EA201892655A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892655 Полный текст описания [**] EA201892655 20170517 Регистрационный номер и дата заявки DKPA 2016 00305 20160518 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2017/061879 Номер международной заявки (PCT) WO2017/198731 20171123 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БОЛЕЗНИ Название документа [8] A61K 39/09, [8] C07K 16/12 Индексы МПК [NL] Кёйперс Аннемари, [NL] Ван Кессел Кок, [NL] Бёрскенс Франк, [NL] Де Йонг Роб, [NL] Стрюмане Кристин, [NL] Схюирман Янине, [NL] Паррен Пауль, [NL] Ван Стрейп Йос, [NL] Роияккерс Сюзан Сведения об авторах [NL] ГЕНМАБ Б.В. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892655a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение имеет отношение к молекулам антител, которые связываются с Wall Teichoic Acid (WTA) или капсульными полисахаридами (CP), например капсульными полисахаридами типа 5 (CP5). Изобретение, в частности, имеет отношение к молекулам антител IgG изотипа, имеющим мутацию в Fc домене, усиливающую образование кластеров IgG молекул после связывания с мишенью. Изобретение также имеет отношение к фармацевтическим композициям, содержащим эти молекулы, и лечению инфекционных болезней с применением этих композиций.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение имеет отношение к молекулам антител, которые связываются с Wall Teichoic Acid (WTA) или капсульными полисахаридами (CP), например капсульными полисахаридами типа 5 (CP5). Изобретение, в частности, имеет отношение к молекулам антител IgG изотипа, имеющим мутацию в Fc домене, усиливающую образование кластеров IgG молекул после связывания с мишенью. Изобретение также имеет отношение к фармацевтическим композициям, содержащим эти молекулы, и лечению инфекционных болезней с применением этих композиций.


Евразийское (2D 201892655 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/09 (2006.01)
2019.04.30 C07K16/12 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.05.17
(54) АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БОЛЕЗНИ
(31) PA 2016 00305
(32) 2016.05.18
(33) DK
(86) PCT/EP2017/061879
(87) WO 2017/198731 2017.11.23
(71) Заявитель: ГЕНМАБ Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Кёйперс Аннемари, Ван Кессел Кок, Бёрскенс Франк, Де Йонг Роб, Стрюмане Кристин, Схюирман Янине, Паррен Пауль, Ван Стрейп Йос, Роияккерс Сюзан (NL)
(74) Представитель:
Фелицына С.Б. (RU)
(57) Настоящее изобретение имеет отношение к молекулам антител, которые связываются с Wall Teichoic Acid (WTA) или капсульными полисахаридами (CP), например капсульными полисахаридами типа 5 (CP5). Изобретение, в частности, имеет отношение к молекулам антител IgG изотипа, имеющим мутацию в Fc домене, усиливающую образование кластеров IgG молекул после связывания с мишенью. Изобретение также имеет отношение к фармацевтическим композициям, содержащим эти молекулы, и лечению инфекционных болезней с применением этих композиций.
1811576
АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БОЛЕЗНИ Область техники
Настоящее изобретение имеет отношение к антителу, которое связывается с тейхоевой кислотой клеточной стенки (WTA) или капсульными полисахаридами (CP), такими как капсульные полисахариды типа 5 (СР5). Изобретение имеет отношение, в частности, к молекулам антител IgG изотипа, имеющим мутацию в Fc-области, которая усиливает кластеризацию IgG молекул после целевого связывания. Изобретение также имеет отношение к фармацевтическим композициям, содержащим эти молекулы, и лечению инфекционных болезней с применением этих композиций.
Уровень техники
Патогенные бактерии являются существенной причиной болезней и смерти, как у человека, так и у животных.
Staphylococcus aureus (S. aureus) - основной патоген человека, вызывающий тяжелые инфекции. S. aureus без вреда колонизирует примерно 30% здоровых людей, вместе с тем, является причиной опасных для жизни заболеваний как в стационарных, так и в амбулаторных условиях. В больничных условиях S. aureus является одной из наиболее существенных причин инфекций в диапазоне от раневых поверхностных инфекций до тяжелых состояний, таких как сепсис, эндокардит и некротическая пневмония. Распространенность как госпитальных, так и внебольничных гипервирулентных штаммов S. aureus, резистентных к бета-лактамным антибиотикам (MRSA), и полирезистентного S. aureus растет. У людей "очищение" организма-хозяина от S. aureus критически зависит от надлежащего поглощения и внутриклеточного лизиса фагоцитами, такими как нейтрофилы и макрофаги. Эффективное поглощение S. Aureus фагоцитами зависит от системы комплемента, большой белковой сети в плазме. После контакта с бактериями белки комплемента организовываются в каскад протеолитических событий, которые в конечном итоге приводят к массовому мечению поверхностей бактерий белками комплемента СЗЬ и iC3b. Эти 'опсонические' C3b/iC3b молекулы сильно увеличивают эффективность фагоцитоза посредством взаимодействия с рецепторами комплемента (CD35, CD lib/CD 18) на фагоцитах. Классический путь комплемента является важным путем приведения в действие ("запуска") каскада реакций комплемента на бактериях. Инициация классического пути происходит, когда антитела, соединенные с бактерией, связываются с Clq, гексамером из глобулярных "головок". После связывания Clq активирует его ассоциированный фермент С1 s для того, чтобы расщепить компоненты С4
и С2 с образованием фермента СЗ конвертазы (С4Ь2а). Эта СЗ конвертаза, прикрепленная к поверхности через С4Ь, быстро катализирует положение СЗЬ молекул на поверхности бактерии.
Была оценена клиническая эффективность различных биологических средств на основе антител (см. обзор Sause et. al, 2015 Trens in Pharmacological Sciences), включая объединенный человеческий иммуноглобулин (альтастаф, веронат), фрагмент антитела против анти-GrfA (аурограб) и моноклональное антитела (анти-ClfA, тефибазумаб; антилипотейхоевая кислота, пагибаксимаб; анти-PNAG, F598). Другие биологические препараты на основе антител против MRSA, которые были описаны, включают моноклональные антитела против различных молекул-мишеней (включая лейкотоксины, альфа гемолизин, субъединицу глюкозаминидазы Atl, IsaA, протеин А) и конъюгат (ADC) лекарственного средства с mAb против тейхоевой кислоты клеточной стенки (WTA) (смотри в Sause et. al, 2015 Trens in Pharmacological Sciences). Также описан IgM против антигена капсулы (WO2009140236).
WO2014/193722 и WO2014/194247 раскрывает антитела к техноевой кислоте клеточной стенки (анти-WTA), конъюгированные с антибиотиками, и применение конъюгата антитело-антибиотик при лечении инфекционных болезней.
WO2013/004842 раскрывает полипептиды с вариантным Fc-доменом и антитела или полипептиды, имеющие измененные эффекторные функции, являющиеся результатом модификаций в Fc-домене.
WO2014/108198 раскрывает полипептиды, содержащие Fc, с повышенной CDC, являющейся результатом модификаций в Fc-домене.
Тем не менее, существует потребность в улучшении терапии антителами от инфекционных болезней, например, бактериальных инфекций, и желательно в форматах на основе антител, для того, чтобы сохранить фармакокинетический (РК) профиль, похожий на профиль нормального IgG, и предсказуемый профиль безопасности, что часто обстоит не так при применении конструкта на основе фрагмента антитела или антитела, конъюгированного с различными другими токсинами.
Настоящее изобретение предоставляет антитела, предназначенные для применения при лечении инфекционных болезней, как, например, антитела со специфичностью связывания с тейхоевой кислотой клеточной стенки (WTA), капсульными полисахаридами (CP), как например, капсульные полисахариды типа 5 (СР5), с модифицированными Fc-областями. Антитела изобретения с модифицированными Fc-областями демонстрируют повышенную фагоцитарную активность по сравнению с исходным антителом с той же самой специфичностью к антигену, но без модификации в Fc-области.
Раскрытие изобретения
Изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что введение специфической точечной мутации в Fc-область антител, связывающихся с WTA или молекулами капсульных полисахаридов, например, СР5, которые являются компонентами клеточной стенки бактерий, значительно увеличивает потенциальную возможность антитела вызывать FcyR-независимое образование кластеров антител после связывания с мишенью на поверхности бактериальной клетки. Изобретатели также обнаружили, что антитела изобретения повышают активацию комплемента, фагоцитоз и уничтожение бактериальных клеток.
Цель настоящего изобретения заключается в предоставлении модифицированного анти-\?ТА-антитела или модифицированного анти-СР-антитела, например, модифицированного анти-СР5-антитела, пригодного для применения при лечении инфекционных болезней. Дополнительной целью изобретения является обеспечение модифицированных антител, как представлено в этом документе, для применения при лечении бактериальных инфекций. Такое модифицированное анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, содержит мутацию в Fc-области. Дополнительная цель настоящего изобретения - предоставить композицию, пригодную для лечения бактериальных инфекций, содержащую одно или более модифицированных анти-\УТА-антител или одно или более анти-СР-антител, например, одно или более анти-СР5-антител. Такая композиция, как описано в данном документе, содержит, по меньшей мере, одно анти-\УТА-антитело или по меньшей мере, одно анти-СР-антитело, например, по меньшей мере, одно анти-СР5-антитело согласно изобретению, и более предпочтительно композиция содержит два или более анти-\УТА-антител или анти-СР-антител, таких как анти-СР5-антитела согласно изобретению.
Настоящее изобретение предоставляет антитело, содержащее Fc-область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающую область, соединяющуюся с WTA или CP, такое как анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, например, анти-СР5 антитело, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую положению Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. Другими словами, антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-область иммуноглобулина G человека с мутацией аминокислоты в положении, соответствующем Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. Иначе говоря, аминокислота в положении, соответствующем Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl, соответствует аминокислоте в положении Е430, Е345 или S440 в аминокислотной последовательности человеческого IgGl согласно EU-нумерации.
Другими словами, изобретатели настоящего изобретения в первом аспекте изобретения обнаружили, что анти-\УТА-антитело или анти-СР5-антитело изобретения увеличивает фагоцитоз бактериальных клеток, экспрессирующих WTA или СР5, по сравнению с анти-WTA или анти-СР5 без мутации, соответствующей положению Е430, Е345 или S440 человеческого IgGl согласно EU-нумерации. Иначе говоря, анти-WTA-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, настоящего изобретения является пригодным для лечения инфекционных болезней. Инфекционные болезни, вызванные бактериями, экспрессирующими WTA или CP, как например СР5, подходят для лечения с помощью антитела настоящего изобретения. Более того, болезни, вызванные грамположительными бактериями, такие как инфекции кожи и мягких тканей (SSTI), пневмония, гнойный целлюлит, менингит, кистозный фиброз, остеомиелит, эндокардит, синдром токсического шока, девайс-ассоциированные инфекции, бактериемия и сепсис можно лечить с помощью антител изобретения. Кроме того, болезни, вызванные Staphylococcus aureus, такие как инфекции кожи и мягких тканей (SSTI), пневмония, бактериемия, эндокардит и остеомиелиты можно лечить с помощью антител изобретения. Кроме того, болезни, вызванные Staphylococcus warned, такие как воспаление межпозвоночных дисков, инфекции мочевыводящих путей, менингит, инфекции, связанные с ортопедическими устройствами, инфекции, связанные с вентрикулярными шунтами, и эндокардит можно лечить с помощью антител согласно изобретению.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-область человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующей Е430 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-область человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующей Е345 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-область человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующей S440 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-антитело содержит Fc-область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающую область, связывающуюся с WTA, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую E430G или Е345К в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело представляет собой анти-WTA-a антитело. В другом варианте осуществления анти-\УТА-антитело представляет собой анти-WTA-P антитело.
Другими словами антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-область иммуноглобулина человека G с мутацией, соответствующей положению аминокислоты Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР-антитело содержит Fc область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающую область, связывающуюся с CP, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую E430G или Е345К в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-область человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-область человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-область человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР5-антитело содержит Fc-область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающую область, связывающуюся с СР5, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую E430G или Е345К в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет анти-\УТА-антитело, анти-СР-антитело, анти-СР5-антитело, в котором Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl, для применения в качестве медикамента.
В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет анти-\УТА-антитело, анти-СР-антитело, анти-СР5-антитело, в котором Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl, для применения при лечении инфекционной болезни.
В одном аспекте изобретение предоставляет композицию, содержащую одно или более антител изобретения. Композиция может содержать одно или более антител, выбранных из следующей группы, состоящей из анти-WTA-a антитела, анти-WTA-P антитела, анти-СР антитела и анти-СР5 антитела.
В другом аспекте изобретение предоставляет антитело или композицию, как описано в данном документе, предназначенную для применения в качестве медикамента.
В одном аспекте изобретение предоставляет антитело или композицию, как
описано в данном документе, предназначенную для применения при лечении инфекции, вызванной грамположительными бактериями.
В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ лечения индивидуума с инфекционным заболеванием, включающий введение указанному индивидууму эффективного количества указанного антитела или композиции, как описывается в этом документе.
В другом аспекте изобретение предоставляет применение антитела или композиции, как описано выше, для производства медикамента, предназначенного для лечения болезни. В одном варианте осуществления изобретение предоставляет применение антитела или композиции, как описано выше, для производства медикамента, предназначенного для лечения инфекционной болезни.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает отложение продуктов активации комплемента на S. aureus бактериях при помощи природных антител в присутствии или отсутствии Fc-связывающего пептида DCAWHLGELVWCT (Fc-III) или контрольных пептидов. Бактерии Wood 46 были опсонизированы или в серии концентраций объединенной сыворотки здорового человека (NHS), предварительно проинкубированной с 20 мкг/мл пептида (А-В), или в 1% сыворотке, предварительно проинкубированной с серией концентраций пептида (C-D). Отложение С4Ь (А и С) и отложение СЗЬ (В и D) были определены с помощью FACS-анализа. Показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI). Графики представляют среднее значение +/- стандартная ошибка среднего (SEM) из двух (C-D) или трех (А-В) отдельных экспериментов.
Фигура 1 показывает опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение FITC-меченых S. aureus Wood 46 бактерий после опсонизации объединенной NHS в присутствии или отсутствии указанных концентраций Fc-связанного Fc-III пептида или несвязанного контрольного пептида. Фагоцитоз представлен в виде MFI гейтированных нейтрофилов, измеренной с помощью FACS-анализа. HI сыворотка, сыворотка инактивированная нагреванием; буфер, контроль без пептида. Графики представляют среднее значение +/- SEM из трех отдельных экспериментов.
Фигура 3 показывает стимулирование С5а высвобождения после инкубации бактерий Wood 46 с антителами против S. Aureus, присутствующими в объединенной NHS, в присутствии или отсутствии Fc-III пептида или несвязанных контрольных пептидов. Выделение С5а было измерено в С5а-репортерном анализе. Флуоресценцию определяли с помощью FACS-анализа и представили в виде MFI относительно буферного контрольного образца без пептида, который был установлен как 1.0. Столбики на графике
представляют собой среднее значение ± среднеквадратическое отклонение (sd) из двух отдельных экспериментов.
Фигура 4 показывает связывание 1 мкг/мл анти-WTA IgGl-S4497 и анти-Clfa IgGl-T1-2-F405L со штаммами S. aureus Wood 46, USA300, 8325-4 и COL, измеренное с помощью FACS-анализа. Связывание антитела показано как MFI +/- SEM двух отдельных экспериментов.
Фигура 5 показывает воздействие введения мутации, увеличивающей гексамеризацию E430G, в анти-WTA IgGl-S4497 на связывание, отложение комплемента и опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение S. aureus. (А) связывание IgGl-S4497-E430G с Wood 46 и USA300, определенное с помощью FACS-анализа. Связывание представлено как MFI относительно связывания IgGl-S4497 дикого типа. (ВС) С4Ь (В) и СЗЬ (С) отложение на Wood 46 после связывания IgGl-S4497 или IgGl-S4497-E430G в очищенной системе классического пути, определенное с помощью FACS-анализа. (D-E) опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение GFP-меченых S. aureus Wood 46 бактерий после связывания IgGl-S4497 или IgGl-S4497-E430G в 3% сыворотке, лишенной IgGЯgM (D), или в 0,1% NHS (Е). Фагоцитарное поглощение представлено в виде MFI гейтированных нейтрофилов, измеренной с помощью FACS-анализа, и выражено относительно значения для WT IgGl (без сыворотки) при 1,25 мкг/мл. IgGl-bl2 mAb против HIV gpl20 использовали в качестве несвязанного изотипического контрольного mAb. Графики представляют среднее значение +/- SEM двух (С) или трех отдельных экспериментов.
Фигура 6 показывает воздействие К439Е и S440K мутаций в анти-WTA IgGl-S4497 на связывание и отложение комплемента на S. aureus. (А) связывание IgGl-S4497-K439E с Wood 46 и USA300, определенное с помощью FACS-анализа. Связывание представлено в виде MFI относительно связывания WT IgGl-S4497. (В-С) С4Ь (В) и СЗЬ (С) отложение на Wood 46 после связывания отдельных "самоотталкивающихся" антител IgGl-S4497-К439Е и IgGl-S4497-S440K или комбинации IgGl-S4497-K439E + IgGl-S4497-S440K. Отложение C4b и СЗЬ было проанализировано в очищенной системе классического пути и определено с помощью FACS-анализа. Графики представляют среднее +/- SEM двух (С) или трех отдельных экспериментов.
Фигура 7 показывает опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение GFP-меченых S. aureus Wood 46 бактерий после связывания указанных анти-WTA IgGl и IgG2 антител в объединенной NHS. Фагоцитарное поглощение представлено в виде MFI гейтированных нейтрофилов, измеренной с помощью FACS-анализа, и выражено относительно значения для WT IgGl (без сыворотки) при 10 мкг/мл. Графики
представляют среднее +/- SEM, полученное из четырех отдельных экспериментов.
Фигура 8 показывает эффект введения мутации, увеличивающей гексамеризацию E430G в IgGl-CP5, на связывание, отложение комплемента и опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение S. aureus. (А) связывание IgGl-CP5 с Reynolds СР5, Reynolds CP-, COL и Newman-/-, как определено с помощью FACS анализа. Связывание представлено как MFI. (В) Связывание IgGl-CP5-E430G с Reynolds СР5 и Newman-/-, определенное с помощью FACS-анализа. Связывание представлено как MFI относительно связывания WT IgGl-CP5. (C-D) C4b (С) и СЗЬ (D) отложение на Reynolds СР5 после связывания IgGl-CP5 или IgGl-CP5-E430G в NHS или сыворотке, инактивированной нагреванием (HI, как определено с помощью FACS анализа. (E-F) опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение GFP-меченых S. aureus Reynolds СР5 бактерий после связывания с IgGl-CP5 или IgGl-CP5-E430G в присутствии (F) или отсутствии (Е) конкурирующего Fc-III пептида или Fc-III скремблированного 1 пептида в присутствии 3% объединенной NHS. Фагоцитарное поглощение представлено в виде MFI гейтированных нейтрофилов, измеренной с помощью FACS-анализа, и выражено относительно значения WT при 10 мкг/мл. Планки погрешностей на графиках представляют среднее +/- SEM нескольких отдельных экспериментов (двух в А, В, и D; трех или четырех в F и пяти в Е).
Фигура 9 показывает эффект от введения мутации E430G, усиливающей гексамеризацию, в анти-WTA IgGl-S4497 на уничтожение фагоцитами S. aureus бактерий. Уничтожение фагоцитами Wood 46 бактерий представлено процентом живых бактерий после связывания IgGl-S4497 или IgGl-S4497-E430G в 1% сыворотке, лишенной IgG/IgM. Процентное содержание выражается относительно образцов бактерий только без антител или нейтрофилов. Киллинг, вызванный 1% сывороткой, лишенной IgG/IgM, в условиях отсутствия анти-WTA mAb, составлял 0,3%. График представляет среднее значение ± SE из 2 экспериментов, подсчитанных в четырех экземплярах.
Фигура 10 показывает эффект от введения мутации E430G, усиливающей гексамеризацию, в IgGl-S4497 на опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение FITC-меченых S. warneri К64 (А) и KV144 (В) бактерий после связывания антитела в NHS, лишенной IgG. Фагоцитарное поглощение представлено MFI (выраженной относительно значения 1,25 мкг/мл WT антитела с сывороткой) гейтированных нейтрофилов, измеренной с помощью проточной цитометрии. График А для К64 представляет среднее значение ± SE для п=3.
Фигура 11 показывает эффект от введения мутации E430G, усиливающей гексамеризацию, в анти-WTA IgGl-6297 на связывание и отложение комплемента и
опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение S. aureus. (A) Clq связывание после связывания антитела с GFP-экспрессирующими COL бактериями, как определено с помощью проточной цитометрии. (В) С4Ь отложение после связывания антитела с GFP-экспрессирующими COL бактериями, как определено с помощью проточной цитометрии. (C/D) Опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение GFP-экспрессирующих COL (С) и Wood 46 (D) бактерий после связывания антитела в NHS, лишенной IgG. Фагоцитарное поглощение представлено процентом GFP-бактерий, содержащих гейтированные нейтрофилы (процент положительных нейтрофилов), как определено с помощью проточной цитометрии.
Подробное описание изобретения
При описании вариантов осуществления изобретения будет использоваться специфическая терминология во избежание двусмысленного толкования. Однако, изобретение не ограничивается специальными терминами, выбранными таким образом, при этом следует понимать, что каждый специальный термин включает все технические эквиваленты, которые функционируют аналогичным образом, чтобы достигнуть сходной цели.
Согласно настоящему описанию, изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что антитела, связывающиеся с WTA или CP, такими как СР5, и содержащие мутацию в Fc-области, превосходят по индуцированию фагоцитоза бактерий, экспрессирующих WTA или CP, такие как СР5, такие же антитела, за исключением того, что эти антитела не содержат указанной мутации в Fc-области. Путем введения специфических мутаций в Fc-область, олигомеризация после связывания мишени на клеточной поверхности может быть увеличена, в то время как молекулы антител остаются мономерными в растворе (WO2013/004842, WO2014/108198).
Определения
Термин "иммуноглобулин", использованный в описании, относится к классу структурно родственных гликопротеинов, состоящих из двух пар полипептидных цепей, одной пары легких (L) цепей с низким молекулярным весом и одной пары тяжелых (Н) цепей, все четыре могут быть связаны между собой дисульфидными связями. Структура иммуноглобулинов хорошо охарактеризована. Смотри, например, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Коротко, каждая тяжелая цепь в большинстве случаев состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенное название VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи обычно состоит из трех доменов CHI, СН2 и СНЗ. Тяжелые цепи являются взаимосвязанными посредством дисульфидных связей в так называемой "шарнирной
области". Каждая легкая цепь в большинстве случаев состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенное название VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи обычно состоит из одного домена CL. VH и VL области дополнительно могут подразделяться на области гипервариабельности (или гипервариабельные участки, которые могут быть гиперизменчивыми в последовательности или создавать петли определенной структуры), также называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), которые перемежаются с участками, являющимися более консервативными и называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL в большинстве случаев состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (смотри также Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)). Если не указано иное или не противоречит контексту, упоминание положений аминокислот в настоящем изобретении соответствует человеческому IgGl согласно EU-нумерации (Edelman et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1969 May;63(l):78-85; Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 913242). Далее, если не указано иное или не противоречит контексту, CDR участки указываются согласно IMGT определениям.
Термины "иммуноглобулин IgG", "IgG" и "иммуноглобулин G", которые могут использоваться в описании взаимозаменяемым образом, относятся к иммуноглобулину G изотипа.
Термин "шарнирная область", использованный в описании, имеет отношение к шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Таким образом, например, шарнирная область человеческого IgGl антитела соответствует аминокислотам 216-230 согласно EU-нумерации.
Термин "СН2 участок" или "СН2 домен", использованный в описании, имеет отношение к СН2 участку тяжелой цепи иммуноглобулина. Таким образом, например, СН2 участок человеческого IgGl антитела соответствует аминокислотам 231-340 согласно EU-нумерации. Тем не менее, СН2 участок также может быть участком любого другого изотипа, как описано в этом документе.
Термин "СНЗ участок" или "СНЗ домен", использованный в описании, имеет отношение к СНЗ участку тяжелой цепи иммуноглобулина. Таким образом, например, СНЗ участок человеческого IgGl антитела соответствует аминокислотам 341-447 согласно EU-нумерации. Тем не менее, СНЗ участок также может быть участком любого другого изотипа, как описано в этом документе.
Термины "кристаллизующийся фрагмент", "Fc участок", "Fc фрагмент" или "Fc
домен", которые могут использоваться в описании взаимозаменяемым образом, относятся к участку антитела, содержащему в направлении от N- к С-концу, по меньшей мере, шарнирную область, СН2 домен и СНЗ домен. Например, Fc-область IgGl антитела можно получить посредством расщепления IgGl антитела с помощью папаина. Fc-область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (такие как эффекторные клетки) и компоненты системы комплемента, такие как Clq, первый компонент в классическом пути активации комплемента
Термин "Fab фрагмент" в контексте настоящего изобретения относится к фрагменту молекулы иммуноглобулина, содержащему вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи, а также константную область легкой цепи и СН1 участок иммуноглобулина. "СН1 участок" относится, например, к участку человеческого IgGl антитела, соответствующему аминокислотам 118-215 согласно EU-нумерации. Таким образом, Fab фрагмент содержит участок связывания иммуноглобулина.
Использованный в описании термин "антитело" (АЬ) относится к молекуле иммуноглобулина, фрагменту молекулы иммуноглобулина или любому их производному. Антитело настоящего изобретения содержит Fc-область иммуноглобулина и антигенсвязывающий участок. Как правило, антитело содержит два СН2-СНЗ участка и связывающий участок, например, шарнирный участок, например, по меньшей мере, Fc-область. Таким образом, антитело настоящего изобретения может содержать Fc-область и антигенсвязывающий участок. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей молекулы иммуноглобулина содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Использованный в описании термин "антитело" также относится, если точно не указано иное или не противоречит контексту, к поликлональным антителам, моноклональным антителам (таким как человеческие моноклональные антитела), смесям антител (рекомбинантным поликлональным антителам), химерным антителам и гуманизированным антителам. Антитело настоящего изобретения может быть антителом любого изотипа.
Использованный в описании термин "человеческое антитело" относится к антителам, имеющим вариабельные и константные участки, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела изобретения могут включать аминокислотные остатки, некодированные последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, вставки или делеции, введенные посредством случайного или сайтнаправленного мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo).
Однако, термин "человеческое антитело", использованный в описании, не предназначается для того, чтобы включать антитела, в которых CDR последовательности, происходящие из зародышевой линии других видов млекопитающих, например, мыши, были "пересажены" в человеческие каркасные последовательности.
Термин "антитело млекопитающего", использованный в описании, относится к антителам, имеющим вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии млекопитающего.
Термин "антитело копытного" использованный в описании, относится к антителам, имеющим вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии копытного животного.
Термин "химерное антитело", использованный в описании, относится к антителу, в котором тяжелая цепь и легкая цепь являются химерными в результате инженерных манипуляций с антителом. Химерная цепь является цепью, которая содержит чужеродный вариабельный домен (происходящий от видов, не являющихся человеком, или синтетический или созданный инженерным путем из любых видов, включая человека), связанный с константной областью человеческого происхождения.
Термин "гуманизированное антитело", использованный в описании, относится к антителу, в котором тяжелая цепь и легкая цепь являются гуманизированными в результате инженерных манипуляций с антителом. Гуманизированная цепь, как правило, является цепью, в которой гипервариабельные участки (CDR) вариабельных доменов являются чужеродными (происходящими от вида, не являющегося человеком, или синтетическими), тогда как остальная цепь является цепью человеческого происхождения. Оценка гуманизации основывается на полученной в результате аминокислотной последовательности, а не на методологии как таковой, что позволяет использовать протоколы, отличные от "пересадки".
Термин "изотип", использованный в описании, относится к классу иммуноглобулина (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgAl, IgA2, IgE, или IgM), который кодируется генами константного участка тяжелой цепи. Для получения "канонического" антитела каждый изотип тяжелой цепи объединяется или с каппа (к) или с лямбда (к) легкой цепью.
Термины "моноклональное антитело", моноклональное АЬ", "композиция моноклонального антитела", "mAb" или тому подобное, использованные в описании, относятся к приготовлению одномолекулярной композиции из молекул АЬ. Композиция моноклональных антител демонстрирует единую специфичность связывания и аффинность в отношении отдельного эпитопа. Соответственно, термин "человеческое
моноклональное антитело" имеет отношение к антителам АЬ, демонстрирующим одну специфичность связывания, которые имеют вариабельные и константные участки, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие mAb могут быть получены с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного или трансхромосомного животного, не являющегося человеком, такого как трансгенная мышь, имеющего геном, содержащий трансгенный набор человеческой тяжелой цепи и трансгенный набор человеческой легкой цепи, перегруппированные для того, чтобы продуцировать функциональное антитело человека, и которая "сливается" с иммортализованной клеткой. Кроме того, mAb может быть получено с помощью фагового дисплея или других стандартных методов, известных специалисту в данной области техники.
Термин "полноразмерное антитело", использованный в описании, имеет отношение к антителу (например, исходному или варианту антитела), которое содержит все константные домены тяжелой и легкой цепи и вариабельные домены, соответствующие тем, которые обычно обнаруживаются в антителе дикого типа этого изотипа.
Термин "олигомер", использованный в описании, относится к молекуле, которая состоит более чем из одной, но ограниченного числа мономерных единиц (например, антител) в противоположность полимеру, который, по меньшей мере, в принципе, состоит из неограниченного числа мономеров. Примерами олигомеров являются димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры и гексамеры. Для обозначения числа мономерных единиц в олигомере часто используются греческие префексы, например, тетрамер состоит из четырех единиц, а гексамер из шести единиц.
Термин "олигомеризация", использованный в описании, относится к процессу, который трансформирует молекулы до конечной степени полимеризации. В этом документе отмечается, что антитела и/или другие димерные протеины, содержащие участки, связывающиеся с мишенью, согласно изобретению могут образовывать олигомеры, такие как гексамеры, при помощи нековалентного соединения Fc-участков после целевого связывания, например, на клеточной поверхности.
Термин "Fc-Fc увеличение", использованный в описании, имеет отношение к увеличению силы связывания между, или стабилизации взаимодействия между, Fc-областями двух антител, содержащих Fc-участок, или полипептидами, в результате чего полипептиды образуют олигомеры после целевого связывания.
Термины "антигенсвязывающий участок", "антигенсвязывающая область", "участок связывания" или "антигенсвязывающий домен" при использовании в описании относятся к участку антитела, который способен связываться с антигеном. Этот участок
связывания в большинстве случаев определяется VH и VL доменами антитела, которые могут дополнительно подразделяться на участки гипервариабельности (или гипервариабельные участки, которые могут быть гипервариабельными в последовательности и/или форме структурно определенных петель), также называемые областями, определяющими комплементарность (CDRs), которые чередуются с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными участками (FRs). Антиген может быть любой молекулой, такой как полипептид, например, присутствующий на клетке, бактерии или вирионе. Термины "антиген" и "мишень", если это не противоречит контексту, могут использоваться взаимозаменяемым образом в контексте настоящего изобретения.
Термин "мишень" или "антиген", использованный в описании, имеет отношение к молекуле, с которой связывается антигенсвязывающая область антитела. Мишень включает любую молекулу, на которую направлено антитело. Термины "антиген" и "мишень" по отношению к антителу могут использоваться взаимозаменяемым образом и определяют одно и то же значение и цель в отношении любого аспекта или варианта осуществления настоящего изобретения.
Термин "связывание", использованный в описании, относится к взаимодействию антигенсвязывающего участка антитела с соответствующей мишенью. Связывание может быть установлено с помощью FACS-анализа, как описано в примере 5. Связывание антитела в отношении отдельного антитела определяется как связывание выше уровня отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля могут использоваться образцы без антител.
Термин "эпитоп" означает белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. Эпитопы в большинстве случаев состоят из поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи Сахаров и их комбинации и обычно имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не со вторым, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп может содержать аминокислотные остатки непосредственно участвующие в связывании (так называемый иммунодоминантный компонент эпитопа) и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не вовлечены в связывание, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим антигенсвязывающим пептидом (другими словами, аминокислотный остаток находится в области узнавания специфического антигенсвязывающего пептида).
Использованный в описании термин "аффинность" имеет отношение к силе связывания одной молекулы, например, антитела, с другой, например, мишенью или антигеном, в одном участке, например, моновалентное связывание отдельного антигенсвязывающего участка антитела с антигеном.
Использованный в описании термин "авидность" имеет отношение к объединенной силе нескольких сайтов связывания между двумя структурами, например, между несколькими антигенсвязывающими участками антител, одновременно взаимодействующими с мишенью. Когда присутствует более чем одно связывающее взаимодействие, только две структуры будут разъединяться, когда все сайты связывания разъединяются, и таким образом, скорость диссоциации будет медленнее, чем для отдельных сайтов связывания, таким образом обеспечивая более эффективную общую силу связывания (авидность) по сравнению с силой связывания отдельных сайтов связывания (аффинность).
Термин "тейхоевая кислота клеточной стенки" (WTA) относится к анионным гликополимерам, которые ковалентно связаны с 6-ОН группой остатков N-ацетилмурамовой кислоты в пептидогликане через дисахарид, состоящий из GlcNAc-1 -Р и N-ацетилманнозамина, за которым следуют две глицерин-фосфатные (GroP) единицы. В одном варианте осуществления основной WTA остов состоит из повторяющихся единиц 1,5- <1-рибитол-фосфата (RboP) или повторяющихся единиц 1,3-1-а-глицерол-фосфата (GroP). В одном варианте осуществления WTA является рибитол тейхоевой кислотой с повторяющимися фрагментами, связанными 1,5 фосфодиэфирными связями D-рибитола и D-аланилового эфира в позиции 2 и гликозильными радикалами в позиции 4. Гликозильными группами могут быть N-ацетилглюкозаминил а (альфа) или Р (бета) как у S. Aureus. Гидроксилы на альдитол/сахароспирт-фосфатных повторах замещаются катионными D-аланиловыми эфирами и моносахаридами, такими как N-ацетилглюкозамин. В одном аспекте, гидроксильные заместители включают D-аланил и альфа (а) или бета (Р) GlcNHAc.
Термины "антитело, связывающееся с WTA", "анти-\УТА-антитело", "WTA-связывающее антитело", "WTA-специфическое антитело", "WTA-антитело" могут использоваться взаимозаменяемым образом в контексте настоящего изобретения, если это не противоречит контексту, и относятся к любому антителу, которое связывается с WTA, например, WTA альфа и/или WTA бета. Термины "антитело против альфа-тейхоевой кислоты клеточной стенки" или "анти-WTA альфа антитело" или "анти-WTAa" или "анти-aGlcNac WTA антитело" используются взаимозаменяемым образом и относятся к антителу, которое связывает альфа-тейхоевую кислоту (WTA) клеточной стенки, но не
WTA бета. Аналогичным образом, термины " антитело против бета-тейхоевой кислоты клеточной стенки" или "анти-WTA-бета антитело" или "анти-WTAP" или "анти-PGlcNac WTA антитело" используются взаимозаменяемым образом и относятся к антителу, которое специфически связывает бета-тейхоевую кислоту (WTA) клеточной стенки. То, что антитело связывается с WTA-бета, следует понимать как то, что антитело связывается исключительно с WTA-бета, и что данное антитело не связывается перекрестно с WTA-альфа.
Термин "капсульные полисахариды" относится к (Капсульные полисахариды являются водорастворимыми, состоят из гексозаминуроновых кислот и имеют молекулярный вес порядка 100-2000 kDa. Они линейные и состоят из регулярно повторяющихся субъединиц от одного до шести моносахаридов.) высокомолекулярным капсульным полисахаридам, которые присоединены к бактериальным клеткам и окружают поверхность бактериальной клетки.
Термин "капсульный полисахарид типа 5", "СР5" имеет отношение к химической структуре капсульного полисахарида, состоящего из трисахаридных повторяющихся единиц N-ацетил-маннозаминуроновой кислоты, N-ацетил L-фукозамина и N-ацетил D-фукозамина (^4)-3 -О-Ac-p-D-ManNАсА-( 1 -^4)-a-L-FucNАс-( 1 -^3 )-p-D-FucNAc-( 1 -> )"
Термины "антитело, связывающее CP", "анти-СР-антитело", "СР-связывающее антитело", "CP-специфическое антитело" и "CP антитело" могут использоваться взаимозаменяемым образом в данном документе и относятся к любому антителу, которое связывается с CP (капсульными полисахаридами) на бактерии.
Термины "анти-СР5" и "анти-СР5 антитело" относятся к антителу, которое связывается с капсульным полисахаридом типа 5. В частности, термин может относиться к антителу, которое связывается с СР5, экспрессированным на грамположительной бактерии, такой как S. aureus.
Бактерии традиционно подразделяются на две основные группы, грамположительные (Gr+) и грамотрицательные (Gr-), исходя из их способности к удержанию красителя Грама. Грамположительные бактерии окружены одиночной липидной мембраной, и они, как правило, содержат толстый слой (20-80 нм) пептидогликана, отвечающего за сохранение красителя Грама. Грамположительные бактерии это бактерии, которые окрашиваются в темно-синий или фиолетовый цвет при окрашивании по Граму. Наоборот, грамотрицательные бактерии не могут удерживать краситель кристаллический фиолетовый, а вместо этого они поглощают контрастный краситель (сафранин или фуксин) и становятся красными или розовыми при окрашивании по Граму {John G. Holt et al (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.).
Lippincott Williams & Wilkins. p. 11). Клеточные стенки грамположительных бактерий в большинстве случаев утрачивают внешнюю мембрану, найденную у грамотрицательных бактерий.
Грамположительные бактерии включают, но не ограничиваются этим, следующую группу видов бактерий из родов Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus и Listeria.
Термин "метициллин-резистентный Staphylococcus aureus" (MRSA), альтернативно известный как множественно-лекарственно-устойчивый Staphylococcus aureus или оксациллин-резистентный Staphylococcus aureus (ORSA), относится к любому штамму Staphylococcus aureus, который является устойчивым к бета-лактамным антибиотикам, которые включают пенициллины (например, метициллин, диклоксациллин, нафциллин, оксациллин и т.д.) и цефалоспорины. "Метициллин-чувствительный Staphylococcus aureus "(MSSA) относится к любому штамму Staphylococcus aureus, который является чувствительным к бета-лактамным антибиотикам.
Термин "бактериемия" имеет отношение к присутствию бактерий в циркулирующей крови, которая чаще всего выявляется с помощью посева крови на стерильность. Бактерии могут проникать в кровоток в результате тяжелого осложнения инфекций (подобно пневмонии или менингиту), в ходе хирургического вмешательства (особенно в том случае, когда затрагиваются слизистые оболочки, такие как желудочнокишечный тракт), или в связи с применением катетеров и других инородных предметов, введенных в артерии или вены. Бактериемия может иметь некоторые последствия. Иммунный ответ на бактерии может вызывать сепсис и септический шок, при котором отмечается относительно высокий уровень смертности. Бактерии также могут использовать кровь для распространения в другие части организма, вызывая инфекции в других местах отличных от первоначального места инфекции. Примеры инфекций, вызванных в других местах, отличных от первоначального места инфекции, включают эндокардит или остеомиелит.
Термин "эффекторные функции" относится к биологической активности, которая соотносится с Fc-областью антитела и варьирует вместе с изотипом антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают фагоцитоз, активацию комплемента, опсонизацию, активацию фагоцитов через С5а, фагоцит-зависимое phagocyte-dependent bacterial killing Clq-связывание, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), FcRn связывание, связывание Fc-рецептора, включая связывание рецептора Fc-гамма, связывание протеина А, связывание протеина G, антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), комплемент-зависимую цитотоксичность (CDCC), комплемент
усиленную цитотоксичность, опсонизацию, интернализацию Fc-содержащего полипептида, ADC поглощение.
Термин "фагоцитоз" имеет отношение к процессу, с помощью которого бактерия поглощается или усваивается клеткой-хозяином (например, макрофагом или нейтрофилом). Фагоциты опосредуют фагоцитоз тремя путями: (i) непосредственно через рецепторы клеточной поверхности (например, лектины, интегрины и фагоцитарные рецепторы), (ii) комплемент-зависимым путем - с применением рецепторов комплемента (включая CR1, рецептор для СЗЬ, CR3, CR4, CRIg) для связывания с и поглощения патогенов, опсонизированных комплементом, и (ш) антителозависимым путем - с применением Fc рецепторов (включая FcgammaRI, FcgammaRIIA и FcgammaRIIIA) для связывания опсонизированных антителами частиц, которые затем становятся интернализованными и сливаются с лизосомами с образованием фаголизосом.
Термин "лечение" (и его грамматические варианты, такие как "лечить") при использовании в описании относится к клиническому вмешательству, нацеленному на изменение естественного развития болезни индивидуума, ткани или клетки, подвергающейся лечению в течение клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, устранение организма, вызвавшего болезнь, например, бактерий, уменьшение скорости прогрессирования болезни, улучшение или временное облегчение болезненного состояния, и ремиссию или улучшенный прогноз, все они могут быть оценены специалистом в данной области, например, врачом. В одном варианте осуществления лечение может означать облегчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых и непрямых патологических последствий болезни, уменьшение скорости прогрессирования инфекционной болезни, улучшение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах осуществления антитела изобретения используются для отсрочки развития болезни или замедления прогрессирования инфекционного заболевания.
"Вариант" или "вариант антитела" настоящего изобретения - это молекула антитела, содержащая одну или более мутаций по сравнению с "родительским" антителом. Примеры родительского антитела включают, без ограничения, антитело дикого типа, полноразмерное антитело или Fc-содержащий фрагмент антитела, биспецифическое антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело или любую их комбинацию.
Примеры мутаций включают делеции, вставки и замены аминокислот в исходной аминокислотной последовательности. Аминокислотные замены - это замены нативной аминокислоты на другую аминокислоту природного происхождения, или на
аминокислотное производное, не встречающееся в природе. Аминокислотные замены могут быть консервативными или неконсервативными. В контексте настоящего изобретения замены могут характеризоваться в соответствии с классами аминокислот, представленными в одной или более из следующих трех таблиц:
остатков
аминокислотными последовательностями определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), включенного в программу Needle, входящую в пакет программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Используются параметры - штраф за открытие гэпа 10, штраф за продление гэпа 0.5, и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62). Выходные данные программы Needle, обозначенные как "идентичность самых длинных последовательностей" (получаемые с применением опции - nobrief), выражены как процент идентичности и вычисляются следующим образом: (Идентичные остатки х 100)/(Длина выравниваемых последовательностей - Общее число пробелов, используемых при выравнивании).
В целях настоящего изобретения степень идентичности между двумя
дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman и Wunsch, 1970, выше), включенного в программу Needle, входящую в пакет программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Использовали следующие параметры - штраф за открытие гэпа 10, штраф за продление гэпа 0.5 и матрица замен EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4). Выходные данные программы Needle, обозначенные как "идентичность самых длинных последовательностей" (получаемые с применением опции - nobrief), выражены как процент идентичности и вычисляются следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды х 100)/(Длина выравниваемых последовательностей - Общее число пробелов, используемых при выравнивании).
Последовательность вариантов CDR может отличаться от CDR последовательностей родительского антитела вследствие преимущественно консервативных замен природных или функциональных аминокислот самое большее на 5 мутаций или замен, выбранных из консервативных, природных или функциональных аминокислот суммарно в пределах шести CDR последовательностей антителосвязывающего участка, например, самое большее на 4 мутации или замены, выбранные из консервативных, природных или функциональных аминокислот, например, самое большее на 3 мутации или замены, выбранные из консервативных, природных или функциональных аминокислот, например, самое большее на 2 мутации или замены, выбранные из консервативных, природных или функциональных аминокислот, например, самое большее на 1 мутацию или замену, выбранную из консервативной, природной или функциональной аминокислоты суммарно в пределах шести CDR последовательностей участка связывания антитела. Консервативные, природные или функциональные аминокислоты выбирают из 20 существующих в природе аминокислот, т.е. Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gin, Cys, Gly, Pro, Ala, He, Leu, Met, Phe, Trp, Туг и Val.
Аминокислота или сегмент в одной последовательности, которая "соответствует" аминокислоте или сегменту в другой последовательности, представляет собой то, что (i) выравнивается (располагается в одну линию) с другой аминокислотой или сегментом при помощи стандартной программы выравнивания последовательностей, такой как ALIGN, ClustalW или тому подобной.
Термин "вектор", использованный в изобретении, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной индуцировать транскрипцию сегмента нуклеиновой кислоты, лигированного в вектор. Одним типом вектора является "плазмида", имеющая форму кольцевой двухцепочечной петли ДНК. Другим типом вектора является вирусный
вектор, в котором сегмент нуклеиновой кислоты может быть лигирован в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (такие как неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и вследствие этого они реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в описании носят название "рекомбинантные векторы экспрессии" (или просто, "векторы экспрессии"). В общем, векторы экспрессии, применяемые в технологиях рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем подробном описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемым образом, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако, настоящее изобретение включает другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (такие как, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто клетка-хозяин"), использованный в изобретении, относится к клетке, в которую введен вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клетке, о которой идет речь, но также к потомству такой клетки. По причине того, что некоторые модификации могут происходить в следующих поколениях вследствие или мутации или влияния окружающей среды, такое потомство может в действительности не быть идентичным родительской клетке, однако все еще включается в рамки термина "клетка-хозяин" при использовании в описании. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как CHO-S клетки, HEK-293F клетки, Expi293F клетки, PER.C6, NS0 клетки и лимфоцитарные клетки, и прокариотические клетки, такие как Е. Coli, и клетки эукариотических хозяев, такие как клетки растений, и клетки грибов.
Конкретные варианты осуществления изобретения
Настоящее изобретение основывается, по меньшей мере отчасти, на открытии, что способность анти-\УТА-антитела или анти-СР-антитела, такого как анти-СР5-антитело, вызывать активацию комплемента, приводящую к фагоцитозу бактерий, экспрессирующих WTA или CP, такой как СР5, может быть значительно увеличена путем введения специфической мутации в Fc-область, соответствующую положению аминокислоты Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
Положения аминокислот, соответствующие Е430, Е345 и S440 в человеческом IgGl
согласно EU-нумерации, находятся в СНЗ домене Fc-области.
При введении мутации в Fc-область, соответствующую, по меньшей мере, одному из положений Е430, Е345 и S440 в человеческом IgGl, олигомеризация после связывания с мишенью на клеточной поверхности усиливается, в то время как молекулы антитела остаются мономерными в растворе (WO2013/004842; WO2014/108198).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область, в которой мутацию выбирают из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W или S440Y. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область, в которой мутацию выбирают из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит Fc-область, в которой мутация представляет собой E430G или Е345К.
В одном варианте осуществления изобретения антитело содержит дополнительную замену в Fc-области, соответствующую положению К439 или S440, при условии, что мутация в S440 не является S440Y или S440W.
Антитела, содержащие Fc-Fc усиливающую замену согласно настоящему изобретению и дополнительную мутацию в положении S440, такую как S440K, не образовывают олигомеров с полипептидами или антителами, содержащими замену в положении S440, такую как S440K. Полипептиды или антитела, содержащие Fc-Fc усиливающую замену согласно настоящему изобретению и дополнительную мутацию в положении К439, такую как К439Е, не образовывают олигомеров с полипептидами или антителами, содержащими мутацию в положении К439, такую как К439Е. В одном варианте осуществления изобретения дополнительную мутацию выбирают из группы, состоящей из S440K и К439Е.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит дополнительную мутацию, которая является ингибирующей гексамеризацию мутацией, такой как К439Е или S440K. Другими словами, в одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как E430G, и ингибирующую гексамеризацию мутацию К439Е. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как Е345К, и ингибирующую гексамеризацию мутацию, такую как К439Е. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как E430G, и ингибирующую гексамеризацию мутацию S440K. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область
содержит Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как Е345К, и ингибирующую гексамеризацию мутацию S440K. Таким образом, предоставляются варианты осуществления, которые обеспечивают возможность эксклюзивной гексамеризации между комбинациями антител, содержащих К439Е мутацию, и антител, содержащих S440K мутацию. Иначе говоря, ингибирующие мутации К439Е и S440K могут рассматриваться как комплементарные мутации. Комбинации антител с двумя различными ингибирующими гексамеризацию мутациями могут представлять особый интерес при применении в композициях, имеющих, по меньшей мере, два антитела с разными специфичностями.
В одном варианте осуществления изобретения антитело содержит а) по меньшей мере, одну Fc-Fc усиливающую мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430, Е345 и S440, и b) К439Е или S440K мутацию.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к антителу, содержащему Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую положению Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA на поверхности грамположительных бактерий, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую положению Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую положению Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. В одном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий участок связывается с WTA-альфа. В одном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий участок связывается с WTA-бета.
В одном варианте осуществления анти-WTA антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления aHTH-WTA-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y, при этом мутация соответствует положению аминокислоты в человеческом IgGl
согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: E430G, E430S, E430F и Е430Т.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E430G мутацию.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: Е345К, E345Q, E345R и E345Y.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит Е345К мутацию.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E345R мутацию.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации, при условии, что мутация в S440 представляет собой S440Y или S440W.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S440Y и S440W.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440Y мутацию.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440W содержит.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-антитело содержит Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA, при этом Fc-область содержит E430G или Е345К мутацию. В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело представляет собой анти-\УТА-альфа антитело. В другом варианте осуществления анти-\УТА-антитело представляет собой
анти-\?ТА-бета антитело. Другими словами, антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-область иммуноглобулина человека G с мутацией в положении аминокислоты, соответствующем Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. Анти-\УТА-антитело согласно изобретению может быть или анти-\УТА-альфа антителом или анти-\УТА-бета антителом.
WTA экспрессируется на целом ряде грамположительных бактерий, включая Staphylococcus aureus и некоторые виды из родов Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcu и Listeria. Таким образом, в одном варианте осуществления WTA является WTA, экспрессированной на одном или более из Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus и Listeria. В следующем варианте осуществления WTA экспрессируется на Staphylococcus aureus. В другом варианте осуществления WTA экспрессируется на Staphylococcus warneri. WTA может составлять до 60% всей массы клеточной стенки у грамположительных бактерий. Настоящее изобретение не ограничивается конкретными aHTH-WTA-антителами, причем в контексте настоящего изобретения может использоваться любой способ получения антител. AHTH-WTA-антитела, например, можно выбрать и получить с помощью методов, указанных в США 8283294; Meijer PJ et al (2006) JMolBiol. 358(3):764-72; Lantto J, et al (2011) J Virol. 85(4): 1820-33.
Химические структуры WTA варьируют между организмами. У S. aureus WTA ковалентно связывается с 6-ОН N-ацетил-мурамовой кислотой (MurNAc) через дисахарид, состоящий из N-ацетилглюкозамина (GlcNAc)-l-P и N-ацетилманнозамина (ManNAc), за которым следует две или три единицы глицерин-фосфатов. Действительный WTA полимер состоит примерно из 11-40 повторяющихся единиц рибитол-фосфата (Rbo-P). Пошаговый синтез WTA сначала инициируется ферментом, называемым TagO. Повторяющиеся единицы могут дополнительно сшиваться D-аланином (D-Ala) при С2-ОН и/или с N- ацетилглюкозамином (GlcNAc) в С4-ОН положении через а- (альфа) или Р-(бета) гликозидные связи. В зависимости от штамма S. aureus или фазы роста бактерий гликозидные связи могут быть а-, Р- или смесью из двух аномеров. Эти GlcNAc сахарные модификации "сшиваются" двумя специфическими происходящими от S. Aureus гликозилтрансферазами (Gtfs): TarM Gtf опосредует а-гликозидные связи, в то время как TarS Gtfs опосредует Р-(бета) гликозидные связи. Тот факт, что WTA экспонируется поверхностно и состоит из некоторого количества повторяющихся эпитопов, делает его идеальной мишенью для терапии, опосредованной антителами.
Таким образом, предоставляются варианты осуществления изобретения, согласно которым антитело настоящего изобретения связывается с WTA. В одном варианте
осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA-альфа. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся WTA-бета. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с WTA-альфа на грамположительной бактерии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с WTA-бета на грамположительной бактерии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с WTA-альфа на S. aureus. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с WTA-бета на S. aureus.
Антитела изобретения содержат мутацию в Fc-области, которая усиливает олигомеризацию, когда антитело связывается с бактерией. Не ограничиваясь теорией, можно предположить, что увеличенная олигомеризация приводит к повышенной активации системы комплемента и фагоцит-зависимому устранению бактерий из организма-хозяина.
Эффективное уничтожение грамположительных бактерий в организме человека в значительной мере зависит от фагоцитоза бактерий "профессиональными" фагоцитами, такими как нейтрофилы, которые могут поглощать бактерии и убивать их внутриклеточно. Повторные инфекции у пациентов с недостатком нейтрофилов, включая многие инфекции S. aureus, показывают, что нейтрофилы играют чрезвычайно важную роль в противомикробной защите человека от грамположительных бактерий [Bardoel BW, Kenny EF, Sollberger G, Zychlinsky A: The Balancing Act of Neutrophils. Cell Host Microbe 2014, 15:526-536]. Контактирование грамположительных бактерий с системой комплемента приводит к быстрой опсонизации бактериальной поверхности СЗЬ/СЗЫ молекулами. Этот процесс имеет важное значение для фагоцитоза бактерий фагоцитами. Антитела изобретения усиливают антителозависимую активацию комплемента на грамположительной бактерии и последующий фагоцитоз иммунными клетками.
В одном аспекте, изобретение предоставляет aHTH-WTA-антитела, представляющие собой анти-WTA-a или анти-WTA-p. В одном варианте осуществления aHTH-WTA-антитела являются человеческими моноклональными антителами. Настоящее изобретение также рассматривает химерные антитела и гуманизированные антитела. В дополнительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения может содержать CDR присутствующего WTА-антитела, раскрытого в таблице 1.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело содержит антигенсвязывающий участок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий CDR1, CDR2 и CDR3 домены, и вариабельный участок легкой цепи (VL), включающий CDR1, CDR2 и CDR3 домены, имеющие аминокислотные последовательности:
a) (VH) SEQ ID NO: 1,2,3 и (VL) SEQ ID NO: 5,WAS,6 или
b) (VH) CDR1, CDR2, CDR3 и (VL) CDR1, CDR2 и CDR3, как определено в а), имеющие всего от одной до пяти мутаций или замен в пределах шести CDR последовательностей.
Другими словами, в одном варианте осуществления до пяти мутаций, например, замен, в сумме разрешается в пределах шести CDRs, содержащих антигенсвязывающий участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения до пяти мутаций, например, замен, например, одна, две, три, четыре или пять мутаций, например, замен, выполняется в пределах трех CDRs VH области и не делается мутаций в пределах CDRs VL области. В других вариантах осуществления не делается мутаций, например, замен, в пределах CDRs VH области, но до пяти мутаций, например, замен, например, одна, две, три, четыре или пять, располагается в пределах CDRs VL области.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-антитело содержит Fc-область, в которой мутацию выбирают из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W или S440Y. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-антитело содержит Fc-область, в которой мутацию выбирают из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y.
В конкретном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело содержит Fc-область, в которой мутация представляет собой E430G или Е345К.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело содержит Fc-область, содержащую E430G или Е345К мутацию и антигенсвязывающий участок, включающий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 домены, и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 домены, имеющие аминокислотные последовательности:
(VH) SEQ ID NO: 1, 2, 3 и (VL) SEQ ID NO: 5, WAS ,6,
(VH) SEQ ID NO: 35, 36, 37 и (VL) SEQ ID NO: 39, DAS, 40.
В другом аспекте настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающий участок, связывающийся с капсульным полисахаридом (CP), таким как капсульный полисахарид типа 5 (СР5), на
поверхности бактерии, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl, EU-нумерация. В одном варианте осуществления бактерия является грамположительной бактерией.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающий участок, связывающийся с капсульным полисахаридом (CP), таким как капсульный полисахарид типа 5 (СР5), при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y, при этом мутация соответствует положению аминокислоты в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: E430G, E430S, E430F и Е430Т.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E430G мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: Е345К, E345Q, E345R и E345Y.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит Е345К мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E345R мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент
человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S440Y и S440W.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440Y мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440W мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y, при этом данная мутация соответствует положению аминокислоты в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, E430S, E430F и Е430Т.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E430G мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: Е345К, E345Q, E345R и E345Y.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит Е345К мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E345R мутацию.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S440Y и S440W.
В одном варианте осуществления анти-СР5-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440Y мутацию.
В одном варианте осуществления анти-\УТА-антитело содержит Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440W мутацию.
Капсульные полисахариды являются обычными вирулентными структурами патогенных бактерий, вызывающих инвазивные болезни. Капсулы увеличивают вирулентность бактерий, делая бактерию устойчивой к фагоцитозу. Клинические штаммы S. Aureus демонстрируют серотип, обусловленный выработкой капсульного полисахарида типа 5 (СР5). Капсульный полисахарид типа 5 (СР5) характерен примерно для 75% всех клинических изолятов. Показано, что экспрессия СР5 усиливает вирулентность и выживаемость S. aureus in vivo. Также описано, что наряду с ингибированием фагоцитарного поглощения, экспрессия СР5 обеспечивает защиту от внутриклеточного уничтожения (лизиса) бактерии. S. aureus вырабатывает различные поверхностные полисахариды, причем большинство штаммов экспрессирует капсульные полисахариды (CPs) in vivo или при определенных условиях культивирования. Фагоцитоз и уничтожение нейтрофильными гранулоцитами играют ключевую роль в защите против инфекций S. aureus. Показано, что большинство CP обладают антифагоцитарными свойствами. Тот факт, что CP экспонируется поверхностно и состоит из некоторого количества повторяющихся эпитопов, делает его идеальной мишенью для опосредованной антителами терапии.
СР5, экспрессированный на n S. aureus, состоит из 2-ацетамидо-2-дезокси-Ь-фукозы (1 часть), 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-фукозы (1 часть) и 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-маннуроновой кислоты (1 часть).
В одном варианте осуществления изобретения анти-СР5-антитело содержит антигенсвязывающий участок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий CDR1, CDR2 и CDR3 домены, и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 домены, имеющие аминокислотные последовательности:
a) (VH) SEQ ID NO: 8,9,10 и (VL) SEQ ID NO: 12,LAS,13; или
b) (VH) CDR1, CDR2, CDR3 и (VL) CDR1, CDR2 и CDR3, как определено в а), имеющие всего от одной до пяти мутаций или замен в пределах указанных шести CDR последовательностей.
Другими словами, в одном варианте осуществления всего до пяти мутаций, например, замен, располагается в пределах шести CDR, содержащих антигенсвязывающий участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения до
пяти мутаций или замен, например, одна, две, три, четыре или пять мутаций, например, замен, выполняется в пределах трех CDR VH области, и не располагается мутаций в пределах CDRs VL области. В других вариантах осуществления мутации, например, замены, не производятся в пределах CDRs VH области, но до пяти мутаций, например, замен, таких как одна, две, три, четыре или пять, располагается в пределах CDRs VL области.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР5-антитело содержит Fc-область, при этом мутацию выбирают из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W или S440Y. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР5-антитело содержит Fc-область, при этом мутацию выбирают из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y.
В отдельном варианте осуществления изобретения анти-СР5-антитело содержит Fc-область, в которой мутация представляет собой E430G или Е345К.
Антитела изобретения используются в качестве противомикробных средств, эффективных в отношении ряда грамположительных бактерий, вызывающих инфекции у человека и животных, включая роды Staphylococci, например, S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. simulans и S. warneri; Listeria, например, L. monocytogenes; Enterococci, например, E. faecalis, E. faecium; Streptococci, например, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. suis; Bacillus, например, В. anthracis, Clostridium, например, С. difficile; Corynebacterium, например, С. diphteriae.
После проникновения в кровоток S. aureus может вызвать метастатическое заражение почти в любом органе. Вторичные инфекции наблюдаются примерно в одной трети случаев до начала лечения (Fowler et al, (2003) Arch. Intern. Med. 163:2066-2072) и у 10% пациентов даже после начала лечения (Khatib et al, (2006) Scand. J. Infect. Dis., 38:714). Отличительными признаками инфекций являются большое количество гноя, разрушение ткани и формирование гнойника (везде содержится большое количество нейтрофилов). Если бактериемия подавляется в течение 48 часов, только примерно у 5% пациентов развиваются осложнения, в то время как, если бактериемия продолжается больше трех дней, уровни поднимаются до 40%. Staphylococcus aureus является основной причиной инфекций в области хирургического вмешательства (SSI). В частности, SSI, обусловленная метициллин-резистентным Staphylococcus aureus (MRSA), является губительным осложнением, приводящим к повышенному проценту смертности, увеличенной продолжительности госпитализации и дополнительным затратам. Он является основной причиной бактериемии и инфекционного эндокардита, а также
костносуставных, плевролегочных инфекций, инфекций кожи и мягкой ткани, а также девайс-ассоциированных инфекций.
В одном варианте осуществления изобретения грамположительную бактерию выбирают из следующей группы: видов из родов Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus и Listeria.
В одном варианте осуществления изобретения Staphylococcus представляет собой, например, S. aureus, S. saprophytics, S. warneri или S. simulan. В одном варианте осуществления изобретения Streptococcus представляет собой, например, S. pneumoniae. В одном варианте осуществления изобретения Clostridium представляет собой, например, С. difficile. В одном варианте осуществления Enterococcus представляет собой, например, Е. faecalis. В одном варианте осуществления Listeria представляет собой, например, Listeria monocytogenes.
В отдельном варианте осуществления изобретения антитело связывается с WTA или СР5 на грамположительной бактерии, которая представляет собой S. aureus. В другом варианте осуществления изобретения Staphylococcus aureus (S. aureus) представляет собой метициллин-резистентный S.aureus (MRSА) или метициллин-чувствительный S. aureus (MSSA). В еще одном варианте осуществления изобретения S. aureus является резистентным или нечувствительным к предшествующему лечению лекарственным средством. То есть, S. aureus может быть резистентным к предшествующему лечению антибиотиком, таким как триметоприм-сульфаметоксазол (TMP-SMX), клиндамицин, доксициклин, миноциклин, тетрациклин, рифампин, ванкомицин или линезолид.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело является моноклональным антителом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело является IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD или IgM изотипом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело является IgGl или IgG2 изотипом.
В одном варианте осуществления изобретения антитело является антителом млекопитающего, человека или антителом копытного животного.
В одном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело.
В одном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело.
В одном варианте осуществления изобретения легкая цепь является каппа или лямбда цепью.
В одном варианте осуществления антитело является полноразмерным антителом.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область, включающую аминокислотную последовательность из следующей группы:
a) SEQ ID N0 15: IgGl, 43OG;
b) SEQ ID NO 16: IgGl, 345K;
c) SEQ ID NO 17: IgGl, 430S;
d) SEQ ID NO 18: IgGl, E430F;
e) SEQ ID NO 19: IgGl, E430T;
f) SEQ ID NO 20: IgGl, E345Q;
g) SEQ ID NO 21: IgGl, E345R;
h) SEQ ID NO 22: IgGl, E345Y;
i) SEQ ID NO 23: IgGl, S440W;
j) SEQ ID NO 24: IgGl, S440 или
k) любую от а) до j), имеющую от одной до пяти мутаций или замен суммарно по всей указанной последовательности. То есть в одном варианте осуществления в целом до пяти мутаций или замен обеспечивается по всей Fc-области. В некоторых вариантах осуществления изобретения до пяти мутаций или замен, например, одна, две, три, четыре или пять мутаций или замен, обеспечивается по всей Fc-области. Таким образом, предоставляются варианты осуществления, которые предусматривают консервативные мутации в Fc-области, такие мутации могут не ослаблять гексамер(изацию)-усиливающую функцию Fc-области согласно изобретению.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область, включающую аминокислотную последовательность из следующей группы:
a) SEQ ID NO 25: IgG2, E430G;
b) SEQ ID NO 26: IgG2, E345K;
c) SEQ ID NO 27: IgG2, E430S;
d) SEQ ID NO 28: IgG2, E430F;
e) SEQ ID NO 29: IgG2, E430T;
f) SEQ ID NO 30: IgG2, E345Q;
g) SEQ ID NO 31: IgG2, E345R;
h) SEQ ID NO 32: IgG2, E345Y;
i) SEQ ID NO 33: IgG2, S440W;
j) SEQ ID NO 34: IgG2, S440 или
k) любую от а) до j), имеющую от одной до пяти мутаций или замен суммарно по всей указанной последовательности. То есть в одном варианте осуществления в целом до пяти мутаций или замен обеспечивается по всей Fc-области. В некоторых вариантах
осуществления изобретения до пяти мутаций или замен, например, одна, две, три, четыре или пять мутаций или замен, обеспечивается по всей Fc-области. Таким образом, предоставляются варианты осуществления, которые предусматривают консервативные мутации в Fc-области, такие мутации могут не ослаблять гексамер-усиливающую функцию Fc-области согласно изобретению.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область, включающую аминокислотную последовательность из следующей группы:
a) SEQ ID N0 15: IgGl, 43OG;
b) SEQ ID NO 16: IgGl, 345K;
c) SEQ ID NO 17: IgGl, 430S;
d) SEQ ID NO 18: IgGl, E430F;
e) SEQ ID NO 19: IgGl, E430T;
f) SEQ ID NO 20: IgGl, E345Q;
g) SEQ ID NO 21: IgGl, E345R;
h) SEQ ID NO 22: IgGl, E345Y;
i) SEQ ID NO 23: IgGl, S440W and
j) SEQ ID NO 24: IgGl, S440
при этом Fc-область a) - j) дополнительно содержит K439E или S440K замену.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит Fc-область, включающую аминокислотную последовательность из следующей группы, состоящей из:
a) SEQ ID NO 25: IgG2, E430G;
b) SEQ ID NO 26: IgG2, E345K;
c) SEQ ID NO 27: IgG2, E430S;
d) SEQ ID NO 28: IgG2, E430F;
e) SEQ ID NO 29: IgG2, E430T;
f) SEQ ID NO 30: IgG2, E345Q;
g) SEQ ID NO 31: IgG2, E345R;
h) SEQ ID NO 32: IgG2, E345Y;
i) SEQ ID NO 33: IgG2, S440W и
j) SEQ ID NO 34: IgG2, S440;
при этом Fc-область от а) до j) дополнительно содержит К439Е или S440K замену.
В одном варианте осуществления изобретения антитело усиливает фагоцитоз. Не ограничиваясь теорией, делается предположение о том, что, когда антитела изобретения связываются с WTA или СР5 на бактериях, мутация в Fc-области увеличивает
олигомеризацию антител на бактерии. Образование олигомерных структур антител, например, гексамерных структур на бактериях, усиливает фагоцитоз бактерий иммунными клетками, такими как нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Антитела изобретения повышают антителозависимую активацию комплемента на грамположительной бактерии и последующий фагоцитоз иммунными клетками.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-антитело вызывает олигомеризацию антител на целевых клетках, экспрессирующих WTA, такие анти-\?ТА-антитела могут быть или анти-WTA-a антителами или анти-WTA-P антителами, связывающимися или с WTA-a или WTA-P на грамположительной бактерии.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР5 антитело вызывает олигомеризацию, например, гексамеризацию антител на клетках-мишенях, экспрессирующих СР5.
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает фагоцитоз в присутствии комплемента. Другими словами, олигомеризация анти-WTA или анти-СР5 антитела на бактериях увеличивает связывание фактора комплемента Clq с Fc-областью антитела, создавая комплекс Clq:антитело, который обеспечивает связывание Clq с Clq рецепторами на фагоцитах, тем самым увеличивая фагоцитоз.
В одном варианте осуществления изобретения антитело усиливает фагоцитоз бактерий иммунными клетками. То есть, антитела изобретения могут увеличивать фагоцитоз иммунными клетками, такими как нейтрофилы, моноциты, макрофаги, клетки Купфера, дендритные клетки, антигенпрезентирующие клетки.
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает фагоцитоз, опосредованный нейтрофилами. Фагоцитоз, опосредованный нейтрофилами, может быть определен, как в примере 6 или примере 8. Антитело согласно изобретению инкубируют с сывороткой человека, флуоресцентно-меченым S. aureus и нейтрофилами человека. Фагоцитоз определяется количественно с помощью проточной цитометрии.
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает активацию комплемента на грамположительной бактерии. Другими словами, в одном варианте осуществления антитело увеличивает активацию белка комплемента С4 в С4Ь. В одном варианте осуществления антитело увеличивает активацию белка комплемента СЗ в СЗЬ. Активация СЗ на грамположительных бактериальных клетках приводит к опсонизации бактерий опсонинами СЗ-происхождения (СЗЬ и СЗЫ)
В одном варианте осуществления изобретения антитело повышает опосредованную комплементом активацию фагоцитов. То есть, в одном варианте осуществления антитело увеличивает образование хемоаттрактанта С5а.
В одном варианте осуществления изобретения антитело повышает уничтожение, опосредованное комплементом. Композиции
Один аспект изобретения имеет отношение к композиции, содержащей антитело согласно настоящему изобретению. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению содержит антитело согласно любому варианту осуществления, описанному в этом документе.
Анти-\УТА-антитела, анти-СР-антитела или анти-СР5-антитела, такие как моноклональное антитела согласно любому аспекту или варианту осуществления настоящего изобретения, могут содержаться в композиции, например, в фармацевтической композиции, диагностической композиции или любой другой композиции.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение имеет отношение к композиции, содержащей антитело согласно настоящему изобретению и фармацевтический носитель или фармацевтический эксципиент.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к композиции, содержащей антитело согласно любому аспекту, описанному в данном документе.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к композиции, содержащей антитело с антигенсвязывающим участком, связывающимся с WTA или CP, таким как СР5, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую положению аминокислоты Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит антитело с антигенсвязывающим участком, связывающимся с WTA, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y. В одном варианте осуществления композиция содержит антитело, связывающееся с WTA-альфа. В одном варианте осуществления композиция содержит антитело, связывающееся с WTA-бета.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е430 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, E430S, E430F и Е430Т.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит
E430G мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: Е345К, E345Q, E345R и E345Y.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит Е345К мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E345R мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S440Y и S440W.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440Y мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440W мутацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает анти-\УТА-антитело, содержащее Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую E430G или Е345К в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-WTA-антитело, которое является анти-WTA-a антителом. В другом варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-\УТА-антитело, которое является анти-WTA-P антителом. Другими словами, антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-область иммуноглобулина G человека с мутацией, соответствующей положению аминокислоты Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU
нумерации. Анти-\УТА-антитело согласно изобретению может быть или анти-WTA-a антителом или анти-WTA-P антителом.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит антитело с антигенсвязывающим участком, связывающимся с CP, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, E430S, E430F и Е430Т.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E430G мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: Е345К, E345Q, E345R и E345Y.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит Е345К мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E345R мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, включающее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит анти-СР-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S440Y и S440W.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440Y мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит
S440W мутацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает анти-СР-антитело, содержащее Fc-область иммуноглобулина человека IgG и антигенсвязывающий участок, связывающийся с CP, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую E430G или Е345К в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. В одном варианте осуществления изобретения анти-СР-антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-область иммуноглобулина G человека с мутацией, соответствующей положению аминокислоты Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит антитело с антигенсвязывающим участком, связывающимся с СР5, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, E430S, E430F и Е430Т.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E430G мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем Е345 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из Е345К, E345Q, E345R и E345Y.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит Е345К мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит E345R мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем S440 в человеческом IgGl.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5
антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S440Y и S440W.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440Y мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-фрагмент человеческого IgG, при этом Fc-область содержит S440W мутацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает анти-СР5-антитело, содержащее Fc-область иммуноглобулина IgG человека и антигенсвязывающий участок, связывающийся с СР5, при этом Fc-область содержит мутацию, соответствующую E430G или Е345К в человеческом IgGl согласно EU-нумерации. В одном варианте осуществления изобретения анти-СР5-антитело согласно настоящему изобретению содержит Fc-область иммуноглобулина G человека с мутацией, соответствующей положению аминокислоты Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает антитело, при этом данное антитело содержит дополнительно мутацию, ингибирующую гексамеризацию, такую как К439Е или S440K. Другими словами, в одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, выбранную из группы, состоящей из К439Е и S440K.
Антитела, содержащие Fc-Fc усиливающую мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430 и Е345, и дополнительно содержащие S440K мутацию, не образовывают олигомеров с антителами, содержащими S440K мутацию. Антитела, содержащие Fc-Fc усиливающую мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430 и Е345, и дополнительно содержащие К439Е мутацию, не образовывают олигомеров с антителами, содержащими К439Е мутацию. В одном варианте осуществления композиция содержит первое антитело и второе антитело, при этом первое и второе антитело содержит мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430 и Е345, при этом первое антитело дополнительно содержит К439Е мутацию, и второе антитело дополнительно содержит S440K мутацию.
В одном варианте осуществления композиция содержит первое антитело и второе антитело, при этом первое и второе антитело содержит мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430 и Е345, при этом первое антитело дополнительно содержит
S440K мутацию, и второе антитело дополнительно содержит К439Е мутацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит первое антитело и второе антитело, при этом первое и второе антитело содержит мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430 и Е345, при этом первое антитело дополнительно содержит S440K мутацию, и второе антитело дополнительно содержит К439Е мутацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит первое антитело и второе антитело, при этом первое или второе антитело содержит S440W или S440Y мутацию, и при этом первое антитело и или второе антитело дополнительно содержит К439Е мутацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит антитело, включающее Fc-область, содержащую Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как E430G и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, К439Е. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает антитело, содержащее Fc-область, содержащую Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как Е345К и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, К439Е. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает антитело, содержащее Fc-область, содержащую Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как E430G, и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, S440K. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает антитело, содержащее Fc-область, содержащую Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как Е345К, и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, такую как S440K. Таким образом, предоставляются варианты осуществления, которые обеспечивают возможность эксклюзивной гексамеризации между комбинациями антител, содержащими К439Е мутацию, и антител, содержащих S440K мутацию. То есть, ингибирующие мутации К439Е и S440K могут рассматриваться как комплементарные мутации. Комбинации антител с двумя разными ингибирующими гексамеризацию заменами могут представлять интерес, в частности, при использовании в композициях, содержащих, по меньшей мере, два антитела с разными специфичностями.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит, по меньшей мере, одно антитело, содержащее а) по меньшей мере, одну Fc-Fc усиливающую замену в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430, Е345 и S440, и b) К439Е мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит, по меньшей мере, одно антитело, содержащее а) по меньшей мере, одну Fc-Fc усиливающую мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из Е430 и Е345, и b) S440K мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит антитело, при
этом антитело дополнительно содержит мутацию, ингибирующую гексамеризацию, соответствующую К439Е или S440K в человеческом IgGl, согласно EU-нумерации. То есть, в одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию и мутацию, ингибирующую гексамеризацию. Таким образом, в одном варианте осуществления Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как E430G или Е345К, и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, такую как К439Е. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит E430G мутацию и К439Е мутацию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Е345К мутацию и К439Е мутацию. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Fc-Fc усиливающую мутацию, такую как E430G или Е345К, и мутацию, ингибирующую гексамеризацию, такую как S440K. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит E430G мутацию и S440K мутацию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область содержит Е345К мутацию и S440K мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит первое антитело, содержащее мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R и E345Y; и второе антитело, содержащее мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y, при этом первое антитело дополнительно содержит К439Е мутацию, и второе антитело дополнительно содержит S440K мутацию.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит первое антитело, содержащее мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y; и второе антитело, содержащее мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, Е345 и E345Y, при этом первое антитело дополнительно содержит К439Е мутацию, и второе антитело дополнительно содержит S440K мутацию. Таким образом, предоставляются варианты осуществления, которые обеспечивают возможность эксклюзивной гексамеризации между комбинациями антител, содержащих К439Е мутацию, и антител, содержащих S440K мутацию. Не ограничиваясь теорией, предполагается, что комбинация первого и второго антител, содержащих К439К и S440K мутацию, соответственно, делает возможной олигомеризацию первого и второго антител после связывания с мишенью на клеточной поверхности бактерий.
Один вариант осуществления изобретения имеет отношение к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно анти-WTA или анти-СР, такое как анти-СР5 антитело, согласно любому из описанных в данном документе вариантов осуществления.
Дополнительный вариант осуществления изобретения имеет отношение к композиции, содержащей, два или более анти-WTA или два или более анти-СР-антител, таких как анти-СР5-антитела, согласно любому из описанных в данном документе вариантов осуществления. Композиция может содержать одно, два или более анти-WTA-антител или одно, два или более анти-СР5-антител согласно изобретению, как описано в данном документе, которые не являются идентичными, например, комбинацию двух различных aHTH-WTA-антител или двух различных анти-СР5 антител или комбинацию одного или более анти-WTA и одного или более анти-СР5-антител. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит комбинацию из двух или более aHTH-WTA-антител, связывающихся с разными WTA молекулами, такими как WTA-альфа и WTA-бета, или с разными эпитопами на одной и той же молекуле WTA. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит комбинацию из двух или более анти-СР5-антител, связывающихся с разными эпитопами на СР5.
В одном варианте осуществления композиция может содержать одно или более aHTH-WTA-антител или анти-СР-антител, например, анти-СР5-антител, в комбинации с другими антителами. В одном варианте осуществления композиция может содержать поликлональные антитела, при этом одно или более анти-WTA антител или одно или более анти-СР антител, например, одно или более анти-СР5 антител, согласно настоящему изобретению включаются в композицию.
В одном варианте осуществления композиция настоящего изобретения может содержать aHTH-WTA-антитело согласно настоящему изобретению и анти-СР, такое как анти-СР5-антитело, согласно настоящему изобретению.
В дополнительном варианте осуществления такая композиция, включающая анти-WTA и анти-СР, такое как анти-СР5-антитело, может содержать любую комбинацию aHTH-WTA-антител и/или любую комбинацию анти-СР, например, анти-СР5, антител, описанных в данном документе.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит антитело в фармацевтической композиции. То есть композиция может содержать aHTH-WTA-антитело или анти-СР5-антитело согласно настоящему изобретению в фармацевтической композиции. Таким образом, композиция может включать фармацевтический носитель или фармацевтический эксципиент.
В дополнительном варианте осуществления композиция настоящего изобретения может содержать фармацевтический носитель или фармацевтический эксципиент.
Антитела или композиции согласно любому аспекту или варианту осуществления настоящего изобретения могут использоваться в качестве медикамента, т.е. с целью
терапевтического применения.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит одно или более антител согласно изобретению, таких как моноклональное антитела для применения в качестве медикамента.
В одном варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при лечении инфекции, вызванной бактериями. В одном варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при лечении инфекции, вызванной грамположительными бактериями. Грамположительные бактерии могут быть выбраны из следующей группы Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus и Listeria.
В одном варианте осуществления изобретения Staphylococcus представляет собой, например, S. aureus, S. saprophytics, S. warneri или S. simulan. В одном варианте осуществления изобретения Streptococcus представляет собой, например, S. pneumoniae. В одном варианте осуществления изобретения Clostridium представляет собой, например, С. difficile. В одном варианте осуществления Enterococcus представляет собой, например, Е. faecalis. В одном варианте осуществления изобретения Listeria представляет собой, например, Listeria monocytogenes.
В отдельном варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при лечении инфекции, вызванной Staphylococcus aureus, MRS А или MSSA.
В одном варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при профилактическом лечении инфекции, вызванной грамположительной бактерией. В некотором варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при профилактическом лечении инфекции, вызванной грамположительными бактериями.
S. aureus, MSSA и MRS А могут быть причиной одной или более из следующих болезней: инфекций в области хирургического вмешательства (SSI), раневых инфекций, кистозного фиброза, пневмонии, вентилятор-ассоциированной пневмонии (vap), сепсиса, синдрома токсического шока, инфекций, вызванных внутривенным катетером, и инфекций, вызванных наличием протезных устройств.
В одном варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при лечении болезни, выбранной из группы: инфекций в области хирургического вмешательства (SSI), раневых инфекций, кистозного фиброза, пневмонии, вентилятор-ассоциированной пневмонии (vap), сепсиса, синдрома токсического шока, инфекций, вызванных внутривенным катетером, и инфекций,
обусловленных наличием протезных устройств.
В одном варианте осуществления изобретения антитело или композиция предназначается для применения при лечении менингита, инфекций мочевыводящих путей или пневмонии.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит фармацевтический эксципиент.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит один или более фармацевтических эксципиентов.
В одном варианте осуществления изобретения антитело или композиция является фармацевтической композицией.
В одном варианте осуществления изобретения антитело входит в состав фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать антитела, такие как моноклональное антитела, согласно любому аспекту или варианту осуществления настоящего изобретения.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать одно или более антител, таких как моноклональные антитела настоящего изобретения, комбинацию антитела согласно изобретению с другим терапевтическим соединением, или комбинацию соединений настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления изобретения антитело настоящего изобретения входит в состав фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать антитела согласно любому аспекту или варианту осуществления настоящего изобретения.
Фармацевтические композиции могут включать в свой состав фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также другие известные адъюванты и эксципиенты в соответствии с общепринятыми методами, раскрытыми, например, в (Rowe et al, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012 June, ISBN 9780857110275)
Фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также другие известные адъюванты и эксципиенты, должны подходить для антитела настоящего изобретения и выбранного способа введения. Пригодность носителей и других компонентов фармацевтических композиций определяется по отсутствию существенного отрицательного влияния на желательные биологические свойства выбранного соединения или фармацевтической композиции настоящего изобретения (например, не особо значительное влияние (относительное ингибирование 10% или меньше, относительное ингибирование 5% или меньше и т.д.) после связывания антигена).
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения также может включать разбавители, наполнители, соли, буферы, поверхностно-активные вещества, стабилизирующие, консервирующие вещества, фиксаторы тканей, солюбилизаторы и/или другие материалы, подходящие для включения в фармацевтическую композицию.
Действительные уровни дозировок активных ингредиентов, т.е. антитела в фармацевтических композициях настоящего изобретения может изменяться с тем, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желательного терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, не будучи токсичным для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от целого ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций настоящего изобретения, способа введения, времени введения, скорости выведения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, использованных в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, заболевания, общего состояния здоровья и предшествующего медицинского анамнеза пациента, подвергающегося лечению, и тому подобных факторов, хорошо известных в области медицины.
Фармацевтическая композиция может быть введена с помощью любого подходящего пути и способа. Подходящие способы введения соединения настоящего изобретения in vivo и in vitro хорошо известны в данной области техники, и могут быть выбраны специалистами в данной области техники.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения вводится парентерально.
Термины "парентеральное введение" и "вводимый парентерально" при
использовании в описании относятся к способам введения, отличным от энтерального и
местного введения, обычно с помощью инъекции, и включают эпидермальную,
внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную,
внутрикапсульную, подглазничную, внутрисердечную, внутрикожную,
внутрибрюшинную, внутрисухожильную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, подкапсульную, субарахноидальную, интраспинальную, внутричерепную, внутригрудинную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию или инфузию.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения вводится при помощи внутривенной или подкожной инъекции или инфузии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая
композиция содержит одно или более антител согласно изобретению, например, моноклональные антитела в сочетании с фармацевтическим носителем.
Фармацевтически приемлемые носители включают любые подходящие растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства, антиоксиданты, средства, замедляющие абсорбцию, и тому подобные средства, совместимые с соединением настоящего изобретения.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях настоящего изобретения, включают воду, физраствор, фосфатно-буферный солевой раствор, этанол, декстрозу, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное), и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло и кунжутное масло, коллоидные растворы карбоксиметилцеллюлозы, трагакантовую камедь и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат, и/или различные буферы. Другие носители также хорошо известны в фармацевтической области техники.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки, предназначенные для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий с целью немедленного приема. Применение подобных сред и средств для фармацевтически активных субстанций известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какая-либо общепринятая среда или средство является несовместимым с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях настоящего изобретения предусматривается.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут включать один или более адъювантов, подходящих для выбранного способа введения, таких как увлажняющие вещества, эмульгирующие вещества, диспергирующие вещества, консервирующие вещества или буферы, увеличивающие срок годности или эффективность фармацевтической композиции. Соединения настоящего изобретения можно приготовить в сочетании с носителями, которые будут предохранять соединение от быстрого высвобождения, например, в составе форм с контролируемым высвобождением, включая импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Такие носители могут включать желатин, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этилен-винилацетат, полиангидриды, полигликолиевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту отдельно или с воском или с другими материалами, хорошо известными в данной области техники. Способы приготовления таких композиций в
целом известны специалистам в данной области техники.
В одном варианте осуществления соединения настоящего изобретения могут создаваться с целью обеспечения надлежащего распространения in vivo. Фармацевтически приемлемые носители для парентерального введения включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных водных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Применение таких сред и веществ для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда среда или вещество является несовместимым с активным соединением, предусматривается их применение в фармацевтических композициях настоящего изобретения. Другие активные или терапевтические соединения также могут быть включены в композиции.
Фармацевтические композиции, предназначенные для инъекции или инфузии, в большинстве случаев должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть создана в виде раствора, микроэмульсии, липосомы, или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть водным или неводным растворителем или дисперсионной средой, содержащей например, воду, этанол, полиолы (такие как, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), и подходящими их смесями, растительными маслами, такими как оливковое масло, инъецируемыми органическими сложными эфирами, такими как этилолеат. Надлежащая текучесть может быть сохранена, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях, предпочтительным является включение в композицию изотонических средств, например, Сахаров, многоатомных спиртов, таких как глицерин, маннитол, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может достигаться включением в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например, моностеаратов и желатина. Стерильные инъецируемые растворы могут быть получены введением активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, например, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Дисперсии в большинстве случаев получают путем введения активного соединения в стерильный разбавитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, например, из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, примерами способов приготовления являются вакуумная сушка и сушка замораживанием
(лиофилизация), продуктом которых является порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрованием ранее.
Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения, т.е. антитела, в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Дисперсии в большинстве случаев получают путем введения активного соединения в стерильный разбавитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, например, из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, примерами способов приготовления являются вакуумная сушка и сушка замораживанием (лиофилизация), продуктом которых является порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрованием.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать одно или более моноклональных антител или несколько моноклональных антител, таких как, например, поликлональные антитела настоящего изобретения, комбинацию антитела, моноклонального антитела или поликлональных антител согласно изобретению с другим терапевтическим соединением, или комбинацию соединений настоящего изобретения.
Методы настоящего изобретения
Антитела изобретения используются в качестве противомикробных средств, эффективных против инфекционных болезней, вызванных бактериями.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение включает способ лечения индивидуума с инфекционной болезнью путем введения указанному индивидууму эффективного количества анти-\УТА-антитела согласно настоящему изобретению, например, анти-\УТА-альфа антитела или анти-\УТА-бета антитела, анти-СР-антитела согласно настоящему изобретению, например, анти-СР5-антитела или композиции согласно изобретению.
Примеры таких инфекционных болезней включают, но не ограничиваются этим, бактериальные легочные инфекции, такие как S. aureus пневмония или туберкулез, бактериальные инфекции глаз, такие как трахома и конъюнктивит, инфекции сердца, мозга или кожи, инфекции желудочно-кишечного тракта, такие как диарея путешественников, остеомиелит, неспецифический язвенный колит, синдром раздраженной толстой кишки (IBS), болезнь Крона и IBD (воспалительное заболевание
кишечника), бактериальный менингит, и абсцесс в каком-либо органе, таком как мышца, печень, мягкие мозговые оболочки или легкое. Бактериальные инфекции также могут располагаться в других частях организма, как то, мочевыводящие пути, сосудистое русло, рана или место установки катетера.
Антитела или композиции настоящего изобретения используются для лечения инфекций, плохо поддающихся терапии, что подразумевает инфекции, связанные с биопленками, имплантатами или недоступными местами расположения (например, остеомиелит и инфекции эндопротезов суставов), и инфекции с высокой смертностью, такие как внутрибольничная пневмония и бактериемия. Группы находящихся под угрозой пациентов, которые могут подвергаться лечению с целью предотвращения инфекции Staphylococcal aureus, включают пациентов на гемодиализе, пациентов с пониженным иммунитетом, пациентов реанимационных отделений и некоторых пациентов хирургического профиля.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ устранения, лечения или предотвращения микробной инфекции у животного, предпочтительно млекопитающего, и наиболее предпочтительно человека, указанный способ включает введение животному, например, человеку, антитела, композиции или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Изобретение дополнительно описывает лечение или предотвращение болезней, связанных с микробными инфекциями, или которые оппортунистически происходят вследствие таких микробных инфекций. Такие способы лечения или предотвращения могут включать пероральное, местное, внутривенное, внутримышечное или подкожное введение антитела или композиции изобретения. Например, до начала операции или введения IV катетера, в отделениях реанимации, в трансплантационной медицине, одновременно или после химиотерапии рака, или в других случаях, которые несут с собой высокий риск инфекции, антитело или композиция настоящего изобретения может вводиться с целью предотвращения начала или распространения инфекции.
Бактериальная инфекция может быть вызвана бактериями в активной и неактивной форме, и антитело или композиция изобретения может вводиться в количестве и в течение периода времени, достаточного для лечения как активной, так и неактивной, латентной формы бактериальной инфекции, длительность лечения которой дольше, чем требуется для лечения активной формы бактериальной инфекции.
Другой аспект изобретения имеет отношение к способу увеличения эффекторной функции антитела путем введения мутации в Fc-область.
Таким образом, в одном аспекте изобретение имеет отношение к способу
увеличения эффекторной функции антитела, содержащего Fc-область и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA или СР5, при этом данный способ включает введение мутации в Fc-область, соответствующую положению Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl, EU-нумерация.
В одном варианте осуществления изобретения способ включает увеличение эффекторной функции анти-\УТА-антитела, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W или S440Y. В одном варианте осуществления изобретения данный способ включает увеличение эффекторной функции анти-WTA-антитела, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y. В отдельном варианте осуществления изобретения данный способ включает увеличение эффекторной функции aHTH-WTA-антитела, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из E430G или Е345К. В одном варианте осуществления aHTH-WTA-антитело может быть или aHTH-WTA-альфа или aHTH-WTA-бета антителом.
В одном варианте осуществления изобретения способ включает увеличение эффекторной функции анти-СР-антитела, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W или S440Y. В одном варианте осуществления изобретения способ включает увеличение эффекторной функции анти-СР-антитела, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y. В конкретном варианте осуществления изобретения способ включает увеличение эффекторной функции анти-СР-антитела, при этом Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из E430G или Е345К. В одном варианте осуществления анти-СР-антитело представляет собой анти-СР5-антитело.
В одном варианте осуществления изобретения эффекторной функцией является активация комплемента.
В одном варианте осуществления изобретения эффекторной функцией является опсонизация, такая опсонизация может обуславливаться СЗ опсонинами. В другом варианте осуществления изобретения эффекторной функцией является индуцированный антителом фагоцитоз, такой как фагоцитоз, опосредованный иммунными клетками, такими как макрофаги и/или нейтрофилы.
В одном варианте осуществления изобретения эффекторной функцией является С5а образование и активация фагоцитов.
В следующем варианте осуществления эффекторной функцией является фагоцитоз,
опосредованный нейтрофилами. В одном варианте осуществления фагоцитоз, опосредованный нейтрофилами определяется, как раскрыто в примере 6 или 8. Антитело согласно изобретению инкубируют с сывороткой человека, флуоресцентномеченым S. aureus и нейтрофилами человека. Фагоцитоз количественно определяют с помощью проточной цитометрии.
В одном варианте осуществления изобретения антитело усиливает фагоцитоз в присутствии комплемента. Другими словами, олигомеризация анти-WTA или анти-СР5 антител на бактериях усиливает связывание фактора комплемента Clq с Fc-областью антитела, создавая комплекс Clq: антитело, который обеспечивает возможность связывания Clq с Clq рецепторами на фагоцитах, тем самым увеличивая фагоцитоз.
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает фагоцитоз бактерий иммунными клетками. То есть, антитела изобретения могут увеличивать фагоцитоз иммунными клетками, такими как нейтрофилы, моноциты, макрофаги, клетки Купфера, дендритные клетки, антигенпрезентирующие клетки.
В одном варианте осуществления изобретения антитело усиливает фагоцитоз, опосредованный нейтрофилами. Фагоцитоз, опосредованный нейтрофилами, может быть определен, как в примере 6 или 8. Антитело согласно изобретению инкубируют с сывороткой, флуоресцентномеченым S. aureus и нейтрофилами человека. Фагоцитоз количественно определяют с помощью проточной цитометрии.
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает активацию комплемента на грамположительной бактерии. То есть, в одном варианте осуществления антитело увеличивает активацию белка комплемента С4 в С4Ь. В одном варианте осуществления антитело увеличивает активацию белка комплемента СЗ в СЗЬ. Активация СЗ на клетках грамположительных бактерий приводит к опсонизации бактерий опсонинами СЗ-происхождения (СЗЬ и СЗЫ)
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает активацию фагоцитов, опосредованную комплементом. То есть, в одном варианте осуществления антитело увеличивает образование хемоаттрактанта С5а.
В одном варианте осуществления изобретения антитело увеличивает уничтожение, опосредованное комплементом.
Один аспект изобретения предоставляет способ усиления Fc-Fc контакта между молекулами антител на клетке-мишени in vivo, включающий;
i) предоставление антитела, описанного выше, и
ii) осуществление контакта антитела с антигеном на клеточной поверхности
грамположительной бактерии in vivo и
iii) в концентрации, которая обеспечивает Fc-Fc взаимодействие.
Таким образом, описывается вариант осуществления изобретения, раскрывающий способ увеличения Fc-Fc контакта между молекулами антитела изобретения при связывании с клеткой-мишенью in vivo. Термин in vivo следует понимать как в целом живом организме, таком как животное, включая людей.
В одном варианте осуществления изобретения грамположительная бактерия представляет собой Staphylococcus aureus.
В одном варианте осуществления изобретения грамположительная бактерия представляет собой Staphylococcus warneri.
В одном варианте осуществления изобретение грамположительная бактерия является резистентной или нечувствительной к предыдущему лечению лекарственным средством.
В другом варианте осуществления изобретения грамположительная бактерия является метициллин-устойчивой S. aureus (MRSA) или метициллин-чувствительной S. aureus (MSSA).
Терапевтическое применение
Антитела, например, моноклональные антитела, или композиции согласно любому аспекту или варианту осуществления настоящего изобретения могут использоваться в качестве медикамента, т.е. для терапевтического применения.
Антитела могут использоваться для лечения людей и других млекопитающих, например, коров.
В частности, анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения инфекционной болезни.
В одном аспекте анти-WTA антитело настоящего изобретения используется для лечения инфекций, вызванных грамположительными бактериями. В одном варианте осуществления настоящего изобретения aHTH-WTA-альфа антитело используется для лечения от грамположительных бактерий. В одном варианте осуществления настоящего изобретения aHTH-WTA-бета антитело используется для лечения от грамположительных бактерий.
В одном аспекте анти-СР-антитело настоящего изобретения используется для лечения инфекционной болезни. В одном аспекте анти-СР-антитело настоящего изобретения используется для лечения от бактерий. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР-антитело используется для лечения от грамположительных бактерий. В одном варианте осуществления настоящего изобретения
анти-СР5 антитело используется для лечения инфекционной болезни. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР5-антитело используется для лечения от бактерий. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР5-антитело используется для лечения от грамположительных бактерий.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется для лечения болезни, вызванной грамположительной бактерией, выбранной из следующей группы Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus и Listeria.
В одном варианте осуществления изобретения Staphylococcus представляет собой, например, S. aureus, S. saprophyticus или S. simulan. В одном варианте осуществления изобретения Streptococcus представляет собой, например, S. pneumoniae. В одном варианте осуществления изобретения Clostridium представляет собой, например, С. difficile. В одном варианте осуществления Enterococcus представляет собой, например, Е. faecalis. В одном варианте осуществления Listeria представляет собой, например, Listeria monocytogenes.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-\УТА-бета антитело или анти-WTA-альфа антитело используется для лечения S.aureus. В отдельном варианте осуществления настоящего изобретения aHTH-WTA-бета антитело или анти-WTA-альфа антитело используется для лечения MRSA. В одном варианте осуществления настоящего изобретения aHTH-WTA-бета антитело или aHTH-WTA-альфа антитело используется для лечения S. aureus, резистентного к предыдущему лечению антибиотиками, такими как триметоприм-сульфаметоксазол (TMP-SMX), клиндамицин, доксициклин, миноциклин, тетрациклин, рифампин, ванкомицин или линезолид.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется для лечения S.aureus. В отдельном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется для лечения MRSA. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-СР-антитело, такое как анти-СР5 антитело, используется для лечения S. aureus, резистентного к предыдущему лечению антибиотиками, такими как триметоприм-сульфаметоксазол (TMP-SMX), клиндамицин, доксициклин, миноциклин, тетрациклин, рифампин, ванкомицин или линезолид.
S. aureus, MSSA и MRSA могут вызывать одну или более из следующих болезней: инфекций в области хирургического вмешательства (SSI), раневых инфекций, кистозного фиброза, пневмонии, вентилятор-ассоциированной пневмонии (vap), сепсиса, синдрома
токсического шока, инфекций, вызванных внутривенным катетером, и инфекций, вызванных наличием протезных устройств.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется для лечения болезни, выбранной из группы болезней инфекций в области хирургического вмешательства (SSI), раневых инфекций, кистозного фиброза, пневмонии, вентилятор-ассоциированной пневмонии (vap), сепсиса, синдрома токсического шока, инфекций, вызванных внутривенным катетером, и инфекций, вызванных наличием протезных устройств.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется для лечения менингита, инфекций мочевыводящих путей, пневмонии.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется для профилактического лечения инфекции, вызванной грамположительной бактерией.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, используется в дополнительной терапии инфекции, вызванной грамположительной бактерией. Таким образом, предоставляются варианты осуществления, в которых антитело и/или композиция согласно настоящему изобретению может вводиться вместе с антибиотиком.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, может использоваться с целью предотвращения у пациента риска развития SSI, VAP или инфекций, связанных с внутрисосудистым катетером.
В одном варианте осуществления изобретения анти-\УТА-антитело или анти-СР-антитело, такое как анти-СР5-антитело, может использоваться для профилактического лечения системных инфекций, таких как сепсис или пневмония.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит одно или более антител согласно изобретению, например, моноклональных антител для применения в качестве медикамента.
Способ получения
Следует понимать, что описанные далее варианты осуществления со ссылкой на антитело имеют отношение к антителу, содержащему Fc-область иммуноглобулина и антигенсвязывающий участок. Антитело также может быть мультиспецифическим антителом, имеющим первую Fc-область иммуноглобулина и первый антигенсвязывающий участок, и вторую Fc-область иммуноглобулина и второй
антигенсвязывающий участок.
Изобретение также предоставляет изолированные нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие вариант согласно любому из аспектов, описанных выше, а также векторы и системы экспрессии, кодирующие данные варианты. Подходящие нуклеиновокислотные конструкции, векторы и системы экспрессии антител и их вариантов хорошо известны в данной области техники, и описаны в примерах. В вариантах осуществления, где вариант содержит не только тяжелую цепь (или Fc-содержащий фрагмент), но также легкую цепь, последовательности нуклеотидов, кодирующих участки тяжелой и легкой цепи, могут располагаться на одной или разных нуклеиновых кислотах или векторах.
Изобретение также предоставляет способ получения в клетке-хозяине антитела согласно любому аспекту, описанному выше, при этом указанное антитело содержит, по меньшей мере, Fc-область тяжелой цепи, причем указанный способ включает следующие стадии:
a) предоставление нуклеотидной конструкции, кодирующей указанную Fc-область указанного варианта,
b) экспрессию указанной нуклеотидной конструкции в клетке-хозяине и
c) восстановление указанного варианта антитела из клеточной культуры указанной клетки-хозяина.
В некоторых вариантах осуществления антитело является антителом, содержащим только тяжелую цепь. В большинстве вариантов осуществления, однако, антитело будет также содержать легкую цепь, и, следовательно, указанная клетка-хозяин дополнительно будет экспрессировать конструкт, кодирующий легкую цепь, или на том же самом или другом векторе.
Клетки-хозяева, подходящие для рекомбинантной экспрессии антител, хорошо известны в данной области техники и включают СНО, НЕК-293, Expi293, PER-C6, NS/0 и Sp2/0 клетки. В одном варианте осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой клетку, способную к Asn-связанному гликозилированию протеинов, например, эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, например, клетка человека. В дополнительном варианте осуществления указанная клетка-хозяин является нечеловеческой клеткой, созданной генно-инженерным путем для продуцирования гликопротеинов и имеющей подобное человеческому или человеческое гликозилирование. Примерами таких клеток являются генетически модифицированные Pichia pastoris (Hamilton et al, Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al, J. Biotechnology 139 (2009) 318-325) и генетически модифицированные Lemna minor (Cox et al, Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597).
В одном варианте осуществления указанная клетка-хозяин является клеткой-хозяином, которая не способна к эффективному удалению С-концевых остатков лизина К447 из тяжелых цепей антитела. Например, таблица 2 в Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426 (включенном в описание путем отсылки) перечисляет целый ряд таких антителопродуцирующих систем, например, Sp2/0, NS/0 или трансгенная молочная железа (козы), в которых достигается только частичное удаление С-концевых лизинов. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является клеткой-хозяином с измененным аппаратом гликозилирования. Клетки с измененным аппаратом гликозилирования были описаны в данной области техники и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела согласно изобретению, для получения тем самым антитела с измененным гликозилированием. Смотри, например, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также EP1176195; WO03/035835; и W099/54342. Дополнительные методы получения сконструированных гликоформ хорошо известны в данной области техники, и включают, но без ограничения, методы, описанные в Davies et al, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), US6602684, WO00/61739A1; WOO 1/292246Al; WO02/311140A1; WO 02/30954A1; технологию Potelligent(tm) (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb(tm) технологию инженерного гликозилирования (GLYCART biotechnology AG, Цюрих, Швейцария); США 20030115614; Okazaki et al, 2004, JMB, 336: 1239-49.
Изобретение также имеет отношение к антителу, полученному или доступному с помощью метода изобретения, описанного выше.
В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к клетке-хозяину, способной продуцировать антитело изобретения. В одном варианте осуществления клетка-хозяин трансформирована или трансфицирована нуклеотидным конструктом изобретения.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется при помощи следующих примеров, которые не должны истолковываться как ограничивающие. Таблица 1
NLRGEDTAVYYCARGDGGLD DWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 5
VL WTA-бета CDR1
QSIFRTSRNKNL
VL WTA-бета CDR2
WAS
SEQ ID NO: 6
VL WTA-бета CDR3
QQYFSPPYT
SEQ ID NO: 7
VL WTA-бета
DIQLTQSPDSLAVSLGERATINC
KSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQ
RPGQPPRLLIHWASTRKSGVPD
RFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDV
AIYYCQQYFSPPYTFGQGTKL
EIK
SEQ ID NO: 8
VH CP5 CDR1
GFSLTNYG
137G18A-N107D
SEQ ID NO: 9
VH CP5 CDR2
IWSGGNT
SEQ ID NO: 10
VH CP5 CDR3
ARDRYDVRAFDY
SEQ ID NO: 11
VHCP5
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITC
TVS GFSL TN YGVHWVRQ SPG
KGLEWLGVIWSGGNTDYNAA
FISRLSISKDNSKSQVFFKMNSL
QADDTAIYYCARDRYDVRAF
DYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 12
VL CP5 CDR1
QNVRTA
VL CP5 CDR2
LAS
SEQ ID NO: 13
VL CP5 CDR3
LQHWNYLYT
SEQ ID NO: 14
VLCP5
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSIT
CKAS QN VRT A VAWYQ QKPGQ
SPKALIYLASNRHTGVPDRFTG
SGSGTDFTLTISNVQSEDLADY
FCLQHWNYLYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 15
Fc IgGlf-E430G
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVF S С S VMHGALHNHYT
QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 16
Fc IgGlf-E345K
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPRKPQVYTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVF S С S VMHE ALHNHYT
QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 17
Fc IgGlf-E430S
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVF S С S VMHS ALHNHYTQ
KSLSLSPGK
SEQ ID NO: 18
Fc IgGlf-E430F
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHF ALHNHYTQ
KSLSLSPGK
SEQ ID NO: 19
Fc IgGlf-E430T
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVF S С SVMHT ALHNHYT
QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 20
Fc IgGlf-E345Q
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPRQPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHE ALHNHYT
QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 21
Fc IgGlf-E345R
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPRRPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHE ALHNHYT
QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 22
Fc IgGlf-E345Y
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPRYPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHE ALHNHYT
QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 23
Fc IgGlf-S440W
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHE ALHNHYT QKWLSLSPGK
SEQ ID NO: 24
Fc IgGlf-S440Y
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
S S WTVP S S SLGTQTYICNVNH
KP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQWTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHE ALHNHYT
QKYLSLSPGK
SEQ ID NO: 25
Fc IgG2-E430G
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPREPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHGALHNHYTQKSLSL
SPGK
SEQ ID NO: 26
Fc IgG2-E345K
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPRKPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
SEQ ID NO: 27
Fc IgG2-E430S
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPREPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHSALHNHYTQKSLSLS
PGK
SEQ ID NO: 28
Fc IgG2-E430F
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPREPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHFALHNHYTQKSLSLS
PGK
SEQ ID NO: 29
Fc IgG2-E430T
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPREPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHTALHNHYTQKSLSL
SPGK
SEQ ID NO: 30
Fc IgG2-E345Q
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPRQPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
SEQ ID NO: 31
Fc IgG2-E345R
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPRRPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
SEQ ID N0:32
Fc IgG2-E345Y
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPRYPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
SEQ ID N0:33
Fc IgG2-S440W
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTVVHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPREPQWTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKWLSL
SPGK
SEQ ID NO: 34
Fc IgG2-S440Y
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
S WTVP S SNFGTQTYTCNVDH
KPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV
определениями.
Примеры
Пример 1. Антитела и пептиды Экспрессирующие конструкции для антител
С целью экспрессии моноклональных антител (mAb) последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) были клонированы в pcDNA3.3 векторы экспрессии, содержащие человеческие IgGl или IgG2 константные участки тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC), как указано в примерах. Необходимые мутации были введены с помощью или синтеза генов или сайт-направленного мутагенеза. Анти-MRSA антитела, упомянутые в этой заявке, имеют VH и VL последовательности, полученные из ранее описанных антител: человеческие mAb против тейхоевой кислоты бета клеточной стенки GlcNAc 4497 (анти-WTA 4497; на основании WO2014/193722) и анти-WTA IgGl-6297 (на основании WO2014/193722), гуманизированное mAb анти-ClfA тефибазумаб (на основании WO2002/072600) и мышиное mAb антикапсульный полисахарид типа 5 (анти-СР5; на основании WO2014/027698). В некоторых примерах человеческое антитело IgGl-bl2 против HJV gpl20 использовали в качестве несвязанного изотипического контроля (Barbas et al, J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23).
Транзиентная экспрессия
Антитела были экспрессированы как IgGl,к или IgG2,K. Смеси плазмидной ДНК, кодирующей и тяжелую и легкую цепи антител, были транзиентно трансфицированы в Expi293T клетки (Life technologies, США) при помощи 293фектина (Life technologies) в основном, как описано Vink et al. (Vink et al, Methods, 65 (1), 5-10 2014).
Очистка и анализ протеинов
Антитела очистили с применением хроматографии с иммобилизованным протеином G, и партии исследовали с помощью целого ряда биоаналитических анализов, включая SDS-PAGE и гель-хроматографию.
Пептиды
Fc-III пептид DCAWHLGELVWCT (deLano et al, 2000 Science), скремблированные версии Fc-III последовательности (Fc-III Скремблированный 1: ACWTLEWGVLDCH; Fc-III Скремблированный 2: WCDLEGVTWHACL) и контрольный пептид (GWTVFQKRLDGSV) были синтезированы компанией Pepscan (Lelystad, Нидерланды). Пептиды растворяли в MiliQ воде в концентрации 1 или 2 мг/мл и хранили в небольших аликвотах при -80°С.
Пример 2. Ингибирование Fc-Fc взаимодействий приводит к уменьшению отложения комплемента на бактериальной поверхности, вызванного природными
антителами против S. aureus.
Действие конкурирующего Fc-связанного пептида на активацию комплемента антителами против S. aureus было исследовано путем измерения отложения С4Ь и СЗЬ на S. aureus бактериях штамма Wood 46, не несущего протеин А, после опсонизации природными антителами, присутствующими в нормальной сыворотке человека (NHS) в присутствии или при отсутствии пептида. С4Ь является первым компонентом комплемента ковалентно "осаждаемым" на бактериальной поверхности при помощи С1.
Источником комплемента и природных человеческих антител против S. aureus, служила объединенная от 20 здоровых доноров нормальная сыворотка человека (NHS). Венозную кровь от здоровых добровольцев собирали согласно Mini Donor Dienst (MDD) университетского медицинского центра г.Ультрехта (МЕТС-протокол 07-125/С, одобренный 1 марта 2010) в 9 мл BD вакуумные пробирки для крови, содержащие активатор свертывания (BD; кат. номер 367896). Свертывание проводили в течение 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, и сыворотку собрали центрифугированием при 2080g в течение 20 мин при 4°С. Сыворотку 20 здоровых добровольцев объединили, а аликвоты (от 100 до 1000 мкл в пробирках Эппендорфа) хранили при -80°С. Инактивированную нагреванием (Ш) сыворотку готовили путем инкубации размороженной сыворотки при 56°С в течение 30 минут.
Wood 46 бактерии (АТСС № 10832) выращивали в течение ночи на планшетах с кровяным агаром при 37°С. Бактерии собирали с помощью инокуляционной петли в PBS, доводили с применением фотометрии (OD 660нм) до концентрации 5х108/мл, промывали и ресуспендировали в буфере HEPES (20 тМ HEPES, 140 тМ NaCl), содержащем 5 тМ СаСЬ и 2,5 тМ MgCh (HEPES++) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA; Serva; кат. номер 11930.03) при рН 7,3. Для опсонизации 50 мкл промытых бактерий (5х108/мл) проинкубировали с 50 мкл пептида, предварительно проинкубированного с NHS, в круглодонных 96-луночных микропланшетах (Greiner; кат. номер 650101) в течение 20 мин при 37°С и встряхивании 600 об/мин. В одном эксперименте серию концентраций NHS (в диапазоне от 0,075 до 5% при 2-кратном разбавлении) предварительно инкубировали с 20 мкг/мл Fc-III пептида или контрольного пептида, в то время как в других экспериментах фиксированная концентрация 1% NHS была преинкубирована с серией концентраций (в диапазоне от 40 до 0,0375 мкг/мл при 2-кратном разбавлении) Fc-III пептида, Fc-III скремблированного 1 или Fc-III скремблированного 2 пептида. Предварительную инкубацию всех пептидов проводили в течение 10 мин при комнатной температуре без встряхивания. Бактерии два раза промывали PBS с 1% BSA (PBSA) и инкубировали с 50 мкл 1 мкг/мл мышиными
античеловек C4d (Quidel, кат. номер А213) или мышиными-античеловек C3d антителами (Quidel, кат. номер А207) в течение 45 мин при 4°С и встряхивании 600 об/мин. Бактерии промывали два раза PBSA и инкубировали с 50 мкл 1 мкг/мл FITC-конъюгированными козьими F(ab')2 антителами к мышиным иммуноглобулинам (Dako, кат. номер F0479) в течение 45 мин при 4°С и встряхивании 600 об/мин. Образцы промывали, фиксировали с 150 мкл 1% параформальдегида в PBS (PFA; 10% не содержащий метанола формальдегид, Poly sciences кат. номер 04018) и анализировали на проточном цитометре (BD) FACS Verse, оборудованном универсальным устройством для загрузки 96-луночных планшетов. Данные собирали при низких параметрах событий, как при прямом рассеянии (FSC), так и боковом рассеянии (SSC) в log-режиме. Графики зависимости псевдоцветного FSC от SSC плотности использовали, чтобы гейтировать одиночные бактерии в качестве самой высокой относительной плотности популяции, и чтобы определить их среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версия 10.0.7.
Фигура 1 показывает, что в отсутствие пептида (буферный контроль) инкубация S. aureus Wood 46 с сывороткой приводит к дозозависимому отложению С4Ь (фигура 1А) и СЗЬ (фигура 1В) на бактериальной поверхности. В присутствии Fc-III пептида отложение комплемента было сильно ингибировано, в случае уровней C4d до базовых уровней, наблюдаемых при применении инактивированной нагреванием (HI) сыворотки, которая содержит активный комплемент, при всех протестированных концентрациях сыворотки, и в случае уровней СЗЬ до базовых уровней, наблюдаемых при применении Ш сыворотки при концентрации сыворотки в пределах до 1%. В противоположность этому, отрицательный контрольный пептид не оказывал влияния на отложение С4Ь и СЗЬ. При применении фиксированной концентрации сыворотки 1% Fc-III пептид приводил к дозозависимому ингибированию отложения С4Ь (фигура 1С) и СЗЬ (фигура 1D), тогда как неспецифические скремблированные пептиды продемонстрировали отсутствие ингибирующих эффектов.
В заключение, наблюдаемое ингибирование отложения С4Ь и СЗЬ конкурирующим Fc-III пептидом DCAWHLGELVWCT дает основание предполагать, что природные антитела в человеческой сыворотке устанавливают Fc-Fc взаимодействия, вовлеченные в IgG гексамеризацию, для стимулирования классического пути активации комплемента на бактериях Wood 46 S. aureus, не несущих протеин А.
Пример 3. Ингибирование Fc-Fc взаимодействий приводит к уменьшению индуцирования фагоцитарного поглощения бактерий природными антителами против S. aureus.
У людей очищение хозяина от S. aureus существенно зависит от надлежащего поглощения и внутриклеточного киллинга фагоцитирующими клетками, которые наиболее эффективно привлекаются путем связывания их рецепторов комплемента (CD35, CDllb/CD18) с C3b/iC3b молекулами, размещенными на бактериальной поверхности после активации комплемента. Чтобы проверить, влияет ли ингибирование Fc-III пептидом отложения С4Ь и СЗЬ, как описано в примере 2, на фагоцитарное поглощение бактерий, флуоресцентно меченые Wood 46 бактерии инкубировали с нейтрофилами человека после опсонизации природными антителами, присутствующими в NHS, в присутствии или при отсутствии пептида.
Wood 46 бактерии были помечены флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC). В связи с этим, бактерии выращивали в течение ночи на планшетах с кровяным агаром при 37°С и собирали в PBS. Бактерии промывали центрифугированием в течение 15 мин при 3000xg и суспендировали в 10 мл PBS. FITC изомер I (Sigma, кат. номер F4274; растворенный в концентрации 10 мг/мл в DMSO) добавляли в количестве 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 30 мин на льду. Бактерии дважды промывали 10 мл PBS и ресуспендировали в 1х RPMI среде 1640 с L-глутамином и 25mM HEPES (Gibco Life Technologies, кат. номер 52400) с добавлением 0,05% сывороточного альбумина человека (HSA; Альбумин 200 г/л для внутривенного применения от Sanquin). Концентрацию бактерий определяли спектрофотометрически при 660нм, и аликвоты 1x109 клеток/мл хранили при -20°С в 1,5 мл пробирках Эппендорфа. 20 мкл серии концентраций (от 0,01 до 10% в 3-кратных разбавлениях) объединенной NHS, содержащей природные антитела против S. Aureus, предварительно инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с 10 мкл 0, 5, 10 или 20 мкг/мл Fc-III пептида или 20 мкг/мл контрольного пептида в RPMI-0.05% HSA. Добавили 20 мкл 3,75x107/мл FITC-меченых Wood 46 бактерий и инкубировали в течение 20 мин при 37°С и встряхивании (600 об/мин). Для выделения нейтрофилов человека кровь здорового донора собирали в вакуумные пробирки Vacuette NH с натрий гепарином (Greiner Bio-one, кат. номер 455051), выделяли нейтрофилы с помощью градиента Ficoll-Histopaque (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare Lifesciences, кат. номер 171440-03; Histopaque 1119, Sigma, кат. номер 11191; Bestebroer et al, 2007 Blood 109: 29362943) и суспендировали в RPMI-HSA. 10 мкл 7.5х106/мл нейтрофилов добавили в опсонизированные бактерии и проводили фагоцитоз в течение 15 минут при 37°С и встряхивании 600 об/мин. Добавили 90 мкл охлажденного параформальдегида (1,7% в RPMI-HSA), чтобы остановить реакцию, и анализировали образцы, измеряя флуоресценцию нейтрофилов с помощью проточной цитометрии (FACSVerse, BD). Популяцию нейтрофилов вводили в график зависимости псевдоцветного FSC против SSC,
чтобы исключить клеточный дебрис, и анализировали популяцию относительно их MFI, представляющей ассоциированные флуоресцирующие бактерии.
Фигура 2 показывает, что в NHS FITC-меченые бактерии поглощались нейтрофилами дозозависимым образом (буферный контроль). В противоположность этому, в HI сыворотке не наблюдалось фагоцитоза, наводя на мысль о том, что активация комплемента необходима для фагоцитоза, опосредованного нейтрофилами. В присутствии конкурирующего Fc-III пептида, фагоцитоз был сильно блокирован, тогда как контрольный пептид не оказывал воздействия.
В заключение, ингибирование фагоцитоза, опосредованного нейтрофилами, конкурирующим Fc-III пептидом DCAWHLGELVWCT показывает, что природные антитела против S. aureus устанавливают Fc-Fc взаимодействия, вовлеченные в IgG гексамеризацию, для индуцирования комплемент-опосредованного фагоцитоза не несущих протеин A S. aureus Wood 46 бактерий нейтрофилами.
Пример 4. Ингибирование Fc-Fc взаимодействий приводит к пониженной индукции секреции С5а природными антителами против S. aureus.
Чтобы проанализировать, находятся ли также заключительные этапы каскада комплемента под воздействием Fc-связывающего Fc-III пептида, было количественно определено высвобождение С5а анафилатоксина после опсонизации Wood 46 бактерий природными антителами против S. aureus в NHS в присутствии или при отсутствии пептида.
25 мкл NHS (1% конечная концентрация) предварительно инкубировали с 25 мкл Fc-III пептида, контрольного пептида, Fc-III скремблированного 2 пептида (20 мкг/мл конечная концентрация) или при отсутствии пептида (буферный контроль) в RPMI-HSA в течение 10 минут при комнатной температуре без встряхивания, а затем смешивали и инкубировали с 50 мкл Wood 46 бактерий (5х108/мл) в RPMI-HSA в течение 20 минут при 37°С и встряхивании 600 об/мин. Бактерии центрифугировали в течение 7 минут при 3500 об/мин, собирали супернатант для С5а исследования в С5а репортерном анализе, описанном в Bestebroer et al, Cellular Microbiology, 2010 Oct; 12(10): 1506-16. Коротко, клетки человека U937, устойчиво экспрессирующие C5aR (предоставленные Eric Prossnitz, Университет Нью-Мексико; Kew et al. J Leukoc Biol. 1997 Mar;61(3):329-37), были помечены цитоплазматическим кальций-чувствительным флуоресцентным зондом Fluo-3 (Fluo-3, AM; Molecular Probes, кат. номер F1241), который показывает увеличение флуоресценции после связывания Са2+. Активация C5aR путем С5а связывания приводит к увеличению внутриклеточного Са2+. Клетки культивировали в RMPI с 10% FCS, промывали и ресуспендировали при 1х106 клеток/мл в RPMI-0.05% HSA. На образец
измеряли 225 мкл клеток в течение 9 секунд с помощью проточной цитометрии (FACSVerse; BD) для определения базовой интенсивности флуоресценции репортерных клеток. Затем, репортерные клетки стимулировали в реальном времени при помощи 25 мкл супернатантов и регистрировали изменение сигнала флуоресценции до 50 сек. В качестве положительного контроля репортерные клетки стимулировали при помощи 10"8 М синтетического С5а (С5а анафилотоксин (человеческий) трифторацетатная соль; Bachem, кат. номер Н-6322), чтобы индуцировать максимальное увеличение флуоресцентного сигнала. Выработку С5а вычисляли относительно буферного контроля без пептида, который был установлен как 100%.
Фигура 3 показывает, что инкубация Wood 46 бактерий с NHS в присутствии конкурирующего Fc-III пептида приводила к сильно пониженной выработке С5а в сравнении с буферным контролем без пептида (от 100% до 12%), в то время как контрольные пептиды имели только незначительный эффект.
В заключение, ингибирование высвобождения С5а конкурирующим Fc-III пептидом DCAWHLGELVWCT показывает, что антитела против S. Aureus, которые являются естественно существующими в сыворотке человека, устанавливают Fc-Fc взаимодействия, вовлеченные в IgG гексамеризацию после связывания с не несущими протеин А бактериями штамма Wood 46 S. Aureus, чтобы активировать заключительные этапы в каскаде комплемента.
Пример 5. Связывание моноклональных антител против двух штаммов S. aureus.
Два рекомбинантных антитела, направленные против поверхностных молекул S. Aureus, были получены в виде IgGl, как описано в примере 1, и протестированы в отношении связывания с некоторыми S. aureus штаммами. IgGl-S4497 распознает тейхоевую кислоту клеточной стенки (WTA) (Lehar et al, Nature 2015 Nov 19;527(7578):323-8), и IgGl-Tl-2-F405L (на основе тефибазумаба) распознает фактор агглютинации (ClfA) (Domanski et al, Infect Immun. 2005 Aug;73(8):5229-32). Связывание было протестировано с помощью FACS-анализа на Wood 46, USA300, 8325-4 (приобретенном у проф. Т. J. Foster; Тринити-Колледж г. Дублин) и COL (приобретенном у проф. Andreas Peschel; Университет г.Тюбинген). F405L мутация (EU-нумерация), связанная с выработкой биспецифических антител согласно WO2011/131746 (Labrijn et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Mar 26;110(13):5145-50), не является релевантной для данной заявки. Как было показано ранее, мутация F405L не оказывает воздействия на связывание антител.
Штаммы выращивали в течение ночи при 37°С на кровяном агаре, промывали PBS и ресуспендировали до 5х108 клеток/мл в HEPES++ с 0,5% BSA. 50 мкл бактерий смешали
с 50 мкл 2,5 мкг/мл антител (конечная концентрация 1,25 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 минут при 4°С и встряхивании (600 об/мин). Бактерии дважды промывали PBSA и инкубировали с 50 мкл А1еха647-меченого протеина A (Molecular probes, кат. номер Р21462) в течение 45 минут при 4°С и встряхивании (600 об/мин). Образцы два раза промывали PBSA, фиксировали 150 мкл 1% параформальдегида в PBS и анализировали с помощью FACS с применением прибора FACSVerse (BD Biosciences).
Анти-WTA IgGl-S4497 продемонстрировал превосходное связывание со всеми протестированными штаммами S. aureus по сравнению с анти-ClfA IgGl-Т1-2 (фигура 4). С учетом этого, IgGl-S4497 против WTA был выбран для проведения дальнейших исследований, описанных в примерах 6-8.
Пример 6. Введение мутации E430G, усиливающей гексамеризацию, в анти-WTA антитело IgGl-S4497 приводит к повышенному отложению комплемента и увеличению фагоцитарного поглощения.
Усиливающая гексамеризацию мутация E430G согласно EU-нумерации была введена в анти-WTA антитело IgGl-S4497. Связывание IgGl-S4497-E430G со штаммами S. aureus Wood 46 и USA300 сравнивали со связыванием (WT) IgGl-S4497 дикого типа в FACS-анализе связывания, как описано в примере 5. Фигура 5А показывает, что связывание IgGl-S4497 с Wood 46 и USA300 не подвергалось влиянию введения E430G мутации.
Способность IgGl-S4497-E430G вызывать активацию комплемента на S. aureus сравнивали со способностью WT IgGl-S4497. В первую очередь, способность IgGl антитела способствовать отложению С4Ь и СЗЬ была проанализирована в очищенной системе классического пути. Очищенные компоненты использовали вместо сыворотки, чтобы гарантировать, что не присутствовали природные антитела против S. aureus, которые могли повлиять на измерения. Бактерии Wood 46 выращивали и собирали, как описано в примере 2. 50 мкл серийных разведений антител (конечные концентрации 0,0810 мкг/мл в 2-кратном разведении) IgGl-S4497 или IgGl-S4497-E430G добавили к 50 мкл промытых бактерий при 5х108/мл и инкубировали в течение 30 минут при 37°С и встряхивании (600 об/мин). Опсонизированные бактерии дважды промывали PBSA, ресуспендировали в 50 мкл буфера HEPES с 1 мкг/мл CI (Complement Technology, кат. номер А098) и инкубировали в течение 30 минут при 4°С и встряхивании 600 об/мин. Образцы два раза промывали PBSA, ресуспендировали в 50 мкл буфера HEPES с 10 мкг/мл С4 (Complement Technology, кат. номер А105) и инкубировали в течение 30 минут при 37°С при встряхивании 600 об/мин. Для отложения СЗЬ образцы потом также инкубировали с С2 (конечная концентрация 10 мкг/мл, Complement Technology, кат. номер
А112) вместе с СЗ (конечная концентрация 10 мкг/мл; выделенные из человеческой плазмы согласно Rooijakkers и Wu, Nature Immunology, 2009 Jul; 10(7):721-7) в течение 30 минут при 37°С и встряхивании 600 об/мин. Образцы промыли и зафиксировали и отложение C4d и C3d анализировали с помощью FACS-анализа, как описано в примере 2.
Инкубация с анти-WTA mAb приводила к дозозависимому отложению С4Ь и СЗЬ и IgGl-S4497 и IgGl-S4497-E430G. Примечательно, введение E430G мутации в IgGl-S4497 приводило к повышенному отложению С4Ь (фигура 5В) и СЗЬ (фигура 5С) на Wood 46 бактериях. Результаты были проанализированы с помощью GraphPad Prism (версия 6.02) с применением the nonlinear fit for log(agonist) versus response с изменяемым наклоном (четыре параметра). Для отложения C4b ЕС50 значения были 0,886 ±0,040 мкг/мл для IgGl-S4497 и 0,431±0,080 мкг/мл для IgGl-S4497-E430G, соответственно. Для отложения СЗЬ ЕС50 значения были 0,668±0,031 мкг/мл для IgGl-S4497 и 0,354±0,068 мкг/мл для IgGl-S4497-E430G, соответственно.
Затем был проанализирован эффект введения усиливающей гексамеризацию E430G мутации на способность IgGl-S4497 индуцировать опосредованный нейтрофилами фагоцитоз. Wood 46 бактерии были генетически модифицированы с помощью усовершенствованной GFP-экспрессирующей плазмиды рСМ29, которая конститутивно и сильно экспрессирует сверхсвернутый зеленый флуоресцентный белок (sGFP) из sarAPl промотора (Pang et al, J Innate Immun. 2010;2(6):546-59). Компетентные бактерии электропорировали с применением 10 мкл плазмиды с помощью Gene Pulser II (BioRad; 100 Ohm resistance, 25uF емкость при 2.5kV), как описано в Schenk et al, FEMS Microbiol Lett. 1992 Jul l;73(l-2): 133-8. После восстановления, бактерии отбирали на агаровых планшетах Todd Hewitt, содержащих 10 мкг/мл хлорамфеникола (Sigma-Aldrich, кат. номер С0378). Отобрали колонию для размножения в течение ночи в 3 мл жидкого ТНВ (Oxoid, кат. номер СМ0189В) с 10 мкг/мл хлорамфеникола при 37°С и встряхивании. Бактерии промывали PBS, ресуспендировали в 1 мл 15% глицерина в PBS и хранили при -80°С. Для экспериментов по фагоцитозу GFP-меченые Wood 46 выращивали в 3 мл ТНВ в течение 18 часов при 37°С и встряхивании при 600 об/мин, разбавляли 1:50 в 10 мл свежего ТНВ и потом культивировали в течение 3 часов при 37°С и встряхивании 600 об/мин. Бактерии промывали два раза PBS и ресуспендировали до 5х108 клеток/мл в IX RPMI 1640 среда + L-глутамин + 25mM HEPES (Gibco Life Technologies; кат. номер 52400) с добавлением 0,05% HSA (Sanquin; Albuman 200 г/л для внутривенного применения). 20 мкл 3.75х107/мл GFP-меченых Wood 46 бактерий опсонизировали путем инкубации в течение 15 минут при 37°С и встряхивании (600 об/мин) с 10 мкл серийных концентраций антител IgGl-S4497, IgGl-S4497-E430G или IgGl-bl2 изотипическим
контролем (0,005 - 10 мкг/мл в 2-кратных разведениях) плюс 10 мкл или 0,4% NHS (0,1% окончательная концентрация сыворотки) или 12% сыворотки, не содержащей природных IgG и IgM антител (3% окончательная концентрация сыворотки). Нейтрофилы человека были выделены, как описано в примере 3. 10 мкл 6,5х106/мл нейтрофилов добавили к опсонизированным бактериям, и проводили фагоцитоз в течение 15 минут при 37°С и встряхивании 750 об/мин. Реакцию останавливали холодным парафольмадегидом и флуоресценцию нейтрофилов анализировали с помощью проточной цитометрии, как описано в примере 3.
Для истощения IgG/IgM из NHS, EDTA (500 тМ стоковый раствор в воде) добавили к объединенный NHS до конечной концентрации 5тМ, и 5 мл сыворотки пропустили через 5 мл колонку с протеином G HiTrap (GE Healthcare; кат. номер 17-040501) параллельно с 5 мл колонкой HiTrap NHS-Sepharose (GE Healtcare; кат. номер 17-071701) дополненной козьим-анти-Hu-IgM в холодном 20 тМ натрий-фосфатном буфере рН 7.5. Собранные пиковые фракции объединили, восстановили с помощью 10 тМ СаСЬ + 10 тМ MgCh, и аликвоты хранили при -80°С. Процедуру проводили на АКТА FPLC с помощью коллектора фракций (GE Healtcare Life Sciences) с применением охлажденных на льду буферов и колонок. Связывание 2 мг козьего-анти-Hu-IgM (ThermoFisher Scientific; кат. номер 31136) с NHS-Sepharose колонкой проводили согласно общему протоколу, предоставленному GE Healthcare (Instructions 71-7006-00 АХ), используя попеременно 0,5 М этаноламин с 0,5 М NaCl, рН 8,3 и 0,1 М ацетат натрия с 0,5 М NaCl, рН 4 для дезактивирования избытка реакционноспособных групп.
Инкубация с анти-WTA mAb приводила к дозозависимому опосредованному нейтрофилами поглощению GFP-меченых бактерий, как в присутствии, так и при отсутствии природных антител в NHS (фигура 5). Примечательно, введение усиливающей гексамеризацию мутации приводило к повышенной эффективности опосредованного нейтрофилами фагоцитарного поглощения, индуцированного IgGl-S4497-E430G по сравнению с IgGl-S4497. Это увеличение наблюдалось и в сыворотке, не содержащей природных антител (фигура 5D), и в нормальной человеческой сыворотке (фигура 5Е). Результаты были проанализированы, как описано выше, и было получено ЕС50 0,144±0,024 мкг/мл для IgGl-S4497 и ЕС50 0,027±0,060 мкг/мл для IgGl-S4497-E430G, соответственно, при применении NHS, не содержащей IgG и IgM. В присутствии интактной NHS, ЕС50 для IgGl-S4497 было 0,096±0,047 мкг/мл и 0,015±0,104 мкг/мл для IgGl-S4497-E430G, соответственно.
Взятые вместе, эти результаты показывают, что увеличение гексамеризации анти-WTA IgGl-S4497 на бактериальной поверхности путем введения E430G мутации может
приводить к увеличенному отложению комплемента и повышению опосредованного нейтрофилами фагоцитарного поглощения не несущих протеин A S. aureus Wood 46 бактерий.
Пример 7. Отложение комплемента на S. aureus после связывания анти-WTA IgGl-S4497 нуждается в Fc-Fc взаимодействиях для образования гексамеров антител.
Чтобы изучить необходимость формирования гексамеров антител IgGl-S4497 для индуцирования отложения комплемента на S. aureus, мы использовали самоотталкивающие мутации К439Е и S440K (Diebolder et al, Science. 2014 Mar 14;343(6176): 1260-3). Fc-отталкивание между антителами, которое вносится наличием или К439Е или S440K в IgGl антитело, приводит к ингибированию гексамеризации (WO2013/0044842). Отталкивание в результате К439Е и S440K мутаций нейтрализуется путем объединения обеих мутаций в смеси двух антител, каждое из которых несет одну и другую мутацию, приводя к возобновлению Fc-Fc взаимодействий и гексамеризации.
Во-первых, связывание IgGl-S4497-K439E со S. aureus штаммами Wood 46 и USA300 сравнивали со связыванием WT IgGl-S4497 в FACS-анализе связывания, как описано в примере 5. Фигура 6А показывает, что связывание IgGl-S4497 с Wood 46 и US A3 00 не находилось под воздействием введения К439Е мутации.
Затем, способность IgGl-S4497-K439E, IgGl-S4497-S440K и комбинации двух антител содействовать отложению С4Ь и СЗЬ на Wood 46 было протестировано в очищенной системе классического пути, как описано в примере 6. Для ингибирующих вариантов К439Е и S440K наблюдалось уменьшенное отложение С4Ь (фигура 6В) и СЗЬ (фигура 6С) по сравнению с WT IgGl-S4497. Однако, когда отталкивание было нейтрализовано путем объединения двух антител, каждое из которых имеет одну из комплементарных мутаций К439Е и S440K, отложение С4Ь (фигура 6В) и СЗЬ (фигура 6С) было восстановлено до WT уровней. Значения ЕС50 были вычислены, как описано в примере 6. Для отложения С4Ь значения ЕС50 были 0,886 ±0,040 мкг/мл для WT IgGl-S4497, 1,490±0,028 мкг/мл для IgGl-S4497-K439E, 1,354±0,033 мкг/мл для IgGl-S4497-S440K, и 1,034±0,033 мкг/мл для комбинации IgGl-S4497-K439E + IgGl-S4497-S440K. Для отложения СЗЬ значения ЕС50 были 0,668±0,031 мкг/мл для WT IgGl-S4497, 1,035±0,031 мкг/мл для IgGl-S4497-K439E, 0,899±0,036 мкг/мл для IgGl-S4497-S440K и 0,657±0,025 мкг/мл для комбинации IgGl-S4497-K439E + IgGl-S4497-S440K.
Эти результаты показывают, что гексамеризация антител посредством Fc-Fc взаимодействий может улучшать отложение С4Ь и СЗЬ на S. aureus Wood 46 при помощи анти-WTA IgGl-S4497.
Пример 8. IgG2-S4497 против S. aureus антигена WTA вызывает комплемент-зависимое фагоцитарное поглощение нейтрофилами человека, которое может быть увеличено путем введения усиливающей гексамеризацию мутации E430G.
Поскольку природные антитела против S. aureus антигена WTA преимущественно включают IgG2 (Jung et al, J Immunol. 2012 Nov 15; 189(10):4951-9), мы также протестировали способность анти-WTA антитела в остове IgG2 вызывать фагоцитарное поглощение GFP-меченых Wood 46 бактерий свежевыделенными нейтрофилами человека, как описано в примере 6. IgG2-S4497 и IgG2-S4497-E430G были получены, как описано в примере 1. Эффект введения мутации E430G, усиливающей гексамеризацию, в IgG2-S4497 на фагоцитарное поглощение был протестирован в присутствии сыворотки. Более того, способность WT IgG2-S4497 индуцировать фагоцитарное поглощение сравнили с IgGl-S4497, и в присутствии и при отсутствии сыворотки, и таким образом, комплемента. Результаты были проанализированы в GraphPad Prism, и значения ЕС50 были вычислены, как описано в примере 6.
Фигура 7 показывает, что при отсутствии сыворотки, WT IgGl-S4497 антитело было способно вызывать более сильное поглощение фагоцитами, чем WT IgG2-S4497 антитело (ЕС50 3,303±0,04 мкг/мл и 16±0,038 мкг/мл, соответственно). Примечательно, что добавление сыворотки, и таким образом, комплемента, оказывало сильный эффект на оба и WT IgGl-S4497 и WT IgG2-S4497 (ЕС50 0,130±0,039 мкг/мл и 0,331±0,061 мкг/мл, соответственно), что не поддерживает предположение, что IgG2 подкласс является неэффективным для активации комплемента.
IgG2-S4497-E430G вызывал усиленное фагоцитарное поглощение по сравнению с WT IgG2-S4497 (ЕС50 0,107±0,073 мкг/мл и 0,331±0,061 мкг/мл, соответственно), указывая на то, что введение мутации, усиливающей гексамеризацию, в анти-WTA IgG2 антитело стимулировало индуцирование фагоцитоза, опосредованного нейтрофилами, в присутствии комплемента. В присутствии сыворотки уровни фагоцитарного поглощения IgG2-S4497-E430G был сравнимы с WT IgGl-S4497 (ЕС50 0,107±0,073 мкг/мл и 0,130±0,039 мкг/мл, соответственно).
Пример 9. Введение мутации E430G, усиливающей гексамеризацию, в анти-СР5 моноклональное IgGl антитело приводит к повышенному отложению комплемента и фагоцитарному поглощению.
S. aureus поверхностные молекулы, такие как WTA, могут экранироваться от узнавания антителами путем экспрессии капсульного полисахарида (PS). Поэтому было получено моноклональное антитело против капсульного полисахарида типа 5 (СР5) в виде WT IgGl-CP5 и IgGl-CP5-E430G, как описано в примере 1, и протестировано в
отношении связывания и активации комплемента на S. aureus бактериях.
Связывание WT IgGl-CP5 с некоторыми СР5-инкапсулированными S. aureus штаммами было протестировано при помощи FACS-анализа связывания, как описано в примере 5. Связывание было протестировано на Reynolds СР5 (предоставленном Dr. Jeane Lee, Brigham и Женским госпиталем, Бостон), Reynolds CP" (предоставленном Dr. Jeane Lee, Brigham и Женским госпиталем, Бостон), COL (предоставленном проф. Andreas Peschel, University Tubingen) и Newman7" (предоставленном проф. Tim Foster, Trinity College, Dublin). IgGl-CP5 продемонстрировал сильное связывание с Reynolds СР5 штаммом, который, как известно, экспрессирует высокие уровни СР5 (фигура 8А). Reynolds СР5 использовали для дальнейших анализов. Сначала было показано, что введение E430G мутации в IgGl-CP5 не оказывает влияния на связывание IgGl-CP5 с Reynolds CP5 (фигура 8В).
Способность IgGl-CP5-E430G вызывать активацию комплемента на S. aureus была сравнена со способностью WT IgGl-CP5. Поскольку сыворотка здоровых индивидуумов не содержит высоких концентраций природных антител против капсульных полисахаридов, все эксперименты были проведены в присутствии NHS.
Сначала было проанализировано воздействие E430G мутации на способность IgGl-СР5 способствовать отложению С4Ь и СЗЬ на бактериях. Reynolds СР5 бактерии выращивали и собирали, как описано в примере 2. Для опсонизации 50 мкл промытых бактерий (5х107/мл) добавили к 50 мкл серийных концентраций антител (конечная концентрация 0,08-10 мкг/мл в 2-коатных разведениях) IgGl-CP5 или IgGl-CP5-E430G в 1% объединенной NHS и инкубировали в течение 20 минут при 37°С и встряхивании 600 об/мин. Бактерии промывали два раза PBSA, а отложенные C4d и СЗЬ окрашивали и анализировали с помощью FACS, как описано в примере 2. Инкубация с анти-СР5 mAb приводила к дозозависимому отложению С4Ь и СЗЬ как при IgGl-CP5, так и IgGl-CP5-E430G. Отложение и С4Ь (фигура 8С) и СЗЬ (фигура 8D) было усилено E430G вариантом IgGl-CP5-E430G по сравнению с WT IgGl-CP5 антителом.
Затем, был проанализирован эффект усиливающей гексамеризацию E430G мутации на способность IgGl-CP5 вызывать опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение. Reynolds СР5 бактерии метили GFP и инкубировали с WT IgGl-CP5 и IgGl-CP5-E430G в объединенной NHS сыворотке, как описано в примере 6. 20 мкл 3,75 х 107/мл GFP-меченых Reynolds СР5 бактерий были опсонизированы с помощью инкубации в течение 15 минут при 37°С и встряхивании 600 об/мин с 20 мкл серий концентраций антител IgGl-CP5 или IgGl-CP5-E430G (конечные концентрации 0,005 - 10 мкг/мл в 2-кратных разведениях) в NHS (3% конечная концентрация). Далее, 10 мкл 7,5 х 106/мл
нейтрофилов добавили к опсонизированным бактериям, и фагоцитарное поглощение проводили в течение 15 минут при 37°С и встряхивании 750 об/мин. Реакцию останавливали охлажденным параформальдегидом и флуоресценцию нейтрофилов анализировали с помощью проточной цитометрии, как описано в примере 3.
Инкубация с анти-СР5 mAb приводила к дозозависимому опосредованному нейтрофилами поглощению GFP-меченых бактерий, показывая, что добавление анти-СР5 антител может нейтрализовать антифагоцитарную активность капсулы (фигура 8Е). Примечательно, что повышенное фагоцитарное поглощение наблюдалось при применении IgGl-CP5-E430G по сравнению с WT IgGl-CP5. В другом эксперименте по фагоцитарному поглощению серия концентраций антител в сыворотке была предварительно проинкубирована в течение 10 минут при комнатной температуре с Fc-III пептидом или Fc-III скремблированным 1 пептидом (10 мкл серийных концентраций антител 0,02 - 40 мкг/мл в 2-кратных разведениях +10 мкл 12% сыворотки с 40 мкг/мл пептида). Fc-III пептид был способен сильно ингибировать фагоцитарное поглощение как WT, так
и E430G вариантом анти-СР5-антитела (фигура 8F).
Вместе взятые, эти данные показывают, что протестированное анти-СР5 антитело может вызывать зависимое от гексамеризации опосредованное комплементом фагоцитарное поглощение инкапсулированного штамма S. aureus Reynolds СР5, которое может быть усилено при помощи мутации, усиливающей гексамеризацию E430G.
Пример 10. Введение усиливающей гексамеризацию мутации E430G в анти-WTA антитело IgGl-S4497 приводит к повышенному фагоцитарному уничтожению S. aureus.
Способность IgGl-S4497-E430G вызывать фагоцитарное уничтожение Wood 46 S. aureus бактерий сравнили со способностью WT IgGl-S4497. Wood 46 бактерии выращивали в 3 мл Todd Hewitt Broth (ТНВ, Oxoid, кат. номер СМ0189) с дрожжевым экстрактом (Oxoid, кат. номер LP0021) в течение 18 часов при 37°С и встряхивании 600 об/мин, разводили 1/100 в свежем ТНВ и выращивали до OD660 -0.50. Бактерии два раза промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS, с феноловым красным; Lonza, кат. номер BE10-527F) и доводили до концентрации 1,7 х 108 бактерий/мл в HBSS + 0,1% HSA. 20 мкл 1,7 х 108/мл Wood 46 бактерий было опсонизировано путем инкубации в течение 5 минут при 37°С и встряхивании (700 об/мин) с 10 мкл серий концентраций антител IgGl-S4497 или IgGl-S4497-E430G (начиная с 3 или 1 мкг/мл в 3-или 2-кратных разведениях) плюс 10 мкл сыворотки, не содержащей IgG (1% конечная концентрация сыворотки). Истощение IgG из NHS проводили, как описано в примере 6. Нейтрофилы человека выделяли в стерильных условиях, как описано в примере 3, и
регулировали до концентрации 1 х 107 клеток/мл в HBSS + 0,1% HSA. 85 мкл 1 х 107/мл нейтрофилов добавили к 15 мкл опсонизированных бактерий в стерильных силиконизированных 2 мл пробирках (Sigma-Aldrich, кат. номер Т3531), и фагоцитоз проводили в течение 90 минут при 37°С в С02-инкубаторе на качающейся платформе (750 об/мин). Конечное отношение бактерий к нейтрофилам составляло 1:1 с 1% сывороткой. Реакцию останавливали при помощи 900 мкл 0,3% сапонина (Sigma-Aldrich, кат. номер 47036) в воде, перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 10 минут на льду. Были приготовлены соответствующие разбавления в PBS, и капли 25 мкл помещали на агаровые чашки Todd Hewitt в двух экземплярах и инкубировали в течение ночи при 37°С. Количество колониеобразующих единиц (CFU) подсчитывали и выражали относительно бактерий в образце без антител или нейтрофилов.
Инкубация с анти-WTA mAb приводила к дозозависимому опосредованному нейтрофилами уничтожению бактерий (фигура 9). Примечательно, введение мутации, усиливающей гексамеризацию, приводило к повышенной эффективности опосредованного нейтрофилами уничтожения, индуцированного IgGl-S4497-E430G по сравнению с IgGl-S4497. Значение ЕС50 составляло 0,037 ± 0,074 мкг/мл для IgGl-S4497 и 0,013 ± 0,071 мкг/мл для IgGl-S4497-E430G, соответственно.
Пример 11. Введение усиливающей гексамеризацию мутации E430G в анти-WTA антитело IgGl-S4497 приводит к повышенному фагоцитарному поглощению Staphylococcus warneri.
Бактерии штаммов S. warneri К64 и KV144 (оба являются клиническими изолятами из Отделения Медицинской Микробиологии университетского медицинского центра г.Утрехта (UMCU)) пометили FITC, как описано в примере 3. 20 мкл 3,75х107/мл FITC-меченых S. warneri К64 и KV144 бактерий были опсонизированы путем инкубации в течение 15 минут при 37°С и встряхивании (600 об/мин) с 10 мкл серий концентраций антител IgGl-S4497 или IgGl-S4497-E430G (0,002 - 5 мкг/мл в 2-кратных разведениях) плюс 10 мкл 4% NHS (1% окончательная концентрация сыворотки). Нейтрофилы человека были выделены, как описано в примере 3. 10 мкл 6,5х106/мл нейтрофилов добавили к опсонизированным бактериям, и проводили фагоцитоз в течение 15 минут при 37°С и встряхивании 750 об/мин. Реакцию останавливали холодным парафольмадегидом и флуоресценцию нейтрофилов анализировали с помощью проточной цитометрии, как описано в примере 3.
Инкубация с анти-WTA антителом IgGl-S4497 приводила к дозозависимому опосредованному нейтрофилами поглощению FITC-меченых S. warneri бактерий (фигура 10). Примечательно, введение усиливающей гексамеризацию мутации E430G приводило к
повышенной эффективности опосредованного нейтрофилами фагоцитарного поглощения, индуцированного IgGl-S4497-E430G по сравнению с IgGl-S4497. Значение ЕС50 на штамме S. warneri К64 было 0,126±0,096 мкг/мл для IgGl-S4497 и 0,016±0,395 мкг/мл для IgGl-S4497-E430G, соответственно.
Пример 12. Введение усиливающей гексамеризацию мутации E430G в анти-WTA антитела IgGl-6297 приводит к повышенному отложению комплемента.
Усиливающая гексамеризацию мутация E430G согласно EU-нумерации была введена в aHTH-WTA-антитело IgGl-6297. Способность IgGl-6297-E430G вызывать активацию комплемента на S. aureus сравнивали со способностью WT IgGl-6297. Была проанализирована способность IgGl антитела способствовать отложению Clq и С4Ь на бактериях. S. aureus COL бактерии были генетически модифицированы с целью экспрессии GFP, затем их выращивали и собирали, как описано в примере 6. Бактерии выращивали в течение ночи на чашках с овечьим кровяным агаром и собирали в PBS, как описано в примере 5. Для опсонизации 20 мкл промытых бактерий (5х107/мл) в буфере RPMI/HSA добавили к 20 мкл серийных концентраций антител IgGl-6297 или IgGl-6297-E430G в 1% объединенной сыворотке, лишенной IgG/IgM, и инкубировали в течение 30 минут при 37°С и встряхивании 750 об/мин. Бактерии два раза промывали RPMI/HSA, и отложенный С4Ь определяли с помощью 1 мкг/мл мышиного-античеловек C4d антитела (Quidel, кат. номер А213) и аллофикоцианин (АРС)-конъюгированных козьих антител против мышиных иммуноглобулинов (1:350 разведение; BD Pharmingen, №550826), в основном как описано в примере 2. Для обнаружения отложения Clq была проведена инкубация антител с FITC-конъюгированным кроличьим анти-Clq антителом (1:350 разбавление, Dako, кат. номер F0254) и АРС-конъюгированным козьим F(ab')2 антикролик-^0(Н+Ь) (1:350 разбавление, Jackson Immunoresearch, кат. номер 111-136144). Флуоресценцию измеряли с помощью проточной цитометрии.
Чтобы проанализировать фагоцитарное поглощение бактерий S. aureus IgGl-6297 и IgGl-6297-E430G, 20 мкл 3,75х107/мл GFP-экспрессирующих COL или FITC-меченых Wood 46 бактерий были опсонизированы путем инкубации в течение 15 минут при 37°С и встряхивании (750 об/мин) при помощи 10 мкл серий концентраций антител IgGl-S6297 или IgGl-S6297-E430G (0,002 - 5 мкг/мл в 2-кратных разведениях) плюс 10 мкл 4% NHS, лишенной IgG (1% окончательная концентрация сыворотки). Нейтрофилы человека были выделены, как описано в примере 3. 10 мкл 6.5х106/мл нейтрофилов добавили к опсонизированным бактериям, и проводили фагоцитоз в течение 15 минут при 37°С и встряхивании 750 об/мин. Реакцию останавливали холодным парафольмадегидом и флуоресценцию нейтрофилов анализировали с помощью проточной цитометрии, как
описано в примере 3.
Фигура 11 показывает, что инкубация с 6297 mAb приводила к дозозависимому отложению Clq и С4Ь как для IgGl-6297, так и IgGl-6297-E430G. Отложение и Clq (фигура ПА) и С4Ь (фигура 11В) было увеличено при применении E430G варианта IgGl-6297-E430G по сравнению с WT IgGl-6297 антителом. Кроме того, опосредованное нейтрофилами фагоцитарное поглощение IgGl-6297-E430G было увеличено по сравнению с WT IgGl-6297 на GFP-меченых COL (фигура ПС) и FITC-меченых Wood 46 (фигура 11D) клетках.
Перечень последовательностей
<110> Genmab B.V.
<120> Антитела и способы их использования при лечении инфекционной болезни
<130> P/0103-WO
<160> 41
<170> Патент в версии 3.5
<210> <211>
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 1
Gly Phe Ser Phe Asn Ser Phe Trp
<210> 2
<211> 8
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 2
Thr Asn Asn Glu Gly Thr Thr Thr 1 5
<210> 3
<211> 9
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 3
Ala Arg Gly Asp Gly Gly Leu Asp Asp 1 5
<210> 4
<211> 116
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400>
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Ile
35 40 45
Ser Phe Thr Asn Asn Glu Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Gly Gly Leu Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 5
<211> 12
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 5
Gln Ser Ile Phe Arg Thr Ser Arg Asn Lys Asn Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 6
Gln Gln Tyr Phe Ser Pro Pro Tyr Thr 1 5
<210> 7
<211> 113
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 7
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Phe Arg Thr
20 25 30
Ser Arg Asn Lys Asn Leu Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 8
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 8
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 1 5
<210> 9
<211> 7
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 9
Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr 1 5
<210> 10
<211> 12
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 10
Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Val Arg Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 118
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 11
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Tyr Asp Val Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 12
<211> 6
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 12
Gln Asn Val Arg Thr Ala
<210> 13
<211> 9
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 13
Leu Gln His Trp Asn Tyr Leu Tyr Thr 1 5
<210> 14
<211> 108
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Leu Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys 100 105
<210> 15
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 275 280
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
290 295
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 305 310
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> <211> <212> <213>
<220> <223> N/A
<400> 16
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 20
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 35 40
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 50 55
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 65 70
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 285
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 300
Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr 315 320
Gly Lys
330
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
10 15
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
25 30
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
75 80
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 17
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 275 280
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
290 295
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 305 310
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> <211> <212> <213>
<220> <223> N/A
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 20
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 35 40
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 50 55
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 65 70
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 285
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 300
Ser Ala Leu His Asn His Tyr Thr 315 320
Gly Lys
330
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
10 15
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
25 30
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
75 80
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Phe Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
290 295
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 305 310
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> N/A <400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 20
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 35 40
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 50 55
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 65 70
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 115 120
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 300
Thr Ala Leu His Asn His Tyr Thr 315 320
Gly Lys
330
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
10 15
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
25 30
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
75 80
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 105 110
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Gln Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 21
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 22
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Tyr Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 23
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Trp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 330
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 26
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Lys
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 27
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Ser Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 28
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Phe Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 29
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Thr Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 30 <211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Gln
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 31
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Arg
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 32
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Tyr
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 245
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
260
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 275 280
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 290 295
Ser Val Met His Glu Ala Leu His
305 310 Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> N/A <400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
35 40
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 50 55
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 65 70
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 85
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 100
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 250 255
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 265 270
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 285
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 300
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 315 320
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
10 15
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
25 30
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
75 80
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Trp Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 34
<211> 326
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Tyr Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 35
<211> 8
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 35
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp 1 5
<210> 36
<211> 8
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 36
Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr 1 5
<210> 37
<211> 19
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 37
Ala Thr Glu Arg Trp Ser Lys Asp Thr Gly His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 38
<211> 455
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Lys Asn Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Arg Trp Ser Lys Asp Thr Gly His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 39
<211> 7
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A
<400> 39
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 40
Gln Lys Tyr Gly Ser Thr Pro Arg Pro 1 5
<210> 41
<211> 215
<212> Белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> N/A <400> 41
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Gly Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, содержащее Fc-область иммуноглобулина IgG человека и
антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA или CP, в котором Fc-область
содержит мутацию аминокислоты в положении, соответствующем Е430, Е345 или S440 в
человеческом IgGl согласно EU-нумерации.
2. Антитело по п. 1, в котором мутацию выбирают из группы, состоящей из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W и S440Y.
3. Антитело по любому из пунктов 1-2, в котором мутацию выбирают из группы, состоящей из E430G и Е345К.
4. Антитело по любому из пунктов 1-3, которое дополнительно содержит мутацию, выбранную из группы К439Е и S440K.
5. Антитело по любому из пунктов 1-4, в котором WTA представляет собой WTA-альфа или WTA-бета.
6. Антитело по любому из пунктов 1 и 4, в котором CP представляет собой СР5.
7. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD или IgM изотипом.
8. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является IgGl или IgG2 изотипом.
9. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является моноклональным антителом.
10. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является антителом млекопитающего, человека или антителом копытного животного.
11. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является гуманизированным или химерным антителом.
12. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое усиливает фагоцитоз.
13. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое усиливает фагоцитоз в присутствии комплемента.
14. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое усиливает фагоцитоз, осуществляемый фагоцитирующими иммунными клетками, такими как нейтрофилы, моноциты, макрофаги, клетки Купфера или дендритные клетки.
15. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое усиливает фагоцитоз, опосредованных нейтрофилами.
16. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое усиливает активацию комплемента.
9.
17. Композиция, содержащая антитело по любому из предшествующих пунктов.
18. Композиция по п. 17, которая содержит, по меньшей мере, одно антитело по любому из предшествующих пунктов.
19. Композиция по п. 17, которая содержит два или более антител по любому из предшествующих пунктов, таких как поликлональные антитела.
20. Композиция по п. 17, которая содержит первое и второе антитело по любому из предшествующих пунктов.
21. Композиция по п. 20, в которой первое антитело дополнительно содержит К439Е мутацию, и второе антитело дополнительно содержит S440K мутацию.
22. Композиция по п. 20, в которой первое антитело дополнительно содержит S440K мутацию и второе антитело дополнительно содержит Е439Е мутацию.
23. Композиция по п. 20, которая содержит первое антитело, связывающееся с WTA альфа, и второе антитело, связывающееся с WTA бета, или наоборот.
24. Композиция по п. 20, которая содержит первое антитело, связывающееся с WTA, и второе антитело, связывающееся с CP, или наоборот.
25. Композиция по любому из пунктов 17 - 20, которая является фармацевтической композицией.
26. Композиция по любому из пунктов 17-20, которая содержит фармацевтический эксципиент.
27. Антитело по любому из пунктов 1-16 или композиция по любому из пунктов 17
- 26 для применения в качестве медикамента.
28. Антитело по любому из пунктов 1-16 или композиция по любому из пунктов 17
- 26 для применения при лечении инфекции, вызванной грамположительными бактериями.
29. Антитело по любому из пунктов 1-16 или композиция по любому из пунктов 17-27, отличающееся тем, что грамположительные бактерии выбирают из группы Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium Enterococcus и Listeria.
30. Антитело по любому из пунктов 1-16 или композиция по любому из пунктов 17-27 для применения при лечении инфекции, вызванной Staphylococcus aureus, MRSA или MSSA.
31. Антитело по любому из пунктов 1-26 или композиция по любому из пунктов 17-27 для применения при лечении инфекции, вызванной Staphylococcus warneri.
32. Антитело по любому из пунктов 1-26 или композиция по любому из пунктов 17-27 для применения при лечении инфекций в области хирургического вмешательства (SSI), раневых инфекций, кистозного фиброза, пневмонии, вентиляяторне
29.
ассоциированной пневмонии (vap), сепсиса, синдрома токсического шока, инфекций, вызванных внутривенным катетером, и инфекций, вызванных наличием протезных устройств.
33. Способ усиления эффекторной функции антитела, содержащего Fc-область и антигенсвязывающий участок, связывающийся с WTA или CP, который включает введение мутации в Fc-область, соответствующую положению Е430, Е345 или S440 в человеческом IgGl, EU-нумерация.
34. Способ по п. 33, в котором Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из E430G, Е345К, E430S, E430F, Е430Т, E345Q, E345R, E345Y, S440W или S440Y.
35. Способ по любому из пунктов 33 или 34, в котором Fc-фрагмент содержит мутацию, выбранную из E430G или Е345К.
36. Способ по любому из пунктов 33-35, в котором WTA представляет собой WTA-альфа или WTA-бета.
37. Способ по любому из пунктов 33-35, в котором CP представляет собой СР5.
38. Способ по любому из пунктов 33-37, в котором эффекторной функцией является активация комплемента.
39. Способ по любому из пунктов 33-37, в котором эффекторной функцией является фагоцитоз, индуцированный антителом.
40. Способ по любому из пунктов 33-37, в котором эффекторная функция является фагоцитозом, опосредованным нейтрофилами.
41. Способ увеличения Fc-Fc контакта между молекулами антител на клетке-мишени in vivo включающий;
i) предоставление антитела по любому из предшествующих пунктов 1-17 и
ii) приведение в контакт антитела с антигеном на клеточной поверхности грамположительных бактерий в условиях in vivo и
iii) в концентрации, предоставляющей возможность Fc-Fc взаимодействия.
42. Способ по п. 41, в котором грамположительная бактерия представляет собой Staphylococcus aureus или Staphylococci warneri.
43. Способ по любому из пунктов 41-42, в котором грамположительная бактерия является резистентной или нечувствительной к предыдущему лечению лекарственным средством.
44. Способ по любому из пунктов 41-43, в котором грамположительная бактерия представляет собой MRSA или MSSA.
42.
42.
42.
42.
42.
Фиг. 5
Фиг. 6
А В
Уничтожение Wood 46
Фиг. 9
S. aureus COL (C1q)
S. aureus COL (C4b)
С S. aureus COL
S. aureus Wood
Фиг. 11
0 -I- - - -
0.001 0.01 0.1 1 10 концентрация антитела (мкг/мл)
1/11
1/11
2/11
5/11
5/11
6/11
6/11
9/11
9/11
10/11
10/11
11/11
11/11
11/11
11/11
11/11
11/11
11/11
11/11