[RU]

1. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, который включает в себя гемоглобин, состоящий из неполимерного, перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, включающий: a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму; b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих; c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с целью получения отфильтрованной фракции эритроцитов; d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с целью удаления примесей белка из плазмы, с целью получения промытых эритроцитов; e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение 2-30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч; f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата с получением первого раствора гемоглобина; g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина; h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка; i) проведение второго процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих молекулярную массу меньше, чем у гемоглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина; j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, α- α субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином; k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока; m) термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, где термообработку проводят согласно процессу "высокая температура - короткое время" при температуре от 70 до 95°С в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением; n) добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% немедленно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина или добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% до термообработки перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с последующим немедленным охлаждением термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина; о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью создания чистого раствора и р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.

2. Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.

3. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором колоночная хроматография проводится с использованием одной или нескольких катионообменных колонок или анионообменных колонок.

4. Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.3, в котором хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько DEAE колонок, СМ колонок и/или гидроксиапатитовых колонок.

5. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором фармацевтически приемлемым носителем является физиологический буфер или вода.

6. Высокоочищенная фармацевтическая композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.1.

7. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, включающей в себя гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, способ содержит: a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму; b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих; c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с получением отфильтрованной фракции эритроцитов; d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с удалением примесей белка из плазмы для получения промытых эритроцитов; e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение 2-30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч; f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата и получение первого раствора гемоглобина; g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с получением второго раствора гемоглобина; h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка; i) проведение второго процесса ультрафильтрации при использовании фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем у гемоглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина; j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, α- α субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином; k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока;m) термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина при температуре примерно от 90 до 95°С с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, термообработку проводят в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением до температуры примерно 25°С; n) добавление N-ацетилцистеина в количестве от 0,2 до 0,4% немедленно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина или добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% до термообработки перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с последующим немедленным охлаждением термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина; о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью создания чистого раствора и р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.

8. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором термообработка проводится в дезоксигенированной среде.

9. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.

10. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором колоночную хроматографию проводят с одной или несколькими катионообменными колонками или анионообменными колонками.

11. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.10, в котором хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько DEAE колонок, СМ колонок и/или гидроксиапатитовых колонок.

12. Фармацевтическая высокоочищенная композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.7.

13. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, включающей в себя гемоглобин, состоящий главным образом из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, включающий: a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму; b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих; c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с целью получения отфильтрованной фракции эритроцитов; d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с целью удаления примесей белка из плазмы, с целью получения промытых эритроцитов; e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение от 2 до 30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч; f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата; g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина; h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка; i) проведение второго процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем у гемоглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина; j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, α- α субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином; k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока; m) добавление N-ацетилцистеина к перекрестно-сшитому тетрамерному гемоглобину и термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина при температуре от 70 до 95°С в дезоксигенированной среде с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, термообработку проводят в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением до температуры 25°С; n) добавление N-ацетилцистеина в количестве приблизительно 0,2-0,4% незамедлительно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина; о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с получением чистого раствора и р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.

14. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.13, в котором количество добавления N-ацетилцистеина до термообработки составляет примерно 0,2%.

15. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.13, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.

16. Фармацевтическая высокоочищенная композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.13.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, который включает в себя гемоглобин, состоящий из неполимерного, перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, включающий: a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму; b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих; c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с целью получения отфильтрованной фракции эритроцитов; d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с целью удаления примесей белка из плазмы, с целью получения промытых эритроцитов; e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение 2-30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч; f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата с получением первого раствора гемоглобина; g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина; h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка; i) проведение второго процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих молекулярную массу меньше, чем у гемоглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина; j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, α- α субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином; k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока; m) термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, где термообработку проводят согласно процессу "высокая температура - короткое время" при температуре от 70 до 95°С в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением; n) добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% немедленно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина или добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% до термообработки перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с последующим немедленным охлаждением термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина; о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью создания чистого раствора и р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.

2. Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.

3. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором колоночная хроматография проводится с использованием одной или нескольких катионообменных колонок или анионообменных колонок.

4. Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.3, в котором хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько DEAE колонок, СМ колонок и/или гидроксиапатитовых колонок.

5. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором фармацевтически приемлемым носителем является физиологический буфер или вода.

6. Высокоочищенная фармацевтическая композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.1.

7. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, включающей в себя гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, способ содержит: a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму; b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих; c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с получением отфильтрованной фракции эритроцитов; d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с удалением примесей белка из плазмы для получения промытых эритроцитов; e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение 2-30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч; f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата и получение первого раствора гемоглобина; g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с получением второго раствора гемоглобина; h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка; i) проведение второго процесса ультрафильтрации при использовании фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем у гемоглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина; j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, α- α субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином; k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока;m) термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина при температуре примерно от 90 до 95°С с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, термообработку проводят в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением до температуры примерно 25°С; n) добавление N-ацетилцистеина в количестве от 0,2 до 0,4% немедленно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина или добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% до термообработки перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с последующим немедленным охлаждением термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина; о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью создания чистого раствора и р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.

8. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором термообработка проводится в дезоксигенированной среде.

9. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.

10. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором колоночную хроматографию проводят с одной или несколькими катионообменными колонками или анионообменными колонками.

11. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.10, в котором хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько DEAE колонок, СМ колонок и/или гидроксиапатитовых колонок.

12. Фармацевтическая высокоочищенная композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.7.

13. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, включающей в себя гемоглобин, состоящий главным образом из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, включающий: a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму; b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих; c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с целью получения отфильтрованной фракции эритроцитов; d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с целью удаления примесей белка из плазмы, с целью получения промытых эритроцитов; e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение от 2 до 30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч; f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата; g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина; h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка; i) проведение второго процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем у гемоглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина; j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, α- α субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином; k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока; m) добавление N-ацетилцистеина к перекрестно-сшитому тетрамерному гемоглобину и термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина при температуре от 70 до 95°С в дезоксигенированной среде с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, термообработку проводят в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением до температуры 25°С; n) добавление N-ацетилцистеина в количестве приблизительно 0,2-0,4% незамедлительно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина; о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с получением чистого раствора и р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.

14. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.13, в котором количество добавления N-ацетилцистеина до термообработки составляет примерно 0,2%.

15. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.13, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.

16. Фармацевтическая высокоочищенная композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.13.

---

Евразийское ои 023689 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. А61К35/14 (2006.01)
2016.07.29
(21) Номер заявки 201101155
(22) Дата подачи заявки 2011.04.15
(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ТЕПЛОСТОЙКИЙ ПЕРЕНОСЧИК КИСЛОРОДА
(31) 12/821,214; 12/957,430; 13/013,850
(32) 2010.06.23; 2010.12.01; 2011.01.26
(33) US
(43) 2012.07.30
(86) PCT/US2011/032595
(87) WO 2011/162863 2011.12.29
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БИЛЛИОН КИНГ ИНТЕРНЭШНЛ ЛИМИТЕД (HK)
(72) Изобретатель:
Вон Бин Лоу (US), Квок Суй И (HK)
(74) Представитель:
Вахнина Т.А. (RU)
(56) US-A1-20100035797 WO-A1-1996040783 US-A-5741894
(57) Описывается высокоочищенный и теплостойкий перекрестносшитый неполимерный тетрамерный гемоглобин, пригодный для использования млекопитающими, не вызывающий почечную недостаточность и сужение кровеносных сосудов. Проводится этап термообработки "высокая температура и короткое время" (HTST) с целью эффективного удаления нежелательной димерной формы гемоглобина, неперекрестносшитого тетрамерного гемоглобина и примесей белка из плазмы. Добавление N-ацетилцистеина после термообработки и, по желанию, до термообработки поддерживает низкий уровень метгемоглобина. N-Ацетилцистеин добавляется до начала и после термообработки, при этом количество, добавляемое до начала термообработки и после термообработки, составляет примерно от 0,2 до 0,4%. Теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин может улучшить и продлить оксигенацию в нормальной и гипоксической ткани. С другой стороны, продукт используется при лечении разных типов раковых заболеваний, таких как лейкемия, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки и рак пищевода. Изобретенный тетрамерный гемоглобин также можно использовать для предупреждения метастаза опухоли и рецидива после хирургической эксцизии опухоли. Более того, изобретенный тетрамерный гемоглобин может вводиться пациентам до проведения химиотерапии и лучевой терапии.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет заявок на патент США № 12/821214, 12/957430 и 13/013850, содержание которых включено в данный документ в качестве ссылки.
Предупреждение об авторском праве/разрешение
Описание данного патентного документа содержит материал, являющийся объектом охраны авторского права. Обладатель авторского права не возражает против факсимильного воспроизведения любого патентного документа или описания патента, принятого при ведении или регистрации патентов или торговых знаков, сохраняя за собой все авторские права в остальных случаях. Данное предупреждение применяется к процессам, экспериментам и данным, как описывается ниже и в прилагаемых к данному документу чертежах: "Copyright (c) 2010, Billion King International Limited", все права защищены.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу приготовления фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, и процессу изготовления композиции. Настоящее изобретение также относится к использованию фармацевтической композиции, содержащей переносчик кислорода, при лечении рака, кислородной недостаточности и для консервирования органов людей и животных.
Предпосылки создания изобретения
Гемоглобин играет важную роль у большинства позвоночных в газообмене между сердечнососудистой системой и тканью. Он отвечает за перенос кислорода от дыхательной системы к соматическим клеткам через кровообращение, а также за вынос конечного продукта обмена веществ углекислого газа из соматических клеток к дыхательной системе, где углекислый газ выдыхается.
Поскольку гемоглобин обладает данной особенностью переноса кислорода, он может использоваться в качестве сильного поставщика кислорода, если его можно стабилизировать ex vivo и использовать in vivo.
Естественный гемоглобин является тетрамером, который обычно устойчив в эритроцитах. Однако, когда естественный гемоглобин отделяется от эритроцитов он становится нестабильным в плазме и расщепляется на два а-Рдимера. Молекулярная масса каждого из этих димеров составляет примерно 32 кДа. Данные димеры могут вызывать острую почечную недостаточность при фильтрации через почки и выделении. Распад тетрамерной связи также отрицательно влияет на устойчивость функционального гемоглобина в циркуляции.
С целью решения проблемы новые разработки в обработке гемоглобина включали разные методики перекрестного сшивания с целью создания внутримолекулярных связей в тетрамере, а также межмолекулярных связей между тетрамерами для образования полимерного гемоглобина. Согласно прототипу полимерный гемоглобин является предпочтительной формой для увеличения циркуляторного периода полураспада гемоглобина. Однако, как установлено авторами настоящего изобретения, полимерный гемоглобин быстрее преобразуется в метгемоглобин в кровообращении. Метгемоглобин не может связывать кислород, следовательно, не может насыщать кислородом ткань. По этой причине, перекрестное сшивание согласно прототипу, которое приводит к образованию полимерного гемоглобина, является проблемой. В области техники существует необходимость в методике, которая допускает внутримолекулярное перекрестное сшивание с целью создания устойчивых тетрамеров без одновременного образования полимерного гемоглобина.
Другие проблемы с попытками стабилизировать гемоглобин включают в себя получение тетрамер-ного гемоглобина, который включает в себя недопустимо высокий процент димерных элементов. Наличие димеров делает композицию гемоглобина неудовлетворительной для введения млекопитающим. Ди-мерная форма гемоглобина может вызывать у них острую почечную недостаточность. Данная почечная недостаточность может быть достаточно острой для того, чтобы привести к смерти. Поэтому в области техники существует необходимость создания устойчивого тетрамерного гемоглобина с невыявляемой димерной формой в конечном продукте.
Другой проблемой с прототипом гемоглобинных продуктов является внезапное увеличение кровяного давления после их введения. В прошлом были зарегистрированы случаи сужения кровеносных сосудов от старшего поколения переносчиков кислорода на основе гемоглобина. Например, продукт He-mopure(r) (Biopure Co., США) привел к повышенному среднему значению артериального давления (124 ±9 миллиметров ртутного столба) или на 30% выше по сравнению с основной линией (96±10 миллиметров ртутного столба), как выявлено Кацем и др., 2010 г. Предыдущие попытки решения данной проблемы основывались на реакции сульфгидрильных реагентов с сульфгидрильными группами гемоглобина, которые, по утверждению, предупреждают связывание продуцируемого эндотелием расслабляющего фактора с сульфгидрильными группами. Тем не менее, сульфгидрильная обработка включается в этапы обработки, приводя к дополнительным затратам и образованию примесей, которые позже необходимо удалять из композиции гемоглобина. Таким образом, в области техники существует необходимость в процессе приготовления гемоглобина, который не будет вызывать сужение кровеносных сосудов и высокое кровяное давление при применении к млекопитающим.
Другие проблемы с попытками создать устойчивый гемоглобин включают в себя наличие примесей
белка, таких как иммуноглобулин G, который может вызывать аллергические эффекты у млекопитающих. Поэтому в области техники существует необходимость в процессе, который может создать устойчивый тетрамерный гемоглобин без примесей белка.
Кроме вышеупомянутых проблем в области техники существует необходимость в стабилизированном тетрамерном гемоглобине, который не содержит димеры, фосфолипиды и который можно производить в промышленном масштабе.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение раскрывает способ обработки неполимерного, теплостойкого, очищенного, перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина, пригодного для применения на млекопитающих, не вызывающего острую почечную недостаточность, не оказывающего вредные воздействия на сосудистую систему и не приводящего к серьезным побочным эффектам, в том числе к смерти. В настоящем изобретении удаляют димерную форму гемоглобина, перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин, фосфоли-пиды и примеси белка. Более того, настоящее изобретение использует (1) устройство мгновенного цитолиза для точного и контролируемого гипотонического лизиса, (2) проточную колоночную хроматографию, (3) пастеризатор "высокая температура - короткое время" (HTST) для термообработки раствора гемоглобина в процессе очищения с целью удаления нежелательных нестабилизированных димеров гемоглобина и удаления примесей белка, например иммуноглобулина-G, таким образом, чтобы можно было избежать почечной недостаточности, вредных воздействий на сосудистую систему и других токсичных реакций, а также (4) воздухонепроницаемую упаковку мешка вливания с целью предупреждения проникновения кислорода в продукт.
Способ включает в себя использование исходного материала цельной крови млекопитающих, включающее, по меньшей мере, эритроциты и плазму. Эритроциты отделяются от плазмы в цельной крови млекопитающих, затем фильтруются для получения отфильтрованной фракции эритроцитов. Отфильтрованная фракция эритроцитов промывается для удаления примесей белка из плазмы. Вымытые эритроциты разрушаются посредством контролируемого гипотонического лизиса в течение периода времени достаточного для лизирования эритроцитов без лизирования лейкоцитов в устройстве мгновенного цитолиза при скорости потока 50-1000 л/ч. Фильтрация осуществляется с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из лизата. Первый раствор гемоглобина извлекается из лизата.
Первый процесс ультрафильтрации осуществляется при использовании фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем тетрамерный гемоглобин, а также для последующего удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентанта из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина. Проточная колоночная хроматография осуществляется на втором растворе гемоглобина для удаления примесей белка, димерного гемоглобина и фосфолипидов с целью создания раствора гемоглобина, не содержащего фосфолипиды. Второй процесс ультрафильтрации осуществляется на растворе гемоглобина, не содержащем фосфолипиды при использовании фильтра, сконфигурированного для удаления примесей с целью получения концентрированного очищенного раствора гемоглобина, не содержащего фос-фолипиды.
По меньшей мере, а-а субъдиницы очищенного гемоглобина являются перекрестносшитыми посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата с целью образования теплостойкого перекрестносшитого гемоглобина без образования полимерного гемоглобина так, чтобы молекулярная масса результирующего неполимерного перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина составляла 60-70 кДа. Выражение "неполимерный", используемое в данном документе, относится к тетрамерному гемоглобину, который не сшит межмолекулярно с другими молекулами гемоглобина или любыми другими негемоглобиновыми молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Подходящий физиологический буфер такой, как фосфатно-солевой буферный раствор (ПБС), лактатный раствор Рингера, ацетатный раствор Рингера или Трис-буфер, меняется для перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина. Любые остаточные химические вещества удаляются при помощи тангенциальной фильтрации потока.
После данной процедуры перекрестносшитый гемоглобин подвергается термообработке для удаления любого остаточного неперекрестносшитого тетрамерного гемоглобина и любого нестабилизирован-ного гемоглобина, например, димерной формы гемоглобина, а также для удаления любых других примесей белка. До термообработки N-ацетилцистеин по желанию добавляется в концентрации примерно 0,2% к перекрестносшитому тетрамерному гемоглобину с целью предупреждения образования метгемоглоби-на. Сразу после термообработки и охлаждения N-ацетилцистеин добавляется в концентрации примерно от 0,2 до 0,4% для предупреждения образования метгемоглобина. Термообработкой предпочтительно является обработка "высокая температура - короткое время", проводимая при температуре примерно от 70 до 95°С в течение от 30 с до 3 ч с последующим охлаждением при температуре 25°С. Любые осадки, которые образуются во время термообработки, удаляются посредством центрифугирования или фильтрационной установки с целью создания прозрачного раствора.
Затем теплостойкий, неполимерный перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин, не содержащий димеров, фосфолипидов, примесей белка, добавляется к фармацевтически приемлемому переносчику.
После этого теплостойкий, перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин вырабатывается и упако
вывается в мешок вливания, изготовленный из воздухонепроницаемого полиэтилена (ПЭ), этиленвинил-ацетата (ЭВА), этиленвинилалкоголя (ЭВАЛ). Упаковка предупреждает кислородное загрязнение, которое приводит к образованию неактивного метгемоглобина.
Теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин, полученный при помощи вышеописанного способа, используется для лечения разных раковых заболеваний таких, как лейкемия, рак толстой кишки, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки и рак пищевода. Механизм разрушения раковых клеток заключается в насыщении кислородом опухолей в гипоксическом состоянии, увеличивая, таким образом, чувствительность к радиации и химиотерапевтическим веществам. Теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин также используется для консервирования тканей органов во время пересадки или для консервирования сердца в случаях недостаточного снабжения кислородом in vivo, например, при кислородной недостаточности сердца.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображен ряд аминокислотных последовательностей разных гемоглобинов.
Фиг. 2 является блок-схемой, изображающей общий вид процесса по настоящему изобретению.
На фиг. 3 схематически изображено устройство мгновенного цитолиза, которое используется в процессе по настоящему изобретению.
На фиг. 4 изображен анализ жидкостной хроматографии высокого разрешения (а) перекрестносши-того тетрамерного гемоглобина без термообработки и (b) теплостойкого перекрестносшитого тетрамер-ного гемоглобина, который подвергся термообработке при температуре 90°С в течение от 45 с до 2 мин или при температуре 80°С в течение 30 мин.
На фиг. 5 изображен анализ электроспрей-ионизационной масс-спектрометрии (ESI-MS) теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина.
На фиг. 6 изображен анализ спектроскопии кругового дихроизма (а) очищенного раствора гемоглобина и (b) теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина.
На фиг. 7 изображена положительная динамика насыщения кислородом в нормальной ткани. Введение раствора теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина объемом 0,2 г/кг приводит к существенному повышению концентрации гемоглобина в (А) плазме и (В) снабжению мышц кислородом. Существенное повышение насыщения кислородом наблюдается в течение более длительного периода времени по сравнению с уровнем гемоглобина в плазме.
На фиг. 8 показана положительная динамика насыщения кислородом в гипоксической опухолевой ткани. Введение раствора теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина объемом 0,2 г/кг приводит к существенному повышению снабжения кислородом ксенотрансплантата эпидермоидного рака головы и шеи (HNSCC).
На фиг. 9 показано частичное сокращение опухоли у грызунов с (А) раком носоглотки (NPC) и (В) раком печени.
На фиг. 10 представлены средние значения изменений артериального давления у крыс с сильным геморрагическим шоком после лечения теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином.
На фиг. 11 представлен профиль элюции проточной колоночной хроматографии, раствор гемоглобина находится в проточной фракции.
На фиг. 12 схематически изображена система проточной СМ колоночной хроматографии с ультрафильтрацией для производства в промышленном масштабе.
На фиг. 13 представлено схематическое изображение устройства, которое используется для этапа термообработки HTST.
На фиг. 14 продемонстрирован профиль температуры в обрабатывающем устройстве HTST и время, необходимое для удаления нестабилизированного тетрамера (димера) настоящего изобретения в системе при температуре 85 и 90°С.
На фиг. 15 продемонстрирован уровень образования метгемоглобина в системе при температуре 85 и 90°С в обрабатывающем устройстве HTST фиг. 13.
На фиг. 16 представлено схематическое изображение мешка вливания для теплостойкого перекре-стносшитого тетрамерного гемоглобина по настоящему изобретению.
На фиг. 17 показан схематический чертеж, суммирующий хирургическую операцию и процедуру введения продукта гемоглобина во время резекции печени.
На фиг. 18 показаны репрезентативные примеры рецидива внутрипеченочного рака печени, метастаза и отдаленного метастаза легкого, индуцированные у крыс группы с IR повреждением после процедур гепатэктомии и ишемии/реперфузии, а также защита против них при использовании изобретательского теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина.
На фиг. 19 показано гистологическое исследование в экспериментальной и контрольной группах в течение четырех недель после процедур резекции печени и IR повреждения.
Подробное описание изобретения
Гемоглобин является железосодержащим транспортным белком кислорода в эритроцитах крови млекопитающих и других животных. Гемоглобин обнаруживает признаки третичной и четвертичной
структур белков. Большинство аминокислот в гемоглобине образуют альфа-спирали, связанные посредством коротких неспиральных сегментов. Водородные связи стабилизируют спиральные участки внутри гемоглобина, приводя к притяжению молекул, заворачивая каждую полипептидную цепь в особую форму. Молекула гемоглобина комбинируется из четырех субъединиц глобулярного белка. Каждая субъединица состоит из полипептидной цепи, которая устроена, как набор а-спиральных структурных сегментов, соединенных в виде "складки миоглобина" со встроенной группой гема.
Группа гема состоит из атома железа, который удерживается в гетероциклическом кольце известном, как порфирин. Атом железа одинаково связывается со всеми четырьмя азотными атомами в центре кольца, которые лежат в одной плоскости. Кислород способен связаться с центром железа перпендикулярно плоскости порфиринового кольца. Таким образом, одна молекула гемоглобина способна объединяться с четырьмя молекулами кислорода.
У взрослых людей самым распространенным типом гемоглобина является тетрамер, называемый гемоглобином А, содержащим две а и две Р нековалентно связанные субъединицы, которые обозначаются, как а2р2, каждая из которых состоит из 141 и 146 аминокислотных остатков, соответственно. Размер и структура субъединиц а и Р очень похожи. Каждая субъединица имеет молекулярную массу примерно 16 кДа от общей молекулярной массы тетрамера примерно 65 кДа. Четыре полипептидные цепи связаны друг с другом посредством солевых мостов, водородных связей и гидрофобного взаимодействия. Структура бычьего гемоглобина похожа на гемоглобин человека (90,14% идентичности в а-цепи, 84,35% идентичности в р-цепи). Разница заключается в том, что две сульфгидрильные группы в бычьем гемоглобине расположены в р Cys 93, а сульфгидрилы в гемоглобине человека расположены в а Cys 104, р Cys 93 и р Cys 112 соответственно. На фиг. 1 показан ряд аминокислотных последовательностей бычьего, человеческого, собачьего, свиного и лошадиного гемоглобина, промаркированные В, Н, С, Р и Е соответственно. Непохожие аминокислоты из разных источников заштрихованы. На фиг. 1 показано, что гемоглобин человека очень схож с бычьим, собачьим, свиным и лошадиным при сравнении их аминокислотных последовательностей.
В естественном гемоглобине внутри эритроцитов, связь а-цепи с соответствующей р-цепью является очень сильной и не разъединяется при физиологических условиях. Однако связь одного димера ар с другим димером ар достаточно слабая вне эритроцитов. Связь имеет тенденцию расщепляться на два димера ар примерно по 32 кДа. Нежелательные димеры являются достаточно маленькими для того, чтобы отфильтровываться почками и выделяться, являясь причиной потенциальной почечной недостаточности и существенного снижения внутрисосудистого времени удержания.
По этой причине необходимо стабилизировать любой гемоглобин, который используется вне эритроцитов для эффективности и безопасности. Процесс изготовления стабилизированного гемоглобина приводится ниже. Общее представление о процессе настоящего изобретения представлено на блок-схеме
фиг. 2.
Сначала выбирается источник цельной крови в качестве источника гемоглобина из эритроцитов. Выбирается цельная кровь млекопитающих, включая, помимо прочего, человеческую, бычью, свиную, лошадиную и собачью цельную кровь. Эритроциты отделяются от плазмы, фильтруются и промываются для удаления осадков белка из плазмы.
Клеточная мембрана лизируется с целью высвобождения гемоглобина из эритроцитов. Несмотря на то, что можно использовать разные методики для лизирования эритроцитов, настоящее изобретение использует лизис при гипотонических условиях, которые можно строго контролировать при объемах пригодных для изготовления в промышленном масштабе. Для этой цели используется устройство мгновенного цитолиза для лизирования эритроцитов, как показано на фиг. 3. Гипотонический лизис создает раствор лизата, включающий в себя гемоглобин и остаточный ретентат. Для того, чтобы сделать изготовление в промышленном масштабе возможным, лизис тщательно контролируется таким образом, чтобы ли-зировались исключительно эритроциты без лизирования лейкоцитов или других клеток. В одном варианте выполнения размер устройства мгновенного цитолиза выбирается таким образом, чтобы эритроциты проходили через устройство в течение от 2 до 30 с или же, чтобы время достаточное и предпочтительное для лизирования эритроцитов составляло 30 с. Устройство мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель. Деионизированная и дистиллированная вода используется в качестве гипотонического раствора. Понятно, что при использовании других гипотонических растворов, имеющих разные солевые концентрации, необходимы другие промежутки времени для лизиса эритроцитов. Поскольку в ходе контролируемой процедуры лизиса лизируются исключительно эритроциты, а не лейкоциты или клеточные вещества, высвобождение токсических белков, фосфолипидов или ДНК из лейкоцитов и других клеточных веществ сводится к минимуму. Гипертонический раствор добавляется незамедлительно по истечении 30 секунд, то есть после того как раствор, содержащий эритроциты пройдет через статический смеситель устройства мгновенного цитолиза. Результирующий гемоглобин имеет более высокую чистоту и более низкие уровни загрязняющих веществ таких, как нежелательные ДНК и фосфолипиды, чем гемоглобин, полученный при использовании других лизисных методик. Нежелательные нуклеиновые кислоты из примесей лейкоцитов и фосфолипидов не обнаруживаются в растворе гемоглобина при помощи
способа полимеразной цепной реакции (предел обнаружения = 64 пг) и жидкостной хроматографии высокого разрешения (предел обнаружения для жидкостной хроматографии высокого разрешения = 1 мкг/мл), соответственно.
Проводятся два процесса ультрафильтрации: один процесс удаляет примеси, имеющие большую молекулярную массу, чем гемоглобин до проточной колоночной хроматографии, а другой удаляет примеси, имеющие меньшую молекулярную массу, чем гемоглобин после проточной колоночной хроматографии. Последний процесс ультрафильтрации концентрирует гемоглобин. В некоторых вариантах выполнения для первой ультрафильтрации используется фильтр 100 кДа, а для второй ультрафильтрации используется фильтр 30 кДа.
Проточная колоночная хроматография используется для удаления примесей белка из очищенного раствора гемоглобина таких, как иммуноглобулин-G, альбумин и углеродная ангидраза. В некоторых вариантах выполнения колоночная хроматография проводится посредством использования одной или комбинации имеющихся в продаже ионообменных колонок таких, как DEAE колонка, СМ колонка, гид-роксиапатитовая колонка и т.д. Уровень рН для колоночной хроматографии типично составляет от 6 до 8,5. В одном варианте выполнения используется проточная СМ колоночная хроматография для удаления примесей белка при уровне рН 8,0. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) проводится для обнаружения примесей белка и фосфолипидов, остающихся в образце после элюирования из колоночной хроматографии. Данное уникальное отделение проточной колоночной хроматографией позволяет осуществить схему непрерывного отделения для изготовления в промышленном масштабе. Результат ELISA показывает, что количество данных примесей является существенно низким в элюированном гемоглобине (иммуноглобулин-G: 44,3 нг/мл, альбумин: 20,37 нг/мл, углеродная ангидраза: 81,2 мкг/мл). Результаты удаления примесей белка при использовании разных видов колонок с разными значениями уровня рН приведены ниже в табл. 1.
Таблица 1
Колонка (условие рН)
Процент удаления(%|
Углеродная ангидраза
Альбумин Иммуноглобулин-G
DEAE (уровень рН 7,5)
...
68 29,8
DEAE (уровень рН 7,8)
...
60 50,9
СМ (уровень рН 6,2)
...
32 21,8
СМ (уровень рН 8,0)
5,6
53,2 66,4
Гидроксиапатит (уровень рН 7,5)
4,5
23,5 22,8
После процесса колоночной хроматографии гемоглобин подвергается перекрестному сшиванию посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата (DBSF). Для того чтобы предупредить образование полимерного гемоглобина, реакция тщательно контролируется в дезоксигенированной среде (предпочтительно ниже 0,1 частей на миллион растворенного уровня кислорода) с молярным отношением гемоглобина к DBSF от 1:2,5 до 1:4,0 в течение периода времени от 3 до 16 ч при температуре среды (15-25°С), предпочтительно при уровне рН примерно 8-9 таким образом, чтобы результирующий перекрестносшитый гемоглобин являлся тетрамерным гемоглобином с молекулярной массой 60-70 кДа, показывающей, что полимерный гемоглобин отсутствует. Выход реакции DBSF является высоким > 99%, а концентрация димеров в конечном продукте является низкой. В настоящем процессе не обязательно использовать реагенты для обработки таких сульфгидрилов, как иодацетамид для реагирования с гемоглобином до перекрестного сшивания, которые используются в устаревших процессах прототипа.
На этой стадии фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), физиологический буфер, заменяется сшивающим раствором, и любые остаточные химические вещества удаляются при помощи тангенциальной фильтрации потока.
После процесса перекрестного сшивания гемоглобина посредством DBSF при дезоксигенирован-ном условии, настоящее изобретение включает этап термообработки для перекрестносшитого тетрамер-ного раствора гемоглобина в дезоксигенированной среде. С целью предупреждения образования метге-моглобина (неактивного гемоглобина) до термообработки можно добавлять N-ацетилцистеин. После термообработки для поддержания низкого уровня метгемоглобина раствор охлаждается и незамедлительно добавляется N-ацетилцистеин. N-Ацетилцистеин добавляется до начала и после термообработки, при этом количество, добавляемое до начала термообработки и после термообработки, составляет примерно от 0,2 до 0,4%.
В некоторых вариантах выполнения перекрестносшитый тетрамерный раствор гемоглобина нагревается в дезоксигенированной среде (ниже 0,1 частей на миллион растворенного уровня кислорода) при температурах от 50 до 95°С в течение периода времени от 0,5 мин до 10 ч. В некоторых вариантах выполнения перекрестносшитый тетрамерный раствор гемоглобина нагревается при температурах от 70 до 95°С в течение периода времени от 30 с до 10 ч. В некоторых вариантах предпочтительного выполнения перекрестносшитый тетрамерный раствор гемоглобина нагревается при температуре 80°С в течение 30
мин. А еще в других вариантах предпочтительного выполнения связанный раствор гемоглобина нагревается до температуры 90°С в течение от 30 с до 3 мин, затем быстро охлаждается до температуры примерно 25°С примерно в течение от 15 до 30 с, а N-ацетилцистеин добавляется, как излагалось выше. Получается очень маленькое количество метгемоглобина, например меньше 3%. Без использования N-ацетил-цистеина количество образуемого метгемоглобина составляет примерно 16%, неприемлемо высокое процентное отношение для фармацевтических применений.
Жидкостная хроматография высокого разрешения (HPLC), электроспрей-ионизационная масс-спектрометрия (ESI-MS), спектроскопия кругового дихроизма (CD) и анализатор Hemox для проведения измерения р50 используются впоследствии для анализирования и характеризирования теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина. В отношении гемоглобина из бычьего источника крови, на фиг. 4 показано, что димерная форма гемоглобина не обнаруживается в системе HPLC (предел обнаружения: 2,6 мкг/мл или 0,043%) для гемоглобина, который подвергся термообработке при температуре 90°С в течение от 45 с до 2 мин или при температуре 80°С в течение 30 мин. Перекрестносшитый неполимерный тетрамерный гемоглобин признан теплоустойчивым при температуре 80 или 90°С в течение некоторого периода времени. Этап термообработки (высокая температура - короткое время, HTST) является мощным этапом для денатурирования природной непрореагировавшей тетрамерной формы и ди-мерной формы гемоглобина.
Для анализирования результата этапа HTST аналитический метод HPLC используется для обнаружения количества димеров после этапа термообработки. Подвижная фаза для анализа HPLC содержит хлорид магния (0,75М), который может разделять димер (нестабилизированный тетрамер) и теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин. Для стимулирования распада гемоглобина на димеры, хлорид магния примерно в 30 раз является более эффективным, чем хлорид натрия с одинаковой ионной силой. Этап термообработки также действует, как этап денатурирования с целью эффективного удаления нежелательных примесей белка в перекрестносшитом тетерамерном гемоглобине (необнаруживаемые в иммуноглобулине-G, необнаруживаемые в альбумине, 99,99% снижение в углеродной ангидразе). Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) проводится для обнаружения примесей белка в образце. Таким образом, очищенный теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный раствор гемоглобина имеет необнаруживаемый уровень димера (ниже предела обнаружения: 0,043%), иммуноглобулина-G, а также очень маленькое количество альбумина (0,02 мкг/мл) и углеродной ангидразы (0,014 мкг/мл). В табл. 2 показаны экспериментальные результаты касательно примесей белка и отделения димера посредством этапа термообработки HTST. Данный этап термообработки HTST делает возможным селективное отделение теплостойкого перекрестносшитого тетрамера от неустойчивого тетрамера и димера.
Таблица 2
Примеси белка (посредством ELISA)
посредством HPLC
р50 при
Состояние образца
Иммуноглобулин-G (мкг/мл)
Альбумин (мкг/мл)
Углеродная ангидраза (мкг/мл)
Тетрамер
(%)
Димер(%)
температуре 37°С (mmHg)
Без термообработки
0,36
0,57
355,41
90,1
5,4
80°С в течение 10 мин.
Необнаружим
0,33
0,032
92,7
3,4
Нет данных
80°С
в течение 15 мин.
Необнаружим
0,14
0,022
93,3
2,9
Нет данных
60Х
в течение 30 мин.
Необнаружим
0,03
0,014
96,6
Необнаружим
Без термообработки
0,29
0,52
261,80
91,8
5,3
90°С
в течение 1,0 мин.
Необкаружим
0,21
> 0,063
93,4
2,0
90°С в течение 1.5 мин.
Необнаружим
0,04
0,022
94,9
0,6
90°С в течение 2,0 мин.
Необнаружим
0,02
0,016
96,1
Необнаружим
После этапа термообработки для перекрестносшитого гемоглобина при дезоксигенированном условии, теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин является готовым для фармацевтической формулировки и упаковывания. Настоящее изобретение включает этап воздухонепроницаемого упаковывания теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного раствора гемоглобина в дезоксигениро
ванной среде. Теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин в настоящем изобретении является устойчивым при дезоксигенированном условии в течение более двух лет.
В данном изобретении фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода, главным образом предназначается для внутривенного введения. Обычно предшествующие продукты используют стандартный поливинилхлоридный мешок для крови или мешок для крови Стерикон (Stericon), имеющий высокую кислородную проницаемость, которая, в конце концов, сокращает срок службы продукта, поскольку он быстро превращается в неактивный метгемоглобин (в течение нескольких дней) при окси-генированных условиях.
Упаковка, используемая в настоящем изобретении, приводит к тому, что теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин остается устойчивым в течение более двух лет. Многослойная упаковка из материала EVA/EVOH используется для минимизации газопроницаемости и для предупреждения образования неактивного метгемоглобина. Мешок вливания объемом 100 мл разработанный для использования с очищенным и теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином по настоящему изобретению сделан из пяти слоев слоистого материала EVA/EVOH толщиной 0,4 мм, проницаемость кислорода которого составляет 0,006-0,132 см3 на 100 квадратных дюймов в течение 24 ч при комнатной температуре. Данный материал является пластиком класса VI (как определено фармакопеей США <88> ), который удовлетворяет испытаниям на биологическую реактивность in vivo и физико-химическим испытаниям и пригоден для изготовления мешка вливания для внутривенного введения. Этот первичный мешок, особенно полезен для защиты теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного раствора гемоглобина от длительного воздействия кислорода, который приводит к его неустойчивости и, в конце концов, влияет на его лечебные свойства.
Для вторичной защиты кровяных продуктов используется алюминиевая обертка для защиты от потенциального притока воздуха и поддержания продукта в дезоксигенированном состоянии. Тем не менее, в алюминиевой обертке существуют потенциальные микроотверстия, которые подвергают риску ее герметичность и делают продукт неустойчивым. По этой причине в настоящем изобретении используется в качестве вторичной упаковки алюминиевый оберточный мешок, предупреждающий оксигенацию и световое воздействие. Состав оберточного мешка включает в себя 0,012 мм полиэтилентерефталата (PET), 0,007 мм алюминия (Al), 0,015 мм нейлона (NY) и 0,1 мм полиэтилена (РЕ). Оберточная пленка имеет толщину 0,14 мм и проницаемость кислорода 0,006 см3 на 100 квадратных дюймов в течение 24 ч при комнатной температуре. Данная вторичная упаковка увеличивает время устойчивости гемоглобина, продлевая срок годности продукта.
Гемоглобин настоящего изобретения анализируется посредством разных методик, включая ESI-MS. ESI-MS делает возможным проведение анализа очень больших молекул. Методика ионизации анализирует состав высокой молекулярной массы посредством ионизации белка, а затем отделения ионизированного белка на основе отношения массы к заряду. Поэтому молекулярная масса и взаимодействия белка могут быть точно определены. На фиг. 5 результат анализа ESI-MS указывает на то, что размер теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина составляет 65 кДа (неполимерные гемоглоби-новые тетрамеры). Дальняя область ультрафиолетового излучения CD-спектра от 190 до 240 нм выявляет вторичные структуры глобиновой части гемоглобина. На фиг. 6 слаженность спектра очищенного раствора гемоглобина и теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина выявляет, что гемо-глобиновые цепочки надлежащим образом свернуты даже после термообработки при температуре 90°С. Результат CD показывает, что теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин имеет примерно 42% альфа-спирали, 38% бета-слоя, 2,5% бета-витка и 16% случайного клубка. Это дополнительно подтверждает, что перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин является теплоустойчивым.
Процесс в данном изобретении применим к широкомасштабному промышленному производству теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина. Более того, теплостойкий перекрестнос-шитый тетрамерный гемоглобин в сочетании с фармацевтическим носителем (например, водой, физиологическим буфером, в форме капсул) является пригодным для использования млекопитающими.
Настоящее изобретение дополнительно раскрывает использование фармацевтической композиции, содержащей переносчик кислорода, в улучшении оксигенации тканей, при лечении рака, кислородной недостаточности, например, геморрагического шока, а также при консервировании сердца в среде с низким содержанием кислорода (например, пересадки сердца). Доза выбирается с интервалом концентрации примерно 0,2-1,3 г/кг со скоростью вливания меньше 10 мл/ч/кг веса тела.
При лечении рака фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода настоящего изобретения, служит в качестве вещества, оксигенирующего ткани с целью улучшения оксигенации в опухолевых тканях, усиливая тем самым чувствительность к химиотерапевтическим препаратам и радиочувствительность.
Более того, в данном изобретении демонстрируется способность теплостойкого перекрестносшито-го тетрамерного гемоглобина улучшать оксигенацию в нормальных тканях (фиг. 7) и в крайне гипокси-ческих опухолях (фиг. 8), в раке носоглотки человека (при использовании клеточной линии CNE2). Репрезентативный профиль кислорода вдоль дорожки ткани ксенотрансплантата CNE2 человека показан на фиг. 8. Парциальное давление кислорода (pO2) в опухолевой массе непосредственно контролируется во
локонно-оптическим кислородным датчиком (Oxford Optronix Limited), соединенным с системой микропозиционирования (DTI Limited). После внутривенного введения 0,2 г/кг теплостойкого перекрестнос-шитого тетрамерного гемоглобина среднее значение pO2 увеличивается от базового значения почти до двукратного относительного среднего парциального давления кислорода в течение 15 минут и длится 6 часов. Более того, в среднем уровень кислорода по-прежнему сохраняется на уровне от 25 до 30% выше базового значения через 24-48 ч после вливания. Ни продукты, имеющиеся в продаже, ни существующие технологии, не демонстрируют такую высокую эффективность по сравнению с фармацевтической композицией, содержащей переносчик кислорода, приготовленную в соответствии с данным изобретением.
Для оксигенации опухолевой ткани репрезентативный профиль кислорода ксенотрансплантата (FaDu) плоскоклеточного рака головы и шеи человека (HNSCC) показан на фиг. 8. После внутривенного введения 0,2 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина наблюдается значительное (более чем в 6,5 и 5 раз) увеличение среднего значения pO2 в 3 и 6 ч соответственно (фиг. 8).
При лечении рака фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая переносчик кислорода, служит в качестве вещества, оксигенирующего ткань с целью улучшения оксигенации в опухолевых тканях, усиливая тем самым чувствительность к химиотерапевтическим препаратам и радиочувствительность. При сочетании рентгеновского облучения и теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина рост опухоли замедляется. На фиг. 9А репрезентативные кривые показывают значительное сокращение опухоли у грызунов с раком носоглотки. Голых мышей, носителей ксе-нотрансплантата CNE2, обрабатывали только рентгеновскими лучами (2Gy) или в сочетании с теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином (2Gy+Hb). 1,2 г/кг теплостойкого перекрест-носшитого тетрамерного гемоглобина вводится мыши внутривенно примерно за 3-6 ч до рентгеновского облучения и приводит к частичному сокращению ксенотрансплантата рака носоглотки.
В одном варианте выполнения после введения композиции вместе с химиотерапевтическим веществом наблюдается значительное сокращение опухоли печени. На фиг. 9В репрезентативная схема показывает значительное сокращение опухоли у крысы с ортотопическим раком печени. Крысы Buffalo с ор-тографтом опухоли печени (клеточная линия CRL1601) обрабатывались только цисплатином 3 мг/кг или в сочетании с теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином 0,4 г/кг (Cisplatin+Hb). Введение теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина до введения цисплатина приводит к частичному сокращению опухоли печени.
При лечении кислородной недостаточности и для консервирования сердца фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода по настоящему изобретению служит в качестве кровезаменителя, снабжая кислородом орган-мишень.
Средние изменения артериального давления у крыс с сильным геморрагическим шоком после лечения 0,5 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина показаны на фиг. 10. У крыс с сильным геморрагическим шоком после лечения теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином среднее артериальное давление возвращается на безопасный и устойчивый уровень и сохраняется на базовом значении или около него. После лечения теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином, среднее артериальное давление возвращается к нормальному за более короткое время, чем при введении аутологичной крови крысы, служащей в качестве положительного контроля. Результаты показывают, что после переливания теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина сужения кровеносных сосудов не происходит.
Примеры
Нижеследующие примеры приводятся как описание особых вариантов выполнения данного изобретения, но ни в коей мере не ограничивают его объем. Пример 1
Общее представление о процессе
Схематическая блок-схема процесса настоящего изобретения проиллюстрирована на фиг. 2. Цельная бычья кровь собирается в закрытую стерильную емкость/мешок, содержащий 3,8% (в/в) раствор три-содиум цитрата в качестве коагулянта. После чего незамедлительно кровь тщательно смешивается с раствором трисодиум цитрата для задержки свертывания крови. Эритроциты (RBC) изолируются и собираются из плазмы и других более маленьких клеток крови посредством механизма аферезиса. "Устройство для промывания клеток" используется для данной процедуры с гамма-стерилизованным съемным ротором центрифуги. RBC промываются с одинаковым объемом 0,9% физиологического раствора (в/в хлорид натрия).
Промытые RBC лизируются с целью выделения содержания гемоглобина посредством применения гипотонического шока к клеточной мембране RBC. Специализированное устройство мгновенного цитолиза для устройства лизиса RBC, изображенное на фиг. 3, используется для этой цели. После лизиса RBC молекулы гемоглобина изолируются от других белков посредством тангенциальной проточной ультрафильтрации при использовании мембраны 100 кДа. Гемоглобин в фильтрате собирается для проточной колоночной хроматографии, а затем концентрируется до 12-14 г/дл при помощи мембраны 30 кДа. Колоночная хроматография проводится с целью удаления примесей белка.
Концентрированный раствор гемоглобина сначала реагирует с DBSF для образования теплоустой
чивых перекрестносшитых тетрамерных молекул гемоглобина при дезоксигенированном условии. Затем проводится этап термообработки при дезоксигенированных условиях при температуре 90°С в течение от 30 с до 3 мин до окончательной формулировки и упаковки. Пример 2
Время, контролируемый гипотонический лизис и фильтрация
Свежая цельная бычья кровь собирается и транспортируется при холодном условии (от 2 до 10°С). Эритроциты отделяются от плазмы через устройство для промывания клеток, а затем через фильтрацию 0,65 мкм. После промывания фильтрата эритроцитов (RBC) 0,9% физиологическим раствором, фильтрат разрушается посредством гипотонического лизиса. Гипотонический лизис проводится при использовании устройства мгновенного цитолиза, изображенного на фиг. 3. Устройство мгновенного цитолиза включает в себя статический смеситель для способствования клеточному лизису. Суспензия RBC с контролируемой концентрацией гемоглобина (12-14 г/дл) смешивается с 4 объемами очищенной воды для порождения гипотонического шока в клеточных мембранах RBC. Продолжительность гипотонического шока контролируется во избежание нежелательного лизиса лейкоцитов и тромбоцитов. Гипотонический раствор проходит через часть статического смесителя устройства мгновенного цитолиза в течение от 2 до 30 с или в течение иного периода времени достаточного для лизирования эритроцитов, предпочтительно 30 с. Шок завершается по истечении 30 с посредством смешивания лизата с 1/10 объема гипертонического буфера при выходе из статического смесителя. Использованным гипертоническим раствором является 0,1М фосфатный буфер, 7,4% NaCl, pH 7,4. Устройство мгновенного цитолиза на фиг. 3 может обрабатывать от 50 до 1000 л лизата в час и предпочтительно по меньшей мере 300 л/ч непрерывно.
После лизиса RBC лизат эритроцитов фильтруется посредством 0,22-мкм фильтра с целью получения раствора гемоглобина. Нуклеиновые кислоты из примесей лейкоцитов и фосфолипидов не обнаруживаются в растворе гемоглобина при помощи способа полимеразной цепной реакции (предел обнаружения = 64 пг) и HPLC (предел обнаружения = 1 мкг/мл), соответственно. Первая 100 кДа ультрафильтрация проводится с целью удаления примесей, имеющих большую молекулярную массу, чем гемоглобин. Затем проводится проточная колоночная хроматография для дополнительной очистки раствора гемоглобина. Далее проводится вторая 30 кДа ультрафильтрация с целью удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем гемоглобин, а также для концентрации.
Пример 3
Исследование по удалению вирусов на растворе гемоглобина, не содержащем стромы Для того, чтобы продемонстрировать безопасность продукта из данного изобретения, способности удаления вирусов (1) этапа 0,65-мкм диафильтрации и (2) этапа 100 кДа ультрафильтрации демонстрируются посредством исследования валидации вирусов. Это осуществляется посредством преднамеренного моделирования масштабированной версии данных двух процессов с разными моделями вирусов (вирус энцефаломиокардита, вирус псевдобешенства, вирус вирусной диареи рогатого скота и бычий парво-вирус). В данном исследовании используются четыре типа вирусов (см. табл. 3). Эти вирусы разнятся по своим биофизическим и структурным особенностям и показывают изменение в сопротивлении к физическим и химическим веществам или лечению.
Таблица 3
Таблица 4
Пример 4
Проточная колоночная хроматография
СМ колонка (производимая компанией GE healthcare) используется с целью дальнейшего удаления любых примесей белка. Стартовым буфером является 20 мМ ацетат натрия (рН 8,0), а элюирующим буфером является 20 мМ ацетат натрия, 2М NaCl (рН 8,0). После уравновешивания СМ колонки со стартовым буфером образец белка загружается в колонку. Несвязанные примеси белка промываются при помощи по меньшей мере 5 колоночного объема стартового буфера. Элюция осуществляется при использовании 25% элюирующего буфера (0-0,5М NaCl) в 8 колоночном объеме. Профиль элюции показан на фиг. 11, раствор гемоглобина находится в проточной фракции. Чистота проточной фракции анализируется посредством ELISA. Результаты показаны в нижеприведенной табл. 6.
Таблица 6
Примеси белка
Иммуноглобулин-G
Углеродная ангидраза
Альбумин
До СМ колонки
1320 нг/мл
860,3 мкг/мл
435,2 нг/мл
Проток
(содержащий
гемоглобин)
44,3 нг/мл
81,2 мкг/мл
20,4 нг/мл
Раствор гемоглобина находится в протоке из СМ колоночной хроматографии с уровнем рН 8 (не в элюате), который подходит для непрерывной работы в промышленном масштабе. Первое устройство ультрафильтрации соединяется непосредственно с системой проточной СМ колоночной хроматографии, а проточная труба может соединяться со вторым устройством ультрафильтрации для работы в промышленном масштабе. Схематическая конфигурация процесса изготовления показана на фиг. 12.
Пример 5
Приготовление теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина (5а) Реакция перекрестного сшивания с DBSF
Реакция перекрестного сшивания проводится при дезоксигенированном условии. DBSF добавляется к раствору гемоглобина для образования перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина без образования полимерного гемоглобина. Процедура DBSF стабилизации стабилизирует тетрамерную форму гемоглобина (65 кДа) и предупреждает распад на димеры (32 кДа), которые выделяются через почки. В данном варианте выполнения используется молярное отношение гемоглобина к DBSF 1:2,5, а уровень рН составляет 8,6. Данный процесс осуществляется в течение 3-16 ч при температуре среды (15-25°С) в инертной среде азота с целью предупреждения окисления гемоглобина и образования метгемоглобина, который является физиологически неактивным (растворенный уровень кислорода поддерживается ниже 0,1 частей на миллион). Завершенность реакции DBSF контролируется посредством измерения остаточного DBSF при использовании HPLC. Результат реакции DBSF является высоким - > 99%.
(5b) Этап термообработки HTST
Обрабатывающее устройство "высокая температура - короткое время" (HTST) показано на фиг. 13. Термообработка при использовании обрабатывающего устройства HTST осуществляется на перекрест-носшитом тетрамерном гемоглобине. В данном примере условием термообработки является температура 90°С в течение от 30 с до 3 мин, предпочтительно от 45 до 60 с, хотя можно выбирать другие условия, как обсуждалось выше, а следовательно, и модифицировать аппарат. Раствор, содержащий перекрест-носшитый гемоглобин, к которому можно добавить 0,2% N-ацетилцистеина, закачивается в обрабатывающее устройство HTST (первый отдел теплообменника HTST предварительно нагревается и поддерживается при температуре 90°С) при скорости потока 1,0 л/мин, время пребывания первого отдела устройства составляет от 45 до 60 с, затем раствор проходит при той же скорости потока в другой отдел теплообменника, который поддерживается при температуре 25°С. Время, которое необходимо для охлаждения составляет от 15 до 30 с. После охлаждения до температуры 25°С, незамедлительно добавляется N-ацетилцистеин в концентрации от 0,2 до 0,4%, предпочтительно 0,4%. Данный химический привнос вещества после термообработки HTST является очень важным для поддержания метгемоглобина (неактив- 10
ного гемоглобина) на низком уровне. Установка обрабатывающего устройства легко контролируется для промышленной работы. Профиль температуры с содержанием димера показан на фиг. 14. Если гемоглобин не является перекрестносшитым, он не является теплоустойчивым и образует осадок после этапа термообработки. Далее осадок удаляется посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью образования чистого раствора.
Во время термообработки HTST при температуре 90°С метгемоглобин (неактивный гемоглобин) увеличивается (показано на фиг. 15). После незамедлительного добавления N-ацетилцистеина можно поддерживать низкий уровень метгемоглобина примерно ниже 3%.
Нижеприведенная табл. 7 показывает, что примеси белка такие, как иммуноглобулин-G, альбумин, углеродная ангидраза и нежелательный нестабилизированный тетрамер или димеры, удаляются после этапа термообработки. Количество иммуноглобулина-G, альбумина и углеродной ангидразы измеряется посредством использования способа ELISA, а количество димера определяется посредством способа HPLC. Чистота теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина является очень высокой после этапа термообработки HTST - в пределах от 98,0 до 99,9%. Значение р50, парциальное давление кислорода (при котором раствор гемоглобина является наполовину (50%) насыщенным), измеряемое посредством анализатора Гемокс (Hemox), поддерживается примерно в пределах от 30 до 40 миллиметров ртутного столба (mmHg) в ходе этапа термообработки HTST и, следовательно, теплостойкий пере-крестносшитый тетрамерный гемоглобин является устойчивым при температуре 90°С.
Таблица 7
Состояние образца
Примеси белка (посредством ELISA)
посредством HPLC
р50 при температуре 37°С
(mmHg)
Иммуноглобули Углеродная
(МКГ/МЛ) (МКГ/МЛ) (МКГ/МЛ)
Т(tm)Р Димер(%)
Без термообработки
Э0°С в течение 2 мин.
Удаление(%)
0,29 0,52 261,80 Необнаружим 0,02 0,016 100,0 96,15 99,99
91,8 5,3 96,1 Необнаружим - 100,0
38 31
Пример 6 Упаковка
Поскольку продукт настоящего изобретения является устойчивым при дезоксигенированных условиях, с целью минимизации газопроницаемости способ упаковки продукта является крайне важным. Для внутривенного применения специально разработанный мешок вливания объемом 100 мл изготовлен из пятислойного слоистого материала EVA/EVOH толщиной 0,4 мм, проницаемость кислорода которого составляет 0,006-0,132 см3 на 100 квадратных дюймов в течение 24 ч при комнатной температуре. Данный специальный материал является пластиком класса VI (как определено фармакопеей США <88> ), который удовлетворяет испытаниям на биологическую реактивность in vivo и физико-химическим испытаниям и пригоден для изготовления емкостей для внутривенного введения (обратите внимание, что другие формы упаковки могут быть изготовлены из этого материала в зависимости от применения). Вторичная упаковка из алюминиевого оберточного мешка также накладывается на первичную упаковку мешка вливания, что создает дополнительный барьер, сводя к минимуму световое воздействие и кислородную диффузию. Слои мешка содержат: 0,012 мм полиэтилентерефталата (PET), 0,007 мм алюминия (Al), 0,015 мм нейлона (NY) и 0,1 мм полиэтилена (РЕ). Оберточная пленка имеет толщину 0,14 мм и проницаемость кислорода 0,006 см3 на 100 квадратных дюймов в течение 24 ч при комнатной температуре. Схематическое изображение мешка вливания изображено на фиг. 16. Общая проницаемость кислорода каждого мешка вливания согласно настоящему изобретению составляет 0,0025 см3 за 24 ч при комнатной температуре.
Пример 7
Улучшение оксигенации
(7а) Улучшение оксигенации в нормальной ткани
Проведены некоторые исследования касательно оксигенации нормальной ткани посредством теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина (показаны на фиг. 7). Сравнительное фармако-кинетическое и фармакодинамическое исследование проведено на крысах "buffalo". Инбредным самцам "buffalo" индивидуально вводится 0,2 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного раствора гемоглобина или ацетатного буфера Рингера (контрольная группа) через вену полового органа крыс посредством инъекции ударной дозы вещества. Профиль концентрации-времени плазмы гемоглобина определяется посредством фотометра Hemacue(tm) за 1, 6, 24, 48 ч и сравнивается с показанием основной линии. Способы основаны на фотометрическом измерении гемоглобина, где концентрация гемоглобина непосредственно считывается как г/дл. Парциальное давление кислорода (pO2) непосредственно измеряется при помощи устройства контроля оксигенации ткани и температуры Oxylab(tm) (Oxford Optronox Limited) в мышце задней конечности крыс "buffalo". Крысы анестезируются посредством внутрибрюшинно-го введения 30-50 мг/кг раствора пентобарбитона, а затем вводится кислородный датчик в мышцу. Все показания pO2 регистрируются системой сбора данных Datatrax2 (World Precision Instrument) в режиме
реального времени. Результаты демонстрируют, что после внутривенного введения 0,2 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина, среднее значение pO2 увеличивается от основной линии почти до двухкратного относительного среднего значения парциального давления кислорода в течение 15 мин и длится 6 ч. Более того, в среднем уровень кислорода по-прежнему сохраняется на 2530% выше базового значения через 24-48 ч после вливания (фиг. 7В).
(7b) Значительное улучшение оксигенации в крайне гипоксической опухолевой области Улучшение оксигенации в крайне гипоксической опухолевой области оценивается посредством модели ксенотрансплантата плоскоклеточного рака головы и шеи человека (HNSCC). Гипофарингеальный плоскоклеточный рак (клеточная линия FaDu) получен из американской коллекции типовых культур. Примерно 1 х 106 раковых клеток вводятся подкожно четырех-шестинедельным инбредным (голым) мышам BALB/c AnN-nu. Когда ксенотрансплантат опухоли достигает диаметра 8-10 мм, парциальное давление кислорода (pO2) в опухолевой массе непосредственно контролируется устройством контроля оксигенации ткани и температуры Oxylab(tm) (Oxford Optronox Limited). Все показания pO2 регистрируются системой сбора данных Datatrax2 (World Precision Instrument) в режиме реального времени. Когда показание pO2 стабилизируется, 0,2 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного раствора гемоглобина вводится внутривенно через хвостовую вену мышей и измеряется оксигенация ткани. Результаты демонстрируют, что после внутривенного введения 0,2 г/кг упомянутого теплостойкого перекрест-носшитого тетрамерного гемоглобина, наблюдается существенное более чем 6,5- и 5-кратное увеличение среднего значения pO2 в течение 3 и 6 ч соответственно (фиг. 8). Пример 8
Исследования, касающиеся лечения раковых заболеваний: значительное сокращение опухоли при раке носоглотки
Значительное сокращение опухоли наблюдается после введения теплостойкого перекрестносшито-го тетрамерного раствора гемоглобина в сочетании с рентгеновским облучением (фиг. 9А). Используется модель ксенотрансплантата рака носоглотки человека. Примерно 1 х 106 раковых клеток (клеточная линия CNE2) вводятся подкожно четырех-шестинедельным инбредным (голым) мышам BALB/c AnN-nu. Когда ксенотрансплантат опухоли достигает диаметра 8-10 мм, мыши с опухолью рандомизируются на три группы, как указано ниже:
группа 1: ацетатный буфер Рингера (Ctrl),
группа 2: ацетатный буфер Рингера + рентгеновское облучение (2Gy),
группа 3: теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин + рентгеновское облучение
(2Gy+Hb).
"Голые" мыши с ксенотрансплантатами CNE2 облучаются только рентгеновскими лучами (группа 2) или в сочетании с теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином (группа 3). Для облучения рентгеновскими лучами (группы 2 и 3) мышей анестезируют посредством внутрибрюшинного введения 50 мг/кг раствора пентобарбитона. Ксенотрансплантат мышей с опухолью облучается рентгеновскими лучами дозой 2 грэя посредством системы линейного ускорителя (Varian Medical Systems). Для группы 3, 1,2 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина вводится внутривенно через хвостовую вену мышей до облучения рентгеновскими лучами. Размеры опухоли и массы тела регистрируются каждый последующий день, начиная с первого дня лечения. Массы опухоли рассчитываются при помощи уравнения 1/2LW2, где L и W представляют длину и ширину опухолевой массы, которая измеряется посредством штангенциркуля с цифровой индикацией (Mitutoyo Co, Токио, Япония) при каждом измерении. Группа 1 представляет собой контрольную группу, которая не подвергается лечению. Результаты (показаны на фиг. 9) демонстрируют, что значительное сокращение ксенотрансплантата CNE2 наблюдается в мышах, которых лечили теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным раствором гемоглобина в сочетании с облучением рентгеновскими лучами (группа 3, фиг. 9А).
Пример 9
Исследования, касающиеся лечения раковых заболеваний: значительное сокращение опухоли печени
Более того, значительное сокращение опухоли наблюдается после введения теплостойкого перекре-стносшитого тетрамерного раствора гемоглобина в сочетании с цисплатином (фиг. 9В). Используется модель ортотопического рака печени крысы. Примерно 2 х 106 раковых клеток печени крысы помеченных люциферазным геном (CRL1601-Luc) вводятся в левую долю печени крысы "buffalo". Рост опухоли контролируется посредством системы формирования изображений in vivo Xenogen. Через две-три недели после введения опухолевая ткань собирается, разрезается на маленькие части и ортотопически имплантируется в левую долю печени второй группы крыс. Крысы с опухолью печени рандомизируются на три группы, как указано ниже:
группа 1: ацетатный буфер Рингера (Control),
группа 2: ацетатный буфер Рингера + цисплатин (Cisplatin),
группа 3: теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин + цисплатин (Cisplatin+Hb). Крысы с имплантированной опухолевой тканью печени лечились только 3 мг/кг цисплатина (груп
па 2) или в сочетании с теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином (группа 3). В группах 2 и 3 крысы анестезируются посредством внутрибрюшинного введения 30-50 мг/кг раствора пентобарбитона и цисплатина, которые вводятся через левую воротную вену. Для группы 3 0,4 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина вводится внутривенно через вену полового органа крысы до лечения цисплатином. Группа 1 представляет собой контрольную группу, которая не подвергается лечению. Важно, что значительное сокращение опухоли печени наблюдается через 3 недели после лечения (фиг. 9В). Пример 10
Лечение острого геморрагического шока у крыс
Теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин также используется в качестве реанимирующего средства в модели острого геморрагического шока у крыс. 50 крыс Sprague-Dawley в случайном порядке разделяются на 3 группы согласно реанимирующим средствам, по 16-18 крыс в каждой группе.
Группа 1: лактатный раствор Рингера (отрицательный контроль, 16 крыс), группа 2: аутологичная кровь животных (положительный контроль, 16 крыс),
группа 3: теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин (0,5 г Hb/кг массы тела, 18 крыс).
Острый геморрагический шок наступает при потере 50% цельной крови животного, которая составляет 7,4% массы тела. После установления геморрагического шока в течение 10 мин, животным вливается лактатный раствор Рингера, аутологичная кровь животных или 0,5 г Hb/кг теплостойкого перекрест-носшитого тетрамерного гемоглобина. Скорость вливания теплостойкого перекрестносшитого тетрамер-ного гемоглобина устанавливается 5 мл/ч, затем все подопытные животные наблюдаются в течение 24 ч. Панель параметров наблюдается и анализируется в течение периода исследования, включая выживание, гемодинамику, миокардиальную механику, минутный объем сердца, сердечную деятельность, газ крови, снабжение ткани кислородом и поглощение, тканевую перфузию и давление кислорода (печень, почка и мозг), деятельность печени и почек, реологию крови (вязкость крови) и контрольную митохондриальную респираторную интенсивность (печень, почки и мозг). Более того, выживаемость является основной конечной точкой. Через 24 ч наблюдения у группы с введенным теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином уровень выживаемости намного выше по сравнению с группой с введенным лактатным раствором Рингера или группой отрицательного контроля, а также группой с аутологичной кровью (показано в нижеприведенной табл. 8).
г Количество выживших Суточный уровень
ру через сутки выживаемости (%)
Отрицательный контроль 3 из 16 крыс 18,8
Аутологичная кровь крыс 10 из 16 крыс 62,5
0,5гНЬ/кг 13 из 18 крыс 72,0
*Hb = теплостойкий перекрестносшитый тетрамерный гемоглобин
Пример 11
Способ предупреждения послеоперационного рецидива опухоли печени и метастаза Хирургическая резекция опухолей печени является передовым лечением рака печени. Однако послеоперационный рецидив и метастаз рака остаются главным атрибутом неблагоприятного прогноза для данных пациентов. Например, в проводимых раннее исследованиях сообщалось, что резекция печени ассоциируется с 5-летним уровнем выживаемости 50%, но также с 70% частотой рецидивов. Последующие исследования на пациентах с печеночно-клеточным раком (НСС) также показывают, что экстрагепа-тические метастазы от первичного НСС были обнаружены примерно у 15% пациентов с НСС, в чьих легких часто встречаются экстрагепатические метастазы. Предполагается, что хирургический стресс, особенно ишемическое/реперфузное повреждение (IR), применяемое во время операции на печени, является основной причиной развития опухоли. Обычно контроль печеночных вен широко используется хирургами с целью предупреждения обширного кровотечения во время гепатэктомии. Например, приточная окклюзия посредством зажима портальной триады (маневр Принта) использовалась с целью сведения к минимуму потери крови и снижению необходимости периоперационных переливаний. Недавнее японское исследование показывает, что 25% хирургов применяют маневр Принта на постоянной основе. Однако маневр Принта вызывает разные степени ишемического повреждения у остающейся печени и связан с рецидивом рака и метастазом.
Связь IR повреждения и развития опухоли также подтверждается ранее проведенными исследованиями на животных. Во-первых, эффект IR повреждения и резекции печени на рецидиве рака печени и метастазе был продемонстрирован в последнем исследовании с моделью ортотопического рака печени. IR повреждение печени и гепатэктомия привели к заметному рецидиву и метастазу опухолей печени. Похожие результаты были получены в мышах с модельным метастазом колоректального рака в печени,
Таблица 8
где причинение IR повреждения ускоряет рост метастаза колоректального рака в печени.
Ранее было изучено несколько защитных стратегий для использования с целью снижения повреждения IR во время резекции. Например, применение короткопериодической ишемии до пролонгированного зажима известной, как ишемическая предварительная подготовка (IP), было предложено для запуска печеночно-клеточных защитных механизмов, и использовалась для снижения IR повреждения во время резекции печени. Другие применяют процедуры прерывистого зажимания (IC), при которых за циклами притока к зоне окклюзии следует реперфузия. Оба способа считались эффективными в защите против послеоперационного повреждения печени у нецирротических пациентов, переносящих "большую" операцию на печени. Однако исследования на животных также показывают, что IP не способна защищать печень от ускоренного роста опухоли, вызываемого IR повреждением. Более того, в некоторых группах использовались антиоксиданты такие, как а-токоферол и аскорбиновая кислота с целью защиты печени от IR повреждения, предупреждая тем самым метастаз печени. Тем не менее, оба антиоксиданта оказались неспособными ограничить рост внутрипеченочной опухоли, стимулированной IR.
Механистически, разные данные предполагают, что гипоксия связана с рецидивом опухоли и метастазом по ряду причин: (1) исследования показывают, что гипоксическая опухоль является более устойчивой к лучевой терапии и химиотерапии, опухолевые клетки, которые выживают в ходе лечения склонны рецидивировать, клинические данные также предполагают, что пациенты с более гипоксическими опухолевыми зонами имеют более высокий показатель метастаза; (2) при гипоксическом условии, раковые клетки становятся более агрессивными при активации гипоксии-индуцированного фактора-1 (HIF-1). Это, в свою очередь, запускает комплементарные реакции, включающие про-ангиогенный фактор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и рецепторы такие, как c-Met и CXCR4, которые усиливают клеточную подвижность и хоминг к определенным, отдаленным органам; (3) последние исследования также демонстрируют, что циркулирующие раковые клетки (CTCs) становятся более агрессивными при гипок-сическом условии. Циркулирующие опухолевые клетки, обнаруженные в периферийной крови пациентов с раковыми заболеваниями, являются индексом агрессии заболевания у пациентов с отдаленным метастазом, тогда как гипоксия активирует более агрессивный фенотип данных клеток и ослабляет апопти-ческий потенциал. В особенности, стволовые клетки рака, которые являются более радиорезистентными, были обогащены при сниженном уровне кислорода в опухоли мозга.
Следовательно, в свете вышеописанных наблюдений и исследований, неполимерный перекрест-носшитый тетрамерный гемоглобин согласно настоящему изобретению используется для предупреждения послеоперационного рецидива опухоли печени и метастаза после резекции печени. Создается модель ортотопического рака печени крысы. Клеточная линия печеночно-клеточного рака (клетки McA-RH7777) используется для создания модели ортотопического рака печени у крыс "Buffalo" (самцы, 300-350 г). Фиг. 17 показывает схематический чертеж, суммирующий хирургические операции и процедуры применения гемоглобинового продукта. Клетки McA-RH7777 (3 х 105/100 мкл) вводятся в печеночную капсулу крысы "buffalo" с целью индуцирования твердого роста опухоли. Через две недели (когда объем опухоли достигает примерно 10 х 10 мм), опухолевая ткань собирается и разрезается на кубики 1-2 мм3 и имплантируется в левые доли печени новой группе крыс "buffalo". Через две недели после имплантации ортотопической опухоли печени крысы подвергаются резекции печени (левая доля с опухолью печени) и частичному гепатическому IR повреждению (30 мин ишемии на правой доле).
Две группы крыс с имплантированной тканью опухоли используются для сравнения рецидива опухоли и метастазов. В группе 1 крыс анестезируют пентобарбиталом и вводят внутривенно 0,2 г/кг неполимерного теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина настоящего изобретения за 1 ч до ишемии. Ишемия проводится на правой доле печени посредством зажимания правых ветвей воротной вены печени и печеночной артерии кровоостанавливающим зажимом "бульдог". Затем осуществляется перевязка в левой доле печени, за которой проводится резекция левой доли печени с опухолью печени. Через 30 мин после ишемии дополнительно вводится 0,2 г/кг теплостойкого перекрестносшитого тетра-мерного гемоглобина через нижнюю полую вену, а затем проводится реперфузия. В группе 2 ацетатный буфер Рингера вводится в качестве контрольного средства по той же процедуре. Все крысы умерщвляются через 4 недели после процедур гепатэктомии.
Для изучения роста опухоли и метастаза через 4 недели после ишемии/реперфузии и процедур ге-патэктомии образец печени и легких крыс Buffalo берется для морфологического исследования. Ткань собирается, заделывается парафильмом и разрезается, а затем окрашивается гематоксилином и эозином (Н &Е). Локальный рецидив/метастаз (внутрипеченочный) и отдаленный метастаз (легкие) подтверждаются посредством гистологического исследования. Наблюдения подытожены в табл. 9.
Для изучения защитного эффекта неполимерного теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина на рецидиве опухоли печени и метастазе все крысы умерщвляются через 4 недели после гепатэктомии и IR процедур. Собираются ткани легкого и печени. Рецидив опухоли печени/метастаза и отдаленного метастаза в легких сравниваются в двух группах. Результаты показывают, что лечение гемоглобином снижает возникновение рецидива и метастаза в двух органах.
На фиг. 18 представлены репрезентативные примеры рецидива внутрипеченочного рака печени и метастаза, а также отдаленного метастаза легкого, индуцированных у крыс группы с IR повреждением после гепатэктомии и процедур ишемии/реперфузии и защиту против них при использовании изобретенного теплостойкого перекрестносшитого тетрамерного гемоглобина. На фиг. 18А наблюдается рецидив обширного внутрипеченочного рака печени/метастаза в группе с IR повреждением. Отдаленный метастаз легкого также наблюдается у той же крысы (указан сплошной стрелкой). На фиг. 18В наблюдается другой случай рецидива внутрипеченочного рака печени/метастаза в группе с IR повреждением (указан пунктирной стрелкой). Обширный метастаз легкого наблюдается в этом же случае (указан сплошной стрелкой). Для сравнения на фиг. 18С показан репрезентативный пример защиты от рецидива внутрипе-ченочного рака печени/метастаза и отдаленного метастаза на крысе, которую лечили изобретенным теплоустойчивым перекрестносшитым тетрамерным гемоглобином.
На фиг. 19 показано гистологическое исследование двух групп через четыре недели после резекции печени и процедур IR повреждения. Гистологическое исследование (окрашивание Н &Е) тканей печени и легкого в группах с IR повреждением и лечением гемоглобином проводится с целью подтверждения идентичности опухолевых узлов. Показаны репрезентативные области, показывающие внутрипеченоч-ный рецидив/метастаз в группах с лечением гемоглобином (Т3) и IR повреждением (Т1 и Т2). Гистологическое исследование, показывающее нормальное строение печени в группе с лечением, включено для сравнения (N1). Более того, отдаленный метастаз в легких обнаружен у той же крысы в группе с IR повреждением (М). Ткань легкого без метастаза показана в группе с лечением (N2) для сравнения.
В результате исследования был сделан вывод, что лечение неполимерным теплоустойчивым пере-крестносшитым тетрамерным гемоглобином полученным в соответствии с настоящим изобретением оказывает профилактическое воздействие на рецидив опухолей печени и метастаз в других органах.
Несмотря на то что вышеизложенное изобретение было описано с учетом разных вариантов выполнений, такие варианты выполнения не являются ограничительными. Многочисленные вариации и модификации будут понятны специалистам, обладающим обычными познаниями в данной области техники. Такие вариации и модификации считаются включенными в объем нижеприведенной формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, который включает в себя гемоглобин, состоящий из неполимерного, перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, включающий:
a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму;
b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих;
c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с целью получения отфильтрованной фракции эритроцитов;
d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с целью удаления примесей белка из плазмы, с целью получения промытых эритроцитов;
e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение 2-30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч;
f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из ли-зата с получением первого раствора гемоглобина;
g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина;
h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка;
i) проведение второго процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтра-
ции, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих молекулярную массу меньше, чем у гемо-
глобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина;
j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, а-а субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетра-мерным гемоглобином;
k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;
l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока;
m) термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированно-го гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, где термообработку проводят согласно процессу "высокая температура - короткое время" при температуре от 70 до 95°С в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением;
n) добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% немедленно после охлаждения термообра
ботанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина или добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% до термообработки перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с последующим немедленным охлаждением термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина;
0) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью соз-
дания чистого раствора и
р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.
2. Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.
3. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей высоко-очищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором колоночная хроматография проводится с использованием одной или нескольких катионообменных колонок или анионообменных колонок.
4. Способ приготовления фармацевтической композиции, содержащей высокоочищенный и теплостойкий переносчик кислорода по п.3, в котором хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько DEAE колонок, СМ колонок и/или гидроксиапатитовых колонок.
5. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.1, в котором фармацевтически приемлемым носителем является физиологический буфер или вода.
6. Высокоочищенная фармацевтическая композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.1.
7. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, включающей в себя гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, способ содержит:
a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму;
b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих;
c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с получением отфильтрованной фракции эритроцитов;
d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с удалением примесей белка из плазмы для получения промытых эритроцитов;
e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение 2-30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч;
f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из ли-зата и получение первого раствора гемоглобина;
g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с получением второго раствора гемоглобина;
h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка;
1) проведение второго процесса ультрафильтрации при использовании фильтра для ультрафильтра-
ции, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем у ге-
моглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина;
j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, а-а субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином;
k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;
l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока;
m) термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина при температуре примерно от 90 до 95°С с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабили-зированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию диме-ра и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, термообработку проводят в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением до температуры примерно 25°С;
n) добавление N-ацетилцистеина в количестве от 0,2 до 0,4% немедленно после охлаждения термо-обработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина или добавление N-ацетилцистеина в количестве 0,2-0,4% до термообработки перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с последующим немедленным охлаждением термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина;
0) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с целью соз-
дания чистого раствора и
р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.
8. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором термообработка проводится в дезоксигенированной среде.
9. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.
10. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.7, в котором колоночную хроматографию проводят с одной или несколькими катионообменными колонками или анионообменными колонками.
11. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.10, в котором хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько DEAE колонок, СМ колонок и/или гидроксиапатитовых колонок.
12. Фармацевтическая высокоочищенная композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, полученного посредством процесса по п.7.
13. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода, включающей в себя гемоглобин, состоящий главным образом из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, включающий:
a) использование цельной крови млекопитающих, включающей в себя, по меньшей мере, эритроциты и плазму;
b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающих;
c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы с целью получения отфильтрованной фракции эритроцитов;
d) промывание отфильтрованной фракции эритроцитов с целью удаления примесей белка из плазмы, с целью получения промытых эритроцитов;
e) разрушение промытых эритроцитов посредством точного и контролируемого гипотонического лизиса в течение от 2 до 30 с или в течение иного периода времени, достаточного для лизирования эритроцитов в устройстве мгновенного цитолиза, с целью создания раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов при скорости потока 50-1000 л/ч;
f) проведение фильтрации с целью удаления по меньшей мере части отработанного ретентата из ли-
зата;
g) проведение первого процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтрации, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих более высокую молекулярную массу, чем гемоглобин, для дополнительного удаления любых вирусов и остаточного отработанного ретентата из первого раствора гемоглобина с целью получения второго раствора гемоглобина;
h) проведение проточной колоночной хроматографии на очищенном растворе гемоглобина с целью удаления примесей белка;
1) проведение второго процесса ультрафильтрации с использованием фильтра для ультрафильтра-
ции, сконфигурированного для удаления примесей, имеющих меньшую молекулярную массу, чем у ге-
моглобина, и концентрации очищенного раствора гемоглобина;
j) перекрестное сшивание, по меньшей мере, а-а субъединиц гемоглобина посредством бис-3,5-дибромсалицил фумарата для образования перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, в которой перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетра-мерным гемоглобином;
k) замену пригодного физиологического буфера для перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;
l) удаление любых остаточных химических веществ посредством тангенциальной фильтрации потока;
m) добавление N-ацетилцистеина к перекрестно-сшитому тетрамерному гемоглобину и термообработку перекрестно-сшитого гемоглобина при температуре от 70 до 95°С в дезоксигенированной среде с целью денатурирования и осаждения любого остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабили-зированного гемоглобина (димера) и любых других примесей белка, таким образом, чтобы полученный теплостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин имел необнаружимую концентрацию диме
ра и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, термообработку проводят в течение от 30 с до 3 ч с последующим незамедлительным охлаждением до температуры 25°С;
n) добавление N-ацетилцистеина в количестве приблизительно 0,2-0,4% незамедлительно после охлаждения термообработанного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с целью поддержания низкого уровня метгемоглобина;
о) удаление осадка посредством центрифугирования или фильтрационного устройства с получением чистого раствора и
р) добавление очищенного и теплостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина в фармацевтически приемлемый носитель.
14. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.13, в котором количество добавления N-ацетилцистеина до термообработки составляет примерно 0,2%.
15. Способ приготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей теплостойкий переносчик кислорода по п.13, в котором цельной кровью является человеческая, бычья, свиная, собачья или лошадиная цельная кровь.
16. Фармацевтическая высокоочищенная композиция, содержащая теплостойкий переносчик кислорода, содержащий гемоглобин, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного ге-моглобина, полученного посредством процесса по п. 13.
АЛЬФА-ЦЕПОЧКА ГЕМОГЛОБИНА
B-VLSA4DKG^M H MVLSB*KnWKAW*VGAHAGE^
C-VLSPADKnjKSlWDKIGGHfl^
P-VLSAADKAEM E^^/lSftADKTOVKA^WSK\ЛЗGHAGEreAEA^
В LSaSOWAHKUWCTWKUSHSaVTlASHIJ^^ 141
H LSALSTXHAHKU^MPVNFKllSHCLLVR 142
P LSlCSrXiVWRVDPVDFiaLSHCUSr^ 141
E imSXHWKLRM*Mm^ БЕТА-ЦЕПОЧКА ГЕМОГЛОБИНА
В M-LTAEEKAAVTAR/VGKVKVDE\^GEALGRLLW^ 78
H MVHLTPEEKSftOTAIWSKVTMEVre^
PMVHLSAEEKEAVLOVUSKWVre^
EMVCiSGBWVlAMa В [XJ"ЗTFA4LSELMЯKШ\/OPE^Щ±G^^^^ 145
H NLKCTrmSBJCOKUHVDPB^^ 147
P NU E^ШTrEW?ELKXIKШ\/DPE^FPЛ.(3^ 147
Фиг. 1
О 2 4 6 8 10 12 14 Количество дней после лечения
Фиг. 9А
Рак печени
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023689
023689
- 1 -
- 1 -
023689
023689
- 1 -
- 1 -
023689
023689
- 4 -
- 3 -
023689
023689
- 9 -
023689
023689
- 12 -
- 12 -
023689
023689
- 16 -
- 16 -
023689
023689
- 19 -
- 19 -
023689
023689
- 21 -
- 22
023689
023689
- 23 -
- 22
023689
023689
- 24 -
- 24 -
023689
023689
- 25 -
- 25 -
023689
023689
- 25 -
- 25 -