[**]

1. Способ изготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, включающий перекрестно-сшитый гемоглобин, состоящий из (а) заготовки цельной крови, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму; (b) отделения эритроцитов от плазмы и белков плазмы в цельной крови путем фильтрования для получения отфильтрованной фракции эритроцитов; (с) лизирования эритроцитов с целью получения раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов; (d) экстрагирования гемоглобина из лизата разрушенных эритроцитов с получением первого раствора гемоглобина; (е) проведения одной или нескольких процедур очистки для удаления любых не гемоглобиновых примесей из первого гемоглобинового раствора для получения очищенного раствора гемоглобина; (f) перекрестного сшивания тетрамеров гемоглобина в очищенном гемоглобиновом растворе для получения второго раствора, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, включающий два или более перекрестно-сшитых тетрамера гемоглобина; (g) термообработки второго раствора гемоглобина, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, в деоксигенированной среде при температуре от 85 до 95°С в течение не более чем 40 мин с целью денатурации и выделения в осадок остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димеров) и прочих примесей, в результате чего получается термостабильный раствор, содержащий перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин с невыявляемой концентрацией димеров; (h) охлаждения термостабильного раствора до температуры не выше 25°С за приблизительно 2 мин или меньше во избежание образования метгемоглобина; (i) удаления осадка путем центрифугирования или при помощи фильтра с получением раствора очищенного термостабильного гемоглобина, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин.

2. Способ по п.1, предусматривающий добавление N-ацетилцистеина сразу после термообработки.

3. Способ по п.1, предусматривающий охлаждение на стадии (h) в течение менее чем 1 мин.

4. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят в температурном диапазоне от 85 до 90°С в течение 8-30 мин.

5. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят при температуре около 90°С в течение 45-150 с.

6. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят при температуре около 95°С в течение 30-100 с.

7. Способ по п.1, предусматривающий добавление N-ацетилцистеина непосредственно перед термообработкой.

8. Способ по п.2, в котором добавление N-ацетилцистеина осуществляется непосредственно перед термообработкой.

9. Способ по п.1, в котором одна или несколько процедур очистки на стадии (е) для получения чистого гемоглобинового раствора включают ультрафильтрацию.

10. Способ по п.1, в котором одна или несколько совершаемых процедур очистки на стадии (е) включают хроматографию.

11. Термостабильная фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода на основе гемоглобина, включающий перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, изготовленный способом по п.1.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ изготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, включающий перекрестно-сшитый гемоглобин, состоящий из (а) заготовки цельной крови, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму; (b) отделения эритроцитов от плазмы и белков плазмы в цельной крови путем фильтрования для получения отфильтрованной фракции эритроцитов; (с) лизирования эритроцитов с целью получения раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов; (d) экстрагирования гемоглобина из лизата разрушенных эритроцитов с получением первого раствора гемоглобина; (е) проведения одной или нескольких процедур очистки для удаления любых не гемоглобиновых примесей из первого гемоглобинового раствора для получения очищенного раствора гемоглобина; (f) перекрестного сшивания тетрамеров гемоглобина в очищенном гемоглобиновом растворе для получения второго раствора, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, включающий два или более перекрестно-сшитых тетрамера гемоглобина; (g) термообработки второго раствора гемоглобина, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, в деоксигенированной среде при температуре от 85 до 95°С в течение не более чем 40 мин с целью денатурации и выделения в осадок остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизированного гемоглобина (димеров) и прочих примесей, в результате чего получается термостабильный раствор, содержащий перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин с невыявляемой концентрацией димеров; (h) охлаждения термостабильного раствора до температуры не выше 25°С за приблизительно 2 мин или меньше во избежание образования метгемоглобина; (i) удаления осадка путем центрифугирования или при помощи фильтра с получением раствора очищенного термостабильного гемоглобина, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин.

2. Способ по п.1, предусматривающий добавление N-ацетилцистеина сразу после термообработки.

3. Способ по п.1, предусматривающий охлаждение на стадии (h) в течение менее чем 1 мин.

4. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят в температурном диапазоне от 85 до 90°С в течение 8-30 мин.

5. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят при температуре около 90°С в течение 45-150 с.

6. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят при температуре около 95°С в течение 30-100 с.

7. Способ по п.1, предусматривающий добавление N-ацетилцистеина непосредственно перед термообработкой.

8. Способ по п.2, в котором добавление N-ацетилцистеина осуществляется непосредственно перед термообработкой.

9. Способ по п.1, в котором одна или несколько процедур очистки на стадии (е) для получения чистого гемоглобинового раствора включают ультрафильтрацию.

10. Способ по п.1, в котором одна или несколько совершаемых процедур очистки на стадии (е) включают хроматографию.

11. Термостабильная фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода на основе гемоглобина, включающий перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, изготовленный способом по п.1.

---

Евразийское 020891 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2015.02.27
(21) Номер заявки 201101154
(22) Дата подачи заявки 2011.08.31
(51) Int. Cl. A61K38/42 (2006.01) C07K1/36 (2006.01)
(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ
(31) 13/097,183
(32) 2011.04.29
(33) US
(43) 2012.10.30
(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец: ВОН БИН ЛОУ (US); КВОК СУЙ И (HK)
(74) Представитель:
Вахнина Т.А. (RU)
(56) US-A-5741894 US-A-5281579 WO-A1-1996040783
(57) Раскрывается способ термообработки растворов перекрестно-сшитого гемоглобина с
полимерным гемоглобином. Способ предполагает обработку растворов гемоглобина в I аппарате высокотемпературного кратковременного действия. В процессе высокотемпературной | кратковременной термообработки происходит денатурация немодифицированного тетрамерного гемоглобина (гемоглобина в димерной форме), удаление белковых примесей (например, иммуноглобулина G, сывороточного альбумина), бактерий и вирусов, что помогает избежать повреждений почек, сосудистых нарушений и токсических реакций.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области переносчиков кислорода на основе гемоглобина и, в частности, методам термической обработки с целью очистки переносчиков кислорода на основе гемоглобина, содержащих полимерный гемоглобин.
Уровень техники изобретения
Существует потребность в кровезамещающих растворах, применяемых в целях лечения и профилактики кислородной недостаточности в результате кровопотерь (например, вследствие острого кровоизлияния или при хирургическом вмешательстве), анемии (например, пернициозной или серповиднокле-точной анемии) или шока (например, от недостатка объема крови, анафилактического, септического или аллергического).
Использование крови и ее фракций в качестве кровезамещающих растворов имеет массу недостатков. Например, использование цельной крови ассоциировано с риском передачи вирусов гепатита и СПИДа, что может привести к осложнениям процесса восстановления пациента или летальному исходу. Кроме того, использование цельной крови требует проведения процедур определения группы крови и перекрестных проб на совместимость во избежание иммуногематологических проблем и междонорской несовместимости.
В качестве заменителя крови гемоглобин обладает осмотическим действием и проявляет способность к транспортировке и переносу кислорода. Однако водные растворы гемоглобина существуют в равновесном состоянии между тетрамерными (65 кДа) и димерными (32 кДа) формами. Димеры гемоглобина вырабатываются почками и способствуют быстрой внутрисосудистой элиминации растворов гемоглобина со средним периодом полураспада в плазме крови от 2 до 4 ч.
Предпринимались попытки, направленные на преодоление присущих растворам гемоглобина ограничений посредством молекулярной модификации гемоглобина. Благодаря внутримолекулярному и межмолекулярному сшиванию гемоглобина, в целом, удалось снизить почечную элиминацию и увеличить время внутрисосудистого удержания.
Тем не менее, растворы перекрестно-сшитого гемоглобина по-прежнему содержат значительное количество немодифицированного тетрамерного гемоглобина, который может преобразовываться в ди-мерный и в таком виде выводиться из организма, снижая средний показатель времени внутрисосудистого удержания для кровезамещающих растворов на основе перекрестно-сшитого гемоглобина. Кроме того, существующие средства сепарации крови, например стандартные фильтры, не всегда способны адекватно различать немодифицированный и модифицированный тетрамерный гемоглобин.
Таким образом, несмотря на недавний прогресс в сфере изготовления кровезамещающих растворов на основе перекрестно-сшитого гемоглобина, по-прежнему существует потребность в эффективном методе выделения немодифицированного гемоглобина из кровезамещающих растворов внутримолекулярно и/или межмолекулярно перекрестно-сшитого гемоглобина, который позволил бы повысить средний показатель времени внутрисосудистого удержания кровезаменителя и предотвратить существенное повышение уровней почечной элиминации гемоглобина.
В применявшихся ранее подходах к удалению различных примесей из растворов гемоглобина упор делался на процедурах термообработки, проводившихся при относительно низкой температуре в течение длительного времени (более 1 ч). В патенте США № 5281579 описывается процесс термообработки при температуре от 45 до 85°С, в частности при 60-66°С на протяжении 1-30 ч. В патенте США № 5741894 описывается процесс удаления примесей из раствора частично оксигенированного гемоглобина при температуре от 45 до 85°С, в частности при 76°С, на протяжении 90 мин. Однако такая длительная термообработка может привести к образованию метгемоглобина, который невозможно использовать для целей насыщения тканей кислородом. Кроме того, такие длительные процессы термообработки не могут применяться на промышленном уровне.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к способу отделения немодифицированного гемоглобина от перекрестно-сшитого гемоглобина в растворах гемоглобина с содержанием полимерного гемоглобина. Способ подразумевает помещение раствора гемоглобина в аппарат высокотемпературной кратковременной термообработки, в котором немодифицированный тетрамерный гемоглобин под воздействием температуры денатурируется, образуя осадок. Затем денатурированные димеры гемоглобина, выпавшие в осадок, отделяются от раствора, а перекрестно-сшитый гемоглобин остается в растворе.
Преимуществами изобретения являются создание кровезамещающих растворов с улучшенным показателем времени внутрисосудистого удержания, снижение или устранение значительной почечной элиминации гемоглобина и связанных с ней побочных эффектов, подходящее онкотическое давление и снижение гипертензивных эффектов.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена принципиальная схема аппарата высокотемпературной кратковременной термообработки для денатурирования немодифицированного гемоглобина из кровезамещающего раствора на основе модифицированного гемоглобина в соответствии с данным изобретением.
На фиг. 2 изображен график высокоэффективной жидкостной хроматографии термически не обра
ботанного полимерного гемоглобина.
На фиг. 3 изображен график жидкостной хроматографии высокого разрешения (а) термически необработанного полимерного гемоглобина с радиоактивно меченным димером гемоглобина и (b) термостабильного полимерного гемоглобина, подвергнутых кратковременной термообработке при 80, 85, 90 и 95°С соответственно.
Подробное описание изобретения
Гемоглобин (Hb), пригодный для изготовления Hb-растворов по данному изобретению, можно получать из новой, старой или просроченной крови человека и других позвоночных, например крупного рогатого скота, свиней, овец, уток и цыплят.
Забор крови можно производить у живых и недавно забитых доноров. Примеры соответствующих методик получения гемоглобина из эритроцитов крови описаны в патентах США №№ 5084558 и 5296465, выданных на имя Рауш и др., патенте США № 6498141, выданном на имя ДеВоскин и др., патенте США № 7291592, выданном на имя Гулд и др. Идеи патентов США №№ 5084558, 5296465, 6498141 и 7291592 включены в данный документ путем ссылки в полном объеме.
В предпочтительном варианте исполнения гемоглобин получают из эритроцитов, как описано в патенте США № 5955581, идеи которого включены в данный документ путем ссылки в полном объеме.
Подходящие растворы гемоглобина содержат водные растворы разведенного Hb, состоящего из не-модифицированного Hb и модифицированного тетрамерного Hb и/или полимерного Hb.
В данном документе под немодифицированным гемоглобином подразумевается гемоглобин в не-диссоциированной и неперекрестно-сшитой тетрамерной форме, которая может диссоциироваться на димеры Hb in vitro или in vivo; немодифицированный гемоглобин также может содержать диссоциированные димеры Hb. Димеры Hb могут далее диссоциироваться на субъединицы (мономеры) Hb. Модифицированный гемоглобин может внутримолекулярно перекрестно сшиваться в стабильные тетрамеры либо - межмолекулярно - в полимерные цепи Hb-растворов. В состав раствора гемоглобина с содержанием полимеров, используемого в качестве исходного раствора данного изобретения, перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин может входить наряду с межмолекулярно перекрестно-сшитым полимерным гемоглобином, а также нежелательным немодифицированным гемоглобином в тетрамерной или димер-ной форме.
Полимерный гемоглобин может содержать только те компоненты гемоглобина, которые упомянуты в патентах США №№ 5753616, 5895810 и 6288027, раскрытие сущности которых включено в данный документ путем ссылки. Полимерный гемоглобин может содержать негемоглобиновые молекулы (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ)), конъюгированные с гемоглобином. Подобные материалы описаны в патентах США №№ 7169900, 7501499 и 7795401, раскрытие сущности которых включено в данный документ путем ссылки. Все упомянутые выше материалы могут использоваться в качестве исходного ге-моглобинсодержащего раствора в описываемом ниже процессе удаления димеров. Также в этом процессе можно использовать переносчики кислорода на основе гемоглобина, выпускаемые промышленным способом, в том числе HEMOPURE(r), OXYGLOBIN(r), POLYHEME(r), HEMOLINK(tm) и МР4.
В процессе данного изобретения раствор с содержанием полимерного гемоглобина, приготовленный в соответствии с одной из представленных выше идей, подвергается термической обработке при температуре от 80 до 95°С, а предпочтительнее от 85 до 95°С, благодаря чему происходит успешное удаление неперекрестно-сшитых тетрамерных и димерных форм гемоглобина из раствора, содержащего полимерный гемоглобин. Любой осадок, образующийся в результате термообработки, удаляется путем центрифугирования или при помощи фильтра, после чего остается прозрачный гемоглобинсодержащий раствор. Предпочтительно, чтобы высокотемпературная кратковременная термообработка осуществлялась с использованием аппарата, показанного на фиг. 1 и подробно описанного в примере 1. При указанном температурном диапазоне термообработка может проводиться в течение менее 1 ч. При немногим меньших температурах - 80-85°С - достаточно 20-40 мин. При температурах от 85 до 90°С достаточно 830 мин. При более высоких температурах - 90-95°С - в примере варианта исполнения термообработка может занимать менее 5 мин, а иногда и менее 3 мин. Желательно, чтобы остывание длилось менее 2 мин, а предпочтительнее менее 1 мин в целях сведения к минимуму образования метгемоглобина.
Высокотемпературная кратковременная термообработка растворов гемоглобина в процессе их очистки также удаляет прочие примеси, например иммуноглобулин G, вредоносные микробы и вирусы, что помогает избежать повреждений почек, сосудистых нарушений и токсических реакций.
Термообработка тетрамерного гемоглобина описана в патенте США № 7932356 и заявках на патент США №№ 12/821214 и 13/013850, раскрытие сущности которых включено в данный документ путем ссылки. Упаковка термообработанного по данному изобретению полимерного гемоглобина может осуществляться в соответствии с процессом, описанным в патенте США № 7932356; такой гемоглобин может использоваться в различных методиках насыщения тканей кислородом, описанных в упомянутых патентах и заявках.
Пример 1. Высокотемпературная кратковременная (ВТКВ) термообработка.
Аппарат высокотемпературной кратковременной (ВТКВ) термообработки показан на фиг. 1. При помощи ВТКВ аппарата производится термообработка исходного материала с содержанием полимерного
гемоглобина. В данном примере условия термообработки следующие: 90°С, 30 с - 3 мин, предпочтительнее 45-60 с; хотя прочие условия могут подбираться, как было описано выше с соответствующей настройкой аппарата. Раствор, содержащий полимерный гемоглобин, в данном случае серийно выпускаемый Oxyglobin(r), обрабатывается (необязательно) 0,2%-ным N-ацетилцистеином и закачивается в аппарат ВТКВ (первый отдел теплообменника ВТКВ предварительно нагревается до 90°С) с интенсивностью потока 1,0 л/мин; время нахождения в первом отделе аппарата составляет 45-60 с, после чего раствор с той же скоростью подается в другой отдел теплообменника, температура в котором поддерживается на уровне 25°С. Время, необходимое для охлаждения, составляет 15-30 с. Сразу после охлаждения до приблизительно 25°С добавляется (необязательно) N-ацетилцистеин в концентрации от 0,2 до 0,4%, предпочтительно 0,4%. Эта добавка позволяет сохранять низкий уровень выработки метгемоглобина (неактивного гемоглобина) после ВТКВ обработки. Аппарат легко настраивается на промышленную эксплуатацию. Если гемоглобин не перекрестно сшит, он не является термостойким и после термообработки образует осадок, удаляемый путем центрифугирования или при помощи фильтра, после чего остается практически прозрачный раствор.
На фиг. 2 представлено молекулярно-массовое распределение полимерного гемоглобина по результатам эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Диапазон молекулярно-массового распределения раствора, содержащего полимерный гемоглобин, составляет от 32 кДа до > 500 кДа. После ВТКВ термообработки (при 80-95°С) по нашему изобретению радиоактивно меченная ди-мерная форма гемоглобина может быть успешно удалена из раствора, содержащего полимерный гемоглобин (см. фиг. 3). Осадок, образующийся при ВТКВ обработке, удаляется путем центрифугирования или при помощи фильтра, после чего остается практически прозрачный раствор перекрестно-сшитого гемоглобина.
После этого при помощи устройства Hemox Analyzer, применяемого для измерения р50 (парциального давления кислорода, при котором раствор гемоглобина насыщен на 50%) производят анализ (а) термически не обработанного раствора, содержащего полимерный гемоглобин, и (b) термически обработанного (при 80°С) раствора, содержащего полимерный гемоглобин. Никаких значительных изменений концентрации гемоглобина (по результатам кооксиметрии) между состоянием (1) до ВТКВ термообработки и (2) после ВТКВ термообработки выявлено не было. Тем не менее, показатель р50 после ВТКВ термообработки снизился (с 37,5 до 23,3 мм рт.ст.). Это указывает на то, что связывающая аффинность кислорода к гемоглобину повышается. Снижение показателя р50 является преимуществом для подачи кислорода в ткани, обедненные кислородом, и в гипоксические опухолевые клетки. По мере разрастания опухоль быстро "перерастает" объемы ее кровоснабжения, в результате чего в некоторых ее участках концентрация кислорода существенно снижается по сравнению со здоровыми тканями. Согласно Дэнни (Дэнни У.А. Стратегии применения неактивных лекарственных форм в лечении рака. Европейский журнал медицинской химии, 2001, 36, 577-595) опухолевые клетки обычно резистентны к рентгенотерапии и химиотерапии, однако их можно сделать более восприимчивыми к подобным воздействиям за счет повышения в них концентрации кислорода.
Таблица 1
показатель р50 (мм рт.ст.)
Термически не обработанный раствор, содержащий полимерный гемоглобин
37,5
Термически обработанный раствор, содержащий полимерный гемоглобин
23,3
Пример 2. Полимерный гемоглобин Oxyglobin(r) и/или Hemopure(r).
Синтетический кровезамещающий раствор стабильного полимерного гемоглобина, созданный на основе патентов США №№ 5895810, 5296465, 5084558, 5753616 и 5955581, также известен как Oxyglo-bin(r) (Оксиглобин) и/или Hemopure(r) (Гемопур), раскрытие сущности которых включено в данный документ путем ссылки.
Следующий пример относится к способу изготовления растворов, содержащих полимерный гемоглобин, подходящих для обработки в аппарате для термообработки и способу данного изобретения.
Производят забор цельной бычьей крови, смешивают ее с антикоагулянтом цитратом натрия для получения кровяного раствора. Эритроциты из цельной бычьей крови изолируют от цельной бычьей крови. Затем эритроциты промывают с целью удаления внеклеточных белков плазмы, таких как альбумин бычьей сыворотки (АБС) или иммуноглобулин G. Затем эритроциты подвергают лизису и получают гемоглобинсодержащий раствор.
Далее концентрированный Hb-раствор из ультрафильтрационного резервуара поступает в среду, содержащуюся в параллельных хроматографических колоннах, где происходит сепарация Hb методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В хроматографических колоннах находится среда анионного обмена, подходящая для отделения Hb от негемоглобиновых белков. Эта среда анионного обмена является средой анионного обмена четвертичного аммония на силикагеле. Данный способ обработки
силикагеля описан в Журнале хроматографии, 120:321-333 (1976).
Затем из Hb-раствора выводят свободный кислород, чтобы концентрация оксигемоглобина (HbO2) составляла около 101. При этом температура Hb-раствора поддерживается в диапазоне от 19 до 31°С. Кроме того, в процессе отделения свободного кислорода и далее Hb находится в обедненной кислородом среде в целях минимизации поглощения кислорода Hb и поддержания концентрации оксигенированного Hb (HbO2) в деоксигенированном Hb на уровне ниже 10%.
Перед началом процесса полимеризации Hb-раствор разбавляют апирогенной и обедненной кислородом водой для инъекций (ВдИ) до концентрации 40 г Hb/л. Полимеризацию проводят в 12 мМ фосфатном буфере при рН 7,8 и концентрации хлора не более 35 мМ.
Далее стабилизированный по кислороду деоксигенированный Hb и N-ацетилцистеин (NAC) в течение 4 ч медленно смешивают с перекрестно-сшивающим агентом глютаральдегидом в пропорции 29,4 г глютаральдегида на каждый килограмм Hb при температуре 42°С, пропуская Hb-раствор через 1,5-дюймовый статический смеситель Kenics с 6 элементами (Chemineer, Inc.), в результате чего получают полимерный Hb-раствор (далее "ПОЛИ(Е[Ь)"). После завершения полимеризации температура ПОЛИ(Е[Ь) в полимеризаторе снижается до 18-22°С.
Затем, пропуская поли(ЫЪ) через ультрафильтр, его концентрацию доводят до 85 г/л. Подходящим для этой цели является ультрафильтр с 30 кДа. Далее раствор поли(Е1Ъ) смешивают с 66,75 г борогидрита натрия, а потом пропускают через статический смеситель на скорости 10-20 л/мин.
После того как уровень рН и электролитов восстановлен до физиологической нормы, кровезаме-щающий раствор на основе стабилизированного полимерного Hb разводят до концентрации 50 г/л путем добавления в полимеризатор фильтрованного деоксигенированного буфера с низким показателем рН. Разбавленный кровезамещающий раствор подвергают диафильтрации путем пропускания из полимеризатора через статический смеситель и 100 кДа очистной фильтр с фильтрованным деоксигенированным буфером, содержащим 27 ммоль лактата натрия, 12 ммоль NAC, 115 ммоль NaCl, 4 ммоль KCl и 1,36 ммоль CaCl2 в ВдИ (рН 7,8). Диафильтрация продолжается до тех пор, пока содержание модифицированных и немодифицированных тетрамерных форм в кровезамещающем растворе не станет меньше 10%.
Полимерный Hb-раствор образуется в соответствии с методом, описанным в данном примере 2 (согласно описанию патента США № 5084558, выданного на имя Рауш и др.). Этот Hb-раствор подвергается анализу посредством гель-проникающей хроматографии, по результатам которой он содержит около 45% димеров Hb, около 15% тетрамеров немодифицированного Hb и около 40% полимерных молекул Hb, которые по размеру превосходят немодифицированные тетрамеры.
Далее материал, содержащий полимерный гемоглобин, может быть подвергнут термообработке согласно примеру 1 в целях удаления димеров и немодифицированных тетрамеров Hb.
Пример 3. Полимерный гемоглобин Polyheme(r).
Синтетический кровезамещающий раствор стабильного полимерного гемоглобина, созданный на основе патентов США №№ 6498141 и 7291592, также известен как препарат компании Northfiel Laboratories Inc. (Polyheme(r) (Полигем)), раскрытие сущности которого включено в данный документ путем ссылки.
Следующий пример относится к способу изготовления растворов, содержащих полимерный гемоглобин, подходящих для обработки в аппарате для термообработки по методу данного изобретения. (3а). Подготовка, промывка и лизис эритроцитов.
Кровяной раствор смешивают с 1%-ным водным раствором хлорида натрия, в результате чего образуется 4%-ный раствор общего гемоглобина. Затем добавляют окись углерода, чтобы в смесительной емкости образовалась атмосфера с монооксидом углерода.
После подключения фильтра с поперечным потоком и размером ячейки 0,65 мкм 4%-ный раствор общего гемоглобина промывают 8 об. 1%-ного раствора хлорида натрия с целью удаления загрязняющих белков плазмы крови. После промывания производят концентрацию раствора до 16% общего гемоглобина и добавляют воду для инъекций (ВдИ), увеличивая объем раствора в 2,5 раза. После добавления ВдИ клетки разбухают и лопаются, выпуская гемоглобин в раствор. Получающийся раствор гемоглобина имеет концентрацию общего гемоглобина около 7%.
Производят очистку получившегося раствора: строма эритроцитов и материалы клеточных стенок удерживаются и удаляются при помощи фильтра. В оставшемся растворе концентрация общего гемоглобина составляет около 3,3%.
(3b). Термообработка, очистка и противовирусная обработка.
Получившийся раствор, очищенный от стромы, подвергается термообработке при температуре 60-62°С в течение приблизительно 10 ч. На протяжении этого времени раствор перемешивается на умеренной скорости. После достижения раствором температуры 55°С образуется осадок.
Получившийся термически обработанный, очищенный от стромы раствор с показателем общего гемоглобина 3,3% (в отношении веса к объему) затем пропускают через фильтр предварительной очистки с размером ячейки 0,2 мкм, за которым следует фильтр предварительной очистки с размером ячейки 0,1 мкм, после чего раствор проходит через ультрафильтр противовирусной обработки 100 кДа.
(3с). Ультрафильтрация, концентрация.
Далее концентрацию общего Hb в профильтрованном растворе доводят до 14%; раствор промывают и подвергают диафильтрации 4 об. ВдИ. Этап концентрации и диафильтрации заканчивают с помощью ультрафильтра 10 кДа. Таким образом, основу раствора составляет карбоксигемоглобин.
(3d). Кислородный и азотный газообмен.
Получившийся карбоксигемоглобиновый раствор в течение 18 ч барботируют потоком кислорода при температуре 10°С. В результате раствор содержит менее 5% карбоксигемоглобина от массы общего гемоглобина.
После обогащения кислородом раствор в течение приблизительно 3-3,5 ч барботируют аналогичным потоком азота при температуре 10°С до тех пор, пока в растворе не останется менее 10% карбокси-гемоглобина от массы общего гемоглобина.
(3е). Химическое модифицирование.
Раствор деоксигенированного гемоглобина (около 4°С) затем добавляют в водный раствор пири-доксил-5-фосфата (Р5Р) (93,75 г/л) в молярном соотношении 2:1 (Р5Р:гемоглобин). Пиридоксилирование проводится при температуре около 4°С. Раствор Р5Р обычно добавляют в течение 1 мин, перемешивают в течение 15 мин, потом к раствору гемоглобина добавляют раствор борогидрида натрия/гидроксида натрия в соотношении 0,8 г гидроксида натрия и 90,8 г борогидрида натрия на 2 л раствора гемоглобина. Раствор борогидрида добавляют как можно быстро в течение 1 мин и перемешивают в течение 1 ч. Получившийся раствор пиридоксилированного гемоглобина затем подвергают диафильтрации при помощи ультрафильтра 10 кДа, удаляющего излишки реагентов посредством 4 об. ВдИ.
(3f). Раствор полимерного гемоглобина.
Пиридоксилированный гемоглобин разводят достаточным количеством ВдИ до получения раствора с концентрацией общего гемоглобина 4,5%. К раствору пиридоксилированного гемоглобина добавляют раствор глютаральдегида в молярном соотношении 24:1 (глютаральдегид:гемоглобин). Обычно, раствор глютаральдегида добавляют в течение около 2,5 ч, используя дозировочный насос. Реакция полимеризации протекает в течение 15-18 ч. Расчетные показатели молекулярно-весового распределения составляют около 75% полимера и 25% тетрамера. Расчетная молекулярная масса полимеров не превышает 600 кДа и преимущественно находится в диапазоне 100-350 кДа.
Когда реакция полимеризации приводит к достижению расчетных показателей молекулярно-весового распределения (по прошествии 15-18 ч), добавляют (для остановки реакции) водный раствор глицина в молярном отношении глицина к гемоглобину 140:1. В этот момент уровень рН раствора равен 8,9. Получившийся раствор перемешивают в течение 30-40 мин, после чего добавляют раствор борогид-рида натрия/гидроксида натрия (в указанной выше концентрации) в молярном отношении борогидрида натрия к гемоглобину 28:1. Получившийся раствор перемешивают в течение 1 ч. Затем раствор концентрируют посредством ультрафильтрации и промывают 4 об. ВдИ. К концентрированному раствору добавляют дополнительную аликвоту борогидрида натрия в том же молярном соотношении и опять перемешивают в течение 1 ч. Получившийся раствор промывают 4 об. ВдИ, получая полимерный пиридокси-лированный бесстромальный гемоглобин, прошедший термическую обработку.
Получившийся раствор оксигенируют в кислородной атмосфере. Затем гемоглобин разбавляют до уровня общего гемоглобина 4%. Далее этот раствор подвергают диафильтрации с применением 10 мМ NaCl/20 мМ NaOH и ультрафильтра 300 кДа. Фильтрация продолжается до тех пор, пока через фильтр не пройдет около 97% гемоглобинового материала при непрерывной концентрации до уровня общего гемоглобина 4-8% при помощи ультрафильтра 70 кДа (около 3% материала, т.е. высокомолекулярных полимеров, удерживаются).
В получившемся материале уровень общего гемоглобина составляет 4-8%, кроме того, в нем содержится около 25% тетрамеров. Далее материал, содержащий полимерный гемоглобин, может быть подвергнут термообработке согласно примеру 1 с целью удаления димеров и немодифицированных Hb-тетрамеров.
Хотя различные аспекты изобретения изложены в отдельных пунктах формулы изобретения, другие аспекты изобретения содержат другие комбинации характеристик описанных вариантов исполнения и/или зависимых пунктов формулы изобретения с характеристиками отдельных пунктов формулы изобретения, а не собственно комбинации, изложенные в формулах изобретения.
Обращаем внимание, что представленные выше описания примерных вариантов исполнения изобретения не должны рассматриваться в ограничительном смысле. Напротив, вариации и модификации могут осуществляться без отклонения от объема данного изобретения, описанного в прилагаемых пунктах формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ изготовления высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, включающий перекрестно-сшитый гемоглобин, состоящий из
(a) заготовки цельной крови, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;
(b) отделения эритроцитов от плазмы и белков плазмы в цельной крови путем фильтрования для получения отфильтрованной фракции эритроцитов;
(c) лизирования эритроцитов с целью получения раствора, содержащего лизат разрушенных эритроцитов;
(d) экстрагирования гемоглобина из лизата разрушенных эритроцитов с получением первого раствора гемоглобина;
(e) проведения одной или нескольких процедур очистки для удаления любых не гемоглобиновых примесей из первого гемоглобинового раствора для получения очищенного раствора гемоглобина;
(f) перекрестного сшивания тетрамеров гемоглобина в очищенном гемоглобиновом растворе для получения второго раствора, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, включающий два или более перекрестно-сшитых тетрамера гемоглобина;
(g) термообработки второго раствора гемоглобина, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, в деоксигенированной среде при температуре от 85 до 95°С в течение не более чем 40 мин с целью денатурации и выделения в осадок остаточного непрореагировавшего гемоглобина, нестабилизи-рованного гемоглобина (димеров) и прочих примесей, в результате чего получается термостабильный раствор, содержащий перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин с невыявляемой концентрацией ди-меров;
(h) охлаждения термостабильного раствора до температуры не выше 25°С за приблизительно 2 мин или меньше во избежание образования метгемоглобина;
(i) удаления осадка путем центрифугирования или при помощи фильтра с получением раствора
очищенного термостабильного гемоглобина, содержащего перекрестно-сшитый полимерный гемогло-
бин.
2. Способ по п.1, предусматривающий добавление N-ацетилцистеина сразу после термообработки.
3. Способ по п.1, предусматривающий охлаждение на стадии (h) в течение менее чем 1 мин.
4. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят в температурном диапазоне от 85 до 90°С в течение 8-30 мин.
5. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят при температуре около 90°С в течение 45150 с.
6. Способ по п.1, где нагревание на стадии (g) проводят при температуре около 95°С в течение 30100 с.
7. Способ по п.1, предусматривающий добавление N-ацетилцистеина непосредственно перед термообработкой.
8. Способ по п.2, в котором добавление N-ацетилцистеина осуществляется непосредственно перед термообработкой.
9. Способ по п.1, в котором одна или несколько процедур очистки на стадии (е) для получения чистого гемоглобинового раствора включают ультрафильтрацию.
10. Способ по п.1, в котором одна или несколько совершаемых процедур очистки на стадии (е) включают хроматографию.
11. Термостабильная фармацевтическая композиция, содержащая переносчик кислорода на основе гемоглобина, включающий перекрестно-сшитый полимерный гемоглобин, изготовленный способом по
п.1.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
020891
- 1 -
(19)
020891
- 1 -
(19)
020891
- 1 -
(19)
020891
- 1 -
(19)
020891
- 4 -
(19)
020891
- 7 -