(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к соединениям и их применению. В частности, к соединениям, которые ингибируют активируемую протеазами передачу эндосомального сигнала рецептора-2 (PAR 2 ), и их применению при лечении боли.
Евразийское (21) 201892672 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.19
(51) Int. Cl.
A61K31/5025 (2006.01) A61K31/166 (2006.01) A61K31/427 (2006.01) A61P25/00 (2006.01) A61P29/00 (2006.01)
(54) ЛЕЧЕНИЕ БОЛИ
(31) 2016901912
(32) 2016.05.20
(33) AU
(86) PCT/AU2017/050469
(87) WO 2017/197463 2017.11.23
(71) Заявитель:
ТАКЕДА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ ЛИМИТЕД (JP)
(72) Изобретатель: Баннет Найджел (AU)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к соединениям и их применению. В частности, к соединениям, которые ингибируют активируемую протеаза-ми передачу эндосомального сигнала рецептора-2 (PAR2), и их применению при лечении боли.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-553543ЕА/018 ЛЕЧЕНИЕ БОЛИ
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к соединениям и их применению. В частности, к соединениям, которые ингибируют активируемую протеазами передачу эндосомального сигнала рецептора-2 (PAR2) , и их применению при лечении боли.
Предпосылки изобретения
Рецепторы, связанные с G-белком, (GPCR) являются крупнейшим семейством рецепторов клеточной поверхности, участвуют в большинстве патофизиологических процессов и являются мишенью для -30% терапевтических препаратов (Audet, М. & Bouvier, М. Nat Chem Biol 2008, 4, 397-403). Расположенные на клеточной поверхности GPCR взаимодействуют с внеклеточными лигандами и связываются с гетеротримерными G-белками, которые инициируют трансмембранную передачу сигналов от плазматической мембраны (формирование второго мессенджера, трансактивация рецептора фактора роста, регулирование ионного канала). Удаление лиганда и ассоциация рецептора с р-аррестинами (Parr) прекращают действие сигналов от плазматической мембраны.
До недавнего времени существовало широко распространенное мнение о том, что активация GPCR, последующая передача сигналов и сигнал терминации происходят исключительно на плазматической мембране. Передача сигналов на плазматической мембране прекращается в течение минут после активации посредством фосфорилирования рецептора GPCR-киназами (GRK), которые являются селективными по конформации рецепторов, связанных с лигандом. GRK фосфорилируют С-концевые S/T-обогащенные домены GPCR (Sato, P.Y., et al. , Physiological reviews 2015, 95, 377-404) . Затем фосфорилированные рецепторы связываются с Parr, который стерически предотвращает связывание между рецептором и G-белком, таким образом завершая активацию G-белка, опосредованную агонистом. Parr дополнительно стимулируют перенос рецептора, связанного с лигандом, с поверхности клетки на ранние эндосомы
за счет динамин- и клатрин-зависимого эндоцитоза. После эндоцитоза лиганд и фосфатные группы удаляются из GPCR, и рецептор либо быстро перераспределяется на клеточную мембрану, либо переносится в лизосому и деградирует.
Однако в последнее время было обнаружено, что широкий
диапазон GPCR не всегда следует традиционной парадигме.
Исследования показали, что после связывания лиганда и активации
рецептора некоторые клеточные поверхностные GPCR
интернализируются и перераспределяются в ранние эндосомы, где передача сигналов с участием гетеротримерного G-белка поддерживается в течение длительного периода времени. Соответственно, вместо того, чтобы просто выступать в качестве канала для направленной миграции GPCR к путям рециркуляции или деградации, эндосомы могут являться жизненно важным участком трансдукции сигнала (Murphy, J.E. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17615-17622). За счет рекрутинга GPCR и активированных митогеном протеинкиназ в эндосомы Parr могут опосредовать эндосомную передачу сигналов GPCR (Murphy, J.E. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17 615-17 622; DeFea, K. A. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 1108 6-11091; DeFea, K. A. et al. J Cell Biol 2000, 148, 1267-1281) .
Parr рекрутируют различные сигнальные белки к активированным рецепторам на плазматической и эндосомальной мембранах и являются важными посредниками передачи сигнала. Каскады МАРК [ERK, c-Jun амино-концевая киназа (JNK), р38] являются наиболее подробно охарактеризованными Parr-зависимыми путями передачи сигналов. Первым свидетельством того, что Parr являются активными участниками сигнального пути, было наблюдение р2АК-вызванного ингибирования активации ERAR1/2 у доминантно-негативных мутантов Parr (Daaka Y, et al. J Biol Chem 1998, 273, 685-688). Позже было обнаружено, что Parr связывают p2AR с c-Src и опосредуют активацию ERK1/2 (Lutterall LM et al. Science 1999, 283, 655661) . Подобным образом Parr участвуют в сигнальном пути ERK1/2 других GPCR, включая рецептор нейрокинина-1 (NKiR) , активируемый протеазой рецептор 2 (PAR2) , 1А1-рецептор ангиотензина II типа
(ATiAR) И У2-рецептор вазопрессина (V2R). Эти данные привели к мнению, что |3агг представляют собой клеточные каркасы, которые соединяют активированные GPCR с сигнальными комплексами МАРК. Таким образом, Parr опосредуют вторую волну передачи сигналов GPCR, отличную от G-зависимой от белка передачи сигналов на плазматической мембране.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что ингибирование передачи эндосомального сигнала PAR2 может быть обеспечить новый способ лечения боли, вызванной протеазами. Активируемый протеазой рецептор-2 (PAR2) является основным посредником воспаления и боли, вызванной протеазами. PAR2 экспрессируется первичными сенсорными нейронами, которые контролируют нейрогенное воспаление и передачу боли. Различные протеазы, которые образуются во время травмы и воспаления, могут активировать PAR2 на сенсорных нервах, включая трипсин IV, полученный из эпителия, триптазу тучных клеток, катепсин S макрофагов и нейтрофильную эластазу. Эти протеазы расщепляют и активируют PAR2 на первичных сенсорных нервах, что приводит к сенсибилизации ионных каналов с транзиторным рецепторным потенциалом и высвобождению нейропептидов (пептида, связанного с веществом Р и кальцитонином). Эти пептиды вызывают периферическое воспаление и центральную передачу боли. Трипсин и триптаза активируют PAR2 каноническими механизмами, что приводит к рекрутингу р-аррестинов и эндоцитозу PAR2.
В настоящее время было обнаружено, что ингибирование передачи эндосомального сигнала PAR2 путем предотвращения эндоцитоза активированного рецептора или путем нацеливания и ингибирования передачи эндосомального сигнала PAR2 является новым способом лечения боли, вызванной протеазами.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения боли, вызванной протеазами, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту соединения, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала активируемого протеазой рецептора-2 (PAR2) .
В одном аспекте соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое ингибирует эндоцитоз активированного рецептора.
В другом аспекте соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2.
В следующем аспекте, соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой трехкомпонентное соединение формулы (I), которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2:
где
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану;
L представляет собой линкерный фрагмент длиной от 1 нм до 50 нм; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2 ;
где липидный якорь распределен в липидных мембранах, которые являются нерастворимыми в неионном детергенте при температуре 4°С; или
его фармацевтически приемлемую соль.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения боли, вызванной протеазами, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту комбинации, содержащей одно или несколько соединений, которые ингибируют эндоцитоз рецептора, и одно или несколько соединений, которые таргетируют или ингибируют передачу эндосомального сигнала PAR2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к
применению соединения, которое ингибирует передачу
эндосомального сигнала PAR2, при производстве лекарственного средства для лечения боли, вызванной протеазами.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, для применения в лечении боли, вызванной протеазами.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут более понятными специалисту из следующего далее подробного описания в сочетании с прилагаемыми примерами и формулой изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фигура 1: Анализы BRET с маркером плазматической мембраны, RIT-venus. (а) Кинетика ABRET при стимуляции тремя известными агонистами PAR2. (Ь) Трипсин CRC (полученный по данным AUC) . (с) Изменение индуцированной трипсином направленной миграции в результате 30-минутной предварительной обработки различными эндоцитарными ингибиторами и контрольными соединениями. Данные представлены в виде средних значений+SEM по меньшей мере для трех независимых экспериментов, каждый из которых включает три повтора для каждого условия.
Фигура 2: Анализы BRET с маркером ранних эндосом, Rab5a-venus. (а) Кинетика ABRET при стимуляции тремя известными агонистами PAR2. (Ь) Трипсин CRC (полученный по данным AUC) . (с) Изменение индуцированной трипсином направленной миграции в результате 30-минутной предварительной обработки различными эндоцитарными ингибиторами и контрольными соединениями. Данные представлены в виде средних значений+SEM по меньшей мере для трех независимых экспериментов, каждый из которых включает три повтора для каждого условия.
Рисунок 3: Анализы FRET с цитозольным сенсором ERK, CytoEKAR. (а) Кинетика AFRET при стимуляции двумя известными агонистами PAR2. (Ь) Трипсин CRC (полученный по данным AUC) . (с) Изменение индуцированного трипсином сигнального пути в результате 30-минутной предварительной обработки различными эндоцитарными ингибиторами и контрольными соединениями. Данные представлены в виде средних значений+SEM по меньшей мере для трех независимых экспериментов, каждый из которых включает три повтора для каждого условия.
Фигура 4. Анализы FRET с ядерным сенсором ERK, NucEKAR. (а) Кинетика AFRET при стимуляции двумя известными агонистами PAR2. (b) Трипсин CRC (полученный по данным AUC). (с) Изменение индуцированного трипсином сигнального пути в результате 30-минутной предварительной обработки различными эндоцитарными ингибиторами и контрольными соединениями. Данные представлены в виде средних значений+SEM по меньшей мере для трех независимых экспериментов, каждый из которых включает три повтора для каждого условия.
Фигура 5. Анализы повторной сенсибилизации BRET. (а) Кинетика ABRET при стимуляции тремя известными агонистами PAR2. (b) Изменение способа направленной миграции, вызванной протеазами, в результате 30-минутной предварительной обработки различными ингибиторами сигнализации. Данные представлены в виде средних значений+SEM по меньшей мере для трех независимых экспериментов, каждый из которых включает три повтора для каждого условия.
Фигура б. Возбуждение нейронов в случае изолированных DRG нейронов и их ингибирование с помощью ингибиторов эндоцитоза PAR2.
Фигура 7. Возбуждение нейронов в случае изолированных DRG нейронов и их ингибирование с помощью ингибиторов эндоцитоза PAR2.
Фигура 8. Ингибирование вызванной трипсином механической гипералгезии у мышей.
Фигура 9. Ингибирование вызванной трипсином механической гипералгезии у мышей.
Подробное описание изобретения
Был оценен вклад эндоцитоза активируемого протеазой рецептора-2 (PAR2) в возникновении сигналов в субклеточных компартментах, которые опосредуют вызванную протеазами сенсибилизацию ноцицепторов. Для оценки близости PAR2 к резидентным белкам плазматической мембраны (KRa) и эндосомам (Rab5a) в клетках НЕК использовали резонансный перенос энергии флуоресценции (BRET). Канонический агонист трипсина, который
расщепляет PAR2 при R36|S37, увеличивает BRET между PAR2 и Rab5a и
уменьшает BRET между PAR2 и KRa, что согласуется с эндоцитозом.
Агонисты смещенной активности катепсин-S и эластаза, которые,
соответственно, расщепляют PAR2 при Е56|Т57 и A66 j S67 |V68, не
индуцировали эндоцитоз PAR2. Для определения способности протеаз
генерировать сигналы в субклеточных компартментах клеток НЕК и
нейронах спинального ганглия крысы были использованы биосенсоры
резонансного переноса энергии Ферстера (FRET) , нацеленные на
плазматическую мембрану, цитозоль или ядро. Трипсин
(интернализация) активировал сАМР и протеинкиназу С (РКС) на
плазматической мембране и в цитозоле, а внеклеточный сигнал
регулировал киназу (ERK) в ядре и цитозоле. Катепсин-S и
эластаза (не-интернализация) активировали только сАМР и РКС на
плазматической мембране и ERK в цитозоле. Ингибитор динамина
Dyngo4a, ингибитор клатрина Pitstop2 и доминантно-негативный Р~
аррестин ингибировали вызванный трипсином эндоцитоз PAR2 и
предотвращали вызванную трипсином активацию цитозольных сАМР и
РКС и ядерного ERK. Эти результаты согласуются с ролью
эндоцитоза PAR2 в активации цитозольных сАМР и РКС и ядерной ERK.
Для изучения связи между эндоцитозом PAR2,
компартментализированным сигнальным путем и сенсибилизацией ноцицептора осуществляли перфорированную пэтч-кламп регистрацию нейронов спинального ганглия мыши. Предварительная инкубация нейронов с трипсином, катепсином-S или эластазой вызывала немедленное повышение возбудимости, определяемое снижением порога гальванической возбудимости и повышением потенциала действия, которое поддерживалось в течение 30 мин после вымывания протеазы. Dyngo4a и Pitstop2 не влияли на начальную гипервозбудимость, вызванную протеазой, но предотвращали устойчивую возбудимость к трипсину, но не катепсину-S или эластазе. Влияние протеаз на возбудимость блокировалось PAR2-антагонистом GB8 8. Таким образом, канонические протеазы и протеазы смещенной активности сенсибилизируют ноцицепторы различными механизмами. Для канонических агонистов эндоцитоз PAR2 генерирует компартментализированные сигнальные пути субклеточных
компартментов, которые лежат в основе устойчивой возбудимости ноцицептивных нейронов. Ингибирование передачи эндосомального сигнала PAR2 может являться новым способом лечения боли, вызванной протеазами.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения боли, вызванной протеазами, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту соединения, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2.
В одном аспекте соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое ингибирует эндоцитоз активированного рецептора.
Понятно, что соединение, которое ингибирует эндоцитоз PAR2, может действовать на любом участке или на нескольких участках пути между фосфорилированием внутриклеточного С-конца активированного PAR2 и последующим динамин- и клатрин-зависимым эндоцитозом рецептора к ранним эндосомам.
В одном варианте осуществления изобретения ингибирование эндоцитоза PAR2 может быть осуществлено путем введения нуждающемуся в этом субъекту ингибитора р-аррестина. Как используется в настоящем документе, термин "ингибитор Р~ аррестина" обозначает соединение, которое ингибирует взаимодействие между р-аррестином и внутриклеточным С-концом активированного PAR2.
Предполагается, что в одном варианте осуществления изобретения ингибирование взаимодействия между Parr и внутриклеточным С-концом активированного PAR2 может быть осуществлено путем введения субъекту ингибитора р-аррестина, который конкурирует с сайтами фосфорилирования на внутриклеточном С-конце активированного PAR2 путем предоставления альтернативного сайта для фосфорилирования GPCR киназы-2 (GRK2), тем самым уменьшая или улучшая связывание Parr с внутриклеточным С-концом активированного PAR2 и последующего эндоцитоза рецептора.
В другом варианте осуществления изобретения предполагается, что ингибирование взаимодействия между Parr и внутриклеточным С-
концом активированного PAR2 может быть осуществлено путем
введения субъекту ингибитора р-аррестина, который ингибирует
фосфорилирование GPCR-KHHa3bi-2 (GRK2) внутриклеточного С-конца
активированного PAR2. В одном из вариантов осуществления
изобретения предполагается, что ингибитор р-аррестина, который
ингибирует фосфорилирование GPCR киназы-2 (GRK2)
внутриклеточного С-конца активированного PAR2, непосредственно
взаимодействует с GRK2, например, путем связывания в центральном
каталитическом домене GRK2, ответственном за фосфорилирование
рецептора. В другом варианте осуществления изобретения
предполагается, что ингибитор р-аррестина может, например,
связываться с GRK2 аллостерически, чтобы предотвратить
распознавание сайтов фосфорилирования на внутриклеточном С-конце
активированного PAR2. В еще одном варианте осуществления
изобретения предусматривается, что ингибитор р-аррестина будет
связываться на сайтах фосфорилирования или вблизи них с
внутриклеточным С-концом PAR2, тем самым предотвращая
распознавание и фосфорилирование с помощью GRK2. Также
предполагается, что соединение, которое ингибирует
взаимодействие между Parr и внутриклеточным С-концом активированного PAR2, может действовать путем прямого взаимодействия с р-аррестином, препятствуя его связыванию с фосфорилированными сайтами на внутриклеточном С-конце PAR2.
В другом варианте осуществления изобретения ингибирование эндоцитоза PAR2 может быть осуществлено путем введения нуждающемуся в этом субъекту ингибитора клатрина для ингибирования зависимого от клатрина эндоцитоза активированного PAR2. Понятно, что ингибитор клатрина может представлять собой соединение, которое ингибирует зависимый от клатрина эндоцитоз активированного PAR2, например, соединение, которое селективно ингибирует ассоциацию лиганда с терминальным доменом клатрина. Некоторые ингибиторы клатрина известны в данной области техники, такие как Pitstop 1(tm) и Pitstop 2(tm).
В другом варианте осуществления изобретения ингибирование эндоцитоза PAR2 может быть осуществлено путем введения
нуждающемуся в этом субъекту ингибитора динамина для ингибирования зависимого от динамина или клатрина эндоцитоза активированного PAR2. Понятно, что ингибитор динамина может представлять собой соединение, которое ингибирует динамин и последующий эндоцитоз активированного PAR2, например, соединение, которое ингибирует стимулируемый липосомой из L-фосфатидилсерина спирального динамина, где динамин индуцирует образование спирали вокруг липосом, соединение, которое ингибирует стимулированный Grb2 динамин, или соединение, которое ингибирует самосборку динамина в отдельные кольца. Некоторые ингибиторы динамина известны в данной области техники, такие как Dyngo 4а и Dynole 2-24 .
В другом варианте осуществления ингибирование эндоцитоза PAR2 может быть осуществлено путем введения субъекту,
нуждающемуся в этом, доминантного негативного р-аррестина, который функционирует, конкурируя с эндогенными аррестинами за связывание с клатрином и тем самым ингибирует клатрин-зависимый эндоцитоз активированного PAR2.
В другом аспекте соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2.
В одном варианте осуществления изобретения соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой трехкомпонентное соединение формулы (I):
где
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану;
L представляет собой линкерный фрагмент длиной от 1 до 50
нм; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2;
где липидный якорь распределен в липидных мембранах, которые являются нерастворимыми в неионном детергенте при температуре 4°С; или
его фармацевтически приемлемую соль.
Термин "трехкомпонентное соединение", как используется в настоящем документе, относится к соединениям, содержащим модулятор эндосомального GPCR, ковалентно связанный с линкерной группой, причем линкерная группа ковалентно связана с липидным якорем, который способен прикреплять соединение формулы (I) к липидному бислою клеточной мембраны и, в конечном счете, к мембране ранней эндосомы.
Термин "липидный якорь", как используется в настоящем
документе, обозначает фрагменты, которые способны распределяться
в липидных мембранах и тем самым закреплять соединение формулы
(I) в липидной мембране. Распределение в липидную мембрану может
происходить непосредственно из внеклеточного или везикулярного
люминального пространства или может происходить сбоку от
липидного бислоя. Липидный якорь может характеризоваться его
способностью распределяться в липидных мембранах, в результате
чего указанные липидные мембраны характеризуются
нерастворимостью в неионных детергентах при температуре 4°С. Примеры подходящих липидных якорей включают, но не ограничиваются ими, холестерин, холестанол, сфинголипид, GPI-якорь или производные насыщенных жирных кислот. Многие такие липидные якоря были описаны в данной области техники, например, в W0 2005/097199, полное описание которого включено в настоящий документ путем ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения липидный якорь представляет собой фрагмент, выбранный из формул (II) или (III) :
I-R4'
I-R4'
(III)
где
собой
необязательно
замещенную
Ci-
1-12
R1 представляет алкильную группу;
NHC0NH-, -NHC(0)0-, -NHCH (COOH) (СН2) ЬС (О) 0-, -NHCH(COOH) (CH2)bC0NH-,
или
R2 и R3 независимо представляют собой Н или С1_3алкил;
R4 представляет собой -СН2-, -0-, -NH-, -S-, -NH (СН2) а0Р03
-NH (СН2) aS02CF2-, -NH (СН2) aS02NH-,
-NHCH(CONH2) (СН2) ЬС (О) 0-, -NHCH(C0NH2) (CH2)bC0NH-, -NHCH (CONH) (CH2) 4NH ( (CO) CH20) e--NHCH (COOH) (CH2) 4NH ( (CO) CH20) e-;
а обозначает целое число от 2 до 3; b обозначает целое число от 1 до 2; е обозначает целое число от 0 до 1; и
представляет одинарную или двойную связь. В других вариантах осуществления изобретения липидный якорь представляет собой фрагмент, выбранный из формул (VI), (VII), (VIII) или (IX):
(vn)
(IX)
где
R4 описан выше;
представляет одинарную или двойную связь;
представляет одинарную, двойную или тройную связь;
каждый R5, независимо, представляет собой -NH-, -О-, -S-, -ОС(О)-, -NHC(O)-, -NHCONH-, -NHC(О)О- или -NHS(02)-;
каждый R6, независимо, представляет собой С14-30 алкильную группу, необязательно замещенную фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора;
каждый R7, независимо, представляет собой NH2, NHCH3, ОН, Н,
галоген или О, при условии, что, когда R7 представляет собой NH2,
NHCH3, ОН, Н или галоген, тогда представляет одинарную
связь и, когда R7 представляет собой О, тогда представляет двойную связь;
каждый R8, независимо, представляет собой Н, ОН или
отсутствует, когда представляет тройную связь;
R9 представляет собой Сю-зо алкильную группу, необязательно замещенную фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора; и
каждый R10, независимо, представляет собой С24-4о алкиленовую группу, С24-4о алкениленовую группу или С24-4о алкиниленовую группу, необязательно замещенную фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора.
где
представляет одинарную или двойную связь;
В других вариантах осуществления изобретения липидный якорь представляет собой фрагмент, выбранный из формул (X) или (XI):
представляет одинарную, двойную или тройную связь;
каждый R , независимо, представляет собой -0
или
-СО (СН2) а (СО) ь0-, где а обозначает целое число от 1 до 3 и b обозначает целое число от 0 до 1;
R14 представляет собой -О- или - ОС (О)- ;
каждый R15, независимо, выбран из С16-30 алкильной группы, необязательно замещенной фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора;
R16 представляет собой -P03~CH2-, -S03CH2-, -СН2-, -С02СН2- или прямую связь;
R17 представляет собой -NH-, -0-, -S-, -ОС(О)-, -NHC(O)-, -NHC0NH-, -NHC (0)0- или -NHS (02) -;
R18 представляет собой NH2, NHCH3, ОН, Н, галоген или О;
R19 представляет собой Ci6-3o алкильную группу, необязательно замещенную фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора; и
каждый R20 представляет собой С (О) С13-25алкильную группу, необязательно замещенную группой из следующих формул:
> 24
где
-представляет одинарную или двойную связь; R21 представляет собой -P03~CH2-, -S03CH2-, -СН2-, -С02СН2- или прямую связь;
R22 представляет собой -NH-, -0-, -S-, -ОС(О)-, -NHC(O)-, -NHC0NH-, -NHC (0)0- или -NHS (02) -;
R23 представляет собой -О- или - ОС (О)- ;
каждый R24, независимо, выбран из Ci6-3o алкильной группы, необязательно замещенной фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора;
R25 представляет собой -СО (СН2) а (СО) ь0- или -СО (СН2) а (СО) bNH-, где а обозначает целое число от 1 до 3 и b обозначает целое число от 0 до 1; и
R26 представляет собой С4-2о алкильную группу, необязательно замещенную фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора.
В других вариантах осуществления изобретения липидный якорь представляет собой фрагмент, выбранный из формул (XII), (XIII), (XIV) или (XV):
R27-(СН2)"
(XV)
каждый R27, независимо, выбран из -NH-, -О-, -NH (СН2) С0Р03 -,
-NH (СН2) cS02NH-, -NHCONH-, -NHC(0)0-, -СО (СН2) ь (СО) aNH-,
-СО (СН2) ь (СО) а0-, -CO(CH2)bS-, -СО (СН2) ьОРОз--, -СО (СН2) bS02NH-,
-СО (СН2) bNHCONH-, -СО (СН2) bOCONH-, -СО (СН2) b0S03- или
-СО (СН2) bNHC (О) О-, где а обозначает целое число от 0 до 1, b обозначает целое число от 1 до 3 и с обозначает целое число от 2 to 3;
каждый R , независимо, представляет собой -СН2- или -О-
каждый R29, независимо, выбран из Н или С16-30 алкильной группы, необязательно замещенной фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора;
каждый R31, независимо, выбран из Н, или С1-15 алкильной группы, необязательно замещенной фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора, или С1-15 алкокси группы, необязательно замещенной фтором, предпочтительно, от 1 до 4 атомами фтора; и
п обозначает целое число от 1 до 2 .
Термин "линкер", как используется в настоящем документе,
относится к той части соединения, которая связывает модулятор
эндосомального GPCR с липидным якорем. Понятно, что линкер
должен быть выбран таким образом, чтобы он не конкурировал с
модуляторами эндосомального GPCR на сайте связывания лиганда.
Также линкер не должен распределяться в липидную мембрану.
Линкерная группа должна иметь длину от 1 до 50 нм, чтобы дать
возможность модулятору эндосомального GPCR взаимодействовать с
рецептором, когда липидный якорь закреплен в эндосомальной
мембране. В одном варианте осуществления изобретения линкерная
группа будет содержать одно или несколько звеньев
полиэтиленгликоля. В другом варианте осуществления изобретения
предполагается, что линкером или субъединицами линкера могут
быть аминокислотные остатки, дериватизированные или
функционализированные аминокислотные остатки, простые полиэфиры, мочевины, карбаматы, сульфонамиды или другие субъединицы, которые обеспечивают достаточное расстояние между модуляторами эндосомального GPCR и липидным якорем без вмешательства в функцию любой из групп.
В одном варианте осуществления изобретения линкер представлен группой формулы (IV):
где
Z является связывающей группой между линкером и липидным якорем и представляет собой -Ci-Сюалкил-, -С2-Сюалкенил-, - С2-Сюалкинил-, -Ci-СюалкилС (О)-, -С2-СюалкенилС (О) - или - С2-СюалкинилС(О)-; или
Z вместе с соседним амином представляет собой необязательно
С-концевую амидированную аминокислоту, выбранную из
аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина, гистидина, цистеина, лизина, аргинина, серина или треонина; где аминокислота присоединена к липидному якорю через свою функциональную группу боковой цепи;
Y является связывающей группой между линкером и модулятором эндосомального GPCR и представляет собой -О-, -NH-, - S-, -С(О)-, -C(0)NH-, -С(О)О- или -C(0)S-; или
Y, вместе с соседней амидо группой представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина, гистидина, цистеина, лизина, аргинина, серина или треонина; где аминокислота присоединена к модулятору эндосомального GPCR через свою функциональную группу боковой цепи;
m обозначает 1 или 2;
п обозначает от 1 до 20; и
р обозначает от 1 до 8.
В другом варианте осуществления изобретения линкер представлен группой формулы (XX):
(XX) , где
каждый R11, независимо, представляет собой боковую цепь природного, дериватизированного или функционализированного аминокислотного остатка;
m обозначает целое число от 3 до 80; и
п обозначает целое число от 0 до 1.
В других вариантах осуществления изобретения, линкер представлен группой формулы (XXI):
/л "°
N-Н
(XXI) ,
где
m обозначает целое число от 0 до 40; п обозначает целое число от 0 до 1;
каждый о, независимо, обозначает целое число от 1 до 5;
каждый R11, независимо, представляет собой боковую цепь природного, дериватизированного или функционализированного аминокислотного остатка; и
где концевой SO2 связан с липидным якорем, а N-конец связан с модулятором эндосомального GPCR.
В еще одном варианте осуществления изобретения линкер представлен группой формулы (XXII):
(XXII), где
m обозначает целое число от 0 до 40; п обозначает целое число от 0 до 1;
каждый о, независимо, обозначает целое число от 1 до 5;
каждый R12, независимо, представляет собой NH или О;
каждый R11, независимо, представляет собой боковую цепь природного, дериватизированного или функционализированного аминокислотного остатка; и
где С (О)-конец связан с липидным якорем, а Ьч12-конец связан с модулятором эндосомального GPCR.
Ряд подходящих линкерных групп был описан в W02005/097199, полный текст которого включен в настоящий документ посредством ссылки.
Термин "ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2", как используется в настоящем документе, относится к антагонистам или ингибиторам PAR2, которые были эндоцитозированы в эндосомах. Ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2 может быть в любом виде, включая, но не ограничиваясь этим, органическую молекулу, полипептидную последовательность, гормон, фрагмент белка или производное любого из них.
Термин "передача эндосомального сигнала PAR2", как
используется в настоящем документе, относится к сигналу,
трансдуцированному активированным PAR2, который был
эндоцитозирован в эндосоме, предпочтительно, ранней эндосоме.
В одном варианте осуществления передача эндосомального сигнала PAR2 будет представлять собой передачу сигнала, который сначала трансдуцируется в плазматической мембране и поддерживается, когда рецептор эндоцитозирован в ранних эндосомах.
В другом варианте осуществления изобретения передача эндосомального сигнала PAR2 будет представлять собой передачу сигнала, при которой необходим эндоцитоз рецептора, и/или она происходит исключительно на эндосомальных мембранах, например, передача сигнала, опосредованная р-аррестином. Считается, что Parr взаимодействуют с агонист-оккупированными фосфорилированными G-белок сопряженными рецепторными киназами (GRK) GPCR на поверхности клетки и способствуют переносу связанного с лигандом рецептора с поверхности клетки на ранние эндосомы посредством динамин- и клатрин-зависимого эндоцитоза. Недавно было обнаружено, что этот путь может опосредовать вторую серию передачи эндосомального сигнала GPCR, отличную от зависимой от G-белка передачи сигнала, на плазматической мембране. Считается, что важность этого механизма зависит от сродства, с которым GPCR
взаимодействуют с Parr, которое варьируется в зависимости от степени фосфорилирования GPCR с помощью GRK. GPCR "класса А" (например, P2AR, a.ibAR) имеют мало сайтов фосфорилирования и временно взаимодействуют с Parrl и Рагг2 главным образом на плазматической мембране, с более высоким сродством к Parr2. GPCR "класса В" (например, ATiAR, NKiR, PAR2) фосфорилируются на нескольких сайтах и взаимодействуют как с Parrl, так и с 2 с высоким сродством в течение длительных периодов в плазме и эндосомальных мембранах. GPCR "класса С" (например, рецептор брадикидина В2) интернализуются с Parr в эндосомах с последующей быстрой диссоциацией Parr при удалении агониста.
Считается, что степень индуцированной Parr передачи сигнала МАРК зависит от аффинности рецептора к Parr, которая зависит от структуры рецептора и от того, какая из семи GRK млекопитающего фосфорилирует рецептор. Таким образом, активация ATiAR и V2R вызывает большее фосфорилирование связанных с Parr ERK1/2, чем активация a.ibAR и P2AR, что указывает на то, что рецепторы класса В более устойчиво передают сигнал по этому пути. Как упоминалось выше, PAR2 является GPCR класса В.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения и со ссылкой на общую формулу (I) применяются один или несколько из следующих вариантов осуществления:
a) А представляет собой липидный якорь, выбранный из холестерина, холестанола, сфинголипида, GPI-якоря или производного насыщенной жирной кислоты.
b) А представляет собой липидный якорь, выбранный из групп формул (II), (III), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII) и (IX).
c) А представляет собой липидный якорь, выбранный из групп формул (II) или (III) .
d) L представляет собой линкерный фрагмент, содержащий одну или несколько субъединиц, где субъединицы содержат звенья полиэтиленгликоля, аминокислотные остатки, дериватизированные
a)
или функционализированные аминокислотные остатки, простые полиэфиры, мочевины, карбаматы и/или сульфонамиды.
e) L представляет собой линкерный фрагмент, представленный формулами (IV), (XX), (XXI) или (XXII).
f) L представляет собой линкерный фрагмент, представленный формулой (IV).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой липидный якорь, представленный формулой (II) или (III) .
Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к трехкомпонентному соединению формулы (I), представленному формулой (1а):
(1а) ,
где
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану, представленный формулой (II) или (III) :
где
R1 представляет собой необязательно замещенную Ci_i2 алкильную группу;
R2 и R3 независимо представляют собой Н или Ci-залкил; R4 представляет собой С, О, NH или S; и
представляет одинарную или двойную связь; L представляет собой линкерную группу длиной от 1 нм до 50
нм; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2; или
его фармацевтически приемлемым солям.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой липидный якорь, представленный формулой (II) или (III) и L представляет собой линкер, представленный формулой (IV).
Соответственно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к трехкомпонентному соединению формулы (I), представленному формулой (lb):
lb) ,
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану, представленный формулой (II) или (III) :
?-R
где
R1 представляет собой необязательно замещенную алкильную группу;
R2 и R3 независимо представляют собой Н или С1_3алкил; R4 представляет собой С, О, NH или S;
представляет одинарную или двойную связь; L представлен формулой (IV):
1-12
где
Z является связывающей группой между линкером и липидным якорем и представляет собой -Ci-Сюалкил-, -С2-Сюалкенил-, - С2-Сюалкинил-, -Ci-СюалкилС (О)-, -С2-СюалкенилС (О) - или - С2-СюалкинилС(О)-; или
Z вместе с соседним амином представляет собой необязательно амидированную на С-конце аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина, гистидина, цистеина, лизина, аргинина, серина или треонина; где аминокислота присоединена к липидному якорю через свою функциональную группу боковой цепи;
Y является связывающей группой между линкером и модулятором эндосомального GPCR и представляет собой -О-, -NH-, - S-, -С(О)-, -C(0)NH-, -С(О)О- или -C(0)S-; или
Y вместе с соседней амидо группой представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина, гистидина, цистеина, лизина, аргинина, серина или треонина; где аминокислота присоединена к модулятору эндосомального GPCR через свою функциональную группу боковой цепи;
m обозначает 1 или 2; п обозначает от 1 до 20; р обозначает от 1 до 8; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2; или
его фармацевтически приемлемым солям.
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) имеет структуру:
где L и А определены выше, или его фармацевтически приемлемая соль.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению:
или его фармацевтически приемлемой соли.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения вызванной протеазами боли, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы (I), описанного в настоящем документе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I), описанного в настоящем документе, при производстве лекарственного средства для лечения вызванной протеазами боли.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (I), описанному в настоящем документе, для применения в лечении боли, вызванной протеазами.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения боли, вызванной протеазами, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту комбинации, содержащей одно или несколько соединений, которые ингибируют эндоцитоз рецептора и одно или несколько соединений, которые таргетируют или ингибируют передачу эндосомального сигнала PAR2.
В контексте настоящего изобретения термин "боль" включает в себя хроническую воспалительную боль (например, боль, связанную с ревматоидным артритом, остеоартритом, ревматоидным спондилитом, подагрическим артритом и ювенильным артритом); мышечно-скелетную боль, боль нижней части спины и шеи, растяжения и деформации связок, нейропатическую боль, симпатически поддерживаемую боль, миозит, боль, связанную со злокачественным новообразованием и фибромиалгией, боль, связанную с мигренью, боль, связанную с постоянной и хронической ежедневной головной болью, боль, связанную с гриппом или другими вирусными инфекциями, такими как простуда, ревматическая лихорадка, боль, связанную с функциональными расстройствами кишечника, такими как неязвенная диспепсия, некардиальную боль в груди и синдром раздраженного кишечника, боль, связанную с ишемией миокарда, послеоперационную боль, головную боль, зубную боль, дисменорею, невралгию, комплексный регионарный болевой синдром (КРБС I и II типов), нейропатические болевые синдромы (включая диабетическую невропатию, нейропатическую боль, вызванную химиотерапией, пояснично-крестцовый радикулит, неспецифические боли в нижней части спины, боль при рассеянном склерозе, нейропатии при ВИЧ, постгерпетическую невралгию, невралгию тройничного нерва) и боль в результате физической травмы, ампутации, злокачественного новообразования, токсинов или хронических воспалительных состояний. В предпочтительном варианте осуществления боль является соматической болью или висцеральной болью.
Ниже описаны общие стратегии синтеза соединений по изобретению.
Синтез холестерилгликолевой кислоты, 3-холестериламина и холестерилглицина описан в литературе (Hussey, S. L. et al., J. Am. Спет. Soc. 2001, 123, 12712-12713; Hussey, S. L. et al. , Org. Lett. 2002, 4, 415-418; Martin, S. E. et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 67-74) . Липидные якоря формулы (III), имеющие амидную, сульфонамидную, мочевиновую или карбаматную функциональную группу в положении 3 стероидной структуры, могут быть получены из 3-холестериналина, например, 3-холестериламин
может быть подвергнут взаимодействию с янтарным ангидридом в
присутствии DMAP с получением соответствующего
сукцинилзамещенного соединения. Соответствующий сульфонамид
может быть получен взаимодействием 3-холестеринамина с
хлорсульфонилуксусной кислотой, которая может быть получена, как
описано в литературе (Hinman, R. L. and Locatell, L. J. Am.
Chem. Soc. 1959, 81, 5655-5658) . Соответствующие мочевина или
карбамат могут быть получены согласно литературным методам с
помощью соответствующего изоцианата (Knolker, H.-J. Т. et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 2497; Knolker, H.-J. et al. ,
Synlett 1996, 502; Knolker, H.-J. and Braxmeier, T. Tetrahedron
Lett. 1996, 37, 5861). Промежуточные продукты для получения
соединения (III), имеющие фосфат или карбоксиметилированный
фосфат в положении 3 стероидной структуры, могут быть получены,
как описано в литературе (Golebriewski, Keyes, Cushman, Bioorg.
Med. Chem. 1996, 4, 1637-1648; Cusinato, Habeler, et al. , J.
Lipid Res. 1998, 39, 1844-1851; Himber, Missano, et al. , J.
Lipid Res. 1995, 36, 1567- 1585). Липидные якоря формулы (III),
имеющие тиол в положениии 3 стероидной структуры, могут быть
получены, как описано в литературе (J. G. Parkes, J. G. et al.,
Biochim. Biophys. Acta 1982, 691, 24-29), соответствующие
карбоксиметилированные тиолы могут быть получены простым
алкилированием, как описано для соответствующих аминов и
спиртов. Липидные якоря формулы (III), имеющие
дифторметиленсульфоновое производное в положении 3 стероидной структуры, могут быть получены, как описано в литературе
(Lapiene, J. et al. , Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 151155) . Введение различных боковых цепей в положении 17 липидных якорей формулы (III) может быть осуществлено путем использования литературных протоколов, исходя из дегидроизоандростерона или прегненолона (Bergmann, Е. D. et al. , J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 123 9-1243, и приведенные ссылки). Липидные якоря формулы
(III), которые являются производными холестана, могут быть получены из соответствующих предшественников, которые являются производными холестерина, путем восстановления 5,б-двойной связи, используя литературные протоколы, например, гидрированием
в присутствии различных катализаторов на основе переходных металлов.
Липидные якоря формулы (II), имеющие кислородсодержащий заместитель в положении 3, получают аналогичным образом, как описано для липидных якорей формулы (III), исходя из эстрона. Липидные якоря формулы (II), имеющие азотсодержащий заместитель в положении 3, могут быть получены аналогичным образом, как описано для липидных якорей формулы (III), исходя из 3-аминоэстрона, который может быть получен, как описано в литературе (Zhang, X. and Sui, Z. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3071-3073; Woo, L. W. L. et al. , Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88). Липидные якоря формулы (II), имеющие серусодержащий заместитель в положении 3, могут быть получены аналогичным образом, как описано для липидных якорей формулы
(III), исходя из 3-тиоэстрона, который может быть получен, как описано в литературе (Woo, L. W. L. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88). Введение различных боковых цепей в положении 17 структуры эстрона может быть осуществлено с помощью реакции Виттига с последующим гидрированием полученной двойной связи, как описано в литературе (Peters, R. Н. et al., J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26). Дальнейшие манипуляции в боковой цепи (например, конструкции с двойной связью, циклоалкильные дополнения) могут быть достигнуты стандартными протоколами
(конденсация по Сузуки и т. д.).
Липидные якоря формулы (VI), относящиеся к классу керамидов, дегидрокерамидов и дигидрокерамидов с различными углеводородными группами, можно получить, как указано в литературе (А. Н. Merrill, Jr., Y. A. Hannun (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999; Koskinen, P. M and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075). В частности, в качестве ключевого промежуточного соединения для всех липидных якорей формулы (VI), имеющих кислородсодержащий заместитель в положении 1 сфингозинового скелета, можно использовать сфингозиновое основание. Соответствующие аминопроизводные получают путем замещения сульфонатов, которые могут быть получены из спиртов в соответствии с известными протоколами.
Алкилирование и ацилирование 1-амино или 1-гидроксипроизводных
может быть осуществлено путем взаимодействия с бромуксусной
кислотой и янтарным ангидридом, соответственно.
Тиоацетилированное производное может быть получено путем
замещения сульфоната меркаптоуксусной кислотой. Фосфат и
производные сульфата можно получить, как описано в литературе
(А. Н. Merrill, Jr., YA A. Hannun (Eds.), Methods in Enzymology,
Vol. 311, Academic Press, 1999; Koskinen, P. M. and Koskinen, A.
M. P. Synthesis 1998, 1075). Ацилирование, сульфонилирование,
образование мочевины и карбамата могут быть осуществлены
стандартными процедурами. Липидные якоря формулы (VI), где R5
представляет собой аминогруппу или аминопроизводную
функциональную группу, могут быть получены, исходя из
сфингозинового основания, которое доступно в соответствии с
публикацией Koskinen (Koskinen, P. М. and Koskinen, A. M. P.
Synthesis 1998, 1075), с использованием стандартных протоколов.
Соответствующие 2-кислородзамещенные сфинголипиды могут быть
получены по стратегии, опубликованной Yamanoi (Yamanoi, Т. et
al. , Chem. Lett. 1989, 335) . Липидные якоря формулы (VI), где
оба R8 представляют собой гидроксигруппу, могут быть получены
путем бисгидроксилирования соответствующего алкена с
использованием известных протоколов. Соответствующие
моногидроксипроизводные могут быть получены, как описано в литературе (Howell, A. R. and Ndakala, A. J. Curr. Org. Chem. 2002, 6, 365-391) . Модификация заместителей R6 и R9 в липидных якорях формулы (VI) может быть достигнута с помощью протоколов и стратегий, изложенных в различных обзорных статьях (Harwood, Н. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280).
Липидные якоря формулы (VII) можно получить по протоколам, описанным в литературе (Muller, S. et al., J. Prakt. Chem. 2000, 342, 779) и их комбинациями с протоколами, описанными для получения липидных якорей формулы (VII).
Липидные якоря формулы (VIII), где R4 и R5 являются кислородсодержащими заместителями, могут быть получены из коммерчески доступного (R)-(-)-2,2-диметил-1,З-диоксолан-4
метанола, как указано Fraser-Reid (Schlueter, U. Lu, J. and Fraser-Reid, B. Org. Lett. 2003, 5, 255-257) . Изменение заместителей R6 в соединениях формулы (VIII) может быть осуществлено с помощью протоколов и стратегий, изложенных в различных обзорных статьях (Harwood, Н. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280). Липидные якоря формулы (VIII), где R4 и R5 являются азотсодержащими заместителями, получают либо исходя из соответствующих кислородзамещенных систем путем нуклеофильного замещения соответствующих сульфонатов и дополнительных модификаций, как описано выше, или исходя из 1,2,3-триаминопропана, который получают, как описано в литературе (Henrick, К. et al., J Chem. Soc. Dalton Trans. 1982, 225-227).
Липидные якоря формулы (IX) можно получить аналогично липидным якорям формулы (VII) или, альтернативно, с помощью метатезиса с закрытием цикла со-этенилированных промежуточных соединений липидных якорей формулы (VIII).
Липидные якоря формул (X) и (XI) могут быть получены в соответствии со стратегиями синтеза, описанными в литературе (Xue, J. and Guo, Z. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 20152018; Xue, J. and Guo, Z. J. Am. Chem. Soc. 2003, 16334-16339; Xue, J. et al., J. Org. Chem. 2003, 68, 4020-4029; Shao, N. , Xue, J. and Guo, Z. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1569-1573) и путем их комбинации со способами, описанными выше для получения липидных якорей формул (VI) и (VIII).
Липидные якоря формулы (XII), (XIII) и (XIV) могут быть получены путем полного синтеза в соответствии со стратегиями синтеза, описанными в литературе (Knolker, H.-J. Chem. Soc. Rev. 1999, 28, 151-157; Knolker, H.-J. and Reddy, K. R. Chem. Rev.
2002, 102, 4303-4427; Knolker, H.-J. and Knoll, J. Chem. Commun.
2003, 1170-1171; Knolker, H.-J. Curr. Org. Synthesis 2004, 1) . Липидные якоря формулы (XV) могут быть получены синтезом
индола по Неницеску исходя из 4-метокси-З-метилбензальдегида с
получением б-метокси-5-метилиндола. Расщепление эфира,
образование трифлата и присоединение по реакции Соногаширы
приводят к соответствующему б-алкинилзамещенному 5-метилиндолу. Формилирование по Вильсмайеру и последующее добавление нитрометана дают производное 3-нитровинилзамещенного индола, которое подвергается полному гидрированию, что приводит к образованию б-алкилзамещенного 5-метилтриптамина. Получение завершает ацилирование аминогруппы с использованием сукцинилового ангидрида.
Для синтеза пептидов по настоящему изобретению могут быть использованы известные способы, осуществляемые в твердой фазе или в растворе, такие как связывание N- или С-конца с твердым носителем (обычно смолой) с последующим последовательным синтезом линейного пептида. Структуры защитных группы для защиты аминокислотных остатков, включая боковые цепи, хорошо известны в данной области и могут быть найдены, например, в работах: Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis (Third Edition, John Wiley & Sons, Inc, 1999), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Способы получения соединений, описанных в настоящем документе, будут очевидны специалистам в данной области и будут включать стадии: а) определения расстояния между фосфорильной концевой группой (группами) или эквивалентной концевой группой липидного якоря и сайтом связывания и/или взаимодействия модулятора ингибитора передачи эндосомального сигнала PAR2; Ь) выбор линкера, который способен простираться на расстояние, определенное в (а) ; и с) связывание липидного якоря и ингибитора передачи эндосомального сигнала PAR2 с помощью линкера, выбранного в (Ь).
В настоящем документе приведены соответствующие рабочие примеры такого способа. Специалист в данной области техники может установить соответствующие сайты связывания или сайты взаимодействия данного или потенциального ингибитора передачи эндосомального сигнала PAR2 и, соответственно, определить расстояние между (а) фосфорильной концевой группой (группами) или эквивалентной концевой группой липидного якоря и сайтом связывания и/или взаимодействия ингибитора передачи
эндосомального сигнала PAR2. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, молекулярное моделирование in vitro и/или анализ молекулярного взаимодействия или связывания (например, система дрожжевых двойных или тройных гибридов, определение пептидов, анализ наложения, фаговый дисплей, бактериальный дисплей, рибосомный дисплей), атомно-силовую микроскопию, а также спектроскопические методы и рентгеновскую кристаллографию. Кроме того, такие методы, как сайт-направленный мутагенез, могут быть использованы для проверки установленных сайтов взаимодействия данного ингибитора передачи эндосомального сигнала PAR2 или кандидата ингибитора передачи эндосомального сигнала PAR2 и его соответствующей мишени.
Опытному специалисту понятно, что выбор линкера включает в себя выбор линкеров, известных в данной области, а также создание и применение новых линкеров, например, получение путем молекулярного моделирования и соответствующего синтеза или других способов, известных в данной области.
Термин "простираться", используемый в настоящем документе со ссылкой на стадию Ь) , относится к длине линкера, выбранного для размещения ингибитора передачи эндосомального сигнала PAR2 в правильном локусе на рецепторе, когда липидный якорь образует часть липидного слоя эндосомы.
Опытный специалист легко сможет установить, проверить и/или оценить липофильность данного трехкомпонентного соединения, а также отдельного фрагмента, описанных в настоящем документе. Соответствующие анализы исследования для определения таргетинга эндосомального GPCR приведены в настоящем документе в примерах.
Специалисту будет понятно, что задача линкерного фрагмента заключается в связывании липидного якоря с ингибитором передачи эндосомального сигнала PAR2 для того, чтобы дать возможность ингибитору передачи эндосомального сигнала PAR2 взаимодействовать с PAR2, когда липидный якорь закреплен на эндосомальной мембране. Липидный якорь и линкер будут содержать функциональные группы, позволяющие ковалентно связаться друг с другом. Природа функциональной группы липидного якоря никоим образом не ограничивается и может включать, например, аминогруппу, которая
образует амидную связь с линкером, или гидроксильную или карбоксильную группу, которая образует эфирную или сложноэфирную связь с линкером.
Точно так же квалифицированному специалисту будет понятно, что выбор функциональной группы на конце линкера, которая соединяется с ингибитором передачи эндосомального сигнала PAR2, будет определяться в первую очередь любыми предпочтительно доступными функциональными группами на ингибиторе передачи эндосомального сигнала PAR2. Например, если ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2 включает группу свободного амина или карбоновой кислоты, предполагается, что функциональная группа линкера будет содержать взаимодействующую с ними группу карбоновой кислоты или амина с образованием амидной связи.
Следует понимать, что соединения по настоящему изобретению могут существовать в виде одной или нескольких стереоизомерных форм (например, диастереомеры). Настоящее изобретение включает в свой объем все эти стереоизомерные формы, либо выделенные (например, отдельный энантиомер), либо в комбинации (включая рацемические смеси и смеси диастереомеров). В настоящем изобретении предлагается использование аминокислот как в L, так и в D-формах, включая использование аминокислот, независимо выбранных из форм L и D, например, когда пептид содержит два сериновых остатка, каждый остаток серина может иметь одинаковую или противоположную абсолютную стереохимию. Если не указано иное, аминокислоту берут с L-конфигурацией.
Таким образом, изобретение также относится к соединениям в практически чистой стереоизомерной форме по отношению к асимметричным центрам аминокислотных остатков, например, более чем примерно 90% ди, например, примерно от 95 до 97% ди, или более 99% ди, а также в виде их смесей, включая рацемические смеси. Такие диастереомеры могут быть получены путем асимметрического синтеза, например, с использованием хиральных промежуточных соединений, или смеси могут быть разделены обычными способами, например, хроматографией или использованием разделительного агента.
Если соединения по настоящему изобретению требуют очистки, могут быть использованы хроматографические методы, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и ВЭЖХ с обращенной фазой. Пептиды могут быть охарактеризованы масс-спектрометрией и/или другими подходящими методами.
Если соединение содержит одну или несколько функциональных групп, которые могут быть протонированы или депротонированы (например, при физиологическом рН) , соединение может быть получено и/или выделено в виде фармацевтически приемлемой соли. Понятно, что при заданном значении рН соединение может быть цвиттерионным. Используемый в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли данного соединения, где соль подходит для введения в качестве фармацевтического средства. Такие соли могут быть образованы, например, взаимодействием кислоты или основания с амином или группой карбоновой кислоты, соответственно.
Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических кислот. Примеры неорганических кислот включают хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и тому подобное. Примерами органических кислот являются уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и тому подобное.
Фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований могут быть получены из неорганических и органических оснований. Соответствующие противоионы, производные неорганических оснований, включают соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. Органические основания включают первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая природные замещенные амины, и циклические амины, включая изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, 2
диметиламиноэтанол, трометамин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, N-алкилглюкамины, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин и N-этилпиперидин.
Кислотные/основные аддитивные соли, как правило, более растворимы в водных растворителях, чем соответствующие формы свободной кислоты/основания.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество соединения, описанного выше, или его фармацевтически приемлемой соли вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
Термин "композиция" предназначен для включения состава активного ингредиента с инкапсулирующим материалом в качестве носителя, с получением капсулы, в которой активный ингредиент (с другим носителем или без него) окружен носителями.
Хотя соединения, описанные выше, или их фармацевтически приемлемые соли, могут являться единственным активным ингредиентом, вводимым субъекту, введение другого активного ингредиента (ингредиентов) вместе с соединением находится в пределах объема изобретения. В одном или нескольких вариантах осуществления изобретения предусматривается, что субъекту будет вводиться комбинация двух или более соединений по изобретению. Предполагается, что соединение (соединения) также могут быть введены в комбинации вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. Комбинация может обеспечивать отдельное, последовательное или одновременное введение соединения (соединений), описанного выше, с другим активным ингредиентом (ингредиентами). Комбинация может быть представлена в виде фармацевтической композиции.
Термин "комбинация", как используется в настоящем документе, относится к композиции или набору из частей, где партнеры по комбинации, определенные выше, могут быть дозированы независимо или независимо друг от друга или с использованием различных фиксированных комбинаций с отмеченными количествами партнеров по комбинации, то есть одновременно или в разные
моменты времени. Партнеры по комбинации могут затем, например, быть введены одновременно или с разнесением по времени, то есть в разные моменты времени и с равными или разными временными интервалами для любой части набора из частей. Соотношение общих количеств партнеров по комбинации, которые должны быть введены в комбинации, можно варьировать, например, для того, чтобы справляться с потребностями подгруппы пациентов, подлежащих лечению, или потребностями одного пациента, которые могут быть обусловлены различными требованиями, связанными с возрастом, полом, массой тела и т. д. пациентов.
Как будет понятно специалистам в данной области, способ введения и природа фармацевтически приемлемого носителя будут зависеть от характера состояния и млекопитающего, подлежащего лечению. Считается, что выбор конкретной системы носителя или доставки и способ введения могут быть легко определены специалистом в данной области. При приготовлении любой композиции, содержащей активное соединение, следует следить за тем, чтобы активность соединения не пропадала в процессе и чтобы соединение могло достичь места своего действия без разрушения. В некоторых случаях может оказаться необходимым защитить соединение способами, известными в данной области, такими как, например, микрокапсуляция. Точно так же выбранный путь введения должен быть таким, чтобы соединение достигало места его действия.
Специалисты в данной области могут легко определить подходящие составы для соединений по настоящему изобретению с использованием обычных подходов. Идентификация предпочтительных диапазонов рН и подходящих инертных вспомогательных веществ, например, антиоксидантов, является обычной в данной области. Буферные системы обычно используются для обеспечения значений рН желаемого диапазона и включают буферы карбоновых кислот, например, ацетатный, цитратный, лактатный и сукцинатный. Для таких составов имеются различные антиоксиданты, включая фенольные соединения, такие как ВНТ или витамин Е, восстановители, такие как метионин или сульфит, и хелаторы металлов, такие как EDTA.
Соединения, описанные выше, или их фармацевтически приемлемые соли, могут быть получены в виде парентеральных лекарственных форм, в том числе подходящих для внутривенной, интратекальной и интрацеребральной или эпидуральной доставки. Фармацевтические формы, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные инъекционные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного получения стерильных растворов для инъекций. Они должны быть стабильными в условиях производства и хранения и могут быть защищены от восстановления или окисления и загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии или грибы.
Растворитель или дисперсионная среда для инъекционного раствора или дисперсии может содержать любую из обычных систем растворителей или носителей для активного соединения и может содержать, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, применяя покрытие, такое как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, а также применяя поверхностно-активные вещества. Действие микроорганизмов при необходимости можно предотвратить путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобное. Во многих случаях предпочтительно включать агенты для регулирования осмолярности, например, сахара или хлорид натрия. Предпочтительно, состав для инъекций будет изотоническим относительно плазмы крови. Продолжительное поглощение композиций, вводимых путем инъекции, можно обеспечить за счет использования в составе композиций агентов, замедляющих поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина. Фармацевтические формы, пригодные для инъекционного применения, могут быть доставлены любым подходящим путем, включая внутривенную, внутримышечную, интрацеребральную, интратекальную, эпидуральную инъекцию или инфузию.
Стерильные растворы для инъекций получают путем включения активных соединений, взятых в необходимом количестве, в
соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами,
перечисленными выше, при необходимости, с последующей
стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают
путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов
в стерильную несущую среду, которая содержит основную
дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из
перечисленных выше. В случае стерильных порошков для
приготовления стерильных растворов для инъекций
предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка или сушка вымораживанием предварительно стерилизованного фильтрованием раствора активного ингредиента плюс любых дополнительных желаемых ингредиентов.
Другие фармацевтические формы включают пероральные и энтеральные препараты по настоящему изобретению, в которых активное соединение может быть составлено с использованием инертного разбавителя или ассимилируемого съедобного носителя, или оно может быть заключено в твердую или мягкую оболочку желатиновой капсулы, или может быть спрессовано в таблетки, или оно может быть включено непосредственно в пищу. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть объединено с инертными вспомогательными веществами и использовано в виде таблеток для глотания, буккальных или сублигвальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, капсул-имплантантов и тому подобное. Количество активного соединения в таких терапевтически используемых композициях представляет собой количество для получения необходимой дозы.
Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и тому подобное также могут содержать компоненты, перечисленные ниже: связующее, такое как смола, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; инертные вспомогательные вещества, такие как дикальций фосфат; разрыхляющий агент, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и может быть добавлен подслащивающий агент, такой сахароза, лактоза или сахарин, или ароматизатор, такой как перечная мята, масло винтергрена или
вишневый ароматизатор. Когда единичная дозированная форма представляет собой капсулу, она может содержать, помимо материалов вышеуказанного типа, жидкий носитель. Различные другие материалы могут присутствовать в виде покрытий или иным образом модифицировать физическую форму дозированной единицы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или ими обоими. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подслащивающего агента, метил и пропилпарабен в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, такие как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Разумеется, любой материал, используемый при получении любой единичной дозированной формы, должен быть фармацевтически чистым и, по существу, нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, соединения по изобретению могут быть включены в препараты и составы с замедленным высвобождением, включая те, которые обеспечивают специфическую доставку активного пептида в конкретные области кишечника.
Жидкие составы также могут быть введены энтерально через желудочную или пищеводную трубку. Энтеральные составы могут быть получены в форме суппозиториев путем смешивания с соответствующими основами, такими как эмульсионные основы или водорастворимые основы. Также возможно, но не обязательно, чтобы соединения по настоящему изобретению вводили местно, интраназально, интравагинально, внутриглазно и тому подобное.
Фармацевтически приемлемые несущие среды и/или разбавители включают любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание вещества и тому подобное. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любые обычные среды или агент несовместимы с активным ингредиентом, предусмотрено их применение в терапевтических композициях по данному описанию. В композиции также могут быть включены дополнительные активные компоненты.
Является особенно благоприятным получение композиций в виде единичной дозированной формы для обеспечения простоты введения и
однородности дозировки. В контексте настоящего документа единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для подлежащего лечению млекопитающего; причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимой фармацевтической несущей средой. Спецификация новых единичных дозированных форм согласно изобретению определяется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного вещества и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (Ь) требований, относящихся к искусству смешивания активных веществ для лечения заболевания у живых субъектов, имеющих заболевание, при которых ухудшается состояние организма, как подробно описано в настоящем документе.
Как упомянуто выше, основной активный ингредиент может быть составлен для удобного и эффективного введения в терапевтически эффективных количествах вместе с подходящим фармацевтически приемлемым носителем в стандартной дозированной форме. Единичная дозированная форма может содержать, например, основное активное соединение в количестве от 0,2 5 до примерно 2 000 мг. Выражая в пропорциях, активное соединение может присутствовать в количестве от примерно 0,2 5 до примерно 2 000 мг/мл носителя. В случае композиций, содержащих дополнительные активные ингредиенты, дозировки определяют с учетом обычной дозы и способа введения указанных ингредиентов.
Как используется в настоящем документе, термин "эффективное количество" относится к количеству соединения, которое при введении в соответствии с желаемой схемой дозирования обеспечивает желаемую терапевтическую активность. Дозирование может осуществляться однократно или с интервалами в минутах или часах, или непрерывно в течение любого из этих периодов. Подходящие дозы могут находиться в пределах от примерно 0,1 нг на кг массы тела до 1 г на кг массы тела на дозу. Типичная доза находиться в пределах от 1 мкг до 1 г на кг массы тела на дозу, например, находиться в пределах от 1 мг до 1 г на кг массы тела на дозу. В одном варианте осуществления изобретения доза может
находиться в пределах от 1 мг до 500 мг на кг массы тела на дозу. В другом варианте осуществления изобретения доза может находиться в пределах от 1 мг до 250 мг на кг массы тела на дозу. И в еще одном варианте осуществления изобретения доза может находиться в пределах от 1 мг до 100 мг на кг массы тела на дозу, например, до 50 мг на массу тела на дозу.
Термины "лечение" и "обработка", как используется в настоящем документе, охватывают лечение состояния или заболевания у животного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно, человека, и включают лечение боли, опосредованной передачей эндосомального сигнала PAR2. Термины "профилактика" и "предотвращение", как используется в настоящем документе, охватывают предотвращение или профилактику состояния или заболевания у животного, предпочтительно, млекопитающего, более предпочтительно, человека, и включают предотвращение боли, опосредованной передачей эндосомального сигнала PAR2.
По всему этому описанию и в последующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово "содержать", и такие вариации, как "содержит" или "содержащий", будут подразумевать включение указанного целого числа или группы целых чисел или стадий, но не исключая любое другое целое число или группу целых чисел.
Ссылка в этом описании на любую предшествующую публикацию (или информацию, полученную из нее), или на любой известный вопрос, не является и не должна восприниматься как подтверждение или допущение или любая форма предположения о том, что предыдущая публикация (или информация полученная от него), или известное вещество является частью общих общеизвестных знаний в области деятельности, к которой относится данная спецификация.
Далее изобретение описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры и фигуры:
Пример 1: BRET-анализ направленной миграции рецептора
BRET исследования направленной миграции рецептора проводили для количественной оценки интернализации PAR2 (RIT-venus) и транспорта в ранние эндосомы (Rab5a-venus) при стимуляции различными агонистами.
Способы
После достижения -50% конфлюенции в 10-и сантиметровых чашках, клетки НЕК2 93 временно трансфицировали 1 мкг PAR2-RLuc8 и 4 мкг либо RIT-venus, либо Rab5a-venus, используя PEI в качестве трансфекционного агента. Через 24 часа после трансфекции клетки высевали в 9б-луночные изопланшеты, покрытые поли-Б-лизином. На следующий день клеточную культуральную среду заменяли либо на IX HBSS (+0,28 г HEPES/100 мл, рН 7-40); на 30 мкМ Dyngo4a (Dyn4a); на 30 мкМ неактивного контроля Dyn4a; на 30 мкМ PitStop2 (PS2), либо на 30 мкМ неактивного контроля PS2. При использовании эндоцитарные ингибиторы разбавляли IX HBSS+1% диметилсульфоксида (ДМСО). После замены культуральной среды клеткам давали возможность уравновешиваться при 37°С в течение 30 минут, затем добавляли коэлентеразин Н [5 мкМ] . После дальнейшей 5-минутной инкубации BRET оценивали с использованием считывателя микропланшетов LUMIstar Omega (BMG LabTech, Оффенбург, Германия), причем люминесценцию считывали при 535 нм и 475 нм. 4-минутный исходный уровень был получен перед добавлением носителя (IX HBSS+/-1% ДМСО) или протеазы, затем измерения продолжались еще 3 0 минут. Коэффициенты BRET рассчитывали с использованием программного обеспечения для анализа LUMIstar MARS, а затем корректировали к исходному уровню и обработкам несущей средой в Microsoft Excel 2013.
Результаты
Первоначальные эксперименты направленной миграции показали, что трипсин является единственным агонистом, который ведет к интернализации PAR2. Стимуляция рецептора с концентрацией трипсина в 10 нМ приводила к зависящему от времени уменьшению BRET с маркером плазматической мембраны (фигура 1а) . Это совпадало с увеличением в BRET между рецептором и ранним эндосомальным маркером (фигура 2а) . Такие ответы согласуются с интернализацией рецепторов и не наблюдались при стимуляции рецептора эластазой или катепсином S. Таким образом, считается, что эластан и катепсин S, активированные PAR2, могут передавать сигнал только от плазматической мембраны.
Способность трипсина индуцировать интернализацию рецепторов дополнительно изучалась путем введения диапазона концентраций в клетки. Было обнаружено, что индуцированная трипсином интернализация PAR2 зависит от концентрации (фигуры lb и 2Ь) . Аналогичные концентрации ЕС50 были получены при анализе с обоими маркерами (-2+8 нМ).
Фармакологическое ингибирование клатрина с помощью PS2 уменьшало величину BRET между меченным люциферазой рецептором и обоими маркерами при стимуляции трипсином, что согласуется с ингибированием интернализации. Менее выраженное ингибирование вызванной трипсином интернализации наблюдалось при ингибировании динамина с помощью Dyn4a (фигуры 1с и 2с).
Пример 2. Полная популяция FRE Т для оценки передачи сигнала по компартментализированной ERK
Ферстеровский резонансный перенос энергии (FRET)
использовался для характеристики PAR2, опосредованной ERK в
разных субклеточных компартментах при стимуляции различными
агонистами. Анализ повторяли после использования
фармакологических и генетических подходов, показывающих отмену интернализации рецепторов для оценки роли интернализации в генерировании компартментализованных сигналов.
Способы
После достижения -50% слияния в 10 см-чашках клетки НЕК2 93 трансфецировали 2,5 мкг PAR2 с N-концевой меткой эпитопа НА (PAR2-HA) и 2,5 мкг желаемого биосенсора FRET с использованием PEI в качестве трансфекционного агента. Через 24 часа после трансфекции клетки высевали в 9б-луночные изопланшеты, покрытые поли-Б-лизином. FRET оценивали через 4 8 часов после посева клеток с последующей рестрикцией сыворотки в течение ночи. Перед началом экспериментов с FRET клеточную культуральную среду заменяли либо на IX HBSS (+0,28 г HEPES/100 мл, рН 7, 40); на 30 мкМ Dyngo4a; на 30 мкМ неактивного контроля Dyn4a; на 30 мкМ PitStop2, либо на 30 мкМ неактивного контроля PitStop2. При использовании эндоцитарные ингибиторы разбавляли IX HBSS+1% диметилсульфоксида (ДМСО). После замены культуральной среды
клеткам давали уравновешиваться при температуре 37°С в течение 30 минут. Затем FRET определяли с использованием считывателя микропланшетов PHERAstar FS (BMG LabTech, Оффенбург, Германия) , ячейки последовательно возбуждали при 430 нм, а выбросы считывали при 550 нм и 4 90 нм. 4-минутный исходный уровень был получен перед добавлением несущей среды (IX HBSS+/-1% ДМСО), протеазы или 1 мкМ PDBu (служащего в качестве положительного контроля). Затем измерения продолжали каждую минуту в течение еще 30 минут. Затем были рассчитаны коэффициенты FRET и скорректированы относительно исходного уровня и обработкам несущей средой в Microsoft Excel 2013. Результаты
Трипсин, но не эластаза, способен продуцировать сигналы ERK в цитоплазме и ядре (фигуры За и 4а) . Показано, что вызванные трипсином ERK-сигналы в этих компартментах зависели от концентрации (фигуры ЗЬ и 4Ь) . Фосфорилирование цитозольного ERK уменьшалось, когда интернализация рецептора блокировалась путем ингибирования клатрина с помощью PS2, но не тогда, когда ингибировался динамин (фигура Зс) . Блокирование интернализации посредством нацеливания клатрина или динамина, по-видимому, не влияет на степень фосфорилирования ERK в ядре (фигура 4с).
Пример 3: BRET-анализ ресенсибилизации
BRET-анализ ресенсибилизации использовали для
количественной оценки экспорта PAR2 из сети транс-Гольджи (TGN38-venus) при стимуляции рецептора, экспрессируемого на поверхности клетки различными протеазами. Анализы повторяли с различными ингибиторами сигнальных узлов для проверки механизмов передачи сигналов, лежащих в основе ресенсибилизации рецепторов.
Способы
После достижения -50% слияния в 10 см-чашках клетки НЕК2 93 временно трансфицировали PAR2-RLuc8 (1мкг) и TGN38-Venus (4 мкг) с использованием PEI в качестве трансфекционного агента. Через 2 4 часа после трансфекции клетки высевали в 9б-луночные изопланшеты, покрытые поли-Б-лизином. Эксперименты BRET проводились на следующий день. Клеткам давали уравновешиваться
либо в IX HBSS (+0,28 г HEPES/100 мл, рН 7,40), в 10 мкМ галлина (ингибитор G(3y) , в 100 нм CRT0066101 (ингибитор PKD) , либо в G06983 (ингибитор РКС) при 37°С в течение 30 минут, затем добавляли коэлентеразин Н [5 мкМ] . После 5-минутной инкубации BRET оценивали с использованием считывателя микропланшетов LUMIstar Omega (BMG LabTech, Оффенбург, Германия), причем люминесценцию считывали при 535 нм и 475 нм. 4-минутный исходный уровень получали перед добавлением несущей среды (IX HBSS) или протеазы, затем измерения продолжали еще 3 0 минут. Коэффициенты BRET рассчитывали с использованием программного обеспечения для анализа LUMIstar MARS, а затем корректировали к исходному уровню и обработкам несущей средой в Microsoft Excel 2013. Результаты
Показано, что отмеченная люциферазой PAR2 удаляется от сети транс-Гольджи при стимуляции рецептора, экспрессируемого на поверхности клетки, всеми тремя агонистами (фигура 5а). Эти результаты подтверждают, что ресенсибилизация PAR2 достигается за счет пополнения рецепторов из уже существующего пула рецепторов, хранящегося в сети транс-Гольджи. Было обнаружено, что наблюдаемое уменьшение BRET также зависит от концентрации (данные не показаны).
Ингибирование G(3y галлеином уменьшало миграцию PAR2 из сети транс-Гольджи при стимуляции всеми тремя протеазами, что приводило к включению этого G-белка в процесс ресенсибилизации. Менее заметные последствия для нормальной направленной миграции наблюдались после ингибирования PKD и РКС с помощью CRT0 0 6 6101 и G06983, соответственно.
Пример 4. Эндоцитарное ингибирование нейрональной возбудимости
Чтобы оценить влияние протеаз на возбудимость ноцицепторов, нейроны DRG предварительно инкубировали с трипсином, катепсином S, эластазой или несущей средой (контроль), промывали, и порог гальванической возбудимости и разность биоэлектрических потенциалов при текущем удвоенном пороге гальванической возбудимости измеряли через 0 мин или 3 0 мин после промывки.
Способы
Выделение нейронов DRG. DRG (Т9-Т13) мышей C57BL/6 усваивали путем инкубации в коллагеназе (1 мг/мл, Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) и дозировали (4 мг/мл, Roche Life Science, Indianapolis, IN) в течение 10 мин при 37°С и диспергировали путем растирания с помощью Пастеровской пипетки с полированным кончиком. Клетки высевали на покровные стекла, покрытые ламинином (0,017 мг/мл) и поли-Б-лизином (2 мг/мл) в 24-луночных планшетах. Нейроны культивировали в среде F12 (Cat N668, Lot RNBD5333, Sigma-Aldrich, St Louis, MO USA), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки с пенициллином и стрептомицином, и поддерживали при 37°С в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% С02, затем извлекали (16 ч) для электрофизиологических исследований.
Электрофизиология. Нейронную возбудимость оценивали с помощью метода локальной фиксации потенциала с амфотерицином В (240 мкг/мл) из нейронов малого диаметра (емкость <30 пФ) в режиме зажима напряжения при комнатной температуре. Были проанализированы только нейроны с потенциалами покоя мембраны более отрицательными, чем -4 0 мВ. Изменения возбудимости были количественно оценены путем измерения порога гальванической возбудимости (от минимального тока до биопотенциала действия горения) и количества потенциалов действия, сбрасываемых при удвоенном пороге гальванической возбудимости. Записи были сделаны с использованием усилителей Axopatch 200В, оцифрованных Digidata 1322А и сохраненных и обработанных с использованием программного обеспечения pClamp 10.1 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Камеру записи непрерывно перфузировали внешним раствором со скоростью 2 мл/мин. Внешний раствор представлял собой (мМ) : 140 NaCl, 5 КС1, 10 HEPES, 10 D-глюкоза, 1 MgCl2, 2 СаС12; рН до 7,4 с помощью 3 М NaOH. Раствор в пипетках представлял собой (мМ) : 110 К-глюконат, 30 КС1, 10 HEPES, 1 МдС12, 2 СаС12; рН 7,2 5 с помощью 1 М КОН.
Обработка протеазами и ингибиторами. Нейроны DRG предварительно инкубировали с несущей средой (контролем) или
протеазами, используя условия, которые, как сообщается, вызывали устойчивую гипервозбудимость: трипсин (50 нМ, 10 мин), эластаза (10 Ед/мл, 390 нМ, 30 мин), Cat-S (500 нМ, 60 мин). Затем нейроны промывали и выдерживали в среде, не содержащей протеазу F12. Возбудимость нейрона оценивали через 0 или 30 мин после промывки. В некоторых экспериментах нейроны инкубировали с несущей средой (0,3% ДМСО), Dyngo4a (30 мкМ) или PitStop2 (15 мкМ) в течение 3 0 минут до и во время инкубации с протеазами.
Статистический анализ. Результаты выражали как среднее+SE. Для анализа данных использовали двухфакторный ANOVA и пост-hoc тесты Tukey.
Результаты
Все протеазы вызывали уменьшение порога гальванической возбудимости на 0 мин и 30 мин, что соответствовало возбудимости. Для оценки важности клатрина и динамина по возбудимости нейроны DRG предварительно инкубировали с ингибитором клатрина PitStop2, ингибитором динамина Dyngo4a или несущей средой (0,3% ДМСО) за 30 минут до и во время инкубации с протеазами. Как можно видеть на фигурах б и 7, PitStop2 и Dymgo4a не влияли на эффекты трипсина, катепсина S или эластазы на порог гальванической возбудимости на 0 мин. PitStop2 и Dyngo4a, оба предотвращали индуцированное трипсином снижение порога гальванической возбудимости через 30 мин, но не влияли на снижение катепсина S- или вызванное эластазой снижение порога гальванической возбудимости через 3 0 мин. Ни одна из несущих сред, ни PitStop2, ни Dyngo4a не влияли на порог гальванической возбудимости на 0 или 3 0 мин.
Пример 5: Влияние эндоцитарных ингибиторов на боль, вызванную протеазами
Способы
Ноцицептивный анализ. Непосредственно перед экспериментами мышам давали привыкнуть к экспериментальной аппаратуре, комнате и исследователю в течение 1-2 часов на 2 последующих дня. Механические ноцицептивные реакции оценивали с помощью отдергивания при стимуляции подошвенной кожи задней лапы
калиброванными волокнами фон Фрея. Показатели теста фон Фрея давали в трех экземплярах, чтобы установить исходный уровень для каждого животного за день до экспериментов. Отек лапы оценивали, измеряя толщину задней лапы с помощью штангенциркулей с цифровой индикацией до и после обработки. Мышей усыпляли 5% изофлураном для проведения внутриподошвенных инъекций. В левую заднюю лапку вводили Dyngo4a (50 мкМ), PitStop2 (50 мкМ) или несущую среду
(0,2% ДМСО в 0,9% NaCl) (все по 10 мкл). Через 30 минут в ту же левую заднюю лапу вводили трипсин (10 нМ) , Cat-S (2,5 мкМ) или эластазу (30 Ед) (все по 10 мкл) . Показатели теста фон Фрея
(левая и правая лапы) и толщину лапы (левая лапа) измеряли каждый час в течение 4 ч после инъекции протеазы. Исследователи использовали испытуемые агенты вслепую. Результаты
Внутриподошвенная инъекция трипсина, Cat-S и эластазы вызывала механическую гипералгезию ипсилатеральной лапы, которая поддерживалась в течение по крайней мере 4 часов, и отек ипсилатеральной лапы, который был максимальным через 4 часа (фигуры 8 и 9). Ранее сообщалось, что эти реакции зависят от PAR2 и TRPV4. Dyngo и PitStop ингибировали механическую гипералгезию, вызванную трипсином. Dyngo не влиял на механическую гипералгезию, вызванную Cat-S- или эластазой. Dyngo не влиял на отек, вызванный трипсином-Cat-S- или эластазой. Эндоцитарные ингибиторы не влияли на реакции отдергивания контралатеральной лапы.
Эти результаты показывают, что для центральной трансмиссии ноцицепции, вызванной трипсином, необходим эндоцитоз PAR2. Эндоцитоз PAR2 не требуется для механической боли, вызванной катепсином S или эластазой - эти протеазы не вызывают эндоцитоз PAR2. Эндоцитоз PAR2 не требуется для отека вызванного протеазами, который зависит от Са-опосредованного SP и высвобождения CGRP.
Пример 6: Ингибирование передачи сигнала эндосомальной PAR2
Ингибирующую активность различных предполагаемых
антагонистов PAR2 определяли в анализе, измеряющем стимулированное 2^yporai-LIGRL-NH2 (2F) накопление IPi в клетках
KNRK, стабильно экспрессирующих рецепторы PAR2 человека или в клетках НТ-2 9, которые эндогенно экспрессируют PAR2. Неспецифическую активность определяли в анализе, измеряющем способность антагонистов ингибировать АТФ-стимулированное накопление IPi в клетках KNRK. Способы
Клетки KNRK-hPAR2, KNRK или НТ-2 9 высевали с плотностью 50х103 клеток/лунку в прозрачный покрытый полидифенином 96-луночный планшет для культивирования ткани. После инкубации в течение 24 ч при 37°С и 5% С02 среду удаляли и заменяли на либо 8 0 мкл, либо 90 мкл стимулирующего буфера IPi (10 мМ HEPES, 1 мМ СаС12, 0,5 мМ МдС12, 4,2 мМ КС1, 146 мМ NaCl, 5,5 мМ глюкозы, 50 мМ LiCl). После добавления стимулирующего буфера лунки, содержащие 8 0 мкл буфера, получали по 10 мкл 10х антагонистов. Все планшеты дополнительно инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 3 0 минут. К планшетам добавляли 10 мкл 2F или АТФ и дополнительно инкубировали в течение 4 0 минут. После инкубации стимулирующий буфер быстро удаляли аспирированием и заменяли на 25 мкл буфера для лизиса (набор для анализа IP-One HTRF(r),
Cisbio). После инкубации лизатов при температуре 37°С, 5% С02 в течение 10 минут, 10 мкл лизата переносили в 3 8 4-луночный OptiPlate (PerkinElmer) и детектировали с использованием набора для тестирования IP-One HTRF(r) (Cisbio).
Концентрационную кривую антагонистов PAR2 в диапазоне от 3 нМ до 3 0 мкМ (добавленных при 10 х концентрациях в объеме 10 мкл) инкубировали в течение 30 мин, затем добавляли 10 мкМ АТФ или 100 нМ или 300 нМ 2F ( (ЕС80, добавляли при 1 Охконцентрациях в 10 мкл), а затем дополнительно инкубировали в течение 40 мин.
Результаты
Было установлено, что антагонист PAR2, показанный ниже, ингибирует 2Е-стимулированное накопление IPi со значением IC50 of 5,3 9+0,13 мкМ.
Антагонист не влиял на АТФ-индуцированное накопление IPi в клетках KNRK, предполагая, что антагонизм 2F в клетках hPAR2-KNRK опосредуется PAR2. Антагонист не оказывал влияния на исходное накопление IPi в клетках KNRK.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения боли, вызванной протеазами, включающий введение нуждающемуся в этом субъек ту соединения, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала активируемого протеазой рецептора-2 (PAR2) .
2. Способ по п.1, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2 представляет собой соединение, которое ингибирует эндоцитоз активированного рецептора.
3. Способ по п.2 где соединение ингибирует динамин, клатрин или |3-аррестин.
4. Способ по п.1, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2.
5. Способ по п. 4, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой трехкомпонентное соединение формулы (I):
где
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану;
L представляет собой линкерный фрагмент длиной от 1 до 50
нм; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2 ;
где липидный якорь распределен в липидных мембранах, которые являются нерастворимыми в неионном детергенте при температуре 4°С; или
его фармацевтически приемлемую соль.
б. Способ по п.5, где трехкомпонентное соединение формулы (I) представлено формулой (1а):
(la) ,
где
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану, представленный формулой (II) или (III) :
где
R1 представляет собой необязательно замещенную Ci_i2 алкильную группу;
R2 и R3 независимо представляют собой Н или С1_3алкил; R4 представляет собой С, О, NH или S; и
представляет одинарную или двойную связь; L представляет собой линкерную группу длиной от 1 нм до 50
нм; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2; или
его фармацевтически приемлемая соль.
7. Способ по п.5, где трехкомпонентное соединение формулы (I) представлено формулой (lb):
(lb) ,
где
А представляет собой липидный якорь, который способствует внедрению соединения в плазматическую мембрану, представленному формулой (II) или (III) :
l-R
?-R4'
где
собой
необязательно
R1 представляет алкильную группу;
R2 и R3 независимо представляют собой Н или С1_3алкил; R4 представляет собой С, О, NH или S;
представляет одинарную или двойную связь; L представлен формулой (IV):
1-12
(IV) , где
Z является связывающей группой между линкером и липидным якорем и представляет собой -Ci-Сюалкил-, -С2-Сюалкенил-, - С2-Сюалкинил-, -Ci-СюалкилС (О)-, -С2-СюалкенилС (О) - или - С2-СюалкинилС(О)-; или
Z вместе с соседним амином представляет собой необязательно амидированную на С-конце аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина, гистидина, цистеина, лизина, аргинина, серина или треонина; где аминокислота присоединена к липидному якорю через ее функциональную группу боковой цепи;
Y является связывающей группой между линкером и модулятором эндосомального GPCR и представляет собой -О-, -NH-, - S-, -С(О)-, -C(0)NH-, -С(О)О- или -C(0)S-; или
Y вместе с соседней амидо группой представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глутаминовой
кислоты, аспарагина, глутамина, гистидина, цистеина, лизина, аргинина, серина или треонина; где аминокислота присоединена к модулятору эндосомального GPCR через ее функциональную группу боковой цепи;
m обозначает 1 или 2;
п обозначает от 1 до 20;
р обозначает от 1 до 8; и
X представляет собой ингибитор передачи эндосомального сигнала PAR2; или
его фармацевтически приемлемыми солями.
8. Способ по любому из пп.5-7, где трехкомпонентное соединение формулы (I) имеет структуру:
где L и А определены выше,
или его фармацевтически приемлемая соль.
9. Способ по п.1, включающий введение нуждающемуся в этом
субъекту комбинации, содержащей одно или несколько соединений,
которые ингибируют эндоцитоз рецептора, и одно или несколько
соединений, которые таргетируют или ингибируют передачу
эндосомального сигнала PAR2.
10. Применение соединения, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала активируемого протеазой рецептора-2 (PAR2) , при производстве лекарственного средства для лечения боли, вызванной протеазами.
11. Применение по п.10, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое ингибирует эндоцитоз активированного рецептора.
10.
12. Применение по п.10, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2.
13. Применение по п.12, где соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение формулы (I), описанное в любом из пп.5-8.
14. Соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала активируемого протеазой рецептора-2 (PAR2) , для применения при лечении вызванной протеазами боли.
15. Соединение для применения по п.14, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое ингибирует эндоцитоз активированного рецептора.
16. Соединение для применения по п.14, где соединение, которое ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2, представляет собой соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2.
17. Соединение для применения по п.16, где соединение, которое таргетирует и ингибирует передачу эндосомального сигнала PAR2 представляет собой соединение формулы (I), описанное в любом из пп.5-8.
По доверенности
НЕК293; PAR2-Rluc8.RlT-Venus
0 0?-,
0 01-
0.00'
-П 01-
-0 П2-
-0 оэ-
11IJ4-
(Ь)
10 20 30
Время (минуты)
Трипсин 10 нМ/2,88Е-02 Ед/мл Эластаза 10 нМ / 2.56Е-01 Ед/мл Катепсин S10 нМ / 5.26Е-01 Ед/мл
а 5
§ О 90
2 & -OS
-1.U
-1,Ь
n UJ
го Ш
-11 -10 -9 -8 -7
[Трипсин] lg(M)
Dyn4a+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
Dyn4a неактивный +Трипсин 10 нМ / 2,88Е-02 Ед/мл
PS2+Трипсин 10 нМ / 2,88Е-02 Ед/мл
> 1Й+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
НЕК293; PAR2-Riuc8.Rab5a-Venus
Ш ООб-i
CG со
""• ом-
о ?5
о го
ООО
-0.02-
3 о
(Ь)
10 20 30
Время (минуты)
Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл Эластаза 10 нМ / 2.56Е-01 Ед/мл Катепсин S10 нМ / 5.26Е-01 Ед/мл
о з
ё Э
| < 2
"1 Ш 1
го m
_о CQ
(С) ш
О .О-
о " го g
IQ CQ
Si? о
-11 -Ю -5" -8 -/ _
[Трипсин] lg(M) (tm)
нн Dyn4a+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
Dyn4a неактивный+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл ш PS2+Трипсин 10 нМ/2,88Е-02 Ед/мл
* Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
НЕК293: PAR2-HA.CytoEKAR
(а)
ш ее
О 2П
(Ь) 3^-
s Q_ О f5
¦пМ
(с)
Ш
0? "
I 10 20
Время(минуты)
-12
[Трипсин] lg(M)
Трипсин 10 н Эластаза 101 J1 мкМ 1Щ88Е-02 Ед/мл нМ/2,56 Ед/мл
Dyn4a+TpnncHH 10 нМ/2,88Е-02 Ед/мл
Dyn4a неактивный+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
Рв2+Трипсин 10 нМ/2,88Е-02 Ед/мл
PS2 неактивный+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
НЕК293; PAR2-HA.NucEKAR
I Ш S3 ?,
(b)
о тда
s Q_
о го
го _5 О
(с)
ш ._,150' : - : 1 ко-
го ^ so-
-0,1*
Время (минуты)
[Трипсин] lg(M)
Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл Эластаза 100 нМ/2,56 Ед/мл | PDBU1 мкМ
¦ш Dyn4a+TpnncMH 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
Dyn4a неактивный+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл | РЭ2+Трипсин 10 нМ/2,88Е-02 Ед/мл PS2 неактивный+Трипсин 10 нМ / 2.88Е-02 Ед/мл
НЕК293: PAR2-Rluc8.TGN38-Venus
) Ш 0.02-
<Х ООО о
s Q 02
'5 -0 С4
(Ь)
Без ингибитора Галлеин
0.0-
о I- о
го <
'1 (- -1(н
^ ш
го [Г
й СО -154
Щ -Q06
10 20
-2.0
Время (минуты)
Трипсин 10 нМ / 2,88Е-02 Ед/мл > •" Эластаза 100 нМ/2,56 Ед/мл и" Катепсин S100 нМ/5,26Е Ед/мл
Контроль
50 мВ
250 мсек
Rh 50 рА
Rh 50 рА
Dyngo4a (30 мкМ) Трипсин (50 нМ)
Rh 40 рА
Rh 80 рА
а Контроль
си Dyngo4a несущая среда (0,3% ДМСО)
¦ 50 нМ Трипсин
¦ 50 нМ Трипсин+30 мкМ Dyngo4a а 30 мкМ Dyngo4a
О Контроль
о PitStop2 несущая среда (0,3% ДМСО)
¦ 50 нМ Трипсин
ш 15 мкМ PitStop2+50 нМ Трипсин
D 15 мкМ PitStop2
о Контроль
Dyngo4a несущая среда (0,3% ДМСО)
¦ 500 нМ Cat-S
¦ 30 мкМ Dyngo4a+500 нМ Cat-S п 30 мкМ Dyngo4a
пи Контроль
о PitStop2 несущая среда (0,3% ДМСО)
¦ 500 нМ Cat-S
¦I 15 мкМ PitStop2 +500 нМ Cat-S
1=1 15 мкМ PitStop2
10080100-
со о
ГО "=1 1_Ю
§_о 20-*-
[=т Ют 1
0JJL
ЩИ I 1 н \щт\
т= зо мин
60 40
0Т1 Н ЩШ\ I
Т= О мин
п mm \
Т= 30 мин
о Контроль
о Dyngo4a несущая среда (0,3% ДМСО)
ш 500 нМ Cat-S
а 30 мкМ Dyngo4a+500 нМ Cat-S
п 30 мкМ Dyngo4a
о Контроль
? PitStop2 несущая среда (0,3% ДМСО)
¦ 500 нМ Cat-S
ш 15 мкМ PitStop2 +500 нМ Cat-S
Q 15 мкМ PitStop2
100'
бон
^1 40-| го ВС
o*g 20
cz QT i и шри ...1...
Т= 0 мин
I II |^И1
т= зо мин
100' о_ 80 60
Т= 30 мин
2 Eg CD Bo
О p -S-o
? S
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
Несущая среда / Трипсин (n=3) ¦Ў¦ Dy4неакг./Трипсин(п=3) Dy4 / Трипсин (п=3)
Время (час)
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
40-
30-
20-
<=с
- о
10-
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
Несущая среда/Трипсин (п=3) Dy4 неакт. / Трипсин (п=3) Dy4 / Трипсин (п=3)
12 3 4
Время (час)
о р -S-o
100 75
50> 25' 0'
Несущая среда/Трипсин (п=3) Dy4 неакт. / Трипсин (п=3) Dy4/Трипсин (п=3)
-г-4
Трипсин
0 12 3
Время (час)
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
2 Е? CD Б5
о р -S-o
§~?
CD _
со I о
ГО О 1 ^
1 2 3
Время (час) 1 2 3
Время (час)
? 125п
о о о
о; х 0с
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
-У- Dy4 Inad/Cal-S (6)
A Dy4/Cat-S (6)
Ў 40
_ § 30'
го ^Г4
2 20 го о
¦=1
о х
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
Cat-S
Dy4 неакт./Cat-S (6) A Dy4 / Cat-S (6)
t 125-CD m 100'
¦О- C2.
in =^ 75 о p
-S-o
о = 50
^ о
^-У 25 го 0
Время (час)
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
Несущая среда/Эластаза (п=5) Dy4 неакт. / Эластаза (5) Dy4 / Эластаза (5)
2 3 4
Время (час)
Время (час)
Ингибирование i.pl. (-30 мин)
12 3
Время (час)
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
:iv)
:iv)
:iv)
:iv),
:iv),
:iv),
:iv),
:iv),
:iv),
:iv),
(III)
(III)
(III)
1/9
ФИГ. 1
1/9
ФИГ. 1
2/9
ФИГ. 2
2/9
ФИГ. 2
3/9
ФИГ.З
3/9
ФИГ.З
3/9
ФИГ.З
3/9
ФИГ.З
3/9
ФИГ.З
3/9
ФИГ.З
4/9
ФИГ. 4
4/9
ФИГ. 4
4/9
ФИГ. 4
4/9
ФИГ. 4
4/9
ФИГ. 4
4/9
ФИГ. 4
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
5/9
ФИГ. 5
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
6/9
ФИГ. 6
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
7/9
ФИГ. 7
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
8/9
ФИГ. 8
9/9
ФИГ. 9
9/9
ФИГ. 9
