающие ADCC и ADCP, опосредованы путем взаимодействия константной области тяжелой цепи с семейством Fcy рецепторов, представленных на поверхности иммунокомпетентных клеток. У людей последние включают FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). Взаимодействие между антигенсвязывающим белком, связанным с антигеном, и образование комплекса Fc/Fcy вызывает диапазон действий, включающий цитоток-сичность, активацию иммунокомпетентных клеток, фагоцитоз и высвобождение провоспалительных ци-токинов.
Полагают, что взаимодействие между константной областью антитела и различными Fc рецепторами (FcR) опосредует эффекторные функции антитела. Значительные биологические действия могут представлять собой следствие эффекторной функциональности, в частности, опосредованной антителами клеточной цитотоксической активности (ADCC), связывания комплемента (комплементзависимой цито-токсичности или CDC), фагоцитоза (зависимого от антитела клеточноопосредованного фагоцитоза или ADCP) и периода полувыведения/клиренса антитела. Обычно способность опосредовать эффекторную функцию требует связывания антитела с антигеном, и не все антитела опосредуют каждую эффекторную функцию.
Эффекторная функция может быть измерена множеством путей, включающих, например, связывание FcyRIII с естественными клетками-киллерами или FcyRI с моноцитами/макрофагами для измерения ADCC эффекторной функции. Например, антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению обладает усиленной ADCC эффекторной функцией в анализе с естественными клетками-киллерами. Примеры таких анализов можно найти в Shields et al., 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al., 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 268, p25124-25131; Lazar et al., 2006
PNAS, 103; 4005-4010.
Примеры анализов для определения функции CDC включают описанные в 1995 J. Imm. Meth.
184:29-38.
Несколько изотипов человеческих константных областей, в частности изотипы IgG4 и IgG2, по существу, лишенные функций а) активации комплемента классическим путем и б) антителозависимой клеточной цитотоксичности. Различные модификации константной области тяжелой цепи антигенсвязы-вающих белков могут быть осуществлены в зависимости от желаемого свойства эффектора. Константные области IgG1, содержащие специфические мутации, как отдельно описано, уменьшают связывание с Fc рецепторами, и, таким образом, уменьшают ADCC и CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75
(24); 12161-12168).
Различные модификации области Fc антител по изобретению могут быть осуществлены в зависимости от желаемого свойства. Например, специфические мутации области Fc для того, чтобы сделать литическое антитело нелитическим, подробно описаны в ЕР 0629240В1 и ЕР 0307434В2, или могут включать эпитоп связывания с рецептором спасения (salvage receptor binding epitope) в антитело для увеличения периода полувыведения из сыворотки крови, смотри US 5739277. Человеческие Fcy рецепторы включают: FcyR (I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa и неонатальный FcRn. Shields et al., (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604 продемонстрировал, что общий набор остатков IgG1 вовлечен в связывание со всеми FcyR, тогда как FcyRII и FcyRIII используют различные сайты вне этого общего набора. Одна группа остатков IgG1 уменьшает связывание со всеми FcyR при замене на аланин: Рго-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 и Pro-239. Все располагаются в IgG CH2 домене и группируются около шарнира, сочленяющего СН1 и СН2. Хотя FcyRI использует только общий набор остатков IgG1 для связывания, FcyRII и FcyRIII взаимодействуют с различными остатками дополнительно к общему набору. Изменение некоторых остатков уменьшает связывание только с FcyRII (например, Arg-292) или FcyRIII (например, Glu-293). Некоторые варианты продемонстрировали улучшенное связывание с FcyRII или FcyRIII, но не влияли на связывание с другим рецептором (например, Ser-267Ala улучшал связывание с FcyRII, но связывание с FcyRIII не менялось). Другие варианты продемонстрировали улучшенное связывание с FcyRII или FcyRIII при уменьшении связывания с другим рецептором (например, Ser-298Ala улучшал связывание с FcyRIII и уменьшал связывание с FcyRII). Для FcyRIIIa варианты IgG1, обладающие наилучшим связыванием, имели комбинированные аланиновые замены по Ser-298, Glu-333 и Lys-334. Полагают, что неонатальный
FcRn вовлечен в клиренс антитела и трансцитоз через ткани (смотри Junghans R.P. (1997) Immunol. Res 16, 29-57 и Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Определили, что остатки человеческого IgG1, которые непосредственно взаимодействуют с человеческим FcRn, включают Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435. Замены по любому из этих положений, описанных в этом разделе, могут обеспечить увеличение периода полувыведения из сыворотки крови и/или измененные эф-фекторные свойства антител.
Другие модификации включают варианты гликозилирования антител. Известно, что гликозилиро-вание антител по консервативным положениям в их константных областях оказывает сильное действие на функцию антитела, в частности эффекторную функцию, такую как описанные выше, смотри, например, Boyd et al. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Рассмотрены варианты гликозилирования антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где одна или более чем одна углеводородная группировка добавлена, замещена, удалена или модифицирована. Введение аспарагин-Х-серинового или аспарагин-Х-треонинового мотива создает потенциальный сайт для ферментативного присоединения углеводородных группировок и, поэтому, может быть использовано для манипуляции гликозилированного антитела. В Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 концевое сиалирование им-муноадгезина TNFR-IgG увеличивалось путем регалактозилирования и/или ресиалирования с использованием бета-1,4-галактозилтрансферазы и/или альфа, 2,3 сиалилтрансферазы. Полагают, что увеличение концевого сиалирования увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. Антитела, как и большинство гликопротеинов, типично продуцируются в виде смеси гликоформ. Эта смесь особенно очевидна, когда антитела продуцируются в эукариотических клетках, в частности клетках млекопитающих. Разработаны различные способы получения определенных гликоформ, смотри Zhang et al. Science (2004), 303, 371, Sears et al., Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al. (2002) Science, 298 1790, Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102, 579, Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. Описанные здесь антитела (например, изо-типа IgG, например IgG1) могут содержать определенное количество (например, 7 или меньше, например 5 или меньше, такое как два или одну) гликоформу(ы).
Антитела могут быть связаны или не связаны с небелковым полимером, таким как полиэтиленгли-коль (PEG), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Конъюгация белков с PEG представляет собой признанный способ увеличения периода полувыведения белков, а также уменьшения антигенности и иммуногенности белков. Применение ПЭГилирования с отличающимися молекулярными массами и типами (линейные или разветвленные) исследовали с интактными антителами, а также фрагментами Fab', смотри Koumenis et al. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95.
Способы получения.
Антигенсвязывающие белки могут быть получены в трансгенных организмах, таких как козы (смотри Pollock et al. (1999), J. Immunol. Methods 231:147-157), цыплята (смотри Morrow (2000) Genet. Eng. News 20:1-55, мыши (смотри Pollock et al.) или растения (смотри Doran (2000) Curr. 0pinion Biotech-nol. 11, 199-204, Ma (1998), Nat. Med. 4; 601-606, Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54, Stoger E. et al.
(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590).
Антигенсвязывающие белки также могут быть получены при помощи химического синтеза. Тем не менее, антигенсвязывающие белки типично получают с использованием рекомбинантного способа выращивания клеток, хорошо известного специалистам в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий белок, выделен и встроен в реплицируемый вектор, такой как плазмида для дополнительного клонирования (амплификации) или экспрессии. Одна из систем экспрессии представляет собой глутаматсинтетазную систему (такую как реализуемую Lonza Biologies), в частности, где клетка-хозяин представляет собой СНО или NS0. Полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий белок, легко выделяют и секвенируют с использованием обычных способов (например, олигонуклеотид-ных зондов). Векторы, которые могут быть использованы, включают плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, из которых плазмиды типично используются. Как правило, такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более чем один маркерный ген, энхансерный элемент, промотор и последовательности терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом антигенсвязывающего белка для облегчения экспрессии. Полинук-леотиды, кодирующие легкую и тяжелую цепи, могут быть встроены в отдельные векторы, и введены (например, путем трансформации, трансфекции, электропорации или трансдукции) в ту же самую клетку-хозяина одновременно или последовательно, или, если желательно, то как тяжелая цепь, так и легкая цепь может быть встроена в тот же самый вектор перед указанным введением.
Оптимизация кодона может быть использована с целью, чтобы общий уровень белка, продуцированного клеткой-хозяином, был больше при трансфекции геном с оптимизированным кодоном по сравнению с уровнем при трансфекции последовательностью дикого типа. Опубликовано несколько способов (Nakamura et. al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215; W098/34640; W097/11086). Вследствие вырожденности генетического кода, полинуклеотиды, альтернативные в отношении раскрытых здесь (особенно с оптимизированным кодоном для экспрессии в заданной клетке-хозяине), могут также кодировать описанные здесь антигенсвязывающие белки. Поэтому использование кодонов антигенсвязы-вающих белков по данному изобретению может быть модифицировано с целью согласования статисти
ческого отклонения кодонов (codon bias) клетки-хозяина для увеличения выхода транскрипта и/или продукта (например, Hoekema et al., Mol. Cell Biol., 1987, 7(8): 2914-24). Выбор кодонов может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Сигнальные последовательности.
Антигенсвязывающие белки могут быть получены в виде слитого белка с гетерологической сигнальной последовательностью, имеющей специфический сайт расщепления по N концу зрелого белка. Сигнальная последовательность должна быть идентифицирована и воспринята клеткой-хозяином. Для эукариотических клеток-хозяев сигнальная последовательность может представлять собой, например, щелочную фосфатазу, пенициллиназу или теплостабильный энтеротоксиновый II лидер. Для дрожжевой секреции сигнальные последовательности могут представлять собой, например, лидер дрожжевой инвер-тазы, лидер фактора или лидер кислой фосфатазы; смотри, например, W090/13646. В системах на основе клеток млекопитающих подходящими могут быть лидеры вирусной секреции, такие как сигнал вируса простого герпеса gD, и нативная иммуноглобулиновая сигнальная последовательность. Типично, сигнальная последовательность лигирована в рамку считывания с ДНК, кодирующей антигенсвязывающий белок по изобретению.
Ориджин репликации.
Ориджин репликации хорошо известны в области техники, причем pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, 2ц плазмида для большинства дрожжей и различные вирусные орид-жины, такие как SV40, полиомы, аденовируса, VSV или BPV, для большинства клеток млекопитающих. Как правило, компонент ориджин репликации не является необходимым для экспрессирующих векторов млекопитающих, но SV40 могут быть использованы, поскольку они содержат ранний промотор.
Маркер отбора.
Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину или (б) дополняют ауксотрофный дефицит или поставляют питательные вещества, отсутствующие в сложных средах, или (в) их комбинация. Схема отбора может включать прекращение роста клетки-хозяина. Клетки, которые успешно трансформируются генами, кодирующими антигенсвязывающий белок, выживают вследствие, например, лекарственной устойчивости, придаваемой маркером отбора. Один из примеров представляет собой DHFR (дигидрофолатредуктаза) маркер отбора, где трансформанты выращивают в присутствии метотрексата. Клетки могут быть выращены в присутствии увеличенных количеств метот-рексата для увеличения количества копий экзогенного интересующего гена. Клетки СНО представляют собой особенно интересную клеточную линию для отбора DHFR. Дополнительный пример представляет собой глутаматсинтетазную систему экспрессии (Lonza Biologies). Пример селективного гена для применения в дрожжах представляет собой ген trp1, смотри Stinchcomb et al. (1979) Nature 282, 38.
Промоторы.
Подходящие промоторы для экспрессии антигенсвязывающих белков по изобретению функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий белок. Промоторы для хо-зяев-прокариот включают промотор phoA, бета-лактамазу и лактозные промоторные системы, щелочную фосфатазу, триптофан и гибридные промоторы, такие как Тас. Промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, включают 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты, например энолазу, глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназу, гексокиназу, пируватдекарбоксилазу, фосфофрук-токиназу, глюкозо-6-фосфатизомеразу, 3-фосфоглицератмутазу и глюкокиназу. Индуцируемые дрожжевые промоторы включают алкогольдегидрогеназу 2, изоцитохром С, кислую фосфатазу, металлотионеин и ферменты, ответственные за метаболизм азота или использование мальтозы/галактозы.
Промоторы для экспрессии в системах клеток млекопитающих включают вирусные промоторы, такие как промоторы вирусов полиомы, оспы птиц и аденовирусов (например, аденовируса 2), вируса папилломы крупного рогатого скота, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса (в частности, немедленного раннего генного промотора), ретровируса, вируса гепатита В, актина, вируса саркомы Рауса (RSV) и раннего или позднего промотора вируса обезьян 40. Безусловно, выбор промотора основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. Первая плазмида может содержать RSV и/или SV40, и/или промотор CMV, ДНК, кодирующую вариабельный домен легкой цепи (VL) по изобретению, область KC вместе с маркерами резистентности к неомицину и ампициллину для отбора, и вторую плазмиду, содержащую промотор RSV или SV40, ДНК, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи (VH) по изобретению, ДНК, кодирующую y1 константную область, DHFR и маркер резистентности к ампициллину.
Энхансерный элемент.
При необходимости, например, для экспрессии в клетках высших эукариот может быть использован энхансерный элемент, функционально связанный с промоторным элементом в векторе. Энхансерные последовательности млекопитающих включают энхансерные элементы глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина и инсулина. Альтернативно, можно использовать энхансерный элемент вируса эукариоти-ческих клеток, такой как энхансер SV40 (по 100-270 п.о.), энхансер раннего промотора цитомегаловиру
са, энхансер polyma, бакуловирусный энхансер или мышиный IgG2a локус (смотри W004/009823). Энхансер может располагаться в векторе по сайту, располагающемуся выше относительно промотора. Альтернативно, энхансер может располагаться где угодно, например в нетранслируемой области или ниже относительно сигнала полиаденилирования. Выбор и расположение энхансера могут быть основаны на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. Сигналы полиаденилирования/терминации.
В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий белок. Такие сигналы типично располагаются 3' относительно открытой рамки считывания. В системах млекопитающих не ограничивающие объем изобретения примеры включают сигналы, происходящие из гормонов роста, фактора элонгации-1 альфа и вирусных (например, SV40) генов, или ретровирусных длинных концевых повторов. В дрожжевых системах не ограничивающие объем изобретения примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают происходящие из генов фосфоглицераткиназы (PGK) и алкогольдегидрогеназы 1 (ADH). В прокариотической системе сигналы полиаденилирования как правило не требуются, и вместо этого обычно используют более короткие и более определенные терминаторные последовательности. Безусловно, выбор последовательностей полиаденилирования/терминации основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.
Другие способы/элементы для увеличения выходов.
Дополнительно к вышеизложенному другие особенности, которые могут быть использованы для увеличения выходов, включают хроматин-ремоделирующие элементы, интроны и специфическую для клетки-хозяина модификацию.
Клетки-хозяева.
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антигенсвя-зывающие белки, представляют собой прокариотические, дрожжевые клетки или клетки высших эукари-от. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерий, например enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например Е. coli (например, АТСС 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (смотри DD 266710), Pseudomonas, такие как P.aeruginosa и Streptomyces. Из дрожжевых клеток-хозяев также охвачены Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (например, АТСС 16,045; 12,424; 24178; 56,500), yarrowia (EP402226), Pichia Pastoris (EP183070, смотри также Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244234), Penicillin, Tolypocladium и хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.
Подходящие клетки-хозяева высших эукариот включают клетки млекопитающих, такие как C0S-1 (АТСС N0:CRL 1650), C0S-7 (АТСС CRL 1651), линия человеческих эмбриональных клеток почки 293, клетки почки детеныша хомячка (BHK) (АТСС CRL. 1632), BHK570 (АТСС N0: CRL 10314), 293 (АТСС N0:CRL 1573), клетки яичника китайского хомячка СНО (например, СНО-Ю, АТСС N0: CCL 61, линия клеток DHFR-CH0, такая как DG44 (смотри Urlaub et al., (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556)), в особенности линии клеток СНО, адаптированные для суспендированной культуры, клетки Сертоли мыши, клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зелёной мартышки (АТСС CRL-1587), клетки HELA, клетки почки собаки (АТСС CCL 34), человеческие клетки легкого (АТСС CCL 75), Hep G2 и клетки миеломы или лимфомы, например NS0 (смотри US 5807715), Sp2/0, Y0.
Такие клетки-хозяева также могут быть дополнительно сконструированы или адаптированы для модификации качества, функции и/или выхода антигенсвязывающего белка. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают экспрессию специфическим образом модифицированных (например, путем гликозилирования) ферментов и шаперонов, складывающих белок.
Способы культивирования клеток.
Клетки-хозяева, трансформированные векторами, кодирующими антигенсвязывающие белки, могут быть культивированы при помощи любого из способов, известных специалистам в данной области техники. Клетки-хозяева можно культивировать в роллерных колбах, роллерных флаконах или системах полых волокон, за исключением крупномасштабного получения, для которого используют реакционный аппарат с мешалкой, в особенности для культур суспензий. Реакционные аппараты с мешалкой могут быть адаптированы для аэрации с использованием, например, барботеров, дефлекторов или вращающихся мешалок с малыми сдвиговыми усилиями. Для барботажных колонок и аэролифтных реакторов может быть использована непосредственная аэрация пузырьками воздуха или кислорода. Когда клетки-хозяева выращивают в бессывороточных культуральных средах, тогда эти среды дополняют агентом, защищающим клетки, таким как плюроник F-68, для того, чтобы способствовать предотвращению повреждения клеток в результате процесса аэрации. В зависимости от характеристик клетки-хозяина могут быть использованы микроносители в качестве субстратов для роста "заякоренных" клеточных линий, или клетки могут быть адаптированы к суспензионной культуре (которая является типичной). Для выращивания клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев беспозвоночных, может быть использовано множество режимов функционирования, таких как выращивание культуры с подпиткой, повторная обработка партии
(смотри Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), расширенная партия или перфузионная культура. Хотя рекомбинантно трансформированные клетки-хозяева млекопитающих можно вытапливать в средах, содержащих сыворотку крови, таких как фетальная телячья сыворотка крови (FCS), например, такие клетки-хозяева выращивают в синтетических бессывороточных средах, таких как раскрытые в Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, или имеющиеся в продаже среды, такие как ProCH0-CDM или UltraCH0(tm) (Cambrex NJ, USA), при необходимости дополненные источником энергии, таким как глюкоза, и синтетическими факторами роста, такими как рекомбинантный инсулин. Для выращивания клеток-хозяев в бессывороточных средах может потребоваться, чтобы эти клетки были адаптированы для выращивания в бессывороточных условиях. Один из подходов заключается в выращивании таких клеток-хозяев в средах, содержащих сыворотку крови, и повторной замене 80% культуральной среды на бессывороточную среду, таким образом, что клетки-хозяева учатся адаптироваться в бессывороточнох условиях (смотри, например, Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers).
Антигенсвязывающие белки, секретируемые в среды, могут быть выделены и очищены с использованием множества способов для достижения степени очистки, подходящей для предполагаемого применения. Например, применение антигенсвязывающих белков для лечения пациентов-людей типично требует по меньшей мере 95% чистоты, более типично 98 или 99% или большей чистоты (по сравнению с неочищенной культуральной средой). Клеточный дебрис из культуральных сред типично удаляют с использованием центрифугирования, а затем на стадии осветления супернатанта с использованием, например, микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубокой фильтрации. Существует множество других способов, таких как диализ и гель-электрофорез, и хроматографические способы, такие как хроматография на гидроксиапатитах (НА), аффинная хроматография (возможно включающая систему с присоединением аффинной метки, такой как полигистидин) и/или хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC, смотри US 5429746). Антитела после различных стадий осветления могут быть захвачены с использованием аффинной хроматографии с белком А или G. Затем могут следовать дополнительные стадии хроматографии, такие как ионообменная и/или НА хроматография, анионо- или катионообменная, эксклюзионная хроматография и осаждение сульфатом аммония. Также могут быть использованы различные стадии удаления вируса (например, нанофильтрация с использованием, например, фильтра DV-20). После этих различных стадий получают очищенный (например, моноклональный) препарат, содержащий по меньшей мере 75 мг/мл или больше, например 100 мг/мл или больше, антигенсвязывающего белка. Такие препараты, по существу, не содержат агрегированных форм антигенсвязывающих белков.
Бактериальные системы могут быть использованы для экспрессии антигенсвязывающих фрагментов. Такие фрагменты могут быть локализованы внутриклеточно, в периплазме или секретированы вне клеток. Нерастворимые белки могут быть экстрагированы и подвергнуты рефолдингу с образованием активных белков в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, смотри Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 и Cupit P.M. et al. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273277.
Фармацевтические композиции.
Термины заболевания, расстройства и состояния используют взаимозаменяемо. Очищенные препараты описанного здесь антигенсвязывающего белка могут быть включены в фармацевтические композиции для применения в лечении описанных здесь заболеваний людей. Фармацевтическая композиция может быть использована в лечении заболеваний, в которые вовлечен IL-7, или где благоприятным является ингибирование/нейтрализация IL-7R-опосредованной сигнализации.
Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество описанного здесь антигенсвязывающего белка.
Фармацевтический препарат может содержать антигенсвязывающий белок в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Антигенсвязывающий белок может быть введен самостоятельно или как часть фармацевтической композиции.
Типично, такие композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель, который является известным и предусмотрен приемлемой фармацевтической практикой, смотри, например, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition, (1980), Mack Publishing Co. Примеры таких носителей включают стерилизованные носители, такие как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, возможно забуференный подходящими буферами до значения рН, находящегося в диапазоне от 5 до 8.
Фармацевтические композиции могут быть введены путем инъекции или непрерывной инфузии (например, внутривенной, внутрибрюшинной, интрадермальной, подкожной, внутримышечной или внутрь воротной вены).
Такие композиции подходящим образом не содержат видимых частиц. Фармацевтические композиции могут содержать от 1 мг до 10 г антигенсвязывающего белка, например от 5 мг до 1 г антигенсвязы-вающего белка. Альтернативно, композиция может содержать от 5 до 500 мг, например от 5 до 50 мг.
Способы приготовления таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области техники. Фармацевтические композиции могут содержать от 1 мг до 10 г антигенсвязы-вающего белка в стандартной лекарственной форме, возможно вместе с инструкциями для применения.
Фармацевтические композиции могут быть лиофилизированными (высушенными замораживанием) для разведения перед введением в соответствии со способами, хорошо известными или понятными специалистам в данной области техники. Когда антитела по изобретению имеют изотип IgG1, то в фармацевтическую композицию может быть добавлен хелатообразователь на основе меди, такой как цитрат (например, цитрат натрия) или EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), или гистидин для уменьшения степени опосредованной медью деградации антител этого изотипа, смотри ЕР0612251. Фармацевтические композиции могут также содержать солюбилизатор, такой как аргининовое основание, детер-гент/антиагрегант, такой как полисорбат 80, и инертный газ, такой как азот, для замещения кислорода свободного пространства флакона.
Эффективные дозы и схемы введения антигенсвязывающего белка, как правило, определяют эмпирически, и они зависят от факторов, таких как возраст, масса и состояние здоровья пациента, и заболевания или расстройства, которое лечат. Такие факторы находятся в компетенции лечащего врача. Руководство по выбору подходящих доз можно найти, например, в Smith et al. (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York. Таким образом, антигенсвязывающий белок по изобретению может быть введен в терапевтически эффективном количестве.
Доза антигенсвязывающего белка, вводимого субъекту как правило составляет от 1 мкг/кг до 150 мг/кг, от 0,1 до 100 мг/кг, от 0,5 до 50 мг/кг, от 1 до 25 мг/кг или от 1 до 10 мг/кг массы организма субъекта. Например, доза может составлять 10, 30 или 60 мг/кг. Антигенсвязывающий белок может быть введен парентерально, например подкожно, внутривенно или внутримышечно.
При желании эффективная суточная доза терапевтической композиции может быть введена в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или больше чем шести субдоз, вводимых раздельно с подходящими интервалами, возможно, в виде единичных лекарственных форм. Например, доза может быть введена подкожно, каждые 14 или 28 суток в форме множества субдоз на каждые сутки введения.
Введение дозы может быть осуществлено путем внутривенной инфузии, типично в течение периода от 15 мин до 24 ч, такого как от 2 до 12 ч или от 2 до 6 ч. Последнее может приводить в результате к уменьшенным токсическим побочным эффектам.
Введение дозы при необходимости может быть повторено один или более чем один раз, например три раза в сутки, один раз каждые сутки, один раз каждые 2 суток, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца, один раз каждые 6 месяцев или один раз каждые 12 месяцев. Антигенсвязывающие белки могут быть введены при помощи поддерживающей терапии, например, один раз в неделю в течение периода 6 месяцев или больше. Антигенсвязывающие белки могут быть введены при помощи прерывистой терапии, например, в течение периода от 3 до 6 месяцев, и затем отсутствие дозы в течение от 3 до 6 месяцев, а затем введения антигенсвязывающих белков вновь от 3 до 6 месяцев и т.д. в течение цикла.
Доза может быть определена или скорректирована путем измерения количества IL-17 в биологическом образце. Могут быть использованы другие способы определения или корректировки дозы, включая без ограничения объема изобретения биологические маркеры ("биомаркеры") фармакологии, измерения мышечной массы и/или слияние, безопасность, переносимость и терапевтический ответ. Антигенсвязы-вающий белок может быть введен в количестве и в течение длительности времени, эффективном для понижающей регуляции IL-7 опосредованной сигнализационной активности у субъекта.
Антигенсвязывающий белок может быть введен субъекту таким путем, чтобы направить терапию на конкретную область. Например, антигенсвязывающий белок может быть инъецирован локально в мышцу, например скелетную мышцу.
Антигенсвязывающий белок может быть использован в комбинации с одним или более чем одним другим терапевтически активным агентом, например иммуномодуляторами, такими как интерферон-бета (IFNp-1a или IFNp-1b), и ацетатом глатирамера, иммунодепрессантами, такими как циклофосфамид, ме-тотрексат, азатиоприн, кладрибин, циклоспорин и митоксантрон, другими иммунологическими способами лечения, такими как внутривенное введение иммуноглобулинов (IVIg), замещение плазмы и сульфа-салазин. Дополнительный терапевтический агент может быть введен таким образом (доза, время, способ), как предписано врачом. В одном воплощении дополнительный терапевтический агент может быть введен одновременно или последовательно, или раздельно с антигенсвязывающим белком по настоящему изобретению. В одном воплощении дополнительный терапевтический агент и антигенсвязывающий белок вводят таким образом, что происходит перекрывание их фармакологических эффектов на пациента; иными словами, они оказывают биологические эффекты на пациента одновременно.
Когда антигенсвязывающий белок применяют в комбинации с другими терапевтически активными агентами, тогда индивидуальные компоненты могут быть введены вместе или по отдельности, последовательно или одновременно в отдельных или комбинированных фармацевтических композиций посредством любого подходящего пути. При введении по отдельности или последовательно антигенсвязываю-щий белок и терапевтически активный(е) агент(ы) может(гут) быть введен(ы) в любой последовательности.
Упомянутые выше комбинации могут быть представлены для применения в форме единой фармацевтической композиции, содержащей определенную выше комбинацию, возможно вместе с фармацев
тически приемлемым носителем или эксципиентом.
В случае комбинации в одной и той же композиции, понятно, что два компонента должны быть стабильны и совместимы друг с другом и другими компонентами композиции, и могут быть приготовлены для введения. При раздельном приготовлении они могут быть представлены в виде любой удобной композиции для удобства, например, таким образом, который известен в области техники для антиген-связывающих белков.
В случае комбинации со вторым терапевтическим агентом, активным против того же самого заболевания, доза каждого компонента может отличаться от дозы, когда используют один антигенсвязываю-щий белок. Подходящие дозы будут очевидны специалистам в данной области техники.
Антигенсвязывающий белок и терапевтически активный(е) агент(ы) могут действовать синергети-чески. Другими словами, введение антигенсвязывающего белка и терапевтически активного(ых) аген-та(ов) в комбинации может оказывать большее действие на описанное здесь заболевание, расстройство или состояние, чем сумма каждого из действий по отдельности.
Фармацевтическая композиция может содержать набор антигенсвязывающего белка вместе с другими лекарственными средствами, возможно с указаниями по применению. Для удобства набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с указаниями по применению.
Термины "индивид", "субъект" и "пациент" использованы здесь взаимозаменяемо. Субъект, как правило, представляет собой человека. Субъект также может представлять собой млекопитающее, такое как мышь, крыса или примат (например, игрунка или обезьяна). Субъект может представлять собой животное, отличное от человека. Антигенсвязывающие белки могут также иметь ветеринарное применение. Субъект, которого лечат, может представлять собой сельскохозяйственное животное, например корову или быка, овцу, свинью, вола, козу или лошадь, или может представлять собой домашнее животное, такое как собака или кошка. Животное может иметь любой возраст, или представлять собой зрелое взрослое животное.
Лечение может быть терапевтическим, профилактическим или предупреждающим. Субъект может представлять субъекта, нуждающегося в лечении. Нуждающиеся в лечении могут включать индивиды, уже страдающие конкретным медицинским заболеванием, дополнительно к индивидам, у которых заболевание может развиться в будущем.
Таким образом, описанный здесь антигенсвязывающий белок может быть использован для профилактического или предупредительного лечения. В этом случае описанный здесь антигенсвязывающий белок вводят индивиду для предупреждения или задержки начала одного или более чем одного аспекта или симптома заболевания. Субъект может не иметь симптомов. Субъект может иметь генетическую предрасположенность к заболеванию. Профилактически эффективное количество антигенсвязывающего белка вводят такому индивиду. Профилактически эффективное количество представляет собой количество, которое предупреждает или задерживает начало одного или более чем одного аспекта или симптома описанного здесь заболевания.
Описанный здесь антигенсвязывающий белок также может быть использован в способах терапии. Термин "терапия" охватывает уменьшение интенсивности, сокращение или предупреждение по меньшей мере одного аспекта или симптома заболевания. Например, описанный здесь антигенсвязывающий белок может быть использован для уменьшения интенсивности или сокращения одного или более чем одного аспекта или симптома описанного здесь заболевания.
Описанный здесь антигенсвязывающий белок используют в эффективном количестве для терапевтического, профилактического или предупредительного лечения. Терапевтически эффективное количество описанного здесь антигенсвязывающего белка представляет собой количество, эффективное для уменьшения интенсивности или сокращения одного или более чем одного аспекта или симптома заболевания. Описанный здесь антигенсвязывающий белок также может быть использован для лечения, предупреждения или терапии описанного здесь заболевания.
Описанный здесь антигенсвязывающий белок может оказывать в общем благоприятное действие на здоровье субъекта, например может увеличивать ожидаемую длительность жизни субъекта.
Описанный здесь антигенсвязывающий белок не обязательно должен оказывать полное излечение, или устранять каждый симптом или проявление заболевания для того, чтобы составлять пригодное терапевтическое лечение. Как понимают в соответствующей области техники, лекарства, используемые в качестве терапевтических агентов, могут уменьшать тяжесть данного болезненного состояния, но не обязательно устранять каждое проявление заболевания для того, чтобы рассматриваться в качестве терапевтических агентов. Аналогично, профилактическое лечение не обязательно должно быть полностью эффективным для предупреждения начала заболевания для того, чтобы составлять пригодный профилактический агент. Достаточно просто сокращения влияния заболевания (например, уменьшения количества или тяжести его симптомов или увеличения эффективности другой обработки, или достижения другого благоприятного действия), или уменьшения вероятности того, что заболевание проявится (например, путем задержки начала заболевания) или ухудшится у субъекта.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут быть использованы в терапии рассеянного склероза и при других аутоиммунных или воспалительных заболеваниях, особенно тех, в раз
витие которых вовлечены патогенные ТиП-клетки. Такие заболевания связаны с высокими уровнями экспрессии IL-17. Было сообщено о повышенных уровнях IL-17 в сыворотке и СМЖ пациентов, страдающих от РС (Matusevicius, D. et al.; Mult. Scler. 5, 101-04; 1999) и в синовиальной жидкости, полученной у пациентов, страдающих от ревматоидного артрита. IL-17 также вовлечен в развитие псориаза (Homey et al.; J. Immunol. 164(12):6621-32; 2000), в то время как Hamzaoui et al. сообщали о высоких уровнях IL-17 при болезни Бехчета (Scand. J. Rhuematol.; 31:4, 205-210; 2002). Повышенные уровни IL-17 также наблюдали при системной красной волчанке (СКВ) (Wong et al.; Lupus 9(8):589-93; 2000).
Ингибирование сигнализации, опосредованной рецептором IL-7, может также быть полезным в лечении воспалительных (не аутоиммунных) заболеваний, при которых повышены уровни IL-17, таких как астма.
Соответственно воспалительные и/или аутоиммунные заболевания по изобретению включают воспалительные заболевания кожи, включая псориаз и атопический дерматит; системную склеродермию и склероз; воспалительное заболевание кишечника (IBD); болезнь Крона; неспецифический язвенный колит; ишемические реперфузионные расстройства, включая реперфузионное повреждение тканей, связанное с хирургическим вмешательством, ишемические состояния миокарда, такие как инфаркт миокарда, остановку сердца, реперфузию после кардиохирургического вмешательства и констрикцию после чре-скожной транслюминальной коронарной ангиопластики, инсульт и аневризмы брюшной аорты; отек головного мозга, обусловленный инсультом; травму головы, гиповолемический шок; асфиксию; респираторный дистресс-синдром взрослых; острое повреждение легких; болезнь Бехчета; дерматомиозит; полимиозит; рассеянный склероз (РС); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; остеоартрит; волчаночный нефрит; аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (РА), синдром Шегрена, васкулит; заболевания, включая диапедез лейкоцитов; воспалительное расстройство центральной нервной системы (ЦНС), синдром полиорганной недостаточности, обусловленный септицемией или травмой, алкогольный гепатит; бактериальную пневмонию; заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, включая гломерулонефрит; сепсис; саркоидоз; иммунопатологические ответы на трансплантацию тканей/органов; воспалительные заболевания легких, включая плеврит, альвеолит, васкулит, пневмонию, хронический бронхит, бронхоэктазы, диффузный панбронхиолит, экзогенный аллергический альвеолит, идиопатический фиброз легких (ИФЛ) и муковисцидоз; псориатический артрит; нейромиелит зрительного нерва, синдром Гийена-Барре (СГБ), хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), диабет 1 типа и т.п.
В частности, антагонисты по настоящему изобретению могут быть полезны в терапии рассеянного склероза при всех его формах, включая нейромиелит зрительного нерва. Предполагают, что лечение антагонистом по настоящему изобретению будет наиболее эффективным при введении в связи с активным воспалительным заболеванием, то есть, при применении в лечении клинически изолированного синдрома или рецидивирующих форм РС. Эти стадии заболевания могут быть определены клинически и/или критериями визуализации, такими как усиление гадолинием или другие более чувствительные методики, и/или другими на данный момент не установленными биомаркерами активного заболевания. В частности, антагонисты по изобретению могут быть использованы для лечения рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза (РРРС) (посредством внутривенной, подкожной, пероральной или внутримышечной доставки) при приближении рецидива или рецидиве у пациентов. В одном воплощении антагонист по изобретению вводят пациенту в начале рецидива или в пределах 1, 2, 3, 6, 12, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 суток от начала рецидива.
Антигенсвязывающие белки по изобретению способны связываться с CD127. В одном воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению способны оказывать антагонистическое действие в отношении биологического действия рецептора IL-7. В одном воплощении антигенсвязывающие белки способны оказывать антагонистическое действие в отношении по меньшей мере одного из: опосредованного рецептором IL-7 роста ТН17 и опосредованного рецептором IL-7 выгживания ТН17.
Термин ингибировать, оказывать антагонистическое действие и нейтрализовать использованы здесь в качестве синонимов. Ни один из терминов не предполагает требование полной нейтрализации; также рассматривается частичная нейтрализация, которая соответствуют снижению, но не полному устранению биологического действия.
Опосредованный рецептором IL-7 рост и/или выживание ТН17 могут быть обнаружены на клеточном уровне по увеличению или поддержанию количества клеток ТН17, или путем увеличения отношения клеток ТН17 по сравнению с количествами других CD4+ Т-клеток, или конкретней по увеличению отношения клеток TH17:TH1, отношения клеток TH17:Treg, отношения клеток (TH17 плюс ТН1):Тге^ и/или отношения клеток ^^(Тн! плюс Treg).
На молекулярном уровне рост и/или выживание TH17 могут быть обнаружены по увеличению продукции IL-17 популяцией CD4+ Т-клеток (или популяцией клеток ТН17). Таким образом, в воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению уменьшают продукция IL-17 популяцией CD4+ Т-клеток. Опосредованный рецептором IL-7 рост и выживание ТН17 может также быть обнаружен по увеличению продукции IFN-Y популяцией CD4+ Т-клеток (или популяцией клеток TH17). Таким образом, в воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению оказывают антагонистическое действие (сокращают)
продукцию IFN-Y популяцией CD4+ Т-клеток. На молекулярном уровне антигенсвязывающие белки по изобретению могут ингибировать опосредованное рецептором IL-7 фосфорилирование STAT-5.
На молекулярном уровне блокирующее действие антигенсвязывающих белков по изобретению можно наблюдать и измерять при помощи таких анализов, как анализ индуцированного IL-7 pSTAT5 или Bcl-2. На клеточном уровне блокирующее действие можно наблюдать и измерять посредством таких анализов, как анализ секреции IL-17 или IFN-y ^П-клетками. Примеры анализов описаны в заявке РСТ № PCT/US2009/053136 (W02010/017468).
В примере анализа pSTAT-5 PBMC стимулируют при помощи IL-7 в присутствии и отсутствии тестируемого агента. Клетки затем количественно оценивают в отношении уровня pSTAT-5, например, путем окрашивания в отношении pSTAT-5 (например, при помощи меченого антитела против pSTAT-5, такого как Alexa Fluor(r) 647 Mouse Anti-Stat5 (pY694, BD [#612599])) с последующей сортировкой флуоресцентно-активированных клеток. Уровни фосфорилированного STAT-5 также могут быть определены при помощи ELISA. Агенты, которые уменьшают уровень фоссфорилированного STAT-5, могут представлять собой потенциальные терапевтические кандидаты для лечения аутоиммунного заболевания.
Антагонист может обладать способностью уменьшать уровни фосфорилированного STAT-5 по меньшей мере на 20, 50, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% по сравнению с уровнями STAT-5 в отсутствие антагониста, или по сравнению с отрицательным контролем или необработанными клетками. Антагонист может иметь IC50 50 мкг/мл, 25 мкг/мл или меньше, 10 мкг/мл или меньше, 5 мкг/мл или меньше или 2 мкг/мл или меньше. В воплощении антагонист имеет IC50 меньше чем или равную 1 мкг/мл, меньше чем или равную 0,75 мкг/мл, меньше чем или равную 0,5 мкг/мл, меньше чем или равную 0,25 мкг/мл, или меньше чем или равную 0,1 мкг/мл.
Антагонисты по изобретению особенно эффективны в ингибировании роста клеток ТН17. Рост клеток ТН17 может быть определен в анализе роста ТН17, который включает стимулирование роста популяции наивных Т-клеток в присутствии и отсутствии тестируемого агента, с последущей стимуляцией клеток в направлении продукции IL-17 и оценкой уровеня IL-17, продуцируемого клетками в присутствии и отсутствии тестируемого агента.
В примере анализа человеческие CD4+ Т-клетки дифференцируются до ТН17 путем стимуляции с активацией Т-клеточного рецептора в присутствии IL-1, IL-6 и IL-23. После 5 суток дифференцировки клетки CCR6+ сортируют с получением обогащенной популяции ТН17. Эту популяцию затем стимулируют человеческим IL-7 и определяют увеличение IL-17 и IFN-y в супернатанте. Способность тестируемого агента, такого как антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, блокировать взаимодействие между IL-7 и CD127, которая может быть определена по присутствию антагонистов этого взаимодействия во время периода инкубации, должна предупреждать рост клеток ТН17, приводя к уменьшению продукции IL-17 и IFN-y.
Антигенсвязывающие белки по изобретению могут быть способны осуществлять 20% или больше чем 20% ингибирование секреции IL-17 в таком анализе по сравнению с отрицательным контролем. Типичней, антигенсвязывающий белок осуществлять от 50, от 75, от 85 или от 90 или больше чем 90% ин-гибирование секреции IL-17 по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент может демонстрировать IC50 меньше чем или равную 50 мкг/мл в анализе. В других воплощениях IC50 может составлять меньше чем или равна 20, 10 или 5 мкг/мл.
Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства, при котором вводят пациенту антигенсвязывающий белок по изобретению в количестве, достаточном для уменьшения количества клеток TH17 у пациента.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта-человека, при котором субъекту водят антигенсвязывающий белок в количестве, достаточном для уменьшения опосредованного рецептором IL-7 фосфорилирования STAT-5.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рассеянного склероза у пациента, при котором пациенту вводят антигенсвязывающий белок по изобретению, где пациент страдает рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания у субъекта-человека, при котором субъекту вводят антигенсвязывающий белок по изобретению в количестве, эффективном для уменьшения отношения клеток ТН17 по сравнению с клетками ТН1.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания у субъекта-человека, при котором субъекту вводят антигенсвязывающий белок по изобретению в количестве, эффективном для уменьшения отношения клеток TH по сравнению с клетками
(Foxp3+) Treg.
Способы диагностического применения.
Описанные здесь антигенсвязывающие белки могут быть использованы для обнаружения CD127 в биологическом образце in vitro или in vivo для диагностических задач. Например, антигенсвязывающие белки против CD127 могут быть использованы для обнаружения CD127 в выращиваемых клетках в ткани или в сыворотке крови. Ткань может быть сначала выделена (например, путем биопсии) из организма
человека или животного. Могут быть использованы обычные иммуноанализы, включая ELISA, Вестерн-блот, иммуногистохимию или иммунопреципитацию.
Антигенсвязывающие белки могут быть представлены в диагностическом наборе, содержащем один или более чем один антигенсвязывающий белок, обнаруживаемую метку и указания для применения набора. Для удобства набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с указаниями по применению.
Генная терапия.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие описанные здесь антигенсвязывающие белки, могут быть введены субъекту, нуждающемуся в таком введении. Молекула нуклеиновой кислоты может экс-прессировать CDR в соответствующем скелете или домене, вариабельном домене или полноразмерном антителе. Молекула нуклеиновой кислоты может находиться в векторе, который дает возможность для экспрессии в человеческой клетке или животной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты или вектор могут быть приготовлены для введения с фармацевтически приемлемым эксципиентом и/или одним или более чем одним терапевтически активным агентом, как обсуждалось выше.
Примеры
1.0. Гуманизация 1А11.
1.1. Клонирование вариабельных областей гибридомы 1А11.
Полную РНК получали из клеточных осадков гиборидом 1А11, и ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) осуществляли для получения кДНК вариабельных областей. Ампли-фицированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей каждой гибридомы клонировали в клонирующем векторе pCR2.1. Получали последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепей каждой гибридомы. Анализ последовательности позволил предсказать следующие пептидные последовательности (с выделенными гипервариабельными участками): А) 1А11 VH
EVQLQQSGPELLKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGVTSYNQKFKG
KATLWAKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGDGISTYWT'FDVWGAGTTVTVSS
Б) 1А11 VL
EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKPWIYEISKLASGVPVRFSGSGSGT
SYSLTISSMEAEDAAIYYCQEWNYPYTFGGGTKLEIK
Рекомбинантную химерную форму антитела получали путем слияния вариабельных областей тяжелой и легкой цепей с человеческим IgG1 Fc и каппа константными областями соответственно.
1.2. Стратегия гуманизации тяжелой цепи 1А11.
В соответствии с анализом BLAST базы данных V гена зародышевой линии человека, IGHV12 зародышевой линии человека, который имеет 64% идентичность (включая CDR) мышиной вариабельной последовательности тяжелой цепи 1А11, был выбран в качестве предпочтительной акцепторной скелетной области для гуманизации. V-область зародышевой линии комбинировали in silico с подходящей FR4, в данном случае с минигеном JH6 (Кабат, Vol. II) на основе сходства последовательностей. Первые шесть остатков из числа остатков минигена JH6, предшествующих мотиву WGQG, попадают в область CDR3, которая заменяется на входящий CDR донорного антитела. Восемь гуманизированных вариантов тяжелой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Н0 представляла собой прямое прививание мышиного CDR из 1А11 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Н1-Ю основаны на Н0; каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 71, 66 и 69 соответственно. Конструкции Н4-Н7 включают две, три, четыре или пять из вышеприведенных обратных мутаций.
1.3. Обоснование для гуманизации тяжелой цепи 1А11 для скелетной области IGHV1-2
1 11 21 CDR1 39 48
VH1A11 EVQLQQSGPE LLKPGASMKI SCKASGYSFT GYTM.NWVK QSHGKNLEWI
IGVH1-2 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYM..HWR QAPGQGLEWM
1А11 НО QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..NWJR QAPGQGLEWM
1A11H1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..№IWR QAPGQGLEWM
1A11H2 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM.NWVR QAPGQGLEWM
1A11H3 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM.NWVR QAPGQGLEWM
1A11H4 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..NWVR QAPGQGLEWM
1A11H5 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GVTM..NWVR QAPGQGLEWM
1A11H6 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GVTM..NWVR QAPGQGLEWM
1A11H7 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..NWVR QAPGQGLEWM
49 CDR2 66 76 83 92
VH1A11 GLINPY..NG VTSYNQKFKG KATLTVAKSS STAYMELLSL TSEDSAVYYC
IGVH1-2 GWINPN..SG GTNYAQKFQG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11 HO GUNPY..NG VTSYNQKFKG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H1 GUNPY..NG VTSYNQKFKG RVTMTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H2 GUNPY..NG VTSYNQKFKG KVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H3 GUNPY..NG VTSYNQKFKG RVTLTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H4 GUNPY..NG VTSYNQKFKG KVTMTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H5 GUNPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H6 GLINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVDKSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
1A11H7 GLINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVAKSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC
93 CDR3 104
VH1A11 ARGDGNY. WYFDWJG AGTTVTVSS
JH6 - WG QGTTVTVSS
1A11 HO ARGDGNY. WYFDWJG QGTTVTVSS
1.4. Стратегия гуманизации легкой цепи 1А11.
В соответствии с анализом BLAST базы данных V гена зародышевой линии человека, IGKV311 зародышевой линии человека, который имел 53% идентичность (включая CDR) мышиной вариабельной последовательности легкой цепи 1А11, был выбран в качестве предпочтительной акцепторной скелетной области для гуманизации. V-область зародышевой линии комбинировали in silico с подходящей FR4, в данном случае с J-областью каппа 4 минигена (Кабат, Vol. II) на основе сходства последовательностей. Первые три остатка минигена JK-4 попадают в область CDR3, которая заменяется на входящий CDR до-норного антитела. Десять гуманизированных вариантов легкой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция L0 представляла собой прямое прививание мышиного CDR из 1А11 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции L1, L2, L4 основаны на L0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые различались в каждой из конструкций; положения 47, 71 и 46 соответственно. Конструкция L3 включает обе из вышеприведенных обратных мутаций 47 и 71. Конструкция L5 включает три из вышеприведенных обратных мутаций 47 и 71, и 46. Конструкции L6-L9 основаны на L5, каждая из которых включает одну, две, три и четыре дополнительные мутации скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 58, 45, 70 и 60 соответственно.
1.5. Обоснование для гуманизации легкой цепи 1А11 для скелетной области IGKV3-11
1 CDR1 44
Vk1A11 EIVLTQSPAI TAASLGQKVT YTCSASS. SVTYMHWYQQKSGTSP
Vk3-11 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQ. SVSSYLA WYQQKPGQAP
1A11L0 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASS. SVTYMH WYQQKPGQAP
1A11L1-L9 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASS. SVTVftfH WYQQKPGQAP
45 CDR2 CDR3 94
Vk1A11 KPWIYE/SKL ASGVPVRFSG SGSGTSYSLT ISSMEAEDAA \YYCQEWNY
Vk3-11 RLLIYDASWR ATCIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYC
1A11L0 RLLIYE/SKL ASGIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWWV
1A11L1 RLWIYE/SKL ASGIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY
1A11L2 RLLIYE/SKL ASGIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEVWVY
1A11L3 RLWIYE/SKL ASGIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEVWVY
1A11L4 RPLIYE/SKL ASGIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYCQEVWVY
1A11L5 RPWIYE/SKL ASGIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEH/NY
1A11L6 RPWIYE/SKL ASGVPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEVWVY
1A11L7 KPWIYE/SKL ASGVPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY
1A11L8 KPWIYE/SKL ASGVPARFSG SGSGTSYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEVWVY
1A11L9 KPWIYE/SKL ASGVPVRFSG SGSGTSYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY
2.0. Гуманизация 6A3.
2.1. Стратегия гуманизации тяжелой цепи 6A3.
В соответствии с анализом BLAST базы данных V гена зародышевой линии человека, IGHV461 зародышевой линии человека, которые имели 71% идентичность (включая CDR) мышиной вариабельной последовательности тяжелой цепи 6A3, и IGHV3 33 зародышевой линии человека, которые имели 51% идентичность (которые, как продемонстрировано ранее, хорошо экспрессируются с IGKV139), были выбраны в качестве предпочтительных акцепторных скелетных областей для гуманизации. V-область зародышевой линии комбинировали in silico с подходящей FR4, в данном случае с минигеном JH6 (Кабат, Vol. II) на основе сходства последовательностей. Первые два остатка из числа остатков минигена JH6, предшествующих мотиву WGQG, попадают в область CDR3, которая заменяется на входящий CDR донорного антитела. Десять гуманизированных вариантов тяжелой цепи со скелетной областью IGHV461 и двенадцать гуманизированных вариантов тяжелой цепи со скелетной областью IGHV333 получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Н0 представляла собой прямое прививание мышиного CDR из 6A3 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Н1-Н5 со скелетной областью IGHV461 основаны на Н0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 71, 27, 30, 67 и 48 соответственно. Конструкции Н6-Н9 включают две, три, четыре или пять из вышеприведенных обратных мутаций. Конструкции Н1-Н11 с каркасной областью IGHV3-33 основаны на Н0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 27, 30, 28, 29, 67, 73, 78, 49, 68, 24 и 48 соответственно.
2.2. Обоснование для гуманизации тяжелой цепи 6АЗ для скелетной области IGHV4 61
1 11 21 CDR1 39 48
VH6A3 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCTVTGYJSjl TDYAW.WWIR QFPGNKLB/Щ
IGHV4_61 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGGYYWSWIR QPPGKGLEWI
6A3-H0 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW.WWIR QPPGKGLEWI
6A3-H1 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW.WWIR QPPGKGLEWI
6A3-H2 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVS TDYAW.m/\R QPPGKGLEWI
6A3-H3 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVI TDYAW.NW\R QPPGKGLEWI
6A3-H4 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TOYAIV.WWIR QPPGKGLEWI
6A3-H5 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW.№N\R QPPGKGLEWM
6A3-H6 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVS TDYAW.1№\R QPPGKGLEWI
6A3-H7 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVI TDYAW.WWIR QPPGKGLEWI
6A3-H8 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVI TDYAW.WWIR QPPGKGLEWI
6A3-H9 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVI TDYAW.WWIR QPPGKGLEWM
49 CDR2 66 76 83 92
VH6A3 QYIFY...SG STTYTPSLKS RISITRDTSK NQFFLQLNSV TTEDTATYYC IGHV4_61 G YIYY...SG STNYNPSLKS RVTISVDTSK NQ FSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H0 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H1 GV7FY...SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H2 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H3 G Y7FY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H4 G YIFY...SG STTYTPSLKS RITISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H5 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H6 GYIFY...SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H7 GY/FY...SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H8 GY/FY...SG STTYTPSLKS RITISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H9 GY/FY...SG STTYTPSLKS RITISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC
93 CDR3 104
VH6A3 ARGGYDVWYF. DYW GQGTTLTVSS
IGHV4_61 AR
6A3 H0-H9 ARGGYDVNYF, DWV GQGTTVTVSS
Скелетная область 4
93 CDR3 104
VH6A3 AGGLAGTL DWV GQGTTLTVSS
IGHV4_61 AR
hJH1 FQH LV~-
ЫН2 FDL- -R-LV--
ШНЗ FDV--MV--
hJH4 LV--
hJH5 FDS-- -LV-
hJH6 MDV- V-
6A3H0-9 AGGLAGTL DYW GQGTTVTVSS
2.3. Обоснование для гуманизации тяжелой цепи 6АЗ для скелетной области IGHV3 33
1 11 21 CDR1 39 48
VH6A3 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT TDYAW.NW\R QFPGNKLEWJM
IGHV3_33 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMH..WJR QAPGKGLEWV
6A3-H0 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H1 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGYTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H2 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFJ TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H3 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFSFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H4 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTIS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-HS QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H6 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H7 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H8 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H9 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H10 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAVSGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWV
6A3-H11 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.tfJWR QAPGKGLEWM
49 CDR2 66 76 63 92
VH6A3 ЈV/FY...SG STTYTPSLKS RJSJTRDISK NQEFLQLNSV TTEDTATYYC IGHV3_33 AVIWY...DGSNKYYADSVKG RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H0 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H1 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H2 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H3 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H4 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-HS AYIFY...SG STTYTPSLKS RjTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H6 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDTSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H7 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTFYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H6 QYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H9 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFSISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H10 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H11 AY1FY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC
93 CDR3 104
VH6A3 ARGGYDVNYF. DYW GQGTTLTVSS
IGHV3_33 AR
6A3H0-H9 ARGGYDVNYF. DYW GQGTTVTVSS
Каркасная область 4
93 CDR3 104
VH6A3 AGGLAGTL DYW GQGTTLTVSS
IGHV3_33 AR
hJH1 FQH LV--
hJH2 FDL- -R-LV--
hJH3 FDV- --MV--
hJH4 LV--
hJH5 FDS LV--
hJH6 MDV V--
6A3H0-11 AGGLAGTL. DVW GQGTTVTVSS
2.4. Стратегия гуманизации легкой цепи 6A3.
В соответствии с анализом BLAST базы данных V гена зародышевой линии человека, IGKV139 зародышевой линии человека, который имел 72% идентичность (включая CDR) мышиной вариабельной последовательности легкой цепи 6A3, был выбран в качестве предпочтительной акцепторной скелетной области для гуманизации. V-область зародышевой линии комбинировали in silico с подходящей FR4, в данном случае J-областью каппа 2 минигена (Кабат, Vol. II) на основе сходства последовательностей. Первые два остатка из числа остатков JK-2 минигена попадают в область CDR3 и идентичны последним двум остаткам в CDR3 легкой цепи мышиной 6A3. Пять гуманизированных вариантов легкой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция L0 представляла собой прямое прививание мышиного CDR из 6A3 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции L1, L2 основа
ны на L0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличались в каждой из конструкций; позиции 45, 70 соответственно. Конструкция L3 включает обе из вышеприведенных обратных мутаций.
Обоснование для гуманизации легкой цепи 6A3 для скелетной области IGKV139 1 CDR144
Vk 6АЗ DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQ TIGAWLA WYQQKPGKSP
IGKV1_39 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ TIGAWLA WYQQKPGKAP
6A3 LO DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ TIGAWLA WYQQKPGKAP
6A3 L1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ TIGAWLA WYQQKPGKAP
6A3 L2 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ TIGAWLA WYQQKPGKAP
6A3 L3 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ TIGAWLA WYQQKPGKAP
45 CDR2 CDR3 94
Vk 6A3 QJJJYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTJJFSFK ISSLQAEDFV SYYCQQFFST IGKV1_39^JJYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCQQFFST 6A3 LO KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 6A3 L1 QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 6A3 L2 KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 6A3 L3 QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST
Vk 6A3 P..WTFGGGT KLEIKR 6A3 L0-L3 P..WTFGQGT KLEIKR Каркасная область 4 hJk2 FGQGT KLEIKR
Пять гуманизированных вариантов легкой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция L0 представляла собой прямое прививание мышиного CDR из 6A3 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции L1, L2 основаны на L0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличались в каждой из конструкций; положения 45, 70 соответственно. Конструкция L3 включает обе из вышеприведенных обратных мутаций. Конструкция L27 включает больше мутаций: T4L, A31Y, D70M, V85T, T94Y, Q100G, L104V (SEQ ID NO:138).
2.5. Конструирование Fc-деактивированной вариабельной области тяжелой цепи.
Две аминокислотные замены L237A и G239A осуществляли с конструкцией 1А11 H3. Эти модификации делают молекулу менее способной рекрутировать иммунные эффекторные клетки или комплемент. Получающуюся в результате конструкцию VH идентифицируют как 1А11 H3-Fc, и она имеет последовательность, как показано на SEQ ID NO:118 (кодируемую полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:119). Антитело, содержащее 1А11 H3-Fc и легкую цепь 1A11.L4 (1А11 H3L4Fc), дополнительно анализировали, как описано в примере 4 ниже.
2.6. Аффинное созревание 1А11 H3L4.
2.6.1. Конструирование рекомбинантных вариантов 1А11 H3L4 CDRH3 против IL7R.
Получали множество вариантов гуманизированного моноклонального антитела 1А11 H3L4 против IL7R. Все они отличались только единичной аминокислотной заменой в области CDRH3 тяжелой цепи антитела, имеющей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:114 (H3), и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:115
(L4).
Гуманизированные по CDRH3 варианты 1А11 H3L4 в составе экспрессирующего вектора млекопи
тающего pLEFD получали с использованием сайт-направленного мутагенеза.
2.6.2. Экспрессия антитела в небольшом масштабе в клетках HEK 293 6Е.
Плазмиды pLEFN и pLEFD, кодирующие легкую и тяжелую цепи вариантов 1А11 H3L4 и варианты CDRH3 соответственно временно трансфицировали вместе в клетки HEK 293 6Е в 96-луночном формате (экспрессируемый объем 500 мкл) с использованием 293fectin (Invitrogen 12347019). Супернатанты собирали путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин. Супернатанты, содержащие антитело, затем фильтровали с использованием фильтрующей пластины 0,45 мкм. Антитела оценивали непосредственно из супернатанта культуры ткани.
2.6.3. Анализ вариантов 1А11 H3L4 CDRH3 против IL7R с использованием Proteon.
Исходный скрининг для определения связывающей аффинности вариантов CDRH3 антитела (которые происходят в результате экспрессии антитела в небольшом масштабе в клетках HEK 293 6Е, и оцениваемых непосредственно из супернатанта культуры ткани, как описано в примере 2.6.2) осуществляли на ProteOn XPR36 (Biorad). Способ был следующим: белок иммобилизовали на чипе GLC путем связывания с первичным амином, мутантные по CDRH3 антитела затем закрепляли на этой поверхности и IL7R пропускали над ними в концентрации 256, 64, 16, 4, 1 нМ, причем инжекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали в качестве двойного референсного значения для кривых связывания. 50 мМ NaOH использовали для регенерации захватывающей поверхности, удаления связавшихся мутантных по CDRH3 антител при подготовке к другому циклу захвата и инжекции аналита. Данные подгоняли к модели 1:1 с использованием программного обеспечения для анализа, установленного в анализаторе. Анализ связывания мутантных антител осуществляли непосредственно на супернатантах культуры ткани.
Скрининг выявил несколько антител, которые, по-видимому, обладали более хорошими кинетическими профилями по сравнению с родительской молекулой (1А11 H3L4). Данные, полученные в результате этого анализа и представленные в 4.2.3, демонстрируют, что несколько мутаций CDRH3 по остаткам N98 и F100b, по-видимому, улучшают связывающую аффинность с IL7R. Из этого набора данных, шесть молекул отобраны для дополнительного анализа (пример 2.6.4).
2.6.4. Экспрессия антитела в клетках HEK 293 6Е в большем масштабе.
Данные демонстрируют, что несколько мутаций CDRH3 по остаткам N98 и F100b, по-видимому, улучшают связывающую аффинность с IL7R (данные представлены в 4.2.3). Таким образом, очищенное антитело получали для этих шести вариантов CDRH3. Конструкции, кодирующие тяжелую и легкую цепь вариантов CDRH3 1А11 H3L4, субклонировали из плазмид pLEFD и pLEFN в вектор рТТ для оптимальной экспрессии в HEK 293 6Е в большом масштабе. Плазмиды временно трансфицировали вместе в 50-100 мл HEK 293 6Е (подробная информация о плазмидах обобщена в табл. 7) с использованием 293fectin (Invitrogen, 12347019). Триптоновую подкормку добавляли к культуре клеток через 24 ч, и клетки собирали после еще 72 ч. Антитело затем аффинно очищали с использованием колонок с иммобилизованным белком и количественно оценивали путем регистрации поглощения при 280 нм.
3.0. Конструирование гуманизированных векторов.
Последовательности ДНК гуманизированных вариабельных областей оптимизировали с использованием программного обеспечения LETO 1.0 (Entelechon GmbH) и синтезировали de novo путем конструирования перекрывающегося олигонуклеотида и амплификации путем ПЦР. Праймеры включали сайты рестрикции для клонирования в экспрессирующиеся векторы млекопитающих и сигнальные последовательности человеческого иммуноглобулина для секреции. Гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую гамма 1 константную область, с использованием Age1/Kas1. Параллельно, гуманизированные вариабельные области легкой цепи клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую константную область каппа, с использованием HindIII и BsiWI.
4.0. Характеристики гуманизированных антител.
4.1. Определение кинетики связывания конструкций 1А11 и 6A3: BIAcore(tm) 3000.
Кинетики связывания антител против CD127 с человеческими CD127 ECD оценивали с использованием устройства BIAcore 3000 (GE Healthcare). Гуманизированные конструкции 6A3 или 1А11 захватывали на биосенсорном чипе СМ5, на котором уже иммобилизовано моноклональное антитело против человеческого IgG (Fc специфическое) BIAcore (GE Healthcare кат. № BR-1008-39) с использованием поставляемого буфера для связывания. Диапазон концентраций человеческого CD127 ECD (512, 256, 128, 64, 32, 16 нМ) инжектировали в течение 240 с со скоростью потока 30 мкл/мин.
1. Захват интересующего mAb.
2. Ассоциация аналита с захваченным mAb.
3. Диссоциация аналита (буфер).
4. Регенерация при помощи оптимизированного для BIAcore буфера. Удаляет все, кроме ковалент-но связанных anti-H Ab. Циклы анализа кинетики BIAcore: буфер, 512, 256, 128, 64, 32, 16 нМ.
IL7R ECD; цикл с буфером использовали в качестве двойного референсного значения.
Поверхности с антителом регенерировали при помощи 3 М MgCl2. Кинетики определили путем общей подгонки данных к модели 1:1 Лэнгмюра с использованием программного обеспечения BIAe-valuation. Результаты представлены в примерах 4.2.1 (1А11) и 4.2.2 (6A3).
4.1.1. Определение кинетик связывания выбранных вариантов 1А11 H3L4 CDRH3.
Анализ BIAcore(tm) использовали для определения связывающей аффинности очищенных мутантных по CDRH3 антител (которые получали в результате экспрессии антитела в клетках HEK 293 6Е в большом масштабе, как описано в примере 2.6.4).
4.1.1.1. Способ 1. BIAcore(tm) T100.
Антитело против человеческого IgG (GE Healthcare/BIAcore(tm) BR-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ3 путем связывания с первичным амином до уровня приблизительно 1300 резонансных единиц (RU), Мутант по CDRH3 антитела затем захватывали на нем, все антитела захватывались с близкими уровнями (44-56 RU) и IL-7R пропускали над ними в концентрации 256, 64, 16, 4, 1 нМ, причем инжек-цию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали в качестве двойного референсного значения для кривых связывания. Регенерацию этой поверхности осуществляли с использованием 3 М MgCl2. Данные по связыванию подгоняли к 1:1 модели, относящейся к программному обеспечению для анализа BIAcore(tm) T100. Анализ осуществляли с использованием HBS-EP в качестве буфера для анализа, и осуществляли при 25°С с использованием BIAcore(tm) T100. Результаты представлены в 4.2.4.
4.1.1.2. Способ 2. BIAcore(tm) 3000.
Антитело против человеческого IgG (GE Healthcare/BIAcore(tm) BR-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином до уровня приблизительно 5400 резонансных единиц (RU), мутант по CDRH3 антитела затем захватывали на этой поверхности, все антитела захватывались с близкими уровнями (175-205 RU), и IL7R пропускали сверху в концентрации 64, 16, 4, 1 нМ, причем ин-жекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали в качестве двойного референсного значения для кривых связывания, регенерацию этой поверхности осуществляли с использованием 3 М MgCl2. Данные по связыванию подгоняли к модели 1:1, относящейся к программному обеспечению для анализа BIAcore(tm) 3000. Анализ осуществляли с использованием HBS-EP в качестве буфера для анализа, и осуществляли при 25°С с использованием BIAcore(tm) 3000. Результаты представлены в 4.2.5.
4.1.2. Определение видов перекрестной реактивности 1А11 H3L4 у яванского макака и игрунки.
Кинетики связывания 1A11H3L4 для CD127 ECD яванского макака и игрунки оценивали с использованием Biacore 3000. 1А11 H3L4 захватывали на биосенсорном чипе СМ5, на котором уже иммобилизовано моноклональное антитело против человеческого IgG (Fc-специфического) BIAcore (GE Healthcare кат № BR-1008-39). Поверхности антитела регенерировали при помощи 3 М MgCl2. Кинетики определяли путем общей подгонки данных к модели 1:1 Лэнгмюра с использованием программного обеспечения BIAevaluation. Результаты представлены в 4.3.
4.1.3. Анализ ингибирования рецептора IL7.
Анализ BIAcore(tm) также использовали для демонстрации того, что очищенные мутантные по CDRH3 антитела (которые получены путем экспрессии анетитела в клетках HEK 293 6Е в большем масштабе, как описано в примере 2.6.4) способны ингибировать взаимодействие между IL7 и IL7R.
IL7 (R &D Systems) иммобилизовали на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином; поверхность кондиционировали с использованием 10 мМ глицина, рН 3,0, с получением поверхности для анализа нейтрализации. IL7R в концентрации 64 нМ инкубировали с тестируемыми антителами в концентрациях 256, 128, 64, 16, 8, 4, 2 и 1 нМ в анализе 1 и 256, 128, 64, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0,25 нМ в анализе 2. Образцы затем инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем пропускали над чипом IL7/CM5, 10 мМ глицин, рН 3,0, использовали для регенерации поверхности для следующего взаимодействия. Значения IC50 рассчитывали с использованием Robosage, в котором связывающие сигналы превращали в процентные значения, основанные на максимальном сигнале, достигнутом с использованием IL7R при 64 нМ с 0 нМ антитела. Результаты представлены в 4.7.
4.2. Результаты по кинетике связывания. 4.2.1. 1А11.
Кинетики связывания для конструкций 1 Al 1
4.2.2. 6A3.
Кинетики связывания для конструкций 6АЗ
4.2.3. Выбор различных вариантов 1А11 H3L4 CDRH3 против IL7R при помощи анализа BIAcore(tm).
Анализ вариантов 1 Al 1 H3L4 CDRH3 против IL-7R с использованием Proteon (KD, в нМ)
НВарианты CDRH3, обладающие улучшенной связывающей аффинностью в отношении IL7R Отсутствие
Типичное значение KD для 1А11 H3L4 = 0,116 нМ
4.2.4. Анализ при помощи BIAcore(tm) T100 выбранных вариантов 1А11 H3L4 CDRH3.
В табл. 8 продемонстрованы данные, полученные в результате исследования 4.1.1.1, которые демонстрируют, что все мутации CDRH3, по-видимому, обладают более хорошими аффинностями по сравнению с родительскими молекулами, причем наилучшая конструкция, по-видимому, представляет собой ВРС4398 (Anti-IL7R 1A11 H3L4 N98D).
4.2.5. Анализ при помощи BIAcore(tm) 3000 выбранных вариантов 1А11 H3L4 CDHR3.
В табл. 9 продемонстрированы данные, полученные в результате исследования 4.1.1.2, и показано, что все мутации CDRH3, по-видимому, обладают более хорошими аффиностями по сравнению с родительскими молекулами, причем наилучшая конструкция, по-видимому, представляет собой ВРС4398 (1А11 H3L4 N98D) и ВРС4399 (1А11 H3L4 N98E).
Различия обнаружены в общих аффинностях, рассчитанных по двум способам. Последнее вероятно является следствием того, что IL7R представляет собой гомодимер, и, таким образом, величина авидно-сти и перекрестного связывания антитела с антигеном может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от различных плотностей IL7R, иммобилизованных на различных захватывающих поверхностях, использованных в двух анализах. Несмотря на различные аффинности, обнаруженные между двумя анализами, ранжирование в двух экспериментах демонстрирует, что ВРС4398 (1А11 H3L4 N98D) обладает улучшенной аффинностью по сравнению с родительской молекулой 1А11 H3L4.
4.3. Виды перекрестной реактивности.
Обнаружено, что 1А11 H3L4 (дикий тип) перекрестно реагирует с IL-7R игрунки и яванского макака, тестируемых на сравнимом уровне, при помощи системы Biacore (табл. 10).
Таблица 10
Сравнение 1 Al 1 H3L4 с человеческим IL7R, мышиным IL7R и IL7R яванского макака
Образец
ka (1/мс)
kd (1/с)
KD(M)
1А11 H3L4 с человеческим IL7R
1,77е5
4,64е-4
2,62е-9
1А11 H3L4 с IL7R яванского макака
2,56 е4
2,34е-4
9,06е-9
1А11 H3L4 с IL7R игрунки
4,93е4
2,99е-4
6,05е-9
4.4. Связывание эпитопа в соответствии с рентгеновской кристаллографией.
При использовании 1А11 H3L4 Fab, рентгеновскую кристаллографию вместе с моделированием in silico использовали для предсказания связывающих поверхностей для mAbs для того, чтобы обеспечить механистическое понимание обнаруженной функциональной нейтрализации, и чтобы произвести рациональные выборы созревания антитела. Получена структура с высоким разрешением (2,08 А) комплекса 1A11H3L4 Fab/человеческого рецептора IL7. Внеклеточный домен человеческого рецептора IL7 и 1A11H3L4 экспрессировали в клетках СНО lee и очищали посредством аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Фрагмент Fab 1A11H3L4 получали путем расщепления папаином. Комплекс Fab1A11H3L4/IL7R ECD получали путем смешивания Fab1A11H3L4 с IL7Receptor ECD в соотношении 1:1,2 моль. Белки концентрировали и кристаллизовали с использованием диффузии паров по методу висячей капли. Данные дифракции рентгеновских лучей получали с использованием усовершенствованного источника протонов в Argonne National Laboratory. Данные дифракции индексировали и масштабировали с использованием программного обеспечения HKL2000. Структуру определяли путем молекулярной замены в программе X-PLOR. Исходный раствор для молекулярной замены подвергали множеству циклов оптимизации молекулярной динамики в CNX и обновления при помощи программы WinCoot.
На основе кристаллической структуры высокого разрешения 2.08А предположили, что 1A11H3L4 связывается с рецептором IL7 по 4 из внеклеточных петель IL-7R, таким образом блокируя связывание лиганда IL7:
петля 2: 55Gly 56Ala 57Leu 58Val 59Glu 60Val 61Lys, петля 3: 80Leu 81Leu 82Ile 83Gly 84Lys 100Lys, петля 4: 138Lys 139Tyr 142Val, петля: 192Tyr 193Phe.
Эти результаты согласовывались с выявленной конкуренцией за связывание с ML7, обнаруженной
для 1А11 и 6A3.
4.5. Анализ эффекторных функций.
4.5.1. 1А11 H3L4 лишен опосредованной комплементом цитотоксичности.
В общей сложности шесть отдельных экспериментов демонстрируют, что 1А11 H3L4 (дикий тип) не обладает измеримой опосредованной комплементом цитотоксичности. Эти эксперименты осуществляли с использованием IL-7r BacMam трансдуцированной клеточной линии HEK 293 MSR II в качестве мишени. Эти клетки трансдуцировали (moi 75) в течение приблизительно 21 ч при 37°С, 5% СО2 в куль-туральных колбах Т175. Прикрепившиеся клетки затем удаляли из колб с использованием TrypLE и несколько раз промывали перед высеванием в количестве 1х105 клеток/50 мкл/лунку в 96-луночном план
шете. 25 мкл антитела добавляли в течение 30 мин при 37°С, 5% СО2. После этой инкубации добавляли 20 мкл кроличьего комплемента, и планшет затем возвращали в инкубатор на 2 ч. Оценку клеточной жизнеспособности осуществляли путем добавления 100 мкл CellTiter-Glo в каждую лунку путем мягкого перемешивания с использованием многоканальной пипетки. Планшет затем визуализировали в отношении люминисцентного сигнала с использованием планшетного ридера Victor V (жизнеспособные клетки демонстрировали увеличенный сигнал). Пример одного из этих экспериментов представлен на фиг. 1.
Положительное контрольное антитело (Grits 32092) использовали в вышеприведенном эксперименте в качестве специфического в отношении рецептора клеточной поверхности для HER3, который коэкс-прессировался на той же самой клетки-мишени, на которой экспрессировался hIL-7Ra. Это контрольное антитело использовали в той же концентрации, что 1А11 H3L4 (10 мкг/мл), и комбинировали с теми же двумя источниками кроличьего комплемента (Calbiochem и Invitrogen). Эти результаты демонстрируют, что как клетки-мишени, так и комплемент, которые использовали в анализе, способны вызывать зависимую от комплемента цитотоксичность.
4.5.2. 1А11 H3L4Fc уменьшал антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность
(ADCC).
Очищенные мононуклеарные клетки периферической крови семи человеческих доноров профилировали в качестве эффекторных клеток в анализе ADCC. Эти эксперименты осуществляли с hIL-7r Bac-Mam трансдуцированной клеточной линией HEK 293 MSR II, используемой в качестве клеток-мишеней. Эти клетки трансдуцировали (moi 75) в течение приблизительно 21 ч при 37°С, 5% СО2 в культуральных колбах Т175. Эти прикрепившиеся клетки затем удаляли из колб с использованием Tryple и несколько раз промывали до "загрузки" европием. Эти загруженные клетки комбинировали в 96-луночном планшете (2х104 клеток/25 мкл/лунку), который содержал антитело против IL-7R, в течение 30 мин при 37°С, 5% СО2. После инкубации эффекторные клетки добавляли в отношениях 200, 100, 50 и 25:1 (100 мкл/лунку) и возвращали к 37°С, 5% CO2 на 2 ч. После этой инкубации 25 мкл супернатанта удаляли и добавляли в 96-луноный планшет, содержащий 100 мкл/лунку проявляющего раствора Delfia. Планшет затем инкубировали с использованием планшетного шейкера при комнатной температуре в течение 5 мин и затем считывали в планшетном ридере Victor V. Любое количество европия, высвобожденное клетками при лизисе, в окружающий супернатант (клеточная цитотоксичность) измеряли в единицах флуоресценции.
В этих анализах сравнивается способность 1А11 H3L4 "дикого типа" и Fc-деактивированной молекулы 1А11 H3L4FC связываться с человеческими эффекторными клетками через их Fc-рецепторы, и убивать положительные в отношении рецептора IL-7 клетки-мишени. Общие результаты этих экспериментов демонстрируют, что Fc-деактивированные 1А11 H3L4FC обладают, по меньшей мере, в двое меньшей способностью инициировать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность по сравнению с 1А11 H3L4 "дикого типа". Эти результаты также демонстрирует, что у шести из семи доноров деактивированное антитело способно индуцировать некоторый уровень акивности ADCC (один донор демонстрирует небольшую активность в отношении как дикого типа, так и деактивированных 1А11 H3L4). Эти результаты представлены на фиг. 2.
4.5.3. Связывание Fc-рецептора.
1А11 H3L4 и 1А11 H3L4Fc оценивали в отношении их способности связываться со множеством Fc-эффекторных рецепторов (Fc гамма I, IIa и IIIa), и FcRn множества видов и по сравнению с диким типом в качестве контроля и Fc-деактивированных антител. Анализ осуществляли с использованием аппарата для исследования поверхностного плазмонного резонанса ProteOn XPR36 (BioRad). Тестируемые антитела связывались с биосенсортным чипом GLM путем связывания с первичным амином. Различные Fcy рецепторы использовали в качестве аналитов в концентрации 2048, 512, 128, 32 и 8 нМ с использованием HBS-EP (рН 7,4) в качестве буфера для анализа. Для связывания с рецептором FcRn человеческий, яванского макака, мышиный и крысиный FcRn использовали в качестве аналита в концентрации 2048, 512, 128, 32 и 8 нМ, причем анализ осуществляли при рН 6,0 и 7,4. Все сенсограммы связывания имели двойное референсное значение при инжекции 0 нМ (т.е. только буфер). Данные подгоняли к равновесным моделям, относящимся к программному обеспечению для анализа ProteOn.
В табл. 11 продемонстрированы аффинности, полученные для связывания антитела с различными Fc рецепторами, измеренными в этом исследовании, и продемонстрировано, что 1А11 H3L4 и 1А11 H3L4Fc имели поведение, сравнимое с соответствующими контрольными антителами. Антитела с деак-тивированным Fc (1A11 H3L4Fc) демонстрировали отсутствие связывания или значительно уменьшенное связывание в отношении рецепторов Fcy и, следовательно, точный анализ не мог быть осуществлен. Данные для связывания FcRn демонстрируют, что Fc деактивированные и Fc дикого типа обладают похожими аффинностями для всех тестируемых видов, данные в таблице приведены для анализа при рН 6,0, связывание отсутствовало или было гораздо меньше при рН 7,4, как ожидалось.
4.6. Анализы силы in vitro.
4.6.1. Ингибирование стимулируемого IL-7 фосфорилирования STAT5 1А11 и 1А11 H3L4.
Для скрининга функционального антитела в отношении IL-7Ra культуры клеток гибридомы, антитело в качестве положительного контроля или тестируемые образцы супернатантов инкубировали с клетками РВМС в течение 30 мин, а затем стимулировали IL-7. Необработанные клетки анализировали в качестве фонового сигнала, тогда как клетки, обработанные IL-7, рассматривали в качестве отрицательного контроля. После 30-минутной инкубации с контролями или анализируемыми образцами клетки стимулировали IL-7 в течение 15 мин при 37°С. Клетки затем фиксировали 1,6% параформальдегидом/PBS в течение 10 мин при 37°С и пермеабилизировали в 100% метаноле в течение 20-30 мин. Клетки затем дважды промывали в буфере для окрашивания (1% BSA в PBS) и окрашивали меченым Alexa-647 антителом против pStat5 (BD Biosciences Inc #612599) в течение 1 ч. Образцы анализировали на приборе BD LSR II FACS.
Родительское моноклональное антитело 1А11 блокировало индукцию IL-7 фосфорилирования STAT5 в человеческих РВМС с IC50 0,088 мкг/мл (данные не представлены). 1А11 H3L4 тестировали в том же анализе с использованием РВМС из двух доноров с двумя концентрациями человеческого IL-7 (0,1 и 1 нг/мл). 1А11 H3L4 демонстрирует очень похожую IC50 (среднее=0,087 мкг/мл) по сравнению с 1А11, указывая на то, что способ гуманизации не влиял на способность антитела ингибировать IL-7-индуцированное pSTAT5 (фиг. 3А и 3В).
4.6.2. Ингибирование IL-7-индуцированной продукции IL-17 в 1А11 H3L4.
1А11 H3L4 анализировали в соответствии со следующим протоколом для определения его способности ингибировать рост Th17. CD4+ клетки выделяли в соответствии с руководством пользователя (#130-091-155, Miltenyi). Приблизительно 1х106/мл CD4+ клеток в 100 мкл смешивали с равным объемом 2х концентрации Th17 дифференцирующей среды (2 мкг/мл анти-CD28 + 10 мкг/мл анти-IFN-y + 10 мкг/мл анти-П.-4 + 12,5 нг/мл IL-1P, + 20 нг/мл IL-23 + 50 нг/мл IL-6) и выращивали при 37°С с 5% CO2 в течение 5 суток. Обработка различными цитокинами и факторами роста в среде Th17 предпочтительно дифференцировала CD4+ клетки в клетки Th17. CCR6+ клетки из дифференцированных культивированных клеток на 5 сутки сортировали с использованием BD FACS SORP Aria II. CCR6+ клетки затем доводили до 2х 106/мл для анализа продукции IL-17.
Для измерения уровня IL-17 и IFN-y 100 мкл CCR6+ клеток предварительно инкубировали с тестирующим антителом в течение 1 ч при 37°С и затем смешивали с 100 мкл 10 нг/мл IL-7. Клетки выращивали в течение 24-40 ч при 37°С с дополнением 5% CO2. Уровни IFN-y и IL-17 в 100 мкл культурального супернатанта измеряли при помощи FlowCytomix (Bender MedSystems) через 24 и 40 ч соответственно.
1А11 H3L4 тестировали в анализе роста Th17 в общей сложности в четырех образцах человеческих CD4+ клеток (фиг. 4A-D). Гуманизированное антитело демонстрирует значительное ингибирование продукции IL-17 в двух образцах и обладает тенденцией ингибировать в двух других образцах. Принимая во внимание вариацию от донора к донору в этом анализе, авторы изобретения заключили, что 1А11 H3L4 способны блокировать опосредованный IL-7 рост клеток Th17.
4.6.3. Действия в отношении сигнализации TSLP.
Субъединица IL-7Ra существует как в IL-7R, так и TSLP рецепторном комплексе (TSLPR). Действие 1А11 H3L4 на опосредованную TSLP передачу сигнала тестировали в анализе in vitro на основе TSLP-индукции продукции TARC человеческими моноцитами. Имеющееся в продаже антитело против IL-7Ra R34.34 использовали в качестве положительного контроля для блокирования TSLP-индукции TARC. Кроме того, Fc-деактивированный гуманизированный IgG1 (HuIgG1; GRITS39633) также использовали в качестве отрицательного контроля. Использовали моноциты 5 доноров, причем TSLP использовали в концентрации 1 нг/мл, 1А11 H3L4 и HuIgG1 использовали в дозах 0,001-30 мкг/мл, и R34.34 использовали в концентрации 0,4, 2 и 10 мкг/мл. Жизнеспособность клеток также оценивали путем подсчета клеток.
1А11 H3L4 не влияли на TSLP-индукцию TARC, как продемонстрировано на фиг. 5А-Е, тогда как такие же 5 доноров R34.34 значительно ингибировали продукция TARC. Гуманизированное антитело в качестве отрицательного контроля не оказывало действие на продуцирование TARC. Этот набор данных
демонстрирует, что 1А11 H3L4 не нейтрализует TSLP передачу сигнала в человеческих моноцитах. Таким образом, предполагают, что 1А11 H3L4 является специфическим для нейтрализации опосредованной IL-7 передачи сигнала через IL-7R и не влияет на TSLP передачу сигнала через TSLPR. 4.7. IL7 Анализ ингибирования рецептора.
В табл. 12А продемонстрированы значения IC50, полученные в анализе 1, и показано, что все конструкции имеют более хорошие значения IC50, чем наилучшее значение, полученные для родительской молекулы 1А11 H3L4, и что две самые хорошие молекулы представляли собой ВРС4401 (Anti-IL7R 1А11 H3L4 F100bH) и ВРС4398 (1А11 VH3 N98D L4). В табл. 12В продемонстрированы значения IC50, полученные в анализе 2, и также продемонстрировано, что обе конструкции ВРС4401 (Anti-IL7R 1A11 H3L4 F100bH) и ВРС4398 (1А11 VH3 N98D L4) обладают более хорошими значениями IC50, чем наилучшее значение, полученное для родительской молекулы 1А11 H3L4. Анализы 1 и 2 осуществляли на разделяющих поверхностях IL7R/CM5.
4.8. Анализ связывания полиморфа IL-7R.
IL-7R существует в виде двух полиморфных форм, вариант 1: Thr66-Ile128, вариант 2: Ile66-Thr128. Анализировали связывание 1A11H3L4 с обоими полиморфными формами. Антитело против человеческого IgG (GE Healthcare/BIAcore(tm) BR-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином до уровня приблизительно 9000 резонансных единиц (RU), 1A11H3L4 затем захватывали на этой поверхности, и IL7R пропускали над ней в концентрации 512, 256, 128, 64, 32 и 16 нМ, причем инжекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали для двойного референса кривых связывания, регенерацию этой поверхности осуществляли с использованием 3 М MgCl2. Данные по связыванию подгоняли к модели 1:1, относящейся к программному обеспечению для анализа BIAcore(tm) 3000. Анализ осуществляли с использованием HBS-EP в качестве буфера для анализа и осуществляли при 25°С на BIAcore(tm) 3000.
В табл. 13 приведены полученные данные и продемонстрировано, что 1А11 H3L4 обладает такой же или похожей связывающей аффинностью с обоими полиморфными вариантами (т.е. связывается с обоими полиморфами).
Таблица 13
В настоящем описании изобретение раскрыто со ссылкой на воплощения таким образом, который дает возможность для ясного и краткого изложения. Предполагается и должно быть понятно, что воплощения могут быть различным образом комбинированы или разделены, не выходя за объем изобретения.
Список последовательностей
<110> Glaxo Group Limited
<120> CD127 Binding Proteins
<130> PB64061
<140> 61/299010 <141> 2010-01-28
<150> unknown <151> 2011-01-26
<160> 138
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 455 <212> PRT
<213> Homo Sapiens <220>
<223> human CD127
<400> 1
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gin
15 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gin Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Суз Gin Leu Glu Val Asn Gly
35 40 45
Ser Gin His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr
50 55 60
Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys
65 70 75 SO
Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gin Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys
85 90 95
Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys
100 105 110
Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu
115 120 125
Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe
130 135 140
Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gin Lys Lys Tyr Val Lys Val
145 150 155 160
Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gin Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp
Leu Gin
Ile Leu
Ser Ser 450
Val
Pro
195 Phe
Pro
Ile
Leu
His 275 Asn
Val
Thr Asp
Glu
355 Ser
Arg
Ser
Ser
Thr 435
Phe
165 Asn Leu
180
Ala Ala
Lys Gly Glu Ile
Ser Ile
245 Trp Lys
260
Lys Lys
Val Ser
Asp Asp
Phe Pro 325 Val Gin 340
Ser Phe
Ala Cys
Glu Ser
Leu Gly 405 Gly Ile
420
Ser Leu Tyr Gin
Ser Ser
Met Tyr
Phe Trp 215 Asn Asn 230
Leu Ser
Lys Arg
Thr Leu
Phe Asn 295 Ile Gin 310
Gin Gin
Ser Pro
Gly Arg
Asp Ala 375 Gly Lys 390
Thr Thr Leu Thr
Gly Ser
Asn Gin 455
170
Thr Lys Leu
185 Glu Ile Lys 200
Ser Glu Trp
Ser Ser Gly
Phe Phe Ser 250
Ile Lys Pro
265 Glu His Leu 280
Pro Glu Ser Ala Arg Asp
Leu Glu Glu
330
Asn Cys Pro
345 Asp Ser Ser 360
Pro Ile Leu Asn Gly Pro
Asn Ser Thr
410
Leu Asn Pro 425
Asn Gin Glu 440
Thr Leu Leu
Val Arg Ser 205
Ser Pro Ser
220 Glu Met Asp
235
Val Leu Val
Ile Val Trp
Cys Lys Lys 285
Phe Leu Asp
300 Glu Val Glu 315
Ser Glu Lys
Ser Glu Asp
Leu Thr Cys 365
Ser Ser Ser 380
His Val Tyr
395
Leu Pro Pro
Val Ala Gin
Glu Ala Tyr 445
175
Gin Arg Lys 190
Ile Pro Asp Tyr Tyr Phe
Pro Ile Leu
240
Ile Leu Ala
255 Pro Ser Leu 270
Pro Arg Lys
Cys Gin Ile
Arg Ser Leu
Gin Asp Leu
400
Pro Phe Ser
415
Gly Gin Pro 430
Val Thr Met
<210> 2 <211> 5 <212> PRT
<213> Mus rausculus <220>
<223> 1A11 CDR HI
<400> 2
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 3 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 1А11 CDR Н2
<400> 3
Leu Ile Asn Pro Туг Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys
15 10 15
Gly
<210> 4 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<223> 1A11 CDR H3
<400> 4
Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 5 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 1A11 CDR LI
<400> 5
Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His 15 10
<210> 6 <211> 7
<210> 9 <211> 105 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 1А11 Vk
<400> 9
Glu Не Val Leu Thr Gin Ser Pro
1 5 Gin Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser 20
His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly
35 40 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 65 70 Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gin 85
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100
Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly
10 15 Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 25 30 Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 45
Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
75 80 Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 90 95
Lys 105
<210> 10 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1A11.H0 VH
Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 11 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.HI VH
<400> 11 Gin Val Gin 1
Ser Val Lys
Thr Met Asn
Gly Leu Ile 50
Lys Gly Arg 65
Met Glu Leu
Arg Asp Gly
Val Thr Val 115
Leu Val
Val Ser 20
Trp Val
Asn Pro Val Thr
Ser Arg
Asn Tyr 100
Ser Ser
Tyr Asn
Met Thr 70
Leu Arg Trp Tyr
Ala Ser
25 Ala Pro 40
Gly Val
Val Asp
Ser Asp
Phe Asp 105
Glu Val 10
Gly Tyr
Gly Gin
Thr Ser
Thr Ser
75 Asp Thr
Val Trp
Lys Lys
Thr Phe
Gly Leu
45 Tyr Asn 60
Ile Ser
Ala Val Gly Gin
Pro Gly Ala 15
Thr Gly Tyr 30
Glu Trp Met Gin Lys Phe
Thr Ala Tyr
Tyr Tyr Cys 95
Gly Thr Thr 110
<210> 12 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.H2 VH
<400> 12
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 13 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.H3 VH
<400> 13 Gin Val Gin 1
Ser Val Lys
Thr Met Asn
Gly Leu Ile 50
Lys Gly Arg 65
Met Glu Leu
Arg Asp Gly
Val Thr Val 115
Leu Val
Val Ser 20
Trp Val
Asn Pro
Val Thr
Ser Arg
85 Asn Tyr 100
Ser Ser
Tyr Asn
55 Leu Thr 70
Leu Arg Trp Tyr
Ala Ser
25 Ala Pro
Gly Val
Arg Asp Ser Asp
Phe Asp
105
Glu Val
Gly Tyr Gly Gin Thr Ser
Thr Ser
75 Asp Thr 90
Val Trp
Lys Lys
Thr Phe
Gly Leu 45
Tyr Asn
Ile Ser Ala Val Gly Gin
Pro Gly Ala
Thr Gly Tyr 30
Glu Trp Met Gin Lys Phe
Thr Ala Tyr
Tyr Tyr Cys 95
Gly Thr Thr 110
<210> 14 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1A11.H4 VH
<400> 14
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
<210> 15 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1А11.Н5 VH
<210> 16 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1А11.Нб VH
<21и> 17 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<210> 18 <211> 105
<223> 1А11.Н7 VH
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.LO Vk
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 19 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1A11.LI Vk
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 20
<211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.L2 Vk
<400> 20
Glu Не Val Leu Thr Gin Ser Pro
1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser 20
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
35 40 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 65 70 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15 Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 25 30 Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 45
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
75 80 Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
90 95
Lys 105
<210> 21 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.L3 Vk
<400> 21
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro
1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser 20
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
35 40 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 65 70 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15 Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 25 30 Gin Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr 45
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
75 80 Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 90 95
Lys 105
<210> 22 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.L4 Vk
<210> 23 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1A11.L5 Vk
<210> 24 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1А11.L6 Vk
<400> 24
Glu Не Val Leu Thr Gin Ser Pro
1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser 20
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
35 40 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 65 70 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15 Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
25 30 Gin Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 45
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
75 80 Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
90 95
Lys 105
<210> 25 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.L7 Vk
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro
1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser 20
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly
35 40 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 65 70 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15 Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 25 30 Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 45
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
75 80 Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 90 95
Lys
105
<210> 26 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.L8 Vk
<400> 26
Glu Не Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 27 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1A11.L9 Vk
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lAllc VH
<40O> 28 Glu Val Gin 1
Ser Met Lys
Thr Met Asn 35
Gly Leu Ile 50
Lys Gly Lys 65
Met Glu Leu
Arg Asp Gly
Val Thr Val 115
Leu Gin
Ile Ser 20
Trp Val
Asn Pro
Ala Thr
Leu Ser
85 Asn Tyr 100
Ser Ser
Gin Ser
Cys Lys
Lys Gin
Tyr Asn
55 Leu Thr 70
Leu Thr Trp Tyr
Gly Pro Glu 10
Ala Ser Gly 25
Ser His Gly 40
Gly Val Thr
Val Ala Lys
Ser Glu Asp 90
Phe Asp Val 105
Leu Leu Lys
Tyr Ser Phe
Lys Asn Leu 45
Ser Tyr Asn 60
Ser Ser Ser 75
Ser Ala Val Trp Gly Ala
Pro Gly Ala 15
Thr Gly Tyr
Glu Trp Ile
Gin Lys Phe
Thr Ala Tyr
Tyr Tyr Cys 95
Gly Thr Thr 110
<210> 29 <211> 105 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lAllc Vk
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly
15 10 15
Gin Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gin Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 30 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H1 VH
<400> 30
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag ccagcggcta gactcgagtg tcaagggcag gcaggctgag ggtacttcga cggagccgag caccttcacc gatgggcctg ggtgaccatg gtccgacgac tgtgtggggc gtgaagaaac ggctacacca atcaacccct accgtggata accgccgtgt cagggcacca ccggagccag tgaactgggt acaacggcgt ccagcatcag attactgcgc ccgtcacagt cgtgaaggtg SO gaggcaggcc 12 0 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 31 <211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H2 VH
<400> 31
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag ccagcggcta gactcgagtg tcaagggcaa gcaggctgag ggtacttcga cggagccgag caccttcacc gatgggcctg ggtgaccatg gtccgacgac tgtgtggggc gtgaagaaac ggctacacca atcaacccct accagggata accgccgtgt cagggcacca ccggagccag tgaactgggt acaacggcgt ccagcatcag attactgcgc ccgtcacagt cgtgaaggtg 60 gaggcaggcc 12 0 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 32 <211> 357 <212> DMA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H3 VH
<400> 32
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt
cgtgaaggtg 60 gaggcaggcc 120 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 33 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H4 VH
<400> 33
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccagcggcta caccttcacc ggctacacca gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct tcaagggcaa ggtgaccatg accgtggata gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccggagccag cgtgaaggtg 60
tgaactgggt gaggcaggcc 120
acaacggcgt gaccagctac 180
ccagcatcag caccgcttac 240
attactgcgc caggggcgac 300
ccgtcacagt gagcagc 357
<210> 34 <211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H5 VH
<4QQ> 34
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt tcaagggcaa ggtgaccctg accgtggata ccagcatcag gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt
cgtgaaggtg 60 gaggcaggcc 120 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 35 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H6 VH
<400> 35
caggtgcagc agctgcaagg cccggccagg aaccagaagt atggaactga ggcaactact tggtgcagag ccagcggcta gactcgagtg tcaagggcaa gcaggctgag ggtacttcga cggagccgag caccttcacc gatgggcctg ggtgaccctg gtccgacgac tgtgtggggc gtgaagaaac ggctacacca atcaacccct accgtggata accgccgtgt cagggcacca ccggagccag tgaactgggt acaacggcgt agagcatcag attactgcgc ccgtcacagt cgtgaaggtg 60 gaggcaggcc 120 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 36 <211> 357 <212> DMA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H7 VH
<400> 36
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact tggtgcagag ccagcggcta gactcgagtg tcaagggcaa gcaggctgag ggtacttcga cggagccgag caccttcacc gatgggcctg ggtgaccctg gtccgacgac tgtgtggggc gtgaagaaac ggctacacca atcaacccct accgtggcca accgccgtgt cagggcacca ccggagccag tgaactgggt acaacggcgt agagcatcag attactgcgc ccgtcacagt cgtgaaggtg 60 gaggcaggcc 120 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 37 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding lAllc VH
<400> 37
gaggtgcagc
agctgcaagg
cacggcaaga
aaccagaagt
atggaactgc
ggcaattact tgcagcagag ccagcggcta acctggagtg tcaagggcaa tgagcctgac ggtacttcga cggccccgaa cagcttcacc gatcggcctg ggccaccctc cagcgaggac cgtgtggggc ctgctgaagc ggctacacca atcaacccct acagtggcca agcgccgtgt gccggaacca
ccggcgctag
catgaagatc
tgaactgggt
caagcagtcc
120
acaacggcgt
gacctcctac
180
aaagcagcag
caccgcctac
240
actattgcgc
caggggcgac
300
ccgtgaccgt
gtctagc
357
<210> 38 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide encoding lAllc Vk
<400> 38
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 6A3 CDR LI
<400> 42
Leu Ala Ser Gin Thr Ile Gly
1 5
<210> 43 <211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<22 3> 6A3 CDR L2
<400> 43
Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp 1 5
<210> 44 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> SA3 CDR L3
<400> 44
Gin Gin Phe Phe Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 45 <211> 117 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<22 3> 6A3 VH
<400> 45
Asp Val 1
Ser Leu
Tyr Ala
Met Gly
50 Lys Ser 65
Leu Gin
Arg Gly Leu Thr
Gin Leu
Ser Leu
20 Trp Asn
Tyr Ile
Arg Ile
Leu Asn
Tyr Asp 100 Val Ser 115
Gin Glu 5
Thr Cys Trp Ile
Phe Tyr
Ser Ile
70 Ser Val 85
Val Asn Ser
Ser Gly Thr Val
Arg Gin
40 Ser Gly 55
Thr Arg Thr Thr
Tyr Phe
Pro Gly 10
Thr Gly
Phe Pro
Ser Thr
Asp Thr
Glu Asp
90 Asp Tyr 105
Leu Val Lys Tyr Ser Ile
Gly Asn Lys
Thr Tyr Thr
Ser Lys Asn 75
Thr Ala Thr
Trp Gly Gin
Pro Ser Gin 15
Thr Thr Asp
Leu Glu Trp
Pro Ser Leu
Gin Phe Phe
Tyr Tyr Cys 95
Gly Thr Thr 110
<210> 46 <211> 107 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 6A3 Vk
<400> 46
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Gin Ser Ala Ser Leu Gly
15 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gin Thr Ile Gly Ala Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Phe Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 47 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV4 61.HO VH
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV4 61.H2 VH
<400> 49 Gin Val Gin 1
Thr Leu Ser
Tyr Ala Trp 35
Ile Gly Tyr 50
Lys Ser Arg 65
Leu Lys Leu
Arg Gly Tyr
Leu Gin Glu 5
Leu Thr Cys 20
Asn Trp Ile Ile Phe Tyr
Val Thr Ile
Ser Ser Val
Asp Val Asn 100
Ser Ser
Ser Gly
Thr Val
Arg Gin
40 Ser Gly 55
Ser Val Thr Ala
Tyr Phe
Pro Gly 10
Ser Gly
Pro Pro Ser Thr Asp Thr
Ala Asp
90 Asp Tyr 105
Thr Tyr
60 Ser Lys 75
Thr Ala
Trp Gly
Val Ser 30
Gly Leu 45
Thr Pro
Asn Gin
Val Tyr
Gin Gly 110
<210> 50 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.IGHV4 61.H3 VH
<400> 50 Gin Val Gin 1
Thr Leu Ser
Tyr Ala Trp 35
Ile Gly Tyr 50
Lys Ser Arg 65
Leu Lys Leu
Arg Gly Tyr Val Thr Val
Leu Gin Glu 5
Leu Thr Cys
Asn Trp Ile Ile Phe Tyr
Val Thr Ile
Ser Ser Val
Asp Val Asn 100
Ser Ser
Ser Gly
Thr Val
Arg Gin
40 Ser Gly 55
Ser Val Thr Ala
Tyr Phe
Pro Gly 10
Ser Gly
Pro Pro Ser Thr Asp Thr
Ala Asp
90 Asp Tyr 105
Thr Tyr
60 Ser Lys 75
Thr Ala
Trp Gly
Val Thr
Gly Leu 45
Thr Pro
Asn Gin
Val Tyr
Gin Gly 110
<210> 51 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV4 61.Н4 VH
<400> 51 Gin Val Gin 1
Thr Leu Ser
Tyr Ala Trp
Ile Gly Tyr
Lys Ser Arg
Leu Lys Leu
Arg Gly Tyr
Val Thr Val 115
Leu Gin
Leu Thr
Asn Trp
Ile Phe
Ile Thr
Ser Ser
85 Asp Val 100
Ser Ser
Glu Ser Gly
Cys Thr Val
Ile Arg Gin 40
Tyr Ser Gly 55
Ile Ser Val
Val Thr Ala Asn Tyr Phe
Pro Gly
10 Ser Gly 25
Pro Pro
Ser Thr Asp Thr
Ala Asp
90 Asp Tyr
105
Leu Val Lys
Gly Ser Val
Gly Lys Gly 45
Thr Tyr Thr 60
Ser Lys Asn 75
Thr Ala Val Trp Gly Gin
Pro Ser Glu 15
Ser Thr Asp
Leu Glu Trp
Pro Ser Leu
Gin Phe Ser 80
Tyr Tyr Cys 95
Gly Thr Thr 110
<210> 52 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.IGHV4 61.H5 VH
<400> 52
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 85
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe 100
Val Thr Val Ser Ser
115
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
105 110
<210> 53 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 53
Gin Val Gin Leu Gin Glu 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr Cys
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile
Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr
Lys Ser Arg Val Thr Ile 65 70 Leu Lys Leu Ser Ser Val 85
Arg Gly Tyr Asp Val Asn 100
Val Thr Val Ser Ser 115
<223> 6A3.IGHV4 61.H6 VH
<210> 54 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV4 61.H7 VH
<400> 54
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Val Thr Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 55 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV4 61.H8 VH
<400> 55 Gin Val Gin 1
Thr Leu Ser
Tyr Ala Trp 35
Ile Gly Tyr 50
Lys Ser Arg
Leu Lys Leu
Arg Gly Tyr
Val Thr Val 115
Leu Gin
Leu Thr
Asn Trp
He Phe
Ile Thr
Ser Ser
85 Asp Val 100
Ser Ser
Tyr Ser
55 Ile Ser 70
Val Thr
Asn Tyr
Val Ser
25 Gin Pro 40
Gly Ser
Arg Asp
Ala Ala
Phe Asp 105
Gly Leu 10
Gly Tyr
Pro Gly
Thr Thr
Thr Ser
75 Asp Thr
Tyr Trp
Val Lys
Ser Val
Lys Gly
45 Tyr Thr 60
Lys Asn
Ala Val Gly Gin
Pro Ser
15 Thr Thr
Leu Glu
Pro Ser
Gin Phe
Tyr Tyr
95 Gly Thr 110
Glu Asp Trp
Leu
Ser
80 Cys
Thr
<210> 56 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV4 61.H9 VH
<400> 56
<210> 57 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H0 VH
<210> 58 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6АЗ.IGHV3-33.H1 VH
<400> 58
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Азп Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 59 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H2 VH
<400> 59
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 60 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<22 3> 6АЗ.IGHV3-33.НЗ VH
<400> 60 Gin Val Gin 1
Ser Leu Arg
Tyr Ala Trp
Val Ala Tyr 50
Lys Ser Arg 65
Leu Gin Met
Arg Gly Tyr
Val Thr Val 115
Leu Val Glu Ser 5
Leu Ser Cys Ala
Asn Trp Val Arg
Ile Phe Tyr Ser
Phe Thr Ile Ser 70
Asn Ser Leu Arg 85
Asp Val Asn Tyr 100
Ser Ser
Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
10 15 Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Asp
25 30 Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 40 45 Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 60
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95 Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 105 110
<210> 61 <211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<22 3> 6A3.IGHV3-33.H4 VH
<400> 61
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 62 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H5 VH
<400> 62
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 63 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H6 VH
<400> 63
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 64 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H7 VH
<400> 64 Gin Val Gin
Ser Leu Arg
Arg Gly Tyr
Val Thr Val 115
Leu Val
Leu Ser 20
Asn Trp
Ile Phe
Phe Thr
Asn Ser
85 Asp Val 100
Ser Ser
Tyr Ser
55 Ile Ser 70
Leu Arg Asn Tyr
Ala Ser
25 Gin Ala 40
Gly Ser
Arg Asp
Ala Glu
Phe Asp 105
Gly Val 10
Gly Phe
Pro Gly
Thr Thr
Asn Ser
75 Asp Thr 90
Tyr Trp
Val Gin
Thr Phe
Lys Gly
45 Tyr Thr 60
Lys Asn Ala Val Gly Gin
Pro Gly Arg 15
Ser Thr Asp
Leu Glu Trp
Pro Ser Leu
Thr Phe Tyr
Tyr Tyr Cys
Gly Thr Thr 110
<210> 65 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H8 VH
<400> 65
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 66 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H9 VH
<400> 66
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser
1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser
50 55 Lys Ser Arg Phe Ser Ile Ser 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr 100
Val Thr Val Ser Ser 115
Gly Gly Gly Val Val Gin 10
Ala Ser Gly Phe Thr Phe 25
Gin Ala Pro Gly Lys Gly 40 45
Gly Ser Thr Thr Tyr Thr 60
Arg Asp Asn Ser Lys Asn 75
Ala Glu Asp Thr Ala Val
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 105
Pro Gly Arg 15
Ser Thr Asp 30
Leu Glu Trp
Pro Ser Leu
Thr Leu Tyr
Tyr Tyr Cys
Gly Thr Thr 110
<210> 67 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H10 VH
<400> 67
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro
15 10 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 68 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6A3.IGHV3-33.H11 VH
<400> 68
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro
15 10 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Met Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90
Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 69 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.LO Vk
<210> 70 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<210> 71 <211> 107
<223> 6A3.L1 Vk
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 6A3.L2 Vk
<210> 72 <211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<210> 73
<223> 6A3.L3 Vk
<210> 74 <211> 107 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 6A3c Vk
<400> 74
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro
1 5 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
35 40 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp
50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser 65 70 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100
Ala Ser Gin Ser Ala Ser Leu Gly
10 15 Ala Ser Gin Thr Ile Gly Ala Trp
25 30 Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Ile 45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gin Ala
75 80 Gin Gin Phe Phe Ser Thr Pro Trp
90 95 Glu Ile Lys 105
<210> 75
<211> 357
<212> DWA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6АЗ.IGHV4_61.НО
<400> 75
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcgg agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgagc gtggatcggc ggtgaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcgtcgaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 2 40 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 76 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.HI VH
<400> 76
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcgg agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgagc gtggatcggc ggtgaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 240 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 77 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4 61.H2 VH
<400> 77
caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcta ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120
cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180
acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 24 0
ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300
tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357
<210> 78 <211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H3
<400> 78
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcgg agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgacc gtggatcggc ggtgaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcgtcgaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg SO gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 24 0 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 79 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_S1.H4 VH
<400> 79
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcgg agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgagc gtggatcggc gatcaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcgtcgaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 240 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 80 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H5 VH
<400> 80
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcgg agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgagc gtggatgggc ggtgaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcgtcgaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 240 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 81
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H6
<400> 81
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcta agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgagc gtggatcggc ggtgaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 240 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 82 <211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H7 VH
<400> 82
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcta agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgacc gtggatcggc ggtgaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 240 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 83 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4 61.H8 VH
<400> 83
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga
tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 tgagcggcgg ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357
<210> 84 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H9 VH
<400> 84
caggtgcagc
acctgcacag
cctcccggca
acccccagcc
ctgaagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgagcggcta agggcctgga tcaagtccag gcagcgtgac actacttcga cggacccggc ctccgtgacc gtggatcggc gatcaccatc cgccgccgat ctactggggc ctggtgaaac accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacca ccagcgagac cttggaactg acagcggcag ccagcaagaa actactgcgc cctatactgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctac 180 ccagttcagc 240 caggggaggc 300 gagcagc 357
<210> 85 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.HO VH
<400> 85
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga tggtggagag ccagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc caccttcagc gtgggtcgcc gttcaccatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 120 caccacctac 180 caccctgtac 240 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 86 <211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.HI VH
<400> 86
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 ccagcggata caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 87 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H2 VH
<400> 87
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 ccagcggatt caccttcacc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 2 40 acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 88 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H3 VH
<400> 88
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag ccagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc cagcttcagc gtgggtcgcc gttcaccatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 120 caccacctac 180 caccctgtac 240 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 89 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H4 VH
<400> 89
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 ccagcggatt caccatcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 2 40 acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 90 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H5 VH
<400> 90
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag ccagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc caccttcagc gtgggtcgcc gatcaccatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 120 caccacctac 180 caccctgtac 240 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 91 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H6 VH
<400> 91
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180
acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca ccagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 92 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H7 VH
<400> 92
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag ccagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc caccttcagc gtgggtcgcc gttcaccatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 12 0 caccacctac 180 caccttctac 240 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 93 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial
Sequence
<22 0>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33. VH
<400> 93
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga
tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 agggcctgga gtgggtcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 94 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H9 VH
<400> 94
caggtgcagc tcttgcgccg gcccccggga acccccagcc ctgcagatga tacgacgtga tggtggagag ccagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc caccttcagc gtgggtcgcc gttcagcatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 12 0 caccacctac 180 caccctgtac 240 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 95 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H10 VH
<400> 95
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga tggtggagag tgagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc caccttcagc gtgggtcgcc gttcaccatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 12 0 caccacctac 180 caccctgtac 24 0 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 96 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3 33.HI 1 VH
<400> 96
caggtgcagc
tcttgcgccg
gcccccggga
acccccagcc
ctgcagatga
tacgacgtga tggtggagag ccagcggatt agggcctgga tgaagagcag acagcctgag actacttcga cggcggcggc caccttcagc gtggatggcc gttcaccatc ggccgaggac ctactggggc gtggtgcagc accgactacg tacatcttct agcagggaca accgccgtgt cagggcacaa ccggcaggag cctggaattg acagcggcag acagcaagaa
attactgcgc ccgtgaccgt cctgaggctc 60 ggtgaggcag 12 0 caccacctac 180 caccctgtac 240 tagggggggc 300 gagcagc 357
<210> 97 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.LO Vk
tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60
tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 12 0
ccaaactgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180
gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cotgcagcco 24 0
ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300
tggagatcaa g 321
<210> 98 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L1 Vk
<400> 98
gacatccaga tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60
atcacctgcc tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 12 0
ggcaaggccc cccagctgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180
aggtttagcg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 24 0
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300
ggcacaaagg tggagatcaa g 321
<210> 99 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L2 Vk
<400> 99
gacatccaga tgacccagag atcacctgcc tggccagcca ggcaaggccc ccaaactgct aggtttagcg gcagcggaag gaggacttcg ccacctacta ggcacaaagg tggagatcaa
ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 12 0 gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180 cggcaccaag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 24 0 ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300 g 321
<210> 100 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L3 Vk
<400> 100
gacatccaga
atcacctgcc
ggcaaggccc
aggtttagcg
gaggacttcg
ggcacaaagg
tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120 cccagctgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180 gcagcggaag cggcaccaag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300 tggagatcaa g 321
<210> 101 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3c VH
<400> 101
gacgtccagc
acctgcaccg
ttccccggca
acccccagcc
ctgcagctga
tacgacgtga tgcaggagag tgaccggcta acaagctgga tcaagagcag acagcgtgac actacttcga cggccccggg cagcatcacc gtggatgggc
gatcagcatc cacagaggac ctactggggc ctggtgaagc accgactacg tacatcttct accagggaca accgccacct cagggcacca cctctcagag cctggaactg acagcggcag cctccaagaa actactgcgc ctctgaccgt cctgagcctg 60 gatcaggcag 120 caccacctat 180 ccagttcttc 240
caggggcgga 300 gagcagc 357
<210> 102 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence encoding 6A3c Vk
<400> 102
gacatccaga
atcacctgcc
ggcaagagcc
aggtttagcg
gaggacttcg
ggaaccaaac
tgacccagag ccccgccagc cagagcgcct tggccagcca gaccattggc gcttggctgg cccagctgct gatctacgcc gccactaggc gcagcggcag cggcaccaag ttcagcttca tgtcctacta ctgccagcag ttcttcagca tcgagatcaa g ctctgggcga gagcgtgaca 60 cctggtacca gcagaagccc 120 tggccgacgg cgtgcccagc 180 agatcagcag cctgcaggcc 240 ccccctggac cttcggcggc 300 321
<210> 103 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.H0
<400> 103
caggtgcagc
agctgcaaag
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
gggaactact tggtgcagag cctccggcta gcctggagtg tcaagggcag gcaggctgag ggtacttcga cggagccgag caccttcacc gatgggcctg ggtgaccatg gagcgacgac cgtatggggc gtgaagaagc ggctacacca atcaacccct accagggaca accgccgtgt cagggaacaa ccggagccag tgaactgggt acaacggcgt ccagcatcag attactgcgc ccgtgaccgt cgtgaaggtg 60 caggcaggct 120 gaccagctac 180 caccgcctac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 104 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L0
<400> 104
gagatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga gagggccacc 60 ctgagctgca gcgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaaacccggc 120 caggcccctc gcctgctgat ctacgagatc tctaagctgg ccagcggcat tcccgctagg 180 ttcagcggca gcggctcagg caccgacttc accctcacca tcagcagcct ggagcccgaa 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct ataccttcgg cggcgggacc 300 aaggtggaga tcaag 315
<210> 105 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L1
<400> 105
gagatcgtgc tgactcagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga aagggccaca 60 ctgagctgca gcgctagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccta ggctgtggat ctacgagatc agcaagctgg ccagcggcat tcccgccagg 180 ttctcaggca gcggaagcgg caccgacttc accctcacca tcagctctct ggagcccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct ataccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315
<210> 106 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L2
<400> 106
gagatcgtgc tgacccagag ccccgcaacc ctgagcctca gccctggcga gagggccact 60 ctgagctgct ctgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccgga 120 caggccccca ggctgctgat ctacgagatc agcaagctgg cctctggcat tcccgccagg 180 ttcagcggct caggcagcgg caccgactac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactatccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315
<210> 107 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L3
<400> 107
gagatcgtgc tgacccagag ccccgccaca ctgtcactgt ctcccggcga aagggccacc 60 ctgagctgca gcgcctctag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggctccca ggctgtggat ctacgagatc agcaagctgg ccagcggcat ccctgccagg 180 ttcagcggca gcggcagcgg caccgactat accctgacca tcagcagcct cgagcccgag 2 40 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcgggacc 300 aaagtggaga tcaag 315
<210> 108 <211> 315 <212> DMA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L4
<400> 108
gaaattgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctgt caccaggcga gagggcaact 60 ctgagctgca gcgccagctc tagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaaacccgga 120 caggcccccc ggcccctgat ctacgagatc tccaagctgg ccagcggcat ccccgccagg 180 tttagcggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct cgagcccgag 2 40 gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315
<210> 109 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L5
<400> 109
gaaatcgtgc tgacccagag ccccgcaacc ctgagcctga gccccggaga gagggccact 60
ctgagctgca gcgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 12 0
caggccccaa ggccctggat ctacgagatt agcaagctgg cctccggcat ccctgccagg 180
ttcagcggct caggcagcgg caccgactat accctcacca tcagcagcct ggagcccgag 240
gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300
aaggtggaga tcaag 315
<210> 110 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L6
<400> 110
gagatcgtgc tgacccagtc acccgcaaca ctgagcctga ctgagctgca gcgcctctag ctccgtgacc tacatgcact caggccccca gaccctggat ctacgagatc agcaagctcg ttcagcggaa gcggcagcgg gaccgactac accctgacca gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct aaggtggaga tcaag
gcccaggaga gagggccacc 60 ggtaccagca gaagcccggc 120 ccagcggcgt ccccgccagg 180 tcagcagcct ggaacccgag 240 acaccttcgg cggcggcacc 300 315
<210> 111 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L7
<400> 111
gaaattgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctgt caccaggcga gagggcaact 60 ctgagctgca gcgccagctc tagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaaacccgga 12 0 caggccccca agccctggat ctacgagatc tccaagctgg ccagcggcgt gcccgccagg 180 tttagcggca gcggcagcgg caccgactac accctgacca tcagcagcct cgagcccgag 240 gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315
<210> 112 <211> 315 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L8
<400> 112
gaaatcgtgc tgacccagag ccccgcaacc ctgagcctga gccccggaga gagggccact 60
ctgagctgca gcgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 12 0
caggccccaa agccctggat ctacgagatt agcaagctgg cctccggcgt ccctgccagg 180
ttcagcggct caggcagcgg cacctcctat accctcacca tcagcagcct ggagcccgag 24 0
gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300
aaggtggaga tcaag 315
<210> 113 <211> 315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<22 0>
<223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L9
<400> 113
gagatcgtgc tgacccagtc acccgcaaca ctgagcctga gcccaggaga gagggccacc 60
ctgagctgca gcgcctctag ctccgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 12 0
caggccccca agccctggat ctacgagatc agcaagctcg ccagcggcgt ccccgtcagg 180
ttcagcggaa gcggcagcgg gaccagctac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 24 0
gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300
aaggtggaga tcaag 315
<210> 114 <211> 441 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.H3FL (Full length)
<400> 114
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Phe Ser Lys Ser
Val Ser 115
Ser Ser
Lys Asp
Leu Thr
Ser Leu 180 Thr Tyr
195
Lys Lys
Cys Pro
Pro Lys
Cys Val 260 Trp Tyr 275
Glu Glu Gin Asp Ala Leu
Pro Arg
340 Thr Lys 355
Ser Asp
Tyr Lys
Lys Leu
Cys Ser 420 Leu Ser 435
Ser Ala
Lys Ser
Tyr Phe 150 Ser Gly
165
Ser Ser Ile Cys Val Glu
Ala Pro
230 Pro Lys 245
Val Val Val Asp
Gin Tyr
Trp Leu 310 Pro Ala 325
Glu Pro
Asn Gin Ile Ala
Thr Thr
390 Thr Val 405
Val Met Leu Ser
Ser Thr Lys 120
Thr Ser Gly
135
Pro Glu Pro
Val His Thr
Val Val Thr 185
Asn Val Asn
200 Pro Lys Ser
215
Glu Leu Leu Asp Thr Leu
Asp Val Ser
265
Gly Val Glu
280
Asn Ser Tyr
295
Asn Gly Lys Pro Ile Glu
Gin Val Tyr
345
Val Ser Leu
360
Val Glu Trp 375
Pro Pro Val
Asp Lys Ser
His Glu Ala 425
Pro Gly Lys 440
Gly Pro Ser
Gly Thr Ala
140
Val Thr Val
155 Phe Pro Ala 170
Val Pro Ser
His Lys Pro
Cys Asp Lys 220
Gly Gly Pro
235 Met Ile Ser 250
His Glu Asp
Val His Asn
Val Val Ser
300
Glu Tyr Lys 315
Lys Thr Ile 330
Thr Leu Pro
Thr Cys Leu
Glu Ser Asn 380
Leu Asp Ser
395 Arg Trp Gin 410
Leu His Asn
Val Phe 125
Ala Leu Ser Trp
Val Leu
Ser Ser 190 Ser Asn 205
Thr His Ser Val Arg Thr
Pro Glu
270 Ala Lys 285
Val Leu
Cys Lys
Ser Lys
Pro Ser 350 Val Lys 365
Gly Gin
Asp Gly Gin Gly
His Tyr
430
<210> 115 <211> 212 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11.L4FL (Full length)
<400> 115 Glu Не Val
Glu Arg Ala
His Trp Tyr
Glu Ile Ser 50
Gly Ser Gly 65
Asp Phe Ala
Gly Gly Gly
Val Phe Ile 115
Ser Val Val 130
Gin Trp Lys 145
Val Thr Glu
Leu Thr Leu
Glu Val Thr 195
Arg Gly Glu
210
Leu Thr
Thr Leu
Gin Gin
Lys Leu Thr Asp
Val Tyr
85 Thr Lys 100
Phe Pro
Cys Leu
Val Asp
Gin Asp 165 Ser Lys 180
His Gin
Cys
Ala Ser
55 Phe Thr 70
Tyr Cys Val Glu
Pro Ser
Leu Asn 135 Asn Ala 150
Ser Lys Ala Asp Gly Leu
Ser Ala
25 Gly Gin 40
Gly Ile
Leu Thr
Gin Glu
Ile Lys 105 Asp Glu 120
Asn Phe Leu Gin
Asp Ser
Tyr Glu 185 Ser Ser 200
Thr Leu 10
Ser Ser Ala Pro
Pro Ala
Ile Ser
75 Trp Asn 90
Arg Thr
Gin Leu
Tyr Pro
Ser Gly 155 Thr Tyr 170
Lys His Pro Val
Ser Leu
Ser Val
Arg Pro 45
Arg Phe 60
Ser Leu
Tyr Pro
Val Ala
Lys Ser 125 Arg Glu 140
Asn Ser Ser Leu Lys Val
Thr Lys
205
Ser Pro Gly 15
Thr Tyr Met
Leu Ile Tyr
Ser Gly Ser
Glu Pro Glu 80
Tyr Thr Phe
Ala Pro Ser 110
Gly Thr Ala
Ala Lys Val
Gin Glu Ser 160
Ser Ser Thr
175 Tyr Ala Cys 190
Ser Phe Asn
<210> 116 <211> 117 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<223> Human immunoglobulin heavy chain IGHV1-2 V gene (leader plus V region) sequence
<400> 116
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
15 10 15
Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg 115
<210> 117 <211> 113 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<223> Human immunoglobulin kappa light chain IGKV3-11 V gene (leader plus V region)sequence
<400> 117
Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
85 90 95
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp
100 105 110
Pro
<210> 118 <211> 441 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11 H3-Fc (FULL LENGTH)
<400> 118
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 119 <211> 1407 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11_VH3-Fc DNA (FULL LENGTH, WITH SIGNAL SEQUENCE)
<400> 119
atgggctggt
gtgcagctgg
tgcaaggcca
ggccagggac
cagaagttca
gaactgagca
aactactggt
accaagggcc
gccgccctgg
agcggagccc
tacagcctga
tgtaacgtga
tgtgacaaga
gtgttcctgt
acctgtgtgg
gacggcgtgg
taccgggtgg
aagtgtaagg
aagggccagc
aagaaccagg
gagtgggaga
agcgatggca
ggcaacgtgt
agcctgagcc
cctgcatcat tgcagagcgg gcggctacac tcgagtggat agggcagggt ggctgaggtc acttcgatgt ccagcgtgtt gctgcctggt tgaccagcgg gcagcgtggt accacaagcc cccacacctg tcccccccaa tggtggatgt aggtgcacaa tgtccgtgct tgtccaacaa ccagagagcc tgtccctgac gcaacggcca gcttcttcct tcagctgctc tgtcccctgg cctgtttctg agccgaggtg cttcaccggc gggcctgatc gaccctgacc cgacgacacc gtggggccag ccccctggcg gaaggactac cgtgcacacc gaccgtgccc cagcaacacc ccccccctgc gcctaaggac gagccacgag tgccaagacc gaccgtgctg ggccctgcct ccaggtgtac ctgcctggtg gcccgagaac gtacagcaag cgtgatgcac caagtga gtggccaccg aagaaacccg tacaccatga aacccctaca agggatacca gccgtgtatt ggcaccaccg cccagcagca ttccccgagc ttcccagctg agcagcagcc aaggtggaca cctgcccccg accctgatga gaccctgagg aagcccaggg caccaggatt gcccctatcg accctgcccc aagggcttct aactacaaga ctgaccgtgg gaggccctgc ccaccggtgt gagccagcgt actgggtgag acggcgtgac gcatcagcac actgcgccag tcacagtgag agagcaccag cagtgaccgt tcctgcagag tgggcaccca agaaggtgga agctggccgg tcagcagaac tgaagttcaa aggagcagta ggctgaacgg agaaaaccat ctagcagaga accccagcga ccaccccccc acaagagcag acaatcacta gcacagccag gaaggtgagc gcaggccccc cagctacaac cgcttacatg gggcgacggc cagcgccagc cggcggcaca gtcctggaac cagcggcctg gacctacatc gcccaagagc agcccccagc ccccgaggtg ctggtacgtg caacagcacc caaggagtac cagcaaggcc tgagctgacc catcgccgtg tgtgctggac atggcagcag cacccagaag
<210> 120 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding 1A11 VH3 N98D
<400> 120
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcgactact tggtgcagag ccagcggcta gactcgagtg tcaagggcag gcaggctgag ggtacttcga cggagccgag caccttcacc gatgggcctg ggtgaccctg gtccgacgac tgtgtggggc gtgaagaaac ggctacacca atcaacccct accagggata accgccgtgt cagggcacca ccggagccag tgaactgggt acaacggcgt ccagcatcag attactgcgc ccgtcacagt cgtgaaggtg 60 gaggcaggcc 120 gaccagctac 180 caccgcttac 240 caggggcgac 300 gagcagc 357
<210> 121 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A11 VH3 N98D
<400> 121
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 122 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding 1A11 VH3 N98E
<400> 122
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 12 0 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300
ggcgagtact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc
357
<210> 123 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 1A11 VH3 N98E
<400> 123
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Glu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 124 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding 1A11 VH3 FIOObE
<40Q> 124
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 12 0 gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 24 0 gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggtacgagga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357
<210> 125 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 10 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr His Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 128 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding VH3 FlOObI
<400> 128
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggtacatcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357
<210> 129 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> VH3 FlOObI
<400> 129
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 130 <211> 357 <212> DMA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding VH3 FlOObV
<400> 130
caggtgcagc
agctgcaagg
cccggccagg
aaccagaagt
atggaactga
ggcaactact
tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggtacgtgga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357
<210> 131 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH3 FlOObV
<400> 131
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Val Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 132 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH3 M98D CDRH3
<400> 132
Gly Asp Gly Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 133 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH3 N98E CDRH3
<400> 133
Gly Asp Gly Glu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 15 10
<210> 134 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH3 FIOObE CDRH3
<400> 134
Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Glu Asp Val 15 10
<210> 135 <211> 10 <212> PRT
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело против CD127, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательно-
стью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 и
131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:
(1) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5,
(2) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6,
(3) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7.
2. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:13 (1А11.И3 VH).
3. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь, как указано в SEQ ID NO:114 или SEQ ID NO:118.
4. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:121
или SEQ ID NO:123.
5. Антитело по любому из пп.1-4, содержащее вариабельную область легкой цепи, как указано в
SEQ ID NO:22.
6. Антитело по любому из пп.1-5, содержащее легкую цепь, как указано в SEQ ID NO:115.
7. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:13, и вариабельную область легкой цепи, как указано в SEQ ID NO:22.
8. Антигенсвязывающий белок, содержащий следующие гипервариабельные участки:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID NO:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID NO:3,
(3) CDRH3, как указано в SEQ ID NO:4, 132, 133, 134, 135, 136 или 137,
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7,
где указанный антигенсвязывающий белок способен связываться с CD127.
9. Антигенсвязывающий белок по п.8, содержащий следующие гипервариабельные участки:
(1) CDRH1, как указано в SEQ ID NO:2,
(2) CDRH2, как указано в SEQ ID NO:3,
(3) CDRH3, как указано в любой из SEQ ID NO:132, 133, 134, 135, 136 или 137,
(4) CDRL1, как указано в SEQ ID NO:5,
(5) CDRL2, как указано в SEQ ID NO:6,
(6) CDRL3, как указано в SEQ ID NO:7.
10. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний или расстройств, в которые вовлечены патогенетические аутореактивные Т-клетки, содержащая антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий белок по п.8 или 9 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
11. Применение антитела по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающего белка по п.8 или 9 в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием.
10.
10.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023700
023700
- 1 -
- 1 -
023700
023700
- 1 -
- 1 -
023700
023700
- 1 -
- 1 -
023700
023700
- 1 -
- 1 -
023700
023700
- 4 -
- 3 -
023700
023700
- 11 -
023700
023700
- 14 -
- 14 -
023700
023700
- 28 -
023700
023700
- 31 -
- 31 -
023700
023700
- 44 -
- 44 -
023700
023700
- 45 -
- 45 -
023700
023700
- 56 -
- 56 -
023700
115
023700
- 59 -
- 60 -
023700
023700
- 62 -
- 62 -
100
023700
023700
- 69 -
- 68 -
023700
023700
- 71 -
- 71 -
023700
023700
- 75 -
- 75 -
023700
023700
- 76 -
- 76 -
115
023700
023700
- 79 -
- 78 -
115
023700
023700
- 79 -
- 78 -
115
023700
023700
- 79 -
- 80 -
115
023700
023700
- 79 -
- 80 -
023700
023700
- 81 -
- 81 -
023700
023700
- 88 -
- 88 -
023700
023700
- 89 -
- 89 -
023700
023700
- 91 -
- 91 -
023700
023700
- 91 -
- 91 -
<220>
023700
023700
- 95 -
- 94 -
023700
023700
- 97 -
- 97 -
023700
023700
- 98 -
- 98 -
023700
023700
- 98 -
- 98 -
023700
023700
- 98 -
- 98 -
023700
023700
- 106 -
- 106 -
023700
023700
- 107 -
- 107 -
023700
023700
- 118 -
- 118 -
023700
023700
- 119 -
- 119 -
|
