|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] В настоящем документе раскрыты белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, с улучшенными значениями аффинности связывания и надежными профилями агрегации. Также описаны мультиспецифические связывающие белки, включающие белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим описанием. Предлагаются фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, раскрытые в настоящем документе, и способы применения таких составов. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
В настоящем документе раскрыты белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, с улучшенными значениями аффинности связывания и надежными профилями агрегации. Также описаны мультиспецифические связывающие белки, включающие белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим описанием. Предлагаются фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, раскрытые в настоящем документе, и способы применения таких составов.
Евразийское (21) 201892693 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.19
(51) Int. Cl.
A61K 39/395 (2006.01) C07K16/18 (2006.01) C07K16/28 (2006.01)
(54) БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ ВАРИАБЕЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С CD3
(31) 62/339,685
(32) 2016.05.20
(33) US
(86) PCT/US2017/033673
(87) WO 2017/201493 2017.11.23
(71) Заявитель:
ХАРПУН ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Дабридж Роберт Б., Сето Пуи, Остин Ричард Дж., Эвнин Люк, Гуно Жанмари, Лемон Брайан Д. (US)
(74) Представитель:
Строкова О.В., Угрюмов В.М. (RU)
(57) В настоящем документе раскрыты белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, с улучшенными значениями аффинности связывания и надежными профилями агрегации. Также описаны мультиспе-цифические связывающие белки, включающие белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим описанием. Предлагаются фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, раскрытые в настоящем документе, и способы применения таких составов.
БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ ВАРИАБЕЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ,
СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С CD3
Перекрестная ссылка
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США 62/339685, поданной 20 мая 2016 года, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Перечень последовательностей
В настоящей заявке содержится список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Упомянутая копия ASCII, созданная 19 мая 2017 года, называется 47517-704_601_SEQ.TXT и имеет размер 66042 байтов.
Включение посредством ссылки
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки и были изложены в настоящем документе во всей своей полноте.
Предпосылки создания изобретения
CD3 представляет собой гомодимерный или гетеродимерный антиген, экспрессирующийся на Т-клетках в ассоциации с комплексом Т-клеточного рецептора (TCR) и требуемый для активации Т-клеток. Антитела против CD3 имеют терапевтические цели, включающие активацию Т-клеток. В настоящем изобретении предлагаются белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, включая содержащие его мультиспецифические антитела.
Сущность изобретения
В одном варианте осуществления раскрыт белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, при этом указанный белок содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL) и линкер, при этом VH содержит определяющие комплементарность области НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3, при этом VL содержит определяющие комплементарность области LC
CDR1, LC CDR2 и LC CDR3, где (а) аминокислотная последовательность НС CDR1 представлена в GX1X2X3NX4YX5X6N (SEQ Ш N0. 2), Xi представляет собой фенилаланин или аспарагин, Х2 представляет собой треонин, глутаминовую кислоту или метионин, Хз представляет собой фенилаланин или тирозин, Х4 представляет собой лизин, треонин, глицин, аспарагин или глутаминовую кислоту, Х5 представляет собой аланин или пролин, Хб представляет собой метионин, лейцин, валин или изолейцин; (Ь) аминокислотная последовательность НС CDR2 представлена в RIRSX7X8NX9YX10TX11YX12DX13VK (SEQ Ш N0. 3), Х7 представляет собой лизин или глицин, Xs представляет собой тирозин или серии, Х9 представляет собой аспарагин или лизин, Хю представляет собой аланин или глутаминовую кислоту, Хп представляет собой тирозин или глутаминовую кислоту, Х12 представляет собой аланин или лизин, Х13 представляет собой серии, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аланин или глутамин; (с) аминокислотная последовательность НС CDR3 представлена в HX14NFX15 XieSXnISYWAXie (SEQ Ш N0. 4), Х14 представляет собой глицин, аланин или треонин, Х15 представляет собой глицин или аспарагин, Xi6 представляет собой аспарагин или аспарагиновую кислоту, Хп представляет собой тирозин, гистидин, пролин, глутамин, лейцин или глицин, Xis представляет собой тирозин или треонин; (d) аминокислотная последовательность LC CDR1 представлена в X19X20X21X22GX23VX24X25GX26YPN (SEQ ID N0. 5), Х19 представляет собой глицин или аланин, Х20 представляет собой серии или глутаминовую кислоту, Х21 представляет собой серии или тирозин, Х22 представляет собой треонин, фенилаланин, лизин или серии, Х23 представляет собой аланин или тирозин, Х24 представляет треонин или валин, Х25 представляет собой серии, аспарагиновую кислоту, лизин, гистидин или валин, Х20 представляет собой аспарагин или тирозин; (е) аминокислотная последовательность LC CDR2 представлена в GX27X28X29X30X31P (SEQ ГО N0. 6), Х27 представляет собой треонин или изолейцин, Х28 представляет собой лизин, глутаминовую кислоту, тирозин, аспарагин или серии, Х29 представляет фенилаланин, лейцин, глутаминовую кислоту, изолейцин, метионин или валин, Хзо представляет собой лейцин, аспарагин или глицин, Х31 представляет собой аланин или валин; и (f) аминокислотная последовательность LC CDR3 представлена в X32LWYX33NX34WX35 (SEQ ГО N0. 7), Х32 представляет собой валин, треонин или аланин, Хзз представляет собой серии, аспарагиновую кислоту или аланин, Х34 представляет собой аргинин или серии, Х35 представляет собой валин, изолейцин или аланин, при этом Xi, Х2, Хз, Х4, Х5,
Хб, Х7, Хв, Х9, Хю, Хп, Xl2, Xl3, Х14, Xl5, Xl6, Xl7, Xl8, X19, X20, X21, X22, X23, X24, X25, X26,
X27, X28, X29, Хзо, X31, X32, X33, X34 и X35 не являются одновременно фенилаланином, треонином, фенилаланином, лизином, аланином, метионином, лизином, тирозином,
аспарагином, аланином, тирозином, аланином, серином, глицином, глицином, аспарагином, тирозином, тирозином, глицином, серином, серином, треонином, аланином, треонином, серином, аспарагином, треонином, лизином, фенилаланином, лейцином, аланином, валином, серином, аргинином и валином, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет следующую формулу: fl-rl-f2-r2-f3-r3-f4-r4-f5-r5-f6-r6-f7, где rl представляет собой SEQ Ш N0: 2; г2 представляет собой SEQ Ш N0: 3; гЗ представляет собой SEQ Ш N0: 4; г4 представляет собой SEQ Ш N0:5; г5 представляет собой SEQ ГО N0:6; и гб представляет собой SEQ ГО N0:7; и где fi, {2, й, {4 и fs представляют собой остатки каркасных участков, выбранные таким образом, что указанный белок является по меньшей мере на восемьдесят процентов идентичным аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ГО N0: 22.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 29, SEQ ГО N0. 30, SEQ ГО N0. 31, SEQ ГО N0. 32, SEQ ГО N0. 33, SEQ ГО N0. 34, SEQ ГО N0. 35, SEQ ГО N0. 36, SEQ ГО N0.37, SEQ ГО N0. 38, SEQ ГО N0. 39 или SEQ ГО N0. 40. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой г2 представляет собой SEQ ГО N0. 41, SEQ ГО N0. 42, SEQ ГО N0. 43, SEQ ГО N0. 44, SEQ ГО N0. 45, SEQ ГО N0. 46, SEQ ГО N0. 47, SEQ ГО N0. 48, SEQ ГО N0. 49 или SEQ ГО N0. 50. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 51, SEQ ГО N0. 52, SEQ ГО N0. 53, SEQ ГО N0. 54, SEQ ГО N0. 55, SEQ ГО N0. 56, SEQ ГО N0. 57, SEQ ГО N0. 58, SEQ ГО N0. 50 или SEQ ГО N0. 60. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой г4 представляет собой SEQ ГО N0. 61, SEQ ГО N0. 62, SEQ ГО N0. 63, SEQ ГО N0. 64, SEQ ГО N0. 65, SEQ ГО N0. 66, SEQ ГО N0. 67, SEQ ГО N0. 68, SEQ ГО N0. 69, SEQ ГО N0. 70, SEQ ГО N0. 71, SEQ ГО N0. 72 или SEQ ГО N0. 73 В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой г5 представляет собой SEQ ГО N0. 74, SEQ ГО N0. 75, SEQ ГО N0. 76, SEQ ГО N0. 77, SEQ ГО N0. 78, SEQ ГО N0. 79, SEQ ГО N0. 80, SEQ ГО N0. 81, SEQ ГО N0. 82, SEQ ГО N0. 83, SEQ ГО N0. 84, SEQ ГО N0. 85
или SEQ Ш NO. 86. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой гб представляет собой SEQ Ш N0. 87, SEQ ID N0. 88, SEQ ГО N0. 89, SEQ ГО N0. 90, SEQ ГО N0. 91, SEQ ГО N0. 92 или SEQ ГО N0. 93. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 39, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 49, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 51, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 61, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 86 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 87. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 30, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 43, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 64 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 89. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 55, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 67, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 77 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 92. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 31, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 42, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 60, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 64, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 79 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 91. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 35, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 46, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 56, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 68 и г5 представляет собой SEQ ГО N0. 75. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 32, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 47, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 56, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 65, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 80 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 87. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ ГО N0. 29, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 44, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 52, г4 представляет
собой SEQ Ш NO. 73 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 76. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 33, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 48, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 57, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 69 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 74. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 38, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 62 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 81. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 37, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 53, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 70, г5 представляет собой SEQ Ш N0. 82 и гб представляет собой SEQ Ш N0. 88. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 34, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 47, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 56, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 68 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 75. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 29, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 54, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 71 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 83. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 33, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 41, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 63, г5 представляет собой SEQ Ш N0. 84 и гб представляет собой SEQ Ш N0. 90. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 30, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 44, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 58, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 66 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 85. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 40, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 45, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 56, г5 представляет собой SEQ Ш N0. 78 и гб представляет собой SEQ Ш N0. 93. В некоторых вариантах осуществления
белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl представляет собой SEQ Ш N0. 36, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 50, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 59, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 72 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 75.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0. 8, SEQ ГО N0. 9, SEQ ГО N0. 10, SEQ ГО N0. 11, SEQ ГО N0. 12, SEQ ГО N0. 13, SEQ ГО N0. 14, SEQ ГО N0. 15, SEQ ГО N0. 16, SEQ ГО N0. 17, SEQ ГО N0. 18, SEQ ГО N0. 19, SEQ ГО N0. 20, SEQ ГО N0. 21, SEQ ГО N0. 94 и SEQ ГО N0. 95. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 8. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 9. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 14. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 19. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 94. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 10. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 11. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 12. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 13. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 15. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 16. В некоторых
вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент,
связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ Ш N0. 17. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 18. В некоторых
вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент,
связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ Ш N0. 20. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 21. В некоторых
вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент,
связывающийся с CD3, содержит аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ Ш N0. 25. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит
аминокислотную последовательность, содержащую линкер, при этом указанный линкер
содержит аминокислотную последовательность, представленную в
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с CD3, выбранным из человеческого CD3 и CD3 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 и CD3 яванского макака с сопоставимой аффинностью связывания (Kd). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 200 нМ и с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 300 нМ. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ, от около 6 нМ до около 10 нМ, от около 11 нМ до около 20 нМ, от около 25 нМ до около 40 нМ, от около 40 нМ до около 60 нМ, от около 70 нМ до около 90 нМ, от около 100 нМ до около 120 нМ, от около 125 нМ до около 140 нМ, от около 145 нМ до около 160 нМ, от около 170 нМ до около 200 нМ, от около 210 нМ до около 250 нМ, от около 260 нМ до около 300 нМ.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 с Kd
человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-CD3 (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0.22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0.22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0.22).
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 8, и значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 8, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 9, и значения hKd и cKd являются
примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 9, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0. 10, и значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 10, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 11, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 11, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0. 12, и значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 12, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0. 13, и значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент,
связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 13, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO. 14, и значения hKd и cKd примерно в 3-5-раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 14, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 15, и значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 15, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 25 нМ до около 40 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 16, и значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 16, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 17, и значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 17, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 40 нМ до около 60 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент,
связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 18, и значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который содержит последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 18, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 19, и значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 19, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 40 нМ до 60 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 20, и значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше аффинности связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 20, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 21, и значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который содержит последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 21, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 125 нМ до около 140 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 94, и значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который содержит последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш
NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 94, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 95, и значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который содержит последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 95, и значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ. В другом варианте осуществления в настоящем документе предлагается белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержащий последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22 (wt анти-СОЗ), при этом один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных положений 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 и 239, являются замещенными, при этом аминокислотное положение 27 замещено аспарагином, аминокислотное положение 28 замещено глутаминовой кислотой или метионином, аминокислотное положение 29 замещено тирозином, аминокислотное положение 31 замещено аспарагином, глицином, глутаминовой кислотой или треонином, аминокислотное положение 33 замещено пролином, аминокислотное положение 34 замещено валином, лейцином или изолейцином, аминокислотное положение 54 замещено глицином, аминокислотное положение 55 замещено серином, аминокислотное положение 57 замещено лизином, аминокислотное положение 59 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 61 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 63 замещено лизином, аминокислотное положение 65 замещено аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой, аланином или глутамином, аминокислотное положение 102 замещено аланином или треонином, аминокислотное положение 105 замещено аспарагином, аминокислотное положение 106 замещено аспарагиновой кислотой, аминокислотное положение 108 замещено гистидином, пролином, глутамином, глицином или лейцином, аминокислотное положение 114 замещено треонином, аминокислотное положение 163 замещено аланином, аминокислотное положение 164 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 165 замещено тирозином, аминокислотное положение 166 замещено фенилаланином, лизином или серином,
аминокислотное положение 168 замещено тирозином, аминокислотное положение 170 замещено валином, аминокислотное положение 171 замещено аспарагиновой кислотой, лизином, валином или гистидином, аминокислотное положение 173 замещено тирозином, аминокислотное положение 193 замещено изолейцином, аминокислотное положение 194 замещено глутаминовой кислотой, тирозином, аспарагином или серином, аминокислотное положение 195 замещено лейцином, глутаминовой кислотой, изолейцином, метионином или валином, аминокислотное положение 196 замещено аспарагином или глицином, аминокислотное положение 197 замещено валином, аминокислотное положение 231 замещено треонином или аланином, аминокислотное положение 235 замещено аспарагиновой кислотой или аланином, аминокислотное положение 237 замещено серином и аминокислотное положение 239 замещено аланином или изолейцином. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит одно или несколько дополнительных замещений в аминокислотных положениях, отличных от положений 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235; 237 и 239. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 27. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 28. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 29. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 31. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 33. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 34. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 54. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 55. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 57. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в
положении 59. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 61. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 63. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 65. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 102. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 105. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 106. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 108. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 114. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 163. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 164. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 165. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 166. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 168. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 170. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 171. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 173. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 193. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 194. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 195. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 196. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 197. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 231. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 235. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 237. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещение в положении 239. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 34, 65, 102, 163, 197 и 231. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 28, 57, 166 и 235. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 108, 168, 194 и 239. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 28, 55, 114, 166, 195 и 237. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 31, 63, 108, 170 и 194. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 29, 65, 108, 166, 195 и 231. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 27, 59, 102, 173 и 194. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 31, 65, 108, 171 и 193. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 34, 164 и 195. В некоторых вариантах осуществления белок,
содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 33, 105, 171, 195 и 231. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 31, 65, 108, 170 и 194. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 27, 106, 171 и 195. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 31, 54, 165, 196 и 235. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 28, 59, 108, 166 и 196. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 34, 61, 108, 194 и 239. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит замещения в положениях 31, 65, 108, 171 и 194.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 34, 65, 102, 163, 197 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 34, 65, 102, 163, 197 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 28, 57, 166 и 235 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 28, 57, 166 и 235 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 108, 168, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 108, 168, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 28, 55, 114, 166, 195 и 237 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 28, 55, 114, 166, 195 и 237 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 63, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 63, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 29, 65, 108, 166, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2- раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 29, 65, 108, 166, 195
и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 27, 59, 102, 173 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 27, 59, 102, 173 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 193 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-12 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 193 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 25 нМ до около 40 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 34, 164 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 34, 164 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 33, 105, 171, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3,
содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 33, 105, 171, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 40 нМ до около 60 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 65, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 65, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 27, 106, 171 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 27, 106, 171 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 40 нМ до 60 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 54, 165, 196 и 235 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 54, 165, 196 и 235 являются замещенными (10В2), и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 28, 59, 108, 166 и 196 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 25-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления
белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 28, 59, 108, 166 и 196 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 125 нМ до около 140 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 34, 61, 108, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 34, 61, 108, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
В другом варианте осуществления в настоящем документе предлагается белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, при этом указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в wt анти-CD3 (SEQ ID NO: 22), содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL), линкер, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ГО NO: 1), при этом VH содержит определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3, при этом VL содержит определяющие комплементарность области LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3, содержащие по меньшей мере одну мутацию в CDR1, CDR2 или CDR3 VH, и LC CDR1, LC CDR2 или LC CDR3 VL, при этом по меньшей мере одна мутация не расположена в аминокислотных положениях 26, 30, 32, 35, 50, 51, 52, 53, 56, 58, 60, 62, 64, ,66, 67, 101, 103, 104, 107, 109, ПО, 111, 112, 113, 167, 169, 172, 174, 175, 176, 192, 198, 232, 233, 234, 236 или 238. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный
вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит по меньшей мере одну мутацию в аминокислотном положении, выбранном из 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 и 239. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в изолейцин, положение 65 подвергнуто мутации в глутамин, положение 102 подвергнуто мутации в аланин, положение 163 подвергнуто мутации в аланин, положение 197 подвергнуто мутации в валин и положение 231 подвергнуто мутации в треонин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 57 подвергнуто мутации в лизин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин и положение 235 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в гистидин, положение 168 подвергнуто мутации в тирозин, положение 194 подвергнуто мутации в серии и положение 239 подвергнуто мутации в изолейцин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в метионин, положение 55 подвергнуто мутации в серии, положение 114 подвергнуто мутации в треонин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, положение 195 подвергнуто мутации в лейцин и положение 237 подвергнуто мутации в серии. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в треонин, положение 63 подвергнуто мутации в лизин, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 29 подвергнуто мутации в тирозин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 166 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 231 подвергнуто мутации в треонин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 102 подвергнуто мутации в треонин, положение 173 подвергнуто мутации в тирозин и положение 194 подвергнуто мутации в тирозин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 65 подвергнуто мутации в аланин, положение 108 подвергнуто мутации в глутамин, положение 171 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту и положение 193 подвергнуто мутации в изолейцин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в валин, положение 164 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 195
подвергнуто мутации в изолейцин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 33 подвергнуто мутации в пролин, положение 105 подвергают мутации в аспарагин, положение 171 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в метионин и положение 231 подвергнуто мутации в аланин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глицин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 106 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, положение 171 подвергнуто мутации в гистидин и положение 195 подвергнуто мутации в валин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 31 подвергают мутации в аспарагин, положение 54 подвергнуто мутации в глицин, положение 165 подвергнуто мутации в тирозин, положение 196 подвергнуто мутации в аспарагин и положение 235 подвергнуто мутации в аланин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в лейцин, положение 166 подвергнуто мутации в серии и положение 196 подвергнуто мутации в глицин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 34 замещено лейцином, аминокислотное положение 61 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 108 замещено пролином, аминокислотное положение 194 замещено аспарагином, и аминокилотное положение 239 замещено аланином. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение 31 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 65 замещено аспарагиновой кислотой, аминокислотное положение 108 замещено глицином, аминокислотное положение 171 замещено валином, аминокислотное положение 194 замещено глутаминовой кислотой.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в изолейцин, положение 65 подвергнуто мутации в глутамин, положение 102 подвергнуто мутации в аланин, положение 163 подвергнуто мутации в аланин, положение 197 подвергнуто мутации в валин и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В
некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в изолейцин, положение 65 подвергнуто мутации в глутамин, положение 102 подвергнуто мутации в аланин, положение 163 подвергнуто мутации в аланин, положение 197 подвергнуто мутации в валин и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 3 нМ до 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 57 подвергнуто мутации в лизин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин и положение 235 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 57 подвергнуто мутации в лизин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин и положение 235 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в гистидин, положение 168 подвергнуто мутации в тирозин, положение 194 подвергнуто мутации в серии и положение 239 подвергнуто мутации в изолейцин, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в гистидин, положение 168 подвергнуто мутации в тирозин, положение 194 подвергнуто мутации в серии и положение 239 подвергнуто мутации в изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в метионин, положение 55 подвергнуто мутации в
серии, положение 114 подвергнуто мутации в треонин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, положение 195 подвергнуто мутации в лейцин и положение 237 подвергнуто мутации в серии, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в метионин, положение 55 подвергнуто мутации в серии, положение 114 подвергнуто мутации в треонин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, положение 195 подвергнуто мутации в лейцин и положение 237 подвергнуто мутации в серии, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в треонин, положение 63 подвергнуто мутации в лизин, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в треонин, положение 63 подвергнуто мутации в лизин, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 29 подвергнуто мутации в тирозин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 166 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит
последовательность, в которой аминокислотное положение 29 подвергнуто мутации в тирозин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 166 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 102 подвергнуто мутации в треонин, положение 173 подвергнуто мутации в тирозин и положение 194 подвергнуто мутации в тирозин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 102 подвергнуто мутации в треонин, положение 173 подвергнуто мутации в тирозин и положение 194 подвергнуто мутации в тирозин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 65 подвергнуто мутации в аланин, положение 108 подвергнуто мутации в глутамин, положение 171 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту и положение 193 подвергнуто мутации в изолейцин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 65 подвергнуто мутации в аланин, положение 108 подвергнуто мутации в глутамин, положение 171 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту и положение 193 подвергнуто мутации в изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 25 нМ до около 40 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное
положение 34 подвергнуто мутации в валин, положение 164 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 195 подвергнуто мутации в изолейцин, и где значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в валин, положение 164 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 195 подвергнуто мутации в изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 33 подвергнуто мутации в пролин, положение 90 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 105 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 171 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в метионин и положение 231 подвергнуто мутации в аланин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 33 подвергнуто мутации в пролин, положение 90 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 105 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 171 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в метионин и положение 231 подвергнуто мутации в аланин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 40 нМ до 60 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глицин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глицин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин,
положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 11 нМ до 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 106 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, положение 171 подвергнуто мутации в гистидин и положение 195 подвергнуто мутации в валин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 106 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, положение 171 подвергнуто мутации в гистидин и положение 195 подвергнуто мутации в валин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 40 нМ до 60 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 54 подвергнуто мутации в глицин, положение 165 подвергнуто мутации в тирозин, положение 196 подвергнуто мутации в аспарагин и положение 235 подвергнуто мутации в аланин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 54 подвергнуто мутации в глицин, положение 165 подвергнуто мутации в тирозин, положение 196 подвергнуто мутации в аспарагин и положение 23 5 подвергнуто мутации в аланин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в лейцин, положение 166 подвергнуто мутации в серии и положение 196 подвергнуто мутации в глицин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинности связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность,
представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в лейцин, положение 166 подвергнуто мутации в серии и положение 196 подвергнуто мутации в глицин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от около 125 нМ до около 140 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в лейцин, аминокислотное положение 61 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в пролин, аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в аспарагин, аминокислотное положение 239 подвергнуто мутации в аланин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинности связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в лейцин, аминокислотное положение 61 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в пролин, аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в аспарагин, аминокислотное положение 239 подвергнуто мутации в аланин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 65 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в глицин, аминокислотное положение 171 подвергнуто мутации в валин и аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержит последовательность, в которой аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 65 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, аминокислотное положение 108
подвергнуто мутации в глицин, аминокислотное положение 171 подвергнуто мутации в валин и аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, который связывается с CD3, не связывается с мышиным CD3.
В одном варианте осуществления предлагается полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления предлагается вектор, содержащий полинуклеотид, описанный в настоящем документе. В одном варианте осуществления предлагается клетка-хозяин, трансформированная вектором, описанным в настоящем документе. В следующем варианте осуществления предлагается фармацевтическая композиция, содержащая (i) белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением, вектор в соответствии с настоящим изобретением или клетку-хозяина в соответствии с настоящим изобретением, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления предлагается способ получения белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанный способ включает культивирование хозяина, трансформированного или трансфицированного вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, в условиях, которые обеспечивают экспрессию белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, и выделение и очистку полученного белка из культуры.
В другом варианте осуществления предлагается способ лечения или ослабления пролиферативного заболевания, опухолевого заболевания, воспалительного заболевания, иммунологического расстройства, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, аллергической реакции, паразитарной реакции, болезни "трансплантат против хозяина" или болезни "хозяин против трансплантата", включающий введение белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек. В некоторых вариантах осуществления способ, кроме того, включает введение
агента в комбинации с белком, содержащим одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением.
В настоящем документе в одном варианте осуществления предлагается мультиспецифический связывающий белок, содержащий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления описано антитело, содержащее белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением. В другом варианте осуществления предлагается мультиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, однодоменное антитело, вариабельный домен тяжелой цепи, пептид или лиганд, содержащий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления в настоящем документе описано антитело, содержащее белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанное антитело представляет собой scFv-антитело. В другом варианте осуществления описан мультиспецифический связывающий белок или антитело, содержащее белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, и домен связывания сывороточного альбумина.
Краткое описание чертежей
Новые признаки изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Более полное понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет получено со ссылкой на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы изобретения, и сопровождающие их чертежи:
На фигуре 1 показано титрование бактериофага на биотин-СОЗе и биотин-HSA.
На фигуре 2 показана аминокислотная последовательность человеческого CD3-связывающего белка (SEQ Ш N0: 22). НС CDR1 указан в первой затененной последовательности (SEQ Ш N0: 23)), НС CDR2 указан во второй затененной последовательности (RIRSKYNNYATYYADSVK (SEQ ID N0: 24)), НС CDR3 указан в третьей затененной последовательности (HGNFGNSYISYWAY (SEQ ГО N0: 25)), LC CDR1 указан в четвертой затененной последовательности (GSSTGAVTSGNYPN (SEQ ГО N0: 26)), LC CDR2 указан в пятой затененной последовательности (GTKFLAP (SEQ ГО N0: 27)), и CDR3 указан в шестой затененной последовательности (VLWYSNRWV (SEQ ГО N0: 28)).
На фигуре 3 показаны профили шестнадцати клонов, выбранных для более точных определений Kd.
На фигуре 4 показана температура гидрофобного воздействия (Ть °С) для нескольких вариантов анти-гшСОЗе scFv. Подробное описание изобретения
Хотя в настоящем документе показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления приведены только в качестве примеров. Не выходя за рамки данного изобретения, специалист в данной области может осуществить многочисленные вариации, изменения и замены. Следует иметь в виду, что в практике осуществления данного изобретения можно использовать различные альтернативы вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что прилагаемая формула изобретения определяет объем данного изобретения, и что способы и структуры в объеме этой формулы и их эквиваленты охвачены этой формулой изобретения. Некоторые определения
Терминология, применяемая в настоящем документе, служит исключительно для описания конкретных случаев и не ограничивает изобретение. В настоящем документе неопределенная и определенная формы единственного числа также включают множественные формы, если контекст ясно не указывает иное. Кроме того, в той мере, в какой термины "включающий", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты применяют в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины подразумевают включение в себя подобно термину "содержащий".
Термин "примерно" или "приблизительно" означает нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины, определенного специалистом в данной области техники, который будет зависеть отчасти от того, каким образом величину измеряют или определяют, то есть от ограничений измерительной системы. Например, термин "примерно" может означать, что величина находится в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, как показывает практика в данной области. В тех случаях, когда в заявке и формуле изобретения приведены конкретные значения, то, если не указано иное, следует предполагать термин "примерно", обозначающий нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины.
Термины "индивидуум", "пациент" или "субъект" применяются как взаимозаменяемые. Ни один из этих терминов не требует или не ограничивается ситуацией, характеризующейся наблюдением (например, постоянным или
периодическим) медицинским работником (например, врачом, дипломированной медицинской сестрой, помощником врача, санитаром или работником хосписа).
Как используется в настоящем документе, "период полувыведения" используется в его обычном смысле, как это описано в Goodman and Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980). Вкратце, данный термин предназначен, чтобы охватить количественную меру периода выведения лекарственного средства. Выведение большинства лекарственных средств описывается экспоненциальной зависимостью (то есть следует кинетике первого порядка), так как концентрации лекарственного средства обычно не достигают тех, которые требуются для насыщения процесса выведения. Скорость экспоненциального процесса может быть выражена его константой скорости, к, выражающей относительное изменение на единицу времени, либо его периодом полувыведения, ti/2, временем, необходимым для 50%-ного завершения процесса. Единицами данных двух констант являются единица времени"1 и единица времени, соответственно. Константа скорости первого порядка и полупериод реакции связаны просто (kxti/2=0,693) и могут быть взаимозаменяемыми соответствующим образом. Поскольку кинетика выведения первого порядка подсказывает, что в единицу времени теряется постоянная доля лекарственного средства, график зависимости логарифма концентрации лекарственного средства от времени является линейным в любой момент времени после начальной фазы распределения (т.е. после того, как абсорбции и распределения лекарственного средства завершатся). Полупериод времени для выведения лекарственного средства может быть точно определен из такого графика.
Используемый в настоящем документе термин "процентная (%) идентичность аминокислотной последовательности" в отношении последовательности определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной последовательности после выравнивания последовательностей и внесения пробелов, если необходимо, чтобы получить максимальную процентную идентичность последовательностей, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процентной идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, известными специалистам в данной области, например, используя общедоступные компьютерные программы, такие как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для
определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Термин "каркасные" или "FR" остатки (или области) относится к тем остаткам вариабельной области, которые отличаются от CDR или остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем документе. "Человеческая консенсусная каркасная область" обозначает каркасную область, которая представляет наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток при отборе VL or VH каркасных последовательностей человеческого иммуноглобулина.
Используемый в настоящем документе термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к тому факту, что последовательности определенных частей вариабельных доменов значительно отличаются среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность не является равномерно распределенной на протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR), или гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют каркасными (FR). Каждый из вариабельных доменов природных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR-области, в значительной степени принимающие конфигурацию Р-слоя, соединенную тремя CDR, которые формируют петли, соединяющие структуру Р-слоев и в некоторых случаях формирующие ее часть. CDR в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости от областей FR и совместно с CDR другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (смотри Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но они обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности. "Нумерация остатка вариабельного домена как у Kabat" или "нумерация положения аминокислоты как у Kabat", и его вариации, относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи для собрания данных по антителам у Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). При использовании этой системы нумерации действительная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению FR или CDR вариабельного домена или вставке в них.
Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать единственную вставку аминокислоты (остаток 52а согласно Kabat) после остатка 52 Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82Ь и 82с и т.п. согласно Kabat) после остатка 82 тяжелой цепи FR. Нумерация остатков по Kabat можно определить для данных антител посредством выравнивания областей гомологии последовательности антител со "стандартной" занумерованной по Kabat последовательностью. Не предполагается, что CDR согласно настоящему изобретению обязательно соответствуют системе нумерации Kabat.
Используемый в настоящем документе термин "аффинность связывания" относится к аффинности белков, описанных в изобретении, по отношению к связывающимся с ними мишеням, и выражается численно с использованием значений "Kd". Если указано, что два или более белков обладают сравнимыми значениями аффинности связывания по отношению к связывающимся с ними мишеням, то значения Kd для связывания соответствующих белков по отношению к связывающимся с ними мишеням ± 2-кратно отличаются друг от друга. Если указано, что два или более белков обладают сравнимыми значениями аффинности связывания по отношению к единственной связывающейся с ними мишени, то значения Kd для связывания соответствующих белков по отношению к указанной единственной связывающейся с ними мишени ± 2-кратно отличаются друг от друга. Если указано, что белок связывается с двумя или более мишенями со сравнимыми значениями аффинности связывания, то значения Kd для связывания указанного белка с двумя или более мишенями ± 2-кратно отличаются друг от друга. В целом, более высокое значение Kd соответствует более слабому связыванию. В некоторых вариантах осуществления "Kd" измеряют с помощью анализа связывания радиоактивно меченного антигена (RIA) или поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore(tm)-2000 or a BIAcore(tm)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). В некоторых вариантах осуществления "скорость связывания" или "скорость ассоциации" или "скорость соединения" или "kon", и "скорость диссоциации" или "скорость разрыва" или "скорость разъединения" или "k0ff" также определяют с помощью способа поверхностного плазмонного резонанса с использованием систем BIAcore(tm)-2000 or a BIAcore(tm)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). В дополнительных вариантах осуществления "Kd", "kon" и "k0ff" измеряют с использованием систем Octet(r) Systems (Pall Life Sciences).
В настоящем документе описаны белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, фармацевтические композиции, а также нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы и клетки-хозяева для получения таких белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент,
связывающийся с CD3. Также, предлагаются способы применения раскрытых белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, для предупреждения и/или лечения заболеваний, состояний и нарушений. В некоторых вариантах осуществления белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, способны специфически связываться с доменом CD3, а также антигеном-мишенью, и доменом, увеличивающим период полувыведения, таким как однодоменное антитело, связывающееся с человеческим сывороточным альбумином (HSA).
СОЗ-связывающий домен
Специфичность ответа Т-клеток опосредуется распознаванием антигена (отображаемого в контексте главного комплекса гистосовместимости, МНС) комплексом Т-клеточного рецептора. В составе комплекса Т-клеточного рецептора CD3 представляет собой белковый комплекс, который включает цепь CD3y (гамма), цепь CD38 (дельта) и две цепи CD3s (эпсилон), которые присутствуют на поверхности клетки. CD3 ассоциируется с а (альфа) и р (бета) цепями Т-клеточного рецептора (TCR), а также с цепью CD3 ? (дзета), которые все вместе образуют комплекс Т-клеточного рецептора. Кластеризация CD3 на Т-клетках, например, посредством иммобилизованных антител против CD3, приводит к активации Т-клеток, сходной с вовлечением Т-клеточного рецептора, но не зависящей от его специфичности в отношении определенного клона.
В одном аспекте описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который специфически связывается с CD3. В одном аспекте описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который специфически связывается с человеческим CD3. В одном аспекте описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который специфически связывается с CD3 яванского макака. В одном аспекте описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который связывается с человеческим CD3 и CD3 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который специфически связывается с CD3y. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который специфически связывается с CD38. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем
документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержат домен, который специфически связывается с CD3s.
В другом аспекте предлагается мультиспецифический связывающий белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, специфически связывается с Т-клеточным рецептором (TCR). В некоторых случаях мультиспецифический белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, связывается с а-цепью TCR. В определенных случаях мультиспецифический белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением, связывается с Р-цепью TCR.
В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен описанных в настоящем документе белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, демонстрирует не только сильное сродство к CD3-связыванию с человеческим CD3, но также и превосходную перекрестную реактивность с соответствующими белками CD3 яванского макака. В некоторых случаях CD3-связывающий домен белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, является перекрестно реактивными с CD3 яванского макака. В определенных случаях значение Kd для связывания с человеческим CD3 (hKd) является примерно таким же, как значение Kd для связывания с CD3 яванского макака (cKd). В некоторых случаях соотношение величин hKd и cKd (hKdxKd) находится в диапазоне от около 20:1 до около 1:2.
В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, может представлять собой любой домен, который связывается с CD3, включая, но без ограничения, домены из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела. В некоторых случаях является преимуществом, чтобы домен, связывающий CD3, был получен из того же вида, в котором, в конечном счете, будет использоваться белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3. Например, для применения на людях может являтся преимуществом, чтобы CD3-связывающий домен белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, содержал человеческие или гуманизированные остатки из антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.
Таким образом, в одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит гуманизированное или человеческое антитело или фрагмент антитела, или мышиное антитело или фрагмент мышиного антитела. В одном варианте осуществления гуманизированный или человеческий анти-СОЗ-связывающий домен содержит одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (LC CDR3) гуманизированного или человеческого анти-СОЗ-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и/или одну или несколько (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (НС CDR1), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (НС CDR2) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (НС CDR3) гуманизированного или человеческого анти-СОЗ-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, гуманизированного или человеческого анти-СБЗ-связывающего домена, содержащего одну или несколько, например, все три LC CDR и одну или несколько, например, все три НС CDR.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированный или человеческий анти-СОЗ-связывающий домен содержит вариабельную область гуманизированной или человеческой легкой цепи, специфическую для CD3, при этом вариабельная область легкой цепи, специфическая для CD3, содержит последовательности CDR человеческой или нечеловеческой легкой цепи в каркасной области человеческой легкой цепи. В определенных случаях каркасная область легкой цепи представляет собой каркасную область легкой цепи X (лямбда). В других случаях каркасная область легкой цепи представляет собой каркасную область легкой цепи к (каппа).
В некоторых вариантах осуществления гуманизированный или человеческий анти-СОЗ-связывающий домен содержит вариабельную область гуманизированной или человеческой тяжелой цепи, специфическую для CD3, при этом вариабельная область тяжелой цепи, специфическая для CD3, содержит последовательности CDR человеческой или нечеловеческой тяжелой цепи в каркасной области человеческой тяжелой цепи.
В определенных случаях, определяющие комплементарность области тяжелой цепи и/или легкой цепи получены из известных анти-СБЗ-антител, таких как, например, муромонаб-СБЗ (ОКТЗ), отеликсизумаб (TRX4), теплизумаб (MGA031), визилизумаб (Nuvion), SP34, TR-66 или Х35-3, VIT3, ВМА030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5,
Fl 11-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 и WT-31.
В одном варианте осуществления анти-СОЗ-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в настоящем документе. Используемый в настоящем документе термин "одноцепочечный вариабельный фрагмент" или "scFv" относится к фрагменту антитела, содержащему вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере одному фрагменту антитела, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, при этом вариабельные области легкой и тяжелой цепей смежно связаны через короткий гибкий полипептидный линкер, и способны экспрессироваться в виде единой полипептидной цепи, и при этом scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он получен. В одном варианте осуществления анти-СОЗ-связывающий домен содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в настоящем документе, или последовательность, имеющую 95-99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в настоящем документе; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены), но не более чем 30, 20 или 10 модификаций (например, замен) в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в настоящем документе, или последовательность, имеющую 95-99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления гуманизированный или человеческий анти-СОЗ-связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, присоединена к вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, с помощью scFv-линкера. Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи из scFv могут располагаться, например, в любом из следующих направлений: вариабельная область легкой цепи-БсРу-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-БсРу-линкер-вариабельная область легкой цепи.
В некоторых случаях scFv, которые связываются с CD3, получены в соответствии с известными способами. Например, молекулы scFv могут быть получены при связывании
областей VH и VL вместе при помощи гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат scFv-линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированной длиной и/или аминокислотным составом. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления длина scFv-линкера такова, что VH- или VL-домен можно связать межмолекулярно с другим вариабельным доменом с образованием сайта связывания с CD3. В определенных вариантах осуществления такие scFv-линкеры являются "короткими", т.е. состоят из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков. Таким образом, в некоторых случаях scFv-линкеры состоят из около 12 или менее аминокислотных остатков. В случае 0 аминокислотных остатков scFv-линкер представляет собой пептидную связь. В некоторых вариантах осуществления данные scFv-линкеры состоят примерно из 3-15, например 8, 10 или 15 смежных аминокислотных остатков. Что касается аминокислотного состава scFv-линкеров, выбраны пептиды, которые придают гибкость, не мешают вариабельным доменам, а также позволяют осуществить межцепочный фолдинг с тем, чтобы объединить два вариабельных домена для образования функционального сайта связывания с CD3. Так, например, scFv-линкеры, включающие остатки глицина и серина, обычно обеспечивают устойчивость к протеазам. В некоторых вариантах осуществления линкеры в scFv содержат остатки глицина и серина. Аминокислотная последовательность scFv-линкеров может быть оптимизирована, например, с помощью способов фагового дисплея для улучшения связывания с CD3 и получения большого количества scFv. Примеры пептидных scFv-линкеров, подходящих для связывания вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи, в scFv, включают, но без ограничения, (GS)n(SEQ Ш N0: 96), (GGS)n (SEQ Ш NO: 97), (GGGS)n (SEQ Ш NO: 98), (GGSG)n (SEQ Ш NO: 99), (GGSGG)n(SEQ Ш NO: 100), (GGGGS)n(SEQ Ш NO: 101), (GGGGG)n (SEQ Ш NO: 102) или (GGG)n (SEQ Ш NO: 103), где n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте осуществления линкер в scFv может быть (GGGGS)4 (SEQ Ш NO: 104) или (GGGGS)3 (SEQ Ш NO: 1). Изменение длины линкера может сохранить или повысить активность, что приводит к более высокой эффективности в исследованиях активности.
В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, обладает аффинностью к CD3 на СОЗ-экспрессирующих клетках со значением Kd, равным 1000 нМ или менее, 500 нМ или менее, 200 нМ или менее, 100 нМ или менее, 80 нМ или менее, 50 нМ или менее, 20 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5 нМ или менее, 1 нМ или менее или 0,5 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающий домен белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, обладает аффинностью к CD3s, у или 8 со значением Kd, равным 1000 нМ или менее, 500 нМ или
менее, 200 нМ или менее, 100 нМ или менее, 80 нМ или менее, 50 нМ или менее, 20 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5 нМ или менее, 1 нМ или менее, или 0,5 нМ или менее. В других вариантах осуществления CD3-связывающий домен белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет низкой аффинностью к CD3, то есть около 100 нМ или выше.
В определенных вариантах осуществления описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, связываются с человеческим CD3 с Kd человека (hKd) и с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd). В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 1 нМ до около 2 нМ, от около 3 нМ до около 5 нМ, от около 6 нМ до около 10 нМ, от около 11 нМ до около 20 нМ, от около 25 нМ до около 40 нМ, от около 40 нМ до около 60 нМ, от около 70 нМ до около 90 нМ, от около 100 нМ до около 120 нМ, от около 125 нМ до около 140 нМ, от около 145 нМ до около 160 нМ, от около 170 нМ и до около 200 нМ, от около 210 нМ до около 250 нМ, от около 260 нМ до около 300 нМ.
В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, являются примерно такими же, как значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 1,1-1,5 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 1,5-2 раза выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 2,5-3 раза выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 3-5 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 6-15 раз выше, чем Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 22. В некоторых
вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 15-20 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 20-50 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 55-70 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 75-100 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 22. В некоторых вариантах осуществления значения hKd и cKd белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, примерно в 120-200 раз выше, чем значение Kd CD3-связывающего белка, имеющего последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 22.
В некоторых вариантах осуществления соотношение между hKd и cKd (hKdxKd) находится в диапазоне от около 20:1 до около 1:2. Аффинность к связыванию с CD3 может быть определена, например, по способности самого белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, или его CD3-связывающего домена связываться с CD3, нанесенным на планшет для анализа; отображаемым на микробной клеточной поверхности; в растворе; и т.д. Связывающая активность самого белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, или его CD3-связывающего домена согласно настоящему изобретению по отношению к CD3 может быть проанализирована при помощи иммобилизации лиганда (например, CD3) или самого белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3), или его CD3-связывающего домена на шарике, подложке, клетке и т.д. Могут быть добавлены агенты в соответствующем буфере, и партнеры по связыванию могут инкубироваться в течение определенного периода времени при заданной температуре. После промывок для удаления несвязанного материала, связанный белок может быть высвобожден при помощи, например, SDS, буферов с высоким рН и т.п., и проанализирован, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR).
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0. 8, SEQ ГО N0. 9, SEQ ГО N0. 10, SEQ ГО N0. 11, SEQ ГО N0. 12, SEQ ГО N0. 13, SEQ ГО N0. 14, SEQ ГО N0. 15, SEQ ГО N0. 16, SEQ ГО N0. 17, SEQ ГО N0. 18, SEQ ГО N0. 19, SEQ ГО N0. 20, SEQ ГО N0. 21, SEQ ГО N0. 94) и SEQ ГО N0. 95.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0. 8, при этом hKd составляет около 3,8 нМ, и при этом cKd составляет около 3,5 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 9, при этом hKd составляет около 4,1 нМ, и при этом cKd составляет около 3,4 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 10, при этом hKd составляет около 4,3 нМ, и при этом cKd составляет около 4,2 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 11, при этом hKd составляет около 4,7 нМ, и при этом cKd составляет около 4,9 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 12, при этом hKd составляет около 6,4 нМ, и при этом cKd составляет около 6,6 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 13, при этом hKd составляет около 8 нМ, и при этом cKd составляет около 6,6 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 14, при этом hKd составляет около 20 нМ, и при этом cKd составляет около 17 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 15, при этом hKd составляет около 37 нМ, и при этом cKd составляет около 30 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ Ш NO. 16, при этом hKd составляет около 14 нМ, и при этом cKd составляет около 13 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 17, при этом hKd составляет около 50 нМ, и при этом cKd составляет около 47 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 18, при этом hKd составляет около 16 нМ, и при этом cKd составляет около 16 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 19, при этом hKd составляет около 46 нМ, и при этом cKd составляет около 43 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 20, при этом hKd составляет около 18 нМ, и при этом cKd составляет около 17 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 21, ри этом hKd составляет около 133 нМ, и при этом cKd составляет около 134 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 94, при этом hKd составляет около 117 нМ, и при этом cKd составляет около 115 нМ. В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 95, при этом hKd составляет около 109 пМ, и при этом cKd составляет около 103 нМ.
В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 8, при этом значения hKd и cKd является примерно такими же, как значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 9, при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 10, при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 11, при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 12, при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 13, при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 14, при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 15, при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 16, при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt нати-СБЗ (SEQ Ш NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 17, при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt
анти-СОЗ (SEQ ГО NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 18, при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 19 (2А4), при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 20, при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 21, при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО N0. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 94, при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО NO. 22). В некоторых вариантах осуществления белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 95, при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем значение Kd по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО N0. 22). Домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения
Человеческий сывороточный альбумин (Human serum albumin, HSA) (молекулярная масса ~ 67 кДа) является наиболее распространенным белком в плазме крови, присутствует в количестве, составляющем около 50 мг/мл (600 мкМ) и имеет период полувыведения, составляющий около 20 дней в организме человека. HSA служит для поддержания рН плазмы крови, способствует поддержанию коллоидного артериального давления, выполняет функции в качестве носителя многих метаболитов и жирных кислот,
а также служит в качестве основного белка для транспорта лекарственных средств в плазме.
Нековалентная ассоциация с альбумином удлиняет период полувыведения короткоживущих белков. Например, рекомбинантное слияние альбумин-связывающего домена с фрагментом Fab привело к in vivo 25- и 58-кратному клиренсу и удлинению периода полувыведения в 26 и 37 раз при внутривенном введении мышам и кроликам, соответственно, по сравнению с введением только фрагмента Fab. В другом примере, когда инсулин ацилируют жирными кислотами для улучшения связи с альбумином, длительный эффект наблюдался при подкожном введении у кроликов или свиней. Взятые вместе, данные этих исследований демонстрируют связь между связыванием с альбумином и пролонгированным действием.
В одном аспекте предлагается мультиспецифический связывающий белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением и, кроме того, содержащий домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, например домен, который специфически связывается с сывороточным альбумином. В некоторых вариантах осуществления связывающий сывороточный альбумин домен белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, может быть любым доменом, который связывается с сывороточным альбумином, включая, но без ограничения, домены из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления связывающий сывороточный альбумин домен представляет собой одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) из полученного из верблюда однодоменного антитела, или антигенсвязывающие фрагменты HSA-связывающих антител, такие как фрагменты Fab, Fab', F(ab)2 и Fv, фрагменты, состоящие из одной или более CDR, одноцепочечные антитела (например, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv)), дисульфидные стабилизированные (dsFv) Fv-фрагменты, гетероконъюгатные антитела (например, биспецифические антитела), pFv-фрагменты, мономеры или димеры тяжелой цепи, мономеры или димеры легкой цепи, и димеры, состоящие из одной тяжелой цепи и одной легкой цепи, пептид, лиганд или низкомолекулярную группу, специфичные к сывороточному альбумину. В определенных вариантах осуществления HSA-связывающий домен является однодоменным антителом. В других вариантах осуществления связывающий сывороточный альбумин домен представляет собой пептид. В других
вариантах осуществления связывающий сывороточный альбумин домен представляет собой низкомолекулярную группу. Предполагается, что связывающий сывороточный альбумин домен мультиспецифического связывающего белка, представляющего собой белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, имеет достаточно малый размер и не более 25 кДа, не более 20 кДа, не более 15 кДа или не более 10 кДа, в некоторых вариантах осуществления. В некоторых случаях, связывающий сывороточный альбумин домен имеет размер 5 кДа или менее, если он представляет собой пептид или низкомолекулярную группу.
Домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, мультиспецифического связывающего белка, представляющего собой белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, обеспечивает изменение фармакодинамики и фармакокинетики самого белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3. Как упомянуто выше, домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, продлевает период полувыведения. Домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, также изменяет фармакодинамические свойства, включая изменение распределения, проникновения и диффузии белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в ткани. В некоторых вариантах осуществления домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, обеспечивает улучшение направленной доставки в ткани (включая опухоль), распределение в ткани, проникновение в ткани, диффузии внутри ткани и повышенную эффективность по сравнению с белком без домена, обеспечивающего удлинение периода полувыведения. В одном варианте осуществления терапевтические способы эффективно и продуктивно используют пониженное количество мультиспецифического связывающего белка, представляющего собой белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, что приводит к снижению побочных эффектов, например, к снижению неопухолевой цитотоксичности.
Кроме того, аффинность связывания домена, обеспечивающего удлинение периода полувыведения, может быть выбрана таким образом, чтобы соответствовать определенному периоду полувыведения в конкретном мультиспецифическом связывающем белке, представляющем собой белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, имеет высокую аффинность связывания. В других вариантах осуществления домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, имеет среднюю аффинность
связывания. В других вариантах осуществления домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, имеет низкую или маргинальную аффинность связывания. Примеры аффинности связывания включают Kd-концентрации при 10 нМ или менее (высокая), в диапазоне от 10 нМ до 100 нМ (средняя), и более 100 нМ (низкая). Как упомянуто выше, аффинности связывания с сывороточным альбумином определяют с помощью известных способов, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Домен связывания антигена-мишени
В дополнение к описанным CD3 и домену, обеспечивающему удлинение периода полувыведения, мультиспецифические связывающие белки, описанные в настоящем документе в определенных вариантах осуществления, также содержат домен, который связывается с антигеном-мишенью. Антиген-мишень вовлечен в заболевание, расстройство или состояние и/или связан с заболеванием, расстройством или состоянием. В частности, антиген-мишень связан с пролиферативным заболеванием, опухолевым заболеванием, воспалительным заболеванием, иммунологическим расстройством, аутоиммунным заболеванием, инфекционным заболеванием, вирусным заболеванием, с аллергической реакцией, с паразитарной реакцией, болезнью "трансплантат против хозяина" или болезнью "хозяин против трансплантата". В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой опухолевый антиген, экспрессированный на опухолевой клетке. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления антиген-мишень связывается с патогеном, таким как вирус или бактерия
В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой молекулу клеточной поверхности, такую как белок, липид или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень находится на опухолевой клетке, зараженной вирусом клетке, бактериально инфицированной клетке, поврежденном эритроците, клетке артериальной бляшки или клетке фиброзной ткани.
Конструкция мультиспецифического связывающего белка, представляющего собой описанный в настоящем документе белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, делает возможным, чтобы домен связывания антигена-мишени был универсальным в том смысле, что домен связывания антигена-мишени может представлять собой любой тип связывающего домена, включая, но без ограничения, домены из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления домен связывания антигена-мишени представляет собой одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), однодоменное антитело, такие как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH)
из полученного из верблюда однодоменного антитела. В других вариантах осуществления домен связывания антигена-мишени представляет собой не являющийся Ig связывающий домен, то есть, антитело-миметик, такое как антикалины, аффилины, молекулы аффитела, аффимеры, аффитины, альфатела, авимеры, белки с анкириновым повтором DARPin, финомеры, пептиды с доменом Кунитца и монотела. В других вариантах осуществления домен связывания антигена-мишени представляет собой лиганд или пептид, который связывается или ассоциируется с антигеном-мишенью. В других вариантах осуществления домен связывания антигена-мишени представляет собой ноттин. В других вариантах осуществления домен связывания антигена-мишени представляет собой низкомолекулярную группу.
Модификации белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3
Описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, включают производные или аналоги, в которых (i) аминокислота замещена остатком аминокислоты, который не является остатком аминокислоты, кодируемым генетическим кодом, (ii) зрелый полипептид слит с другим соединением, таким как полиэтиленгликоль, или (iii) дополнительные аминокислоты слиты с белком, такие как лидерная последовательность или секреторная последовательность, или последовательность для блокирования иммуногенного домена и/или для очистки белка.
Типичные модификации включают, но без ограничения, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных сшивок, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредуемое транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование.
Модификации выполнены в любом месте в описанных в настоящем документе белках, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксильный
концы. Некоторые общие модификации пептидов, которые являются применимыми для модификации белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся CD3, включают гликозилирование, присоединение липида, сульфатирование, gamma-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование, блокирование амино- или карбоксильной группы или обеих групп в полипептиде, посредством ковалентой модификации, и АДФ-рибозилирование. Полинуклеотиды, кодирующие белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3
Настоящее изобретение также относится, в некоторых вариантах осуществления, к полинуклеотидным молекулам, кодирующим белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, или мультиспецифический связывающий белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные молекулы представлены в виде ДНК-конструкции. В других вариантах осуществления полинуклеотидные молекулы обеспечены в виде транскрипта информационной РНК.
Полинуклеотидные молекулы построены известными способами, например, путем объединения генов, кодирующих три связывающих домена, либо разделенных пептидными линкерами, либо, в других вариантах осуществления, непосредственно связанных пептидной связью, в единую генетическую конструкцию, функционально связанную с подходящим промотором и необязательно подходящий терминатором транскрипции, и их экспрессии в бактериях или других подходящих экспрессионных системах, например, в клетках СНО. В вариантах осуществления, в которых домен связывания антигена-мишени представляет собой низкомолекулярную группу, полинуклеотиды содержат гены, кодирующие домен связывания CD3 и домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения. В вариантах осуществления, где домен, обеспечивающий удлинение периода полувыведения, представляет собой низкомолекулярную группу, полинуклеотиды содержат гены, кодирующие домены, которые связываются с CD3 и антигеном-мишенью. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина, может быть использовано любое число подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Промотор выбирают таким образом, что он приводит в действие экспрессию полинуклеотида в соответствующей клетке-хозяине.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид встраивают в вектор, предпочтительно экспрессирующий вектор, что представляет дополнительный вариант
осуществления. Данный рекомбинантный вектор может быть сконструирован в соответствии с известными способами. Векторы, представляющие особый интерес, включают плазмиды, фагмиды, производные фагов, вирусы (например, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, лентивирусы и т.п.) и космиды.
Различные экспрессионные системы вектор/хозяин могут применяться, чтобы служить в качестве носителя и использоваться для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид описанного белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3. Примерами экспрессирующих векторов для экспрессии в E.coli являются pSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1): 111-27) или pcDNA5 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих, PICHIAPINK(tm) Yeast Expression Systems (Invitrogen), BACUVANCE(tm) Baculovirus Expression System (GenScript).
Таким образом, белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления получают путем введения вектора, кодирующего белок, как описано выше, в клетку-хозяина и культивирования упомянутой клетки-хозяина в условиях, при которых белковые домены экспрессируются, могут быть выделены и, при необходимости, дополнительно очищены.
Получение белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе раскрыт способ получения белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3. В некоторых вариантах осуществления способ включает культивирование хозяина, трансформированного или трансфицированного вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, в условиях, обеспечивающих экспрессию белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, и выделение и очистку полученного белка из культуры.
В дополнительном варианте осуществления предлагается способ, направленный на улучшение одного или нескольких свойств, например, аффинности, стабильности, устойчивости к высоким температурам, перекрестной реактивности и т.д. белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, и/или мультиспецифических связывающих белков, включающих белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, как описано в
настоящем документе, по сравнению с референсным связывающим соединением. В некоторых вариантах осуществления обеспечено множество библиотек с одиночными замещениями, каждая из которых соответствует разному домену или аминокислотному сегменту белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, или референсного связывающего соединения, так что каждый член библиотеки с одиночными замещениями кодирует только одну аминокислотную замену в своем соответствующем домене или аминокислотном сегменте. (Это позволяет исследовать все потенциальные замены в крупном белке или участке связывания белка с помощью нескольких небольших библиотек.) В некоторых вариантах осуществления множество доменов образует или покрывает непрерывную последовательность аминокислот белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, или референсного связывающего соединения. Нуклеотидные последовательности различных библиотек с одиночными замещениями перекрываются с нуклеотидными последовательностями по меньшей мере одной другой библиотеки с одиночными замещениями. В некоторых вариантах осуществления множество библиотек с одиночными замещениями сконструированы таким образом, что каждый член перекрывается с каждым членом каждой библиотеки с одиночными замещениями, кодирующим соседний домен.
Связывающие соединения, экспрессирующиеся из таких библиотек с одиночными замещениями, отбирают отдельно для получения поднабора вариантов в каждой библиотеке, который имеет свойства, по меньшей мере, такие же, как и у референсного связывающего соединения, и полученная в результате библиотека уменьшается по размеру. (То есть число нуклеиновых кислот, кодирующих выбранный набор связывающих соединений, меньше, чем число нуклеиновых кислот, кодирующих члены исходной библиотеки с одиночными замещениями). Такие свойства включают, но без ограничения, аффинность к целевому соединению, стабильность к различным условиям, таким как тепло, высокое или низкое значение рН, ферментативное разложение, перекрестная реактивность с другими белками и т.п. Выбранные соединения из каждой библиотеки с одиночными замещениями называются в настоящем документе взаимозаменяемо как "предварительные соединения-кандидаты" или "предварительные белки-кандидаты". Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие предварительные соединения-кандидаты из отдельных библиотек с одиночными замещениями, затем перетасовываются в PCR для создания перетасованной библиотеки, используя методы перетасовки генов на основе PCR.
В настоящем документе описан иллюстративный порядок проведения процесса скрининга. Библиотеки предварительных соединений-кандидатов получали из библиотек с одиночными замещениями и отбирали с точки зрения связывания с белком(ами)-мишенью, после чего библиотеки предварительных кандидатов перетасовывали с получением библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих соединения-кандидаты, которые, в свою очередь, клонировали в подходящий экспрессионный вектор, такой как фагемидная система экспрессии. Затем экспрессирующие фаг соединения-кандидаты подвергали одному или нескольким циклам отбора для улучшения желаемых свойств, таких как аффинность связывания с молекулой-мишенью. Молекулы-мишени могут быть адсорбированы или иным образом прикреплены к поверхности лунки или другого реакционного контейнера, или молекулы-мишени могут быть дериватизированы с использованием связывающего фрагмента, такого как биотин, который после инкубации со связывающими соединениями-кандидатами может быть захвачен комплементарным фрагментом, таким как стрептавидин, связанный с частицами, такими как магнитные частицы, для промывки. В иллюстративных режимах отбора, связывающие соединения-кандидаты подвергаются стадии продолжительной промывки, таким образом, выбирают только соединения-кандидаты с очень низкими скоростями диссоциации от молекулы-мишени. Иллюстративные времена промывки для таких вариантов осуществления составляют по меньшей мере 8 часов; или, в других вариантах осуществления, по меньшей мере 24 часа; или, в других вариантах осуществления, по меньшей мере 48 часов; или, в других вариантах осуществления, по меньшей мере 72 часа. Выделенные клоны после селекции амплифицировали и подвергали дополнительному циклу отбора или анализировали, например, путем секвенирования и путем проведения сравнительных измерений аффинности связывания, например, с помощью ELISA, связывания методом поверхностного плазмонного резонанса, биослойной интерферометрии (например, Octet system, ForteBio, Menlo Park, CA) или т.п.
В некоторых вариантах осуществления процесс осуществляют для идентификации одного или нескольких белков, содержащих одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, и/или мультиспецифического связывающего белка, включающего белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, с улучшенной термической стабильностью, улучшенной перекрестной реактивностью в отношении выбранного набора мишеней для связывания по сравнению с референсным CD3 -связывающим белком, таким как белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 22. Библиотеки с одиночными замещениями получали путем изменения кодонов в VH- и VL-областях референсного CD3-связывающего белка,
включая кодоны в каркасных областях и в CDR; в другом варианте осуществления локализации, в которых изменяли кодоны, содержат CDR тяжелой и легкой цепей референсного CD3-связывающего белка, или поднабор таких CDR, например, только CDR1, только CDR2, только CDR3, или их пары. В другом варианте осуществления локализации, где изменяли кодоны, возникают только в каркасных областях. В некоторых вариантах осуществления библиотека содержит замены только одного кодона из референсного CD3-связывающего белка, только в каркасных областях как VH, так и VL с нумерацией в диапазоне от 10 до 250. В другом варианте осуществления локализации, в которых изменяли кодоны, содержат CDR3 тяжелой и легкой цепей референсного CD3-связывающего белка, или поднабор таких CD3. В другом варианте осуществления число локализаций, где кодоны VH- и VL-кодирующих областей были изменены, находится в диапазоне от 10 до 250, например, до 100 локализаций находятся в каркасной области. После получения библиотеки с одиночными замещениями, как описано выше, выполняли следующие стадии: (а) экспрессия отдельно каждого члена каждой библиотеки с одиночными замещениями в качестве предварительного белка-кандидата; (Ь) отбор членов каждой библиотеки с одиночными замещениями, которые кодируют предварительные белки-кандидаты, которые связываются с партнером по связыванию, отличным от исходной мишени для связывания [например, желаемой перекрестно-реагирующей мишени(ей)]; (с) перетасовка членов выбранных библиотек в PCR с получением комбинаторной перетасованной библиотеки; (d) экспрессия членов перетасованной библиотеки в качестве CD3-связывающих белков-кандидатов; и (е) отбор членов перетасованной библиотеки один или несколько раз в отношении CD3-связывающих белков-кандидатов, которые связываются с исходным партнером по связыванию, и (f) дополнительный отбор белков-кандидатов для связывания с желаемой перекрестно-реагирующей мишенью(мишенями), тем самым обеспечивая кодируемый нуклеиновой кислотой CD3 -связывающий белок с повышенной перекрестной реактивностью для одного или нескольких веществ по отношению к референсному CD3-связывающему белку без утраты аффинности к исходному лиганду. В дополнительных вариантах осуществления способ может быть осуществлен для получения белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, с пониженной реакционной способностью в отношении выбранного перекрестно-реактивного вещества(веществ) или соединения(соединений), или эпитопа(эпитопов) путем замены стадии (f) следующей стадией: деплеция связывающих соединений-кандидатов один или несколько раз из поднабора белка-кандидата, содержащего
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, которые связываются с нежелательным перекрестно-реагирующим соединением. Фармацевтические композиции
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, содержащие описанный в настоящем документе белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, или клетку-хозяина, трансформированную этим вектором, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает, но без ограничения, любой носитель, который не препятствует эффективности биологической активности ингредиентов и не является токсичным для пациента, которому его вводят. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области и включают фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих средств, стерильные растворы и т.д. Такие носители могут быть приготовлены обычными способами и могут быть введены субъекту в подходящей дозе. Предпочтительно композиции являются стерильными. Данные композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, эмульгаторы и диспергирующие средства. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтических композиций описанный в настоящем документе белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, инкапсулируется в наночастицах. В некоторых вариантах осуществления наночастицы представляют собой фуллерены, жидкие кристаллы, липосомы, квантовые точки, сверхпарамагнитные наночастицы, дендримеры или наностержни. В других вариантах осуществления фармацевтических композиций белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, присоединен к липосомам. В некоторых случаях белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент CD3, конъюгирован с поверхностью липосом. В некоторых случаях белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент CD3, инкапсулирован в оболочку липосомы. В некоторых случаях липосома представляет собой катионную липосому.
Описанные в настоящем документе белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, рассматриваются для применения в
качестве лекарственного средства. Введение осуществляют различными способами, например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. В некоторых вариантах осуществления способ введения зависит от вида терапии и вида соединения, содержащегося в фармацевтической композиции. Режим дозирования будет определяться лечащим врачом и другими клиническими факторами. Дозирование для любого пациента зависит от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное соединение, подлежащее введению, время и путь введения, вид терапии, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. "Эффективная доза" относится к количествам активного ингредиента, которые являются достаточными, чтобы повлиять на ход и тяжесть заболевания, что приводит к уменьшению или ремиссии такой патологии и может быть определено с использованием известных способов. Способы Лечения
Также, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы и применения для стимуляции иммунной системы индивидуума, нуждающегося в этом, включающие введение белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, описанного в настоящем документе. В некоторых случаях введение описанного в настоящем документе белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, индуцирует и/или поддерживает цитотоксичность по отношению к клетке, экспрессирующей антиген-мишень. В некоторых случаях клетка, экспрессирующая антиген-мишень, представляет собой раковую или опухолевую клетку, инфицированную вирусом клетку, бактериально инфицированную клетку, аутореактивную Т- или В-клетку, поврежденные эритроциты, артериальные бляшки или фиброзную ткань.
В настоящем изобретении также предлагаются способы и применения для лечения заболевания, нарушения или состояния, связанного с антигеном-мишенью, включающие введение индивидууму, нуждающемуся в этом, описанного в настоящем документе белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3. Заболевания, нарушения или состояния, связанные с антигеном-мишенью, включают, но без ограничения, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, атеросклероз или фиброз. В других вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние, связанное с антигеном-мишенью, представляет собой пролиферативное заболевание, опухолевое заболевание, воспалительное заболевание, иммунологическое расстройство, аутоиммунное заболевание, инфекционное заболевание, вирусное заболевание, аллергическую реакцию,
паразитарную реакцию, болезнь "трансплантат против хозяина" или болезнь "хозяин против трансплантата". В одном варианте осуществления заболевание, нарушение или состояние, связанное с антигеном-мишенью, представляет собой рак. В одном случае рак представляет собой гематологический рак. В другом случае рак представляет собой рак с солидной опухолью.
Используемый в некоторых вариантах осуществления в настоящем документе термин "лечение" или "лечить" или "подвергнутый лечению" относится к терапевтическому лечению, целью которого состоит в том, чтобы замедлить (уменьшить) нежелательное физиологическое состояние, нарушение или заболевание, или для получения благоприятных или желаемых клинических результатов. Для целей, описанных в настоящем документе, благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничения, облегчение симптомов; уменьшение степени состояния, нарушения или заболевания; стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния, нарушения или заболевания; задержку начала или замедление прогрессирования состояния, расстройства или заболевания; коренное улучшение состояния, нарушения или болезненного состояния; и ремиссию (частичную или полную), будь то обнаруживаемая или необнаруживаемая, или облегчение или улучшение состояния, нарушения или заболевания. Лечение включает выявление клинически значимого ответа без чрезмерных уровней побочных эффектов. Лечение также включает продлевание выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если не было получено лечение. В других вариантах осуществления "лечение" или "лечить" или "подвергнутый лечению" относится к профилактическим мерам, цель которых состоит в задержке начала или уменьшении тяжести нежелательного физиологического состояния, нарушения или заболевания, например, у человека, который предрасположен к заболеванию (например, человек, который несет генетический маркер для заболевания, такого как рак молочной железы).
В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, вводят в комбинации со средством для лечения конкретного заболевания, нарушения или состояния. Средства включают, но без ограничения, терапии, включающие антитела, небольшие молекулы (например, химиотерапевтические препараты), гормоны (стероидные, пептидные и т.п.), радиотерапии (гамма-лучи, рентгеновские лучи и/или направленная доставка радиоизотопов, микроволновые печи, УФ-излучение и т.п.), генную терапию (например, препараты антисмысловой, антиретровирусной терапии и т.п.) и другие иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления белки, содержащие
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, вводят в комбинации с противодиарейными средствам, противорвотными средствами, анальгетиками, опиоидами и/или нестероидными противовоспалительными средствами. В некоторых вариантах осуществления белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, вводят до, во время или после хирургической операции.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Идентификация анти-СРЗ scFv вариантов с различной аффинностью к человеческим CD3s
Характеристика исходного anmu-CD3s фага
Исходный анти-СОЗ s показал хорошее связывание с 6HOTHH-CD3S И низкое связывание с биотин-HSA (ФИГ. 1).
Anmu-CD3s scFv фаговые библиотеки
Библиотека с одиночными замещениями была обеспечена для доменов CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи. Аминокислотные остатки, изменяющиеся в каждом домене, проиллюстрированы в затененной области на ФИГ. 2. Остатки изменяли по одному посредством NNN мутагенеза.
Выбор клонов и определение аффинности связывания
Библиотеки с одиночными замещениями связывали с биотинилированным hu-CD3s, промывали, элюировали и подсчитывали. Биотинилированный cynoCD3 (яванского макака) использовали в качестве мишени для отбора первого раунда и промывали в течение 4 часов после комбинаторного связывания фагов из двух независимых библиотек (выбор ~2х). Биотинилированные huCD3 (человека) использовали в качестве мишени для отбора второго раунда и промывали в течение 3 часов после связывания обеих библиотек (выбор <2х). Вставки, привнесенные посредством PCR из второго раунда отбора, субклонировали в экспрессирующий вектор pcDNA3.4 His6 ("His6" раскрыт как SEQ ГО NO: 105). Отбирали 180 клонов, и ДНК очищали, секвенировали и трансфицировали в Expi293. Панель из шестнадцати клонов с диапазоном аффинностей для человеческого CD3s была выбрана для более точного определения Kd (ФИГ. 3). Пример 2: Анализ цитотоксичности
Биспецифическое антитело, направленное против CD20 и CD3, содержащее вариант анти-СОЗ scFv, идентифицированный в Примере 1, оценивали in vitro на его посредничество в зависимой от Т-клеток цитотоксичности по отношению к CD20+ клеткам-мишеням.
Флуоресцентно-меченые CD20+ клетки REC-1 (линия мантийноклеточной лимфомы, АТСС CRL-3004) инкубировали с выделенными РВМС случайных доноров или Т-клетками СВ15 (стандартизованная линия Т-клеток) в качестве эффекторных клеток в присутствии CD20-CD3 биспецифичесского антитела, содержащего вариант анти-СОЗ scFv, идентияицированный в Примере 1. После инкубации в течение 4 ч при 37°С в инкубаторе с увлажнением, высвобождение флуоресцентного красителя из клеток-мишеней в супернатант определяли в спектрофлуориметре. Клетки-мишени, инкубированные без D20-CD3 биспецифического антитела, содержащего вариант анти-СОЗ scFv, идентифицированный в Примере 1, и клетки-мишени, полностью лизированные при добавлении сапонина в конце инкубации, служили в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно.
На основании измеренных оставшихся живых клеток-мишеней рассчитывали процент специфического лизиса клеток в соответствии со следующей формулой: [1-(число живых мишеней(образце)/число живых мишеней(самопроизвольно))] х 100%. Сигмовидные кривые зависимости ответа от дозы и значения ЕС50 рассчитывали с помощью нелинейной регрессии/аппроксимации 4-параметрической логистической модели с использованием программного обеспечения GraphPad. Значения лизиса, полученные для данной концентрации варианта, использовали для расчета сигмоидальных кривых дозы-ответа с помощью анализа аппроксимации 4-параметрической логистической модели с использованием программного обеспечения Prism.
Пример 3: Термическая стабильность анти-СРЗ scFv вариантов с различной аффинностью к человеческим CD3s
Температура гидрофобного воздействия (Ть) белка соответствует производному точки перегиба пиковой флуоресценции красителя и, как известно, коррелирует с температурой плавления (Тш), которая является показателем стабильности белка. Целью данного исследования являлась оценка Ть для нескольких вариантов scFv против CD3s человека. Получение белка
Последовательности анти-человеческих CD3E SCFV связывающих доменов клонировали в вектор pcDNA3.4 (Invitrogen), с предшествующей лидерной последовательностью и последующей последовательностью 6х Histidine tag (SEQ Ш NO: 105). Клетки Expi293F (Life Technologies A14527) поддерживали в суспензии в колбах для оптимального роста (Thomson) в количестве от 0,2 до 8 х 1Е6 клеток/мл в среде для роста Expi 293. Очищенную плазмидную ДНК трансфицировали в клетки Expi293F в соответствии с протоколами Expi293 Expression System Kit (Life Technologies, A14635) и
выдерживали в течение от 4 до 6 дней после трансфекции. Кондиционированные среды частично очищали аффинной и обессоливающей хроматографией. Анти-человеческие CD3s scFv белки концентрировали в устройствах для центробежной фильтрации Amicon Ultra (EMD Millipore), наносили на среду Superdex 200 (GE Healthcare) для хроматографии исключения по размеру и элюировали в нейтральном буфере, содержащем наполнители. Собранные фракции и окончательную чистоту оценивали с помощью SDS-PAGE и аналитической SEC (эксклюзионной хроматографии). Поглощение растворов очищенного белка определяли при 280 нм с использованием SpectraMax М2 (Molecular Devices) и прозрачных для ультрафиолетовых лучей 96-луночных планшетов (Corning 3635) и их концентрации рассчитывали из молярных коэффициентов экстинкции. Дифференциальная сканирующая флуориметрия
Очищенные анти-человеческие CD3s scFv белки разводили до концентраций в диапазоне от 0,2 до 0,25 мг/мл вместе с 5х красителем оранжевым SYPRO (Life Technologies S6651) в конечной концентрации 0,15% DMSO в нейтральном буфере, содержащем вспомогательные вещества, в оптических микропланшетах с адгезивной пленкой MicroAmp EnduraPlate (Applied Biosystems 4483485 и 4311971). Планшет, содержащий смеси разведенного белка и красителя, нагружали на прибор для проведения Fast real-time PCR (Applied Biosytems) и подвергали многоступенчатому градиенту температуры от 25 °С до 95 °С. Температурный градиент состоял из выдержки в течение двух минут при каждом градусе по Цельсию при длине волны возбуждения 500 нм, и эмиссию регистрировали с помощью фильтра ROX. На ФИГ. 4 Ть в градусах по Цельсию показана для нескольких очищенных вариантов белка, содержащего scFv против человеческого CD3s.
SEOID NO:
Описание
АА Последовательность
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGS
НС CDR1 с положениями вариантов
GX1X2X3NX4YX5X6N
НС CDR2 с положениями вариантов
RIR S Х7 Xs N Х9 Y Хю Т Хп Y Xi2 D Xi3 V К
НС CDR3 с положениями вариантов
Н Х14 N F Х15 Xie S Хп I S Y W A Xi8
LC CDR1 с положениями вариантов
X19 X20 X21 X22 G X23 V X24 X25 G X26 YPN
LC CDR2 с положениями вариантов
G X27 X28 X29 X30 X31 P
LC CDR3 с положениями
вариантов
Х32 L W Y Х33 N Х34 W Х35
AHTH-CD3, клон 2В2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGL
EWVAmRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKT
EDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQ
KPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAE
YYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 9F2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFEFNKYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKYNKYATYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSFGAVTSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCVLWYDNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 5А2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKYNNYATYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSHISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGYVTSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTSFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEA
EYYCVLWYSNRWIFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 6А2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFMFNKYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKSNNY ATYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWATWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSFGAVTSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTKLLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCVLWYSNSWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 2D2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGL
EWVARIRSKYNNY ATYYKD S VKDRFTISRDD SKNT AYLQMNNLKT
EDTAVYYCVRHGNFGNSPISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVVSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTEFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEA
EYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 3F2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTYNKYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKYNNYATYYADEVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSPISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSKGAVTSGNYPNWV
QQKPGQAPRGLIGGTKELAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPED
EAE YYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 1А2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGNTFNKYAMNWVRQAPGKG LEW VARIRSKYNNYETYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK TEDTAVYYCVRHTNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTYFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE AEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTII-CD3, КЛОН 1C2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKG
LEWVAmRSKYNNYATYYADAVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSQISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTDGNYPNWV
QQKPGQAPRGLIGGIKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 2Е4
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAVNWVRQAPGKGL
EW VARIRSKYNNY ATYY AD S VKDRFTISRDD SKNT AYLQMNNLKT
EDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGESTGAVTSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTKILAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEA
EYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 10Е4
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYPMNWVRQAPGKGL
EW VARIRSKYNNY ATYY AD S VKDRFTISRDD SKNT AYLQMNNLKN
EDTAVYYCVRHGNFNNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTKGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTKMLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 2Н2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKYNNYATYYADEVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSPISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVVSGNYPNWV
QQKPGQAPRGLIGGTEFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 2А4
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGNTFNKYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKYNNYATYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGDSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTHGNYPNWV
QQKPGQAPRGLIGGTKVLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPED
EAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 10В2
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSGYNNYATYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSYTGAVTSGNYPNWV
QQKPGQAPRGLIGGTKFNAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPED
EAEYYCVLWYANRWVFGGGTKLTVL
AHTH-CD3, клон 1G4
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFEFNKYAMNWVRQAPGKG LEW VARIRSKYNNYETYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK TEDTAVYYCVRHGNFGNSLISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSSGAVTSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTKFGAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
wt анти-СБЗ
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKG
LEWVARIRSKYNNYATYY AD S VKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLK
TEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE
AEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
wt анти-СБЗ HC CDR1
GFTFNKYAMN
wt анти-СБЗ HC CDR2
RIRSKYNNY ATYY AD S VK
wt анти-СОЗ HC CDR3
HGNFGNSYISYWAY
wt анти-СОЗ LC CDR1
GSSTGAVTSGNYPN
wt анти-СОЗ LC CDR2
GTKFLAP
wt анти-СОЗ LC CDR3
VLWYSNRWV
HC CDR1 вариант 1
GNTFNKYAMN
HC CDR1 вариант 2
GFEFNKYAMN
HC CDR1 вариант 3
GFMFNKYAMN
HC CDR1 вариант 4
GFTYNKYAMN
HC CDR1 вариант 5
GFTFNNYAMN
HC CDR1 вариант 6
GFTFNGYAMN
HC CDR1 вариант 7
GFTFNTYAMN
HC CDR1 вариант 8
GFTFNEYAMN
HC CDR1 вариант 9
GFTFNKYPMN
HC CDR1 вариант 10
GFTFNKYAVN
HCCDR1 вариант 11
GFTFNKYAIN
HC CDR1 вариант 12
GFTFNKYALN
HC CDR2 вариант 1
RIRSGYNNYATYYADSVK
HC CDR2 вариант 2
RIRSKSNNYATYYADSVK
HC CDR2 вариант 3
RIRSKYNKY ATYY AD S VK
HC CDR2 вариант 4
RIRSKYNNYETYY AD S VK
HC CDR2 вариант 5
RIRSKYNNY ATEYADSVK
HC CDR2 вариант 6
RIRSKYNNY ATYYKDSVK
HC CDR2 вариант 7
RIRSKYNNY ATYY ADEVK
HC CDR2 вариант 8
RIRSKYNNY ATYY ADAVK
HC CDR2 вариант 9
RIRSKYNNY ATYY ADQVK
HC CDR2 вариант 10
RIRSKYNNY ATYY ADDVK
HC CDR3 вариант 1
HANFGNSYISYWAY
HC CDR3 вариант 2
HTNFGNSYISYWAY
HC CDR3 вариант 3
HGNFNNSYISYWAY
HC CDR3 вариант 4
HGNFGD SYISYWAY
HC CDR3 вариант 5
HGNFGNSHISYWAY
НС CDR3 вариант 6
HGNFGNSPISYWAY
НС CDR3 вариант 7
HGNFGNSQISYWAY
НС CDR3 вариант 8
HGNFGNSLISYWAY
НС CDR3 вариант 9
HGNFGNSGISYWAY
НС CDR3 вариант 10
HGNFGNSYISYWAT
LC CDR1 вариант 1
ASSTGAVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 2
GESTGAVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 3
GSYTGAVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 4
GSSFGAVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 5
GSSKGAVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 6
GSSSGAVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 7
GSSTGYVTSGNYPN
LC CDR1 вариант 8
GSSTGAVVSGNYPN
LC CDR1 вариант 9
GSSTGAVTDGNYPN
LC CDR1 вариант 10
GSSTGAVTKGNYPN
LC CDR1 вариант 11
GS STG A VTHGNYPN
LC CDR1 вариант 12
GS STGAVTVGNYPN
LC CDR1 вариант 13
GSSTGAVTSGYYPN
LC CDR2 вариант 1
GIKFLAP
LC CDR2 вариант 2
GTEFLAP
LC CDR2 вариант 3
GTYFLAP
LC CDR2 вариант 4
GTSFLAP
LC CDR2 вариант 5
GTNFLAP
LC CDR2 вариант 6
GTKLLAP
LC CDR2 вариант 7
GTKELAP
LC CDR2 вариант 8
GTKILAP
LC CDR2 вариант 9
GTKMLAP
LC CDR2 вариант 10
GTKVLAP
LC CDR2 вариант 11
GTKFNAP
LC CDR2 вариант 12
GTKFGAP
LC CDR2 вариант 13
GTKFLVP
LC CDR3 вариант 1
TLWYSNRWV
LC CDR3 вариант 2
ALWYSNRWV
LC CDR3 вариант 3
VLWYDNRWV
LC CDR3 вариант 4
VLWYANRWV
LC CDR3 вариант 5
VLWYSNSWV
LC CDR3 вариант 6
VLWYSNRWI
LC CDR3 вариант 7
VLWYSNRWA
Анти-СОЗ, KTOH2G5
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYALNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNY ATEY AD S VKDRFTISRDD SKNT AYLQMNNLKT
EDTAVYYCVRHGNFGNSPISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQ KPGQAPRGLIGGTNFLAPGTPERFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAE YYCVLWYSNRWAFGGGTKLTVL
AHTII-CD3, клон 8А5
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNEYAMNWVRQAPGKGL
EWVAmRSKYNNYATYYADDVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKT
EDTAVYYCVRHGNFGNSGISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTVGNYPNWVQ
QKPGQAPRGLIGGTEFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEA
EYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
Иллюстративная линкерная последовательность
(GS)n
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGS)n
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGGS)n
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGSG)n
100
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGSGG)n
101
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGGGS)n
102
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGGGG)n
103
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGG)n
104
Иллюстративная линкерная последовательность
(GGGGS)4
105
6Х Histidine
FfflHHHH
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ХАРПУН ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
<120> БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ ВАРИАБЕЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С CD3
<130> 47517-704.601
<140> <141>
<150> 62/339,685
<151> 2016-05-20 <160> 105
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 2 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Phe или Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Thr, Glu или Met
<220>
<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe или Tyr
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> Lys, Thr, Gly, Asn или Glu
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Ala или Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Met, Leu, Val или Ile
<400> 2
Gly Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Asn
1 5 10
<210> 3 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Lys или Gly
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> Tyr или Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Asn или Lys
<220>
<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ala или Glu
<220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Tyr или Glu
<220>
<221> MOD_RES <222> (14)..(14)
<223> Ala или Lys
<220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16)
<223> Ser, Glu, Asp, Ala или Gln
<400> 3
Arg Ile Arg Ser Xaa Xaa Asn Xaa Tyr Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Asp Xaa
1 5 10 15
Val Lys
<210> 4 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Gly, Ala или Thr
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Gly или Asn
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> Asn или Asp
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Tyr, His, Pro, Gln, Leu или Gly
<220>
<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Tyr или Thr
<400> 4
His Xaa Asn Phe Xaa Xaa Ser Xaa Ile Ser Tyr Trp Ala Xaa
1 5 10
<210> 5 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Gly или Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2)
<223> Ser или Glu
<220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3)
<223> Ser или Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Thr, Phe, Lys или Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ala или Tyr
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Thr или Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (9)..(9)
<223> Ser, Asp, Lys, His или Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11)
<223> Asn или Tyr
<400> 5
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Val Xaa Xaa Gly Xaa Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 6 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr или Ile
<220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3)
<223> Lys, Glu, Tyr, Asn или Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (4)..(4)
<223> Phe, Leu, Glu, Ile, Met или Val
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Ile, Asn или Gly
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ala или Val
<400> 6
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 1 5
<210> 7 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Val, Thr или Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Ser, Asp или Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)..(7)
<223> Arg или Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Val, Ile или Ala
<400> 7
Xaa Leu Trp Tyr Xaa Asn Xaa Trp Xaa 1 5
<210> 8 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 9 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Asp Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 10 <211> 249 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser His Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Ser Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ile Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 11 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Leu Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Ser Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 12 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Lys Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Val Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Glu Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 13 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Glu Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Lys Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Glu Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 14 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Tyr Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 15 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ala Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gln Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Asp Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Ile Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Glu Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Ile Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 17 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Asn Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Lys Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Met Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 18 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Glu Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Val Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Glu Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 19 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr His Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Val Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 20 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Tyr Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Asn Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ala Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 21 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Leu Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Gly Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 22 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 23 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 23
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 24 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 24
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 25 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 25
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 26 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 26
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 27 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 27
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro 1 5
<210> 28 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 28
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5
<210> 29 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 29
Gly Asn Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 30 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 30
Gly Phe Glu Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 31 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
<400> 31
Gly Phe Met Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 32 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 32
Gly Phe Thr Tyr Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 33 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 34 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Asn Gly Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 35 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 35
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Asn Glu Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 37 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 37
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Pro Met Asn
1 5 10
<210> 38 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 38
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Val Asn
1 5 10
<210> 39 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 39
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 40 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Leu Asn
1 5 10
<210> 41 <211> 18 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 41
Arg Ile Arg Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 42 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 42
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 43 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 43
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 44 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 44
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 45
<211> 18 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 45
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 46
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 46
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Lys Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys
<210> 47
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 47
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Val Lys
<210> 48 <211> 18 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 48
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala
1 5 10 15
Val Lys
<210> 49
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 49
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Gln
1 5 10 15
Val Lys
<210> 50 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 50
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp
1 5 10 15
Val Lys
<210> 51 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<400> 51
His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 52 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 52
His Thr Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 53 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 53
His Gly Asn Phe Asn Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 54 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 54
His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 55 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 55
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser His Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 56
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 57
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gln Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 58 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 58
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Leu Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 59 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 59
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gly Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 60 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Thr
1 5 10
<210> 61 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 61
Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 62 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 62
Gly Glu Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 63 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 63
Gly Ser Tyr Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 64 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 64
Gly Ser Ser Phe Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 65 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 65
Gly Ser Ser Lys Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 66 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 66
Gly Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 67 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 67
Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 68 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 68
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Val Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 69 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 69
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Asp Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 70 <211> 14 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 70
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Lys Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 71 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 71
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr His Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 72 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 72
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Val Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 73 <211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 73
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 74 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 74
Gly Ile Lys Phe Leu Ala Pro 1 5
<210> 75 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 75
Gly Thr Glu Phe Leu Ala Pro 1 5
<210> 76
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 76
Gly Thr Tyr Phe Leu Ala Pro 1 5
<210> 77 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 77
Gly Thr Ser Phe Leu Ala Pro 1 5
<210> 78
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 78
Gly Thr Asn Phe Leu Ala Pro 1 5
<210> 79
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 79
Gly Thr Lys Leu Leu Ala Pro 1 5
<210> 80 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 80
Gly Thr Lys Glu Leu Ala Pro 1 5
<210> 81 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 81
Gly Thr Lys Ile Leu Ala Pro 1 5
<210> 82 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 82
Gly Thr Lys Met Leu Ala Pro 1 5
<210> 83 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
<400> 83
Gly Thr Lys Val Leu Ala Pro 1 5
<210> 84 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 84
Gly Thr Lys Phe Asn Ala Pro 1 5
<210> 85 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 85
Gly Thr Lys Phe Gly Ala Pro 1 5
<210> 86 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 86
Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro 1 5
<210> 87 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 87
Thr Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 88
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5
<210> 89 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 89
Val Leu Trp Tyr Asp Asn Arg Trp Val 1 5
<210> 90 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 90
Val Leu Trp Tyr Ala Asn Arg Trp Val 1 5
<210> 91 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 91
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Ser Trp Val 1 5
<210> 92 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ile 1 5
<210> 93 <211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 93
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ala 1 5
<210> 94 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Pro Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Asn Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Ala Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 95 <211> 249
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Asp Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Gly Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Val Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Glu Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245
<210> 96
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 96
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser 20
<211> 30
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 97
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 98 <211> 40
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Gly Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 98
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40
<210> 99 <211> 40
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Gly Ser Gly" повторяющихся звеньев
<400> 99
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40
<210> 100 <211> 50
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Gly Ser Gly Gly" повторяющихся звеньев
<400> 100
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly 50
<210> 101 <211> 50
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220> <221> <222>
MISC_FEATURE (1)..(50)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Gly Gly Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 101
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser 50
<210> 102 <211> 50
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50)
<223> Эта последовательность может включать 1-10 "Gly Gly Gly Gly Gly" повторяющихся звеньев
<400> 102
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly 50
<210> 103 <211> 30
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 104 <211> 20 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 104
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser 20
<210> 105
<211> 6 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая метка 6xHis
<400> 105
His His His His His His 1 5
Формула изобретения
1. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL) и линкер, при этом VH содержит определяющие комплементарность области НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3, при этом VL содержит определяющие комплементарность области LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3, где
(a) аминокислотная последовательность НС CDR1 представлена в GX1X2X3NX4YX5X6N (SEQ ID N0. 2), Xi представляет собой фенилаланин или аспарагин, Х2 представляет собой треонин, глутаминовую кислоту или метионин, Хз представляет собой фенилаланин или тирозин, Х4 представляет собой лизин, треонин, глицин, аспарагин или глутаминовую кислоту, Х5 представляет собой аланин или пролин, Хб представляет собой метионин, лейцин, валин или изолейцин;
(b) аминокислотная последовательность НС CDR2 представлена в RIRSX7X8NX9YX10TX11YX12DX13VK (SEQ ГО N0. 3), Х7 представляет собой лизин или глицин, Х8 представляет собой тирозин или серии, Х9 представляет собой аспарагин или лизин, Хю представляет собой аланин или глутаминовую кислоту, Хп представляет собой тирозин или глутаминовую кислоту, Х12 представляет собой аланин или лизин, Х13 представляет собой серии, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аланин или глутамин;
(c) аминокислотная последовательность НС CDR3 представлена в HX14NFX15 X16SX17ISYWAX18 (SEQ ГО N0. 4), Х14 представляет собой глицин, аланин или треонин, Х15 представляет собой глицин или аспарагин, Xi6 представляет собой аспарагин или аспарагиновую кислоту, Хп представляет собой тирозин, гистидин, пролин, глутамин, лейцин или глицин, Xis представляет собой тирозин или треонин;
(d) аминокислотная последовательность LC CDR1 представлена в X19X20X21X22GX23VX24X25GX26YPN (SEQ ГО N0. 5), Х19 представляет собой глицин или аланин, Х20 представляет собой серии или глутаминовую кислоту, Х21 представляет собой серии или тирозин, Х22 представляет собой треонин, фенилаланин, лизин или серии, Х23 представляет собой аланин или тирозин, Х24 представляет треонин или валин, Х25 представляет собой серии, аспарагиновую кислоту, лизин, гистидин или валин, Х26 представляет собой аспарагин или тирозин;
(e) аминокислотная последовательность LC CDR2 представлена в GX27X28X29X30X31P (SEQ ГО N0. 6), Х27 представляет собой треонин или изолейцин, Х28 представляет собой лизин, глутаминовую кислоту, тирозин, аспарагин или серии, Х29
(a)
представляет фенилаланин, лейцин, глутаминовую кислоту, изолейцин, метионин или валин, Хзо представляет собой лейцин, аспарагин или глицин, Х31 представляет собой аланин или валин; и
(f) аминокислотная последовательность LC CDR3 представлена в X32LWYX33NX34WX35 (SEQ ID N0. 7), Х32 представляет собой валин, треонин или аланин, Хзз представляет собой серии, аспарагиновую кислоту или аланин, Х34 представляет собой аргинин или серии, Х35 представляет собой валин, изолейцин или аланин, где Xi, Х2, Хз,
Х4, Х5, Хб, Х7, Х8, Х9, Хю, Хп, Xl2, Xl3, Х14, Xl5, Xl6, Xl7, Xl8, X19, X20, X21, X22, X23, X24,
X25, X26, X27, X28, X29, Хзо, X31, X32, X33, X34 и X35 не являются одновременно фенилаланином, треонином, фенилаланином, лизином, аланином, метионином, лизином, тирозином, аспарагином, аланином, тирозином, аланином, серином, глицином, глицином, аспарагином, тирозином, тирозином, глицином, серином, серином, треонином, аланином, треонином, серином, аспарагином, треонином, лизином, фенилаланином, лейцином, аланином, валином, серином, аргинином и валином, соответственно.
2. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, отличающийся тем, что указанный белок имеет следующую формулу:
f 1 -г 1 -f2-r2-f3 -гЗ -f4-r4-f5 -r5 -f6-r6-f7, где rl представляет собой SEQ ГО N0: 2; г2 представляет собой SEQ ГО N0: 3; гЗ представляет собой SEQ ГО N0: 4; г4 представляет собой SEQ ГО N0:5; г5 представляет собой SEQ ГО N0:6; и гб представляет собой SEQ ГО N0:7; и где fi, f2, f3, U и fs представляют собой каркасные остатки, выбранные таким образом, что указанный белок является по меньшей мере на восемьдесят процентов идентичным аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ГО N0: 22.
3. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 2, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 29, SEQ ГО N0. 30, SEQ ГО N0. 31, SEQ ГО N0. 32, SEQ ГО N0. 33, SEQ ГО N0. 34, SEQ ГО N0. 35, SEQ ГО N0. 36, SEQ ГО N0. 37, SEQ ГО N0.38, SEQ ГО N0. 39 или SEQ ГО N0. 40.
4. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 2, отличающийся тем, что г2 представляет собой SEQ ГО N0. 41, SEQ ГО N0. 42, SEQ ГО N0. 43, SEQ ГО N0. 44, SEQ ГО N0. 45, SEQ ГО N0. 46, SEQ ГО N0. 47, SEQ ГО N0. 48, SEQ ГО N0. 49 или SEQ ГО N0. 50.
5. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 2, отличающийся тем, что гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 51, SEQ Ш N0. 52, SEQ ID N0. 53, SEQ ГО N0. 54, SEQ ГО N0. 55, SEQ ГО N0. 56, SEQ ГО N0. 57, SEQ ГО N0. 58, SEQ ГО N0. 50 или SEQ ГО N0. 60.
6. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 2, отличающийся тем, что г4 представляет собой SEQ ГО N0. 61, SEQ ГО N0. 62, SEQ ГО N0. 63, SEQ ГО N0. 64, SEQ ГО N0. 65, SEQ ГО N0. 66, SEQ ГО N0. 67, SEQ ГО N0. 68, SEQ ГО N0. 69, SEQ ГО N0. 70, SEQ ГО N0. 71, SEQ ГО N0. 72 или SEQ ГО N0. 73.
7. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 2, отличающийся тем, что г5 представляет собой SEQ ГО N0. 74, SEQ ГО N0. 75, SEQ ГО N0. 76, SEQ ГО N0. 77, SEQ ГО N0. 78, SEQ ГО N0. 79, SEQ ГО N0. 80, SEQ ГО N0. 81, SEQ ГО N0. 82, SEQ ГО N0. 83, SEQ ГО N0. 84, SEQ ГО N0. 85 или SEQ ГО N0. 86.
8. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 2, отличающийся тем, что гб представляет собой SEQ ГО N0. 87, SEQ ГО N0. 88, SEQ ГО N0. 89, SEQ ГО N0. 90, SEQ ГО N0. 91, SEQ ГО N0. 92 или SEQ ГО N0. 93.
9. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 39, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 49, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 51, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 61, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 86 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 87.
10. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 30, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 43, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 64 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 89.
11. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 55,
12. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 31, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 42, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 60, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 64, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 79 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 91.
13. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 35, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 46, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 56, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 68 и г5 представляет собой SEQ ГО N0. 75.
14. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 32, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 47, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 56, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 65, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 80 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 87.
15. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 29, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 44, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 52, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 73 и г5 представляет собой SEQ ГО N0. 76.
16. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 33, г2 представляет собой SEQ ГО N0. 48, гЗ представляет собой SEQ ГО N0. 57, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 69 и г5 представляет собой SEQ ГО N0. 74.
17. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ ГО N0. 38, г4 представляет собой SEQ ГО N0. 62 и г5 представляет собой SEQ ГО N0. 81.
18. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 37, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 53, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 70, г5 представляет собой SEQ Ш N0. 82 и гб представляет собой SEQ Ш N0. 88.
19. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 34, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 47, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 56, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 68 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 75.
20. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 29, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 54, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 71 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 83.
21. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 33, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 41, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 63, г5 представляет собой SEQ Ш N0. 84 и гб представляет собой SEQ Ш N0. 90.
22. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 30, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 44, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 58, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 66 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 85.
23. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 40, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 45, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 56, г5 представляет собой SEQ Ш N0. 78 и гб представляет собой SEQ Ш N0. 93.
24. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что rl представляет собой SEQ Ш N0. 36, г2 представляет собой SEQ Ш N0. 50, гЗ представляет собой SEQ Ш N0. 59, г4 представляет собой SEQ Ш N0. 72 и г5 представляет собой SEQ Ш N0. 75.
25. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0. 8, SEQ ГО N0. 9, SEQ ГО N0. 10, SEQ ГО N0. 11, SEQ ГО N0. 12, SEQ ГО N0. 13, SEQ ГО N0. 14, SEQ ГО N0. 15, SEQ ГО N0. 16, SEQ ГО N0. 17, SEQ ГО N0. 18, SEQ ГО N0. 19, SEQ ГО N0. 20, SEQ ГО N0. 21, SEQ ГО NO. 94HSEQIDNO. 95.
26. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, отличающийся тем, что указанный линкер содержит аминокислотную последовательность, представленную в GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ГО NO: 1).
27. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что указанный белок связывается с CD3, выбранным из человеческого CD3 и CD3 яванского макака.
28. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 и CD3 яванского макака с сопоставимой аффинностью связывания (Kd).
29. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 со значением Kd человека (hKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 200 нМ, и с CD3 яванского макака со значением Kd яванского макака (cKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 300 нМ.
30. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ, от около 6 нМ до около 10 нМ, от около 11 нМ до около 20 нМ, от около 25 нМ до около 40 нМ, от около 40 нМ до около 60 нМ, от около 70 нМ до около 90 нМ, от около 100 нМ до около 120 нМ, от около 125 нМ до около 140 нМ, от около 145 нМ до около 160 нМ, от около 170 нМ до около 200 нМ, от около 210 нМ до около 250 нМ, от около 260 нМ до около 300 нМ.
31. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
32. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
33. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
34. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
35. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
36. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 8, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
37. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 8, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
38. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 9, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
39. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 9, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
40. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 10, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
41. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 10, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
42. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 11, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
43. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 11, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
44. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 12, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
45. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 12, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ.
46. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 13, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
47. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет
48. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 14, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
49. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 14, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
50. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 15, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
51. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 15, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 25 нМ до около 40 нМ.
52. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 16, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО N0. 22).
53. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 16, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
54. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 17, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
55. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 17, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 40 нМ до около 60 нМ.
56. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 18, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО N0. 22).
57. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 18, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
58. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 19, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО N0. 22).
59. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 19, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 40 нМ до около 60 нМ.
60. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 20, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
61. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 20, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
62. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 21, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ID NO. 22).
63. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО NO. 21, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 125 нМ до около 140 нМ.
64. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО NO. 94, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по
65. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 94, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
66. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-27 и 31-35, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО NO. 95, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ГО NO. 22).
67. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО NO. 95, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
68. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, содержащий последовательность, представленную в SEQ ГО NO. 22 (wt анти-СБЗ), при этом один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных положений 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 и 239, являются замещенными,
где
аминокислотное положение 27 замещено аспарагином,
аминокислотное положение 28 замещено глутаминовой кислотой или метионином, аминокислотное положение 29 замещено тирозином,
аминокислотное положение 31 замещено аспарагином, глицином, глутаминовой кислотой или треонином,
аминокислотное положение 33 замещено пролином,
аминокислотное положение 55 замещено серином, аминокислотное положение 57 замещено лизином, аминокислотное положение 59 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 61 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 63 замещено лизином,
аминокислотное положение 65 замещено аспарагиновой кислотой, глутаминовой
кислотой, аланином или глутамином,
аминокислотное положение 102 замещено аланином или треонином, аминокислотное положение 105 замещено аспарагином, аминокислотное положение 106 замещено аспарагиновой кислотой, аминокислотное положение 108 замещено гистидином, пролином, глутамином,
глицином или лейцином,
аминокислотное положение 114 замещено треонином, аминокислотное положение 163 замещено аланином, аминокислотное положение 164 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 165 замещено тирозином,
аминокислотное положение 166 замещено фенилаланином, лизином или серином, аминокислотное положение 168 замещено тирозином, аминокислотное положение 170 замещено валином,
аминокислотное положение 171 замещено аспарагиновой кислотой, лизином, валином или гистидином,
аминокислотное положение 173 замещено тирозином, аминокислотное положение 193 замещено изолейцином,
аминокислотное положение 194 замещено глутаминовой кислотой, тирозином,
аспарагином или серином,
аминокислотное положение 195 замещено лейцином, глутаминовой кислотой,
изолейцином, метионином или валином,
аминокислотное положение 196 замещено аспарагином или глицином, аминокислотное положение 197 замещено валином, аминокислотное положение 231 замещено треонином или аланином, аминокислотное положение 23 5 замещено аспарагиновой кислотой или аланином, аминокислотное положение 237 замещено серином и аминокислотное положение 239 замещено аланином или изолейцином.
69. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68, содержащий одно или несколько дополнительных замещений в аминокислотных положениях, отличных от положений 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235,237и239.
70. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 27.
71. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 28.
72. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 29.
73. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 31.
74. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 33.
75. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 34.
76. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 54.
77. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 55.
78. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 57.
69.
79. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 63.
80. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 65.
81. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 102.
82. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 105.
83. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 106.
84. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 108.
85. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 114.
86. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 163.
87. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 164.
69.
88. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 168.
89. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 170.
90. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 171.
91. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 173.
92. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 193.
93. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 194.
94. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 195.
95. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 196.
96. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 197.
97. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 231.
69.
98. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 239.
99. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 65, 102, 163, 197 и 231 являются замещенными.
100. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 57, 166 и 235 являются замещенными.
101. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 108, 168, 194 и 239 являются замещенными.
102. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 55, 114, 166, 195 и 237 являются замещенными.
103. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 63, 108, 170 и 194 являются замещенными.
104. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 29, 65, 108, 166, 195 и 231 являются замещенными.
105. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 27, 59, 102, 173 и 194 являются замещенными.
69.
106. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 193 являются замещенными.
107. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 164 и 195 являются замещенными.
108. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 33,
105, 171, 195 и 231 являются замещенными.
115. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 170 и 194 являются замещенными.
116. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 27,
106, 171 и 195 являются замещенными.
117. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 54, 165, 196 и 235 являются замещенными.
118. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 59, 108, 166 и 196 являются замещенными.
119. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 61, 108, 194 и 239 являются замещенными.
120. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-104, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 194 являются замещенными.
117.
121. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-120, отличающийся тем, что указанный белок связывается с CD3, выбранным из человеческого CD3 и CD3 яванского макака.
122. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 и CD3 яванского макака с сопоставимой аффинностью связывания (Kd).
123. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-122, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 со значением Kd человека (hKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 200 нМ, и с CD3 яванского макака со значением Kd яванского макака (cKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 300 нМ.
124. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 123, отличающийся тем, что значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ, от около 6 нМ до около 10 нМ, от около 11 нМ до около 20 нМ, от около 25 нМ до около 40 нМ, от около 40 нМ до около 60 нМ, от около 70 нМ до около 90 нМ, от около 100 нМ до около 120 нМ, от около 125 нМ до около 140 нМ, от около 145 нМ до около 160 нМ, от около 170 нМ до около 200 нМ, от около 210 нМ до около 250 нМ, от около 260 нМ до около 300 нМ.
125. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
126. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем
117.
127. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
128. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
129. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается с CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
130. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 65, 102, 163, 197 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
131. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 65, 102, 163, 197 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
117.
132. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 57, 166 и 235 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
133. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 57, 166 и 23 5 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
134. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 108, 168, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
135. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 108, 168, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
136. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 55, 114, 166, 195 и 237 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
137. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 55, 114, 166, 195 и 237 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
117.
138. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 63, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
139. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 63, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ.
140. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 29, 65, 108, 166, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
141. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 29, 65, 108, 166, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ.
142. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 27, 59, 102, 173 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
143. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 27, 59, 102, 173 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
117.
положения 31, 65, 108, 171 и 193 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
145. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 193 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 25 нМ до около 40 нМ.
146. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 164 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
147. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 164 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
148. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 33, 105, 171, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
149. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 33, 105, 171, 195 и 231 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 40 нМ до около 60 нМ.
150. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd
145.
151. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 170 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
152. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 27, 106, 171 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
153. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 27, 106, 171 и 195 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 40 нМ до около 60 нМ.
154. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 54, 165, 196 и 235 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
155. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 54, 165, 196 и 235 являются замещенными (10В2), и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
156. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 59, 108, 166 и 196 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
145.
157. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 28, 59, 108, 166 и 196 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 125 нМ до около 140 нМ.
158. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 61, 108, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
159. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 34, 61, 108, 194 и 239 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
160. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
161. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 68-124, отличающийся тем, что аминокислотные положения 31, 65, 108, 171 и 194 являются замещенными, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
162. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, при этом указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в wt anti-CD3 (SEQ Ш NO: 22), которая содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL), линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 1), при этом VH содержит определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3, VL содержит определяющие комплементарность области LC CDR1, LC CDR2 и LC
145.
CDR3, содержащие по меньшей мере одну мутацию в CDR1, CDR2 или CDR3 VH, и LC CDR1, LC CDR2 или LC CDR3 VL, и по меньшей мере одна мутация не находится в аминокислотных положениях 26, 30, 32, 35, 50, 51, 52, 53, 56, 58, 60, 62, 64, ,66, 67, 101, 103, 104, 107, 109, ПО, 111, 112, 113, 167, 169, 172, 174, 175, 176, 192, 198, 232, 233, 234, 236 или 238.
163. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 162, содержащий по меньшей мере одну мутацию в аминокислотном положении, выбранном из 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54,55,57,59,61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163,164,165,166,168,170,171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 и 239.
164. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в изолейцин, положение 65 подвергнуто мутации в глутамин, положение 102 подвергнуто мутации в аланин, положение 163 подвергнуто мутации в аланин, положение 197 подвергнуто мутации в валин, и положение 231 подвергнуто мутации в треонин.
165. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 57 подвергнуто мутации в лизин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, и положение 235 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту.
166. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в гистидин, положение 168 подвергнуто мутации в тирозин, положение 194 подвергнуто мутации в серии, и положение 239 подвергнуто мутации в изолейцин.
167. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в метионин, положение 55 подвергнуто мутации в серии, положение 114 подвергнуто мутации в треонин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, положение 195 подвергнуто мутации в лейцин и положение 237 подвергнуто мутации в серии.
163.
168. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в треонин, положение 63 подвергнуто мутации в лизин, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин, и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту.
169. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 29 подвергнуто мутации в тирозин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 166 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 231 подвергнуто мутации в треонин.
170. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 102 подвергнуто мутации в треонин, положение 173 подвергнуто мутации в тирозин и положение 194 подвергнуто мутации в тирозин.
171. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 65 подвергнуто мутации в аланин, положение 108 подвергнуто мутации в глутамин, положение 171 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту и положение 193 подвергнуто мутации в изолейцин.
172. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в валин, положение 164 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 195 подвергнуто мутации в изолейцин.
173. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 33 подвергнуто мутации в пролин, положение 105 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 171 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в метионин и положение 231 подвергнуто мутации в аланин.
163.
174. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глицин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту.
175. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 106 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, положение 171 подвергнуто мутации в гистидин и положение 195 подвергнуто мутации в валин.
176. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 54 подвергнуто мутации в глицин, положение 165 подвергнуто мутации в тирозин, положение 196 подвергнуто мутации в аспарагин и положение 235 подвергнуто мутации в аланин.
177. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в лейцин, положение 166 подвергнуто мутации в серии и положение 196 подвергнуто мутации в глицин.
178. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 замещено лейцином, аминокислотное положение 61 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 108 замещено пролином, аминокислотное положение 194 замещено аспарагином и аминокислотное положение 239 замещено аланином.
179. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 163, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 замещено глутаминовой кислотой, аминокислотное положение 65 замещено аспарагиновой кислотой, аминокислотное положение 108 замещено глицином, аминокислотное
163.
180. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-179, отличающийся тем, что указанный белок связывается с CD3, выбранным из CD3 человека, CD3 яванского макака.
181. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3, CD3 яванского макака с сопоставимой аффинностью связывания (Kd).
182. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-181, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 со значением Kd человека (hKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 200 нМ, и с CD3 яванского макака со значением Kd яванского макака (cKd) в диапазоне от около 1 нМ до около 300 нМ.
183. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 182, отличающийся тем, что значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ, от около 6 нМ до около 10 нМ, от около 11 нМ до около 20 нМ, от около 25 нМ до около 40 нМ, от около 40 нМ до около 60 нМ, от около 70 нМ до около 90 нМ, от около 100 нМ до около 120 нМ, от около 125 нМ до около 140 нМ, от около 145 нМ до около 160 нМ, от около 170 нМ до около 200 нМ, от около 210 нМ до около 250 нМ, от около 260 нМ до около 300 нМ.
184. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
185. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd
163.
яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
186. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
187. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
188. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180, отличающийся тем, что указанный белок связывается с человеческим CD3 с Kd человека (hKd), связывается CD3 яванского макака с Kd яванского макака (cKd), и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
189. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в изолейцин, положение 65 подвергнуто мутации в глутамин, положение 102 подвергнуто мутации в аланин, положение 163 подвергнуто мутации в аланин, положение 197 подвергнуто мутации в валин и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
186.
190. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в изолейцин, положение 65 подвергнуто мутации в глутамин, положение 102 подвергнуто мутации в аланин, положение 163 подвергнуто мутации в аланин, положение 197 подвергнуто мутации в валин и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до 5 нМ.
191. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 57 подвергнуто мутации в лизин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин и положение 235 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
192. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 57 подвергнуто мутации в лизин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин и положение 235 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
193. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в гистидин, положение 168 подвергнуто мутации в тирозин, положение 194 подвергнуто мутации в серии и положение 239 подвергнуто мутации в изолейцин, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш NO. 22).
194. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в гистидин, положение 168 подвергнуто мутации в тирозин, положение 194 подвергнуто мутации в серии и положение 239 подвергнуто мутации в
186.
195. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в метионин, положение 55 подвергнуто мутации в серии, положение 114 подвергнуто мутации в треонин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, положение 195 подвергнуто мутации в лейцин и положение 237 подвергнуто мутации в серии, и при этом значения hKd и cKd являются примерно такими же, как аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
196. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в метионин, положение 55 подвергнуто мутации в серии, положение 114 подвергнуто мутации в треонин, положение 166 подвергнуто мутации в фенилаланин, положение 195 подвергнуто мутации в лейцин и положение 237 подвергнуто мутации в серии, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
197. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в треонин, положение 63 подвергнуто мутации в лизин, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ID NO. 22).
198. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в треонин, положение 63 подвергнуто мутации в лизин, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ.
186.
199. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 29 подвергнуто мутации в тирозин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 166 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации с глутаминовую кислоту и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 1,5-2 раза выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
200. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 29 подвергнуто мутации в тирозин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 166 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 231 подвергнуто мутации в треонин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ.
201. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 102 подвергнуто мутации в треонин, положение 173 подвергнуто мутации в тирозин и положение 194 подвергнуто мутации в тирозин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ID NO. 22).
202. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 102 подвергнуто мутации в треонин, положение 173 подвергнуто мутации в тирозин и положение 194 подвергнуто мутации в тирозин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
186.
положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 65 подвергнуто мутации в аланин, положение 108 подвергнуто мутации в глутамин, положение 171 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту и положение 193 подвергнуто мутации в изолейцин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ID N0. 22).
204. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 65 подвергнуто мутации в аланин, положение 108 подвергнуто мутации в глутамин, положение 171 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту и положение 193 подвергнуто мутации в изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 25 нМ до около 40 нМ.
205. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в валин, положение 164 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 195 подвергнуто мутации в изолейцин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ ГО NO. 22).
206. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в валин, положение 164 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту и положение 195 подвергнуто мутации в изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
207. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 33 подвергнуто мутации в пролин, положение 90 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 105 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 171 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в метионин и положение 231 подвергнуто мутации в аланин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше,
204.
208. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 33 подвергнуто мутации в пролин, положение 90 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 105 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 171 подвергнуто мутации в лизин, положение 195 подвергнуто мутации в метионин и положение 231 подвергнуто мутации в аланин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 40 нМ до 60 нМ.
209. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глицин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш NO. 22).
210. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глицин, положение 65 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в пролин, положение 170 подвергнуто мутации в валин и положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 11 нМ до 20 нМ.
211. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 106 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, положение 171 подвергнуто мутации в гистидин и положение 195 подвергнуто мутации в валин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 6-15 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
204.
212. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 27 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 106 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, положение 171 подвергнуто мутации в гистидин и положение 195 подвергнуто мутации в валин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне примерно от 40 нМ до 60 нМ.
213. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 54 подвергнуто мутации в глицин, положение 165 подвергнуто мутации в тирозин, положение 196 подвергнуто мутации в аспарагин и положение 235 подвергнуто мутации в аланин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
214. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в аспарагин, положение 54 подвергнуто мутации в глицин, положение 165 подвергнуто мутации в тирозин, положение 196 подвергнуто мутации в аспарагин и положение 23 5 подвергнуто мутации в аланин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 11 нМ до около 20 нМ.
215. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 59 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в лейцин, положение 166 подвергнуто мутации в серии и положение 196 подвергнуто мутации в глицин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш NO. 22).
216. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 28 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, положение 59 подвергнуто мутации в
204.
глутаминовую кислоту, положение 108 подвергнуто мутации в лейцин, положение 166 подвергнуто мутации в серии и положение 196 подвергнуто мутации в глицин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 125 нМ до около 140 нМ.
217. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в лейцин, аминокислотное положение 61 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в пролин, аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в аспарагин, аминокислотное положение 239 подвергнуто мутации в аланин, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш NO. 22).
218. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 34 подвергнуто мутации в лейцин, аминокислотное положение 61 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в пролин, аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в аспарагин, аминокислотное положение 239 подвергнуто мутации в аланин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
219. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 65 подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в глицин, аминокислотное положение 171 подвергнуто мутации в валин и аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd примерно в 20-50 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ID NO. 22).
220. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 162-183, отличающийся тем, что аминокислотное положение 31 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, аминокислотное положение 65
217.
подвергнуто мутации в аспарагиновую кислоту, аминокислотное положение 108 подвергнуто мутации в глицин, аминокислотное положение 171 подвергнуто мутации в валин и аминокислотное положение 194 подвергнуто мутации в глутаминовую кислоту, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 100 нМ до около 120 нМ.
221. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный белок не связывается с мышиным CD3.
222. Полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221.
223. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 222.
224. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 223.
225. Фармацевтическая композиция, содержащая (i) белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, полинуклеотид по п. 232, вектор по п. 223 или клетку-хозяина по п. 224, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
226. Способ получения белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, при этом указанный способ включает культивирование хозяина, трансформированного или трансфицированного вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, в условиях, обеспечивающих экспрессию белка, содержащего одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, и выделение и очистку полученного белка из культуры.
227. Способ лечения или облегчения пролиферативного заболевания, опухолевого заболевания, воспалительного заболевания, иммунологического расстройства, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, аллергической реакции, паразитарной реакции, болезни "трансплантат против хозяина" или болезни "хозяин против трансплантата", включающий введение белка, содержащего
221.
228. Способ по п. 227, отличающийся тем, что субъектом является человек.
229. Способ по п. 228, отличающийся тем, что способ, кроме того, включает введение средства в сочетании с белком, содержащим одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-138.
230. Мультиспецифический связывающий белок, включающий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, п. 68 или п. 162.
231. Антитело, содержащее белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, п. 68 или п. 162.
232. Мультиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, однодоменное антитело, вариабельный домен тяжелой цепи, пептид или лиганд, содержащий белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, п. 68 или п. 162.
233. Антитело, содержащее белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, п. 68 или п. 162, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой scFv-антитело.
234. Мультиспецифический связывающий белок или антитело, содержащее белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по п. 1, п. 68 или п. 162, и связывающий сывороточный альбумин домен.
235. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 8.
236. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 9.
221.
237. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 14.
238. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 19.
239. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 94.
240. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 10.
241. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 11.
242. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 12.
243. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 13.
244. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 15.
221.
245. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 16.
246. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 17.
247. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 18.
248. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 20.
249. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 21.
250. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221, отличающийся тем, что указанный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 95.
221.
245.
Е VQL VE SGGGLVQPGG SLKL S С AA S GFTFNK Y AMN W V
RQ APGKGLE WVARIRSKYNN YAT Y Y AD S VKDRETISR
DDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISY
WAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQE
PSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQ
APRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPE
DEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
анти-СРЗе scFv
KD (нМ) hum CD3e
kon(l/Ms)
kdis(l/s)
KD (нМ) суп о CD3e
kon(l/Ms)
kdis(l/s)
cyno/hum
отношение
4.4
4.71E+05
2.07E-03
3.9
4.БЗЕ+05
1.33Е-03
0.9
2B2
3.3
6.03E+05
2.32E-03
3.5
5.57Е+05
1.93Е-03
0.9
9F2
4.1
3.61E+05
1.33E-03
3.4
З.ЗЗЕ+05
1.05Е-03
0.3
5A2
4.3
5.66E+05
2.36E-03
4.2
4.75Е+05
1.93Е-03
1.0
6A2
4.7
5.22E+05
2.4SE-03
4.9
4.5БЕ+05
2.22Е-03
1.0
2D2
6.4
5.27E+05
3.38E-03
Б. Б
4.71Е+05
3.09Е-03
1.0
3F2
8.0
7.O4E+05
5.02E-03
Б. Б
7.12Е+05
4.33Е-03
0.3
2E4
14.4
4.16E+05
5.99E-03
13.2
4.04Е+05
5.32Е-03
0.9
2H2
1Б.0
5.S7E+05
9.06E-03
16.0
5.25Е+05
8.37Е-03
1.0
10B2
17.9
4.90E+05
3.74E-03
16.6
4.93Е+05
3.15Е-03
0.9
1A2
19.9
5.99E+05
1.19E-02
5.31Е+05
9.03Е-03
0.9
1C2
36.S
G.63E+05
2.44E-02
Б.Б9Е+05
1.97Е-02
0.3
2A4
4Б.З
3.64E+05
1.Б6Е-02
43.4
3.53Е+05
1.53Е-02
0.9
10E4
49.3
5.22E+05
2.БОЕ-02
46.3
5.0SE+05
2.33Е-02
0.9
SA5
109
7.46E+05
3.10E-02
103
7.23Е+05
7.44Е-02
0.9
2G5
117
9.94E+05
1.15E-01
115
9.64E+Q5
1.11Е-01
1.0
1G4
132.9
1.67E+05
2.20E-02
133.7
1.64E+Q5
2.19Е-02
1.0
Варианты анти-huCD3s
Ть (°С)
59.2
2В2
57.4
3F2
52.2
2Е4
2Н2
10В2
51.5
2А4
56.2
2G5
1G4
60.3
(19)
(19)
(19)
<220>
<220>
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
Thr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
<210> 16 <211> 249
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
<220>
<220>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<210> 36 <211> 10
<210> 36 <211> 10
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 40
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 40
<220>
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<210> 56
<211> 14
<210> 56
<211> 14
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 60
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 60
<220>
<220>
<220>
<220>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<210> 88 <211> 9
<210> 88 <211> 9
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 92
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 92
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
<210> 97
<210> 97
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
г4 представляет собой SEQ ID N0. 67, г5 представляет собой SEQ ГО N0. 77 и гб представляет собой SEQ ГО N0. 92.
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 13, и при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 6 нМ до около 10 нМ.
отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ ID N0. 22).
аминокислотное положение 34 замещено валином, лейцином или изолейцином, аминокислотное положение 54 замещено глицином,
79. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 59.
79. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 59.
80. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 61.
80. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 61.
90. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 165.
90. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 165.
91. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 166.
91. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 166.
102. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 235.
102. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 235.
103. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 237.
103. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по п. 68 или 69, содержащий замещение в положении 237.
аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СБЗ (SEQ Ш N0. 22).
144. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные
144. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по любому из пп. 68-121 и 125-129, отличающийся тем, что аминокислотные
примерно в 3-5 раз выше, чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
положение 171 замещено валином и аминокислотное положение 194 замещено глутаминовой кислотой.
изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
изолейцин, при этом значения hKd и cKd находятся в диапазоне от около 3 нМ до около 5 нМ.
203. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное
203. Белок, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с
CD3, по любому из пп. 162-180 и 184-188, отличающийся тем, что аминокислотное
100
101
чем аффинность связывания по отношению к CD3 белка, который имеет последовательность, представленную в wt анти-СОЗ (SEQ Ш N0. 22).
103
103
104
105
одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с CD3, по любому из пп. 1-221 субъекту, нуждающемуся в этом.
107
107
1/4 ФИГ. 1
1/4 ФИГ. 1
4/4 ФИГ. 4
4/4 ФИГ. 4
|
