Изобретение относится к новым способам и продуктам для определения физиологического состояния индивидуума. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам определения наличия злокачественной опухоли у индивидуума, риска ее возникновения или стадии ее развития путем измерения уровней антител против конкретных аберрантных белковых доменов в образце, взятом у индивидуума, или наличия или числа иммунных клеток, несущих TCR, специфичный в отношении таких аберрантных белковых доменов. Настоящее изобретение предназначено также для определения чувствительности индивидуума к лечению, а кроме того для скрининга лекарственных средств-кандидатов и разработки новых терапевтических подходов. Настоящее изобретение может быть использовано в отношении любого млекопитающего, в частности человека.

[0001] Способ определения наличия злокачественной опухоли у индивидуума, предусматривающий приведение в контакт in vitro образца, взятого у указанного индивидуума, с полипептидом, содержащим последовательность аберрантного белкового домена, образованного в результате неправильной транскрипции, при этом образование комплекса между указанным полипептидом и антителом (TIAB) или TCR-несущей клеткой, присутствующими в указанном образце, указывает на наличие злокачественной опухоли.

[0002] Способ по п.1, в котором уровень указанного TIAB или иммунных клеток в указанном образце сравним с эталонным значением, а отклонение от указанного эталонного значения является показателем наличия злокачественной опухоли.

[0003] Способ по п.2, в котором указанное отклонение от указанного эталонного значения составляет 10, 20, 30, 40, 50% или более.

[0004] Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный полипептид содержит последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов.

[0005] Способ по п.4, в котором указанный полипептид содержит последовательность любого из 45 полипептидов РАР табл. 5.

[0006] Способ по п.4 или 5, в котором увеличение указанного уровня TIAB или иммунных клеток в указанном образце по сравнению с эталонным уровнем является показателем наличия злокачественной опухоли.

[0007] Способ по любому из пп.1-6, в котором указанной злокачественной опухолью является солидная опухоль или жидкая опухоль, предпочтительно рак толстой кишки, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак головы и шеи или меланома.

[0008] Способ по любому из пп.1-7, в котором указанной злокачественной опухолью является рак легкого, а указанный полипептид содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 7, 1413, 581, 1457, 1769, 1270, 1276, 1396, 80, 1810, 1864, 847, 2119 или 1451 или их эпитопсодержащих фрагментов, в частности, из РАР 1, 2, 4, 6, 7, 24, 25, 28, 29, 44, 48, 66, 70, 68, 69, 74, 94, 82, как представлено в табл. 5.

[0009] Способ по любому из пп.1-8, в котором указанная стадия приведения в контакт предусматривает приведение указанного образца в контакт одновременно с несколькими полипептидами, предпочтительно с 2-10 полипептидами, содержащими последовательность отличного от других аберрантного белкового домена, образованного в результате неправильной транскрипции.

[0010] Способ определения физиологического состояния индивидуума, предусматривающий стадию определения наличия или уровня антител, специфичных в отношении аберрантных белковых доменов, образованных в результате неправильной транскрипции (TIAB), или TCR-несущих иммунных клеток, которые связываются с такими доменами в образце, взятом из организма указанного индивидуума, при этом модифицированный уровень указанного TIAB или иммунных клеток в указанном образце по сравнению с эталонным значением является показателем физиологического расстройства.

[0011] Способ определения эффективности лечения злокачественной опухоли, предусматривающий (i) определение уровня по меньшей мере одного полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, образованного в результате неправильной транскрипции, или уровня TIAB или соответствующих TCR-несущих клеток, в образце, взятом из организма индивидуума, и (ii) сравнение указанного уровня с уровнем в образце, взятом из организма указанного индивидуума, до лечения или на ранней стадии лечения.

[0012] Способ мониторинга прогрессирования или распространения злокачественной опухоли у индивидуума, предусматривающий (i) приведение в контакт образца, взятого из организма указанного индивидуума, и по меньшей мере одного полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, образованного в результате неправильной транскрипции, (ii) определение уровня TIAB или соответствующих TCR-несущих клеток в указанном образце и (iii) сравнение указанного уровня с эталонным уровнем, при этом отклонение от указанного эталонного уровня указывает на прогрессирование или распространение злокачественной опухоли.

[0013] Способ по любому из пп.11, 12, в котором указанный полипептид содержит последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов.

[0014] Способ по п.12, в котором указанный полипептид содержит последовательность любого из 45 полипептидов РАР, приведенных в табл. 5.

[0015] Способ по п.12 или 13, в котором указанная стадия приведения в контакт предусматривает приведение в контакт указанного образца одновременно с несколькими из указанных полипептидов, предпочтительно с 2-10 полипептидами.

[0016] Способ определения экспрессии аберрантного полипептида, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334, у индивида, предусматривающий приведение в контакт образца, взятого из организма указанного индивида, и вещества, указывающего на наличие указанного полипептида, и определение того, связывается ли указанное вещество с указанным образцом.

[0017] Способ по п.16, в котором указанное вещество является полипептидом, который связывается с антителом, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0018] Способ по п.16, в котором указанное вещество является полипептидом, который связывается с иммунной клеткой, содержащей TCR, специфичный в отношении полипептида, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0019] Способ по п.16, в котором указанное вещество является антителом или его частью, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0020] Способ по п.16, в котором указанное вещество является иммунной клеткой, содержащей TCR, специфичный в отношении полипептида, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0021] Способ по любому из пп.1-18, в котором указанный полипептид иммобилизован на подложке.

[0022] Способ определения характеристик, скрининга или оптимизации биологически активного соединения, предусматривающий приведение в контакт in vitro тестируемого соединения и гена и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать продукцию с указанного гена молекул РНК, содержащих пробелы, образующиеся в результате неправильной транскрипции.

[0023] Способ получения пептида, характерного для процесса неправильной транскрипции, предусматривающий:

[0024] Полипептид, содержащий последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов.

[0025] Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.24.

[0026] Выделенный полинуклеотид по п.25, где указанный полинуклеотид является меченым.

[0027] Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая первую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или комплементарных им последовательностей, и вторую нуклеотидную последовательность из 100 или менее нуклеотидов в длину, где указанная вторая нуклеотидная последовательность в природной нуклеиновой кислоте примыкает к указанной первой нуклеотидной последовательности.

[0028] Клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по п.25 или 27.

[0029] Клетка, трансформированная или трансфицированная вектором по п.28.

[0030] Выделенное антитело или часть антитела, которое специфически связывается с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0031] Выделенная клетка, которая специфически связывается с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0032] Выделенная клетка по п.31, где указанная клетка является иммунной клеткой, содержащей TCR, специфичный в отношении указанного полипептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0033] Твердая подложка, содержащая по меньшей мере один иммобилизованный полипептид, содержащий последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащего фрагмента, или по меньшей мере одно иммобилизованное антитело или часть антитела, которое специфически связывается с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

[0034] Набор, содержащий по меньшей мере продукт по п.33 и реагент для проведения иммунной реакции.

Изобретение относится к новым способам и продуктам для установления физиологического состояния индивидуума. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам установления наличия злокачественной опухоли у индивидуума, риска ее возникновения или стадии ее развития путем измерения уровней антител против конкретных аберрантных белковых доменов в образце, взятом у индивидуума, или наличия или числа иммунных клеток, несущих TCR, специфичных в отношении таких аберрантных белковых доменов. Настоящее изобретение также можно использовать для определения чувствительности индивидуума к лечению, а также для скрининга лекарственных средств-кандидатов и создания новых терапевтических подходов. Настоящее изобретение может быть использовано в отношении любого млекопитающего, в частности человека.

Введение

Злокачественная опухоль является основной прогрессивно нарастающей причиной смертности в западных странах, но стойкого терапевтического эффекта, то есть длительной выживаемости без проявления симптомов заболевания, у > 90% пациентов, в основном добиваются при раннем диагностировании ¹ . Злокачественная опухоль является генетическим заболеванием, связанным с накоплением мутаций в онкогенах и в генах, осуществляющих супрессию опухолей ² . Генетическое тестирование эффективно для идентификации индивидов с риском развития злокачественных опухолей толстой кишки, легкого, молочной железы, яичника, нейро-эндокринных злокачественных опухолей ^3,4 . Однако клинический контроль за пациентами с генетическим риском осложнен из-за отсутствия четких представлений о том, когда у данного индивида может произойти запуск развития злокачественной опухоли ⁵ .

Экспрессия генов в клетках злокачественной опухоли широко изменяется, и анализ различий в характере транскрипции привел к тому, что были определены молекулярные признаки, связанные с положительным или отрицательным прогнозом ⁶ . Такие признаки могут служить ориентиром для выбора направления и для оптимизации терапевтических стратегий, однако опять необходимым условием является предварительная идентификация опухоли.

Огромные усилия по идентификации надежных молекулярных маркеров начальной стадии злокачественной опухоли, обнаруживаемых в доступных жидкостях организма человека, осуществлялись в трех основных направлениях. Во-первых, изучали изменения концентраций белков и/или изоформ у нормальных индивидуумов и больных со злокачественными опухолями, используя различные приемы разделения и идентификации ^7,8 . Некоторые из этих методов подходят для осуществления систематического скрининга, но в настоящее время такая технология сталкивается с проблемой, связанной со значительным различием в концентрации многочисленных белков, находящихся в плазме (> > > мг/мл), по сравнению с концентрацией белка, в малых количествах высвобождаемого той или иной тканью ( < < пкг/мл). Альтернативный подход состоит в идентификации путем определения характера экспрессии нескольких специфических мишеней, иначе экспрессируемых в злокачественных опухолях, и развитии чувствительных анализов для мониторинга их концентраций в плазме ⁹ . Обе эти стратегии с успехом используются, но ни одна из них не способна обеспечить достаточно надежный маркер, который можно было бы использовать в систематическом клиническом скрининге ^10,11 . Второе направление исследований основано на идентификации и характеристике циркулирующих ДНК в плазме. Имеется публикация, в которой предлагалось одно лишь присутствие циркулирующей в сыворотке ДНК считать диагностическим признаком ¹² ; однако в настоящее время такой подход ставят под сомнение, поскольку у здоровых индивидуумов концентрации циркулирующей свободной ДНК находятся в тех же пределах, что и у пациентов со злокачественной опухолью ^13,14 . Поддержание нормального характера метилирования ДНК является критическим для адекватного функционирования клетки, и утрату такого характера относят к числу ранних изменений, происходящих в процессе канцерогенеза ^15,16 . Несколькими группами исследователей были опубликованы данные об обнаружении ими опухолеассоциированного характера метилирования в сыворотке, однако уровень успеха при использовании разными научными коллективами одних и тех же биомаркеров и технологии весьма сильно варьировал ^17-20 . Это связано как с различным характером метилирования ДНК в опухолях, так и с низким уровнем опухолевой ДНК, которая максимально составляет 0,12% соматически нормального гаплоидного генома ^21,22 . Таким образом, детектируемое количество соматических мутаций в минутном объеме циркулирующей ДНК в злокачественной опухоли также слишком близок базовым уровням, чтобы можно было обеспечить надежный анализ, несмотря даже на значительный прогресс в современных технологиях секвенирования ^23,24 . Третье направление исследований состоит в зондировании ответа иммунной системы на злокачественную опухоль путем систематического изучения аутоантител ^25,26 . Присутствие таких антител установлено, но процесс, в результате которого собственные молекулы становятся иммуногенными, до сих пор не понятен ²⁷ . Скрининг экспрессирующих библиотек, созданных на основе мРНК злокачественных клеток, привел к идентификации большого количества низкочувствительных антител, которые, при их использовании в сочетании > 20, достигают 82% чувствительности у пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы ^28,29 . Альтернативный способ основан на идентификации аутоантительного признака путем иммуноблоттинга двумерного гель-электрофореза ³⁰ . Это обеспечивает последующую идентификацию прежде всего белков, идентифицируемых с помощью аутоантител, независимо от состояния злокачественности и от ограниченного числа белков, предпочтительно, реагирующих со злокачественной сывороткой ³⁰ .

Подход авторов изобретения основан на другом соображении, которое напрямую следует из результатов, полученных с помощью программ широкомасштабного секвенирования ДНК при злокачественных опухолях ^31,32 . Указанная очень важная работа привела к выводу, что соматические мутации при злокачественных опухолях происходят с частотой, превышающей ожидаемые, но тем не менее они по-прежнему являются редким явлением: оцениваемая частота составляет 3,1 на 10 ⁶ нуклеотидов, что в среднем приводит к появлению 90 аминокислотных замен в заданной опухоли ³¹ . Фактически все биохимические, биологические и клинические признаки являются гетерогенными в ряду злокачественных опухолей одного и того же гистологического подтипа ³³ . Таким образом, авторы изобретения провели поиск альтернативных механизмов, участвующих в гетерогенности злокачественных клеток. В настоящее время авторы изобретения показали, что последовательности мРНК злокачественных клеток содержат большее количество замен нуклеотидов, чем таковые нормальных клеток ³⁴ . Замена нуклеотидов в мРНК злокачественной клетки возникает в тех сайтах, которые являются в 10 ⁴ раз более употребительными, чем сайты, несущие соматические мутации, и которые не соответствуют однонуклеотидным полиморфизмам (SNP). Таким образом, различия в гетерогенности мРНК, выделенной из нормальных и злокачественных клеток одного и того же пациента, не могут быть объяснены различиями, возникающими на геномном уровне. Замена нуклеотида в мРНК злокачественной клетки определяется составом контекстной зоны ДНК, которая соответствует той части, на которую воздействовали активной РНК-полимеразой II (Pol II) ^34,35 . Замещенный нуклеотид чаще всего идентичен нуклеотиду, непосредственно предшествующему или следующему непосредственно после указанного события. Данные in vitro показали, что в специфических контекстных зонах ДНК Pol II проскальзывает вперед ^36,37 , и в связи с этим авторы изобретения предположили, что ошибка в транскрипции (TI, transcription infidelity) объясняет то, что фракция мРНК злокачественной клетки не является точной копией геномной ДНК.

Указанный выше анализ авторами изобретения был проведен в отношении всего гена и всех известных человеческих транскриптов, и этот анализ подтвердил, что количество замен нуклеотидов в мРНК при злокачественных опухолях значительно повышено (в 2,5 раза). И, что наиболее важно, авторы изобретения обнаружили, что количество пропусков одного нуклеотида в мРНК при злокачественных опухолях повышено в значительно большей степени (в 38 раз). Пробелы в мРНК вызывают потерю низлежащей геномной информации и могут привести к появлению аберрантных белков, которые могли бы запускать иммунологический ответ. В результате поисков авторы изобретения обнаружили у пациентов со злокачественной опухолью специфический IgG против спрогнозированных аберрантных пептидов (РАР), транслируемых в злокачественной опухоли с мРНК, содержащей одиночный пробел нуклеотида. Определение малораспространенного диверсифицированного IgG дает основание для развития нового способа диагностики наиболее распространенных форм солидных опухолей человека. Панель IgG обеспечивает возможность эффективного отличия пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC) от индивидуумов, не имеющих злокачественной опухоли.

Таким образом, в настоящем изобретении показано, что количество таких пробелов (и вставок) существенно повышено у пациентов со злокачественной опухолью, и это способствует созданию аберрантных, но спрогнозированных иммуногенных белков, которые являются крайне эффективными биомаркерами.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественной опухоли у индивида, риска ее возникновения или стадии ее развития, при этом указанный способ предусматривает приведение в контакт in vitro пробы, взятой из организма пациента, с полипептидом, содержащим последовательность аберрантного белкового домена, образованного в результате неправильной транскрипции, при этом образование комплекса между указанным полипептидом и антителом (TIAB) или TCR-несущей клеткой, находящейся в указанной пробе, указывает на наличие злокачественной опухоли, на риск ее образования или стадию ее развития.

Другим объектом настоящего изобретения является способ определения физиологического состояния индивидуума, при этом указанный способ предусматривает стадию обнаружения или измерения уровня антител, специфичных в отношении доменов аберрантного белка, образованных в результате неправильной транскрипции (TIAB), или TCR-несущих иммунных клеток, которые связываются с такими доменами в пробе, взятой у индивидуума, при этом модифицированный уровень указанного TIAB или иммунных клеток в указанной пробе по сравнению с контрольным уровнем указывает на наличие физиологического расстройства.

Другим объектом настоящего изобретения является способ определения эффективности лечения злокачественной опухоли, при этом указанный способ предусматривает (i) определение уровня по меньшей мере одного полипептида, содержащего последовательность домена аберрантного белка, образованного в результате неправильной транскрипции, или уровня TIAB, или соответствующих TCR-несущих клеток в пробе, взятой у индивида, и (ii) сравнение указанного уровня с уровнем, определяемым в пробе, взятой у указанного индивида до лечения или на ранней стадии указанного лечения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ мониторинга прогрессирования или степени распространения злокачественной опухоли у индивидуума, при этом указанный способ предусматривает (i) приведение в контакт пробы, взятой у указанного индивидуума, по меньшей мере с одним полипептидом, содержащим последовательность домена аберрантного белка, образованного в результате неправильной транскрипции, (ii) определение уровня TIAB или соответствующих TCR-несущих клеток в указанной пробе и (iii) сравнение указанного уровня с контрольным уровнем. Контрольным уровнем может быть среднее или срединное значение, определяемое у индивидов, не пораженных злокачественной опухолью или заболеванием, контрольный (эталонный) уровень, полученный у контрольного пациента, эталонный уровень, полученный у этого же самого индивидуума до возникновения у него злокачественной опухоли, или полученный с использованием контрольного полипептида.

Другим объектом настоящего изобретения является способ определения того, продуцируется ли у индивидуума полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334, предусматривающий приведение в контакт пробы, взятой у указанного индивидуума, и средства, которое способно указывать на наличие указанного полипептида, и определение того, связалось ли указанное средство с указанной пробой.

Другим объектом настоящего изобретения является способ селекции, определения характеристик, скрининга или оптимизации биологически активного соединения, где указанный способ предусматривает приведение в контакт in vitro тестируемого соединения и гена и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать продукцию с указанного гена молекул РНК, содержащих пробелы и вставки, образующиеся в результате неправильной транскрипции.

Другим объектом настоящего изобретения является способ продукции пептида, характерного для процесса неправильной транскрипции, при этом указанный способ предусматривает:

a) идентификацию белкового домена, образующегося в результате неправильной транскрипции пробела или вставки;

b) синтез пептида, содержащего последовательность белкового домена, указанного в подпункте а); и

c) необязательную проверку в биологической пробе, взятой у млекопитающего, того, что указанный пептид связывается с антителом.

Настоящее изобретение также относится к любому полипептиду, содержащему последовательность аберрантного белкового домена, образующегося в результате неправильной транскрипции с введением пробела или вставки, или его эпитоп-содержащего фрагмента, в частности, с полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:1-3334, или с его эпитопсодержащим фрагментом.

Другим объектом настоящего изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, описанный выше или содержащий первую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334, или комплементарную ей последовательность, и вторую последовательность из 100 или менее нуклеотидов в длину, где указанная вторая нуклеотидная последовательность в природной нуклеиновой кислоте примыкает к указанной первой нуклеотидной последовательности.

Другим объектом настоящего изобретения является клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий описанный выше полинуклеотид, и клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная указанным вектором.

Другим объектом настоящего изобретения является выделенное антитело или часть антитела, которое специфически связывается с любым полипептидом, содержащим последовательность домена аберрантного белка, образующегося в результате неправильной транскрипции с введением пробела или вставки, и, в частности, с полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащего фрагмента.

Другим объектом настоящего изобретения является иммунная клетка, содержащая TCR, специфичный в отношении любого полипептида, содержащего последовательность домена аберрантного белка, образующегося в результате неправильной транскрипции с введением пробела или вставки, и, в частности, в отношении полипептида, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334.

Настоящее изобретение также относится к твердой подложке, содержащей по меньшей мере один полипептид, содержащий последовательность домена аберрантного белка, образующегося в результате неправильной транскрипции с введением пробела или вставки, и, в частности, по меньшей мере один полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или из их эпитопсодержащего фрагмента.

Настоящее изобретение дополнительно относится к устройству или продукту, содержащему иммобилизованный на подложке по меньшей мере один полипептид, содержащий последовательность домена аберрантного белка, образующегося в результате неправильной транскрипции с введением пробела или вставки, и, в частности, по меньшей мере один полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или из их эпитопсодержащего фрагмента.

Другим объектом настоящего изобретения является набор, содержащий, по меньшей мере, устройство или продукт, описанный выше, и реагент для проведения иммунной реакции.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу модуляции иммунного ответа у индивида, при этом указанный способ предусматривает лечение индивида с целью истощения иммунных клеток, экспрессирующих TCR, специфичный в отношении полипептида, как было определено выше. Такие иммунные клетки обычно включают В-клетки, дендритные клетки или Т-клетки. Истощение может быть осуществлено способами, известными в данной области, такими как истощение ex vivo с использованием специфических лигандов.

Описанние фигур

Фиг. 1. Представление пробелов K, локализованных внутри ORF. Показаны все статистически значимые пробелы K внутри ORF, % отклонения измеряли в группе со злокачественной опухолью, ось Y, и в нормальной группе, ось X. Красные ромбы указывают на 45 пробелов K, выбранных для биологической оценки (табл. 5). На встроенном графике показано число транскриптов, затронутых указанным числом статистически значимых пробелов K, локализованных внутри ORF.

Фиг. 2. Детекция аберрантной мРНК с делецией, предсказанной на гене кофилина в библиотеке кДНК пациента с раком легкого.

Фиг. 2А. Биоинформационное прогнозирование и характеристики выбранного пробела.

Фиг. 2В. Стратегия клонирования.

Фиг. 2C. Количественная ПЦР варианта и нормы.

Фиг. 2D. кДНК-последовательность варианта.

Фиг. 2Е. Последовательность геномной ДНК.

Фиг. 3. Детекция распознавания иммуноглобулином IgG пятнадцати (15) РАР (пептиды 1-15 из табл. 5) в плазме контрольных индивидов и пациентов со злокачественной опухолью, несущих указанные формы солидных опухолей.

Фиг. 3А. Сигнал интенсивности флуоресценции, регистрируемый для каждой индивидуальной пробы, инкубируемой с биотинилированным РАР, отнимали от сигнала, регистрируемого в холостых покрытых стрептавидином лунках. Интенсивности этой разницы показаны голубым цветом, если это соответствует нижней половине значений, зарегистрированных в контрольных пробах. Синий цвет соответствует сигналам в верхней половине контрольных значений. Если выше контролей, но ниже половины положительного сигнала, обозначено светло-красным. Темно-красный использован для пациентов с верхней половиной положительных сигналов. Области белого цвета относятся к тестам, которые не удалось реализовать в связи с недостаточностью материала в пробе. В качестве контролей были взяты 26 здоровых индивидов, пациентов с указанными различными формами злокачественной опухоли ранжировали сверху (ранняя стадия) вниз (продвинутая стадия) по каждому из типов злокачественной опухоли в соответствии со стадией. Значимость значений р в тестах Вилкоксона указана внизу данной фигуры.

Фиг. 3В. Детекция IgG, направленного на 13 предсказанных аберрантных пептидов в плазме контрольных индивидов и пациентов со злокачественной опухолью, несущих указанные формы солидных опухолей. Сигнал интенсивности флуоресценции, регистрируемый для каждой индивидуальной пробы, инкубируемой с биотинилированным РАР, отнимали от средней величины сигнала, регистрируемого с РАР 14 и 15 или же только РАР 15, когда информация относительно РАР 14 была недоступна. Исходные данные являются теми же, что и таковые фиг. 3А. Интенсивность расчетного сигнала показана голубым цветом, если это соответствует нижней половине значений, зарегистрированных в контрольных пробах. Синий цвет соответствует сигналам в верхней половине контрольных значений. Если выше контролей, но ниже половины положительного сигнала, обозначено светло-красным. Если выше половины положительных сигналов, обозначено темно-красным.

Фиг. 4. Детекция IgG против РАР в сыворотках NSCLC и в контрольных пробах без злокачественной опухоли.

Фиг. 4А. Измеряли IgG против 37 РАР (37 первых пептидов из табл. 5). Биотинилированные с N-конца пептиды с АА-последовательностью, соответствующей 37 РАР, были продуцированы и использованы в качестве затравок в покрытых стрептавидином лунках для связывания предполагаемых иммуноглобулинов. Образцы тестировали при разведении 1/100, затем, после промывки, подтверждали IgG, связанный с РАР, с помощью вторичного антитела против человеческого Fc-домена IgG. Контрольные пациенты включали 25 здоровых индивидов и 12 пациентов с COPD (голубая и синяя панели) и 49 NSCLC (исследование II, таблица 4) (красная панель). Показаны значения Р в тестах Вилкоксона против всех контролей.

Фиг. 4В. Статистический анализ данных по 37 контрольным пробам и 49 пробам рака легких. Значения р, полученные в непараметрическом тесте Вилкоксона, приведены для каждого TIAB.

Фиг. 5. Отсутствие детекции IgG против канонических пептидов (СР).

Интенсивность флуоресценции IgG против пептидов, соответствующих каноническому считыванию генома, то есть пептидов, соответствующих трансляции мРНК, соответствующей RefSeq без пробела. Канонические пептидные последовательности приведены в табл. 6.

Фиг. 5А. Измеряли IgG против РАР 1 и канонического пептида, выбранного на том же самом гене (от I ₆₄ до Q ₉₃ ). Измеряли также IgG против канонического пептида из альбумина (от Q ₁₂₈ до P ₁₄₃ ). Включены все пациенты, представленные на фиг. 4.

Фиг. 5В. Схематическое представление канонических и предсказанных последовательностей аберрантных пептидов.

Фиг. 5С. IgG против РАР 7, 24 и 28 и их канонические пептиды для 11 контрольных проб (синяя панель) и 16 проб больных с NSCLC (красная панель).

Фиг. 6. Детекция IgG против РАР в сыворотках Mus musculus.

Фиг. 6А. Анализ гомологии между последовательностями Homo sapiens и Mus musculus методами биоинформатики. Выравнивание мРНК и РАР проводили в отношении РАР 7, 48 и 62 и показали, что указанные последовательности являются консервативными. Белковая последовательность отрицательного контроля СР 7 также консервативна между человеком и мышью. РАР 2 и 9 отличаются между контрольными пробами и пробами в случае NSCLC у человека, но не являются консервативными между человеком и мышью.

Фиг. 6В. Двенадцати нормальным мышам (С57В1/6) подкожно инъецировали 5 ×10 ⁵ клеток LLC1. В день, когда производили инъекцию, и через 1-2-3 недели после этого измеряли титры TIAB против РАР 48, 62, 7 и соответствующие титры СР. Титры TIAB против РАР 2 и 9 измеряли у 4 мышей в день инъекции и через 3 недели после этого. Показаны средние значения ± SEM.

Фиг. 7. Комбинация титров IgG против РАР в сыворотках больных с раком легких и контрольных индивидов.

Фиг. 7А. Контрольные пациенты включали 161 здорового индивида (синяя панель) и 140 пациентов с раком легких (исследование III, табл. 4), включая аденокарциномы (ADK) (красная панель), плоскоклеточный (оранжевая панель) и другие (желтая панель). Метод опорных векторов позволяет отличать контроли от случаев рака легких с помощью 6 РАР (7, 29, 48, 66, 68, 70). Показано расстояние до гиперплоскости; пациентов с отрицательными значениями, полученными с применением модели SVM, классифицировали как не пораженных злокачественной опухолью. Пациентов с положительными значениями классифицировали как пораженных злокачественной опухолью.

На фиг. 7В приведен процент пациентов с раком легких, классифицируемых как положительные в соответствии с их возрастом.

На фиг. 7С приведен процент пациентов с раком легких, классифицируемых как положительные в соответствии с гистопатологией их заболевания.

На фиг. 7D показана разница расстояний до гиперплоскости SVM между пациентами с раком легких, у которых через 3 года после операции не обнаружено рецидива заболевания, и пациентами, которые умерли или живут с повторной злокачественной опухолью.

Фиг. 8. Комбинация титров IgG против РАР в сыворотках больных раком легкого и больных раком молочной железы. Контрольные пациенты включают 20 здоровых индивидов (синяя панель), 20 больных раком легкого (красная панель) и 20 больных раком молочной железы (фиолетовая панель) (исследование IV, табл. 4).

На фиг. 8А показана комбинация РАР, которая позволяет отличить случаи рака легких от контролей, не имеющих злокачественной опухоли.

На фиг. 8В показано несколько комбинаций РАР, которые позволяют отличить случаи рака легких от случаев рака молочной железы.

На фиг. 8С показана комбинация РАР, которая позволяет отличить случаи рака молочной железы от контролей, не имеющих злокачественной опухоли.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к новым способам и продуктам для определения физиологического состояния индивидуума путем установления уровней TIAB. Более конкретно, настоящее изобретение связано со способами обнаружения злокачественной опухоли у индивидуума, риска ее возникновения или стадии ее развития путем измерения уровней TIAB в пробе, взятой из организма указанного индивидуума. Настоящее изобретение может использоваться также для определения чувствительности индивидуума на лечение, для мониторинга уровня прогрессирования или степени распространения злокачественной опухоли, а также для скрининга лекарственных средств-кандидатов.

Под неправильной транскрипцией подразумевается новый механизм, с помощью которого несколько различных молекул РНК продуцируется в клетке из одной последовательности-транскрипта. Этот вновь идентифицированный механизм вероятно поражает любой ген, является неслучайным и следует конкретным правилам, как описано в совместно поданной заявке РСТ/ЕР07/057541, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

В настоящем изобретении показано, что неправильная транскрипция может вносить пробелы или вставки в молекулы РНК, образуя таким образом большое число различных детектируемых последовательностей аберрантных белков на основе единственного гена (полипептидные TI-последовательности). Интерес к указанным полипептидным TI-последовательностям, в частности, связан с тем, что они являются достаточно длинными, чтобы содержать эпитопы, в отношении которых млекопитающие могут вырабатывать антитела. В результате, экспрессия таких аберрантных белков у индивидуума может быть установлена путем обнаружения соответствующих антител или TCR-несущих клеток в пробе, взятой из организма индивидуума.

В настоящее время изобретение относится к способу прогнозирования и/или идентификации таких аберрантных белковых доменов, образующихся в результате неправильной транскрипции с введением пробела или вставки, с любого гена, а также к способам получения полипептидов, содержащих такие TI-последовательности. Кроме того, в настоящем изобретении описано более чем 2000 полипептидов с TI-пробелами (gTI) и более чем 1000 полипептидов с TI-вставками (iTI), и на пробах, взятых из организма человека, показана четкая корреляция между наличием антител против последовательностей указанных полипептидов и наличием у такого индивидуума злокачественной опухоли. Более конкретно, повышенные уровни специфического IgG против прогнозированного аберрантного пептида (РАР), превышающие таковые у нормальных индивидуумов, обнаружены в сыворотках большинства (> 75 %) пациентов с распространенными формами солидных опухолей. Все 7 типов самых распространенных форм солидных опухолей (рак толстой кишки, легкого, молочной железы, яичника, матки, рак головы и шеи, а также меланома) вызывают продукцию IgG против аберрантных белков. Повышенные специфические уровни IgG были выявлены у большинства индивидуумов на ранних стадиях заболевания, то есть при отсутствии метастазов в лимфатических узлах и других областях.

Таким образом, измерение таких антител против TI-полипептидов, названных TIAB (Transcriptional Infidelity AntiBody), или соответствующих иммунных клеток, несущих TCR-рецептор, специфичный в отношении таких аберрантных доменов, представляет собой новый подход в области обнаружения и контроля расстройств, а также в области получения лекарственных средств.

TIAB

В контексте настоящего изобретения термин TIAB ("Transcriptional Infidelity AntiBody") означает антитело, которое специфически связывается с эпитопом, содержащимся в белковой последовательности, продуцируемой в результате TI, в частности, в результате gTI или iTI. Более конкретно, термином TIAB обозначают антитела, в норме продуцируемые млекопитающим, против эпитопа, содержащегося в белковой последовательности, вырабатываемой в результате неправильной транскрипции (TI), в частности, в результате gTI и iTI (gap and insertion Transcription Infidelity). TIAB может быть антителом любого типа, включая IgG, IgM, IgA, IgE, IgD и тому подобное. Антитело является "специфичным" в отношении конкретного эпитопа или последовательности, если связывание такого антитела с указанным эпитопом или с указанной последовательностью можно достоверно отличить от неспецифического связывания (то есть от связывания с другим антигеном, в частности, с нативным белком, не содержащим указанный домен).

В одном из аспектов TIAB или часть TIAB могут быть прикреплены к твердой подложке. Такое прикрепление сохраняет TIAB в подходящей конформации, облегчая связывание специфического gTI- или iTI-полипептида при контакте с пробой, содержащей указанный полипептид. Прикрепление может быть ковалентным или нековалентным, непосредственно с подложкой или через спейсерную группу. В данной области известны различные технологии иммобилизации антитела на подложку (полимерную, керамическую, пластиковую, стеклянную, из диоксида кремния и пр.). Подложка может быть магнитной, например из магнитных бус, например, для разделения.

Иммунные клетки, несущие TCR, специфичный в отношении таких TI-полипептидов, включают любые клетки иммунной системы, которые содержат TCR, такие, например, как Т-клетки, такие как CTL, CD4 ⁺ -лимфоциты, CD8 ⁺ -лимфоциты и/или регуляторные Т-клетки (Treg), а также антиген-презентирующие клетки: В-клетки, дендритные клетки или макрофаги. В частности, указанный термин включает любые TIAB-продуцирующие иммунные клетки. Такие клетки можно культивировать в обычных условиях и увеличивать их количество in vitro или ex vivo, используя TI-полипептиды по изобретению в качестве костимулирующего фактора.

TI-полипептиды и их получение

Как описано ниже, в настоящем изобретении описана последовательность различных TI-полипептидов, и на основании изобретения можно прогнозировать TI-последовательности фактически любого гена.

В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему gTI-последовательность, то есть последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции с введением пробела. Специфические примеры полипептидов по изобретению включают последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:1-2206 (см. табл. 3а), или эпитоп, содержащий фрагмент этих последовательностей.

В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему TI-последовательность со вставкой, то есть последовательность аберрантного белкового домена, образованного в результате неправильной транскрипции с введением вставки. Специфические примеры полипептидов по изобретению включают последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:2207-3334 (см. табл. 3В), или эпитоп, содержащий их фрагмент.

Термин "эпитопсодержащий фрагмент" означает любой фрагмент, содержащий по меньшей мере 6 последовательных аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 8, еще более предпочтительно по меньшей мере 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12, которые образуют иммуногенный эпитоп для антител или TCR-экспрессирующих клеток. Такой эпитоп может быть линейным или конформационным, а также специфичным для В- или Т-клеток.

TI-полипептид по изобретению обычно содержит от 8 до 100 аминокислот, предпочтительно от 8 до 50, более предпочтительно от 10 до 40 аминокислот. Указанный полипептид по изобретению может быть получен с использованием любой подходящей технологии, такой как искусственный синтез полипептидов, или с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

Полипептиды по изобретению необязательно могут содержать дополнительные остатки или функциональные группы, такие как, но ими не ограничиваясь, дополнительные аминокислотные остатки, химические или биологические группы, включая метки, маркеры, стабилизатор, нацеливающие группы, таги для очистки, секреторные пептиды, функциональные реактивные группы и тому подобное. Такие дополнительные остатки или группы могут быть химически преобразованы, добавлены в виде области аминокислотной последовательности слитого белка, могут входить в состав комплекса или могут быть прикреплены иным способом, ковалентно или нековалентно. Они могут также содержать природные или неприродные аминокислотные остатки. Указанный полипептид может находиться в растворимой форме, или же он может быть прикреплен к подложке (или может образовывать с ней комплекс, или же может быть вдавлен в нее), такой как матрикс, колонка, частица, чашка Петри, мембрана, предметное стекло, клетка, липид, лунка и тому подобное.

В конкретном варианте осуществления полипептиды биотинилированы, образуя комплексы со стрептавидином.

Полипептиды по изобретению могут быть представлены в виде мономеров или мультимеров. Они могут быть представлены также в линейной конформации или частично в трехмерной пространственной конформации. В этой связи полипептиды могут быть введены в особый каркас для придания им специфической конфигурации.

Полипептиды по изобретению могут быть использованы в качестве иммуногенов в композициях вакцин или для продукции специфических антител. Они могут быть использованы также для нацеливания лекарственных средств или других молекул (например, меток) на специфические сайты внутри организма. Они могут быть использованы также в качестве специфических реагентов для обнаружения или дозирования специфических антител или TCR-несущих иммунных клеток любого образца.

В этой связи конкретным объектом изобретения является устройство или продукт, содержащий полипептид, как определено выше, прикрепленный к твердой подложке. Предпочтительно, указанное прикрепление является концевым прикреплением, что позволяет удерживать указанный полипептид в конформации, подходящей для связывания специфического антитела, при приведении его в контакт с пробой, содержащей указанное антитело. Прикрепление может быть ковалентным или нековалентным, может быть непосредственным прикреплением к подложке или же прикреплением через спейсерную группу. В данной области известны различные технологии иммобилизации пептида на подложку (полимерную, керамическую, пластиковую, стеклянную, из диоксида кремния и тому подобное), как описано, например, Hall et al., Mechanisms of ageing and development 128 (2007) 161. Указанная подложка может быть магнитной, такой, например, как магнитные частицы, например, для облегчения разделения.

Указанное устройство предпочтительно содержит множество полипептидов по изобретению, например, расположенных в заранее определенной последовательности, для проведения в одном и том же устройстве детекции или количественного определения нескольких TIAB.

Указанное устройство обычно состоит из любого твердого или полутвердого носителя-подложки, такого как планшет для титрования, чашка Петри, предметное стекло, лунки, мембрана, частица, колонка и тому подобное. Указанная подложка обычно содержит по меньшей мере два полипептида, выбранных из SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащего фрагмента, более предпочтительно, из 45 РАР-полипептидов табл. 5 (входящих в число SEQ ID NO:1-3334).

В более предпочтительном варианте осуществления в указанном способе или в подложке по изобретению используется сочетание по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3 полипептидов, содержащих последовательность различных РАР-полипептидов табл. 5.

В конкретном варианте осуществления в указанном устройстве или способе используется по меньшей мере один, два или три полипептида, выбранных из РАР 1, 2, 4, 6, 7, 24, 25, 28, 29, 44 или 48 (табл. 5).

В другом конкретном варианте осуществления в указанном способе или носителе (подложке) по изобретению используется сочетание различных РАР-полипептидов табл. 5, выбранных из полипептидов РАР7, РАР66, РАР70, РАР29, РАР68 и РАР48; полипептидов РАР7, РАР48, РАР70 и РАР29; полипептидов РАР6, РАР29, РАР70 и РАР82; полипептидов РАР6, РАР7, РАР29, РАР48, РАР70 и РАР82; полипептидов РАР6, РАР29, РАР70 и РАР69; полипептидов РАР7, РАР48, РАР70, РАР74 и РАР29; или полипептидов РАР7, РАР29 и РАР94.

В конкретном варианте осуществления указанное устройство содержит от 2 до 10 полипептидов.

Указанный носитель может содержать дополнительные объекты или биологические элементы, такие как контрольные полипептиды и/или полипептиды, обладающие различной иммунной активностью.

Образование иммунного комплекса между полипептидом и TIAB может быть установлено с помощью известных технологий, например, с использованием второго меченого антитела, специфичного в отношении антител человека, или же с помощью конкурентных реакций, и тому подобное.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему описанное выше устройство, а также один или несколько реагентов для проведения иммунной реакции, то есть образования и детектирования иммунного комплекса.

TI-полинуклеотиды

В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую описанный выше полипептид, или ее комплементарную цепь. В частности, указанный полинуклеотид включает первую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334, или комплементарную ей последовательность, и вторую нуклеотидную последовательность длиной в 100 или менее нуклеотидов, где указанная вторая нуклеотидная последовательность прилегает к указанной первой нуклеотидной последовательности в природной нуклеиновой кислоте. Длина второй нуклеотидной последовательности, которая прилегает к первой нуклеотидной последовательности, может составлять, например, 75, 50, 25, 10 или 0.

Полинуклеотидами по изобретению могут быть ДНК или РНК, такие как комплементарная ДНК, искусственная ДНК, мРНК или их аналоги, содержащие, например, модифицированные нуклеотиды, такие как 3'-алкоксирибонуклеотиды, метилфосфонаты и пр., и пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), и тому подобное. Такой полинуклеотид может быть меченым. Полинуклеотид может быть получен в соответствии с методиками, которые как таковые хорошо известны в данной области, например, методы химического синтеза, транскрипция in vitro, или же в соответствии с методами рекомбинантной ДНК, с использованием информации о последовательностях, представленных в настоящем описании. Указанный полинуклеотид может быть получен, в частности, путем химического синтеза олигонуклеотидов, путем скрининга библиотек, амплификации, лигирования, с помощью рекомбинантных технологий и путем их сочетания (сочетаний).

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, содержащий последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2207-3334, или его эпитопсодержащий фрагмент.

Полинуклеотиды по изобретению могут содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, такие как регуляторные области, то есть промоторы, энхансеры, сайленсеры, терминаторы и тому подобное, которые могут быть использованы для инициации или регуляции экспрессии полипептида.

Полинуклеотиды по изобретению могут быть использованы для получения рекомбинантного полипептида по изобретению. Они могут быть также использованы для создания специфических реагентов, таких как праймеры, зонды или антисмысловые молекулы (включая антисмысловую РНК, iPHK, аптамеры, рибозимы и тому подобное), которые специфически обнаруживают полинуклеотид, кодирующий определяемый выше полипептид, связывают его или воздействуют на его экспрессию. Они могут также быть использованы в качестве терапевтических молекул (например, как часть вируса, созданного генно-инженерным путем, такого, без ограничения, как созданные генно-инженерным путем, в программах генной терапии, аденовирусные векторы или векторы адено-ассоциированных вирусов) или для получения рекомбинантных клеток или генетически модифицированных животных, исключая человека, которые используются, например, при скрининге библиотек соединений на предмет поиска средств, которые модулируют активность определяемого выше полипептида.

В контексте настоящего изобретения "зонд" нуклеиновой кислоты относится к нуклеиновой кислоте или олигонуклеотиду, имеющему полинуклеотидную последовательность, которая способна к селективной гибридизации с доменом, полученным в результате неправильной транскрипции, или с комплементарным ему доменом, и которая является подходящей для обнаружения (или для количественного определения) в образце указанного домена или комплементарного ему домена. Предпочтительно, зонды являются комплементарными домену, полученному в результате неправильной транскрипции, хотя допустимо некоторое несовпадение. Обычно зонды содержат одноцепочечные нуклеиновые кислоты длиной от 8 до 1500 нуклеотидов, например от 10 до 1000, более предпочтительно от 10 до 800, обычно от 20 до 700. Следует иметь в виду, что можно также использовать и более длинные зонды. Предпочтительным зондом по изобретению является одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты длиной от 8 до 400 нуклеотидов, которая может специфически гибридизоваться с доменом, полученным в результате неправильной транскрипции.

Термин "праймер" означает нуклеиновую кислоту или олигонуклеотид с полинуклеотидной последовательностью, которая способна к селективной гибридизации с доменом, полученным в результате неправильной транскрипции, или с комплементарным ему доменом, или с областью нуклеиновой кислоты, которая фланкирует домен, полученный в результате неправильной транскрипции, и которая является подходящей для полной или частичной амплификации указанного домена, полученного в результате неправильной транскрипции, или комплементарного ему домена. Обычно праймеры по изобретению являются одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот с длиной приблизительно от 5 до 60 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 8 примерно до 50 нуклеотидов, еще более предпочтительно приблизительно от 10 до 40, 35, 30 или 25 нуклеотидов. Для обеспечения высокой специфичности предпочтительна полная комплементарность. Однако, как обсуждалось выше в отношении зондов, некоторое несовпадение является допустимым.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий или клонирующий вектор, содержащему полинуклеотид, как описано выше. Такие векторы могут быть выбраны из плазмид, рекомбинантных вирусов, фагов, эписом, искусственных хромосом и т.п. Многие из таких векторов являются коммерчески доступными, и их можно получить в соответствии с рекомбинантной технологией, хорошо известной в данной области, такой, например, как способы, указанные в справочниках, таких как руководство Sambrook et al., Molecular Cloning (2d ed. Cold Spring Harbor Press 1989), которое включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной полинуклеотидом или вектором, как описано выше. Указанная клетка-хозяин может быть любой клеткой, которая может быть генетически модифицирована и, предпочтительно, может быть культивирована. Указанная клетка может быть эукариотической или прокариотической, такой как клетка млекопитающего, клетка насекомого, клетка растения, дрожжевая клетка, грибная клетка, бактериальная клетка и тому подобное. Характерные примеры включают первичные клетки млекопитающих или стабильные линии клеток млекопитающих (3Т3, СНО, Vero, Hela и тому подобное), а также клетки дрожжей (например, Saccharomyces species, Kluyveromyces и тому подобное) и бактерий (например, Е. coli). Следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным типом клеток, и оно может быть применимо к любым разновидностям клеток, в соответствии с общедоступной информацией, используемой в данной области.

Диагностика

Благодаря настоящему изобретению возможно провести анализы для обнаружения или диагностики, которые могут быть использованы, например, для определения наличия, отсутствия, предрасположенности, риска или степени тяжести заболевания на основании пробы, взятой у индивидуума. В конкретном варианте осуществления указанным заболеванием является злокачественная опухоль. Под термином "диагностика" следует понимать также методы фармакогеномики, прогностические методы и тому подобное.

В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к способу определения in vitro или ex vivo наличия, отсутствия, предрасположенности, вероятного риска или степени тяжести заболевания у индивидуума, предпочтительно человека, который предусматривает приведение в контакт пробы, взятой из организма индивидуума, и полипептида, как описано выше, и обнаружения факта образования иммунного комплекса. Наиболее предпочтительно, полипептид является иммобилизованным на подложке. В предпочтительном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение пробы в контакт с устройством, как описано выше, и обнаружение факта образования иммунных комплексов. Предпочтительно, указанный полипептид выбран из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитоп-содержащих фрагментов и наиболее предпочтительно из 45 РАР табл. 5 (включенных в SEQ ID NO:1-3334).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу определения in vitro или ex vivo наличия, отсутствия, предрасположенности, риска или степени тяжести заболевания у индивидуума, предпочтительно человека, предусматривающим приведение в контакт пробы, взятой у индивидуума, с TIAB или частью TIAB, или соответствующей TCR-несущей клеткой, как определено выше, и определение образования иммунного комплекса. Наиболее предпочтительно, TIAB или соответствующая TCR-несущая клетка иммобилизована на подложке. В предпочтительном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение пробы в контакт с устройством, как описано выше, и определение образования иммунных комплексов. В другом предпочтительном варианте осуществления TIAB или соответствующая TCR-несущая клетка специфична в отношении полипептида, выбранного из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов и предпочтительно из 45 РАР табл. 5.

Другим объектом настоящего изобретения является способ определения наличия, отсутствия, предрасположенности, риска или степени тяжести злокачественной опухоли у индивидуума, при этом указанный способ предусматривает приведение в контакт in vitro или ex vivo пробы, взятой у индивидуума, с полипептидом, как описано выше, и определение образования иммунного комплекса. Более предпочтительно полипептид иммобилизован на подложке и выбран из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов и наиболее предпочтительно из 45 РАР табл. 5.

Другим объектом настоящего изобретения является способ определения in vitro или ex vivo наличия, отсутствия, предрасположенности, риска или степени тяжести заболевания в биологической пробе, предпочтительно в биологической пробе, взятой у человека, предусматривающим приведение в контакт указанной пробы с полипептидом, как описано выше, и определение присутствия иммунных клеток, экспрессирующих TCR, специфичный в отношении такого полипептида. Предпочтительно указанный полипептид выбран из последовательностей SEQ ID NO:2-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов и наиболее предпочтительно из 45 РАР табл. 5.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу установления in vitro или ex vivo уровня неправильной транскрипции у индивидуума, предпочтительно у человека, предусматривающим приведение в контакт пробы, взятой у индивидуума, с полипептидом, как описано выше, и определение образования иммунного комплекса. Наиболее предпочтительно полипептид иммобилизован на подложке. В предпочтительном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение пробы в контакт с устройством, как описано выше, и определение образования иммунных комплексов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу определения in vitro или ex vivo уровня неправильной транскрипции у индивидуума, предпочтительно у человека, предусматривающим приведение пробы, взятой у индивидуума, в контакт с полипептидом, как описано выше, и определение присутствия иммунных клеток, экспрессирующих TCR, специфичный в отношении такого полипептида.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения эффективности лечения злокачественной опухоли, при этом указанный способ предусматривает (i) определение уровня по меньшей мере одного полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, продуцируемого в результате неправильной транскрипции, или уровня TIAB или соответствующих TCR-несущих клеток, в пробе, взятой из организма указанного индивидуума, и (ii) сравнение указанного уровня с уровнем в пробе, взятой из организма указанного индивидуума до лечения или на ранней стадии лечения. Предпочтительно, полипептид(ы) выбран(ы) из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов, и наиболее предпочтительно из 45 РАР табл. 5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения у индивида продукции полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции, и, в частности, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов, при этом указанный способ предусматривает приведение пробы, взятой из организма указанного индивидуума, в контакт с веществом, указывающим на наличие указанного полипептида, и определение того, действительно ли указанное вещество связывается с указанной пробой.

В первом варианте осуществления указанную пробу, взятую из организма указанного индивидуума, приводят в контакт с полипептидом, который связывается с антителами, специфичными в отношении полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции, и, в частности, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитоп-содержащих фрагментов.

В другом варианте осуществления указанную пробу, взятую из организма указанного индивидуума, приводят в контакт с полипептидом, который связывается с иммунной клеткой, содержащей TCR, специфичный в отношении полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции, и, в частности, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов.

В другом варианте осуществления указанную пробу, взятую из организма указанного индивидуума, приводят в контакт с антителом или его частью, причем указанное антитело специфично в отношении полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции, и, в частности, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов.

В другом варианте осуществления указанную пробу, взятую из организма указанного индивидуума, приводят в контакт с иммунными клетками, содержащими TCR, специфичный в отношении полипептида, содержащего последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции, и, в частности, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3334 или их эпитопсодержащих фрагментов.

Настоящее изобретение кроме того относится к способу мониторинга прогрессирования или степени распространения злокачественной опухоли у индивидуума, при этом указанный способ предусматривает (i) приведение пробы, взятой из организма указанного индивидуума, в контакт по меньшей мере с одним полипептидом, содержащим последовательность аберрантного белкового домена, вырабатываемого в результате неправильной транскрипции, (ii) определение уровня TIAB или соответствующих TCR-несущих клеток в указанной пробе и (iii) сравнение указанного уровня с эталонным уровнем, где указанный эталонный уровень представляет собой среднее или срединное значение, определяемое у индивидуумов, не пораженных злокачественной опухолью, или контрольное значение, полученное у того же индивидуума до возникновения у него злокачественной опухоли. Предпочтительно, полипептид содержит последовательность РАР 12, в отношении которой титр антител значительно повышен у неработоспособных, в отличие от работоспособных, пациентов, что, таким образом, указывает на стадию распространения заболевания.

Наличие (или повышение уровня) TIAB или соответствующих TCR-несущих иммунных клеток в пробе является показателем наличия злокачественного заболевания, предрасположенности к нему или стадии его прогрессирования. Таким образом, благодаря настоящему изобретению, можно прогнозировать, какой из терапевтических подходов будет более эффективным и больше подходит для данного конкретного индивида. Такое определение на предсимптоматическом уровне позволяет также выработать профилактическую схему воздействия.

Диагностические способы по изобретению можно проводить in vitro, ex vivo или in vivo, предпочтительно in vitro или ex vivo. Указанной пробой может быть любая проба, взятая из организма индивидуума, которая, в зависимости от обстоятельств, содержит антитела или иммунные клетки. Примеры таких проб включают жидкости организма, ткани, образцы клеток, органы, биоптаты и тому подобное. Наиболее предпочтительными образцами являются пробы крови, плазмы, сыворотки, слюны, семенной жидкости и пр. Такая проба перед проведением указанного способа может быть тем или иным способом обработана, с тем, чтобы преобразовать или улучшить доступность антител для тестирования. Обработка может, например, включать одну или несколько из следующих процедур: лизис клеток (например, механический, физический, химический и пр.), центрифугирование, экстракцию, колоночную хроматографию и прочее.

В предпочтительном варианте осуществления указанный тест проводят на сыворотке или плазме крови.

Кроме того, в большинстве из предпочтительных вариантов осуществления указанную пробу перед тестированием обрабатывают так, как описано в документе ЕР08305293.6. Действительно, авторы изобретения показали, что оптимальные условия тестирования отличаются от условий, когда свежие образцы замораживают при до -20 °С или при -80 °С. Более предпочтительно, образцы, предназначенные для тестирования, подвергают химической или физической обработке, подходящей для обеспечения доступа к участку связывания с антителом, изменения конформации участка связывания с антителом или для открытия участка связывания с антителом. Более предпочтительно, указанная обработка включает нагревание образца при температуре по меньшей мере 36 °С в течение периода, достаточного для активации антитела. Предпочтительными температурами являются температуры от 36 до 70 °С, предпочтительно от 36 до 60 °С.

Определение наличия, отсутствия или относительно большого количества TIAB или специфических иммунных клеток в образце может быть предпринято с помощью различных методов, известных в данной области. Такие методики включают, но ими не ограничиваются, методы определения иммунных комплексов, такие, но ими не ограничиваются, как ELISA, как радио-иммуноанализы (RIA), методы флуоресцентных иммуноанализов, микропанель, микрочип, дот-блот-анализ, вестерн-блоттинг, EIA, IEMA, IRMA или IFMA (см. также Immunoassays, a practical approach, Edited by JP Gosling, Oxford University Press). В конкретном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение образца в контакт с полипептидом (полипептидами) в условиях, способствующих образованию иммунного комплекса, и определение факта образования указанного комплекса с помощью второго меченого реагента.

В характерном варианте осуществления указанный способ включает сравнение измеренного уровня TIAB или иммунных клеток с эталонным уровнем, при этом разница указывает на наличие дисфункции у индивидуума, например, на наличие злокачественной опухоли. Изменение обычно составляет 10, 20, 30, 40, 50% или более по сравнению с эталонным значением. Более конкретно указанное изменение уровня соответствует его увеличению по сравнению с эталонным уровнем, что является показателем наличия злокачественной опухоли.

Эталонное значение может быть средним или срединным значением, определяемым у индивидов, не больных злокачественной опухолью или другим заболеванием, эталонным уровнем, полученным у контрольного пациента, эталонным уровнем, взятым у индивидуума до возникновения у него злокачественной опухоли, или полученным на контрольном полипептиде.

В предпочтительном варианте осуществления изменение (например, повышение) уровня TIAB или иммунных клеток в указанной пробе по сравнению с эталонным уровнем является показателем наличия, возможного риска или стадии развития злокачественной опухоли.

Приведение в контакт может быть предпринято в любом подходящем устройстве, таком как планшет, планшет для микротитрования, пробирка, лунки, стекло, колонка и тому подобное. В особых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляют на субстрате, покрытом полипептидом. Указанный субстрат может быть твердым или полутвердым субстратом, таким как любая подложка, содержащая стекло, пластик, нейлон, бумагу, металл, полимеры и пр. Субстрат может иметь различные формы и размеры, например, пленка, мембрана, частица, колонка, гель и тому подобное. Приведение в контакт может осуществляться в любых условиях, подходящих для определения комплекса антиген-антитело, образуемого между полипептидом и антителами указанной пробы.

В конкретном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение образца, взятого из организма индивидуума, в контакт с (подложкой, покрытой) множеством полипептидов, как было описано выше, и определение наличия иммунных комплексов.

В конкретном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение указанного образца в контакт с многочисленными наборами частиц, где каждый набор частиц покрыт разными полипептидами, как описано выше.

В другом конкретном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение указанного образца в контакт с пленкой или мембраной, на которой, как было описано выше, расположено несколько полипептидов.

В другом конкретном варианте осуществления указанный способ предусматривает приведение указанного образца в контакт с многолуночным планшетом для титрования, где по меньшей мере часть лунок покрыта разными полипептидами, как описано выше.

Настоящее изобретение может быть использовано для определения наличия какой-либо злокачественной опухоли у индивидуума, наличия риска ее возникновения или определения ее стадии. К злокачественным опухолям относятся солидные опухоли, такие, не ограничиваясь перечисленным, как опухоль толстого кишечника, легкого, молочной железы, яичника, матки, печени или злокачественные опухоли головы и шеи, а также меланома, опухоли мозга и тому подобное. Настоящее изобретение также может быть использовано и в отношении гуморальных опухолей, таких как лейкемии. Настоящее изобретение может быть использовано при первом скрининге, для определения злокачественных опухолей, даже на ранних их стадиях, у индивидуума с риском развития такого заболевания. При втором скрининге настоящее изобретение может быть использовано для более точной идентификации типа злокачественной опухоли, в зависимости от полипептидов, используемых для определения. В этом отношении, как описано на фиг. 3, полипептиды, содержащие последовательность РАР 1, 2, 3, 4 или 7 (табл. 5), или их эпитоп-содержащий фрагмент позволяют идентифицировать пациентов с различными типами злокачественной опухоли.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение используется для определения наличия, возможного риска или стадии развития рака легкого, и указанный полипептид содержит последовательность, выбранную из РАР 1, 2, 4, 6, 7, 24, 25, 28, 29, 44 и 48 (табл. 5) (фиг. 4) или их эпитоп-содержащего фрагмента.

Скрининг лекарственных средств

Настоящее изобретение позволяет также разрабатывать (или осуществлять скрининг) новые лекарственные средства путем определения способности молекулы-кандидата модулировать уровни TIAB или соответствующих иммунных клеток.

Особым объектом настоящего изобретения является способ селекции, характеристики, скрининга или оптимизации биологически активного соединения, при этом указанный способ предусматривает определение того, модулирует ли тестируемое соединение уровни TIAB. Модуляция уровней TIAB может быть установлена либо глобально, либо в отношении конкретного белка, либо в отношении заранее прогнозированных белков.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу селекции, характеристики, скрининга или оптимизации биологически активного соединения, при этом указанный способ предусматривает приведение в контакт in vitro тестируемого соединения с геном и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать продукцию с указанного гена молекул РНК, содержащих пробелы и вставки вследствие неправильной транскрипции.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу селекции, характеристики, скрининга или оптимизации биологически активного соединения, при этом указанный способ предусматривает приведение в контакт in vitro тестируемого соединения с иммунной клеткой, экспрессирующей TCR-рецептор, специфичный в отношении полипептида, как описано выше, и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать активность роста указанной клетки.

Указанные выше анализы скрининга могут быть выполнены в любом подходящем устройстве, таком как чашки Петри, пробирки, планшеты, флаконы и тому подобное. Обычно указанный анализ проводят в многолуночных планшетах для титрования. С помощью настоящего изобретения можно параллельно исследовать несколько тестируемых соединений. Кроме того, указанное тестируемое соединение может быть получено из разных источников, иметь различную природу и состав. Оно может быть любым органическим или неорганическим веществом, таким как липид, пептид, полипептид, нуклеиновая кислота, малая молекула, может быть представлено в выделенном виде либо в составе смеси с другими веществами. Например, указанные соединения могут представлять собой полную или частичную комбинаторную библиотеку.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут описаны в следующем экспериментальном разделе, который следует интерпретировать исключительно как иллюстративный и ни в коем случае не ограничивающий объем, охватываемый настоящим изобретением.

Примеры

А - Материалы и методы.

Образцы плазмы.

Образцы крови брали у нормальных людей (n=26), участвующих в клинических испытаниях в качестве пациентов в локальном университетском госпитале, с целью биологического тестирования, не связанного со злокачественными опухолями (университетский госпиталь в Нэнси). Записи клинических наблюдений просматривались квалифицированным врачом, который устанавливал, что указанные индивидуумы не имеют острого заболевания, у них не подозревается наличие активной злокачественной опухоли, аллергии или аутоиммунных состояний. Указанная группа включает пациентов с факторами риска для развития злокачественной опухоли, например курение и ожирение, у одной из контрольной группы индивидуумов за 10 лет до момента взятия образца крови была хирургически удалена злокачественная опухоль матки, а другая была беременна на момент взятия крови. Пациенты с хроническим обструктивным заболеванием легких [COPD] (n=12) были включены в испытание либо из того же самого отделения (n=6), либо из отделения медицинской радиологии того же самого госпиталя (n=6). Ни у одного из пациентов с COPD не наблюдалось эпизодов обострения болезни в период взятия образцов крови. У пациентов с различными формами солидных опухолей (n=46) пробы были взяты во время оценки у них распространенности злокачественной опухоли методом РЕТ-СТ [позитронно-эмиссионная компьютерная томография] перед началом лечения, и определение стадии заболевания завершали, производя анализ патологических образцов (университетский госпиталь в Нэнси). В испытание были включены пациенты с активным NSCLC (n=49) из Страсбургского университетского госпиталя, и эти пациенты участвовали в многолетнем исследовании рака легких. Образцы крови были взяты во время определения стадии заболевания. Все пациенты, принимавшие участие в указанных медицинских исследованиях, дали свое письменное согласие на то, чтобы в научных целях их пробы тестировались анонимно. Сбор и анализ указанных проб, в соответствии с законами Франции, был описан и предъявлен Министерству Здравоохранения Франции и Министерству Науки.

Методы биоинформатики.

Анализ проводили, как описано выше, но с некоторыми модификациями ³⁴ . Каждый EST, с помощью доступных в базе данных источников тканей, был восстановлен и приписан каждому набору последовательностей, соответствующих злокачественным опухолям или норме. Затем каждую последовательность, с использованием MegaBlast 2.2.16 ³⁸ , единовременно выравнивали с эталонной последовательностью (RefSeq) человеческой РНК из NCBI. Придерживались единственной самой лучшей балльной оценки по выравниванию. Каждый из EST, оценка которого по выравниванию составляла не более 70% его длины, во внимание не принимался. Положения, в которых наблюдались вариации единственного нуклеотида в последовательности, принимали во внимание только в том случае, если по 10 нуклеотидам выше этого положения и по 10 нуклеотидам ниже этого положения имело место идеальное совпадение с эталонной последовательностью. При выравнивании первые и последние 50 нуклеотидов с каждого конца удаляли. Пробелы и вставки, в случае необходимости, были локализованы в положении последнего нуклеотида любого n-уплета (n-uplet).

Биохимические анализы.

Биотинилированные по N-концу пептиды с последовательностью, определяемой путем трансляции in silico эталонной последовательности (RefSeq) с учетом идентифицированного пробела K, и пептиды, соответствующие канонической последовательности альбумина и гена MRPL12, были приобретены у разных производителей. Образцы разбавляли 100-кратно, и детекцию IgG проводили с помощью ImmunoCAP100 (Phadia, Uppsala, Sweden), используя коммерчески доступные реагенты и следуя инструкциям производителя. Образцы анализировали в двух параллельных пробах, за исключением некоторых, представленных на фигуре 3, в силу недостаточности материала. Порядок тестирования образцов злокачественной опухоли и контрольных образцов, также как и РАР, был случайным. В отсутствие внутренних стандартов результаты выражали в единицах флуоресценции (FU).

Статистические методы.

Проверку статистической значимости состава нуклеотидов EST и подсчет ложноположительных ответов, полученных в результате многократного тестирования, производили так, как описано выше ³⁴ . При тестировании различий в титрах IgG использовали непараметрический ранговый критерий парных сравнений Вилкоксона.

В - Результаты.

Идентификация белковых доменов, обусловленных TI-пробелами.

Для анализа гетерогенности EST по полногеномной шкале авторы изобретения восстановили из базы данных "noncurated dbEST" ³⁹ все последовательности, раскрытые за период с января 2000 до июля 2007. Как указано в упомянутой выше базе данных, указанные последовательности были разделены в соответствии с их нормальной или злокачественной природой. Затем каждый EST единовременно выравнивали со всеми эталонными последовательностями (RefSeq) человеческой РНК из NCBI (июль 2007). Сначала авторы изобретения определяли статистическую значимость различий, имеющих место в любом конкретном положении, согласно эталонной последовательности RefSeq, между матрицами в норме и в злокачественной опухоли, а затем подсчитывали ложноположительные ответы, полученные в результате многократного тестирования ⁴¹ . Положения со статистически значимыми различиями в последовательности обозначены как K, если изменение в них выше при злокачественной опухоли, и, наоборот, N, если вариабельность выше в норме.

Наиболее важное наблюдение, вытекающее из результатов таблицы 1, состоит в том, что пробелы K возникали даже чаще, чем замены нуклеотидов K. В биоинформатике ограничения, накладываемые на указанные пробелы, являются довольно жесткими: данное положение EST с одиночным пробелом нуклеотида принимается во внимание только в том случае, если оно сверху и снизу фланкировано 10 нуклеотидами, которые точно совпадают с эталонной последовательностью RefSeq. Для 2191 пробела К, локализованных внутри открытой рамки считывания, ORF, проценты EST-пробелов в норме и при злокачественной опухоли представлены на фиг. 1. Поразительно то, что вставки К встречались в 5 раз чаще, чем вставки N, в то время как пробелы К наблюдались приблизительно в 13 раз чаще, чем пробелы N. Вычитание оценки статистических ложноположительных ответов повышало отношение до 38, поскольку значения р пробелов K значительно ниже значений р в случае пробелов N. В отличие от К, пробелов N было незначительное число, и среди них, как можно легко увидеть (см. табл. 1), имеется большой процент ложноположительных ответов. В связи с этим авторы изобретения дальнейшие анализы положений пробелов сосредоточили на положениях пробелов К, локализованных в области ORF.

В табл. 2 суммированы данные проведенных анализов. Само собой разумеется, что никаких очевидных погрешностей результата измерения в связи с различиями в числе EST или транскриптов, представленных в группе злокачественных опухолей и в нормальной группе, не было. Из табл. 1 и 2 можно подсчитать, что в клетках злокачественных опухолей вариации последовательностей мРНК, то есть замены, вставки и пробелы, возникают с частотой 1-2 на тысячу нуклеотидов. Это значительно превышает интенсивность соматических мутаций: 1-2 на миллион нуклеотидов ³¹ .

SBG (одиночный пробел нуклеотида, single base gap) в мРНК может быть вызван либо соматической, либо зародышевой мутацией, либо тем, что РНК-полимераза при считывании пропускает один нуклеотид ДНК и продолжает дальнейший процесс транскрипции. Авторами изобретения предложена также гипотеза проскальзывания вперед или назад (опережения или отставания) механизма сплайсинга, в результате чего образуются SBG, локализованные в положении первого или последнего нуклеотида экзонов. Последний из указанных механизмов был, однако, признан маловероятным, поскольку 99,2% идентифицированных SBG оказались расположенными вне зон непосредственно граничащих друг с другом экзонов и интронов.

Пропущенные в мРНК нуклеотиды, в порядке убывания, имели следующий состав: U (47%) > С (39%) > > G (10%) > А (4%). Такое распределение существенно отклоняется от случайного (критерий согласия хи-квадрат, двусторонний, α=0,05, Р=10 ^-248 ). Также и 99, 76, 98 и 95% пробелов U, С, G и А, соответственно, имело место внутри повторов одного или более идентичных нуклеотидов. Наконец, в 97% случаев пробелов U непосредственно после них обнаруживался G. Таким образом, контекстная зона геномной ДНК в клетках злокачественной опухоли частично определяется возможным возникновением пробелов в мРНК. Подробный анализ воздействия контекстной зоны ДНК на возникновение явлений TI будет приведен ниже.

Детекция аберрантной мРНК.

Для проверки указанных заключений, сделанных на основе биоинформатики, авторы изобретения клонировали библиотеку кДНК пациента с раком легких в составе плазмиды, в которой, после осуществления количественной ПЦР и секвенирования, явление SBG возникало в заранее предсказанном положении (фиг. 2, А-Е). Авторами изобретения проанализировано такое же число клонов, полученных из нормальной ткани того же самого индивида, и никакой вариабельности последовательности не обнаружено (данные не приведены). Прямое секвенирование геномной ДНК, полученной из злокачественной опухоли, из непосредственно прилегающей к ней ткани и из нормальной ткани того же самого пациента, однозначно показало отсутствие в указанном положении как соматической, так и зародышевой мутации. Авторы изобретения не могут исключить того, что идентифицированный пробел в мРНК был искусственно создан в процессе клонирования. Однако маловероятно, чтобы такое явление в точности совпало с положением, предсказанным с помощью методов биоинформатики. Таким образом, вполне закономерно заключение, что в клетках злокачественной опухоли малая, но детектируемая часть мРНК не является точной копией геномной ДНК.

Материалы и методы.

Получение плазмид.

Плазмиду pBAD (Invitrogen) использовали, чтобы иметь индуцибельный промотор выше клонируемой последовательности. Последовательность альфа-пептида, амплифицированного из плазмиды pBS-SK+, клонировали не в фазе с ATG, присутствующей в клонирующем сайте CCATGG плазмиды pBAD, чтобы получить альфа-плазмиду pBAD. В отсутствие клонируемой последовательности альфа-пептид не продуцировался, и колония Е. coli имела белую окраску.

Получение вставки и клонирование.

кДНК из злокачественной опухоли легкого и прилежащей нормальной ткани, полученных у одного и того же индивида (Biochain Inc.), амплифицировали с помощью ПЦР, используя олигонуклеотиды, комплементарные гену CFL1, и высокоточную полимеразу Phusion (Finnzyme) и следуя рекомендациям производителя. Затем кДНК очищали на колонках Nucleospin Extract II (Macherey Nagel), визуализировали на агарозном геле и подвергали действию рестрикционных ферментов NcoI и NheI (Biolabs). Затем полученные продукты лигировали в альфа-плазмиду pBAD, обработанную теми же самыми ферментами, и дефосфорилировали. Клетки Е. coli TOP10 (Invitrogen) трансформировали лигирующей смесью и высевали на планшетах, покрытых средой LB, содержащей ампициллин (100 мг/л), арабинозу (0,5%), X-Gal (80 мкг/мл).

Скрининг колоний.

Когда клонировали последовательность CFL1 без пробела, альфа-пептид был не в фазе с ATG: колония имела белую окраску. Когда клонировали последовательность CFL1 с пробелом, продуцировался альфа-пептид, неактивная β-галактозидаза (присутствующая в геноме данной бактерии) дополнялась, и колония Е. coli приобретала голубую окраску (фиг. 2В).

Голубые колонии росли в среде LB, обогащенной ампициллином (100 мг/л), и 1 мкл культуры подвергали скринингу в ПЦР в реальном времени, используя специфические олигонуклеотиды CFL1 и краситель Syber-green I (Sigma) (фиг. 2С). Первый олигонуклеотид (показано зеленым на указанной фигуре) является специфичным в отношении обеих последовательностей, и с его помощью показано, что число плазмидных копий между этими 2 образцами не отличается. Второй олигонуклеотид является специфичным в отношении эталонной последовательности CFL1 (Refseq), и с его помощью показано различие между Ct, когда указанная последовательность не идентична последовательности Refseq (показано красным на указанной фигуре).

Плазмидную ДНК клонов, в которых показано различие между Ct, экстрагировали и секвенировали с помощью олигонуклеотида, присутствующего на данной плазмиде (GATC biotech) (фиг. 2С).

Последовательности были выровнены с эталонной последовательностью CFL1.

Детекция TIAB.

На фиг. 1 показан процент отклонений, зарегистрированных для каждого положения К как при злокачественных опухолях (ось Y), так и в нормальных пробах (ось X). Пробелы К распределялись в ограниченном числе (532 или 1,4%) транскриптов (фиг. 1, встроенный график). Указанные мРНК утратили свою каноническую рамку считывания и должны будут транслироваться в аберрантные, возможно, иммуногенные белки. Для проверки такой гипотезы авторы изобретения выбрали панель пробелов 15 K, характерных для положений пробелов 2206 ORF (табл. 5, РАР 1-15), и они были распределены по 8 различным хромосомам человека. Указанные 15 положений связаны с 8, 5 и 2 пропусками U, С и G, соответственно. Авторами изобретения подтверждено, что АА-последовательности, согласно прогнозированию, происходящие в результате трансляции мРНК с одиночным пробелом нуклеотида, 1) кодируют АА-последовательность длиной не более чем 12, 2) не совпадают ни с одним из человеческих белков более чем по 7 последовательным АА (Swiss-Prot ⁴² ), 3) не являются гомологичными друг другу АА-последовательностями. Авторами изобретения также установлено, что выбранные пробелы К не были идентифицированы как соматические мутации при злокачественных опухолях ни в каталоге соматических мутаций Института Сэнджера (http://www.sanger.ac.uk/cosmic) ⁴³ , ни по 2 современным крупномасштабным программам глубокого секвенирования генома клеток злокачественных опухолей, которые включают 11 из 15 генов, включенных в текущий скрининг ^31,32 . Пробелы K не соответствуют биологически ратифицированному или предполагаемому однонуклеотидному полиморфизму (SNP). Наконец, и в соответствии с наиболее поздним обновлением базы данных dbSNP (21 сентября 2007), не существует SNP, вызывающего сдвиг рамки считывания, идентичный сдвигу, вызываемому одиночным пробелом выше определенного положения ⁴⁴ .

Образцы крови отбирали у людей, разделенных на две или более групп. Все образцы представляли собой остаточную сыворотку крови. По меньшей мере в одну группу входили пациенты с активными злокачественными опухолями. Клинические данные, релевантные для всех групп, включая контроли и активные злокачественные опухоли, были собраны и дополнительно констатированы квалифицированным врачом. Данные по контролям могут включать факторы риска в отношении развития злокачественной опухоли. Данные по пациентам со злокачественной опухолью могут включать данные по стадийности и ответу на лечение. Группы организованы таким образом, чтобы оценить панель TIAB и их специфичность и чувствительность к конкретным диагностическим признакам, таким как раннее обнаружение злокачественной опухоли, идентификация типа злокачественной опухоли, прогнозирование степени тяжести и прогрессирования заболевания или ответ на лечение.

Синтетические биотинилированные по N-концу пептиды, соответствующие указанным выше предсказанным аберрантным белкам (РАР), были получены и индивидуально нанесены поверх лунок Elia, покрытых стрептавидином (Phadia, Uppsala Sweden). Сыворотки 46 пациентов со злокачественной опухолью (стадия I) и 26 контрольных индивидуумов (табл. 4) инкубировали либо в холостых (не покрытых пептидом лунках), либо в покрытых пептидом лунках. IgG, связанный с лунками после промывки, был выявлен с помощью вырабатывающих флуоресценцию коммерческих вторичных антител с инвариантным доменом, полученных против IgG человека. В первом анализе интенсивность флуоресценции, измеренную с любым данным РАР у данного индивидуума, вычитали из таковой, измеренной у того же самого индивидуума с использованием не содержащей пептид покрытой стрептавидином лунки (контроль). В результатах, полученных у пациентов со злокачественными опухолями, в отличие от контрольных, статистически значимо повышен уровень IgG против РАР 1, 2, 4, 7 (тесты Вилкоксона, Р <2Е ^-8 ; Р <2Е ^-3 ; Р <5Е ^-2 ; Р <3Е ^-2 , соответственно) (фиг 3А). В норме не было обнаружено статистически значимых различий в уровне какого-либо IgG, обнаруживаемого у молодых ( <50 лет), в отличие от старых (> 50 лет) индивидуумов (тесты Вилкоксона = NS), и значимых различий, связанных с полом, среди контролей (тесты Вилкоксона = NS). Далее авторы изобретения произвели тестирование того, позволяет ли етекция IgG против РАР установить различия между индивидуумами со злокачественной опухолью и контрольными индивидами. Указанный тест было принято считать положительным (фиг. 3, светло- и темно-красный), если разница в интенсивности флуоресценции между лунками, покрытыми РАР, и холостыми лунками была больше, чем наиболее высокое значение, измеренное в контрольной группе. Таким образом, специфичность была условно принята за 100%. При этих условиях все, кроме одного, РАР выявляли по меньшей мере одного пациента со злокачественной опухолью; 6 из 15 РАР дали возможность идентифицировать уровни IgG, превышающие контрольные, более чем у 10% пациентов. Учитывая все вместе, 35 из 46 пациентов (76%) с 7 формами наиболее распространенных солидных опухолей имели уровни IgG выше порога, определяемого в контрольной группе. На фиг. 3 показано, что пациенты с раком толстой кишки, легкого и раком головы и шеи имели более разнообразную панель положительных сигналов и были позитивны в отношении РАР 11, 10 и 8, соответственно. У пациента с раком молочной железы IgG связывался только с РАР 6. Указанное разнообразие далее уменьшалось у пациентов с раком яичника, кожи и матки (фиг. 3).

Таким образом, при использовании указанной первой панели из 15 РАР полнота охвата и чувствительность были оптимальными для рака легких. Для ранней стадии рака легкого не существует чувствительных тестов, в связи с этим диагностика ранних стадий является редкой, и 5-летний период выживания достигается только у 14% (46).

Детекция TIAB для диагностики ранних стадий рака легких.

Важным значением настоящего изобретения является то, что диагностика ранней стадии рака легких может стать возможной на основе тестирования крови. Анализ данных не требует изощренных статистических методов, таким образом, риск подгонки является минимальным ¹⁰ . Кроме того, предлагаемый здесь тест не связан с систематическим изучением биомаркеров, а является управляемым гипотезами автоматическим решением на основе прогнозирований биоинформатики, таким образом, риск искажений в результате многократного тестирования низок ¹⁰ . Однако в связи с клиническим аспектом такого решения авторы изобретения искали подтверждения репликации в независимом исследовании.

Синтетические биотинилированные по N-концу пептиды с АА-последовательностью, выбранной из 45 РАР табл. 5, составляющие панель затравок TIAB, были приобретены у разных производителей и индивидуально нанесены поверх планшетов, покрытых стрептавидином Reacti-Bind (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois). Образцы разбавляли в 100 раз и изучали в двух параллельных пробах. Сывороточный IgG, связанный с пептидами, выявлен с помощью коммерческих вторичных антител с инвариантным доменом, полученных против IgG человека, конъюгированных с ферментом, в частности, с фосфатазой. Реакцию с флуоресцентным субстратом проводили, используя коммерчески доступные реагенты. Считывание флуоресценции проводили с помощью устройства для считывания микропланшетов FLUOstar Galaxy (BMG Labtech, Offenburg, Germany) в соответствии с инструкциями производителя.

TIAB выбирают из панели для получения конкретного диагностического признака заболевания, если может быть установлен порог для разделения индивидуумов по меньшей мере на две группы, подобранные в соответствии с указанным признаком. Для выбранных TIAB абсолютная интенсивность флуоресценции в одной группе выше, чем указанный порог, а флуоресценция, измеряемая тем же способом в другой группе, ниже, чем указанный порог.

Отбор РАР для мониторинга прогрессирования или распространения заболевания.

Авторы изобретения приступили к отбору РАР из панели в группе пациентов, у которых представлены разные стадии прогрессирования или распространения заболевания, следуя способу, описанному в предыдущем примере (отбор PAP/TIAB для получения конкретного диагностического признака заболевания).

Затем приступили к тестированию эффективности выбранной панели РАР в первой группе из 49 пациентов, у которых представлены разные стадии немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) (фиг. 4).

Образцы крови отбирали у 25 здоровых людей в качестве контроля, у 12 индивидуумов с заболеванием немелкоклеточного рака легкого и, на момент диагностики, у 49 пациентов с разными стадиями NSCLC (таблица 4, исследование II). Указанные пациенты с NSCLC были показательными в отношении текущего состояния указанного заболевания во Франции. В силу отсутствия надежных способов тестирования ранних стадий большинство пациентов с NSCLC было диагностировано на продвинутой стадии заболевания, и только 20% имело раннюю стадию. Результаты по интенсивности флуоресценции (FI), полученные по 37 первым РАР в табл. 5 для каждого пациента и для контрольных индивидуумов, приведены на фиг. 4А. Статистическую значимость различий между группами определяли согласно критерию Вилкоксона, результаты представлены на каждой панели. Как можно видеть, показатель FI значительно повышался у пациентов с раком легкого по сравнению с контрольными индивидуумами по 33 из 37 РАР. Значение р в тестах Вилкоксона изменялось от 10 ^-15 до 10 ^-10 для 10 наиболее отличительных PAP (фиг. 4В). Отдельно РАР1 позволял совершенно четко отличить контроли от NSCLC (специфичность = 100% и чувствительность = 100%).

Таким образом, гипотеза о том, что побочные продукты трансляции аберрантной мРНК с SBG вносят вклад в модуляцию гуморального иммунного ответа на NSCLC, оказалась обоснованной. Авторы изобретения подтвердили это путем тестирования того, что связывание IgG с РАР было спецификой их АА-последовательности. Таким образом, были измерены уровни IgG против альбуминового пептида, пептида, соответствующего каноническому считыванию генома на уровне гена 1, и 3 самых отличительных РАР по отношению к IgG против соответствующих им канонических пептидов (СР). Указанные канонические пептиды (СР) кодируются теми же самыми генами, что и сегмент, кодирующий РАР (7, 24, 28), но их АА-последовательности были последовательностями, полученными при каноническом считывании человеческого генома, то есть без смещения рамки считывания. Полученные данные показывают, что у пациентов с раком легких титры Ig против канонических пептидов были значительно ниже, чем таковые против РАР (фиг. 5), и что канонические пептиды в случаях указанного заболевания и в контроле не отличаются (NS, то есть статистически незначимо, согласно тесту Вилкоксона).

Детекция TIAB у мышей.

Чтобы распространить концепцию TIAB на остальных млекопитающих и подтвердить то, что детекция TIAB вызвано злокачественной опухолью, авторы изобретения попытались перенести результаты указанных наблюдений на мышиную модель. Сначала было выбрано 5 РАР, которые позволяли эффективно отличить пациентов с NSCLC от контролей. Как показано на фиг. 6А, три из них на геномном уровне отличаются высокой степенью консервативности между мышью и человеком. И, что самое главное, потенциально затронутые нуклеотиды были идентичны у обоих видов, это имеет место также и в отношении 4 нуклеотидов выше и 2 нуклеотидов ниже. Ранее авторы изобретения показали степень важности указанной контекстной зоны короткой ДНК, которой обусловлено явление TI ³⁴ . Два других выбранных РАР относились к генам, не являющимся консервативными между мышью и человеком. Ген, который давал РАР 9, присутствует в геноме человека, но отсутствует у мыши. У мышей появление SBG в предсказанном положении гена, при трансляции которого образуется РАР 2, связано с включением стоп-кодона после кодирования 7 АА. Был введен также дополнительный отрицательный контроль, соответствующий каноническому пептиду РАР 7. Иммунокомпетентным мышам (С57В16), (n=12) подкожно инокулировали мышиную легочную карциному Льюиса (LLC1) ^45,46 . Связывание IgG с 5 РАР и одним СР было измерено перед трансплантацией LLC1 и далее, с недельным интервалом, до 21 дня. К этому сроку средние размеры опухоли составляли 3,15+0,4 см ³ . Как показано на фигуре 6В, уровень IgG против РАР 7, РАР 48 и РАР 62 значительно повышался через 2 недели после имплантации. Значения р в парном t-тесте составляли 1 ×10 ^-4 , 3 ×10 ^-4 9 ×10 ^-4 , соответственно, для РАР 7, РАР 48 и РАР 62. Значительного увеличения уровня IgG против СР7 не наблюдалось.

Материалы и методы.

Культура клеток.

Линию клеток мышиной легочной карциномы Льюиса (LLC1) получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Указанные клетки культивировали во флаконах в 75 см ² , содержащих среду RPMI 1640 (Invitrogen, France), обогащенную 10% ЭБС, стрептомицином (0,1 мг/мл) и пенициллином (100 ед./мл), и инкубировали при 37 °С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО ₂ в воздухе.

Трансплантация опухоли.

Клетки опухоли LLC1 (5 ×10 ⁵ клеток в конечном объеме 0,1 мл RPMI 1640) инъецировали подкожно (п/к) в правую заднюю часть туловища 7-недельных самок крыс С57b1/6 (Janvier, France). Через 21 день после п/к инъекции клеток LLC1 объемы опухолей определяли путем измерения диаметра каждой рассеченной пополам опухоли и расчета по формуле V= а ² × b × 0,5236, где "а" представляет собой больший диаметр, и "b" представляет собой меньший диаметр. Перед п/к инъекцией опухолевых клеток у мышей, находящихся под действием изофлурановой анестезии, в качестве пробы в срок Т0, брали образец крови в 100 мкл. Один раз в неделю под действием изофлурановой анестезии брали образец крови в 100 мкл в пробирку с ЭДТА, в качестве проб в дни Т 7, 14 и 21.

Клиническое подтверждение.

Чтобы подтвердить тот факт, что комбинация РАР по изобретению может обеспечить надежную диагностику рака легких, авторы изобретения провели широкомасштабное контрольное ретроспективное исследование, которое включало 161 контрольного индивидуума, которые были здоровыми донорами крови в возрасте от 18 до 65 лет и среди которых не были исключены курильщики. Пациенты состояли из 140 индивидов с ранней стадией немелкоклеточного рака легких. Образцы крови этих пациентов отбирали во время диагностики. Все пациенты этой группы соответствовали критериям, подходящим для хирургического вмешательства, и, таким образом, в подавляющем большинстве случаев речь шла о ранней стадии. Все пациенты этой группы были подвергнуты оперативному вмешательству, таким образом, послеоперационные стадии и классификация патологии были отслежены у всех пациентов. Следует подчеркнуть, что пациенты в этой группе не получали перед операцией ни химиотерапии, ни радиотерапии. Клинические характеристики контрольных индивидуумов и пациентов представлены в табл. 4, исследование III. Пациентов и контрольных индивидуумов тестировали в отношении TIAB, направленных против 6 РАР, измеряемых в специфических экспериментальных условиях. Статистический анализ диагностической ценности указанной комбинации маркеров определяли с помощью метода опорных векторов (SVM). SVM сохранялся после того, как анализировали характеристики способов альтернативной классификации. SVM определяет 6-мерную гиперплоскость и обеспечивает измерение индивидуального расстояния контрольных индивидуумов и пациентов от этой гиперплоскости. Таким образом, для каждого пациента данные представлены в виде относительного расстояния до гиперплоскости. Видно, что 2 популяции пациентов со злокачественными опухолями и контрольных индивидуумов полностью разделены (фиг. 7А). Общая разрешающая способность теста составляла 86% чувствительности и 97% специфичности. Только 5 контролей оказались не на той стороне гиперплоскости. И 19 пациентов с раком легких оказались не на той стороне гиперплоскости. После многократной перекрестной проверки результата на достоверность чувствительность и специфичность составили, соответственно, 82 и 95%. Чувствительность у более молодых или более старых пациентов не отличается (фиг. 7В). Из анализа полученных данных видно, что чувствительность настоящего теста ниже для пациентов с аденокарциномами, которые диагностированы при 76% чувствительности, в отличие от этого, разрешающая способность теста составляет > 90% чувствительности для всех остальных классов немелкоклеточной карциномы. Указанные различия в разрешающей способности теста были статистически значимы (фиг. 7С).

Благоприятный эффект операции при раке легких является хорошо установленным. Указанный благоприятный эффект заключается не только в увеличении продолжительности жизни, но и в окончательном излечении, которое установлено в результате анализа числа диагностированных и количества смертельных исходов. Во Франции эти категории составляют ≈33000 вновь диагностированных и ≈28000 смертельных исходов. Таким образом, определенно можно констатировать, что 5000 пациентов, то есть 15%, вылечилось от рака легкого. Все, кто остается в живых после перенесенного рака легких, подвергались хирургической процедуре, но не все пациенты с раком легких, подвергнутые хирургической операции, излечиваются. В настоящее время не известно такого метода, который позволил бы отличить индивидов, для которых одно только хирургическое вмешательство окажется достаточно благотворным, от тех, для которых это не так. Таким образом, авторы изобретения сделали попытку оценить разрешающую способность данного теста на основе 6 РАР в плане прогнозирования степени тяжести заболевания во время установления диагноза. Для достижения этой цели исследуемую популяцию подразделили на 2 группы. В первую группу входили пациенты, для которых авторами изобретения было задокументировано основание для безрецидивной выживаемости в течение периода, превышающего 36 месяцев. Ко второй группе относились либо умершие пациенты, либо пациенты с рецидивом заболевания, возникшим в течение 36 месяцев после операции. Не включены были пациенты, для которых срок наблюдения был короче 36 месяцев, просто потому, что срок отслеживания таких индивидов был слишком короток для установления результата. Затем для пациентов указанных 2 групп, численность которых была приблизительно одинаковой, сравнивали расстояние до указанной гиперплоскости. Из данных, представленных на фиг. 7D, становится понятно, что у пациентов, которые излечились в результате хирургической операции и которые в течение 3 лет жили без рецидива заболевания, расстояние до гиперплоскости было значимо больше (Р=0,005), чем у тех, для которых хирургическое вмешательство было менее эффективным. Это заключение порождает 2 непосредственно связанных с ним практических выхода. Во-первых, наверняка данный тест даст возможность идентифицировать пациентов с ранней стадией рака легких, на которых оперативное вмешательство окажет самое благоприятное воздействие. Во-вторых, для пациентов с положительным диагностическим тестом, но с малым расстоянием до гиперплоскости будет установлена целесообразность альтернативного терапевтического вмешательства. Такой альтернативной мерой может служить традиционная рентгенотерапия или химиотерапия. Однако текущая интерпретация этих данных авторами изобретения состоит в том, что маловероятно, чтобы для выздоровления пациентов с низким уровнем иммунологического ответа на наличие злокачественной опухоли легких было достаточно только хирургического вмешательства. При такой перспективе может оказаться полезным фармакологическое усиление их иммунологического ответа перед или вскоре после хирургического вмешательства. Таким образом, в настоящей заявке проиллюстрировано на примерах важное значение открытия РАР как ведущего критерия для дальнейшей инновационной стратегии в терапии.

Далее авторы изобретения попытались разработать тест, специфичный в отношении рака легких, путем тестирования различных комбинаций РАР в специфических экспериментальных условиях. Новая комбинация РАР позволила достичь 100% специфичности и 90% чувствительности в отношении рака легкого против контроля. Самое главное то, что при использовании этого теста у пациентов с раком молочной железы только у 3 из 20 пациентов с раком молочной железы тест оказывался положительным. Таким образом, при сравнении рака легких и рака молочной железы ошибочно классифицированными оказывались, соответственно, 10 и 15% пациентов. Авторы изобретения сочли, что такая частота ошибки повлечет за собой излишние и дорогостоящие последующие диагностические процедуры. Следующим плановым мероприятием в случае диагностики рака легких является компьютерная томография грудного отдела, тогда как в случае диагностики рака молочной железы таким мероприятием является маммография или эхография. Сканирование методом позитронно-эмиссионной томографии используется для оценки стадии распространения заболевания. Таким образом, были созданы специфические тесты, дающие возможность более эффективно отличать рак легкого от рака молочной железы. Для достижения указанной цели были найдены четыре комбинации РАР. Указанные комбинации маркеров проиллюстрированы на фиг. 8В. Во всех 4 случаях пациентов с раком легких удалось отделить от пациентов с раком молочной железы, а перекрывание получено лишь при диагностике от одного до трех пациентов. Представлена клиническая значимость указанной комбинации маркеров, поскольку их прогностическая ценность в отношении степени тяжести заболевания требует дополнительной оценки. Авторы изобретения прогнозируют возможность выявления в широкомасштабном исследовании специфической комбинации РАР, наподобие той, которая была найдена для рака легких, которая позволит прогнозировать клинический исход в случае рака молочной железы. Для достижения этой цели необходим специфический тест в отношении рака молочной железы. В настоящее время авторами изобретения идентифицирована комбинация 3 маркеров, которые при специфических условиях дают возможность идентифицировать рак молочной железы и отличать его от контроля с 60% чувствительностью и с 95% специфичностью (фиг. 8С). Авторы считают, что можно идентифицировать комбинацию РАР, которая будет служить индикатором наличия наиболее распространенных видов злокачественной опухоли на ранней их стадии, просто в образце крови. Вторичные комбинации РАР обеспечат более тонкую индикацию с уточнением локализации заболевания, позволяя, таким образом, выбрать адекватную вторичную диагностическую процедуру, например, срез СТ, маммографию, ультразвуковое обследование, фиброскопию, эндоскопию, биопсию. Третья ступень тестирования с использованием РАР должна будет обеспечить прогнозирование индивидуального ответа каждого пациента на хирургическое лечение и, следовательно, будет служить индикатором того, есть ли необходимость в дополнительных терапевтических мерах. Четвертая ступень тестирования с использованием РАР обеспечит инструмент для мониторинга рецидива заболевания и/или его благоприятного ответа на лечение.

С - Обсуждение.

Авторы изобретения идентифицировали новый и поддающийся оценке на ранних стадиях источник гетерогенности белков злокачественных клеток человека, при этом указанная гетерогенность запускает слабую, но разнообразную продукцию IgG. Точная детекция этих низких титров специфических IgG создает многообещающие перспективы для диагностики ранних стадий злокачественных опухолей и может предоставить информацию относительно стадии распространения заболевания. Данное открытие сделано на основе совмещения прогнозирований в области биоинформатики с иммунологической детекцией специфических IgG, направленных на аберрантные пептиды. Белки, содержащие последовательность РАР, не могут быть транслированы с нормальной человеческой мРНК, а только с такой мРНК, которая утратила свою каноническую геномную информацию в результате одиночного пробела нуклеотида.

Полученные данные подтверждают вывод о том, что предсказанные мРНК с одиночным пробелом присутствуют в злокачественных клетках и по меньшей мере частично транслируются. Возникновение идентифицированных пробелов EST является слишком обычным явлением, чтобы вырабатываться злокачественными клетками в результате соматических мутаций ^31,32 . Текущие оценки уровня соматических мутаций в злокачественных клетках ведут к прогнозированию 12 делеций, из которых 4 должны быть одиночными пробелами. Вместо этого авторами изобретения выявлено 2206 таких статистически значимых событий. Кроме того, ни один из выбранных пробелов не соответствовал ни мнимым, ни биологически ратифицированными SNP ⁴⁴ . Таким образом, маловероятно, чтобы пробелы в мРНК возрастали на геномном уровне, и, следовательно, они должны возникать позже, то есть в процессе транскрипции или непосредственно после нее.

Установлено, что основания пре-мРНК и зрелой мРНК могут быть модифицированы ферментами, но ни разу не было показано, чтобы какой-нибудь из известных ферментов, осуществляющих редактирование человеческой мРНК, удалял одиночный пробел из одноцепочечной человеческой РНК ⁴⁷ . Показано, что эдитосома митохондриальной мРНК Трипаносомы способна осуществлять U-специфическую делецию ⁴⁸ . Однако в человеческом геноме не обнаружено гомологов эдитосомных белков трипаносомы и лейшмании. Кроме того, указанный механизм эдитинга является U-специфическим и не может объяснить наблюдаемые 53% не-U-пробелов при злокачественных опухолях человека. Авторы изобретения рассмотрели и возможность того, что в результате проскальзывания механизма сплайсинга вперед или назад могут образовываться одиночные пробелы нуклеотидов, которые могли бы затрагивать первый или последний нуклеотид экзонов ⁴⁹ . Ни один из тестируемых пробелов не был локализован в таких положениях. Более того, этот последний механизм был признан маловероятным, поскольку 99,2% из более чем 2000 идентифицированных SBG оказались расположенными вне зон непосредственно граничащих друг с другом экзонов и интронов. Наконец, ясно, что контекстная зона короткой ДНК оказывает существенное влияние на возникновение EST-пробелов при злокачественных опухолях, сходное с тем, что показано в отношении EST-замен нуклеотидов ^34,36,37 . На этом основании авторы изобретения в настоящее время считают, что пропуск одиночного нуклеотида ферментом Pol II, то есть явление TI, вызывает возникновение мРНК с пробелами.

Далее авторы изобретения проиллюстрировали то, что мРНК с одиночным пробелом, возникающим в заранее предсказанном положении, образуется в клетке злокачественной опухоли в отсутствие соматической или зародышевой мутации. Таким образом, в биоинформатике концепция неправильной транскрипции (TI) у человека является биологически ратифицированной.

Вторым наиболее важным следствием описанного здесь открытия является то, что с позиций канонического считывания человеческого генома невозможно объяснить гетерогенность клеток злокачественной опухоли. В связи с этим авторы изобретения предполагают, что в клетках злокачественной опухоли повышается уровень неправильной транскрипции. Такое предположение имеет под собой следующие основания. Во-первых, авторами изобретения было показано ранее методом DHPLC, что мРНК клеток злокачественной опухоли более гетерогенны, чем мРНК, выделенные из нормальных клеток ³⁴ . Повышенная вариабельность последовательностей мРНК в злокачественной опухоли по сравнению с нормальной мРНК подтверждена независимыми исследованиями на основе экспериментов с использованием SAGE. Во-вторых, анализ всех доступных последовательностей, полученных из человеческой мРНК, выявил статистически значимое возрастание уровня замен, вставок и пробелов (SBG) нуклеотидов при злокачественных опухолях по сравнению с нормальными библиотеками. Такие явления возникают в 10 ³ чаще, чем соматические мутации при злокачественных опухолях. Если бы они возникали на уровне ДНК, скорее всего, такой уровень мутаций оказался бы летальным. Таким образом, логично предположить, что такие вариации возникают в процессе транскрипции или же вскоре после нее и затрагивают только пре-мРНК и зрелую мРНК, то есть транзитные молекулы. В-третьих, в настоящее время не известно никаких молекулярных механизмов, кроме TI, которые могли бы осуществлять либо удаление, либо добавление одиночного нуклеотида в молекулах мРНК, а затем осуществлять повторную сборку последовательностей. Таким образом, прямое исследование предсказанного SBG, возникающего в клетках рака легкого у человека, в отсутствие мутации на уровне ДНК указывало на то, что РНК-полимераза может при считывании пропускать одиночный нуклеотид ДНК, но тем не менее продолжать процесс считывания. Наконец, в работах других групп исследователей было показано, что явление TI возникает in vivo даже в отсутствие злокачественной опухоли. В частности, у крыс линии Brattleboro GA-делеция, возникающая в последовательности GAGAG, возвращает транскрипт вазопрессина к нормальному виду, вызывая тем самым супрессию несахарного диабета. В результате сдвига транскрипционной рамки, затрагивающей повторяющуюся А-последовательность β-амилоида и убиквитина В, образуются белки, которые обнаружены путем иммунологического окрашивания бляшек при болезни Альцгеймера.

В настоящее время авторы изобретения отдают предпочтение гипотезе, согласно которой повышенная гетерогенность мРНК злокачественной опухоли является скорее следствием, чем причиной канцерогенеза. И действительно, им удалось обнаружить специфический IgG, направленный против панели РАР, о которых идет здесь речь, в сыворотке детей с развернутой анапластической крупноклеточной лимфомой, у которых обнаружена транслокация киназы анапластической лимфомы (ALK) (G. Delsol и В. Bihain, неопубликованные результаты) ⁵⁰ . Исследования на грызунах показали, что транслокация, вызывающая конститутивную экспрессию указанной киназы, является первичным онкогенным явлением, которое само по себе является достаточным для того, чтобы вызвать трансформацию ⁵¹ . Таким образом, детекция положительных сигналов, которые отражают продукцию аномальной мРНК, кодирующей функционально не связанные гены, которые не являются частью данной специфической транслокации, свидетельствует о том, что данное явление возникает как следствие указанного онкогенного поражения. Однако возможно, что явление TI вносит свой вклад в ускорение канцерогенеза. Действительно, несколько генов, участвующих в регуляции транскрипции, трансляции и репарации ДНК - не включены в настоящее исследование, поскольку предполагаемая функция гена не являлась частью процесса селекции РАР - идентифицированы при проведении методов биоинформатики с помощью пробела K. Таким образом, не исключено, что в данном случае имеют дело с автокаталитическим процессом, многообразие и интенсивность которого повышаются с прогрессированием степени тяжести заболевания.

Подходы биоинформатики указывают на то, что возникновение SBG в мРНК является общим признаком злокачественной опухоли. Тем не менее различия в профилях IgG были обнаружены также и у пациентов при лимфомах (N=27). РАР 1 и 2, которые обычно положительны при NSCLC, оказались отрицательными у пациентов как с фолликулярной, так и с анапластической лимфомой. Это противоречит тому, что РАР 4 и 7, которые, в отличие от фолликулярной лимфомы, обычно положительны при анапластической крупноклеточной лимфоме. Поэтому, в силу разнообразия (> чем 2000 кандидатов) доступной панели РАР, авторы изобретения предлагают подбирать состав опухолеспецифических панелей РАР. Они проиллюстрировали данную концепцию, показав способность РАР эффективно отличать пациентов с раком легких от таковых с раком молочной железы.

Заключение авторов изобретения о том, что молекулы мРНК с одиночным пробелом по меньшей мере частично транслируются в аберрантные белки, предполагает, что в клетках злокачественных опухолей механизм деградации мРНК, содержащей преждевременные стоп-кодоны [механизм ПСК, или NMD, nonsense-mediated decay], может быть дефективным ⁵² . Если учесть современные достижения в области протеомики, весьма неожиданно то, что такая в высшей степени разнообразная панель аберрантных белков до сих пор оставалась необнаруженной. Это может иметь 2 объяснения. 1) Идентификация белков методом масс-спектрометрии основана на соответствии, наблюдаемом при сравнении с предсказанными спектрами, определяемыми на основе известных или предполагаемых АА-последовательностей ⁵³ . АА-последовательностей аберрантных белков, образующихся в результате пробелов в мРНК, нет в современных белковых базах данных (Swiss-Prot/TrEMBL ⁴² , и, таким образом, они не могут быть идентифицированы путем MS/MS-анализа. 2) Протеасома быстро подвергает аберрантные белки деградации, с выходом потенциально аберрантных иммуногенных пептидов ⁵⁴ .

Представление о том, что явление TI учащается в злокачественной опухоли, порождает вопрос о современной стратегии выявления биомаркеров злокачественных опухолей и создания новых методов. Систематические попытки в области протеомики злокачественных опухолей приводят к противоречивым результатам, расхождения приписывают вариабельности пре-аналитических условий. Это может быть очень и очень правильно, но в данном случае должно быть рассмотрено альтернативное объяснение. Если принять, что гетерогенность белков клеток злокачественной опухоли значительно превышает текущие оценки, становится вероятным, что объемов проб недостаточно для тщательного зондирования в высшей степени разнообразного репертуара белковых вариантов. Другим ограничением в современной протеомике является то, что, как было указано ранее, в настоящее время данные масс-спектрометрии интерпретируются с позиций канонического считывания человеческого генома. Таким образом, белки с аберрантными АА-последовательностями могут оказаться вне сферы адекватной идентификации. Следовательно, есть вероятность, что для того, чтобы достичь успеха в области протеомики злокачественных опухолей, будут необходимы не только методологические, но и концептуальные изменения. С учетом явления неправильной транскрипции по изобретению, можно идентифицировать более надежные и релевантные биомаркеры.

Авторы изобретения в мышиных клетках злокачественной опухоли выявили 3 аберрантных белка, кодируемых высококонсервативными, но функционально не связанными генами. Наиболее обильно представленным белком в LLC1 был цитоплазматический поли(А)-связывающий белок 1 (РАВРС1) (РАР 62). РАВРС1 в норме связывается с мРНК поли-А и модулирует путь деградации мРНК, содержащей преждевременные стоп-кодоны (NMD). Прикрепление РАВРС1 ниже преждевременного стоп-кодона отменяет механизм NMD. Вторым наиболее обильно представленным белком в LLC1 был белок, кодируемый геном виментина (VIM) (PAP 48). Виментин является белком промежуточных филаментов типа III, который образует как гомо-, так и гетерополимерные структуры, способствуя поддержанию клеточных мембран, удерживанию ядра и органелл на определенных местах, а также ассоциации с микротрубочками. Третьим наиболее обильно представленным аберрантным белком был белок, кодируемый геном IK (PAP 7). Нормальной функцией IK является функция ингибирования цитокином индуцируемой гамма-интерфероном экспрессии главного комплекса гистосовместимости класса II. Кроме того, IK идентифицирован также как ассоциированный с хондросаркомой белок 2. Последствия, связанные с присутствием в клетках злокачественной опухоли указанных вариантов белков, в настоящее время неизвестны. Однако нельзя исключить возможность их существенного вмешательства в клеточную биологию злокачественной клетки, и их вклад в метаболизм злокачественной клетки, в ее морфологические изменения, а также в гетерогенность мРНК требует дальнейшего изучения. На данной стадии авторы изобретения смогли установить, что большая часть из РАР модулирует гуморальный иммунный ответ на злокачественную опухоль NSCL у человека и на LLC1 у мышей. Авторы предсказывают, что продуцирование указанных аберрантных белков клетками злокачественной опухоли может значительно изменять клеточную функцию вплоть до доминантного отрицательного или положительного эффекта. Таким образом, эти три высококонсервативных гена могли бы стать новыми терапевтическими мишенями.

Анализ мышиной модели рака легких позволил установить причинную связь между наличием LLC1 и детекцией анти-PAP-IgG. Таким образом, анти-PAP-IgG появляются как часть нормального и своевременного иммунного ответа, запущенного злокачественной опухолью. Интересно, что у мышей уровни анти-PAP-IgG были значительно выше (в 100 раз), чем таковые, измеряемые у человека с раком легких. Тот факт, что относительный размер опухоли легких у мышей тоже значительно больше, а также тот факт, что LLC1 имплантирован эктопически в подкожную ткань, может, возможно, служить объяснением для таких различий.

Таким образом, в настоящем изобретении описан новый механизм, посредством которого злокачественная опухоль модулирует гуморальный иммунный ответ. На данной стадии авторы изобретения полагают, что новый механизм TI вносит вклад в резкое возрастание гетерогенности мРНК клеток злокачественной опухоли, часть образующихся аберрантных мРНК-посредников транслируется в аберрантные белки, некоторые из которых накапливаются в клетках злокачественной опухоли и большинство которых модулирует гуморальный иммунный ответ, обусловленный злокачественной опухолью. Таким образом, в настоящем изобретении представлены продукты и способы, позволяющие безошибочно отличать пациентов со злокачественной опухолью от пациентов, не имеющих активной формы рака. Таким образом, можно разработать систематический биохимический скрининг у подверженных риску индивидов, производя визуализацию всего организма у пациентов с положительными тестами и повышая процент индивидуумов, диагностируемых на ранней стадии.

Таблица 1. Результаты статистического тестирования

LBE относится к оценке уровня ложноположительных ответов на основе установления локализации.

Таблица 2. Результаты анализа биоинформатики

Результаты анализов, проведенных после получения всех доступных из базы данных "noncurated dbEST" человеческих последовательностей EST, раскрыты за период с января 2000 по июль 2007. В данной таблице приведено также число положений, совпадающих при применении первого (эффективны > 70) и второго статистических критериев.

Таблица 3. TI-пептид и последовательности нуклеиновых кислот.

Таблица 3а. Нуклеиновые и аминокислотные последовательности 2206 TI-пептидов, образующихся в результате пробела. Последовательности SEQ ID NO:1-2206, обозначаемые так в настоящем документе, представляют собой пептидные последовательности, представленные в колонке 6 табл. 3А.

Таблица 3b. Нуклеиновые и аминокислотные последовательности 1128 TI-пептидов, образующихся в результате вставки. Последовательности SEQ ID NO:2207-3334, обозначаемые так в настоящем документе, представляют собой пептидные последовательности, представленные в колонке 6 табл. 3В.

Таблица 4. Клинические данные контрольных индивидов и индивидуумов со злокачественными опухолями

* Международный Противораковый Союз (UICC): Классификация злокачественных опухолей TNM. 4th ed. Hermanek P., Sobin L.H., eds. Berlin, Heidelberg, New York: Springer Verlag; 1987. Revised 1992.

Исследование III

Исследование IV

Таблица 5. Характеристические свойства 45 РАР-полипептидов

"Номер РАР" означает ссылочный номер РАР в данном тексте.

"SEQ ID NO" соответствует идентификационному номеру в списке последовательностей.

"Координаты РАР на SEQ ID" означает положение аминокислотных остатков полипептида РАР в цитируемой SEQ ID.

Таблица 6. Пять отрицательных контролей

Литература

1. Weinberg, R. in The biology of cancer 655-724 (Garland Science, Taylor and Francis Group, LLC, 2007).

2. Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. Cancer genes and the pathways they control. Nat Med 10, 789-99 (2004).

3. ASCO. American Society of Clinical Oncology policy statement update: genetic testing for cancer susceptibility. J Clin Oncol 21, 2397-406 (2003).

4. Fackenthal, J. D. & Olopade, O. I. Breast cancer risk associated with BRCA1 and BRCA2 in diverse populations. Nat Rev Cancer 7, 937-48 (2007).

5. Guillem, J. G. et al. ASCO/SSO review of current role of risk-reducing surgery in common hereditary cancer syndromes. J Clin Oncol 24,4642-60 (2006).

6. van de Vijver, M. J. et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347, 1999-2009 (2002).

7. Anderson, N. L. et al. The human plasma proteome: a nonredundant list developed by combination of four separate sources. Mol Cell Proteomics 3, 311- 26 (2004).

8. Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A. & Petricoin, E. F. Proteomic applications for the 20 early detection of cancer. Nat Rev Cancer 3, 267-75 (2003).

9. Ishikawa, N. et al. ADAM8 as a novel serological and histochemical marker for lung cancer. Clin Cancer Res 10, 8363-70 (2004).

10. Ransohoff, D. F. Rules of evidence for cancer molecular-marker discovery and validation. Nat Rev Cancer 4, 309-14 (2004).

11. Ransohoff, D. F. Bias as a threat to the validity of cancer molecular-marker research. Nat Rev Cancer 5, 142-9 (2005).

12. Stroun, M. et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. Oncology 46, 318-22 (1989).

13. Boddy, J. L., Gal, S., Malone, P. R., Harris, A. L. & Wainscoat, J. S. Prospective study of quantitation of plasma DNA levels in the diagnosis of malignant versus benign prostate disease. Clin Cancer Res 11,1394-9 (2005).

14. Boddy, J. L. et al. The role of cell-free DNA size distribution in the management of prostate cancer. Oncol Res 16, 35-41 (2006).

15. Lund, A. H. & van Lohuizen, M. Epigenetics and cancer. Genes Dev 18, 2315- 35 (2004).

16. Ducasse, M. & Brown, M. A. Epigenetic aberrations and cancer. Mol Cancer 5, 60 (2006).

17. Goessl, C. et al. Fluorescent methylation-specific polymerase chain reaction for DNA-based detection of prostate cancer in bodily fluids. Cancer Res 60, 5941-5 (2000).

18. Jeronimo, C. et al. Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer. Urology 60, 1131-5 (2002).

19. Reibenwein, J. et al. Promoter hypermethylation of GSTP1, AR, and 14-3-3sigma in serum of prostate cancer patients and its clinical relevance. Prostate 67, 427-32 (2007).

20. Wang, Y. et al. Identification of epigenetic aberrant promoter methylation of RASSF1A in serum DNA and its clinicopathological significance in lung cancer. Lung Cancer 56, 289-94 (2007).

21. Diehl, F. et al. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci USA 102, 16368-73 (2005) .

22. Korshunova, Y. et al. Massively parallel bisulphite pyrosequencing reveals the molecular complexity of breast cancer-associated cytosine-methylation patterns obtained from tissue and serum DNA. Genome Res (2007).

23. Bentley, D. R. Whole-genome re-sequencing. Curr Opin Genet Dev 16, 545-52 (2006).

24. Meyer, M., Stenzel, U., Myles, S., Prufer, K. & Hofreiter, M. Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples. Nucleic Acids Res 35, e97 (2007).

25. Tan, E. M. Autoantibodies as reporters identifying aberrant cellular mechanisms in tumorigenesis. J Clin Invest 108, 1411-5 (2001).

26. Finn, O. J. Immune response as a biomarker for cancer detection and a lot more. N Engl J Med 353, 1288-90 (2005).

27. Zinkernagel, R. M. What is missing in immunology to understand immunity? Nat Immunol 1, 181-5 (2000).

28. Wang, X. et al. Autoantibody signatures in prostate cancer. N Engl J Med 353, 1224-35 (2005).

29. Somers, V. A. et al. A panel of candidate tumor antigens in colorectal cancer revealed by the serological selection of a phage displayed cDNA expression library. J Immunol 169, 2772-80 (2002).

30. Hardouin, J., Lasserre, J. P., Sylvius, L., Joubert-Caron, R. & Caron, M. Cancer immunomics: from serological proteome analysis to multiple affinity protein profiling. Алл N Y Acad Sci 1107, 223-30 (2007).

31. Sjoblom, T. et al. The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 314, 268-74 (2006).

32. Wood, L. D. et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science 318, 1108-13 (2007).

33. Nelkin B., P. D., Robinson S., Small D., Vogelstein B. (ed. Owens, A., Coffey, D.S., Baylin, S.B.) 441-460 (Academic Press, New York, 1982).

34. Brulliard, M. et al. Nonrandom variations in human cancer ESTs indicate that mRNA heterogeneity increases during carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 104, 7522-7 (2007).

35. Armache, K. J., Kettenberger, H. & Cramer, P. The dynamic machinery of mRNA elongation. Curr Opin Struct Biol 15, 197-203 (2005).

36. Kashkina, E. et al. Template misalignment in multisubunit RNA polymerases and transcription fidelity. Mol Cell 24, 257-66 (2006).

37. Pomerantz, R. Т., Temiakov, D., Anikin, M., Vassylyev, D. G. & McAllister, W. T. A mechanism of nucleotide misincorporation during transcription due to template-strand misalignment. Mol Cell 24, 245-55 (2006).

38. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L. & Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol 7, 203-14 (2000).

39. Boguski, M. S., Lowe, Т. М. & Tolstoshev, С. М. dbEST-database for "expressed sequence tags". Nat Genet 4, 332-3

(1993).

40. Pruitt, K. D., Tatusova, T. & Maglott, D. R. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. Nucleic Acids Res 35, D61-5 (2007).

41. Dalmasso, C., Broet, P. Procedures d'estimation du false discovery rate basees sur la distribution des degres de signification. Journal de la Societe Franqaise de Statistiques 146 (2005).

42. Bairoch, A. & Apweiler, R. The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL in 1999. Nucleic Acids Res 27, 49-54 (1999).

43. Bamford, S. et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer 91, 355-8 (2004).

44. Sherry, S. T. et al. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res 29, 308-11 (2001).

45. Sharma, S. et al. T cell-derived IL-10 promotes lung cancer growth by suppressing both T cell and APC function. J Immunol 163, 5020-8 (1999).

46. Bertram, J. S. & Janik, P. Establishment of a cloned line of Lewis Lung Carcinoma cells adapted to cell culture. Cancer Lett 11, 63-73 (1980).

47. Gott, J. M. & Emeson, R. B. Functions and mechanisms of RNA editing. Annu Rev Genet 34, 499-531 (2000).

48. Rogers, K., Gao, G. & Simpson, L. U-specific 3'-5' exoribonucleases involved in U-deletion RNA editing in trypanosomatid mitochondria. J Biol Chem (2007).

49. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, L., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J. in Molecular cell biology (ed. Freeman) 404-452 (2000).

50. Lamant, L. et al. Gene-expression profiling of systemic anaplastic large-cell lymphoma reveals differences based on ALK status and two distinct morphologic ALK+ subtypes. Blood 109, 2156-64 (2007).

51. Chiarle, R. et al. NPM-ALK transgenic mice spontaneously develop T-cell lymphomas and plasma cell tumors. Blood 101, 1919-27 (2003).

52. Wormington, M. Zero tolerance for nonsense: nonsense-mediated mRNA decay uses multiple degradation pathways. Mol Cell 12, 536-8 (2003).

53. Biemann, K. Sequencing of peptides by tandem mass spectrometry and high-energy collision-induced dissociation. Methods Enzymol 193, 455-79 (1990).

54. Glickman, M. H. & Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway destruction for the sake of construction. Physiol Rev 82, 373-428 (2002).