[**]

1. Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей H-Asp-Glu-NH-CH ₂ -CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, или их фармацевтически приемлемые соли.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием и содержащая в эффективном количестве пептиды по п.1.

3. Применение пептидов H-Asp-Glu-ОСН3 и Ac-Asp-Glu-OH в качестве цитопротекторного средства.

(57) Реферат / Формула:

1. Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей H-Asp-Glu-NH-CH ₂ -CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, или их фармацевтически приемлемые соли.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием и содержащая в эффективном количестве пептиды по п.1.

3. Применение пептидов H-Asp-Glu-ОСН3 и Ac-Asp-Glu-OH в качестве цитопротекторного средства.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
020866 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2015.02.27
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
(51) Int. Cl. C07K5/06 (2006.01) C07K 5/072 (2006.01) C07K 5/113 (2006.01) A61K38/03 (2006.01) A61P 43/00 (2006.01)
(54) ПЕПТИДЫ С ЦИТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
(43) 2014.08.29
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЗАМЕРТОН ХОЛДИНГС ЛИМИТЕД (CY)
(72) Изобретатель:
Белый Петр Александрович, Черторижский Евгений Александрович, Овчинников Михаил Владимирович (RU)
(74) Представитель:
Баландина Л.А. (RU)
(56) SUBASINGHE N. et al. "Synthesis of acyclic
and dehydroaspartic acid analogues of Ac-Asp-Glu-OH and their inhibition of rat brain N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase (NAALA dipeptidase", J. Med. Chem., 1990 Oct; 33(10): pp. 2734-2744 (реферат) [он-лайн] [найдено 28.05.2013] Найдено из PubMed, PMID: 2213826
Chemical Book. AC-ASP(GLU-OH)-OH, 4910-46-7, Copyright 2010, [он-лайн] [найдено 28.05.2013] Найдено из Интернет: URL:http://www.chemicalbook.com/ChemicalProduct Property_EN_CB3767672.htm
DATABASE STN CA, № 104840-89-3P CA, DILL KILIAN et al. "Structural studies of neuropep-tides composed of L-Asp and D-Glu by carbon-13 NMR spectroscopy", Journal of Protein Chemistry, 1985, v. 4, n. 6, pp. 363373, реферат
DATABASE STN CA, № 1046152-23-1 CA, MATTHIAS K. KOCH et al. "Physiological Sites of Deamidation and Methyl Esterification in Sensory Transducers of Halobacterium salinarum" Journal of Molecular Biology, 4 July 2008, Vol. 380, Issue 2, pp. 285-302, реферат
Organic Chemistry Laboratory Final Exam. Chemistry 238, 2011, с. 11, [найдено 28.05.2013] Найдено из Интернет: URL:http://readbag.com/organic-chem-tamu-chem-238-labs-finalstuff-238-spring
KHAVINSON VKH. et al. "Tetrapeptide
H-Ala-Glu-Asp-Arg-OH stimulates expression of cytoskeletal and nuclear matrix proteins" Bull Exp. Biol. Med., 2012 Aug; 153(4): pp. 559-562 (реферат) [он-лайн] [найдено 28.05.2013] Найдено из PubMed, PMID:
22977870
(57) Изобретение относится к медицине и касается пептидов, обладающих цитопротекторной активностью, выбираемых из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-СН2-СН3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, Ala-Asp-Glu, Lys-Asp-Glu и Asp-Glu-Gly, при этом пептиды являются химически стабильными при хранении. Также предложена фармацевтическая композиция, содержащая в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-№1-СН2-СН3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, Ala-Asp-Glu, Lys-Asp-Glu или Asp-Glu-Gly. Выраженное цитопротекторное действие позволяет использовать фармацевтическую композицию в пищевой, косметологической и фармацевтической промышленности.
Изобретение относится к медицине и касается биологически активных пептидов, обладающих ци-топротекторой активностью, и фармацевтической композиции на их основе.
Уровень техники
Известен ряд коротких пептидов, содержащих в своей структуре производные дипептида Y-L-Glu-L-Asp-X и имеющие свойства межклеточных медиаторов [патенты РФ №№ 2177802; 2161501; 2301074; 2304444; 2155063]. Недостатком этих соединений является их химическая неустойчивость и склонность к самопроизвольным перегруппировкам. В случае, если X - остаток глицина, происходит самопроизвольная миграция этого остатка от а-карбоксила аспарагиновой кислоты к р-карбоксилу. И хотя это превращение может происходить в случае любой аминокислоты, скорость этой реакции сильно зависит от стерических препятствий [Pharmactutical Research, Vol. 11, № 5, 1994, p. 751-758; Pharmactutical Research, Vol. 7, № 8, 1990, p. 787-793]. В случае, если X - остаток пролина или любое другое органическое соединение с вторичной аминогруппой, то происходит самопроизвольный разрыв связи между этими остатками [Synthetic peptides, Sec. ed., Gregory A. Grant, Oxford Univ. Press 2002, p. 283]. Следует отметить, что эти превращения приводят к частичной рацемизации остатка аспарагиновой кислоты.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения впервые предложены пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH. Пептиды, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, оказывают выраженное цитопротекторное действие, при этом являются химически стабильными при хранении.
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая цитопротек-торным действием, содержащая в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-ОСН3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH или H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3 (DENHEt);
фиг. 2 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом
Ac-Asp-Glu-OH (AcDE);
фиг. 3 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe);
фиг. 4 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом H-
Val-Asp-Glu-OH (VDE);
фиг. 5 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом H-
Leu-Asp-Glu-OH (LDE);
фиг. 6 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом H-
Ala-Asp-Glu-Arg-OH (ADER);
фиг. 7 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподипло-идным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3 (DENHEt);
фиг. 8 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподипло-идным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом Ac-Asp-Glu-OH (AcDE);
фиг. 9 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподипло-идным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe);
фиг. 10 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподип-лоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом VDE;
фиг. 11 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподип-лоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом LDE;
фиг. 12 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподип-лоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ADER;
фиг. 13 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-NH-СН2-СН3 (DENHEt) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина;
фиг. 14 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-NH-СН2-СН3 (DENHEt) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 15 - протективное действие пептида Ac-Asp-Glu-OH (AcDE) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 16 - протективное действие пептида Ac-Asp-Glu-OH (AcDE) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина;
фиг. 17 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина;
фиг. 18 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 19 - протективное действие пептида H-Val-Asp-Glu-OH (VDE) на клетки NIH3T3 в присутст
вии капмтотецина;
фиг. 20 - протективное действие пептида H-Val-Asp-Glu-OH (VDE) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина;
фиг. 21 - протективное действие пептида H-Leu-Asp-Glu-OH (LDE) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина;
фиг. 22 - протективное действие пептида H-Leu-Asp-Glu-OH (LDE) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 23 - протективное действие пептида H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH (ADER) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина;
фиг. 24 - протективное действие пептида H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH (ADER) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение впервые обеспечивает биологические активные пептиды, обладающие ци-топротекторной активностью и выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, причём пептиды являются химически стабильными при хранении.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, обладающую цитопротекторным действием, содержащую в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-ОСЮ, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH или H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH. Обнаруженный цитопротекторный эффект позволяет использовать предложенную фармацевтическую композицию в пищевой, косметологической или фармацевтической промышленности.
Примером ацетилированного на N-конце пептида является пептид Ac-Asp-Glu-OH (AcDE). Примеры, иллюстрирующие соединения со сложноэфирной связью на С-конце, являются пептиды H-Asp-Glu-ОСН3. Примером соединения с амидной связью на С-конце является пептид Н-Asp-Glu-NH-СН2-СН3. Синтез пептидов осуществляют с использованием общепринятых в химии биологически активных пептидов методических приемов [А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Химический синтез пептидов. Киев, Нау-кова думка, 1992 г.; Пептиды, основные методы образования пептидных связей. Москва, "Мир", 1983 г.], как представлено в примерах 1-6.
Условные сокращения:
Boc - трет-бутилоксикарбонил
Bzl - бензил
Z-бензилоксикарбон
Bu - трет-бутил
DCHA - дициклогексил амин
TFA - трифторуксусная кислота
ONP - паранитрофенил
ONSu - N-оксисукценил
NMM - N-метилморфолин
DMF - диметилформамид
Tos - паратолуолсульфонат
DCHA - дициклогексиламин
Ala (А) - остаток аланина
Asp (D) - остаток аспарагиновой кислоты
Glu (E) - остаток глутаминовой кислоты
Lys (K) - остаток лизина
Gly (G) - остаток глицина
Arg (R) - остаток аргинина
Trp (W) - остаток триптофана
Leu (L) - остаток лейцина
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium, среда Игла, модифицированная Дульбекко
FBS - fetal bovine serum, сыворотка плода коровы
PBS - phosphate buffer saline, фосфатный солевой буфер, рН 7,4
HeLa (ATCC Number - CCL-2.2, subclone S3) - клетки аденокарциномы матки человека эпителиальной морфологии
NIH3T3 (ATCC Number - CRL-1658) - эмбриональные фибробласты мыши DMSO - диметилсульфоксид EDTA - этилендиаминтетраацетат.
Исследование стабильности пептидов при хранении осуществляли в соответствии с примером 7. Представленные результаты (табл. 1) свидетельствуют о том, что пептиды в соответствии с изобретением хорошо хранятся в растворах при различных значениях рН.
Исследование биологической активности пептидов было проведено с использованием в качестве
модельной системы культивируемых клеток мыши и человека: NIH3T3 и HeLa S3 соответственно (пример 8).
Биологическая активность каждого пептида была определена по следующим параметрам: влияние на пролиферативную активность клеток и способность вызывать апоптоз и некроз. Для этого были исследованы следующие показатели: доля погибших (с поврежденной плазматической мембраной) клеток NIH3T3 при обработке пептидами от общего количества клеток (результаты представлены на фиг. 1-6), и уровень апоптотической гибели клеток.
Апоптотическую гибель клеток оценивали по доле клеток HeLa S3 с гиподиплоидным содержанием ДНК. Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагмен-тированная ДНК, которая удаляется из клеток во время обработки раствором HCl. Результаты определения апоптотической гибели клеток HeLa S3 после инкубации с пептидами представлены на фиг. 7-12.
Протекторные свойства пептидов были продемонстрированы в экспериментах по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека: NIH3T3 и HeLa S3 (пример 9).
Апоптоз - программируемая клеточная гибель, являющаяся результатом реализации генетической программы или ответом на внешние факторы и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул. Апоптоз сопровождается появлением характерных цитологических признаков (маркеров апоптоза) и молекулярных процессов. В живых клетках, в частности, наблюдается асимметричное распределение различных фосфолипидов между внутренним и наружным монослоями цитоплазматической мембраны: фосфолипиды, содержащие холин, такие как фосфатидилхолин и сфингомиелин, локализованы в основном в наружном монослое, а фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин (аминофосфолипиды) - во внутреннем. В процессе апоптоза цитоплплазматическая мембрана претерпевает изменения, одним из которых является переход фосфатидилсерина из внутреннего ее монослоя в наружный, где фосфатидил-серин оказывается доступным для связывания с Annexin-V, кальцийзависимым, фосфолипид-связывающим белком с мол. массой 35-36 кДа, обладающим высоким сродством к фосфатидилхолину (Кд равна 5х10-10 М). Annexin-V-связывающий анализ основан на быстром и высокоспецифическом выявлении клеток, содержащих фосфатидилхолин в наружном монослое цитоплазматической мембраны, т.е. клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза.
Данные процентного содержания апоптотических и некротических клеток в популяциях HeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях представлены в табл. 2. На гистограммах (фиг. 13-24) представлено процентное содержание апоптотических и некротических клеток в популяциях HeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях.
Из приведенных гистограмм и данных, представленных в табл. 2, видно, что исследуемые пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 400 нг/мл оказывают выраженное защитное действие на клетки HeLa S3 и NIH3T3, т.е. обладают цитопротективной активностью.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена в виде таблеток, капсул с использованием фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и приемов, традиционных для данной области техники, а также может быть выполнена в виде раствора для инъекций. Кроме того, композиция может быть выполнена в виде капель, или раствора для приема внутрь, или в виде спрея назального или капель назальных, аэрозоля подъязычного или орального, или в виде порошка, или в виде лиофилизата для приготовления раствора.
Перечисленые формы фармацевтической композиции получают известными методами. Композицию согласно изобретению вводят перорально или парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно). Для получения фармацевтической композиции согласно изобретению используют любые фармацевтически приемлемые носители или растворители. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков и тому подобного.
Таблетки, содержащие различные наполнители, например цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция или любые другие фармацевтически приемлемые наполнители, применяются вместе с различными дезинтеграторами, например крахмалом, предпочтительно картофельным крахмалом или тапиокой, сложными силикатами или любыми другими фармацевтически приемлемыми дезинтеграторами, вместе со связывающими веществами, например поливинилпирролидоном, сахарозой, желатином, аравийской камедью, любыми другими фармацевтически приемлемыми связывающими веществами. Кроме того, часто применяются скользящие вещества, например стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк для таблетирования или любые другие фармацевтически приемлемые вещества. Композиции согласно изобретению также применяются в мягких и твердых заполненных желатиновых капсулах; предпочтительные в этом случае материалы включают, например, лактозу или молочный сахар, а также полиэти-ленгликоли с высоким молекулярным весом. Если для перорального введения желательны водные суспензии и/или эликсиры, соединения этого изобретения могут сочетаться с различными подслащивающими средствами, улучшающими вкус и запах, подкрашивающими веществами, эмульгирующими веществами и/или суспендирующими средствами, а также растворителями, такими как вода, этанол, пропиленг-ликоль, глицерин и различные подобные их комбинации. Для парентерального введения могут использо
ваться растворы в кунжутном или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле, так же как и стерильные водные растворы соответствующих водорастворимых солей. Такие водные растворы могут быть соответственно буферными, если необходимо, и водный растворитель сначала изотонируют с помощью достаточного количества раствора соли или глюкозы. Эти водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи используемые водные среды легко можно получить с помощью стандартных методик, хорошо известных специалистам.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH или H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция согласно предложенному изобретению содержит пептид(ы) от 10 до 95 мас.%.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Синтез пептида Ac-Asp-Glu-OH (AcDE).
Boc-Asp(OBzl)-Glu (OBzl)-Obzl.
К охлажденному до -20°С раствору 48,5 г (150 ммоль) Boc-Asp(Bzl)-OH в 300 мл ДМФ добавляли 16,5 мл (150 ммоль) NMM и 19,5 мл (150 ммоль) изобутилхлороформиата и перемешивали в течение 15 мин. Смесь перемешивали при той же темпиратуре 20 мин. Далее прибавляли охлажденный до -20°С раствор 74,5 г (155 ммоль) аминокомпонента H-Glu(Bzl)-OBzl х Tos в 200 мл ДМФ, содержащий 17 мл NMM (155 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -10°С, в течение 2 ч при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате (500 мл) и последовательно промывали 5% NaHCO3, H2O, 2% H2SO4, H2O (дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопро-пиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 500 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 89 г (89%) хроматографически однородного продукта.
12,64 г (20 ммоль) защищенного дипептида 1 растворяли в 100 мл хлороформа и к полученному раствору при 0°С прибавляли 100 мл трифторуксусной кислоты, смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и растворители упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 300 мл этилацетата и промывали 5% раствором бикарбоната 3 раза по 200 мл. Органический слой отделяли, сушили над безводным Na2SO4 и этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 300 мл диметилформамда и к полученному раствору прибавляли 3,6 г (20 ммоль) паранитрофнилового эфира уксусной кислоты. Смесь оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток растворяли в этилацетате и промывали 5% водным раствором аммиака до исчезновения следов паранитрофенола (контороль по ТСХ), водой до рН 6-7, органический слой отделяли, сушили и этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Pd/C при комнатной темпиратуре. После завершения гидрирования катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 300 мл воды, повторно упаривали до половины объема и лиофилизовали. Получили 5,2 г (85,8%) целевого ацильного производного дипептида. По данным ВЭЖХ чистота продукта больше 95%.
В спектре ПМР:
Asp - 4.62 (а-СН); 2.70, 2.53 (Р-СН2); 8.63 (NH)
Glu - 4.20 (а-СН); 1.97, 1.78 (р-СН2); 2.26 (у-СН2); 8.19 (NH)
Ас - 1.96 (3H, -СОСН3).
Пример 2. Синтез пептида H-Asp-Glu-OCH3.
Z-Asp(OBut)-Glu(OBut)-OCH3.
10,0 г (46,3 ммоль) H-Glu(OBut)-OCH3 растворяли в 300 мл диметилфорамида и при комнатной температуре прибавляли 19,7 г ( 47 ммоль) Z-Asp(OBut)-ONSu. Через 12 ч (контроль - ТСХ в системе хлоро-форм:метанол:уксусная кислота - 9:1:0.5 "Б") реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этил-ацетате, промывали последовательно 2% серной кислотой, водой, сушили над Na2SO4, упаривали. Остаток растворяли в 100 мл эфира. Вещество кристаллизуется при 4°С. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Получено 20 г (80,3%) хроматографически однородного вещества.
20 г (37 ммоль) полученного выше соединения растворяли в 100 мл хлороформа и к раствору прибавляли 100 мл трифторуксусной кислоты. Смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Растворители упаривали. Остаток растворяли в этилацетате и промывали водой, 1-2% раствором бикарбоната натрия и снова водой. Органический слой отделяли, сушили и растворитель упаривали. Остаток растворяли в 10% водном метиловом спирте и гидрировали над 5% Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывали, метанол упаривали. Продукт высаживали эфиром. Твердый осадок отфильтровывали и сушили на воздухе. Получено 9,6 г (94%) искомого метилового эфира.
В спектре ПМР:
Asp - 4.13 (а-СН); 2.79, 2.66 (Р-СН2); 8.14 (NH2)
Glu - 4.59 (а-СН); 1.93, 1.72 (Р-СН2); 2.36 (у-СН2); 8.67 (NH)
ОСН3 - 2.8 (3Н, СН3).
Пример 3. Синтез пептида H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3 (DENHEt). Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)-NH-CH2-CH3.
К охлажденному до -20°С раствору 6,46 г (20 ммоль) Вос-Asp(OBzl)-OH в 100 мл диметилформа-мида добавляли 2,22 мл (20 ммоль) N-метилморфолина и 2,6 мл (20 ммоль) изобутилхлороформиата, перемешивали в течение 15 мин и прибавляли охлажденный до -20°С раствор 5,0 г (21 ммоль) амино-компонента H-Glu(Bzl)-NHEt в 40 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -10°С, в течение 2 ч при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате (250 мл) и последовательно промывали 2% раствором серной кислоты, 5% раствором бикарбоната, водой (дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопропиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 50 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гек-саном, сушили. Получено 9,9 г (85%) хроматографически однородного продукта.
5,86 г (10 ммоль) защищенного дипептида, полученного, как описано выше, растворяли в 50 мл хлороформа и к полученному раствору при 0°С прибавляли 50 мл трифторуксусной кислоты, смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и растворители упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 100 мл этилацетата и промывали 5% раствором бикарбоната 3 раза по 200 мл. Этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Pd/C при комнатной температуре. После завершения гидрирования ( контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 300 мл воды, повторно упаривали до половины объема и лиофилизовали. Получили 2,57 г (95%) целевого дипептида. По данным ВЭЖХ чистота продукта больше 95%.
В спектре ПМР:
Asp - 4.13 (а-СН); 2.79, 2.66 (Р-СН2); 8.14 (NH2)
Glu - 4.59 (а-СН); 1.93, 1.72 (р -СН2); 2.36 (у-СН2); 8.67 (NH)
NH-CH2-CH3 - 2.45 (СН2), 1.43 (СН3), 7.56 (NH).
Пример 4. Синтез пептида H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH (ADER).
Z-Glu(OtBu)-ArgOH.
К раствору 104,4 г (228 ммоль) Z-Glu(OtBu)-ONP в 0,5 л диметилформамида прибавляли 38,3 г (228 ммоль) H-Arg-OH. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 ч. Затем выдерживали при температуре 4°С 4 ч, образовавшийся осадок отфильтровывали и промывали на фильтре 0,4 л смеси диметилформамид-эфир (1:2), 0,45 л эфира, 0,4 л гексана. Сушили. Выход: 91,7 г (82,3%) хромато-графически однородного Z-Glu(OtBu)ArgOH, контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота
(5:3:1).
Z-Asp(OBu)-Glu(OBu)-Arg-OH.
Раствор 90,6 г (185 ммоль) Z-Glu(OtBut)-ArgOH в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5% Pd/C. После окончания гидрирования (контроль по ТСХ в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1) катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 75,9 г (185 ммоль) Z-Asp(OtBu)-ONP, реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 ч до завершения реакции (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносили на колонку с силикагелем (400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали (контроль в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1).
Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, растворители упаривали. К остатку проливали 400 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получили 103 г (84%) хроматографически однородного защищенного трипептида.
Раствор 100 г (150 ммоль) Z-Asp(Bu)-Glu(OtBut)-ArgOH в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5% Pd/C. После окончания гидрирования (контроль по ТСХ в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1) катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 51,6 г (150 ммоль) Z-Ala-ONp. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 ч до завершения реакции (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносили на колонку с силикагелем (примерно 400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, растворители упаривали. К остатку проливали 400 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получили 95 г (86%) хроматографически однородного защищенного тетрапептида. Полученный продукт растворяли в 500 мл трифторуксусной кислоты и смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Кислоту упаривали, к остатку приливали 1000 мл диэтилового эфира, образовавшийся аморфный осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром два раза по 150 мл и сушили. Вещество растворяли в 1500 мл смеси воды с этиловым спиртом и гидрировали в токе водорода над 10% Pd/C.
По окончании гидрирования (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали и растворители упаривали до масла, растворяли в 300 мл воды и наносили на колонку с SP-сефадексом. Колонку промывали двумя объемами 0,05М пиридин-ацетатного буфера и смывали вещество тем же 0,2М буфером. Фракции, содержащие продукт, объединяли, растворители упаривали, повторно упаривали с водой для удаления остатков пиридин-ацетата и лиофилизовали.
Получили 60 г (82%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.
В спектре ПМР:
Ala - 3.75 (а-CH); 1.42 (P-CH3); 8.02 (2Н, NH2) Asp - 4.16 (а-СН); 2.82, 2.65 (Р-СН2); 8.14 (NH) Glu - 4.35 (а-СН); 1.93, 1.87 (р-СН2); 2.30 (у-СН2); 8.60 (NH)
Arg - 4.16 (а-СН); 1.75, 1.62 (Р-СН2); 1.54, 1.50 (у-СН2); 3.10 (5-СН2); 7.58 (e-NH2); 8.28 (NH). Пример 5. Синтез пептида H-Val-Asp-Glu-OH (VED).
Z-Val-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2.
10 г (15,8 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2 растворяли в 200 мл TFA, выдерживали 1 ч при комнатной температуре, кислоту упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого DMF и прибавляли порциями Na2CO3 до прекращения выделения СО2. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл DMF, прибавляли 3,33 мл (30 ммоль) N-метилморфолина и 5,57 г (16 ммоль) Z-Val-ONSu, оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали на 80%, к образовавшемуся сиропообразному остатку прибавляли 800 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 ч при +4°С, осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход 10,3 г (82%) продукта.
10,3 г (13,4 ммоль) защищенного трипептида при нагревании до +50°С растворяли в 1000 мл АсОН + 100 мл воды до полного растворения осадка и гидрировали, периодически подогревая реакционную смесь. После окончания реакции (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали до консистенции жидкого масла и прибавляли 800 мл изопропилового спирта. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Вещество растворяли в деио-низированной воде, упаривали остатки изопропилового спирта и лиофилизировали. Получали 4,4 г (92%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.
В спектре ПМР:
Val - 0.94, 0.97 (у-СН3); 418 (а-СН); 2.13 (Р-СН); 8.08 (NH2) Asp - 4.62 (а-CH); 2.70, 2.53 (P-CH2); 8.63 (NH) Glu - 4.20 (а-СН); 1.97, 1.78 (p-CH2); 2.26 (y-CH2); 8.19 (NH). Пример 6. Синтез пептида H-Leu-Asp-Glu-OH (LDE).
Z-Leu-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2.
12,6 г (20,0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2 растворяли в 200 мл TFA, выдерживали 1 ч при комнатной температуре, кислоту упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого DMF и прибавляли порциями Na2CO3 до прекращения выделения СО2. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл DMF, прибавляли 3,33 мл (30 ммоль) N-метилморфолина и 5,0 г (20 ммоль) Z-Leu-ONSu, оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали на 80%, к образовавшемуся сиропообразному остатку прибавляли 800 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 ч при +4°С, осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход: 13,3 г (84%) продукта. 13 г (16,7 ммоль) защищенного трипептида при нагревании до +50°С растворяли в 1000 мл АсОН + 100 мл воды до полного растворения осадка и гидрировали, периодически подогревая реакционную смесь. После окончания реакции (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали до консистенции жидкого масла и прибавляли 800 мл изопропилового спирта. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Вещество растворяли в деионизированной воде, упаривали остатки изопропилового спирта и лиофилизировали. Получали 5,5 г (87%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.
В спектре ПМР:
Leu - 0.94, 0.90 (5-СН3); 4,38 (а-СН); 1.92 (Р-СН2); 1.65 (у-СН); 8.08 (NH2)
Asp - 4.62 (а-СН); 2.70, 2.53 (Р-СН2); 8.63 (NH)
Glu - 4.20 (а-СН); 1.97, 1.78 (р-СН2); 2.26 (у-СН2); 8.19 (NH).
Пример 7. Исследование стабильности пептидов при хранении.
Пептиды растворяли в 0,05М ацетатаммонийном буфере с рН 4.5 и рН 7.5 с таким расчетом, чтобы их концентрация была примерно 1 мг/мл. Растворы стерильно фильтровали и хранили в стерильных, хорошо закупоренных флаконах. По истечении срока хранения вещества анализировали методом ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 1.
Представленные результаты анализов свидетельствуют о том, что продукты хорошо хранятся в растворах при различных значениях рН.
Пример 8. Исследование биологической активности пептидов в условиях стандартного культивирования клеток.
Было проведено изучение биологической активности синтезированных пептидов в пяти различных концентрациях (400, 200, 100, 10 и 1 нг/мл) с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека №ЮТ3 и HeLa S3.
Биологическая активность каждого пептида была определена по следующим параметрам: влиянию пептидов на пролиферативную активность клеток и способность пептидов вызывать апоптоз и некроз. Для этого были исследованы действие пептидов на фибробласты №ЮТ3 (определение доли погибших клеток после инкубации с пептидами и общего количества клеток) и уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3 после инкубации с пептидами.
Культивирование клеток и обработка пептидами.
Культивирование фибробластов №ЮТ3 проводили в полной питательной среде DMEM (Панэко, РФ), содержащей 10% эмбриональной сыворотки (Панэко), гентамицин 2 ед./мл (Панэко), глютамин 29,2 мкг/мл (Панэко), в СО2-инкубаторе. Для культивирования использовали флаконы фирмы SPL (Южная Корея) с площадью 25 и 175 см2. Пересев клеток осуществляли в соотношении 1:5 - 1:7.
По достижении примерно 50% конфлюэнтности во флаконы добавляли пептиды в указанных выше конечных концентрациях. В каждом эксперименте использовали по два флакона с одинаковой концентрацией каждого пептида. В контрольные флаконы добавляли соответствующий объем полной среды без пептидов. С каждым пептидом проведено по два независимых эксперимента (по два повтора в каждом). Через 24 ч инкубации с пептидами клетки извлекали из культурального флакона с помощью обработки в смеси трипсина и версена (1:3, Панэко). Клетки из каждого флакона помещали в одинаковый объем за-буференного физиологического раствора (0,01М PBS, рН 7,2). Суспензию клеток делили на 3 равные части для исследования перечисленных выше показателей.
Культивирование клеток HeLa выполняли сходным образом за исключением того, что пересев клеток осуществляли в соотношении 1:3-1:4. Исследование показателей осуществляли с помощью проточной цитометрии. Использовали проточный цитофлуориметр-сортировщик FACS Vantage (Becton Dickinson, США). Перед проведением каждой серии анализов прибор тестировали и калибровали по стандартным микросферам (Polyscience) в соответствии с методикой, рекомендованной фирмой-изготовителем.
Определение общего количества клеток во флаконе и доли погибших клеток.
К суспензии клеток, полученной, как описано выше, добавляли йодистый пропидий (prodium iodide -PI, Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл и калибровочные частицы Calibrite (Becton Dickinson, США), меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦем). Конечную концентрацию калибровочных частиц определяли с помощью камеры Горяева. Инкубировали 10-12 мин и немедленно анализировали на проточном цитометре по 4 параметрам - прямое светорассеяние, боковое светорассеяние, флуоресценция PI, флуоресценция ФИТЦа. В каждом образце анализировали по 20 тыс. клеток. Данные записывали в файл. Затем проводили компьютерную обработку данных с помощью программы CellQuestPro (Becton Dickinson, США).
Определяли долю PI+ клеток с поврежденной плазматической мембраной (погибшие клетки). Уровень гибели в контрольных флаконах (15-20 шт.) усредняли и принимали за 100%. Возможное влияние пептидов оценивали по соотношению с контролем.
В каждом файле выявляли ФИТЦ+ калибровочные частицы и определяли их количество. Затем по показателям светорассеяния идентифицировали клетки и находили их количество в тех же файлах. Рассчитывали соотношение клеток/калибровочных частиц в каждом файле (образце), по которому судили о количестве клеток во флаконе. Соотношение клеток/калибровочных частиц в контроле принимали за 100%. Количество клеток в опытных флаконах оценивали в процентах по сравнению с контролем. Ре
зультаты представлены на фиг. 1-6.
Определение гибели клеток путем апоптоза.
Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фраг-ментированная ДНК, которая удаляется из клеток во время обработки раствором HCl. Затем оставшуюся в клетках ДНК окрашивают специфическими красителями, например PI (пропидиум йодид), и определяют поклеточное содержание ДНК. Апоптотическую гибель клеток оценивают по доле клеток с гиподип-лоидным содержанием ДНК.
Суспензию клеток, полученную, как описано выше, охлаждали до +4°С. К суспензии клеток добавляли охлажденный этанол в объемном соотношении 1:3 при постоянном перемешивании. Клетки хранили 1-2 недели до анализа. При помощи центрифугирования удаляли этанол из образцов, затем удаляли фрагментированную ДНК из клеток с помощью 0,6М HCl (37°С, 10 мин). Далее клетки отмывали PBS и окрашивали в 0,3 мл раствора PI (50 мкг/мл) в PBS, выдерживали 15 мин при комнатной температуре и анализировали на проточном цитометре. PI в данной концентрации позволяет проводить определение поклеточного содержания ДНК и выявлять фракцию клеток с фрагментированной ДНК с высоким разрешением. Для измерения флуоресценции PI использовали узкополосные фильтры 585/42 нм, мощность лазера составляла 57 мВт. В каждом образце анализировали 5-103 клеток, затем проводили компьютерную обработку с использованием программы CellQuestPro (Becton Dickinson, США). На первом этапе анализа выделяли регион клеток по светорассеянию, затем в этом регионе оценивали флуоресценцию PI. Маркер гиподиплоидного содержания ДНК выставляли по контрольным образцам.
Результаты определения апоптотической гибели клеток HeLa S3 после инкубации с пептидами представлены на фиг. 7-12.
Пример 9. Изучение протекторных свойств пептидов.
В экспериментах по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз использовали набор реагентов ApoTarget Annexin-V FITC Apoptosis Kit (Invitrogen США). Помимо Annexin-V, меченного флуоресцентным красителем FITC, набор реагентов ApoTarget Annexin-V FITC Apoptosis Kit содержит краситель пропидиум йодид (PI). PI обладает способностью проникать только в те клетки, у которых нарушена целостность цитоплазматической мембраны, что является одним из характерных признаков поздних стадий апоптоза или некроза. Проникнув в клетки с поврежденной клеточной мембраной, PI связывается с ДНК. "Красная" флуоресценция образовавшихся комплексов выявляется с помощью поточного цитофлуори-метра.
Таким образом, используя процедуру двойного окрашивания клеток (Annexin-V FITC плюс PI) и метод поточной цитофлуорометрии можно различать 3 популяции клеток и определять их процентное соотношение: 1) неапоптотические клетки (Annexin-V-негативные и PI-негативные), 2) клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза (Annexin-V-позитивные и PI-негативные), 3) некротические клетки или клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза (Annexin-V-позитивные и PI-позитивные). По увеличению доли апоптотических и некротических клеток можно судить о степени влияния добавляемых в среду культивирования соединений на упомянутые процессы. В качестве контроля в экспериментах использовали рекомендуемое производителем соединение камптотецин (Camptothecin, Sigma, США), обладающее ярко выраженной способностью вызывать апоптоз и некроз клеток, в особенности опухолевых.
Растворы пептидов в стерильном PBS с концентрациями 1 мг/мл готовили непосредственно перед проведением экспериментов по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз. Для изучения пролифе-ративной активности использовали те же растворы, которые после приготовления хранили в стерильных пробирках при +4°С. В день проведения каждого эксперимента готовили рабочие разведения пептидов в среде культивирования клеток. Для этого использовали стерильный пластиковый 96-луночный планшет (Corning, США). Разведения готовили таким образом, чтобы при внесении 25 мкл каждого рабочего разведения в экспериментальную лунку с культивируемыми клетками конечные концентрации пептидов составляли 400, 200, 100 и 50 нг/мл.
Культивируемые клетки.
Для культивирования клеток HeLa S3 и №ЮТ3 использовали реагенты компании Invitrogen (США) и пластиковые флаконы, планшеты, пипетки и фильтры компании Corning (США). Клетки культивировали в среде DMEM, приготовленной из сухого концентрата, растворенного в апирогенной дистиллированной воде (Millipore, США). Среда содержала 10% FBS, 2 мМ глутамина и пенициллин-стрептомицин (разбавленный в соответствии с рекомендациями производителя). HeLa S3 и NIH 3Т3 выращивали во флаконах Т150 при +37°С в атмосфере 5,6% СО2. Клетки постоянно поддерживали в логарифмической фазе роста, для чего рассеивали их не реже 2 раз в неделю, используя трипсин для снятия прикрепленных клеток с поверхности культуральных флаконов. Подсчёт живых клеток проводили в гемацитометре после окрашивания аликвоты суспензии трипановым синим. Клетки HeLa S3 и №ЮТ3 снимали с поверхности культуральных флаконов, подсчитывали, доводили концентрацию до 105 кл/мл и рассеивали полученные суспензии по 1 мл в лунки 24-луночных культуральных планшетов. На следующий день, убедившись, что клетки прикрепились к поверхности планшетов, среду культивирования во всех лунках меняли на свежую. В контрольные лунки (положительный контроль - стимуляция апоптоза и некроза) добавляли камптотецин до конечной концентрации 50 мкМ, которая была определена в предварительных
экспериментах с клетками NIH3T3 и HeLa S3. В контрольные лунки (отрицательный контроль) добавляли 25 мкл свежей среды культивирования в экспериментальные лунки добавляли по 25 мкл рабочих разведений пептидов (каждое рабочее разведение - в 2 повторах) и камптотецин в той же конечной концентрации. Инкубацию проводили при +37°С. Через 24 ч после начала инкубации клетки снимали с поверхности 24-луночных планшетов, переносили из каждой лунки в отдельную центрифужную пробирку объёмом 1,5 мл, промывали 1 мл рабочего раствора буфера для связывания красителя Annexin-V FITC и осаждали клетки центрифугированием (Sysmex Platelet Centrifuge PC-810). Супернатант сливали, к клеточному осадку добавляли 5 мкл красителя Annexin-V FITC и 10 мкл красителя пропидиум йодид (PI) и инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре (+25°С). Затем в каждую пробирку добавляли 300 мкл рабочего раствора буфера для связывания Annexin-V FITC и измеряли интенсивности зелёной и красной флуоресценции. В полученных распределениях выделяли две популяции - Annexin-V-позитивные и PI-негативные (клетки, находящиеся в стадии апоптоза) и Annexin-V-позитивные и PI-позитивные клетки (клетки, находящиеся в стадии некроза). На гистограммах (фиг. 13-24) и в табл. 2 представлены данные процентного содержания апоптотических и некротических клеток в популяциях HeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях.
Таблица 2
Процентное содержание апоптотических и некротических клеток в популяциях HeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях
Из приведенных гистограмм и данных, представленных в табл. 2, видно, что исследуемые пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 400 нг/мл оказывают выраженное защитное действие на клетки HeLa S3 и NIH3T3, т.е. обладают цитопротективной активностью.
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что лекарственное средство, предлагаемое в соответствии с настоящим изобретением, обладает выраженным цитопротекторным действием и может быть использовано в пищевой, косметологической й фармацевтической промышленности.
Пример 10. Приготовление форм композиции.
Приготовление раствора для инъекций.
Инъекционные растворы получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 510-543). 180 г субстанции пептида растворяют при перемешивании и барботаже азотом в 0,8 л воды для инъекций, добавляют воду для инъекций до общего объема 1,0 л. Проводят стерилизующую фильтрацию полученного раствора и в асептических условиях, осуществляют под азотом его розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Заполненные ампулы запаивают под азотом.
Приготовление капсул.
Капсулы получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 400-413). Для приготовления капсул смешивают ингредиенты из расчета состава одной капсулы:
пептид - 200 мг;
вспомогательные вещества (целлюлоза микрокристаллическая, кальция стеарат) - в количестве, достаточном до получения содержимого капсулы массой 300 мг. Состав капсул: красители, желатин. Приготовление таблеток.
Таблетки получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 335-368). Для приготовления таблеток смешивают ингредиенты из расчета состава одной таблетки:
пептид - 250 мг;
кремния диоксид коллоидный - 2,5 мг; тальк - 5 мг;
лактозы моногидрат - 90 мг; крахмал кукурузный - 102,5 мг.
Перечень последовательностей
Замертон Холдинге Лимитед
<120> Пептиды с цитопротекторной активностью
<140> 20(300197
<И1> 26.02.2013
<160> 1
<2I0> SEQ IDNO:l
<211> 2
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Ацетилированный на N-конце пептид Asp-Glu (Ac-Asp-Glu-OH)
<4О0> Asp Glu 1
<160> 2
<2I0> SEQIDNO:2
<2I1> 2
<2I2> PRT
<213=* Искусственная последовательность
<223> Содержащий сломсноэфирную связь на С-конце пептид Asp-Glu (H-Asp-Glu-ОСНЗ)
<400> Asp Glu 1
3
<210> SEQ ID NO:3
<2П> 2
<212> PRT
<213> ИсЕ <усственная последовательность
<223> Содержащий амидную связь на С-конце пептид Asp-Glu (H-Asp-Glu-NH-CH2-СНЗ)
<400> Asp G)u
<160> 4
<210> SEQ ID NO:4
<2!l> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <223> Пептид H-Val-Asp-Glu-OH <400> Val Asp Glu I
5
<2I0> SEQ ID NO:5
<2I1> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <223> Пептид H-Uu-Asp-Glu-OH
<400> Leu Asp Glu I
<160> 6
<210> SEQ IDNO:6
<2I1> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <223> Пептид H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH
<400> Ala Asp Glu Arg 1
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, или их фармацевтически приемлемые соли.
2. Фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием и содержащая в эффективном количестве пептиды по п.1.
3. Применение пептидов H-Asp-Glu-ОСЮ и Ac-Asp-Glu-OH в качестве цитопротекторного средства.
1.
Концентрация i
Фиг. 2
Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом AcDE
LDE
¦ Кол-во клеток OPI+
150
100
Концентрация пептида, нг/мл
Фиг. 5
Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом LDE
ADER
¦ Кол-во клеток OPI+
150
100
lil li Mil
200
Концентрация пептида, нг/мл
Фиг. 6
Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом ADER
Концентрация, нг/мл
Фиг. 7
Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом DENHEt
200 юо ю
Концентрация, нг/мл
Фиг. 8
Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом AcDE
200 юо ю
Концентрация, нг/мл
Фиг. 9
Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом DEOMe
200 100 10
Концентрация, нг/мл
Фиг. 11
Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом LDE
Концентрация, нг/мл
Фиг. 12
Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ADER
Протективное действие пептида AcDE на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина
Протективное действие пептида AcDE на клетки HeLa в присутствии капмтотецина
Пептид DEOMe NIH3T3
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 50 нг/мл ¦ Некроз (PI) ? Апоптоз (Annexin-VFITC)
Фиг. 17
Протективное действие пептида DEOMe на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина
Протективное действие пептида DEOMe на клетки HeLa в присутствии капмтотецина
контроль камптотецин 400 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл I Некроз (PI) ? Апоптоз (Annexin-VFITC)
Фиг. 24
Протективное действие пептида ADER на клетки HeLa в присутствии капмтотецина
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
020866
- 1 -
020866
- 1 -
020866
- 1 -
020866
- 1 -
020866
- 4 -
020866
- 13 -
020866
- 13 -