|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[**] 1. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК), способная ингибировать экспрессию гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 человека (PCSK9) в клетке, включающая по меньшей мере две комплементарные друг другу последовательности, где смысловая цепь содержит последовательность, выбранную из группы, представленной в табл. 1 и/или 2, и антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, выбранную из группы, представленной в табл. 1 и/или 2, причем вторая последовательность содержит область, которая, по существу, комплементарна мРНК, кодирующей PCSK9, отличную от области от положения 3530 до положения 3548 NM_174936. 2. дцРНК по п.1, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. 3. дцРНК по п.1 или 2, где модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-О-метилмодифицированного нуклеотида; нуклеотида, содержащего 5'-фосфортиоатную группу, и концевого нуклеотида, присоединенного к холестериловому производному или бисдециламидной группе додекановой кислоты, 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, неосновного нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего неприродное основание. 4. Клетка, не являющаяся клеткой человека, содержащая дцРНК по любому из пп.1-3. 5. Фармацевтическая композиция для ингибирования в организме экспрессии гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 человека (PCSK9), отличающаяся тем, что содержит дцРНК по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель. 6. Применение in vitro дцРНК по любому из пп.1-3 для снижения уровня экспрессии гена PCSK9 человека в клетке. 7. Применение in vitro по п.6, где дцРНК используется in vitro в концентрации не более 30 нМ. 8. Применение in vitro по п.6 или 7, где клетка представляет собой клетку HepG2, экспрессирующую PCSK9, причем уровень экспрессии гена PCSK9 в указанной клетке HepG2 снижен по меньшей мере на 20%. 9. Применение дцРНК по любому из пп.1-3 или фармацевтической композиции по п.5 в приготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 (PCSK9) у человека. 10. Применение по п.9, где нарушение представляет собой гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, гиперлипидемию, болезнь сердца или болезнь кровообращения. 11. Применение по п.9, где лекарственное средство предназначено для снижения уровня общего холестерина у индивидуума. 12. Способ in vitro ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке, предусматривающий: (a) введение в выделенную клетку дцРНК по любому из пп.1-3 и (b) поддержание выделенной клетки, полученной на стадии (а), в течение периода времени, достаточного для разрушения в клетке мРНК-транскрипта гена PCSK9, и, тем самым, ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК), способная ингибировать экспрессию гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 человека (PCSK9) в клетке, включающая по меньшей мере две комплементарные друг другу последовательности, где смысловая цепь содержит последовательность, выбранную из группы, представленной в табл. 1 и/или 2, и антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, выбранную из группы, представленной в табл. 1 и/или 2, причем вторая последовательность содержит область, которая, по существу, комплементарна мРНК, кодирующей PCSK9, отличную от области от положения 3530 до положения 3548 NM_174936. 2. дцРНК по п.1, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. 3. дцРНК по п.1 или 2, где модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-О-метилмодифицированного нуклеотида; нуклеотида, содержащего 5'-фосфортиоатную группу, и концевого нуклеотида, присоединенного к холестериловому производному или бисдециламидной группе додекановой кислоты, 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, неосновного нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего неприродное основание. 4. Клетка, не являющаяся клеткой человека, содержащая дцРНК по любому из пп.1-3. 5. Фармацевтическая композиция для ингибирования в организме экспрессии гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 человека (PCSK9), отличающаяся тем, что содержит дцРНК по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель. 6. Применение in vitro дцРНК по любому из пп.1-3 для снижения уровня экспрессии гена PCSK9 человека в клетке. 7. Применение in vitro по п.6, где дцРНК используется in vitro в концентрации не более 30 нМ. 8. Применение in vitro по п.6 или 7, где клетка представляет собой клетку HepG2, экспрессирующую PCSK9, причем уровень экспрессии гена PCSK9 в указанной клетке HepG2 снижен по меньшей мере на 20%. 9. Применение дцРНК по любому из пп.1-3 или фармацевтической композиции по п.5 в приготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 (PCSK9) у человека. 10. Применение по п.9, где нарушение представляет собой гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, гиперлипидемию, болезнь сердца или болезнь кровообращения. 11. Применение по п.9, где лекарственное средство предназначено для снижения уровня общего холестерина у индивидуума. 12. Способ in vitro ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке, предусматривающий: (a) введение в выделенную клетку дцРНК по любому из пп.1-3 и (b) поддержание выделенной клетки, полученной на стадии (а), в течение периода времени, достаточного для разрушения в клетке мРНК-транскрипта гена PCSK9, и, тем самым, ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке.
Евразийское 020840 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2015.02.27
(21) Номер заявки 201100907
(22) Дата подачи заявки
2007.05.10
(51) Int. Cl.
C12Q1/68 (2006.01) A01N 43/04 (2006.01) C07H21/04 (2006.01) A61K31/07 (2006.01)
(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА PCSK9
(31) 60/799,458; 60/817,203; 60/840,089; 60/829,914; 60/901,134
(32) 2006.05.11; 2006.06.27; 2006.08.25; 2006.10.18; 2007.02.13
(33) US
(43) 2012.03.30
(62) 200870528; 2007.05.10
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛНИЛЭМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Тан Памела, Брамлаге Биргит (DE), Франк-Каменетски Мария, Фитцжеральд Кевин, Акинк Акин, Котелянски Виктор Е. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) DATABASE,GenBank, NMI74936,
Sep. 2003, [найдено 08.12.2011], найдено из Интернет:
SAYDA M. ELBASHIR et al., Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. The EMBO Journal, 2001, vol. 20,
pp. 6877-6888 [найдено 06.12.2011], найдено из Интернет: , с. 1-6
WO-A-2005044981
AJOY BASAK. Inhibitors of proprotein convertases. Journal of Molecular Medicine, 08 October 2005, [найдено 06.12.2011], найдено I из Интернет: , с. 1-24 1
ЕР-A1-1471152
ЕР^Ь^ШП
(57) Настоящее изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 (PCSK9), где указанная дцРНК включает в себя антисмысловую цепь, имеющую нуклеотидную последовательность длиной менее чем в 30 нуклеотидов, обычно 19-25 нуклеотидов и, по существу, комплементарную по меньшей мере части гена PCSK9. Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей дцРНК в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и к способам лечения заболеваний, вызываемых экспрессией гена PCSK9, с использованием указанной фармацевтической композиции.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 60/799458, поданной 11 мая 2006 г.; предварительной заявки на патент США № 60/817203, поданной 27 июня 2006 г.; предварительной заявки на патент США № 60/840089, поданной 25 августа 2006 г.; предварительной заявки на патент США № 60/829914, поданной 18 октября 2006 г.; и предварительной заявки на патент США № 60/901134, поданной 13 февраля 2007 г. Содержание всех указанных предварительных заявок во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК) и к ее применению в опосредовании интерференции РНК для ингибирования экспрессии гена PCSK9, а также к применению дцРНК для лечения патологических состояний, которые могут быть модулированы посредством ингибирования PCSK9, таких как гиперлипидемия.
Предшествующий уровень техники
Пропротеин-конвертаза субтилизин-кексин 9 (PCSK9) является членом семейства сериновых про-теаз субтилизинов. Другие восемь субтилизиновых протеаз, PCSK1-PCSK8 (также называемых РС1/3, РС2, фурин, РС4, РС5/6, РАСЕ4, РС7 и S1P/SKI-1), представляют собой пропротеин-конвертазы, которые направляют белки широкого ряда на секреторный путь и играют определенную роль в различных биологических процессах (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell. Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N.G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N.A., (2003) FASEB J. 17, 1215-1227 и Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748). Было высказано предположение, что PCSK9 играет определенную роль в метаболизме холестерина. Экспрессия мРНК PCSK9 ингибировалась после кормления мышей холестерин-содержащей пищей (Maxwell, K.N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), активируется статинами в клетках HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24, 1454-1459) и активируется белком, связывающимся со стерол-регулирующим элементом у трансгенных мышей (SREBF) (Horton, J.D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032), аналогично действию ферментов биосинтеза холестерина и рецептора липопротеина низкой плотности (LDL-R). Кроме того, было обнаружено, что миссценс-мутации PCSK9 ассоциируются с гиперхолестеринемией, наследуемой по аутосомно-доминантному типу (Hchola3) (Abifadel, M., et al. (2003) Nat. Genet, 34, 154-156, Timms, K.M, (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T.P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422). PCSK9 может также имеет важное значение в определении уровней холестерина ЛНП у всего населения, поскольку, как наблюдалось у населения Японии, полиморфизм в один нуклеотид (SNP) обычно влияет на уровни холестерина (Shioji, K.,
(2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).
Аутосомно-доминантная гиперхолистеринемия (ADH) представляет собой моногенное заболевание, при котором у пациентов наблюдается повышение уровня общего холестерина и холестерина ЛНП и развитие ксантом сухожилий, а также наблюдается атеросклероз у недоношенных новорожденных (Rader, D.J., (2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803). Патогенез ADH и его рецессивной формы, аутосомно-рецессивной гиперхолистеринемии (ARH) (Cohen, J.C, (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14, 121-127), обусловлен нарушением поглощения ЛНП печенью. ADH может быть вызвана мутациями ЛНПР, которые препятствуют поглощению ЛНП, или мутациями в белке, присутствующем на ЛНП, а именно, на аполипо-протеине В, который связывается с ЛНПР. ARH вызывается мутациями в белке ARH, который необходим для осуществления эндоцитоза комплекса "ЛНПР-ЛНП" посредством его взаимодействия с клатри-ном. Поэтому, если мутации PCSK9 являются этиологическим фактором заболеваний группы Hchola3, то очевидно, что PCSK9 играет определенную роль в опосредуемом рецептором поглощении ЛНП.
Исследования сверхэкспрессии показали, что PCSK9 играет определенную роль в регуляции уровней ЛНПР, а следовательно и в поглощении ЛНП печенью (Maxwell K.N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-18875, Park, S.W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). У мышей, опосредуемая аденовирусом сверхэкспрессия мышиного или человеческого PCSK9, наблюдаемая в течение 3 или 4 дней, приводит к повышению уровней общего холестерина и холестерина ЛНП; при этом такой эффект не наблюдается у животных, не содержащих ЛНПР (Maxwell K.N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2904) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S.W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). Кроме того, сверхэкспрессия PCSK9 приводит к значительному снижению уровня белка ЛНПР в печени, но не влияет на уровни мРНК ЛНПР, уровни белка SREBP или на отношение ядерного белка SREBP к цитоплазматическому белку SREBP. Полученные результаты показали, что PCSK9 прямо или опосредованно снижает уровни белка ЛНПР по посттрансляционному механизму.
Мутации, приводящие к потере функций в PCSK9, были смоделированы на мышах (Rashid et al.,
(2005) PNAS, 102, 5374-5379) и идентифицированы у человека (Cohen et al., (2005), Nature Genetics., 37.161-165). В обоих случаях потеря функции PCSK9 приводит к снижению уровней общего холестерина и холестерина ЛНП. Результаты ретроспективных исследований, проводимых в течение 15 лет, показали, что утрата одной копии PCSK9 приводит к снижению уровня ЛНП и к увеличению степени защиты от развития сердечно-сосудистых заболеваний (Cohen et al. 2006 N. Engl. J. Med., 354, 1264-1272). В настоящее время имеются неопровержимые данные, которые указывают на то, что снижение уровней
(2005)
PCSK9 приводит к снижению уровней ЛНП.
Недавно было показано, что молекулы двухцепочечной РНК (дцРНК) блокируют экспрессию генов по высококонсервативному регуляторному механизму, известному как интерференция РНК (РНКи). В WO 99/32619 (Fire et al.) описано применение дцРНК длиной по меньшей мере 25 нуклеотидов для инги-бирования экспрессии генов у С. elegans. Было также показано, что дцРНК разрушает РНК-мишень в других организмах, включая растения (см., например, WO 99/53050, Waterhouse et al. и WO 99/61631, Heifetz et al.), дрозофилу (Drosophila) (см., например, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) и млекопитающих (см. WO 00/44895, Limmer и DE 10100586.5, Kreutzer et al.). Такой природный механизм был положен в основу разработки нового класса фармацевтических средств для лечения расстройств, вызываемых нарушением регуляции гена или нежелательной регуляцией гена.
Несмотря на значительные успехи в области исследования интерференции РНК (РНКи) и успехи в лечении патологичесих состояний, которые могут быть модулированы негативной регуляцией экспрессии гена PCSK9, необходимость в разработке средств, которые могут ингибировать экспрессию гена PCSK9 и которые могут быть применены для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией гена PCSK9, таких как гиперлипидемия, остается актуальной.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к решению проблемы, связанной с лечением заболеваний, которые могут быть модулированы путем ингибирования пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 (PCSK9) с использованием двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) для подавления экспрессии PCSK9.
Настоящее изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), а также к композициям и к способам, применяемым в целях ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетках или у млекопитающих с использованием такой дцРНК. Настоящее изобретение также относится к композициям и к способам, применяемым для лечения патологических состояний, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии гена PCSK9, таких как гиперлипидемия. дцРНК согласно изобретению содержит цепь РНК (антисмысловую цепь), имеющую область длиной менее чем 30 нуклеоти-дов, а обычно 19-24 нуклеотидов, и является, в основном, комплементарной по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена PCSK9.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к молекулам двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК), ингибирующим экспрессию гена PCSK9. дцРНК содержит по меньшей мере две последовательности, комплементарные друг другу. дцРНК содержит смысловую цепь, включающую первую последовательность, и антисмысловую цепь, включающую вторую последовательность. Антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, в основном, комплементарную по меньшей мере части мРНК, кодирующей PCSK9, где указанная область комплементарности имеет длину менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 19-24 нуклеотидов. дцРНК после ее контактирования с клеткой, экспрессирующей PCSK9, ингибирует экспрессию гена PCSK9 по меньшей мере на 40%.
Так, например, молекулы дцРНК согласно изобретению могут состоять из первой последовательности дцРНК, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 2, и из второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 2. Молекулы дцРНК согласно изобретению могут состоять из природных нуклеотидов, либо они могут состоять по меньшей мере из одного модифицированного нуклеотида, такого как 2'-O-метил-модифицированный нуклеотид; нуклеотид, содержащий 5'-фосфортиоатную группу, и концевой нуклеотид, присоединенный к холестериловому производному. Альтернативно, модифицированный нуклеотид может быть выбран из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, неосновного нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолино-нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего неприродное основание. Обычно такую модифицированную последовательность получают на основе первой последовательности указанной дцРНК, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 2, и второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 2.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей одну из дцРНК согласно изобретению. Такой клеткой обычно является клетка млекопитающего, такая как человеческая клетка.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для ингибирования экспрессии гена PCSK9 в организме, обычно в организме человека, где указанная композиция содержит одну или несколько дцРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или носитель для доставки.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке, где указанный способ включает следующие стадии:
(a) введение в клетку двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК), где указанная дцРНК содержит по меньшей мере две последовательности, комплементарные друг другу. дцРНК содержит
смысловую цепь, включающую первую последовательность, и антисмысловую цепь, включающую вторую последовательность. Антисмысловая цепь содержит область комплементарности, которая, в основном, комплементарна по меньшей мере части мРНК, кодирующей PCSK9, где указанная комплементарная область имеет длину менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 19-24 нуклеотида, и где указанная дцРНК, после ее контактирования с клеткой, экспрессирующей PCSK9, ингибирует экспрессию гена PCSK9 по меньшей мере на 40%; и
(b) поддержание клетки, продуцированной в стадии (а), в течение определенного периода времени, достаточного для разрушения мРНК-транскрипта гена PCSK9 и, тем самым, ингибирования экспрессии гена PCSK9 в указанной клетке.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или подавления патологических состояний, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии гена PCSK9, например гиперлипидемии, где указанные способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, предупреждении или подавлении, терапевтически или профилактически эффективного количества одной или нескольких дцРНК согласно изобретению.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к векторам для ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке, где указанные векторы содержат регуляторную последовательность, функционально присоединенную к нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере одну цепь одной из дцРНК согласно изобретению.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор для инги-бирования экспрессии гена PCSK9 в клетке. Указанный вектор содержит регуляторную последовательность, функционально присоединенную к нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере одну цепь одной из дцРНК согласно изобретению.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 представлена структура липида ND-98.
На фиг. 2 представлены результаты in vivo скрининга 16 киРНК, специфических к мышиному
PCSK9 (AL-DP-9327 - AL-DP-9342), направленных против различных областей ОРС мРНК PCSK9 (имеющих первый нуклеотид, соответствующий положению ОРС, как показано на графике), у мышей C57/BL6 (5 животных/группу). Отношение мРНК PCSK9 к мРНК GAPDH в лизатах печени усредняли для каждой группы обработки и сравнивали с контрольной группой, обработанной PBS, или с контрольной группой, обработанной неродственной киРНК (фактора свертывания крови VII).
На фиг. 3 представлены результаты in vivo скрининга 16 человеческих/мышиных/крысиных перекрестно-реактивных PCSK9-специфических киРНК (AL-DP-9311 - AL-DP-9326), направленных против различных областей ОРС мРНК PCSK9 (имеющих первый нуклеотид, соответствующий положению ОРС, как показано на графике) у мышей C57/BL6 (5 животных/группу). Отношение мРНК PCSK9 к мРНК GAPDH в лизатах печени усредняли для каждой группы обработки и сравнивали с контрольной группой, обработанной PBS, или с контрольной группой, обработанной неродственной киРНК (фактора свертывания крови VII).
Сайленсинг мРНК PCSK9 приводил к снижению общего уровня холестерина в сыворотке.
Наибольшая эффективность в ингибировании киРНК-транскрипта PCSK9 выражается в наиболее заметном снижении уровня холестерина (примерно на 20-30%).
На фиг. 4 представлены результаты in vivo скрининга 16 киРНК, специфических к мышиному PCSK9 (AL-DP-9327 - AL-DP-9342) у мышей C57/BL6 (5 животных/группу). Общие уровни холестерина в сыворотке усредняли для каждой группы обработки и сравнивали с контрольной группой, обработанной PBS, или с контрольной группой, обработанной неродственной киРНК (фактора свертывания крови
VII).
На фиг. 5 представлены результаты in vivo скрининга 16 человеческих/мышиных/крысиных перекрестно-реактивных PCSK9-специфических киРНК (AL-DP-9311 - AL-DP-9326) у мышей C57/BL6 (5 животных/группу). Общие уровни холестерина в сыворотке усредняли для каждой группы обработки и сравнивали с контрольной группой, обработанной PBS, или с контрольной группой, обработанной неродственной киРНК (фактора свертывания крови VII).
На фиг. 6 проиллюстрировано сравнение результатов in vitro и in vivo, полученных для сайленсинга
PCSK9.
На фиг. 7А и 7В представлены результаты, полученные in vitro для сайленсинга PCSK9 с использованием первичных гепатоцитов обезьян.
На фиг. 8 проиллюстрирована in vivo активность киРНК, полученных в виде липосомных препаратов LNP-01 и направленных против pcsk-9.
На фиг. 9 проиллюстрирована in vivo активность препаратов LNP-01, содержащих химически модифицированные родительские молекулы 9314 и 10792 в различные периоды времени. Было выявлено, что модифицированные варианты 10792 обнаруживают активность в сайленсинге in vivo.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к решению проблемы, связанной с лечением заболеваний, которые могут быть модулированы путем ингибирования гена PCSK9 с использованием двухцепочечной ри
бонуклеиновой кислоты (дцРНК) для подавления экспрессии гена PCSK9 и, тем самым, для лечения таких заболеваний, как гиперлипидемия.
Настоящее изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), а также к композициям и к способам, применяемым для ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетках или у млекопитающих с использованием такой дцРНК. Настоящее изобретение также относится к композициям и к способам, применяемым для лечения патологических состояний и заболевания, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии гена PCSK9. дцРНК регулирует последовательность-специфическое разрушение мРНК по механизму, известному как интерференция РНК (РНКи).
дцРНК согласно изобретению включает цепь РНК (антисмысловую цепь), которая имеет область длиной менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 19-24 нуклеотида и, в основном, комплементарна по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена PCSK9. Применение таких дцРНК позволяет осуществлять направленное разрушение мРНК, которое приводит к транспорту натрия. С помощью клеточных анализов и анализов, проводимых на животных, авторами настоящего изобретения было продемонстрировано, что очень низкие дозы этих дцРНК могут специфически и эффективно опосредовать РНКи, что будет приводить к значительному ингибированию экспрессии гена PCSK9. Таким образом, указанные способы и композиции согласно изобретению, в которых используются эти дцРНК, могут быть применены для лечения патологических состояний, которые могут быть модулированы путем ингибирования PCSK9, например, для лечения гиперлипидемии.
Ниже подробно описан способ получения и использования дцРНК и композиций, содержащих дцРНК, для ингибирования экспрессии гена-мишени PCSK9, а также описаны композиции и способы, применяемые для лечения заболеваний, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии PCSK9, таких как гиперлипидемия. Фармацевтические композиции согласно изобретению включают дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, которая содержит область комплементарности длиной менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 19-24 нуклеотида, и является, в основном, комплементарной по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена PCSK9, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
В соответствии с этим в некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим дцРНК согласно изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем; к способам применения таких композиций для ингибирования экспрессии гена PCSK9 и к способам применения фармацевтических композиций для лечения заболеваний, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии PCSK9.
I. Определения.
Для удобства ниже приводятся значения некоторых терминов и выражений, используемых в настоящем описании, в примерах и в прилагаемой формуле изобретения. Если имеется значительное различие между употреблением данного термина в других разделах настоящего описания и его определением, приводимым в этом разделе, то следует отдать предпочтение определению данного термина в этом разделе.
Каждый из "G", "С", "А" и "U" обычно означает нуклеотид, который содержит гуаниновое, цитози-новое, адениновое и урациловое основания, соответственно. Однако при этом следует отметить, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" также может означать модифицированный нуклеотид, как будет подробно описано ниже, или молекулу-аналог, имеющую замену. Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими молекулами без какого-либо значительного изменения свойств спаривания оснований олигонуклеотида, включающего нуклео-тид, имеющий такую замененную молекулу. Так, например, нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может спариваться с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил и т.п. Следовательно, в нуклеотидных последовательностях согласно изобретению нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены нуклеотидом, содержащим, например, инозин.
Последовательности, содержащие такие замененные молекулы, являются вариантами настоящего изобретения.
Используемый здесь термин "PCSK9" означает ген полипротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 или его белок (также известный как FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1).
Последовательности мРНК, нацеленные на PCSK9, представляют собой человеческую последовательность NM 174936; мышиную последовательность NM 153565 и крысиную последовательность NM_199253.
Используемый здесь термин "последовательность-мишень" означает непрерывную часть нуклео-тидной последовательности молекулы мРНК, образованную в процессе транскрипции гена PCSK9, включая мРНК, которая является продуктом РНК-процессинга первичного продукта транскрипции.
Используемый здесь термин "цепь, содержащая последовательность" означает олигонуклеотид, содержащий цепь нуклеотидов, последовательность которой описана в соответствии со стандартной номенклатурой нуклеотидов.
Используемый здесь термин "комплементарный", если это не оговорено особо, и если он используется для описания первой нуклеотидной последовательности по сравнению со второй нуклеотидной по
следовательностью, означает способность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру в определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как хорошо известно специалистам. Такими условиями могут быть, например, жесткие условия, где указанные жесткие условия могут включать обработку 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES, рН 6,4, 1 мМ EDTA, при 50 или 70°С в течение 12-16 ч с последующей промывкой. Могут быть применены и другие условия, такие как физиологически релевантные условия, которые могут возникать внутри организма. Специалист в данной области может самостоятельно определить ряд условий, наиболее подходящих для оценки комплементарности двух последовательностей в зависимости от целей применения гибриди-зованных нуклеотидов.
Это определение включает спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, по всей длине первой и второй нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут называться "полностью комплементарными" друг другу. Однако если первую последовательность определяют как "в основном, комплементарную" второй описанной здесь последовательности, то эти две последовательности могут быть полностью комплементарными, либо они могут образовывать одну или более, но в основном не более чем 4, 3 или 2 несоответствующих пар оснований после гибридизации и при этом сохранять свою способность гибридизоваться в условиях, наиболее подходящих для их конечного применения. Однако если после гибридизации два олигонуклеотида образуют один или несколько одноцепочечных выступающих концов, то такие концы не должны рассматриваться как несоответствия при определении комплементарности. Так, например, дцРНК, содержащая один олигонуклеотид длиной в 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной в 23 нуклеотида, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая является полностью комплементарной более короткому олигонуклеотиду, может также называться "полностью комплементарной" с точки зрения цели применения настоящего изобретения.
Используемый здесь термин "комплементарные" последовательности может также включать пары оснований, не спаренные в соответствии с правилами Уотсона-Крика, или полностью состоять из таких пар оснований, и/или они могут включать пары оснований, образованные неприродными и модифицированными нуклеотидами, в зависимости от того, насколько удовлетворяются вышеуказанные требования к их способности к гибридизации.
Используемые здесь термины "комплементарный", "полностью комплементарный" и "в основном, комплементарный" могут употребляться по отношению к спариванию основания смысловой цепи и антисмысловой цепи дцРНК или антисмысловой цепи дцРНК и последовательности-мишени, как будет очевидно исходя из целей их применения.
Используемый здесь термин полинуклеотид, который является, "по существу, комплементарным по меньшей мере части" матричной РНК (мРНК), означает полинуклеотид, в основном, комплементарный непрерывной части представляющей интерес мРНК (например, кодирующей PCSK9). Так, например, полинуклеотид является комплементарным по меньшей мере части мРНК PCSK9, если его последовательность, по существу, комплементарна непрерывной части мРНК, кодирующей PCSK9.
Используемый здесь термин "двухцепочечная РНК" или "дцРНК" означает комплекс молекул рибонуклеиновой кислоты, имеющий дуплексную структуру, содержащую две антипараллельных и, по существу, комплементарных, как определено выше, цепи нуклеиновой кислоты. Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут представлять собой различные части одной более крупной молекулы РНК, либо они могут представлять собой отдельные молекулы РНК. В случае отдельных молекул РНК такая дцРНК часто называется в литературе киРНК ("короткой интерферирующей РНК"). Если две цепи являются частью одной более крупной молекулы, а поэтому между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи они соединены друг с другом непрерывной цепью нуклеотидов, образующих дуплексную структуру, то такая соединяющая цепь РНК называется "шпилечной петлей", "короткой шпилечной РНК" или "кшРНК". Если две цепи между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, ковалентно связанные друг с другом посредством другой цепи, т.е. цепи, не являющейся непрерывной цепью нуклеотидов, образующей дуплексную структуру, то такая соединяющая структура называется "линкером". Цепи РНК могут иметь одинаковые или различные количества нуклеоти-дов. Максимальным числом пар оснований является число нуклеотидов в самой короткой цепи дцРНК минус какие-либо выступающие концы, присутствующие в этом дуплексе.
Помимо дуплексной структуры дцРНК может содержать один или несколько выступающих нуклео-тидов. Кроме того, используемый в настоящем описании термин "дцРНК" может включать химические модификации рибонуклеотидов, включая основные модификации во многих положениях нуклеотидов и все типы модификаций, описанные в настоящей заявке или известные специалистам. Все такие модификации, присутствующие в молекуле типа киРНК, входят в объем термина "дцРНК", определяемого в настоящем описании и в формуле изобретения.
Используемый здесь термин "выступающий нуклеотид" означает неспаренный нуклеотид или нук-леотиды, которые выступают из дуплексной структуры дцРНК, если 3'-конец одной цепи дцРНК нахо
дится за пределами 5'-конца другой цепи или наоборот. Термины "тупой" или "тупой конец" означают, что на конце дцРНК отсутствуют неспаренные нуклеотиды, т.е. отсутствует выступающий нуклеотид. "Затупленная по концам дцРНК" представляет собой дцРНК, которая является двухцепочечной по всей ее длине, т.е. у любого конца этой молекулы отсутствуют выступающие нуклеотиды. Для ясности следует отметить, что при определении наличия у киРНК выступающего конца или тупого конца не рассматриваются химические "кэпы" или ненуклеотидные химические молекулы, конъюгированные с 3'-концом или с 5'-концом киРНК.
Термин "антисмысловая цепь" означает цепь дцРНК, которая включает область, по существу, комплементарную последовательности-мишени. Используемый здесь термин "область комплементарности" означает область на антисмысловой цепи, которая, по существу, комплементарна последовательности, например последовательности-мишени, определенной в настоящей заявке. Если область комплементар-ности не полностью комплементарна последовательности-мишени, то такие несоответствия являются наиболее приемлемыми в концевых областях, а если они и присутствуют, то, главным образом, в концевой области или в концевых областях, например в положениях 6, 5, 4, 3 или 2 нуклеотида 5'- и/или 3'-концов.
Используемый здесь термин "смысловая цепь" означает цепь дцРНК, включающую область, по существу, комплементарную области антисмысловой цепи.
Термин "введение в клетку", если он относится к дцРНК, означает облегчение поглощения или абсорбции в клетке, как это очевидно для специалиста в данной области. Абсорбция или поглощение дцРНК может происходить посредством природных диффузных или активных клеточных процессов, либо оно может быть осуществлено с помощью вспомогательных средств или устройств. Значения этого термина не ограничиваются клетками in vitro; при этом дцРНК может быть также "введена в клетку", которая является частью живого организма. В таком случае термин "введение в клетку" также включает доставку в организм. Так, например, для доставки in vivo, дцРНК может быть инъецирована в конкретный участок, или она может быть введена системно. Введение in vitro в клетку осуществляют методами, известными специалистам, такими как электропорация и липофекция.
Используемые здесь термины "сайленсинг" и "ингибирование экспрессии если они относятся к гену PCSK9, означают, по меньшей мере, частичное подавление экспрессии гена PCSK9, на что указывает снижение количества мРНК, транскрибируемого из гена PCSK9, который может быть выделен из первой клетки или группы клеток, в которой (в которых) транскрибируется ген PCSK9 и которая (которые) были обработаны так, чтобы происходило ингибирование экспрессии гена PCSK9, по сравнению со второй клеткой или группой клеток, по существу, идентичной (или идентичных) первой клетке или группе клеток, которая (или которые) не была (не были) обработана(ы) указанным способом (контрольными клетками). Степень ингибирования обычно выражают математической формулой
(мРНК в контрольных клетках)-(мРНК в обработанных клетках)
• 100%
(мРНК в контрольных клетках)
Альтернативно, степень ингибирования может быть определена как уменьшение значения параметра, которое функционально связано с транскрипцией гена PCSK9, например количества белка, кодируемого геном PCSK9, и секретируемого клеткой, или числа клеток, представляющих определенный фенотип, например подверженных апоптозу. В принципе, сайленсинг гена PCSK9 может быть обнаружен в любой клетке, экспрессирующей мишень, либо конститутивно, либо с помощью генной инженерии, а также с помощью любого подходящего анализа. Однако если необходимо определить, ингибирует ли данная дцРНК экспрессию гена PCSK9 в определенной степени, а следовательно, такое определение входит в объем настоящего изобретения, то для осуществления такого определения рекомендуется проводить анализ, описанный ниже в разделе "Примеры".
Так, например, в некоторых случаях, экспрессию гена PCSK9 подавляют по меньшей мере примерно на 20, 25, 35 или 50% путем введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения ген PCSK9 ингибируется по меньшей мере примерно на 60, 70 или 80% путем введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения ген PCSK9 ингибируется по меньшей мере примерно на 85, 90 или 95% путем введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В табл. 1 и 2 приводится широкий ряд величин для ингибирования экспрессии, полученных с помощью анализа in vitro, проводимого с использованием различных молекул дцРНК PCSK9 в различных концентрациях.
Термины "лечить", "лечение" и т.п., используемые здесь с точки зрения экспрессии PCSK9, означают ослабление или облегчение тяжести патологических состояний, которые могут быть модулированы посредством ингибирования гена PCSK9. В контексте настоящего изобретения термины "лечить", "лечение" и т.п., если они относятся к любым другим описанным ниже состояниям (а не к патологическим состояниям, которые могут быть модулированы посредством ингибирования гена PCSK9), означают облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, либо его реверсию. Так, например, если термин "лечение" относится к гиперлипидемии, то он включает снижение уровней липидов в сыворотке.
Используемые здесь термины "терапевтически эффективное количество" и "профилактически эффективное количество" означают количество, которое дает терапевтический эффект при лечении, предупреждении или ослаблении патологических состояний или явно выраженного симптома таких патологических состояний, которые могут быть модулированы посредством ингибирования гена PCSK9. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, может быть легко определено практикующим врачом и может широко варьироваться в зависимости от факторов, известных специалистам, таких как тип патологических состояний, которые могут быть модулированы посредством ингибирова-ния гена PCSK9, история болезни данного пациента и его возраст, стадия развития патологических состояний, которые могут быть модулированы посредством ингибирования PCSK9, и способа введения других средств для подавления патологий, которые могут быть модулированы посредством ингибирова-
ния гена PCSK9.
Используемая здесь "фармацевтическая композиция" включает фармакологически эффективное количество дцРНК и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый здесь термин "фармакологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или просто "эффективное количество" означает количество РНК, эффективное для достижения нужного фармакологического, терапевтического или превентивного эффекта. Так, например, если эффективным лечением заболевания считается по меньшей мере 25% снижение величины измеряемого параметра, ассоциированного с данным заболеванием или расстройством, то терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения данного заболевания или расстройства представляет собой количество, необходимое для достижения по меньшей мере 25% снижения величины данного параметра.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель для введения терапевтического средства. Такими носителями являются, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, забуферен-ный физиологический раствор, декстроза, вода, глицерин, этанол и их комбинации, и такие носители более подробно описаны ниже. Данный термин, в частности, исключает среду для культивирования клеток.
Используемый здесь термин "трансформированная клетка" означает клетку, в которую был введен вектор, способный экспрессировать молекулу дцРНК.
II. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК).
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к молекулам двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК), используемой для ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетках или у млекопитающих, где указанная дцРНК содержит антисмысловую цепь, включающую область компле-ментарности, которая является комплементарной по меньшей мере части мРНК, образованной в результате экспрессии гена PCSK9, где указанная область комплементарности имеет длину менее чем 30 нук-леотидов, а обычно 19-24 нуклеотида, и где указанная дцРНК после ее контактирования с клеткой, экс-прессирующей указанный ген PCSK9, ингибирует экспрессию указанного гена PCSK9 по меньшей мере на 40%. Указанная дцРНК содержит две цепи РНК, которые являются достаточно комплементарными для гибридизации с образованием дуплексной структуры. Одна цепь дцРНК (антисмысловая цепь) содержит область комплементарности, которая, по существу, комплементарна, а обычно полностью комплементарна последовательности-мишени, происходящей от последовательности мРНК, образованной в процессе экспрессии гена PCSK9, а другая цепь (смысловая цепь) содержит область, которая является комплементарной антисмысловой цепи, в результате чего эти две цепи гибридизуются и при их объединении в подходящих условиях образуют дуплексную структуру. Обычно дуплексная структура имеет длину 15-30, чаще 18-25, еще чаще 19-24, а чаще всего 19-21 пару оснований. Аналогичным образом, область, комплементарная последовательности-мишени, имеет длину 15-30, чаще 18-25, еще чаще 19-24, а чаще всего 19-21 пару оснований. дцРНК согласно изобретению может также включать один или несколько выступающих одноцепочечных нуклеотидов. дцРНК может быть синтезирована стандартными методами, известными специалистам и подробно обсуждаемыми ниже, например, с применением автоматического синтезатора ДНК, например, такого как синтезатор, поставляемый компанией Biosearch, Applied Biosystems, Inc. В предпочтительном варианте изобретения геном PCSK9 является человеческий ген PCSK9. В конкретных вариантах изобретения антисмысловая цепь дцРНК включает цепь, выбранную из смысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 2, и вторую последовательность, выбранную из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 2. Альтернативные антисмысловые агенты, нацеленные на последовательность-мишень, представленную в табл. 1 и 2, могут быть легко определены с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности PCSK9.
В других вариантах изобретения дцРНК содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в табл. 1 и 2. В других вариантах изобретения дцРНК содержит по меньшей мере две последовательности, выбранные из этой группы, где одна по меньшей мере из двух последовательностей комплементарна другой последовательности по меньшей мере из двух последовательностей, а одна по меньшей мере из двух последовательностей, по существу, комплементарна последовательности мРНК, продуцированной в результате экспрессии гена PCSK9. Обычно дцРНК содержит два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан в табл. 1 и 2 как смысловая цепь, а второй олигонуклеотид описан в табл. 1 и 2 как антисмысловая цепь.
Специалистам в данной области хорошо известно, что дцРНК, содержащие дуплексную структуру из 20-23 пар оснований, а в частности из 21 пары оснований, является особенно эффективной в индуцировании интерференции РНК (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако другими исследователями было также обнаружено, что могут оказаться эффективными и более короткие или более длинные дцРНК. В описанных выше вариантах дцРНК согласно изобретению могут содержать по меньшей мере одну цепь длиной минимум 21 нуклеотид, что обусловлено природой олигонуклеотидных последовательностей, представленных в табл. 1 и 2. Разумно предположить, что более короткие дцРНК, содержащие одну из последовательностей, представленных в табл. 1 и 2, только без нескольких нуклеотидов у одного или обоих концов, могут быть также эффективными по сравнению с дцРНК, описанными выше. Следовательно, в настоящем изобретении рассматриваются дцРНК, содержащие неполную последовательность по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов одной из последовательностей, представленных в табл. 1 и 2, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена PCSK9 в FACS-анализе, описанном ниже, не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% по сравнению с дцРНК, содержащей полноразмерную последовательность. Другие дцРНК, которые расщепляются в последовательности-мишени, представленной в табл. 1 и 2, могут быть легко получены с использованием описанной здесь последовательности PCSK9 и последовательности-мишени.
Кроме того, РНКи-агенты, представленные в табл. 1 и 2, идентифицируют сайт в мРНК PCSK9, восприимчивый к РНКи-расщеплению. Настоящее изобретение также относится к РНКи-агентам, нацеленным на последовательность, на которую нацелен один из агентов согласно изобретению. Считается, что используемый здесь второй РНКи-агент нацелен на последовательность первого РНКи-агента, если указанный второй РНКи-агент расщепляет транскрипт в любом участке мРНК, который является комплементарным антисмысловой цепи первого РНКи-агента. Такой второй агент, по существу, состоит по меньшей мере из 15 смежных нуклеотидов, происходящих от одной из последовательностей, представленных в табл. 1 и 2, и присоединенных к дополнительным нуклеотидным последовательностям, происходящим от области, смежной с выбранной последовательностью в гене PCSK9. Так, например, по меньшей мере 15 нуклеотидов SEQ ID NO: 1 (минус добавленные последовательности АА), объединенные со следующими 6 нуклеотидами от гена-мишени PCSK9, продуцируют одноцепочечный агент из 21 нуклеотида на основе одной из последовательностей, представленных в табл. 1 и 2.
дцРНК согласно изобретению может содержать одно или несколько несоответствий по отношению к последовательности-мишени. В предпочтительном варианте изобретения дцРНК согласно изобретению содержит не более чем 3 несоответствия. Если антисмысловая цепь дцРНК содержит несоответствия по отношению к последовательности-мишени, то предпочтительно, чтобы область несоответствий не находилась в центре области комплементарности. Если антисмысловая цепь дцРНК содержит несоответствия по отношению к последовательности-мишени, то предпочтительно, чтобы такое несоответствие ограничивалось 5 нуклеотидами, расположенными у любого конца, например 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидом, присутствующими у 5'- или 3'-конца области комплементарности. Так, например, в случае цепи дцРНК из 23 нуклеотидов, которая комплементарна области гена PCSK9, эта дцРНК обычно не содержит каких-либо несоответствий в центральной области, состоящей из 13 нуклеотидов. Для того чтобы определить, является ли дцРНК, содержащая несоответствия по отношению к последовательности-мишени, эффективной в ингибировании экспрессии гена PCSK9, могут быть применены способы, описанные в настоящей заявке. Очень важно, чтобы дцРНК с несоответствиями эффективно ингибировали экспрессию гена PCSK9, особенно если известно, что конкретная область комплементарности в гене PCSK9 имеет модификацию полиморфной последовательности в пределах данной популяции.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере на одном конце дцРНК присутствуют 1-4, а обычно 1-2 выступающих одноцепочечных нуклеотида. Было неожиданно обнаружено, что дцРНК, имеющие по меньшей мере один выступающий нуклеотид, обладают превосходными ингибирующими свойствами по сравнению со свойствами их аналогов, имеющих тупые концы. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что присутствие лишь одного выступающего нуклеотида усиливает интерферирующую активность дцРНК, не оказывая при этом какого-либо влияния на ее общую стабильность. Было подтверждено, что дцРНК, имеющая только один выступающий конец, является особенно стабильной и эффективной in vivo, а также в различных клетках, в средах для культивирования клеток, в крови и сыворотке. Вообще говоря, одноцепочечный выступающий конец расположен у 3'-конца антисмысловой цепи, или альтернативно, у 3'-конца смысловой цепи. дцРНК может также иметь тупой конец, обычно расположенный у 5'-конца антисмысловой цепи. Такие дцРНК обладают повышенной стабильностью и ингибирующей активностью, что позволяет вводить эти дцРНК в низких дозах, т.е. в дозах, составляющих менее чем 5 мг/кг массы тела реципиента в день. Обычно антисмысловая цепь дцРНК имеет выступающие нуклеотиды у 3'-конца, а 5'-конец является тупым. В другом варианте изобретения один или несколько нуклеотидов в выступающем конце заменены нуклеозид-тиофосфатом.
В еще одном варианте изобретения дцРНК химически модифицируют для повышения стабильности. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть синтезированы и/или модифицированы методами, хорошо известными специалистам, например, как описано в публикации "Current protocols in nucleic acid chemistry". Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA, которая
вводится в настоящее описание посредством ссылки. Химическими модификациями могут быть, но не ограничиваются ими, 2'-модификации; модификации в других положениях сахаров или оснований оли-гонуклеотида; введение неприродных оснований в олигонуклеотидную цепь; ковалентное связывание с лигандом или химической молекулой и замена межнуклеотидных фосфатных связей другими связями, такими как тиофосфатные связи. При этом может быть использована более чем одна такая модификация.
Химическое связывание двух отдельных цепей дцРНК может быть достигнуто с применением любых различных хорошо известных методов, например, путем введения ковалентных, ионных или водородных связей; посредством гидрофобных взаимодействий, ван-дер-ваальсовых взаимодействий или стэ-кинг-взаимодействий; посредством введения координационных связей "металл-ион" или с использованием пуриновых аналогов. В основном, химическими группами, которые могут быть использованы для модификации дцРНК, являются но не ограничиваются ими, метиленовый синий; бифункциональные группы, обычно бис-(2-хлорэтил)амин; ^ацетил-№-(п-глиоксилбензоил)цистамин; 4-тиоурацил и псора-лен. В одном из вариантов изобретения указанным линкером является гексаэтиленгликолевый линкер. В этом случае дцРНК продуцируют посредством твердофазного синтеза, а гексаэтиленгликолевый линкер вводят в соответствии со стандартными методами (см. Williams, D.J. and Hail K^., Biochem. (1996) 35:14665-14670). В конкретном варианте изобретения 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи химически связаны посредством гексаэтиленгликолевого линкера. В другом варианте изобретения по меньшей мере один нуклеотид дцРНК содержит фосфортиоатные или фосфордитиоатные группы. Химическая связь у концов дцРНК обычно образована трехспиральными связями. В табл. 1 и 2 приводятся примеры модифицированных РНКи-агентов согласно изобретению.
В еще одном варианте изобретения нуклеотиды у одной или обеих двух одиночных цепей могут быть модифицированы так, чтобы они предотвращали или ингибировали расщепляющую активность клеточных ферментов, например, таких как некоторые нуклеазы и т.п. Методы ингибирования расщепляющей активности клеточных ферментов, направленной против нуклеиновых кислот, известны специалистам, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, 2'-амино-модификации, 2'-амино-модификации сахаров, 2'^-модификации сахаров, 2'-F-модификации, 2'-алкил-модификации сахаров, модификации незаряженного остова, морфолино-модификации, 2'-О-метил-модификации и фосфорами-датные модификации (см., например, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). Таким образом, по меньшей мере одна 2'-гидроксильная группа нуклеотидов на дцРНК заменена химической группой, обычно 2'-амино- или 2'-метильной группой. Кроме того, по меньшей мере один нуклеотид может быть модифицирован так, чтобы он образовывал блокированный нуклеотид. Такой блокированный нуклеотид содержит метиленовый мостик, соединяющий 2'-кислород рибозы с 4'-углеродом рибозы. Олигонуклеотиды, содержащие указанный блокированный нуклеотид, описаны в публикации Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) и Obika, S. et al. Tetrahedron Lett. (1998), 39; 5401-5404).
Введение блокированного нуклеотида в олигонуклеотид приводит к повышению аффинности по отношению к комплементарным последовательностям и увеличению температуры плавления на несколько градусов (Braasch, D.A. and Corey, D.R., Chem. Biol. (2001), 8:1-7).
Конъюгирование лиганда с дцРНК может усиливать ее абсорбцию в клетки, а также ее нацеливание на конкретную ткань или поглощение клетками конкретных типов, такими как клетки печени. В некоторых случаях гидрофобный лиганд конъюгируют с дцРНК для облегчения прямого прохождения через клеточную мембрану или поглощения клетками печени. Альтернативно, лиганд, конъюгированный с дцРНК, представляет собой субстрат для опосредуемого рецептором эндоцитоза. Такие подходы были применены для облегчения проникновения в клетку антисмысловых олигонуклеотидов, а также дцРНК-агентов. Так, например, холестерин был конъюгирован с различными антисмысловыми олигонуклеоти-дами с получением соединений, которые являются, в основном, более активными, чем их неконъюгиро-ванные аналоги. См. М. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103. Другими липофильными соединениями, которые были конъюгированы с олигонуклеотидами, являются 1-пирен-масляная кислота, 1,3-бис-О-(гексадецил)глицерин и ментол. Одним из примеров лиганда для опосредуемого рецептором эндоцитоза является фолиевая кислота. Фолиевая кислота поступает в клетку благодаря эндоцитозу, опосредуемому фолатным рецептором. Соединения дцРНК, несущие фолиевую кислоту, могут эффективно транспортироваться в клетку посредством эндоцитоза, опосредуемого фолатным рецептором. Li и сотрудники сообщают, что присоединение фолиевой кислоты к 3'-концу олигонуклео-тида приводит к 8-кратному повышению уровня поглощения олигонуклеотида клетками. Li, S.; Deshmukh, Н.М.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540. Другими лигандами, которые были конъюгирова-ны с олигонуклеотидами, являются полиэтиленгликоли, углеводные кластеры, перекрестно-связывающие агенты, конъюгаты порфирина, пептиды для доставки и липиды, такие как холестерин.
В некоторых случаях конъюгирование катионного лиганда с олигонуклеотидами приводит к повышению резистентности к нуклеазам. Репрезентативными примерами катионных лигандов являются про-пиламмоний и диметилпропиламмоний. Интересно отметить, что антисмысловые олигонуклеотиды, как сообщалось, сохраняют свою высокую аффинность связывания с мРНК в том случае, если катионный лиганд распределен по всему олигонуклеотиду. См. публикацию М. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 22, 103 и цитируемые в ней работы.
Конъюгированная с лигандом дцРНК согласно изобретению может быть синтезирована с использованием дцРНК, содержащей боковую реакционноспособную функциональную группу, такую как группа, образующаяся в результате присоединения линкерной молекулы к дцРНК. Этот реакционноспособный олигонуклеотид может непосредственно взаимодействовать с коммерчески доступными лигандами; с синтезированными лигандами, содержащими любую из различных защитных групп; или с лигандами, имеющими присоединенную к ним линкерную группу. Способы согласно изобретению облегчают синтез конъюгированной с лигандом дцРНК с использованием в некоторых предпочтительных вариантах изобретения нуклеозидных мономеров, которые были соответствующим образом конъюгированы с лиган-дами и которые могут быть также присоединены к твердому носителю. Такие конъюгаты "лиганд-нуклеозид", присоединенные, но необязательно, к твердому носителю, получают в соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами способов согласно изобретению посредством взаимодействия выбранного связывающегося с сывороткой лиганда с линкерной группой, присутствующей в 5'-положении нуклеозида или олигонуклеотида. В некоторых случаях дцРНК, несущую аралкильный ли-ганд, присоединенный к 3'-концу дцРНК, получают, главным образом, посредством ковалентного присоединения мономерного структурного блока к стеклянному носителю с регулируемым размером пор через длинноцепочечную аминоалкильную группу. Затем нуклеотиды присоединяют к мономерному структурному блоку, связанному с твердым носителем, стандартными методами твердофазного синтеза. Таким мономерным структурным блоком может быть нуклеозид или другое органическое соединение, совместимое с твердофазным синтезом.
дцРНК, используемая в конъюгатах согласно изобретению, может быть получена подходящим и рутинным способом с применением хорошо известного метода твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза поставляется несколькими компаниями, включая, например, Applied Biosystems (Foster City, CA.). Дополнительно или альтернативно могут быть применены любые другие методы такого синтеза, известные специалистам. Для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфортиоаты и их алкилированные призводные, могут быть применены аналогичные методы, также известные специалистам.
Описание синтеза конкретных модифицированных олигонуклеотидов можно найти в следующих патентах США: в патентах США №№ 5138045 и 5218105, относящихся к олигонуклеотидам, конъюгиро-ванным с полиаминами; в патенте США № 5212295, относящемся к мономерам, используемым для получения олигонуклеотидов, имеющих хиральные фосфорные связи; в патентах США №№ 5378825 и 5541307, относящихся к олигонуклеотидам, имеющим модифицированные остовы; в патенте США № 5386023, относящемся к олигонуклеотидам с модифицированным остовом и к их получению посредством восстановительного связывания; в патенте США № 5457191, относящемся к модифицированным нуклеотидным основаниям, полученным на основе 3-деазапуриновой кольцевой системы и к методам их синтеза; в патенте США № 5459255, относящемся к модифицированным нуклеотидным основаниям, полученным на основе N-2-замещенных пуринов; в патенте США № 5521302, относящемся к способам получения олигонуклеотидов, имеющих хиральные фосфорные связи; в патенте США № 5539082, относящемся к нуклеиновым кислотам, связанным с пептидами; в патенте США № 5554746, относящемся к олигонуклеотидам, имеющим р-лактамовые остовы; в патенте США № 5571902, относящемся к методам и материалам для синтеза олигонуклеотидов; в патенте США № 5578718, относящемся к нуклеозидам, имеющим алкилтиогруппы, где указанные группы могут быть использованы в качестве линкеров или других групп, присоединенных в любом из различных положений нуклеозида; в патентах США №№ 5587361 и 5599797, относящихся к олигонуклеотидам, имеющим фосфортиоатные связи с высокой хи-ральной чистотой; в патенте США № 5506351, относящемся к способам получения 2'-O-алкилгуанозиновых и родственных соединений, включая 2,6-диаминопуриновые соединения; в патенте США № 5587469, относящемся к олигонуклеотидам, имеющим N-2-замещенные пурины; в патенте США № 5587470, относящемся к олигонуклеотидам, имеющим 3-деазапурины; в патентах США №№ 5223168 и 5608046, относящихся к конъюгированным 4'-десметилнуклеозидным аналогам; в патентах США №№ 5602240 и 5610289, относящихся к олигонуклеотидным аналогам с модифицированным остовом; и в патентах США №№ 6262241 и 5459255, относящихся, inter alia, к методам синтеза 2'-фтор-олигонуклеотидов.
В конъюгированной с лигандом дцРНК и в молекуле лиганда, несущей последовательность-специфические связанные нуклеозиды согласно изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могут быть сконструированы на подходящем синтезаторе ДНК с использованием стандартных нуклеотид-ных или нуклеозидных предшественников или предшественников нуклеотидных или нуклеозидных конъюгатов, которые уже несут линкерную группу, предшественников конъюгатов лиганд-нуклеотид или лиганд-нуклеозид, которые уже несут молекулу лиганда, или структурных блоков, несущих не-нуклеозидный лиганд.
При использовании предшественников нуклеотидных конъюгатов, уже несущих линкерную группу, обычно осуществляют синтез последовательность-специфических связанных нуклеозидов, а затем молекулу лиганда подвергают взаимодействию с линкерной группой, в результате чего образуется конъюги-рованный с лигандом олигонуклеотид. Олигонуклеотидные конъюгаты, несущие различные молекулы,
такие как стероиды, витамины, липиды и репортерные молекулы, уже были описаны в литературе (см. заявку РСТ WO 93/07883, Manoharan et al.). В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды согласно изобретению синтезируют на автоматическом синтезаторе с использованием фосфорамидитов, происходящих от конъюгатов "лиганд-нуклеозид", помимо стандартных фосфорамидитов и нестандартных фосфорамидитов, которые являются коммерчески доступными и обычно используются в синтезе олигонуклеотидов.
Введение 2'-О-метильной группы, 2'-О-этильной группы, 2'-О-пропильной группы, 2'-О-аллильной группы, 2'-О-аминоалкильной группы или 2'-дезокси-2'-фторгруппы в нуклеозиды олигонуклеотида придает такому олигонуклеотиду повышенную способность к гибридизации. Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие фосфортиоатные остовы, обладают повышенной стабильностью к нуклеазе. Таким образом, функционализированные связанные нуклеозиды согласно изобретению могут быть увеличены по своему размеру за счет включения любых из следующих компонентов: фосфортиоатного остова или 2'-О-метильной группы, 2'-О-этильной группы, 2'-О-пропильной группы, 2'-O-аминоалкильной группы, 2'-О-аллильной группы или 2'-дезокси-2'-фторгруппы. Краткий список некоторых олигонуклеотидных модификаций, известных специалистам, можно найти, например, в публикации заявки РСТ WO 200370918.
В некоторых вариантах изобретения функционализированные нуклеозидные последовательности согласно изобретению, имеющие аминогруппу у 5'-конца, получают с использованием синтезатора ДНК, а затем их подвергают взаимодействию с активным сложноэфирным производным выбранного лиганда. Активные производные сложных эфиров хорошо известны специалистам в данной области. Репрезентативными активными сложными эфирами являются N-гидроксисукцинимидоэфиры, сложные эфиры тет-рафторфенола, сложные эфиры пентафторфенола и сложные эфиры пентахлорфенола. В результате взаимодействия аминогруппы и активного сложного эфира образуется олигонуклеотид, в котором выбранный лиганд присоединен к 5'-положению посредством линкерной группы. Аминогруппа у 5'-конца может быть введена с использованием 5'-амино-модификатора С6. В одном из вариантов изобретения молекулы лиганда могут быть конъюгированы с олигонуклеотидами в 5'-положении с использованием конъюгата "лиганд-нуклеозид-фосфорамидит", где указанный лиганд прямо или опосредованно присоединен к 5'-гидроксигруппе посредством линкера. Такие конъюгаты "лиганд-нуклеозид-фосфорамидиты" обычно вводят по окончании автоматизированной процедуры синтеза, в результате чего получают конъ-югированный с лигандом олигонуклеотид, содержащий лиганд у 5'-конца.
Примерами модифицированных межнуклеозидных связей или остовов являются, например, фос-фортиоаты, хиральные фосфортиоаты, фосфордитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метилфосфонаты и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофос-форамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, 2'-5'-связанные аналоги этих соединений и аналоги, имеющие обратную полярность, где смежные пары нуклеозидных остатков имеют 3'-5' - 5'-3'- или 2'-5' - 5'-2'-связи. Могут быть также включены различные соли, смешанные соли и свободные кислоты.
Репрезентативными патентами США, относящимися к получению вышеописанных связей, содержащих атом фосфора, являются, но не ограничиваются ими, патенты США №№ 3687808; 4469863;
4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361;
5625050 и 5697248, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Примерами модифицированных межнуклеозидных связей или остовов, не включающих атом фосфора (т.е. олигонуклеозидов), являются связи или остовы, образованные короткоцепочечным алкильны-ми или циклоалкильными межсахарными связями, смешанным гетероатомом и алкильными или цикло-алкильными межсахарными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межсахарными связями. Такими молекулами являются молекулы, имеющие морфолиносвязи (частично образованные из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; мети-ленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие остовы, имеющие смешанные группы N, О, S и СН2.
Репрезентативными патентами США, относящимися к получению вышеописанных олигонуклеози-дов, являются, но не ограничиваются ими, патенты США №№ 5034506; 5166315; 5185444; 5214134;
5216141; 5235033; 5264562; 1264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и
5677439, каждый и которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В некоторых случаях олигонуклеотид может быть модифицирован нелигандной группой. Различные нелигандные молекулы были конъюгированы с олигонуклеотидами для повышения их активности, улучшения распределения в клетках или усиления их поглощения клетками, и процедуры получения таких конъюгатов описаны в научной литературе. Указанными нелигандными молекулами являются ли-пидные молекулы, такие как холестерин (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холе
вая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), тиоэфир, например гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например додекандиол или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Ka-banov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoha-ran et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), полиаминовая или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантанук-сусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), пальмитиловая группа (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229) или октадециламиновая или гексиламино-карбонил-оксихолестериновая молекула (Crooks et al., J. Pharmacol Exp. Ther., 1996, 277:923). Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, перечислены выше. Типичные протоколы конъюгирования включают синтез олигонуклеотидов, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем аминогруппу подвергают взаимодействию с молекулой, конъюгированной с использованием соответствующих связывающих или активирующих реагентов. Реакция конъюгирования может быть проведена либо с олигонуклеотидом, еще связанным с твердым носителем, либо уже отщепленным в жидкой фазе. После очистки олигонуклеотидного конъю-гата с помощью ВЭЖХ обычно получают чистый конъюгат. Использование холестеринового конъюгата является особенно предпочтительным, поскольку такая молекула может улучшать доставку в клетки печени, т.е. в место, где происходит экспрессия PCSK9. Кодируемые вектором РНКи-агенты.
дцРНК согласно изобретению могут также экспрессироваться из рекомбинантных вирусных векторов внутри клеток in vivo. Рекомбинантные вирусные векторы согласно изобретению включают последовательности, кодирующие дцРНК согласно изобретению, и любой подходящий промотор для экспрессии последовательностей дцРНК. Подходящими промоторами являются, например, последовательности промоторов РНК U6 или H1 pol III и промотор цитомегаловируса. Выбор других подходящих промоторов может быть осуществлен самим специалистом в данной области. Рекомбинантные вирусные векторы согласно изобретению могут также содержать индуцибельные или регуляторные промоторы для экспрессии дцРНК в конкретной ткани или в конкретной внутриклеточной среде. Использование рекомби-нантных вирусных векторов для доставки дцРНК согласно изобретению в клетки in vivo более подробно обсуждается ниже.
дцРНК согласно изобретению может экспрессироваться из рекомбинантого вирусного вектора в виде двух отдельных комплементарных молекул РНК или в виде одной молекулы РНК с двумя комплементарными областями.
При этом может быть использован любой вирусный вектор, способный включать кодирующие последовательности экспрессируемой(ых) молекулы(молекул) дцРНК, например векторы, происходящие от аденовируса (AV); аденоассоциированного вируса (AAV); ретровирусов (например, лентивирусов (LV), рабдовирусов, вируса мышиного лейкоза); вируса герпеса и т.п. Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов оболочечными белками или другими поверхностными антигенами, происходящими от других вирусов, или путем замены, если это необходимо, различных вирусных капсидных белков.
Так, например, лентивирусные векторы согласно изобретению могут быть псевдотипированы поверхностными белками, происходящими от вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы согласно изобретению могут быть получены для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов, экспрессирующих капсидные белки различных серотипов. Так, например, AAV-вектор, экспрессирующий капсид серотипа 2 на геноме серотипа 2, обозначается AAV 2/2. Такой ген капсида серотипа 2 в векторе AAV 2/2 может быть заменен геном капсида серотипа 5 с получением вектора AAV 2/5. Методы конструирования AAV-векторов, которые экспрессируют капсидные белки различных серотипов, известны специалистам, см., например, публикацию Rabinowitz J.E. et al. (2002), J. Virol. 76:791-801, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Методы отбора рекомбинантных вирусных векторов, подходящих для применения в настоящем изобретении, методы встраивания последовательностей нуклеиновой кислоты для экспрессии дцРНК в векторе и методы доставки вирусного вектора в представляющие интерес клетки известны специалистам. См., например, публикации Dornburg R. (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M.A. (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A.D. (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W.F. (1998), Nature 392; 25-30 и Rubin-son D.A. et al., Nat. Genet. 33: 401-406, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Предпочтительными вирусными векторами являются векторы, происходящие от AV и AAV. В особенно предпочтительном варианте изобретения дцРНК согласно изобретению экспрессируются как две отдельные комплементарные одноцепочечные молекулы РНК из рекомбинантного AAV-вектора, содержащего, например, либо промоторы РНК U6 или H1, либо промотор цитомегаловируса (CMV).
AV-вектор, подходящий для экспрессии дцРНК согласно изобретению, метод конструирования ре-комбинантного AV-вектора и метод доставки вектора в клетки-мишени описаны в публикации Xia Н. et
al., (2002), Nat. Biotech, 20; 1006-1010.
Подходящие AAV-векторы для экспрессии дцРНК согласно изобретению, методы конструирования рекомбинантного AV-вектора и методы доставки векторов в клетки-мишени описаны в публикациях Samulski R. et al., (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K.J. et al., (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R. et al., (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; в патенте США № 5252479; в патенте США № 5139941; в международной патентной заявке № WO 94/13788 и в международной патентной заявке № WO 93/24641, содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
III. Фармацевтические композиции, содержащие дцРНК.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим дцРНК, описанную в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая дцРНК, может быть использована для лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с экспрессией или активностью гена PCSK9, таких как патологические состояния, которые могут быть модулированы посредством ингибирования экспрессии гена PCSK9, например гиперлипидемия. Такие фармацевтические композиции получают исходя из способа доставки. Одним из примеров являются композиции, приготовленные для доставки в печень путем парентерального введения.
Фармацевтические композиции согласно изобретению вводят в дозах, достаточных для ингибиро-вания экспрессии гена PCSK9. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что благодаря своей высокой эффективности, композиции, содержащие дцРНК согласно изобретению, могут быть введены в поразительно низких дозах. Доза в 5 мг дцРНК на 1 кг массы тела реципиента в день является достаточной для ингибирования или подавления экспрессии гена PCSK9 и может быть системно введена данному пациенту.
В общих чертах, подходящая доза дцРНК составляет в пределах от 0,01 до 5,0 мг/кг массы тела реципиента в день, а обычно в пределах от 1 мкг до 1 мг на 1 кг массы тела в день. Фармацевтическая композиция может быть введена один раз в день, либо дцРНК может быть введена в виде двух, трех или более субдоз через определенные интервалы времени в течение дня или даже путем непрерывного вливания или доставки с помощью препарата с регулируемым высвобождением. В этом случае для достижения общей суточной дозы количество дцРНК, содержащееся в каждой субдозе, должно быть соответствующим образом снижено. Унифицированная лекарственная форма может быть также приготовлена для доставки в течение нескольких дней, например, с использованием стандартного препарата с пролонгируемым высвобождением, который обеспечивает пролонгированное высвобождение дцРНК в течение нескольких дней. Препараты с пролонгированным высвобождением хорошо известны специалистам.
Специалисту в данной области совершенно очевидно, что на выбор дозы и времени, требуемых для эффективного лечения индивидуума, могут влиять некоторые факторы, включая, но не ограничиваясь ими, тяжесть заболевания или расстройства, предварительное лечение, общее состояние здоровья и/или возраст индивидуума, а также наличие других заболеваний. Кроме того, лечение индивидуума терапевтически эффективным количеством композиции может включать один или несколько курсов лечения.
Оценка эффективности доз и времени полужизни in vivo отдельных дцРНК согласно изобретению может быть осуществлена с применением стандартных методик или на основе in vivo тестирования с использованием соответствующего животного-модели, как описано в настоящей заявке.
Прогресс в области генетических исследований на мышах позволяет создать ряд мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические состояния, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии гена PCSK9. Указанные модели используются для in vivo анализа дцРНК, а также для определения терапевтически эффективной дозы.
Для введения дцРНК согласно изобретению млекопитающему может быть применен любой метод. Так, например, таким методом введения может быть прямое введение; пероральное введение или парентеральное введение (например, подкожное введение, интравентрикулярное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение или внутривенное вливание). Введение может быть осуществлено сразу (например, путем инъекции) или в течение определенного периода времени (например, путем пролонгированного вливания или введения препаратов с пролонгированным высвобождением).
Обычно при лечении млекопитающего с гиперлипидемией молекулы дцРНК вводят системно путем парентеральной доставки. Так, например, пациенту могут быть внутривенно введены дцРНК, которые могут быть конъюгированы или не конъюгированы либо приготовлены в виде липосом или без использования липосом. Для этого молекула дцРНК может быть приготовлена в виде композиций, таких как стерильные и нестерильные водные растворы, безводные растворы в стандартных растворителях, таких как спирты, или растворы в жидких или твердых масляных основах. Такие растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения молекула дцРНК может быть приготовлена в виде композиций, таких как стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки (например, усилители пенетрации, соединения-носители и другие фармацевтически при
емлемые носители).
Кроме того, молекулы дцРНК могут быть введены млекопитающему биологическими или небиологическими методами, описанными, например, в патенте США № 6271359. Небиологическая доставка может быть осуществлена различными методами, включая, но не ограничиваясь ими, (1) загрузку липо-сом молекулой дцРНК, описанной в настоящей заявке, и (2) образование комплекса молекулы дцРНК с липидами или липосомами с получением комплексов "нуклеиновая кислота - липид" или "нуклеиновая кислота - липосома". Липосома может состоять из катионных и нейтральных липидов, обычно используемых для трансфецирования клеток in vitro. Катионные липиды могут подвергаться реакции комплек-сообразования (например, с переносом заряда) с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами с образованием липосом. Примерами катионных липосом являются, но не ограничивается ими, липофек-тин, липофектамин, липофектак и DOTAP. Методы получения липосом хорошо известны специалистам. Липосомные композиции могут быть получены, например, из фосфатидилхолина, димиристоилфосфати-дилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, димиристоилфосфатидилглицерина или диолеилфосфати-дилзтаноламина. Многие липофильные агенты являются коммерчески доступными, включая липофек-тин(r) (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) и эффектин(tm) (Qiagen, Valencia, Calif.). Кроме того, методы системной доставки могут быть оптимизированы с использованием коммерчески доступных ка-тионных липидов, таких как DDAB или DOTAP, каждый из которых может быть смешан с нейтральным липидом, таким как DOPE или холестерин. В некоторых случаях могут быть использованы липосомы, например, описанные в публикации Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997)). В других вариантах изобретения для доставки in vivo и ex vivo могут быть использованы поликатионы, такие как полиэтиленимин (Boletta et al., J. Am. Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996)). Дополнительную информацию, относящуюся к использованию липосом для доставки нуклеиновых кислот, можно найти в патенте США № 6271359, в публикации заявки РСТ WO 96/40964 и в публикации Morrissey, D. et al., 2005, Nat. Biotechnol.
23(8): 1002-7.
Биологическая доставка может быть осуществлена различными методами, включая, но не ограничиваясь ими, использование вирусных векторов. Так, например, вирусные векторы (например, аденовирусные и герпесвирусные векторы) могут быть использованы для доставки молекул дцРНК в клетки печени. Стандартные методы молекулярной биологии могут быть применены для введения одной или нескольких описанных здесь дцРНК в один из множества различных вирусных векторов, предварительно полученных для доставки нуклеиновой кислоты в клетки. Такие вирусные векторы могут быть использованы для доставки одной или нескольких дцРНК в клетки, например, путем инфицирования.
дцРНК согласно изобретению могут быть приготовлены в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" (также называемый здесь "наполнителем") означает фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующий агент или любой другой фармакологически инертный носитель. Фармацевтически приемлемые носители могут быть жидкими или твердыми и могут быть выбраны в зависимости от выбранного метода введения с учетом желаемого объема, нужной консистенции и другого подходящего способа доставки, а также от химических свойств. Типичными фармацевтически приемлемыми носителями являются, например, но не ограничиваются ими, вода; физиологический раствор; связующие агенты (например, поливинилпирролидон или гидро-ксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза и другие сахара, желатин или сульфат кальция); замасливатели (например, крахмал, полиэтиленгликоль или ацетат натрия); дезинтегрирующие агенты (например, крахмал или натрийсодержащий гликолят крахмала); и смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия).
Кроме того, дцРНК, нацеленная на ген PCSK9, может быть приготовлена в виде композиций, содержащих дцРНК, смешанную, инкапсулированную, конъюгированную или как-либо иначе ассоциированную с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями нуклеиновых кислот. Так, например, композиция, содержащая один или несколько дцРНК-агентов, нацеленных на ген PCSK9, может содержать другие терапевтические средства, например средства, снижающие уровни липидов (например, статины).
Способы лечения заболеваний, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии PCSK9.
Описанные здесь способы и композиции могут быть использованы для лечения заболеваний и состояний, которые могут быть модулированы путем ингибирования экспрессии гена PCSK9. Так, например, описанные здесь композиции могут быть использованы для лечения гиперлипидемии и других форм нарушений липидного обмена, таких как гиперхолистеринемия, гипертриглицеридемия, а также патологических состояний, ассоциированных с этими расстройствами, таких как болезни сердца и крови.
Способы ингибирования экспрессии гена PCSK9.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии гена PCSK9 у млекопитающего. Такой способ включает введение композиции согласно изобретению млекопитающему для ингибирования экспрессии гена-мишени PCSK9. Благодаря своей высокой специфичности, дцРНК согласно изобретению специфически нацелены на РНК (первичные или процессиро-ванные) гена-мишени PCSK9. Композиции и способы для ингибирования экспрессии этих генов PCSK9 с
использованием дцРНК могут быть применены как описано в настоящей заявке.
В одном из вариантов изобретения указанный способ включает введение композиции, содержащей дцРНК, где указанная дцРНК содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части РНК-транскрипта гена PCSK9 у млекопитающего, подвергаемого лечению. Если подвергаемым лечению организмом является организм млекопитающего, такого как человек, то композиция может быть введена любыми методами, известными специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное или парентеральное введение, включая внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, чрезкожное введение и введение в дыхательные пути (с помощью аэрозоля). В предпочтительных вариантах изобретения указанные композиции вводят путем внутривенного вливания или внутривенной инъекции.
Если это не оговорено особо, то все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют общепринятые значения, понятные среднему специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя для осуществления настоящего изобретения или для анализов, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь методам и материалам, однако предпочтительными являются методы и материалы, описанные ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие упомянутые здесь работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В случае возникновения противоречий они могут быть урегулированы в соответствии с представленным описанием, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.
Примеры
Прогулка по геному гена PCSK9.
Конструирование киРНК осуществляли для ее идентификации в двух отдельных процедурах отбора:
a) киРНК, нацеленных на мРНК человеческого и мышиного или крысиного PCSK9, и
b) всех человеческих реактивных киРНК с предсказанной специфичностью к гену-мишени PCSK9. Были использованы последовательности мРНК для человеческого, мышиного и крысиного PCSK9:
человеческая последовательность NM 174936.2 была использована в качестве эталонной последовательности в процессе осуществления процедуры отбора киРНК.
19-Мерные фрагменты, которые являются консервативными для последовательностей мРНК человеческих и мышиных и человеческих и крысиных PCSK9, были идентифицированы в первой стадии, в результате чего были отобраны киРНК, которые перекрестно реагируют с человеческими и мышиными мишенями, и киРНК, которые перекрестно реагируют с человеческими и крысиными мишенями.
Во второй процедуре отбора были идентифицированы киРНК, специфически нацеленные на человеческий PCSK9. Все возможные 19-мерные последовательности человеческого PCSK9 были экстрагированы и определены как кандидаты на последовательности-мишени. Последовательности, перекрестно реагирующие с человеческими и обезьяньими мишенями и с мышиными, крысиными, человеческими и обезьяньими мишенями, перечислены в табл. 1 и 2. Химически модифицированные варианты этих последовательностей и их активность в анализах in vitro и in vivo также перечислены в табл. 1 и 2 и в примерах, представленных на фиг. 2-8.
Для ранговой оценки кандидатов последовательностей-мишеней и их соответствующих киРНК и для отбора подходящих последовательностей их предсказанный потенциал взаимодействия с нерелевантными мишенями (off-target potential) был взят за ранговый параметр. киРНК с низким потенциалом нерелевантного взаимодействия были определены как предпочтительные и было сделано предположение, что они являются специфичными in vivo.
Для предсказания киРНК-специфического потенциала нерелевантного взаимодействия были сделаны следующие предположения, что
1) положения 2-9 (в направлении 5'-> 3') цепи (уникальная область) могут вносить более важный вклад в потенциал нерелевантного взаимодействия, чем остальная последовательность (область за пределами уникальной области и область сайта расщепления);
2) положения 10 и 11 (в направлении 5'- 3') цепи (область сайта расщепления) могут вносить более важный вклад в потенциал нерелевантного взаимодействия, чем область за пределами уникальной области;
3) положения 1 и 19 каждой цепи не являются подходящими для нерелевантных взаимодействий;
4) показатель нерелевантности может быть вычислен для каждого гена и для каждой цепи исходя из комплементарности последовательности цепи киРНК к последовательности данного гена и из положения несоответствия;
5) число предсказанных нерелевантных мишеней, а также наиболее высокий показатель нелеле-вантности должен рассматриваться как потенциальная нерелевантность;
6) показатели нерелевантности являются более достоверными для оценки потенциала нерелевантности, чем число нерелевантных мишеней;
7) если принять во внимание возможное нарушение активности смысловой цепи в результате вве
дения внутренних модификаций, то следует рассматривать только потенциал нерелевантных взаимодействий антисмысловой цепи.
Для идентификации потенциальных нерелевантных генов 19-мерные последовательности-кандидаты были подвергнуты скринингу на гомологию с известными человеческими последовательностями мРНК.
Для вычисления показателя нерелевантности были выявлены следующие нерелевантные свойства для каждой 19-мерной исходной последовательности каждого нерелевантного гена: число несоответствий в неуникальной области; число несоответствий в уникальной области; число несоответствий в области сайта расщепления.
Показатель нерелевантности вычисляли исходя из предположений 1-3 по следующей формуле: Показатель нерелевантности = число несоответствий в уникальной области • 10 + число
несоответствий в сайте расщепления • 1,2 + число несоответствий в неуникальной области • 1.
Самый нерелевантный ген для каждой киРНК, соответствующей исходной 19-мерной последовательности, был определен как ген с наиболее низким показателем нерелевантности. В соответствии с этим наиболее низкий показатель нерелевантности был определен как наиболее достоверная оценка нерелевантности для каждой киРНК.
Синтез дцРНК.
Источник реагентов.
Если источник реагентов конкретно не указан в настоящей заявке, то это означает, что такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для исследований в области молекулярной биологии в соответствии со стандартами качества/чистоты, установленными для применения в молекулярной биологии.
Синтез киРНК.
Одноцепочечные РНК были получены методом твердофазного синтеза в масштабе 1 мкмоль на синтезаторе Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany) с использованием стекла с регулируемым размером пор (CPG, 500 A, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany) в качестве твердого носителя. РНК и РНК, содержащую 2'-О-метилнуклеотиды, получали методом твердофазного синтеза с применением соответствующих фосфорамидитов и 2'-О-метил-фосфорамидитов соответственно (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany). Эти структурные блоки были введены в выбранные сайты последовательности олигорибонуклеотидной цепи стандартным химическим нуклеозид-фосфорамидитным методом, описанным в современных протоколах по химии нуклеиновых кислот, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA. Фосфортиоат-ные связи были введены путем замены раствора йодного окислителя раствором реагента Бокажа (Chru-achem Ltd., Glasgow, UK) в ацетонитриле (1%).
Дополнительные вспомогательные реагенты были получены от компании Mallinckrodt Baker (Gri-esheim, Germany).
Снятие защиты и очистку неочищенных олигорибонуклеотидов с помощью анионообменной ВЭЖХ проводили в соответствии со стандартными процедурами. Выходы и концентрации определяли по УФ-поглощению раствора соответствующей РНК на длине волны 260 нм с помощью спектрофотометра (DU 640В, Beckman Coulter GmbH, Unterschleibheim, Germany). Двухцепочечную РНК получали путем смешивания эквимолярного раствора комплементарных цепей в буфере для отжига (20 мМ фосфат натрия, рН 6,8; 100 мМ хлорид натрия), а затем нагревали на водяной бане при 85-90°С в течение 3 мин и охлаждали до комнатной температуры в течение 3-4 ч. Раствор гибридизованной РНК хранили при -20°С вплоть до ее использования.
Для синтеза киРНК, конъюгированных с холестерином в 3' положении (также обозначаемых здесь Chol-3'), использовали соответствующим образом модифицированный твердый носитель. Модифицированный твердый носитель получали следующим образом.
Диэтил-2-азабутан-1,4-дикарбоксилат АА
4,7М водный раствор гидроксида натрия (50 мл) добавляли в перемешиваемый охлажденный льдом раствор гидрохлорида этилглицината (32,19 г, 0,23 моль) в воде (50 мл). Затем добавляли этилакрилат (23,1 г, 0,23 моль) и смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции, на что указывала ТСХ. Через 19 ч раствор распределяли с дихлорметаном (3x100 мл). Органический слой сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали. Остаток подвергали перегонке с получением АА (28,8 г, 61%).
Этиловый эфир 3-{этоксикарбонилметил-[6-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)гексаноил] амино}пропионовой кислоты АВ
Fmoc-6-аминогексановую кислоту (9,12 г, 25,83 ммоль) растворяли в дихлорметане (50 мл) и охлаждали на льду. К полученному раствору добавляли диизопропилкарбодиимид (3,25 г, 3,99 мл, 25,83 ммоль) при 0°С. Затем добавляли диэтилазабутан-1,4-дикарбоксилат (5 г, 24,6 ммоль) и диметиламино-пиридин (0,305 г, 2,5 ммоль). Раствор доводили до комнатной температуры и перемешивали еще 6 ч. Завершение реакции определяли с помощью ТСХ. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и добавляли этилацетат для осаждения диизопропилмочевины. Суспензию фильтровали. Фильтрат промывали 5% водной соляной кислотой, 5% бикарбонатом натрия и водой. Объединенный органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением неочищенного продукта, который затем очищали с помощью колоночной хроматографии (50% EtOAC/гексан), в результате чего получали 11,87 г (88%) АВ.
Этиловый эфир 3-[(6-аминогексаноил)этоксикарбонилметиламино]пропионовой кислоты АС
Этиловый эфир 3- {этоксикарбонилметил-[6-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)гексаноил] амино}пропионовой кислоты АВ (11,5 г, 21,3 ммоль) растворяли в 20% пиперидине в диметилформами-де при 0°С. Раствор перемешивали в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, а затем к остатку добавляли воду и продукт экстрагировали этилацетатом. Неочищенный продукт очищали путем его превращения в гидрохлоридную соль.
Этиловый эфир 3-({6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}этоксикарбонилметил-амино)пропионовой кислоты AD
Гидрохлоридную соль этилового эфира 3-[(6-аминогексаноил)этоксикарбонилметиламино]пропио-новой кислоты АС (4,7 г, 14,8 ммоль) растворяли в дихлорметане. Суспензию охлаждали до 0°С на льду. К этой суспензии добавляли диизопропилэтиламин (3,87 г, 5,2 мл, 30 ммоль). К полученному раствору добавляли холестерилхлорформиат (6,675 г, 14,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали 10% соляной кислотой. Полученный продукт очищали флеш-хроматографией (10,3 г, 92%).
трет-Бутоксид калия (1,1 г, 9,8 ммоль) суспендировали в 30 мл сухого толуола. Смесь охлаждали до
Этиловый эфир 1-{6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}-4-оксопирролидин-3-карбоновой кислоты АЕ
0°С на льду и медленно добавляли 5 г (6,6 ммоль) диэфира AD при перемешивании в течение 20 мин. В процессе добавления температуру поддерживали ниже 5°С. Перемешивание продолжали в течение 30 мин при 0°С и добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты, а затем сразу добавляли 4 г NaH2PO4 • H2O в 40 мл воды. Полученную смесь два раза экстрагировали 100 мл дихлорметана и объединенные органические экстракты два раза промывали 10 мл фосфатного буфера, а затем сушили и упаривали досуха. Остаток растворяли в 60 мл толуола, охлаждали до 0°С и экстрагировали тремя 50-миллилитровыми порциями холодного карбонатного буфера, рН 9,5. Водные экстракты доводили до рН 3 добавлением фосфорной кислоты и экстрагировали пятью 40-миллилитровыми порциями хлороформа, которые затем объединяли, сушили и упаривали досуха. Остаток очищали колоночной хроматографией с использованием 25% этилацетата/гексана, в результате чего получали 1,9 г р-кетоэфира (39%).
17-(1,5-Диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-иловый эфир [6-(3-гидрокси-4-гидроксиметил-пирролидин-1-ил)-6-оксо-гексил]карбаминовой кислоты AF
В кипящую смесь b-кетоэфира АЕ (1,5 г, 2,2 ммоль) и борогидрида натрия (0,226 г, 6 ммоль) в тет-рагидрофуране (10 мл) по каплям в течение 1 ч добавляли метанол (2 мл). Перемешивание продолжали при температуре флегмы в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 1н. HCl (12,5 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (3x40 мл). Объединенный этилацетатный слой сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением продукта, который очищали колоночной хроматографией (10% MeOH/CHCl3) (89%).
17-(1,5-Диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-иловый эфир (6-{3-[бис-(4-метоксифенил)фенилметоксиметил]-4-гидрокси-пирролидин-1-ил}-6-оксигексил)карбаминовой кислоты AG
Диол AF (1,25 г, 1,994 ммоль) сушили путем выпаривания с пиридином (2x5 мл) в вакууме. Затем при перемешивании добавляли безводный пиридин (10 мл) и 4,4'-диметокситритилхлорид (0,724 г, 2,13 ммоль). Реакцию осуществляли при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакцию гасили добавлением метанола. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и к остатку добавляли дихлорметан (50 мл). Органический слой промывали 1М водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаточный пиридин удаляли путем выпаривания с толуолом. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (2% МеОН/хлороформ, Rf=0,5 в 5% MeOH/CHCb) (1,75 г, 95%).
Моно-(4-[бис(4-метоксифенил)фенилметоксиметил] -1-{6-[17-(1,5 -диметилгексил)-10,13 -диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1 Н-циклопента[а] фенантрен-3 -илоксикарбониламино] гексаноил}пирролидин-3-ил)эфир янтарной кислоты АН
Соединение AG (1,0 г, 1,05 ммоль) смешивали с ангидридом янтарной кислоты (0,150 г, 1,5 ммоль) и DMAP (0,073 г, 0,6 ммоль), а затем сушили в вакууме при 40°С в течение ночи. Смесь растворяли в безводном дихлорэтане (3 мл), добавляли триэтиламин (0,318 г, 0,440 мл, 3,15 ммоль) и раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 16 ч. Затем раствор разбавляли ди-хлорметаном (40 мл) и промывали охлажденной льдом водной лимонной кислотой (5 мас.%, 30 мл) и водой (2x20 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали досуха. Остаток использовали в следующей стадии без очистки. Дериватизированный холестерином CPG AI
Сукцинат АН (0,254 г, 0,242 ммоль) растворяли в смеси дихлорметана/ацетонитрила (3:2, 3 мл). К полученному раствору последовательно добавляли DMAP (0,0296 г, 0,242 ммоль) в ацетонитриле (1,25 мл) и 2,2'-дитио-бис-(5-нитропиридин) (0,075 г, 0,242 ммоль) в ацетонитриле/дихлорэтане (3:1, 1,25 мл). К полученному раствору добавляли трифенилфосфин (0,064 г, 0,242 ммоль) в ацетонитриле (0,6 мл). Реакционная смесь приобретала ярко-оранжевую окраску. Раствор быстро перемешивали в шарнирном шейкере (5 мин). Затем добавляли длинноцепочечный алкиламин-CPG (LCAA-CPG) (1,5 г, 61 мМ). Сус-
пензию перемешивали в течение 2 ч. CPG фильтровали через воронку из спеченного стекла и последова-
тельно промывали ацетонитрилом, дихлорметаном и эфиром. Непрореагировавшие аминогруппы маскировали с использованием ангидрида уксусной кислоты/пиридина. Конечную загрузку CPG определяли по интенсивности УФ-излучения (37 мМ/г).
Синтез киРНК, несущих группу бисдециламида 5'-12-додекановой кислоты (обозначаемую здесь "5'-С32-") или группу 5'-холестерилового производного (обозначаемую здесь "5'-Chol-"), проводили, как
описано в WO 2004/065601, за исключением того, что в случае холестерилового производного для введе-
ния фосфортиоатной связи у 5'-конца олигомера нуклеиновой кислоты проводили стадию окисления с использованием реагента Бокажа.
Последовательности нуклеиновой кислоты представлены ниже в соответствии со стандартной номенклатурой и имеют конкретные аббревиатуры, указанные в табл. 1-2.
Скрининг киРНК PCSK9 в клетках HuH7, HepG2, Hela и в первичных гепатоцитах обезьян выявил в высокой степени активные последовательности.
Клетки HuH7 были получены из банка клеток JCRB (Японская коллекция биологических источников для исследований) (Shinjuku, Japan, cat. No. JCRB0403). Клетки культивировали в среде MEM Дуль-бекко (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. F0435), в которую были добавлены 10% фетальная телячья сыворотка (FCS) (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. S0115), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. A2213) и 2 мМ L-глутамина (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. K0282), при 37°С в атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе с повышенной влажностью (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany). Клетки HepG2 и клетки Hela получали из Американской коллекции типовых культур (Rockville, Md., cat. No. HB-8065) и культивировали в MEM (Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Germany, cat. No, 21090-022), в которую были добавлены 10% фетальная телячья сыворотка (FCS) (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. S0115), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. A2213), 1x заменимых аминокислот (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. K-0293) и 1 мМ пирувата натрия (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. L-0473), при 37°С в атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе с повышенной влажностью (Her-aeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany).
Для киРНК-трансфекции клетки HuH7, HepG2 или Hela высевали в 96-луночные планшеты при плотности 2,0x10 клеток/лункку и сразу трансфецирововали. киРНК-трансфекцию (30 нМ для скрининга одной дозы) осуществляли с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No. 11668-019), как описано производителем.
Через 24 ч после трансфекции, клетки HuH7 и HepG2 подвергали лизису и уровни мРНК PCSK9 оценивали с использованием набора Quantigene Explore Kit (Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, cat. No. QG-000-02) в соответствии с протоколом. Уровни мРНК PCSK9 нормализовали по мРНК GAP-DH. Для каждой киРНК получали восемь независимых результатов. В качестве контроля использовали киРНК-дуплексы, не являющиеся родственными гену PCSK9. Активность данного PCSK9-специфического киРНК-дуплекса выражали как процент концентрации мРНК PCSK9 в обработанных клетках по отношению к концентрации мРНК PCSK9 в клетках, обработанных контрольным киРНК-
Первичные гепатоциты собакоподобных обезьян (криоконсервированные) получали от компании In vitro Technologies, Inc. (Baltimore, Md., USA, cat No. M00305) и культивировали в среде In VitroGRO CP Medium (cat No. Z99029) при 37°С в атмосфере с 5% СО2 в инкубаторе с повышенной влажностью.
Для киРНК-трансфекции первичные клетки собакоподобных обезьян высевали на покрытые коллагеном 96-луночные планшеты (Fisher Scientific, cat. No. 08-774-5) при плотности 3,5x104 клеток на лунку и сразу трансфецировали. киРНК-трансфекцию (восемь 2-кратных серийных разведений, начиная с 30 нМ) осуществляли в дубликатах с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No. 11668-019), как описано производителем.
Через 16 ч после трансфекции среду заменяли свежей средой In VitroGRO CP, содержащей смесь антибиотиков Torpedo Antibiotic Mix (In vitro Technologies, Inc., cat. No. Z99000).
Через 24 ч после замены среды первичные клетки собакоподобных обезьян подвергали лизису и уровни мРНК PCSK9 оценивали с использованием набора Quantigene Explore Kit (Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, cat. No. QG-000-02) в соответствии с протоколом. Уровни мРНК PCSK9 нормализовали по мРНК GAPDH. Затем нормализованные отношения PCSK9/GAPDH сравнивали с отношением PCSK9/GAPDH для контрольных клеток, обработанных только липофектамином 2000.
В табл. 1-2 (и на фиг. 6) систематизированы результаты и приводятся примеры in vitro скрининга в различных клеточных линиях при различных дозах. Сайленсинг транскрипта PCSK9 выражали как процент от остального транскрипта, присутствующего в данной дозе. В высокой степени активными последовательностями являются последовательности, в которых присутствовало менее чем 70% остаточного транскрипта после обработки данной киРНК в дозе, равной 100 нМ или менее. Очень активными последовательностями являются последовательности, в которых присутствовало менее чем 60% остаточного транскрипта после обработки данной киРНК в дозе, равной 100 нМ или менее. Активными последовательностями являются последовательности, в которых присутствовало менее чем 85% остаточного транскрипта после обработки высокой дозой (100 нМ). Репрезентативные активные киРНК, полученные в виде липидоидных препаратов, описанных ниже, были также скринированы у мышей in vivo. Последовательности, которые были активными in vitro, также обычно обнаруживали активность in vivo (см., например, фиг. 6).
Скрининг in vivo эффективности киРНК PCSK9.
Процедура получения препаратов.
Для получения наночастиц "липид-киРНК" использовали липидоид LNP-01-4HCl (MW 1487) (фиг. 1), холестерин (Sigma-Aldrich) и ПЭГ-церамид С16 (Avanti Polar Lipids). Были получены маточные эта-ноловые растворы каждого из следующих компонентов: LNP-01 133 мг/мл; холестерина 25 мг/мл, ПЭГ-церамида С16 100 мг/мл. Затем маточные растворы LNP-01, холестерина и ПЭГ-церамида С16 объединяли в молярном отношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор быстро смешивали с водной киРНК (в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла 35-45%, а конечная концентрации ацетата натрия составляла 100-300 мМ. Наночастицы "липид-киРНК" спонтанно образовывались после смешивания. В зависимости от нужного распределения частиц по размеру полученную смесь наночастиц в некоторых случаях подвергали экструзии через поликарбонатную мембрану (с отсечкой 100 нМ) на поршневом термоэкструдере (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc.). В других случаях стадию экструзии не проводили. Затем этанол удаляли и одновременно проводили замену буфера либо путем диализа, либо путем фильтрации в тангенциальном потоке. Буфер заменяли забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), рН 7,2.
Характеризация препаратов.
Препараты, полученные либо стандартным методом, либо неэкструзионным методом, охарактери-зовывали аналогичным образом. Препараты сначала охарактеризовывали путем визуального наблюдения. Эти препараты представляли собой беловатые прозрачные растворы, не содержащие агрегированных включений или осадка. Размер частиц и гранулометрический состав липидных наночастиц измеряли по динамическому рассеянию света с использованием Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Частицы должны иметь размер 20-300 нм, а в идеальном случае 40-100 нм. Распределение частиц по размеру должно быть унимодальным. Общую концентрацию киРНК в данном препарате, а также наличие иммобилизованной фракции оценивали с помощью анализа на вытеснение метки-красителя. Образец препарата киРНК инкубировали с РНК-связывающим красителем Ribogreen (Molecular Probes) в присутствии или в отсутствие поверхностно-активного вещества, разрушающего препарат, 0,5% тритона-Х100. Общее количество киРНК в данном препарате определяли по сигналу, передаваемому от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, в соответствии со стандартной кривой. Иммобилизованную фракцию определяли путем вычитания содержания "свободной" киРНК (измеренного по сигналу в отсутствие поверхностно-активного вещества) из общего содержания киРНК. Процент иммобилизованной киРНК обычно составляет > 85%.
Ударная доза.
Мышам C57/BL6 (5 мышей на группу, в возрасте 8-10 недель, Charles River Laboratories, MA) в хвостовую вену иглой 27G инъецировали ударную дозу препарата киРНК. киРНК приготавливали в LNP-01 (а затем диализовали против PBS) при концентрации 0,5 мг/мл, что позволяло вводить дозу 5 мг/кг в
объеме 10 мкл/г массы тела. Перед введением дозы мышей помещали под инфракрасную лампу приблизительно на 3 мин для облегчения инъекции.
Через 48 ч после введения дозы мышей умерщвляли путем CO2-асфиксии. Затем из ретроорбиталь-ной области брали 0,2 мл крови, после чего печень собирали и замораживали в жидком азоте. Сыворотку и печень хранили при -80°С.
Замороженную печень измельчали с использованием холодильника 6850/криогенной мельницы (SPEX CentriPrep, Inc.) и порошок хранили при -80°С до проведения анализа.
Уровни мРНК PCSK9 определяли методом продуцирования разветвленных ДНК с использованием набора, поставляемого QuantiGene Reagent System (Genospectra), в соответствии с протоколом. 10-20 мг порошка замороженной печени подвергали лизису в 600 мкл 0,16 мкг/мл протеиназы K (Epicentre, #MPRK092) в растворе для лизиса ткани и клеток (Epicentre, #MTC096H) при 65°С в течение 3 ч. Затем к 90 мкл рабочего реагента для лизиса добавляли 10 мкл лизатов (1 об. маточной смеси для лизиса в 2 об. воды) и смесь инкубировали при 52°С в течение ночи на планшетах для иммобилизации Genospectra с наборами зондов, специфичных к мышиному PCSK9 и мышиному GAPDH или циклофилину В. Последовательности нуклеиновой кислоты для активатора захвата (СЕ), активатора метки (LE) и блокирующих (BL) зондов отбирали из последовательностей нуклеиновой кислоты PCSK9, GAPDH и циклофиллина В с помощью компьютерной программы QuantiGene ProbeDesigner 2.0 (Genospectra, Fremont, Calif., USA, cat. No. QG-002-02). Хемолюминесценцию считывали на устройстве Victor2-Light (Perkin Elmer) в относительных единицах силы света. Отношение мРНК PCSK9 к мРНК GAPDH или циклофилина В в лиза-тах печени усредняли для каждой группы обработки и сравнивали с отношением для контрольной группы, обработанной PBS, или контрольной группы, обработанной неродственной киРНК (фактора свертывания крови VII).
Общий уровень холестерина в сыворотке мышей измеряли с использованием набора StanBio Cholesterol LiquiColor (StanBio Laboratory, Boerne, Tex., USA) в соответствии с инструкциями производителей. Измерения проводили на счетчике Victor2 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) на 495 нм.
Примеры
32 киРНК PCSK9, приготовленных в липосомах LNP-01, тестировали in vivo в мышиной модели. Этот эксперимент проводили при дозе киРНК 5 мг/кг и по меньшей мере 10 киРНК PCSK9 обнаруживали более чем 40% разрушенной мРНК PCSK9 по сравнению с контрольной группой, обработанной PBS, a контрольная группа, обработанная неродственной киРНК (фактора свертывания крови VII), не обнаруживала какого-либо эффекта (фиг. 2-5). Сайленсинг транскрипта PCSK9 также коррелировал со снижением уровня холестерина у этих животных (фиг. 4-5). Кроме того, между молекулами, которые были активны in vitro и in vivo, наблюдалась значительная корреляция (фиг. 6). Последовательности, содержащие различные химические модификации, также скринировали in vitro (табл. 1 и 2) и in vivo. Так, например, последовательности 9314 и 9318 с меньшим числом модификаций и варианты последовательностей 9314-(10792, 10793 и 10796); 9318-(10794, 10795, 10797) с большим числом модификаций тестировали in vitro (в первичных гепатоцитах обезьян) или in vivo (9314 и 10792) в препарате LNP-01. На фиг. 7 (см. также табл. 1 и 2) показано, что все родительские молекулы 9314 и 9318 и их модифицированные варианты являются активными in vitro. На фиг. 8 в качестве примера показано, что родительская последовательность 9314 и последовательность 10792 с большим числом модификаций являются активными in vivo, на что указывает 50-60% сайленсинг эндогенного PCSK9 у мышей. На фиг. 9 также проиллюстрирована активность других химически модифицированных вариантов родительских последовательностей 9314 и 10792.
дцРНК-экспрессирующие векторы.
В другом аспекте изобретения PCSK9-специфические молекулы дцРНК, которые модулируют активность экспрессии гена PCSK9, экспрессируются от транскрипционных единиц, встроенных в ДНК-или РНК-векторы (см., например, Couture, A. et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., публикацию международной заявки РСТ № WO 00/22113, Conrad, публикацию международной заявки РСТ № WO 00/22114, Conrad и патент США № 6054299). Эти трансгены могут быть введены в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, которые могут быть включены в геном хозяина и могут наследоваться как интегрированный трансген. Этот трансген может быть также сконструирован так, чтобы он наследовался как внехромосомная плазмида (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
Отдельные цепи дцРНК могут транскрибироваться промоторами на двух отдельных экспрессион-ных векторах и котрансфецироваться в клетку-мишень. Альтернативно, каждая отдельная цепь дцРНК может транскрибироваться промоторами, которые присутствуют на одной и той же экспрессионной плазмиде. В предпочтительном варианте изобретения дцРНК экспрессируется как инвертированный повтор, связанный посредством линкерной полинуклеотидной последовательности, в результате чего дцРНК имеет структуру типа "стебля" и "петли".
Рекомбинантными дцРНК-экспрессирующими векторами обычно являются плазмидные ДНК или вирусные векторы. дцРНК-экспрессирующие вирусные векторы могут быть сконструированы на основе вирусов, таких как, но не ограничивающихся ими, аденоассоциированный вирус (обзор см., например,
Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); аденовирус (см., например, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434) и Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)) или альфавирус, а также другие вирусы, известные специалистам. Ретровирусы были использованы для введения различных генов в различные клетки многих типов, включая эпителиальные клетки in vitro или in vivo (см., например, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:30143018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beuscechem, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; патент США No. 4868116; патент США No. 4980286; заявку PCT WO 89/07136; заявку РСТ WO 89/02468; заявку РСТ WO 89/05345 и заявку РСТ WO 92/07573). Рекомбинант-ные ретровирусные векторы, способные переносить и экспрессировать гены, встроенные в геном клетки, могут быть продуцированы путем трансфекции рекомбинантного ретровирусного генома в подходящие упаковывающие клеточные линии, такие как РА317 и Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81:6349). Рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть использованы для инфицирования клеток и тканей широкого ряда у восприимчивых хозяев (например, крыс, хомячков, собак и шимпанзе) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), а также они имеют то преимущество, что для их инфицирования не требуется митотически активных клеток.
Промотором, регулирующим экспрессию дцРНК в плазмидной ДНК или в вирусном векторе согласно изобретению, может быть промотор гена эукариотической РНК-полимеразы I (например, промотор рибосомной РНК), промотор РНК-полимеразы II (например, ранний промотор CMV или промотор актина или промотор мяРНК U1) или обычно промотор РНК-полимеразы III (например, промотор мяРНК U6 или РНК 7SK) или прокариотический промотор, например промотор Т7, при условии, что экспресси-онная плазмида также кодирует РНК-полимеразу Т7, необходимую для транскрипции с промотора Т7. Промотор может также направлять экспрессию трансгена в поджелудочную железу (например, последовательность, регулирующая поступление инсулина в поджелудочную железу (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)).
Кроме того, экспрессия трансгена может соответствующим образом регулироваться, например, с использованием индуцибельной регуляторной последовательности и экспрессионных систем, таких как регуляторная последовательность, восприимчивая к некоторым физиологическим регуляторам, например уровням глюкозы в крови или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такими индуцибельны-ми экспрессионными системами, подходящими для регуляции экспрессии трансгенов в клетках или у млекопитающих, являются системы регуляции под действием экдизонов, эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изоггоогшл-Р^Ьтиогалактопиранозида (EPTG). Специалист в данной области может самостоятельно выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность в зависимости от целей использования дцРНК-трансгена.
Обычно доставку рекомбинантных векторов, способных экспрессировать молекулы дцРНК, осуществляют как описано ниже, и после этого они интегрируются в клетках-мишенях. Альтернативно, могут быть использованы вирусные векторы, обеспечивающие временную экспрессию молекул дцРНК. Такие векторы, при необходимости, могут быть введены повторно. После экспрессии дцРНК связываются с РНК-мишенью и модулируют ее функцию или экспрессиию. Доставка дцРНК-экспрессирующих векторов может быть системной, например, она может быть осуществлена путем внутривенного или внутримышечного введения, или путем введения в клетки-мишени, эксплантированные у пациента, с последующим введением этих клеток снова пациенту, или любыми другими методами, позволяющими осуществлять введение в нужные клетки-мишени.
дцРНК-экспрессирующие ДНК-плазмиды обычно трансфецируют в клетки-мишени в виде комплекса с катионными липидными носителями (например, олигофектамином) или с некатионными ли-пидными носителями (например, Transit-TKO(tm)). В настоящем изобретении также рассматриваются множественные липидные трансфекции для дцРНК-опосредуемого подавления различных областей-мишеней одного гена PCSK9 или множества генов PCSK9 в течение одной недели или более. Успешное введение векторов согласно изобретению в клетки-хозяева может быть оценено различными известными методами. Так, например, временная трансфекция может быть выявлена по сигналу репортера, такого как флуоресцентный маркер, например белок, флуоресцирующий в зеленом диапозоне спектра (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть обеспечена с использованием маркеров, которые сообщают трансфецированным клеткам резистентность к конкретным внешним факторам (например, к антибиотикам и лекарственным средствам), такую как резистентность к гигромицину В.
PCSK9-специфические молекулы дцРНК могут быть также встроены в векторы и использованы в качестве векторов, применяемых в генотерапии для лечения человека. Векторы для генотерапии могут быть доставлены индивидууму, например, путем внутривенной инъекции, местного введения (см. патент США № 5328470) или стереотаксической инъекции (см., например, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Фармацевтический препарат векторов, применяемый в генотерапии, может
включать вектор для генотерапии в приемлемом разбавителе, либо он может содержать матрицу с пролонгированным высвобождением, в которую может быть введен носитель для доставки генов. Альтернативно, если вектор для доставки полноразмерного гена, например ретровирусный вектор, может быть получен в интактной форме из рекомбинантных клеток, то такой фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, продуцирующих систему доставки гена.
Специалистам в данной области очевидно, что помимо методов и композиций, конкретно описанных в настоящей заявке, существуют и другие методы и композиции, которые могут быть применены для осуществления настоящего изобретения, полный объем которого определен в прилагаемой формуле изобретения.
Положения в человеческой
рег.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи (З'-З1)'
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (S'-З')1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при ссютветствугошей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
nM/HepG2
30 нМ/ HeLa
205-223
CACCGCAAGGCUCAAGGCGTT
CGCCUUGAGCCUUGCGGUGTT
AD-15222
208-226
CGCAAGGCUCAAGGCGCCGTT
CGGCGCCUUGAGCCUUGCGTT
AD-15278
210-228
CAAGGCUCAAGGCGCCGCCTT
GGCGGCGCCUUGAGCCUUGTT
AD-15178
232-250
GUGGACCGCGCACGGCCUCTT
GAGGCCGUGCGCGGUCCACTT
AD-15308
233-251
UGGACCGCGCACGGCCUCUTT
AGAGGCCGUGCGCGGUCCATT
AD-15223
234-252
GGACCGCGCACGGCCUCUATT
UAGAGGCCGUGCGCGGUCCTT
AD-15309
235-253
GACCGCGCACGGCCUCUAGTT
CUAGAGGCCGUGCGCGGUCTT
AD-15279
236-254
ACCGCGCACGGCCUCUAGGTT
CCUAGAGGCCGUGCGCGG UTT
AD-15194
237-255
CCGCGCACGGCCUCUAGGUTT
ACCUAGAGGCCGUGCGCGGTT
AD-15310
238-256
CGCGCACGGCCUCUAGG UCTT
GACCUAGAGGCCGUGCGCGTT
AD-15311
239-257
GCGCACGGCCUCUAGGUCUTT
AGACCUAGAGGCCGUGCGCTT
AD-15392
240-258
CGCACGGCCUCUAGGUCUCTT
GAGACCUAGAGGCCGUGCGTT
AD-15312
248-266
CUCUAGGUCUCCUCGCCAGTT
CUGGCGAGGAGACCUAGAGTT
AD-15313
249-267
UCUAGGUCUCCUCGCCAGGTT
CCUGGCGAGGAGACCUAGATT
AD-15280
250-268
CUAGGUCUCCUCGCCAGGATT
UCCUGGCGAGGAGACCUAGTT
AD-15267
252-270
AGGUCUCCUCGCCAGGACATT
UGUCCUGGCGAGGAGACCUTT
AD-15314
258-276
CCUCGCCAGGACAGCAACCTT
GGUUGCUGUCCUGGCGAGGTT
AD-15315
300-318
CGUCAGCUCCAGGCGGUCCTsT
GGACCGCCUGGAGCUGACGTsT
AD-9624
300-318
cGucAGcuccAGGcGGuccTsT
GGACCGCCUGGAGCUGACGTsT
AD-9750
301-319
GUCAGCUCCAGGCGGUCCUTsT
AGGACCGCCUGGAGCUGACTsT
AD-9623
301-319
GucAGcuccAGGcGGuccuTsT
AGGACCGCCUGGAGCUGACTsT
AD-9749
105
Положения в человеческой
рег№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3$
SEQ ID
NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3')1
SEQ ID NO:
Обсвютение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках
IC50B HepG2 [нМ]
1С50в гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
nM/HepG2
30 нМУ HeLa
370-388
GGCGCCCGUGCGCAGGAGGTT
CCUCCUGCGCACGGGCGCCTT
AD-15384
408-426
GG AGCUGGUGCU AGCCUUGTsT
CAAGGCUAGCACCAGCUCCTsT
AD-9607
0,20
408-426
GGAGcuGGuGcuAGccuuGTsT
cAAGGCuAGcACcAGCUCCTsT
AD-9733
411-429
GCUGGUGCUAGCCUUGCGUTsT
ACGCAAGGCUAGCACCAGCTsT
AD-9524
0,07
411-429
GcuGGuGcuAGccuuGcGuTsT
ACGcAAGGCuAGcACcAGCTsT
AD-9650
412-430
CUGGUGCUAGCCUUGCGUUTsT
AACGCAAGGCUAGCACCAGTsT
AD-9520
412-430
CUGGUGCUAGCCUUGCGUUTsT
AACGCAAGGCUAGCACCAGTsT
AD-9520
412^130
cuGGuGcuAGccuuGcGuuTsT
AACGcAAGGCuAGcACcAGTsT
100
AD-9646
108
416-434
UGCUAGCCU UGCGUUCCGATsT
101
UCGGAACGCAAGGCUAGCATsT
102
AD-9608
416-434
uGcuAGccuuGcGuuccGATsT
103
UCGGAACGcAAGGCuAGcATsT
104
AD-9734
419-437
UAGCCUUGCGUUCCGAGGATsT
105
UCCUCGGAACGCAAGGCUATsT
106
AD-9546
419-437
uAGccuuGcGuuccGAGGATsT
107
UCCUCGGAACGcAAGGCuATsT
108
AD-9672
439-457
GACGGCCUGGCCGAAGCACTT
109
GUGCUUCGGCCAGGCCGUCTT
110
AD-15385
447-465
GGCCGAAGCACCCGAGCACTT
11!
GUGCUCGGGUGCUUCGGCCTT
112
AD-15393
448-466
GCCGAAGCACCCGAGCACGTT
113
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCTT
114
AD-15316
449-467
CCGAAGCACCCGAGCACGGTT
115
CCGUGCUCGGGUGCUUCGGTT
116
AD-15317
458-476
CCGAGCACGGAACCACAGCTT
117
GCUGUGGUUCCGUGCUCGGTT
118
AD-15318
484-S02
CACCGCUGCGCCAAGGAUCTT
119
GAUCCUUGGCGCAGCGGUGTT
120
AD-15195
486-504
CCGCUGCGCCAAGGAUCCGTT
121
CGGAUCCUUGGCGCAGCGGTT
122
AD-15224
487-505
CGCUGCGCCAAGGAUCCGUTT
123
ACGGAUCCUUGGCGCAGCGTT
!24
AD-
15188
489-507
CUGCGCCAAGGAUCCGUGGTT
125
CCACGGAUCCUUGGCGCAGTT
126
AD-15225
Положения в человеческой
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи(б-З^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цигя(5'-301
SEQ
NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
500-518
AUCCGUGGAGGUUGCCUGGTT
127
CCAGGCAACCUCCACGGA UTT
128
AD-15281
509-527
GGUUGCCUGGCACCUACGUTT
129
ACGUAGGUGCCAGGCAACCTT
130
AD-15282
542-560
AGGAGACCCACCUCUCGCATT
131
UGCGAGAGGUGGGUCUCCUTT
132
AD-15319
543-561
GGAGACCCACCUCUCGCAGTT
133
CUGCGAGAGGUGGGUCUCCTT
134
AD-15226
544-562
GAGACCCACCUCUCGCAGUTT
135
ACUGCGAGAGGUGGGUCUCTT
136
AD-15271
549-567
CCACCUCUCGCAGUCAGAGTT
137
CUCUGACUGCGAGAGGUGGTT
138
AD-15283
552-570
CCUCUCGCAGUCAGAGCGCTT
139
GCGCUCUGACUGCGAGAGGTT
140
AD-15284
553-571
CUCUCGCAGUCAGAGCGCATT
141
UGCGCUCUGACUGCGAGAGTT
142
AD-15189
554-572
UCUCGCAGUCAGAGCGCACTT
143
GUGCGCUCUGACUGCGAGATT
144
AD-15227
555-573
CUCGCAGUCAGAGCGCACUTsT
145
AGUGCGCUCUGACUGCGAGTsT
146
AD-
9547
0,20
555-573
cucGcAGucAGAGcGcAcuTsT
147
AGUGCGCUCUGACUGCGAGTsT
148
AD-9673
558-576
GCAGUCAGAGCGCACUGCCTsT
149
GGCAGUGCGCUCUGACUGCTsT
150
AD-9548
558-576
GcAGucAGAGcGcAcuGccTsT
151
GGcAGUGCGCUCUGACUGCTsT
152
AD-9674
606-624
GGGAUACCUCACCAAGAUCTsT
153
GAUCUUGGUGAGGUAUCCCTsT
154
AD-9529
606-624
GGGAuAccucAccAAGAucTsT
155
GAUCUUGGUGAGGuAUCCCTsT
156
AD-9655
140
659-677
UGGUGAAGAUGAGUGGCGATsT
157
UCGCCACUCAUCUUCACCATsT
158
AD-9605
0,27
659-677
uGGuGAAGAuGAGuGGcGATsT
159
UCGCcACUcAUCUUcACcATsT
160
AD-9731
0,32
663-681
GAAGAUGAGUGGCGACCUGTsT
161
CAGGUCGCCACUCAUCUUCTsT
162
AD-9596
663-681
GAAGAuGAGuGGcGAccuGTsT
163
cAGGUCGCcACUcAUCUUCTsT
164
AD-9722
704-722
CCCAUGUCGACUACAUCGATsT
165
UCGAUGUAGUCGACAUGGGTsT
166
AD-9583
704-722
cccAuGucGAcuAcAucGATsT
167
UCGAUGuAGUCGAcAUGGGTsT
168
AD-9709
104
Положения в человеческой
рег.№ тЛ_ 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цегш(5'-3^
SEQ ID NO:
Обсоначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
Ю50в
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HlWHepG2
uM/HepG2
30 нМ/ HeLa
718-736
AUCGAGGAGGACUCCUCUGTsT
169
CAGAGGAGUCCUCCUCGAUTsT
170
AD-9579
113
718-736
AucGAGGAGGAcuccucuGTsT
171
cAGAGGAGUCCUCCUCGAUTsT
172
AD-9705
758-776
GGAACCUGGAGCGGAUUACTT
173
GUAAUCCGCUCCAGGUUCCTT
174
AD-15394
759-777
GAACCUGGAGCGGAUUACCTT
175
GGUAAUCCGCUCCAGGUUCTT
176
AD-151%
760-778
AACCUGGAGCGGAUUACCCTT
177
GGGUAAUCCGCUCCAGGUUTT
178
AD-15197
777-795
CCCUCCACGGUACCGGGCGTT
179
CGCCCGGUACCGUGGAGGGTT
180
AD-15198
782-800
CACGGUACCGGGCGGAUGATsT
181
UCAUCCGCCCGGUACCGUGTsT
182
AD-9609
782-800
cAcGGuAccGGGcGGAuGATsT
183
UcAUCCGCCCGGuACCGUGTsT
184
AD-9735
115
783-801
ACGGUACCGGGCGG A UGAATsT
185
UUCAUCCGCCCGGUACCGUTsT
186
AD-L9537
145
783-801
AcGGuAccGGGcGGAuGAATsT
187
UUcAUCCGCCCGGuACCGUTsT
188
AD-9663
102
784-802
CGGUACCGGGCGGAUGAAUTsT
189
AUUCAUCCGCCCGGUACCGTsT
190
AD-9528
113
784-802
cGGuAccGGGcGGAuGAAuTsT
191
AUUcAUCCGCCCGGuACCGTsT
192
AD-9654
107
785-803
GGUACCGGGCGGAUGAAUATsT
193
UAUUCAUCCGCCCGGUACCTsT
194
AD-9515
785-803
GGuAccGGGcGGAuGAAuATsT
195
uAUUcAUCCGCCCGGuACCTsT
196
AD-9641
786-804
GUACCGGGCGGAUGAAUACTsT
197
GUAUUCAUCCGCCCGGUACTsT
198
AD-9514
786-804
GuAccGGGcGGAuGAAuAcTsT
199
GuAUUc A UCCGCCCGGuACTsT
200
AD-9640
788-806
ACCGGGCGGAUGAAUACCATsT
201
UGGUAUUCAUCCGCCCGGUTsT
202
AD-9530
788-806
AccGGGcGGAuGAAuAccATsT
203
UGGuAUUcAUCCGCCCGGUTsT
204
AD-9656
789-807
CCGGGCGGAUGAAUACCAGTsT
205
CUGGUAUUCAUCCGCCCGGTsT
206
AD-9538
789-807
ccGGGcGGAuGAAuAccAGTsT
207
CUGGuAUUcAUCCGCCCGGTsT
208
AD-9664
825-843
CCUGGUGGAGGUGUAUCUCTsT
209
GAGA UACACCUCCACCAGGTsT
210
AD-9598
Положения в человеческой
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-30'
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (5'-3:)l
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
nM/HepG2
30 нМ/ HeLa
825-843
ccuGGuGGAGGuGuAucucTsT
211
GAGAuAcACCUCcACcAGGTsT
212
AD-9724
127
826-844
CUGGUGGAGGUGUAUCUCCTsT
213
GGAGAUACACCUCCACCAGTsT
214
AD-9625
826-844
cuGGuGGAGGuGuAucuccTsT
215
GGAGAuAcACCUCcACcAGTsT
216
AD-9751
827-845
UGGUGGAGGUGUAUCUCCUTsT
217
AGGAGAUACACCUCCACCATsT
218
AD-9556
827-845
uGGuGGAGGuGuAucuccuTsT
219
AGGAGAuAcACCUCcACcATsT
220
AD-9682
828-846
GGUGGAGGUGUAUCUCCUATsT
221
UAGGAGAUACACCUCCACCTsT
222
AD-
9539
828-846
GGuGGAGGuGuAucuccuATsT
223
uAGGAGAuAcACCUCcACCTsT
224
AD-9665
831-849
GGAGGUGUAUCUCCUAGACTsT
225
GUCUAGGAGAUACACCUCCTsT
226
AD-9517
831-849
GGAGGuGuAucuccuAGAcTsT
227
GUCuAGGAGAuAcACCUCCTsT
228
AD-9643
833-851
AGGUGUAUCUCCUAGACACTsT
229
GUGUCUAGGAGAUACACCUTsT
230
AD-9610
0,04
833-851
AGGuGuAucuccuAGAcAcTsT
231
GUGUCuAGGAGAuAcACCUTsT
232
AD-9736
0,04
833-851
AfgGfuGfuAfuCfuCfcUfaGfaCfaCfTsT
233
p-gUfgUfcUfaGfgAfgAfuAfcAfcCfuTsT
234
AD-14681
833-851
AGGUfoUlAUfCfUfCfCfUfAGACfACfTsT
235
GUfGUfCfUfAGGAGAUfACfACfCnjfTsT
236
AD-14691
833-851
AgGuGuAuCuCcUaGaCaCTsT
237
p-gUfgUfcUfaGfgAfgAfuAfcAfcCfuTsT
238
AD-14701
833-851
AgGuGuAuCuCcUaGaCaCTsT
239
GUfGUfCfUfAGGAGAUfACfACiCnjfTsT
240
AD-14711
833-851
AfgGfuGruAfuCfuCfcUfaGfaCfaCfTsT
241
GUGUCuaGGagAUACAccuTsT
242
AD-14721
833-851
AGGUfGUfAUfCfUfOCaJfAGACfACfTsT
243
GUGUCuaGGagAUACAccuTsT
244
AD-14731
833-851
AgGuGuAuCuCcUaGaCaCTsT
245
GUGUCuaGGagAUACAccuTsT
246
AD-14741
833-851
GfcAfcCfcUfcAfuAfgGfcCruGfgAfTsT
247
p-uCfcAfgGfcCfuAfuGfaGfgGfuGfcTsT
248
AD-15087
833-851
GCfA CfCfCfUfCfA UfAGGCfCfU fGG ATsT
249
UfCfCfAGGCfCfUfAUfGAGGGUfGCfTsT
250
AD-15097
833-851
GcAcCcUcAuAgGcCuGgATsT
251
p-uCfcAfgGfcCfuAfuGfaGfgGfuGfcTsT
252
AD-15107
Положения в человеческой
рег.№ NM_ 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3r)1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи Р'-З1)1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрилта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
IC50B гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 nM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
833-851
GcAcCcUcAuAgGcCuGgATsT
253
UfCfCfAGGCfCfUfAUfGAGGGUfGCfTsT
254
AD-15117
833-85)
GfcAfcCfcUfcAfuAfgGfcCfuGfgAfTsT
255
UCCAGgcCUauGAGGGugcTsT
256
AD-15127
833-851
GCfACfCfCfUfCfAUfAGGCfCfUfGGATsT
257
UCCAGgcCUauGAGGGugcTsT
258
AD-15137
833-851
GcAcCcUcAuAgGcCuGgATsT
259
UCCAGgcCUauGAGGGugcTsT
260
AD-15147
836-854
UGUAUCUCCUAGACACCAGTsT
26 (
CVGGUGUCUAGGAGA UACATsT
262
AD-9516
836-854
uGuAucuccuAGAcAccAGTsT
263
CUGGUGUCuAGGAGAuAcATsT
264
AD-9642
105
840-858
UCUCCUAGACACCAGCAUATsT
265
UAUGCUGGUGUCUAGGAGATsT
266
AD-9562
840-858
ucuccuAGAcAccAGcAuATsT
267
uAUGCUGGUGUCuAGGAGATsT
268
AD-9688
4,20
840-858
UfcUfcCfiiAfgAfcAfcCfaGfcAfuAfTsT
269
p-uAfuGfcUfgGfuGtuCfuAfgGfaGfaTsT
270
AD-14677
840-858
UfCfUfCfCfUfAGACfACfCfAGCfAUfATsT
271
UfAUfGCfUfGGUrGUtCfUfAGGAGATsT
272
AD-14687
840-858
UcUcCuAgAcAcCaGcAuATsT
273
p-uAfuGfcUfgGruGfuCfuAfgGfaGfaTsT
274
AD-14697
840-858
UcUcCuAgAcAcCaGcAuATsT
275
UfAUfGCfUfGGUfGUfCfUfAGGAGATsT
276
AD-14707
840-858
UfcUfcCfuAafAfcAfcCfaGfcAfuAfTsT
277
UAUGCugGUguCUAGGagaTsT
278
AD-14717
840-858
UfCfUfCfCfUfAGACfACtCfAGCfAUfATsT
279
UAUGCugGUguCUAGGagaTsT
280
AD-14727
840-858
UcUcCuAgAcAcCaGcAuATsT
281
UAUGCugGUguCUAGGagaTsT
282
AD-14737
840-858
AfgGfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfTsT
283
p-cCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcCfuTsT
284
AD-15083
840-858
AGGCfCfUlGGAGUflJfUfAUfUfCfGGTsT
285
CfCKAAUfAAACmfCfCfAGGCrCfUfTsT
286
AD-15093
840-858
AgGcCuGgAgUuUaUuCgGTsT
287
p-cCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcCfuTsT
288
AD-15103
840-858
AgGcCuGgAgUuUaUuCgGTsT
289
CfCfGA A UfAAACnjlCfCfAGGCfCRlfTsT
290
AD-15ПЗ
840-858
AfgGfcCfuGfgAfgUfiiUfaUfuCfgGfTsT
291
CCGAAuaAAcuCCAGGccuTsT
292
AD-15123
840-858
AGCrCfCWrGGAGUmfUiAUfUfCfGGTsT
293
CCGAAuaAAcuCCAGGccuTsT
294
AD-15133
Положения в человеческой
пос-ти
рег.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи (5-31)1
SEQ ID
NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3')1
SEQ ID
NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
IC50B гепатоцитах
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM7HepG2
30 нМ/ HeLa
840-858
AgGcCuGgAgUuUaUuCgGTsT
295
CCGAAuaAAcuCCAGGccuTsT
296
AD-15143
841-859
CUCCUAGACACCAGCAUACTsT
297
GUAUGCUGGUGUCUAGGAGTsT
298
AD-9521
841-859
cuccuAGAcAccAGcAuAcTsT
299
GuAUGCUGGUGUCuAGGAGTsT
300
AD-9647
842-860
UCCUAGACACCAGCAUACATsT
301
UGUAUGCUGGUGUCUAGGATsT
302
AD-9611
842-860
uccuAGAcAccAGcAuAcATsT
303
UGu AUGCUGG UGUCuAGGATsT
304
AD-9737
843-861
CCUAGACACCAGCAUACAGTsT
305
CUGUAUGCUGGUGUCUAGGTsT
306
AD-9592
843-861
ccuAGAcAccAGcAuAcAGTsT
307
CUGuAUGCUGGUGUCuAGGTsT
308
AD-9718
847-865
GA CACCAGCA UACAGAG UGTsT
309
CACUCUGUAUGCUGGUGUCTsT
310
AD-9561
847-865
GAcAccAGcAuAcAGAGuGTsT
311
cACUCUGuAUGCUGGUGUCTsT
312
AD-9687
855-873
CAUACAGAGUGACCACCGGTsT
313
CCGGUGGUCACUCUGUAUGTsT
314
AD-9636
2,10
855-873
cAuAcAGAGuGAccAccGGTsT
315
CCGGUGGUcACUCUGuAUGTsT
316
AD-9762
0,40
860-878
AGAGUGACCACCGGGAAAUTsT
317
AUUUCCCGGUGGUCACUCUTsT
318
AD-9540
860-878
AGAGuGAccAccGGGAAAuTsT
319
AUUUCCCGGUGGUcACUCUTsT
320
AD-9666
861-879
GAGUGACCACCGGCAAAUCTsT
321
GAUUUCCCGGUGGUCACUCTsT
~322
AD-9535
861-879
GAGuGAccAccGGGAAAucTsT
323
GAUUUCCCGGUGGUcACUCTsT
324
AD-9661
863-881
GUGACCACCGGGAAAUCGATsT
325
UCGAUUUCCCGGUGGUCACTsT
326
AD-9559
863-881
GuGAccAccGGGAAAucGATsT
327
UCGAUUUCCCGGUGGUcACTsT
328
AD-9685
865-883
GACCACCGGGAAAUCGAGGTsT
329
CCUCGAUUUCCCGGUGGUCTsT
330
AD-9533
100
865-883
GAccAccGGGAAAucGAGGTsT
331
CCUCGAUUUCCCGGUGGUCTsT
"332
AD-9659
866-884
ACCACCGGGAAA UCGAGGGTsT
333
CCCUCGAUUUCCCGGUGGUTsT
334
AD-9612
122
866-884
AccAccGGG A AAucG AGGGTsT
335
CCCUCGAUUUCCCGGUGGUTsT
336
AD-9738
Положения в человеческой пос-ти рег.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи(5-3')1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой ierm(5'-3')l
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
IC50B гепатоцитах
собакоподобных обезьян (вМ)
100 HM/HepG2
HMfflepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
867-885
CCACCGGGAAAUCGAGGGCTsT
337
GCCCUCGAVUUCCCGGVGGTsT
338
AD-9557
867-885
ccAccGGGAAAucGAGGGcTsT
339
GCCCUCGAUUUCCCGGUGGTsT
340
AD-9683
875-893
AAAUCGAGGGCAGGGUCAUTsT
341
AUGACCCUGCCCUCGAUUUTsT
342
AD-
_9531__^
0,53
875-893
AAAucGAGGGcAGGGucAuTsT
343
AUGACCCUGCCCUCGAUUUTST
344
AD-9657
0,66
875-893
AfaAfuCfgAfgGfgCfaGfgGfoCfaUfTsT
345
p-aUfgAfcCfcUfgCfcCfuCfgAfuUfuTsT
346
AD-14673
875-893
AAAUfCfGAGGGCfAGGGUfCfAUfTsT
347
AUfGACfCfCfUfGCfCfCfUfCfGAUfUfUfTs T
348
AD-14683
875-893
AaAuCgAgGgCaGgGuCaUTsT
349
p-aUfgAfcCfcUfgCfcCfuCfgAfuUfuTsT
350
AD-14693
875-893
AaAuCgAgGgCaGgGuCaUTsT
351
АШОАСГСГСШЮСГСгСЮГСгаАиШШПз T
352
AD-14703
875-893
AfaAfuCfgAfgGfgCfaGfgGfuCfaUfTsT
353
AUGACccUGccCUCGAuuuTsT
354
AD-14713
875-893
AAAUfCfGAGGGCfAGGGUfCfAUfTsT
355
AUGACccUGccCUCGAuuuTsT
356
AD-14723
875-893
AaAuCgAgGgCaGgGuCaUTsT
357
AUGACccUGccCUCGAuuuTsT
358
AD-14733
875-893
CfgGfcAfcCfcUfcAfuAfgGfcCfuGfTsT
359
p-cAfgGfcCfuAruGfaGfgGfuGfcCfgTsT
360
AD-15079
875-893
CfGGCfACfCfCfUfCfAUfAGGCfCfUfGTsT
361
CfAGGCfCfUfAUfGAGGGUfGCfCfGTsT
362
AD-15089
875-893
CgGcAcCcUcAuAgGcCuGTsT
363
p-cAfgGfcCfuAfuGfaGfgGfijGfcCfgTsT
364
AD-
15099
875-893
CgGcAcCcUcAuAgGcCuGTsT
365
CfAGGCfEfUfAUfGAGGGUfGCfCfGTsT
366
AD-15109
875-893
CfgGfcAfcCfcUfcAfuAfgGfcCfuGfTsT
367
CAGGCcuAUgaGGGUGccgTsT
368
AD-
15119
875-893
CfGGCfACfCfCfUfCfAUfAGGCfCfUfGTsT
369
CAGGCcuAUgaGGGUGccgTsT
370
AD-15129
875-893
CgGcAcCcUcAuAgGcCuGTsT
371
CAGGCcuAUgaGGGUGccgTsT
372
AD-
15139
877-895
AUCGAGGGCAGGGUCAUGGTsT
373
CCAUGACCCUGCCCUCGA UTsT
374
AD-9542
160
877-895
AucGAGGGcAGGGucAuGGTsT
375
CcAUGACCCUGCCCUCGAIJTsT
376
AD-9668
878-896
cGAGGGcAGGGucAuGGucTsT
377
GACcAUGACCCUGCCCUCGTsT
378
AD-9739
109
Положения в человеческой
perJfc NM_ 174936
Последовательность смысловой цепи (5-3')^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3')1
SEQ ID
NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
1С50в гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ-' HeLa
880-898
GAGGGCAGGGUCAUGGUCATsT
379
UGACCAUGACCCUGCCCUCTsT
380
AD-9637
880-898
GAGGGcAGGGucAuGGucATsT
381
UGACcAUGACCCUGCCCUCTsT
382
AD-9763
882-900
GGGCAGGGUCAUGGUCACCTsT
383
GGUGACCAUGACCCUGCCCTsT
384
AD-9630
882-900
GGGcAGGGucAuGGucAccTsT
385
GGUGACcAUGACCCUGCCCTsT
386
AD-9756
885-903
CAGGGUCAUGGUCACCGACTsT
387
GUCGGUGACCAUGACCCUGTsT
388
AD-9593
885-903
cAGGGucAuGGucAccGAcTsT
389
GUCGGUGACcAUGACCCUGTsT
390
AD-9719
115
886-904
AGGGUCAUGGUCACCGACUTsT
391
AGUCGGUGACCAUGACCCUTsT
392
AD-9601
111
886-904
AGGGucAuGGucAccGAcuTsT
393
AGUCGGUGACcAUGACCCUTsT
394
AD-9727
118
892-910
AUGGUCACCGACUUCGAGATsT
395
UCUCGAAGUCGGUGACCAUTsT
396
AD-9573
1,60
892-910
AuGGucAccGAcuucGAGATsT
397
UCUCGAAGUCGGUGACcAUTsT
398
AD-9699
2,50
899-917
CCGACUUCGAGAAUGUGCCTT
399
GGCACAUUCUCGAAGUCGGTT
400
AD-15228
921-939
GGAGGACGGGACCCGCUUCTT
401
GAAGCGGGUCCCGUCCUCCTT
402
AD-15395
993-1011
CAGCGGCCGGGAUGCCGGCTsT
403
GCCGGCAUCCCGGCCGCUGTsT
404
AD-9602
126
993-1011
cAGcGGccGGGAuGccGGcTsT
405
GCCGGcAUCCCGGCCGCUGTsT
406
AD-9728
1020-1038
GGGUGCCAGCAUGCGCAGCTT
407
GCUGCGCAUGCUGGCACCCTT
408
AD-15386
1038-1056
CCUGCGCGUGCUCAACUGCTsT
409
GCAGUUGAGCACGCGCAGGTsT
410
AD-9580
112
1038-1056
ccuGcGcGuGcucAAcuGcTsT
411
GcAGUUGAGcACGCGcAGGTsT
412
AD-9706
1040-1058
UGCGCGUGCUCAACUGCCATsT
413
UGGCAGUUGAGCACGCGCATsT
414
AD-9581
1040-1058
uGcGcGuGcucAAcuGccATsT
415
UGGcAGUUGAGcACGCGcATsT
416
AD-9707
1042-1060
CGCGUGCUCAACUGCCAAGTsT
417
CUUGGCAGUUGAGCACGCGTsT
418
AD-9543
1042-1060
cGcGuGcucAAcuGccAAGTsT
419
CUUGGcAGUUGAGcACGCGTsT
420
AD-9669
Положения в человеческой
рег.№ NM174936
Последовательность смысловой цепи (5'-rf
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (в'-З')1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
1С50в гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM7HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
1053-1071
CUGCCAAGGGAAGGGCACGTsT
421
CGUGCCCUUCCCUUGGCAGTsT
422
AD-9574
1053-1071
cuGccAAGGGAAGGGcAcGTsT
423
CGUGCCCUUCCCUUGGcAGTsT
424
AD-9700
1057-1075
CAAGGGAAGGGCACGGUUATT
425
UAACCGUGCCCUUCCCUUGTT
426
AD-15320
1058-1076
AAGGGAAGGGCACGGUUAGTT
427
CUAACCGUGCCCUUCCCUUTT
428
AD-15321
1059-1077
AGGGAAGGGCACGGUUAGCTT
429
GCUAACCGUGCCCUUCCCUTT
430
AD-15199
1060-1078
GGGAAGGGCACGGUUAGCGTT
431
CGCUAACCGUGCCCUUCCCTT
432
AD-15167
1061-1079
GGAAGGGCACGGUUAGCGGTT
433
CCGCUAACCGUGCCCUUCCTT
434
AD-15164
1062-1080
GAAGGGCACGGUUAGCGGCTT
435
GCCGCUAACCGUGCCCUUCTT
436
AD-15166
1063-1081
AAGGGCACGGUUAGCGGCATT
437
UGCCGCUAACCGUGCCCUUTT
438
AD-15322
1064-1082
AGGGCACGGUUAGCGGCACTT
439
GUGCCGCUAACCGUGCCCUTT
440
AD-15200
1068-1086
CACGGUUAGCGGCACCCUCTT
441
GAGGGUGCCGCUAACCG UGTT
442
AD-15213
1069-1087
ACGGUUAGCGGCACCCUCATT
443
UGAGGGUGCCGCUAACCGUTT
444
AD-15229
1072-1090
GUUAGCGGCACCCUCAUAGTT
445
CUAUGAGGGUGCCGCUAACTT
446
AD-15215
1073-1091
UUAGCGGCACCCUCAUAGGTT
447
CCUAUGAGGGUGCCGCUAATT
448
AD-15214
101
1076-1094
GCGGCACCCUCAUAGGCCUTsT
449
AGGCCUAUGAGGGUGCCGCTsT
450
AD-9315
0,98
1079-1097
GCACCCUCAUAGGCCUGGATST
451
UCCAGGCCUAUGAGGGUGCTST
452
AD-9326
1085-1103
UCAUAGGCCUGGAGUUUAUTsT
453
AUAAACUCCAGGCCUAUGATsT
454
AD-9318
0,40
1090-1108
GGCCUGGAGUUUAUUCGGATsT
455
UCCGAAUAAACUCCAGGCCTsT
456
AD-9323
1091-1109
GCCUGGAGUUUAUUCGGAATsT
457
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
458
AD-9314
0,04
1091-1109
GccuGGAGuuuAuucGGAATsT
459
UUCCGAAuAAACUCcAGGCTsT
460
AD-10792
0,10
0,10
1091-1109
GccuGGAGuuuAuucGGAATsT
461
UUCCGAAUAACUCCAGGCTsT
462
AD-10796
0,1
0,1
Положения в человеческой
рег.№ МММ 74936
Последовательность смысловой цепи Г5Т-3")^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3')1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствугошей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 At HeLa
1093-1111
CUGGAGUUUAUUCGGAA A ATsT
463
UUUUCCGAAUAAACUCCAGTsT
464
AD-9638
101
1093-1 1 1 1
cuGGAGuuuAuucGGAAAATsT
465
UUUUCCGAAuAAACUCcAGTsT
466
AD-9764
112
1095-1113
GGAGUUUAUUCGGAAAAGCTsT
467
GCUUUUCCGAAUAAACUCCTsT
468
AD-9525
1095-11 13
GGAGuuuAuucGGAAAAGcTsT
469
GCUUUUCCGAAuAAACUCCTsT
470
AD-9651
1096-11 14
GAGUUUAUUCGGAAAAGCCTsT
471
GGCUUUUCCGAAUAAACUCTsT
472
AD-9560
1096-1114
GAGuuuAuucGGAAAAGccTsT
473
GGCUUUUCCGAAuAAACUCTsT
474
AD-9686
111
1100-1118
UUAUUCGGAAAAGCCAGCUTsT
475
AGCUGGCUUUUCCGAAUAATsT
476
AD-9536
157
1100-1118
uuAuucGGAAAAGccAGcuTsT
477
AGCUGGCUUUUCCGAAuAATsT
478
AD-9662
1154-1172
CCCUGGCGGGUGGGUACAGTsT
479
CUGUACCCACCCGCCAGGGTsT
480
AD-9584
1154-1172
cccuGGcGGGuGGGuAcAGTsT
481
CUGuACCcACCCGCcAGGGTsT
482
AD-9710
111
1155-1173
CCUGGCGGGUGGG UACAGCTT
483
GCUGUACCCACCCGCCAGGTT
484
AD-15323
1157-1175
UGGCGGGUGGGUACAGCCGTsT
485
CGGCUGUACCCACCCGCCATsT
486
AD-9551
1157-1175
uGGcGGGuGGGuAcAGccGTsT
487
CGGCUGuACCcACCCGCcATsT
488
AD-9677
1158-1176
GGCGGGUGGGUAC AGCCGCTT
489
GCGGCUGUACCCACCCGCCTT
490
AD-15230
1162-1180
GGUGGGUACAGCCGCGUCCTT
491
GGACGCGGCUGUACCCACCTT
492
AD-15231
1164-1182
UGGGUACAGCCGCGUCCUCTT
493
GAGGACGCGGCUGUACCCATT
494
AD-15285
1172-1190
GCCGCGUCCUCAACGCCGCTT
495
GCGGCGUUGAGGACGCGGCTT
496
AD-15396
1173-1191
CCGCGUCCUCAACGCCGCCTT
497
GGCGGCGUUGAGGACGCGGTT
498
AD-15397
1216-1234
GUCGUGCUGGUCACCGCUGTsT
499
CAGCGGUGACCAGCACGACTsT
500
AD-9600
112
1216-1234
GucGuGcuGGucAccGcuGTsT
501
cAGCGGUGACcAGcACGACTsT
502
AD-9726
1217-1235
UCGUGCUGGUCACCGCUGCTsT
503
GCAGCGGUGACCAGCACGATsT
~504
AD-9606
107
Положения в человеческой
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи ^'-З^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи^-З^
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскриггта при соответствугошей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
!C50 в
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
BM-HepG2
нМЖерС2
30 HW HeLa
1217-1235
ucGuGcuGGucAccGcuGcTsT
505
GcAGCGGUGACcAGcACGATsT
506
AD-9732
105
1223-1241
UGGUCACCGCUGCCGGCAATsT
507
UUGCCGGCAGCGGUGACCATsT
508
AD-
9633
1223-1241
uGGucAccGcuGccGGcAATsT
509
UUGCCGGcAGCGGUGACcATsT
510
AD-9759
111
1224-1242
GGUCACCGCUGCCGGCAACTsT
511
GUUGCCGGCAGCGGUGACCTsT
512
AD-9588
1224-1242
GGucAccGcuGccGGcAAcTsT
513
GUUGCCGGcAGCGGUGACCTsT
514
AD-9714
106
1227-1245
CACCGCUGCCGGCAACUUCTsT
515
GAAGUUGCCGGCAGCGGUGTsT
516
AD-9589
1227-1245
cAccGcuGccGGcAAcuucTsT
517
GAAGUUGCCGGcAGCGGUGTsT
518
AD-
9715
113
1229-1247
CCGCUGCCGGCAACUUCCGTsT
519
CGGAAGUUGCCGGCAGCGGTsT
520
AD-
9575
120
1229-1247
ccGcuGccGGcAAcuuccGTsT
521
CGGAAGUUGCCGGcAGCGGTsT
522
AD-9701
100
1230-1248
CGCUGCCGGCAACUUCCGGTsT
523
CCGGAAGUUGCCGGCAGCGTsT
524
AD-
9563
103
1230-1248
cGcuGccGGcAAcuuccGGTsT
525
CCGGAAGGUGCCGGcAGCG TsT
526
AD-9689
1231-1249
GCUGCCGGCAACUUCCGGGTsT
527
CCCGGAAGUUGCCGGCAGCTsT
528
AD-9594
1231-1249
GcuGccGGcAAcuuccGGGTsT
529
CCCGGAAGUUGCCGGcAGCTsT
530
AD-9720
1236-1254
CGGCAACUUCCGGGACGAUTsT
531
AUCGUCCCGGAAGUUGCCGTsT
532
AD-9585
1236-1254
cGGcAAcuuccGGGAcGAuTsT
533
AUCGUCCCGGAAGUUGCCGTsT
534
AD-9711
122
1237-1255
GGCAACUUCCGGGACGAUGTsT
535
СA UCGUCCCGGAAGUUGCCTsT
536
AD-9614
100
1237-1255
GGcAAcuuccGGGAcGAuGTsT
537
cAUCGUCCCGGAAGUUGCCTsT
538
AD-9740
198
1243-1261
UUCCGGGACGAUGCCUGCCTsT
539
GGCAGGCAUCGUCCCGGAATsT
540
AD-9615
116
1243-1261
uuccGGGAcGAuGccuGccTsT
~541
GGcAGGcAUCGUCCCGGAATsT
542
AD-9741
130
1248-1266
GGACGAUGCCUGCCUCUACTsT
543
G UAGAGGCAGGCA UCG UCCTsT
544
AD-9534
1248-1266
GGACGAUGCCUGCCUCUACTsT
545
GUAGAGGCAGGCAUCGUCCTsT
546
AD-9534
Положения в человеческой
perJfe KIMJ 74936
Последовательность смысловой цепи (5'-3*)'
SEQ ID
NO:
Последовательность антисмысловой цепи^-ЗО1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
1С50в гепатоштгах собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
1248-1266
GGAcGAuGccuGccucuAcTsT
547
GuAGAGGcAGGcAUCGUCCTsT
548
AD-9660
1279-1297
GCUCCCGAGGUCAUCACAGTT
549
CUGUGAUGACCUCGGGAGCTT
550
AD-15324
1280-1298
CUCCCGAGGUCAUCACAGUTT
551
ACUGUGAUGACCUCGGGAGTT
552
AD-15232
1281-1299
UCCCGAGGUCAUCACAGUUTT
553
AACUGUGAUGACCUCGGGATT
554
AD-
15233
1314-1332
CCAAGACCAGCCGGUGACCTT
555
GGUCACCGGCUGGUCUUGGTT
556
AD-15234
1315-1333
CAAGACCAGCCGGUGACCCTT
557
GGGUCACCGGCUGGUCUUGTT
558
AD-15286
109
1348-1366
ACCAACUUUGGCCGCUGUGTsT
559
CACAGCGGCCAAAGUUGGUTsT
560
AD-9590
122
1348-1366
AccAAcuuuGGccGcuGuGTsT
561
cAcAGCGGCcAAAGUUGGUTsT
562
AD-9716
114
1350-1368
CAACUUUGGCCGCUGUGUGTsT
563
CACACAGCGGCCAAAGUUGTsT
564
AD-9632
1350-1368
cAAcuuuGGcxGcuGuGuGTsT
565
cAcAcAGCGGCcAAAGUUGTsT
566
AD-9758
1360-1378
CGCUGUGUGGACCUCUUUGTsT
567
CAAAGAGGUCCACACAGCGTsT
568
AD-9567
1360-1378
cGcuGuGuGGAccucuuuGTsT
569
cAAAGAGGUCcAcAcAGCGTsT
570
AD-
9693
1390-1408
GACAUCAUUGGUGCCUCCATsT
571
UGGAGGCACCAAUGAUGUCTsT
572
AD-9586
104
1390-1408
GAcAucAuuGGuGccuccATsT
573
UGGAGGcACcAAUGAUGUCTsT
574
AD-9712
107
1394-1412
UCAUUGGUGCCUCCAGCGATsT
575
UCGCUGGAGGCACCAAUGATsT
576
AD-9564
120
1394-1412
ucAuuGGuGccuccAGcGATsT
577
UCGCUGGAGGcACcAAUGATsT
578
AD-9690
1417-1435
AGCACCUGCUUUGUGUCACTsT
579
GUGACACAAAGCAGG UGCUTsT
580
AD-9616
1417-1435
AGcAccuGcuuuGuGucAcTsT
581
GUGAcAcAAAGcAGGUGCUTsT
582
AD-9742
127
1433-1451
CACAGAGUGGGACAUCACATT
583
UGUGAUGUCCCACUCUGUGTT
584
AD-15398
1486-1504
AUGCUGUCUGCCGAGCCGGTsT
585
CCGGCUCGGCAGACAGCAUTsT
586
AD-9617
111
1486-1504
AuGcuGucuGccGAGccGGTsT
587
CCGGCUCGGcAGAcAGcAUTsT
588
AD-9743
104
Положения в человеческой пос-ти рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (З'-З1)^
SEQ
ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (5'-3)l
SEQ ID NO:
ЭЭсзнэчеяие дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскршгга при соответствующей кош1ентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
1С50в гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
1491-1509
GUCUGCCGAGCCGGAGCUCTsT
589
GAGCUCCGGCUCGGCAGACTsT
590
AD-9635
1491-1509
GucuGccGAGccGGAGcucTsT
591
GAGCUCCGGCUCGGcAGACTsT
592
AD-9761
1521-1539
GUUGAGGCAGAGACUGAUCTsT
593
GAUCAGUCUCUGCCUCAACTsT
594
AD-9568
1521-1539
G uuG AGGc AG AGAcuGAucTsT
595
GAUcAGUCUCUGCCUcAACTsT
596
AD-
9694
1527-1545
GCAGAGACUGAUCCACUUCTsT
597
GAAGUGGAUCAGUCUCUGCTsT
598
AD-9576
1527-1545
GcAGAGAcuGAuccAcuucTsT
599
GAAGUGGAUcAGUCUCUGCTsT
600
AD-9702
1529-1547
AGAGACUGAUCCACUUCUCTsT
601
GAGAAGUGGAUCAGUCUCUTsT
602
AD-9627
1529-1547
AGAGAcuGAuccAcuucucTsT
603
GAGAAGUGGAUcAGUCUCUTsT
604
AD-9753
127
1543-1561
UUCUCUGCCAAAGAUGUCATsT
605
UGACAUCUUUGGCAGAGAATsT
606
AD-9628
141
1543-1561
uucucuGccA AAG AuG ucATsT
607
UGAcAUCUUUGGcAGAGAATsT
608
AD-9754
1545-1563
CUCUGCCAAAGAUGUCAUCTsT
609
GAUGACAUCUUUGGCAGAGTsT
610
AD-9631
1545-1563
cucuGccAAAGAuGucAucTsT
611
GAUGAcAUCUUUGGcAGAGTsT
612
AD-9757
1580-1598
CUGAGGACCAGCGGGUACUTsT
613
AGUACCCGCUGGUCCUCAGTsT
614
AD-9595
1580-1598
cuGAGGAccAGcGGGuAcuTsT
615
AGuACCCGCUGGUCCUcAGTsT
616
AD-
9721
1581-1599
UGAGGACCAGCGGGUACUGTsT
617
CAGUACCCGCUGGUCCUCATsT
618
AD-9544
1581-1599
uGAGGAccAGcGGGuAcuGTsT
619
cAGuACCCGCUGGUCCUcATsT
620
AD-9670
1666-1684
ACUGUAUGGUCAGCACACUTT
621
AGUGUGCUGACCAUACAGUTT
622
AD-15235
1668-1686
UOUAUGGUCAGCACACUCGTT
623
CGAGUGUGCUGACCAUACATT
624
AD-15236
1669-1687
GUAUGGUCAGCACACUCGGTT
625
CCGAGUGUGCUGACCAUACTT
626
AD-15168
100
1697-1715
GG A UGGCCAC AGCCGUCGCTT
627
GCGACGGCUGUGGCCAUCCTT
628
AD-15174
1698-1716
GAUGGCCACAGCCGUCGCCTT
629
GGCGACGGCUGUGGCCAUCTT
630
AD-15325
Положения в человеческой пос-ти рег.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3")^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (З'-З1)'
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрита при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [KM]
Ю50в гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 нМ/Нер02
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
1806-1824
CAAGCUGGUOJGCCGGGCCTT
631
GGCCCGGCAGACCAGCUUGTT
632
AD-
15326
1815-1833
CUGCCGGGCCCACAACGCUTsT
633
AGCGUUGUGGGCCCGGCAGTsT
634
AD-9570
1815-1833
cuGccGGGcccAcAAcGcuTsT
635
AGCGUU GUGGGCCCGGc AG TsT
636
AD-9696
1816-1834
UGCCGGGCCCACAACGCUUTsT
637
AAGCGUUGUGGGCCCGGCATsT
638
AD-9566
1816-1834
uGccGGGcccAcAAcGcuuTsT
639
AAGCGUUGUGGGCCCGGcATsT
640
AD-9692
1818-1836
CCGGGCCCACAACGCUUUUTsT
641
AAAAGCGUUGUGGGCCCGGTsT
642
AD-9532
100
1818-1836
ccGGGcccAcAAcGcuuuuTsT
643
AAAAGCGUUGUGGGCCCGGTsT
644
AD-9658
102
1820-1838
GGGCCCACAACGCUUUUGGTsT
645
CCAAAAGCGUUGUGGGCCCTsT
646
AD-9549
1820-1838
GGGcccAcAAcGcuuuuGGTsT
647
CcAAAAGCGUUGUGGGCCCTsT
648
AD-9675
1840-1858
GG UGAGGGUGUCUACGCCATsT
649
UGGCGUAGACACCCUCACCTsT
650
AD-9541
1840-1858
GGuGAGGGuGucuAcGccATsT
651
UGGCGuAGAcACCCUcACCTsT
652
AD-9667
1843-1861
GAGGGUGUCUACGCCAUUGTsT
653
CAAUGGCGUAGACACCCUCTsT
654
AD-9550
1843-1861
GAGGGuGucuAcGccAuuGTsT
655
cAAUGGCGuAGAcACCCUCTsT
656
AD-9676
100
1861-1879
GCCAGGUGCUGCCUGCUACTsT
657
GUAGCAGGCAGCACCUGGCTsT
658
AD-9571
1861-1879
GccAGGuGcuGccuGcuAcTsT
659
GuAGcAGGcAGcACCUGGCTsT
660
AD-9697
1862-1880
CCAGGUGCUGCCUGCUACCTsT
661
GGUAGCAGGCAGCACCUGGTsT
662
AD-9572
1862-1880
ccAGGuGcuGccuGcuAccTsT
663
GGuAGcAGGcAGcACCUGGTsT
664
AD-9698
2008-2026
ACCCACAAGCCGCCUGUGCTT
665
GCACAGGCGGCUUGUGGGUTT
666
AD-15327
2023-2041
GUGCUGAGGCCACGAGGUCTsT
667
GACCUCGUGGCCUCAGCACTsT
668
AD-9639
2023-2041
GuGcuGAGGccAcGAGGucTsT
669
GACCUCGUGGCCUcAGcACTsT
670
AD-9765
2024-2042
UGCUGAGGCCACGAGGUCATsT
671
UGACCUCGUGGCCUCAGCATsT
672
AD-9518
0,60
Положения в человеческой
рег.№ NMJ 74936
Последовательность смысловой цепи (Э'-З1)1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскршгга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
IC50B гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 нМ/НерС-2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 ИМ/
HeLa
2024-2042
UGCUGAGGCCACGAGGUCATsT
673
UGACCUCGUGGCCUCAGCATsT
674
AD-9518
2024-2042
uGcuGAGGccAcGAGGucATsT
675
UGACCUCGUGGCCUcAGcATsT
676
AD-9644
2,60
2024-2042
UfgCfuGfaGfgCfcAfcGfaGfgUfcAfTsT
677
p-uGfaCfcUfcGfuGfgCfcUfcAfgCfaTsT
678
AD-14672
2024-2042
UfGCfUroAGGCrCfACfGAGGUfCfATsT
679
UfGACfCfUfCfGUfGGCfCfUfCfAGCfATsT
680
AD-14682
2024-2042
UgCuGaGgCcAcGaGgUcATsT
681
p-uGfaCfcUfcGfuGfgCfcUfcAfgCfaTsT
682
AD-14692
2024-2042
UgCuGaGgCcAcGaGgUcATsT
683
UfGACfCfUfCfGUfGGCfCfUfCfAGCfATsT
684
AD-14702
2024-2042
UfgCfuGfaGfgCfcAfcGfaGfgUfcAfTsT
685
UGACCucGUggCCUCAgcaTsT
686
AD-14712
2024-2042
UfGCfUfCAGGCfCfACfGAGGUfCfATsT
687
UGACCucGUggCCUCAgcaTsT
688
AD-14722
2024-2042
UgCuGaGgCcAcGaGgUcATsT
689
UGACCucGUggCCUCAgcaTsT
690
AD-14732
2024-2042
GfuGfgUfcAfgCfgGfcCfgGfgAfuGfTsT
691
p-cAfuCfcCfgGfcCfgCfuGfaCfcAfcTsT
692
AD-15078
2024-2042
GUfGGUfCfAGCfGGCfCfGGGAUfGTsT
693
CfAUfCfCfCfGGCfCfGCfUfGACfCfACfTsT
694
AD-15088
2024-2042
GuGgUcAgCgGcCgGgAuGTsT
695
p-cAfuCfcCfgGfcCfgCfuGfaCfcAfcTsT
696
AD-15098
2024-2042
GuGgUcAgCgGcCgGgAuGTsT
697
CfAUfCfCfCfGGCfCfGCfUfGACfCfACfTsT
698
AD-15108
2024-2042
GfuGfgUfcAfgCfgGfcCfgGfgAfuGfTsT
699
CAUCCcgGCcgCUGACcacTsT
700
AD-15118
2024-2042
GUfGGUfCfAGCfGGCfCfGGGAUfGTsT
701
CAUCCcgGCcgCUGACcacTsT
702
AD-15128
2024-2042
GuGgUcAgCgGcCgGgAuGTsT
703
CAUCCcgGCcgCUGACcacTsT
704
AD-15138
2030-2048
GGCCACGAGGUCAGCCCAATT
705
UUGGGCUGACCUCGUGGCCTT
706
AD-15237
2035-2053
CGAGG UCAGCCCAACCAGUTT
707
ACUGGUUGGGCUGACCUCGTT
708
AD-15287
2039-2057
GUCAGCCCAACCAGUGCGUTT
709
ACGCACUGGUUGGGCUGACTT
710
AD-15238
2041-2059
CAGCCCAACCAGUGCGUGGTT
711
CCACGCACUGGUUGGGCUGTT
712
AD-15328
2062-2080
CACAGGGAGGCCAGCAUCCTT
713
GGAUGCUGGCCUCCCUGUGTT
714
AD-15399
Положения в человеческой
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (б'-З*)'
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-351
SEQ ID
NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [HM]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 ffM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
2072-2090
CCAGCAUCCACGCUUCCUGTsT
715
CAGGAAGCGUGGAUGCUGGTsT
716
AD-9582
2072-2090
ccAGcAuccAcGcuuccuGTsT
717
cAGGAAGCGUGGAUGCUGGTsT
718
AD-9708
2118-2136
AGUCAAGGAGCAUGGAAUCTsT
719
GAUUCCAUGCUCCUUGACUTsT
720
AD-9545
2118-2136
AGucAAGGAGcAuGGAAucTsT
721
GAUUCcAUGCUCCUUGACUTsT
722
AD-9671
2,50
2118-2136
AfgUfcAfaGfgAfgCfaUfgGfaAfuCfTsT
723
p-gAfuUfcCfaUfgCfuCfcUfuGfaCfuTsT
724
AD-14674
2118-2136
AGUfCfAAGGAGCfAUfGGAAUfCfTsT
725
GAUfUfCfCfAUfGCfUfCfCfUfUfGACfUfTs
726
AD-14684
2118-2136
AgUcAaGgAgCaUgGaAuCTsT
727
p-gAfuUfcCfaUfgCtuCfcUfuGfaCfuTsT
728
AD-14694
2118-2136
AgUcAaGgAgCaUgGaAuCTsT
729
GAU fUfCfCfAUfGCfUfCfCfUfUfG ACfUfTs
730
AD-14704
2118-2136
AfgUfcAfaGfgAfgCfaUfgGfaAfuCfTsT
731
GAU UCcaUGcuCCUUGacuTsT
732
AD-14714
2118-2136
AGUfCfAAGGAGCfAUfGGAAUfCfTsT
733
GAUUCcaUGcuCCUUGacuTsT
734
AD-14724
2118-2136
AgUcAaGgAgCaUgGaAuCTsT
735
GAUUCcaUGcuCCUUGacuTsT
736
AD-14734
2118-2136
GfcGfgCfaCfcCfuCfaUfaGfgCfcUfTsT
737
p-aGfgCfcU &UfgAfgGfgUfgCfcGfcTsT
738
AD-15080
2118-2136
GCfGGCfACfCfCfUfCfAUfAGGCfCfUfTsT
739
AGGCfCfUfAUfGAGGGUfGCfCfGOTsT
740
AD-15090
2118-2136
GcGgCaCcCuCaUaGgCcUTsT
741
p-aGfgCfcUfeUfgAfgGfgUfgCfcGfcTsT
742
AD-15100
2)18-2136
GcGgCaCcCuCaUaGgCcUTsT
743
AGGCfCfUfAUfGAGGGUfGCfCfGCfTsT
744
AD-15110
2118-2136
GfcGfgCfaCfcCfuCfaUfaGfgCfcUfTsT
745
AGGCCuaUGagGGUGCcgcTsT
746
AD-15120
2118-2136
GCfGGCfACfCfCfUfCfAUfAGGCfCfUfTsT
747
AGGCCuaUGagGGUGCcgcTsT
748
AD-15130
2118-2)36
GcGgCaCcCuCaUaGgCcUTsT
749
AGGCCuaUGagGGUGCcgcTsT
750
AD-15140
2122-2140
AAGGAGCAUGGAAUCCCGGTsT
751
CCGGGAUUCCAUGCUCCUUTsT
752
AD-9522
2122-2140
AAGGAGcAuGGAAucccGGTsT
753
CCGGGAUUCcAUGCUCCUUTsT
754
AD-9648
2123-2141
AGGAGCAUGGAAUCCCGGCTsT
755
GCCGGGAUUCCAUGCUCCUTsT
756
AD-9552
Положения в человеческой
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-30'
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3')1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
1С50в
собакоподобных обезьян
(DM)
100 HM7HepG2
HM7HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
2123-2141
AGGAGcAuGGAAucccGGcTsT
757
GCCGGGAUUCCAUGCUCCUTsT
758
AD-9678
2125-2143
GAGCAUGGAAUCCCGGCCCTsT
759
GGGCCGGGAUUCCAUGCUCTsT
760
AD-9618
2125-2143
GAGcAuGGAAucccGGcccTsT
761
GGGCCGGGAUUCcAUGCUCTsT
762
AD-9744
2230-2248
GCCUACGCCGUAGACAACATT
763
UGUUGUCUACGGCGUAGGCTT
764
AD-15239
2231-2249
CCUACGCCGUAGACAACACTT
765
GUGUUGUCUACGGCGUAGGTT
766
AD-15212
2232-2250
CUACGCCGUAGACAACACGTT
767
CGUGUUGUCUACGGCGUAGTT
768
AD-15240
2233-2251
UACGCCGUAGACAACACGUTT
769
ACGUGUUGUCUACGGCGUATT
770
AD-15177
2235-2253
CGCCGUAGACAACACGUG UTT
771
ACACGUGUUGUCUACGGCGTT
772
AD-15179
2236-2254
GCCGUAGACAACACGUGUGTT
773
CACACGUGUUGUCUACGGCTT
774
AD-15180
2237-2255
CCGUAGACAACACGUGUGUTT
775
ACACACGUGUUG UCUACGGTT
776
AD-15241
2238-2256
CGUAGACAACACGUGUGUATT
777
UACACACGUGUUG UCUACGTT
778
AD-15268
2240-2258
UAGACAACACGUGUGUAGUTT
779
ACUACACACGUGUUGUCUATT
780
AD-15242
2241-2259
AGACAACACGUGUGUAGUCTT
781
GACUACACACGUGUUGUCUTT
782
AD-15216
2242-2260
GACAACACGUGUGUAGUCATT
783
UGACUACACACGUGUUGUCTT
784
AD-15176
2243-2261
ACAACACGUGUGUAGUCAGTT
785
CUGACUACACACGUGUUGUTT
786
AD-15181
2244-2262
CAACACGUGUGUAGUCAGGTT
787
CCUGACUACACACGUGUUGTT
788
AD-15243
2247-2265
CACGUGUGUAGUCAGGAGCTT
789
GCUCCUGACUACACACGUGTT
790
AD-15182
2248-2266
ACGUGUGUAGUCAGGAGCCTT
791
GGCUCCUGACUACACACGUTT
792
AD-15244
2249-2267
CGUGUGUAGUCAGGAGCCGTT
793
CGGCUCCUGACUACACACGTT
794
AD-15387
2251-2269
UGUGUAGUCAGGAGCCGGGTT
795
CCCGGCUCCUGACUACACATT
796
AD-15245
2257-2275
GUCAGGAGCCGGGACGUCATsT
797
UGACGUCCCGGCUCCUGACTsT
798
AD-9555
Положения в человеческой
рег.№ NMJ 74936
Последовательность смысловой цепи (З'-З1)1
SEQ
ID NO:
Последовательность антисмысловой цегш(5'-301
SEQ ID
NO:
ОбозначениЕ дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствутощей концентрации киРНКв клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
H_M/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
2257-2275
GucAGGAGccGGGAcGucATsT
799
UGACGUCCCGGCUCCUGACTsT
800
AD-9681
2258-2276
UCAGGAGCCGGGACGUCAGTsT
801
CUGACGUCCCGGCUCCUGATsT
802
AD-9619
2258-2276
ucAGGAGccGGGAcGucAGTsT
803
CUGACGUCCCGGCUCCUGATsT
804
AD-9745
2259-2277
CAGGAGCCGGGACGUCAGCTsT
805
GCUGACGUCCCGGCUCCUGTsT
806
AD-9620
2259-2277
cAGGAGccGGGAcGucAGcTsT
807
GCUGACGUCCCGGCUCCUGTsT
808
AD-9746
2263-2281
AGCCGGGACGUCAGCACUATT
809
UAGUGCUGACGUCCCGGCUTT
810
AD-15288
2265-2283
CCGGGACGUCAGCACUACATT
811
UGUAGUGCUGACGUCCCGGTT
812
AD-15246
2303-2321
CCGUGACAGCCGUUGCCAUTT
813
A UGGCAACGGCUGUCACGGTT
814
AD-15289
2317-2335
GCCAUCUGCUGCCGGAGCCTsT
815
GGCUCCGGCAGCAGAUGGCTsT
816
AD-9324
2375-2393
CCCAUCCCAGGAUGGGUGUTT
817
ACACCCAUCCUGGGAUGGGTT
818
AD-15329
103
2377-2395
СA UCCCAGGAUGGGUG UC UTT
819
AGACACCCAUCCUGGGAUGTT
820
AD-15330
2420-2438
AGCUUUAAAAUGGUUCCGATT
821
UCGGAACCAUUUUAAAGCUTT
822
AD-15169
2421-2439
GCUUUAAAAUGGUUCCGACTT
823
GUCGGAACCAUUUUAAAGCTT
824
AD-15201
2422-2440
CUUUAAAAUGGUUCCGACUTT
825
AGUCGGAACCAUUUUAAAGTT
826
AD-15331
2423-2441
UUUAAAAUGGUUCCGACUUTT
827
AAGUCGGAACCAUUUUAAATT
828
AD-15190
2424-2442
UUAAAAUGGUUCCGACUUGTT
829
CAAGUCGGAACCAUUUUAATT
830
AD-15247
2425-2443
UAAAA UGGUUCCGACUUGUTT
831
ACAAGUCGGAACCAUUUUATT
832
AD-15248
2426-2444
AAAAUGGUUCCGACUUGUCTT
833
GACAAGUCGGAACCA U U UUTT
834
AD-15175
2427-2445
AAAUGGUUCCGACUUGUCCTT
835
GGACAAGUCGGAACCAUUUTT
836
AD-15249
2428-2446
AAUGGUUCCGACUUGUCCCTT
837
GGGAC AAGUCGGAACCA UUTT
838
AD-15250
2431-2449
GGUUCCGACUUGUCCCUCUTT
839
AGAGGGACAAGUCGGAACCTT
840
AD-15400
Положения в человеческой
рег.№ NMJ 74936
Последовательность смысловой цепи (5'-зУ
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи^-З^
SEQ ID NO:
Обозначен!* дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскриггта при соответствугошей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [HMJ
1С50в
собакоподобных обезьян (нМ)
100 нМ/Нер02
HMHepG2
HM7HepG2
30 нМ/ HeLa
2457-2475
CUCCAUGGCCUGGCACGAGTT
841
CUCGUGCCAGGCCAUGGAGTT
842
AD-15332
2459-2477
CCAUGGCCUGGCACGAGGGTT
843
CCCUCG UGCCAGGCCAUGGTT
844
AD-15388
2545-2563
GAACUCACUCACUCUGGGUTT
845
ACCCAGAGUGAGUGAGUUCTT
846
AD-15333
2549-2567
UCACUCACUCUGGGUGCCUTT
847
AGGCACCCAGAGUGAGUGATT
848
AD-15334
2616-2634
UUUCACCAUUCAAACAGGUTT
849
ACCUGUUUGAAUGG UGAAATT
850
AD-15335
2622-2640
CAUUCAAACAGGUCGAGCUTT
851
AGCUCGACCUGUUUGAAUGTT
852
AD-15183
2623-2641
A UUCAAACAG GUCGAGCUGTT
853
CAGCUCGACCUGUUUGAAUTT
854
AD-15202
2624-2642
UUCAAACAGGUCGAGCUGUTT
855
ACAGCUCGACCUGUUUGAATT
856
AD-15203
2625-2643
UCAAACAGGUCGAGCUGUGTT
857
CACAGCUCGACCUGUUUGATT
858
AD-15272
2626-2644
CAAACAGGUCGAGCUGUGCTT
859
GCACAGCUCGACCUGUUUGTT
860
AD-15217
2627-2645
AAACAGGUCGAGCUGUGCUTT
861
AGCACAGCUCGACCUGUUUTT
862
AD-15290
2628-2646
AACAGGUCGAGCUGUGCUCTT
863
GAGCACAGCUCGACCUGUUTT
864
AD-15218
2630-2648
CAGGUCGAGCUGUGCUCGGTT
865
CCGAGCACAGCUCGACCUGTT
866
AD-15389
2631-2649
AGGUCGAGCUGUGCUCGGGTT
867
CCCGAGCACAGCUCGACCUTT
868
AD-15336
2633-2651
GUCGAGCUGUGCUCGGGUGTT
869
CACCCGAGCACAGCUCGACTT
870
AD-15337
2634-2652
UCGAGCUGUGCUCGGGUGCTT
871
GCACCCGAGCACAGCUCGATT
872
AD-15191
2657-2675
AGCUGCUCCCAAUGUGCCGTT
873
CGGCACAUUGGGAGCAGCUTT
874
AD-15390
2658-2676
GCUGCUCCCAAUGUGCCGATT
875
UCGGCACAUUGGGAGCAGCTT
876
AD-15338
2660-2678
UGCUCCCAAUGUGCCGAUGTT
877
CA UCGGCACA UUGGGAGCATT
878
AD-15204
2663-2681
UCCCAAUGUGCCGAUGUCCTT
879
GGACAUCGGCACAUUGGGATT
880
AD-15251
2665-2683
CCAAUGUGCCGAUGUCCGUTT
881
ACGGACAUCGGCACAUUGGTT
882
AD-15205
Положения в человеческой
рег_№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи Р'-ЗО1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи <5'-30>
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрилга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HcpG2 [нМ]
IC50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HMVHepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
2666-2684
CAAUGUGCCGAUGUCCGUGTT
883
CACGGACAUCGGCACAUUGTT
884
AD-15171
2667-2685
AAUGUGCCGAUGUCCGUGGTT
885
CCACGGACAUCGGCACAUUTT
886
AD-15252
2673-2691
CCGAUGUCCGUGGGCAGAATT
887
UUCUGCCCACGGACAUCGGTT
888
AD-15339
2675-2693
GAUGUCCGUGGGCAGAAUGTT
889
CAUUCUGCCCACGGACAUCTT
890
AD-15253
2678-2696
GUCCGUGGGCAGAAUGACUTT
891
AGUCAUUCUGCCCACGGACTT
892
AD-15340
2679-2697
UCCGUGGGCAGAAUGACUUTT
893
AAGUCAUUCUGCCCACGGATT
894
AD-15291
2683-2701
UGGGCAGAAUGACUUUUAUTT
895
AUAAAAGUCAUUCUGCCCATT
896
AD-15341
2694-2712
ACUUUUAUUGAGCUCUUGUTT
897
ACAAGAGCUCAAUAAAAGUTT
898
AD-15401
2700-2718
AUUGAGCUCUUGUUCCGUGTT
899
CACGGAACAAGAGCUCAAUTT
900
AD-15342
2704-2722
AGCUCUUGUUCCGUGCCAGTT
901
CU GGCACGGAACAAGAGCUTT
902
AD-15343
2705-2723
GCUCUUGUUCCGUGCCAGGTr
903
CCUGGCACGGAACAAGAGCTT
904
AD-15292
2710-2728
UGUUCCGUGCCAGGCAUUCTT
905
GAAUGCCUGGCACGGAACATT
906
AD-15344
2711-2729
GUUCCGUGCCAGGCAUUCATT
907
UGAAUGCCUGGCACGGAACTT
908
AD-15254
2712-2730
UUCCGUGCCAGGCAUUCAATT
909
UUGAAUGCCUGGCACGGAATT
9)0
AD-15345
2715-2733
CGUGCCAGGCAUUCAAUCCTT
91!
GGAUUGAAUGCCUGGCACGTT
912
AD-15206
2716-2734
GUGCCAGGCAUUCAAUCCUTT
913
AGGAUUGAAUGCCUGGCACTT
914
AD-15346
2728-2746
CAAUCCUCAGGUCUCCACCTT
915
GGUGGAGACCUGAGGAUUGTT
916
AD-15347
2743-2761
CACCAAGGAGGCAGGAUUCTsT
917
GAAUCCUGCCUCCUUGGUGTsT
918
AD-9577
2743-2761
с АссА AGGAGGcAGG AuucTsT
919
GAAUCCUGCCUCCUUGGUGTsT
920
AD-9703
2743-2 761
CfaCfcAfaGfgAfgGfcAfgGfaUfuCfTsT
92!
p-gAfaUfcCfuGfcCfuCfcUfuGfgUfgTsT
922
AD-14678
2743-2761
CfACfCfAAGGAGGCfAGGAUfUfCfTsT
923
GAAUfCfCRJfGCfCfUfCiCfUfUfGGUfGTs
924
AD-14688
Положения в человеческой
рег.№ NM174936
Последовательность смысловой цепи (У-Зг^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3^
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
1С50в
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HNMiepG2
30 нМ/ HeLa
2743-2 761
CaCcAaGgAgGcAgGaUuCTsT
925
p-gAfaUfcCfuGfcCfuCfcUfuGfgUfgTsT
926
AD-14698
2743-2761
CaCcAaGgAgGcAgGaUuCTsT
927
GAAUfCfCftJfGCfCflJfCfCflJfUfGGUfGTs
928
AD-14708
2743-2761
CfaCfcAfaGfgAfgGfcAfgGfaUfuCfTsT
929
GAAUCcuGCcuCCUUGgugTsT
930
AD-14718
2743-2761
CfACfCfAAGGAGGCfAGGA UfUfCfT sT
931
GAAUCcuGCcuCCUUGgugTsT
932
AD-14728
2743-2761
CaCcAaGgAgGcAgGaUuCTsT
933
GAAUCcuGCcuCCUUGgugTsT
934
AD-14738
2743-2761
GfgCfcUfgGfaGfuUfuAfuUfcGfgAfTsT
935
p-uCfcGfaATuAfaAfcUfcCfaGfgCfcTsT
936
AD-15084
2743-2761
C 937
UfCfCfGA A UfAAACfUfCfCfAGGClCfTsT
938
AD-15094
2743-2761
GgCcUgGaGuUuAuUcGgATsT
939
p-uCfcGfaAtuAfaAfcUfcCfaGfgCfcTsT
940
AD-15104
2743-2761
GgCcUgGaGuUuAuUcGgATsT
941
UfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfCfTsT
942
AD-15114
2743-2761
GfgCfcUfgGfaGfuUfuAfuUfcGfgAfTsT
943
UCCGAauAAacUCCAGgccTsT
944
AD-
15124
2743-2761
GGCfCfUrGGAGUfUfUfAUfUfCfGGATsT
945
UCCGAauAAacUCCAGgccTsT
946
AD-15134
2743-2761
GgCcUgGaGuUuAuUcGgATsT
947
UCCGAauAAacUCCAGgccTsT
948
AD-15144
2753-2771
GCAGGAUUCUUCCCAUGGATT
949
UCCAUGGGAAGAAUCCUGCTT
950
AD-15391
2794-2812
UGCAGGGACAAACAUCGUUTT
951
AACGAUGUUUGUCCCUGCATT
952
AD-15348
2795-2813
GCAGGGACAAACAUCGUUGTT
953
CAACGAUGUUUGUCCCUGCTT
954
AD-15349
2797-2815
AGGGACAAACAUCGUUGGGTT
955
CCCAACGAUGUUUGUCCCUTT
956
AD-15170
2841-2859
CCCUCAUCUCCAGCUAACUTT
957
AGUUAGCUGGAGAUGAGGGTT
958
AD-15350
2845-2863
CAUCUCCAGCUAACUGUGGTT
959
CCACAGUUAGCUGGAGAUGTT
960
AD-15402
2878-2896
GCUCCCUGAUUAAUGGAGGTT
961
CCUCCAUUAAUCAGGGAGCTT
962
AD-15293
2881-2899
CCCUGAUUAAUGGAGGCUUTT
Г 963
AAGCCUCCAUUAAUCAGGGTT
964
AD-15351
2882-2900
CCUGAUUAAUGGAGGCUUATT
965
UAAGCCUCCAUUAAUCAGGTT
966
AD-15403
Положения в человеческой
пос-ти
рсг.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (5-301
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [HMJ
1С50в гепатоцитах собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 вМ/ HeLa
2884-2902
UGAUUAAUGGAGGCUUAGCTT
967
GCUAAGCCUCCAUUAAUCATT
968
AD-15404
2885-2903
GAUUAAUGGAGGCUUAGCUTT
969
AGCUAAGCCUCCAUUAAUCTT
970
AD-15207
2886-2904
AUUAAUGGAGGCUUAGCUUTT
971
AAGCUAAGCCUCCAUUAAUTT
972
AD-15352
2887-2905
UUAAUGGAGGCUUAGCUUUTT
973
AAAGCUAAGCCUCCAUUAATT
974
AD-15255
2903-2921
UUUCUGGA UGGCA UCUAGCTsT
975
GCUAGAUGCCAUCCAGAAATsT
976
AD-
9603
123
2903-2921
uuucuGGAuGGcAucuAGcTsT
977
GCuAGAUGCcAUCcAGAAATsT
978
AD-9729
2904-2922
UUCUGGAUGGCAUCUAGCCTsT
979
GGCUAGAUGCCAUCCAGAATsT
980
AD-9599
139
2904-2922
uucuGGAuGGcAucuAGccTsT
981
GGCuAGAUGCcAUCcAGAATsT
982
AD-9725
2905-2923
UCUGGAUGGCAUCUAGCCATsT
983
UGGCUAGAUGCCAUCCAGATsT
984
AD-9621
2905-2923
ucuGGAuGGcAucuAGccATsT
985
UGGCuAGAUGCcAUCcAGATsT
986
AD-9747
2925-2943
AGGCUGGAGACAGGUGCGCTT
987
GCGCACCUGUCUCCAGCCUTT
988
AD-15405
2926-2944
GGCUGGAGACAGGUGCGCCTT
989
GGCGCACCUGUCUCCAGCCTT
990
AD-15353
2927-2945
GCUGGAGACAGGUGCGCCCTT
991
GGGCGCACCUGUCUCCAGCTT
992
AD-15354
2972-2990
UUCCUGAGCCACCUUUACUTT
993
AGUAAAGGUGGCUCAGGAATT
994
AD-15406
2973-2991
UCCUGAGCCACCUU UACUCTT
995
GAGUAAAGGUGGCUCAGGATT
996
AD-15407
2974-2992
CCUGAGCCACCUUUACUCUTT
997
AGAGUAAAGGUGGCUCAGGTT
998
AD-15355
2976-2994
UGAGCCACCUUUACUCUGCTT
999
GCAGAGUAAAGGUGGCUCATT
1000
AD-15356
2978-2996
AGCCACCUUUACUCUGCUCTT
1001
GAGCAGAGUAAAGGUGGCUTT
1002
AD-15357
2981-2999
CACCUUUACUCUGCUCUAUTT
1003
AUAGAGCAGAGUAAAGGUGTT
1004
AD-15269
2987-3005
UACUCUGCUCUAUGCCAGGTsT
1005
CCUGGCAUAGAGCAGAGUATsT
1006
AD-9565
2987-3005
uAcucuGcucuAuGccAGGTsT
1007
CCUGGcAuAGAGcAGAGuATsT
1008
AD-9691
Положения в человеческой
рег.№ NMJ74936
Последовательность смысловой цепи (5-301
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи^'-ЗО1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНХ-транскриггга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
1С50в гепатоцитах
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
2998-3016
AUGCCAGGCUGUGCUAGCATT
1009
UGCUAGCACAGCCUGGCAUTT
1010
AD-15358
3003-3021
AGGCUGUGCUAGCAACACCTT
1011
GGUGUUGCUAGCACAGCCUTT
1012
AD-15359
~ 24
3006-3024
CUGUGCUAGCAACACCCAATT
1013
UUGGGUGUUGCUAGCACAGTT
1014
AD-15360
3010-3028
GCUAGCAACACCCAAAGGUTT
1015
ACCUUUGGGUGUUGCUAGCTT
1016
AD-15219
3038-3056
GGAGCCAUCACCUAGGAC UTT
1017
AGUCCUAGGUGAUGGCUCCTT
1018
AD-15361
3046-3064
CACCUAGGACUGACUCGGCTT
1019
GCCGAGUCAGUCCUAGGUGTT
1020
AD-15273
3051-3069
AGGACUGACUCGGCAGUGUTT
1021
ACACUGCCGAGUCAGUCCUTT
1022
AD-15362
3052-3070
GGACUGACUCGGCAGUGUGTT
1023
CACACUGCCGAGUCAGUCCTT
1024
AD-15192
^20~"
3074-3092
UGGUGCAUGCACUGUCUCATT
1025
UGAGACAGUGCAUGCACCATT
1026
AD-15256
3080-3098
AUGCACUGUCUCAGCCAACTT
1027
GUUGGCUGAGACAGUGCA UTT
1028
AD-15363
3085-3103
CUGUCUCAGCCAACCCGCUTT
1029
AGCGGGUUGGCUGAGACAGTT
1030
AD-15364
3089-3107
CUCAGCCAACCCGCUCCACTsT
1031
GUGGAGCGGGUUGGCUGAGTsT
1032
AD-9604
3089-3107
cucAGccAAcccGcuccAcTsT
1033
GUGGAGCGGGUUGGCUGAGTsT
1034
AD-9730
3093-3111
GCCAACCCGCUCCACUACCTsT
1035
GGUAGUGGAGCGGGUUGGCTsT
1036
AD-9527
3093-3111
GccAAcccGcuccAcuAccTsT
1037
GGuAGUGGAGCGGGUUGGCTsT
1038
AD-9653
3096-31 14
AACCCGCUCCACUACCCGGTT
1039
CCGGGUAGUGGAGCGGGUUTT
1040
AD-15365
3099-3117
CCGCUCCACUACCCGGCAGTT
1041
CUGCCGGGUAGUGGAGCGGTT
1042
AD-15294
3107-3125
CUACCCGGCAGGGUACACATT
1043
UGUGUACCCUGCCGGGUAGTT
1044
AD-15173
3108-3126
UACCCGGCAGGGUACACAUTT
1045
AUGUGUACCCUGCCGGGUATT
1046
AD-15366
3109-3127
ACCCGGCAGGGUACACAUUTT
1047
AAUGUGUACCCUGCCGGGUTT
1048
AD-15367
3110-3128
CCCGGCAGGGUACACAUUCTT
1049
GAAUGUGUACCCUGCCGGGTT
1050
AD-15257
Положения в человеческой
рег.Х" NMJ74936
Последовательность смысловой цепи (З'-З1)1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5 <-3')1
SEQ
ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскриггга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [нМ]
IC50B гепатоцитах
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM7HepG2
нМ/НерС-2
30 нМ/ HeLa
3112-3130
CGGCAGGGUACACAUUCGCTT
1051
GCGAAUGUGUACCCUGCCGTT
1052
AD-15184
3114-3132
GCAGGGUACACAUUCGCACTT
1053
GUGCGAAUGUGUACCCUGCTT
1054
AD-15185
3115-3133
CAGGGUACACAUUCGCACCTT
1055
GGUGCGAAUGUGUACCCUGTT
1056
AD-15258
3116-3134
AGGGUACACAUUCGCACCCTT
1057
GGGUGCGAAUGUGUACCCUTT
1058
AD-15186
3196-3214
GGAACUGAGCCAGAAACGCTT
1059
GCGUUUCUGGCUCAGUUCCTT
1060
AD-15274
3197-3215
GAACUGAGCCAGAAACGCATT
1061
UGCGUUUCUGGCUCAGUUCTT
1062
AD-15368
3198-3216
AACUGAGCCAGAAACGCAGTT
1063
CUGCGUUUCUGGCUCAGUUTT
1064
AD-15369
3201-3219
UGAGCCAGAAACGCAGAUUTT
1065
AAUCUGCGUUUCUGGCUCATT
1066
AD-15370
3207-3225
AGAAACGCAGAUUGGGCUGTT
1067
CAGCCCAAUCUGCGUUUCUTT
1068
AD-15259
3210-3228
AACGCAGAUUGGGCUGGCUTT
1069
AGCCAGCCCAAUCUGCGUUTT
1070
AD-15408
3233-3251
AGCCAAGCCUCUXJCUUACUTsT
1071
AGUAAGAAGAGGCUUGGCUTsT
1072
AD-9597
0,04
3233-3251
AGccAAGccucuucuuAcuTsT
1073
AGuAAGAAGAGGCUUGGCUTsT
1074
AD-9723
3233-3251
AfgCfcAfaGfcCfijCfuUfcUfuAfcUfTsT
1075
p-aGfuAfaGfaAfgAfgGfcUfuGfgCfuTsT
1076
AD-14680
3233-3251
AGCiCfAAGCrcWfCWaifCfUfUfACaifTsT
1077
AGUfAAGAAGAGGCfUfUfGGCfUfTsT
1078
AD-14690
3233-3251
AgCcAaGcCuCuUcUuAcUTsT
1079
p-aGfuAfaGfaAfgAfgGfcUfuGfgCfuTsT
1080
AD-14700
3233-3251
AgCcAaGcCuCuUcUuAcUTsT
1081
AGUfAAGAAGAGGCfUfUroGCfUfTsT
1082
AD-14710
3233-3251
AfgCfcAfaGfcCfuCfuUfcUfuAfcUfTsT
1083
AGUAAgaAGagGCUUGgcuTsT
1084
AD-14720
3233-3251
AGCfCfAAGCiCl^fCaifUfCfljfUfACfUfTsT
1085
AGUAAgaAGagGCUUGgcuTsT
1086
AD-14730
3233-3251
AgCcAaGcCuCuUcUuAcUTsT
1087
AGUAAgaAGagGCUUGgcuTsT
1088
AD-14740
3233-3251
UfgGfuUfcCfcUfgAfgGfaCfcAfgCfTsT
1089
p-gCfuGfgUfcCfuCfaGfgGfaAfcCfaTsT
1090
AD-15086
3233-3251
UfGGUfUfCfCfCfUfGAGGACfCfAGCfTsT
1091
GCfUfGGUfCfCfU fCfAGGG AACfCfATsT
1092
AD-15096
Положения в человеческой
рег.№ NMJ 74936
Последовательность смысловой цепи (У-З1)1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цегш(5'-3')!
SEQ ID
NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в HepG2 [KM]
1С50в гепатоцитах собакоподобных
(нМ)
100 HM/HepG2
Hrv№epG2
HMfflepG2
30 нМ/ HeLa
3233-3251
UgGuUcCcUgAgGaCcAgCTsT
1093
p-gCfuGfgUfcCfuCfaGfgGfaAfcCfaTsT
1094
AD-15106
3233-3251
UgGuUcCcUgAgGaCcAgCTsT
1095
GCfUfGGUfCfCfUfCfAGGGAACfCfATsT
1096
AD-15116
3233-3251
UfgGfuUfcCfcUfgAfgGfaCfcAfgCfTsT
1097
GCUGGucCUcaGGGAAccaTsT
1098
AD-15126
3233-3251
ufGGUWfcrcfcraraAGGACfCfAGCfrsT
1099
GCUGGucCUcaGGGAAccaTsT
1100
AD-15136
3233-3251
UgGuUcCcUgAgGaCcAgCTsT
1101
GCUGGucCUcaGGGAAccaTsT
1102
AD-15146
3242-3260
UCUUCUUACUUCACCCGGCTT
1103
GCCGGGUGAAGUAAGAAGATT
1104
AD-15260
3243-3261
CUUCUUACUUCACCCGGCUTT
1105
AGCCGGGUGAAGUAAGAAGTT
1106
AD-15371
3244-3262
UUCUUACUUCACCCGGCUGTT
1107
CAGCCGGGUGAAGUAAGAATT
1108
AD-15372
3262-3280
GGGCUCCUCAUUUUUACGGTT
1109
CCGUAAAAAUGAGGAGCCCTT
1110
AD-15172
3263-3281
GGCUCCUCAUUUUUACGGGTT
1111
CCCGUAAAAAUGAGGAGCCTT
1112
AD-15295
3264-3282
GCUCCUCAUUUUUACGGGUTT
1113
ACCCGUAAAAAUGAGGAGCTT
1114
AD-15373
3265-3283
CUCCUCAUUUUUACGGGUATT
1115
UACCCGUAAAAAUGAGGAGTT
1116
AD-15163
3266-3284
UCCUCAUUUUUACGGGUAATT
1117
UUACCCG UAAAAA UGAGGATT
1118
AD-15165
3267-3285
CCUCAUUUUUACGGGUAACTT
1119
GUUACCCGUAAAAAUGAGGTT
1120
AD-15374
3268-3286
CUCAUUUUUACGGG UAACATT
1121
UGUUACCCGUAAAAAUGAGTT
1122
AD-15296
3270-3288
CAUUUUUACGGGUAACAGUTT
1123
ACUGUUACCCGUAAAAAUGTT
1124
AD-15261
3271-3289
AUUUUUACGGGUAACAGUGTT
1125
CACUG UUACCCGUAAAAAUTT
J126
AD-15375
3274-3292
UUUACGGGUAACAGUGAGGTT
1127
CCUCACUGUUACCCGUAAATT
1128
AD-15262
3308-3326
CAGACCAGGAAGCUCGGUGTT
1129
CACCGAGCUUCCUGGUCUGTT
1130
AD-15376
3310-3328
GACCAGGAAGCUCGGUGAGTT
1131
CUCACCGAGCUUCCUGGUCTT
1132
AD-15377
3312-3330
CCAGGAAGCUCGGUGAGUGTT
1133
CACUCACCGAGCUUCCUGGTT
1134
AD-15409
Положения в человеческой
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3')1
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5-3')1
SEQ
ID NO:
О &спначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
1C50B
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
3315-3333
GGAAGCUCGGUGAGUGAUGTT
1135
CAUCACUCACCGAGCUUCCTT
1136
AD-15378
3324-3342
GUGAGUGAUGGCAGAACGATT
1137
UCGUUCUGCCAUCACUCACTT
1138
AD-15410
3326-3344
GAGUGAUGGCAGAACGAUGTT
1139
CAUCGUUCUGCCAUCACUCTT
1140
AD-15379
3330-3348
GAUGGCAGAACGAUGCCUGTT
1141
CAGGCAUCGUUCUGCCAUCTT
1142
AD-15187
3336-3354
AGAACGAUGCCUGCAGGCATT
1143
UGCCUGCAGGCAUCGUUCUTT
1144
AD-15263
3339-3357
ACGAUGCCUGCAGGCAUGGTT
1145
CCAUGCCUGCAGGCAUCGUTT
1146
AD-15264
3348-3366
GCAGGCAUGGAACUUUUUCTT
1147
GAAAAAGUUCCAUGCCUGCTT
1148
AD-15297
3356-3374
GGAACUUUUUCCGUUAUCATT
1149
UGAUAACGGAAAAAGUUCCTT
1150
AD-15208
3357-3375
GAACUUUUUCCGUUAUCACTT
1151
GUGAUAACGGAAAAAGUUCTT
1152
AD-15209
3358-3376
AACUUUUUCCGUUAUCACCTT
1153
GGUGAUAACGGAAAAAGUUTT
1154
AD-15193
131
3370-3388
UAUCACCCAGGCCUGAUUCTT
1155
GAAUCAGGCCUGGGUGAUATT
1156
AD-15380
3378-3396
AGGCCUGAUUCACUGGCCUTT
1157
AGGCCAGUGAAUCAGGCCUTT
1158
AD-15298
3383-3401
UGAUUCACUGGCCUGGCGGTT
1159
CCGCCAGGCCAGUGAAUCATT
1160
AD-15299
3385-3403
AUUCACUGGCCUGGCGGAGTT
1161
CUCCGCCAGGCCAGUGAAUTT
1162
AD-15265
3406-3424
GCUUCUAAGGCAUGGUCGGTT
1163
CCGACCAUGCCUUAGAAGCTT
1164
AD-15381
3407-3425
CUUCUAAGGCAUGGUCGGGTT
1165
CCCGACCAUGCCUUAGAAGTT
1166
AD-15210
3429-3447
GAGGGCCAACAACUGUCCCTT
1167
GGGACAGUUGUUGGCCCUCTT
1168
AD-15270
3440-3458
ACUGUCCCUCCUUGAGCACTsT
1169
GUGCUCAAGGAGGGACAGUTsT
1170
AD-9591
3440-3458
AcuGucccuccuuGAGcAcTsT
1171
GUGCUcAAGGAGGGAcAGUTsT
1172
AD-9717
105
3441-3459
CUGUCCCUCCUUGAGCACCTsT
1173
GGUGCUCAAGGAGGGACAGTsT
1174
AD-9622
3441-3459
cuGucccuccuuGAGcAccTsT
1175
GGUGCUcAAGGAGGGAcAGTsT
1176
AD-9748
103
Положения в человеческой пос-ти рег.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи (5'-зУ
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи(5'-3')1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскриггга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1C50B HepG2 [нМ]
1С50в гепатоцитах
собако-тгодобнъгх обезьян (нМ)
100 jM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
HeLa
3480-3498
ACAUUUAUCUUUUGGGUCUTsT
1177
AGACCCAAAAGAUAAAUGUTsT
1178
AD-9587
3480-3498
AcAuuuAucuuuuGGGucuTsT
1179
AGACCcAAAAGAuAAAUGUTsT
1180
AD-9713
3480-3498
AfcAfuUfuAfuCfuUfuUfgGfgUfcUfTsT
1181
p-aGfaCfcCfaAfaAfgAfuAfaAfuGfuTsT
1182
AD-14679
3480-3498
ACfAUnJOJtAUfCfUfUfUfUfGGGUfCfUfTs T
1183
AGACfCfCfAAAAGAUfAAAUfGUlTsT
1184
AD-14689
3480-3498
AcAuUuAuCuUuUgGgUcUTsT
1185
P-aGfaCfcCfaA.faAfgAruAfaAfuGtuTsT
1186
AD-14699
3480-3498
AcAuUuAuCuUuUgGgUcUTsT
1187
AGACfCfCfAAAAGAUfAAAUfGUfTsT
1188
AD-14709
3480-3498
AfcAfuUfuAfuCfuUfuUfgGfgUfcUfTsT
1189
AGACCcaAAagAUAAAuguTsT
1190
AD-14719
3480-3498
ACfAUfljaJfAUfCfUfUfUfUfGGGUfCWfTs T
1191
AGACCcaAAagAUAAAuguTsT
1192
AD-14729
3480-3498
AcAuUuAuCuUuUgGgUcUTsT
1193
AGACCcaAAagAUAAAuguTsT
1194
AD-14739
3480-3498
GfcCfaUfcUfgCfuGfcCfgGfaGfcCfTsT
1195
p-gGfcUfcCfgGfcAfgCfaGfaUfgGfcTsT
1196
AD-15085
3480-3498
GCfCfAUrCfUfGCflJfGCfCfGGAGCfCfTsT
1197
GGCfUfCfCroGCfAGCfAGAUfGGCfTsT
1198
AD-15095
3480-3498
GcCaUcUgCuGcCgGaGcCTsT
1199
p-gGfcUfcCfgGfcAfgCfaGfaUfgGfcTsT
1200
AD-15105
3480-3498
GcCaUcUgCuGcCgGaGcCTsT
1201
GGCfUfCfCfGGCfAGCfAGAUfGGCfTsT
1202
AD-15115
3480-3498
GfcCfaUfcUfgCfuGfcCfgGfaGfcCfTsT
1203
GGCUCauGCagCAGAUggcTsT
1204
AD-15125
3480-3498
GCfCfAUfCfUfGCfUfGCfCfGGAGCfCfTsT
1205
GGCUCauGCagCAGA UggcTsT
1206
AD-15135
3480-3498
GcCaUcUgCuGcCgGaGcCTsT
1207
GGCUCauGCagCAGAUggcTsT
1208
AD-15145
3481-3499
CAUUUAUCUUUUGGGUCUGTsT
1209
CAGACCCAAAAGAUAAAUGTsT
1210
AD-9578
3481-3499
cAuuuAucuuuuGGGucuGTsT
1211
cAGACCcAAAAGAuAAAUGTsT
T212
AD-9704
111
3485-3503
UAUCUUUUGGGUCUGUCCUTsT
1213
AGGACAGACCCAAAAGAUATsT
1214
AD-9558
3485-3503
uAucuuuuGGGucuGuccuTsT
1215
AGGAcAGACCcAAAAGAuATsT
1216
AD-9684
3504-3522
CUCUGUUGCCUUUUUACAGTsT
1217
CUGUAAAAAGGCAACAGAGTsT
1218
AD-9634
Положения в человеческой пос-ти рег.№ NMJ 74936
Последовательность смысловой цепи (5'-3')' I gЈQ
Последовательность антисмысловой цепи (5'-У)1
SEQ ID NO:
СЯсаначение дуплекеа
Средний процент оставшегося мРНК-транскрипта при соответствугошей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [HM}
1C50B гепатоцитах
подобных обезьян (нМ)
JNU:
100 HM/HepG2
nM/HepG2
HM/HepG2
нМУ HeLa
3504-3522
cucuGuuGccuuuuuAcAGTsT
1219
CUGuAAAAAGGcAAcAGAGTsT
1220
AD-9760
3512-3530
CCUUUUUACAGCCAACUUUTT
1221
AAAGUUGGCUGUAAAAAGGTT
1222
AD-15411
3521-3539
AGCCAAC UUUUCUAGACCUTT
1223
AGGUCUAGAAAAGUUGGCUTT
1224
AD-15266
3526-3544
ACUUUUCUAGACCUGUUUuTT
1225
AAAACAGGUCUAGAAAAGUTT
1226
AD-15382
3530-3548
UUCUAGACCUGUUUUGCUUTsT
1227
AAGCAAAACAGG UCUAGAATsT
1228
AD-
9554
3530-3548
uucuAGAccuGuuuuGcuuTsT
1229
AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT
1230
AD-9680
0,10
0,10
3530-3548
UfuCfuAfgAfcCfuGfuUfuUfgCfuUfTsT
1231
p-aAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuAfgAfaTsT
1232
AD-14676
3530-3548
UfUfCfUfAGACfCfUfGUnjfUfUfGCfUftlfTs
1233
AAGCfAAAACfAGGUfCfUfAGAATsT
1234
AD-14686
3530-3548
UuCuAgAcCuGuUuUgCuUTsT
1235
p-aAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuAfgAfaTsT
1236
AD-
14696
3530-3548
UuCuAgAcCuGuUuUgCuUTsT
1237
AAGCfAAAACfAGGUfCfUfAGAATsT
1238
AD-14706
3530-3548
UfuCfuAfgAfcClW3 &UfuUffCfuUfTsT
1239
AAGcAaaACagGUCUAgaaTsT
1240
AD-
14716
3530-3548
UШfCfUfAGACfCШfGUШfUfUfGCfUf^JrTs
1241
AAGcAaaACagGUCUAgaaTsT
1242
AD-14726
3530-3548
UuCuAgAcCuGuUuUgCuUTsT
1243
AAGcAaaACagGUCUAgaaTsT
1244
AD-14736
3530-3548
CfaUfaGfgCfcUfgGfaGfuUfuAfuUfTsT
1245
p-aAfuAfaAfcUfcCfaGfgCfcUfaUfgTsT
1246
AD-15082
3530-3548
CfAUfAGGCfCfUfGGAGU fUOJ ЈAU fUfTsT
1247
AAUfAAACfUfCfCfAGGCfCfUfAUfGTsT
1248
AD-15092
3530-3548
CaUaGgCcUgGaGuUuAuUTsT
1249
p-aAfu AfaA fcUfcCfaGfgCfcUfaUfgTsT
1250
AD-15102
3530-3548
CaUaGgCcUgGaGuUuAuUTsT
1251
AAUfAAACfUfCfCfAGGCfCfUfAUroTsT
1252
AD-15112
3530-3548
CfaUfaGfgCfcUfgGfaGfuUfuAfuUfTsT
1253
AAUAAacUCcaGGCCUaugTsT
1254
AD-15122
3530-3548
СГАиГАОООСШГССАСиЮГиГАиштТ
1255
AAUAAacUCcaGGCCUaugTsT
1256
AD-15132
3530-3548
CaUaGgCcUgGaGuUuAuUTsT
1257
AAUAAacUCcaGGCCUaugTsT
1258
AD-15142
3531-3549
UCUAGACCUGUUUUGCUUUTST
1259
AAAGCAAAACAGGUCUAGATST
1260
AD-9553
0,02
Положения в человеческой
рег.№ NM_174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3^
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-трансхриггга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
IC50B HepG2 [нМ]
IC50 в гепатоцитах
собакоподобных обезьян (нМ)
100 нМ/НерШ
HM7HepG2
нКШер02
30 нМ/ HeLa
3531-3549
ucuA GAccuGuuuuGcuuuTsT
1261
AAAGcAAAAcAGGUCuAGATsT
1262
AD-9679
3531-3549
UfcUfaGfaCfcUfgUfuUfuGfcUfuUfTsT
1263
p-aAfaGfcAfaAfaCfaGfgUfcUfaGfaTsT
1264
AD-14675
3531-3549
иЯГЮГАСАСтСШЮиЮШШЮСШШГиГГв
1265
AAAGCfAAAACfAGGUfCfUfAGATsT
1266
AD-14685
3531-3549
UcUaGaCcUgUuUuGcUuUTsT
1267
p-aAfaGfcAfaAfaCfaGfgUfcUfaGfaTsT
1268
AD-14695
3531-3549
UcUaGaCcUgUuUuGcUuUTsT
1269
AAAGCfAAAACfAGGUfCfUfAGATsT
1270
AD-14705
3531-3549
UfcUfaGfaCfcUfgUfuUfuGfcUfuUfTsT
1271
AAAGCaaAAcaGGUCUagaTsT
1272
AD-14715
3531-3549
иГСШГАОАСгСШГОиШШЮГОСПЗГиШПГз
1273
AAAGCaaAAcaGGUCUagaTsT
1274
AD-14725
3531-3549
UcUaGaCcUgUuUuGcUuUTsT
1275
AAAGCaaAAcaGGUCUagaTsT
1276
AD-14735
3531-3549
UfcAfuAfgGfcCfuGfgAfgUfuUfaUfTsT
1277
p-aUfaAfaCfuCfcAfgGfcCfuAfuGfaTsT
1278
AD-15081
3531-3549
UfCfAUfAGGCfCflJfGGAGUfUfUfAUfTsT
1279
АиГАААСШ1СК:ГАОССЯ:ЮГАи{САТхТ
1280
AD-15091
3531-3549
UcAuAgGcCuGgAgUuUaUTsT
1281
p-aUfaAfaCfuCfcAfgGfcCfuAfuGfaTsT
1282
AD-15101
3531-3549
UcAuAgGcCuGgAgUuUaUTsT
1283
AUfAAACfUfCfCfAGGCfCfUfAUfGATsT
1284
AD-15111
3531-3549
UfcAfuAfgGfcCfuGfgAfgUfiiUfaUfTsT
1285
AUAAAcuCCagGCCUAugaTsT
1286
AD-15121
3531-3549
UfCfAUfAGGCfCflJfGGAGUfUfUfAUtTsT
1287
AUAAAcuCCagGCCUAugaTsT
1288
AD-15131
3531-3549
UcAuAgGcCuGgAgUuUaUTsT
1289
AUAAAcuCCagGCCUAugaTsT
1290
AD-15141
3557-3575
UGAAGAUAUUUA UUCUGGGTsT
1291
CCCAGAAUAAAUAUCUUCATsT
1292
AD-9626
3557-3575
uGAAGAuAuuuAuucuGGGTsT
1293
CCcAGAAuAAAuAUCUUcATsT
1294
AD-9752
3570-3588
UCUGGGUUUUGUAGCAUUUTsT
1295
AAAUGCUACAAAACCCAGATsT
1296
AD-9629
3570-3588
ucuGGGuuuuGuAGcAuuuTsT
1297
AAAUGCuAcAAAACCcAGATsT
1298
AD-9755
3613-3631
AUAAAAACAAACAAACGUUTT
1299
AACGUUUG UUUGUU UUUA UTT
1300
AD-
15412
3617-3635
AAACAAACAAACGUUGUCCTT
1301
GGACAACGUUUGUUUGUUUTT
1302
AD-
15211
Положения в человеческой
пос-ти
рег.№ NM 174936
Последовательность смысловой цепи (5'-3")'
SEQ ID NO:
Последовательность антисмысловой цепи (З'-З1)1
SEQ ID NO:
Обозначение дуплекса
Средний процент оставшегося мРНК-транскритгга при соответствующей концентрации киРНК в клетках различных типов
1С50в гепатоцитах
собакоподобных обезьян (нМ)
100 HM/HepG2
HM/HepG2
HM/HepG2
30 нМ/ HeLa
IC50B HepG2 [нМ]
3618-3636
AACAAACAAACGUUGUCCUTT
1303
AGGACAACGUUUGUUUGUUTT
1304
AD-15300
1 U, С, A, G: соответствующий рибонуклеотид; Т: дезокситимидин; u, с, a, g: соответствующий 2'-0-метил-рибонуклеотид; Uf, Cf, Af, Gf: соответствующий 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотид; если нуклеотиды представлены в виде последовательности, то они присоединены посредством 3'-5'-фосфодиэфирных групп; нуклеотиды со вставленной буквой "s" присоединены посредством 3,-0-5,-0-фосфотиодиэфирных групп; если перед последовательностью не стоит префикс "р", то это означает, что олигонуклеотиды не содержат 5'-фосфатной группы у 5'-концевого нуклеотида; все олигонуклеотиды имеют 3'-ОН у 3'-концевого нуклеотида.
AD-12348
GccuGGAGuuuAuucGGAATsT
1395
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfiiCfcAfgGfcTsT
1396
AD-12349
GcCuGgnAgUuUaUuCgGaATsT
1397
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcTsT
1398
AD-12350
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAfTTab
1399
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcTTab
1400
AD-12351
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1401
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcsCfsu
1402
AD-12352
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1403
UUCCGaaUAaaCUCCAggcscsu
1404
AD-12354
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1405
UUCCGAAUAAACUCCAGGCscsu
1406
AD-12355
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1407
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
1408
AD-12356
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1409
uUcCGAAuAAACUccAGGCTsT
1410
AD-12357
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1411
UUCCGaaUAaaCUCCAggc
1412
AD-12358
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1413
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfc
1414
AD-12359
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1415
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcsCfsu
1416
AD-12360
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1417
UUCCGAAUAAACUCCAGGCscsu
1418
AD-12361
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1419
UUCCGAAuAAACUCcAGGCTsT
1420
AD-12362
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1421
uUcCGAAuAAACUccAGGCTsT
1422
AD-12363
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1423
UUCCGaaUAaaCUCCAggcscsu
1424
AD-12364
GmocCmouGmogAmogUmouUmoaUmouCmogGmoaATsT
1425
UUCCGaaUAaaCUCCAggcTsT
1426
AD-12365
GmocCmouGmogAmogUmouUmoaUmouCmogGmoaATsT
1427
UUCCGAAuAAACUCcAGGCTsT
1428
AD-12366
GmocCmouGmogAmogUmouUmoaUmouCmogGmoaATsT
1429
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
1430
AD-12367
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1431
UUCCGaaUAaaCUCCAggcTsT
1432
AD-12368
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1433
UUCCGAAuAAACUCcAGGCTsT
1434
AD-12369
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1435
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
1436
AD-123 70
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1437
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfTsT
1438
AD-12371
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1439
P-UfUfCfCroAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1440
AD-123 72
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1441
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcsCfsu
1442
AD-12373
GmocmocmouGGAGmoumoumouAmoumoumocGGAATsT
1443
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
1444
AD-12374
GCfCfU fGG AGUfUfUfAUfUfCfGG AATsT
1445
UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfTsT
1446
AD-12375
GCfCfUfGGAGUfUfUfAUfUfCfGGAATsT
1447
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
1448
AD-12377
GCfCfUfGGAGUfUfUfAUfUfCfGGAATsT
1449
uUcCGAAuAAACUccAGGCTsT
1450
AD-12378
GCfCfUfGGAGUfUfUfAUfUfCfGGAATsT
1451
UUCCGaaUAaaCUCCAggcscsu
1452
AD-12379
GCfCfUfGGAGUfUfUfAUfU fCfGG AATsT
1453
UUCCGAAUAAACUCCAGGCscsu
1454
AD-123 80
GCfCfUfGGAGUfUfUfAUfUfCfGGAATsT
1455
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcsCfsu
1456
AD-12381
GCfCfUfGG AGUfU fUfAUfUfCfGG AATsT
1457
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcTsT
1458
AD-12382
GCfCfU fGG AGUfU fUfAUfUfCfGG AATsT
1459
P-UfU fCfCfG AAUfA А АСШ fCfCfAGGCfTsT
1460
AD-123 83
GCCUGGAGUUUAUUCGGAATST
1461
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfTsT
1462
AD-123 84
GccuGGAGuuuAuucGGAATsT
1463
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfTsT
1464
AD-123 85
GcCuGgnAgUuUaUuCgGaATsT
1465
P-UfUfCfCfGA AUfA A ACfU fCfCfAGGCfTsT
1466
AD-123 86
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1467
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfTsT
1468
AD-12387
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1469
UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1470
AD-12388
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1471
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfc
1472
AD-12389
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1473
P-uUfcCfgAfaUfaAfaCfuCfcAfgGfcsCfsu
1474
AD-12390
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1475
UUCCGAAUAAACUCCAGGCscsu
1476
AD-12391
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1477
UUCCGaaUAaaCUCCAggc
1478
AD-12392
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1479
UUCCGAAUAAACUCCAGGCTsT
1480
AD-12393
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1481
UUCCGAAuAAACUCcAGGCTsT
1482
AD-12394
GCfCfUfGGAGGUfUfUfAUfUfCfGGAA
1483
uUcCGAAuAAACUccAGGCTsT
1484
AD-12395
GmocCmouGmogAmogUmouUmoaUmouCmogGmoaATsT
1485
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1486
AD-12396
GmocCmouGmogAm02gUmouUmoaUmouCmogGmoaA
1487
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1488
AD-12397
GfcCfuGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAf
1489
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1490
AD-12398
GfcCfoGfgAfgUfuUfaUfuCfgGfaAfTsT
1491
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1492
AD-12399
GcCuGgnAgUuUaUuCgGaATsT
1493
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1494
AD-12400
GCCUGGAGUUUAUUCGGAATST
1495
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1496
AD-12401
GccuGGAGuuuAuucGGAATsT
1497
P-UfUfCfCfGAAUfAAACfUfCfCfAGGCfsCfsUf
1498
1 U, С, A, G: соответствующий рибонуклеотид; Т: дезокситимидин; u, с, a, g: соответствующий 2'-0-метил-рибонуклеотид; Uf, Cf, Af, Gf: соответствующий 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотид; moc, mou, mog, moa: соответствующий 2'-МОЕ-нуклеотид; если нуклеотиды представлены в виде последовательности, то они присоединены посредством 3'-5'-фосфодиэфирных групп; ab: 3'-концевой неосновный нуклеотид; нуклеотиды со вставленной буквой "s" присоединены посредством 3,-0-5,-0-фосфотиодиэфирных групп; если перед последовательностью не стоит префикс "р", то это означает, что олигонуклеотиды не содержат 5'-фосфатной группы у 5'-концевого нуклеотида; все олигонуклеотиды имеют 3'-ОН у 3'-концевого нуклеотида.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК), способная ингибировать экспрессию гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 человека (PCSK9) в клетке, включающая по меньшей мере
две комплементарные друг другу последовательности, где смысловая цепь содержит последовательность, выбранную из группы, представленной в табл. 1 и/или 2, и антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, выбранную из группы, представленной в табл. 1 и/или 2, причем вторая последовательность содержит область, которая, по существу, комплементарна мРНК, кодирующей PCSK9, отличную от области от положения 3530 до положения 3548 NM 174936.
2. дцРНК по п.1, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
3. дцРНК по п.1 или 2, где модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-О-метилмодифицированного нуклеотида; нуклеотида, содержащего 5'-фосфортиоатную группу, и концевого нуклеотида, присоединенного к холестериловому производному или бисдециламидной группе доде-кановой кислоты, 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, неосновного нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклео-тида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего неприродное основание.
4. Клетка, не являющаяся клеткой человека, содержащая дцРНК по любому из пп.1-3.
5. Фармацевтическая композиция для ингибирования в организме экспрессии гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 человека (PCSK9), отличающаяся тем, что содержит дцРНК по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
6. Применение in vitro дцРНК по любому из пп.1-3 для снижения уровня экспрессии гена PCSK9 человека в клетке.
7. Применение in vitro по п.6, где дцРНК используется in vitro в концентрации не более 30 нМ.
8. Применение in vitro по п.6 или 7, где клетка представляет собой клетку HepG2, экспрессирую-щую PCSK9, причем уровень экспрессии гена PCSK9 в указанной клетке HepG2 снижен по меньшей мере на 20%.
9. Применение дцРНК по любому из пп.1-3 или фармацевтической композиции по п.5 в приготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена пропротеин-конвертазы субтилизин-кексина 9 (PCSK9) у человека.
10. Применение по п.9, где нарушение представляет собой гиперхолестеринемию, гипертриглице-ридемию, гиперлипидемию, болезнь сердца или болезнь кровообращения.
11. Применение по п.9, где лекарственное средство предназначено для снижения уровня общего холестерина у индивидуума.
12. Способ in vitro ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке, предусматривающий:
(a) введение в выделенную клетку дцРНК по любому из пп.1-3 и
(b) поддержание выделенной клетки, полученной на стадии (а), в течение периода времени, достаточного для разрушения в клетке мРНК-транскрипта гена PCSK9, и, тем самым, ингибирования экспрессии гена PCSK9 в клетке.
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
<211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 125
cugcgccaag gauccguggt t 21
<210> 126 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 126
ccacggaucc uuggcgcagt t 21
<210> 127 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 127
auccguggag guugccuggt t 21
<210> 128 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 128
ccaggcaacc uccacggaut t 21
<210> 129 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основан] + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 129
gguugccugg caccuacgut t 21
<2Ю> 130 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 130
acguaggugc caggcaacct t 21
<220>
<221> модифицированное основание <222> 14
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-О-метил-основание" <220>
<221> модифицированное основание <222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин" <220>
<221> модифицированное основание
<222> 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание"
<400> 156
gaucuuggug agguauccct t 21
<210> 157
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основа) + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин" <220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 157
uggugaagau gaguggcgat t 21
<210> 158 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин" <220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 158
ucgccacuca ucuucaccat t 21
<210> 159 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1, 4, 10, 14, 17
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-О-метил-основание" <220>
<221> модифицированное основание <222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин" <220>
<221> модифицированное основание
<222> 2, 3, 5, б, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 159
uggugaagau gaguggcgat t 21
<210> 160 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 5, 9, 15, 18
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-О-метил-основание" <220>
<221> модифицированное основание <222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин"
+ сахар без 5'-фосфата <220>
<221> модифицированное основание <222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин" <220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание"
<210> 170
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9
<220>
<221> модифицированное основание
<222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание"
<210> 171
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9
<220>
<221> модифицированное основание
<222> 2, 3, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-О-метил-основание"
<220>
<221> модифицированное основание
<220>
<221> модифицированное основание
<222> 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание"
<210> 172 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9
<220>
<221> модифициров,
<222> 1
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-О-метил-основание"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> 21
<223> /модифицированное основание = "5'-тио-тимидин"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> 2..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание"
<400> 172
cagaggaguc cuccucgaut t 21
<210> 173
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательност:
<220>
<223> 5'-концевой нуклеиновой кислотой является нуклеозид, то есть, основание + сахар без 5'-фосфата
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 173
ggaaccugga gcggauuact t 21
<213> Искусственная последовательность е220>
<223> киРНК, нацеленные на PCSK9 <220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 1166
cccgaccaug ccuuagaagt t 21
<220>
<221> модифицированное основание <222> 1..19
<223> /модифицированное основание = "соответствующее 2'-гидрокси-основание" <400> 1169
acugucccuc cuugagcact t 21
!!!П!!! ¦!!!!! I!!!!
iiii ii ii ii ill II li
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
020840
020840
- 1 -
- 1 -
(19)
020840
020840
- 1 -
- 1 -
(19)
020840
020840
- 4 -
- 3 -
(19)
020840
020840
- 18 -
020840
020840
- 21 -
- 21 -
020840
020840
- 43 -
- 43 -
020840
020840
- 328 -
- 328 -
|
