Изобретение относится к новым производным тиенотриазолодиазепина формулы 1

в которой R ¹ представляет собой CH ₃ ; R ² представляет собой CH ₃ , или -(CH ₂ ) _n -R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -O-R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -S-R ⁴ , где n равно 1, 2, 3 или 4; R ⁴ представляет собой CH ₃ , СН ₂ СН ₃ или СН ₂ СН ₂ ОСН ₃ и R ³ представляет собой водород или группу -OCH ₂ O- или -ОСН ₂ СН ₂ О-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца; или R ¹ и R ² являются водородом и R ³ представляет собой группу -OCH ₂ O- или -ОСН ₂ СН ₂ О-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца; и их фармацевтически приемлемым кислотно-аддитивным солям. Данные соединения и фармацевтические композиции, содержащие их, применимы для лечения и профилактики атеросклеротических болезней сердца, таких как инфаркт миокарда и инсульт, а также болезни Альцгеймера.

[0001] Соединение формулы 1

[0002] Соединение по п.1 формулы 1, в которой

[0003] Соединение по п.1 формулы 1, в которой

[0004] Соединение по п.1 формулы 1, в которой

[0005] Соединение по п.1 формулы 1, в которой

[0006] Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики заболеваний, вызванных низким содержанием аполипопротеина А1 (Apo A1), содержащая соединение формулы 1 по п.1 или его фармацевтически приемлемую кислотно-аддитивную соль.

[0007] Фармацевтическая композиция по п.6, дополнительно содержащая соединение, выбранное из статинов, фибратов, ниацина и эзетимиба.

[0008] Применение соединения формулы 1 по п.1 или его фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли для лечения и профилактики заболеваний, которые вызваны низким содержанием в плазме Apo A1.

[0009] Применение по п.8, где заболевание представляет собой атеросклеротическую болезнь сердца.

[0010] Применение по п.8, где заболевание представляет собой инфаркт миокарда или инсульт.

[0011] Применение по п.8, где заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

[0012] Способ повышения содержания Apo A1 в плазме млекопитающего, который включает введение млекопитающему эффективного количества соединения формулы 1 по п.1.

[0013] Способ по п.12 для лечения млекопитающего, страдающего атеросклеротической болезнью сердца или болезнью Альцгеймера, который включает введение млекопитающему эффективного количества соединения формулы 1 по п.1.

[0014] Способ по п.12 для профилактики атеросклеротических болезней сердца у пациента, подверженного риску атеросклеротической болезни сердца, но не страдающего такой болезнью, который включает введение эффективного количества соединения формулы 1 по п.1 пациенту, нуждающемуся в этом.

[0015] Способ по п.12 для профилактики болезни Альцгеймера у пациента, подверженного риску болезни Альцгеймера, но не страдающего такой болезнью, который включает введение эффективного количества соединения формулы 1 по п.1 пациенту, нуждающемуся в этом.

[0016] Способ по п.12, в котором млекопитающим является человек.

[0017] Способ по п.13, в котором млекопитающим является человек.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым производным тиенотриазолодиазепина и фармацевтическим препаратам, применимым для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и болезни Альцгеймера.

Предшествующий уровень техники

В патенте США 4155913 описан ряд тиенотриазолодиазепинов, их синтез, фармацевтические композиции и применение в качестве противосудорожных средств, седативных средств, миорелаксантов, транквилизаторов и анксиолитиков.

В патенте США 5854238 описано, что один из таких тиенотриазолодиазепинов, соединение 9-метил-4-фенил-6Н-тиено[3,2-f]-s-триазоло[4,3-а][1,4]диазепин, является активным в отношении увеличения содержания аполипротеина A1 (Apo A1) в плазме. Apo A1 представляет собой основной белковый ингредиент липопротеинов плазмы высокой плотности (HDL). Известно, что низкое содержание в плазме HDL и Apo A1 связано с повышенной частотой инфарктов миокарда, инсультов и инфарктов ног, как следствием атеросклеротической болезни сердца. Следовательно, упомянутое соединение является применимым для лечения и профилактики таких атеросклеротических болезней сердца.

В патенте США 6444664 описано, что определённые производные бензо- и тиенотриазолодиазепина с известным фактором активации тромбоцитов (PAF) антагонистической активности также стимулируют усиленный синтез Apo A1 и являются применимыми в способе лечения или профилактики атеросклеротических заболеваний.

Поскольку пациенты с болезнью Альцгеймера имеют низкое содержание Apo A1 (Merched A., Xia Y., Visvikis S., Serot J.M., and Siest G., Neurobiol. Aging, 21 (1):27-30, 2000), вышеупомянутые диазепины, стимулирующие синтез Apo A1, также могут быть применимы для лечения болезни Альцгеймера.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым производным тиенотриазолодиазепина формулы 1

в которой R ¹ представляет собой CH ₃ ;

R ² представляет собой CH ₃ , или -(CH ₂ ) _n -R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -O-R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -S-R ⁴ , где n равно 1, 2, 3 или 4;

R ⁴ представляет собой CH ₃ , CH ₂ CH ₃ или СН ₂ СН ₂ ОСН ₃ и

R ³ представляет собой водород или группу -OCH ₂ O- или -OCH ₂ CH ₂ O-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца; или

R ¹ и R ² являются водородом и

R ³ представляет собой группу -ОСН ₂ О- или -ОСН ₂ СН ₂ О-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца,

и их фармацевтически приемлемым кислотно-аддитивным солям.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения формулы 1, приведённой выше, и применению данных соединений в способе лечения и профилактики атеросклеротических болезней сердца, таких как инфаркт миокарда и инсульт, и болезни Альцгеймера, а также к получению медикамента для лечения и профилактики атеросклеротических болезней сердца, таких как инфаркт миокарда и инсульт, и болезни Альцгеймера.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы 1

в которой R ¹ представляет собой CH ₃ ;

R ² представляет собой CH ₃ , или -(CH ₂ ) _n -R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -O-R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -S-R ⁴ , где n равно 1, 2, 3 или 4;

R ⁴ представляет собой CH ₃ , СН ₂ СН ₃ или СН ₂ СН ₂ ОСН ₃ и

R ³ представляет собой водород или группу -OCH ₂ O- или -ОСН ₂ СН ₂ О-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца; или

R ¹ и R ² являются водородом и

R ³ представляет собой группу -OCH ₂ O- или -ОСН ₂ СН ₂ О-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца;

и их фармацевтически приемлемым кислотно-аддитивным солям.

Понятно, что соединение формулы 1, приведённой выше, включает все его кристаллические формы.

В соединении формулы 1, в которой R ¹ представляет собой CH ₃ и R ² представляет собой -(CH ₂ ) _n -R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -O-R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -S-R ⁴ , углеродный атом цикла, несущий R ¹ и R ² , является асимметрично замещенным и образуются стереоизомеры. Понятно, что в случае таких соединений в определение соответствующего соединения формулы 1 включены рацемат, а также (S)- и (R)-энантиомеры.

Соединения формулы 1, а также их фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли применимы для лечения и профилактики атеросклеротических болезней сердца, в частности инфаркта миокарда и инсульта, и болезни Альцгеймера.

Повышение содержания Apo A1 является хорошо проверенным клиническим механизмом ослабления атеросклероза и его клинических последствий. Apo A1 сворачивается кольцом вокруг частиц HDL и поддерживает их функциональность в отношении удаления холестерина из бляшек. Показано, что введение Apo A1 приводит к стабилизации и уменьшению атеросклеротических бляшек в организмах людей. И наоборот, недостаточность Apo A1 связана с ускоренным атеросклерозом.

Соединения по изобретению стимулируют печень вырабатывать больше Apo A1. Данный терапевтический подход увеличения собственной выработки Apo A1 организмом человека позволяет избежать иммунологических осложнений, потенциально связанных с пептидами, например с рекомбинантными видами Apo А1 терапии, рассматриваемыми в настоящее время для лечения атеросклероза увеличением содержания Apo А1.

Несмотря на то что соединения изобретения включают частичную структуру диазепина, они характеризуются полным отсутствием рецепторсвязывающей активности бензодиазепинов, и, следовательно, соединения изобретения не приводят к проявлению нежелательных побочных эффектов, вызываемых бензодиазепинами, таких как сонливость и т.п.

Соединения изобретения характеризуются также полным отсутствием антагонистической активности в отношении фактора активации тромбоцитов (PAF), характерной для близкородственных тиенотриазолодиазепинов, подобных WEB2086 (апафант).

Предпочтительными являются соединения формулы 1, в которой R ¹ представляет собой CH ₃ ; R ² представляет собой СН ₃ , или -(CH ₂ ) _n -R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -O-R ⁴ , или -(CH ₂ ) _n -S-R ⁴ , где n равно 1, 2, 3 или 4; R ⁴ представляет собой CH ₃ , CH ₂ CH ₃ или CH ₂ CH ₂ OCH ₃ и R ³ представляет собой водород. Наиболее предпочтительными являются такие соединения, в которых R ² представляет собой CH ₃ или в которых R ² представляет собой -(CH ₂ ) _n -O-R ⁴ ; n равно 1 или 2 и R ⁴ представляет собой CH ₃ , конкретно, такие соединения, в которых R ² представляет собой CH ₃ .

Предпочтительными являются также соединения формулы 1, в которой R ¹ и R ² представляют собой водород и R ³ представляет собой группу -ОСН ₂ О- или -ОСН ₂ СН ₂ О-, присоединенную в орто/мета- или мета/пара-положение фенильного кольца; конкретно, такие соединения, в которых R ³ представляет собой -ОСН ₂ О-. Предпочтительно, чтобы данный метилендиоксидный заместитель был присоединен в мета/пара-положение фенильного кольца.

Наиболее предпочтительными являются соединения примеров.

Соединения формулы 1 образуют кислотно-аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми органическими и неорганическими кислотами. Пригодные для целей настоящего изобретения кислоты включают соляную, бромоводородную, серную, фосфорную, муравьиную, уксусную, фумаровую, щавелевую, малоновую, сукциновую, малеиновую, винную, лимонную, трифторуксусную, метансульфоновую, паратолуолсульфоновую, 10-камфорсульфокислоту и т.п. Для целей выделения и очистки можно также использовать фармацевтически неприемлемые соли, например соли пикриновой или хлорной кислоты.

Понятно, что изобретение относится также к любому гидрату, сольвату или конкретной кристаллической форме соединений, описанных здесь выше, и их фармацевтически приемлемым солям, а также к рацемату или (S)- и (R)-энантиомерам соответствующих соединений с асимметрическим атомом углерода.

Новые соединения формулы 1 можно получать различными способами синтеза, например способом, подробно описанным в патенте США 4155913.

В одном из таких способов соединения формулы 1 можно получать взаимодействием соединения формулы 2, в которой заместители R ¹ , R ² и R ³ соответствуют значениям, описанным выше, с гидразидом уксусной кислоты или гидразином и последующим взаимодействием с ортоэфиром уксусной кислоты, что приводит к получению метилзамещённого s-триазольного кольца, конденсированного с диазепиновым циклом, присутствующим в соединениях формулы 1.

Тиодиазепиноны формулы 2 можно получить из соответствующих диазепинонов (т.е. соединений формулы 2, в которой =S заменено на =O) взаимодействием с реагентом Лоуссона или другими эквивалентными способами превращения амида в тиоамид. Такие диазепиноны можно получить посредством циклизации соединений формулы 3, в которой R ³ соответствует значению, описанному выше.

Соединения формулы 3 можно подвергнуть ацилированию функциональной аминогруппы соответствующе замещённым галогенацетилхлоридом, затем взаимодействию с азидом натрия, восстановлению азидной группы в аминогруппу и затем циклизации, или подвергнуть галогенацетилированное соединение прямой циклизации в присутствии реагента, образующего аммиак, или подвергнуть соединение формулы 3 взаимодействию с производным α-аминокислоты H ₂ NCR ¹ R ² COX, где R ¹ и R ² соответствуют значениям, описанным выше, и X является остатком сложного эфира, конкретно, остатком активированного сложного эфира, или подвергнуть взаимодействию с хлорангидридом α-аминокислоты, в которой аминогруппа защищена соответствующим образом, и затем снять защиту для осуществления реакции циклизации, позволяющей получить соединение формулы 2, где =S заменено на =O. Соединения формулы 3 являются либо известными, либо доступными для получения по известным методикам.

В качестве альтернативы соединения формулы 1 можно получать по реакции циклизации соединения формулы 4, где заместители R ¹ , R ² и R ³ соответствуют значениям, описанным выше.

Такой промежуточный продукт формулы 4 можно получить взаимодействием соединения формулы 3 с ортоэфиром уксусной кислоты, затем с гидразином и на конечной стадии с производным α-аминокислоты H ₂ NCR ¹ R ² COX, где R ¹ и R ² соответствуют значениям, описанным выше, функциональная α-аминогруппа находится в соответственно защищённой форме и СОХ означает активированную группу карбоновой кислоты. Такие защищённые аминогруппы и способы активации карбоксильных групп хорошо известны в данной области техники.

Изобретение также относится к новым промежуточным продуктам, в частности к промежуточным продуктам формул 2, 3 или 4, где заместители соответствуют значениям, описанным выше для формулы 1.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединение формулы 1 и его фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли в качестве активного ингредиента и которые можно применять главным образом для лечения болезней, упомянутых здесь выше. Предпочтительными являются композиции для энтерального введения, такого как назальное, трансбуккальное, ректальное или, особенно, пероральное введение. Композиции содержат активный ингредиент, один или, предпочтительно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции могут быть в форме таблеток, драже, капсул, гранул, лепёшек, жевательных резинок, суппозиториев, растворов, суспензий, эмульсий или т.п., и их получают согласно стандартным методикам, известным в данной области техники.

Фармацевтически приемлемыми носителями являются, например, сахара, такие как манноза, лактоза, фруктоза, глюкоза, сукроза или сахароза, сахарные спирты, такие как манит, ксилит, сорбит, крахмалы, например кукурузный, пшеничный, рисовый или картофельный крахмал, препараты целлюлозы, например микрокристаллическая целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза (гипролоза), гидроксипропилметилцеллюлоза (гипромеллоза) или натрийкарбоксиметилцеллюлоза, гуаровая смола, карраген или смола акации. Дополнительно рассматриваемыми твёрдыми носителями являются фосфаты магния или кальция, например фосфат или гидрофосфат кальция, диоксид кремния, силикаты, например магнийалюминийсиликат или силикат кальция, и диоксид титана.

Подходящими дополнительными носителями являются главным образом наполнители, такие, как сахара, сахарные спирты, препараты целлюлозы и/или фосфаты и силикаты, упомянутые выше в качестве носителей, диоксид кремния и диоксид титана, а также связующие, такие как крахмалы, например кукурузный, пшеничный, рисовый или картофельный крахмал, гуаровая смола, желатин, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, шеллак, трагант, ксантан или поливинилпирролидон и/или дезинтеграторы, такие как упомянутые крахмалы, а также натрий- или кальцийкарбоксиметил-крахмал и натрийгликолят крахмала, сшитый поливинилпирролидон (кросповидон), кроскармеллоза, альгиновая кислота или её соль, такая как альгинат натрия, и коллоидный диоксид кремния. Дополнительными эксципиентами являются главным образом кондиционеры и лубриканты, например кремниевая кислота, тальк, стеариновая кислота или её соли, такие как стеарат магния, цинка или кальция, моностеарат глицерина, пальмитостеарат глицерина и/или полиэтиленгликоль или его производные.

Красители и пигменты можно добавлять в таблетки, гранулы, лепёшки или жевательные резинки, например, в целях идентификации или для указания различных доз активных ингредиентов.

Фармацевтические композиции для перорального введения включают также твёрдые капсулы, состоящие из желатина, и мягкие запечатанные капсулы, состоящие из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Капсулы могут содержать активные ингредиенты в форме гранул, например в смеси с наполнителями, такими как кукурузный крахмал, связующие и/или глиданты, такие как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторы.

Фармацевтические композиции для перорального введения включают также формы длительного действия, такие как ретард-таблетки или капсулы, таблетки с плёночным покрытием и таблетки с энтеросолюбильным покрытием. Такие специальные фармацевтические пероральные композиции представляют собой композиции, полученные по стандартным методикам в данной области техники. Ретард -таблетки могут содержать, например, полимерные компоненты, такие как полиметакрилаты и сополимеры полиметакрилата, полиакрилат-полиметакрилатные сополимеры или аналогичные им смолообразные полимеры. Таблетки с плёночным покрытием получают нанесением покрытия, например этилцеллюлозой и гидроксипропилметилцеллюлозой. Пригодными энтеросолюбильными покрытиями являются, например, этилцеллюлоза, ацетат фталат целлюлозы, шеллак, ацетат сукцинат гидроксипропилцеллюлозы, а также полиметакрилаты и сополимеры полиметакрилата.

Фармацевтические композиции, пригодные для ректального введения, представляют собой, например, суппозитории, которые состоят из сочетания активных ингредиентов и основы. Пригодными основами для суппозиториев являются, например, натуральные или синтетические триглицериды, парафиновые углеводороды, полиэтиленгликоли или высшие алканолы.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения получают, по существу, известным способом, например при помощи способов обычного смешивания, гранулирования, растворения или лиофилизации.

Дозировка активного ингредиента зависит от болезни, которую надо лечить, и от вида особи, ее возраста, массы и индивидуального состояния, индивидуальных фармакокинетических данных, а также от способа введения. Дозировка соответствует индивидуальным требованиям, но предпочтительной является дозировка от около 0,1 до около 30 мг/кг. При введении лекарственного препарата в парентеральной форме предпочтительной является дозировка в интервале от 0,1 до около 10 мг/кг. Пригодные формы фармацевтической дозировки могут содержать от 1 до 1000 мг активного ингредиента формулы 1.

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы 1, описанным здесь выше, для лечения и профилактики заболеваний, которые вызываются низким содержанием Apo A1 в плазме, и применению соединений формулы 1 с целью получения медикаментов для лечения и профилактики заболеваний, которые вызываются низким содержанием Apo A1 в плазме. Примерами таких заболеваний являются упомянутые выше атеросклеротические болезни сердца, такие как инфаркт миокарда и инсульт, а также болезнь Альцгеймера.

Дополнительный аспект изобретения относится к повышающим содержание Apo A1 в плазме медикаментам, которые содержат соединения формулы 1, описанные здесь выше, вместе с одним или несколькими другими терапевтически ценными веществами. Данными другими терапевтически ценными веществами являются предпочтительно соединения, известные своей эффективностью для лечения или профилактики атеросклеротической болезни сердца, например статины, фибраты, ниацин и эзетимиб.

Ещё один аспект изобретения относится к способу повышения содержания Apo A1 в плазме у млекопитающих, в частности у человеческих существ, который содержит введение эффективного количества соединения изобретения пациенту, нуждающемуся в этом, и, кроме того, к способу лечения млекопитающих, в частности человеческих существ, страдающих атеросклеротическими болезнями сердца, такими как инфаркт миокарда и инсульт, или болезнью Альцгеймера, способу, который содержит введение эффективного количества соединения изобретения пациенту, нуждающемуся в этом.

Дополнительный аспект изобретения относится к способу профилактики атеросклеротических болезней сердца, таких как инфаркт миокарда и инсульт, у пациента, подверженного риску атеросклеротической болезни сердца, но не страдающего такой болезнью, который содержит введение эффективного количества соединения изобретения пациенту, нуждающемуся в этом.

Кроме того, изобретение относится к способу профилактики болезни Альцгеймера у пациента, подверженного риску болезни Альцгеймера, но не страдающего такой болезнью, который содержит введение эффективного количества соединения изобретения пациенту, нуждающемуся в этом.

Для дополнительного пояснения настоящего изобретения представлены следующие примеры.

Примеры

Пример 1. 3-Бензоил-2-(2-бром-2-метилпропаноиламино)тиофен.

1,0 г 2-амино-3-бензоилтиофена (соединение 3, в котором R ³ представляет собой водород) подвергали ацилированию 2-бром-2-метилпропаноилбромидом с целью получения 1,49 г (86%) соединения, указанного в заголовке.

Пример 2. 2-(2-Амино-2-метилпропаноиламино)-3-бензоилтиофен.

3,4 г соединения примера 1 и азид натрия в этаноле кипятили с обратным холодильником. Сырой азид подвергали прямому восстановлению цинком и хлоридом аммония в кипящем этаноле с целью получения 65% соединения, указанного в заголовке.

Пример 3. 1,3-Дигидро-3,3-диметил-5-фенил-2Н-тиено[2,3-е]-1,4-диазепин-2-он.

55 мг соединения примера 2 кипятили с обратным холодильником в этаноле, содержащем уксусную кислоту. Получено циклизованное соединение, указанное в заголовке, с выходом 48%.

Пример 4. 1,3-Дигидро-3,3-диметил-5-фенил-2Н-тиено[2,3-е]-1,4-диазепин-2-тион.

50 мг соединения примера 3 нагревали с пентасульфидом фосфора (P ₂ S ₅ ) и бикарбонатом натрия в диметиловом эфире диэтиленгликоля (диглиме) при 80 °C с целью получения 49 мг (92%) тиона (соединение 2, в котором R ¹ =R ² - метил, R ³ - водород).

Пример 5. 6,6-Диметил-4-фенил-9-метил-6Н-тиено[3,2-f]-s-триазоло[4,3-а][1,4]диазепин

49 мг тиона из примера 4 в тетрагидрофуране перемешивали с водным раствором гидразина при комнатной температуре. Полученное соединение смешивали с триэтилортоацетатом в этаноле и нагревали до 50 °C. Флэш-хроматографией выделено 15 мг (28%) соединения 5, указанного в заголовке.

¹ Н-ЯМР (CD ₃ OD): 1,28 (6Н, с, 2СН ₃ ), 2,74 (3H, с, СН ₃ ), 6,88 (1H, д, J=6 Гц, ArH), 7,5 (6Н, м, ArH).

ЖХ (колонка YMC ODS-A 150 ×4,6 мм, 5 мкм; объём впрыска 10 мкл, 30 °C, скорость потока 1,4 мл/мин, А: 0,05% TF в воде/В: 0,05% TFA в ацетонитриле/градиент от 5 до 95% В за 8 мин): время удерживания 4,42 мин, степень чистоты 99,3%

МС: М+Н ⁺ m/z вычислено 309,41; найдено 308,95.

Пример 6. 3,4-Метилендиокси- α-цианоацетофенон.

Метил-3,4-метилендиоксибензоат подвергали конденсации с ацетонитрилом в присутствии метанолята натрия при 90 °C для получения цианоацетофенона с 70%-ным выходом.

Пример 7. 2-Амино-3-(3',4'-метилендиоксибензоил)тиофен.

3,4-Метилендиокси- α-цианоацетофенон примера 6 подвергали взаимодействию с 2,5-дигидрокси-1,4-дитианом (полученным из хлорала и гидросульфида натрия) в присутствии триэтиламина в метаноле при медленном повышении температуры от 5 до 50 °C. Соединение, указанное в заголовке (соединение 3, где R ³ представляет собой метилендиокси в мета/пара-положении), выделено флэш-хроматографией.

Пример 8. 2-Бромацетиламино-3-(3',4'-метилендиоксибензоил)тиофен.

3,9 г аминокетона из примера 7 перемешивали с бромацетилхлоридом в дихлорметане при комнатной температуре для получения 4,3 г (86%) соединения, указанного в заголовке.

Пример 9. 5-(3',4'-Метилендиоксифенил)-1,3-дигидро-2Н-тиено[2,3-е]-1,4-диазепин-2-он.

4,3 г бромацетиламинокетона из примера 8 в метиленхлориде обрабатывали водным раствором аммиака при кипячении с обратным холодильником. Сырой амин (5,5 г) подвергали циклизации с 2,5 экв. уксусной кислоты в этаноле при кипячении с обратным холодильником. Сырой продукт (8 г) очищали флэш-хроматографией для получения 3,1 г (77%) соединения, указанного в заголовке.

Пример 10. 5-(3',4'-Метилендиоксифенил)-1,3-дигидро-2Н-тиено[2,3-е]-1,4-диазепин-2-тион.

Соединение примера 9 нагревали с реагентом Лоуссона (2,4-бис-(п-метоксифенил)-1,3-дитиафосфетан-2,4-дисульфидом) в триамиде гексаметилфосфорной кислоты (НМРТ) при 75 °C в течение 3,5 ч для получения тиона, указанного в заголовке (соединение 2, в котором R ¹ =R ² - водород, R ³ - метилендиокси в мета/пара-положении), с выходом 76%.

Пример 11. 4-(3',4'-Метилендиоксифенил)-9-метил-6Н-тиено[3,2-f]-s-триазоло[4,3-а][1,4]диазепин.

Соединение примера 10 и гидразид уксусной кислоты в диметиловом эфире диэтиленгликоля (диглиме) медленно нагревают до 110 °C и поддерживают при данной температуре в течение нескольких минут до прекращения выделения газа. Полученное соединение 6, указанное в заголовке, выпаривают, очищают колоночной флэш-хроматографией и выделяют с 40%-ным выходом.

¹ Н-ЯМР (400 МГц, CD ₃ OD): 2,72 (3H, с, СН ₃ ), 6,01 (2Н, с, ОСН ₂ О), 6,83 (1H, д, J=8 Гц, ArH), 7,06 (3H, м, ArH), 7,57 (1Н, д, J=6 Гц, ArH).

ЖХ (колонка YMC ODS-A 150 ×4,6 мм, 5 мкм; объём впрыска 10 мкл, 30 °C, скорость потока 1,4 мл/мин, А: 0,05% TF в воде/В: 0,05% TFA в ацетонитриле/градиент от 5 до 95% В за 8 мин): время удерживания 4,01 мин, степень чистоты 99,4%.

МС: М+Н ⁺ m/z вычислено 325,37; найдено 324,90.

Пример 12. 9-Метил-4-фенил-6Н-тиено[3,2-f]-s-триазоло[4,3-а][1,4]диазепин

Соединение 7, указанное в заголовке (известное также как Ro-11-1464), использованное в целях сравнения, синтезировали согласно патенту США 4155913, пример 2.

¹ Н-ЯМР (400 МГц, CD ₃ OD): 2,73 (3H, с, СН ₃ ), 6,99 (1Н, д, J=6 Гц, ArH), 7,5 (6Н, м, ArH).

ЖХ (колонка YMC ODS-A 150 ×4,6 мм, 5 мкм; объём впрыска 10 мкл, 30 °C, скорость потока 1,4 мл/мин, А: 0,05% TF в воде/В: 0,05% TFA в ацетонитриле/градиент от 5 до 95% В за 8 мин): время удерживания 4,16 мин, степень чистоты > 99,9%.

МС: М+Н ⁺ m/z вычислено 281,36; найдено 281,00.

Пример 13. Секреция Apo A1, выделяемая гепатоцитами человека.

Гепатоциты человека выделяли из кусочков, полученных от доноров печеней, которые не могли быть использованы для трансплантации, согласно методике, описанной в патенте США 6444664. Клетки высевали в чашки для культивирования плотностью 1,5 ×10 ⁵ жизнеспособных клеток на 1 см ² и в течение первых 24 ч держали в количестве 1,5 мл на 10 см ² среды Е Вильямса, дополненной 10% теплой инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 ммоль/л L-глютамина, 20 мкЕд/мл инсулина (135 нмоль/л), 50 нмоль/л дексаметазона, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл канамицина, при 37 °C в атмосфере 5% CO ₂ /95% воздуха. Через 14-16 ч несращенные клетки отмывали из планшетов при использовании той же культуральной среды, что и описанная выше. Через 24 ч после высевания начинали культивирование с соединениями в 1 мл той же культуральной среды, но с концентрацией инсулина 10 нмоль/л вместо 135 нмоль/л.

Гепатоциты человека обрабатывали соединениями 5, 6 и 7 (растворёнными в ДМСО, с конечной концентрацией ДМСО, не превышающей 0,1% об./об.) в концентрациях 100, 30, 10 и 3 мкМ и выдерживали в термостате в течение 24 ч. Концентрация ДМСО во всех образцах и в стандартах составляла 0,1%. Контрольные лунки содержали только ДМСО (0,1% об./об.). Среду на клетках удаляли и заменяли свежей средой со свежим соединением и выдерживали в термостате в течение 24 ч. После этого среду опять удаляли и заменяли свежей средой со свежим соединением и выдерживали в термостате ещё в течение 24 ч. Затем надосадочную жидкость удаляли с клеток и определяли содержание Apo A1 при использовании доступного для приобретения реагента ELISA (торговая марка AlerCHEK ™), содержащего HRP-конъюгированное козье антитело анти-Apo A1 с хромогеном, субстратом ТМВ/пероксидаза. Надосадочные жидкости разбавляли в отношении 1:4 промывочным буферным раствором, предусмотренным в наборе.

После последнего выдерживания в термостате клетки дважды промывали PBS и добавляли реагент ВСА (бицинхониновая кислота) в каждую лунку с целью анализа общего количества клеточного белка согласно стандартным способам.

Таблица 1

Стимулирование выделения Apo A1 в гепатоцитах человека

Контрольные клетки (инкубированные только с одним ДМСО) характеризовались выделением Apo A1, составившим 66 ±9 нг на 1 мг клеточного белка (среднее значение ± планшет SEM, 8 лунок). Таким образом, соединения 6 и, особенно, 5 стимулировали выделение белка Apo A1 в гепатоцитах человека выше контрольного уровня даже при таких низких концентрациях, как 3 мкМ, при которых соединение 7 (эталонное соединение) было явно менее активным.

Пример 14. Связывание с центральным бензодиазепиновым рецептором (BZD).

Сродство соединений изобретения к центральному бензодиазепиновому рецептору (BZD) оценивали определением связывания 0,4 нМ [ ³ Н]-флунитразепама с мембранами клеток коры головного мозга крыс и замещением его соединениями изобретения по сравнению со стандартным лигандом диазепамом при 4 °C в течение 60 мин, как описано в работе R.C. Speth et al., Life 20 Sci. 24:351-358 (1979). Значение показателя IC ₅₀ для диазепама в данной пробе составляет 16 нМ.

Специфическое связывание с рецепторами определяют как разницу между уровнем общего связывания и уровнем неспецифического связывания, определенного в присутствии избытка немеченого лиганда (диазепама). Данные результаты, полученные в присутствии соединений 5, 6 и 7, представлены в виде процента от контрольного специфического связывания ((измеренный уровень специфического связывания/уровень контрольного специфического связывания) ×100).

В каждом эксперименте соответствующее стандартное соединение испытывали одновременно с соединениями 5, 6 и 7 в целях оценки пригодности для анализа. Его испытывали при нескольких концентрациях (для определения величины показателя IC ₅₀ ).

Таблица 2

Специфическое связывание с BZD рецептором головного мозга крыс

Таким образом, соединения 5 и 6 характеризуются незначительным сродством к бензодиазепиновому рецептору, тогда как соединение 7 (эталонное соединение) характеризуется умеренным сродством, замещая меченый лиганд с показателем IC ₅₀ около 5 ×10 ^-7 .