Изобретение относится к фракции гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, полученной ферментированием биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, в культуральном растворе с использованием Acetobacter aceti, смесей различных видов Acetobacter, Gluconobacter suboxydans, Xanthomonas campestris или Enterobacter cloacae, которая безопасна для добавления в фармацевтические препараты и продукты питания. Изобретение также относится к способу получения указанной фракции и фармацевтической композиции, содержащей указанную фракцию, обладающей анальгетическим и антиаллергическим действием.

[0001] Фракция гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, полученная ферментированием биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, с использованием Acetobacter aceti, смесей различных видов Acetobacter, Gluconobacter suboxydans, Xanthomonas campestris или Enterobacter cloacae в культуральном растворе, с последующим экстрагированием твердого содержимого культуральных растворов горячей водой, охлаждением и отделением супернатанта, содержащего фракцию гликолипидов, центрифугированием.

[0002] Способ получения фракции гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, включающий ферментирование биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, в культуральном растворе, содержащем Acetobacter aceti, смеси различных видов Acetobacter, Gluconobacter suboxydans, Xanthomonas campestris или Enterobacter cloacae, последующее экстрагирование твердого содержимого культуральных растворов горячей водой, охлаждение и отделение супернатанта, содержащего фракцию гликолипидов, центрифугирование.

[0003] Фармацевтическая композиция, содержащая фракцию гликолипидов по п.1.

[0004] Фармацевтическая композиция по п.3, обладающая анальгетическим и антиаллергическим действием.

Область техники изобретения

Изобретение касается способа ферментации биологического пищевого материала посредством грамотрицательных бактерий с получением фракции гликолипидов, которая безопасна для добавления в фармацевтические препараты, парафармацевтические средства, косметические средства, функциональные продукты питания, корма, удобрения и средства для ванны, используемые для растений и животных, таких как млекопитающие (в частности, домашние животные и комнатные домашние животные), включая людей, птиц (в частности, домашних кур и комнатных птиц), амфибий, рептилий, рыб (в частности, аквариумных рыб) и беспозвоночных животных, а также касается фракции гликолипидов и фармацевтической композиции, которая ее содержит.

Уровень техники изобретения

Разработка способов предотвращения или лечения болезней, которые включают в себя технологии защиты от инфекции, является неотложной проблемой для млекопитающих (в частности, домашних животных и комнатных животных), включающих в себя людей, птиц (в частности, домашних кур и комнатных птиц), амфибий, рептилий, рыб (в частности, аквариумных рыб), беспозвоночных животных и растений. Дополнительно, для их осуществления настоятельно требуются способы, в которых не применяются какие-либо химикаты, не происходит какое-либо экологическое загрязнение, отсутствуют устойчивые бактерии и не происходит накопления в организме человека. По вышеупомянутой проблеме авторы настоящего изобретения выявили, что эффект предотвращения и лечения болезней успешно достигается с иммуностимулятором, полученным из продукта природного происхождения (непатентная литература 1). В качестве одного из примеров такого продукта можно использовать липополисахарид, полученный из Pantoea agglomerans, которые являются резидентными бактериями пшеницы (непатентная литература 1). Известно, что Limulus - положительный гликолипид (по реакции с лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus)), обладает мощным иммуностимулирущим действием (непатентная литература 2). Так называемый липополисахарид также включен в эту категорию. Известно, что липополисахарид является основным компонентом наружной клеточной оболочки грамотрицательных бактерий, а также одним из основных компонентов вакцины Коли и обладает мощным иммуностимулирующим действием (непатентная литература 3).

Авторы настоящего изобретения выявили, что Limulus-положительные гликолипиды присутствуют в пшенице, часть их представляет собой липополисахарид симбиотических бактерий пшеницы, и они мощно стимулируют врожденный иммунитет (непатентная литература 4). Вышеупомянутые гликолипиды и липополисахариды являются безопасными и мощными стимуляторами врожденного иммунитета при подкожном или пероральном введении и проявляют профилактическое и терапевтическое действие для широкого диапазона заболеваний, включающих в себя инфекционные заболевания (непатентная литература 5). Кроме того, авторы настоящего изобретения сообщают, что вместо антибиотических химических веществ защитный противоинфекционный эффект в области животноводства и аквакультуры в качестве безопасных и надежных материалов природного происхождения проявляет не только липополисахарид, полученный из Pantoea agglomerans, содержание которого повышено ферментацией пшеничной муки посредством Pantoea agglomerans, являющихся резидентными бактериями в пшеничной муке, но также экстракт ферментированной пшеницы, который является новым иммуностимулятором, содержащим компоненты, полученные из пшеницы.

Основную структуру липополисахарида составляет липид, называемый липидом А, и различные сахара (полисахарид), ковалентно связанные с липидом. Участок, следующий за липидом А, состоит из ядра R, и у родственных бактерий он имеет относительно однородную структуру, и далее расположен участок антигена О полисахарида, структура которого отличается в зависимости от видов бактерий (непатентная литература 7). Антиген О также имеет повторяемую структуру того же олигосахарида, который является характерным для ЛПС (липополисахарида) (непатентная литература 1). Таким образом, липополисахарид обычно представляет собой смесь, где соединения имеют различный молекулярный вес. Также известно, что структура липополисахарида различается в зависимости от микроорганизма, из которого происходит липополисахарид. Например, липополисахарид, происходящий из Salmonella и липополисахарид, поисходящий из Escherichia coli, различаются по структуре, а также по биологической активности. Вместе с тем, в силу обычно затрудненного определения структуры липополисахарида, неизвестны детали структуры и функции липополисахаридов, происходящих из грамотрицательных бактерий. Таким образом, описано, на основании функциональных различий, наличие у липополисахарида обычно новой структуры.

В то же время в последних исследованиях показано, что липополисахарид стимулирует врожденный иммунитет посредством Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) (непатентная литература 6). Было выявлено, что участок липида А липополисахарида является необходимым для связывания с TLR4 и что полисахаридный участок в значительной степени влияет на эффективность внутриклеточной трансдукции сигнала TLR4. Исходя из вышеупомянутого, предполагается, что различия в клеточной реакции липополисахарида указывают на структурное различие.

Для установления полезности липополисахарида важно показать надежность и безопасность подкожного или перорального введения липополисахарида. Таким образом, особое значение имеют грамотрицательные бактерии, общепринято используемые в производстве и ферментации продуктов питания. В этой связи, если в грамотрицательных бактериях, используемых в производстве продуктов питания и представляемых в виде съедобных продуктов с ферментированными продуктами, присутствуют Limulus-положительный гликолипид и липополисахарид, этот факт показывает, что существует опыт использования в пище Limulus-положительного гликолипида и липополисахарида. Выявлены убедительные доказательства, что подкожное или пероральное введение Limulus-положительного гликолипида или липополисахарида является надежным и безопасным и что в то же время должна появиться возможность разрабатывать с использованием указанных веществ новые продукты для здоровья и фармацевтические препараты, такие как косметические средства и продукты питания.

Непатентная литература 1. Chie Kohchi et al., "Natural immunity regulatory action of fermented wheat extract", New Food Industry (2006), Vol. 48, p. 19-27.

Непатентная литература 2. Ulmer, A.J. et al., "Lipopolysaccharide: Structure, Bioactivity, Receptors, and Signal Transduction". Trends in Glycoscience and Glycotechnology (2002),Vol. 14, p. 53-68.

Непатентная литература 3. Stames, С.О., "Coley's toxins in perspective". Nature (1992), Vol. 357, p. 11-12.

Непатентная литература 4. Nishizawa, Т. et al., Chem. Pharm. Bull. (1992), Vol. 40, p. 479-483.

Непатентная литература 5. Inagawa H. et al., "Effects of lipopolysaccharide (LPSw) derived from wheat flour having macrophage activating effect on treatment and prevention of various diseases". Biotherapy (1991), Vol. 5, p. 617-621.

Непатентная литература 6. Kiyoshi Takedal et al., "Toll-like receptors in innate immunity". International Immunology, Vol. 17, p. 1-14.

Непатентная литература 7. Seikagaku Jiten 2nd edition (1990), Tokyo Kagaku Dojin, p. 1949.

Раскрытие изобретенияЗадачи для решения согласно изобретению

Иммуностимулятор часто получают из полисахаридов грибов и морских водорослей или из полисахаридов грамположительных бактерий, таких как молочнокислые бактерии. Коммерчески доступные продукты полисахаридных экстрактов из грибов или морских водорослей являются чрезвычайно дорогими в силу трудности получения большого количества материала и высокой стоимости экстракции. При этом для культивирования грамположительных бактерий, таких как молочнокислые бактерии, используют материалы от животных. Таким образом, стоимость культивирования является высокой и существует проблема безопасности животных компонентов. С другой стороны, для получения иммуностимулятора из микроорганизма, который широко распространен и постоянно присутствует в растениях, является полезным эффективное культивирование микроорганизма в растительных компонентах и получение структурного компонента или его продукта. В качестве примера можно безопасно и с малыми затратами получать Pantoea agglomerans, находящиеся в пшенице, путем культивирования их с использованием в качестве среды пшеничной муки. При этом практически не существует опыта осознанного перорального употребления грамотрицательных бактерий. Таким образом, безопасность их продолжительного перорального употребления в общем является неизвестной.

Вместе с тем было выявлено, что пероральное введение экстракта Pantoea agglomerans, культивированных с пшеничной мукой, является высокобезопасным. Человечество употребляет Pantoea agglomerans с пищей на протяжении долгого времени с начала выращивания пшеницы, поскольку их присутствие в муке является постоянным. Т.е. существует продолжительный опыт употребления в пищу Pantoea agglomerans и их компонентов. Фактически, необходимая для роста молочнокислых бактерий ржаного хлеба фолиевая кислота обеспечивается с помощью Pantoea agglomerans, которые растут во время процесса ферментации. Таким образом, рост Pantoea agglomerans является необходимым для производства ржаного хлеба. При употреблении ржаного хлеба поглощается значительное количество компонентов микробной клетки. Среди грамотрицательных бактерий, в отношении которых также существует опыт употребления их в пищу, и возможных для культивирования с растительными компонентами, доступными являются Acetobacter aceti, используемые для производства уксусов, (1) Acetobacter xylinum, (2) Zymomonas mobilis, (3) Xanthomonas campestris и (4) Enterobacter cloacae, используемые для производства (1) десерта nata de coco, (2) текилы, (3) ксантановой камеди, (4) салапао (salapao). Вместе с тем, в процессе их ферментации сложно культивировать много видов бактерий и не происходит рост единственного вида бактерий. Например, в процессе производства уксуса сначала Aspergillus вырабатывают сахар, затем Saccharomyces вырабатывают этанол и после происходит рост Acetobacter. При этом культивирование единственных Acetobacter осуществляют в среде SH Шрамма Хестрина (Schramm-Hestrin) (20 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г полипептона, 1,15 г лимонной кислоты, 2,7 г динатрия гидрофосфата и 1000 мл дистиллированной воды), которая является стандартной средой. При этом полипептон является продуктом расщепления казеина коровьего молока ферментом, который представляет собой дорогостоящий белок, полученный из рогатого скота, и также остаются проблемы относительно его безопасности.

В настоящее время доступно несколько типов грамотрицательных бактерий, известных для использования в ферментации пищевых продуктов или обеспечиваемых в виде съедобного продукта вместе с ферментированным продуктом. Примерами таких съедобных продуктов являются уксус, текила, йогурт и хлеб. При этом не сообщается о том, что Limulus-положительный гликолипид или липополисахарид присутствует в грамотрицательных бактериях (Acetobacter, Gluconobacter, Frateuria, Zymomonas или Gluconobacter suboxydans), используемых при ферментации пищи или обеспечиваемых в качестве съедобного продукта вместе с ферментированным продуктом.

С учетом вышеупомянутых проблем настоящее изобретение нацелено на идею, что пероральное введение грамотрицательных бактерий, опыт употребления в пищу которых существует продолжительное время, является высокобезопасным, и целью настоящего изобретения является обеспечение культурального раствора, полученного путем культивирования грамотрицательных бактерий, опыт употребления в пищу которых существует продолжительное время, и которые можно культивировать с растительными компонентами при малой стоимости способа, их экстракты, композиция экстракта, а также липополисахарид и способ получения липополисахарида.

Целью настоящего изобретения является фракция гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, полученная ферментированием биологического пищевого материала в культуральном растворе с использованием Acetobacter aceti, смесей различных видов Acetobacter, Gluconobacter suboxydans, Xanthomonas campestris или Enterobacter cloacae, которая безопасна в производстве продуктов питания, может быть представлена в виде съедобного продукта с ферментированными продуктами и обладает иммуностимулирующим действием. Считается, что происхождение указанного иммуностимулирующего действия обусловлено липополисахаридом, который присутствует в Acetobacter. Поэтому считается, что Liinulus-положительный гликолипид или липополисахарид можно извлекать аналогичным способом из обладающих иммуностимулирующим действием грамотрицательных бактерий, отличных от Acetobacter. Таким образом, очевидно, что настоящее изобретение не ограничено микроорганизмами, описанными в разделе примеров, и может быть адаптировано к другим микроорганизмам, таким как Zymomonas и Gluconobacter, которые представляют собой грамотрицательные бактерии с иммуностимулирующим действием. Кроме того, поскольку фракция гликолипидов, представляемая настоящим изобретением, способна безопасно стимулировать иммунитет путем перорального или подкожного введения, ее можно включать в состав фармацевтических композиций и использовать в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах, продуктах для ухода за кожей, кормах и продуктах для комнатных животных, которые широко используются с целью поддержания здоровья животных и растений.

Средства решения задачи

Способ получения фракции гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала настоящего изобретения включает ферментирование биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, в культуральном растворе, содержащем Acetobacter aceti, смеси различных видов Acetobacter, Gluconobacter suboxydans, Xanthomonas campestris или Enterobacter cloacae, последующее экстрагирование твердого содержимого культуральных растворов горячей водой, охлаждение и отделение супернатанта, содержащего фракцию гликолипидов, и центрифугирование.

Фракцию гликолипидов настоящего изобретения, полученную указанным способом, вводят в состав фармацевтической композиции, обладающей анальгетическим действием и антиаллергическим действием.

Ферментированный растительный экстракт настоящего изобретения получают указанным способом ферментации и культивирования.

Порошок ферментированного растительного экстракта настоящего изобретения получают из ферментированного растительного экстракта.

Композиция ферментированного растительного экстракта настоящего изобретения содержит ферментированный растительный экстракт или порошок ферментированного растительного экстракта.

Композиция ферментированного растительного экстракта может представлять собой фармацевтический препарат, фармацевтический препарат для животных, парафармацевтическое средство, косметическое средство, пищевой продукт, функциональный пищевой продукт, корм или средство для ванны.

Композиция ферментированного растительного экстракта может проявлять противовоспалительное действие при болезни кишечника, антиаллергическое действие при аллергическом заболевании, анальгетическое действие, противораковое действие, действие снижения уровня холестерина, действие снижения уровня сахара в крови, действие повышения способности к естественному оздоровлению или иммуностимулирующее действие.

Липополисахарид настоящего изобретения получают из бактерии, культивируемой указанным способом ферментации и культивирования.

Способ получения липополисахарида настоящего изобретения содержит получение липополисахарида из бактерии, культивируемой указанным способом ферментации и культивирования.

Липополисахарид настоящего изобретения получают из Acetobacter.

Способ получения липополисахарида настоящего изобретения содержит получение липополисахарида из Acetobacter.

Эффект изобретения

Согласно настоящему изобретению очевидно, что Limulus-положительный гликолипид содержится в экстракте Acetobacter aceti, в смеси экстракта Acetobacter - экстракта Gluconobacter suboxydans, и что липополисахарид содержится в Limulus-положительном гликолипиде. Этим показано, что Limulus-положительный гликолипид или липополисахарид содержатся в грамотрицательных бактериях, используемых в пищевых продуктах, и в результате обеспечивается липополисахарид в Limulus-положительном гликолипиде в качестве безопасного, надежного и недорогой иммуностимулятора, для которого существует опыт продолжительного употребления в пищу.

Настоящее описание включает в себя содержание данного описания и/или фигуры Японской патентной заявки № 2005-342971, которая является основанием для приоритета настоящего изобретения.

Лучшие способы осуществления изобретения

Далее в настоящем изобретении будут подробно описаны предпочтительные примеры настоящего изобретения.

Пример 1.

Ферментированный растительный экстракт, содержащий Limulus-положительный гликолипид Acetobacter.

Ферментированный растительный иммуностимулирующий экстракт, полученный путем ферментации растительного компонента с использованием только единственных бактерий Acetobacter.

(1) Ферментированный экстракт пшеницы.

А. Получение.

Культивирование разных видов Acetobacter с мукой.

Пшеничную муку (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Acetobacter aceti, или 0,1 мл смеси Acetobacter, или одну колонию Gluconobacter suboxydans, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли эндотоксин-специфическим Limulus-тестом (endospecy).

В. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Acetobacter экстракте пшеницы было выявлено, что экстракцией получено около 18, 56 и 43 мкг гликолипидов соответственно на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта пшеницы, ферментированного посредством Acetobacter aceti, экстракта пшеницы, ферментированного посредством смеси Acetobacter, и экстракта пшеницы, ферментированного посредством Gluconobacter suboxydans.

Реакция крахмала с йодом.

Компоненты, происходящие из пшеницы, также содержатся в каждом ферментированном экстракте пшеницы, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Acetobacter. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию крахмала с йодом. Все ферментированные экстракты пшеницы давали положительную реакцию крахмала с йодом, однако очищенный липополисахарид, происходящий из Acetobacter, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством разных ферментированных Acetobacter экстрактов пшеницы, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов разными ферментированными экстрактами пшеницы настоящего изобретения, путем измерения продукции ФНО или NO, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта пшеницы, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта пшеницы, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта пшеницы, ферментированного Gluconobacter suboxydans в пересчете на количество ЛПСр (липополисахарид из Pantoea agglomerans), пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного посредством Acetobacter, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO в концентрации 10 мкМ/мл или больше при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта пшеницы, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта пшеницы, ферментированного Gluconobacter suboxydans, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта пшеницы, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта пшеницы, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта пшеницы, ферментированного Gluconobacter suboxydans, с полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении любого из тестовых ферментированных посредством Acetobacter экстрактов пшеницы в концентрации 100 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(2) Ферментированный посредством Acetobacter экстракт сыворотки соевого творога.

А. Получение.

Высушенную сыворотку соевого творога (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфата гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Acetobacter aceti, или 0,1 мл смеси Acetobacter, или одну колонию Gluconobacter suboxydans, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

В. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Acetobacter экстракте сыворотки соевого творога было выявлено, что экстракцией получено около 4, 23 и 21 мкг гликолипидов соответственно на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Acetobacter aceti, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством смеси Acetobacter, и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Gluconobacter suboxydans.

Ксантопротеиновая реакция.

Компоненты, происходящие из сыворотки соевого творога, также содержатся в ферментированном посредством Acetobacter экстракте сыворотки соевого творога, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Acetobacter. Чтобы это продемонстрировать, применяли ксантопротеиновую реакцию. Все ферментированные экстракты сыворотки соевого творога давали положительную ксантопротеиновую реакцию, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Acetobacter, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством разных ферментированных Acetobacter экстрактов сыворотки соевого творога, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов разными ферментированными посредством Acetobacter экстрактами сыворотки соевого творога настоящего изобретения путем измерения продукции ФНО или NO в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Gluconobacter suboxydans в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации, составлявшая 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Acetobacter, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали продукцию NO в концентрации 10 мкМ/мл или больше, зависевшую от концентрации, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Gluconobacter suboxydans, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Gluconobacter suboxydans, с полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении любого из тестовых ферментированных посредством Acetobacter экстрактов сыворотки соевого творога в концентрации 100 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(3) Ферментированный посредством Acetobacter экстракт коричневой морской водоросли.

A. Получение.

Порошок сушеного мекабу (mekabu) (спорофилл коричневой морской водоросли) (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфата гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Acetobacter aceti, или 0,1 мл смеси Acetobacter, или одну колонию Gluconobacter suboxydans, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Acetobacter экстракте коричневой морской водоросли было выявлено, что экстракцией получено около 17, 62 и 46 гликолипидов соответственно на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством Acetobacter aceti, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством смеси Acetobacter, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством Gluconobacter suboxydans.

Реакция на β-гликан.

Компоненты, происходящие из коричневой морской водоросли, также содержатся в ферментированном Acetobacter экстракте коричневой морской водоросли, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Acetobacter. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию на β-гликан, с ипользованием теста Fungitec G Test MK (Seikagaku Corporation). Все ферментированные Acetobacter экстракты коричневой морской водоросли давали положительную реакцию на β-гликан, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Acetobacter, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством разных ферментированных Acetobacter экстрактов коричневой морской водоросли, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов разными ферментированными экстрактами коричневой морской водоросли настоящего изобретения путем измерения продукции ФНО или NO в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Gluconobacter suboxydans в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации, составлявшая 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Acetobacter, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO наблюдали продукцию NO в концентрации 10 мкМ/мл или больше, зависевшую от концентрации, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Gluconobacter suboxydans, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Acetobacter aceti, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного смесью Acetobacter, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Gluconobacter suboxydans, с полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении любого из тестовых ферментированных посредством Acetobacter экстрактов коричневой морской водоросли в концентрации 100 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(4) Пример практического применения разных ферментированных посредством Acetobacter aceti растительных экстрактов в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих разные растительные экстракты, ферментированные посредством Acetobacter aceti.

Смешивали такие материалы, как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и каждый из ферментированных Acetobacter aceti растительных экстрактов (пшеничный экстракт Acetobacter aceti, экстракт сыворотки соевого творога, или ферментированный экстракт коричневой морской водоросли), полученных в указанном примере, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160 °С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида в качестве активного компонента растительного экстракта, ферментированного Acetobacter, и количество составляло соответственно 3,5, 3,1 и 2,4 мкг/г для ферментированного Acetobacter aceti экстракта пшеницы, ферментированного Acetobacter aceti экстракта сыворотки соевого творога и ферментированного Acetobacter aceti экстракта коричневой морской водоросли. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле, все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Acetobacter aceti растительного экстракта (один образец критерия знаков: р <0,03).

(5) Пример эффективности лекарственных препаратов разных ферментированных Acetobacter aceti растительных экстрактов.

Действие ингибирования атопического дерматита каждого растительного экстракта, ферментированного посредством Acetobacter aceti.

Для изучения действия при атопическом дерматите каждого из растительных экстрактов, ферментированных посредством Acetobacter aceti, использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей BALB/c. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в этом примере ферментированный Acetobacter aceti экстракт пшеницы, ферментированный Acetobacter aceti экстракт сыворотки соевого творога или ферментированный Acetobacter aceti экстракт коричневой морской водоросли (каждый экстракт в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мкл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха мышей. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражена в разнице ( Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1- Δ отек наружного уха после введения препарата/ Δ отек наружного уха в контрольной группе) ×100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 1. Из табл. 1 очевидно, что наблюдается ингибирование аллергической реакции с ферментированным Acetobacter aceti экстрактом пшеницы, ферментированным Acetobacter aceti экстрактом сыворотки соевого творога и ферментированным Acetobacter aceti экстрактом коричневой морской водоросли.

Таблица 1Действие ингибирования аллергической реакции разных растительных экстрактов, ферментированных посредством Acetobacter aceti

Пример 2.

Ферментированный растительный экстракт, содержащий Limulus-положительный гликолипид из Xanthomonas.

Ферментированный растительный иммуностимулирующий экстракт, полученный путем ферментации растительного компонента единственными Xanthomonas.

(1) Ферментированный экстракт пшеницы.

A. Получение.

Культивирование Xanthomonas с пшеницей.

Пшеничную муку (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Xanthomonas campestris, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °C в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Xanthomonas экстракте пшеницы было выявлено, что экстракцией получено около 2,2 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта пшеницы, ферментированного Xanthomonas campestris.

Реакция крахмала с йодом.

Компоненты, происходящие из пшеницы, также содержатся в каждом ферментированном экстракте пшеницы, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Xanthomonas. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию крахмала с йодом. Ферментированный экстракт пшеницы давал положительную реакцию крахмала с йодом, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Xanthomonas, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством ферментированных Xanthomonas экстрактов пшеницы и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами пшеницы, ферментированными Xanthomonas, путем измерения продукции ФНО или NO в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Xanthomonas campestris, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного посредством Xanthomonas, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного Xanthomonas, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта пшеницы, ферментированного Xanthomonas, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Xanthomonas экстракта пшеницы в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(2) Ферментированный посредством Xanthomonas экстракт сыворотки соевого творога.

A. Получение.

Сухой экстракт сыворотки соевого творога (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Xanthomonas campestris и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в ферментированном посредством Xanthomonas экстракте сыворотки соевого творога было выявлено, что экстракцией получено около 1,6 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта, ферментированного Xanthomonas campestris.

Ксантопротеиновая реакция.

Компоненты, происходящие из сыворотки соевого творога, также содержатся в ферментированном экстракте сыворотки соевого творога, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Xanthomonas. Чтобы это продемонстрировать, применяли ксантопротеиновую реакцию. Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога давал положительную ксантопротеиновую реакцию, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Xanthomonas, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством ферментированных Xanthomonas экстрактов сыворотки соевого творога и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами сыворотки соевого творога, ферментированными Xanthomonas, путем измерения продукции ФНО или NO, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Xanthomonas campestris, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Xanthomonas, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Xanthomonas, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Xanthomonas, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Xanthomonas экстракта сыворотки соевого творога в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(3) Ферментированный посредством Xanthomonas экстракт коричневой морской водоросли.

A. Получение.

Порошок сушеного мекабу (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Xanthomonas campestris, и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в ферментированном посредством Xanthomonas экстракте коричневой морской водоросли было выявлено, что экстракцией получено около 2,2 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Xanthomonas campestris.

Реакция на β-глюкан.

Компоненты, происходящие из коричневой морской водоросли, также содержатся в ферментированном Xanthomonas экстракте коричневой морской водоросли, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Xanthomonas. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию на β-глюкан, с использованием теста Fungitec G Test MK (Seikagaku Corporation). Ферментированный Xanthomonas экстракт коричневой морской водоросли давал положительную реакцию на β-глюкан, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Xanthomonas, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством ферментированных Xanthomonas экстрактов коричневой морской водоросли и их ингибирование полимиксином B.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами коричневой морской водоросли, ферментированными Xanthomonas, путем измерения продукции ФНО или NO, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Xanthomonas campestris, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством Xanthomonas, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Xanthomonas, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Xanthomonas, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Xanthomonas экстракта коричневой морской водоросли в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(4) Пример практического применения разных ферментированных посредством Xanthomonas растительных экстрактов в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих разные растительные экстракты, ферментированные посредством Xanthomonas.

Смешивали такие материалы как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и каждый из ферментированных посредством Xanthomonas растительных экстрактов (пшеничный экстракт Xanthomonas, экстракт сыворотки соевого творога, или ферментированный экстракт коричневой морской водоросли), полученных в указанном примере, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160 °С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида в качестве активного компонента растительного экстракта, ферментированного Xanthomonas, и это количество составляло соответственно 3,5, 3,1 и 2,4 мкг/г для ферментированного Xanthomonas экстракта пшеницы, ферментированного Xanthomonas экстракта сыворотки соевого творога и ферментированного Xanthomonas экстракта коричневой морской водоросли. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле, все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Xanthomonas растительного экстракта (один образец критерия знаков: р <0,03).

(5) Пример эффективности лекарственных препаратов разных ферментированных Xanthomonas растительных экстрактов.

Действие ингибирования атопического дерматита каждого растительного экстракта, ферментированного посредством Xanthomonas.

Для изучения действия при атопическом дерматите каждого из растительных экстрактов, ферментированных посредством Xanthomonas, использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей BALB/c. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в этом примере ферментированный Xanthomonas экстракт пшеницы, ферментированный Xanthomonas экстракт сыворотки соевого творога и ферментированный Xanthomonas экстракт коричневой морской водоросли (каждый экстракт в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мкл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха каждой мыши. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражается в разнице ( Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1- Δ отек наружного уха после введения препарата/ Δ отек наружного уха в контрольной группе) ×100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 2. Из табл. 2 очевидно, что наблюдается ингибирование аллергической реакции с ферментированным Xanthomonas экстрактом пшеницы, ферментированным Xanthomonas экстрактом сыворотки соевого творога и ферментированным Xanthomonas экстрактом коричневой морской водоросли.

Таблица 2Действие ингибирования аллергической реакции разных растительных экстрактов, ферментированных посредством Xanthomonas

Пример 3.

Ферментированный растительный экстракт, содержащий Limulus-положительный гликолипид из Enterobacter.

Ферментированный растительный иммуностимулирующий экстракт, полученный путем ферментации растительного компонента единственными Enterobacter.

(1) Ферментированный экстракт пшеницы.

A. Получение.

Культивирование Enterobacter с пшеницей.

Пшеничную муку (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Enterobacter cloacae, и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Enterobacter экстракте пшеницы было выявлено, что экстракцией получено около 1,9 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта пшеницы, ферментированного Enterobacter cloacae.

Реакция крахмала с йодом.

Компоненты, происходящие из пшеницы, также содержатся в каждом ферментированном Enterobacter экстракте пшеницы, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Enterobacter. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию крахмала с йодом. Ферментированный экстракт пшеницы давал положительную реакцию крахмала с йодом, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Enterobacter, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством ферментированных Enterobacter экстрактов пшеницы, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами пшеницы, ферментированными Enterobacter, путем измерения продукции ФНО или NO, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Enterobacter cloacae, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, наблюдалась продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного посредством Enterobacter, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного Enterobacter, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта пшеницы, ферментированного Enterobacter, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Enterobacter экстракта пшеницы в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(2) Ферментированный посредством Enterobacter экстракт сыворотки соевого творога.

A. Получение.

Сухой экстракт сыворотки соевого творога (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфата гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Enterobacter cloacae и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в ферментированном посредством Enterobacter экстракте сыворотки соевого творога было выявлено, что экстракцией получено около 5 60 мкг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта, ферментированного Enterobacter cloacae.

Ксантопротеиновая реакция.

Компоненты, происходящие из сыворотки соевого творога, также содержатся в ферментированном Enterobacter экстракте сыворотки соевого творога, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Enterobacter. Чтобы это продемонстрировать, применяли ксантопротеиновую реакцию. Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога давал положительную ксантопротеиновую реакцию, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Enterobacter, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством ферментированных Enterobacter экстрактов сыворотки соевого творога, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами сыворотки соевого творога, ферментированными Enterobacter, путем измерения продукции ФНО или NO, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Enterobacter cloacae, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации, в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Enterobacter, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Enterobacter, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Enterobacter, полимиксином В, представляющий собой ингибитор липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Enterobacter экстракта сыворотки соевого творога в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(3) Ферментированный посредством Enterobacter экстракт коричневой морской водоросли.

A. Получение.

Порошок сушеного мекабу (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1M магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1M хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Enterobacter cloacae, и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90 °С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом endospecy.

Limulus-реакция.

В результате измерения тестом endospecy содержания гликолипидов в ферментированном посредством Enterobacter экстракте коричневой морской водоросли было выявлено, что экстракцией получено около 910 мкг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Enterobacter cloacae.

Реакция на β-глюкан.

Компоненты, происходящие из коричневой морской водоросли, также содержатся в ферментированном Enterobacter экстракте коричневой морской водоросли, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Enterobacter. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию на β-глюкан, с использованием теста Fungitec G Test MK (Seikagaku Corporation). Ферментированный Enterobacter экстракт коричневой морской водоросли давал положительную реакцию на β-глюкан, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Enterobacter, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (NO) посредством ферментированных Enterobacter экстрактов коричневой морской водоросли, и их ингибирование полимиксином.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами коричневой морской водоросли, ферментированными Enterobacter, путем измерения продукции ФНО или NO, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Enterobacter cloacae, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством Enterobacter, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Enterobacter, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Enterobacter, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Enterobacter экстракта коричневой морской водоросли в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(4) Пример практического применения разных ферментированных посредством Enterobacter растительных экстрактов в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих разные растительные экстракты, ферментированные посредством Enterobacter.

Смешивали такие материалы как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и каждый из ферментированных посредством Enterobacter растительных экстрактов (пшеничный экстракт Enterobacter, экстракт сыворотки соевого творога, или ферментированный Enterobacter экстракт коричневой морской водоросли), полученных в указанном примере, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160 °С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида в качестве активного компонента растительного экстракта, ферментированного Enterobacter, и это количество составляло соответственно 10,1, 8,4 и 6,8 мкг/г для ферментированного Enterobacter экстракта пшеницы, ферментированного Enterobacter экстракта сыворотки соевого творога и ферментированного Enterobacter экстракта коричневой морской водоросли. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле, все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Enterobacter растительного экстракта (один образец критерия знаков: р <0,03).

(5) Пример эффективности лекарственных препаратов разных ферментированных Enterobacter растительных экстрактов.

Действие ингибирования атопического дерматита каждого растительного экстракта, ферментированного посредством Enterobacter.

Для изучения действия при атопическом дерматите каждого из растительных экстрактов, ферментированных посредством Enterobacter, использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей BALB/c. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в этом примере ферментированный Enterobacter экстракт пшеницы, ферментированный Enterobacter экстракт сыворотки соевого творога или ферментированный Enterobacter экстракт коричневой морской водоросли (каждый экстракт в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха каждой мыши. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражается в разнице ( Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1А отек наружного уха после введения препарата/ Δ отек наружного уха в контрольной группе) ×100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 3. Из табл. 3 очевидно, что наблюдается ингибирование аллергической реакции с ферментированным Enterobacter экстрактом пшеницы, ферментированным Enterobacter экстрактом сыворотки соевого творога и ферментированным Enterobacter экстрактом коричневой морской водоросли.

Таблица 3Действие ингибирования аллергической реакции разных растительных экстрактов, ферментированных посредством Enterobacter

Пример 4.

Липополисахариды из Acetobacter (Acetobacter aceti, смеси Acetobacter, Gluconobacter suboxydans).

Виды Acetobacter, представляющие собой грамотрицательные, широко распространенные во всем мире бактерии, часто употребляются в пищу и необходимы для производства уксуса. При этом практически ничего не известно о липополисахаридах из Acetobacter, культивированных с животным материалом или растительным материалом. Их биологическая активность также отличается от биологической активности известных липополисахаридов.

(1) Липополисахариды из Acetobacter, полученные общепринятым способом культивирования Acetobacter.

А. Получение.

Acetobacter aceti или Gluconobacter suboxydans высевали на агаровую среду (полипептон 5,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, глюкоза 5,0 г, магния сульфата гептагидрат 1,0 г и агар 15,0 г/л) и культивировали при 30 °С в течение двух дней. В культуральный флакон добавляли одну колонию Acetobacter aceti, или Gluconobacter suboxydans, или 0,1 мл смеси Acetobacter, в которую было добавлено 50 мл стерилизованной жидкой среды (полипептон 5,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, глюкоза 5,0 г и магния сульфата гептагидрат 1,0 г/л), оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней. После культивирования в течение 5 дней, в 30 культуральных флаконов добавляли 1 мл раствора культуры бактерий, в эти флаконы было также добавлено 50 мл среды, их оставляли для отстаивания и культивировали при 30 °С в течение 5 дней.

Экстракция.

В качестве способа экстракции применяли способ Вестфаля (Westphal).

К влажным микробным клеткам Acetobacter aceti, или Gluconobacter suboxydans, или смеси Acetobacter добавляли дистиллированную воду для получения конечной концентрации 100 мг/мл и делали суспензию микробных клеток. К указанной суспензии добавляли равный объем 90% раствора фенола и полученную смесь перемешивали при температуре от 65 до 68 °С в течение 20 мин. После этого раствор охлаждали до 10 °С или ниже и центрифугировали со скоростью 10000 об/мин при 4 °С в течение 20 мин, используя высокоскоростную охлаждающую центрифугу. После центрифугирования в другую пробирку переносили только верхний водный слой, а промежуточный слой и нижний слой фенола возвращали назад в исходную пробирку, в которую добавляли дистиллированную воду в количестве, равном количеству собранного водного слоя. Получаемый раствор снова перемешивали при 65-68 °С в течение 20 мин. Затем раствор охлаждали до 10 °С или ниже, и центрифугировали со скоростью 10000 об/мин при 4 °С в течение 20 мин, используя высокоскоростную охлаждающую центрифугу. После центрифугирования собирали только верхний водный слой и соединяли с ранее собранным водным слоем. Этот собранный водный слой подвергали ультрафильтрации или диализу с целью удаления фенола. Содержание гликолипида, содержавшегося в каждом экстракте раствора, измеряли тестом endospecy.

В. Физические свойства и биологическая активность.

Липополисахариды, происходящие из Acetobacter, получали из микробных клеток Acetobacter способом Вестфаля. В этом анализе задействовали три вида Acetobacter species, т.е. Acetobacter aceti, которые являются представителем видов Acetobacter species, смесь Acetobacter, применяемая в производстве уксусов, и Gluconobacter suboxydans. В результате измерения содержания гликолипидов тестом endospecy было выявлено, что экстракцией получено около 5, 12,5 и 10 мг гликолипидов на 1 г влажных микробных клеток Acetobacter aceti, смеси Acetobacter и Gluconobacter suboxydans соответственно. Для изучения биологической активности были предприняты попытки дополнительной очистки раствора, полученного фенольной экстракцией. Поскольку основными компонентами экстракта раствора, кроме гликолипидов, являлись нуклеиновые кислоты, вначале раствор обрабатывали ДНКазой, и затем РНКазой. Затем добавляли равный объем 90% фенола. Получаемый раствор перемешивали в течение 10 мин со скоростью 10000 об/мин при 4 °С в течение 20 мин, используя высокоскоростную охлаждающую центрифугу. Собирали только верхний водный слой. Этот собранный водный слой подвергали ультрафильтрации или диализу для удаления фенола.

Реакция Limulus.

Изучали присутствие Limulus-положительных гликолипидов в Acetobacter aceti, смеси Acetobacter и в Gluconobacter suboxydans, используя набор endospecy для обнаружения липополисахарид-специфической реакции, коммерчески доступный от Seikagaku Corporation. В результате было выявлено, что экстракцией получено около 5, 12,5 и 10 мг Limulus-положительных ликолипидов на 1 г влажных микробных клеток Acetobacter aceti, смеси Acetobacter и Gluconobacter suboxydans. Этим показано, что Limulus-положительные гликолипиды содержатся в Acetobacter aceti, смеси Acetobacter и Gluconobacter suboxydans.

Молекулярная масса.

Проводили анализ SDS-PAGE электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для определения молекулярной массы Limulus-положительного гликолипида (липополисахарида) происходящего из Acetobacter aceti или смеси Acetobacter. В отношении ЛПСр выявлена полоса около 5000, что свидетельствует о низкой молекулярной массе. У липополисахаридов, происходящих из Acetobacter aceti или смеси Acetobacter, выявлена полоса около 5000, и предполагается, что эти Limulus-положительные ликолипиды (липополисахариды) являются низко молекулярными.

Продукция ФНО и продукция NO и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов липополисахаридами, происходящими из Acetobacter aceti, липополисахаридами, происходящими из Gluconobacter suboxydans, и липополисахаридами, происходящими из смеси Acetobacter, путем измерения продукции ФНО или NO в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который представляет собой ингибитор липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества липополисахаридов из Acetobacter aceti, липополисахаридов из Gluconobacter suboxydans и липополисахаридов из смеси Acetobacter в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Limulus. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении липополисахаридов из Acetobacter aceti, липополисахаридов из Gluconobacter suboxydans или липополисахаридов из смеси Acetobacter в концентрации 1000 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции NO наблюдали зависевшую от концентрации продукцию NO, в концентрации 20 мкМ/мл или больше, при добавлении липополисахаридов из Acetobacter aceti, липополисахаридов из Gluconobacter suboxydans или липополисахаридов из смеси Acetobacter в концентрации 10000 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции NO выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, которые стимулированы посредством липополисахаридов из Acetobacter, полимиксином В, представляющий собой ингибитор липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция NO почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении липополисахаридов из Acetobacter aceti, липополисахаридов из Gluconobacter suboxydans или липополисахаридов из смеси Acetobacter в концентрации 10000 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

Продукция ФНО с использованием макрофагов с делецией TLR4.

При использовании макрофагальных клеток с делецией TLR4, являющегося рецептором для липополисахаридов, было выявлено ослабление активирующей функции макрофагов, индуцируемой липополисахаридом из Acetobacter aceti, липополисахаридом из Gluconobacter suboxydans или липополисахаридом из смеси Acetobacter. Липополисахарид передает сигнал на макрофагальные клетки посредством TLR4, который является его рецептором на поверхности клетки. При этом зимозан, представляющий собой компонент оболочки дрожжевой клетки, передает сигнал для активации макрофагов посредством TLR2. Поэтому считается, что, если субстанцией, содержащейся в Acetobacter, которая активирует макрофаги, является липополисахарид, сигнал не передается в макрофаги с делецией TLR4, и в результате ослабляется активация макрофагов, что уменьшает продукцию ФНО и NO.

В макрофагальных клетках с делецией TLR4 отсутствовала продукция ФНО, если липополисахарид из Acetobacter aceti, липополисахарид из Gluconobacter suboxydans или липополисахарид из смеси Acetobacter добавляли в концентрации 1000 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр. Этот результат означает ослабление активации макрофагов, что уменьшает продукцию ФНО и NO. Таким образом, было показано, что TLR4 вовлечен в активацию макрофагов посредством липополисахарида из Acetobacter aceti, липополисахарида из Gluconobacter suboxydans или липополисахарида из смеси Acetobacter.

Функциональные различия между липополисахаридом из Acetobacter и известными липополисахаридами.

Липополисахарид из Acetobacter aceti и липополисахарид из смеси Acetobacter полностью отличаются от известных липополисахаридов, а именно от липополисахарида из Escherichia coli и липополисахарида из Pantoea agglomerans дозозависимой продукцией ФНО и NO. Известные липополисахариды, например липополисахарид из Escherichia coli и липополисахарид из Pantoea agglomerans в концентрации 10 нг/мл (в пересчете на концентрацию ЛПСр, на основе реакции Limulus), показали продукцию ФНО в концентрации 10 ед./мл или больше В зависимом от концентрации образом. Аналогично, в отношении продукции NO, указанные липополисахариды в концентрации 10 нг/мл или больше показали продукцию NO в концентрации 20 мкМ/мл или большезависимым от концентрации образом. С другой стороны, липополисахарид из Acetobacter aceti и липополисахарид из смеси Acetobacter в концентрации 100 нг/мл (в пересчете на концентрацию ЛПСр, на основании реакции Limulus), не показали продукции ФНО. В случае продукции NO также не выявлено индуцирования продукции NO липополисахаридом из Acetobacter aceti и липополисахаридом из смеси Acetobacter в концентрации 1000 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр. Таким образом, это указывает на различия в биологической активности липополисахаридов из Acetobacter и известных липополисахаридов, и на то, что липополисахарид из Acetobacter можно считать новым веществом.

(2) Пример практического применения липополисахаридов из Acetobacter в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих липополисахариды из Acetobacter.

Смешивали такие материалы, как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и липополисахарид из Acetobacter aceti, полученный в примере 2, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160 °С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида из Acetobacter aceti в качестве активного компонента, составившее 2,1 мкг/г. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Acetobacter aceti растительного экстракта (один образец критерия знаков: р <0,03).

(3) Пример эффективности лекарственного препарата липополисахарида из Acetobacter.

Действие ингибирования атопического дерматита липополисахаридом из Acetobacter.

Для изучения действия липополисахарида из Acetobacter при атопическом дерматите использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей BALB/c. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в указанном примере липополисахарида из Acetobacter aceti (в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мкл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха мышей. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражена в разнице ( Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1- Δ отек наружного уха после введения препарата/ Δ отек наружного уха в контрольной группе) ×100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 4. Из табл. 4 очевидно, что липополисахарид из Acetobacter aceti ингибирует аллергическую реакцию как при подкожном введении, так и при пероральном введении.

Таблица 4Ингибирующее действие липополисахарида из Acetobacter aceti на аллергическую реакцию

Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем изобретении, включены в него со ссылкой во всей их полноте.