[RU]

Настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающему введение соединения формулы I

где R ₁ представляет собой -NHC(O)C _3-6 циклоалкил и R ₂ представляет собой водород; или R ₁ и R ₂ вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C _1-6 алкила; R ₃ и R ₄ независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, C _1-3 алкил, OC _1-3 алкил, NO ₂ , SC _1-3 алкил, C _1-3 галогеналкил, OC _1-3 галогеналкил и SC _1-3 галогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающему введение соединения формулы I

где R ₁ представляет собой -NHC(O)C _3-6 циклоалкил и R ₂ представляет собой водород; или R ₁ и R ₂ вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C _1-6 алкила; R ₃ и R ₄ независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, C _1-3 алкил, OC _1-3 алкил, NO ₂ , SC _1-3 алкил, C _1-3 галогеналкил, OC _1-3 галогеналкил и SC _1-3 галогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.

---

Евразийское (21) 201892640 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.06.02
(51) Int. Cl.
A61K31/44 (2006.01) A61K31/47 (2006.01) A61P25/16 (2006.01)
(54) ЛЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
(31) 201621019087; 201621019185
(32) 2016.06.02
(33) IN
(86) PCT/IN2017/050224
(87) WO 2017/208267 2017.12.07
(71) Заявитель:
САН ФАРМА АДВАНСЕД РЕСЁРЧ КОМПАНИ ЛИМИТЕД (IN)
(72) Изобретатель:
Дамле Нитин Кришнаджи, Мандхане Санджай Нандлалджи, Упадхя Манодж Атмарамджи, Мехетре Самеер Вишванатх, Чхидревар Гаджанан Уттамрао, Сенгупта Прабал, Чхиттури Тринадха Рао (IN)
(74) Представитель:
Носырева Е.Л. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения болезни Паркинсо-на у субъекта, включающему введение соединения формулы I
Формула I
где R1 представляет собой -№НС(О)С3-6циклоалкил и R2 представляет собой водород; или R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С1-6алкила; R3 и R4 независимо выбраны из I группы, включающей водород, галоген, С1-3алкил, | ОС1-3алкил, NO2, 8С1-3алкил, С1-3галогеналкил, ОС1-3галогеналкил и 8С1-3галогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.
P51451525EA
ЛЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Индии № IN 201621019087, поданной 02 июня 2016 г., и IN 201621019185, поданной 02 июня 2016 г., которые включены в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающему введение соединения формулы I,
где Ri представляет собой -ГЧНС(0)Сз_6циклоалкил, и R2 представляет собой водород;
или Ri и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С^бЭлкила;
R3 и Pv4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, С^залкил, ОСх.залкил, N02, SC^arncHn, Сх.згалогеналкил, ОСх.згалогеналкил и SC^ згалогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
с-АЫ представляет собой нерецепторную тирозиновую протеинкиназу, которая вовлечена в различные клеточные процессы, которые включают регуляцию клеточного выживания, роста и подвижности. Ингибиторы с-АЫ-киназы, такие как иматиниб (Gleevec(r)), нилотиниб (Tasigna(r)), дазатиниб (Sprycel(r)) и понатиниб (Iclusig(r)), были разработаны и поступили в продажу для клинического применения в лечении хронического миелоидного лейкоза.
Недавние исследования продемонстрировали, что с-АЫ выполняет важную роль в индуцированной оксидативным стрессом гибели нервных клеток (Wu et al., Cell Death Differ., 2016; 23:542-552). Сообщалось, что с-АЫ участвует в развитии болезни Паркинсона (Gonflom et al., Int. J. Cell Biol., 2012; 2012:1-7). Также известно, что с-АЫ активируется дофаминергическим стрессом и дофаминергическими нейротоксинами, так например 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР, который под воздействием ферментов in vivo превращается в его активную форму МРР+) вызывает фосфорилирование тирозина в паркине, что влечет за собой потерю паркином его активности как ЕЗ-лигазы. Это приводит к накоплению разных субстратов паркина и в конечном итоге к гибели дофаминергических нейронов (Ко et al., PNAS, 2010; 107:16691-16696).
Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся накоплением белка во внутриклеточных включениях, называемых тельцами Леви и невритами Леви, и последующей утратой дофаминергических нейронов. Редкие семейные мутации дали представление об этом хроническом, прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, например, мутации в а-синуклеине и LRRK2 вызывают развитие аутосомно-доминанта ой формы PD, а мутации в DJ-1, PINK1 и паркине приводят к развитию аутосомно-рецессивной формы PD. Паркин представляет собой ЕЗ
убиквитин-лигазу, и предполагается, что семейные мутации нарушают активность паркина как ЕЗ-лигазы (Ко et al, PNAS, 2010; 107:16691-16696).
Показано, что с-АЫ контролирует разрушение двух белков, вовлеченных в патогенез PD, а именно паркина и а-синуклеина (Mahul-Mellier et al., Hum. Mol. Genet., 2014; 23:2858-2879). с-АЫ фосфорилирует паркин по тирозину 143. Такое фосфорилирование ингибирует активность паркина как ЕЗ-убиквитин-лигазы, что приводит к накоплению AIMP2 и FBP1 (субстраты паркина) и утрате паркином его цитопротекторной функции, вызывающих гибель клеток (Ко et al., PNAS, 2010; 107:16691-16696; Imam et al., J. Neurosci., 2011; 31:157-163). В дополнение к этому с-АЫ контролирует клиренс а-синуклеина, синаптического белка, который в значительной мере вовлечен в патогенез PD. Описана двунаправленная взаимосвязь между а-синуклеином и с-АЫ in vivo, где повышение экспрессии а-синуклеина способствует фосфорилированию и последующей активации с-АЫ. И наоборот, повышение экспрессии и активация с-АЫ приводит к накоплению и агрегации а-синуклеина, согласно чему можно предположить, что ингибирование с-АЫ может представлять собой жизнеспособную стратегию защиты дофаминергических нейронов от токсического воздействия накопленного а-синуклеина при PD (Hebron et al., Hum. Mol. Genet, 2013; 22:3315-3328; Hebron et al, Autophagy, 2013; 9:1249-1250).
Известно, что такие ингибиторы с-АЫ, как нилотиниб, проникают через гематоэнцефалический барьер и защищают дофаминергические нейроны в мышиной модели PD, индуцированного 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (в данном документе называемым МРТР) (Karuppagounder et al., Sci. Rep. 2014; 4:4874). Показано, что нилотиниб усиливает клиренс а-синуклеина по пути аутофагии и защищает от индуцированной накоплением а-синуклеина потери дофаминергических нейронов в данной мышиной модели PD (Hebron et al, Hum. Mol. Genet, 2013; 22:3315-3328; Imam et al, J. Neurosci., 2011; 31:157-163). Кроме того, в US20150087653 раскрыт способ лечения
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
нейродегенеративных заболеваний, включающий введение ингибиторов тирозинкиназ, таких как нилотиниб. Однако нилотиниб характеризуется несколькими существенными неблагоприятными эффектами, связанными с лекарственным средством. USFDA выпустило особое предупреждение в отношении капсул Tasigna(r), поскольку их применение для лечения связано с потенциально тяжелыми побочными эффектами со стороны сердца (удлинение интервала QT) и случаями скоропостижной смерти пациентов. Известно, что дазатиниб вызывает плевральный выпот и кровотечение. Понатиниб также связан с тяжелыми неблагоприятными эффектами, которые включают тромбоэмболию и закупорку сосудов. Иматиниб не является сильным ингибитором Abl-киназы. Более того, как для иматиниба, так и для дазатиниба, являющихся субстратом Р-гликопротеина (p-gp), показана низкая концентрация в мозге. Таким образом, существует потребность в сильном ингибиторе Abl-киназы, который может проникать через гематоэнцефалический барьер и не вызывает побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
где Ri представляет собой -ГЧНС(0)Сз_6циклоалкил, и R2 представляет собой водород;
Настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I,
или Ri и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С^бЭлкила;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, С^залкил, ОСьзалкил, N02, SCi-залкил, С^згалогеналкил, ОС^згалогеналкил и SCi_ згалогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1. Микрофотоснимки коронарных срезов, на которых показаны нейроны, положительные по тирозингидроксилазе (ТН), демонстрирующие предупреждение нейродегенерации с помощью соединения формулы La.
Фиг. 2. Процентное значение площади ТН-положительных нейронов при введении соединения формулы La.
Фиг. 3. Интегральная плотность ТН-иммунореактивности при введении соединения формулы La.
Фиг. 4. Микрофотоснимки коронарных срезов, на которых показаны нейроны, положительные по тирозингидроксилазе (ТН), демонстрирующие предупреждение нейродегенерации с помощью соединения формулы Lb.
Фиг. 5. Процентное значение площади ТН-положительных нейронов при введении соединения формулы Lb.
Фиг. 6. Интегральная плотность ТН-иммунореактивности при введении соединения формулы Lb.
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I,
где Ri представляет собой -]ЧНС(0)Сз_6циклоалкил, и R2 представляет собой водород;
или Rj и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С^бЭлкила;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, С^залкил, ОСьзалкил, N02, SCi-залкил, С^згалогеналкил, ОС^згалогеналкил и SCi_ згалогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий выбор субъекта, страдающего болезнью Паркинсона или подверженного риску развития болезни Паркинсона, и введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I.
Выражение "терапевтически эффективное количество соединения формулы I", применяемое в данном документе, относится к количеству соединения формулы I, которое вызывает терапевтический эффект, для достижения которого его вводят.
Термин "алкил" относится к радикалу с насыщенной углеводородной цепью, который в остове содержит только атомы углерода и водорода, либо к линейному, либо разветвленному, и который присоединен к остальной части молекулы посредством одинарной связи, например, к метилу, этилу, н-пропилу, 1 -метилэтилу (изопропилу), н-бутилу и н-пентилу.
Цифры в таком выражении, как "С^балкил", означают, что в алкильной цепи присутствует от 1 до 6 атомов углерода.
Термин "Сз-бЦиклоалкил" относится к неароматической моноциклической кольцевой системе с 3-6 атомами углерода. Моноциклические кольца включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
Термин "галогеналкил" относится к алкильной цепи, замещенной одним или более радикалами, представляющими собой галоген, выбранными из хлорида, бромида, йодида и фторида.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где Ri в соединении формулы I представляет собой -ГЧНС(0)циклопропил, и R2 представляет собой водород.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где Ri и R2 в соединении формулы I вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, где кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С1.6алкила. Предпочтительно ароматическое кольцо замещено водородом, т. е. является незамещенным.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где Ri и R2 в соединении формулы I вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, где кольцо замещено водородом, т. е. является незамещенным, и R3 представляет собой хлор, a R4 представляет собой метил и присутствуют в качестве заместителей в положении 2 и 6 в кольце.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где R3 и R4 в соединении формулы I выбраны из галогена и Сьбалкила. В предпочтительном варианте осуществления R3 и R4 представляют собой галоген и метил и присутствуют в качестве заместителей в положении 2 и 6 в кольце.
Химические названия некоторых предпочтительных соединений формулы I представлены ниже в таблице 1.
циклобутанкарбоновой кислоты
I.e
Лг'-(2-Хлор-6-метилбензоил)-4-метил-3-[2-(6-хлор-3-хинолил)этинил]-бензогидразид
Лг'-(2-Хлор-6-метилбензоил)-4-метил-3-[2-(6-метил-3-хинолил)этинил]-бензогидразид
Лг'-(2-Хлор-6-метилбензоил)-4-метил-3-[2-(6-фтор-3-хинолил)этинил]-бензогидразид
Подходящими фармацевтически приемлемыми солями соединения согласно настоящему изобретению могут быть соли неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, ортофосфорная кислота и т. п., или органических кислот, таких как, например, уксусная кислота, бензолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, или аминокислот, таких как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота и т. п. Один или более атомов водорода соединения формулы I могут быть дейтерированными, т. е. замещенными атомом дейтерия.
В публикации WIPO WO2012098416 ('публикация 416') раскрыта группа Маркуша из соединений, активных в качестве ингибиторов с-АЫ-киназы, и их полезность при лечении таких видов рака, как хронический миелоидный лейкоз (CML). Соединения формулы I по настоящему изобретению можно получить способами, описанными в WO2012098416 и WO2016185490, которые включены в данный документ посредством ссылки.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения формулы I по настоящему изобретению являются сильными ингибиторами Abl-киназы и
успешно проникают через гематоэнцефалический барьер, в результате чего эффективно достигается высокое соотношение концентраций соединения формулы I в мозге и в плазме и высокий терапевтический индекс.
В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение формулы I в терапевтически эффективной дозе не вызывает побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы при его тестировании в отношении влияния in vitro на канал hERG и его влияния in vivo на параметры ECG, такие как интервал QT, интервал QTC, интервал QTcf, и частоту сердечных сокращений у собак породы бигль в состоянии бодрствования и морских свинок. Обнаружено, что соединение формулы I является безопасным, поскольку оно не оказывает никакого ненадлежащего влияния на параметры ECG и частоту сердечных сокращений, как описано в данном документе в примерах.
Соединение формулы I можно вводить перорально в виде подходящей лекарственной формы. Подходящая лекарственная форма может включать таблетку, пеллеты, капсулу, саше, пеллеты в саше, пеллеты в капсуле, порошок, гранулы и т. п. Соединение формулы I может быть составлено в лекарственную форму для перорального применения, которая может содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, обычно хорошо известные специалисту в данной области. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно применять для получения подходящей лекарственной формы, раскрыты в "Remington's Pharmaceutical Sciences)), шестнадцатое издание, Е. W. Martin (Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания, 1980 г.).
Следующие примеры служат для иллюстрирования настоящего изобретения без ограничения настоящего изобретения по его объему.
ПРИМЕР 1
Ингибирование Abl-киназы
В конечной реакционной смеси объемом 25 ил АЫ (человека) (5-10 мЕд) инкубировали с использованием 8 мМ MOPS с рН 7,0, 0,2 мМ EDTA, 50 цМ EAIYAAPFAKKK, ЮмМ Mg(OAc)2 и [у-33Р-АТР] [удельная активность приблизительно 500 число импульсов в минуту/пмоль, концентрация в соответствии с требованиями). Реакцию инициировали посредством добавления смеси MgATP. После инкубирования в течение 40 минут при комнатной температуре реакцию останавливали посредством добавления 5 мкл 3 % раствора ортофосфорной кислоты. Затем 10 мкл реакционной смеси помещали в Р30 Filtermat и промывали три раза в течение 5 минут в 75 мМ ортофосфорной кислоте и один раз в метаноле перед высушиванием и подсчетом импульсов.
Результаты для представленных соединений формулы I приведены в таблице 2.
ПРИМЕР 2
Фармакокинетические исследования в мозге и плазме
Чтобы определить, проникает ли соединение формулы La через гематоэнцефалический барьер, мышам линии C57BL6 перорально вводили 30 мг/кг соединения формулы La, 100 мг/кг нилотиниба или 30 мг/кг дазатиниба. В
моменты времени 1, 4 и 8 часов после обработки мышей анестезировали изофлураном и проводили забор 0,4 мл крови из ретроорбитального сплетения в пробирки фирмы "Эппендорф", содержащие 8 мкл гепарина натрия в качестве противосвертывающего средства (100МЕ/мл), и переносили в контейнеры со льдом. Образцы крови немедленно центрифугировали в течение 7 мин. при 8500 об./мин., 4°С. Плазму отделяли в предварительно маркированные пробирки
фирмы "Эппендорф" и хранили при -70 С до следующего анализа. Непосредственно после этого мышей умерщвляли, мозг целиком извлекали и ополаскивали с помощью охлажденного льдом фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) для удаления периферической крови и высушивали путем промокания. Образцы ткани мозга взвешивали и гомогенизировали в объеме PBS в соотношении 1:2 с применением гомогенизатора для тканей и хранили в маркированных флаконах при -70°С до следующего анализа. Концентрации соединения формулы La в мозге и плазме определяли с применением методики LC-MS.
Было обнаружено, что соотношение концентрации в мозге и концентрации в плазме было значительно выше для соединения формулы La, по сравнению с таковым для нилотиниба или дазатиниба (см. таблицу 3).
ПРИМЕР 3
Эффективность соединения формулы La в животной модели болезни Паркинсона
Мышам линии C57BL/6 (возрастом 6-8 недель, с массой тела 25-30 г) перорально, с применением носителя вводили соединения формулы La (10 или 30 мг/кг, один раз в сутки) в течение 7 дней. На 7-ой день эти животные получали четыре внутрибрюшинные инъекции нейротоксина, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР-НС1; 17 мг/кг в пересчете на свободное основание;
Sigma), в солевом растворе с интервалами по 2 часа. Ежедневное введение дозы соединения продолжали в течение 7 дополнительных дней после последней инъекции МРТР. Вкратце, соединение вводили 6 дней до введения МРТР, в день введения МРТР и 7 дней после введения МРТР. Всех животных умерщвляли через 7 дней после введения МРТР и ткани мозга обрабатывали для иммуногистохимической оценки. Для иммуногистохимического обнаружения тирозингидроксилазы (ТН) применяли стандартный авидин-биотиновый метод (Benno et al., Brain Res., 1982; 246:225-236). На начальном этапе с применением криостата делали срезы мозга на уровне компактной части черного вещества (SNPc) и помещали на предметные стекла. Предметные стекла со срезами мозга промывали 3x5 минут в 0,1 М PBS. Срезы сначала инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с нормальной блокирующей сывороткой в 0,1 М PBS с 0,3% Triton Х-100 и в течение еще 2 часов с кроличьими поликлональными антителами к мышиной тирозингидроксилазе (Invitrogen), разбавленными в соотношении 1:1000 в 0,1 М PBS с нормальной блокирующей сывороткой. Предметные стекла со срезами дополнительно промывали 3x5 минут в 0,1 М PBS и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с биотинилированными антителами к иммуноглобулину кролика (набор ABC фирмы Vectastain(r)). Срезы ополаскивали 3x5 минут в 0,1 М PBS и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с растворами А и В (набор ABC фирмы Vectastain(r)), разбавленными в соотношении 1:50 в 0,1 М PBS. Через 1 час срезы промывали 3x5 минут в 0,1 М PBS и инкубировали в растворе 3,3'-диаминобензидин (DAB)/H202 (Sigma) в течение приблизительно 5-8 минут (за ходом процесса наблюдали под микроскопом на предмет оптимального соотношения сигнал/шум). Срезы сначала промывали 2x5 минут в 0,1 М PBS и затем 3x5 минут в воде качества Milli-Q. Предметные стекла накрывали покровными стеклами с добавлением глицерин-желатинового раствора и выдерживали при комнатной температуре в течение ночи для высушивания, после чего получали изображения окрашенных срезов мозга с применением
присоединенной к микроскопу камеры и анализировали с применением программного обеспечения NIH ImageJ(r) (NIH, Бетесда, Мэриленд). Для осуществления анализа изображения преобразовывали до 8-битового разрешения и оптимальных яркости/контраста. На отдельных изображениях удаляли фоновые и ложные сигналы и проводили измерение площади, покрытой клеточными телами и волокнами. Рассчитывали процент данной области относительно общей площади изображения и интегральную плотность. Для определения наличия какой-либо межгрупповой или внутригрупповой изменчивости и статистической значимости полученные результаты сравнивали с применением GraphPad Prism(r) 6.0. Пероральное введение соединения формулы La в значительной степени препятствовало индуцированной МРТР нейродегенерации, как видно из микрофотоснимков коронарных срезов, на которых видны ТН-положительные нейроны (фиг. 1), определения процента площади ТН-положительных нейронов (фиг. 2) и интегральной плотности ТН-иммунореактивности (фиг. 3).
ПРИМЕР 4
Эффективность соединения формулы Lb в животной модели болезни Паркинсона
Эффективность соединения формулы Lb в отношении лечения болезни Паркинсона тестировали тем же способом, который описан для соединения формулы La в примере 3 выше.
Для определения наличия какой-либо межгрупповой или внутригрупповой изменчивости и статистической значимости полученные результаты сравнивали с применением GraphPad Prism(r) 6.0. Пероральное введение соединения формулы Lb в значительной степени препятствовало индуцированной МРТР нейродегенерации, как видно из микрофотоснимков коронарных срезов, на которых видны ТН-положительные нейроны (фиг. 4), определения процента площади ТН
положительных нейронов (фиг. 5) и интегральной плотности ТН-
иммунореактивности (фиг. 6).
ПРИМЕР 5
Электрофизиологические процедуры - влияние на К+-канал hERG
Соединение формулы La и Lb тестировали на безопасность для сердечнососудистой системы в ходе теста in vitro для определения ингибирования К+-канала hERG. В тестируемой концентрации соединения формулы La и Lb не демонстрировали какой-либо значимой величины ингибирования тока hERG.
Исследовали влияние in vitro соединений формулы La и Lb на ионные токи в эмбриональных клетках почки человека (НЕК293), стабильно экспрессирующих ген ether-a-go-go человека (hERG), к которым были подсоединены электроды для фиксации потенциала. Тестировали две концентрации соединений формулы La и Lb (1 и 10 мкМ) при температуре, близкой к физиологической.
Клетки переносили в камеру регистрации сигналов и заливали контрольным раствором, представляющим собой среду-носитель (HEPES-забуференный физиологический солевой раствор + 1% диметилсульфоксида + 1% альбумина бычьей сыворотки). Раствор для заполнения микропипетки для записи результатов локальной фиксации потенциала целой клетки состоял из: аспартата калия, 130 мМ; MgCl2, 5 мМ; EGTA, 5 мМ; АТР, 4 мМ; HEPES, 10 мМ; рН регулировали до значения 7,2 с помощью Юн. КОН. Раствор для заполнения микропипетки получали отдельными сериями, делили на аликвоты, хранили в замороженном состоянии и каждый день размораживали свежую аликвоту. Запись результатов проводили при температуре от 33 до 35°С с применением комбинации напрямую подключенных встроенного устройства для предварительного нагрева раствора, нагревательного устройства камеры и регулятора температуры с обратной связью. Температуру измеряли в камере регистрации сигналов с применением датчика
терморезистора. Микропипетки для записи результатов фиксации потенциала изготовляли из стеклянных капиллярных трубок с применением устройства для вытягивания микропипеток Р-97 (Sutter Instruments, Новато, Калифорния). Для записи результатов измерений с целых клеток применяли серийный усилитель для локальной фиксации потенциала. Перед оцифровкой записи результатов измерения тока обрабатывали с помощью фильтра низких частот на уровне одной пятой от выборочной частоты.
Клетки, стабильно экспрессирующие hERG, поддерживали при -80 мВ. Начальный ток и ток при ингибировании калиевого тока через канал hERG в состоянии покоя, обусловленный тестируемыми соединениями (формула La и Lb), измеряли с применением последовательности импульсов с фиксированными амплитудами (подготовительный импульс для приведения в заданное состояние +20 мВ в течение 1 с; реполяризующее тестовое изменение до -80 мВ (-0,5 В/с), повторяющееся с интервалами 5 с). Для оценки вклада эндогенных токов каждую запись результатов измерения заканчивали финальным внесением сверхмаксимальной концентрации вещества сравнения (Е-4031, 500 нМ). Чтобы определить эффективность тестируемых соединений в отношении ингибирования канала hERG из полученных данных вычитали остающийся неингибированным ток в цифровом формате в автономном режиме.
Соединение формулы La ингибировало ток через канал hERG на (среднее значение ± SEM) 2,1 ± 0,4% при 1 мкМ (п = 3) и на 9,7 ± 0,4% при 10 мкМ (п = 3) по сравнению с 1,0 ±0,6% (п = 3) в случае контроля, представляющего собой среду-носитель (см. таблицу 4). Концентрации соединения формулы La выше 10 мкМ не тестировали в связи с пределом растворимости соединения в контроле, представляющем собой среду-носитель. При подобных условиях положительный контроль (терфенадин, 60 нМ) ингибировал калиевый ток через канал hERG на (среднее значение ± SD; п = 2) 82,8 ± 1,2%, подтверждая наличие слабого эффекта соединения формулы La при его очень высокой концентрации в отношении К+
канала hERG. Для сравнения, нилотиниб демонстрирует приблизительно 90% ингибирование при концентрации 1 мкМ (таблица 5).
ПРИМЕР 6
Влияние соединения формулы La на интервалы QT, QTC и частоту сердечных сокращений у собак породы бигль в состоянии бодрствования
Соединение формулы La подвергали тестированию in vivo для определения его влияния на интервалы QT, QTct, и QTCf и частоту сердечных сокращений у собак породы бигль в состоянии бодрствования.
Соединение формулы La вводили пероральным путем (р.о.) на трех уровнях дозирования, 5, 15 и 30 мг/кг, самцам и самкам собак породы бигль, регистрацию состояния которых проводили дистанционно в состоянии бодрствования. Рвота возникла у двух животных (1 самец и 1 самка), которых обрабатывали с применением соединения формулы La дозовой группы 30 мг/кг, через 14 мин. после введения дозы. Следовательно, группу, которую обрабатывали с применением дозы 30 мг/кг, при анализе данных не рассматривали. При применении доз 5 и 15 мг/кг рвота не наблюдалась.
Измерения параметров ECG (интервал QT, интервал QTcb, интервал QTcf) и частоты сердечных сокращений проводили и записывали в течение 2 часов до введения лекарственного средства (исходный уровень) и непрерывно в течение не более 24 часов после введения. Каждое животное получало как среду-носитель (плацебо), так и три разные дозы соединения формулы La в разные дни по схеме латинского квадрата с периодом отмывки минимум 96 ч. Чтобы получить фармакокинетические (РК) параметры в отдельный день проводили одно дополнительное пероральное введение дозы соединения формулы La для оценки концентраций соединения формулы La в плазме в разные моменты времени.
Данные по параметрам ECG (интервал QT, интервал QTcb, интервал QTcf) и частоте сердечных сокращений статистически сравнивали следующим образом. Данные группы плацебо в моменты времени 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа
сравнивали с исходными данными той же группы. Данные разных групп, лечение которых осуществляли с применением соединения формулы La, сравнивали с соответствующими данными группы плацебо.
Анализ ECG на основе объединенных данных самцов и самок собак указал на то, что по сравнению с исходным уровнем лечение с применением плацебо не оказывало статистически значимого влияния ни на один из параметров ECG (интервал QT, интервал QTcb, интервал QTcf), ни на частоту сердечных сокращений. Соединение формулы La в дозах 5 и 15 мг/кг не оказывало влияния на интервалы времени QT, QTcb, QTcf по сравнению с плацебо. Кроме того, другой параметр, такой как частота сердечных сокращений, оставался неизменным.
В РК-анализе продемонстрировано дозозависимое системное воздействие соединения формулы La на животных, которым вводили разные дозы соединения формулы La. Значение AUC0-mf находилось в диапазоне от 1925 до 4824, от 6776 до 12756 и от 25927 до 46749 ч.хнг/мл при применении соединения формулы La в дозах 5, 15 и 30 мг/кг соответственно. Значение Спщ находилось в диапазоне от 1218 до 2033, от 2723 до 5323 и от 9825 до 9967 нг/мл при применении соединения формулы La в дозах 5, 15 и 30 мг/кг соответственно.
Результаты данного исследования указывают на то, что однократное пероральное введение соединения формулы La в дозе не более 15 мг/кг не оказывает влияния на функции сердечно-сосудистой системы у собак породы бигль в состоянии бодрствования. Изменения в морфологии ECG отсутствовали при любом уровне дозы соединения формулы La. Отличия между полами в отношении влияния лечения на параметры ECG и частоту сердечных сокращений отсутствовали.
ПРИМЕР 7
Влияние соединения формулы Lb на интервалы QT, QTc и частоту сердечных сокращений у морской свинки под наркозом
Влияние соединения формулы Lb на интервалы QT, QTc и частоту сердечных сокращений изучали на морских свинках под наркозом.
Самцов морской свинки линии Данкин-Хартли с массой тела в диапазоне 300-400 г анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции уретана (1,5 г/кг). Осуществляли трахеотомию и животному позволяли дышать спонтанно на протяжении всего эксперимента. Левую яремную вену катетеризировали с применением полиэтиленового катетера, заполненного гепаринизированным солевым раствором (100МЕ/мл), для введения лекарственного средства. Электроды помещали в положение отведения II и записывали исходную ECG.
Для разных животных дозы соединения формулы Lb отвешивали в зависимости от массы тела и готовили в 0,5 мл DMSO, а затем вводили путем медленной внутривенной инфузии в течение 10 мин. ECG записывали в ходе инфузии, длящейся не более 0,5 ч., и после ее завершения. Интервалы QT и RR измеряли с применением программного обеспечения PowerLab 4SP(r). Данные анализировали на 1, 5 и 10 мин. в ходе инфузии и через 5, 10, 15 и 30 мин. после инфузии, рассчитывая среднее по 9 систолам.
При внутривенном введении соединения формулы Lb в дозе 1 мг/кг изменение интервалов QT отсутствовало.
Формула изобретения
Первоначально поданная формула изобретения
1. Способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I,
где Ri представляет собой -]ЧНС(0)Сз_6циклоалкил, и R2 представляет собой водород;
или Ri и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С^бЭлкила;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, С^залкил, ОСьзалкил, N02, SCi-залкил, С^згалогеналкил, ОС^згалогеналкил и SCi_ згалогеналкил.
2. Способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий выбор субъекта, страдающего болезнью Паркинсона или подверженного риску развития болезни Паркинсона, и введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I,
где Ri представляет собой -КНС(0)Сз_6циклоалкил, и R2 представляет собой водород;
или Ri и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С^бЭлкила;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, С^залкил, ОСьзалкил, N02, SCi-залкил, С^згалогеналкил, ОС^згалогеналкил и SCi_ згалогеналкил.
3. Способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона по п. 1 и п. 2, где R3 и
R4 в соединении формулы I выбраны из галогена и С^залкила.
4. Способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона по любому из предыдущих пунктов, где Ri в соединении формулы I представляет собой -]ЧНС(0)циклопропил, и R2 представляет собой водород.
5. Способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона по любому из предыдущих пунктов, где Ri и R2 в соединении формулы I вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и С^атсила.
Фиг. 1. Микрофотоснимки коронарных срезов, на которых показаны нейроны, положительные по тирозингидроксилазе (ТН)
+МРТР (17 мг/кг, i.p., q.i.d.) Фиг. 2
+МРТР (17 мг/кг, i.p., q.i.d.) Фиг. 3
Фиг. 4. Микрофотоснимки коронарных срезов, на которых показаны нейроны, положительные по тирозингидроксилазе (ТН)
Интактные
Плацебо + МРТР
<*^V ^ ^ * . ill
Соединение формулы Lb + МРТР
Фиг. 4
Фиг. 5. Процентное значение площади ТН-положительных нейронов при введении соединения формулы Lb.
^ СП Интактные 1Щ| Соединение формулы Lb (10 мг/кг, р.о., b.i.d.) 1Ш Плацебо
п ее
5. i
5 Чч Чч Чч '¦¦чЧ ч\ Чч ¦"
& ччу <-¦ w" чч w vw.c wv "у .ч\-> чч v-Л
¦§> Ч\ Ч •¦ Чл
is t
Интактные
Плацебо Соединение формулы I. b
+MPTP (17 мг/кг, i.p., q.i.d.)
Фиг. 5
Интактные Плацебо Соединение формулы I. b
+МРТР (17 мг/кг, i.p., q.i.d.) Фиг. 6
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
(19)
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
(19)
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
(19)
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267 PCT/IN2017/050224
WO 2017/208267
1/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
1/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
2/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
2/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
4/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
4/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
5/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
6/6
PCrTYIN2017/050224
WO 2017/208267
6/6
PCrTYIN2017/050224