Изобретение относится к новым нейростероидным производным с антиапоптотическими, нейропротективными и нейрогенными свойствами, которые влияют на нервную систему, а также к способам их получения и их применения при лечении и/или предотвращении или улучшении нейродегенеративных заболеваний, относящихся к нейрональному апоптозу или нейрональному повреждению, или состояний, относящихся или возникающих в результате апоптоза, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз (БАС), дегенерацию и отслоение сетчатки глаз, периферическую невропатию, вызванную генетическими нарушениями, диабетом, полиомиелитом, герпесом, СПИДом и химиотерапией, травмой головного мозга или ишемией и инсультом. Активные соединения изображены формулой (I)

где R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , А, В, X, Y и Z определены в описании изобретения. Также изобретение включает композиции, которые содержат одно или более соединений формулы (I).

[0001] Композиция, обладающая нейростероидной активностью, содержащая по меньшей мере одно соединение формулы (I)

[0002] Композиция по п.1, где X представляет собой атом кислорода.

[0003] Композиция по п.1, где X представляет собой метиленовую группу.

[0004] Композиция по любому из предшествующих пунктов, где двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R3 отсутствует.

[0005] Композиция по любому из пп.1-3, где R1=OH; R2=R5=R6=R7=Y=Н, А=-(СН2)n- и В=-(СН2)y-; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R3 отсутствует; R4=Me; n=0 и y=1.

[0006] Композиция по п.1, где соединение формулы (I) выбрано из следующих соединений, включая их фармацевтически приемлемые эфиры, соли и кислотно-аддитивные соли:

[0007] Соединение формулы (I), как определено в п.1, или его фармацевтически приемлемый эфир, соль или кислотно-аддитивная соль, но не включая соединения формулы (I), где:

[0008] Соединение по п.7, где X представляет собой атом кислорода.

[0009] Соединение по п.7, где X представляет собой метиленовую группу.

[0010] Соединение по любому из пп.7-9, где двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R3 отсутствует.

[0011] Соединение по любому из пп.7-9, где R1=OH; R2=R5=R6=R7=Y=Н, А=-(СН2)n- и В=-(СН2)y-; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R3 отсутствует; R4=Me; n=0 и y=1.

[0012] Соединение по п.7, выбранное из следующих соединений, включая его фармацевтически приемлемые эфиры, соли и кислотно-аддитивные соли:

[0013] Соединение формулы (I), как определено в любом из пп.1-6, или его фармацевтически приемлемый эфир, соль или кислотно-аддитивная соль для применения в терапии.

[0014] Способ предотвращения или лечения нейродегенеративного состояния, относящегося к нейрональному апоптозу или нейрональному повреждению, согласно которому вводят пациенту эффективное количество соединения формулы (I), как определено ниже

[0015] Способ по п.14, где состояние выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза (БАС), дегенерации сетчатки глаз, отслоения сетчатки глаз, периферической невропатии, вызванной генетическими нарушениями, диабетом, полиомиелитом, герпесом, СПИДом, травмой головного мозга, ишемией и инсультом.

[0016] Применение соединения формулы (I), как определено в п.14, или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли для регулирования пролиферации, дифференциации, миграции и регенерации нервных стволовых клеток и нервных клеток-предшественников в разных органах и тканях, включая центральную нервную систему и периферическую нервную систему.

[0017] Применение соединения формулы (I), как определено в п.14, или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли для регулирования пролиферации, дифференциации, миграции и регенерации эпителиальных, эндотелиальных, мезенхимных, лимфоидных, эритроидных и мононуклеарных клеток.

[0018] Применение соединения формулы (I), как определено в п.14, или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли для предотвращения, улучшения или лечения ФРН-связанных состояний или заболеваний в ходе связывания, активации или ингибирования рецепторов факторов роста нервов (ФРН), включая рецепторы TrkA и p75NTR.

Область изобретения

Данное изобретение относится к нейростероидным соединениям, включая спиронейростероидные аналоги без эндокринных эффектов, но с сильными антиапоптотическими, нейропротективными и нейрогенными свойствами, и их применению при лечении, предотвращении или улучшении симптомов нейродегенеративных заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз (ALS от amyotrophic lateral sclerosis), дегенерацию и отслоение сетчатки глаз, и для уменьшения доброкачественной забывчивости и нарушения памяти при старческом слабоумии или в связи с нейродегенеративными заболеваниями. В качестве неограничивающего примера показано непосредственное воздействие стероидных соединений на нервную систему. Дополнительными показаниями для этих нейростероидных соединений являются лечение невропатии, а именно периферической невропатии, вызванной генетическими нарушениями и другими состояниями, такими как диабет, полиомиелит, герпес, СПИД, химиотерапия, травма головного мозга или ишемия и инсульт.

Предшествующий уровень техники

Термин "нейродегенерация" используется здесь в отношении прогрессирующей потери нервных клеток, возникающей при старении и при нейродегенеративных заболеваниях, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), рассеянный склероз и болезнь Хантингтона, и при инсульте, травме головы и спинного мозга (Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 1, 120 (2000)). Главным образом, эти заболевания характеризуются хронической и прогрессирующей потерей нейронов в отдельных областях головного мозга или периферических нервах, вызывая ослабляющие симптомы, такие как слабоумие, потеря памяти, потеря сенсорной или двигательной способности, сниженное общее качество жизни и здоровья, нетрудоспособность и, в результате, преждевременную смерть. В настоящее время не существует или существует мало способов лечения большинства нейродегенеративных заболеваний, в лучшем случае способы лечения являются по природе симптоматическими и не предотвращают или не замедляют развитие болезни.

Термин "гибель нейрональных клеток" в результате апоптоза используется здесь в отношении "конечной точки" многих неврологических заболеваний человека, включая, но не ограничиваясь ими, болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона, инсульт/травму, рассеянный и боковой амиотрофический склероз (Trends Neurosci., 28, 670 (2006)). Апоптотическая гибель гиппокампальных и кортикальных нейронов обусловливает симптомы болезни Альцгеймера; гибель нейронов среднего мозга, что используют нейромедиатор дофамин, лежит в основе болезни Паркинсона; болезнь Хантингтона приводит к гибели нейронов в стриатуме, что регулируют движения тела; и гибель низших двигательных нейронов проявляется как боковой амиотрофический склероз. Кроме того, ишемия и травма головного мозга вызывают некроз небольшой области головного мозга, который затем увеличивает потерю нейрональных клеток в результате апоптоза в более значительной области головного мозга вследствие высвобождения некротическими клетками нейротоксического вещества. Также апоптотическая гибель нейрональных клеток наблюдается в стареющем головном мозге как физиологический процесс.

Термин "природные нейростероиды" используется здесь в отношении молекул с остовом холестерина, таких как дегидроэпиандростерон (ДГЭА) или аллопрегнанолон, которые вырабатываются в головном мозге (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 4089 (1998)). Предшествующие изучения показали, что эти эндогенные встречающиеся в природе нейростероиды могут защищать нейроны от апоптоза клеток, вызванного депривацией нейротрофических факторов (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 8209 (2004)). Нейропротективные, антиапоптотические эффекты этих нейростероидов проявляются при очень низких наномолярных концентрациях (1 нМ) и опосредованы активацией специфических мембранных рецепторов и последующим образованием антиапоптотических Bcl-2 белков (FASEB. J. 20, 577 (2006)). Кроме того, эти природные нейростероиды в наномолярных концентрациях стимулируют секрецию и образование нейропротективного дофамина (Endocrinology. 146, 3309 (2005)).

Центральная нервная система (ЦНС) взрослого человека традиционно известна как структура с очень ограниченной регенерационной способностью. Однако показано, что некоторые патологические состояния, такие как ишемия, эпилепсия и травма, повышающее регулируют активность нервных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне и зубчатой извилине. Эти открытия указывают на то, что импульсы присутствуют во всем взрослом головном мозге, что позволяет проявляться ограниченной нейрональной регенерации. Это основное наблюдение изменяет наш взгляд на нейродегенерацию и регенерационную способность головного мозга, давая нам потенциальную возможность регенерировать конкретные области головного мозга. Недавно было показано, что два встречающихся в природе нейростероида (ДГЭА и аллопрегнанолон) вызывают нейрогенез в разных экспериментальных моделях (Proc. Natl. Acad Sci USA. 101, 3202 (2004) и J. Neurosci. 25, 4706 (2005)).

Отсутствие эффективного способа лечения угнетающих нейродегенеративных заболеваний вызвало значительный интерес к разработке нейропротективных средств, которые могут предотвращать или лечить прогрессирующую потерю нервной функции, приводящую к серьезному нарушению и смерти. Существует длительная потребность в разработке новых соединений для защиты, восстановления и сохранения нервных клеток, направленной на апоптоз нервных клеток и продолжительность существования или нейрогенез. Природные нейростероиды, такие как ДГЭА, обладают важными нейропротективными и нейрогенными свойствами in vitro и in vivo в экспериментальных животных. Однако встречающиеся в природе нейростероиды в процессе обмена веществ превращаются в людях в эстрогены, андрогены или прогестины, которые проявляют распространенные и важные эндокринные побочные эффекты, включая гормонально-зависимую неоплазию (Front Neuroendocrinol. 21, 1 (2000)), таким образом ограничивая их клиническое применение.

Патент GB 1079840 (1966) раскрывает 3 β-гидрокси-17-спирооксиранил-андрост-50-ен в качестве промежуточного соединения при синтезе конкретных стероидных соединений лактона.

Патент US 3320242 (1967) раскрывает 17 β,20-эпоксистероиды и способы их получения. А именно, 17 β,20-эпокси-17 α-метиландрост-5-ен-3 β-ол (1) и 17 β,20-эпокси-17 α-метиландрост-4-ен-3-он (2) заявлены.

В патенте US 3300489 (1967) раскрыты стероидные С-17 спиролактоны, способы и промежуточные соединения, используемые при их получении. Соединения 3 и 4, представленные ниже, раскрыты как промежуточные соединения.

где X представляет собой одинарную С-С связь или метиленовую группу.

Патенты US 3413288 (1968) и US 3506652 раскрывают способ получения стероидных С-17 спиролактонов при использовании в качестве промежуточного соединения стероидного эпоксидного соединения, имеющего формулу

где Y представляет собой одинарную связь, когда W представляет собой гидроксильную группу.

Патент US 3365475 (1968) раскрывает способ получения 17 α-(3'-гидроксипропил)-4-андростен-3 β,17 β-диола, который используется при получении стероидных 17-спиротетрагидрофуранов, которые обладают полезными терапевтическими свойствами в качестве ингибиторов альдостерона.

Патент US 3364238 (1968) раскрывает 3-окисленные спиро[андростен-17,1'-циклопроп-2'-ены] и их 2',3'-дигидропроизводные структурной формулы

где R может представлять собой водород или низший алканоильный радикал;

R' и R" могут представлять собой водород или низший алкильный радикал;

пунктирная линия указывает на возможное присутствие двойной связи.

Патент US 4026918 (1977) описывает получение определенных D-гомостероидов, которые, как указано, обладают противовоспалительной активностью. (3 β,11 α,17 α)-Спиро[андрост-5-ен-17,2'-оксиран]-3,11-диол раскрыт в качестве химического промежуточного соединения.

Патент US 4054563 (1977) раскрывает способ изготовления стероидных соединений 17-спиро-(2'-оксациклопентана) общей формулы

где R ¹ представляет собой атом водорода или низшую алкильную группу, которые содержат двойную связь в 5-положении и метильную группу в 10-положении или три двойных связи в положениях 1, 3 и 5(10) и которые могут содержать дополнительную двойную связь в 9(11)-положении.

Указано, что соединения являются полезными промежуточными соединениями при получении антагонистов альдостерона.

Публикация WO 98/33506 раскрывает применение конкретных соединений для ингибирования синтеза андрогенов, которые, как указано, полезны при лечении рака предстательной железы и доброкачественной гиперплазии предстательной железы 17 β,20 β-азиридинил-прегн-5-ен-3 β-ол является одним из перечисленных соединений сравнения.

Helvetica Chimica Acta 34, 756-767 (1951) раскрывает схемы реакций, согласно которым могут быть образованы 20 α- и 20 β-стереоизомеры 17,20-эпокси-17 α-аллопрегнан-3 β,21-диола диацетата.

В Journal of Medicinal Chemistry 10(4), 546-551 (1967) указанный ниже стероидный циклический эфир формулы 5 упоминается как промежуточное соединение при получении стероидных соединений, имеющих антиэстрогенные свойства.

Tetrahedron 29, 883-889 (1973) раскрывает пути синтеза конкретных стероидов, при которых (3 β,17 β)-3'-этинил спиро[андрост-5-ен-17,2'-оксиран]-3-ол ацетат и (3 β,17 β)-3'-[(триметилсилил)этинил]спиро[андрост-5-ен-17,2'-оксиран]-3-ол ацетат являются промежуточными соединениями.

Tetrahedron 43, 631-641 (1987) описывает получение соединений формул 6 и 7, указанных ниже, а также их 5 α-Н аналогов.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)

где R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , А, В, X, Y и Z являются такими, как определено в подробном описании ниже,

и к их фармацевтически приемлемым эфирам, солям и кислотно-аддитивным солям.

В другом аспекте данное изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый эфир, соль или кислотно-аддитивную соль в качестве активного компонента вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу предотвращения или лечения нейродегенеративного состояния, относящегося к нейрональному апоптозу или нейрональному повреждению, согласно которому вводят пациенту эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли. Указанное состояние, только в качестве примера, может быть болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, рассеянным склерозом, боковым амиотрофическим склерозом (БАС), дегенерацией сетчатки глаз, отслоением сетчатки глаз, периферической невропатией, вызванной генетическими нарушениями, диабетом, полиомиелитом, герпесом, СПИДом, травмой головного мозга, ишемией и инсультом.

В другом аспекте данное изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемому эфиру, соли или кислотно-аддитивной соли для применения в терапии.

В другом аспекте данное изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемому эфиру, соли или кислотно-аддитивной соли для применения при предотвращении или лечении нейродегенеративного состояния, относящегося к нейрональному апоптозу или нейрональному повреждению. Например, указанное состояние может быть любым из перечисленных выше.

В другом аспекте данное изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли для регулирования пролиферации, дифференциации, перемещения (миграции) и регенерации нервных стволовых клеток и нервных клеток-предшественников в разных органах и тканях, включая центральную нервную систему и периферическую нервную систему.

В другом аспекте данное изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли для регулирования пролиферации, дифференциации, миграции и регенерации эпителиальных, эндотелиальных, мезенхимных, лимфоидных, эритроидных и мононуклеарных клеток.

В другом аспекте данное изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого эфира, соли или кислотно-аддитивной соли для связывания, активации или ингибирования рецепторов фактора роста нервов (NGF от nerve growth factor), включая рецепторы TrkA и p75NTR.

Лучше понять изобретение возможно из следующего подробного описания статьи и желательных особенностей, свойств, характеристик и соотношения элементов, а также стадий способа, одной относительно других, как изложено и проиллюстрировано примерами в описании и иллюстративных воплощениях.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является гистограммой, показывающей влияние некоторых стероидных соединений на апоптоз РС12 клеток, полученных из нервного гребня, в экспериментальном исследовании с использованием методики анализа.

Фиг. 2 состоит из нескольких графиков, показывающих зависимость апоптоза PC12 клеток, полученных из нервного гребня (как измерено с помощью оптической плотности с использованием колориметра), от концентрации некоторых стероидных соединений в экспериментальном исследовании с использованием методики анализа.

Фиг. 3 показывает результаты экспериментального исследования с использованием анализа FACS (возбужденной флуоресценции сортированных клеток) влияния некоторых стероидных соединений на апоптоз РС12 клеток, полученных из нервного гребня.

Фиг. 4 показывает результаты экспериментального исследования влияния некоторых стероидных соединений на уровни антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL белков в РС12 клетках, полученных из нервного гребня.

Фиг. 5 показывает результаты экспериментального исследования связывания некоторых стероидных соединений с выделенными мембранами РС12 симпатоадреналовых клеток крыс в зависимости от концентрации.

Фиг. 6 показывает результаты экспериментального исследования влияния некоторых стероидных соединений на дофаминергические РС12 клетки, полученные из нервного гребня.

Фиг. 7 показывает результаты экспериментального исследования влияния некоторых соединений на первичные кортикальные нейросферы, полученные из мышей дикого типа.

Фиг. 8 показывает результаты экспериментального исследования влияния синтетического нейростероида на нервные клетки-предшественники, выделенные из эмбрионального мозга мышей, в сравнении с контролем.

Фиг. 9 показывает результаты экспериментального исследования связывающей, активирующей или ингибирующей способности синтетического нейростероида в отношении факторов роста нервов в трансфицированных клетках HEK293.

Более подробное обсуждение графических материалов показано в примерах 7-13 ниже.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)

где R ¹ =OH;

R ² =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=Н;

R ⁴ =Me;

R ³ представляет собой водород или, когда двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, R ³ отсутствует;

X представляет собой метиленовую группу (-СН ₂ -) или атом кислорода;

А представляет собой -(СН ₂ ) _n -, С _2-5 алкениленовую группу или С _2-5 алкиниленовую группу, где n представляет собой целое число и может принимать значение 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5;

В представляет собой -(СН ₂ ) _y -, С _2-5 алкениленовую группу или С _2-5 алкиниленовую группу, где у представляет собой целое число и может принимать значение 1, или 2, или 3, или 4, или 5;

Z может быть связан с любым углеродом спироциклического заместителя в С17 стероидного скелета и независимо представлять собой возможно замещенный C _1-10 алкил, возможно замещенный С _2-10 алкенил, возможно замещенный С _2-10 алкинил, возможно замещенный арил, возможно замещенный арил-C ₁ -C ₁₆ -алкил, возможно замещенный гетероарил, возможно замещенный гетероарилалкил, формил, карбокси, -NC(O)R ⁸ , NC(S)R ⁸ , -NR ⁸ R ⁹ , возможно замещенный C(O)-W, возможно замещенный C(O)O-W, возможно замещенный C(S)O-W;

W представляет собой возможно замещенный С _1-10 алкил, возможно замещенный гетероциклоалкил, возможно замещенную конденсированную бициклическую кольцевую систему, возможно замещенную мостиковую бициклическую кольцевую систему, возможно замещенную мостиковую трициклическую кольцевую систему, возможно замещенный С _2-10 алкенил, возможно замещенный гетероциклоалкенил, возможно замещенный С _2-10 алкинил, возможно замещенный гетероциклоалкинил, возможно замещенный арил или возможно замещенный гетероарил;

R ⁸ и R ⁹ независимо представляют собой возможно замещенный C _1-10 алкил, возможно замещенный гетероциклоалкил, возможно замещенную конденсированную бициклическую кольцевую систему, возможно замещенную мостиковую бициклическую кольцевую систему, возможно замещенную мостиковую трициклическую кольцевую систему, возможно замещенный С _2-10 алкенил, возможно замещенный гетероциклоалкенил, возможно замещенный С _2-10 алкинил, возможно замещенный гетероциклоалкинил, возможно замещенный арил или возможно замещенный гетероарил;

где "возможно замещенный" относится к группам, замещенным в любом возможном положении группой, выбранной из C ₁ -C ₆ -алкила, C ₃ -C ₆ -циклического алкила, арила (карбоциклического арила и гетероарила), C ₂ -C ₁₆ -алкенила, C ₂ -C ₁₆ -алкинила, алкокси, гало, гало-C ₁ -C ₁₆ -алкила, амино, C ₁ -C ₁₆ -алкиламино, ди-C ₁ -C ₁₆ -алкиламино, меркапто, C ₁ -C ₁₆ -алкилтио, C ₁ -C ₁₆ -алкилсульфинила, C ₁ -C ₁₆ -алкилсульфонила, нитро, алканоила, алканоилокси, алканоилоксиалканоила, алкоксикарбокси, карбалкокси, карбоксамидо, формила, карбокси, гидрокси, циано, азидо, изоциано, изотиоциано, оксима, кето и их циклических кеталей, алканоиламидо, гетероарилокси, O-ароила, O-C ₁ -C ₁₆ -алкил-OH, O-C ₂ -C ₁₆ -алкенил-OH, O-C ₂ -C ₁₆ -алкинил-OH, O-C ₁ -C ₁₆ -алкил-NX ₁ X ₂ , O-C ₂ -C ₁₆ -алкенил-NX ₁ X ₂ , O-C ₂ -C ₁₆ -алкинил-NX ₁ X ₂ , NH-ацила, NH-ароила, CF ₃ , COOX ₃ , SO ₃ H, PO ₃ X ₁ X ₂ , OPO ₃ X ₁ X ₂ , SO ₂ NX ₁ X ₂ , CONX ₁ X ₂ , где каждый X ₁ и X ₂ независимо обозначает Н, или C ₁ -C ₁₆ -алкил, или C ₂ -C ₁₆ -алкенил, или C ₂ -C ₁₆ -алкинил, или X ₁ и X ₂ вместе составляют часть гетероциклического кольца, имеющего от приблизительно 4 до приблизительно 7 кольцевых атомов и возможно один дополнительный гетероатом, выбранный из O, N или S, или вместе X ₁ и X ₂ составляют часть имидного кольца, имеющего приблизительно 5-6 кольцевых атомов, и X ₃ обозначает Н, C ₁ -C ₁₆ -алкил, C ₂ -C ₁₆ -алкенил, C ₂ -C ₁₆ -алкинил, гидрокси-C ₁ -C ₆ -алкил или C ₁ -C ₁₆ -алкил-NX ₁ X ₂ ;

"арил" обозначает C ₆ -C ₁₀ -арильные группы;

"гетероарил" относится к углеродосодержащим 5-14-членным циклическим ненасыщенным радикалам, содержащим один, два, три или четыре атома O, N или S и имеющим 6, 10 или 14 π электронов, делокализованных в одном или более чем одном кольце;

"гетероциклоалкил" обозначает циклическую углеводородную группу, содержащую один, два, три или четыре атома O, N или S или сочетания атомов O, N, S;

"гетероциклоалкенил" или "гетероциклоалкинил" обозначает циклическую ненасыщенную углеводородную группу, содержащую по меньшей мере одну двойную или тройную связь углерод-углерод, содержащую один, два, три или четыре атома O, N или S или сочетания атомов O, N, S; и

пунктирные линии указывают на возможное наличие одинарной или двойной связи;

или их фармацевтически приемлемым эфирам, солям или кислотно-аддитивной соли в качестве активного компонента вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, не включая соединение формулы (I), где R ¹ =ОАс; R ² =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=Н, А=-(СН ₂ ) _n - и В=-(СН ₂ ) _y -; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; R ³ =Н или отсутствует и двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы; R ⁴ =Me; X=O, Z=2-пиридил, n=0 и у=1.

Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые эфиры, соли или кислотно-аддитивные соли можно применять для лечения, предотвращения или улучшения симптомов нейродегенеративных заболеваний, для уменьшения доброкачественной забывчивости и нарушения памяти при старческом слабоумии или в связи с нейродегенеративными заболеваниями, для лечения невропатии, обусловленной различными причинами, или для предотвращения апоптотической гибели нейрональных клеток в результате травмы головного мозга. Только в качестве примера состояния, которые можно лечить, включают болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз (БАС), дегенерацию сетчатки глаз, отслоение сетчатки глаз, периферическую невропатию, вызванную генетическими нарушениями, диабетом, полиомиелитом, герпесом, СПИДом, ишемией и инсультом.

Предпочтительными являются воплощения изобретения, где в вышеприведенной формуле (I) X представляет собой метиленовую группу или атом кислорода. Более предпочтительно X является атомом кислорода.

Также предпочтительными являются воплощения изобретения, где в вышеприведенной формуле (I) двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R ³ отсутствует.

Более предпочтительными являются воплощения изобретения, где в вышеприведенной формуле (I) R ¹ =OH; R ² =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=Н, А=-(СН ₂ ) _n - и В=-(СН ₂ ) _y -; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R ³ отсутствует; и R ⁴ =Me. Еще более предпочтительными являются такие соединения, где n=0 и у=1.

Самыми предпочтительными являются воплощения изобретения, где соединение формулы (I) выбрано из следующих, включая их фармацевтически приемлемые эфиры, соли и кислотно-аддитивные соли:

(20S)-3 β,21-дигидрокси-17 β,20-эпокси-5-прегнен;

(20S)-3 β-гидрокси-17 β,20-эпокси-20-(2-бромэтинил)-5-андростен и

3 β,21-дигидрокси-17 α,20-эпокси-5-прегнен.

Ввиду того что следующие соединения формулы (I), приведенные выше, известны по существу, они не включены в объем настоящего изобретения:

1) R ¹ представляет собой гидрокси или алканоилокси; R ² =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=H, А=-(СН ₂ ) _n - и В=-(СН ₂ ) _y -; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R ³ отсутствует; R ⁴ =Me; X=-СН ₂ -, Z представляет собой C ₁ -C ₇ -алкил, n=0 и y=1;

2) R ¹ =ОАс; R ² =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=Н, А=-(СН ₂ ) _n - и В=-(СН ₂ ) _У -; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; R ³ =Н или отсутствует, и двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы; R ⁴ =Me; X=O, Z=2-пиридил, n=0 и y=1;

3) R ¹ =ОАс; R ² =R ³ =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=Н, А=-(СН ₂ ) _n - и В=-(СН ₂ ) _y -; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; двойная связь отсутствует между С5 и С6 стероидной кольцевой системы; R ⁴ =Me; X=O, Z=-СН ₂ ОАс, n=0 и y=1;

4)R ¹ =ОАс; R ² =R ⁵ =R ⁶ =R ⁷ =Y=Н, А=-(СН ₂ ) _n - и В=-(СН ₂ ) _y -; отсутствует двойная связь между С1 и С2 стероидной кольцевой системы; двойная связь находится между С5 и С6 стероидной кольцевой системы, так что R ³ отсутствует; R ⁴ =Me; X=O, Z=-С ≡СН или -C ≡C-SiMe ₃ , 2-хинолинил или 2-бензотиазолил, n=0 и y=1; где X находится в 17 β-положении.

Подобные соединения известны по существу, хотя не известно их применение или они не ассоциируются с заболеваниями или состояниями, относящимися к нейрональному повреждению или гибели нейрональных клеток, или другими упомянутыми здесь состояниями. Следовательно, данные соединения не исключены из других аспектов этого изобретения (композиции, способы, применение и т.д.).

Следующие термины, отдельно или в комбинации, определены здесь ниже.

Термин "алкил" обозначает прямую, или разветвленную, или циклическую насыщенную углеводородную группу. Предпочтительными являются C ₁ -C ₁₆ -алкильные группы. Если не указаны иные конкретные ограничения, то алкильная группа может быть не замещена, однократно замещена или, если возможно, многократно замещена заместителями в любом возможном положении. Если не указаны иные конкретные ограничения, то циклическая алкильная группа включает моноциклические, бициклические, трициклические и полициклические кольца, например адамантил, норборнил и родственные терпены.

Термин "гетероциклоалкил" обозначает циклическую углеводородную группу, содержащую один, два, три или четыре атома O, N или S или сочетания атомов O, N, S, например оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидро-2H-пиранил, морфолинил, азиридинил, азетидинил, пирролидинил, пиперидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидро-2H-тиопиранил. Если не указаны иные конкретные ограничения, то гетероциклоалкильная группа может быть не замещена, однократно замещена или, если возможно, многократно замещена заместителями в любом возможном положении.

Термин "галоалкил" обозначает алкильную группу, замещенную одним или более чем одним галогеном.

Термин "алкенил", отдельно или в комбинации, обозначает прямую, или разветвленную, или циклическую ненасыщенную углеводородную группу, которая содержит по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод. Если не указаны иные конкретные ограничения, то алкенильная группа может быть не замещена, однократно замещена или, если возможно, многократно замещена заместителями в любом возможном положении. Предпочтительными являются C ₂ -C ₁₆ -алкенильные группы. Подразумевается, что алкенил включает алленильную группу, которая содержит две кумулированные двойные связи.

Термин "гетероциклоалкенил" обозначает циклическую ненасыщенную углеводородную группу, содержащую по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, содержащую один, два, три или четыре атома O, N или S или сочетания атомов O, N, S. Если не указаны иные конкретные ограничения, то гетероциклоалкенильная группа может быть не замещена, однократно замещена или, если возможно, многократно замещена заместителями в любом возможном положении.

Термин "алкинил", отдельно или в комбинации, обозначает прямую, или разветвленную, или циклическую ненасыщенную группу, которая содержит по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод. Если не указаны иные конкретные ограничения, то алкинильная группа может быть не замещена, однократно замещена или, если возможно, многократно замещена заместителями в любом возможном положении. Предпочтительными являются C ₂ -C ₁₆ -алкинильные группы.

Термин "арил", отдельно или в комбинации, обозначает ароматическую группу, которая содержит по меньшей мере одно кольцо с сопряженными π электронами, карбоциклические арильные группы и биарильные группы, которые могут быть не замещены, однократно замещены или, если возможно, многократно замещены заместителями в любом возможном положении. Предпочтительными являются C ₆ -C ₁₀ -арильные группы. Типичные арильные группы включают фенил, нафтил, фенантрил, антрацил, инденил, азуленил, бифенил, бифениленил и флуоренильные группы.

Термин "биарил" означает арильные группы, замещенные другими арильными группами.

Термин "карбоциклический арил" относится к группам, где кольцевые атомы в ароматическом кольце являются атомами углерода.

Термин "тио" обозначает -SR ¹⁰ , где R ¹⁰ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил или гетероарил, все из которых возможно замещены.

Термин "сульфинил" обозначает -SOR ¹⁰ , где R ¹⁰ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил или гетероарил, все из которых возможно замещены.

Термин "сульфонил" обозначает -SO ₂ R ¹⁰ , где R ¹⁰ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил или гетероарил, все из которых возможно замещены.

Термин "сульфонамидо" обозначает -SO ₂ NR ¹⁰ R ¹¹ , где R ¹⁰ и R ¹¹ независимо представляют собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил или гетероарил, все из которых возможно замещены.

Термин "возможно замещенный" или "замещенный" относится к группам, замещенным описанным ниже заместителем в любом возможном положении. Заместителями для вышеприведенных группировок, пригодных в изобретении, являются те группы, которые незначительно уменьшают биологическую активность соединения по изобретению. Заместители, которые незначительно уменьшают биологическую активность соединения по изобретению, включают, например, C ₁ -C ₆ -алкил (ациклический и циклический), арил (карбоциклический арил и гетероарил), C ₂ -C ₁₆ -алкенил, C ₂ -C ₁₆ -алкинил, алкокси, гало, гало-C ₁ -C ₁₆ -алкил, амино, C ₁ -C ₁₆ -алкиламино, ди-C ₁ -C ₁₆ -алкиламино, меркапто, C ₁ -C ₁₆ -алкилтио, C ₁ -C ₁₆ -алкилсульфинил, C ₁ -C ₁₆ -алкилсульфонил, нитро, алканоил, алканоилокси, алканоилоксиалканоил, алкоксикарбокси, карбалкокси, карбоксамидо, формил, карбокси, гидрокси, циано, азидо, изоциано, изотиоциано, оксим, кето и их циклические кетали, алканоиламидо, гетероарилокси, O-ароил, O-C ₁ -C ₁₆ -алкил-OH, O-C ₂ -C ₁₆ -алкенил-OH, O-C ₂ -C ₁₆ -алкинил-OH, O-C ₁ -C ₁₆ -алкил-NX ₁ X ₂ , O-C ₂ -C ₁₆ -алкенил-NX ₁ X ₂ , O-C ₂ -C ₁₆ -алкинил-NX ₁ X ₂ , NH-ацил, NH-ароил, CF ₃ , COOX ₃ , SO ₃ H, PO ₃ X ₁ X ₂ , OPO ₃ X ₁ X ₂ , SO ₂ NX ₁ X ₂ , CONX ₁ X ₂ , где каждый X ₁ и X ₂ независимо обозначает Н, или C ₁ -C ₁₆ -алкил, или C ₂ -C ₁₆ -алкенил, или C ₂ -C ₁₆ -алкинил, или X ₁ и X ₂ вместе составляют часть гетероциклического кольца, имеющего от приблизительно 4 до приблизительно 7 кольцевых атомов и возможно один дополнительный гетероатом, выбранный из O, N или S, или вместе X ₁ и X ₂ составляют часть имидного кольца, имеющего приблизительно 5-6 кольцевых атомов, и X ₃ обозначает Н, C ₁ -C ₁₆ -алкил, C ₂ -C ₁₆ -алкенил, C ₂ -C ₁₆ -алкинил, гидрокси-C ₁ -C ₆ -алкил или C ₁ -C ₁₆ -алкил-NX ₁ X ₂ .

Термин "низший" упоминается здесь в связи с органическими радикалами или соединениями, содержащими от одного до шести атомов углерода включительно. Подобные группы могут представлять собой неразветвленную цепь, разветвленную цепь или быть циклическими.

Термин "гетероарил" относится к углеродосодержащим 5-14-членным циклическим ненасыщенным радикалам, содержащим один, два, три или четыре атома O, N или S и имеющим 6, 10 или 14 π электронов, делокализованных в одном или более чем одном кольце, таким как тиенил, бензо[b]тиенил, нафта[2,3-b]тиенил, тиантренил, фурил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксантинил, 2Н-пирролил, имидазолил, пиразолил, пиридил, пиримидинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3H-индолил, индоил, индазолил, пуринил, 4H-хинолизинил, изохинолил, хинолил, фтазинил, нафтиридинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 5аН-карбазоил, карбозоил, бета-карболинил, фенантридинил, акриндинил, оксазолил, пиримидинил, бензимидазолил, тиазолил, каждый из которых может быть замещен, как указано выше.

Также настоящее изобретение включает фармацевтически приемлемые эфиры и соли соединений формулы (I), включая кислотно-аддитивные соли.

Квалифицированные специалисты в данной области понимают, что в соединениях формулы (I) существуют стереоцентры. Соответственно настоящее изобретение включает все возможные стереоизомеры и геометрические изомеры формулы (I) в виде смеси или в виде чистых диастереомеров. Когда требуется соединение формулы (I) в виде отдельного диастереомера, то его возможно получить либо в ходе повторного растворения конечного продукта, либо в ходе стереоспецифического синтеза из изомерно чистого исходного вещества или любого подходящего промежуточного соединения.

В объем настоящего изобретения (соединения, фармацевтические композиции, способы, применение и т.д.) включены кристаллические формы (например, полиморфы), энантиомерные формы и таутомеры соединений формулы (I), как определено здесь, и их фармацевтически приемлемых солей или кислотно-аддитивных солей.

Соединения формулы (I) можно получить из имеющихся в продаже стероидных соединений, используя традиционные реакции синтеза, хорошо известные квалифицированным специалистам в данной области. Предпочтительные воплощения изобретения, где X представляет собой атом кислорода, можно получить из важного промежуточного соединения (20S)-3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-21-гидрокси-17 β,20-эпокси-5-прегнена, используя ряд стадий синтеза в соответствующем порядке, включая, но не ограничиваясь этим, окисление, реакцию Виттига, восстановление, гидрирование, образование оксима, галогенирование, реакции связывания углерод-углерод и удаление защитной группы в С3. Можно использовать подходящие гидроксилзащитные группы за исключением трет-бутилдифенилсилилокси. Ниже примерами проиллюстрированы некоторые препаративные методики, которые соответственно можно использовать.

Соединения по настоящему изобретению воздействуют на ЦНС и периферическую нервную систему. Желательными целями фармацевтических композиций и способов по этому изобретению являются лечение и/или предотвращение нейродегенеративных заболеваний или расстройств, связанных с нейрональным апоптозом или нейрональным повреждением, таких как, но не ограничиваясь этим, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз (БАС), дегенерация и отслоение сетчатки глаз, периферическая невропатия, вызванная генетическими нарушениями, диабетом, полиомиелитом, герпесом, СПИДом и химиотерапией, травма головного мозга, или ишемия и инсульт, или любого другого состояния, приводящего к дегенерации и/или апоптозу нервных клеток в центральной или периферической нервной системе.

Используемый здесь термин "лечить" или "лечение" относится к любому лечению расстройства или заболевания, связанного с нейрональным апоптозом или нейрональным повреждением, у объекта и включает, но не ограничивается этим, предотвращение расстройства или заболевания, встречающегося у объекта, у которого еще не было диагностировано наличие расстройства или заболевания, замедление расстройства или заболевания, например подавление развития расстройства или заболевания, облегчение расстройства или заболевания, например вызывая регрессию расстройства или заболевания, или облегчение состояния, вызванного заболеванием или расстройством, например замедление симптомов расстройства или заболевания.

Препараты по настоящему изобретению можно вводить общепринятым для лечения указанных заболеваний способом, включая, но не ограничиваясь этим, пероральное, парентеральное, сублингвальное, трансдермальное, ректальное введение, или введение посредством ингаляции, или буккальное введение. Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно изготовить для парентерального введения посредством инъекции или непрерывного вливания. Композиции по настоящему изобретению могут быть разработаны в виде формы с замедленным высвобождением или в виде препарата пролонгированного действия. Способ введения может представлять собой любой способ, с помощью которого активное соединение эффективно доставляется до требуемого участка, чтобы проявить свои антиапоптотические эффекты. Любой специалист в данной области может распространить вышеупомянутое описание на любой другой способ введения, не причиняя вреда человеку, получающему лечение.

Фармацевтические композиции по этому изобретению получают в виде традиционных единичных форм дозирования, включающих активное соединение по изобретению или смесь подобных соединений с нетоксичным фармацевтическим носителем согласно принятым процедурам в нетоксичном количестве, достаточном, чтобы получить требуемую фармакодинамическую активность у объекта, животного или человека. Композиция предпочтительно содержит активный компонент в активном, но нетоксичном количестве, которое зависит от требуемой конкретной биологической активности и состояния пациента.

Используемый фармацевтический носитель может быть, например, либо твердым веществом, либо жидкостью. Типичными твердыми носителями являются лактоза, каолин, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, гуммиарабик, стеарат магния, стеариновая кислота, микрокристаллическая целлюлоза, полимерные гидрогели и подобные. Типичными жидкими носителями являются пропиленгликоль, водные растворы β-циклодекстринов, сироп, арахисовое масло, оливковое масло и подобные эмульсии. Подобным образом носитель или разбавитель может включать любое хорошо известное в данной области вещество временной задержки, такое как глицерол моностеарат или глицерол дистеарат отдельно или с воском, микрокапсулами, микросферами, липосомами и/или гидрогелями.

В случае твердого носителя препарат можно просто размолоть, измельчить до микро- или наноразмера, в масле, таблетировать, поместить в твердую желатиновую или покрытую энтеросолюбильной оболочкой капсулу в тонкоизмельченной порошкообразной или таблетированной форме или в форме таблетки, пастилки или суппозитория. В случае жидкого носителя препарат может находиться в форме жидкости, например в ампуле, или в виде водной или безводной жидкой суспензии, смешанной с фармацевтически приемлемыми консервантами и т.п. Когда требуются низкие дозировки, то также подходящими фармацевтическими формами для местного применения являются назальный спрей, препарат для сублингвального введения и трансдермальные пластыри с регулируемым во времени высвобождением.

Ниже приведены некоторые конкретные соединения формулы (I), синтез которых был осуществлен в соответствии с нижеизложенным разделом "Примеры". Эти примеры предусмотрены для лучшего понимания изобретения и считается, что они не ограничивают каким-либо образом объем изобретения.

1) 17 β-Спиро[5-андростен-17,2'-оксиран]-3 β-ол ("BNN-50").

2) (20S)-3 β,21-Дигидрокси-17 β,20-эпокси-5-прегнен ("BNN-124").

3) (20S)-3 β-Гидрокси-17 β,20-эпокси-20-(2-бромэтинил)-5-андростен.

4) 3 β,21-Дигидрокси-17 α,20-эпокси-5-прегнен ("BNN-93").

Экспериментальный раздел

ЯМР спектры регистрировали на спектрометре Bruker AC 300, работающем при 300 МГц для ¹ Н и 75,43 МГц для ¹³ С. ¹ Н ЯМР спектры представлены в единицах δ относительно внутреннего стандарта CHCl ₃ при 7,24 млн ^-1 . ¹³ С ЯМР сдвиги выражены в единицах δ относительно CDCl ₃ при 77,0 млн ^-1 . ¹³ С ЯМР спектры снимали с развязкой от протонов. Все ЯМР спектры регистрировали в CDCl ₃ . Для тонкослойной хроматографии использовали силикагелевые пластины (Merck F254). Хроматографическую очистку осуществляли на силикагеле (200-400 ячеек).

Пример 1. Получение 17 β-спиро[5-андростен-17,2'-оксиран]-3 β-ола

К раствору дегидроэпиандростерона (500 мг, 1,73 ммоль) в безводном ДМФА (10 мл) добавляли триметилсульфония иодид (530 мг, 2,60 ммоль) и t-BuOK (292 мг, 2,60 ммоль) при 0 °C и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После завершения реакции добавляли воду и полученную в результате смесь экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой промывали солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир 40-60 °C/ацетон 8:2), получая соединение примера 1 в виде белого кристаллического твердого вещества.

Выход: 310 мг (59%);

Т _пл 170-173 °C;

[ α] _D ²⁰ =-72,80 ° (С=0,00125 г/мл, CHCl ₃ );

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,35 (s, 1H, 6-СН), 3,47-3,54 (m, 1H, 3а-Н), 2,89 (d, J=4,88 Гц, 1Н), 2,59 (d, J=4,88 Гц, 1Н), 2,2-0,9 (m, 20Н), 1,00 (s, 3H, 18-СН ₃ ), 0,88 (s, 3H, 19-СН ₃ );

¹³ С ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 14,14, 19,38, 20,41, 23,58, 28,99, 31,35, 31,54, 31,99, 33,84, 36,59, 37,23, 39,89, 42,18, 50,14, 53,12, 53,63, 70,52, 71,59, 121,21, 140,88.

Пример 2. Получение (20S)-3 β,21-дигидрокси-17 β,20-эпокси-5-прегнена.

17 α-Винил-5-андростен-3 β,17 β-диол

К раствору дегидроэпиандростерона (250 мг, 0,87 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (7 мл) добавляли по каплям при -78 °C раствор винилмагнийбромида (1 M в тетрагидрофуране, 4,35 мл, 4,35 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. После завершения реакции добавляли насыщенный хлорид аммония и полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан/ацетон 9:1), получая 17 α-винил-5-андростен-3 β,17 β-диол в виде белого кристаллического твердого вещества.

Выход: 200 мг (74%);

Т _пл 180-183 °C;

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 6,01 (q, J=10,99 Гц, 1Н), 5,31 (s, 1Н,), 5,09 (t,J=10,99 Гц, 2Н), 3,47-3,51 (m, 1H, 3а-Н), 1,18-2,48 (m, 21Н), 0,99 (s, 3H), 0,90 (s, 3H);

¹³ С ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 13,95, 19,38, 20,64, 23,65, 31,61, 32,09, 32,58, 36,14, 37,24, 42,22, 46,10, 49,95, 50,31, 71,69, 84,18, 111,87, 121,31, 140,82, 143,02.

3 β,17 β-Дигидрокси-20,21-эпокси-5-андростен

К раствору 17 α-винил-5-андростен-3 β,17 β-диола (150 мг, 0,47 ммоль) в безводном дихлорметане (5 мл) последовательно добавляли ацетилацетонат ванадия (2,5 мг, 0,01 ммоль) и 70% трет-бутилгидропероксид (0,14 мл, 0,94 ммоль) при -10 °C. Полученную в результате смесь перемешивали при 0 °C в течение 12 ч. После завершения реакции смесь разбавляли дихлорметаном и органический слой экстрагировали Н ₂ О, насыщенным Na ₂ SO ₃ и солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: дихлорметан/этилацетат 6:1), получая 3 β,17 β-дигидрокси-20,21-эпокси-5-андростен в виде белого кристаллического твердого вещества.

Выход: 50 мг (32%);

Т _пл 165-168 °C;

[ α] _D ²⁰ =-53,10 ° (С=0,00113 г/мл, CHCl ₃ );

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,35 (s, 1Н), 3,08 (t, J=4,27 Гц, 1Н), 2,87 (q, J=3,05 Гц, 1Н), 2,76 (d, J=3,05 Гц, 1Н), 1,24-2,29 (m, 19H), 1,02 (s, 3H ₃ ), 0,92 (s, 3H);

¹³ С ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 13,91, 19,38, 20,54, 24,04, 31,61, 32,38, 36,01, 36,59, 37,27, 42,22, 43,19, 45,48, 50,11, 51,44, 51,79, 54,83, 56,22, 71,69, 79,68, 121,24, 140,81.

(20S)-3 β,21-Дигидрокси-17 β,20-эпокси-5-прегнен

К раствору 3 β,17 β-дигидрокси-20,21-эпокси-5-андростена (40 мг, 0,12 ммоль) в безводном MeOH (2 мл) добавляли K ₂ CO ₃ (41 мг, 0,3 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. После завершения реакции смесь разбавляли этилацетатом и органический слой экстрагировали Н ₂ О и солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ . Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: дихлорметан/этилацетат 3:1), получая (20S)-3 β,21-дигидрокси-17 β,20-эпокси-5-прегнен в виде белого кристаллического твердого вещества.

Выход: 32 мг (80%);

[ α] _D ²⁰ =-70,00 ° (С=0,0009 г/мл, CHCl ₃ );

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,28 (s, 1Н), 3,63 (q, J=4,27 Гц, 1Н), 3,40-3,49 (m, 2H), 3,12 (q, J=3,66 Гц), 1,36-2,21 (m, 21Н), 0,95 (s, 3H), 0,81 (s, 3H).

Пример 3. Получение (20S)-3 β-гидрокси-17 β,20-эпокси-20-(2-бромэтинил)-5-андростена.

3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-5-андростен-17-он

К раствору дегидроэпиандростерона (1 г, 3,47 ммоль) в сухом ДМФА (20 мл) добавляли при 0 °C имидазол (591 мг, 8,981 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 30 мин, добавляли трет-бутилдифенилсилилхлорид (2,22 мл, 8,681 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 50 °C. После завершения реакции добавляли 20 мл насыщенного NH ₄ Cl, полученную в результате смесь перемешивали в течение 30 мин и растворитель выпаривали в вакууме. К остатку добавляли этилацетат и органический слой экстрагировали Н ₂ О и солевым раствором, а затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ . Растворитель выпаривали в вакууме и остаток перекристаллизовывали из EtOH/петролейного эфира 40-60 °C. После фильтрации твердого вещества маточную жидкость очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан/EtOAc 95:5).

Выход: 1282 мг (70%);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 7,80-7,74 (m, 4H), 7,42-7,40 (m, 6H), 5,22 (bs, 1H), 3,62 (bs, 1H), 2,50-0,90 (m, 19H), 1,14 (s, 9H), 1,07 (s, 3H), 0,89 (s, 3H).

3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-17 α-винил-5-андростен-17 β-ол

К раствору 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-5-андростен-17-она (861 мг, 1,635 ммоль) в сухом ТГФ (30 мл) добавляли по каплям при -78 °C 1 М раствор винилмагнийбромида в ТГФ (16,35 мл, 16,35 ммоль). Смесь перемешивали при -20 °C в течение 2 ч и затем в течение ночи при комнатной температуре. Насыщенный NH ₄ Cl (25 мл) вливали в реакционный сосуд, смесь перемешивали в течение 30 мин и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан/EtOAc 95:5), что давало 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 α-винил-5-андростен-17 β-ол с выходом 60%.

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 7,67-7,65 (m, 4H), 7,39-7,25 (m, 6H), 6,00 (dd, J=10,98, 17,70 Гц, 1Н), 5,14-5,05 (m, 3H), 3,50-3,46 (m, 1H), 2,32-0,87 (m, 19H), 1,05 (s, 9H), 0,99 (s, 3H), 0,88 (s, 3H).

3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-17 β-гидрокси-20,21-эпокси-5-андростен

К раствору 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 α-винил-5-андростен-17 β-ола (191 мг, 0,345 ммоль) в сухом дихлорметане (3,7 мл) последовательно добавляли при -10 °C VO(acac) ₂ (1,95 мг, 0,021 экв.) и 0,2936 мл t-BuOOH (0,69 ммоль, ~2,35 М раствор в 1,2-дихлорэтане). Реакционную смесь перемешивали при 0 °C в течение ночи и затем разбавляли 15 мл дихлорметана, промывали водой, Na ₂ SO ₃ и солевым раствором (1 ×10 мл). Органические слои высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир:диэтиловый эфир 95:5), что давало 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β-гидрокси-20,21-эпокси-5-андростен.

Выход: 127 мг (65%);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 7,73-7,69 (m, 4H), 7,43-7,36 (m, 6H), 5,17-5,15 (m, 1H), 3,59-3,53 (m, 1H), 3,09-3,07 (m, 1H), 2,89-2,87 (m, 1H), 2,76-2,73 (m, 1H), 2,42-2,34 (m, 1H), 2,21-0,84 (m, 18H), 1,09 (s, 9Н), 1,04 (s, 3H), 0,93 (s, 3H).

(20S)-3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-21-гидрокси-17 β,20-эпокси-5-андростен

К раствору 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β-гидрокси-20,21-эпокси-5-андростена (51 мг, 0,0894 ммоль) в смеси сухого MeOH:сухого ТГФ (1,5:1,5 мл) добавляли при комнатной температуре K ₂ CO ₃ (31 мг, 0,2235 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем разбавляли EtOAc (5 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органические слои высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан:EtOAc 8:2), что давало (20S)-3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-21-гидрокси-17 β,20-эпокси-5-андростен с выходом 80%.

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 7,69-7,65 (m, 4Н), 7,42-7,33 (m, 6Н), 5,13-5,12 (m, 1Н), 3,76 (dd, J=3,66, 12,20 Гц, 1Н) 3,58-3,49 (m, 2Н), 3,17 (dd, J=4,27, 6,71 Гц, 1Н), 2,37-2,29 (m, 1Н), 2,17-2,11 (m, 1Н), 1,99-0,81 (m, 17Н), 1,05 (s, 9H), 0,99 (s, 3H), 0,85 (s, 3H).

(20S)-3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-17 β,20-эпокси-5-андростен-21-карбоксальдегид

К раствору 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-21-гидрокси-17 β,20-эпокси-5-андростена (51 мг, 0,0894 ммоль) в сухом дихлорметане (5 мл) добавляли при 0 °C периодинан Десса-Мартина (75,8 мг, 0,1782 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром (10 мл), промывали смесью насыщенного NaHCO ₃ :насыщенного Na ₂ S ₂ O ₃ 1:2 (10 мл), насыщенным NaHCO ₃ (10 мл) и солевым раствором (10 мл). Органические слои высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан:EtOAc 9:1), что давало (20S)-3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β,20-эпокси-5-андростен-21-карбоксальдегид.

Выход 46,6 мг (98%).

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 9,26 (d, J=5,49 Гц, 1Н), 7,69-7,67 (m, 4H), 7,42-7,34 (m, 6H), 5,14-5,12 (m, 1H), 3,56-3,51 (m, 1H), 3,33 (d, J=4,88 Гц, 1Н), 2,37-2,29 (m, 1H), 2,18-0,86 (m, 18H), 1,06 (s, 9H), 0,99 (s, 3H), 0,91 (s, 3H).

3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-17 β-гидрокси-17 α-(1,3,3-трибромаллил)-5-андростен

К раствору (20S)-3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β,20-эпокси-5-андростен-21-карбоксальдегида (45 мг, 0,0792 ммоль) в сухом дихлорметане (2 мл) при 0 °C добавляли Ph ₃ P (113,8 мг, 0,434 ммоль). После перемешивания в течение 10 мин при 0 °C добавляли CBr ₄ (70,78 мг, 0,213 ммоль). После перемешивания реакционной смеси в течение 1 ч при 0 °C добавляли воду (1 мл). Реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном и органический слой высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ , затем растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан:EtOAc 98:2), что давало 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β-гидрокси-17 α-(1,3,3-трибромаллил)-5-андростен.

Выход 32,8 мг (52%);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 7,68-7,66 (m, 4H), 7,41-7,36 (m, 6H), 7,08 (d, J=9,77 Гц, 1Н), 5,11 (bs, 1Н), 4,85 (d, J=10,37 Гц, 1Н), 3,52 (bs, 1H), 2,43-0,87 (m, 19Н), 1,06 (s, 9H), 0,99 (s, 3H), 0,95 (s, 3H).

(20S)-3 β-(трет-Бутилдифенилсилилокси)-17 β,20-эпокси-20-(2,2-дибромвинил)-5-андростен

К раствору 3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β-гидрокси-17 α-(1,3,3-трибромаллил)-5-андростена (32,8 мг, 0,04136 ммоль) в сухом ТГФ (1 мл) добавляли при 0 °C TBAF (фторид тетра-н-бутиламмония) (0,08271 мл 1 М раствора в ТГФ, 0,08271 ммоль). После перемешивания в течение 1 мин при 0 °C к реакционной смеси при этой же температуре добавляли воду (2 мл). Реакционную смесь экстрагировали диэтиловым эфиром и органический слой высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ , затем растворитель выпаривали в вакууме. Остаток был достаточно чистым, чтобы затем провести следующую реакцию.

Выход: 30 мг (количественный);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 7,69-7,65 (m, 4H), 7,44-7,33 (m, 6H), 6,19 (d, J=6,71 Гц, 1Н), 5,14-5,12 (m, 1Н), 3,75 (d, J=6,71 Гц, 1Н), 3,59-3,47 (m, 1H), 2,38-2,29 (m, 1H), 2,16-2,10 (m, 1H), 1,99-1,92 (m, 1H), 1,79-0,85 (m, 16H), 1,05 (s, 9H), 0,99 (s, 3H), 0,85 (s, 3H).

(20S)-3 β-Гидрокси-17 β,20-эпокси-20-(2-бромэтинил)-5-андростен

К раствору (20S)-3 β-(трет-бутилдифенилсилилокси)-17 β,20-эпокси-20-(2,2-дибромвинил)-5-андростена (30 мг, 0,04212 ммоль) в сухом ТГФ (1 мл) при 0 °C добавляли 1 М раствор TBAF в ТГФ (0,08424 мл, 0,08424 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 ч при комнатной температуре и добавляли воду. Реакционную смесь экстрагировали диэтиловым эфиром и органический слой высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ , затем растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан:EtOAc 98:2), что давало (20S)-3 β-гидрокси-17 β,20-эпокси-20-(2-бромэтинил)-5-андростен.

Выход: 18 мг (количественный);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,37 (bs, 1H), 3,60-3,46 (m, 1H), 3,47 (s, 1H), 2,38-0,86 (m, 19H), 1,02 (s, 3H), 0,89 (s, 3H).

Пример 4. Получение 3 β,21-дигидрокси-17 α,20-эпокси-5-прегнена.

(3 β-Гидрокси-5-андростен-17-илиден)ацетонитрил

К раствору t-BuOK (4,14 ммоль, 465 мг) в сухом ТГФ (5 мл) при 0 °C добавляли диэтил-цианометилфосфонат (2,76 ммоль, 0,44 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. К вышеописанной смеси добавляли по каплям раствор ДГЭА (0,69 ммоль, 200 мг) в сухом ТГФ (5 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. Реакцию гасили, добавляя насыщенный NH ₄ Cl, экстрагировали этилацетатом, органический слой промывали солевым раствором и высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ , затем растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир:EtOAc 6:4), что давало названное выше соединение.

Выход: 175 мг (81,5%);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,28 (bs, 1H), 5,06 (s, 0,3H), 4,96 (s, 0,7H), 3,49-3,41 (m, 1H), 2,7-0,9 (m, 19H), 0,99 (s, 3H), 0,91 (s), 0,79 (s, 3H);

¹³ С ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 180,9, 179,2, 141,1, 140,9, 120,9, 120,8, 117,4, 116,6, 87,9, 87,8, 71,3, 60,4, 55,2, 54,1, 49,9, 46,4, 45,9, 42,1, 37,2, 36,5, 34,5, 32,4, 31,5, 31,4, 30,2, 23,8, 20,8, 20,7, 19,4, 17,7, 16,6.

(3 β-Гидрокси-5-андростен-17-илиден)ацетальдегид

К раствору (3 β-гидрокси-5-андростен-17-илиден)ацетонитрила (150 мг, 0,48 ммоль) в сухом дихлорметане (15 мл) добавляли при -78 °C раствор DIBAL-H (диизобутилалюминий гидрид) (1 M в дихлорметане, 1,44 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78 °C и в течение 5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и добавляли раствор тартрата Na-K. Органический слой экстрагировали солевым раствором и высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ , затем растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир:ацетон 8:2), что давало названное выше соединение.

Выход: 151 мг (93%);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 10,02 (d, J=8,54 Гц, 0,63Н), 9,74 (d, J=7,93, 0,37H), 5,74-5,71 (m, 0,63H), 5,67-5,64 (m, 0,37H), 5,25-5,21 (m, 1H), 3,44-3,39 (m, 1H), 2,89-0,93 (m, 19H), 0,99 (s) и 0,93 (s) и 0,78 (s) (все три 6Н);

¹³ C ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 192,4, 190,7, 180,5, 179,4, 140,9, 124,0, 120,8, 119,3, 71,2, 65,0, 55,6, 53,3, 50,1, 49,4, 46,9, 46,3, 42,0, 38,6, 37,1, 36,6, 36,5, 36,4, 34,7, 33,5, 31,5, 31,3, 27,7, 24,3, 23,9, 21,3, 20,8, 19,3, 18,8, 17,8.

17-(2-Гидроксиэтилиден)-5-андростен-3 β-ол

К раствору (3 β-гидрокси-5-андростен-17-илиден)ацетальдегида (0,24 ммоль, 75 мг) в MeOH (2,5 мл) последовательно добавляли CeCl ₃ ∙7H ₂ O (0,24 ммоль, 89 мг) и NaBH ₄ (0,24 ммоль, 10 мг). После завершения реакции добавляли насыщенный NH ₄ Cl до pH 7. Смесь разбавляли этилацетатом, органический слой экстрагировали солевым раствором и высушивали над безводным Na ₂ SO ₄ , затем растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир:ацетон 8:2), что давало названное выше соединение.

Выход: 70 мг (92%).

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,36-5,24 (m, 2Н), 4,33-3,99 (m, 2Н), 3,42-3,39 (m, 1Н), 2,4-0,9 (m, 19Н), 1,02 (s) и 0,94 (s) (оба 3H), 0,90 (s) и 0,77 (s) (оба 3H).

3 β,21-Дигидрокси-17 α,20-эпокси-5-прегнен

К раствору 17-(2-гидроксиэтилиден)-5-андростен-3 β-ола (0,22 ммоль, 70 мг) в сухом дихлорметане (2,2 мл) добавляли K ₂ CO ₃ (0,26 ммоль, 36 мг) и 55% м-хлорпероксибензойную кислоту (0,22 ммоль, 61 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. Твердое вещество отфильтровывали, фильтрат выпаривали в вакууме и очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир:этилацетат 1:1), что давало названное выше соединение с 75% выходом.

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,36-5,34 (m, 1Н), 3,90-3,53 (m, 3H), 3,15-3,11 (m, 1Н), 2,4-0,9 (m, 19Н), 0,99 (s, 3H), 0,83 (s, 3H).

Пример 5. Получение 3 β,22-дигидрокси-17 β,21-оксетанил-5-прегнена.

17 α-Аллил-5-андростен-3 β,17 β-диол

К раствору 3 β-ацетил-5-андростен-17-она (200 мг, 0,6 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (4 мл) добавляли по каплям при 0 °C раствор аллилмагнийбромида (1,7 М в тетрагидрофуране, 3,52 мл, 6 ммоль) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. После завершения реакции добавляли насыщенный хлорид аммония и полученную в результате смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: циклогексан:этилацетат 85:15), получая 17 α-аллил-5-андростен-3 β,17 β-диол в виде белого кристаллического твердого вещества.

Выход: 190 мг (95%).

3 β,17 β-Дигидрокси-21,22-эпокси-5-андростен

К раствору 17 α-аллил-5-андростен-3 β,17 β-диола (190 мг, 0,57 ммоль) в безводном дихлорметане (6 мл) последовательно добавляли ацетилацетонат ванадия (6,6 мг, 0,025 ммоль) и 70% трет-бутилгидропероксид (0,74 мл, 1,7 ммоль) при -10 °C. Полученную в результате смесь перемешивали при 0 °C в течение 12 ч. После завершения реакции смесь разбавляли дихлорметаном и органический слой экстрагировали Н ₂ О, насыщенным Na ₂ SO ₃ и солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ , после чего растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: дихлорметан:этилацетат 6:1), получая 3 β,17 β-дигидрокси-21,22-эпокси-5-андростен в виде белого кристаллического твердого вещества.

Выход: 69 мг (35%);

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ: 5,35 (bs, 1H), 3,53 (m, 1H), 3,26 (m, 1Н), 2,84-2,97 (m, 1Н), 2,52-2,49 (m, 1Н), 2,28-1,01 (m, Н), 1,02 (s, 3H), 0,90 и 0,89 (s, 3H).

3 β,22-Дигидрокси-17 β,21-оксетанил-5-прегнен

К раствору 3 β,17 β-дигидрокси-21,22-эпокси-5-андростена (40 мг, 0,12 ммоль) в безводном метиленхлориде (12 мл) добавляли p-TsOH (0,6 ммоль, 114 мг) и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. После завершения реакции твердое вещество удаляли фильтрованием и фильтрат выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии, что давало требуемое 17-спирооксетановое производное.

Пример 6. Получение 17 β-спиро[3 β-гидрокси-5-андростен-17,2'-оксиран-7-илиденаминоокси]уксусной кислоты

К раствору дегидроэпиандростерон-7-карбоксиметилоксима (20 мг, 0,052 ммоль) в безводном ДМФА (0,5 мл) добавляли триметилсульфония иодид (32 мг, 0,16 ммоль) и t-BuOK (18 мг, 0,16 моль) при 0 °C и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 ч. После завершения реакции добавляли воду, раствор подкисляли разбавленной HCl до pH 5 и полученную в результате смесь экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали солевым раствором, затем высушивали с безводным Na ₂ SO ₄ и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (элюент: петролейный эфир 40-60 °C/ацетон 8:2), получая указанное в заголовке соединение.

Пример 7. Применение синтетических спиронейростероидов для защиты PC12 клеток, полученных из нервного гребня, от вызванного потерей сыворотки апоптоза клеток.

Способ.

РС12 клетки, полученные из нервного гребня, выдерживали в культуре в 5% СО ₂ при 37 °C в RPMI 1640 среде, содержащей 2 мМ L-глутамин, 15 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллин, 0,1 мг/мл стрептомицин, 10% лошадиную сыворотку и 5% эмбриональную телячью сыворотку. Бессывороточную среду дополняли 1% альбумином бычьей сыворотки (АБС). Изначально разные стероиды, используемые в различных концентрациях, растворяли в этаноле. Конечная концентрация этанола в каждой лунке, включая контрольные, составляла 0,01%. С самого начало конъюгат ДГЭА-АБС разбавляли фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).

Клетки культивировали в условиях отсутствия сыворотки в течение 12 ч с добавлением ДГЭА и разных синтетических спиронейростероидов при 10 нМ. Апоптоз клеток количественно анализировали двумя разными способами: анализ апоптоза APOPercentage (Biocolor Ltd., Belfast, N. Ireland) применяли для количественной оценки апоптоза в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественно апоптоз определяли исходя из лизиса клеток, измеряя красящее вещество, введенное в апоптотические клетки, при 550 нм (контрольный фильтр 620 нм), используя колориметр со светофильтром для микропланшетов (аппарат для чтения планшетов Dynatech MicroElisa, Chantilly, VA) (см. фиг. 1 и 2). Анализ FACS: анализ FACS апоптотических клеток осуществляли согласно нашему протоколу (Proc Natl Acad Sci USA 101, 8209 (2004)). Проточную цитометрию выполняли с помощью FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) и результаты анализировали с помощью FACScan и программного обеспечения Cell Quest (см. фиг. 3).

Культивирование клеток РС12 в условиях отсутствия сыворотки приводило к сильному индуцированию апоптоза по сравнению с клеточными культурами, дополненными сывороткой, как было показано в ходе анализа APOPercentage (фиг. 1). ДГЭА, непроницаемый конъюгат ДГЭА-АБС и спиронейростероиды отменяли вызванный потерей сыворотки апоптоз почти на 50%, защищая клетки РС12 от апоптоза, с ИК ₅₀ 0,15 нМ (фиг. 2). Синтетические 17-спиронейростероиды также демонстрировали сильные антиапоптотические, цитопротективные эффекты с ИК ₅₀ 0,088, 4,16 и 68,4 нМ для BNN-50, BNN-93 и BNN-124 соответственно (фиг. 2). Антиапоптотические эффекты синтетических спиронейростероидов также подтверждались в ходе анализа FACS (фиг. 3).

Пример 8. Исследование нейропротективных, антиапоптотических эффектов синтетических спиронейростероидов при введении нейропротективных и антиапоптотических Bcl-2 белков в РС12 клетки, полученные из нервного гребня.

Способ.

РС12 клетки, полученные из нервного гребня, культивировали в течение 8 ч в условиях отсутствия сыворотки, но с добавлением разных 10 нМ нейростероидов. В конце инкубации клеточные лизаты подвергали электрофорезу в 12% ДСН-полиакриламидном геле (ДСН - додецилсульфат натрия). Затем белки переносили в нитроцеллюлозные мембраны, которые обрабатывали в соответствии со стандартными процедурами вестерн-блоттинга. Для определения уровней белка мембраны выдерживали с соответствующими антителами: Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, разбавление 1:100), Bcl-xL (Cell Signalling Technology Inc., Beverly, MA, разбавление 1:100). Для определения количества интенсивности каждой полосы использовали программу на базе ПК Image Analysis (Image Analysis, Inc., Ontario, Canada). Для того чтобы нормализовать содержание белка, пятна обесцвечивали и окрашивали с антиактиновыми антителами (Chemicon, Temecula, CA, разбавление 1:400); концентрацию каждого белка-мишени нормализовали относительно актина.

Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 4. Потеря сыворотки (ПС) клетками РС12 приводила к сильной супрессии уровней антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL. ДГЭА и все три синтетических спиронейростероида (BNN-50, BNN-93 и BNN-124) предупреждали этот эффект еще через 12 ч относительно уровней, сопоставимых с уровнями при добавлении сыворотки (С).

Пример 9. Исследование нейропротективных, антиапоптотических эффектов синтетических спиронейростероидов после связывания с ДГЭА специфическими рецепторами мембран.

Способ.

РС12 симпатоадреналовые клетки крыс культивировали в 225 см ² колбах, затем дважды промывали PBS и отделяли их от колб в ходе интенсивного встряхивания. После центрифугирования при 1500 ×g их гомогенизировали при обработке ультразвуком при 4 °C в 50 мМ Tris-HCl буфере с pH 7,4, содержащем только что добавленные протеазные ингибиторы (1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид) и 1 мкг/мл апротинин). Неповрежденные клетки удаляли методом центрифугирования при 1500 ×g (10 мин при 4 °) и мембраны собирали в ходе центрифугирования при 102000 ×g в течение 1 ч при 4 °C. Мембраны один раз промывали Tris-HCl, недолго подкисляли при 4 °C (в течение 3 мин) с 50 мМ глицином (pH 5,0) и повторно суспендировали в том же самом буфере. Содержание белка анализировали методом Брэдфорд, используя реагенты от Bio-Rad (Hercules, CA). Мембраны (при конечной концентрации 2 мг/мл) инкубировали с 5 нМ [ ³ Н]-ДГЭА при отсутствии (для определения общего связывания) или в присутствии немеченых нейростероидов и их синтетических спироаналогов в концентрациях, изменяющихся от 10 ^-12 до 10 ^-6 М, и при конечном объеме 100 мкл в Tris-HCl буфере (50 мМ, pH 7,4). После 30 мин инкубации на водяной бане при 37 °C мембраны собирали на GF/B фильтрах, предварительно увлажненных 0,5% раствором ПЭИ (полиэтиленимина) при 4 °C. Фильтры промывали три раза ледяным Tris-HCl, высушивали, дополняли сцинтилляционным веществом (Sigma Hellas, Athens, Greece) и считывали на β-сцинтилляционном счётчике (Perkin Elmer, Foster City, CA) с 60% эффективностью для трития.

Результаты изображены на фиг. 5. Немеченый ДГЭА конкурировал за связывание [ ³ Н]-ДГЭА на выделенных мембранах РС12 клеток с К _д 1,1 нМ. При 1 мкМ была получена почти полная конкуренция (фиг. 5). Значительное замещение (около 60% специфического связывания при 1 мкМ) было подтверждено синтетическими спиронейростероидами BNN-50, BNN-93 и BNN-124 с кажущейся К _д 0,016, 11,2 и 0,33 нМ соответственно, что указывает на сильное взаимодействие всех трех синтетических нейростероидов с ДГЭА связанными мембранами.

Пример 10. Изучение применения синтетических спиронейростероидов для стимулирования выработки и секреции дофамина из дофаминергических клеткок, полученных из нервного гребня.

Способ.

Дофаминергические РС12 клетки, полученные из нервного гребня, выращивали на 6-луночных планшетах, покрытых поли-L-лизином, при концентрации 10 ⁶ клеток/лунка. Клетки инкубировали с нейростероидами или наполнителем в течение нескольких периодов времени; для непродолжительных экспериментов время инкубации составляло от 5 до 30 мин и для продолжительных - от 3 до 48 ч. По 1 мл супернатантов переносили в пробирки, содержащие по 200 мкл 0,1 М HCl, для измерения дофамина, который измеряли в ходе радиоиммуноанализа (TriCat ™ RIA, RE29395, IBL Immuno Biological Lab., Гамбург, Германия), используя ¹²⁵ I в качестве индикатора. Аналитическая чувствительность метода составляла 30 пг/мл, коэффициент вариации (Кв) метода в пределах одного эксперимента (intra-assay) составлял 9,5% и Кв в трех независимых экспериментах (inter-assay) составлял 16,7%. Перекрестная реактивность между дофамином и норэпинефрином составляла <0,013%.

ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) тирозингидроксилазы (ТГ).

Суммарную РНК выделяли из дофаминергических РС12 клеток, используя тризол реагент (Invitrogen Life technologies, CA). 1 мкг суммарной РНК обратно считывали с помощью Thermo-Script RT-PCR System (Invitrogen), используя случайные гексамеры в общем объеме 20 мкл. По 2 мкл продукта ОТ использовали в качестве матрицы, амплифицированной методом ПЦР с использованием 2 мМ MgCl ₂ , буфера ПЦР одной концентрации, 0,2 мМ смысловых и антисмысловых праймеров, 0,2 мМ дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфатов) и 2,5 Ед AmpliTaq Gold ДНК-полимеразы (Perkin Elmer ABD, Foster City, CA) в конечном объеме реакционной смеси 50 мкл. ПЦР выполняли в ДНК-амплификаторе (термоциклере) Perkin Elmer. Праймерами для ТГ служили 5'-TCGCCACAGCCCAAGGGCTTCAGAA-3' (смысловой) и 5-CCTCGAAGCGCACAAAATAC-3 (антисмысловой) и для Г3ФДГ (глицерол-3-фосфатдегидрогеназы) - 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3' (смысловой) и 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3' (антисмысловой). Олигонуклеотиды были синтезированы MWG-Biotech AG (Мюнхен, Германия). После обратной транскрипции продукт кДНК амплифицировали методом ПЦР за 33 цикла. Число циклов (33) было выбрано так, чтобы амплификация продуктов находилась в линейном диапазоне относительно количества исходной кДНК. ПЦР для Г3ФДГ выполняли параллельно, чтобы обеспечить высокое качество препаратов РНК и кДНК. Каждый цикл состоял из 60 с при 92 °C для денатурации, 120 с при 53 °C для ренатурации и 180 с при 72 °C для удлинения (60 с при 98 °C, 90 с при 55 °C и 150 с при 72 °C для Г3ФДГ соответственно). По 10 мкл амплифицированных продуктов (368bp для ТГ и 983bp для Г3ФДГ) разделяли на 2% агарозном геле и визуализировали посредством окрашивания бромидом этидия.

Дофаминергические РС12 клетки подвергались воздействию ДГЭА или синтетических спиронейростероидов BNN-50 и BNN-93 (10 ^-7 М) в течение коротких периодов времени (от 5 до 30 мин) и концентрацию дофамина в культуральной среде измеряли в ходе радиоиммуноанализа, как описано выше. Все три исследуемых стероида вызывали быструю и статистически значимую стимуляцию секреции дофамина, удваивая его уровни в культуральной среде за 10 мин (см. фиг. 6А). Также исследовали эффекты стероидов в течение длительных периодов времени. А именно, РС12 клетки инкубировали с ДГЭАС (дегидроэпиандростерон-сульфатом) или с синтетическими спиронейростероидами BNN-50 и BNN-93 (10 ^-7 М) в течение 3-48 ч и измеряли концентрацию дофамина в культуральной среде. Инкубация РС12 клеток с ДГЭАС или синтетическими нейростероидами приводила к увеличению уровней дофамина, достигающих пика через 24 ч (см. фиг. 6Б). Данные длительные эффекты ДГЭАС и синтетических нейростероидов указывают на то, что они также могут в дополнение к их сильным воздействиям на секрецию дофамина (фиг. 6А) влиять на выработку дофамина заново в дофаминергических нейронах. Действительно все три нейростероида вызывали значительное индукцирование мРНК фермента, ограничивающего скорость биосинтеза дофамина, тирозингидроксилазы (см. фиг. 6В).

Пример 11. Нейрогенные свойства синтетических спиронейростероидов.

Способ.

Первичные кортикальные нейросферы (21 день), сгенерированные из мышей дикого типа, выращивали, прикрепляя к палетке и покрытым ламинином покровным стеклам, в бессывороточной среде в присутствии или отсутствии ЭФР (эпидермального фактора роста) и оФРФ (основного фактора роста фибробластов) (20 нг/мл конечная концентрация каждого). Для скрининга среду дополняли этанолом, ретиноевой кислотой (в РК), ДГЭА или синтетическим спиронейростероидом BNN-93 при конечной концентрации 10 ^-7 М.

В течение 24-48 ч культивирования нейросферы, дополненные BNN-93 и ДГЭА, показывали обширную миграцию нервных клеток к периферии нейросфер по сравнению с другими соединениями и этанольным контролем (см. фиг. 7). Данный эффект, по-видимому, зависит от ЭФР/оФРФ. К 6 дню все выращенные нейросферы показывали такую же степень миграции нервных клеток на покровном стекле. Степень миграции в первые дни культивирования была главным образом стабилизирована, так, в большинстве состояний клетки перемещались из сферы к периферии. Представленные фотографии (фиг. 7) были получены на 6-й день культивирования, когда эффекты миграции не так существенны, но по-прежнему проявляются. Кроме того, нервные клетки-предшественники, выделенные из эмбрионального мозга мышей, выдерживали в течение 24 ч в 100 нМ BNN-93 или в наполнителе (контроль). BNN-93 стимулировал нейрогенез и дифференцировку предшественников в нервные клетки, развивая образование невритов (см. фиг. 8, стрелки).

Пример 12. Эстрогенные свойства синтетических спиронейростероидов.

Лечение постклимактерических синдромов с 17 β-эстрадиолом (Е2) связано с высоким риском развития рака молочной железы и/или рака эндометрия (Arch. Intern. Med. 166, 1027 (2006)). Стимуляция Е2 пролиферации раковых клеток управляется эстрогенным рецептором альфа (ER α от estrogen receptor alpha) (Mol. Endocrinol. 13, 969 (1999)). Так как BNN-50, BNN-93 и BNN-124 могут образовывать две водородные связи с O-О расстоянием 10,9-12,5 Å и, таким образом, могут соответствовать полости связывания ER α (Chem. Biol. 11, 397 (2004)), то необходимо было проверить свойства этих нейростероидов на агонизм/антагонизм эстрогена, используя клетки аденокарциномы человека из молочной железы (клетки MCF-7) и матки (клетки Ишикава) в качестве "репортеров". Контрольные уровни полного агонизма эстрогена (Е2 ≥0,1 нМ) и неагонизма (только среда) применяли для классификации нейростероидов на сверх-, полные, частичные, слабые и минимальные агонисты в зависимости от того, была ли их эстрогенная эффективность > 100, 76-100, 26-75, 10-25 и 1-10% относительно Е2 (принимаемого за 100). Подобным образом эффект полного антагонизма Е2 (при 0,1 нМ) под действием ICI 182,780 (при ≥0,1 нМ) и неантагонизма (только среда) применяли для классификации нейростероидов на полные, частичные, слабые и минимальные антагонисты в зависимости от того, составляла ли их супрессия эффекта Е2 76-100, 26-75, 10-25 и 1-10% относительно ICI 182,780. Различия между контрольными и обработанными с нейростероидами клетками оценивали, используя метод одностороннего ANOVA. Для значений была принята значимость р <0,05.

Способы.

Чтобы определить влияния нейростероидов на рост клеток MCF-7 молочной железы человека (от АТСС, Американской коллекции типовых культур) и клеток Ишикава внутриматочной аденокарциномы (от ЕСАСС, Европейской коллекции клеточных культур животных), клетки культивировали при 37 °C в минимальной поддерживающей среде Дульбекко (DMEM от Dulbecco's Minimal Essential Medium), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS от Fetal Bovine Serum, от Biochrom) в 5% СО ₂ , и субкультивировали, используя раствор 0,25% трипсина - 0,02% ЭДТА. Влияния нейростероидов на рост клеток определяли, используя МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид] и стандартную методику (Chem. Biol. 11, 397 (2004)). Кратко, клетки высевали на 96-луночные плоскодонные микропланшеты при плотности 10000 клеток/лунка в среде без фенолового красного, дополненной 1% обработанной покрытым декстраном углем FBS (DCC-FBS). Спустя 24 ч добавляли последовательно разведенные растворы исследуемых соединений (начальное разведение в ДМСО, дальнейшие разведения в культуральной среде), свежую среду с исследуемыми соединениями добавляли через каждые 24 ч и через 6 дней среду удаляли и клетки инкубировали с 1 мг/мл МТТ (от Sigma) в бессывороточной среде без фенолового красного в течение 4 ч. Образующийся МТТ-формазан растворяли в изопропаноле и измеряли, контролируя поглощение при 550 нм против 690 нм, используя планшет-ридер Safire (от Tecan). Клетки, которые получали только среду, служили в качестве контроля неагонизма, тогда как те, которые обрабатывали с ICI 182,780 (от Tocris) и/или Е2 (от Sigma), служили в качестве контроля полного антагонизма и агонизма соответственно.

Для того чтобы определить влияния нейростероидов на индуцирование Е2 активности щелочной фосфатазы клеток Ишикава - очень чувствительный способ определения агонистов/антагонистов Е2 среди природных химических реактивов и химических продуктов (Planta Med. 72, 488 (2006)) - клетки выращивали и пересевали, как описано выше. Затем клетки высевали на 96-луночные плоскодонные микропланшеты при плотности 12000 клеток на лунку в среде без фенолового красного, дополненной 5% DCC-FBS. Спустя 24 ч добавляли свежую среду, затем исследуемые соединения (начальное разведение в ДМСО, дальнейшие разведения в культуральной среде), клетки культивировали в течение 72 ч, затем их промывали PBS и планшеты переворачивали, осторожно промокали бумажной салфеткой, выдерживали при -80 °C в течение по меньшей мере 15 мин, размораживали при комнатной температуре в течение 5-10 мин и затем переносили на лед. Потом добавляли 50 мкл ледяного раствора, содержащего 5 мМ п-нитрофенилфосфат, 0,24 мМ MgCl ₂ и 1 М диэтаноламин (pH 9,8), клетки нагревали до комнатной температуры (начало отсчета) и давали окрашенному в желтый цвет п-нитрофенолу накапливаться со временем. Клетки, которые получали только среду, служили в качестве контроля неагонизма, тогда как те, которые обрабатывали с ICI 182,780 и/или Е2, служили в качестве контроля полного антагонизма и агонизма соответственно. Цвет проверяли каждые 30 мин при 405 нм, используя планшет-ридер Safire, пока положительные контроли показывали поглощение (А ₄₀₅ ) около 1,2. Характеристика агониста/антагониста эстрогена спиронейростероидов в разных тест-системах представлена в табл. 1.

Таблица 1

Агонизм/антагонизм эстрогена BNN-50

Пример 13. Изучение связывающей, активирующей или ингибирующей способности синтетических спиронейростероидов влиять на рецепторы фактора роста нервов TrkA и p75NTR.

Способ.

Клетки HEK293 трансфицировали кДНК TrkA и p75NTR, высоко- и низкоаффинными рецепторами фактора роста нервов (ФРН) (Ann Rev Biochem 72: 604, 2003). Трансфектанты, экспрессирующие два подтипа рецепторов ФРН, культивировали в колбах и после промывки два раза с PBS их вытряхивали из колб. После центрифугирования при 1500 ×g их гомогенизировали при обработке ультразвуком при 4 °C в 50 мМ Tris-HCl буфере pH 7,4, содержащем только что добавленные протеазные ингибиторы (1 мМ ФМСФ и 1 мкг/мл апротинин). Неповрежденные клетки удаляли методом центрифугирования при 1500 ×g (10 мин при 4 °C ) и мембраны собирали в ходе центрифугирования при 102000 ×g в течение 1 ч при 4 °C. Мембраны один раз промывали Tris-HCl, недолго подкисляли при 4 °C (в течение 3 мин) 50 мМ глицином (pH 5,0) и повторно суспендировали в том же буфере. Содержание белка анализировали методом Брэдфорд, используя реагенты от Bio-Rad (Hercules, CA). Мембраны (при конечной концентрации 2 мг/мл) инкубировали с 5 нМ [ ³ Н]-ДГЭА при отсутствии (для определения общего связывания) или в присутствии немеченого BNN-124 в концентрациях, изменяющихся от 10 ^-12 до 10 ^-6 М, и при конечном объеме 100 мкл в Tris-HCl буфере (50 мМ, pH 7,4). После 30 мин инкубации на водяной бане при 37 °C мембраны собирали на GF/B фильтрах, предварительно увлажненных 0,5% раствором ПЭИ при 4 °C. Фильтры промывали три раза ледяным Tris-HCl, высушивали и считывали на β-сцинтилляционном счётчике (Perkin Elmer, Foster City, CA) с 60% эффективностью для трития.

Результаты представлены на фиг. 9. Немеченый BNN-124 конкурировал за связывание [ ³ Н]-ДГЭА на выделенных мембранах из клеток TrkA HEK293, экспрессирующих рецепторы ФРН TrkA. Сродство данного связывания составляло К _д : 0,29 нМ, т.е. было подобно ФРН. Подобным образом немеченый BNN-124 конкурировал за связывание [ ³ Н]-ДГЭА на выделенных мембранах из клеток p75NTR HEK293, экспрессирующих рецепторы ФРН p75NTR. Сродство данного связывания составляло К _д : 1,0 нМ, т.е. было подобно ФРН. Отсутствие связывания наблюдалось в клетках HEK293, трансфицированных пустым вектором кДНК TrkA, или нетрансфицированных клетках. Кроме того, показано окрашивание мембран клеток HEK293, трансфицированных кДНК TrkA, мембранным непроницаемым конъюгатом ДГЭА-АБС-флуоресцеин. Эти данные указывают на сильное связывание и взаимодействие синтетических спиронейростероидов с мембранными рецепторами ФРН.

РС12 клетки, полученные из нервного гребня, культивировали в течение 8 ч в условиях отсутствия сыворотки, но с добавлением 10 нМ синтетических нейростероидов 20 нг/мл ФРН. В конце инкубации клеточные лизаты подвергали электрофорезу в 12% ДСН-полиакриламидном геле. Затем белки переносили в нитроцеллюлозные мембраны, которые обрабатывали в соответствии со стандартными процедурами вестерн-блоттинга. Для определения уровней белка мембраны выдерживали с соответствующими антителами: Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, разбавление 1:100), фосфорилированная ERK1/2 (внеклеточная сигнал-регулируемая киназа) (Cell Signalling Technology Inc., Beverly, MA, разбавление 1:100). Для того чтобы нормализовать содержание белка, пятна обесцвечивали и окрашивали с антиактиновыми или антисуммарными антителами ERK1/2 (Chemicon, Temecula, CA, разбавление 1:400).

Поведение BNN-124 имитировало поведение ФРН при индуцировании антиапоптотического белка Bcl-2 и фосфорилировании киназы ERK1/2 в лишенных сыворотки РС12 клетках. В действительности, 10 нМ BNN-124 оказывал такое же влияние как на Bcl-2, так и ERK1/2 с 20 нг/мл ФРН (фиг. 9). Активация Bcl-2 под действием ФРН избавляет нейроны от апоптоза, эффект, который опосредован активацией посредством фосфорилирования передачи сигналов киназы ERK1/2.