[**]

1. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, в частности, когда индивид имеет одну или несколько доклинических форм рака, диагностированную первичную злокачественную опухоль и метастазирующий рак, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии, или для идентификации опухолеспецифического признака, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови больного раком; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови больного раком; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии.

2. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента, специфичного для первого набора характеристик.

3. Способ по п.2, где повышение количества маркера в первом наборе характеристик экспрессии по сравнению со вторым набором характеристик экспрессии указывает на наличие либо циркулирующей опухолевой клетки, либо ее субклеточного фрагмента, либо того и другого.

4. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии: выделение популяции фагоцитарных клеток индивида; отделение фагоцитарных клеток 2n от фагоцитарных клеток > 2n; получение первого набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток 2n; получение второго набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток > 2n; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии.

5. Способ по пп.1, 2 или 4, где один или несколько маркеров для выявления или идентификации раковой клетки выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, белка, липида, углевода и их комбинаций.

6. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одного или нескольких из нейтрофила, макрофага, моноцита, дендритной клетки и пенистой клетки.

7. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где нефагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одной или нескольких из T-клетки, В-клетки, нуль-клетки и базофила.

8. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости.

9. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из популяции лейкоцитов.

10. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием антител, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови выделяют с использованием антител.

11. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики.

12. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или выявления инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов.

13. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер выбран из одной или нескольких ДНК, РНК и микроРНК, соответствующих одному или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогена и гена супрессии опухоли, или по п.1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой ДНК или РНК, соответствующие двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам и генам супрессии опухоли, или их сочетания, или по п.4 для выявления раковой клетки, где один или несколько маркеров выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, микроРНК и их сочетаний, соответствующих двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам, генам супрессии опухоли или их сочетаниям.

14. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер представляет собой белок или полипептид или белок и пептид, кодируемые одним или несколькими генами злокачественной опухоли, и онкогеном и геном опухолевой супрессии, или способ по п.1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой белки или пептиды, кодируемые двумя или несколькими генами злокачественной опухоли, онкогенами, генами опухолевой супрессии или их сочетаниями.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, в частности, когда индивид имеет одну или несколько доклинических форм рака, диагностированную первичную злокачественную опухоль и метастазирующий рак, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии, или для идентификации опухолеспецифического признака, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови больного раком; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови больного раком; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии.

2. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента, специфичного для первого набора характеристик.

3. Способ по п.2, где повышение количества маркера в первом наборе характеристик экспрессии по сравнению со вторым набором характеристик экспрессии указывает на наличие либо циркулирующей опухолевой клетки, либо ее субклеточного фрагмента, либо того и другого.

4. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии: выделение популяции фагоцитарных клеток индивида; отделение фагоцитарных клеток 2n от фагоцитарных клеток > 2n; получение первого набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток 2n; получение второго набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток > 2n; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии; идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии.

5. Способ по пп.1, 2 или 4, где один или несколько маркеров для выявления или идентификации раковой клетки выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, белка, липида, углевода и их комбинаций.

6. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одного или нескольких из нейтрофила, макрофага, моноцита, дендритной клетки и пенистой клетки.

7. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где нефагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одной или нескольких из T-клетки, В-клетки, нуль-клетки и базофила.

8. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости.

9. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из популяции лейкоцитов.

10. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием антител, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови выделяют с использованием антител.

11. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики.

12. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или выявления инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов.

13. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер выбран из одной или нескольких ДНК, РНК и микроРНК, соответствующих одному или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогена и гена супрессии опухоли, или по п.1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой ДНК или РНК, соответствующие двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам и генам супрессии опухоли, или их сочетания, или по п.4 для выявления раковой клетки, где один или несколько маркеров выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, микроРНК и их сочетаний, соответствующих двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам, генам супрессии опухоли или их сочетаниям.

14. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер представляет собой белок или полипептид или белок и пептид, кодируемые одним или несколькими генами злокачественной опухоли, и онкогеном и геном опухолевой супрессии, или способ по п.1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой белки или пептиды, кодируемые двумя или несколькими генами злокачественной опухоли, онкогенами, генами опухолевой супрессии или их сочетаниями.

---

Евразийское 020920 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2015.02.27
(21) Номер заявки 201070863
(22) Дата подачи заявки 2009.01.19
(51) Int. Cl. G01N33/574 (2006.01)
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ КЛЕТКИ У ИНДИВИДА
(31) 61/022,033; 61/073,434
(32) 2008.01.18; 2008.06.18
(33) US
(43) 2011.02.28
(86) PCT/US2009/031395
(87) WO 2009/092068 2009.07.23
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ПРЕЗИДЕНТ ЭНД ФЕЛЛОУЗ ОФ ГАРВАРД КОЛЛЕДЖ (US)
(72) Изобретатель:
Кассис Амин И. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20070134689 US-A1-20060094067 US-A1-20070015172 US-A-5043267 US-A-4814434 US-A-6117985 US-A1-20070099209 US-A1-20060115832
CHAKRABORTY et al., A spontaneous murine melanoma lung metastasis comprised of host X tumor hybrids. Cancer Research, 1 May 2000, vol. 60, No. 9. pg. 2512-2519, pg. 2517, para 2
ENGELS. Infectious agents as causes of non-Hodgkin lymphoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. March 2007. Vol. 16. No. 3. pg. 401-404
KRAVTSOV et al.. Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte DNA degradation in response to Yersinia pestis and Staphylococcus aureus, Proc. SPIE, 4 May 2001. Vol. 4241. pg. 260-267 [online]. Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II. edited by Valery V. Tuchin [retrieved on 17.03.2009]. Retrieved from the internet: (57) Предложены варианты способа выявления злокачественной клетки у индивида, в частности когда индивид имеет одну или несколько доклинических форм рака, диагностированную первичную злокачественную опухоль и метастазирующий рак, а также способы и композиции для диагностики наличия злокачественной опухоли у индивида.
Родственные заявки
По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет по дате подачи предварительных патентных заявок США № 61/073434, поданной 18 июня 2008 г., и 61/022033, поданной 18 января 2008 г., каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для любых целей.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам идентификации маркеров состояний, таких как пол плода, или заболеваний, таких как геномные, протеомные, метаболомные, гликомные, гликопротеомные, липидомные и/или липопротеомные признаки опухоли, в клетках, полученных из жидкостей организма пациента.
Уровень техники
Опухоли возникают из нормальных клеток при накоплении генетических и эпигенетических изменений. Этот многостадийный процесс вовлекает множественные генетические изменения, которые ведут к постепенной трансформации нормальных клеток в злокачественный фенотип. Эти изменения заключаются в необратимых изменениях последовательности ДНК (например, мутациях, делециях, транслокациях) и ведут к активации онкогенов, инактивации генов супрессии опухоли и слиянию генов. Случайная природа этих событий приводит к генетической гетерогенности, которая обеспечивает молекулярные отпечатки трансформированных клеток (например, один или несколько компонентов клетки, таких как ДНК, РНК, белок, липид, углевод и т.п.), указывающих на злокачественную опухоль, которые приводят к их уникальным фенотипам. Таким образом, известно, что различными опухолями экспрессируются уникальные отличительные черты/признаки набора генов (Perou et al. (2000), Nature, 406:747; Lobenhofer et al. (2001), Health Perspect. 109:881; van't Veer et al. (2002), Nature, 415:530 (2002); Liotta and Kohn (2003), Nat. Genet. 33:10; Ginos et al. (2004), Cancer Res. 64:55; Liu (2005), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 102:3531; Grigoriadis et al. (2006), Breast Cancer Research, 8:R56).
Как первичные, так и метастатические опухоли могут быть бессимптомными и необнаруженными в течение нескольких лет. Однако эти латентные и скрытые опухоли, а также ранее диагностированные первичные и метастатические солидные опухоли каждые сутки теряют в кровоток приблизительно от 1 до 6 млн клеток/г опухоли. Большая часть этих циркулирующих опухолевых клеток, известных как СТС, претерпевает апоптоз и погибает, в то время как отдельные клеточные популяции могут приводить к ме-тастазирующему заболеванию. Также в крови пациентов со злокачественной опухолью находятся апоп-тотические тельца, ДНК, нуклеосомы, РНК и белки опухолевых клеток. Holmgren et al., Blood, 93, 3956 (1999). Были предприняты попытки для исследования того, можно ли идентифицировать признаки опухоли и можно ли их использовать для выявления или мониторинга злокачественных опухолей. См. Ran-sohoff, Nature Reviews Cancer, 5, 142 (2005) и McLerran et al., Clin. Chem. 54, 44 (2008).
ДНК может легко трансфицироваться в различные эукариотические клетки, т.е. после того как она интернализуется в цитоплазму клеток, она способна встраивать свои гены в геном клетки-хозяина. Например, нейтрофилы и макрофаги могут трансфицироваться быстро и с высокой эффективностью (5090%). Также был продемонстрирован перенос ДНК из прокариотических клеток в эукариотические, и полагают, что он происходит от эукариотических клеток в эукариотические. ДНК, высвобожденная из опухолевых клеток, обладает высокой трансформирующей активностью. Добавление супернатанта среды культивированных опухолевых клеток к нормальным клеткам приводит к появлению стольких трансформированных очагов, сколько возникает после трансфекции клонированным геном ras, введенным в качестве преципитата с кальцием. Более того, когда здоровым крысам инъецировали плазму крыс с опухолью (таким образом, содержащую опухолевую ДНК), в ДНК их клеток легких был выявлен маркерный ген опухоли, т.е. в клетках легких транскрибировались гены опухоли.
Лейкоциты начинаются с плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге и развиваются либо по миелоидной линии (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы), либо по лимфоидной линии (Т- и В-лимфоциты и естественные киллерные клетки). Основной функцией клеток миелоидного ростка (например, нейтрофилов и макрофагов) является фагоцитоз инфекционных организмов, нежелательных живых поврежденных клеток, стареющих и погибших клеток (апоптотиче-ских и некротических), а также выведение клеточного дебриса. Фагоциты из здоровых животных не размножаются и являются диплоидными, т.е. они имеют индекс ДНК, равный единице. В среднем, каждая клетка содержит <10 нг ДНК, <20 нг РНК и <300 нг белка.
В WBC здоровых доноров были выявлены различные паттерны вариабельности экспрессии генов, например паттерны, ассоциированные с типом клеток, полом, возрастом, межиндивидуальными отличиями и т.п. Например, "ассоциированный с лимфоцитами" кластер имеет 55 уникальных генов. В ней-трофилах также была описана значительная вариабельность экспрессии кластера из 52 уникальных генов. Гены в этом кластере могут быть сгруппированы в три семейства с возрастающей специфичностью:
(i) гены, повсеместно экспрессируемые во многих типах циркулирующих иммунных клеток;
(ii) гены, экспрессируемые клетками миелоидного ростка; и (iii) гены, специфичные к гранулоцитам.
Продолжительность жизни различных субпопуляций WBC варьирует от нескольких суток (например, нейтрофилы) до нескольких месяцев (например, макрофаги). Подобно другим типам клеток, лейко
циты стареют и в итоге погибают. В этом процессе старения фагоциты человека из крови и тканей (например, нейтрофилы) обладают всеми классическими маркерами запрограммированной гибели клеток (т.е. апоптоза), включая активацию каспазы, пикнотические ядра и фрагментацию хроматина. Эти клетки также экспонируют ряд меток для "поглощения" (например, фосфатидилсерин, сахара) на внеклеточных поверхностях их плазматических мембран. Следовательно, погибающие и погибшие клетки и их субклеточные фрагменты выводятся из тканей и крови другими фагоцитарными клетками.
Апоптоз фагоцитов ускоряется после их активации. Например, после поглощения нейтрофилами S.aureus на их плазматические мембраны выставляется фосфатидилсерин, тем самым вызывая их быстрый фагоцитоз макрофагами. Также было показано, что активированные моноциты связывают различные опухолевые клеточные линии с повышенными уровнями фосфатидилсерина.
Известно, что циркулирующие фагоцитарные клетки поглощают живые и погибшие СТС и их фрагменты в процессе, который приводит к повышению содержания ДНК (и других клеточных компонентов) фагоцитирующей клетки. Например, было показано, что апоптотические опухолевые клетки фагоцитируются макрофагами и дендритными клетками. Было показано, что вследствие такой фагоцитарной активности макрофаги крови, полученные от пациентов с раком предстательной железы, содержат значительно более высокие внутриклеточные уровни простат-специфического антигена (PSA), чем макрофаги, полученные от пациентов с доброкачественными состояниями предстательной железы. См. Herwig et al., Clinical Prostate Cancer, 3, 184 (2004) и Herwig et al., Prostate, 62, 290 (2005). Полагают, что это является следствием фагоцитоза опухолевых клеток. Известно, что в материнской крови циркулируют стволовые клетки плода, ядросодержащие эритроциты, лимфоциты плода, а также значительные количества бесклеточных нуклеиновых кислот плода. См. Cheung et al., Nat. Genet. 14, 264 (1996).
Также было показано, что, когда апоптотические тельца (инкапсулированные в мембрану клеточные фрагменты), происходящие из клеток лимфомы Беркитта человека, культивируют с моноцитами (фагоцитарными) или сосудистыми гладкомышечными клетками (нефагоцитарными) человека, моноциты демонстрируют высокий процент специфичных к вирусу Эпштейна-Барр (EBV), положительных по опухолевым генам клеток, в то время как гладкомышечные клетки проявляют частоту захвата и экспрессии приблизительно 0,01%.
Необходимы способы, которые обеспечивают раннюю диагностику наличия заболеваний (например, опухолей) у индивидов, например индивидов, о которых неизвестно, имеют ли они заболевание, или которые имеют рецидивирующее заболевание. Одной из задач настоящего изобретения является упрощение выявления специфичных для заболевания (например, опухолеспецифических) маркеров, например белков, РНК, ДНК, углеводов и/или липидов и т.п., в субпопуляциях лейкоцитов (WBC) у животного, включая человека.
Сущность изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения основаны на применении фагоцитов для определения наличия или отсутствия маркеров, ассоциированных с определенными заболеваниями или состояниями. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фагоциты поглощают клетки, и/или их фрагменты, и/или компоненты, циркулирующие в крови, которые характерны для конкретного заболевания или состояния. Содержимое фагоцитов обеспечивает маркерный профиль заболевания или состояния, например по содержанию ДНК и/или белков в клетке или по экспрессии ДНК или белка клеткой. Сравнение профилей экспрессии ДНК фагоцитарными и нефагоцитарными WBC приводит к выявлению опухолеспецифических, специфичных для заболевания или специфичных к состоянию ДНК-признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессируются, либо экспрессируются на сниженном уровне в нефагоцитарных клетках. Аналогично, профили экспрессии белков в фагоцитарных и нефагоцитарных WBC приводят к выявлению опухолеспецифических, специфичных для заболевания или специфичных к состоянию белковых признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрес-сируются, либо экспрессируются на сниженном уровне в нефагоцитарных клетках. Таким образом, в определенных вариантах осуществления способы по настоящему изобретению идентифицируют наличие солидных опухолей (например, первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида, предположительно имеющего злокачественную опухоль, и/или идентифицируют наличие злокачественной опухоли перед проявлением патологических признаков или симптомов и выявляют рецидив заболевания. Согласно другим вариантам осуществления способы по настоящему изобретению позволяют диагностировать некоторые заболевания или другие состояния путем идентификации конкретных признаков из крови или другой жидкости организма.
Настоящее изобретение основано, частично, на открытии, что компоненты клеток крови, такие как фагоцитарные клетки и нефагоцитарные клетки, индивида идеально подходят для простой идентификации и дифференциации опухолеспецифических и нормальных неспецифических признаков и, таким образом, устранения исходного следствия естественных межиндивидуальных (например, возраст, пол, этническая принадлежность, состояние здоровья) и временных отклонений в экспрессии генов.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены способы идентификации опухолеспецифических и/или специфичных для другого заболевания признаков в WBC (полученных из крови или других жидкостей организма, например мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной
жидкости и т.п.) индивида, предположительно имеющего злокачественную опухоль и/или одно или несколько других заболеваний или нарушений или состояний. Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают результаты для конкретного пациента, и они не зависят от популяционных средних профилей признаков и величин, полученных от "здоровых" контролей, т.е. исходный/фоновый при-знак(и) является специфичным для геномного, протеомного, метаболомного, гликомного, гликопротеом-ного, липидомного и/или липопротеомного профиля(ей) оцениваемого индивида. Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают персонализированное определение предрасположенности, скрининг, диагностику и мониторинг заболевания.
В определенных вариантах осуществления и ссылаясь на фиг. 1, настоящее изобретение основано на способности фагоцитарных клеток захватывать и поглощать жизнеспособные, погибающие и погибшие клетки (например, апоптотические клетки, некротические клетки), микроорганизмы (например, бактерии (например, Rickettsia), вирусы, грибы, дрожжи, простейшие и т.п.), субклеточные частицы и/или их фрагменты (тельца Кахаля, клеточную мембрану, центриоли, центросомы, гемы, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, ядерную мембрану, ядра, ядрышко, параспеклы, проимелоцитарные лейкозные тельца (тельца PML), рибосомы, шероховатую эндоплазматическую сеть, гладкую эндоплазматическую сеть, вакуоли, везикулы, микровезикулы и т.п.) и клеточный дебрис, например хромосомы, ДНК (ядерную и митохондриальную), экзоны, гены, интроны, белки, прионы, связывающие углеводы белки, гли-копротеины, липопротеины, РНК, микроРНК, липиды, апоптотические тельца, ядра, микровезикулы, экзосомы, нуклеосомы, полиморфные интерфазные кариосомные ассоциации молекул (PIKA), спеклы сплайсинга и т.п.) и отсутствие этих характеристик в нефагоцитарных клетках. Таким образом, анализ ДНК (ядерной, митохондриальной), РНК, микроРНК, белков, прионов, связывающих углеводы белков, гликопротеинов, липидов, липопротеинов, апоптотических телец, ядер, микровезикул, экзосом и/или нуклеосом и/или профилей экспрессии фагоцитарных WBC и их сравнение с нефагоцитарными клетками, полученными из крови или других жидкостей организма того же донора, обеспечивают идентификацию опухолеспецифических и/или специфичных для заболевания признаков в фагоцитарной клетке (специфичный для пациента сигнал), которые либо не экспрессируются, либо экспрессируются на значительно отличающемся уровне в нефагоцитарных клетках (специфичный для пациента шумовой уровень). Поскольку фагоцитарные или нефагоцитарные клетки происходят из одной плюрипотентной стволовой клетки в костном мозге, вычитание не ассоциированного с опухолью/индуцированного профиля признаков (идентифицированного в нефагоцитарных клетках) из признаков фагоцитарных клеток позволяет идентификацию опухолеспецифических и/или специфичных для заболевания признаков в образце конкретного пациента, как представлено на фиг. 2. Согласно некоторым другим вариантам осуществления клеточный дебрис в жидкостях организма интернализуется энтозом (поглощение клеток), эндоцитозом и пиноцитозом.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения и ссылаясь на фиг. 3, образец крови получают от индивида, где образец крови включает фагоцитарные и нефагоцитарные клетки (например, WBC). Затем фагоцитарную клетку(и) (например, нейтрофилы, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, пенистые клетки) отделяют от нефагоцитарной клетки(ок) (например, T-клеток, В-клеток, нуль-клеток, базофилов) различными способами, известными специалистам в данной области. В соответствии с настоящим изобретением фенотип WBC изменяют фагоцитозом живых/погибающих/погибших СТС (и их субклеточных фрагментов) и/или опухолеспецифических и/или специфичных для заболевания ДНК, РНК, белка, углевода и/или липидов, находящихся в крови. Фагоцитоз приводит к интернализации этих признаков опухоли и/или заболевания в фагоцитарную клетку и возможному встраиванию ДНК опухолевой клетки с ее опухолеспецифическими соматическими мутациями (или другими связанными с заболеванием мутациями) в ДНК нормальной фагоцитарной клетки (т.е. к трансфекции ею хромосом клетки-мишени). Последующая транскрипция "трансфицированной" ДНК фагоцитарных клеток в РНК и трансляция последней в белки приводят к фенотипу, отличающемуся от нефагоцитарных WBC.
Таким образом, сравнение с использованием геномных, протеомных, метаболомных, гликомных, гликопротеомных, липидомных и/или липопротеомных способов, известных специалистам в данной области, профилей экспрессии ДНК, РНК, белков и/или липидов в фагоцитарных и нефагоцитарных WBC (как показано на фиг. 3), полученных от индивида со злокачественной опухолью (и/или одним или несколькими другими заболеваниями), используют для идентификации опухолеспецифического (и/или специфичного для заболевания, и/или специфичного для состояния) признака(ов) и/или профиля(ей) селективно в фагоцитарных клетках, который подтверждает наличие скрытой опухоли(ей) (или других заболеваний или состояний) у индивида. В соответствии с настоящим изобретением вычитание профилей ДНК, РНК, белков, углеводов и/или липидов фагоцитарных клеток из профилей нефагоцитарных клеток обеспечивает способ идентификации (например, после геномного, протеомного, метаболомного, гликом-ного, гликопротеомного, липидомного и/или липопротеомного анализов) опухолеспецифических (и/или специфичных для заболевания) признаков в образце крови (и/или другом биологическом образце) конкретного пациента и означает наличие скрытой опухоли(ей) и/или другого заболевания, как представлено на фиг. 2.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления фагоцитарные и нефагоцитарные клетки,
например, полученные из крови или одного или нескольких других биологических образцов (например, мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной жидкости и т.п.) разделяют. Поскольку фагоцитоз СТС (и их субклеточных фрагментов) фагоцитарными WBC приводит к интернализации опухолевых клеток в цитоплазму фагоцитарных клеток, количество ДНК, РНК, белка, углевода и/или липида в фагоцитарных клетках может превышать их количество в нефагоцитарных клетках. Таким образом, сравнение количества и профиля этих компонентов между фагоцитарными и нефагоцитарными клетками используют в качестве признака злокачественной опухоли.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрен способ диагностики наличия злокачественной клетки у индивида. Способ включает стадии получения первого профиля экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида, получения второго профиля экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида, сравнения первого и второго профилей, идентификации дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, и соотнесения дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, с наличием злокачественной клетки у индивида.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрен способ идентификации опу-холеспецифического признака у индивида, имеющего злокачественную опухоль. Способ включает стадии получения первого профиля экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида, имеющего злокачественную опухоль, получения второго профиля экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида, имеющего злокачественную опухоль, сравнения первого и второго профилей экспрессии, идентификации дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, и сопоставления дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для опухолеспецифического признака у индивида, имеющего злокачественную опухоль.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрен способ диагностики наличия злокачественной клетки у индивида, включающий стадии получения первого профиля экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида и получения второго профиля экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида. Способ включает стадии сравнения первого и второго профилей экспрессии, идентификации наличия циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента, специфичного для первого профиля экспрессии, и сопоставления наличия циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента с наличием злокачественной клетки у индивида. В некоторых аспектах повышение количества маркера в первом профиле экспрессии относительно второго профиля экспрессии указывает на наличие циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления и ссылаясь на фиг. 4-6, предусмотрен способ диагностики наличия злокачественной клетки у индивида, включающий стадии выделения популяции фагоцитарных клеток индивида и отделения фагоцитарных клеток 2n от фагоцитарных клеток > 2n. Способ включает стадии получения первого профиля экспрессии из фагоцитарных клеток 2n, получения второго профиля экспрессии из фагоцитарных клеток > 2n, сравнения первого и второго профилей экспрессии и идентификации дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии. Также способ включает стадию сопоставления дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, с наличием злокачественной клетки у индивида.
В некоторых аспектах способов, описанных в настоящем документе, маркеры включают ДНК, РНК, микроРНК (например, ДНК или РНК, соответствующую гену злокачественной опухоли, онкогену, гену супрессии опухоли или любой их комбинации), белок (например, белок или полипептид, кодируемый геном злокачественной опухоли, онкогеном, геном супрессии опухоли или любой их комбинацией), ли-пид, углевод и/или любую их комбинацию. В некоторых аспектах фагоцитарная клетка крови представляет собой нейтрофил, макрофаг, моноцит, дендритную клетку, эозинофил, пенистую клетку или любую их комбинацию. В некоторых аспектах нефагоцитарная клетка крови представляет собой T-клетку, В-клетку, нуль-клетку, базофил или любую их комбинацию. В других аспектах фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови с использованием способов, известных специалистам в данной области, например с использованием антител. В других аспектах фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из популяции лейкоцитов с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как активированная флуоресценцией сортировка клеток (FACS). В других аспектах фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессиро-ванным на плазматических мембранах популяций WBC. В других аспектах фагоцитарную клетку и нефагоцитарную клетку крови разделяют одним или несколькими способами, включающими фильтрацию, центрифугирование на основе градиента, элюирование, способы микрофлюидики и т.п. В некоторых аспектах индивид имеет одну или несколько из скрытой (например, латентной, недиагностированной, неявной или замаскированной) злокачественной опухоли, ранее диагностированной первичной злокачественной опухоли и метастатической злокачественной опухоли. В некоторых аспектах способ включает стадию сопоставления наличия одного или нескольких маркеров с эффективностью терапии злокачественной опухоли.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления описанные выше способы применяют для выявления, идентификации или диагностики наличия инфекционного агента или заболевания, отличного от злокачественной опухоли, путем сравнения профилей экспрессии фагоцитарных и нефагоцитарных клеток для определения дифференциальной экспрессии маркеров, характерных для инфекционного агента или заболевания, отличного от злокачественной опухоли. В другом аспекте один или несколько способов, описанных в настоящем документе, используют для выявления профилей ДНК, РНК, белков, углеводов и/или липидов патогенов (например, вирусов, бактерий, риккетсий, простейших, гельминтов, грибов, дрожжей и т.п.) и других заболеваний или патологий (например, болезни Альцгеймера, демен-ции, сердечной недостаточности, атеросклероза, артрита, генетических нарушений, заболеваний костей, желудочно-кишечных заболеваний, прионных заболеваний и инфекционных заболеваний).
В некоторых аспектах способов, описанных в настоящем документе, маркеры включают ДНК патогена, РНК патогена, белок патогена, полипептид патогена, липид патогена и любую их комбинацию. В некоторых аспектах инфекционный агент представляет собой вирус, бактерию, гриб, паразит, инфекционный белок и любую их комбинацию. В некоторых аспектах способ включает стадию соотнесения наличия одного или нескольких маркеров с эффективностью терапии от патогена.
Способы и композиции, описанные в настоящем документе, таким образом, обеспечивают простую идентификацию опухолеспецифических признаков в образце крови пациента, независимо от популяци-онных средних профилей признаков и величин, полученных от "здоровых" контролей. Конкретно, способы и композиции, описанные в настоящем документе, могут легко и экономично: (i) идентифицировать наличие опухоли (первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида перед проявлением патологических признаков и симптомов; (ii) идентифицировать наличие опухоли (первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида, предположительно имеющего злокачественную опухоль; и/или (iii) выявить рецидив опухоли (первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида, проходящего/прошедшего различные способы лечения.
Таким образом, способы и композиции, описанные в настоящем документе, (i) обеспечивают неин-вазивный скрининг злокачественной опухоли; (ii) позволяют диагностировать опухоли, особенно в наиболее ранние моменты времени; (iii) перемещают целенаправленное вмешательство(а) на значительно более ранний момент на пути прогрессии опухоли, тем самым предупреждая развитие метастатического заболевания; (iv) осуществляют мониторинг раннего ответа на общепринятый или экспериментальный способ(ы) лечения; (v) предсказывают ответ на общепринятый или экспериментальный способ(ы) лечения; (vi) упрощают выбор эффективного способа лечения, позволяя быструю идентификацию неэффективных способов лечения, побочные эффекты которых могут не соотноситься с ожидаемой пользой; (vii) минимизируют неудобство и нетрудоспособность пациента; (viii) позволяют тесное сопряжение выявления, диагностики и лечения (например, персонализацию терапии злокачественной опухоли); (ix) обеспечивают предсказание и раннее выявление типа и стадии опухоли; (х) обеспечивают выбор терапии; (xi) определяют, является ли опухоль метастазирующей; (xii) обеспечивают способы мониторинга заболеваний и (xiii) обеспечивают способы прогноза заболеваний.
Краткое описание чертежей
Патент или заявка содержит по меньшей мере один рисунок, выполненный в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветным рисунком(ами) будут предоставлены патентным ведомством при запросе и осуществлении необходимой оплаты. Указанные выше и другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут полнее понятны из представленного ниже подробного описания иллюстративных вариантов осуществления, совместно с прилагаемыми фигурами.
На фиг. 1 схематично представлен предполагаемый каскад, ведущий к приобретению опухолеспе-цифических ДНК, РНК, белковых и/или липидных признаков фагоцитами после поглощения живых СТС, апоптотических СТС, фрагментированных СТС, опухолевой ДНК, РНК, белков и липидов, высвобожденных живыми и/или апоптотическими опухолевыми клетками. Следует отметить, что только фагоцитарные клетки (но не нефагоцитарные клетки) приобретают признаки опухоли.
На фиг. 2 схематично представлен аналитический способ, используемый для идентификации признаков злокачественной опухоли, экспрессированных в/из фагоцитарных клеток пациенток с раком яичника (ОС).
На фиг. 3 схематично представлена общая блок-схема одного варианта осуществления способа по изобретению.
На фиг. 4 схематично представлен предполагаемый каскад, ведущий к приобретению опухолеспе-цифических ДНК, РНК, белковых и липидных признаков фагоцитами крови после поглощения живых СТС, апоптотических СТС, фрагментированных СТС, опухолевой ДНК, РНК, белков и липидов, высвобождаемых жизнеспособными и/или апоптотическими опухолевыми клетками. Следует отметить, что содержание ДНК в фагоцитах после фагоцитоза составляет > 2n.
На фиг. 5 схематично представлены аналитические подходы, используемые для идентификации признаков рака молочной железы (ВС) у животных, имеющих ВС.
На фиг. 6 схематично представлена общая блок-схема другого варианта осуществления способа по изобретению.
На фиг. 7 представлен анализ с помощью гель-электрофореза тотальной РНК, выделенной из клеток
LNCaP и LLC1.
На фиг. 8 приведен выход и количество РНК, полученной из лейкоцитов мышей (WBC).
На фиг. 9A-D представлены чипы, на которых показаны семь активированных (в > 2 раз) связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах мышей nude с опухолью LNCaP (рак предстательной железы человека).
(А) Опухоль LNCaP. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LNCaP (NT). (С) T-клетки, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LNCaP (TT). (D) Нейтрофилы, полученные от мышей nude, не имеющих опухоли (NN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в NT в > 2 раз превышала экспрессию в NN и TT.
На фиг. 10A-D представлены чипы, на которых показаны три активированных связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в макрофагах мышей nude с опухолью LNCaP (рак предстательной железы человека).
(А) Опухоль LNCaP. (В) Макрофаги, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LNCaP (MT). (С) T-клетки, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LNCaP (TT). (D) Макрофаги, полученные от мышей nude, не имеющих опухоли (MN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтро-филах от мышей, не имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в MT в > 2 раз превышала экспрессию в MN и TT.
На фиг. 11A-D представлены чипы, на которых показаны четыре активированных (в > 2 раз) связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в нейтрофилах мышей nude с опухолью LS174T (рак толстого кишечника человека).
(А) Опухоль LS174T. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LS174T (NT). (С) T-клетки, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LS174T (TT). (D) Нейтрофилы, полученные от мышей nude, не имеющих опухоли (NN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессирован-ные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в NT в > 2 раз превышала экспрессию в NN и TT.
На фиг. 12A-D представлены чипы, на которых показаны три активированных (в > 2 раз) связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в макрофагах мышей nude с опухолью LS174T (рак толстого кишечника человека).
(А) Опухоль LS174T. (В) Макрофаги, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LS174T (MT). (С) T-клетки, полученные от мышей nude, имеющих опухоли LS174T (TT). (D) Макрофаги, полученные от мышей nude, не имеющих опухоли (MN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в ней-трофилах от мышей, не имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в MT в > 2 раз превышала экспрессию в MN и TT.
На фиг. 13A-D представлены чипы, на которых показаны пять активированных (в > 2 раз) связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах мышей С57ЛБ1 с опухолью LLC1 (мета-стазирующий рак легкого мыши).
(А) Опухоль LLC1. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей С57ЛБ1, имеющих опухоли LLC1 (NT). (С) T-клетки, полученные от мышей С57ЛБ1, имеющих опухоли LLC1 (TT). (D) Нейтрофилы, полученные от мышей С57ЛБ1, не имеющих опухоли (NN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в NT в > 2 раз превышала экспрессию в NN и TT.
На фиг. 14A-D представлены чипы, на которых показаны два активированных (в > 2 раз) связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в макрофагах С57ЛБ1 с опухолью LLC1 метастазирую-щий рак легкого мыши.
(А) Опухоль LLC1. (В) Макрофаги, полученные от мышей С57Л31, имеющих опухоли LLC1 (MT). (С) T-клетки, полученные от мышей С57ЛБ1, имеющих опухоли LLC1 (TT). (D) Макрофаги, полученные от мышей С57ЛБ1, не имеющих опухоли (MN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в MT в > 2 раз превышала экспрессию в MN и TT.
На фиг. 15A-D представлены чипы, на которых показаны два активированных (в > 2 раз) связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах мышей С57ЛБ1 с опухолью B16F10 (ме
тастазирующая меланома мыши).
(А) Опухоль B16F10. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей С57Я31, имеющих опухоли B16F10 (NT). (С) T-клетки, полученные от мышей С57ЛБ1, имеющих опухоли B16F10 (TT). (D) Нейтрофилы, полученные от мышей С57ЛБ1, не имеющих опухоли (NN). В круги заключены признаки, экспрессирован-ные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспресси-рованные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в NT в > 2 раз превышала экспрессию в NN и TT.
На фиг. 16A-D представлены чипы, на которых показан один активированный (в > 2 раз) связанный со злокачественной опухолью ген, выявленный в макрофагах С57ЛБ1 с опухолью B16F10 (метастази-рующая меланома мыши).
(А) Опухоль B16F10. (В) Макрофаги, полученные от мышей С57Я31, имеющих опухоли B16F10 (MT). (С) T-клетки, полученные от мышей С57Л31, имеющих опухоли B16F10 (TT). (D) Макрофаги, полученные от мышей С57ЛБ1, не имеющих опухоли (MN). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессирован-ные в нейтрофилах от мышей, имеющих опухоль (D), и в нефагоцитарных T-клетках (С). Экспрессия в MT в > 2 раз превышала экспрессию в MN и TT.
На фиг. 17A-D представлены чипы, на которых показаны пять активированных (в > 2 раз), связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах пациента с раком головы и шеи (плоскоклеточная карцинома).
(А) Биоптат нормальной ткани (кожи). (В) Биоптат опухолевой ткани. (С) Нейтрофилы, полученные из крови пациента (NT). (D) T-клетки, полученные из крови пациента (TT). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (В) и в нейтрофилах из крови пациента (С) и минимально экс-прессированные или неэкспрессированные в нормальной коже (А) или нефагоцитарных T-клетках (D). Экспрессия в NT в > 2 раз превышала экспрессию в TT и коже.
На фиг. 18A-D представлены чипы, на которых показаны 23 активированных (в > 2 раз), связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в макрофагах пациентки с раком яичника (аденокарци-нома).
(А) Макрофаги, полученные из крови пациента (MT). (В) T-клетки, полученные из крови пациента (TT). В круги заключены признаки, экспрессированные в макрофагах пациента (А) и минимально экспрессированные в нефагоцитарных T-клетках (В). Экспрессия в MT в > 2 раз превышала экспрессию в TT.
На фиг. 19 представлен способ, использованный для идентификации признаков опухоли в фагоцитарных клетках. В этом примере количественно определяли интенсивность экспрессии ассоциированных со злокачественной опухолью генов в макрофагах, имеющих опухоль животных (MT) по сравнению с интенсивностью их экспрессии в T-клетках из тех же животных (TT), и идентифицировали гены, сверх-экспрессированные в > 2 раз. Далее количественно определяли интенсивность всех экспресированных генов в MT и сравнивали с генами в макрофагах, полученных от не имеющих опухоли животных (MNT) и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные в > 2 раз. Гены, общие для обоих списков, отбирали и сравнивали с генами, экспрессированными указанной опухолью (затемненная область).
На фиг. 20А, В представлено сравнение интенсивности экспрессии генов в (А) макрофагах (MLNCaP), полученных от мышей nude, имеющих опухоли предстательной железы человека LNCaP, и в T-клетках тех же животных (T-клетках NCLaP), (В) в MLNCaP и макрофагах, полученных от не имеющих опухоль животных (Мбез опухоли), (С) в нейтрофилах (NLNCaP), полученных от мышей nude, имеющих опухоли предстательной железы человека LNCaP, и T-клетках от тех же животных (T-клетках LNCaP), и (D) NLNCaP и макрофагах, полученных от не имеющих опухоль мышей (N без опухоли). Гены, обозначенные красным цветом, сверхэкспрессировались в > 2 раз; гены, обозначенные зеленым цветом, имели экспрессию, сниженную в
> 2 раз.
На фиг. 21 приведена экспрессия связанных со злокачественной опухолью генов в фагоцитарных нейтрофилах (N) и макрофагах (М).
На фиг. 22 приведены связанные со злокачественной опухолью гены, активированные (> 2 раз) в фагоцитарных макрофагах пациентки с раком яичника по сравнению с нефагоцитарными T-клетками.
На фиг. 23 представлен SDS (10%) гель-электрофорез белкового образца (5,9 мкг), полученного из WBC мыши.
На фиг. 24 представлен вестерн-блот анализ экспрессии TAG-72 и PSA в T-клетках и моноцитах/макрофагах (М/М), полученных от имеющих опухоль мышей, иллюстрирующий наличие признаков только в фагоцитарных клетках.
Подробное описание некоторых вариантов осуществления
Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу предоставления индивидуального для пациента профиля экспрессии маркеров, ассоциированных с заболеваниями, инфекционными агентами и состояниями организма на основе клеточного содержимого и/или профилей экспрессии фагоцитарных клеток. Согласно одному аспекту настоящего изобретения клеточное содержимое и/или профили экспрессии фагоцитарных клеток сравнивают с известными маркерами конкретного болезненного состояния или расстройства для выявления и/или диагностики конкретного болезненного состояния или расстройства. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения клеточное содержимое и/или профиль экспрессии фагоцитарных клеток сравнивают с клеточным содержимым и/или профилем экспрессии нефагоцитарных клеток из крови отдельного пациента. Вычитание клеточного содержимого и/или профиля экспрессии нефагоцитарных клеток из клеточного содержимого и/или профиля экспрессии фагоцитарных клеток дает клеточное содержимое и/или профиль экспрессии, репрезентативный только для болезненного состояния индивида.
Согласно дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения получают популяцию фагоцитарных клеток индивида и клеточное содержимое и/или профиль экспрессии популяции, где содержание ДНК превышает 2n, сравнивают с клеточным содержимым и/или профилем экспрессии фагоцитарных клеток из той же популяции, где содержание ДНК составляет 2n. Согласно следующему дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения получают популяцию фагоцитарных клеток индивида и профиль экспрессии популяции фагоцитарных клеток, где содержание РНК, белков, углеводов и/или липидов превышает норму и индекс ДНК превышает 1, сравнивают с профилем экспрессии фагоцитарных клеток из той же популяции, где содержание РНК, белков, углеводов и/или липи-дов является нормальным и/или индекс ДНК составляет 1.
Такой специфичный для пациента профиль экспрессии устраняет зависимость от среднего популя-ционного профиля признаков для конкретного заболевания или инфекционного агента, которая может вносить ошибку в выявление и диагностику конкретного заболевания у индивида. Такой индивидуальный для пациента профиль экспрессии для болезненного состояния по настоящему изобретению позволяет персонализованное выявление, диагностику и лечение у индивида.
Ссылаясь на фиг. 1-3 и согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, сравнивали профили экспрессии генов фагоцитарных и нефагоцитарных WBC, полученные от мышей, имеющих примерно трехнедельные подкожные (s.c.) опухоли человека (аденокарцинома предстательной железы LNCaP или аденокарцинома толстого кишечника LS174^ или опухоли мыши (метастазирующая меланома B16F10, вводимая внутривенно, или рак легкого LLC1, инъецированный подкожно). Результаты показали, что нейтрофилы и макрофаги, полученные от имеющих опухоль мышей, экспрессируют различные онкогены и другие связанные со злокачественной опухолью признаки, которые также экс-прессируется в каждой из соответствующих опухолей. См. фиг. 9-16 и 19-21. Эти связанные со злокачественной опухолью гены и онкогены (например, ERBB2, Jun, Fos и т.д.) не экспрессируются или экс-прессируются на минимальном уровне (i) нефагоцитарными T-клетками, выделенными из мышей, имеющих опухоль, и (ii) нейтрофилами и макрофагами, полученными от не имеющих опухоли мышей. Более того, было выявлено, что опухолеспецифические белки экспрессируют только фагоцитарные клетки от имеющих опухоль мышей. См. фиг. 23 и 24. СТС, и/или опухолеспецифические ДНК, и/или белки в крови мышей фагоцитировались, и часть ДНК опухолевой клетки с опухолеспецифическими мутациями и генами встраивалась, вероятно, путем трансфекции (без связи с какой-либо теорией) в ДНК нормального фагоцита, транскрибировалась в РНК и транслировалась в белок.
Ссылаясь на фиг. 1-3 и согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления настоящего изобретения, также сравнивали профили экспрессии генов фагоцитарных и нефагоцитарных WBC, полученных от пациентов с опухолями головы и шеи или с раком яичника. Результаты показали, что нейтро-филы и макрофаги, полученные от этих пациентов, экспрессируют различные онкогены и другие связанные со злокачественной опухолью генные признаки, которые также экспрессируются в каждой из соответствующих опухолей. См. фиг. 17-18 и 22. Эти связанные со злокачественной опухолью гены и онкогены не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне нефагоцитарными T-клетками, полученными от того же конкретного пациента. СТС и/или опухолеспецифическая ДНК и РНК в крови пациента фагоцитировались, и часть ДНК и/или РНК опухолевых клеток с ее опухолеспе-цифическими мутациями и генами встраивалась, вероятно, путем трансфекции (без связи с какой-либо теорией) в ДНК нормальных фагоцитов, транскрибировалась в РНК и транслировалась в белок.
Ссылаясь на фиг. 4-6 и согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления, количественный анализ профилей экспрессии ДНК (ядерной и/или митохондриальной), РНК, микроРНК, белка и/или липидов в фагоцитарных клетках (например, макрофагах), полученных из крови одного или нескольких других биологических образцов (например, мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной жидкости и т.п.), в которых (1) содержание ДНК составляет > 2n (Pn> 2) или (2) содержание РНК, белков, углеводов и/или липидов превышает норму, т.е. в клетках, которые осуществили фагоцитоз СТС и/или их субклеточных фрагментов или ДНК/РНК/липидов (т.е. опухолеспецифических признаков или других специфичных для заболевания признаков) и/или имеют индекс ДНК, превышающий единицу, и сравне
ние этих показателей с показателями той же популяции фагоцитарных клеток (например, макрофагов), в которых (1) содержание ДНК составляет 2n (Pn=2) или (2) содержание РНК, белков, углеводов и/или ли-пидов является нормальным, т.е. клеток, которые не осуществляли фагоцитоз СТС и/или их субклеточных фрагментов и имеют индекс ДНК, равный единице, обеспечивает способ выявления опухолеспеци-фических (или специфичных для другого заболевания) признаков в клетках Pn> 2 (специфичный для пациента сигнал), которые ранее не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне в клетках Pn=2 (специфичный для пациента шумовой уровень). Ссылаясь на фиг. 6, вычитание профилей ДНК, РНК, белков и/или липидов для Pn=2 из этих показателей для Pn> 2, как показано на фиг. 5, обеспечивает способ идентификации (например, после одного или нескольких геномных, протеомных, метабо-ломных, гликомных, гликопротеомных, липидомных и/или липопротеомных анализов) опухолеспецифи-ческих (и/или специфичных для заболевания, и/или специфичных для состояния) признаков в образце крови (или в одном, или нескольких других биологических образцах, например, таких как другие жидкости организма) животного и/или человека со злокачественной опухолью (и/или заболеванием, и/или состоянием организма) и указывает на наличие скрытой опухоли(ей), и/или других заболеваний, и/или других состояний. В отличие от способов, описанных выше, в которых геномный, протеомный, метаболом-ный, гликомный, гликопротеомный, липидомный и/или липопротеомный профили фагоцитарных клеток сравнивают с профилями нефагоцитарных клеток, главными преимуществами этого аналитического способа выявления в соответствии с настоящим изобретением является то, что (i) в нем используется одна субпопуляция фагоцитарных клеток в качестве источника "опухолеспецифических" (например, макрофаги Pn> 2) и "нормальных неспецифических" (например, макрофаги Pn=2) признаков, т.е. в обоих случаях исходный генотип является одним и тем же; и (ii) клетки, которые приобрели признак (например, ней-трофилы Pn> 2), не разрежены клетками, которые не фагоцитировали и, таким образом не приобрели, погибшие СТС и/или их фрагменты (например, нейтрофилами Pn=2).
Ссылаясь на фиг. 4-6 и согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления, количественный анализ фагоцитарных клеток (например, макрофагов), полученных из крови или одного или нескольких других биологических образцов или жидкостей организма (например, мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной жидкости и т.п.), в которых внутриклеточное содержание вследствие фагоцитоза или интернализации других живых, погибающих или погибших (например, апоптотических или некротических) клеток, апоптотических телец, ядер, микровезикул, экзосом, нуклеосом, митохондрий, эндоплазматической сети и т.п., превышает их содержание в той же популяции фагоцитарных клеток (например, макрофагов) с нормальным внутриклеточным содержанием (PNIC), т.е. клеток, которые не фагоцитировали какие-либо из указанных выше клеток и клеточного дебриса (специфичный для пациента шумовой уровень), обеспечивает способ выявления опухолеспецифических (или специфичных для другого заболевания или другого состояния) признаков в фагоцитах с повышенным внутриклеточным содержанием (PnC), которые ранее не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне в фагоцитах с нормальным внутриклеточным содержанием (специфичный для пациента шумовой уровень). Ссылаясь на фиг. 6, вычитание ДНК, РНК, белковых и/или липидных профилей PNIC из профилей PnC, как показано на фиг. 5, обеспечивает способ идентификации (например, после одного или нескольких геномных, протеомных, метаболомных, гликомных, гликопротеомных, липидомных и/или липопро-теомных анализов) опухолеспецифических (и/или специфичных для заболевания) признаков в образце крови (или одном, или нескольких других биологических образцах, например, таких как другие жидкости организма) животного со злокачественной опухолью или другим заболеванием, и указывает на наличие скрытой опухоли(ей) и/или другого заболевания. В отличие от способов, описанных выше, в которых геномные, протеомные, метаболомные, гликомные, гликопротеомные, липидомные и/или липопротеом-ные профили фагоцитарных клеток сравнивают с профилями нефагоцитарных клеток, главными преимуществами этого аналитического способа выявления в соответствии с настоящим изобретением является то, что (i) в нем используется одна субпопуляция фагоцитарных клеток в качестве источника "специфичных для заболевания" (например, макрофаги PIIC) и "нормальных неспецифических" (например, макрофаги PNIC) признаков, т.е. в обоих случаях исходный генотип является одним и тем же; и (ii) клетки, которые приобрели признак (например, нейтрофилы PIIC), не разрежены клетками, которые не фагоцитировали, и, таким образом, не приобрели погибшие СТС и/или их фрагменты (например, нейтрофи-лами PNIC).
Способы, описанные в настоящем документе, (i) имеют высокую специфичность, чувствительность и точность и должны обеспечивать выявление опухолеспецифических (и/или специфичных для другого заболевания) и нормальных неспецифических признаков, присутствующих в образце крови (или другом биологическом образце, например, таком как жидкость организма); и (ii) устраняют "неоднородность фона", которая, как известно, существует между индивидами вследствие имманентных (например, возраст, пол, этническая принадлежность, состояние здоровья и т.п.) и временных отклонений в экспрессии генов. Таким образом, в некоторых аспектах изобретение относится к неинвазивным способам анализа для раннего выявления скрытых первичных и метастазирующих опухолей (и/или одного или нескольких других заболеваний или состояний) у пациентов, т.е. до того, как заболевание может быть диагностировано общепринятыми способами визуализации (например, PET, MRI, СТ и т.п.), и, таким образом, оно
обеспечивает основу для более точного принятия решения относительно необходимости во вмешательстве и его стратегии, профилактики и лечения индивидов со злокачественной опухолью.
Как используют в настоящем документе, термин "опухолеспецифический маркер" включает, но не ограничивается ими, один или несколько клеточных компонентов, таких как одна или несколько последовательностей ДНК, одна или несколько последовательностей РНК, один или несколько белков, один или несколько полипептидов, один или несколько липидов и т.п. В некоторых аспектах опухолеспеци-фический маркер присутствует в одном или нескольких WBC, например, таких как нейтрофил, макрофаг и/или дендритная клетка.
Как используют в настоящем документе, термин "связанные со злокачественной опухолью гены" относится к генам, например, таким как гены злокачественной опухоли, онкогены и/или гены супрессии опухолей, которые имеют измененную экспрессию (например, повышенную экспрессию или сниженную экспрессию по сравнению с незлокачественной клеткой) в злокачественной клетке (например, WBC, например, такой как макрофаг, нейтрофил, T-клетка или сходные с ними). В данной области известно множество связанных со злокачественной опухолью генов. Связанные со злокачественной опухолью генов включают, например, но не ограничиваются ими, ERBB2, JUN, RBI, SUPP1, MDM2, MAP2K1, ММР2, PDGFB, PLAUR, FGR, MYCL1, BLYM, NRAS1, РЕ1, SKI, TRK, ABL2, MYCN, RAB1, REL, RALB, LCO, ERBB4, RAF1, ЕСТ2, KIT, FGF5, GRO1, GRO2, GRO3, FMS, PIM, KRAS1P, FYN, MYB, ROS1, MAS1, RALA, MYCLK1, GLB, ARAF2, MET, BRAF, MOS, LYN, MYBL1, MYC, OVC, VAV2, BMI1, RET, HRAS, SPI1, RELA, SEA, EMS1, ETS1, KRAS2, ERBB3, GLI, FLT, BRCA2, RBI, FOS, AKT1, ELK2, FES, MAF, TP53, CRK, ERBA1, NF1, EVI2, ERBBB2, INT4, BRCA1, YES1, JUND, JUNB, MEL, LPSA, VAV1, AKT2, FOSB, RRAS, HKR1, HKR2, ERBAL2, SRC, MYBL2, ETS2, ERG, ARAF1, YUASA, HS2, INT3, SNO, RMYC, BMYC, HRASP, TC21, TIM, PTI-1, JAK, один или несколько представителей семейства СЕА (см., например, Zhou et al. (2001), Gene 264:105), PSA, MUC-16 и т.п.
Как используют в настоящем документе, термин "злокачественная опухоль" относится к различным типам злокачественных новообразований, большинство из которых могут инвазировать окружающие ткани и метастазировать в другие области (см., например, PDR Medical Dictionary, 1st edition (1995), включенный в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для любых целей). Термины "новообразование" и "опухоль" относятся к аномальной ткани, которая растет путем клеточной пролиферации более быстро, чем нормальная ткань, и продолжает расти после стимулов, которые предназначены для прекращения пролиферации. Id. Такая аномальная ткань демонстрирует частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью, и она может быть либо доброкачественной (т.е. доброкачественная опухоль), либо злокачественной (т.е. злокачественная опухоль).
Примеры основных категорий злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, карциномы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из эпителиальных клеток, например, таких как распространенные формы рака молочной железы, предстательной железы, легкого и толстого кишечника), саркомы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из соединительной ткани или мезенхимных клеток), лимфомы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из кроветворных клеток), лейкозы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из кроветворных клеток), герминомы (т.е. опухоли, происходящие из тотипотентных клеток. У взрослых они часто встречаются в яичках и яичниках; у плодов, младенцев и детей раннего возраста они наиболее часто встречаются по средней линии тела, в частности на вершине крестца), бластные опухоли (т.е., как правило, злокачественная опухоль, которая сходна с незрелой или эмбриональной тканью) и т.п.
Примеры типов новообразований, охватываемых настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, новообразования, ассоциированные со злокачественными опухолями нервной ткани, кроветворной ткани, молочной железы, кожи, кости, предстательной железы, яичников, матки, шейки матки, печени, легкого, головного мозга, гортани, желчного пузыря, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидной железы, щитовидной железы, надпочечников, иммунной системы, головы и шеи, толстого кишечника, желудка, бронхов и/или почек.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, применяют для выявления, идентификации и/или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием хромосомных нарушений у плода (например, синдрома Дауна, аутизма и сходных нарушений, являющихся разновидностями аутизма (включая, но не ограничиваясь ими, синдром Аспергера и аутистические расстройства - в остальных случаях), серповидно-клеточной анемии, таляссемии и т.п.) благодаря наличию клеток плода и ДНК в материнской крови. Скрининг и диагностику одного или нескольких из этих нарушений можно проводить с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких хромосомных маркеров, например ДНК и РНК и т.п., в фагоцитарных клетках материнской крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно применять для определения пола плода у беременной женщины путем выявления наличия протеомных, липидомных и/или геномных признаков плода в крови беременной женщины, поскольку известно, что стволовые клетки плода, ядросодержащие эритро
циты, лимфоциты плода, а также значительные количества бесклеточных нуклеиновых кислот плода, циркулируют в материнской крови. В соответствии со способами, описанными в настоящем документе, клеточное содержание и/или профиль экспрессии фагоцитарных клеток сравнивают с клеточным содержанием и/или профилем экспрессии нефагоцитарных клеток из крови беременной женщины. Вычитание клеточного содержания и/или профиля экспрессии нефагоцитарных клеток из клеточного содержания и/или профиля экспрессии фагоцитарных клеток обеспечивает клеточное содержание и/или профиль экспрессии, репрезентативный для пола плода, вынашиваемого беременной женщиной.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для выявления, идентификации и/или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием протеомных и/или геномных признаков миоцитов в крови субъектов, имеющих риск развития заболевания сердца (например, инфаркта миокарда, хронической сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, смерти от сердечно-сосудистого заболевания и т.п.), путем выявления наличия погибающих/погибших миоцитов и/или их фрагментов (например, ДНК, белков и т.п.). Скрининг и диагностику одного или нескольких из этих нарушений проводят с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК и РНК, белка и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для выявления, идентификации и/или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием протеомных, липидомных и/или геномных признаков в крови субъектов с атеросклерозом или имеющих риск развития атеросклероза вследствие сужения коронарной артерии, аневризмы абдоминального отдела аорты и т.п. Скрининг и диагностику этих нарушений можно проводить с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
Подтверждение отторжения биопсией, одним способов диагностики отторжения аллотранспланта-та, является инвазивным и имеет проблему ошибок при заборе образцов. Таким образом, разработка не-инвазивных анализов, которые выявляют молекулярные биомаркеры для диагностики и лечения отторжения трансплантированного органа, является полезной для лечения реципиентов трансплантата посредством (а) определения профиля до отторжения, которое позволит терапевтические вмешательства до того, как отторжение вызовет дисфункцию трансплантата, (b) повышения чувствительности и специфичности диагностики отторжения, (с) разработки новых систем классификации отторжения, которые улучшат прогноз, и (d) предоставления информации для разработки индивидуальных иммунодепрессивных режимов, которые могут предотвратить отторжение, минимизируя токсичность лекарственного средства.
Таким образом, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько из способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для выявления, идентификации или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием протеомных, липидомных и геномных признаков в крови субъектов, перенесших трансплантацию органа, путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка или сходных с ними, в фагоцитарных клетках крови.
Митохондриальные заболевания являются следствием недостаточности митохондрий. Она приводит к повреждению клеток и даже к гибели клеток. Заболевания митохондрий в наибольшей степени вызывают повреждение клеток головного мозга, сердца, печени, скелетных мышц, почки и эндокринной и дыхательной систем, а также диабет, осложнения дыхательной системы, эпилептические припадки, болезнь Альцгеймера, проблемы со зрением/слухом, молочный ацидоз, замедление развития, чувствительность к инфекции и злокачественную опухоль.
Таким образом, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления митохондриального заболевания посредством выявления одного или нескольких геномных, ассоциированных с митохондриями ДНК-маркеров в фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления болезни Альцгеймера и/или деменции путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
Системная красная волчанка (SLE) представляет собой комплексное аутоиммунное нарушение, которое повреждает различные органы и системы. Таким образом, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления SLE путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, липидов, белков и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга и/или выявления геномных и/или протеомных признаков, пригодных для разработки терапевтических и/или визуализирующих молекул путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка и т.п., в
фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления изменения геномных, протеомных и/или липидомных признаков, пригодных для выявления заболеваний и патологий вследствие одного или нескольких наружных или внутренних повреждений (например, воздействия "грязной" бомбы, воздействия радиации, химического воздействия, лучевой терапии, введения радиофармацевтического средства, воздействия терапевтической молекулы, воздействия радона, воздействия асбеста, воздействия загрязнения окружающей среды и т.п.) путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белков, липидов и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
Как используют в настоящем документе, термин "организм" включает, но не ограничивается ими, человека, не являющегося человеком примата, корову, лошадь, овцу, козу, свинью, собаку, кошку, кролика, мышь, крысу, песчанку, лягушку, жабу и их трансгенные виды. Термин "организм", кроме того, включает патогенные организмы, включая, но не ограничиваясь ими, такой патоген, как паразит, дрожжевая клетка, дрожжевая тетрада, дрожжевая колония, бактерия, колония бактерий, вирион, виросома, вирусоподобная частица и/или культуры любых из них и т.п.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления анализы, описанные в настоящем документе, можно использовать для выявления инфекционного агента и/или диагностики нарушения, ассоциированного с инфицированием клетки, ткани, органа или сходных с ними инфекционным агентом. В некоторых аспектах выявление инфекционного агента и/или диагностику нарушения, ассоциированного с инфекцией, проводят с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких маркеров инфекционных агентов, например ДНК, РНК, белков липидов и т.п. одного или нескольких инфекционных агентов.
Как используют в настоящем документе, термин "инфекционный агент" включает, но не ограничивается ими, патогенные организмы, такие как вирусы, бактерии, грибы, паразиты, инфекционные белки и т.п.
Вирусы включают, но не ограничиваются ими, ДНК- или РНК-вирусы животных. Как используют в настоящем документе, РНК-вирусы включают, но не ограничиваются ими, семейства вирусов, такие как Picornaviridae (например, полиовирусы), Reoviridae (например, ротавирусы), Togaviridae (например, вирусы энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус краснухи), Orthomyxoviridae (например, вирус гриппа), Paramyxoviridae (например, респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа), Rhabdoviridae (например, вирус бешенства), Coronaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Filoviridae, Arenaviridae, и Retroviridae (например, лимфотропные вирусы T-клеток человека (HTLV), вирусы иммунодефицита человека (HIV)). Как используют в настоящем документе, ДНК-вирусы включают, но не ограничиваются ими, семейства вирусов, такие как Papovaviridae (например, вирусы папилломы), Adeno-viridae (например, аденовирус), Herpesviridae (например, вирусы простого герпеса) и Poxviridae (например, вирусы оспы).
Бактерии включают, но не ограничиваются ими, грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, кислотоустойчивые бактерии и т.п.
Как используют в настоящем документе, грамположительные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Actinomedurae, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae и т.п.
Как используют в настоящем документе, грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Afipia fielis, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella pertusis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escherichia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilius aegyptius, Haemophilius ducreyi, Haemophilius influenziae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidia, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteridis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholrae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis и т.п.
Как используют в настоящем документе, кислотоустойчивые бактерии включают, но не ограничиваются ими, Myobacterium avium, Myobacterium leprae, Myobacterium tuberculosis и т.п.
Как используют в настоящем документе, другие бактерии, не относящиеся к этим трем категориям, включают, но не ограничиваются ими, Bartonella henselae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia typhi, Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafen-sis, Enterococcus faecium, Meningococci и т.п.
Как используют в настоящем документе, грибы включают, но не ограничиваются ими, Aspergilli, Candidae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococci и их комбинации.
Как используют в настоящем документе, паразитарные микроорганизмы включают, но не ограничиваются ими, Balantidium coli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis, Encephalitozoa, Entamoeba histolytica, Enterocytozoon bieneusi, Giardia lamblia, Leishmaniae, Plasmodii, Toxoplasma gondii, Trypanosomae, трапецевидная амеба и т.п.
Как используют в настоящем документе, паразиты включают червей (например, гельминтов), в частности паразитарных червей, включая, но не ограничиваясь ими, Nematoda (круглые черви, например трихоцефал, анкилостомы, острица, аскариды, филярии и т.п.), Cestoda (например, ленточные черви).
Как используют в настоящем документе, инфекционные белки включают прионы. Нарушения, вызываемые прионами, включают, но не ограничиваются ими, нарушения человека, такие как болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD) (включая, например, ятрогенную болезнь Крейтцфельдта-Якоба (iCJD), вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (vCJD), семейную болезнь Крейтцфельдта-Якоба (fCJD) и спорадическую болезнь Крейтцфельдта-Якоба (sCJD)), синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера (GSS), летальную семейную инсомнию (fFI), спорадическую летальную инсомнию (sFI), куру и т.п., а также нарушения у животных, такие как почесуха (овцы и козы), губчатая энцефалопатия быков (BSE) (крупный рогатый скот), трансмиссивная энцефалопатия норки (ТМЕ) (норка), хронический акобальтоз (CWD) (лось, чернохвостый олень), губчатая энцефалопатия кошек (кошки), энцефалопатия экзотических копытных животных (EUE) (ньяла, орикс, большой куду), губчатая энцефалопатия страусов и т.п.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены способы выявления маркеров, таких как последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК, РНК и т.п.), белки, полипептиды, липиды, полисахариды и т.п. в биологическом образце. Как используют в настоящем документе, термин "нуклеиновая кислота" включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием аналогов нуклео-тидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Как используют в настоящем документе, термин "аминокислота" включает органические соедине-
ния, содержащие как основную аминогруппу, так и кислотную карбоксильную группу. В этот термин
включены природные аминокислоты (например, L-аминокислоты), модифицированные и необычные
аминокислоты (например, D-аминокислоты и р-аминокислоты), а также аминокислоты, которые, как из-
вестно, биологически встречаются в свободной или комбинированной форме, но обычно не встречаются
в белках. Природные встречающиеся в белках аминокислоты включают аланин, аргинин, аспарагин, ас-
парагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин,
лизин, метионин, фенилаланин, серин, треонин, тирозин, триптофан, пролин и валин. Природные небел-
ковые аминокислоты включают аргиноянтарную кислоту, цитруллин, цистеин-серную кислоту,
3,4-дигидроксифенилаланин, гомоцистеин, гомосерин, орнитин, 3-монойодтирозин, 3,5-дийодотирозин,
3,5,5-трийодтиронин и 3,3',5,5'-тетрайодтиронин. Модифицированные или необычные аминокислоты
включают D-аминокислоты, гидроксилизин, 4-гидроксипролин, N-Cbz-защищенные аминокислоты,
2,4-диаминомасляную кислоту, гомоаргинин, норлейцин, N-метиламиномасляную кислоту, нафтилала-
нин, фенилглицин, а-фенилпролин, трет-лейцин, 4-аминоциклогексилаланин, N-метилнорлейцин,
3,4-дегидропролин, ^^диметиламиноглицин, N-метиламиноглицин, 4-аминопиперидин-4-карбоновую
кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, транс-4-(аминометил)циклогексанкарбоновую кислоту, 2-, 3- и
4-(аминометил)бензойную кислоту, 1-аминоциклопентанкарбоновую кислоту,
1-аминоциклопропанкарбоновую кислоту и 2-бензил-5-аминопентановую кислоту.
Как используют в настоящем документе, термин "пептид" включает соединения, которые состоят из двух или более аминокислот, которые связаны пептидной связью. Пептиды могут иметь молекулярную массу менее 10000 Да, менее 5000 Да или менее 2500 Да. Также термин "пептид" включает соединения, содержащие как пептидные, так и непептидные компоненты, такие как псевдопептидные или пептидо-миметические остатки или другие неаминокислотные компоненты. Такие соединения, содержащие как пептидные, так и непептидные компоненты, также могут называться "аналогами пептидов".
Как используют в настоящем документе, термин "белок" включает соединения, которые состоят из аминокислот, расположенных в виде линейной цепи и связанных пептидными связями между карбоксильными группами и аминогруппами соседних аминокислотных остатков.
Как используют в настоящем документе, термин "липид" включает синтетические или встречающиеся в природе соединения, которые обычно являются амфипатическими или биологически совместимыми. Липиды, как правило, содержат гидрофильный компонент и гидрофобный компонент. Иллюстративные липиды включают, но не ограничиваются ими, жирные кислоты, нейтральные жиры, фосфатиды, гликолипиды и т.п. Как используют в настоящем документе, термин "липидная композиция" относится к композиции, которая содержит липидное соединение, как правило, в водной среде. Иллюстративные ли-пидные композиции включают, но не ограничиваются ими, суспензии, эмульсии, композиции везикул и т.п.
Иллюстративный способ выявления наличия или отсутствия полипептида или нуклеиновой кислоты, соответствующей маркеру по изобретению, в биологическом образце вовлекает получение биологического образца (например, образца жидкости организма (например, крови) и/или образца опухоли) от
тестируемого субъекта и контактирование биологического образца с соединением или средством, способным выявлять один или несколько маркеров (например, ДНК, РНК, белок, полипептид, углевод, ли-пид или сходные с ними).
Способы выявления, описанные в настоящем документе, можно использовать для выявления одного или нескольких маркеров (например, ДНК, РНК, белка, полипептида, углевода, липида или сходных с ними) в биологическом образце in vitro, а также in vivo. Например, способы выявления мРНК in vitro включают нозерн-гибридизацию и гибридизацию in situ. Способы выявления полипептида, соответствующего маркеру по изобретению, in vitro включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Способы выявления геномной ДНК in vitro включают саузерн-гибридизацию. Более того, способы выявления полипептида, соответствующего маркеру по изобретению, in vivo включают введение субъекту меченого антитела, направленного против полипептида. Например, антитело может быть мечено радиоактивным маркером, присутствие и расположение которого можно выявлять у субъекта стандартными способами визуализации.
Способы анализа содержания липидов в биологическом образце известны в данной области (см., например, Kang et al. (1992), Biochim. Biophys. Acta. 1128:267; Weylandt et al. (1996), Lipids, 31:977; J. Schiller et al. (1999), Anal. Biochem. 267:46; Kang et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:4050; Schiller et al. (2004), Prog. Lipid Res. 43:499). Иллюстративным способом анализа липидов является экстракция липидов из биологического образца (например, с использованием смеси хлорформ:метанол (2:1, об./об.), содержащей 0,005% бутилированный гидрокситолуол (ВНТ, в качестве антиоксиданта)), получение метиловых сложных эфиров жирных кислот (например, реагент 14% ВР3-метанол) и количественное определение метиловых сложных эфиров жирных кислот (например, посредством ВЭЖХ, TLC, газовой хро-матографии-масс-спектрометрии с использованием коммерчески доступных газовых хроматографов, масс-спектрометров и/или комбинации газовых хроматографов/масс-спектрометров). Массу жирной кислоты определяют сравнением зон различных анализируемых жирных кислот с зонами, соответствующими фиксированной концентрации внутреннего стандарта.
Общий принцип диагностических и прогностических анализов вовлекает получение образца или реакционной смеси, которая может содержать маркер (например, один или несколько из ДНК, РНК, белка, полипептида, углевода, липида и т.п.) и зонд в соответствующих условиях и в течение периода времени, достаточного для обеспечения взаимодействия и связывания маркера и зонда, таким образом, образующих комплекс, который может быть извлечен из реакционной смеси и/или выявлен в ней. Эти анализы можно проводить различными способами.
Например, один из способов проведения такого анализа может вовлекать заякоривание маркера или зонда на твердофазной подложке, также называемой субстратом, и выявление комплексов маркер-мишень/зонд, заякоренных на твердой фазе, в конце реакции. В одном варианте осуществления такого способа образец субъекта, который подлежит анализу в отношении наличия и/или концентрации маркера, можно заякоривать на носителе или твердофазной подложке. В другом варианте осуществления возможна обратная ситуация, при которой зонд можно заякоривать на твердой фазе, и образцу от субъекта можно позволять реагировать в качестве незаякоренного компонента анализа.
Существует множество общепризнанных способов заякоривания компонентов анализа на твердой фазе. Они включают, но не ограничиваются ими, молекулы маркеров или зондов, которые иммобилизованы путем конъюгации биотина и стрептавидина. Такие биотинилированные компоненты анализа можно получать из биотин^Ж-(№гидроксисукцинимида) с использованием способов, известных в данной области (например, набора для биотинилирования, Pierce Chemicals, Rockford, IL), и иммобилизовывать на лунках покрытых стрептавидином 96-луночых планшетов (Pierce Chemical). В определенных вариантах осуществления поверхности с иммобилизованными компонентами анализа можно получать заранее и хранить.
Другие пригодные носители или твердофазные подложки для таких анализов включают любой материал, способный связывать тот класс молекул, к которому относится маркер или зонд. Хорошо известные подложки или носители включают, но не ограничиваются ими, стекло, полистирол, нейлон, полипропилен, полиэтилен, декстран, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакрилами-ды, габбро и магнетит.
Для проведения анализов с помощью указанных выше подходов неиммобилизованный компонент добавляют к твердой фазе, на которой заякорен второй компонент. После завершения реакции не образовавшие комплексы компоненты можно удалять (например, промыванием) в таких условиях, чтобы любые образованные комплексы оставались иммобилизованными на твердой фазе. Выявление комплексов маркер/зонд, заякоренных на твердой фазе, можно проводить рядом способов, описанных в настоящем документе.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления зонд, когда он представляет собой незая-коренный компонент анализа, можно метить для выявления и получения данных анализа, либо прямо, либо непрямо, поддающимися выявлению метками, рассмотренными в настоящем документе и хорошо известными специалисту в данной области.
Также можно прямо выявлять образование комплексов маркер/зонд без дальнейшего манипулирования или мечения какого-либо компонента (маркера или зонда), например, с использованием способа переноса энергии флуоресценции (см., например, патенты США № 5631169 и 4868103). Флуорофорную метку на первой "донорной" молекуле выбирают так, чтобы при возбуждении падающим светом соответствующей длины волны его испускаемая флуоресцентная энергия поглощалась флуоресцентной меткой на второй "акцепторной" молекуле, которая, в свою очередь, способна флуоресцировать вследствие поглощенной энергии. Альтернативно, в "донорной" молекуле белка можно просто использовать природную флуоресцентную энергию остатков триптофана. Выбирают такие метки, которые испускают свет отличающейся длины волны, так чтобы метку "акцепторной" молекулы можно было отличить от метки "донора". Поскольку эффективность переноса энергии между метками связана с расстоянием, разделяющим молекулы, можно оценивать пространственную взаимосвязь между молекулами. В ситуации, когда между молекулами происходит связывание, флуоресцентное испускание метки "акцепторной" молекулы в анализе должно быть максимальным. Явление связывания FET можно удобным образом измерять с помощью стандартных средств для флуореметрического выявления, хорошо известных в данной области (например, с использованием флуориметра).
В другом варианте осуществления определение способности зонда распознавать маркер можно проводить без мечения какого-либо компонента анализа (зонда или маркера) с использованием технологии, такой как анализ взаимодействия биомолекул в реальном времени (BIA) (см., например, Sjolander, S. and Urbaniczky, С., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 и Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Как используют в настоящем документе, "BIA" или "поверхностный плазмонный резонанс" представляет собой технологию для исследования биоспецифических взаимодействий в реальном времени, без мече-ния каких-либо из участников взаимодействия (например, BIAcore). Изменение массы на связывающей поверхности (указывающее на факт связывания) приводит к изменениям коэффициента рефракции света вблизи поверхности (оптический феномен поверхностного плазмонного резонанса (SPR)), приводящим к поддающемуся выявлению сигналу, который можно использовать в качестве признака реакций между биологическими молекулами в реальном времени.
Альтернативно, в другом варианте осуществления аналогичные диагностические и прогностические анализы можно проводить с маркером или зондом, растворенными в жидкой фазе. В таком анализе образовавшие комплекс маркер и зонд отделяют от не образовавших комплексы компонентов рядом стандартных способов, включая, но не ограничиваясь ими, дифференциальное центрифугирование, хроматографию, электрофорез и иммунопреципитацию. При дифференциальном центрифугировании комплексы маркер/зонд можно отделять от не образовавших комплексы компонентов анализа с помощью серии стадий центрифугирования, вследствие различного седиментационного равновесия комплексов, основанного на их различных размерах и плотностях (см., например, Rivas and Minton (1993), Trends Biochem. Sci. 18:284). Также для разделения образовавших комплексы молекул и не образовавших комплексы молекул можно использовать стандартные способы хроматографии. Например, гель-фильтрационная хроматография разделяет молекулы на основе размера, и с использованием, например, соответствующей гель-фильтрационной смолы в колонке относительно более крупный комплекс может быть отделен от относительно меньших не образовавших комплексы компонентов. Аналогично, для отделения комплекса от не образовавших комплекс компонентов можно использовать относительно отличающиеся свойства заряда маркера/зонда комплекса по сравнению с не образовавшими комплекс компонентами, например, с использованием смол для ионообменной хроматографии. Такие смолы и хромато-графические способы хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Heegaard (1998), J. Mol. Recognit. 11:141; Hage and Tweed (1997), J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 12:499). Также для разделения образовавших комплекс компонентов и несвязанных компонентов можно использовать гель-электрофорез (см., например, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987, 1999). В этом способе комплексы белков или нуклеиновых кислот разделяют на основе, например, размера или заряда. Для сохранения связывающего взаимодействия в ходе процесса электрофореза предпочтительными, как правило, являются неденатурирующие материалы матрикса геля и условия в отсутствие восстановителя. Соответствующие условия для конкретного анализа и его компоненты хорошо известны специалисту в данной области.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления уровень мРНК, соответствующей маркеру, можно определять в биологическом образце или in situ и/или in vitro с использованием способов, известных в данной области. Во многих способах выявления экспрессии используют выделенную РНК. Для способов in vitro для очистки РНК из клеток крови можно использовать любой способ выделения РНК, который не является селективным в отношении мРНК (см., например, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987, 1999). Кроме того, большие количества клеток и/или образцов можно легко обрабатывать с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, например, таких как одностадийный способ выделения РНК Chomczynski (1989, патент США № 4843155).
Выделенную мРНК можно использовать в анализах гибридизации или амплификации, которые включают, но не ограничиваются ими, саузерн- или нозерн-анализы, анализы способом полимеразной
цепной реакции и чипы с зондами. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления диагностический способ для выявления уровней мРНК вовлекает контактирование выделенной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК, кодируемой геном, подвергаемым выявлению. Зонд нуклеиновой кислоты может представлять собой, например, полноразмерную кДНК или ее часть, такую как олигонуклеотид, имеющий длину по меньшей мере 7, 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов и достаточный для специфичной гибридизации в строгих условиях гибридизации с мРНК или геномной ДНК, кодирующей маркер по настоящему изобретению. Другие пригодные зонды для применения в диагностических анализах по изобретению описаны в настоящем документе. Гибридизация мРНК с зондом указывает на то, что рассматриваемый маркер экспрессируется.
В одном формате мРНК иммобилизуют на твердой поверхности и контактируют с зондом, например, разделением выделенной мРНК на агарозном геле и переносом мРНК с геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза. В альтернативном формате, зонд(ы) иммобилизуют на твердой поверхности и мРНК контактируют с зондом(ами), например, на генном чипе. Квалифицированный специалист может легко адаптировать известные способы выявления мРНК для применения в выявлении уровня мРНК, кодируемой маркерами по настоящему изобретению.
Альтернативный способ определения уровня мРНК, соответствующей маркеру по настоящему изобретению в образце, вовлекает способ амплификации нуклеиновых кислот, например, посредством rtPCR (экспериментальный вариант осуществления указан в патентах США № 4683195 и 4683202), COLD-PCR (Li et al. (2008), Nat. Med. 14:579), лигазной цепной реакции (Barany (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189), самоподдерживающейся репликации последовательностей (Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874), транскрипционной системы амплификации (Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173), Q-бета репликазы (Lizardi et al. (1988), Bio/Technology 6:1197), репликации по типу "катящегося кольца" (патент США № 5854033) или любого другого способа амплификации нуклеиновых кислот с последующим выявлением амплифицированных молекул с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. Эти схемы выявления особенно пригодны для выявления молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень низких количествах. Как используют в настоящем документе, праймеры для амплификации определяют как пару молекул нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с 5'- или 3'-областями гена (плюс- и минус-цепи, соответственно, или наоборот) и содержат короткую область между ними. Как правило, праймеры для амплификации имеют длину приблизительно от 10 до 30 нуклеотидов и фланкируют область длиной приблизительно от 50 до 200 нуклеотидов. В соответствующих условиях и с соответствующими реагентами такие праймеры позволяют амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, фланкированную праймерами.
Для способов in situ мРНК не должна быть выделена из образца (например, жидкости организма (например, клеток крови)) перед выявлением. В таких способах образец клеток или ткани получают/обрабатывают с использованием известных гистологических способов. Затем образец иммобилизуют на подложке, как правило, на предметном стекле, а затем контактируют с зондом, который может гибри-дизоваться с мРНК, которая кодирует маркер.
В качестве альтернативы определению, основанному на абсолютном уровне экспрессии маркера, определение может быть основано на нормализованном уровне экспрессии маркера. Уровни экспрессии нормализуют коррекцией абсолютного уровня экспрессии маркера путем сравнения его экспрессии с экспрессией гена, который не является маркером, например гена домашнего хозяйства, который экспрес-сируется конститутивно. Пригодные гены для нормализации включают гены домашнего хозяйства, такие как ген актина, или специфичные для эпителиальных клеток гены. Эта нормализация позволяет сравнение уровня экспрессии в образце пациента из одного источника с образцом пациента из другого источника, например сравнение фагоцитарной клетки крови индивида с нефагоцитарной клеткой крови индивида.
В другом иллюстративном варианте осуществления проводят выявление белка или полипептида, соответствующего маркеру. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления агентом для выявления полипептида по изобретению является антитело, способное связываться с полипептидом, соответствующим маркеру по изобретению, такое как антитело с поддающееся выявлению меткой. Антитела могут быть поликлональными или более предпочтительно моноклональными. Можно использовать целое антитело или его фрагмент (например, Fab или F(ab')2). Термин "меченый" в отношении зонда или антитела охватывает прямое мечение зонда или антитела присоединением (т.е. физическим связыванием) поддающегося выявлению вещества к зонду или антителу, а также непрямое мечение зонда или антитела вследствие реакционной способности к другому реагенту, который является прямо меченым. Примеры непрямого мечения включают выявление первичного антитела с использованием флуоресцентно меченого вторичного антитела и концевое мечение ДНК-зонда биотином, так чтобы его можно было выявить с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина.
Для определения того, содержит ли образец белок, который связывается с данным антителом, можно использовать множество форматов. Примеры таких форматов включают, но не ограничиваются ими, ферментный иммунологический анализ (EIA), радиоиммунный анализ (RIA), вестерн-блот анализ, твер
дофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и т.п. Квалифицированный специалист может легко адаптировать известные способы выявления белка/антитела для применения в определении того, экспресси-руют ли клетки (например, клетки жидкостей организма, такие как клетки крови) маркер по настоящему изобретению.
В одном формате антитела или фрагменты антител можно использовать в способах, таких как вес-терн-блоттинг или иммунофлуоресцентные способы, для выявления экспрессированных белков. В таких применениях обычно предпочтительно иммобилизуют либо антитело, либо белки на твердой подложке. Пригодные твердофазные подложки или носители включают любую подложку, способную связывать антиген или антитело. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиак-риламиды, габбро, магнетит и т.п.
Специалисту в данной области известно множество других пригодных носителей для связывания антитела или антигена, и он способен адаптировать такую подложку для применения с настоящим изобретением. Например, белок, выделенный из клеток (например, клеток жидкостей организма, таких как клетки крови), можно разделять полиакриламидным гель-электрофорезом и иммобилизовывать на твердофазной подложке, такой как нитроцеллюлоза. Затем подложку можно промывать пригодными буферами с последующей обработкой меченым поддающейся выявлению меткой антителом. Затем твердофазную подложку можно промывать буфером второй раз для удаления несвязавшегося антитела. Затем количество связанной метки на твердой подложке можно выявлять с помощью общепринятых средств.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены диагностические анализы. Иллюстративный способ выявления наличия или отсутствия состояния, заболевания и/или нарушения в организме, ассоциированных со злокачественной опухолью, инфекционным агентом и/или другим заболеванием в биологическом образце, вовлекает получение биологического образца из тестируемого субъекта и контактирование биологического образца с соединением или веществом, способным осуществлять выявление одного или нескольких маркеров заболевания и/или нарушения, ассоциированных со злокачественной опухолью, инфекционным агентом и/или другим заболеванием или состоянием, например, маркерной нуклеиновой кислотой (например, мРНК, геномной ДНК), маркерным пептидом (например, полипептидом или белком) или маркерным липидом, кодируемым маркерной нуклеиновой кислотой, так чтобы в биологическом образце выявлялось наличие маркерной нуклеиновой кислоты или маркерного пептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления средство для выявления маркерной мРНК или геномной ДНК метят нуклеиновой кислотой-зондом, способной гибридизоваться с маркерной мРНК или геномной ДНК. Нуклеиновая кислота-зонд может представлять собой, например, полноразмерную маркерную нуклеиновую кислоту или ее часть. Другие пригодные зонды для применения в диагностических анализах по изобретению описаны в настоящем документе.
Средство для выявления маркерного пептида может представлять собой антитело, способное связываться с маркерным пептидом, такое как антитело с поддающейся выявлению меткой. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Можно использовать целое антитело или его фрагмент (например, Fab или F(ab')2). Термин "меченый" в отношении зонда или антитела охватывает прямое ме-чение зонда или антитела присоединением (т.е. физическим связыванием) поддающегося выявлению вещества к зонду или антителу, а также непрямое мечение зонда или антитела вследствие реакционной способности к другому реагенту, который является прямо меченым. Примеры непрямого мечения включают выявление первичного антитела с использованием флуоресцентно меченого вторичного антитела и концевое мечение ДНК-зонда биотином, так чтобы его можно было выявить с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина.
Как используют в настоящем документе, термин "биологический образец" включает ткани, клетки (например, фагоцитарные клетки, нефагоцитарные клетки, клетки 2n, клетки > 2n и т.п.) и биологические жидкости (например, цельную кровь, WBC и т.п.), выделенные от субъекта, а также ткани, клетки (например, фагоцитарные клетки, нефагоцитарные клетки, клетки 2n, клетки > 2n и т.п.) и жидкости организма (например, мочу, цельную кровь, WBC и т.п.), находящиеся в субъекте. Таким образом, способ выявления по изобретению можно использовать для выявления маркерного полипептида, белка, углевода, липида, олигосахарида, мРНК, микроРНК, геномной ДНК и т.п. в биологическом образце in vitro, а также in vivo. В одном варианте осуществления биологический образец содержит белки, полипептиды, липиды и/или олигосахариды тестируемого субъекта. Альтернативно, биологический образец может содержать молекулы мРНК тестируемого субъекта и/или молекулы геномной ДНК тестируемого субъекта. В одном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец сыворотки, образец слюны или образец биоптата, взятый у субъекта общепринятыми способами.
В другом варианте осуществления способы дополнительно вовлекают получение контрольного биологического образца (например, нефагоцитарной клетки или клетки 2n) от контрольного субъекта, контактирования контрольного образца (например, нефагоцитарной клетки или клетки 2n) с соединением или агентом, способным выявлять маркерный полипептид, белок, липид, олигосахарид, мРНК, микро-РНК, геномную ДНК и т.д. в биологическом образце, и сравнение наличия маркерного полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, геномной ДНК и т.п. в контрольном образце с наличием маркерно
го полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, геномной ДНК и т.п. в тестируемом образце (например, фагоцитарной клетке или клетке > 2n). Альтернативно, наличие маркерного полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, геномной ДНК и т.п. в тестируемом образце (например, фагоцитарной клетке или клетке > 2n) можно сравнивать с информацией в базе данных или на карте, в результате осуществляя выявление или диагностику.
Также изобретение относится к наборам для выявления наличия одного или нескольких маркеров, ассоциированных со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, в биологическом образце. Например, набор может содержать меченое соединение или вещество, способное осуществлять выявление маркерного полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, микроРНК, геномной ДНК и т.п. в биологическом образце; средства для определения количества маркера в образце и средства для сравнения количества маркера в образце со стандартом (например, нефагоцитарной клеткой или клеткой 2n). Соединение или средство может быть упаковано в пригодный контейнер. Набор может дополнительно содержать инструкции по применению набора для выявления маркерного пептида или нуклеиновой кислоты.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены прогностические анализы. Диагностические способы, описанные в настоящем документе, более того, можно использовать для идентификации субъектов, имеющих состояние или риск развития заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, или другого нарушения, описанного в настоящем документе, ассоциированного с повышенной (или сниженной) экспрессией одного или нескольких маркеров, описанных в настоящем документе. Например, для идентификации субъекта, имеющего заболевание и/или нарушение или риск развития заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе, можно использовать анализы, описанные в настоящем документе, такие как указанные выше диагностические анализы или представленные ниже анализы.
Прогностические анализы, описанные в настоящем документе, можно использовать для определения того, можно ли субъекту вводить средство (например, агонист, антагонист, пептидомиметик, белок, пептид, нуклеиновую кислоту, низкомолекулярное соединение или другое лекарственное средство-кандидат) для лечения заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе, ассоциированными с одним или несколькими маркерами, описанными в настоящем документе. Например, такие способы можно использовать для определения того, можно ли субъекта эффективно лечить средством для лечения, смягчения течения или уменьшения одного или нескольких симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам определения того, можно ли субъекта эффективно лечить средством от заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе.
Способы по изобретению также можно использовать для выявления генетических изменений маркерного гена, тем самым определяя, имеет ли субъект с измененным геном риск развития заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе, характеризующимися нарушением регуляции активности маркерного белка или экспрессии нуклеиновой кислоты, такими как злокачественная опухоль. В определенных вариантах осуществления способы включают выявление в образце клеток (например, в клетках жидкостей организма, таких как клетки крови) от субъекта наличия или отсутствия генетического изменения, влияющего на целостность гена, кодирующего маркерный пептид и/или маркерный ген. Например, такие генетические изменения можно выявлять путем установления существования по меньшей мере одного из: 1) делеция одного или нескольких нуклеотидов из одного или нескольких маркерных генов; 2) вставка одного или нескольких нуклеотидов в один или несколько маркерных генов; 3) замена одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких маркерных генах; 4) хромосомная перестройка одного или нескольких маркерных генов; 5) изменение уровня транскрипта матричной РНК одного или нескольких маркерных генов; 6) нарушенная модификация одного или нескольких маркерных генов, такая как паттерн метилирования геномной ДНК; 7) наличие паттерна сплайсинга, не соответствующего дикому типу, у транскрипта матричной РНК одного или нескольких маркерных генов; 8) уровень, не соответствующий дикому типу, одного или нескольких маркерных белков; 9) аллельная потеря одного или нескольких маркерных генов и 10) ненадлежащая посттрансляционная модификация одного или нескольких маркерных белков. Как описано в настоящем документе, существует большое количество анализов, известных в данной области, которые можно использовать для выявления изменений в одном или нескольких маркерных генах.
В определенных вариантах осуществления выявление изменения вовлекает использование зон-да/праймера в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см., например, патенты США № 4683195, 4683202 и 5854033), такой как ПЦР в реальном времени, COLD-PCR, якорная ПЦР, пошаговая ПЦР или RACE ПЦР, или, альтернативно, в лигазной цепной реакции (LCR) (см., например, Landegran et al. (1988),
Science, 241:1077; Prodromou and Pearl (1992), Protein Eng. 5:827 и Nakazawa et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:360), последняя из которых может быть особенно пригодна для выявления точковых мутаций в маркерном гене (см. Abravaya et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23:675). Этот способ может включать стадии взятия образца от субъекта, выделение нуклеиновой кислоты (например, геномной, мРНК или обеих из них) из клеток образца, контактирование образца нуклеиновой кислоты с одним или несколькими праймерами, которые специфично гибридизуются с маркерным геном в таких условиях, чтобы происходила гибридизация и амплификация маркерного гена (если он присутствует), и выявление наличия или отсутствия продукта амплификации, или выявление размера продукта амплификации и сравнение длины с контрольным образцом. Ожидается, что ПЦР и/или LCR могут быть желательными для применения в качестве предварительной стадии амплификации совместно с любым из способов, используемых для выявления мутаций, описанных в настоящем документе.
Альтернативные способы амплификации включают самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874), транскрипционную систему амплификации (Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173), Q-бета репликазу (Lizardi et al. (1988), Bio-Technology, 6:1197) или любой другой способ амплификации нуклеиновых кислот с последующим выявлением амплифицированных молекул с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. Эти схемы выявления являются особенно пригодными для выявления молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень низких количествах.
В альтернативном варианте осуществления, мутации в одном или нескольких маркерных генах в клетке образца можно идентифицировать по изменению паттерна расщепления ферментом рестрикции. Например, выделяют ДНК образца и контроля, необязательно амплифицируют, расщепляют одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции и определяют длины фрагментов гель-электрофорезом и сравнивают их. Различия в размерах длин фрагментов ДНК образца и контроля указывают на мутации в ДНК образца. Более того, для оценки наличия конкретных мутаций можно использовать специфичные для последовательности рибозимы (см., например, патент США № 5498531) вследствие приобретения или утраты участка расщепления рибозима.
В других вариантах осуществления генетические мутации в одном или нескольких из маркеров, описанных в настоящем документе, можно идентифицировать гибридизацией нуклеиновых кислот, ДНК или РНК, образца и контроля, например с чипами высокой плотности, содержащими сотни или тысячи олигонуклеотидных зондов (Cronin et al. (1996), Human Mutation, 7:244; Kozal et al. (1996), Nature Medicine, 2:753). Например, генетические мутации в маркерной нуклеиновой кислоте можно идентифицировать в двухмерных чипах, содержащих полученные с помощью света ДНК-зонды, как описано в Cronin, MT. et al. выше. В кратком изложении первый чип для гибридизации зондов можно использовать для сканирования через длительные участки ДНК в образце и контроле для идентификации изменений оснований между последовательностями, создавая линейные чипы последовательных перекрывающихся зондов. Эта стадия позволяет идентификацию точковых мутаций. После этой стадии второй чип для гибридизации позволяет охарактеризацию конкретных мутаций с использованием меньших специализированных чипов с зондами, комплементарных всем выявленным вариантам или мутациям. Каждый чип для мутаций состоит из параллельных наборов зондов, одного комплементарного гену дикого типа и другого комплементарного мутантному гену.
В другом варианте осуществления для прямого секвенирования маркерного гена и выявления мутаций путем сравнения последовательности маркерного гена образца с соответствующей последовательностью дикого типа (контрольной) можно использовать любую из множества реакций секвенирования, известных в данной области. Примеры реакций секвенирования включают реакции на основе способов, разработанных Maxam and Gilbert ((1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560) или Sanger ((1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463). Также предусматривается, что при проведении диагностических анализов можно использовать любой из множества способов автоматического секвенирования ((1995), Biotechniques, 19:448), включая секвенирование с помощью масс-спектрометрии (см., например, международную публикацию РСТ № WO 94/16101 (Cohen et al. (1996), Adv. Chromatogr. 36:127-162 и Griffin et al. (1993), Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147).
Другие способы выявления мутаций в маркерном гене включают способы, в которых используют защиту от расщепляющих агентов для выявления неправильно спаренных оснований в РНК/РНК или гетеродуплексах РНК/ДНК (Myers et al. (1985), Science, 230:1242). Как правило, известный в данной области способ "расщепления неправильно спаренных оснований" начинают путем предоставления гетеро-дуплексов, образованных гибридизацией (меченой) РНК или ДНК, содержащей маркерную последовательность дикого типа с потенциально мутантной РНК или ДНК, полученной из образца ткани. Двухце-почечные дуплексы обрабатывают агентом, который расщепляет одноцепочечные области дуплекса, которые существуют вследствие ошибочного спаривания оснований между цепями контроля и образца. Например, дуплексы РНК/ДНК можно обрабатывать РНКазой, а гибриды ДНК/ДНК можно обрабатывать S1-нуклеазой для ферментативного расщепления неправильно спаренных областей. В других вариантах осуществления для расщепления неправильно спаренных областей дуплексы либо ДНК/ДНК, либо РНК/ДНК можно обрабатывать гидроксиламином или тетроксидом осмия и пиперидином. После расще
пления неправильно спаренных областей полученный материал разделяют по размеру на денатурирующих полиакриламидных гелях для определения участка мутации. См., например, Cotton et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397; Saleeba et al. (1992), Methods Enzymol. 217:286. В одном варианте осуществления ДНК или РНК контроля можно метить для выявления.
В другом варианте осуществления в реакции расщепления неправильно спаренных оснований используются один или несколько белков, которые распознают неправильно спаренные пары оснований в двухцепочечной ДНК (так называемые ферменты "репарации неправильно спаренных оснований ДНК") в определенных системах для выявления и картирования точковых мутаций в маркерных кДНК, полученных из образцов клеток. Например, фермент mutY E.coli расщепляет А при неправильно спаренных основаниях G/A, а тимидин-ДНК-гликозилаза из клеток HeLa расщепляет Т при неправильно спаренных основаниях G/T (Hsu et al. (1994), Carcinogenesis, 15:1657). Согласно иллюстративному варианту осуществления зонд на основе маркерной последовательности, например маркерной последовательности дикого типа, гибридизуют с кДНК или другим ДНК-продуктом из тестируемой клетки(ок). Дуплекс обрабатывают ферментом репарации неправильно спаренных оснований ДНК, и продукты расщепления, при их наличии, могут быть выявлены с помощью протоколов электрофореза или сходных с ними. См., например, патент США № 5459039.
В других вариантах осуществления для идентификации мутаций в маркерных генах можно использовать изменения электрофоретической подвижности. Например, для выявления различной электрофоре-тической подвижности между мутантной нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой дикого типа можно использовать полиморфизм одноцепочечной конформации (SSCP) (Orita et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766, см. также Cotton (1993), Mutat. Res. 285:125 и Hayashi (1992), Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73). Одноцепочечные фрагменты ДНК маркерных нуклеиновых кислот образца и контроля можно денатурировать и позволять им ренатурировать. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот варьирует, в зависимости от последовательности, полученное изменение электрофоретической подвижности обеспечивает выявление даже одного изменения оснований. Фрагменты ДНК можно метить или выявлять с помощью меченых зондов. Чувствительность анализа можно повышать с использованием РНК (вместо ДНК), в которой вторичная структура является более чувствительной к изменению последовательности. В одном варианте осуществления в рассматриваемом способе анализ гетеродуплек-сов используется для разделения двухцепочечных гетеродуплексных молекул на основании изменений электрофоретической подвижности (Keen et al. (1991), Trends Genet. 7:5).
В другом варианте осуществления анализируют миграцию мутантных фрагментов или фрагментов дикого типа в полиакриламидных гелях, содержащих градиент денатурирующего агента, с использованием гель-электрофореза в денатурирующем градиенте (DGGE) (Myers et al. (1985), Nature, 313:495). Когда в качестве способа анализа используют DGGE, ДНК может быть модифицирована для обеспечения того, чтобы она полностью не денатурировала, например, добавлением с помощью ПЦР GC-зажима приблизительно из 40 п.н. из GC-богатой ДНК с высокой температурой отжига. В следующем варианте осуществления для идентификации различий в подвижности ДНК контроля и образца вместо денатурирующего градиента используют градиент температуры (Rosenbaum and Reissner (1987), Biophys. Chem.
265:12753).
Примеры других способов выявления точковых мутаций включают, но не ограничиваются ими, селективную гибридизацию с олигонуклеотидами, селективную амплификацию или селективное удлинение праймеров. Например, можно получать олигонуклеотидные праймеры, в центр которых внесена мутация, а затем гибридизовать их с ДНК-мишенью в условиях, которые позволяют гибридизацию, только если найдено точное совпадение (Saiki et al. (1986), Nature, 324:163; Saiki et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6230). Такие аллелеспецифические олигонуклеотиды гибридизуются с амплифицированной посредством ПЦР ДНК-мишенью или рядом различных мутаций, когда олигонуклеотиды присоединяются к мембране для гибридизации и гибридизуются с меченой ДНК-мишенью.
Альтернативно, совместно с настоящим изобретением можно использовать технологию аллелеспе-цифической амплификации, которая зависит от селективной амплификации посредством ПЦР. Олиго-нуклеотиды, используемые в качестве праймеров для специфичной амплификации, могут нести представляющую интерес мутацию в центре молекулы (так что амплификация зависит от отличающейся гибридизации) (Gibbs et al. (1989), Nucl. Acids Res. 17:2437) или на самом 3'-конце одного праймера, где в соответствующих условиях неправильное спаривание оснований может предотвращаться или оно может уменьшать удлинение полимеразой (Prossner (1993), Tibtech, 11:238). Кроме того, может быть желательным внесение нового участка рестрикции в область мутации для обеспечения выявлению на основе расщепления (Gasparini et al. (1992), Mol. Cell Probes, 6:1). Ожидается, что в определенных вариантах осуществления амплификацию также можно проводить с использованием Taq-лигазы для амплифликации (Barany (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189). В таких случаях лигирование происходит, только если существует точное совпадение на 3'-конце 5'-последовательности, что делает возможной выявление наличия известной мутации в конкретном участке путем выявления наличия или отсутствия амплификации.
Следует понимать, что описанные варианты осуществления настоящего изобретения являются только иллюстративными для некоторых из применений принципов настоящего изобретения. Специалисты в данной области на основе указаний, представленных в настоящем документе, могут проводить различные модификации без отклонения от истинной сущности и объема изобретения. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных на протяжении этого документа, включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.
Нижеследующие примеры представлены в качестве репрезентативных для настоящего изобретения. Эти примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения, поскольку эти и другие эквивалентные варианты осуществления будут очевидны ввиду настоящего описания, фигур и прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1.
Репрезентативный способ I для отделения фагоцитарных клеток от нефагофитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, покрыть планшеты авидином.
2. Добавить в лунки биотинилированное антитело к нефагоцитарной клетке крови (например, T-клеткам), инкубировать в течение 30 мин при RT, промыть лунки.
3. Добавить магнитные гранулы.
4. Добавить образец WBC крови.
5. Инкубировать при 37°С (30 мин - 1 ч).
6. После фагоцитоза гранул фагоцитарными клетками и связывания авидин-биотин-антитела с нефагоцитарными клетками поместить планшет сверху магнита и промыть (фагоцитарные клетки, которые интернализовали магнитные гранулы и нефагоцитарные клетки, связанные с антителом, останутся; все другие клетки отмоются).
7. Удалить магнит и собрать фагоцитарные клетки.
8. Выделить РНК из фагоцитарных клеток (например, клеток, связанных с магнитными гранулами) и нефагоцитарных клеток (например, клеток, прикрепленных ко дну лунок с помощью связанного с ним биотинилированного антитела против нефагоцитарных клеток), получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, полные генные чипы и/или чипы для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
9. Выделить ДНК из каждого клеточного образца и идентифицировать признаки ДНК опухоли, селективно присутствующие в фагоцитах (т.е. отсутствующие в нефагоцитах); сравнить профили (например, полные генные чипы, мутации ДНК и/или SNP, выявленные в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках).
10. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, PSA и PSMA при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
11. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 2.
Репрезентативный способ II для отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, лизировать RBC в образце крови.
2. Центрифугировать WBC на предметных стеклах на цитоцентрифуге.
3. Фиксировать клетки в смеси ацетон/метанол (-20°C в течение 5 мин).
4. Окрашивать гематоксилином и эозином и антителом против T-клеток.
5. Выделить T-клетки (нефагоцитарные) и макрофаги (фагоцитарные) с использованием микроскопии с лазерным захватом (LCM).
6. Выделить РНК из фагоцитарных клеток и нефагоцитарных клеток, получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, полные генные чипы и/или чипы для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
7. Выделить ДНК из каждого клеточного образца, провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили (например, полные генные чипы, мутации ДНК и/или SNP), полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
8. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, PSA и PSMA при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
1.
9. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ. Пример 3.
Репрезентативный способ III для отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, лизировать RBC в образце крови.
2. Использовать магнитные конъюгированные с антителом гранулы для выделения нефагоцитарных (например, T-клеток) и фагоцитарных клеток (например, нейтрофилов, и/или макрофагов, и/или моноцитов) из цельной крови.
3. Выделить РНК из каждого клеточного образца, получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из каждого образца, провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, PSA и PSMA при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
6. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 4.
Репрезентативный способ IV отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, окрасить WBC флуоресцентными антителами, специфичными к конкретной субпопуляции клеток (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам, T-клеткам и т.п.).
2. Сортировать клетки (например, FACS).
3. Выделить РНК из каждого клеточного образца, получить кДНК, кРНК и использовать их для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из каждого клеточного образца, провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, PSA и PSMA при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
6. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 5.
Репрезентативный способ V отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 5 и 6, окрасить WBC флуоресцентными антителами к каждой субпопуляции клеток (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам и T-клеткам), а затем окрасить красителем ДНК (например, йодидом пропидия).
2. Сортировать клетки (FACS) на T-клетки, нейтрофилы (2n), нейтрофилы (> 2n), макрофаги (2n), макрофаги (> 2n), моноциты (2n) и моноциты (> 2n).
3. Выделить РНК из T-клеток, нейтрофилов (> 2n), макрофагов (> 2n) и моноцитов (> 2n). Затем получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из T-клеток, нейтрофилов (> 2n), макрофагов (> 2n) и моноцитов (> 2n). Провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из T-клеток, нейтрофилов (> 2n), макрофагов (> 2n) и моноцитов (> 2n). Провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, PSA и PSMA при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
6. Выделить липиды из T-клеток, нейтрофилов (> 2n), макрофагов (> 2n) и моноцитов (> 2n). Сравнить количество и качество липидов, например, с использованием ВЭЖХ.
1.
Пример 6.
Репрезентативный способ VI отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 5 и 6, окрасить WBC флуоресцентными антителами к каждой субпопуляции клеток (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам и T-клеткам), а затем окрасить красителем ДНК (например, йодидом пропидия).
2. Сортировать клетки (FACS) на фагоцитах 2n и > 2n.
3. Выделить РНК из фагоцитов 2n и > 2n. Затем получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) 2n-фагоцитарных и ^n-фагоцитарньгх клеток.
4. Выделить ДНК из фагоцитов 2n и > 2n. Провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для 2n-фагоцитарных и ^n-фагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из каждых из фагоцитов 2n и > 2n. Провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, PSA и PSMA при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для 2n-фагоцитарных и ^n-фагоцитарных клеток.
6. Выделить липиды из фагоцитов 2n и > 2n. Сравнить количество и качество липидов, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 7.
Выявление опухолеспецифических генных признаков в фагоцитах, полученных от имеющих опухоли мышей.
Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы дифференциации между "нормальным неспецифическим шумовым уровнем" и "опухолеспецифическими" и/или "специфичными к заболеванию" признаками в крови или других жидкостях организма. Профили экспрессии генов в моноцитах/макрофагах и нейтрофилах крови от имеющих опухоли мышей сравнивали с профилями для нефагоцитарных T-клеток от тех же донорных мышей для идентификации опухолеспе-цифических признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессировались, либо в значительной степени дифференциально экспрессировались в нефагоцитарных клетках от тех же имеющих опухоли мышей и от не имеющих опухолей мышей.
Злокачественные клетки LNCaP предстательной железы человека.
Бестимусным мышам nude (n=5) подкожно инъецировали (s.c.) клетки LNCaP рака предстательной железы человека. Через 27 суток (размер опухоли ~0,4 см) у мышей брали кровь путем пункции сердца (~1 мл/мышь) в содержащие ЭДТА пробирки, которые затем центрифугировали. Лейкоцитарную пленку отбирали и промывали и нейтрофилы, макрофаги и T-клетки разделяли с использованием соответственно иммуномагнитных DynaBeads для нейтрофилов, макрофагов и T-клеток мыши. РНК выделяли из каждого клеточного образца (Triazol(r)). Качество РНК определяли, как показано на фиг. 3. Выход РНК представлен на фиг. 20. Получали кДНК и биотинилированную кРНК (кРНК-В). Наконец, образец кРНК-В инкубировали с микрочипами генов злокачественных опухолей человека (Oligo GEArray(r) Human Cancer PathwayFinder Microarray - OHS-033 - SuperArray Bioscience). После гибридизации мембраны промывали и окрашивали авидин-щелочной фосфатазой и проводили выявление генов с использованием хемилюми-несценции (рентгеновская пленка).
Опухоли аденокарциномы толстого кишечника LS174T человека, клетки карциномы LLC1, клетки меланомы B16F10 мыши.
Сходные эксперименты проводили с клетками, полученными от бестимусных мышей nude (n=5), которым подкожно инъецировали опухоли аденокарциномы толстого кишечника LS174T человека (размер опухоли ~0,3 см), мышей С57ЛБ1 (n=5), которым подкожно инъецировали клетки карциномы легкого Льюис LLC1 (размер опухоли ~0,6 см), и мышей С57ЛБ1 (n=5), которым внутривенно инъецировали за 22 суток до этого 106 клеток меланомы мыши B16F10 (когда клетки опухоли имели мышиное происхождение, образцы кРНК-В гибридизовали с Oligo GEArray(r) Mouse Cancer PathwayFinder Microarray - OMM-033 - SuperArray Bioscience). РНК также выделяли из экспоненциально растущих клеток LS174T, LLC1, B16F10 и LNCaP в культуре и из нейтрофилов, макрофагов и T-клеток, полученных от не имеющих опухолей мышей С57ЛБ1 и мышей nude, и определяли их связанные со злокачественной опухолью генные профили.
Согласно данным, полученным из этих экспериментов и показанным на фиг. 9-17, нейтрофилы и макрофаги, полученные от мышей, которым инъецировали клетки опухоли предстательной железы или толстого кишечника, и от мышей, имеющих рак легкого или меланому мыши, имеют различные связанные с опухолью генные признаки, которые также имеются в их соответствующих опухолевых клетках. Эти связанные со злокачественной опухолью гены не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне (i) нефагоцитарными T-клетками, полученными от имеющих опухолей мышей; и (ii) фагоцитарными нейтрофилами и макрофагами, полученными от не имеющих опухолей мышей.
Например, нейтрофилы, выделенные из крови мышей nude, имеющих клетки рака предстательной железы человека LNCaP, экспрессировали несколько генных признаков человека (Human Cancer Path-wayFinder Microarray), которые также экспрессировались в клетках LNCaP (профили чипов на фиг. 9А и В для сравнения). Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в T-клетках, полученных от имеющих опухоли мышей, или нейтрофилах, полученных от нормальных мышей (см. профили на фиг. 9С и D). Аналогично, нейтрофилы, выделенные из крови мышей, имеющих клетки рака легкого мыши LLC1, экспрессировали несколько генных признаков опухоли мыши (Mouse Cancer PathwayFinder Microarray), которые экспрессировались в клетках LLC1 (профили чипов на фиг. 13А и В для сравнения).
Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в T-клетках, полученных от имеющих опухоли мышей, или нейтрофилах, полученных от нормальных мышей (см. профили, представленные на фиг. 13С и D). Наконец, чипы сканировали, количественно определяли интенсивность каждого гена с использованием программного обеспечения, предоставляемого компанией, и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные селективно фагоцитарными клетками, как представлено на фиг. 19 и 20. На фиг. 21 и 22 приведены генные признаки, приобретенные и дифференциально проявляемые фагоцитарными WBC имеющих опухоли мышей. Как показано на фиг. 21, были выявлены многие онкогены (гены, обозначенные красным цветом, например ERBB2 и Jun), и они экспрессирова-лись одновременно в макрофагах и нейтрофилах.
Мышам С57ЛБ1 (n=5) инъецировали подкожно клетки карциномы легкого Льюис мыши 1Е6 (LLCl). Через 20 суток мышам проводили анестезию и отбирали кровь пункцией сердца (приблизительно 1 мл/мышь) в содержащую ЭДТА пробирку. После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре лейкоцитарную пленку переносили в пробирку и промывали PBS.
Антитела IgG крысы против макрофагов/моноцитов мыши (маркер моноцитов/макрофагов - F4/80 -IgG2b от AbD Serotec, Raleigh, NC) инкубировали (комнатная температура в течение 30 мин) с магнитными гранулами с антителом против IgG крысы (DYNABEAD(r) с антителом овцы против IgG крысы от INVITROGEN(tm), Carlsbad, СА). Затем гранулы для макрофагов/моноцитов промывали в PBS и хранили на льду.
IgG крысы против нейтрофилов мыши (маркер нейтрофилов NIMP-R14 - IgG2a - Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) инкубировали (комнатная температура в течение 30 мин) с магнитными гранулами с антителом против IgG крысы (DYNABEAD(r) с антителом овцы против IgG крысы - INVITROGEN(tm)), промывали в PBS и хранили на льду.
Гранулы DYNABEAD(r) mouse Pan T (Thy 1.2) (INVITROGEN(tm)) также промывали в PBS и хранили на льду.
Макрофаги и моноциты крови мыши выделяли из суспензии WBC, полученной, как указано выше, с использованием гранул с антителами к макрофагам/моноцитам. По существу, гранулы добавляли к образцу WBC и после их инкубации (4°С в течение 30 мин) выделяли связанные с макрофагами гранулы с использованием магнита и промывали PBS три раза и хранили на льду.
Затем из оставшихся WBC выделяли T-клетки мыши. В кратком изложении, гранулы для T-клеток мыши добавляли к суспензии WBC, образцы инкубировали (4°С в течение 30 мин), выделяли связанные с T-клетками гранулы с использованием магнита, промывали их PBS и хранили на льду.
Наконец, нейтрофилы мыши выделяли из оставшегося образца WBC. К клетками добавляли магнитные гранулы для нейтрофилов мыши и образцы инкубировали (4°С в течение 30 мин). Связанные с нейтрофилами гранулы выделяли с использованием магнита, промывали PBS и хранили на льду.
Затем из каждого образца выделяли РНК (с использованием TRIZOL(r), INVITROGEN(tm), Carlsbad, СА). Качество РНК определяли, как показано на фиг. 7. Выход РНК представлен на фиг. 8. Далее, получали кДНК (биотинилированную) и инкубировали (60°С в течение ночи) с микрочипами для генов злокачественных опухолей человека (OLIGO GEARRAY(r) Human Cancer PathwayFinder Microarray OMM-033, SuperArray Bioscience, Frederick, MD). После гибридизации мембраны промывали и окрашивали авидин-щелочной фосфатазой и проводили выявление генов с использованием хемилюминесценции (рентгеновская пленка).
Опухоли аденокарциномы толстого кишечника человека LS175T, клетки карциномы LLC1 и клетки меланомы мыши B16F10.
Сходные эксперименты проводили с клетками, полученными от бестимусных мышей nude (n=5), которым подкожно инъецировали опухоли аденокарциномы толстого кишечника человека LS174T (размер опухоли ~0,3 см), мышей С57ЛБ1 (n=5), которым подкожно инъецировали клетки карциномы легкого Льюис LLC1 (размер опухоли ~0,6 см), и мышей С57ЛБ1 (n=5), которым внутривенно инъецировали за 22 суток до этого 106 клеток меланомы мыши B16F10 (когда клетки опухоли имели мышиное происхождение, образцы кРНК-В гибридизовали с Oligo GEArray(r) Mouse Cancer PathwayFinder Microarray - OMM-033 - SuperArray Bioscience). РНК также выделяли из экспоненциально растущих клеток LS174T, LLC1, B16F10 и LNCaP в культуре и из нейтрофилов, макрофагов и T-клеток, полученных от не имеющих опухолей мышей С57ЛБ1 и мышей nude, и определяли их связанные со злокачественной
опухолью генные профили.
Согласно данным, полученным из этих экспериментов и представленным на фиг. 9A-D, 10A-D, 11A-D, 12A-D, 13A-D, 14A-D, 15A-D, 16A-D, нейтрофилы и макрофаги (полученные от мышей, которым инъецировали клетки предстательной железы или клетки опухоли толстого кишечника человека, и от мышей, имеющих рак легкого или меланому мыши) имели различные связанные со злокачественной опухолью генные признаки, которые также имелись в их соответствующих опухолевых клетках (фиг. 21). Эти связанные со злокачественной опухолью гены не экспрессировались или экспрессирова-лись на минимальном уровне (i) нефагоцитарными T-клетками, полученными от имеющих опухолей мышей; и (ii) фагоцитарными нейтрофилами и макрофагами, полученными от не имеющих опухолей мышей.
Например, нейтрофилы, выделенные из крови мышей nude, имеющих клетки рака предстательной железы человека LNCaP, экспрессировали несколько генных признаков человека (Human Cancer Path-wayFinder Microarray), которые также экспрессировались в клетках LNCaP (профили чипов на фиг. 9А и В для сравнения). Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в T-клетках, полученных от имеющих опухоли мышей, или нейтрофилах, полученных от нормальных мышей (см. профили на фиг. 9С и D). Наконец, чипы сканировали, интенсивность каждого гена количественно определяли с использованием программного обеспечения, предоставляемого компанией, и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные селективно фагоцитарными клетками, как представлено на фиг. 19 и 20. На фиг. 21 и 22 приведены генные признаки, приобретенные и дифференциально проявляемые фагоцитарными WBC имеющих опухоли мышей. Как показано на фиг. 21, были выявлены многие онкогены (например, ERBB2 и Jun), и они экспрессировались одновременно в макрофагах и нейтрофилах (показаны как гены, выделенные зеленым цветом).
Пример 8.
Выявление опухолеспецифических генных признаков в фагоцитах, полученных от пациентов со злокачественной опухолью.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения профили экспрессии генов в моноцитах/макрофагах и нейтрофилах крови от пациентов со злокачественной опухолью сравнивали с профилями экспрессии в нефагоцитарных T-клетках тех же доноров для идентификации опухолеспеци-фических признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессировались, либо экспрессирова-лись на значительно отличающемся уровне в нефагоцитарных клетках.
Пациенты с опухолями головы и шеи.
10 мл венозной крови получали (в содержащую ЭДТА пробирку) от пациентов, о которых было известно, что они имеют плоскоклеточную карциному шеи и у которых запланирована хирургическая операция. После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре лейкоцитарную пленку переносили в пробирку и промывали PBS.
Клетки разделяли с использованием иммуномагнитных гранул DynaBeads(r) с антителами крысы против T-клеток, нейтрофилов и макрофагов/моноцитов INVTTROGEN(tm), Carlsbad, CA. По существу, гранулы добавляли последовательно к образцу WBC и после индивидуальных инкубации при 4°C в течение 30 мин гранулы, связанные с T-клетками, нейтрофилами и макрофагами/моноцитами выделяли с использованием магнита и промывали PBS три раза.
Затем из каждого образца выделяли РНК (с использованием TRIZOL(r), INVITROGEN(tm), Carlsbad, CA). Определяли количество и качество РНК и получали кДНК и биотинилированную кРНК (кРНК-В). Наконец, образцы кРНК-В инкубировали (60°C в течение ночи) с микрочипами генов злокачественных опухолей человека (Oligo GEArray(r) Human Cancer PathwayFinder Microarray - OHS-033 -SuperArray Bioscience, Frederick, MD). После гибридизации мембраны промывали и окрашивали авидин-щелочной фос-фатазой и проводили выявление генов с использованием хемилюминесценции (рентгеновская пленка).
Согласно данным, полученным из этих экспериментов, нейтрофилы и макрофаги (полученные от пациентов с раком головы и шеи) имели различные связанные со злокачественной опухолью генные признаки, которые также были найдены в их соответствующих опухолевых клетках. Эти связанные со злокачественной опухолью гены не экспрессировались или минимально экспрессировались нефагоцитарными T-клетками.
Например, нейтрофилы, выделенные из крови одного такого пациента, экспрессировали четыре генных признака опухоли человека (Human Cancer PathwayFinder Microarray), которые также экспресси-ровались в биоптате опухоли, полученном от того же пациента (профили на чипах на фиг. 17В и С для сравнения). Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в би-оптатах нормальной кожи и в T-клетках, выделенных из того же образца крови (см. профили на фиг. 17А и D соответственно). Наконец, чипы сканировали, количественно определяли интенсивность каждого гена с использованием программного обеспечения, предоставляемого компанией, и были идентифицированы следующие гены, которые селективно сверхэкспрессировались (> 2 раз) фагоцитарными клетками: ген гомолога вирусного онкогена Е26 (ETS2), ген взаимодействующего с Tat белка HIV-I (HTAT1P2), ген IL8 (активация и хемотаксис нейтрофилов), онкоген Jun (JUN) и ген матриксной металлопротеиназы 9
(ММР9).
Пациенты с раком яичника.
Сходные эксперименты проводили с клетками, полученными от пациента с раком яичника. Согласно данным, полученным из этих экспериментов, нейтрофилы и макрофаги (полученные от женщины с заболеванием) экспрессировали множество связанных со злокачественной опухолью генов, которые не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне нефагоцитарными T-клетками.
Например, макрофаги, выделенные из крови пациентки с раком яичника, экспрессировали 23 генных признака опухоли человека (Human Cancer PathwayFinder Microarray), которые либо не экспрессиро-вались, либо экспрессировались на минимальном уровне в T-клетках, выделенных из образца крови (профили на фиг. 18А и В для сравнения). Наконец, чипы сканировали, количественно определяли интенсивность каждого гена с использованием программного обеспечения, предоставленного компанией, и определяли интенсивность для каждого связанного со злокачественной опухолью гена в каждом типе клеток. Перечень из 23 связанных со злокачественной опухолью генов, дифференциально активирован-ных/сверхэкспрессированных в макрофагах, а также отношения интенсивности макрофагов к интенсивности T-клеток представлены на фиг. 22. Следует отметить, что было выявлено пять онкогенов (показаны красным на фиг. 21).
Пример 9.
Выявление опухолеспецифических белковых признаков в фагоцитах, полученных от мышей, имеющих опухоли предстательной железы человека LNCaP и опухоли толстого кишечника человека
LS174T.
Для выделения и очистки белков из WBC, T-клеток и макрофагов мыши использовали набор для очистки белков (Norgen, Incorporated, Product # 23500). Анализ был очень простым и быстрым (приблизительно 30 мин) и выделенные белки, которые имели высокое качество и превосходный выход (117,6+10,60 мкг на 4 мл крови, n=5), можно было использовать в ряде последующих применений, таких как анализ SDS-PAGE, как представлено на фиг. 23, и вестерн-блоттинг.
Для этих исследований образцы белков выделяли из фагоцитарных (моноциты/макрофаги) и нефагоцитарных (Т-лимфоциты) клеток, полученных от мышей, имеющих опухоли LNCaP и LS174T, поскольку первая из этих клеточных линий экспрессирует PSA (Denmeade et al. (2001), Prostate, 48:1; Lin et al. (2001), J. Urol. 166:1943), а вторая обладает опухолеспецифическим гликопротеином (TAG-72), высокомолекулярным муцином (Colcher et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3199; Colcher et al. (1984), Cancer Res. 44:5744; Kassis et al. (1996), J. Nucl. Med. 37:343). Вестерн-блот анализ проводили с помощью 16 мкг очищенных образцов белков. По существу, каждый образец смешивали с двумя объемами нагрузочного буфера SDS и разделяли на 10% SDS-PAGE вместе с неокрашенными белковыми стандартами Precision Plus (Biorad) в буфере Tris-глицин-SDS (pH 8,4) при 200 В. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (в течение ночи при 4°С) с использованием устройства Mini Trans-Blot (Biorad) и буфера для переноса, содержащего 25 мМ Tris, pH 8,4, 192 мМ глицин и 20% метанол. Мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком (60 мин при комнатной температуре (RT)) и инкубировали (1 ч, RT) либо с В72.3, моноклональным антителом мыши против TAG-72 человека, либо с ER-PR8, моноклональным антителом мыши против PSA человека. Блоты промывали, а затем инкубировали с конъюгатом антитела козы против антител мыши с HRP Immun-Star (Biorad), вторичным антителом специфчным к IgG мыши, и проявляли посредством инкубации (5 мин, RT) со смесью 1:1 раствора люминола и пероксидного буфера (Biorad) с последующей радиоавтографией.
Данные отчетливо указывают на то, что фагоцитарные клетки из имеющих опухоли LNCaP мышей были положительными по PSA, в то время как этот белок нельзя было выявить в нефагоцитарных T-клетках от тех же животных, как представлено на фиг. 24. Аналогично, TAG-72 экспрессировался моноцитами/макрофагами, полученными от имеющих опухоли LS174T мышей, и он полностью отсутствовал в T-клетках этих же животных. Эти данные демонстрируют "приобретение" и экспрессию опухолес-пецифических белковых признаков фагоцитарными клетками.
Хотя эти данные являются специфичными для животных со злокачественной опухолью и фагоцитарных и нефагоцитарных клеток, полученных из крови мышей, описанные способы также пригодны для человека и при диагностике и/или выявлении одного или нескольких других нарушений и/или заболеваний и для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток, полученных из других жидкостей организма.
Пример 10.
Эксперименты по анализу профиля. Выделение фагоцитарных клеток крови.
Получают образец крови пациента. Кровь (~5 мл) переносят в 50-мл пробирку, содержащую 50 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация ЭДТА ~4,8 мМ). Пробирку встряхивают осторожно и добавляют 25 мл лизирующего RBC буфера (Norgen, Incorporated). Пробирку снова осторожно встряхивают, инкубируют при комнатной температуре до изменения цвета раствора на ярко-красный (3-5 мин) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 3 мин. После осторожного аспирирования супернатанта WBC промывают 40 мл не содержащего Ca/Mg 0,1 М PBS (содержащего 2% FBS, 2 мМ ЭДТА и 20 мМ глюкозу), а
затем клетки (106/мл) инкубируют (30 мин, 4°С в темноте) с раствором для окрашивания клеток, содержащим (i) проникающую в жизнеспособные клетки краску для ДНК Hoechst 33342 (4 мкг/мл; Em=483 нм), (ii) моноклональное антитело против моноцитов/макрофагов человека (Alexa Fluor(r) 647-конъюгат; Em=668 нм), которое распознает антиген F4/80 человека, экспрессируемый циркулирующими моноцитами/макрофагами, и (iii) моноклональное антитело против моноцитов человека (RPE-конъюгат; Em=578 нм), которое распознает циркулирующие нейтрофилы человека. Затем клетки промывают и сортируют (BD FACSAria) на нейтрофилы (Nn=2), нейтрофилы (Nn> 2), моноциты/макрофаги (M/Mn=2) и моноциты/макрофаги (M/Mn> 2). Анализ профиля генов.
Будет проведен анализ полногеномного профиля человека. Для образцов РНК, полученных из опухолевых клеток или нейтрофилов (Nn=2, Nn> 2) и моноцитов/макрофагов (M/Mn=2, M/Mn> 2) человека, используют GeneChip(r) Human Genome U133 Plus 2.0 Array от Affymetrix Incorporated. Этот чип анализирует уровень экспрессии свыше 47000 транскриптов и вариантов, включая 38500 хорошо охарактеризованных генов человека. Как правило, для определения профилей экспрессии генов человека с использованием указанного выше чипа используют экстрагированную РНК. Для обеспечения воспроизводимости на чипе анализ профиля каждого образца проводят три раза и эксперимент повторяют один раз. Данные микрочипа фильтруют в отношении связанных со злокачественной опухолью генов, как описано ниже, и проверяют с использованием количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскриптазой (RT-PCR).
Активация/подавление связанных со злокачественной опухолью генов.
РНК выделяют с использованием Triazol (Invitrogen, Incorporated) и очищают с использованием кассет, предоставленных в наборе. Качество и количество РНК оценивают с помощью Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Incorporated, Palo Alto, CA) и программного обеспечения Degradometer версии 1.41 (всемирный Web: DNAarrays.org). Эти экспериментальные результаты помогут отличить молекулярные каскады, нарушенные вследствие присутствия опухолей.
Анализ экспериментов на микрочипах.
Анализ полученных данных крупномасштабной/высокопроизводительной экспрессии будет основан в основном на возможности (i) идентифицировать гены, дифференциально экспрессируемые в фагоцитарных клетках с содержанием ДНК > 2, (ii) отметить идентифицированные гены и (iii) определить отмеченные гены как гены, специфично экспрессируемые конкретными опухолями. Статистический анализ данных микрочипа можно проводить, например, с использованием пакета dChip, который легко адаптирует этот тип построения списка генов в его меню "Analysis/Compare Samples". При использовании Affymetrix GeneChips один или несколько Gene Chips и связанных с ними способов будут применять для проверки качества исходных данных микрочипов (Gautier et al. (2004), Bioinformatics, 20:307). Более того, для обеспечения оптимального протокола нормализации и суммирования наборов зондов (для получения величин экспрессии) будут использовать различные способы коррекции и нормализации по фону (Huber et al. (2002), Bioinformatics, 18 (Suppl. 1): S96; Wu et al. (2004), Journal of the American Statistical Association, 99:909; Seo and Hoffman (2006), BioMed. Central Bioinformatics, 7:395). В двухстадийном фильтрационном подходе авторы настоящего изобретения будут сравнивать профили генов Pn=2 с профилями Pn> 2 и строить список экспрессированных генов, а затем сравнивать эти гены с опухолеспецифиче-скими генами, идентифицированными для каждой опухолевой клеточной линии - после фильтрации профиля генов Pn=2, как показано на фиг. 5. Например, (i) получат кровь от пациентов с раком молочной железы; (ii) выделят нейтрофилы (n> 2 и n=2) и определят их генные профили три раза; (iii) для каждой группы (Nn> 2 и Nn=2) вычислят среднее значение (для 3 образцов) для каждого идентифицированного гена и его соответствующую стандартную ошибку (SB); (iv) затем профили экспрессии генов двух групп сравнят и идентифицируют список (L-1) экспрессированных генов на основе абсолютного логарифмического изменения > 2 раз (Nn> 2/Nn=2), согласно модифицированному двухвыборочному t-критерию Велша; (v) профили экспрессии генов Nn=2 и профили экспрессии генов при раке молочной железы (полученные из биоптатов опухоли и нормальной ткани молочной железы) сравнят и идентифицируют список (L-2) экспрессированных генов; и (vi) приобретенные/экспрессированные в Nn> 2 специфичные для рака молочной железы генные признаки идентифицируют путем сравнения генов в L-1 и L-2 ("Analysis/Compare Samples/Combine Comparisons", dChip) и фильтрации общих генов.
Анализ профиля белков.
От 50 до 100 мкг тотального белка из каждого типа клеток будут денатурировать и восстанавливать трис-(2-карбоксиэтил)фосфинтрипсином (1 мМ) и 0,02% додецилсульфатом натрия при 60°С в течение 1 ч. Затем остатки цистеин будут блокировать и общий белок будут расщеплять трипсином при 37°С в течение 12-16 ч. Полученные пептиды будут метить iTRAQ (с помощью меток 113-119 и 121) в течение 1 ч (4-компонентные или 8-компонентные в зависимости от числа типов клеток, для сравнения). После мечения отдельно меченые образцы объединят и инъецируют в систему ВЭЖХ Agilent 1200 Series, оборудованную сильной катионообменной колонкой (Applied Biosystems 4,6x100 Porous). Затем 96 собранных фракций объединяют в 14 фракций и каждую фракцию инъецируют в систему ВЭЖХ LC Packings
Ultimate для второго раунда фракционирования в обращенно-фазовых условиях (аналитическая колонка LC Packings 15 смх75 мкм). Обращенно-фазовые фракции точечно нанесут непосредственно на заданный планшет с использованием LC Packings Probot и проанализируют с помощью масс-спектрометрии (Applied Biosystems 4800 Plus Proteomics Analyzer). После получения данных спектры обработают с использованием пакета программ ProteinPilot (Applied Biosystems MDS Sciex) и идентифицируют отдельные белки в каждом из типов клеток с их относительными уровнями экспрессии с использованием программного обеспечения ProteinPilot(tm) (анализ и идентификация ассоциированных со злокачественной опухолью протеомных признаков будет сходна с анализом, приведенным на фиг. 5, для геномных признаков).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, в частности, когда индивид имеет одну
или несколько доклинических форм рака, диагностированную первичную злокачественную опухоль и
метастазирующий рак, включающий следующие стадии:
получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии,
или для идентификации опухолеспецифического признака, включающий следующие стадии:
получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови больного раком;
получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови больного раком;
сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
идентификация дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии.
2. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии:
получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида;
получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида;
сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
идентификация циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента, специфичного для первого набора характеристик.
3. Способ по п.2, где повышение количества маркера в первом наборе характеристик экспрессии по
сравнению со вторым набором характеристик экспрессии указывает на наличие либо циркулирующей
опухолевой клетки, либо ее субклеточного фрагмента, либо того и другого.
4. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии:
выделение популяции фагоцитарных клеток индивида;
отделение фагоцитарных клеток 2n от фагоцитарных клеток > 2n; получение первого набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток 2n; получение второго набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток > 2n; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии.
5. Способ по пп.1, 2 или 4, где один или несколько маркеров для выявления или идентификации раковой клетки выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, белка, липида, углевода и их комбинаций.
6. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одного или нескольких из нейтрофила, макрофага, моноцита, дендритной клетки и пенистой клетки.
7. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где нефагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одной или нескольких из T-клетки, В-клетки, нуль-клетки и базофила.
8. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости.
9. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из популяции лейкоцитов.
10. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием антител, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови выделяют с использованием антител.
11. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы,
10.
состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюиро-вания, и способов микрофлюидики.
12. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или выявления инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессиро-ванным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов.
13. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер выбран из одной или нескольких ДНК, РНК и микроРНК, соответствующих одному или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогена и гена супрессии опухоли, или по п. 1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой ДНК или РНК, соответствующие двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам и генам супрессии опухоли, или их сочетания, или по п.4 для выявления раковой клетки, где один или несколько маркеров выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, микроРНК и их сочетаний, соответствующих двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам, генам супрессии опухоли или их сочетаниям.
14. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер представляет собой белок или полипептид или белок и пептид, кодируемые одним или несколькими генами злокачественной опухоли, и онкогеном и геном опухолевой супрессии, или способ по п.1 для идентификации опухолеспецифиче-ского признака, где два или несколько маркеров представляют собой белки или пептиды, кодируемые двумя или несколькими генами злокачественной опухоли, онкогенами, генами опухолевой супрессии или их сочетаниями.
фрагментов (> 2п)
Опухолеспецифические признаки : ДНК (35). РНК (IP'), белок (|Ж1),и липид (pfe'j)
Фиг. 4
Среднее значение = 6 препаратов каждого
Фиг. 8
Нормальная Опухолевая Нейтрофил Т-клетки
ткань ткань
Таблица 5. Экспрессия связанных со злокачественной опухолью генов в фагоцитарных нейтрофилах (N) и макрофагах (М)
Сверхэспре-ссированные гены
LNCaP (карцинома предстательной железы человека) (мыши nude)
LS174T (карцинома толстого кишечника человека) (мыши nude)
B16F10 (меланома мыши) (черные мыши)
LLC1 (карцинома легкого мыши) (черные мыши)
ВАК1
Яш" "
EGFR
ERBB2
FOS
JUN
ИНН-
МАР2К1
Mdm2
ММР2
PDGFB
Plaur
RB1
SNCG
SERPINB2
SPP1
Всего
1 ены,
сверхэкспрессированные в фагоцитах (M+N)
Красный = онкогены; синий = опухолеспецифические гены; и черный = связанные со злокачественной опухолью ген
§5] = ген
приобретенный/экспрессированный одновременно М и N
Фиг. 21
Обозначение гена
Макрофаги/Т-клетки
онкоген
Фиг. 22
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
020920
- 1 -
(19)
020920
- 1 -
(19)
020920
- 1 -
(19)
020920
- 1 -
(19)
020920
- 1 -
(19)
020920
- 4 -
020920
- 30 -
020920
- 33 -
020920
- 34 -
020920
- 35 -
020920
- 36 -
020920
- 38 -
020920
- 38 -
020920
- 39 -