[**]

1. Способ радиационной терапии для нарушения, изменения или разрушения доброкачественных, предраковых или злокачественных человеческих клеток у субъекта, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей наночастицы и фармацевтически приемлемый эксципиент, субъекту и воздействие на клетки ионизирующих излучений, где наночастицы являются частицами металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от 80 до 105 нм, и где данные наночастицы покрыты биосовместимым покрытием.

2. Способ по п.1, где биосовместимым покрытием является небиоразлагаемое покрытие, выбранное из группы, состоящей из оксида кремния, оксида алюминия, сахара, фосфата, силана, тиола, цвиттерионного соединения, липида, насыщенного углеродного полимера и неорганического полимера, или биоразлагаемое покрытие, выбранное из группы, состоящей из биологического полимера, фосфолипида, сахарида, олигосахарида и полисахарида.

3. Способ по п.1 или 2, в котором металл выбран из золота (Au), серебра (Ag), платины (Pt), палладия (Pd), олова (Sn), циркония (Zr), железа (Fe).

4. Способ по п.3, в котором композиция содержит от примерно 10 ^-6 до 10 ^-3 наномоль металла на клетку-мишень.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором металлическая наночастица имеет сферическую или яйцевидную форму.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором указанные ионизирующие излучения выбраны из группы, состоящей из рентгеновского излучения, γ-излучения, пучков электронов и излучений радиоактивных изотопов.

7. Способ по п.6, в котором энергия ионизирующих излучений находится в диапазоне от примерно 50 до примерно 12000 кэВ.

8. Способ по п.6, в котором энергия рентгеновских излучений находится в диапазоне от примерно 50 до 6000 кэВ.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором указанные злокачественные клетки человека являются клетками солидной опухоли.

10. Фармацевтическая композиция, предназначенная для изменения или разрушения клеток-мишеней у человека, когда указанные клетки подвергаются воздействию ионизирующих излучений, указанная фармацевтическая композиция включает совокупность металлических наночастиц и фармацевтически приемлемый наполнитель, где данные наночастицы изготовлены из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ радиационной терапии для нарушения, изменения или разрушения доброкачественных, предраковых или злокачественных человеческих клеток у субъекта, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей наночастицы и фармацевтически приемлемый эксципиент, субъекту и воздействие на клетки ионизирующих излучений, где наночастицы являются частицами металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от 80 до 105 нм, и где данные наночастицы покрыты биосовместимым покрытием.

2. Способ по п.1, где биосовместимым покрытием является небиоразлагаемое покрытие, выбранное из группы, состоящей из оксида кремния, оксида алюминия, сахара, фосфата, силана, тиола, цвиттерионного соединения, липида, насыщенного углеродного полимера и неорганического полимера, или биоразлагаемое покрытие, выбранное из группы, состоящей из биологического полимера, фосфолипида, сахарида, олигосахарида и полисахарида.

3. Способ по п.1 или 2, в котором металл выбран из золота (Au), серебра (Ag), платины (Pt), палладия (Pd), олова (Sn), циркония (Zr), железа (Fe).

4. Способ по п.3, в котором композиция содержит от примерно 10 ^-6 до 10 ^-3 наномоль металла на клетку-мишень.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором металлическая наночастица имеет сферическую или яйцевидную форму.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором указанные ионизирующие излучения выбраны из группы, состоящей из рентгеновского излучения, γ-излучения, пучков электронов и излучений радиоактивных изотопов.

7. Способ по п.6, в котором энергия ионизирующих излучений находится в диапазоне от примерно 50 до примерно 12000 кэВ.

8. Способ по п.6, в котором энергия рентгеновских излучений находится в диапазоне от примерно 50 до 6000 кэВ.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором указанные злокачественные клетки человека являются клетками солидной опухоли.

10. Фармацевтическая композиция, предназначенная для изменения или разрушения клеток-мишеней у человека, когда указанные клетки подвергаются воздействию ионизирующих излучений, указанная фармацевтическая композиция включает совокупность металлических наночастиц и фармацевтически приемлемый наполнитель, где данные наночастицы изготовлены из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм.

---

Евразийское 020942 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2015.02.27
(21) Номер заявки 201270154
(22) Дата подачи заявки 2010.07.09
(51) Int. Cl. A61K41/00 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)
(54) МЕТАЛЛИЧЕСКИЕ НАНОЧАСТИЦЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 09165157.0; 61/224,576
(32) 2009.07.10
(33) EP; US (43) 2012.07.30
(86) PCT/EP2010/059871
(87) WO 2011/003999 2011.01.13
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НАНОБИОТИКС (FR)
(72) Изобретатель:
Леви Лоран, Поттье Аньес, Пуль Лоранс, Маджиорелла Лоранс (FR)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) BRUN E. ET AL.: "Parameters governing gold nanoparticle X-ray radiosensitization of DNA in solution", COLLOIDS AND SURFACES. B, BIOINTERFACES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 72, no. 1, 5 April 2009 (2009-04-05), pages 128-134, XP026160236, ISSN: 0927-7765 [retrieved on 2009-04-05], published online 5 April 2009 * abstract, figure 4, page 133, section 3.3.4 Perspectives for therapy
US-A1-2004181114
ZHANG S. X. ET AL.: "Quantifying tumor-selective radiation dose enhancements using gold nanoparticles: A monte carlo simulation study", BIOMEDICAL MICRODEVICES 2009 KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS USA, vol. 11, no.
4, 21 April 2009 (2009-04-21), pages 925-933,
XP002548125, ISSN: 1387-2176, published online 21 April 2009 * abstract, page 926, column 2
(57) Настоящее изобретение относится к активируемым наночастицам, которые могут использоваться в области здравоохранения, в частности в области здравоохранения человека, для того чтобы нарушать, изменять или разрушать клетки-мишени, ткани или органы. В особенности данное изобретение относится к наночастицам, которые могут оказывать значительно эффективное терапевтическое действие, когда подвергаются воздействию ионизирующих излучений. Наночастица настоящего изобретения является металлической наночастицой, самый большой размер которой находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм, из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим совокупность вышеуказанных наночастиц, а также к их применению.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к активируемым наночастицам, которые могут использоваться в области здравоохранения, в частности в области здравоохранения человека, для того чтобы нарушать, изменять или разрушать клетки-мишени, ткани или органы. В особенности данная заявка относится к наночастицам, которые оказывают неожиданно эффективное терапевтическое действие, когда подвергаются воздействию ионизирующих излучений, таких как рентгеновское излучение, у-излучение, радиоактивные изотопы и/или пучки электронов. Наночастица настоящего изобретения является металлической наночастицей, самый большой размер которой находится в диапазоне от примерно 80 до примерно 105 нм, из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим совокупность вышеуказанных наночастиц, а также к их применению.
Уровень техники
Различные виды излучений, такие как рентгеновское излучение, гамма-излучение, УФ-излучение, лазерные лучи, пучки электронов, а также пучки частиц, например нейтронов и протонов, использовались для лечения онкологических заболеваний. Некоторые из упомянутых излучений использовались для этой цели в сочетании с радиационно-чувствительными молекулами. Электромагнитное и ионизирующее излучения в действительности способны, в частности, вызывать разрывы молекулы ДНК в клетке, тем самым, убивая клетки и/или предотвращая рост и деление этих клеток. Этот эффект обусловлен, главным образом, косвенными повреждениями, вызываемыми, в частности, электронами и/или фотонами высокой энергии, испускаемыми после ионизации, которая является причиной образования свободных радикалов.
Термин "ионизирующее излучение" относится к частицам или волнам высокой энергии, которые могут ионизировать атом или молекулу. Ионизирующая способность зависит от энергии отдельных частиц или волн, а не от их количества. Большой поток частиц или волн, в большинстве случаев, не будет вызывать ионизацию, если отдельные частицы или волны не обладают достаточной энергией. Обычно ионизирующим излучением является излучение, энергия которого больше 2 кэВ.
Радиосенсибилизация наночастицами золота (НЧЗ) была определена как перспективный подход для повышения качества лучевой терапии.
В патенте США № 6955639 (Hainfeld et al.) описывается способ повышения эффективности воздействия рентгеновского излучения с использованием наночастиц металла, в частности золота, с размером (диаметром) металлического ядра предпочтительно, по соображениям биораспределения, находящимся в диапазоне от 0,8 до 20 нм, более предпочтительно от 0,8 до 3 нм.
В работе Herold et al. (Int. J. Rad. Biol. 76 (2000) 1357) указывается на то, что наночастицы золота небольшого размера (~2 нм) должны распределяться более равномерно по всей массе опухоли.
Было показано преимущественное проникновение и накопление НЧЗ диаметром 50 нм в клетках HeLa (Chithrani et al. (Nano Lett. 6 (2006) 662; Nano Lett. 7 (2007) 1542).
На мышиной модели меланомы было показано, что применение НЧЗ диаметром 13 нм в сочетании с однократной дозой 25 Гр от пучка электронов 6 МэВ приводило к более выраженному уменьшению объема опухоли по сравнению с контрольными группами (Chang et al. (Cancer Sci. 99 (2008) 1479).
В работе Zhang et al. (Biomed Microdevices (2009), 11: 925-933) приводятся данные компьютерного моделирования (имитационное моделирование методом Монте-Карло), подтверждающие, что наноча-стицы золота могут усиливать эффективную дозу облучения, но влияние размера наночастиц на это усиление дозы в данной работе не изучалось. В этом источнике дается ссылка на наночастицы диаметром 1,9 нм в контексте лучевой терапии (Hainfeld) (см. стр. 930, правая колонка), но не приводится никаких результатов, которые могут быть полезны для точного количественного определения коэффициента усиления дозы в биологической системе (см. Montenegro et al., J. Phys. Chem. A. 2009, 113, 12364-12369: "Monte Carlo Simulations and Atomic Calculations for Auger Processes in Biomedical Nanotheranostics"), в частности в организме человека.
Авторы настоящего изобретения предлагают сильнодействующие наночастицы, которые при воздействии на них ионизирующих излучений неожиданно оказались способны обеспечивать более эффективное нарушение, изменение или разрушение клеток-мишеней in vitro, ex vivo и in vivo, по сравнению с наночастицами, известными из уровня техники, что показано в настоящей заявке.
Наночастица настоящего изобретения является металлической наночастицей, самый большой размер которой находится преимущественно в диапазоне от примерно 80 до примерно 105 нм, изготовленной из металла, предпочтительно имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25. Отличительные свойства описанных наночастиц не могли быть очевидны из уровня техники, в котором, в противоречии с настоящим изобретением, предлагается использовать наночастицы золота небольшого размера для того, чтобы повысить коэффициент усиления дозы [см., в частности, работу Brun et al. (Colloids and Surfaces B: interfaces, 72 (2009) 128-134: "Parameters governing gold nanoparticle X-ray radiosensitization"), где было показано влияние концентрации наночастиц золота]. Результаты, показанные на фиг. 4(В) в работе Brun et al., в частности, свидетельствуют о том, что коэффициент усиления дозы повышается, когда размер наночастиц золота уменьшается, для данной концентрации золота (содержание золота изменяется в
зависимости от радиуса наночастиц в соответствии с коэффициентом 3).
Для данной концентрации металла и данной способности поглощать ионизирующее излучение, описанные металлические наночастицы, у которых размер стандартной металлической наночастицы предпочтительно находится в диапазоне от примерно 80 до примерно 105 нм, обеспечивают повышение терапевтической эффективности (способности вызывать повреждения клеток-мишеней) по сравнению с наночастицами меньших размеров, в частности, по сравнению с наночастицами, имеющими размер 60 нм или менее.
Для данной концентрации металла и эквивалентного ослабления рентгеновского излучения на клеточном уровне, описанные металлические наночастицы обладают более сильной способностью убивать клетки и/или предотвращать их деление.
Еще одним характерным свойством, которым обладают описанные наночастицы, является их способность, когда они подвергаются воздействию ионизирующих излучений, оказывать терапевтическое действие при контакте с клетками-мишенями. Другими словами, терапевтический эффект, наблюдаемый при облучении, не требует поглощения клетками этих наночастиц. Это свойство впервые описывается в настоящей заявке.
В действительности до настоящего времени в данной области техники считалось, что поглощение клетками-мишенями необходимо для того, чтобы наночастицы могли вызывать эффективные летальные повреждения клеток при облучении (см., например, Kong et al. (Small 4 (2008) 1537)).
Таким образом, настоящее изобретение идет вразрез с существующим во всей данной области техники предубеждением, приводящим специалиста в этой области техники, главным образом, по соображениям биосовместимости, биораспределения и клеточного поглощения, к использованию для медицинских целей наночастиц с диаметром от примерно 1 до 20 нм, самое большее 60 нм, с особым и продолжительным интересом к наночастицам размером 50 нм (см., например, Chithrani et al. (2006) и Chang et al.
(2008)).
Кроме того, наночастицы настоящего изобретения успешно позволяют уменьшить количество металла, вводимого субъекту, а также снизить до минимума число этапов введения наночастиц при осуществлении полного протокола радиотерапевтического лечения, способствуя тем самым их переносимости субъектом.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что возможно нарушать, изменять или разрушать клетки-мишени, ткани или органы, в частности атипичные клетки или ткани, которые определены как доброкачественные клетки или ткани, или больные клетки или ткани, такие как предраковые или злокачественные клетки (раковые клетки) или ткани (опухоли), находящиеся на поверхности или в глубине тела, с неожиданно высокой эффективностью, используя наночастицу, изготовленную из металла, предпочтительно имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, наибольший размер указанной наноча-стицы находится в диапазоне от примерно 80 до примерно 105 нм.
Преимуществом настоящего изобретения является создание наночастиц, которые не являются токсичными сами по себе и могут безопасно использоваться в соответствующих условиях для функционального нарушения, изменения или разрушения клеток-мишеней у животного, предпочтительно у млекопитающего, еще более предпочтительно у человека. Желаемый терапевтический эффект наночастиц в действительности сильно зависит от их ионизации, указанная ионизация создается источником ионизирующего излучения, который сам преимущественно регулируется по качеству и количеству и используется направленным, т.е. локализованным способом специалистом в данной области техники.
Фактически, в настоящем изобретении описываются наночастицы, которые могут индуцировать нарушение, изменение или разрушение клеток in vitro, ex vivo или in vivo, при воздействии на указанные клетки ионизирующих излучений, таких как, в частности, рентгеновское излучение, гамма-излучение (у-излучение), радиоактивные изотопы, пучки ионов и/или пучки электронов.
Описанные наночастицы способны непосредственно взаимодействовать с поступающим излучением и производить неожиданно эффективное терапевтическое действие, при этом не является необходимым, чтобы наночастицы были интернализированы клетками-мишенями.
В соответствии с настоящим изобретением наночастицы могут быть покрыты биосовместимым покрытием, предпочтительно способствующим стабильности наночастиц в физиологических жидкостях, как далее описывается в материалах данной заявки.
Наночастицы настоящего изобретения могут применяться, если это целесообразно и желательно, направленным образом с использованием, например, поверхностного компонента, обеспечивающего специфично направленную доставку к биологическим тканям или клеткам. Однако они не требуют направляющих молекул, для того чтобы концентрироваться в клетках-мишенях или тканях.
В действительности, пассивное накопление наночастиц в массе опухоли, спустя некоторое время после их внутривенной инъекции (один возможный путь введения), происходит благодаря эффекту увеличенной проницаемости и задержания. Было замечено, что сосуды опухоли сильно отличаются от нормальных капилляров, и что проницаемость этих сосудов способствует избирательной экстравазации на-ночастиц, несвойственной для нормальных тканей. Отсутствие эффективного лимфодренажа опухоли
мешает выведению проникших наночастиц и способствует их накоплению. Таким образом, наночастицы настоящего изобретения могут успешно избирательно проникать в первичные, а также в метастатические опухоли после внутривенного введения.
Наночастицы настоящего изобретения также с успехом можно вводить внутриопухолевым или внутриартериальным способом.
Поэтому объектом настоящего изобретения является применение наночастицы настоящего изобретения или совокупности этих наночастиц, для того чтобы изменять или разрушать клетку-мишень ткань или орган.
Описанные конкретные варианты осуществления изобретения относятся к применению совокупности металлических наночастиц для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для нарушения, изменения или разрушения клеток-мишеней млекопитающих, когда указанные клетки подвергаются воздействию ионизирующих излучений, где данные наночастицы изготовлены из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм, и к соответствующим способам лечения.
Продукты в соответствии с настоящим изобретением, а именно наночастица и совокупность металлических наночастиц для применения при лечении рака, в частности, раскрыты в настоящем описании.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтической композиции, в частности, как будет очевидно из всего описания, к фармацевтической композиции, предназначенной для нарушения, изменения или разрушения клеток-мишеней у млекопитающего, когда указанные клетки подвергаются воздействию ионизирующих излучений, указанная фармацевтическая композиция включает совокупность металлических наночастиц, как они здесь определены, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, где данные наночастицы изготовлены из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм.
Еще один вариант осуществления изобретения относится к применению наночастицы, совокупности металлических наночастиц или композиции в соответствии с настоящим изобретением для предупреждения или лечения рака или для облегчения симптомов рака у животного, когда указанное животное подвергается воздействию излучений, в частности ионизирующих излучений, как определено здесь.
Настоящее раскрытие, в частности, включает способ предупреждения или лечения рака или облегчения симптомов рака у субъекта, который является животным, в частности млекопитающим, предпочтительно человеком, путем введения металлической наночастицы, совокупности металлических наноча-стиц или композиции, содержащей совокупность таких наночастиц, в соответствии с настоящим изобретением, субъекту, и воздействия на данного субъекта излучений, в частности ионизирующих излучений.
В другом аспекте настоящее раскрытие относится к наборам, включающим один или несколько описанных продуктов, т.е. наночастицы и композиции, вместе с этикеткой, содержащей инструкции по применению этого продукта(ов).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А и 1В.
На фиг. 1А показаны изображения наночастиц золота, описанных в табл. 1 (см. Пример 1), полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ).
На фиг. 1В показано распределение по размерам наночастиц золота (НЧЗ), описанных в табл. 1. Фиг. 2А и 2В.
Кристаллическая структура свежеприготовленной наночастицы золота, определенная с помощью электронной дифракции.
На фиг. 2А показана электронная дифрактограмма стандартных наночастиц (наночастицы золота с гранецентрированной кубической структурой используются в качестве стандарта, для того чтобы определить константу камеры (LA) трансмиссионного электронного микроскопа) и наночастиц золота (НЧЗ) из примера 1.
На фиг. 2В приведены данные индексирования электронной дифрактограммы наночастиц золота из примера 1, показывающие гранецентрированную кубическую (ГЦК) структуру этих наночастиц золота. Индексирование электронной дифрактограммы состоит из следующих этапов:
1) определение константы камеры из электронной дифрактограммы стандартных наночастиц;
2) измерение диаметра кольца (D1, D2, Dn) электронной дифрактограммы наночастиц золота из примера 1;
3) расчет dhkl, с использованием выражения dhkl = L*X/(Dn/2);
4) использование существующей базы данных структур для индексирования каждого кольца.
Фиг. 3A и 3B.
На фиг. 3A показана оценка клоногенной выживаемости с использованием клеток рака толстой кишки НТ29, облученных рентгеновским излучением с энергией пучка 200 кВ пикового напряжения, при отсутствии (отрицательный контроль), или в присутствии наночастиц золота с размером частицы 15 нм (GOLD-15 из примера 1) в количестве 12, 20 и 130 мкМ золота на клеточном уровне. Доза облучения варьирует от 0 (без облучения) до 4 Гр.
Отрицательный контроль с клетками НТ29: квадратные точки.
Наночастицы GOLD-15 в количестве 12 мкМ с клетками НТ29: крестообразные точки.
Наночастицы GOLD-15 в количестве 20 мкМ с клетками НТ29: треугольные точки.
Наночастицы GOLD-15 в количестве 130 мкМ с клетками НТ29: круглые точки.
На фиг. 3B показана оценка клоногенной выживаемости с использованием клеток рака толстой кишки НТ29, облученных рентгеновским излучением с энергией пучка 200 кВ пикового напряжения, при отсутствии (отрицательный контроль), или в присутствии наночастиц золота с размером частицы 80 нм (GOLD-80 из примера 1) в количестве 17, 52 и 119 мкМ золота на клеточном уровне. Доза облучения варьирует от 0 (без облучения) до 4 Гр.
Отрицательный контроль с клетками НТ29: квадратные точки.
Наночастицы GOLD-80 в количестве 17 мкМ с клетками НТ29: крестообразные точки. Наночастицы GOLD-80 в количестве 52 мкМ с клетками НТ29: треугольные точки. Наночастицы GOLD-80 в количестве 119 мкМ с клетками НТ29: круглые точки. Фиг. 4A и 4B.
Влияние размера наночастиц золота на коэффициент усиления дозы при одинаковой концентрации золота на клеточном уровне, также определяемой здесь как концентрация золота на клетку-мишень. Фиг. 4А.
Концентрация золота (Au) на клеточном уровне выражена в мкМ. Концентрация золота ниже 20 мкМ ([Au] <20 мкМ): крестообразные точки. Концентрация золота от 20 мкМ до 83 мкМ (20 мкМ <[Au] < 83 мкМ): ромбовидные точки. Концентрация золота от 95 мкМ до 148 мкМ (95 мкМ <[Au] < 148 мкМ): квадратные точки. Концентрация золота 400 мкМ ([Au]=400 мкМ): треугольные точки. Фиг. 4B.
Концентрация золота (Au) на клетку-мишень выражена следующим образом:
Клетка : Au=1 : X (X выражен в наномолях).
Клетка : Au <1 : 15х10-5: крестообразные точки.
1 : 20х10-5 <Клетка:Au <1 : 45х10-5: ромбовидные точки.
1 : 60х10-5 <Клетка:Au <1 : 110х10-5: квадратные точки.
Клетка : Au=1:182х10-5: треугольные точки.
Фиг. 5А и 5В.
На фиг. 5А показан пороговый эффект для наночастиц золота размером > 80 нм. Концентрация золота на клеточном уровне находилась между 20 мкМ и 83 мкМ.
Соответствующая концентрация золота на клетку-мишень составляла от 20х 10-5 наномоль до 45х 105 наномоль.
Были выявлены две кривые линейных тенденций со значительным различием между их соответствующими значениями наклона: наночастицам золота с размером от 15 нм до 60 нм соответствует кривая линейной тенденции с наклоном 0,0033. Наночастицам золота с размером от 80 нм до 105 нм соответствует кривая линейной тенденции с наклоном 0,0384. Отношение между этими значениями наклона, определенное для указанных двух кривых, составляет примерно 10. Пороговый эффект при оценке коэффициента усиления дозы, вызываемого размером металлических наночастиц, наблюдается когда указанный размер составляет примерно 8 0 нм или более.
На фиг. 5В показан пороговый эффект для наночастиц золота размером > 80 нм. Концентрация золота на клеточном уровне находилась между 95 мкМ и 148 мкМ.
Соответствующая концентрация золота на клетку-мишень составляла от 60х10-5 до 110х 10-5 нано-
моль.
Были выявлены две кривые линейных тенденций со значительным различием между их соответствующими значениями наклона: наночастицам золота с размером от 15 до 60 нм соответствует кривая линейной тенденции с наклоном 0,0025. Наночастицам золота с размером от 80 нм до 105 нм соответствует кривая линейной тенденции с наклоном 0,0865. Отношение между этими значениями наклона, определенное для указанных двух кривых, составляет примерно 30. Пороговый эффект при оценке коэффициента усиления дозы, вызываемого размером металлических наночастиц, наблюдается когда указанный размер составляет примерно 80 нм или более.
Фиг. 6А и 6В.
На фиг. 6А показано ослабление рентгеновского излучения в зависимости от концентрации золота для каждой наночастицы золота, описанной в примере 1, табл. 1.
Количество ЕдН в зависимости от [Au] (г/л) для GOLD-15: ромбовидные точки. Количество ЕдН в зависимости от [Au] (г/л) для GOLD-30: квадратные точки. Количество ЕдН в зависимости от [Au] (г/л) для GOLD-60: треугольные точки. Количество ЕдН в зависимости от [Au] (г/л) для GOLD-80: крестообразные точки. Количество ЕдН в зависимости от [Au] (г/л) для GOLD-105: + точки.
На фиг. 6В показано влияние размера наночастицы золота на ослабление рентгеновского излучения.
Значение наклона для каждого размера наночастицы золота получено с фиг. 6А и выражено как функция размера наночастицы золота. Фиг. 7А и 7В.
На фиг. 7А показана доля выживших при дозе облучения 4 Гр (ДВ4) клеток НТ29, инкубированных с наночастицами золота (GOLD-60 из примера 1) в течение менее чем 5 мин.
На фиг. 7В показана доля выживших при дозе облучения 4 Гр (ДВ4) клеток НТ2 9, инкубированных с наночастицами золота (GOLD-60 из примера 1) в течение примерно 12 ч.
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что наночастица, изготовленная из металла, предпочтительно из металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и имеющая самый большой размер в диапазоне от примерно 80 до 105 нм, может существенно усиливать терапевтический эффект местного облучения, направленного на нарушение, изменение или разрушение атипичных клеток, тканей или органов у животного.
Значительное повышение эффективности лучевой терапии впервые может наблюдаться при использовании металлических наночастиц в соответствии с настоящим изобретением (см, напимер, фиг. 4А, 4В, 5А и 5В).
Согласно сущности настоящего изобретения термин "наночастица" относится к продуктам, в частности к синтетическим продуктам, имеющим размер в нанометровом диапазоне.
В контексте настоящего изобретения термин "размер" относится к наибольшему измерению металлического ядра наночастицы. Как правило, наибольшим измерением является диаметр наночастицы круглой или сферической формы, или наибольшая длина наночастицы яйцевидной или овальной формы.
Форма наночастицы может быть, например, круглой, плоской, продолговатой, яйцевидной или овальной, и тому подобное. Форма может определяться или регулироваться способом производства, и адаптируется специалистом в данной области техники в соответствии с желаемым применением.
Так как форма частиц может оказывать влияние на их "биосовместимость", частицы, имеющие практически однородную форму, являются предпочтительными. Так, по фармакокинетическим соображениям наночастицы, имеющие в основном сферическую, круглую или яйцевидную форму, являются предпочтительными. Сферическая или круглая форма является особенно предпочтительной.
Наибольший размер наночастиц в соответствии с настоящим изобретением, как показано в экспериментальной части, преимущественно находится в диапазоне от примерно 70 до примерно 130 нм, преимущественно от примерно 75 или 80 нм до примерно 105 нм, предпочтительно от примерно 75 до примерно 95 нм, или от примерно 80 до примерно 90 или 95 нм.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно впервые показано, что проникновение нано-частицы в клетку-мишень, например опухолевую клетку, не является необходимым, в контексте настоящего изобретения, для того чтобы нарушить, разрушить или изменить указанную клетку. В действительности, авторы настоящего изобретения наблюдали эквивалентное воздействие на клетки-мишени, как в условиях, при которых наночастицы инкорпорировались клетками-мишенями, так и тогда, когда они находились в контакте, в частности во внешнем контакте, с указанными клетками.
Авторы настоящего изобретения описывают в данной заявке применение раскрытых здесь металлических наночастиц или совокупности таких металлических наночастиц для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для нарушения, повреждения, изменения или разрушения клеток-мишеней млекопитающего, когда указанные клетки подвергаются воздействию ионизирующих излучений. В указанной совокупности наночастицы изготовлены из металла. Этот металл предпочтительно имеет атомный номер (Z) по меньшей мере 25. Преимущественно, средний наибольший размер наноча-стиц в этой совокупности находится в диапазоне от примерно 70 до примерно 130 нм, преимущественно от примерно 75 или 80 нм до примерно 105 нм, предпочтительно от примерно 75 до примерно 95 нм, или от примерно 80 до примерно 90 или 95 нм.
Типичная совокупность наночастиц, которая описана выше, состоит из наночастиц, полученных способом, известным из уровня техники (как будет описано далее), где средний наибольший размер на-ночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от примерно 60 до 155 нм, как правило, от 60, 65, 70, 75 или 80 до 105, 110, 130, 140, 150 или 155 нм.
Другими словами, 95% (2а) этой совокупности составляют наночастицы, наибольший размер которых находится в диапазоне от примерно 60 до примерно 155 нм или 68% (1а) этой совокупности составляют наночастицы, наибольший размер которых находится в диапазоне от примерно 70 до примерно 130 нм.
Металлические наночастицы в соответствии с настоящим изобретением изготовлены из металла, указанный металл предпочтительно имеет атомный номер по меньшей мере 25, преимущественно по меньшей мере 40 или 50, более предпочтительно по меньшей мере 60 или 70.
Такой металл может быть выбран из золота (Au-Z = 79), серебра (Ag-Z = 47), платины (Pt-Z = 78), палладия (Pd-Z = 46), олова (Sn-Z = 50), тантала (Та-Z = 73), иттербия (Yb -Z = 70), циркония (Zr-Z = 40), гафния (Hf-Z = 72), тербия (Tb-Z = 65), туллия (Tm-Z = 69), церия (Се-Z = 58), диспрозия (Dy-Z = 66),
эрбия (Er-Z = 68), европия (Eu-Z = 63), гольмия (Но-Z = 67), железа (Fe-Z = 26), лантана (La-Z = 57), не-одимия (Nd-Z = 60), празеодимия (Pr-Z = 59) и их смеси.
Предпочтительно металл выбирается из золота (Au), серебра (Ag), платины (Pt), палладия (Pd), олова (Sn), циркония (Zr) и железа (Fe).
Атомный номер (также известный как протонное число) представляет собой число протонов, находящихся в ядре атома. Он традиционно обозначается символом Z. Атомный номер однозначно определяет химический элемент. В атоме с нейтральным зарядом атомный номер равен числу электронов.
Z принимает участие в формировании у наночастиц поглощающей способности поступающего излучения.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения металлические наночастицы изготовлены из золота.
В настоящем изобретении смесь металлов, как указано выше, в конкретной наночастице или в конкретной совокупности наночастиц также возможна.
Наночастицы, имеющие небольшую удельную площадь поверхности (УПП), являются еще более предпочтительными, так как они меньше взаимодействуют с окружающей средой.
Удельная площадь поверхности (УПП) представляет собой свойство материала твердых частиц, которое измеряется как общая площадь поверхности на единицу массы (м2/г). По-видимому, УПП является важным фактором, влияющим на взаимодействие между наночастицей и биологической системой на равной основе масса-доза, сообщалось, что ультрамелкие частицы, когда они вводятся животному, вызывают больше побочных эффектов, таких как воспаление, по сравнению с мелкими частицами (см., например, Nel et al. Nature Materials 8 (2009) 543).
Металлические наночастицы, наибольший размер которых находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм, особенно предпочтительными с точки зрения УПП, как объясняется ниже.
Для целей настоящего изобретения удельная площадь поверхности наночастицы находится, например, в диапазоне от примерно 1 до 50 м2/г. Предпочтительно удельная площадь поверхности находится в диапазоне от 2 до 20 м2/г.
Удельную площадь поверхности сферической наночастицы можно оценить, используя следующее уравнение: УПП = 3000ДС1ХГ), где d плотность металлической наночастицы, и r - радиус наночастицы.
Таким образом, сферические наночастицы золота с размером частицы 15, 30, 60, 80 и 100 нм будут иметь удельную площадь поверхности, соответственно, 20,7, 10,3, 5,2, 3,9 и 3,1 м2/г для плотности нано-частиц золота 19,32.
Сферические наночастицы железа с размером частицы 15, 30, 60, 80 и 100 нм будут иметь удельную площадь поверхности, соответственно, 50,8, 25,4, 12,7, 9,5 и 7,6 м2/г для плотности наночастиц железа
7,87.
Авторы настоящего изобретения показали, что неожиданная эффективность наночастиц в соответствии с настоящим изобретением главным образом обусловлена их размером. Наночастица, размер которой составляет, по меньшей мере, 80 нм, когда подвергается воздействию ионизирующих излучений, в действительности способна вызывать больше повреждений клеток-мишеней, чем наночастица меньшего размера, в частности наночастица размером 60 нм или менее. Таким образом, авторы настоящего изобретения подчеркивают фундаментальное и непосредственное влияние размера наночастиц на повреждение клетки под воздействием ионизирующих излучений, описанные размеры наиболее подходят для терапевтического применения у млекопитающих, когда указанный размер достигает, и предпочтительно превышает порог 80 нм (см. экспериментальную часть). Чем больше размер наночастиц в определенном здесь диапазоне размеров, тем более эффективной является их способность вызывать клеточные повреждения.
Возможное объяснение этого механизма может быть связано со способностью наночастиц доставлять уловленную энергию (ионизирующее излучение) лучшим или другим образом.
В примерах 2 и 3, для того чтобы показать влияние размера наночастиц золота отдельно от влияния концентрации золота на терапевтический эффект, вызываемый наночастицами под действием облучения, авторами настоящего изобретения были проведены анализы in vitro, в которых размер наночастиц золота был единственным изменяемым параметром. Результаты экспериментов, полученные авторами настоящего изобретения, выявили неожиданное влияние размера наночастиц (при постоянной концентрации металла) на повышение терапевтической эффективности (способность убивать клетки и/или предотвращать их деление).
Для того чтобы производить эффективное терапевтическое действие под влиянием ионизирующих излучений, применение металлических наночастиц с размером наночастицы > 80 нм требует такой концентрации металла на клетку-мишень, которая от примерно 2 до 7 раз, в частности от 4 до 7 раз или от 2 до 5 раз, ниже, чем концентрация металла на клетку-мишень, необходимая при использовании наноча-стиц с размером наночастицы примерно 60 нм или менее (см. примеры 2 и 3, касающиеся НЧЗ).
Таким образом, благодаря настоящему изобретению возможно значительное и выгодное уменьшение количества металла, вводимое пациенту, при аналогичной эффективности лечения, связанное с уменьшением вредных побочных эффектов.
Настоящее изобретение также позволяет значительно уменьшить количество этапов введения при радиотерапевтическом лечении, в частности, как правило, в ходе мультифракционного облучения, которое до сих пор применяется в клинической практике. В действительности наночастицы, описанные в настоящей патентной заявке достаточно велики, для того чтобы они эффективно задерживались в опухолевой ткани. Существенно пониженное выведение металлических наночастиц большего размера из ткани-мишени было описано в литературе (CHANG et al. Cancer Sci. 99 (2008) 1479; Hainfeld et al., Phys. Med. Biol 49 (2004) N309).
Необходимыми дозами ионизирующих излучений предпочтительно являются дозы от примерно 0,05 до примерно 16 Гр, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 6 Гр, для применений in vitro.
Дозы больше примерно 0,05 Гр и меньше примерно 16 или 30 Гр используются, в частности, для местного применения ex vivo или in vitro.
Общая доза ионизирующих излучений для человека в соответствии с существующей практикой находится в диапазоне от примерно 1,5 до примерно 85 Гр. В соответствии с существующей практикой человек также может получить дополнительную дозу облучения около 40 Гр.
Общая доза принятого излучения может быть получена по различным схемам, таким как однократная доза, фракционные дозы, гиперфракционные дозы и т.д.
Описанные облученные наночастицы обеспечивают, как показано в экспериментальной части, явное улучшение терапевтического эффекта по сравнению с эффектом, получаемым при использовании облученных наночастиц меньших размеров.
В соответствии с настоящим изобретением наночастицы являются преимущественно биосовместимыми, то есть они могут быть безопасно введены в организм животного, как правило, млекопитающего, в частности человека, для того, чтобы обеспечить свой терапевтический эффект. Указанная биосовместимость может быть обеспечена, например, природой металла(ов), образующего частицу, и/или дополнительным покрытием.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными являются наночастицы, покрытые биосовместимым покрытием, независимо от пути их введения. Когда наночастицы настоящего изобретения вводятся субъекту внутривенно, такое биосовместимое покрытие, в частности, предпочтительно для того, чтобы оптимизировать биораспределение наночастиц в контексте вышеописанного эффекта увеличенной проницаемости и задержания. Полное биосовместимое покрытие наночастицы является предпочтительным, в частности, при внутривенном введении, для того чтобы избежать взаимодействия поверхности частицы с любым распознающим элементом (макрофагом, опсонинами, и т.п.). "Полное покрытие" подразумевает наличие очень высокой плотности биосовместимых молекул, способных создать, по меньшей мере, сплошной монослой на поверхности частицы. Указанное покрытие обеспечивает так называемый "стелс эффект" наночастицы.
Биосовместимое покрытие обеспечивает или способствует (в зависимости от металла, выбранного для изготовления наночастиц), в частности, стабильности наночастицы в биосовместимой суспензии, такой как физиологическая жидкость (кровь, плазма, сыворотка крови, и т.д.), любая изотоническая среда или физиологическая среда, например, среда, содержащая глюкозу (5%) и/или NaCl (0,9%), необходимой для фармацевтического введения.
Такое биосовместимое покрытие получают путем обработки наночастицы агентом для обработки поверхности.
Стабильность может быть подтверждена с помощью метода динамического рассеяния света металлических наночастиц в биосовместимой суспензии, или путем количественного определения металлического элемента при помощи масс-спектрометрии с индукционной плазмой до и/или после фильтрации металлических наночастиц в биосовместимой суспензии через 0,22 мкм фильтр.
Преимущественно, указанное покрытие сохраняет целостность частиц in vivo, обеспечивает или улучшает их биосовместимость и облегчает их дополнительную функционализацию (например, спейсер-ными молекулами, биосовместимыми полимерами, агентами, обеспечивающими направленную доставку, белками и т.д.). В действительности, отдельная наночастица в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает поверхностный компонент, обеспечивающий специфично направленную доставку к биологическим тканям или клеткам. Такой поверхностный компонент предпочтительно является агентом, обеспечивающим направленную доставку, который обеспечивает взаимодействие наноча-стицы с распознающим элементом, находящимся на клетке-мишени. Такие агенты, обеспечивающие направленную доставку, могут действовать сразу после того, как наночастицы накопятся в опухоли. Так как конформация агента, обеспечивающего направленную доставку, будет обеспечивать его взаимодействие с мишенью, плотность указанного агента, обеспечивающего направленную доставку, необходимо тщательно контролировать. Его высокая плотность в действительности может нарушить конформацию агента, обеспечивающего направленную доставку, и, как следствие, его распознавание клеткой-мишенью (см., например, J A Reddy et al. Gene therapy 9 (2002) 1542; Ketan B. Ghaghada et al. Journal of Controlled Release 104 (2005) 113). Кроме того, высокая плотность агента, обеспечивающего направленную доставку, может способствовать выведению наночастиц ретикулоэндотелиальной системой во время циркуляции крови по сосудистой системе.
Биосовместимое покрытие может быть составлено из любой аморфной или кристаллической структуры.
Как правило, покрытие может быть небиоразлагаемым или биоразлагаемым. Оба варианта могут быть использованы для целей настоящего изобретения.
Примерами небиоразлагаемых покрытий являются один или несколько материалов или агентов для обработки поверхности, выбранных из группы, состоящей из оксида кремния, оксида алюминия, сахара (например, агарозы), фосфата, силана, тиола, цвиттер-ионных химических соединений, липидов, насыщенных углеродных полимеров (например, полиэтиленоксида) и неорганических полимеров, сетчатых или нет, модифицированных или нет (например, полиметакрилата или полистирола), а также их комбинаций.
Примерами биоразлагаемых покрытий являются, например, один или несколько материалов или агентов для обработки поверхности, выбранных из группы, состоящей из биологической молекулы, модифицированной или нет, естественной или нет, и полимера биологических молекул, модифицированного или нет, естественной формы или нет. Биологический полимер может быть фосфолипидом, сахари-дом, олигосахаридом или полисахаридом, полисульфатированным или нет, например декстраном.
Вышеуказанные материалы, химические соединения или агенты для обработки поверхности могут использоваться по отдельности или в комбинациях, смесях или сочетаниях, комплексных или нет, кова-лентных или нет, при необходимости в сочетании с другими химическими соединениями. Кроме того, также возможно использовать любой вышеупомянутый материал, указанный материал может быть водорастворимым или жирорастворимым, или быть искусственно модифицированным таким образом, чтобы стать водорастворимым или жирорастворимым.
Биосовместимое покрытие предпочтительно включает или изготовлено из химического соединения, выбранного из группы, состоящей из неорганического агента, органического агента и их смеси или комбинации. Соответствующий неорганический агент может быть выбран из группы, состоящей из оксида, гидроксида и метагидроксида. Неорганический агент может включать, например, кремний, алюминий, кальций и/или магний.
Такие агенты могут использоваться для придания наночастице положительного или отрицательного заряда, для того чтобы изменять взаимодействия указанной наночастицы с биологической средой.
Неорганический агент, выбранный из группы, состоящей из, например, магния и кальция, будет придавать положительный заряд поверхности наночастицы при значении pH 7.
Например, кремний может использоваться для придания отрицательного заряда поверхности нано-частицы при значении pH 7.
Соответствующим органическим агентом может быть любой агент, содержащий функциональную группу, способную взаимодействовать с наночастицей в соответствии с настоящим изобретением, и функциональную группу, придающую биосовместимость указанной наночастице.
Агентом, содержащим функциональную группу, способную взаимодействовать с наночастицей, может быть, например, карбоксилат (R-COO-), силан (R-Si(OR)3), фосфиновая группа (R-РО (ОН)2), фосфорнокислая группа (R-O-PO(ОН)2) или тиоловая группа (R-SH).
Агент, содержащий функциональную группу, способную придавать биосовместимость наночастице в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь стерическую группу и/или электростатическую группу. Такой агент со стерической группой может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленг-ликоля (ПЭГ), полиэтиленоксида, поливинилового спирта, полиакрилата, полиакриламида (поли(N-изопропилакриламида)), поликарбамида, биополимера или полисахарида, такого как декстран, ксилан, целлюлоза, коллаген, и цвиттер-ионного химического соединения, такого как полисульфобетаин, и т.д.
Агентом с положительной электростатической группой может быть амин, такой как аминопропил-триэтоксисилан, полилизин или 2-аминоэтантиол.
Агент с отрицательной электростатической группой может быть выбран из группы, состоящей из фосфата (например, полифосфата, метафосфата, пирофосфата и т.д.), карбоксилата (например, цитрата или дикарбоновой кислоты, в частности янтарной кислоты) и тиола (например, заканчивающийся карбоксилом тиол, такой как меркаптоянтарная кислота).
Покрытие также может содержать различные функциональные группы (или линкерные сегменты), позволяющие любой представляющей интерес молекуле связываться с поверхностью частицы, например, поверхностному компоненту, обеспечивающему специфично направленную доставку к биологическим тканям или клеткам.
Типичным примером наночастицы в соответствии с настоящим изобретением является наночасти-ца, изготовленная из золота. Кроме того, такая наночастица золота может содержать биосовместимое покрытие, покрытие, изготовленное из тиоловых химических соединений, таких как полиэтиленгликоль-тиол (ПЭГ-SH), тиоглюкоза, или карбоксилатных химических соединений, таких как цитрат.
Другим примером наночастицы в соответствии с настоящим изобретением является наночастица, изготовленная из золота, содержащая в качестве биосовместимого покрытия, покрытие, изготовленное из тиоловых агентов, несущих, по меньшей мере, одну функциональную группу, выбранную из полиэтилена, амина или карбоксила, или покрытие, состоящее из цитрата.
Преимуществом предложенных наночастиц является то, что их легко получить. В действительности, способы получения металлических наночастиц хорошо известны из уровня техники (см., например, Brian L. Cushing et al. (Chem. Rev. 104 (2004) 3893). Как правило, металлические наночастицы получают путем осаждения металлического элемента в водном или неводном растворе, указанное осаждение включает химическое восстановление катиона металла. Другим возможным способом получения металлических наночастиц является восстановление под воздействием радиации.
Другим объктом настоящего изобретения является способ получения металлической наночастицы или совокупности металлических наночастиц, таких как определено выше, включающий
обеспечение наличия металлического элемента, предпочтительно металлического элемента, имеющего атомный номер (Z), равный или больше 25,
получение металлической наночастицы из указанного металлического элемента путем осаждения указанного металлического элемента в среде в присутствии восстанавливающего агента, и, в некоторых случаях,
добавление в среду комплексообразующего агента (комплексообразующий агент добавляется до, во время или после добавления восстанавливающего агента), в некоторых случаях восстанавливающий агент и комплексообразующий агент являются одним и тем же химическим соединением, и в некоторых случаях покрытие наночастицы с использованием агента для обработки поверхности, как описано выше.
Среда, как правило, используемая в настоящем изобретении, может быть выбрана из водного раствора, спиртового раствора и т.д.
Восстанавливающий агент, как правило, используемый, может быть выбран из цитрата, аскорбиновой кислоты, 2-меркаптоянтарной кислоты.
Комплексообразующий агент, как правило, используемый, может быть выбран из цитрата, тиола, такого как 2-меркаптоянтарная кислота и т.д.
Преимущественно, стадия покрытия заключается в приведении наночастицы в контакт с агентом для обработки поверхности, как определено выше.
В конкретном варианте осуществления изобретения способ получения совокупности наночастиц включает следующие этапы, предпочтительно в следующем порядке:
a) обеспечение в качестве исходного материала металлического элемента, предпочтительно металлического элемента, имеющего атомный номер (Z), равный или больше 25,
b) осаждение исходного материала из этапа а) в полярной среде, как определено выше, в присутствии восстанавливающего агента, предпочтительно путем регулирования концентрации исходного материала и/или восстанавливающего химического соединения и/или температуры,
c) в некоторых случаях добавление в полярную среду комплексообразующего агента до, во время или после этапа осаждения b), комплексообразующий агент и восстанавливающий агент в некоторых случаях являются одним и тем же химическим соединением,
d) в некоторых случаях промывание суспензии, полученной в конце этапа b) или с), для удаления любых посторонних примесей, восстанавливающего агента и/или комплексообразующего агента,
e) в некоторых случаях концентрирование суспензии, полученной в конце этапа d), и
f) в некоторых случаях покрытие наночастиц.
Описанная выше совокупность может быть в дальнейшем подвергнута процедуре оформления в виде препаративной формы, перед тем, как она будет введена субъекту.
В конкретном примере способ получения наночастицы в соответствии с настоящим изобретением, где наночастица изготавливается из металла, предпочтительно включает следующие этапы в следующем порядке:
a) осаждение раствора исходного материала хлорида золота (такого как, в частности, HAuCl4 или KAuCl4) в водном растворе в присутствии восстанавливающего агента (такого как цитрат), температура среды находится в диапазоне от 50 до 100°С,
b) в некоторых случаях промывание полученной суспензии металлических наночастиц для удаления любых посторонних примесей,
c) в некоторых случаях концентрирование полученной таким образом суспензии металлических на-ночастиц,
d) в некоторых случаях покрытие указанных металлических наночастиц путем приведения их в контакт с агентом для обработки поверхности, как определено выше.
Другим объектом настоящего изобретения является композиция, включающая наночастицы, определенные выше, и/или которые могут быть получены описанными способами. Частицы в композициях настоящего изобретения преимущественно имеют практически однородную форму, как указано выше, хотя это не является обязательным требованием.
Биосовместимые суспензии, содержащие металлический элемент в высокой концентрации (например, 300 г/л), могут быть получены описанным способом.
Отдельным объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая наночастицы, определенные выше, и, в некоторых случаях, фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.
Композиции могут быть в виде твердого вещества, жидкости (частицы в суспензии), аэрозоля, геля, пасты и тому подобного. Предпочтительными являются композиции в виде препаративной формы, пригодной для инъекций, предпочтительно в виде жидкости.
Используемым наполнителем или носителем может быть любая классическая основа для данного типа применений, такая как солевые, изотонические, стерильные буферные растворы и тому подобное. Они также могут содержать стабилизаторы, подсластители, поверхностно-активные вещества и тому подобное. При помощи известных технологий для фармацевтических препаратов они могут быть выполнены, например, в виде ампул, аэрозольных баллончиков, флаконов, таблеток, капсул.
Преимущественно, концентрация вводимого металла на клетку-мишень находится в диапазоне от примерно 10-7 наномоль (клетка: [металл] = 1:10-7 (наномоль)) до примерно 5х10-1 наномоль (клетка: [металл] = 1:5х10-1 (наномоль)). Более предпочтительно концентрация металла на клетку-мишень находится в диапазоне от примерно 10-6 наномоль (клетка:[металл] = 1:10-6 (наномоль)) до примерно 2х10-1 наномоль (клетка: [металл] = 1:2х10-1 (наномоль)).
Еще более предпочтительно концентрация металла на клетку-мишень находится в диапазоне от примерно 10-6 наномоль (клетка:[металл] = 1:10-6 (наномоль)) до примерно 10-3 наномоль (клетка: [металл] = 1:10-3 (наномоль)) или от примерно 10-6 наномоль (клетка:[металл] = 1:10-6 (наномоль)) до примерно 10-4 наномоль (клетка: [металл] = 1:10-4 (наномоль)).
В описанных композициях приемлемая или желательная концентрация металла находится в диапазоне от примерно 1 мг до примерно 100 мг металла на грамм клеток-мишеней млекопитающего, таких как, в частности, опухолевые клетки млекопитающего, как правило, в диапазоне от примерно 1 или 5 мг до примерно 50 мг металла на грамм клеток-мишеней млекопитающего.
Как правило, композиции в виде жидкости содержат от 0,01 до 300 г/л металла, предпочтительно по меньшей мере 1, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 или 250 г/л.
Количественное определение металла лучше всего выполнять при помощи масс-спектрометрии с индукционной плазмой.
Вышеуказанные концентрации металла варьируют в зависимости от конкретного пациента, избранного способа введения, природы клеток-мишеней и т.д., и легко подбираются специалистом в данной области техники.
Наночастицы, совокупности наночастиц и композиции настоящего изобретения являются продуктами, которые могут применяться во многих областях, в частности в медицине и ветеринарии.
Объектом настоящего изобретения является применение описанного продукта для того, чтобы изменять, разрушать клетку-мишень, ткань или орган.
В зависимости от энергии ионизирующих излучений частицы могут обеспечивать нарушение клеток и/или тканей, или их разрушение.
Таким образом, отдельным объектом настоящего изобретения является применение металлической наночастицы или совокупности наночастиц в соответствии с настоящим изобретением для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для изменения, разрушения клеток-мишеней у животного, когда указанные клетки подвергаются воздействию излучений, в частности ионизирующих излучений, а также соответствующие терапевтические методики.
Фармацевтическая композиция может также включать дополнительное терапевтическое соединение, отличающееся от наночастицы или совокупности наночастиц, как описано здесь, которое также предназначено для лечения рака.
Другим отдельным объектом настоящего изобретения является способ индуцирования или порождения нарушения, лизиса, апоптоза или разрушения клеток-мишеней in vitro, ex vivo или in vivo, включающий контактирование клеток, в частности клеток-мишеней, с одной или несколькими наночастица-ми, определенными выше, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить взаимодействие наночастиц с указанными клетками, и воздействие на клетки излучений, соответствующими излучениями являются, в частности, ионизирующие излучения, предпочтительно рентгеновское излучение, у-излучение радиоактивные изотопы и/или пучки электронов, указанное воздействие индуцирует или порождает нарушение, лизис, апоптоз или разрушение указанных клеток-мишеней.
Клетками-мишенями могут быть любые патологические клетки, то есть клетки, вовлеченные в патологический механизм, например, пролиферативные клетки, такие как опухолевые клетки, стенози-рующие клетки (фибробласты/клетки гладкой мускулатуры) или клетки иммунной системы (патологические клеточные клоны). Предпочтительное применение основано на лечении (например, разрушении или функциональном изменении) злокачественных клеток или ткани.
В этой связи, отдельным объектом настоящего изобретения является применение наночастицы или совокупности таких наночастиц, как определено выше, для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения, в частности, рака, когда она используется в сочетании с ионизирующими излучениями (как определено выше).
Настоящее раскрытие дополнительно включает применение композиции, наночастицы или совокупности наночастиц, определенных выше, для предупреждения или лечения рака или для облегчения
симптомов рака у животного, когда указанные клетки подвергается воздействию излучений, в частности ионизирующих излучений, как определено выше.
Еще одним отдельным объектом настоящего изобретения является способ индуцирования или порождения нарушения, лизиса или разрушения клеток-мишеней, в частности раковых клеток, in vitro, ex vivo или in vivo, включающий контактирование клеток-мишеней с одной или несколькими наночастица-ми, определенными выше, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить взаимодействие частиц с указанными клетками, и воздействие на клетки излучений, в частности ионизирующих излучений, как определено выше, указанное воздействие индуцирует или порождает нарушение, лизис или разрушение указанных клеток.
Другим отдельным объектом настоящего изобретения является способ предупреждения или лечения заболевания, в частности рака, или облегчения симптомов этого заболевания у субъекта или пациента, включающий введение пациенту, страдающему данным заболеванием, наночастицы, совокупности наночастиц или композиции, такой, которая определена выше, в условиях, позволяющих наночастицам взаимодействовать (находиться в контакте) с атипичными клетками, в частности, раковыми клетками, и последующее лечение субъекта путем воздействия на указанного субъекта излучений, такое облучение приводит к изменению, нарушению или функциональному разрушению атипичных клеток пациента, тем самым, предупреждая или излечивая рак.
Классический подход к лечению рака предполагает системное сочетание методов в комбинированной терапии (например, сочетание радиотерапии и химиотерапии).
Описанные наночастицы, подвергнутые воздействию ионизирующих излучений, в контексте радиотерапии, могут применяться совместно с другим протоколом терапии рака. Такой протокол может быть выбран из группы, состоящей из хирургии, радиохирургии, химиотерапии, лечения, включающего введение цитостатического препарата(ов), цитотоксического препарата(ов), таргетной терапии, вакцины и любых других биологических или неорганических продуктов, предназначенных для лечения рака.
Неожиданно оказалось, что описанные наночастицы кроме того сами по себе могут использоваться в контексте радиотерапии с повышенной наблюдаемой эффективностью.
Настоящее изобретение может быть использовано для лечения любых видов злокачественных опухолей, таких как гематологические опухоли или злокачественные новообразования и солидные опухоли, в частности эпителиального, нейроэктодермального или мезенхимального происхождения. Кроме того, наночастицы могут быть использованы для лечения предракового состояния или определенного доброкачественного новообразования, в тех случаях, когда классически применяется или показана радиотерапия.
Изобретение применимо в терапии первичных опухолей или вторичных поражений, локорегионар-ных или отдаленных метастаз, а также при профилактике с целью избежать вторичных злокачественных поражений центральной нервной системы, таких как наблюдаемые поражения (метастазы) при меланоме, раке легкого, раке почки, раке молочной железы и т.д.
Наночастицы могут применяться в любое время в течение периода противораковой терапии. Они могут быть введены, например, как неоадъювант (до хирургического вмешательства по удалению раковой опухоли) или как адъювант (после хирургического вмешательства).
Наночастицы также могут использоваться для лечения опухолей на поздней стадии, которые не могут быть удалены хирургическим путем.
Как объяснено здесь, облучение может быть применено в любое время после введения частиц, однократно или несколько раз, с использованием любой существующей системы радиотерапии.
Описанные наночастицы предназначены, в частности, для применения при лечении рака, когда радиотерапия является классическим способом лечения. Такой рак может быть выбран, в частности, из группы, состоящей из рака кожи, включая злокачественные новообразования, ассоциированные со СПИД, меланому; опухолей центральной нервной системы, включая опухоли головного мозга, ствола головного мозга, мозжечка, гипофиза, спинномозгового канала, глаза и глазницы; опухолей головы и шеи; рака легких; рака молочной железы; желудочно-кишечных опухолей, таких как рак печени и гепа-тобилиарного тракта, рак толстой кишки, прямой кишки и анального канала, рак желудка, поджелудочной железы, пищевода; опухолей мужской мочеполовой системы, таких как рак предстательной железы, яичка, пениса и уретры; гинекологических опухолей, таких как рак шейки матки, эндометрия, яичника, фаллопиевой трубы, влагалища и вульвы; опухолей надпочечников и ретроперитонеальных опухолей; саркомы костей и мягких тканей, независимо от локализации; лимфомы; миеломы; лейкемии; и педиатрических опухолей, таких как опухоль Вильмса, нейробластома, опухоли центральной нервной системы, саркома Юинга и т.д.
Частицы могут быть активированы в большом диапазоне общей дозы облучения.
Количества и схемы (планирование и доставка излучений в виде однократной дозы или в контексте фракционного или гиперфракционного протокола и т.д.) определяются для любого заболевания/анатомического участка/стадии заболевания/самочувствия пациента/возраста пациента (ребенок, взрослый, пожилой пациент) в соответствии со стандартом лечения в любой конкретной ситуации.
Облучение может быть применено в любое время после введения наночастиц однократно или не
сколько раз, с использованием любой существующей системы радиотерапии. Наночастицы могут быть введены различными путями, например, местно (в частности, внутриопухолевым способом), подкожно, внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, воздушным путем (ингаляция), внутрибрюшинно, внутримышечно и перорально (per os). Кроме того, наночастицы могут быть введены во внутреннюю полость, такую как полость ложа опухоли, образующуюся после туморэктомии.
При необходимости могут быть проведены повторные инъекции или введения.
Термин "лечение" означает любое действие, направленное на исправление ненормальных функций, с целью предупреждения заболеваний, облегчения патологических симптомов, такое как, в частности, уменьшение размеров или роста атипичной ткани, в частности опухоли, регулирование указанного размера или роста, подавление или разрушение атипичных клеток или тканей, замедление прогрессирова-ния заболевания, стабилизация заболевания с задержкой прогрессирования рака, уменьшение образования метастаз, ослабление симптомов заболевания или полная ремиссия (например, в случае рака) и т.д.
Как указывалось выше, соответствующими излучениями или источниками ионизации предпочтительно являются ионизирующие излучения, которые преимущественно могут быть выбраны из группы, состоящей из рентгеновского излучения, гамма-излучения, пучков электронов, пучков ионов и радиоактивных изотопов или излучений радиоактивных изотопов. Особенно предпочтительным источником ионизации является рентгеновское излучение.
Энергия ионизирующих излучений, как правило, находится в диапазоне от примерно 2 до примерно 25000 кэВ, в частности от примерно 2 до примерно 6000 кэВ (источник линейный ускоритель), или от примерно 2 до примерно 1500 кэВ (например, у источника кобальт 60). При использовании источника рентгеновского излучения энергия особенно предпочтительного ионизирующего излучения, как правило, находится в диапазоне от примерно 50 до примерно 12000 кэВ, например, от примерно 50 до примерно
6000 кэВ.
Как правило, рентгеновское излучение со следующими значениями энергии (которые не являются ограничивающими настоящее изобретение) может быть применено в различных случаях для активации наночастиц:
рентгеновское излучение с энергией от 50 до 150 кэВ, которое, в частности, эффективно для поверхностной ткани-мишени;
рентгеновское излучение с энергией от 200 до 500 кэВ (ортонапряжение), которое может проникать в ткань толщиной 6 см;
рентгеновское излучение с энергией от 1000 до 25000 кэВ (меганапряжение). Например, ионизация наночастиц для лечения рака предстательной железы может быть проведена при помощи пяти сфокусированных рентгеновских лучей с энергией 15000 кэВ.
Альтернативно, в качестве источника ионизирующего излучения могут быть использованы радиоактивные изотопы (именуется как кюритерапия или брахитерапия). В частности, могут с успехом применяться иод I125 (t 1/2 = 60,1 день), палладий Pd103 (t 1/2 = 17 дней), цезий Cs137 и иридий Ir192.
Иммунорадионуклид (или радиоактивно меченный иммунный лиганд) также может быть использован в качестве источника ионизирующего излучения в контексте радиоиммунотерапии. Пригодные для радиоиммунотерапии радионуклиды могут быть выбраны, например, из 131I, 186Re, 177Lu или 90Y.
Заряженные частицы, такие как пучки протонов, пучки ионов, таких как углерод, в частности пучки ионов высоких энергий, также могут использоваться в качестве источника ионизирующего излучения или пучков нейтронов.
Пучки электронов также могут использоваться в качестве источника ионизирующего излучения с энергией от 4 до 25 МэВ.
Специальный источник монохромного излучения может использоваться для того, чтобы генерировать рентгеновское излучение с энергией близкой к или соответствующей границе поглощения атома(ов) металлической наночастицы.
Предпочтительные источники ионизирующих излучений могут быть выбраны из линейного ускорителя, кобальта 60 и источников для брахитерапии.
Термин "в сочетании" указывает на то, что нужный эффект, получаемый, когда клетки-мишени, ткани или органы находятся в контакте с наночастицами настоящего изобретения, активируется определенным источником. Однако не является необходимым, чтобы частицы и излучение вводились одновременно или по одному и тому же протоколу.
Кроме того, настоящее раскрытие относится к наборам, включающим одну или несколько описанных наночастиц или композиций. Как правило, набор включает по меньшей мере одну наночастицу или совокупность наночастиц в соответствии с настоящим изобретением. Обычно набор также включает один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций настоящего изобретения. Вместе с таким контейнером(ами) может находиться этикетка с инструкциями по использованию этих продуктов, для применения наночастиц, совокупности наноча-стиц или композиций в соответствии с настоящими способами.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующих примеров, которые приводятся с целью иллюстрации, а не для ограничения изобретения.
Экспериментальная часть
Пример 1. Синтез и физико-химические характеристики наночастиц золота с различными размерами.
Наночастицы золота получали путем восстановления хлорида золота цитратом натрия в водном растворе. Протокол был взят из работы G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21.
В стандартном эксперименте раствор HAuC4 нагревали до кипения. Затем добавляли раствор цитрата натрия. Получившийся раствор дополнительно кипятили в течение 5 мин.
Размер наночастиц регулировали от 15 до 105 нм путем аккуратного изменения соотношения между цитратом и источником золота (см. табл. 1).
Затем полученные суспензии наночастиц золота концентрировали с использованием ультрафильтрационного аппарата (кювета с перемешиванием Millipore Amicon модель 8400) с целлюлозной мембраной 30 кДа.
Получившиеся суспензии окончательно фильтровали через мембранный фильтр с границей пропускания 0,22 мкм (мембрана PES Millipore) в ламинарном боксе и хранили при температуре 4°С.
Содержание золота определяли при помощи масс-спектрометрии с индукционной плазмой и выражали как [Au] в г/л.
Размер частиц определяли при помощи трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) путем подсчета более чем 200 частиц (фиг. 1А), выбирая самое длинное измерение наночастицы для определения размера. Строили гистограммы и вычисляли среднее значение и стандартное отклонение (фиг. 1В).
Таблица 1
Образцы
Размер ча стицы
Синтез
Структура
[Au] г/л
Цитрат
HAuCl,
Gold-15
15±2(1а)
20 мл 30 мМ
500 мл 0,25 мМ
гцк
17,86
Gold-30
32±10(la)
7, 5 мл 40 мМ
500 мл 0,25 мМ
гцк
16, 90
Gold-бО
60+10{la)
2 мл 85 ММ
500 мл 0,25 ММ
гцк
4,98
Gold-80
80±10{la)
1,2 мл 43 мН
200 мл 0,30 мМ
гцк
10, 67
Gold-105
105+25{la)
1,2 мл 39 мМ
200 мл 0,33 мМ
гцк
5,06
Заключение.
Все наночастицы, описанные в табл. 1, были получены при помощи одного и того же процесса синтеза, для того чтобы обеспечить одинаковые свойства характеристики поверхности.
ТЭМ-изображения показывают, что все синтезированные наночастицы золота имеют сферическую и/или яйцевидную форму.
Электронная дифрактограмма, полученная с помощью ТЭМ, показывает, что все синтезированные наночастицы золота обладают ГЦК структурой.
Таким образом, изменяется только размер наночастиц золота, хорошо характеризуемый средним размером частиц и величиной полидисперсности в соответствии с уровнем техники.
Пример 2. Влияние размера наночастиц золота на эффективность in vitro (оценка клоногенной выживаемости), при постоянной концентрации золота на клеточном уровне.
Протокол.
Для того чтобы исследовать усиление реакции на облучение наночастиц золота (НЧЗ), которые были интернализированы в клетку или связаны с клеткой (ниже выражается как концентрация золота на клеточном уровне), авторы настоящего изобретения применяли специфичную оценку клоногенной выживаемости, описанную ниже:
Клетки НТ29 высевали с плотностью 20000 клеток/см2. НЧЗ добавляли в среду при различной концентрации золота, измеряемой в мкМ. После инкубации в течение периода времени от 1 до 24 ч отбирали клеточные супернатанты. Затем клетки недолго промывали фосфатно-солевым буфером, чтобы удалить НЧЗ, не прикрепившиеся или неинтернализированые в клетки. Затем авторы изобретения проводили обработку клеток трипсином и подсчитывали количество клеток при помощи гемоцитометра.
Для каждых условий авторы изобретения отбирали пробу от 100000 до 220000 клеток/мл, в которой затем определяли концентрацию золота при помощи масс-спектрометрии с индукционной плазмой.
Концентрацию золота (Au) на клеточном уровне (количество атомов золота в единице объема) выражали в мкМ.
Этот параметр также можно выразить как концентрацию золота (Au) на клетку-мишень следующим образом:
Клетка: Au=1: X (X выражен в наномолях) в соответствии со следующим вычислением: Клетка = 1
X (выражен в наномолях) = Концентрация золота (Au) (мкМ)х 1 (мл)/1000 (мл)хКоличество клеток на мл
Другие клетки высевали (с плотностью от 300 до 1000 клеток на чашку в зависимости от условий обработки), чтобы провести оценку клоногенности. После того как клетки прикреплялись к чашке, их либо не облучали (ложный контроль), или облучали дозами от 2 до 4 Гр с помощью рентгеновского аппарата с энергией пучка 200 кВ пикового напряжения. Клеткам давали расти в течение периода времени до 12 дней, чтобы они образовали колонии. Затем колонии фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым и производили подсчет, для того чтобы определить клоногенную долю выживших (см. фиг. 3A и 3B), используя следующие формулы:
Эффективность посева (ЭП) представляет собой отношение количества колоний, образованных в условиях без воздействия какого-либо излучения, к количеству посеянных клеток:
ЭП = n° образованных колоний х 100/n° посеянных клеток
Доля выживших (ДВ) представляет уровень жизнеспособных клеток после облучения и нормирована по отношению к ЭП контроля:
ДВ = n° колоний, образованных после облучения, x100/(n° посеянных клеток * ЭП) Коэффициент усиления дозы (КУД) определяли как отношение ДВ (только доза облучения)/ДВ (наночастицы золота, активированные той же дозой облучения).
Таблица 2
Образцы наночастиц золота
Концентрация золота (Au) на клеточном уровне (мкМ)
Концентрация золота (Au) на клетку-мишень Клетка : Au = 1 : Х(Х выражен в наномолях)
[Au]
Количество клеток на мл
Клетка : Au = 1 : X(наномоль)
GOLD-15
GOLD- 3 0
GOLD-SO
GOLD-80
GOLD-105
1,6х105
3,бх10"5
GOLD-15
1,3x10*
9,5x10*
GOLD-3 0
1,3x10s
13,1х10"5
GOLD-SO
2,2x10*
7, 3x10"*
GOLD-SO
2, 0x10*
8,5х10~*
GOLD-105
1,3x10*
13, бх10~*
GOLD-15
9,7x10*
20,7xl0"5
GOLD-30
1,8x10s
22,6xl0"5
GOLD-60
2,2x10*
37,7x10"*
GOLD-80
2,Ixl0b
24,9xl0"b
GOLD-105
1,4x10*
43,4x10"*
GOLD-15
130
1,4x10*
92,0xl0~b
GOLD-3 0
148
1,4x10*
108, 6x10"*
GOLD-60
1,5x10*
61, 9x10"*
GOLD-80
119
1,8x10*
65,4x10"*
GOLD-15
GOLD-30
GOLD-60
400
2,2x10*
181,8x10"*
GOLD-80
GOLD-105
В табл. 2 показана концентрация золота на клеточном уровне (мкМ) или [концентрация золота на клетку-мишень (клетка : Au=1 : X (X выражен в наномолях))] для различных концентраций золота (Au), инкубированных с раковыми клетками НТ29, для каждого типа наночастиц, синтезированных в примере 1 и указанных в табл. 1.
Таблица ЗА
Образцы наночастиц золота
Концентрация золота (Au) на клеточном уровне (мкМ) Концентрация золота (Au) на клетку-мишень Клетка : Au = 1 : X(X выражен в наномолях)
КУД (4 Гр)
[Au]
мкМ
Количество клеток на мл
Клетка : Au = 1 : X(наномоль)
GOLD-15
1, Зх10ь
9, 5х10"ь
0, 98
GOLD-3 0
1,3х105
13,1х10"5
0, 99
GOLD-60
2, 2x10s
7, ЗхЮ"5
1, 09
GOLD-80
2, ОхЮ5
8,5х10"5
0, 98
GOLD-105
1, Зх10ь
13, 6х10~ь
1, 35
В табл. 3A приведены значения КУД, полученные для дозы облучения наночастиц, описанных в примере 1, равной 4 Гр, когда концентрация золота на клеточном уровне была ниже 20 мкМ [или соответствующая концентрация золота на клетку-мишень была ниже 15х 10-5 наномоль (Клетка : Au <1: 15х 10-5 наномоль)].
Таблица ЗВ
Образцы наночастиц золота
Концентрация золота (Au) на клеточном уровне (мкМ) Концентрация золота (Au) на клетку-мишень Клетка : Au =1 : X(X выражен в наномолях)
КУД (4 Гр)
[Au]
мкМ.
Количество клеток на мл
Клетка : Au = 1 : X(наномоль)
GOLD-15
9,7х104
20,7х10"5
0, 96
GOLD-3 0
1, 8xl0b
22,6xl0_!l
1, 16
GOLD-60
2,2x10s
37, 7х10"5
1,13
GOLD-80
2,1х105
24, 9xl0"s
1,63
GOLD-105
l,4xl0b
43,4х10"ь
2, 59
В табл. 3B приведены значения КУД, полученные для дозы облучения наночастиц, описанных в примере 1, равной 4 Гр, когда концентрация золота на клеточном уровне находилась между 20 мкМ и 83 мкМ [или соответствующая концентрация золота на клетку-мишень находилась между 20х10-5 наномоль и 45х10-5 наномоль (1 : 20х10-5 наномоль <Клетка: Au <1: 45х10-5 наномоль)].
Таблица ЗС
Образцы наночасти ц золота
Концентрация золота (Au) на клеточном уровне (мкМ) Концентрация золота (Au) на клетку-мишень Клетка : Au = 1 : X(X выражен в наномолях)
КУД (4 Гр)
[Au]
мкМ
Количество клеток на мл
Клетка : Au = 1 : Х(наномоль)
GOLD-15
130
1,4х105
92, ОхЮ"5
1,57
GOLD-30
148
1, 4х10ь
108,6xl0_i
1,23
GOLD-60
1, 5х10ь
61, 9х10"ь
1,63
GOLD-80
119
1, 8х105
65,4х10"5
3,36
В табл. 3C приведены значения КУД, полученные для дозы облучения наночастиц, описанных в примере 1, равной 4 Гр, когда концентрация золота на клеточном уровне находилась между 95 мкМ и 148 мкМ [или соответствующая концентрация золота на клетку-мишень находилась между 60х10-5 наномоль и 110х10-5 наномоль (1 : 60х10-5 наномоль < Клетка: Au <1: 110х 10-5 наномоль)].
Заключение.
Неожиданно, пороговый эффект в значении коэффициента усиления дозы наблюдается для наночастиц золота с размером частицы > 80 нм (см. фиг. 5А и 5В).
Пример 3. Влияние размера наночастиц золота на эффективность in vitro, когда способностью ослаблять рентгеновское излучение каждой испытываемой наночастицы золота является постоянной на клеточном уровне.
Протокол: Измерение ослабления рентгеновского излучения.
Наночастицы золота с различной концентрацией золота (выраженной в [Au] г/л) готовили в пробирках объемом 200 мкл и помещали в специально сконструированный полистироловый штатив. Компьютерную микротомографию проводили с использованием системы Locus (General Electric) с анодным напряжением и током 50 кВ и 450 мкА, соответственно. Сканирование проводили в режиме изотропного разрешения 90 мкм.
Небольшую цилиндрическую целевую область аккуратно помещали в систему для формирования трехмерного изображения по центру каждой пробирки для измерения значений ослабления заполненных жидкостью пробирок, содержащих дисперсии наночастиц.
Заключение.
Аналогичные значения ослабления рентгеновского излучения наблюдались независимо от размера наночастиц золота, для размера, находящегося в диапазоне от 15 до 105 нм (см. фиг. 6А и 6В). Этот результат подтверждает пороговый эффект эффективности, наблюдаемый для размера наночастицы > 80 нм. Такая наночастица способна вызывать больше повреждений на клеточном уровне при данной поглощенной энергии рентгеновского излучения (см. фиг. 4А и 4B).
Пример 4. Влияние локализации наночастиц золота на клеточном уровне (физическое взаимодействие с мембранами опухолевой клетки и/или поглощение клеткой) на эффективность in vitro.
Клетки НТ29 высевали в количестве, позволяющем образовать от 50 до 200 колоний, в зависимости от условий обработки. После того как клетки прикреплялись, добавляли 50, 100 или 400 мкМ золота и инкубировали менее 5 мин (без инкубации) или 12 ч. Тестировали наночастицу золота с размером частицы 60 нм (GOLD-60 из примера 1). Клетки либо не облучали (ложный контроль) или облучали дозами 2 и 4 Гр с помощью рентгеновского аппарата с энергией пучка 200 кВ пикового напряжения. После облучения клетки инкубировали от 10 до 12 дней при температуре 37°C. Клоны фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым и производили подсчет, для того чтобы определить долю выживших.
На фиг. 7А показана доля выживших при дозе облучения 4 Гр (ДВ4) клеток НТ29, инкубированных с наночастицами золота (GOLD-60 из примера 1) в течение менее чем 5 мин, и на фиг. 7В показана доля выживших при дозе облучения 4 Гр (ДВ4) клеток НТ29, инкубированных с наночастицами золота (GOLD-60 из примера 1) в течение примерно 12 ч.
Таблица 4
КУД GOLD-60
50 мкМ
100 мкМ
400 мкМ
4 Гр время инкубации менее 5 минут
0,96
1,25
1,8
4 Гр время инкубации 12 часов
0, 88
1,5
В табл. 4 представлены значения КУД для наночастицы золота (GOLD-60) для концентрации золота 50, 100 и 400 мкМ при дозе облучения 4 Гр для времени инкубации менее 5 мин или 12 ч. Заключение.
Приведенные данные показывают, что для концентрации золота 400 мкМ значения КУД для нано-частиц золота, инкубированных с клетками до облучения менее 5 мин, и наночастиц золота, инкубированных 12 ч, являются сходными.
Эти результаты показывают, что наночастицы золота (НЧЗ) усиливают ответ клеток-мишеней на радиацию, без необходимости интернализации НЧЗ этими клетками. В действительности, и, как известно специалисту в данной области техники, для того чтобы обеспечить поглощение клеткой примерно 50% наночастиц, присутствующих в биологической среде, требуется два часа (см., например, Chitrani et al.,
2006).
Когда наночастицы золота находятся в контакте с раковыми клетками, они преимущественно способны вызывать повреждения раковой клетки под действием излучения.
Приведенные выше экспериментальные результаты примеров 1-4 демонстрируют способность металлических наночастиц оказывать усиленное терапевтическое действие при введении in vivo, если в месте локализации опухоли (поглощение металлических наночастиц клетками не требуется, как показано выше) обеспечивается соответствующая концентрация металла (пропорциональная массе опухоли, что очевидно для специалиста в данной области техники).
При использовании металлических наночастиц с размером частицы > 80 нм, требуется значительно меньшее количество металла, по сравнению с количеством металла, необходимым при использовании металлических наночастиц с размером частицы примерно 60 нм, для того чтобы производить эффективное терапевтическое действие, когда металлические наночастицы подвергаются воздействию ионизи
рующих излучений (например, при радиотерапии).
Для того чтобы производить эффективное терапевтическое действие под влиянием ионизирующих излучений, применение металлических наночастиц с размером наночастицы > 80 нм требует такой концентрации металла на клетку-мишень, которая от примерно 2 до 7 раз, в частности, от 4 до 7 раз или от 2 до 5 раз, ниже, чем концентрация металла на клетку-мишень, необходимая при использовании наноча-стиц с размером наночастицы примерно 60 нм или менее.
Такие металлические наночастицы являются предпочтительными для применения in vivo.
Совокупность металлических наночастиц, в которой средний наибольший размер наночастиц находится в диапазоне от примерно 80 до 105 нм, является наиболее предпочтительной для терапии, когда указанные наночастицы подвергаются воздействию ионизирующих излучений. В действительности, такие наночастицы, в частности, обеспечивают повышенный коэффициент усиления дозы (КУД). Пороговый эффект наблюдается in vivo для наночастицы, как описано здесь, наибольший размер которой предпочтительно > 80 нм и еще более предпочтительно находится в диапазоне от примерно 80 до примерно 105 нм. Такая наночастица обладает уменьшенной площадью поверхности, обеспечивающей улучшенную биосовместимость и, как следствие, пониженную токсичность.
Кроме того, описанная совокупность металлических наночастиц обеспечивает уменьшенное выведение из опухоли. Однократная инъекция композиции в соответствии с настоящим изобретением теперь позволяет обеспечить требуемый терапевтический эффект в контексте протокола мультифракционного облучения, который до сих пор применяется в клинической практике.
Ссылки
- 'Gold microspheres : a selective technique for producing biologically effective dose enhancement1, Her-old et al., Int. J. Rad. Biol., 2000, 76, pp. 1357-1364;
'Increased apoptotic potential and dose-enhancing effect of gold nanoparticles in combination with single-dose clinical electron beams on tumor-bearing mice', Meng-Ya Chang et al., Cancer Sci., 2008, 99(7) pp. 14791484;
'Elucidating the Mechanism of Cellular Uptake and Removal of Protein-Coated Gold Nanoparticles of Different Sizes and Shapes', B. Devika Chithrani et al., Nano Lett, 2007, 7(6), pp. 1542-1550;
'Determining the Size and Shape Dependence of Gold Nanoparticle Uptake into Mammalian Cells', B. Devika Chithrani et al., Nano Lett, 2006, 6 (4), pp. 662-668;
'Enhancement of Radiation Cytotoxicity in Breast-Cancer Cells by Localized -Attachment of Gold Nanoparticles', Tao Kong et al., Small, 2008, 4(9), pp. 1537-1543;
'Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface', Andre E. Nel et al., Nature Materials, 2009, 8, pp. 543-557;
The use of gold nanoparticles to enhance radiotherapy in mice', James F Hainfeld et al., Phys. Med. Biol.,
2004, 49, pp N309-N315;
'Recent Advances in the Liquid-Phase Syntheses of Inorganic Nanoparticles', Brian L. Cushing et al., Chem. Rev., 2004, 104, pp. 3893-3946;
"Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors'; J A Reddy et al., Gene therapy, 2002, 9, pp. 1542-1550;
'Folate targeting of drug carriers: A mathematical model', Ketan B. Ghaghada et al., Journal of Controlled
Release, 2005, 104, pp. 113-128;
'Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions', G. Frens, Mature Physical Science, 1973, 241, pp. 21-22.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ радиационной терапии для нарушения, изменения или разрушения доброкачественных, предраковых или злокачественных человеческих клеток у субъекта, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей наночастицы и фармацевтически приемлемый эксципиент, субъекту и воздействие на клетки ионизирующих излучений, где наночастицы являются частицами металла, имеющего атомный номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится в диапазоне от 80 до 105 нм, и где данные наночастицы покрыты биосовместимым покрытием.
2. Способ по п.1, где биосовместимым покрытием является небиоразлагаемое покрытие, выбранное из группы, состоящей из оксида кремния, оксида алюминия, сахара, фосфата, силана, тиола, цвиттерион-ного соединения, липида, насыщенного углеродного полимера и неорганического полимера, или биораз-лагаемое покрытие, выбранное из группы, состоящей из биологического полимера, фосфолипида, саха-рида, олигосахарида и полисахарида.
3. Способ по п.1 или 2, в котором металл выбран из золота (Au), серебра (Ag), платины (Pt), палладия (Pd), олова (Sn), циркония (Zr), железа (Fe).
4. Способ по п.3, в котором композиция содержит от примерно 10-6 до 10-3 наномоль металла на клетку-мишень.
1.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором металлическая наночастица имеет сферическую или яйцевидную форму.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором указанные ионизирующие излучения выбраны из группы, состоящей из рентгеновского излучения, у-излучения, пучков электронов и излучений радиоактивных изотопов.
7. Способ по п.6, в котором энергия ионизирующих излучений находится в диапазоне от примерно 50 до примерно 12000 кэВ.
8. Способ по п.6, в котором энергия рентгеновских излучений находится в диапазоне от примерно
50 до 6000 кэВ.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором указанные злокачественные клетки человека являются клетками солидной опухоли.
10. Фармацевтическая композиция, предназначенная для изменения или разрушения клеток-
мишеней у человека, когда указанные клетки подвергаются воздействию ионизирующих излучений, ука-
занная фармацевтическая композиция включает совокупность металлических наночастиц и фармацевти-
чески приемлемый наполнитель, где данные наночастицы изготовлены из металла, имеющего атомный
номер (Z) по меньшей мере 25, и средний наибольший размер наночастиц в этой совокупности находится
в диапазоне от примерно 80 до 105 нм.
Стандарт: наночастицы золота с ГЦК структурой для определения LA:
Диаметр (см)
dhkl
1,90
d,"
2,354
2,236
2,20
da"
2,039
2,243
3,10
Й220
1,442
2,235
3,65
с!зп
1,229
2,243
Индексирование наночастиц золо
2,239
та из примера 1:
Диаметр (см)
dhki
Определение
1,90
2,239
2,357
2,20
2,239
2,036
da"
3,20
2,239
1,400
d220
3,60
2,239
1,244
dan
Фиг. 2В
ГЦК структура золота
1.0 '
0 2 4
Доза (Гр)
Фиг. 3A
-в- КОНТРОЛЬ
-tt-GOLD-eO(17"m) -*-GOLD-B0(52.*i) -e-GOLD-80(119"*()
2 4
Доза (Гр)
Фиг. 3B
GOLD-6050 м"м GOLD-60100 MIM GOLD-60400 мим
Фиг. 7В
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
020942
- 1 -
(19)
020942
- 1 -
(19)
020942
- 1 -
(19)
020942
- 1 -
(19)
020942
- 1 -
(19)
020942
- 4 -
020942
- 19 -