[RU]

В данном документе представлены композиции и способы, применимые в идентификации и отборе растений маиса с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев. В способах применяют молекулярные генетические маркеры в пределах участка QTL, расположенного на хромосоме 4, для идентификации и отбора растений с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, и растения, содержащие аллель QTL, ассоциированный с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, можно скрестить с другими растениями маиса для введения повышенной устойчивости в другие линии или сорта маиса.

(57) Реферат / Формула:

В данном документе представлены композиции и способы, применимые в идентификации и отборе растений маиса с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев. В способах применяют молекулярные генетические маркеры в пределах участка QTL, расположенного на хромосоме 4, для идентификации и отбора растений с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, и растения, содержащие аллель QTL, ассоциированный с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, можно скрестить с другими растениями маиса для введения повышенной устойчивости в другие линии или сорта маиса.

---

Евразийское (21) 201990256 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A01H1/04 (2006.01)
2019.07.31 C12N15/82 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.06.26
(54) СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МАИСА, УСТОЙЧИВОГО К СЕРОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ
(31) 62/360,585
(32) 2016.07.11
(33) US
(86) PCT/US2017/039249
(87) WO 2018/013323 2018.01.18
(71) Заявитель: ПАЙОНИР ХАЙ-БРЕД ИНТЕРНЭШНЛ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Джанг Марк Тимоти, Перуджини Леандро Даниэль, Уолтерс Петра Дж.
(US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) В данном документе представлены композиции и способы, применимые в идентификации и отборе растений маиса с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев. В способах применяют молекулярные генетические маркеры в пределах участка QTL, расположенного на хромосоме 4, для идентификации и отбора растений с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, и растения, содержащие аллель QTL, ассоциированный с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, можно скрестить с другими растениями маиса для введения повышенной устойчивости в другие линии или сорта маиса.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-554950ЕА/025
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МАИСА, УСТОЙЧИВОГО К СЕРОЙ ПЯТНИСТОСТИ ЛИСТЬЕВ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам,
применимым для повышения устойчивости к серой пятнистости
листьев у растений маиса.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка является продолжением предварительной заявки на патент США № 62/360585, поданной 11 июля 2016 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В
ВИДЕ
ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА С ПОМОЩЬЮ EFS-WEB
Официальная копия перечня последовательностей подается
одновременно с описанием с помощью EFS-Web в виде текстового
файла в соответствии с Американским стандартным кодом для обмена
информацией (ASCII), имеющего название файла
BB2457WOPCT_SequenceListing_ST25.txt, дату создания 22 мая 2017 года и размер 14,1 кбайт. Перечень последовательностей, поданный с помощью EFS-Web, является частью описания и, таким образом, включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Маис является одним из важнейших источников пищи для человека и животных. Многие стрессорные факторы окружающей среды влияют на растения маиса, отражаясь на производстве и доступности маиса. Например, культуры маиса зачастую сильно поражены серой пятнистостью листьев (GLS), вызываемой грибковым патогеном Cercospora zeae-maydis или Cercospora zeina (называемыми в данном документе Cercospora spp.) .
GLS представляет собой глобальную проблему с преобладанием в Африке, Северной, Центральной и Южной Америке и Азии. Cercospora spp. зимует в растительных остатках на полях, а для распространения своих спор и заражения маиса требует влаги,
обычно в виде сильного тумана, росы или дождя. Заражение маиса Cercospora spp. вызывает увеличение выделения ресурсов растения для защиты от поврежденной ткани листьев, что приводит к повышению риска возникновения корневой и стеблевой гнили и снижению распределения ресурсов на наполнение зерна, что, в конечном итоге, приводит к еще большим потерям урожая. Симптомы, как правило, включают удлиненные повреждения серого цвета, ширина которых составляет приблизительно 1-3 мм, а длина от 5 до 70 мм, появляющиеся на материале листьев. Также было отмечено, что во время случаев сильного заражения повреждения возникают на стеблях. Кроме того, заражение Cercospora spp. снижает урожай зерна и качество силоса. GLS может приводить к потере до 68% урожая. Следовательно, само собой разумеется, важное значение имеет снижение восприимчивости маиса к GLS.
Некоторыми общеупотребительными способами контроля GLS являются фунгициды, севооборот, подготовка почвы и санитарная обработка полей. Некоторыми недостатками данных способов является то, что они относительно дороги, неэффективны или вредны для окружающей среды. В то же время, наиболее эффективным и наиболее предпочтительным способом контроля GLS является разведение устойчивых гибридов.
Применение отбора по фенотипу для интрогрессии признака стойкости к GLS из устойчивого сорта в восприимчивый сорт может быть длительным и трудоемким. GLS чувствительна к условиям окружающей среды и требует высокой влажности и повышенной увлажненности листьев. Данная чувствительность затрудняет надежный отбор на устойчивость к GLS из года в год исключительно на основе фенотипа (Lehmensiek et al. , Theor. Appl. Genet. 103:797-803 (2001)). Специализированные участки для проведения скрининга заболеваний могут быть дорогостоящими в эксплуатации, и растения должны быть выращены до зрелости, чтобы классифицировать уровень устойчивости.
Отбор с применением молекулярных маркеров, ассоциированных с устойчивостью к GLS, обладает тем преимуществом, что позволяет проводить по меньшей мере некоторый отбор исключительно на основе набора генов потомков. Таким образом, устойчивость к GLS
можно измерять в жизненном цикле растения очень рано, даже на стадии семени. Повышенная скорость отбора, которую можно достичь благодаря применению молекулярных маркеров, ассоциированных с признаком устойчивости к GLS, означает, что селекция растений на устойчивость к GLS может происходить с большей скоростью и что коммерчески приемлемые растения, устойчивые к GLS, можно разработать быстрее.
Существует потребность в коммерчески приемлемых гибридных и инбредных линиях, проявляющих относительно высокий уровень устойчивости к GLS, ассоциированной с Cercospora zeina. Таким образом, представляют интерес способы идентификации растений маиса с устойчивостью к GLS, с помощью которых можно преодолеть или по меньшей мере свести к минимуму вышеуказанные недостатки. Также представляют интерес молекулярные генетические маркеры для скрининга растений маиса, проявляющих варьирующие уровни устойчивости к GLS.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
В данном документе представлены композиции и способы идентификации и/или отбора (т. е. получения) растений маиса, характеризующихся повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев.
В одном варианте осуществления в данном документе представлен способ идентификации и/или отбора растения маиса с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, причем способ предусматривает стадии: (а) проведения скрининга популяции с помощью маркера, расположенного на хромосоме 4 в пределах интервала, содержащего и фланкированного РНМ67 64-7 и РНМ2 8 9-1, для определения того, содержит ли одно или несколько растений маиса из популяции аллель QTL, ассоциированный с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, где аллель QTL содержит "С" в РНМ1963-15 и одно или несколько из следующего: "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20; и (Ь) отбора из указанной
популяции по меньшей мере одного растения маиса, содержащего аллель QTL. Маркер может располагаться на хромосоме 4 в пределах интервала, содержащего и фланкированного РНМ521-8 и РНМ18451-2. Способ может дополнительно предусматривать: (с) скрещивание растения маиса со вторым растением маиса; и (d) получение растения-потомка, которое имеет благоприятный аллель QTL. Способ может включать проведение отбора растения маиса из программы селекции, если аллель QTL выявлен, или проведение негативного отбора растения маиса, если аллель QTL не выявлен. В одном аспекте аллель QTL, ассоциированный с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, содержит: "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ2 8 9-2 0.
В другом варианте осуществления в данном документе представлен способ идентификации и/или отбора растения маиса, которое проявляет повышенную устойчивость к серой пятнистости листьев. Способ предусматривает стадии (а) выявления у растения маиса аллеля маркерного локуса, где указанный маркерный локус расположен на хромосоме 4 в пределах хромосомного интервала, содержащего и фланкированного РНМ6764-7 и РНМ289-1, и указанный аллель ассоциирован с гаплотипом, содержащим "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20; и (Ь) отбора растения маиса, которое имеет аллель маркерного локуса, ассоциированный с гаплотипом, содержащим "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20. Положение маркерного локуса на хромосоме 4 можно дополнительно уточнить до хромосомного
интервала, содержащего и фланкированного РНМ521-8 и РНМ18451-2. Способ может дополнительно предусматривать: (с) скрещивание растения маиса со вторым растением маиса; и (d) получение растения-потомка, которое имеет аллель, ассоциированный с гаплотипом, содержащим "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_4 5; "А" в РНМСО01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20.
В другом варианте осуществления в данном документе представлен способ идентификации и/или отбора растения маиса, которое проявляет повышенную устойчивость к серой пятнистости листьев. Способ предусматривает стадии (а) выявления в растении маиса аллеля QTL, содержащего "С" в РНМ1963-15 и одно или несколько из следующего: "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_4 5; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20; где указанный аллель QTL расположен на хромосоме 4 в интервале, заданном и включающем РНМ6764-7 и РНМ289-1; и (Ь) отбора растения маиса, которое имеет аллель QTL. Аллель QTL может быть расположен на хромосоме 4 в интервале, заданном и включающем РНМ521-8 и РНМ18451-2. Способ может дополнительно предусматривать: (с) скрещивание растения маиса со вторым растением маиса; и (d) получение растения-потомка, которое имеет аллель QTL. Аллель QTL может дополнительно содержать "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_4 5; "А" в РНМСО01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20.
В другом варианте осуществления в данном документе представлен способ идентификации и/или отбора растения маиса, которое проявляет повышенную устойчивость к серой пятнистости листьев. Способ включает стадии (а) выявления в растении маиса "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в
PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20; и (Ь) отбора растения маиса, которое имеет "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_4 5; "А" в РНМСО01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20, где указанное растение маиса характеризуется повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев. Способ может дополнительно предусматривать: (с) скрещивание растения маиса со вторым растением маиса; и (d) получение растения-потомка, которое имеет "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20.
Также представлены растения, идентифицированные и/или отобранные с применением способов, описанных в данном документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящее изобретение можно более полно понять за счет следующего подробного описания и перечня последовательностей, который составляет часть настоящей заявки.
Описания последовательностей и перечень
последовательностей, включенные в данный документ в качестве приложения, соответствуют правилам, регулирующим раскрытия нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей в патентных заявках, как изложено в 1.821 1.825 раздела 37 C.F.R. В перечне последовательностей предусмотрен однобуквенный код для обозначений нуклеотидных последовательностей и трехбуквенные коды для аминокислот, как определено в соответствии со стандартами IUPAC-IUBMB, описанными в Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) и в Biochemical J. 219 (2):345-373 (1984), которые включены в данный документ посредством ссылки. Символы и формат, применяемые для данных нуклеотидных и аминокислотных
последовательностей, соответствуют правилам, изложенным в 1.822 раздела 37 C.F.R.
N0: 1
представляет
собой
эталонную
РНМ67
64-7 .
N0:2
представляет
собой
эталонную
РНМ16
360-9.
N0:3
представляет
собой
эталонную
РНМ52
1-8 .
N0:4
представляет
собой
эталонную
РНМ58
6-10.
N0:5
представляет
собой
эталонную
РНМ2 8
9-20 .
N0: 6
представляет
собой
эталонную
РНМ12
024-9.
N0:7
представляет
собой
эталонную
РНМ19
9-23 .
N0: 8
представляет
собой
эталонную
РНМ19
63-15.
N0: 9
представляет
собой
эталонную
РНМ18
451-2.
SEQ ID N0:10 представляет собой
последовательность для маркера PZE-104068674.
SEQ ID N0:11 представляет собой
последовательность для маркера SYN25809.
SEQ ID N0:12 представляет собой
последовательность для маркера PZE-104069351.
SEQ ID N0:13 представляет собой
последовательность для маркера PZE-104069548.
SEQ ID N0:14 представляет собой
последовательность для маркера PZE-104069570.
SEQ ID N0:15 представляет собой
SEQ
последовательность для маркера PZE-104069652.
N0:16 представляет собой
эталонную
эталонную
эталонную
эталонную
эталонную
эталонную
эталонную
последовательность для маркера SYN21168.
SEQ ID N0:17 представляет
последовательность для маркера SYN4720.
собой эталонную
SEQ ID
NO:
18 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера SYN4714.
SEQ ID
NO:
19 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PZE-104070450.
SEQ ID
NO:
20 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PHMGLS 01.
SEQ ID
NO:
21 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PHMGLS 07.
SEQ ID
NO:
22 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PHMGLS 14.
SEQ ID
NO:
23 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PHMGLS 19.
SEQ ID
NO:
24 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PHMGLS 21.
SEQ ID
NO:
25 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера PHMGLS 45.
SEQ ID
NO:
2 6 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера РНМСО01YAR.
SEQ ID
NO:
27 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера РНМ5013-12.
SEQ ID
NO:
28 представляет
собой
эталонную
последовательность
ДЛЯ
маркера РНМ15534-13.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В данном документе представлены маркерные локусы маиса, которые демонстрируют статистически значимую косегрегацию с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев. Выявление этих локусов или дополнительных сцепленных локусов можно применять при отборе с помощью маркеров в рамках программы селекции маиса для получения растений маиса, которые характеризуются устойчивостью к серой пятнистости листьев.
Следующие определения представлены для содействия пониманию настоящего изобретения.
Следует понимать, что настоящее раскрытие не ограничивается конкретными вариантами осуществления, которые, само собой разумеется, можно менять. Также следует понимать, что терминология, применяемая в данном документе, предназначена лишь
для описания конкретных вариантов осуществления и не подразумевается как ограничивающая. Используемые в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения термины в единственном числе и формы единственного числа, например, включают объекты во множественном числе, если только смысл явно не подразумевает иное. Таким образом, например, ссылка на "растение", "определенное растение" или "некоторое растение" также включает несколько растений; также, в зависимости от контекста, применение термина "растение" также включает генетически подобных или идентичных потомков такого растения; применение термина "нуклеиновая кислота" необязательно на практике включает множество копий такой молекулы нуклеиновой кислоты; аналогичным образом, термин "зонд" необязательно (и, как правило) охватывает множество подобных или идентичных молекул зондов.
Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации от 5'- к 3'-концу. Числовые диапазоны, перечисляемые в описании, охватывают числа, задающие диапазон, и включают каждое целое число или любое дробное число в пределах заданного диапазона. Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно рядовому специалисту в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при тестировании объекта, упоминаемого в настоящем изобретении, можно применять любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, предпочтительные материалы и способы описаны в данном документе. При описании и заявлении объекта настоящего изобретения будет применяться нижеследующая терминология в соответствии с изложенными ниже определениями.
Термин "аллель" относится к одной из двух или более различных нуклеотидных последовательностей, которые находятся в определенном локусе.
"Частота аллеля" относится к частоте (доле или процентной доле), при которой аллель присутствует в локусе в пределах особи, в пределах линии или в пределах популяции линий.
Например, в случае аллеля "А" диплоидные особи с генотипом "АА", "Аа" или "аа" характеризуются значениями частоты аллеля, составляющими 1,0, 0,5 или 0,0 соответственно. Частоту аллеля в пределах линии можно оценивать путем усреднения значений частоты аллеля в выборке особей из данной линии. Аналогичным образом, частоту аллеля в пределах популяции из линий можно рассчитывать путем усреднения значений частоты аллеля в линиях, которые составляют данную популяцию. В случае популяции с ограниченным количеством особей или линий частоту аллеля можно выражать как число особей или линий (или любой другой указанной группы), содержащих данный аллель.
"Ампликон" представляет собой амплифицированную нуклеиновую кислоту, например, нуклеиновую кислоту, которая получена путем амплификации матричной нуклеиновой кислоты с помощью любого доступного способа амплификации (например, PCR, LCR, транскрипция и т. п.).
Термин "осуществление амплификации" в контексте амплификации нуклеиновой кислоты представляет собой любой процесс, посредством которого получают дополнительные копии выбранной нуклеиновой кислоты (или ее транскрибированной формы). Типичные способы амплификации включают способы репликации на основе различных полимераз, в том числе полимеразную цепную реакцию (PCR), лигаза-опосредованные способы, такие как лигазная цепная реакция (LCR), и способы амплификации на основе РНК-полимеразы (например, с помощью транскрипции).
Термин "сборка" применяется в отношении ВАС и их способностей к объединению с образованием непрерывных отрезков ДНК. ВАС "собирается" в контиг на основании выравнивания последовательности, если ВАС секвенируют, или путем выравнивания фингерпринта данной ВАС с фингерпринтами других ВАС. Общедоступные сборки можно найти с применением Maize Genome Browser, который находится в открытом доступе в сети Интернет.
Аллель "ассоциирован с" признаком, если он является частью последовательности ДНК или аллеля, которые влияют на экспрессию признака, или сцеплен с ними. Присутствие аллеля является
показателем того, как признак будет экспрессироваться.
"ВАС", или искусственная бактериальная хромосома, представляет собой вектор клонирования, полученный из природного F-фактора Escherichia coli, который сам по себе представляет собой элемент на основе ДНК, который может существовать в виде кольцевой плазмиды или может быть интегрирован в бактериальную хромосому. ВАС допускают возможность введения крупных вставок из последовательности ДНК. В случае маиса целый ряд ВАС, каждая из которых содержит крупную вставку геномной ДНК маиса из инбредной линии маиса В7 3, был собран в контиги (перекрывающиеся непрерывные генетические фрагменты или "непрерывная ДНК"), и данная сборка находится в открытом доступе в сети Интернет.
Фингерпринт ВАС представляет собой средство анализа
сходства между несколькими образцами ДНК, исходя из присутствия
или отсутствия специфических сайтов рестрикции (сайты рестрикции
представляют собой нуклеотидные последовательности,
распознаваемые ферментами, которые разрезают или "осуществляют рестрикцию" ДНК). Образцы двух или более ВАС расщепляют с помощью одного набора ферментов рестрикции и сравнивают размеры образованных фрагментов, обычно с применением разделения на геле.
"Возвратное скрещивание" относится к способу, при котором
гибридных потомков многократно скрещивают с одним из родителей.
В схеме возвратного скрещивания "донорный" родитель относится к
родительскому растению с требуемыми геном/генами,
локусом/локусами или специфическим фенотипом, подлежащим интрогрессии. "Реципиентный" родитель (используется один или несколько раз) или "рекуррентный" родитель (используется два или более раз) относится к родительскому растению, в которое интрогрессируют ген или локус. Например, см. Ragot, М. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing: a practical example, в Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol. 72, pp. 45-56, и Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breedingr Analysis of Molecular Marker Data, pp. 41-4 3. Первичное скрещивание приводит к возникновению поколения F1; в таком случае термин "BCi" относится
ко второму применению рекуррентного родителя, "ВСг" относится к третьему применению рекуррентного родителя и т. д.
"Сантиморганида" ("сМ") представляет собой единицу измерения частоты рекомбинации. Одна сМ равна 1% вероятности того, что маркер в одном генетическом локусе будет отделен от маркера во втором локусе вследствие кроссинговера за одно поколение.
Используемый в данном документе термин "хромосомный интервал" обозначает непрерывный линейный участок геномной ДНК, который расположен in planta на одной хромосоме. Генетические элементы или гены, расположенные в одном хромосомном интервале, являются физически сцепленными. Размер хромосомного интервала особым образом не ограничен. В некоторых аспектах генетические элементы, расположенные в пределах одного хромосомного интервала, являются генетически сцепленными, как правило, с расстоянием генетической рекомбинации, например, меньше или равным 2 0 сМ или, в качестве альтернативы, меньше или равным 10 сМ. То есть, два генетических элемента в пределах одного хромосомного интервала подвергаются рекомбинации с частотой меньше или равной 2 0% или 10%.
"Хромосома" представляет собой отдельную единицу спиральной ДНК, содержащую множество генов, которые выполняют свою функцию и перемещаются как единое целое во время клеточного деления и, следовательно, можно сказать, являются сцепленными. Ее также можно называть "группой сцепления".
В случае настоящей заявки фраза "близкосцепленные" означает, что рекомбинация между двумя сцепленными локусами происходит с частотой, равной или меньшей чем приблизительно 10% (т. е. они разделены на генетической карте не более чем 10 сМ) . Иначе говоря, близкосцепленные локусы косегрегируют в по меньшей мере 90% случаев. Маркерные локусы особенно применимы в отношении объекта настоящего изобретения, когда они демонстрируют значительную вероятность косегрегации (сцепления) с требуемым признаком (например, устойчивостью к серой пятнистости листьев). Близкосцепленные локусы, такие как маркерный локус и второй локус, могут проявлять частоту
межлокусной рекомбинации, составляющую
10%
или
менее,
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
даже
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
даже
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
даже
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее и
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее.
очень
предпочтительных
вариантах осуществления соответствующие
локусы
проявляют частоту рекомбинации, составляющую приблизительно 1% или менее, например, приблизительно 0,75% или менее, более предпочтительно приблизительно 0,5% или менее или даже более предпочтительно приблизительно 0,25% или менее. О двух локусах, которые локализованы на одной и той же хромосоме и на таком расстоянии, что рекомбинация между двумя данными локусами происходит с частотой, составляющей меньше 10% (например, приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или менее), также говорят, что они "расположены близко" друг к другу. В некоторых случаях два различных маркера могут характеризоваться одинаковыми координатами на генетической карте. В этом случае два маркера расположены настолько близко друг к другу, что рекомбинация происходит между ними с настолько низкой частотой, что ее невозможно выявить.
Выражение "комплементарная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая комплементарна данной нуклеотидной последовательности, т. е. последовательности соответствуют друг другу согласно правилам спаривания оснований Уотсона-Крика.
Термин "непрерывная ДНК" относится к непрерывающемуся отрезку геномной ДНК, представленному частично перекрывающимися единицами или контигами.
При ссылке на взаимосвязь между двумя генетическими элементами, такими как генетический элемент, вносящий вклад в устойчивость к серой пятнистости листьев, и близкий маркер, сцепление в фазе "притяжения" обозначает состояние, при котором
"благоприятный" аллель в локусе устойчивости к серой пятнистости листьев физически ассоциирован на одной и той же нити хромосомы с "благоприятным" аллелем соответствующего сцепленного маркерного локуса. В фазе "притяжения" оба благоприятных аллеля совместно наследуются потомками, которые наследуют такую хромосомную нить.
Термин "подвергнутый скрещиванию" или "скрещивание" относится к половому скрещиванию и включает слияние двух гаплоидных гамет путем опыления с получением диплоидных потомков (например, клеток, семян или растений). Термин охватывает как опыление одного растения другим, так и самооплодотворение (или самоопыление, например, когда пыльца и семяпочка происходят из одного и того же растения).
Растение, называемое в данном документе "диплоидным", имеет два набора (генома) хромосом.
Растение, называемое в данном документе "удвоенным гаплоидом", получают путем удвоения гаплоидного набора хромосом (т. е. половины нормального количества хромосом). Растение удвоенный гаплоид имеет два идентичных набора хромосом, и все локусы считаются гомозиготными.
"Элитная линия" представляет собой любую линию, которая была получена на основе селекции и отбора в отношении самого лучшего агрономического показателя.
"Экзотическая линия маиса" или "экзотическая зародышевая плазма маиса" представляет собой линию, полученную от растения маиса, которое не принадлежит доступной элитной линии или линии зародышевой плазмы маиса. В контексте скрещивания двух растений или линий зародышевой плазмы маиса экзотическая зародышевая плазма не является близкородственной по происхождению с элитной зародышевой плазмой, с которой ее скрещивают. Чаще всего экзотическая зародышевая плазма не происходит ни от одной известной элитной линии маиса, а, напротив, выбрана для введения новых генетических элементов (как правило, новых аллелей) в программу селекции.
"Благоприятный аллель" представляет собой аллель в конкретном локусе (маркер, QTL и т. д.), который обеспечивает
или вносит вклад в требуемый с агрономической точки зрения фенотип, например, устойчивость к серой пятнистости листьев, и который обеспечивает возможность идентификации растений с требуемым с агрономической точки зрения фенотипом. Благоприятный аллель маркера представляет собой маркерный аллель, который сегрегирует с благоприятным фенотипом.
Подразумевается, что "фрагмент" означает часть нуклеотидной последовательности. Фрагменты можно применять в качестве гибридизационных зондов или праймеров для PCR при применении способов, раскрытых в данном документе.
"Генетическая карта" представляет собой описание взаимосвязей генетического сцепления у локусов на одной или нескольких хромосомах (или группах сцепления) в пределах данного вида, обычно представленная в форме диаграммы или таблицы. В случае каждой генетической карты расстояния между локусами измеряются по тому, насколько часто их аллели появляются вместе в популяции (по их частотам рекомбинации). Аллели можно выявлять с применением ДНК- или белковых маркеров или наблюдаемых фенотипов. Генетическая карта является отражением картируемой популяции, типов применяемых маркеров и потенциала полиморфизма у каждого маркера в различных популяциях. Генетические расстояния между локусами на разных генетических картах могут отличаться. Однако информацию на разных картах можно привести в соответствие с помощью общих маркеров. Специалист в данной области может использовать положения общих маркеров для идентификации положений маркеров и других представляющих интерес локусов на каждой отдельной генетической карте. Порядок расположения локусов на разных картах не должен меняться, хотя зачастую встречаются небольшие изменения в порядке расположения маркеров, обусловленные, например, маркерами, выявляющими альтернативные дупликатные локусы в различных популяциях, различиями в статистических подходах, применяемых для определения порядка расположения маркеров, новой мутацией или ошибкой в ходе лабораторных исследований.
"Местоположение на генетической карте" представляет собой местоположение на генетической карте относительно окружающих
генетических маркеров в той же группе сцепления, в которой указанный маркер можно обнаружить в пределах данного вида.
"Генетическое картирование" представляет собой способ определения взаимосвязей сцепления локусов за счет применения генетических маркеров, популяций, сегрегирующих по маркерам, и стандартных генетических принципов частоты рекомбинации.
"Генетические маркеры" представляют собой нуклеиновые
кислоты, которые являются полиморфными в популяции, и при этом
их аллели можно выявлять и распознавать с помощью одного или
нескольких аналитических способов, например, анализов RFLP,
AFLP, изоферментного, SNP, SSR и т. п. Данный термин также
относится к последовательностям нуклеиновой кислоты,
комплементарным геномным последовательностям, таким как
нуклеиновые кислоты, применяемые в качестве зондов. Маркеры,
соответствующие генетическим полиморфизмам между представителями
популяции, можно выявлять с помощью способов, общепринятых в
данной области техники. Они включают, например, способы
специфической в отношении последовательности амплификации на
основе PCR, выявление полиморфизмов длин рестрикционных
фрагментов (RFLP), выявление изоферментных маркеров, выявление
полинуклеотидных полиморфизмов с помощью аллель-специфической
гибридизации (ASH), выявление амплифицированных вариабельных
последовательностей генома растения, выявление
самоподдерживающейся репликации последовательностей, выявление простых повторов последовательности (SSR), выявление однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или выявление полиморфизмов длины амплифицированных фрагментов (AFLP). Также известны общепринятые способы выявления маркеров экспрессируемых последовательностей (EST) и маркеров SSR, полученных из последовательностей EST, и произвольно амплифицированных полиморфных ДНК (RAPD).
"Частота генетической рекомбинации" представляет собой частоту явления кроссинговера (рекомбинации) между двумя генетическими локусами. Частоту рекомбинации можно определять по последующей сегрегации маркеров и/или признаков после мейоза.
"Геном" относится к общей ДНК или к полному набору генов,
которые содержаться в хромосоме или хромосомном наборе.
Термин "генотип" представляет собой генетическое строение особи (или группы особей) по одному или нескольким генетическим локусам. Генотип определяет аллель(и) одного или нескольких известных локусов, которые особь унаследовала от своих родителей. Термин "генотип" можно применять для обозначения генетического строения особи по отдельному локусу, по нескольким локусам или, в более общем смысле, термин "генотип" можно применять для обозначения генетического состава особи с точки зрения всех генов в ее геноме.
"Зародышевая плазма" относится к генетическому материалу особи (например, растения), группы особей (например, линии, сорта или семейства растений), или клона, полученного из линии, сорта, вида или культуры, или, в более общем смысле, всех особей в пределах вида или нескольких видов (например, коллекция зародышевой плазмы маиса или коллекция зародышевой плазмы Анд), или полученному из них. Зародышевая плазма может быть частью организма или клетки, или может быть выделена из организма или клетки. В целом, зародышевая плазма предусматривает генетический материал со специфическим молекулярным составом, который обеспечивает физическую основу для некоторых или всех наследственных качеств организма или клеточной культуры. Используемая в данном документе зародышевая плазма включает клетки, семена или ткани, из которых можно вырастить новые растения, или части растений, такие как листья, стебли, пыльца или клетки, которые можно культивировать с получением целого растения.
Растение, называемое в данном документе "гаплоидным", имеет один набор (геном) хромосом.
"Гаплотип" представляет собой генотип особи по нескольким генетическим локусам, т. е. комбинацию аллелей. Как правило, генетические локусы, описываемые гаплотипом, являются физически и генетически сцепленными, т. е. находятся на одном и том же хромосомном сегменте.
Термин "гетерогенность" применяют для обозначения того, что особи в пределах группы отличаются генотипом по одному или
нескольким специфическим локусам.
Гетерозисный ответ материала или "гетерозис" можно определить по показателю, который превышает средние показатели родителей (или родителя с высоким показателем) при скрещивании с другими несходными или неродственными группами.
"Гетерозисная группа" предусматривает набор генотипов, которые показывают хорошие результаты при скрещивании с генотипами из другой гетерозисной группы (Hallauer et al. (1998) Corn breeding, p. 463-564. В G.F. Sprague и J.W. Dudley (ed.) Corn и corn improvement) . Инбредные линии относят к определенным гетерозисным группам и дополнительно подразделяют на семейства в пределах гетерозисной группы на основании нескольких критериев, таких как родословная, ассоциации на основе молекулярных маркеров и показатели в гибридных комбинациях (Smith et al.
(1990) Theor. Appl. Gen. 80:833-840). Две наиболее широко используемые гетерозисные группы в Соединенных Штатах называются "Iowa Stiff Stalk Synthetic" (также называемая в данном документе "Stiff Stalk") и "Lancaster" или "Lancaster Sure Crop"
(иногда называемая NSS или non-Stiff Stalk).
Некоторые гетерозисные группы обладают признаками, которые необходимы женскому родителю, а другие обладают признаками для мужского родителя. Например, в случае кукурузы, урожайность общедоступных инбредов, выделенных из популяции, называемой BSSS
(популяция Iowa Stiff Stalk Synthetic), привела к тому, что эти инбреды и их производные стали пулом женских особей в центральном кукурузном поясе. Инбреды BSSS были скрещены с другими инбредами, например, SD 105 и Maiz Amargo, и эта общая группа материалов стала известной как Stiff Stalk Synthetics
(SSS), даже несмотря на то, что не все инбреды произошли от исходной популяции BSSS (Mikel и Dudley (2006) Crop Sci: 46:1193-1205). По умолчанию, всех остальных инбредов, которые хорошо сочетаются с инбредами SSS, отнесли к пулу мужских особей, который за отсутствием лучшего названия обозначили как NSS, т. е. Non-Stiff Stalk. Данная группа включает несколько главных гетерозисных групп, таких как Lancaster Surecrop, Iodent и Learning Corn.
Особь является "гетерозиготной", если в данном локусе присутствует более одного типа аллеля (например, диплоидная особь с одной копией каждого из двух различных аллелей).
Термин "гомогенность" означает, что представители группы имеют одинаковый генотип по одному или нескольким специфическим локусам.
Особь является "гомозиготной", если особь имеет только один тип аллеля в данном локусе (например, диплоидная особь имеет копию одного и того же аллеля в локусе для каждой из двух гомологичных хромосом).
Термин "гибрид" относится к потомкам, полученным при скрещивании по меньшей мере двух генетически разнородных родителей.
"Гибридизация" или "гибридизация нуклеиновой кислоты" относится к спариванию комплементарных нитей РНК и ДНК, а также к спариванию комплементарных одиночных нитей ДНК.
Термин "гибридизируется" означает образование пар оснований между комплементарными участками нитей нуклеиновой кислоты.
Термин "генетическая карта IBM" может относиться к любой из следующих карт: IBM, IBM2, IBM2 neighbors, IBM2 FPC0507, IBM2 2004 neighbors, IBM2 2005 neighbors, IBM2 2005 neighbors frame, IBM2 2008 neighbors, IBM2 2008 neighbors frame или последней версии на веб-сайте maizeGDB. Генетические карты IBM основаны на популяции В73 х Мо17, в которой потомков первичного скрещивания подвергали случайному скрещиванию на протяжении нескольких поколений перед конструированием рекомбинантных инбредных линий для картирования. Более новые версии отражают добавление генетических и ВАС-картированных локусов, а также улучшенную детализацию карты, обусловленную включением информации, полученной из других генетических карт или физических карт, уточненных данных или применения новых алгоритмов.
Термин "инбредный" относится к линии, которая была выведена для обеспечения генетической однородности.
Термин "вставка/делеция" относится к вставке или делеции, при этом одна линия может рассматриваться как имеющая вставленный нуклеотид или участок ДНК в сравнении со второй
линией, или вторая линия может рассматриваться как имеющая удаленный нуклеотид или участок ДНК в сравнении с первой линией.
Термин "интрогрессия" относится к передаче требуемого аллеля генетического локуса из одного генетического фона в другой. Например, интрогрессия требуемого аллеля по указанному локусу может передаваться по меньшей мере одному потомку посредством полового скрещивания между двумя родителями одного вида, если по меньшей мере один из родителей имеет требуемый аллель в своем геноме. Например, в качестве альтернативы передача аллеля может происходить путем рекомбинации между двумя донорными геномами, например, в слитом протопласте, если по меньшей мере один из донорных протопластов имеет требуемый аллель в своем геноме. Например, требуемый аллель можно выявлять с помощью маркера, который ассоциирован с фенотипом, QTL, трансгеном и т. п. В любом случае, можно проводить многократные возвратные скрещивания потомства, содержащего требуемый аллель, с линией, имеющей требуемый генетический фон, и проводить отбор в отношении требуемого аллеля, что приводит к тому, что аллель закрепляется в выбранном генетическом фоне.
Способ "интрогрессии" зачастую называют "осуществлением возвратного скрещивания", если способ повторяют два или более раз.
"Линия" или "штамм" представляет собой группу особей от идентичных родителей, которые обычно являются в некоторой степени инбредными, и которые обычно являются гомозиготными и гомогенными по большинству локусов (изогенными или почти изогенными). "Сублиния" относится к инбредному подмножеству потомков, которые являются генетически отличными от других сходных инбредных подмножеств, происходящих от одного и того же предка.
Используемый в данном документе термин "сцепление" применяется для описания степени, с которой один маркерный локус ассоциирован с другим маркерным локусом или каким-либо иным локусом. Взаимосвязь сцепления между молекулярным маркером и локусом, влияющим на фенотип, приводится как "вероятность" или "скорректированная вероятность". Сцепление может выражаться в
виде требуемого предела или диапазона. Например, в некоторых вариантах осуществления любой маркер сцеплен (генетически и физически) с любым другим маркером, если маркеры разделены менее чем 50, 40, 30, 25, 20 или 15 единицами картирования (или сМ) на карте однократного мейоза (генетическая карта на основании популяции, которая прошла один раунд мейоза, такой как, например, F2; карты IBM2 предусматривают несколько мейозов). В некоторых аспектах предпочтительным является определение ограниченного диапазона сцепления, например, от 10 до 2 0 сМ, от 10 до 3 0 сМ или от 10 до 4 0 сМ. Чем теснее маркер сцеплен со вторым локусом, тем лучшим индикатором для второго локуса становится данный маркер. Таким образом, "близкосцепленные локусы", такие как маркерный локус и второй локус, проявляют
частоту межлокусной рекомбинации,
составляющую 10%
или
менее,
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
даже
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
даже
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее,
даже
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее и
еще
более
предпочтительно
приблизительно
или
менее.
очень
предпочтительных
вариантах осуществления соответствующие
локусы
проявляют частоту рекомбинации, составляющую приблизительно 1% или менее, например, приблизительно 0,75% или менее, более предпочтительно приблизительно 0,5% или менее или даже более предпочтительно приблизительно 0,25% или менее. О двух локусах, которые локализованы на одной и той же хромосоме и на таком расстоянии, что рекомбинация между двумя данными локусами происходит с частотой, составляющей меньше 10% (например, приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или менее), также говорят, что они "расположены вблизи" друг друга. Поскольку одна сМ представляет собой расстояние между двумя маркерами, для которых показана частота рекомбинации 1%, любой маркер является близкосцепленным (генетически и физически) с любым другим маркером, находящимся в
непосредственной близости, например, удаленным на 10 сМ или менее. Два близкосцепленных маркера на одной и той же хромосоме могут располагаться на расстоянии 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 или 0,2 5 сМ или менее друг от друга.
Термин "неравновесное сцепление" относится к неслучайной сегрегации генетических локусов или признаков (или и того, и другого). В любом случае неравновесное сцепление означает, что соответствующие локусы находятся в пределах достаточной физической близости вдоль длины хромосомы, чтобы они сегрегировали вместе с частотой, более высокой, чем случайная
(т. е. неслучайно). Маркеры, которые проявляют неравновесное
сцепление, считаются сцепленными. Сцепленные локусы
косегрегируют в более чем 50% случаев, например, от приблизительно 51% до приблизительно 10 0% случаев. Иными словами, два маркера, которые косегрегируют, характеризуются частотой рекомбинации, составляющей меньше 50% (и по определению, разделены менее чем 50 сМ на одной и той же группе сцепления). Используемое в данном документе сцепление может иметь место между двумя маркерами или, в качестве альтернативы, между маркером и локусом, влияющим на фенотип. Маркерный локус может быть "ассоциирован с" (сцеплен с) признаком. Степень сцепления маркерного локуса и локуса, влияющего на фенотипический признак, измеряется, например, как статистическая вероятность косегрегации этого молекулярного маркера с фенотипом
(например, статистический F-критерий или LOD-показатель).
Неравновесное сцепление чаще всего оценивают с применением критерия г2, который рассчитывают с применением формулы, описанной в Hill, W.G. и Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 38:22 6-231(1968). Если г2=1, то между двумя маркерными локусами существует полное LD, что означает, что маркеры не подвергались разделению за счет рекомбинации и характеризуются одинаковой аллельной частотой. Значение г2 будет зависеть от используемой популяции. Значения г2 выше 1/3 указывают на достаточно сильное LD, что применимо для картирования (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). Следовательно, аллели находятся в неравновесном сцеплении, когда значения г2 между
парой маркерных локусов больше или равны 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, или 1,0.
Используемый в данном документе термин "равновесное сцепление" описывает ситуацию, при которой два маркера сегрегируют независимо, т. е. распределяются среди потомков случайным образом. Маркеры, которые демонстрируют равновесное сцепление, считаются несцепленными (независимо от того, лежат ли они на одной и той же хромосоме).
"Локус" представляет собой положение на хромосоме, например, где локализован нуклеотид, ген, последовательность или маркер.
"Значение логарифма шансов (LOD)" или "LOD-показатель" (Risen, Science 255:803-804 (1992)) применяют при картировании генетического интервала для описания степени сцепления между двумя маркерными локусами. LOD-показатель для двух маркеров, составляющий три, обозначает, что сцепление в 1000 раз более вероятно, чем отсутствие сцепления, при этом LOD-показатель, составляющий два, обозначает, что сцепление в 100 раз более вероятно, чем отсутствие сцепления. Для выявления сцепления можно применять LOD-показатели больше чем или равные двум. LOD-показатели можно также применять для демонстрации силы ассоциации между маркерными локусами и количественными признаками при картировании "локусов количественных признаков". В этом случае величина LOD-показателя зависит от близости маркерного локуса к локусу, влияющему на количественный признак, а также от величины эффекта количественного признака.
"Маис" относится к растению Zea mays L. ssp. mays, которое также известно как "кукуруза".
Термин "растение маиса" включает целые растения маиса, клетки растения маиса, протопласт растения маиса, клеточную или тканевую культуру растения маиса, из которой могут быть регенерированы растения маиса, каллюсы растения маиса, скопления клеток растения маиса и клетки растения маиса, которые являются интактными в растениях маиса или частях растений маиса, таких как семена маиса, стержни початков маиса, цветки маиса, семядоли маиса, листья маиса, стебли маиса, почки маиса, корни маиса,
корневые кончики маиса и т. п.
"Маркер" представляет собой средство для установления положения на генетической или физической карте или сцепления между маркерами или локусами признаков (локусов, влияющих на признаки). Положение, которое выявляют с помощью маркера, можно узнать путем выявления полиморфных аллелей и их генетического картирования, или же путем гибридизации, совпадения последовательностей или амплификации последовательности, которая была физически картирована. Маркер может представлять собой ДНК-маркер (с помощью которого детектируют ДНК-полиморфизмы), белок
(с помощью которого детектируют вариацию в кодируемом полипептиде) или фенотип, наследуемый по моногенной системе
(такой как фенотип 'waxy'). ДНК-маркер также можно разработать на основе геномной нуклеотидной последовательности или на основе экспрессированных нуклеотидных последовательностей (например, на основе подвергнутой сплайсингу РНК или кДНК). В зависимости от технологии получения ДНК-маркера, маркер будет состоять из комплементарных праймеров, фланкирующих локус, и/или комплементарных зондов, которые гибридизируются с полиморфными аллелями в локусе. ДНК-маркер, или генетический маркер, также можно применять для описания гена, последовательности ДНК или нуклеотида в хромосоме самих по себе (а не компонентов, используемых для выявления гена или последовательности ДНК), и его зачастую применяют, когда ДНК-маркер ассоциирован с конкретным признаком в генетике человека (например, маркер рака молочной железы). Термином "маркерный локус" обозначают локус
(ген, последовательность или нуклеотид), который выявляют с помощью маркера.
Маркеры, с помощью которых выявляют генетические
полиморфизмы у членов популяции, хорошо известны из уровня
техники. Маркеры могут определяться типом полиморфизма, который
выявляют с их помощью, а также маркерной технологии, применяемой
для выявления полиморфизма. Типы маркеров включают без
ограничения, например, выявление полиморфизмов длин
рестрикционных фрагментов (RFLP), выявление изоферментных
маркеров, случайно амплифицированные полиморфные ДНК (RAPD),
полиморфизмы длины амплифицированных фрагментов (AFLP),
выявление простых повторов последовательности (SSR), выявление
амплифицированных вариабельных последовательностей генома
растения, выявление самоподдерживающейся репликации
последовательности или выявление однонуклеотидных полиморфизмов
(SNP) . SNP можно выявлять, например, с помощью секвенирования
ДНК, способов специфичной в отношении последовательности
амплификации на основе PCR, выявления полинуклеотидных
полиморфизмов при помощи аллель-специфичной гибридизации (ASH),
динамической аллель-специфичной гибридизации (DASH),
молекулярных маяков, гибридизации на микрочипах, олигонуклеотид-лигазных анализов, флэп-эндонуклеаз, 5'-эндонуклеаз, удлинения праймера, одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) или гель-электрофореза с температурным градиентом (TGGE). Секвенирование ДНК, такое как технология пиросеквенирования, обладает тем преимуществом, что с помощью него можно выявлять серию сцепленных аллелей SNP, которые составляют гаплотип. Гаплотипы, в большинстве случаев, более информативны (выявляют более высокий уровень полиморфизма), чем SNP.
"Маркерный аллель", в качестве альтернативы "аллель маркерного локуса", может относиться к одной из нескольких полиморфных нуклеотидных последовательностей, обнаруженных в маркерном локусе в популяции.
"Отбор с помощью маркеров" (MAS) представляет собой способ, при котором отдельные растения отбирают на основе маркерных генотипов.
"Негативный отбор с помощью маркера" представляет собой способ, при котором маркерные генотипы применяют для идентификации растений, которые не будут отобраны, что позволяет исключить их из программы селекции или разведения.
"Маркерный гаплотип" относится к комбинации аллелей в маркерном локусе.
"Маркерный локус" представляет собой специфическое местоположение на хромосоме в геноме вида, в котором может быть обнаружен специфический маркер. Маркерный локус можно применять
для отслеживания присутствия второго сцепленного локуса, например, такого, который влияет на экспрессию фенотипического признака. Например, маркерный локус можно применять для отслеживания сегрегации аллелей в генетически или физически сцепленном локусе.
"Маркерный зонд" представляет собой последовательность или молекулу нуклеиновой кислоты, которые можно применять для идентификации присутствия маркерного локуса, например, зонд на основе нуклеиновой кислоты, который является комплементарным последовательности маркерного локуса, путем гибридизации нуклеиновых кислот. Маркерные зонды, состоящие из 30 или более смежных нуклеотидов маркерного локуса ("всей или части" последовательности маркерного локуса), можно применять для гибридизации нуклеиновых кислот. В качестве альтернативы, в некоторых аспектах маркерный зонд относится к зонду любого типа, который способен распознавать (т. е. определять генотип) конкретный аллель, присутствующий в маркерном локусе.
Термин "молекулярный маркер" может применяться для обозначения генетического маркера, определяемого выше, или кодируемого им продукта (например, белка), применяемых в качестве ориентира при идентификации сцепленного локуса. Маркер также может быть получен из геномных нуклеотидных последовательностей или из экспрессированных нуклеотидных последовательностей (например, из подвергнутой сплайсингу РНК, кДНК и т. д.), или из кодируемого полипептида. Данный термин также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, комплементарным маркерным последовательностям или фланкирующим их, таким как нуклеиновые кислоты, применяемые в качестве зондов, или пары праймеров, способные к амплификации маркерной последовательности. "Молекулярный маркерный зонд" представляет собой последовательность или молекулу нуклеиновой кислоты, которые можно применять для идентификации присутствия маркерного локуса, например, зонд на основе нуклеиновой кислоты, который является комплементарным последовательности маркерного локуса. В качестве альтернативы, в некоторых аспектах маркерный зонд относится к зонду любого типа, который способен распознавать (т.
е. определять генотип) конкретный аллель, присутствующий в
маркерном локусе. Нуклеиновые кислоты являются
"комплементарными", когда они специфическим образом
гибридизируются в растворе, например, согласно правилам спаривания оснований Уотсона-Крика. Некоторые маркеры, описанные в данном документе, также называют гибридизационными маркерами, когда они расположены на участке вставки/делеции, таком как неколлинеарный участок, описанный в данном документе. Это связано с тем, что участок вставки, по определению, представляет собой полиморфизм по отношению к растению без вставки. Таким образом, маркер должен только показать, присутствует или отсутствует участок вставки/делеции. Для идентификации такого гибридизационного маркера можно применять любую подходящую технологию выявления маркера, например, в примерах, представленных в данном документе, применяют технологию SNP.
Аллель "отрицательно" коррелирует с признаком, если он сцеплен с ним, и если присутствие аллеля является индикатором того, что требуемый признак или форма признака не будет наблюдаться у растения, содержащего данный аллель.
"Нуклеотидная последовательность", "полинуклеотид",
"последовательность нуклеиновой кислоты" и "фрагмент нуклеиновой кислоты" используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру РНК или ДНК, который является одно- или двухнитевым, необязательно содержит синтетические, не являющиеся природными или измененные нуклеотидные основания. "Нуклеотид" представляет собой мономерное звено, из которого сконструированы полимеры ДНК или РНК, и оно состоит из пуринового или пиримидинового основания, пентозы и группы фосфорной кислоты. Нуклеотиды (обычно находящиеся в форме своих 5'-монофосфатов) называют согласно их однобуквенному обозначению, как указано ниже: "А" применительно к аденилату или дезоксиаденилату (в случае РНК или ДНК соответственно), "С" применительно к цитидилату или дезоксицитидилату, "G" применительно к гуанилату или дезоксигуанилату, "U" применительно к уридилату, "Т" применительно к дезокситимидилату, "R" применительно к пуринам (А или G) , "Y" применительно к пиримидинам (С или Т) , "К"
применительно к G или Т, "Н" применительно к А, или С, или Т, "I" применительно к инозину и "N" применительно к любому нуклеотиду.
Термин "фенотип", "фенотипический признак" или "признак" могут относиться к наблюдаемой экспрессии гена или серии генов. Фенотип может наблюдаться невооруженным глазом или с помощью любых других способов оценки, известных из уровня техники, например, взвешивания, подсчета, измерения (длины, ширины, углов и т. д.), микроскопии, биохимического анализа или электромеханического анализа. В некоторых случаях фенотип напрямую контролируется одним геном или генетическим локусом, т. е. является "признаком, контролируемым одним геном" или "признаком, наследуемым по моногенной системе". В отсутствие высоких уровней изменчивости под влиянием окружающей среды, признаки, контролируемые одним геном, могут сегрегировать в популяции с образованием "качественного" или "дискретного" распределения, т. е. фенотипы распределены по отдельным классам. В других случаях фенотип является результатом взаимодействия нескольких генов, и его можно считать "признаком, контролируемым несколькими генами" или "сложным признаком". Признаки, контролируемые несколькими генами, сегрегируют в популяции с образованием "количественного" или "непрерывного" распределения, т. е. фенотипы нельзя разделить на отдельные классы. Как признаки, контролируемые одним геном, так и признаки, контролируемые несколькими генами, могут подвергаться воздействию окружающей среды, в которой они экспрессируются, но признаки, контролируемые несколькими генами, в большинстве случаев более подвержены влиянию окружающей среды.
"Физическая карта" генома представляет собой карту, на которой показан линейный порядок идентифицируемых ориентиров (включая гены, маркеры и т. д.) на хромосомной ДНК. Однако, в отличие от генетических карт, расстояния между ориентирами являются абсолютными (например, измеренными в парах оснований или выделенных и перекрывающихся смежных генетических фрагментов), а не основаны на генетической рекомбинации (которая может отличаться в разных популяциях).
"Растение" может представлять собой целое растение, любую его часть или клеточную или тканевую культуру, полученную из растения. Таким образом, термин "растение" может относиться к чему-нибудь из целых растений, растительных компонентов или органов (например, листьев, стеблей, корней и т. п.), растительных тканей, семян, растительных клеток и/или их потомков. Растительная клетка представляет собой клетку растения, взятую из растения или полученную путем культивирования из клетки, взятой из растения.
Растение маиса, "полученное из инбреда в популяции Stiff Stalk Synthetic", может быть гибридом.
"Полиморфизм" представляет собой вариацию в ДНК между двумя или более особями в пределах популяции. Полиморфизм в популяции предпочтительно характеризуется частотой по меньшей мере 1%. Применимый полиморфизм может включать однонуклеотидный полиморфизм (SNP), простой повтор последовательности (SSR), полиморфизм по типу вставки/делеции, также называемый в данном документе "вставка/делеция".
Аллель "положительно" коррелирует с признаком, если он сцеплен с ним, и если присутствие аллеля является индикатором того, что требуемый признак или форма признака будет наблюдаться у растения, содержащего данный аллель.
"Значение вероятности" или "р-значение" представляет собой статистическую вероятность того, что конкретная комбинация фенотипа и присутствия или отсутствия конкретного маркерного аллеля является случайной. Таким образом, чем ниже показатель вероятности, тем выше вероятность того, что локус и фенотип ассоциированы. На показатель вероятности может влиять близость первого локуса (обычно маркерного локуса), а также локуса, влияющего на фенотип, плюс величина фенотипического эффекта (изменение фенотипа, вызванное замещением аллеля). В некоторых аспектах показатель вероятности считается "значимым" или "незначимым". В некоторых вариантах осуществления показатель вероятности 0,05 (р=0,05, или 5% вероятность) случайного подбора считается значимым показателем наличия ассоциации. Однако приемлемой вероятностью может быть любая вероятность меньше 50%
(р=0,5) . Например, значимая вероятность может составлять менее чем 0,25, менее чем 0,20, менее чем 0,15, менее чем 0,1, менее чем 0,05, менее чем 0,01 или менее чем 0,001.
"Маркер получения" или "SNP-маркер получения" представляет собой маркер, который был разработан для целей высокой производительности. SNP-маркеры получения разрабатывают для выявления специфических полиморфизмов, и они сконструированы для применения в разнообразных химических анализах и платформах. Используемые в данном документе названия маркеров начинаются с префикса РНМ, обозначающего 'Pioneer Hi-Bred Marker', за которым следует число, которое определяется последовательностью, из которой он был разработан, после которого следует "." или а затем суффикс, определяющий полиморфизм ДНК. Далее также может следовать версия маркера (А, В, С и т. д.), которая обозначает версию маркера, сконструированного для данного специфического полиморфизма.
Термин "потомки" относится к потомству, полученному за счет скрещивания.
"Растение-потомок" представляет собой растение, полученное за счет скрещивания двух растений.
Термин "локус количественного признака" или "QTL" относится к участку ДНК, который ассоциирован с дифференциальной экспрессией количественного фенотипического признака в по меньшей мере одном генетическом фоне, например, в по меньшей мере одной селекционной популяции. Участок QTL охватывает ген или гены, которые влияют на рассматриваемый признак, или является близкосцепленным с ними.
"Эталонная последовательность" или "консенсусная
последовательность" представляет собой заданную
последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонную последовательность для РНМ-маркера получают путем секвенирования ряда линий в данном локусе, выравнивания нуклеотидных последовательностей в программе для выравнивания последовательностей (например, Sequencher), а затем получения наиболее общей нуклеотидной
последовательности из выравнивания. Полиморфизмы, обнаруживаемые
в отдельных последовательностях, аннотируются в консенсусной
последовательности. Эталонная последовательность обычно не
является точной копией какой-либо индивидуальной
последовательности ДНК, а представляет собой сочетание доступных последовательностей и применима для разработки праймеров и зондов для полиморфизмов в пределах последовательности.
В случае сцепления в фазе "отталкивания" "благоприятный" аллель в представляющем интерес локусе физически сцеплен с "неблагоприятным" аллелем на близком маркерном локусе, и два "благоприятных" аллеля не наследуются вместе (т. е. два локуса находятся "в противофазе" друг относительно друга).
Фраза "серая пятнистость листьев" или "GLS" относится к заболеванию злаков, вызываемому грибковым патогеном Cercospora zeae-maydis, который характеризуется образованием длинных, прямоугольных, серовато-коричневых повреждений на листьях, проходящих параллельно жилке листа.
"Впервые придаваемая устойчивость", или "улучшенная устойчивость", или "повышенная устойчивость" у растения маиса в отношении GLS является показателем того, что растение маиса подвергается меньшему влиянию на урожайность и/или выживаемость или другие соответствующие агрономические показатели после внедрения возбудителей такого заболевания, например, Cercospora zeae-maydis. "Повышенная устойчивость" указывает на то, что зараженное растение производит лучший урожай маиса, чем другое более восприимчивое растение, подвергнутое аналогичному воздействию. Иными словами, условия вызывают уменьшенное снижение выживаемости маиса и/или урожайности растения маиса при повышенной устойчивости (или переносимости) по сравнению с восприимчивым растением маиса.
Специалисту будет понятно, что устойчивость растений маиса к GLS варьируется в широких пределах, она может предусматривать целый спектр из более устойчивых или менее устойчивых фенотипов и может варьироваться в зависимости от тяжести заражения. Однако с помощью простого наблюдения специалист может определять относительную устойчивость или восприимчивость различных
растений, линий растений или семейств растений к GLS и, кроме того, также будет распознавать фенотипические градации "устойчивости". Например, можно применять визуальное ранжирование от 1 до 9, указывающее на уровень устойчивости к GLS. Более высокий показатель указывает на более высокую устойчивость. Данные следует собирать только при существовании достаточного давления отбора в эксперименте с измерениями.
"Топкроссный тест" представляет собой тест, осуществляемый путем скрещивания каждой особи (например, отобранной особи, особи из инбредной линии, клона или потомка) с одним и тем же опылителем или "тестером", обычно гомозиготной линией.
Фраза "в жестких условиях" относится к условиям, при
которых зонд или полинуклеотид будут гибридизироваться со
специфической последовательностью нуклеиновой кислоты, как
правило, находящейся в сложной смеси нуклеиновых кислот, но
практически не будет гибридизоваться с другими
последовательностями. Жесткие условия являются зависимыми от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизируются при более высоких температурах. Обычно, жесткие условия выбирают таким образом, чтобы они были на приблизительно 5-10°С ниже температурной точки плавления (Тт) для специфической последовательности при заданных ионной силе, рН. Тт представляет собой температуру (при заданных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% комплементарных с мишенью зондов гибридизируются с целевой последовательностью в состоянии равновесия (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, при Тт 50% зондов являются занятыми в состоянии равновесия). Жесткие условия будут представлять собой условия, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,0 М ионов натрия, как правило, концентрация ионов натрия (или других солей) составляет от приблизительно 0,01 до 1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С в случае коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С в случае длинных зондов
(например, более 50 нуклеотидов). Жестких условий также можно достигать путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. В случае селективной или специфической гибридизации положительный сигнал в по меньшей мере два раза превышает фоновую гибридизацию, предпочтительно в 10 раз превышает фоновую гибридизацию. Зачастую иллюстративные жесткие условия гибридизации являются следующими: 50% формамида, 5х SSC и 1% SDS, инкубация при 42°С, или 5х SSC, 1% SDS, инкубация при 65°С, с отмывкой в 0,2х SSC и 0,1% SDS при 65°С. В случае PCR типичная температура для амплификации в условиях низкой жесткости составляет приблизительно 36°С, хотя температуры отжига могут варьироваться от приблизительно 32°С до 48°С, в зависимости от длины праймера. Дополнительные указания для определения параметров гибридизации представлены во множестве литературных источников.
"Неблагоприятный аллель" маркера представляет собой маркерный аллель, который сегрегирует с неблагоприятным фенотипом растения, таким образом, он обеспечивает преимущество в идентификации растений, которые можно удалить из программы селекции или разведения.
Термин "урожайность" относится к продуктивности на единицу
площади для конкретного растительного продукта, обладающего
коммерческой ценностью. Например, урожайность маиса обычно
измеряют в бушелях семян на акр или в метрических тоннах семян
на гектар за сезон. На урожайность оказывают влияние не только
генетические факторы, но и факторы окружающей среды.
"Агрономические параметры", "агрономические признаки" и
"агрономические показатели" относятся к признакам (и
генетическим элементам, лежащим в их основе) данного сорта
растений, которые вносят вклад в урожайность на протяжении
вегетационного периода. Отдельные агрономические признаки
включают мощность всходов, мощность вегетации,
стрессоустойчивость, устойчивость или переносимость заболеваний, устойчивость к гербицидам, ветвление, цветение, закладку семян, размер семян, плотность семян, устойчивость к полеганию,
обмолачиваемость и т. п. Следовательно, урожайность является наиболее важным из всех агрономических признаков.
Выравнивания последовательностей и подсчеты процента
идентичности можно осуществлять с применением разнообразных
способов сравнения, разработанных для выявления гомологичных
последовательностей, включая без ограничения программу MEGALIGN(r)
из комплекта биоинформатических вычислительных программ
LASERGENE(r) (DNASTAR(r) Inc., Мадисон, Висконсин). Если не указано
иное, множественное выравнивание последовательностей,
представленных в данном документе, осуществляли с помощью способа выравнивания CLUSTAL V (Higgins и Sharp, CABIOS. 5:151 153 (1989)) с параметрами по умолчанию (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Параметры по умолчанию для парных выравниваний и расчета процента идентичности белковых последовательностей с помощью способа CLUSTAL V представляют собой KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WIND0W=5 и DIAGONALS SAVED= 5. В случае нуклеиновых кислот данные параметры представляют собой KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WIND0W=4 и DIAGONALS SAVED=4. После выравнивания последовательностей с применением программы CLUSTAL V можно получить значения "процента идентичности" и "дивергенции" посредством просмотра таблицы "расстояния между последовательностями" в той же программе; если не указано иное, представленные и заявленные в данном документе показатели процента идентичности и дивергенции рассчитаны таким способом.
Применяемые в данном документе стандартные методики рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования хорошо известны из уровня техники и более полно описаны в Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Maniatis, Т. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (далее в данном документе "Sambrook").
Генетическое картирование
Уже довольно давно было признано, что специфические генетические локусы, коррелирующие с конкретными фенотипами, такими как устойчивость к серой пятнистости листьев, можно картировать в геноме организма. Селекционер растений может с
успехом применять молекулярные маркеры для идентификации требуемых особей путем выявления маркерных аллелей, которые демонстрируют статистически значимую вероятность косегрегации с требуемым фенотипом, проявляющуюся как неравновесное сцепление. При идентификации молекулярного маркера или кластеров молекулярных маркеров, которые косегрегируют с представляющим интерес признаком, селекционер может быстро отбирать требуемый фенотип путем отбора в отношении надлежащего молекулярного маркерного аллеля (способ, называемый отбором с помощью маркера, или MAS).
Различные способы, хорошо известные из уровня техники, доступны для выявления молекулярных маркеров или кластеров молекулярных маркеров, которые косегрегируют с представляющим интерес признаком, таким как признак устойчивости к серой пятнистости листьев. Главная идея, лежащая в основе этих способов, состоит в выявлении маркеров, у которых альтернативные генотипы (или аллели) имеют значимо отличающиеся усредненные фенотипы. Таким образом, для маркерных локусов проводят сравнение по величине различия альтернативных генотипов (или аллелей) или по уровню значимости этого различия. Можно сделать вывод, что гены признака располагаются ближе всего к маркеру(ам), который характеризуется наибольшим ассоциированным генотипическим различием. Двумя такими способами, применяемыми для выявления локусов признаков, представляющих интерес, являются следующие: 1) анализ ассоциаций на популяционной основе (т. е. ассоциативное картирование) и 2) традиционный анализ сцепления.
Ассоциативное картирование
Понимание степени и паттернов неравновесного сцепления (LD)
в геноме является необходимым условием для разработки
эффективных ассоциативных подходов для идентификации и
картирования локусов количественных признаков (QTL).
Неравновесное сцепление (LD) относится к неслучайной ассоциации аллелей у совокупности особей. Если LD наблюдается у аллелей в сцепленных локусах, его измеряют как ослабление LD в пределах специфического участка хромосомы. Степень LD является отражением
рекомбинационной истории в данном участке. Средняя скорость ослабления LD в геноме может помочь предсказать количество и плотность маркеров, которые необходимы для проведения полногеномного поиска ассоциаций, и дает оценку разрешающей способности, которую можно ожидать.
Целью ассоциативного или LD-картирования является идентификация значимых ассоциаций генотип-фенотип. Его использовали в качестве мощного инструмента для точного картирования таких аутбредных видов, как человек (Corder et al.
(1994) "Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late-onset Alzheimer-disease," Nat Genet 7:180-184; Hastbacka et al. (1992) "Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in FinlM," Nat Genet 2:204211; Kerem et al. (1989) "Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis," Science 245:1073-1080) и маис
(Remington et al., (2001) "Structure of linkage disequilibrium и phenotype associations in the maize genome," Proc Natl Acad Sci USA 98:11479-11484; Thornsberry et al. (2001) "Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time," Nat Genet 28:286-289; обзор в Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants," Annu Rev Plant Biol. 54:357-374), у которых рекомбинация в гетерозиготах является частой и приводит к быстрому ослаблению LD. У инбредных видов, у которых рекомбинацию в гомозиготных генотипах невозможно определить генетически, степень LD выше (т. е. более крупные блоки сцепленных маркеров наследуются вместе), и это значительно повышает мощность обнаружения при ассоциативном картировании
(Wall и Pritchard (2003) "Haplotype blocks и linkage disequilibrium in the human genome," Nat Rev Genet 4:587-597).
Рекомбинационная и мутационная история популяции зависит от особенностей брачного поведения, а также от эффективного размера и возраста популяции. Большие размеры популяции обеспечивают лучшие возможности для обнаружения рекомбинации, в то же время более высокие уровни полиморфизма обычно ассоциированы с более старыми популяциями, оба этих признака вносят вклад в заметное ускорение скорости ослабления LD. С другой стороны, популяции с
меньшим эффективным размером, например, недавно перенесшие генетический эффект "бутылочного горлышка", в большинстве случаев демонстрируют более медленную скорость ослабления LD, что приводит к сохранению расширенного гаплотипа (Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants," Annu Rev Plant Biol. 54:357-374).
Элитные селекционные линии обеспечивают ценную отправную точку для анализов ассоциаций. Количественные фенотипические показатели (например, переносимость заболевания, оцениваемая от одного до девяти для каждой линии маиса) применяются в анализе при проведении анализов ассоциаций (в отличие от рассмотрения только распределения частот толерантных и устойчивых аллелей в типах анализа межгруппового распределения аллелей). Наличие подробных данных о фенотипических характеристиках, собранных в программах селекции в течение многих лет и при множестве условий окружающей среды, для большого количества элитных линий, обеспечивает ценный набор данных для анализа ассоциативного картирования генетических маркеров. Это прокладывает путь к эффективной интеграции между исследованием и применением и использует преимущества накопленных в прошлом наборов данных. При этом понимание взаимосвязи между полиморфизмом и рекомбинацией применимо при разработке подходящих стратегий для эффективного извлечения максимальной информации из таких ресурсов.
Данный тип анализа ассоциаций не генерирует, и не требует
никаких данных на основании карты, а является независимым от
положения на карте. В данном анализе сравнивают фенотипическую
оценку растений с генотипами в различных локусах. Впоследствии
можно необязательно применить любую подходящую карту маиса
(например, комбинированную карту) для содействия в изучении
распределения идентифицированных маркеров QTL и/или
кластеризации маркеров QTL с применением ранее определенных местоположений маркеров на карте.
Традиционный анализ сцепления
Те же самые принципы лежат в основе традиционного анализа сцепления; однако LD получают за счет создания популяции из
небольшого числа основателей. Основателей отбирают таким образом, чтобы максимально повысить уровень полиморфизма в пределах сконструированной популяции, и полиморфные сайты оценивают в отношении уровня их косегрегации с данным фенотипом. Целый ряд статистических способов использовался для идентификации значимых ассоциаций маркер-признак. Одним таким способом является подход интервального картирования (Ъиег и Botstein, Genetics 121:185-199 (1989)), при котором каждое из множества положений вдоль генетической карты (предположим с интервалами в 1 сМ) тестируют в отношении вероятности того, что ген, контролирующий представляющий интерес признак, находится в данном положении. Данные генотипа/фенотипа применяют для расчета LOD-показателя (логарифм отношения правдоподобия) для каждого тестируемого положения. Если LOD-показатель превышает пороговое значение, существует значимое доказательство расположения гена, контролирующего представляющий интерес признак, в данном положении на генетической карте (которое будет приходиться между двумя конкретными маркерными локусами).
В данном документе представлены маркерные локусы маиса, которые демонстрируют статистически значимую косегрегацию с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев, как определено с помощью традиционного анализа сцепления и полногеномного анализа ассоциаций. Выявление этих локусов или дополнительных сцепленных локусов можно применять в программах селекции маиса с помощью маркера для получения растений, характеризующихся устойчивостью к серой пятнистости листьев.
Действия в программах селекции маиса с помощью маркера могут включать без ограничения: отбор среди новых селекционных популяций для идентификации того, какая из популяций характеризуется более высокой частотой благоприятных последовательностей нуклеиновой кислоты на основании исторического генотипа и ассоциаций агрономических признаков, отбор благоприятных последовательностей нуклеиновой кислоты среди потомства в селекционных популяциях, отбор среди родительских линий на основании прогноза характеристики потомков и продвижение линий в действиях, направленных на улучшение
зародышевой плазмы, на основании присутствия благоприятных последовательностей нуклеиновой кислоты. Местоположения QTL
QTL на хромосоме 4 идентифицировали как ассоциированный с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев с применением традиционного картирования сцепления, а затем подтвердили (примеры 1 и 2) . Хотя данный QTL находится в том же местоположении, что и описанный в US2009172845, анализ маркеров и исследования идентичности по происхождению показали, что аллель QTL, описанный в данном документе, происходит из другого источника.
Хромосомные интервалы
Представлены хромосомные интервалы, которые коррелируют с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев. Для идентификации хромосомных интервалов доступны разнообразные способы, хорошо известные из уровня техники. Границы таких хромосомных интервалов наносят таким образом, чтобы они охватывали маркеры, которые будут сцеплены с геном(ами), контролирующим представляющий интерес признак. Другими словами, хромосомный интервал наносят таким образом, что любой маркер, который находится в пределах такого интервала (включая концевые маркеры, которые задают границы интервала), можно применять в качестве маркера для признака устойчивости к серой пятнистости листьев. В таблицах 1 и 3 идентифицированы маркеры в пределах участка QTL хромосомы 4, которые, как показано в данном документе, ассоциированы с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев, и которые сцеплены с геном(ами), контролирующим устойчивость к серой пятнистости листьев. Эталонные последовательности для каждого из маркеров представлены под SEQ ID N0: 1-9.
Каждый интервал содержит по меньшей мере один QTL, и, кроме того, в действительности может содержать более одного QTL. Непосредственная близость нескольких QTL на одном интервале может осложнить определение корреляции конкретного маркера с конкретным QTL, так как один маркер может демонстрировать сцепление более чем с одним QTL. Напротив, например, если два
маркера в непосредственной близости демонстрируют косегрегацию с необходимым фенотипическим признаком, иногда становится неясно идентифицирует ли каждый из этих маркеров один и тот же QTL или два различных QTL. Независимо от этого, понимание того, сколько QTL находится в конкретном интервале, не является необходимым для получения или применения на практике того, что представлено в настоящем изобретении.
Интервал на хромосоме 4 может охватывать любой из маркеров, идентифицированный в данном документе как ассоциированный с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев, включая: РНМ6764-7, РНМ16360-9, РНМ521-8, РНМ586-10, РНМ289-20, РНМ12024-9, РНМ199-23, PHMGLS_01, PHMGLS_07, PHMGLS_14, PHMGLS_19, PHMGLS_21, PHMGLS_45, PHMC001YAR, PHM5013-12, PHM1963-15 и PHM18451-2. Интервал на хромосоме 4 может задаваться маркерами РНМ6764-7 и РНМ289-1 (пример 1), которые разделены наибольшим расстоянием на физической карте. Подынтервал этого участка может дополнительно задаваться маркерами РНМ521-8 и РНМ185451-2. Любой маркер, расположенный в пределах данных интервалов, может найти применение в качестве маркера устойчивости к серой пятнистости листьев и может применяться в контексте способов, представленных в данном документе, для идентификации и/или отбора растений маиса, которые характеризуются устойчивостью к серой пятнистости листьев, независимо от того, является ли она впервые придаваемой или улучшенной по сравнению с контрольным растением.
Хромосомные интервалы также могут задаваться маркерами, которые сцеплены (демонстрируют неравновесное сцепление) с маркером QTL, а г2 представляет собой общеупотребительный показатель неравновесного сцепления (LD) в контексте исследований ассоциаций. Если значение г2 для LD между маркерным локусом на хромосоме 4, представленном в данном документе, и другим маркерным локусом на хромосоме 4, находящимся в непосредственной близости, превышает 1/3 (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)), то локусы находятся в неравновесном сцеплении друг с другом.
Маркеры и взаимоотношения сцепления
Обычным показателем сцепления является частота, с которой
признаки косегрегируют. Она может быть выражена в виде процентной доли косегрегации (частоты рекомбинации) или в сантиморганидах (сМ) . сМ представляет собой единицу измерения частоты генетической рекомбинации. Одна сМ равна 1% вероятности того, что признак в одном генетическом локусе будет отделен от признака в другом локусе вследствие кроссинговера за одно поколение (что означает, что признаки сегрегируют вместе в 99% случаев). Поскольку хромосомное расстояние приблизительно пропорционально частоте явлений кроссинговера между признаками, то существует приблизительное физическое расстояние, которое коррелирует с частотой рекомбинации.
Маркерные локусы сами по себе являются признаками, и их можно оценивать в соответствии со стандартным анализом сцепления путем отслеживания маркерных локусов в ходе сегрегации. Таким образом, одна сМ равна 1% вероятности того, что маркерный локус будет отделен от другого локуса вследствие кроссинговера за одно поколение.
еще даже еще даже еще даже еще
более более более более более более более
предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно предпочтительно
Чем ближе маркер расположен к гену, контролирующему представляющий интерес признак, тем более эффективно и предпочтительно такой маркер служит индикатором для требуемого признака. Близкосцепленные локусы проявляют частоту межлокусного кроссинговера, составляющую приблизительно 10% или менее,
приблизительно 9% или менее,
приблизительно 8% или менее,
приблизительно 7% или менее,
приблизительно б% или менее,
приблизительно 5% или менее,
приблизительно 4% или менее,
В наиболее
приблизительно 3% или менее
приблизительно 2% или менее
предпочтительных вариантах осуществления соответствующие локусы (например, маркерный локус и целевой локус) проявляют частоту рекомбинации, составляющую приблизительно 1% или менее, например, приблизительно 0,75% или менее, более предпочтительно приблизительно 0,5% или менее или даже более предпочтительно приблизительно 0,2 5% или менее. Таким образом, локусы находятся
на расстоянии, составляющем приблизительно 10 сМ, 9 сМ, 8 сМ, 7 сМ, б сМ, 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ, 0,75 сМ, 0,5 сМ или 0,25 сМ или менее. Другими словами, о двух локусах, которые локализованы на одной и той же хромосоме и на таком расстоянии, что рекомбинация между данными двумя локусами происходит с частотой, составляющей менее 10% (например, приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или менее), говорится, что они "находятся вблизи" друг от друга.
Хотя конкретные маркерные аллели могут косегрегировать с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев, важно отметить, что данный маркерный локус не обязательно отвечает за экспрессию фенотипа, устойчивого к серой пятнистости листьев. Например, не является необходимым условием, чтобы маркерная полинуклеотидная последовательность была частью гена, который отвечает за фенотип, устойчивый к серой пятнистости листьев (например, частью открытой рамки считывания гена). Ассоциация между специфическим маркерным аллелем и признаком устойчивости к серой пятнистости листьев обусловлена исходным сцеплением в фазе "притяжения" между маркерным аллелем и данным аллелем в предковой линии маиса, из которой происходит данный аллель. Рано или поздно при повторяющейся рекомбинации явления кроссинговера между маркером и генетическим локусом могут изменить такую ориентацию. По этой причине благоприятный маркерный аллель может меняться в зависимости от фазы сцепления, наблюдаемой в пределах родителя, характеризующегося устойчивостью к серой пятнистости листьев, которого применяют для создания сегрегирующих популяций. Это не меняет того факта, что маркер можно применять для отслеживания сегрегации фенотипа. Это только меняет то, какой маркерный аллель считается благоприятным в данной сегрегирующей популяции.
Способы, представленные в данном документе, включают выявление присутствия одного или нескольких маркерных аллелей, ассоциированных с устойчивостью к серой пятнистости листьев у растения маиса, и затем идентификацию и/или отбор растений маиса, которые имеют благоприятные аллели в таких маркерных локусах. Маркеры, перечисленные в таблицах 1, 2 и 3, были
идентифицированы в данном документе как ассоциированные с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев, и, следовательно, их можно применять для прогнозирования устойчивости к серой пятнистости листьев у растения маиса. Любой маркер, находящийся в пределах 50 сМ, 40 сМ, 30 сМ, 20 сМ, 15 сМ, 10 сМ, 9 сМ, 8 сМ, 7 сМ, б сМ, 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ, 0,75 сМ, 0,5 сМ или 0,25 сМ (исходя из генетической карты однократного мейоза) от любого из маркеров в таблицах 1 и 3, также можно применять для прогнозирования устойчивости к серой пятнистости листьев у растения маиса. Отбор с помощью маркеров
Молекулярные маркеры можно применять в различных направлениях селекции растений (например, см. Staub et al.
(1996) Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter. 1: 3-8) . Одной из главных представляющих интерес областей является повышение эффективности возвратного скрещивания и интрогрессии генов с применением отбора с помощью маркера (MAS). Молекулярный маркер, который демонстрирует сцепление с локусом, влияющим на требуемый фенотипический признак, обеспечивает полезный инструмент для отбора признака в популяции растений. Это особенно актуально в случае, когда фенотип сложно анализировать. Поскольку анализы ДНК-маркеров являются менее трудоемкими и требуют меньше физического пространства, чем фенотипирование в полевых условиях, можно анализировать гораздо большие популяции, что повышает вероятность обнаружения рекомбинанта, у которого целевой сегмент из донорной линии перенесен в реципиентную линию. Чем теснее сцепление, тем более применимым является маркер, поскольку между этим маркером и обуславливающим признак геном с меньшей вероятностью произойдет рекомбинация, которая может приводить к ложноположительным результатам. Наличие фланкирующих маркеров снижает вероятность ложноположительного отбора, поскольку будет требоваться событие двойной рекомбинации. Идеальной ситуацией является наличие маркера в самом гене, чтобы рекомбинация между маркером и геном не могла происходить. Такой маркер называют
4 совершенным маркером".
Когда интрогрессия гена осуществляется посредством MAS, присутствует не только ген, который вводится, но также фланкирующие участки (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). Это называется "шлейф сцепления". В случае, когда донорное растение имеет очень низкую степень родства с реципиентным растением, эти фланкирующие участки несут дополнительные гены, которые могут кодировать нежелательные с агрономической точки зрения признаки. Такой "шлейф сцепления" также может приводить к снижению урожайности или другим отрицательным агрономическим характеристикам даже после нескольких циклов возвратного скрещивания с элитной линией маиса. Он также иногда называется "шлейф в отношении урожайности". Размер фланкирующего участка можно снижать с помощью дополнительного возвратного скрещивания, хотя это не всегда является успешным, поскольку селекционеры не могут контролировать размер участка или точечные разрывы при рекомбинации (Young et al. (1998) Genetics 120:579-585) . При классической селекции обычным делом является то, что рекомбинации, которые вносят вклад в уменьшение размера донорного сегмента, отбираются исключительно случайно (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264). Даже после 20 возвратных скрещиваний у беккроссов данного типа можно ожидать обнаружения того, что участок донорной хромосомы значительных размеров, все еще сцеплен с геном, по которому проводят отбор. Однако с помощью маркеров становится возможным отбор тех редких особей, у которых произошла рекомбинация вблизи представляющего интерес гена. В случае 150 растений-беккроссов существует 95% вероятность того, что по меньшей мере у одного растения произойдет кроссинговер в пределах 1 сМ от гена, исходя из расстояния на карте однократного мейоза. Маркеры будут обеспечивать однозначную идентификацию таких особей. В случае одного дополнительного возвратного скрещивания 300 растений будет 95% вероятность кроссинговера в пределах расстояния 1 сМ по карте однократного мейоза с другой стороны гена, что приведет к сегменту вокруг целевого гена, составляющему менее 2 сМ, исходя из расстояния на карте однократного мейоза. Этого можно достичь за два поколения с помощью маркеров, тогда как без
маркеров потребовалось бы в среднем 100 поколений (см. Tanksley et al., выше). Если известно точное положение гена, фланкирующие маркеры, окружающие ген, можно использовать для отбора в отношении рекомбинаций при различных размерах популяций. Например, в случае популяций меньшего размера можно ожидать рекомбинаций, расположенных дальше от гена, поэтому более отдаленные фланкирующие маркеры будут требоваться для выявления рекомбинации.
Доступность интегрированных карт сцепления генома маиса, содержащих общедоступные маркеры маиса, плотность которых все время возрастает, облегчили генетическое картирование маиса и MAS. См., например, карты IBM2 Neighbors, которые доступны онлайн на веб-сайте MaizeGDB.
Ключевые компоненты реализации MAS представляю собой: (i) определение популяции, в пределах которой будут определять ассоциацию маркер-признак, которая может представлять собой сегрегирующую популяцию, или случайную или структурированную популяцию; (ii) отслеживание сегрегации или ассоциации полиморфных маркеров с признаком и определение сцепления или ассоциации с применением статистических способов; (iii) определение набора необходимых маркеров на основании результатов статистического анализа и (iv) применение и/или экстраполяция такой информации на существующий набор селекционной зародышевой плазмы для обеспечения решений в отношении отбора на основе маркеров, которые следует принять. Маркеры, описанные в настоящем документе, а также другие типы маркеров, такие как SSR и FLP, можно применять в протоколах отбора с помощью маркеров.
SSR могут определяться как сравнительно короткие серии тандемно повторяющейся ДНК длиной б п. о. или менее (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang et al. (1994) Theoretical и Applied Genetics, 88:1-6). Полиморфизмы возникают вследствие вариации в количестве повторяющихся звеньев, что, вероятно, обусловлено проскальзыванием во время репликации ДНК (Levinson и Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221). Вариацию длины повторов можно выявить с помощью конструирования PCR-праймеров для консервативных неповторяющихся фланкирующих
участков (Weber и May (1989) Am J Hum Genet. 44:388-396). SSR в высшей степени подходят для картирования и MAS, поскольку они являются мультиаллельными, кодоминантными, воспроизводимыми и доступными для высокопроизводительной автоматической обработки
(Rafalski et al. (1996) Generating и using DNA markers in plants. В Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic press, pp 75-135).
Можно создать различные типы SSR-маркеров, и SSR-профили можно получать с помощью гель-электрофореза продуктов амплификации. Оценка маркерного генотипа основывается на размере амплифицированного фрагмента. Сервис для работы с SSR маиса находится в общем доступе на договорной основе от компании DNA Lranarks в Сен-Жан-сюр-Ришелье, Квебек, Канада.
Также можно создавать различные типы FLP-маркеров. Чаще всего, для получения полиморфизмов длин фрагментов применяют праймеры для амплификации. Такие FLP-маркеры во многих отношениях подобны SSR-маркерам, за исключением того, что участок, амплифицируемый с помощью праймеров, как правило, не является участком с высокой частотой повторов. При этом амплифицированный участок, или ампликон, будет характеризоваться достаточной изменчивостью у зародышевой плазмы, зачастую вследствие вставок или делеций, вследствие чего фрагменты, полученные с помощью праймеров для амплификации, могут отличаться у полиморфных особей, и, как известно, такие вставки/делеции часто встречаются у маиса (Bhattramakki et al.
(2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b), выше).
SNP-маркеры выявляют замены нуклеотида в одной паре оснований. Из всех типов молекулярных маркеров SNP являются наиболее распространенными, следовательно, потенциально они могут обеспечить самое высокое разрешение генетической карты
(Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547).
SNP можно анализировать даже с более высокой
производительностью, чем SSR, в так называемом
4 сверхвысокопроизводительном4 способе, поскольку для них не требуются большие количества ДНК, а автоматизация анализа может быть несложной. Также в перспективе SNP будут относительно
недорогими системами. Вместе три данные фактора делают SNP в высшей степени привлекательными для применения в MAS. Для генотипирования SNP доступны несколько способов, включая без ограничения гибридизацию, элонгацию праймера, лигирование олигонуклеотидов, расщепление нуклеазами, минисеквенирование и кодирующие сферы. Обзор таких способов был приведен в: Gut
(2001) Hum Mutat 17 pp. 475-492; Shi (2001) Clin Chem 47, pp. 164-172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, pp. 95-100; и Bhattramakki и Rafalski (2001) Discovery и application of single nucleotide polymorphism markers in plants. В R. J. Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CAB I Publishing, Wallingford. Данные и другие способы подробного исследования SNP используются в широком спектре коммерчески доступных технологий, включая Masscode.TM. (Qiagen), INVADER(r).
(Third Wave Technologies) и Invader PLUS(r), SNAPSHOT(r). (Applied Biosystems), TAQMAN(r). (Applied Biosystems) и BEADARRAYS(r).
(Illumina).
Некоторое количество SNP вместе в пределах
последовательности или в разных связанных последовательностях можно применять для описания гаплотипа любого конкретного генотипа (Ching et al. (2002), ВМС Genet. 3:19 рр, Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:32 9-333). Гаплотипы могут быть более информативными, чем одиночные SNP, и могут лучше описывать любой конкретный генотип. Например, одиночный SNP может представлять собой аллель 4 Т4 у специфической линии или сорта с устойчивостью к серой пятнистости листьев, однако аллель 4Т4 может также встречаться в селекционной популяции маиса, используемой в качестве рекуррентных родителей. В этом случае гаплотип, например, комбинация аллелей в сцепленных SNP-маркерах, может быть более информативным. После того как донорному хромосомному участку был приписан уникальный гаплотип, такой гаплотип можно применять в такой популяции или любом ее подмножестве для определения того, имеет ли особь конкретный ген. См., например, документ WO2003054229. Применение высокопроизводительных автоматизированных платформ для выявления
маркера, известных рядовым специалистам в данной области, делает данный способ очень продуктивным и эффективным.
Многие из РНМ-маркеров, представленных в данном документе, с легкостью могут применяться в качестве FLP-маркеров для отбора локусов генов на хромосоме 4 вследствие наличия полиморфизмов на основе вставки/делеции. Праймеры для РНМ-маркеров также можно применять для преобразования этих маркеров в SNP или другие структурно подобные или функционально эквивалентные маркеры
(SSR, САР, вставки/делеции и т. д.) в тех же участках. Один очень продуктивный подход для преобразования в SNP описан в Rafalski (2002а) Current opinion in plant biology 5 (2): 94-100, а также в Rafalski (2002b) Plant Science 162: 329-333. В ходе PCR праймеры применяют для амплификации сегментов ДНК от особей
(предпочтительно инбредных), которые отображают разнообразие в представляющей интерес популяции. Продукты PCR секвенируют напрямую в одном или обоих направлениях. Полученные последовательности выравнивают и полиморфизмы идентифицируют. Полиморфизмы не ограничиваются однонуклеотидными полиморфизмами
(SNP), но также включают вставки/делеции, CAPS, SSR и VNTR
(варьирующее количество тандемных повторов). Так, с учетом информации точной карты, описанной в данном документе, можно легко применять информацию, представленную в данном документе, для получения дополнительных полиморфных SNP (и других маркеров) в пределах участка, амплифицированного с помощью праймеров, перечисленных в настоящем изобретении. Маркеры в пределах описанного участка карты можно гибридизировать с ВАС или другими геномными библиотеками, или с помощью электронных средств выравнивать с геномными последовательностями, чтобы найти новые последовательности в том же приблизительном местоположении, что и описанные маркеры.
В дополнение к SSR, FLP и SNP, описываемым выше, также широко применяются другие типы молекулярных маркеров, включая без ограничения маркеры экспрессируемых последовательностей
(EST), SSR-маркеры, полученные из последовательностей EST, случайно амплифицированные полиморфные ДНК (RAPD) и другие маркеры на основе нуклеиновой кислоты.
Изоферментные профили и связанные морфологические характеристики в некоторых случаях также могут опосредованно применяться в качестве маркеров. Хотя они напрямую не выявляют различия в ДНК, на них зачастую оказывают воздействие специфические генетические различия. Тем не менее, маркеры, которые выявляют вариацию ДНК, гораздо более многочисленны и полиморфны, чем изоферменты или морфологические маркеры (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3-8).
Результаты выравнивания последовательностей или контиги также можно применять для обнаружения последовательностей выше или ниже специфических маркеров, перечисленных в данном документе. Такие новые последовательности, расположенные вблизи маркеров, описанных в данном документе, затем применяют для нахождения и разработки функционально эквивалентных маркеров. Например, разные физические и/или генетические карты выравнивают, чтобы локализовать эквивалентные маркеры, не описанные в пределах данного раскрытия, но находящиеся в пределах подобных участков. Такие карты могут принадлежать к картам для вида маис или даже других видов, таким как рис, пшеница, ячмень или сорго, при этом они были генетически или физически выровнены с картами маиса.
Обычно в MAS применяют полиморфные маркеры, которые были идентифицированы как характеризующиеся значительной вероятностью косегрегации с признаком, таким как признак устойчивости к серой пятнистости листьев. Предполагается, что такие маркеры находятся на карте вблизи гена или генов, которые придают растению фенотип, устойчивый к серой пятнистости листьев, и они считаются индикаторами требуемого признака, или маркерами. Растения тестируют в отношении присутствия требуемого аллеля в маркере, и, ожидается, что растения, содержащие требуемый генотип в одном или нескольких локусах, передадут требуемый генотип вместе с требуемым фенотипом своим потомкам. Таким образом, посредством выявления одного или нескольких маркерных аллелей можно отбирать растения с устойчивостью к серой пятнистости листьев и, кроме того, также можно отбирать растения-потомки, полученные от таких растений. В результате получают растение, содержащее требуемый
генотип в указанном хромосомном участке (т. е. генотип, ассоциированный с устойчивостью к серой пятнистости листьев), а затем скрещивают его с другим растением. Затем потомков от такого скрещивания будут оценивать в отношении генотипа с применением одного или нескольких маркеров, и растения-потомки с тем же генотипом в указанном хромосомном участке можно затем отобрать как характеризующиеся устойчивостью к серой пятнистости листьев.
Путем применения картирования сцепления и анализа ассоциаций идентифицировали маркеры, ассоциированные с признаком устойчивости к серой пятнистости листьев. Эталонные последовательности для маркеров представлены под SEQ ID N0:1-9. В пределах маркерных последовательностей идентифицируют положения SNP.
Способы идентификации и/или отбора растений маиса с повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев могут включать: (а) проведение скрининга популяции с помощью маркера в интервале QTL для определения того, имеет ли растение маиса из популяции аллель QTL, заданный в данном документе; (Ь) выявление растения маиса, которое имеет маркерный аллель, ассоциированный с гаплотипом, заданным в данном документе; (с) выявление растения маиса, которое имеет аллель QTL, где указанный аллель QTL содержит "С" в РНМ1963-15 и любой другой аллель, предусмотренный в данном документе; или (d) выявление растения маиса, которое имеет "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20. Растение маиса, которое было идентифицировано, затем может быть отобрано для дальнейшей разработки, которая может включать скрещивание со вторым растением маиса и получение растения-потомка.
Специалисту в данной области следует ожидать, что возможно наличие дополнительных полиморфных сайтов в маркерных локусах, идентифицированных в данном документе маркеров на хромосоме 4 и вокруг них, где один или несколько полиморфных сайтов находятся в неравновесном сцеплении (LD) с аллелем в одном или нескольких полиморфных сайтах в гаплотипе и, таким образом, их можно будет
применять в программе отбора с помощью маркеров для интрогрессии представляющего интерес аллеля QTL. Считается, что два конкретных аллеля в разных полиморфных сайтах находятся в LD, если присутствие аллеля в одном из сайтов в большинстве случаев прогнозирует присутствие аллеля в другом сайте на одной и той же хромосоме (Stevens, Mol. Diag. 4:309-17 (1999)) . Маркерные локусы могут располагаться в пределах 5 сМ, 2 сМ или 1 сМ (на генетической карте однократного мейоза) от QTL признака устойчивости к серой пятнистости листьев.
Специалисту в данной области будет понятно, что аллельная частота (и, следовательно, частота гаплотипа) может отличаться в разных пулах зародышевой плазмы. Пулы зародышевой плазмы варьируют вследствие различий в созревании, гетерозисных группировок, географического распространения и т. д. Это приводит к тому, что SNP и другие полиморфизмы могут не быть информативными для некоторых пулов зародышевой плазмы.
Составы растений
Растения маиса, идентифицированные и/или отобранные с помощью одного из способов, описанных выше, также представляют интерес. Это подразумевает любое растение вида Zea mays, которое имеет в своем геноме на хромосоме 4 гаплотип, содержащий: "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20; и проявляет устойчивость к серой пятнистости листьев (устойчивость может быть впервые придаваемой или улучшенной) по сравнению с растением маиса, которое не имеет данного гаплотипа в своем геноме.
Средства для обработки семян
Чтобы защитить и повысить урожай и улучшить технологии
усовершенствования признаков, применяются способы обработки
семян, которые могут обеспечивать дополнительную
приспособляемость культурных растений и экономически эффективный контроль насекомых, сорняков и заболеваний, тем самым дополнительно улучшая объект, описанный в данном документе. Семенной материал можно обрабатывать, как правило, обрабатывать его поверхность, с помощью композиции, содержащей комбинации
химических или биологических гербицидов, антидотов гербицидов,
инсектицидов, фунгицидов, ингибиторов и усилителей прорастания,
питательных веществ, регуляторов и активаторов роста растений,
бактерицидных веществ, нематоцидов, авицидов и/или
моллюскоцидов. Такие соединения, как правило, составляют вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными веществами, способствующими нанесению, традиционно используемыми в области, связанной с получением составов. Покрытия можно наносить за счет пропитывания материала для размножения жидким составом или за счет покрытия комбинированным влажным или сухим составом. Примеры различных типов соединений, которые можно применять в качестве средств для обработки семян, представлены в The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., опубликованном British Crop Production Council, который тем самым включен в данный документ посредством ссылки.
Некоторые средства для обработки семян, которые можно
применять в отношении семян сельскохозяйственных культур,
включают без ограничения одно или несколько из абсцизовой
кислоты, ацибензолар-Б-метила, авермектина, амитрола,
азаконазола, азоспириллума, азадирахтина, азоксистробина,
Bacillus spp. (включая один или несколько из видов cereus,
firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis и/или
thuringiensis), Bradyrhizobium spp. (включая один или несколько
из видов betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum,
liaonigense, pachyrhizi и/или yuanmingense), каптана,
карбоксина, хитозана, клотианидина, меди, циазипира,
дифеноконазола, этидиазола, фипронила, флудиоксонила,
флуквинконазола, флуразола, флуксофенима, белка гарпина,
имазалила, имидаклоприда, ипконазола, изофлавоноидов,
липохитоолигосахарида, манкозеба, марганца, манеба, мефеноксама,
металаксила, метконазола, PCNB, пенфлуфена, пеницилла,
пентиопирада, перметрина, пикоксистробина, протиоконазола,
пираклостробина, ринаксипира, S-метолахлора, сапонина,
седаксана, ТСМТВ, тебуконазола, тиабендазола, тиаметоксама, тиокарба, тирама, толклофос-метила, триадименола, триходермы,
трифлоксистробина, тритиконазола и/или цинка. Средство для покрытия семян PCNB, относящееся к регистрационному номеру ЕРА 00293500419, содержит квинтозен и терразол. ТСМТВ относится к 2-(тиоцианометилтио)бензотиазолу.
Семена, которые производят растения со специфическими признаками (такими как устойчивость к серой пятнистости листьев), можно тестировать, чтобы определить, какие способы обработки семян и нормы внесения могут сочетаться с такими растениями для повышения урожайности. Например, растение с хорошей потенциальной урожайностью, но с восприимчивостью к пыльной головне, может выиграть от применения средства для обработки семян, которое обеспечивает защиту от пыльной головни, растение с хорошей потенциальной урожайностью, но с восприимчивостью к цистообразующим нематодам, может выиграть от применения средства для обработки семян, которое обеспечивает защиту от цистообразующей нематоды и т. д. Более того, хорошее укоренение и раннее появление всходов, которые являются результатом надлежащего применения средства для обработки семян, могут приводить к более эффективному использованию азота, лучшей способности к перенесению засухи и общему увеличению потенциального урожая растения или растений, имеющих определенный признак, при комбинации со средством для обработки семян.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры предусмотрены для иллюстрации, а не для ограничения заявляемого объекта. Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что специалисты в данной области распознают различные реагенты или параметры, которые могут быть изменены без отступления от сути настоящего изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕР 1
Картирование и подтверждение QTL, связанного с
устойчивостью к серой пятнистости листьев
В исследовании с картированием QTL было обнаружено, что участок генома маиса в положении 100-115 сМ на хромосоме 4 на
генетической карте однократного мейоза ассоциирован с устойчивостью к серой пятнистости листьев. Чтобы дополнительно исследовать участок QTL, проприетарную инбредную линию, восприимчивую к серой пятнистости листьев (называемую в данном документе "Инбред В"), скрещивали с устойчивой проприетарной инбредной линией (называемой в данном документе "Инбред А") с получением популяции BC4F2, состоящей из -1600 растений. Семена собирали после самоопыления последнего беккросса, а затем высевали. Растения инокулировали с помощью семян маиса, зараженных Cercospora zeae-maydisг в качестве носителя. Инокуляции выполняли, опуская по 5-10 зараженных семян в мутовки листьев на стадии роста V5-6 и снова на стадии роста V8. Оценку заболевания в баллах проводили путем ранжирования растений по шкале от 1 до 9, где 1 означает худшее, а 9 означает лучшее. Контрольные графики с известным ответом на заболевание применяли в качестве руководства для лучшего времени проведения оценки и для калибровки ранжирования. Проведение оценки выполняли дважды. Также собирали данные о цветении, отмечая дату, на которую у 50% каждого растения выявлен шелк, и пересчитывая ее в показатель суммы активных температур (GDUSLK) на основе данных о погоде в этом местоположении.
Из 1633 растений, выращенных в полевых условиях, 1607 растений генотипировали по 5 маркерам в участке хромосомы 4 ; данные маркеры представляли собой РНМ67 64-7 (94,7 8 сМ на генетической карте однократного мейоза), РНМ16360-9 (104, 12 сМ) , РНМ521-8 (108,38 сМ), РНМ586-10 (111,72 сМ) и РНМ289-20 (113,94 сМ) . Различия наблюдали между растениями с одной или двумя копиями аллеля донорного родителя и растениями без копий аллеля донорного родителя (таблица 1) . Для двух копий аллеля донорного родителя показано различие, составляющее 0, 62 балла, а для одной копии показано различие, составляющее 0,7 9 балла по шкале от 1 до 9 (таблица 2) . Растения без копий аллеля донорного родителя характеризовались средним показателем, составляющим 4,64 (таблица 2) . Между классами отсутствовали различия во времени цветения.
ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ УТОЧНЕНИЕ QTL
Те же способы применяли для оценки отдельных растений ВСг, полученных от 3 дополнительных рекуррентных родителей (PH18F6 (см. US 8766059), PH18G5, см. US 8304633) и третья проприетарная инбредная линия, обозначаемая в данном документе "Инбред С"), чтобы определить эффект донорного родителя ("Инбред А") в разных генетических фонах. Во всех популяциях применяли дополнительные маркеры в участке 108-114 сМ (299-331 сМ в случае карты IBM2). Применяемые маркеры и генотипы каждого рекуррентного родителя и донорного родителя приведены в таблице 3. Некоторые из этих маркеров являются мономорфными для некоторых комбинаций
донорный/рекуррентный родитель. Данное тестирование вновь
показало различия между растениями с одной копией аллеля
донорного родителя и растениями с двумя копиями аллеля
рекуррентного родителя (таблица 4) . Различия варьировались в
диапазоне от 1,5 балла до 2,5 балла по шкале от 1 до 9.
Восприимчивые рекуррентные родители характеризовались
родителей
показателями в диапазоне от 3,7 до 4,3.
Het=reTepo3nroTa
Осуществляли дополнительный анализ участка вокруг РНМ58 610, поскольку он находится близко от QTL, идентифицированного в патентной заявке US2009172845. Инбред А и PHJEP (в патентной заявке US2009172845) имеют разные полиморфизмы в РНМ1963-15 в положении 111,72 сМ (собственная карта, 304,3 сМ на карте IBM2). Кроме того, дополнительный анализ маркеров вблизи пикового маркера (таблица 5) показывает, что Инбред А и PHJEP отличаются в данном участке, указывая на то, что Инбред А представляет собой новый источник устойчивости.
104069351
PZE-104069548
SEQ ID NO:13
111,57
304, 3
A\A
A\A
PZE-104069570
SEQ ID NO:14
111,59
304, 3
A\A
G\G
PZE-104069652
SEQ ID NO:15
111,62
304, 3
T\T
C\C
SYN21168
SEQ ID NO:16
111,68
304, 3
G\G
T\T
SYN4720
SEQ ID NO:17
111,72
304, 3
G\G
A\A
SYN4714
SEQ ID NO:18
111,74
304, 3
T\T
T\T
PZE-104070450
SEQ ID NO:19
112, 5
323,2
C\C
G\G
Таблица б. Маркерные гаплотипы в текущем интервале картирования с показателями GLS для каждого гаплотипа и рекомбинантов.
растения
PHMGLS _01
PHMGLS _07
PHMGLS _14
PHMGLS _19
PHMGLS _21
PHMGLS _45
РНМС 001YAR
РНМ5 013-12
Положение на
хромосоме 4 согласно Blup
Донорный родитель
Инбред С
419
5,73
373
5,22
312
5, 62
316
5,5
256
Т/А
с/т
G/A
с/т
5, 68
253
5,09
207
5,44
211
5,08
159
5,43
103
5,87
5,08
Среднее Значение класса
5,43
223
5, 65
121
5,84
120
5,79
239
4,58
270
4, 37
406
4,76
282
4, 15
4,48
4,4
4,2
4, 61
391
3, 64
Среднее Значение класса
4, 35
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.
<120> Способы получения маиса, устойчивого к серой пятнистости листьев <130> BB2457-WO-PCT <160> 28
<150> 62/360585
<151> 2016/07/11
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 374
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM6764-7
другой_признак (103)..(103)
<220> <221> <222>
<223> n представляет
собой a, c, g или t
другой_признак (210)..(211)
<220> <221> <222>
<223> n представляет
собой a, c, g или t
другой_признак
(222)..(222)
<220> <221> <222>
<223> n представляет
собой a, c, g или t
другой_признак (238)..(239)
<220> <221> <222>
<223> n представляет
собой a, c, g или t
другой_признак (316)..(316)
<220> <221> <222>
<223> n представляет
<210> 2
<211> 362
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM16360-9
<220>
<221> другой_признак
<222> (15)..(15)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (24)..(24)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (108)..(108)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (172)..(173)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (179)..(179)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (187)..(187)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (346)..(346)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (356)..(356)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 2
aagatccgcg
acacnggacc
ggancggcag
atggaggagg
cgctcaggat
cgcctacctg
tgcaccgcgg
agctgccgtc
caagaggccc
gccatgcagc
agatcgtngg
ccttctcaag
120
gacatcgagc
cgaaggtgga
agaggagggg
gactgaagat
ctggaggagt
gnnatcggnt
180
gcacctngca
gcgtgtcgga
tggtggtgag
atttgtgtag
tgacagcgtc
sgcaggcagg
240
caggctgtga
ctgtgagtga
gctcgtggtt
gttttaccat
cgtcgagctc
actatgccat
300
gccttgctct
gcatatatct
ttttcatcct
tctttcttcc
cttttncccg
cttctntctc
360
gc 362
<210> 3 <211> 395 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM521-8
<400> 3
agtgagaaag gaaatcaacc catcttgcag cagcatagtt gcagggaagg gcaactgcat 60
cgtctactct tctgatggga agcggtttga gatccccctt tcttacctcc acacggcagt 120
gtttgtagag ctcctgaagc tgtcgcagga agagtttggg ttcacaagtg atgggaggat 180
cacactgcct tgcgataaag cagtgatgga gtatgtgatg tgtttgctaa ggagagaagc 240
ctcygaggat gttgagaagg cgctcctcag ttccatagtg atgtcttgcc accacacaaa 300
caggatggtg caaccaccaa gtggagtgaa ccaccacttc gctgtgtgca gctcctgaag 360
atgaagatat ccatggcttg gagcttgttt cagca 395
<210> 4 <211> 374 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM586-10
<400> 4
gcagctcggc gtcaggtcyt ggcccaagtg agcaccgctg ccgccgatca ctgyccgcta 60
gtttacttct tggtytctcg tccccagctc ctgatcgccg tggcgtatgt aacygctgcc 120
gtgcgtgtgc aggtggggtt gcccgccggg gaagttcccg gtgaagttcg acgcgcggca 180
gacgtgctac ctgctcaagg gcaaggtgcg ggcgcacatc aaggggtcgt cggagtgcgt 240
ggagttcggc gccggcgacc tcgtcgtctt ccccaagggk ctcagctgca cctgggacgt 300
cgccgccgcc gtcgacaagt actacaagtt cgactcgtcc tgacggctga cgcacatcgc 360
tcccgcccgg ctcc 374
<210> 5 <211> 183 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM289-20
<400> 5
cgtcatcgag aagaaagcca aggggacaga agaagaagaa cgtgtgtggg cgtgggagat 60 ggtggagcca ctcatgacca aagcgctcac caccatgccc tacctcaacg aatacaaggt 120
ycctgaacct gaacctgaac ctgaacccat cccttgaact tctgcactgc agagtctccg
180
gat
183
<210> 6 <211> 373 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM12024-9
<400> 6
cccctcttgg atgtcggtca tgggaggcaa tgcacgctcc ttgggacttg taagagttat 60
ctgttttgtt gcttcgcggg cccaaaggac gcttccctgc accatctgcc tttgtttgga 120
acggcttgga ccgccgtggt ccttttacct gcagcaagga aaggaatggc tgggagggaa 180
tggatactgs tatcgttccg tgtgtggcac cccgtgatct gtttgccgtg ctttgtagga 240
ggcatggcgt attgccgggt actttggttt tggagactgc tactgactgc tgmcgtcgtc 300
gggccgctcc tctcacctct ggtaaatagg actttgtaca caattatttt gttagtagca 360
gtatatgtac atc 373
<210> 7 <211> 350 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM199-23
<220> <221> <222> <223>
собой a, c, g или t
<220> <221> <222> <223>
собой a, c, g или t
<220> <221> <222> <223>
собой a, c, g или t
<220> <221> <222> <223>
собой a, c, g или t
<220> <221> <222> <223>
собой a, c, g или t
<400>
ttatcaggtg
gcactcctct
gcacgcaggg
ctcccgttgg
agcgtccaaa
gatgtcggag
gtggtgagga
tgctggaagg
tgacggcctg
gcagagcgtt
gggacgaatg
gcagaaagta
120
gaggtggtga
ggcaggaggc
ngantcggca
ccgctccgca
atgactggat
cgtcgattcc
180
acgtacaacc
ttcgtgcngt
ggagctgtcc
ggtccaaggt
agtagccact
ccatgactcc
240
gawgaaagaa
ttcaacactg
aattgcctag
attcagtcta
attgctgctt
gtgtntatga
300
aaggtagctt
ttggaattgt
tagcgncagt
caatatgaag
ggatgttttt
350
<210> 8
<211> 361
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM1963-15
<220>
<221> другой_признак
<222> (9)..(9)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (21)..(21)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (125)..(125)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (185)..(185)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (201)..(201)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (215)..(215)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (301)..(301)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (332)..(335)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (337)..(337)
<223> n представляет собой a, a, g или t <220>
<221> другой_признак <222> (345)..(345)
<223> n представляет собой a, a, g или t <400> 8
ggtgatttna gagggaagta naaaataaaa aagattttgt gaagatgaaa ataaatggaa 60
attttatata ygatgaaggg gttgatgagg tgaaggaaat tatgaaggat ggtaagaaat 12 0
atatngatgt gatgggaaaa atagaagaga atgaaaatga tggagagaat gatgatgagg 180 atgangagga agatgaggaa nagatggatt tgaanatgaa gagtgtgaag gttgagaagg 240 atgaggatga ttgaagataa ttaggttaaa tatatttaga taataagtaa taatttggat 300 ntaaatgaga taagaaaaat tttaattaaa annnntntaa tgagnatttt gaattgtaat 360
g 361
<210> 9
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM18451-2
<400> 9
ataaaataag taattaattt aagtaagaga aaagagattg aaggattaat ggtggaaata 60
aatttatgaa gaatttaatt gaaatgatat taaaagtaaa aagtgttaaa aaatgttgta 120
aaattggaat aatagttgaa atggaagttt aaaggttgaa aaagggaaag gaatgaagat 180
aaatttattt tttggtgtgt gtaaatggat aaaagagaag agaagtggtt ggraattttt 240
aaaattaatt tggtttaggt gaaagttgga aatatgtaga taggagtatt agaaggtaga 300
aagttttwat ttatgataag tttttaggaa agttgtaagt tgtagaaaaa aatagataaa 360
ttg 363
<210> 10 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PZE-104068674
<400> 10
aaagaaggag agatgggaaa ataaaaggag aaaatgaatt atgtgaaaag rtaaaataaa 60 taaaaatata aaagaagata atagaagtaa ggaagaaaaa a 101
<210> 11 <211> 121
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность SYN25809
<400> 11
gaataaaaaa atatttgaaa attataaata agatagggtt gaaaaagagg aagaaagtag 60 ygatgttaat gtggtgaaag ttaaagtgaa taaatgaaaa gtttggtgaa attggggatg 120
a 121
<210> 12 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PZE-104069351
<400> 12
gtgtattaat agtaggatat atatatgagt ggtgtgggat gaagtgaagt raaataaatg 60 atataatgaa ataatattta taaaaagaga gaaaagaggg a 101
<210> 13 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PZE-104069548
<400> 13
attaagatgg ggaaataaag gggagaaaga ttagtaatat tataataata rggggaagag 60 aagaaaaaga gggagttaaa aatgaaaaga ttaattaagg g 101
<210> 14 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PZE-104069570
<400> 14
aagatgagag aaggtaaaag aataagggta atagatgaga aaatgttttt raaataaata 60 gggaataata tgaaagttta gaataaaaat ttaagtttaa a 101
<210> 15
<211> 101
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PZE-104069652
<400> 15
aggaatttat tgagataata tttatataaa attaaaaaag agaaattaaa yagtaatgtt
ggatgaatag agtgtaatta tggatgaata gagagagggt a 101
<210> <211> <212> <213>
16 121
ДНК
Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность SYN21168
<220>
<221> другой_признак
<222> (83)..(83)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 16
tattatataa taatgaagga gataagaagt agaaaaaaaa ataggtagtt tataagaaga 60 kataatgaaa aataaaggtg gangtgaagt tattggggta gataatgatg gtgttattga 120
a 121
<210> 17 <211> 121 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность SYN4720
<400> 17
tttatatgaa gggatgataa gtggagttat attaatatta atgatgatgt aggggatgtt 60 ragaaagttg gagaagagga aagtggattg gtgagtgggg aagtagatga agtagggggg 120
a 121
<210> 18 <211> 121 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность SYN4714
<400> 18
gaaaagaata tagatattat aaaaagggat ataaattttt aaaaaaagaa tgagaataat 60 ytatgaaatt ataaaaagga taaagaggaa attataagaa gtattggttg gagagaaaat 120
a 121
<210> 19
<211> 101
<212> ДНК
<213> Искусственная
<223> Эталонная последовательность PZE-104070450
<220>
<221> другой_признак
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 19
aaaatttgtt taaataagta aaagtatgta agtatgtatg atgtttagta nataaatgtg 60 atgtgattaa gttagttgtt ttatgattat gatattaatt g 101
<210> <211> <212> <213>
20 102
ДНК
Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMGLS_01
<220>
<221> другой_признак
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 20
aatgatagga gaagatgaag aaaaaaaatt attatagaat aataattgat ngataagtat 60 atatgaaaga aatggatgga tggatggatg gatggaaatt gt 102
<210> <211> <212> <213>
21 102
ДНК
Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMGLS_07
<220>
<221> другой_признак
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 21
ttaaaaaatg aatttataat aaatttggtt tatgtaaatg aaataagatg naatttaatg 60 tatgagaata aaatagaaat aaagaagtga gtaatataaa tg 102
<210> 22
<211> 102
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMGLS_14
<220>
<221> другой_признак
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 22
agaaggagga gaaagaagaa aaagaggatg agagaggagg aatagaagaa nagaagaaga 60 gaaaggtgga gaaagaaatt attgatgaaa aagaataaat gg 102
<210> 23
<211> 102
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMGLS_19
<220>
<221> другой_признак
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 23
gaaaaaaata aaaataaaaa tgattggaaa aatattgtaa agaatgattg nttgttggat 60 aaaaggaata aagaaaaaaa aaaagttgtg ataaagatga ga 102
<210> 24
<211> 102
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMGLS_21
<220>
<221> другой_признак
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, a, g или t
<400> 24
taaagtaatg tttgaaagtt atttttatag gatggaaaga tagtaaaaaa nagatataat 60 gaatataatg attatataag atagtaaaaa gggaataata at 102
<210> 25
<211> 102
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMGLS_45
<220> <221> <222>
(51)..(51)
<223> n представляет собой a, c, g или t <400> 25
tgcctaatca gcgtcgagca gctcaacctg gccggaaacc gcctctacgg ncaggtaccc gacgcgctct gcaagcttgc tgggcccgct ggccgcctcg cc
60 102
<210> 26
<211> 101
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHMC001YAR
другой_признак (5)..(5)
<220> <221> <222>
<223> n представляет собой a, c, g или t
другой_признак
(51)..(51)
<220> <221> <222>
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 26
aagantagcc tgctaaccca yttcttgctt tctcactgga attgtaatac ntgcagaagt 60 tcgattctat gagtcgacat ggtataaaaa gtggtagatt g 101
<210> <211>
27 99
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM5013-12
другой_признак
(50)..(50)
<220> <221> <222>
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 27
ggcccctccc cttttccggg ttcttcaaca gcttcgacgg cgccgatttn gacgacgacg 60 acctcgcctg agggaactsc crcccggttc ggtaacgga 99
<210> <211>
28 99
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эталонная последовательность PHM15534-13
<220>
<221> другой_признак
<222> (50)..(50)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 28
aaagttgcat gaagtatatt tatgcatgtt tgtgttcaaa actaacatcn taataattgt 60 gctccycttt ccatatgcag ttatgatcac tcgattcag 99
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ идентификации и/или отбора растения маиса, характеризующегося повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев, причем указанный способ предусматривает:
a. проведение скрининга популяции с помощью маркера, расположенного на хромосоме 4 в пределах интервала, содержащего и фланкированного РНМ6764-7 и РНМ289-1, для определения того, содержит ли одно или несколько растений маиса из популяции аллель QTL, содержащий "С" в РНМ1963-15 и представителя группы, состоящей из:
1. "Т" в РНМ521-8;
ii. "G" в РНМ12024-9;
iii. "Т" в РНМ199-23;
iv. "Т" в PHMGLS_01;
v. "С" в PHMGLS_07;
vi. "G" в PHMGLS_14;
vii. "С" в PHMGLS_19;
viii. "С" в PHMGLS_21;
ix. "С" в PHMGLS_4 5;
x. "А" в РНМСО01YAR;
xi. "С" в РНМ5013-12;
xii. "Т" в РНМ586-10;
xiii. "А" в РНМ15534-13;
xiv. "G" в РНМ18451-2 и XV. "С" в РНМ2 8 9-2 0; и
b. отбор из указанной популяции по меньшей мере одного растения маиса, содержащего аллель QTL.
2. Способ по п. 1, где указанный маркер расположен на хромосоме 4 в пределах интервала, содержащего и фланкированного РНМ521-8 и РНМ18451-2.
3. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий:
c. скрещивание растения маиса из (Ь) со вторым растением маиса и
d. получение растения-потомка, имеющего аллель QTL.
4. Способ по п. 1 или п. 3, где указанный аллель QTL, ассоциированный с повышенной устойчивостью к серой пятнистости
4.
листьев, содержит: "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_4 5; "А" в РНМСО01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20.
5. Способ идентификации и/или отбора растения маиса,
которое проявляет повышенную устойчивость к серой пятнистости
листьев, причем указанный способ предусматривает:
a. выявление в растении маиса аллеля маркерного локуса, где указанный маркерный локус расположен на хромосоме 4 в пределах хромосомного интервала, содержащего и фланкированного РНМ67 64-7 и РНМ2 8 9-1, и указанный аллель ассоциирован с гаплотипом, содержащим "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20; и
b. отбор растения маиса, имеющего аллель маркерного локуса, который ассоциирован с гаплотипом, содержащим: "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20.
6. Способ по п. 5, где указанный маркерный локус расположен на хромосоме 4 в пределах хромосомного интервала, содержащего и фланкированного РНМ521-8 и РНМ18451-2.
7. Способ по п. 5, дополнительно предусматривающий:
c. скрещивание растения маиса из (Ь) со вторым растением маиса и
d. получение растения-потомка, которое имеет аллель,
ассоциированный с гаплотипом, содержащим "Т" в РНМ521-8; "G" в
РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07;
"G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в
PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10;
"С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в
РНМ2 8 9-2 0.
8. Способ идентификации и/или отбора растения маиса,
которое проявляет повышенную устойчивость к серой пятнистости
листьев, причем указанный способ предусматривает:
a. выявление в растении маиса аллеля QTL, содержащего "С" в РНМ19 63-15 и одно или несколько из следующего:
1. "Т" в РНМ521-8;
ii. "G" в РНМ12024-9;
iii. "Т" в РНМ199-23;
iv. "Т" в PHMGLS_01;
v. "С" в PHMGLS_07;
vi. "G" в PHMGLS_14;
vii. "С" в PHMGLS_19;
viii. "С" в PHMGLS_21;
ix. "С" в PHMGLS_4 5;
x. "А" в РНМСО01YAR;
xi. "С" в РНМ5013-12;
xii. "Т" в РНМ586-10;
xiii. "А" в РНМ15534-13;
xiv. "G" в РНМ18451-2 и XV. "С" в РНМ2 8 9-2 0;
где указанный аллель QTL расположен на хромосоме 4 в интервале, заданном и включающем РНМ6764-7 и РНМ289-1; и
b. отбор указанного растения маиса, имеющего аллель QTL.
9. Способ по п. 8, где указанный аллель QTL расположен на хромосоме 4 в интервале, заданном и включающем РНМ521-8 и РНМ18451-2.
10. Способ по п. 8, дополнительно предусматривающий:
c. скрещивание растения маиса из (с) со вторым растением маиса и
d. получение растения-потомка, имеющего аллель QTL.
11. Способ по п. 8, где указанный аллель QTL содержит "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в
11.
РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20.
12. Способ идентификации и/или отбора растения маиса,
которое проявляет повышенную устойчивость к серой пятнистости
листьев, причем указанный способ предусматривает:
a. выявление в растении маиса "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ2 8 9-2 0 и
b. отбор указанного растения маиса, имеющего "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ289-20, где указанное растение маиса характеризуется повышенной устойчивостью к серой пятнистости листьев.
13. Способ по п. 12, дополнительно предусматривающий:
c. скрещивание растения маиса из (с) со вторым растением маиса;
d. получение растения-потомка, имеющего "Т" в РНМ521-8; "G" в РНМ12024-9; "Т" в РНМ199-23; "Т" в PHMGLS_01; "С" в PHMGLS_07; "G" в PHMGLS_14; "С" в PHMGLS_19; "С" в PHMGLS_21; "С" в PHMGLS_45; "А" в РНМСО 01YAR; "С" в РНМ5013-12; "Т" в РНМ586-10; "С" в РНМ1963-15; "А" в РНМ15534-13; "G" в РНМ18451-2 и "С" в РНМ2 8 9-2 0.
По доверенности
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>