[RU]

В настоящей заявке описаны однодоменные белки, связывающие сывороточные альбумины с повышенной термостабильностью, аффинностью связывания и устойчивыми профилями агрегации. Описаны также мультиспецифичные связывающие белки, включающие однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, согласно настоящему изобретению. Данное изобретение предусматривает также фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, описанные в данной заявке, и способы применения таких композиций.

(57) Реферат / Формула:

В настоящей заявке описаны однодоменные белки, связывающие сывороточные альбумины с повышенной термостабильностью, аффинностью связывания и устойчивыми профилями агрегации. Описаны также мультиспецифичные связывающие белки, включающие однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, согласно настоящему изобретению. Данное изобретение предусматривает также фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, описанные в данной заявке, и способы применения таких композиций.

---

Евразийское (21) 201892691 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.19
(51) Int. Cl.
A61K 39/395 (2006.01) C07K16/18 (2006.01) C07K16/28 (2006.01)
(54) ОДНОДОМЕННЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН
(31) 62/339,682
(32) 2016.05.20
(33) US
(86) PCT/US2017/033665
(87) WO 2017/201488 2017.11.23
(71) Заявитель:
ХАРПУН ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Дабридж Роберт Б., Лемон Брайан Д., Остин Ричард Дж., Эвнин Люк, Гуно Жанмари (US)
(74) Представитель:
Строкова О.В., Угрюмов В.М. (RU)
(57) В настоящей заявке описаны однодоменные белки, связывающие сывороточные альбумины с повышенной термостабильностью, аффинностью связывания и устойчивыми профилями агрегации. Описаны также мультиспецифичные связывающие белки, включающие однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, согласно настоящему изобретению. Данное изобретение предусматривает также фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, описанные в данной заявке, и способы применения таких композиций.
Перекрёстная реактивность HSA фага
ОДНОДОМЕННЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ
АЛЬБУМИН
ПЕРЕКРЁСТНАЯ ССЫЛКА
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/339,682, поданной 20 мая 2016 года, которая во всей полноте включена в настоящее изобретение посредством отсылки.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка содержит Список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и тем самым включён в настоящее изобретение посредством отсылки во всей полноте. Указанная ASCII копия, созданная 18 мая 2017 года, получила название 47517-703_601_SEQ.txt и имеет объём 22,218 байт.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ОТСЫЛКИ
[0003] Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, вводятся в настоящее изобретение посредством отсылки в той степени, как если бы было указано, что каждая(-ый) индивидуальная(-ый) публикация, патент или заявка на патент включена (включён) посредством отсылки и представлена (представлен) во всей полноте.
СВЕДЕНИЯ О ПРЕДШЕСТВУЮЩЕМ УРОВНЕ ТЕХНИКИ [0004] Альбумин представляет собой самый распространённый (основной) белок плазмы крови, высокорастворимый, очень стабильный, и имеет чрезвычайно продолжительный период полужизни в кровотоке (период полувыведения). Альбумин можно использовать разными способами для повышения периода полужизни терапевтических молекул в кровотоке. В настоящем изобретении предусматривается однодоменный альбумин-связывающий белок, который можно использовать для пролонгирования периода полужизни (полувыведения) терапевтических молекул.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Согласно одному варианту в изобретении предусматривается однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержащий области (участки), определяющие комплементарность, CDR1, CDR2 и CDR3, где (а) аминокислотная последовательность CDR1 представлена как GFX1X2X3X4FGMS (SEQ ID NO. 1), Xi обозначает треонин, аргинин, лизин, серии или пролин, Х2 обозначает фенилаланин или тирозин, Хз означает серии, аргинин или лизин, Х4 означает серии, лизин, аргинин или
аланин; (b) аминокислотная последовательность CDR2 представлена последовательностью SISGSGX5X6TLYAX7SX8K (SEQ Ш N0. 2), Xs обозначает серии, аргинин, треонин или аланин, Хб обозначает аспарагиновую кислоту, гистидин, валин или треонин, Х7 обозначает аспарагиновую кислоту, гистидин, аргинин или серии, Xs обозначает валин или лейцин; и (с) аминокислотная последовательность CDR3 представлена последовательностью GGSLX9X10 (SEQ ID N0. 3), Х9 обозначает серии, аргинин, треонин или лизин и Хю обозначает аргинин, лизин, валин, пролин или аспарагин, при этом Xi, Х2, Хз, Х4, Х5, Хб, Х7, Xs, Х9 и Хю не обозначают одновременно треонин, фенилаланин, серии, серии, серии, аспарагиновую кислоту, аспарагиновую кислоту, валин, серии и аргинин, соответственно. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет следующую формулу: fl-rl-f2-r2-f3-r3-f4, где rl обозначает последовательность SEQ ГО NO. 1; г2 обозначает последовательность SEQ ГО N0. 2; и гЗ обозначает последовательность SEQ ГО N0. 3; и где fi, {2, гз и U обозначают остатки каркасной области, выбранные таким образом, чтобы указанный белок был по меньшей мере на восемьдесят процентов идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ГО N0. 10. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 14, SEQ ГО N0. 15 или SEQ ГО N0. 16. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой г2 включает SEQ ГО N0. 17, SEQ ГО N0. 18, SEQ ГО N0. 19, SEQ ГО N0. 20, SEQ ГО N0. 21 или SEQ ГО N0. 22. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой гЗ включает SEQ ГО N0. 23 или SEQ ГО N0. 24. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 14. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 15, г2 включает SEQ ГО N0. 17 и гЗ включает SEQ ГО N0.23. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 16, и гЗ включает SEQ ГО N0. 23. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 15 и г2 включает SEQ ГО N0. 18. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит
аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ Ш N0. 14 и гЗ включает SEQ Ш N0. 23. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ID N0. 15, г2 включает SEQ ГО N0. 19 и гЗ включает SEQ ГО N0. 24. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 14 и г2 включает SEQ ГО N0. 20. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 15 и г2 включает SEQ ГО N0. 21. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой rl включает SEQ ГО N0. 15, г2 включает SEQ ГО N0. 22 и гЗ включает SEQ ГО N0. 24. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ГО N0. 4, SEQ ГО N0. 5, SEQ ГО N0. 6, SEQ ГО N0. 7, SEQ ГО N0. 8, SEQ ГО N0. 9, SEQ IN N0. 25, SEQ ГО N0. 26 и SEQ ГО N0. 27. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 4. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 7. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 9. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 26. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 27. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 5. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 6. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 8. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО N0. 25.
[0006] Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с сывороточным альбумином, выбранным из человеческого сывороточного альбумина, сывороточного альбумина яванского макака и мышиного сывороточного альбумина. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с человеческим сывороточным альбумином и с сывороточным альбумином яванского макака со сравнимой аффинностью связывания (Kd). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с мышиным сывороточным альбумином с аффинностью связывания (Kd), которая от около 1.5 до около 20 раз слабее аффинности связывания (Kd) указанного белка по отношению к сывороточному альбумину человека и яванского макака. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с человеческим сывороточным альбумином с величиной Kd (hKd) между около 1 нМ и около 100 нМ, а с сывороточным альбумином яванского макака с величиной Kd (cKd) между 1 нМ и 100 нМ. Согласно некоторым вариантам величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, составляет между 1 нМ и около 5 нМ, или между около 5 нМ и около 10 нМ. Согласно некоторым вариантам величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, составляет между 1 нМ и около 2 нМ, между около 2 нМ и около 3 нМ, между около 3 нМ и около 4 нМ и между около 4 нМ и около 5 нМ, между около 5 нМ и около 6 нМ, между около 6 нМ и около 7 нМ, между около 7 нМ и около 8 нМ, между около 8 нМ и около 9 нМ, или между около 9 нМ и около 10 нМ. Согласно некоторым вариантам соотношение между hKd и cKd (hKd: cKd) однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в пределах от около 20:1 до около 1: 2.
[0007] Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш NO. 4, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш NO. 5, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш NO. 6, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш NO. 7, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1
нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 8, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 5 нМ и около 10 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 9, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 22, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 23, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 24, и при этом имеет значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ.
[0008] Согласно некоторым вариантам период полувыведения однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, составляет по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 40 часов, по меньшей мере 45 часов, по меньшей мере 50 часов или по меньшей мере 100 часов.
[0009] Согласно другому варианту однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3, включает последовательность, представленную как SEQ Ш NO. 10, в которой один или более аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных остатков в положениях 28, 29, 30 или 31 в области CDR1; в положениях 56, 57, 62 или 64 в области CDR2; и в положениях 103 и 104 в области CDR3 заменены, причём аминокислота в положении 28 заменена на аргинин, лизин, серии или пролин, аминокислота в положении 29 заменена на тирозин, аминокислота в положении 30 заменена на аргинин или лизин, аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аргинин или аланин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, треонин или аланин, аминокислота в положении 57 заменена на гистидин, валин или треонин, аминокислота в положении 62 заменена на гистидин, аргинин глутаминовую кислоту или серии, аминокислота в положении 64 заменена на лейцин, аминокислота в положении 103 заменена на аргинин, треонин или лизин, аминокислота в положении 104 заменена на лизин, валин, пролин или аспарагин.
Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит одну или более дополнительных замен в других положениях аминокислотных остатков, отличных от положений 28, 29, 30, 31, 56, 57, 62, 64, 103 и 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замену в положении 29. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замену в положении 31. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замену в положении 56. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замену в положении 62. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замену в положении 64. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замену в положении 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях 31 и 62. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на аргинин. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, а аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях аминокислотных остатков 31, 56, 64 и 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аланин, аминокислота в положении 64 заменена на лейцин и аминокислота в положении 104 заменена на лизин. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотные замены в положениях 29 и 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 29 заменена на тирозин и аминокислота в положении 104 заменена на лизин. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях аминокислотных остатков 31 и 56. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, а аминокислота в положении 56 заменена на треонин.
Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях аминокислотных остатков 31, 56 и 62. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на треонин и аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях аминокислотных остатков 31 и 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, а аминокислота в положении 104 заменена на лизин. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях аминокислотных остатков 31, 56 и 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин и аминокислота в положении 104 заменена на валин. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит замены в положениях аминокислотных остатков 31, 56, 62 и 104. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту и аминокислота в положении 104 заменена на валин. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, а величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту, а величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аланин, аминокислота в положении 64 заменена на лейцин, аминокислота в
положении 104 заменена на лизин, а величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 29 заменена на тирозин, аминокислота в положении 104 заменена на лизин, а величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на треонин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на треонин и аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, аминокислота в положении 104 заменена на лизин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 5 нМ и до около 10 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, аминокислота в положении 104 заменена на валин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит аминокислотную последовательность, в которой аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту и аминокислота в положении 104 заменена на валин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ.
[0010] Согласно другому варианту в настоящем изобретении предусматривается однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержащий по меньшей
мере одну мутацию в CDR1, CDR2 или CDR3, при этом CDR1 содержит последовательность, представленную как SEQ Ш N0:11, CDR2 содержит последовательность, представленную как SEQ Ш N0:12, CDR3 содержит последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 13, и по меньшей мере одна мутация не является мутацией в положениях аминокислотных остатков 1, 2, 7, 8, 9 или 10 последовательности SEQ Ш N0: 11, в положениях 1, 3, 6, 10 или 11 последовательности SEQ Ш N0: 12 или в положениях 1 или 2 последовательности SEQ Ш N0: 13. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит по меньшей мере одну мутацию в положениях аминокислотных остатков, выбранных из положений 3, 4, 5 и 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0: 11), положений аминокислот 7, 8, 13 и 15 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) и положений аминокислот 5 и
6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит одну или более дополнительных замен в положениях аминокислотных остатков, отличных от положений 3, 4, 5 и 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0: 11), положений аминокислотных остатков 7, 8, 13 и 15 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) и положений аминокислотных остатков 5 и 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутацию в положении аминокислоты 6 области CDR 1 (SEQ Ш N0:11). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутацию в положении аминокислоты 6 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11) и в положении аминокислоты 13 области CDR2 (SEQ ГО N0: 12). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в положении аминокислоты 6 в последовательности (SEQ ГО N0:11), в положениях аминокислот 7 и 15 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) и в положении аминокислоты 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в положении аминокислоты 4 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11) и в положении аминокислоты 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в положении аминокислоты 6 в области CDR 1 (SEQ ГО NO: 11), в положении аминокислоты
7 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в положении аминокислоты 6 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11), в положениях аминокислот 7 и 13 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в положении аминокислоты 6 в области
CDR1 (SEQ Ш N0:11) и в положении аминокислоты 6 в области CDR3 (SEQ ID N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в аминокислотном положении 6 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11), в аминокислотном положении 7 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) и в аминокислотном положении 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит мутации в аминокислотном положении 6 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11), в аминокислотных положениях 7 и 13 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) и в аминокислотном положении 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11) мутирована в аргинин (заменена на аргинин), и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11) мутирована в аргинин, аминокислота в положении 13 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) мутирована в глутаминовую кислоту и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11) мутирована в лизин, аминокислоты в положениях 7 и 15 области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) мутирована в аланин и лейцин, соответственно, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13) мутирована в лизин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 4 в области CDR1 (SEQ ГО N0:11) мутирована в тирозин и аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13) мутирована в лизин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR2 (SEQ ID N0:11) мутирована в лизин, аминокислота в положении 7 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) мутирована в треонин, и при этом величина hKd и cKd
однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR 1 (SEQ Ш N0:11) мутирована в лизин, аминокислоты в положениях 7 и 13 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) мутирована в треонин и глутаминовую кислоту, соответственно, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) мутирована в аргинин, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 12) мутирована в лизин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 5 нМ и до около 10 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR 1 (SEQ Ш N0:11) мутирована в лизин, аминокислота в положении 7 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) мутирована в аргинин, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13) мутирована в валин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит последовательность, в которой аминокислота в положении 6 в области CDR 1 (SEQ Ш N0:11) мутирована в лизин, аминокислоты в положениях 7 и 13 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) мутированы в аргинин и глутаминовую кислоту, соответственно, и аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13) мутирована в валин, и при этом величина hKd и cKd однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в диапазоне от около 1 нМ и до около 5 нМ.
[ООН] Согласно другому варианту в настоящем изобретении предусматривается полинуклеотид, кодирующий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению. В соответствии с другим вариантом описывается вектор, содержащий полинуклеотид, раскрываемый в настоящем изобретении. Согласно другому варианту описывается клетка-хозяин, трансформированная вектором по настоящему изобретению. Согласно одному варианту в изобретении предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая (i) однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему
изобретению, вектор по настоящему изобретению или клетку-хозяина по настоящему изобретению, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
[0012] Согласно другом варианту в изобретении описывается способ получения однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, по настоящему изобретению, причём указанный способ включает культивирование хозяина, трансформированного или трансфицированного с использованием вектора, содержащего нуклеотидную последовательность по настоящему описанию, кодирующую однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, в условиях, предусматривающих экспрессию однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, и выделение и очистку полученного белка от культуры.
[0013] Также описывается способ лечения или уменьшения интенсивности пролиферативного заболевания, опухолевого заболевания, воспалительного заболевания, иммунологического нарушения, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, аллергической реакции, паразитарной (инвазионной) реакции, болезни "трансплантат-против-хозяина" или "хозяин-против-трансплантата", включающий введение однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Согласно некоторым вариантам субъектом является человек. Согласно некоторым вариантам субъект также включает введение агента в комбинации с однодоменным белком, связывающим сывороточный альбумин, по настоящему изобретению.
[0014] Согласно другому варианту в изобретении описывается мультиспецифичный связывающий белок, содержащий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению. Согласно другому варианту в изобретении описывается антитело, содержащее однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению.
[0015] Согласно другому варианту в изобретении описывается мультиспецифичное антитело, биспецифичное антитело, sdAb (однодоменное антитело), вариабельный домен тяжёлой цепи, пептид или лиганд, содержащий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению. Согласно одному варианту в изобретении предусматривается антитело, содержащее однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению, при этом указанное антитело представляет собой однодоменное антитело. Согласно некоторым вариантам однодоменное антитело получено из вариабельной области тяжёлой цепи IgG.
[0016] В одном варианте описывается мультиспецифичный/(-ое) связывающий/(-ее) белок/антитело, содержащий/(-ее) однодоменный белок, связывающий сывороточный
альбумин, по настоящему изобретению и CD3 связывающий домен. В одном варианте описывается способ лечения или уменьшения интенсивности лечения или уменьшения интенсивности пролиферативного заболевания, опухолевого заболевания, воспалительного заболевания, иммунологического нарушения, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, аллергической реакции, паразитарной (инвазионной) реакции, болезни "трансплантат-против-хозяина" или "хозяин-против-трансплантата", включающий введение мультиспецифичного антитела по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0017] Новые признаки изобретения с характерными особенностями представлены в прилагаемой Формуле изобретения. Для лучшего понимания признаков и преимуществ настоящего изобретения даётся ссылка на нижеприведённое подробное описание, где представлены иллюстративные варианты, в которых используются принципы изобретения, и прилагаемые фигуры, из которых:
[0018] На Фигуре 1 иллюстрируется специфическое связывание фага, несущего родительские антитела к HSA, по определению титрованием методом ELISA (ИФА), с HSA антигеном и CD3 антигеном.
[0019] На Фигуре 2 иллюстрируется перекрёстная реактивность фага, несущего анти-HSA антитела, по отношению к сывороточному альбумину человека, яванского макака и мыши по определению титрованием методом ELISA (ИФА).
[0020] На Фигуре 3 представлены профили аффинности связывания девяти клонов для более точного определения Kd с использованием очищенных sdAbs (однодоменных антител, одАЬ).
[0021] На Фигуре 4 представлена температура экспозиции с гидрофобными веществами (Ть°С) для некоторых вариантов анти-HSA sdAb (одАЬ).
[0022] На Фигуре 5 иллюстрируется свойство некоторых вариантов анти-HSA sdAb образовывать димер в сравнении с образованием мономера при низких значениях рН.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0023] Хотя предпочтительные варианты настоящего изобретения показаны и описаны в настоящей заявке, для специалистов в данной области техники очевидно, что такие варианты даются только в качестве примеров. Множество вариантов, изменений и
замен в пределах изобретения будут очевидны специалистам в данной области. Следует иметь в виду, что различные варианты изобретения по данному описанию могут применяться при практическом осуществлении изобретения. Предполагается, что в нижеприведённой Формуле изобретения определяется объём изобретения и что тем самым охватываются способы и структуры в объёме этой Формулы и их эквиваленты. Некоторые определения
[0024] Терминология, употребляемая в настоящей заявке, даётся лишь с целью описания конкретных случаев и не предполагается как ограничивающая. В контексте настоящей заявки предполагается, что формы единственного числа включают также формы множественного числа, если в контексте однозначно не указано иное. Также в тех случаях, когда термины "включающий", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты употребляются как в подробном описании, так и/или в Формуле изобретения, то предполагается, что такие термины являются неограничительными, аналогично термину "содержащий".
[0025] Термин "около" или "приблизительно" означает, с допустимой погрешностью, пределы конкретной величины, определяемые специалистом в данной области, которые частично зависят от того, как эта величина измеряется или определяется, например, от ограничений системы измерения. Например, "около" может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения, в соответствии с практикой, принятой для данной величины. Если не указано иное, в случае, когда в заявке или в Формуле изобретения описываются конкретные значения, то следует понимать, что термин "около" означает приемлемый интервал погрешности для конкретной величины.
[0026] Термины "индивидуум" ("человек"), "пациент" или "субъект" употребляются взаимозаменяемо, как синонимы. Употребление любого из этих терминов не требует описания ситуации и не ограничивается ситуацией, характеризующейся наблюдением (например, постоянным или периодическим) медицинского работника (например, врача, медсестры, среднего медработника, фельдшера, сиделки или работника хосписа).
[0027] Термин "каркасные" или "FR" остатки (или области) относятся к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков CDR или гипервариабельной области по настоящему описанию. "Человеческая консенсусная каркасная область" означает каркасную область, которая представляет обычно (чаще всего) встречающийся аминокислотный остаток при отборе каркасных последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина.
[0028] В данном контексте термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к тому факту, что последовательности некоторых участков вариабельных доменов значительно отличаются от последовательности антител и используются при связывании каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако, вариабельность не распределена равномерно по всем вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трёх сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDRs), или гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как лёгкой, так и тяжёлой цепи. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасной областью (FR). Вариабельные домены нативной тяжёлой и лёгкой цепей, каждый, содержат четыре FR области, как правило, принимающие Р-складчатую конфигурацию, связанную тремя CDRs, которые образуют петли, связывающие Р-складчатую структуру, а в некоторых случаях образующие часть Р-складчатой структуры. CDRs в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR областей и при использовании CDRs из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Константные домены не включены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, например, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности. Выражения "нумерация остатков вариабельного домена согласно Kabat" или "нумерация положений аминокислотных остатков по Kabat" и их варианты относятся к системе нумерации, применяемой для вариабельных доменов тяжёлой цепи или вариабельных доменов лёгкой цепи при составлении (создании) антител и описанной в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). При использовании этой системы нумерации действительная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, что соответствует укорочению или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжёлой цепи может включать инсерцию одной аминокислоты (остаток 52а согласно Kabat) после остатка 52 Н2 и встроенные остатки (например, остатки 82а, 82Ь и 82с и т.д., согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжёлой цепи. Нумерацию остатков по Kabat для данного антитела можно определить выравниванием в областях гомологии последовательности антитела со "стандартной" последовательностью с нумерацией по Kabat. Не
предполагается, что CDRs по настоящему изобретению обязательно соответствует условиям нумерации по Kabat.
[0029] В данном контексте термин (выражение) "процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" применительно к последовательности определяется как процентное содержание (относительное количество) аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, идентичных аминокислотным остаткам в специфической (конкретной) последовательности, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимальной идентичности последовательностей в процентах, и при этом какие-либо консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательностей. Выравнивание аминокислотных последовательностей с целью определения их процентной идентичности можно осуществлять различными способами, известными специалистам в данной области, например, используя общедоступную компьютерную программу, такую как BLAST, BLAST-2, ALIGN, или программу Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для количественного определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
[0030] В данном контексте термин "период полувыведения" употребляется в его общепринятом смысле, как это описано в публикации Goodman and Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980). Коротко говоря, предполагается, что термин охватывает количественное определение динамики выведения лекарства. Выведение (элиминация) большинства лекарств происходит по экспоненте (т.е. следует кинетике реакций первого порядка), поскольку концентрации лекарства не приближаются к концентрациям, необходимым для насыщения процесса исчезновения (удаления из организма). Скорость экспоненциального процесса может быть выражена его константной скорости, к, которая показывает относительное изменение в единицу времени, или его полупериодом, ti/2, временем, необходимым для завершения процесса на 50 %. Единицами измерения этих констант являются время-1 и время, соответственно. Константа скорости реакции первого порядка и полупериод реакции связаны простым уравнением (kxti/2=0.693), и, соответственно, могут заменяться. Так как кинетика элиминации (удаления) первого порядка предписывает, что в единицу времени теряется постоянная доля лекарства, то кривая зависимости log концентрации лекарства от времени является линейной всё время (непрерывно) после фазы начального распределения (т.е. после завершения абсорбции и
распределения лекарственного средства). Период полувыведения лекарства можно точно определить на основании этого графика.
[0031] В данном контексте термин "аффинность связывания" относится к аффинности белков, описанных в настоящей заявке, к их связывающим мишеням и выражается количественно с использованием значений "Kd". Если указано, что у двух или более белков аффинности связывания с их мишенями сравнимы, тогда значения Kd в отношении связывания соответствующих белков с их мишенями находятся в пределах ±2х-кратного интервала относительно друг друга. Если указано, что у двух или более белков аффинности связывания с одной единственной мишенью сравнимы, тогда значения Kd в отношении связывания соответствующих белков с единственной указанной мишенью находятся в пределах ±2х-кратного интервала относительно друг друга. Если указано, что белок связывает две или более мишеней со сравнимыми аффинностями связывания, тогда значения Kd в отношении связывания указанного белка с двумя или более мишенями находятся в пределах ±2х-кратного интервала относительно друг друга. В принципе более высокое значение Kd соответствует более слабому связыванию. Согласно некоторым вариантам величину "Kd" определяют анализом связывания с антигеном, меченым радиоактивным изотопом (RIA), или методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием биосенсора В1Асоге(tm)-2000 или BIAcore(tm)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). Согласно некоторым вариантам "скорость образования", или "скорость ассоциации", или "коп" ("коп") и "скорость диссоциации", или "koff" ("k0ff") также определяют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием биосенсора В1Асоге(tm)-2000 или BIAcore(tm)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). Согласно другим вариантам "Kd", "kon" и "koff количественно определяют, используя системы Octet(r) Systems (Pall Life Sciences).
[0032] В настоящем изобретении описываются однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, фармацевтические композиции, а также нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы и клетки-хозяева для получения таких однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин. Также предусматриваются способы применения раскрываемых однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин, для предупреждения и/или лечения заболеваний, патологических состояний и нарушений. Однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, способны специфически связываться с сывороточным альбумином. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, включают дополнительные домены, такие как CD3 связывающий домен, а также связывающие домены для других целевых антигенов.
Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин [0033] В настоящем изобретении рассматриваются однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин. Сывороточный альбумин вырабатывается в печени, встречается растворённым в плазме крови и является наиболее распространённым белком крови у млекопитающих. Альбумин имеет важное значение для поддержания онкотического давления, необходимого для адекватного распределения жидкостей в организме между кровеносными сосудами и тканями тела; без альбумина высокое давление в кровеносных сосудах вытесняло бы больше жидкостей в ткани. Альбумин также ведёт себя в плазме как носитель посредством неспецифического связывания некоторых гидрофобных стероидных гормонов, и как транспортный белок для гемина и жирных кислот. Человеческий сывороточный альбумин (HSA) (молекулярная масса ~67 кДа) является преобладающим белком в плазме, присутствует в концентрации около 50 мг/мл (600 мкМ) и имеет период полувыведения (время полужизни) в организме человека около 20 дней. HSA служит для поддержания рН плазмы крови, вносит вклад в коллоидно-осмотическое давление крови, функционирует как носитель многих метаболитов и жирных кислот и служит в качестве основного транспортного белка для лекарственных веществ в плазме крови. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, связываются с HSA. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, связываются с сывороточным белком-сывороточным альбумином яванского макака. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, связываются с белком HSA и с сывороточным альбумином яванского макака. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, также связываются с мышиным сывороточным белком альбумином. Согласно некоторым вариантам аффинность связывания в отношении мышиного сывороточного альбумина от около 1.5 раз до около 20 раз слабее, чем в отношении сывороточного альбумина человека или яванского макака.
[0034] Нековалентная ассоциация с альбумином продлевает период полувыведения короткоживущих белков. Например, рекомбинантное слияние альбумин-связывающего домена с Fab фрагментом приводило в результате к снижению in vivo клиренса в 25- и в 58 раз, а продления полужизни в 26- и в 37 раз при внутривенном введении мышам и кроликам, соответственно, по сравнению с введением одного Fab фрагмента. В другом примере, когда инсулин ацилировали жирными кислотами с целью инициировать ассоциацию с альбумином, то наблюдали эффект пролонгирования при введении кроликам или свиньям с помощью подкожной инъекции. Все вместе эти
исследования демонстрируют взаимосвязь между связыванием альбумина и пролонгированным действием /временем полужизни в сыворотке крови.
[0035] Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, по настоящему изобретению представляют собой однодоменное антитело, например, такое как вариабельный домен тяжёлой цепи (VH), вариабельный домен (VHH) sdAb (одАЬ) камелидов, лиганд или низкомолекулярная частица, специфическая к сывороточному альбумину. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, по настоящему изобретению представляют собой однодоменное антитело, например, такое как вариабельный домен тяжёлой цепи (VH), вариабельный домен (VHH) sdAb (одАЬ) камелидов, лиганд или низкомолекулярная частица, специфическая к HSA. Согласно некоторым вариантам домен, связывающий сывороточный альбумин, связывающего сывороточный альбумин однодоменного белка по настоящему описанию представляет собой любой домен, который связывается с сывороточным альбумином, включая, но без ограничения, домены из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела. Согласно некоторым вариантам домен, связывающий сывороточный альбумин, представляет собой однодоменное антитело. Согласно другим вариантам домен, связывающий сывороточный альбумин, представляет собой пептид. Согласно другим вариантам домен, связывающий сывороточный альбумин, представляет собой а малую молекулу (низкомолекулярное соединение). Предполагается, что однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, является весьма малым и имеет протяжённость не более 25 кДа, не более 20 кДа, не более 15 кДа или не более 10 кДа в некоторых вариантах. В некоторых случаях однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет протяжённость 5 кДа или менее, если это пептид или низкомолекулярная частица.
[0036] Согласно некоторым вариантам связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок по настоящему описанию представляет собой домен с пролонгированным временем полужизни, который обеспечивает изменённую фармакодинамику и фармакокинетику самого однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин. Как указано выше, домен, продлевающий время полужизни, продлевает период полувыведения. Домен, продлевающий время полужизни, также изменяет фармакодинамические свойства, включая изменение распределения в тканях, проникновения в ткани и диффузии в тканях связывающего сывороточный альбумин однодоменного белка. Согласно некоторым вариантам пролонгирование времени
полужизни обеспечивает улучшенное целенаправленное воздействие на ткани (включая опухоль), улучшенное распределение в тканях, проникновение в ткани, диффузию внутри ткани и повышенную эффективность по сравнению с белком без домена, пролонгирующего время полужизни. Согласно одному варианту в терапевтических методах рационально и эффективно используется пониженное количество однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, что в результате приводит к снижению побочных эффектов, например, к снижению цитотоксичности в отношении неопухолевых клеток.
[0037] Далее, аффинность связывания однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, в отношении его связывающей мишени можно выбрать таким образом, чтобы воздействовать на конкретное время полувыведения в конкретном однодоменном белке, связывающем сывороточный альбумин. Так, согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет высокую аффинность связывания (сродство к связыванию) в отношении связывающей его мишени. Согласно другим вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин имеет среднюю аффинность связывания в отношении связывающей его мишени. Согласно другим вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет низкую или предельно низкую аффинность связывания в отношении связывающей его мишени. Представленные в качестве примера значения аффинности связывания включают KD 10 нМ или менее (высокая), между 10 нМ и 100 нМ (средняя) и выше 100 нМ (низкая). Как указано выше, аффинность связывания однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин, в отношении связывающих мишеней определяют известными методами, например, такими как поверхностный плазмонный резонанс (SPR).
[0038] Согласно некоторым вариантам связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок, раскрываемый в настоящем изобретении, связывается с HSA с величиной Kd для человеческого SA (hKd). Согласно некоторым вариантам связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок, раскрываемый в настоящем изобретении, связывается с сывороточным альбумином яванского макака с Kd для SA яванского макака (cKd). Согласно некоторым вариантам связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок, раскрываемый в настоящем изобретении, связывается с сывороточным альбумином яванского макака с Kd для SA яванского макака (cKd), а с HSA с Kd для HSA (hKd). Согласно некоторым вариантам значения hKd находятся в пределах между 1 нМ и 100 нМ. Согласно некоторым вариантам значения hKd находятся в пределах между 1 нМ и 10 нМ. Согласно некоторым вариантам значения cKd находятся в пределах между 1 нМ и 100 нМ. Согласно некоторым вариантам значения cKd
находятся в пределах между 1 нМ и 10 нМ. Согласно некоторым вариантам значения hKd и cKd находятся в пределах между около 1 нМ и около 5 нМ или между около 5 нМ и 10 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с сывороточным альбумином, выбранным из человеческого сывороточного альбумина, сывороточного альбумина яванского макака и мышиного сывороточного альбумина. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с человеческим сывороточным альбумином, сывороточным альбумином яванского макака и мышиным сывороточным альбумином со сравнимой аффинностью связывания (Kd). Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с человеческим сывороточным альбумином с величиной Kd для человеческого SA (hKd) между, примерно, 1 нМ и около 10 нМ, а с сывороточным альбумином яванского макака с Kd для SA яванского макака (cKd) между 1 нМ и 10 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, связывается с мышиным сывороточным альбумином с Kd для мышиного SA (mKd) между около 10 нМ и около 50 нМ.
[0039] Согласно некоторым вариантам величина hKd составляет около 1.5 нМ, около 1.6 нМ, около 1.7 нМ, около 1.8 нМ, около 1.9 нМ, около 2 нМ, около 2.1 нМ, около 2.2 нМ, около 2.3 нМ, около 2.4 нМ, около 2.5 нМ, около 2.6 нМ, около 2.7 нМ, около 2.8 нМ, около 2.9 нМ, около 3 нМ, около 3.1 нМ, около 3.2 нМ, около 3.3. нМ, около 3.4 нМ, около 3.5 нМ, около 3.6 нМ, около 3.7 нМ, около 3.8 нМ, около 3.9 нМ, около 4 нМ, около 4.5 нМ, около 5 нМ, около 6, около 6.5 нМ, около 7 нМ, около 7.5 нМ, около 8 нМ, около 8.5 нМ, около 9.0 нМ, около 9.5 нМ или около 10 нМ.
[0040] Согласно некоторым вариантам величина cKd составляет около 1.5 нМ, около 1.6 нМ, около 1.7 нМ, около 1.8 нМ, около 1.9 нМ, около 2 нМ, около 2.1 нМ, около 2.2 нМ, около 2.3 нМ, около 2.4 нМ, около 2.5 нМ, около 2.6 нМ, около 2.7 нМ, около 2.8 нМ, около 2.9 нМ, около 3 нМ, 3.1 нМ, около 3.2 нМ, около 3.3 нМ, около 3.4 нМ, около 3.5 нМ, около 3.6 нМ, около 3.7 нМ, около 3.8 нМ, около 3.9 нМ, около 4 нМ, около 4.5 нМ, около 5 нМ, около 6, около 6.5 нМ, около 7 нМ, около 7.5 нМ, около 8 нМ, около 8.5 нМ, около 9.0 нМ, около 9.5 нМ или около 10 нМ.
[0041] Согласно некоторым вариантам величина mKd составляет около 10 нМ, около 11 нМ, около 12 нМ, около 13 нМ, около 14 нМ, около 15 нМ, около 16 нМ, около 17 нМ, около 18 нМ, около 19 нМ, около 20 нМ, около 21 нМ, около 22 нМ, около 23 нМ, около 24 нМ, около 25 нМ, около 26 нМ, около 27 нМ, около 28 нМ, около 29 нМ, около 30 нМ, около 31 нМ, около 32 нМ, около 33 нМ, около 34 нМ, около 35 нМ, около 36 нМ,
около 37 нМ, около 38 нМ, около 39 нМ, около 40 нМ, около 41 нМ, около 42 нМ, около 43 нМ, около 44 нМ, около 45 нМ, около 46 нМ, около 47 нМ, около 48 нМ или около 50 нМ.
[0042] Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0. 4, SEQ ГО NO. 5, SEQ ГО NO. 6, SEQ ГО NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 и SEQ ID NO. 27.
[0043] Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 4, и значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 4, и значение hKd около 2.3 нМ и значение cKd около 2.4 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 25, и значения hKd и cKd между около about 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 25, а значение hKd около 2.1 нМ и значение cKd около 2.2 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 5, а значения hKd и cKd между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 5, и значение hKd составляет около 1.9 нМ, а значение cKd составляет около 1.7 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 6, а значения hKd и cKd составляет между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 6, и значение hKd составляет около 3.2 нМ, а значение cKd составляет около 3.6 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 7, а значения hKd и cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ГО NO. 7, и значение hKd составляет около
2.7 нМ, а значение cKd составляет около 2.6 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 26, а значения hKd и cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 26, а значение hKd составляет около 2.1 нМ и значение cKd составляет около 2 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 8, и значения hKd и cKd составляют между около 5 нМ и около 10 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 8, и значение hKd составляет около 6 нМ, а значение cKd составляет около 7.5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 9, и при этом значения hKd и cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 9, и при этом значение hKd составляет около 2.2 нМ, а значение cKd составляет около 2.3 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 27, и при этом значения hKd и cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 27, и при этом значение hKd составляет около 1.6 нМ, а значение cKd составляет около 1.6 нМ.
[0044] Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 4, а значение mKd составляет около 17 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 5, и имеет значение mKd около 12 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 6, и значение mKd составляет около 33 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 7, а
значение mKd составляет около 14 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 9, а его значение mKd составляет около 16 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 25, а его значение mKd составляет около 17 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 26, а его значение mKd составляет около 17 нМ. Согласно некоторым вариантам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 27, а его значение mKd составляет около 16 нМ.
[0045] Согласно некоторым вариантам соотношение между hKd и cKd (hKd: cKd) находится в интервале от около 20:1 до около 1:2.
[0046] Согласно некоторым вариантам период полувыведения связывающего сывороточный альбумин однодоменного белка составляет по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 40 часов, по меньшей мере 45 часов, по меньшей мере 50 часов или по меньшей мере 100 часов.
СОЗ-связывающий домен
[0047] Специфичность ответа Т клеток опосредуется распознаванием антигена (выявляемого в контексте главного комплекса гистосовместимости, МНС) с использованием Т-клеточного рецепторного комплекса. Будучи частью Т-клеточного рецепторного комплекса, CD3 представляет собой комплекс, который включает CD3y (гамма) цепь, CD38 (дельта) цепь и две CD3s (эпсилон) цепи, которые находятся на поверхности клетки. CD3 ассоциируется с а (альфа) и Р (бета) цепями Т-клеточного рецептора (TCR), равно как и CD3 ? (дзета), в целом составляя Т-клеточный рецепторный комплекс. Кластеризация CD3 на Т клетках, например, с использованием анти-СБЗ антител, приводит к активации Т клеток, аналогичной включению Т-клеточного рецептора, но независимой от свойственной клону специфичности.
[0048] Согласно одному аспекту в данной заявке описывается мультиспецифичный белок, содержащий связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывается с CD3. Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен,
который специфически связывается с человеческим CD3. Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывается с CD3y. Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывается с CD38. Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывается с CD3s.
[0049] Согласно дополнительным вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывается с Т-клеточным рецептором (TCR). Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывает а цепь TCR. Согласно некоторым вариантам мультиспецифичный белок содержит также домен, который специфически связывает Р цепь TCR.
[0050] Согласно некоторым вариантам СОЗ-связывающий домен мультиспецифичного белка, содержащего связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок по настоящему изобретению, проявляет не только высокую CD3-связывающую аффинность в отношении человеческого CD3, но также прекрасную перекрёстную реактивность в отношении соответствующих CD3 белков яванского макака. В некоторых случаях СОЗ-связывающий домен мультиспецифичных белков проявляет перекрёстную реактивность в отношении CD3 яванского макака. В некоторых случаях соотношения KD человека: яванского макака (hKd: cKd) для СОЗ-связывания находятся в интервале между 20:1 и 1:2.
[0051] Согласно некоторым вариантам СОЗ-связывающий домен мультиспецифичного белка, содержащего однодоменный белок, по настоящему описанию может представлять собой любой домен, который связывается с CD3, включая, но без ограничения, домены из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, или антигенсвязывающие фрагменты СОЗ-связывающих антител, таких как однодоменные антитела (sdAb), Fab, Fab', F(ab)2 и Fv фрагменты, состоящие из одной или более областей CDRs, одноцепочечные антитела (например, одноцепочечные Fv фрагменты (scFv)), стабилизированные дисульфидным мостиком (дисульфидной связью) (dsFv) Fv фрагменты, антитела-гетероконъюгаты (например, биспецифичные антитела), pFv фрагменты, мономеры или димеры тяжёлых цепей, мономеры или димеры лёгких цепей, и димеры, состоящие из одной тяжёлой и одной лёгкой цепи. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы СОЗ-связывающий домен был получен из того же вида, в котором в конечном счёте будет использоваться мультиспецифичный белок, содержащий
связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок. Например, для применения на людях может быть предпочтительно, чтобы СОЗ-связывающий домен мультиспецифичного белка, содержащего однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению, содержал остатки антигенсвязывающего домена человеческого или гуманизированного антитела или фрагмента антитела.
[0052] Так, в одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит гуманизированное или человеческое антитело или фрагмент гуманизированного или человеческого антитела, или мышиное антитело или фрагмент мышиного антитела. Согласно одному варианту гуманизированный или человеческий анти-СОЗ связывающий домен (CD3-связывающий домен антитела к CD3) содержит одну или более (например, все три) области лёгкой цепи, определяющие комплементарность: определяющую комплементарность область лёгкой цепи 1 (LC CDR1), определяющую комплементарность область лёгкой цепи 2 (LC CDR2) и определяющую комплементарность область лёгкой цепи 3 (LC CDR3) гуманизированного или человеческого анти-СОЗ-связывающего домена по настоящему описанию, и/или одну или более (например, все три) области тяжёлой цепи, определяющие комплементарность: определяющую комплементарность область тяжёлой цепи 1 (НС CDR1), определяющую комплементарность область тяжёлой цепи 2 (НС CDR2), и определяющую комплементарность область тяжёлой цепи 3 (НС CDR3) гуманизированного или человеческого анти-СОЗ-связывающего домена по настоящему описанию, например, гуманизированного или человеческого анти-СОЗ-связывающего домена, содержащего одну или более, например, все три области LC CDRs и одну или более, например, все три области НС CDRs.
[0053] Согласно некоторым вариантам гуманизированный анти-СОЗ-связывающий домен содержит вариабельную область гуманизированной или человеческой лёгкой цепи, специфическую к CD3, при этом вариабельная область лёгкой цепи, специфическая к CD3, содержит CDRs человеческой или нечеловеческой лёгкой цепи в каркасной области лёгкой цепи. В некоторых случаях каркасная область лёгкой цепи представляет собой каркасную область лёгкой цепи X (лямбда). В других случаях каркасная область лёгкой цепи представляет собой каркасную область лёгкой цепи к (каппа).
[0054] Согласно некоторым вариантам гуманизированный или человеческий анти-СОЗ-связывающий домен содержит вариабельную область гуманизированной или человеческой тяжёлой цепи, специфичную к CD3, причём вариабельная область тяжёлой
цепи, специфичная к CD3, содержит человеческие или нечеловеческие CDRs в каркасной области тяжёлой цепи.
[0055] В некоторых случаях определяющие комплементарность области (участки) тяжёлой цепи и/или лёгкой цепи получены из известных анти-СОЗ антител, например, таких как муромонаб-СБЗ (ОКТЗ), отеликсизумаб (TRX4), теплизумаб (MGA031), висилизумаб (Nuvion), SP34, TR-66 или Х35-3, VIT3, ВМА030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, ХШ-141, ХШ-46, ХШ-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, М-Т301, SMC2, F101.01, UCHT-1 и WT-31.
[0056] Аффинность связывания (сродство к связыванию) с CD3 можно определять, например, способностью мультиспецифичного белка, содержащего сам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, или его СОЗ-связывающий домен, связываться с CD3, нанесённым на аналитический планшет; экспонированным на поверхности микробной клетки; в растворе; и т.д. Связывающую активность мультиспецифичного белка, содержащего сам однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, или его СОЗ-связывающий домен, согласно настоящему изобретению, с CD3, можно анализировать посредством иммобилизации лиганда (например, CD3), или самого указанного мультиспецифичного белка, или его CD3-связывающего домена на (в) грануле (бусах), субстрате, клетке и т.д. Агенты можно добавлять в соответствующем буфере, а партнёры по связыванию инкубировать в течение некоторого периода времени при данной температуре. После отмывок для удаления несвязанного материала связанный белок можно высвобождать с использованием, например, SDS, буферов с высоким рН и т.п. и анализировать, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Домен, связывающий целевой антиген
[0057] Помимо описанных связывающих сывороточный альбумин и CD3 доменов мультиспецифичный связывающий белок, содержащий связывающие сывороточный альбумин однодоменные белки по настоящему описанию, в некоторых вариантах содержит также домен, который связывается с целевым антигеном. Целевой антиген играет активную роль в заболевании, нарушении или патологическом состоянии и/или связан с ними. В частности, целевой антиген связан с (обусловлен) пролиферативным заболеванием, опухолевым заболеванием, воспалительным заболеванием, иммунологическим нарушением, аутоиммунным заболеванием, инфекционным заболеванием, вирусным заболеванием, аллергической реакцией, паразитарной (инвазионной) реакцией, болезнью трансплантат-против-хозяина и
болезнью хозяин-против-трансплантата. Согласно некоторым вариантам целевой антиген представляет собой опухолевый антиген, экспрессируемый на опухолевой клетке. Или же, согласно некоторым вариантам целевой антиген ассоциирован с патогеном, таким как вирус или бактерия.
[0058] Согласно некоторым вариантам целевой антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, например, такую как белок, липид или полисахарид. Согласно некоторым вариантам целевой антиген находится на опухолевой клетке; клетке, инфицированной вирусом; клетке, инфицированной бактерией; поражённом эритроците; клетке атеросклеротической бляшки; или клетке фиброзной ткани.
[0059] Дизайн мультиспецифичных связывающих белков, содержащих однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению, способствует тому, чтобы домен, связывающий с целевым антигеном, был гибким в том смысле, что домен, связывающий с целевым антигеном, может быть связывающим доменом любого типа, включая, но без ограничения, домены из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела. Согласно некоторым вариантам домен, связывающий с целевым антигеном, представляет собой одноцепочечные фрагменты вариабельного домена (scFv), однодоменное антитело, например, вариабельный домен тяжёлой цепи (VH), вариабельный домен лёгкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) sdAb (одАЬ) камелидов. Согласно другим вариантам домен, связывающий с целевым антигеном, представляет собой не-Ig связывающий домен, а именно, миметик антитела, например, такой как антикалины, аффилины, молекулы аффител (Affibody(r), аффибоди), аффимеры, аффитины, "альфатела", авимеры, дарпины, финомеры, пептиды домена Куница и монотела. Согласно другим вариантам домен, связывающий с целевым антигеном, представляет собой лиганд или пептид, который связывается или ассоциируется с целевым антигеном. Согласно другим вариантам домен, связывающий с целевым антигеном, представляет собой ноттин. Согласно другим вариантам домен, связывающий с целевым антигеном, представляет собой низкомолекулярную частицу.
Модификации однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин
[0060] Однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, по настоящему изобретению, охватывают производные или аналоги, в которых (i) аминокислота заменена на аминокислотный остаток, который не является аминокислотным остатком, кодируемым генетическим кодом, (ii) зрелый полипептид слит с другим соединением, таким как полиэтиленгликоль, или (iii) дополнительные кислоты
слиты с белком, таким как лидерная или секреторная последовательность или последовательность для блокады иммуногенного домена и/или для очистки белка.
[0061] Типичные модификации включают, но без ограничения, ацетилирование, ацилирование, ADP-рибозилирование, амидирование, ковалентное связывание флавина, ковалентное связывание частицы гема, ковалентное связывание нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное связывание липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, перекрёстное связывание (сшивание), циклизацию, образование дисульфидной связи (дисульфидного мостика), деметилирование, образование ковалентных перекрёстных связей, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI (ГФИ)-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное тРНК присоединение аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование.
[0062] Модификации делают в любом месте в связывающих сывороточный альбумин однодоменных белках по настоящему описанию, включая пептидный скелет, боковые цепи аминокислот и амино- или карбокси-концы. Некоторые общие модификации пептидов, применимые для модификации однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин, включают гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование, блокировку (защиту) амино- или карбоксильной группы, или и той, и другой, в полипептиде с помощью ковалентной модификации, и ADP-рибозилирование.
Полинуклеотиды, кодирующие однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин
[0063] Согласно некоторым вариантам в изобретении предусматриваются молекулы полинуклеотидов, кодирующие связывающий сывороточный альбумин однодоменный белок по настоящему описанию. Согласно некоторым вариантам молекулы полинуклеотидов предусматриваются в виде конструкции ДНК. Согласно другим вариантам молекулы полинуклеотидов предусматриваются в виде транскрипта мРНК (иРНК).
[0064] Молекулы полинуклеотидов конструируют известными методами, например, соединяя гены, кодирующие три связывающих домена, либо разделённые пептидными линкерами, либо, согласно другим вариантам, непосредственно связанные пептидной связью в единую генетическую конструкцию, функционально связанную с
подходящим промотором и, необязательно, с подходящим терминатором транскрипции, и экспрессируя её в бактериях или в другой подходящей экспрессионной системе, например, такой как СНО клетки.
[0065] Согласно некоторым вариантам в изобретении также предусматриваются молекулы полинуклеотидов, кодирующие мультиспецифичный связывающий белок, содержащий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам полинуклеотид, кодирующий указанный мультиспецифичный связывающий белок, также включает последовательность, кодирующую СОЗ-связывающий домен. Согласно некоторым вариантам полинуклеотид, кодирующий указанный мультиспецифичный связывающий белок, также включает последовательность, кодирующую домен, связывающий целевой антиген. Согласно некоторым вариантам полинуклеотид, кодирующий указанный мультиспецифичный связывающий белок, также включает последовательности, кодирующие СОЗ-связывающий домен и домен, связывающий целевой антиген. Согласно некоторым вариантам молекулы полинуклеотидов предусматриваются в виде конструкции ДНК. Согласно другим вариантам молекулы полинуклеотидов в виде транскрипта мРНК. Согласно другим вариантам, в которых домен, связывающий целевой антиген, представляет собой малую молекулу, полинуклеотиды содержат гены, кодирующие домен, связывающий сывороточный альбумин, и СОЗ-связывающий домен. Согласно вариантам, в которых домен, пролонгирующий период полувыведения, представляет собой малую молекулу, полинуклеотиды содержат гены, кодирующие домены, которые связываются с CD3 и с целевым антигеном. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина можно применять любое число подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Промотор выбирают таким образом, чтобы он обусловливал экспрессию полинуклеотида в соответствующей клетке-хозяине.
[0066] Согласно некоторым вариантам полинуклеотид включают в вектор, предпочтительно, в экспрессионный вектор, который представляет собой другой вариант изобретения. Этот рекомбинантный вектор может быть сконструирован известными методами. Векторы, представляющие особый интерес, включают плазмиды, фагмиды, производные фагов, вирусы (например, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, лентивирусы и т.п.) и космиды.
[0067] Для включения и экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид описанного однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, могут быть использованы различные системы хозяин/вектор. Примером экспрессионных векторов для
экспрессии в E.coli являются pSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1): 11127), pcDNA5 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих, дрожжевые системы экспрессии PICHIAPINK(tm) (Invitrogen), бакуловирусные системы экспрессии BACUVANCE(tm) Baculovirus Expression System (GenScript).
[0068] Так, однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, описанные в данной заявке, согласно некоторым вариантам получаются путём включения вектора, кодирующего белок, как описано выше, в хозяйскую клетку, культивирования указанной хозяйской клетки в условиях, когда экспрессируются белковые домены, и выделения и необязательной последующей очистки.
Получение однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин
[0069] Согласно некоторым вариантам в данной заявке описан способ получения однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин. Согласно некоторым вариантам этот способ включает культивирование клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором, включающим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин в условиях, позволяющих экспрессировать белок, связывающий сывороточный альбумин, и выделение и очистку полученного белка из культуры.
[0070] Согласно дополнительному варианту предусмотрен способ, направленный на улучшение одного или более свойств, например, аффинности, стабильности, переносимости высокой температуры, перекрёстной реактивности и т. д., однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин и/или мультиспецифичных связывающих белков, включающих однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанный в данной заявке, по сравнению с референсным связывающим соединением. Согласно некоторым вариантам предусмотрена совокупность библиотек с одной заменой, каждая из которых соответствует другому домену или аминокислотному сегменту однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, или референсному связывающему соединению, для того, чтобы каждый член библиотеки одной замены кодировал только одно аминокислотное изменение в соответствующем домене или аминокислотном сегменте. (Это даёт возможность зондировать с помощью нескольких небольших библиотек все потенциальные замены в белке большого размера или в сайте связывания белка.) Согласно некоторым вариантам множество доменов образует или покрывает непрерывную последовательность аминокислот однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, или референсного связывающего соединения. Нуклеотидные последовательности разных библиотек с одной заменой перекрываются с нуклеотидными последовательностями по меньшей мере одной другой библиотеки с
одной заменой. Согласно некоторым вариантам совокупность библиотек с одной заменой конструируют таким образом, что каждый член перекрывает каждый член каждой библиотеки с одной заменой, кодирующий прилегающий домен.
[0071] Связывающие соединения, экспрессированные из таких библиотек с одной заменой выбираются отдельно для получения ряда вариантов в каждой библиотеке, которые имеют свойства, по меньшей мере такие же хорошие, как свойства референсного связывающего соединения и чья полученная библиотека уменьшена по размеру (то есть, количество нуклеиновых кислот, кодирующих выбранный ряд связывающих соединений, меньше, чем количество нуклеиновых кислоты, кодирующих члены исходной библиотеки с одной заменой). Такие свойства включают, но без ограничения, аффинность к соединению-мишени, стабильность по отношению к различным условиям, таким как нагрев, высокое или низкое значение рН, ферментное расщепление, перекрёстная реактивность в отношении других белков и т. д. Выбранные соединения из каждой библиотеки с одной заменой в данной заявке называются взаимозаменяемыми терминами "прекандидатное соединение" или "прекандидатный белок." Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих прекандидатные соединения из отдельных библиотек с одной заменой, затем подвергаются шаффлингу методом ПЦР для генерирования библиотеки, подвергнутой шаффлингу, используя технику шаффлинга генов с использованием ПЦР (полимеразной цепной реакции).
[0072] Пример осуществления процесса скрининга описан в данной заявке. Библиотеки "прекандидатных" соединений генерируются из библиотек с одной заменой и выбираются для связывания с белком-мишенью (белками-мишенями), после чего проводят шаффлинг библиотек прекандидатов для получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих соединения-кандидаты, которые в свою очередь, клонируются в обычный экспрессионный вектор, например, в систему фагмидной экспрессии. Соединения-кандидаты, экспрессирующие фаги, затем подвергаются одному или более раундам селекции для улучшения желательных свойств, таких как сродство к связыванию молекулы-мишени. Молекулы-мишени могут быть адсорбированы или прикреплены другим образом к поверхности лунки или другого реакционного контейнера, или молекулы-мишени могут быть дериватизированы с помощью фрагмента связывания, такого как биотин, который после инкубации со связывающими соединениями-кандидатами может быть захвачен комплементарным фрагментом, таким как стрептавидин, связанным с гранулами, такими как магнитные гранулы, для промывки. Например, при проведении метода селекции связывающие соединения-кандидаты подвергаются продолжительной стадии промывки для того, чтобы были выбраны только
соединения-кандидаты с очень низкими скоростями диссоциации из молекулы-мишени. Согласно таким вариантам время промывки, составляет, например, по меньшей мере 8 ч или согласно другим вариантам оно равно по меньшей мере 24 ч; или в соответствии с другими вариантами равно по меньшей мере 48 ч; или согласно другим вариантам равно по меньшей мере 72 ч. Выделенные клоны после селекции амплифицируют и подвергают дополнительному циклу селекции или анализируют, например, путём секвенирования и проведения сравнительных измерений аффинности связывания, например, методом ELISA, связывания, основанного на явлении поверхностного плазмонного резонанса, интерферометрии биослоя (например, с применением системы Octet, ForteBio, Menlo Park, CA) или т. п. Согласно некоторым вариантам осуществляется процесс для идентификации одного или более однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин, и/или мультиспецифичного связывающего белка, включающего однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, с повышенной термостабильностью, улучшенной перекрёстной реактивностью по отношению к выбранному ряду связывающих мишеней по сравнению с показателями для референсного белка, связывающего сывороточный альбумин, такого как белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ Ш N0. 10. Библиотеки с одной заменой получают, варьируя кодоны в VH области референсного белка, связывающего сывороточный альбумин, включая оба кодона в каркасных областях и в CDRs; согласно другому варианту локализации, где варьируются кодоны, включают CDRs тяжёлой цепи референсного белка, связывающего сывороточный альбумин, или ряд таких CDRs, например, только CDR1, только CDR2, только CDR3, их пары. Согласно другому варианту локализации, где варьируются кодоны, возникают только в каркасных областях. Согласно некоторым вариантам библиотека содержит единственные изменения кодонов из референсного белка, связывающего сывороточный альбумин, только в каркасных областях VH в количестве от 10 до 250. Согласно другому варианту локализации, где варьируются кодоны, включают CDR3s тяжёлой цепи референсного белка, связывающего сывороточный альбумин, или ряд таких CDR3s. Согласно другому варианту количество локаций, где варьируются кодоны кодирующих областей VH, находится в пределах от 10 до 250, например, до 100 локаций находятся в каркасной области. После получения библиотеки однократного действия, как описано выше, проводятся следующие стадии: (а) экспрессия отдельно каждого члена библиотеки с одной заменой как белка-прекандидата; (Ь) выбор членов каждой библиотеки с одной заменой, которые кодируют белки-прекандидаты, которые связываются с партнёром по связыванию, который может или не может отличаться от исходной связывающей мишени [например, желательной (-ых) мишени (-ей) перекрёстной реакции]; (с) проведение
шаффлинга членов выбранных библиотек в ПЦР для получения комбинаторной библиотеки, подвергнутой шаффлингу; (d) экспрессия членов библиотеки, подвергнутой шаффлингу, как кандидатных белков, связывающих сывороточный альбумин; и (е) выбор членов библиотеки, подвергнутой шаффлингу, один или два раза для кандидатных белков, связывающих сывороточный альбумин, которые связываются с исходным партнёром по связыванию, и необязательно (f) последующий выбор белков-кандидатов для связывания с желательной (-ых) мишенью (-ями)перекрёстной реакции, тем самым обеспечивается белок, связывающий сывороточный альбумин, кодированный нуклеиновой кислотой с повышенной способностью к перекрёстной реакции для одного или более веществ в сравнении с референсным белком, связывающим сывороточный альбумин без потери аффинности у исходного лиганда. Согласно дополнительным вариантам можно осуществлять способ получения белка, связывающего сывороточный альбумин, с пониженной реактивностью к выбранному перекрёстно-реагирующему веществу (-ам) или соединению (-ям), или эпитопу (-ам) путём проведения стадии замены (f) с последующей стадией: извлечения связывающих соединений-кандидатов один или два раза из ряда кандидатов-белков, связывающих сывороточный альбумин, которые связываются с нежелательным перекрёстно-реагирующим соединением.
[0073] В появившихся в последнее время исследованиях сообщается, что во время получения, хранения и in vivo использования терапевтические антитела подвергаются опасности разложения через посредство ряда сигнальных путей. Среди наиболее часто возникающих реакций химического разложения белков находятся деамидирование остатков аспарагина (N) и изомеризация остатков аспартовой кислоты (D). В частности, появилась гипотеза, что, если остатки N и остатки D участвуют в распознавании антигена, их химическое изменение может привести к значительной потере активности. Известно, что остатки аспарагина и аспартовой кислоты имеют общий путь биодеградации, который проходит через образование циклического сукцинимидного интермедиата. Образование сукцинимидных интермедиатов и продукты их гидролиза (аспартат и изоаспартат), в сайтах аспартовой кислоты антитела представляют серьёзную проблему стабилизации. Когда происходит изомеризация, химическая структура антитела изменяется, что может привести к низкой стабильности, проявляющейся, например, в агрегации, в меньшем сроке годности. Соответственно, согласно некоторым вариантам настоящего изобретения предусмотрены однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, в которых один или более остатков аспартовой кислоты является мутированным, при этом снижается возможность изомеризации однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин. Согласно некоторым вариантам остаток аспартовой кислоты находится в
области CDR2 однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, и остаток аспартовой кислоты мутирован с образованием глутаминовой кислоты. Согласно некоторым вариантам остаток аспартовой кислоты в положениип 62 белка, представленного последовательностью SEQ Ш N0. 10, мутирован в глутаминовую кислоту (D62E). Согласно некоторым вариантам аффинность связывания сывороточного альбумина однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, содержащего мутацию D62E, не затронута мутацией. Согласно некоторым вариантам, однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, с мутацией или без мутации D62E обладают сравнимой аффинностью связывания с сывороточным альбумином. Фармацевтические композиции
[0067] Согласно некоторым вариантам предусмотрены также фармацевтические композиции, содержащие однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанный в данной заявке, вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий полипептид однодоменных белков, связывающих сывороточный альбумин, или клетку-хозяин, трансформированную этим вектором, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Термин " фармацевтически приемлемый носитель" включает, но без ограничения, любой носитель, который не влияет на эффективность биологической активности ингредиентов и который не является токсичным для пациента, которому он вводится. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны из предшествующего уровня техники и включают физиологические растворы с фосфатным буфером, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло-в-воде, различные виды смачивающих агентов, стерильные растворы и т. д. Такие носители могут быть введены обычными методами и могут быть применены для субъекта в подходящей дозе. Предпочтительно, чтобы композиции были стерильными. Эти композиции могут также содержать вспомогательные средства (адъюванты), такие как консерванты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто за счёт включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов.
[0068] В соответствии с некоторыми вариантами фармацевтических композиций однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанный в данной заявке, инкапсулируется в наночастицы. Согласно некоторым вариантам наночастицы представляют собой фуллерены, жидкие кристаллы, липосомы, квантовые точки, супер магнитные наночастицы, дендримеры или наностержни. Согласно другим вариантам фармацевтических композиций однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, прикреплён к липосомам. В некоторых случаях однодоменный белок,
связывающий сывороточный альбумин, является связанным с поверхностью липосом. В некоторых случаях однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, инкапсулирован в оболочку липосомы. В некоторых случаях липосома представляет собой катионную липосому.
[0069] Однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, описанные в данной заявке, предназначены для использования в качестве лекарственного средства. Введение осуществляется различными путями, например, путём внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, топического или внутридермального введения. Согласно некоторым вариантам путь введения зависит от вида терапии и вида соединения, содержащегося в фармацевтической композиции. Режим дозирования будет определяться практикующим врачом и зависит от других клинических факторов. Дозирование для любого одного пациента зависит от многих факторов, включая массу пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное соединение, которое должно быть введено, время и путь введения, вид терапии, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводятся совместно. Термин "эффективная доза" относится к количествам активного ингредиента, которые достаточны для влияния на ход течения и степень серьёзности заболевания, приводящие к уменьшению или ремиссии такой патологии, и эта доза может быть определена с использованием известных методов.
Способы лечения
[0070] Согласно некоторым вариантам в данной заявке предусмотрены также способы и применение для стимуляции иммунной системы индивидуума, нуждающегося в этом, включающие введение однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, или мультиспецифичного связывающего белка, включающего однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанный в данной заявке. В некоторых случаях введение однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, описанного в данной заявке, индуцирует и/или поддерживает цитотоксичность в отношении клетки, экспрессирующей антиген-мишень. В некоторых случаях клетка, экспрессирующая антиген-мишень, является раковой или опухолевой клеткой, клеткой, заражённой вирусом, клеткой, заражённой фагом бактерии, аутореактивной Т- или В-клеткой, повреждёнными эритроцитами, артериальными бляшками или клетками фибротической ткани.
[0071] В данной заявке предусмотрены также способы и применение для лечения заболевания, расстройства или состояния, ассоциированных с антигеном-мишенью, включающие введение индивидууму, нуждающемуся в этом, однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, или мультиспецифичного связывающего белка,
включающего однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанный в данной заявке. Заболевания, расстройства или состояния, ассоциированные с антигеном-мишенью, включают, но без ограничения, вирусные инфекции, бактериальные инфекции, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантатов, атеросклероз или фиброз. Согласно другим вариантам заболевание, расстройство или состояние, ассоциированные с антигеном-мишенью, представляет собой пролиферативное заболевание, опухолевое заболевание, воспалительное заболевание, иммунологическое расстройство, аутоиммунное заболевание, инфекционное заболевание, вирусное заболевание, аллергическую реакцию, паразитарное (инвазивное) заболевание, реакцию трансплантат против хозяина или реакцию хозяин против трансплантата. Согласно одному из вариантов заболевание, расстройство или состояние, ассоциированные с антигеном-мишенью, представляет собой раковое заболевание. В одном случае рак является гематологическим раковым заболеванием. В другом случае рак представляет собой солидный рак.
[0072] Согласно некоторым вариантам используемые в данной заявке термины "лечение" или "терапия", или "проведённое лечение" относятся к терапевтическому лечению, когда цель заключается в замедлении развития (уменьшении) нежелательного физиологического состояния, расстройства или заболевания, или в получении благоприятных или желательных клинических результатов. Для целей, описанных в данной заявке, благоприятные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения, ослабление симптомов, уменьшение степени развития состояния, расстройства или заболевания; стабилизацию (то есть, не ухудшение) состояния, расстройства или заболевания; задержку начала или замедление прогрессирования состояния, расстройства или заболевания; улучшение состояния, степени расстройства или заболевания; и ремиссию (или частичную, или полную), выявляемые или не выявляемые, или улучшение болезненного состояния при наличии расстройства или заболевания. Лечение включает получение клинически значимого ответа без чрезмерного проявления побочных эффектов. Лечение включает также пролонгирование продолжительности жизни по сравнению с продолжительностью жизни без проведения лечения. Согласно некоторым вариантам используемые в данной заявке термины "лечение" или "терапия", или "проведённое лечение" относятся к профилактическим мерам, когда целью лечения являются задержка начала или уменьшение степени развития нежелательного физиологического состояния, расстройства или заболевания, например, когда субъект предрасположен к возникновению заболевания (например, индивидуум, у которого содержится генетический маркер заболевания, например, рака молочной железы).
[0073] Согласно некоторым вариантов способов, описанных в данной заявке, однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, мультиспецифичный связывающий белок, включающий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанный в данной заявке, вводятся в комбинации с агентом для лечения конкретных заболевания, расстройства или состояния. Такие агенты включают, но без ограничения, терапевтические антитела, малые молекулы (например, химиотерапевтические препараты), гормоны (стероидные, пептидные и т. п.), радиотерапевтические средства (у-лучи, Х-лучи и/или направленная доставка радиоизотопов, микроволны, УФ облучение и т. п.), препараты генной терапии (например, антисмысловые, антиретровирусные препараты и т. п.) и другие иммунотерапевтические средства. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин, мультиспецифичный связывающий белок, включающий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанные в данной заявке, вводятся в комбинации с антидиарейными средствами, противорвотными средствами, анальгетиками, опиоидами и/или нестероидными противовоспалительными средствами. Согласно некоторым вариантам однодоменные белки, связывающие сывороточный альбумин (анти-HSA антитела), мультиспецифичный связывающий белок, включающий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, описанные в данной заявке, вводятся до, во время или после хирургического вмешательства.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение вариантов анти-HSA однодоменного антитела с эквивалентными связывающими свойствами по отношению к родительскому анти-HSA однодоменному антителу
Характеристика родительского анти-HSA фага
Специфичное связывание фага, несущего родительские антитела к HSA ("анти-HSA фага"), с HSA определяли, используя CD3 в качестве отрицательного контроля (ФИГУРА 1) и перекрёстную реактивность "анти-HSA фага" в отношении сывороточного альбумина человека, сывороточного альбумина яванского макака и сывороточного альбумина мыши (Фигура 2).
Библиотеки HSA sdAb фагов с одной заменой
[0074] Библиотека с одной заменой была создана для каждого из трёх доменов CDR. Библиотеки однократного были связаны с HSA и затем промыты буфером, содержащим различные уровни HSA. Фаги собирали через 0 и 24 ч и подсчитывали. Фаги
выбранные с использованием отмывки в течение 24 ч с помощью 2.5 мг/мл HSA в буфере, использовали для создания двух независимых комбинаторных фаговых библиотек. Комбинаторные библиотеки фагов, несущих антитела к HSA
[0075] MSA использовали как мишень селекции в первом раунде. Лунки промывали в течение 24 ч после связывания комбинаторного фага из двух независимых библиотек. HSA использовали как выбранную мишень во втором раунде. Лунки отмывали при помощи 1 мг/мл HSA в течение 24 ч после связывания обеих библиотек. Вставки, полученные методом ПЦР во втором раунде селекции, субклонировали в экспрессионный вектор МЕЮ His6 (6XHis, последовательность представлена как SEQ Ш N0: 38). 96 клонов собирали, ДНК очищали, секвенировали и трансфицировали в клетки Expi293.
Определение аффинности связывания
[0076] Для расчёта Kd к HSA и CSA с использованием платформы Octet применяли супернатанты. Девять клонов выбирали для дальнейшей характеризации (Фигура 3), основанной на величинах аффинности связывания по сравнению с родительским sdAb, а также получения, агрегации и профилей стабильности.
Пример 2: Фармакокинетика триспецифичного антитела, включающего однодоменное антитело к HSA (анти-HSA антитело)
Однодоменное антитело анти-HSA по Примеру 1 использовали для получения триспецифичного антитела, которое оценивали для определения периода полувыведения при исследованиях на животных.
[0077] Триспецифичное антитело вводилось яванским макакам путём внутримышечной инъекции болюса 0.5 мг/кг. Другая группа яванских макак получала белок с размером, сравнимым с размером доменов, связывающих CD3 и CD20, но не проявляющий связывания с HSA. Третья и четвёртая группы получали антитело с CD3- и HSA-связывающими доменами и белок с CD20- и HSA-связывающими доменами, соответственно, при этом оба антитела были сравнимы по размеру с триспецифичным антителом. Каждая испытуемая группа состояла из 5 обезьян. Образцы сыворотки отбирали в указанные моменты времени, серийно разводили и определяли концентрацию белков с использованием связывания с CD3 и/или CD20 с использованием метода ELISA.
[0078] Фармакокинетический анализ осуществляли, используя концентрации испытуемого объекта в плазме крови. Усреднённые плазменные концентрации для групп при применении каждого объекта подтверждал мультиэкспоненциальный профиль в зависимости от времени после дозирования. Эти данные использовали в стандартной модели с двумя компартментами при введении болюса и при скоростях первого порядка
для фаз распределения и выведения (элиминации). Общее уравнение для лучшего подбора данных в случае внутривенного введения имеет вид: с(г)=Ае~а1+Ве~Р1, где c(t) обозначает концентрацию в плазме в момент времени t, А и В обозначают отрезки на оси Y и а и Р обозначают скорости первого порядка для фаз распределения и выведения, соответственно. а-Фаза представляет собой начальную фазу клиренса и отражает распределение белка во всех внеклеточных жидкостях животного, в то время как вторая или Р-фаза кривой распада представляет отражение подлинного клиренса из плазмы. Методы подбора таких уравнений хорошо известны из предшествующего уровня техники. Например, A=D/V(a-k21)/(a-p), B=D/V(p-k21)/(a-p), и а и р (для a > р) являются корнями квадратичного уравнения: r2+(kl2+k21+kl0)r+k21kl0=0 с использованием рассчитанных параметров: У=объёма распределения, к10=скорости выведения (элиминации), к12=скорость перехода из компартмента 1 в компартмент 2 и к21=скорость перехода из компартмента 2 в компартмент 1, и В=введённая доза.
[0079] Анализ данных: графики зависимости концентрации от временных профилей строят, используя программу KaleidaGraph (KaleidaGraph(tm) V. 3.09 Copyright 1986-1997. Synergy Software. Reading, Pa.). Величины, которые были меньше сообщаемых (LTR), не включены в анализ РК (фармакокинетики) и не представлены графически. Фармакокинетические параметры определяли методом компартментального анализа с использованием компьютерной программы WinNonlin (WinNonlin(r) Professional V. 3.1 WinNonlin(tm) Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, Calif). Фармакокинетические параметры вычисляли, как описано в публикации Ritschel W A and Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5th edition, American Pharmaceutical Assoc., Washington, D.C.
[0080] Ожидается, что триспецифичное антитело, включающее однодоменное антитело против HSA по Примеру 1, обладает улучшенными фармакокинетическими параметрами, такими как увеличение полупериода элиминации по сравнению с белками, не содержащими HSA-связывающий домен.
Пример 3: Термостабильность вариантов однодоменного антитела против HSA (анти-HSA антитела)
[0081] Температура экспозиции белка в гидрофобных условиях (Тп) соответствует производной величине переломной точки кривой флуоресценции красителя и, как известно, коррелирует с температурой плавления (Тш), которая является мерой температурной стабильности белка. Цель этого исследования заключается в определении Ть для нескольких вариантов однодоменного антитела к HSA.
Получение белков
[0082] Последовательности однодоменных антител к huALB клонировали в pcDNA3.4 (Invitrogen) после лидерной последовательности и затем вводили метку 6х гистидином (SEQ Ш N0: 38). Клетки Expi293F (Life Technologies А14527) выдерживали в суспензии в Optimum Growth (Thomson) с плотностью между 0.2 и 8 х 1е6 клеток/мл в среде для клеток Expi. Очищенную плазмидную ДНК трансфицировали в клетки Expi293F с использованием протоколов набора Expi293 Expression System Kit (Life Technologies, A14635) и выдерживали в течение 4-6 дней после трансфекции. Кондиционированную среду частично очищали методом аффинной хроматографии с обессоливающей колонкой. Белковые антитела aHTH-huCD3e scFv концентрировали с помощью центрифугирования на центрифугах Amicon Ultra (EMD Millipore), помещали в среду для эксклюзионной хроматографии Superdex 200 (GE Healthcare) и разделяли в нейтральном буфере, содержащем эксципиенты. Пул фракций и конечную степень чистоты оценивали методами SDS-PAGE (электорофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC). Абсорбцию очищенных растворов белков определяли при длине волны 280 нм с использованием 96-луночньгх планшетов SpectraMax М2 (Molecular Devices) и УФ-прозрачных 96-луночньгх планшетов (Corning 3635) и концентрацию рассчитывали по коэффициентам молярной экстинкции (поглощения).
Дифференциальная сканирующая флуометрия
[0083] Очищенные однодоменные белковые антитела к HSA разводили от 0.2 до 0.25 мг/мл вместе с оранжевым красителем 5х SYPRO (Life Technologies S6651) до 0.15 % концентрации равной 0.15 % в DMSO, в нейтральном буферном растворе, содержащем эксципиенты, в оптических микропланшетах MicroAmp EnduraPlate и биосистемах с адгезивной плёнкой (Applied Biosystems 4483485 и 4311971). Планшет, содержащий разбавленный белок и смеси красителей, загружали в прибор ABI 7500 для ПЦР в реальном времени (Applied Biosytems) и применяли многостадийный температурный градиент от 25 0 С до 95 0 С. Температурный градиент включал выдержку в течение двух минут при каждом повышении на один градус Цельсия с возбуждением при длине волны 500 нм и эмиссию улавливали с помощью фильтра ROX. Величины Ть в градусах Цельсия для однодоменных белковых антител к HSA показана на Фигуре 4.
Пример 4: Относительная способность к димеризации вариантов однодоменных антител анти-HSA при действии низкого рН
[0084] Анти-HSA однодоменные белковые антитела экспрессировали в клетках Expi293-F, как описано выше. Кондиционированную среду для каждого варианта наносили на агарозу с белком A (GE Healthcare, 17519901), помещённую в колонку, тщательно промывали физиологическим раствором, содержащим TRIS буфер, элюировали с помощью 0.05 % (об/об) уксусной кислоты при рН 3, выдерживали при комнатной температуре до десяти минут перед частичной нейтрализацией до рН 5, и затем проводили обессоливание в нейтральном буфере, содержащем эксципиенты, используя колонки Sephadex G25 (GE Healthcare 17058401).
[0085] Концентрации вариантов очищенных однодоменных антител к HSA определяли по абсорбции при длине волны 280 нм, как описано в Примере 3. Очищенные белки оценивали, используя SDS-PAGE и аналитическую SEC (эксклюзивную хроматографию) на колонке Yarra 2000 SEC (Phenomenex 00Н-4512-Е0) с применением фосфатного буфера, содержащего растворитель, в аппарате 1200 LC при помощи компьютерной программы Chemstation (Agilent). Пики, соответствующие димеру и мономеру, интегрировали вручную, полученные величины показаны на Фигуре 5.
SEP
Ш NO:
Описание
Последовательность АА
CDR1 с вариантами положений
GFX1X2X3X4FGMS
CDR2 с вариантами положений
SISGSGXsXeTLYAXvSXgK
CDR3 с вариантами положений
GGSLX9X10
Клон 6С анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSRFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT AVYYCTIGGSLSRS SQGTL VT VS S
Клон 7А анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGADTLYADSLKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT A VYYCTIGGSLSKS SQGTL VTVS S
Клон 7G анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTYSSFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT A VYYCTIGGSLSKS SQGTL VTVS S
Клон 8Н анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGTDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT AVYYCTIGGSLSRS SQGTL VTVS S
Клон 9А анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSRFGMSWVRQAPG
KGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT A VYYCTIGGSLSKS SQGTL VTVS S
Клон 10G анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT A VYYCTIGGSLSVS SQGTL VTVS S
wt анти-HSA
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT AVYYCTIGGSLSRS SQGTL VTVS S
CDR1 wt анти-HSA
GFTFSSFGMS
CDR2 wt анти-HSA
SISGSGSDTLYADSVK
CDR3 wt анти-HSA
GGSLSR
CDR1 вариант 1
GFTFSRFGMS
CDR1 вариант 2
GFTFSKFGMS
CDR1 вариант 3
GFTYSSFGMS
CDR2 вариант 1
SISGSGADTLYADSLK
CDR2 вариант 2
SISGSGTDTLYADSVK
CDR2 вариант 3
SISGSGRDTLYADSVK
CDR2 вариант 4
SISGSGSDTLYAESVK
CDR2 вариант 5
SISGSGTDTLYAESVK
CDR2 вариант 6
SISGSGRDTLYAESVK
CDR3 вариант 1
GGSLSK
CDR3 вариант 2
GGSLSV
Клон 6СЕ анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSRFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGSDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNS LRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Клон 8НЕ анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGTDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT AVYYCTIGGSLSRS SQGTL VTVS S
Клон 10GE анти-HSA sdAb
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPG KGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDT A VYYCTIGGSLSVS SQGTL VTVS S
Примерная линкерная последовательность
(GS)n
Примерная линкерная последовательность
(GGS)n
Примерная линкерная последовательность
(GGGS)n
Примерная линкерная последовательность
(GGSG)n
Примерная линкерная последовательность
(GGSGG)n
Примерная линкерная последовательность
(GGGGS)n
Примерная линкерная последовательность
(GGGGG)n
Примерная линкерная последовательность
(GGG)n
Примерная линкерная последовательность
(GGGGS)3
Примерная линкерная последовательность
(GGGGS)4
6Х гистидин
HHHHHH
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ХАРПУН ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
<120> ОДНОДОМЕННЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН
<130> 47517-703.601
<140> <141>
<150> 62/339,682
<151> 2016-05-20 <160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3)
<223> Thr, Arg, Lys, Ser или Pro
<220>
<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe или Tyr
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Ser, Arg или Lys
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> Ser, Lys, Arg или Ala
<400> 1
Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 2 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser, Arg, Thr или Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Asp, His, Val или Thr
<220>
<221> MOD_RES <222> (13)..(13)
<223> Asp, His, Arg или Ser
<220>
<221> MOD_RES <222> (15)..(15)
<223> Val или Leu
<400> 2
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Xaa Xaa Thr Leu Tyr Ala Xaa Ser Xaa Lys
1 5 10 15
<210> 3 <211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Ser, Arg, Thr или Lys
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> Arg, Lys, Val, Pro или Asn
<400> 3
Gly Gly Ser Leu Xaa Xaa 1 5
<210> 4 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 5 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Ser 115
<210> 6 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 7 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 8 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Ser
<210> 9 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 10 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 11
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 12 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 12
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 13 <211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 13
Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5
<210> 14 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 14
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 15 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 15
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 16 <211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 16
Gly Phe Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 17 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 17
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ala Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 18 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 18
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 19 <211> 16 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 19
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 20 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 20
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 21 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 21
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 22 <211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 22
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 23
Gly Gly Ser Leu Ser Lys
1 5
<210> 24 <211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 24
Gly Gly Ser Leu Ser Val
1 5
<210> 25 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Ser 115
<210> 26 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 27 <211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 28 <211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 28
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser 20
<210> 29 <211> 30
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 29 Gly Gly Ser 1
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 30
<211> 40
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40
<210> 31 <211> 40
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Ser Gly" повторяющихся звеньев
<400> 31
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
<210> 32 <211> 50
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Ser Gly Gly" повторяющихся звеньев
<400> 32
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly 50
<210> 33 <211> 50
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Gly Gly Ser" повторяющихся звеньев
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
<210> 34 <211> 50 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Gly Gly Gly" повторяющихся звеньев
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly 50
<210> 35 <211> 30
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30)
<223> Эта область может включать 1-10 "Gly Gly Gly" повторяющихся звеньев
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 36
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser 20
<210> 38
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая метка 6xHis
<400> 38
His His His His His His 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержащий
области (участки), определяющие комплементарность, CDR1, CDR2 и CDR3, где
(a) аминокислотная последовательность CDR1 представлена последовательностью GFX1X2X3X4FGMS (SEQ Ш NO. 1), где Xi обозначает треонин, аргинин, лизин, серии или пролин, Х2 обозначает фенилаланин или тирозин, Хз означает серии, аргинин или лизин, Х4 означает серии, лизин, аргинин или аланин;
(b) аминокислотная последовательность CDR2 представлена последовательностью SISGSGXsXeTLYAXvSXgK (SEQ Ш N0. 2), где Х5 обозначает серии, аргинин, треонин или аланин, Хб обозначает аспарагиновую кислоту, гистидин, валин или треонин, Х7 обозначает аспарагиновую кислоту, гистидин, аргинин или серии, Xs обозначает валин или лейцин; и
(c) аминокислотная последовательность CDR3 представлена последовательностью GGSLX9X10 (SEQ ID N0. 3), где Х9 обозначает серии, аргинин, треонин или лизин и Хю обозначает аргинин, лизин, валин, пролин или аспарагин, при этом Xi, Х2, Хз, Х4, Х5, Хб, Х7, Xs, Х9 и Хю не обозначают одновременно треонин, фенилаланин, серии, серии, серии, аспарагиновую кислоту, аспарагиновую кислоту, валин, серии и аргинин, соответственно.
2. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 1, в котором
указанный белок соответствует следующей формуле:
fl-rl-f2-r2-f3-r3-f4,
где rl обозначает последовательность SEQ ГО NO. 1; г2 обозначает последовательность SEQ ГО N0. 2; и гЗ обозначает последовательность SEQ ГО N0. 3; и где fi, f2, f3 и U обозначают остатки каркасной области, выбранные таким образом, чтобы указанный белок был по меньшей мере на восемьдесят процентов идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ГО N0. 10. .
3. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 2, в котором rl включает SEQ ГО N0. 14, SEQ ГО N0. 15 или SEQ ГО N0. 16.
4. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 2, в котором г2 включает SEQ ГО N0. 17, SEQ ГО N0. 18, SEQ ГО N0. 19, SEQ ГО N0. 20, SEQ ГО N0. 21 или SEQ ГО N0. 22.
5. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 2, в котором гЗ включает SEQ ГО N0. 23 или SEQ ГО N0. 24.
3.
6. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ Ш N0. 14.
7. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ Ш N0. 15, г2 обозначает SEQ Ш N0. 17 и гЗ обозначает SEQ ГО N0.23.
8. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 16, гЗ включает SEQ ГО N0. 23.
9. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 15 и г2 включает SEQ ГО N0. 18.
10. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 14 и гЗ включает SEQ ГО N0. 23.
11. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 15, г2 включает SEQ ГО N0. 19 и гЗ включает SEQ ГО N0. 24.
12. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 14 и г2 включает SEQ ГО N0. 20.
13. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 15 и г2 включает SEQ ГО N0. 21.
14. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 2-5, в котором rl включает SEQ ГО N0. 15, г2 включает SEQ ГО N0. 22 и гЗ comprises SEQ ГО N0. 24.
15. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 1, где указанный белок имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ГО N0. 4, SEQ ГО N0. 5, SEQ ГО N0. 6, SEQ ГО N0. 7, SEQ ГО N0. 8, SEQ ГО N0. 9, SEQ IN N0. 25, SEQ ГО N0. 26 и SEQ ГО N0. 27.
16. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-15, где указанный белок связывается с сывороточным альбумином, выбранным из человеческого сывороточного альбумина, сывороточного альбумина яванского макака и мышиного сывороточного альбумина.
17. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-16, где указанный белок связывается с человеческим сывороточным альбумином и с сывороточным альбумином яванского макака со сравнимой аффинностью связывания (Kd).
18. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-17, где указанный белок связывается с мышиным сывороточным альбумином с
3.
аффинностью связывания (Kd), которая от около 1.5 до около 20 раз слабее аффинности связывания (Kd) указанного белка по отношению к сывороточному альбумину человека и яванского макака.
19. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-18, где указанный белок связывается с человеческим сывороточным альбумином с величиной Kd (hKd) между около 1 нМ и около 100 нМ, а с сывороточным альбумином яванского макака с величиной Kd (cKd) между 1 нМ и 100 нМ.
20. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 19, где величина hKd и cKd составляет между 1 нМ и около 5 нМ, или между около 5 нМ и около 10 нМ.
21. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 20, где величина hKd и cKd составляет между 1 нМ и около 2 нМ, или между около 2 нМ и около 3 нМ и между около 3 нМ и около 4 нМ, между около 4 нМ и около 5 нМ, между около 5 нМ и около 6 нМ, между около 6 нМ и около 7 нМ, между около 7 нМ и около 8 нМ, между около 8 нМ и около 9 нМ или между около 9 нМ и около 10 нМ.
22. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 16-21, где соотношение между hKd и cKd (hKd : cKd) однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, находится в пределах от около 20:1 до около 1: 2.
23. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 4, и где величина hKd и cKd находится между около 1 нМ и около 5 нМ.
24. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 5, и где величина hKd и cKd находится между около 1 нМ и около 5 нМ.
25. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 6, и где величина hKd и cKd находится между около 1 нМ и около 5 нМ.
26. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 7, и где величина hKd и cKd находится между около 1 нМ и около 5 нМ.
19.
27. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 8, и где величина hKd и cKd находится между около 5 нМ и около 10 нМ.
28. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 9, и где величина hKd и cKd находится между около 1 нМ и около 5 нМ.
29. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 10, и где величина hKd и величина cKd находится между около 1 нМ и около 5 нМ.
30. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 26, и где величина hKd и cKd находятся между около 1 нМ и около 5 нМ.
31. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-22, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0. 27, и где величина hKd и величина cKd находятся между около 1 нМ и около 5 нМ.
32. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-31, где указанный белок имеет период полувыведения, составляющий по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 40 часов, по меньшей мере 45 часов, по меньшей мере 50 часов или по меньшей мере 100 часов.
33. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержащий области CDR1, CDR2 и CDR3, который включает последовательность, представленную как SEQ Ш N0. 10 (wt анти-HSA), в которой один или более аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных остатков в положениях 28, 29, 30 или 31 области CDR1; в положениях 56, 57, 62 или 64 области CDR2; и в положениях 103 и 104 области CDR3 заменены, причём
аминокислота в положении 28 заменена на аргинин, лизин, серии или пролин, аминокислота в положении 29 заменена на тирозин,
аминокислота в положении 30 заменена на аргинин или лизин, аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аргинин или аланин,
аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, треонин или аланин, аминокислота в положении 57 заменена на гистидин, валин или треонин, аминокислота в положении 62 заменена на гистидин, аргинин глутаминовую кислоту или серии,
аминокислота в положении 64 заменена на лейцин,
аминокислота в положении 103 заменена на аргинин, треонин или лизин, аминокислота в положении 104 заменена на лизин, валин, пролин или аспарагин.
34. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33, который содержит одну или более дополнительных замен в других положениях аминокислотных остатков, отличных от положений 28, 29, 30, 31, 56, 57, 62, 64, 103 и 104.
35. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замену в положении 29.
36. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замену в положении 31.
37. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замену в положении 56.
38. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замену в положении 62.
39. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замену в положении 64.
40. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замену в положении 104.
41. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или
п. 34, который содержит замену в положениях 31 и 62 аминокислоты.
42. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 36, где аминокислота в положении 31 заменена на аргинин.
43. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 41, где аминокислота в положении 31 заменена на аргинин и аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту.
44. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, который содержит замены в положениях аминокислот 31, 56, 64 и 104.
45. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин по, п. 44, где аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аланин, аминокислота в положении 64 заменена на лейцин и аминокислота в положении 104 заменена на лизин.
42.
46. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 33 или п. 34, в котором аминокислоты в положениях 29 и 104 заменены.
47. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 46, в котором аминокислота в положении 29 заменена на тирозин и аминокислота в положении 104 заменена на лизин.
48. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. п. 33 или 34, в котором аминокислоты в положениях 31 и 56 заменены.
49. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 48, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин и аминокислота в положении 56 заменена на треонин.
50. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. п. 33 или 34, в котором аминокислоты в положениях 31, 56 и 62 заменены.
51. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин по п. 50, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на треонин и аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту.
52. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. п. 33 или 34, в котором аминокислоты в положениях 31 и 104 заменены.
53. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 52, в котором аминокислота в положении 31 заменена на аргинин и аминокислота в положении 104 заменена на лизин.
54. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. п. 33 или 34, в котором аминокислоты в положениях 31, 56 и 104 заменены.
55. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 54, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин и аминокислота в положении 104 заменена на валин.
56. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. п. 33 или 34, в котором аминокислоты в положениях 31, 56, 62 и 104 заменены.
57. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 56, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту и аминокислота в положении 104 заменена на валин.
58. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-57, который связывается с человеческим сывороточным альбумином и с сывороточным альбумином яванского макака со сравнимой аффинностью связывания (Kd).
42.
59. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-58, который связывается с мышиным сывороточным альбумином с аффинностью связывания (Kd), которая от около 1.5 до около 20 раз слабее аффинности связывания (Kd) указанного белка по отношению к сывороточному альбумину человека и яванского макака.
60. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-59, который связывается с человеческим сывороточным альбумином с аффинностью связывания (Kd) (hKd) между около 1 нМ и около 100 нМ, и с сывороточным альбумином яванского макака с величиной Kd (cKd) между 1 нМ и 100 нМ.
61. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-60, где величина hKd и cKd составляет между 1 нМ и около 5 нМ или между около 5 нМ и около 10 нМ.
62. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-61, где величина hKd и cKd составляет между 1 нМ и около 2 нМ, или между около 2 нМ и около 3 нМ, между около 3 нМ и около 4 нМ, между около 4 нМ и около 5 нМ, между около 5 нМ и около 6 нМ, между около 6 нМ и около 7 нМ, между около 7 нМ и около 8 нМ, между около 8 нМ и около 9 нМ или между около 9 нМ и около 10 нМ.
63. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-62, где указанный белок связывается с человеческим сывороточным альбумина с величиной Kd(hKd) и с сывороточным альбумином яванского макака с величиной Kd (cKd) и где соотношение между hKd и cKd (hKdxKd) составляет между 20:1 и 1: 2.
64. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на аргинин и в котором величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
65. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту, и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
66. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аланин, аминокислота в положении 64 заменена на лейцин, аминокислота в положении 104 заменена на лизин, и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
67. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 29 заменена на тирозин, аминокислота в
42.
положении 104 заменена на лизин и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
68. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на треонин и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
69. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на треонин и аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту, и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
70. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на аргинин, аминокислота в положении 104 заменена на лизин, и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
71. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, аминокислота в положении 104 заменена на валин и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
72. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-63, в котором аминокислота в положении 31 заменена на лизин, аминокислота в положении 56 заменена на аргинин, аминокислота в положении 62 заменена на глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 104 заменена на валин и где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 5 нМ.
73. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 33-72, который имеет период полувыведения, составляющий по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 20 ч, по меньшей мере 25 ч, по меньшей мере 30 ч, по меньшей мере 35 ч, по меньшей мере 40 ч, по меньшей мере 45 ч, по меньшей мере 50 ч или по меньшей мере 100 ч.
74. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, содержащий по меньшей мере одну мутацию в CDR1, CDR2 или CDR3, при этом CDR1 содержит последовательность, представленную в SEQ Ш N0:11, CDR2 содержит последовательность, представленную в SEQ Ш N0:12, CDR3 содержит последовательность, представленную в SEQ Ш NO. 13, и по меньшей мере одна мутация не является мутацией в положениях аминокислотных остатков 1, 2, 7, 8, 9 или 10 в
68.
последовательности SEQ Ш NO: 11, в положениях 1, 3, 6, 10 или 11 в последовательности SEQ Ш N0: 12 или в положениях 1 или 2 в последовательности SEQ Ш N0: 13.
75. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 74, содержащий по меньшей мере одну мутацию в положениях аминокислотных остатков, выбранных из положений 3, 4, 5 и 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0: 11), положений аминокислот 7, 8, 13 и 15 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) и положений аминокислот 5 и 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13).
76. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 75, содержащий одну или более замен в положениях аминокислотных остатков, отличных от положений 3, 4, 5 и 6 в области CDR1 (SEQ ГО N0: 11), положениях аминокислотных остатков 7, 8, 13 и 15 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) и положениях аминокислотных остатков 5 и 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13).
77. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11).
78. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11) и в положении аминокислотных остатков 13 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12).
79. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11), в положениях аминокислотных остатков 7 и 15 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12) и в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13).
80. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 4 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11) и в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR3 (SEQ ГО N0: 13).
81. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ ГО N0:11) и в положении аминокислотных остатков 7 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12).
82. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ ГО NO: 11) и в положениях аминокислотных остатков 7 и 13 в области CDR2 (SEQ ГО N0: 12).
75.
83. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ Ш N0:11) и в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13).
84. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ Ш N0:11), в положении аминокислотных остатков 7 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) и в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13).
85. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-76, содержащий мутацию в положении аминокислотных остатков 6 в области CDR 1 (SEQ Ш N0:11), в положениях аминокислотных остатков 7 и 13 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) и в положении аминокислотных остатков в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13).
86. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-85, который связывается с человеческим сывороточным альбумином и с сывороточным альбумином японского макака со сравнимой аффинностью связывания (Kd).
87. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-86, который связывается с мышиным сывороточным альбумином с аффинностью связывания (Kd), которая от около 1.5 до около 20 раз слабее аффинности связывания (Kd) указанного белка по отношению к сывороточному альбумину человека и яванского макака.
88. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-87, который связывается с человеческим сывороточным альбумином с аффинностью связывания (Kd) (hKd) между около 1 нМ и около 100 нМ, и с сывороточным альбумином яванского макака с величиной Kd (cKd) между 1 нМ и 100 нМ.
89. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-88, где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ или от около 5 нМ и около 10 нМ.
90. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-89, где величина hKd и величина cKd составляют между около 1 нМ и около 2 нМ, или между около 2 нМ и около 3 нМ, между около 3 нМ и около 4 нМ, между около 4 нМ и около 5 нМ, между около 5 нМ и около 6 нМ, между около 6 нМ и около 7 нМ, между около 7 нМ и около 8 нМ, между около 8 нМ и около 9 нМ или между около 9 нМ и около 10 нМ.
75.
91. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-90, который связывается с человеческим сывороточным альбумином с аффинностью связывания Kd(hKd) и с сывороточным альбумином яванского макака с аффинностью связывания Kd (cKd), и где соотношение между hKd и cKd (hKdxKd) составляет между 20: 1 и 1: 2.
92. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена (мутирована) на аргинин, и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
93. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на аргинин, аминокислота в положении 13 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) заменена на глутаминовую кислоту и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
94. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на лизин, аминокислоты в положении 7 и 15 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) заменены на аланин и лейцин, соответственно, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13) заменена на лизин и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
95. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 4 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на тирозин, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13) заменена на лизин, и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
96. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на лизин, аминокислота в положении 7 of CDR2 (SEQ Ш N0: 12) заменена на треонин, и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
97. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на лизин, аминокислоты в положении 7 и 13 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) заменены на треонин и глутаминовую кислоту, соответственно, и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
75.
98. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на аргинин, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 12) заменена на лизин, и где величина hKd и величина cKd составляют между 5 нМ и около 10 нМ.
99. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на лизин, аминокислота в положении 7 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) заменена на аргинин, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13) заменена на валин, и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
100. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-91, в котором аминокислота в положении 6 в области CDR1 (SEQ Ш N0:11) заменена на лизин, аминокислоты в положении 7 и 13 в области CDR2 (SEQ Ш N0: 12) заменены на аргинин и глутаминовую кислоту, соответственно, аминокислота в положении 6 в области CDR3 (SEQ Ш N0: 13) заменена на валин, и где величина hKd и величина cKd составляют между 1 нМ и около 5 нМ.
101. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 74-100, который имеет период полувыведения, составляющий по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 20 ч, по меньшей мере 25 ч, по меньшей мере 30 ч, по меньшей мере 35 ч, по меньшей мере 40 ч, по меньшей мере 45 ч, по меньшей мере 50 ч или по меньшей мере 100 ч.
102. Полинуклеотид, кодирующий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101.
103. Вектор, включающий полинуклеотид по п. 102.
104. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 103.
105. Фармацевтическая композиция, содержащая (i) однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, полинуклеотид по п. 102, вектор по п. 103 или клетку-хозяина по п. 104 и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
106. Способ получения однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, включающий культивирование хозяина, трансформированного или трансфицированного с использованием вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, в условиях, предусматривающих
100.
экспрессию однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, и выделение и очистку полученного белка от культуры.
107. Способ лечения или уменьшения интенсивности пролиферативного заболевания, опухолевого заболевания, воспалительного заболевания, иммунологического нарушения, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, аллергической реакции, паразитарной (инвазионной) реакции, болезни "трансплантат-против-хозяина" или "хозяин-против-трансплантата", включающий введение однодоменного белка, связывающего сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101 субъекту, нуждающемуся в этом.
108. Способ по п. 107, где субъектом является человек.
109. Способ по п. 108, который также включает введение агента в комбинации с однодоменным белком, связывающим сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-100.
110. Мультиспецифичный связывающий белок, содержащий однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. 1, п. 33 или п. 74.
111. Антитело, содержащее однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. 1, п. 33 или п. 74.
112. Мультиспецифичное антитело, биспецифичное антитело, sdAb (однодоменное антитело), вариабельный домен тяжёлой цепи, пептид или лиганд, содержащие однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 1, п. 33 или п. 74.
113. Антитело, содержащее однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по п. 1, п. 33 или п. 74, при этом антитело представляет собой однодоменное антитело.
114. Однодоменное антитело по п. 113, полученное из вариабельной области тяжёлой цепи IgG.
115. Мультиспецифичный связывающий белок или антитело, содержащие однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. 1, п. 33 или п. 74 и CD3 связывающий домен.
116. Способ лечения или уменьшения интенсивности пролиферативного заболевания, опухолевого заболевания, воспалительного заболевания, иммунологического нарушения, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, аллергической реакции, паразитарной (инвазионной) реакции, болезни "трансплантат-против-хозяина" или "хозяин-против-трансплантата", включающий введение мультиспецифичного антитела по любому из п. п. 111-115 субъекту, нуждающемуся в этом.
107.
117. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 4.
118. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 7.
119. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 9.
120. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 26.
121. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 27.
122. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 5.
123. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 6.
124. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 8.
125. Однодоменный белок, связывающий сывороточный альбумин, по любому из п. п. 1-101, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ГО N0. 25.
107.
Масса антигена (Ад) (нг)
Масса Ад (нг)
Клон
hKd
cKd
тКн
4 нм
4.1 нм
42.5 нм
2.3 нм
2.4 нм
17.3 нм
1.9 нм
1.7 нм
12.3 нм
3.2 нм
3.6 нм
32.9 нм
2.7 нм
2.6 нм
14.5 нм
6.0 нм
7.5 нм
10G
2.2 нм
2.3 нм
15.7 нм
6СЕ
2.1 нм
2.2 нм
16.8 нм
8НЕ
2.1 нм
2.0 нм
16.7 нм
10GE
1.6 нм
1.6 нм
16.1 нм
Варианты однодоменного анти-HSA
Ть ( °С)
64.9
59.1
57.3
66.2
10G
70.7
6СЕ
8НЕ
65.9
10GE
71.1
Варианты однодоменного
% димера
% мономера
анти-HSA
3.9
96.1
6.1
93.9
35.1
64.9
5.5
94.5
10G
1.3
98.7
(19)
(19)
(19)
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Lys Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
115
115
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40
Gly Ser 50
Gly Ser 50
1/5
ФИГУРА 1
1/5
ФИГУРА 1
3/5
ФИГУРА 3
3/5
ФИГУРА 3
4/5
ФИГУРА 4
4/5
ФИГУРА 4