|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] В заявке описан иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) с тремя аминокислотными мутациями, соответствующими аминокислотным заменам F42A, Y45A и L72G в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO:1), где указанные мутации аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Кроме того, в заявке описаны выделенный полинуклеотид, кодирующий, указанный иммуноконъюгат, эксперессионный вектор и клетки-хозяева, содержащие этот выделенный полинуклеотид. В ней также раскрыты способ получения иммуноконъюгата, содержащие его фармацевтические композиции, способы лечения рака и стимуляции иммунной системы, в которых применяются эти композиции.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
В заявке описан иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) с тремя аминокислотными мутациями, соответствующими аминокислотным заменам F42A, Y45A и L72G в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO:1), где указанные мутации аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Кроме того, в заявке описаны выделенный полинуклеотид, кодирующий, указанный иммуноконъюгат, эксперессионный вектор и клетки-хозяева, содержащие этот выделенный полинуклеотид. В ней также раскрыты способ получения иммуноконъюгата, содержащие его фармацевтические композиции, способы лечения рака и стимуляции иммунной системы, в которых применяются эти композиции.
Евразийское (21) 201892619 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2012.02.07
(51) Int. Cl.
C07K14/55 (2006.01) C12N15/26 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01)
(54) ИММУНОКОНЪЮГАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ МУТАНТНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2
(31) 11153964.9; 11164237.7
(32) 2011.02.10; 2011.04.29
(33) EP
(62) 201300896; 2012.02.07
(71) Заявитель:
РОШЕ ГЛИКАРТ АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Аст Оливер, Брюнкер Петер, Фраймозер-Грундшобер Анне, Хертер Зильвия, Хофер Томас У., Хоссе Ральф, Клайн Кристиан, Мёсснер Эккехард, Николини Валерия Г., Умана Пабло (CH)
(74) Представитель:
Веселицкий М.Б., Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В., Соколов Р.А., Кузнецова Т.В. (RU)
(57) В заявке описан иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) с тремя аминокислотными мутациями, соответствующими аминокислотным заменам F42A, Y45A и L72G в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO:1), где указанные мутации аннулируют или снижают аффинность мутантно-го полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Кроме того, в заявке описаны выделенный полинуклеотид, кодирующий, указанный иммуноконъюгат, эксперессионный вектор и клетки-хозяева, содержащие этот выделенный по-линуклеотид. В ней также раскрыты способ получения иммуноконъюгата, содержащие его фармацевтические композиции, способы лечения рака и стимуляции иммунной системы, в которых применяются эти композиции.
129776
Заявка №
Заявитель Роше Гликарт АГ, СН
ИММУНОКОНЪЮГАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ МУТАНТНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ
ИНТЕРЛЕЙКИНА-2
Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится в целом к мутантным полипептидам интерлейкина-2. Более конкретно изобретение относится к мутантным полипептидам IL-2, которые обладают улучшенными свойствами при применении в качестве иммунотерапевтических агентов. Кроме того, изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим указанные мутантные полипептиды IL-2, к полинуклеотидным молекулам, кодирующим мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, и векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанные полипептидные молекулы. Изобретение относится также к способам получения мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению. Предпосылки создания изобретения
Интерлейкин-2 (IL-2), который называют также фактором роста Т-клеток (TCGF), представляет собой глобулярный гликопротеин с молекулярной массой 15,5 кДа, который играет основную роль в образовании, выживании и гомеостазе лимфоцитов. Он включает 133 аминокислоты и состоит из четырех 5 антипараллельных амфипатических а-спиралей, которые формируют
четвертичную структуру, необходимую для его функционирования (Smith, Science 240, 1988, сс. 1169-1176; Bazan, Science 257, 1992, сс. 410-413). Последовательности IL-2 из различных видов находятся в базе данных RefSeq NCBI под №№ NP000577 (человеческая), NP032392 (мышиная), NP446288
10 (крысиная) или NP517425 (шимпанзе).
IL-2 осуществляет свое действие посредством связывания с рецепторами IL-2 (IL-2R), которые содержат вплоть до трех индивидуальных субъединиц, различная ассоциация которых может приводить к образованию форм рецепторов, которые отличаются по их аффинности к IL-2. Ассоциация
15 субъединиц a (CD25), Р (CD122) и у (ус, CD132) приводит к образованию
тримерного высокоаффинного рецептора для IL-2. Димерный рецептор IL-2, состоящий из субъединиц Р и у, обозначают как IL-2R с промежуточной аффинностью. Субъединица а образует мономерный низкоаффинный рецептор IL-2. Хотя димерный рецептор IL-2 с промежуточной аффинностью связывается
20 с IL-2 с более низкой примерно в 100 раз аффинностью по сравнению с
тримерным высокоаффинным рецептором, как димерные, так и тримерные варианты рецептора IL-2 обладают способностью передавать сигналы после связывания с IL-2 (Minami и др., Annu Rev Immunol 11, 1993, сс. 245-268). Поэтому а-субъединица, т.е. CD25, не имеет решающего значения для передачи
25 сигналов IL-2. Она обеспечивает высокую аффинность связывания со своим
рецептором, в то время как Р-субъединица, т.е. CD122, и у-субъединица имеют решающее значение для трансдукции сигналов (Krieg и др., Proc Natl Acad Sci 107, 2010, сс. 11906-11911). Тримерные рецепторы IL-2, включающие CD25, экспрессируются (покоящимися) регуляторными CD4+, forkhead box РЗ
30 ((ТохРЗ)+-Т-клетками (Treg). Они кратковременно индуцируются также на
обычных активированных Т-клетках, в то время как в покоящемся состоянии эти клетки экспрессируют только димерные рецепторы IL-2. Тгеё-клетки постоянно
экспрессируют наиболее высокий уровень CD25 in vivo (Fontenot и др., Nature Immunol 6, 12005, сс. 142-151).
IL-2 синтезируется главным образом активированными Т-клетками, в частности, СВ4+-Т-клетками-хелперами. Он стимулирует пролиферацию и 5 дифференцировку Т-клеток, индуцирует образование цитотоксических Т-
лимфоцитов (CTL) и дифференцировку лимфоцитов периферической крови в цитотоксические клетки и лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK), усиливает экспрессию цитокинов и цитолитических молекул Т-клетками, способствует пролиферации и дифференцировке В-клеток и синтезу
10 иммуноглобулинов В-клетками и стимулирует образование, пролиферацию и активацию естественных клеток-киллеров (NK) (см., например, обзор у Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 2009, сс. 595-601; Olejniczak и Kasprzak, Med Sci Monit 14, 2008, RA179-89; Malek, Annu Rev Immunol 26, 2008, cc. 453-479).
Способность IL-2 увеличивать популяции лимфоцитов in vivo и усиливать
15 эффекторные функции этих клеток определяет противоопухолевые действия IL-2, что делает иммунотерапию на основе IL-2 привлекательным средством лечения определенных метастатических видов рака. По этой причине для пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой и злокачественной меланомой разрешено лечение высокими дозами IL-2.
20 Однако IL-2 обладает двойной функцией с позиций иммунного ответа,
поскольку он не только опосредует размножение и активность эффекторных клеток, но также играет решающую роль в поддержании периферической иммунной толерантности.
Основным механизмом, лежащим в основе периферической
25 самотолерантности, является индуцируемая IL-2 индуцированная активацией клеточная гибель (AICD) Т-клеток. AICD представляет собой процесс, при котором полностью активированные Т-клетки подвергаются запрограммированной клеточной гибели в результате взаимодействия с экспрессируемыми на клеточной поверхности рецепторами смерти, такими как
30 CD95 (известный также как Fas) или TNF-рецептор. Когда активированные
антигеном Т-клетки, которые экспрессируют высокоаффинный IL-2-рецептор (после предварительного воздействия IL-2) в процессе пролиферации, повторно стимулируют антигеном с помощью комплекса Т-клеточный рецептор
(TCR)/CD3, то индуцируется экспрессия лиганда Fas (FasL) и/или фактора некроза опухолей (TNF), что делает клетки чувствительными к опосредуемому Fas апоптозу. Это процесс зависит от IL-2 (Lenardo, Nature 353, 1991, сс. 858861) и опосредуется STAT5. С помощью процесса AICD у Т-лимфоцитов может 5 создаваться толерантность не только к аутоантигенам, но также и к
персистентным антигенам, таким как опухолевые антигены, которые, как очевидно, не являются созданным хозяином компонентом.
Кроме того, IL-2 участвует также в поддержании периферических регуляторных CD4+ СБ25+-Т-клеток (Treg) (Fontenot и др., Nature Immunol 6,
10 2005, сс. 1142-11451; D'Cruz и Klein, Nature Immunol 6, 2005, сс. 1152-1159;
Maloy и Powrie, Nature Immunol 6, 2005, cc. 1171-1172), которые известны также как супрессорные Т-клетки. Они подавляют разрушение эффекторными Т-клетками их (собственной) мишени либо путем контакта типа клетка-клетка посредством ингибирования хелперной функции и активации Т-клеток, либо
15 посредством высвобождения иммуносупрессорных цитокинов, таких как IL-10 или TGF-p. Установлено, что истощение Тгеё-клеток повышает индуцируемый IL-2 противоопухолевый иммунитет (Imai и др., Cancer Sci 98, 2007, сс. 416-423).
Таким образом, IL-2 не является оптимальным агентом для ингибирования роста опухолей, поскольку в присутствии IL-2 либо образовавшиеся CTL могут
20 распознавать опухоль как "свою" и подвергаться AICD, либо иммунный ответ может ингибироваться зависимыми от IL-2 Тгеё-клетками.
Другой проблемой, связанной с иммунотерапией на основе IL-2, являются побочные действия лечения рекомбинантным человеческим IL-2. У пациентов, получающих высокие дозы IL-2, часто обнаружены серьезные сердечно-
25 сосудистые, легочные, почечные, печеночные, желудочно-кишечные,
неврологические, кожные, гематологические и системные нежелательные явления, которые требуют интенсивного мониторинга и устранения в организме пациента. Большинство этих побочных действий можно объяснить развитием, так называемого синдрома васкулярного (или капиллярного) просачивания
30 (VLS), т.е. патологического повышения сосудистой проницаемости, приводящей к транссудации жидкости во многих органах (что вызывает, например, отек легких или кожи и поражение клеток печени) и внутрисосудистому истощению жидкости (что вызывает падение кровяного давления и компенсирующее
увеличение частоты сердечных сокращений). Не существует другого лечения VLS, кроме отказа от IL-2. На пациентах изучали режимы, основанные на применении IL-2 в низких дозах с целью избегания VLS, однако полученные терапевтические результаты оказались ниже оптимальных. Предполагалось, что 5 VLS вызывается высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как
фактор некроза опухолей (TNF)-a из активированных IL-2 NK-клеток, однако в последние годы было установлено, что индуцированный IL-2 легочный отек возникает в результате непосредственного связывания IL-2 с эндотелиальными клетками легких, в которых происходит экспрессия от низкого до среднего
10 уровня функциональных офу IL-2-рецепторов (Krieg и др., Proc Nat Acad Sci USA 107, 2010, сс. 11906-11911).
Для преодоления этих проблем, связанных с иммунотерапией на основе IL-2, применяли несколько подходов. Например, было установлено, что комбинация IL-2 с некоторыми моноклональными антителами к IL-2 повышает
15 действия лечения IL-2 in vivo (Kamimura и др., J Immunol 177, 2006, сс. 306-314; Boyman и др., Science 311, 2006, сс. 1924-1927). Согласно альтернативному подходу IL-2 подвергали мутации различными путями для снижения его токсичности и/или повышения его эффективности. Ни с соавторами (Blood 101, 2003, сс. 4853-4861, публикация патента США № 2003/0124678) заменяли
20 остаток аргинина в положении 38 IL-2 на триптофан для элиминации активности IL-2 в отношении сосудистой проницаемости. Shanafelt с соавторами (Nature Biotechnol 18, 2000, сс. 1197-1202) заменяли посредством мутации аспарагин 88 на аргинин для повышения избирательности в отношении Т-клеток относительно NK-клеток. Heaton с соавторами (Cancer Res 53, 1993, сс. 2597-2602; US №
25 5229109) интродуцировали две мутации, Arg38Ala и Phe42Lys, для снижения секреции провоспалительных цитокинов из NK-клеток. Gillies с соавторами (публикация патента США № 2007/0036752) заменяли три остатка IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg и Glnl26Asp), с которыми связана аффинность к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, для снижения VLS. Gillies с соавторами
30 (WO 2008/0034473) изменяли также путем мутации поверхность раздела IL-2 с CD25 путем аминокислотной замены Arg38Trp и Phe42Lys для снижения взаимодействия с CD25 и активации Тгеё-клеток с целью повышения эффективности. Для этой же цели Wittrup с соавторами (WO 2009/061853)
получали мутанты IL-2 с повышенной аффинностью к CD25, но не
активирующие рецептор, которые в результате действовали в качестве
антагонистов. Мутации интродуцировали с целью нарушения взаимодействия с
Р-и/или у-субъединицей рецептора.
5 Однако было установлено, что ни один из известных мутантов IL-2 не
позволял преодолевать все вышеуказанные проблемы, связанные с иммунотерапией на основе IL-2, а именно, токсичность, которая обусловлена индукцией VLS, толерантность к опухолевым антигенам, вызываемую индукцией AICD, и иммуносупрессию, вызываемую активацией Тгеё-клеток. 10 Таким образом, в данной области сохраняется потребность в дополнительном повышении терапевтической ценности белков IL-2. Краткое изложение сущности изобретения
В основу настоящего изобретения положены, в частности, данные о том, что проблемы, связанные с иммунотерапией на основе IL-2, определяются 15 взаимодействием IL-2 с а-субъединицей тримерного высокоффинного IL-2-рецептора.
Таким образом, первым объектом изобретения является мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2), содержащий первую аминокислотную мутацию, которая аннулирует или уменьшает аффинность мутантного
20 полипептида IL-2 к высокоаффинному IL-2-рецептору и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к IL-2-рецептору с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная первая аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-
25 2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная первая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная первая аминокислотная мутация представляет собой
30 аминокислотную замену L72G. В некоторых вариантах осуществления
изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит вторую аминокислотную мутацию, которая аннулирует или уменьшает аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному IL-2-рецептору и сохраняет аффинность
мутантного полипептида IL-2 к IL-2-рецептору с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная вторая мутация находится в положении, выбранном из положений, соответствующих остаткам 35, 38, 42, 43 5 и 45 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 42 человеческого IL-2. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы,
10 включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R и F42K. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену F42A. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид интерлейкина-2 содержит третью аминокислотную мутацию, которая аннулирует
15 или уменьшает аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному IL-2-рецептору и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к IL-2-рецептору с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид интерлейкина-2 содержит три
20 аминокислотные мутации, которые аннулируют или уменьшают аффинность
мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному IL-2-рецептору и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к IL-2-рецептору с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа, где указанные три аминокислотные мутации находятся в положениях,
25 соответствующих остаткам 42, 45 и 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены, выбранные из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A,
30 L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид интерлейкина-2
дополнительно содержит аминокислотную мутацию, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в 5 положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2, представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей ТЗА, T3G, T3Q, ТЗЕ, T3N, T3D, T3R, ТЗК и ТЗР. В конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная мутация, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого 10 IL-2, представляет собой ТЗА. В некоторых вариантах осуществления
изобретения мутантный полипептид IL-2, как правило, представляет собой полноразмерную молекулу IL-2, в частности человеческую полноразмерную молекулу IL-2.
В изобретении предложен также мутантный полипептид интерлейкина-2,
15 сцепленный с отличным от IL-2-фрагментом (не-1Ь-2-фрагментом). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный не-1Ь-2-фрагмент представляет собой обеспечивающий направленный перенос фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный не-1Ь-2-фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов
20 осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент
представляет собой антитело. В другом варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент выбирают из молекулы Fab и молекулы scFv. В
25 конкретном варианте осуществления изобретения указанный
антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab. В другом варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу scFv. В конкретных вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 сцеплен с первым и вторым не-1Ь-2-
30 фрагментом. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения
мутантный полипептид интерлейкина-2 объединен карбоксиконцевой пептидной связью с указанным первым не-1Ь-2-фрагментом и аминоконцевой пептидной связью с указанным вторым не-1Ь-2-фрагментом. В одном из вариантов
осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу иммуноглобулина. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу иммуноглобулина класса IgG, в частности, 5 подкласса IgGi. В некоторых вариантах осуществления изобретения мишенью указанного антигенсвязывающего фрагмента является антиген, присутствующий на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки, в частности, антиген, выбранный из группы, включающей белок активации фибробластов (фибробласт-активирующий белок) (FAP), А1-домен тенасцина-С (TNC А1), А2-
10 домен тенасцина-С (TNC А2), экстра-домен В фибронектина (EDB),
карциноэмбриональный антиген (СЕА) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP).
В изобретении предложен также иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании, и
15 антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, мутантный полипептид IL-2 объединен с помощью амино- или карбоксиконцевой пептидной связи с указанным антигенсвязывающим фрагментом. В конкретных вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит первый и второй антигенсвязывающий
20 фрагмент. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения
мутантный полипептид IL-2, входящий в иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом и второй антигенсвязывающим фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо I) с
25 мутантным полипептидом IL-2, либо II) с указанным первым
антигенсвязывающим фрагментом. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, входящий в иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, представляет собой антитело, в другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой
30 фрагмент антитела. В конкретном варианте осуществления изобретения
указанный антигенсвязывающий фрагмент выбран из молекулы Fab и молекулы scFv. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab. В другом
конкретном варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу иммуноглобулина. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу иммуноглобулина 5 класса IgG, в частности, подкласса IgGi. В некоторых вариантах осуществления изобретения мишенью указанного антигенсвязывающего фрагмента является антиген, присутствующий на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки, в частности, антиген, выбранный из группы, включающей белок активации фибробластов (FAP), А1-домен тенасцина-С (TNC А1), А2-домен
10 тенасцина-С (TNC А2), экстра-домен В фибронектина (EDB),
карциноэмбриональный антиген (СЕА) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP).
В изобретении предложены также выделенные полинуклеотиды, кодирующие мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, представленный
15 в настоящем описании, экспрессионные векторы, содержащие указанные полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды или экспрессионные векторы.
Предложен также способ получения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, представленного в настоящем описании, фармацевтической
20 композиции, содержащей мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель, и способы применения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, представленного в настоящем описании.
В частности, изобретение относится к мутантному полипептиду IL-2 или
25 иммуноконъюгату, представленному в настоящем описании, предназначенному для применения для лечения заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. В конкретном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В конкретном варианте осуществления изобретения индивидуум представляет собой человека.
30 Изобретение относится также в применению мутантного полипептида IL-2
или иммуноконъюгата, представленного в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у индивидуума, который нуждается в этом.
Кроме того, предложен способ лечения заболевания у индивидуума, заключающийся в том, что вводят указанному индивидууму в терапевтически эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании. Указанное заболевание 5 предпочтительно представляет собой рак.
Кроме того, предложен способ стимуляции иммунной системы у индивидуума, заключающийся в том, что вводят указанному индивидууму в эффективном количестве композицию, содержащую мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, в 10 фармацевтически приемлемой форме.
Подробное описание изобретения
Определения
Понятия, применяемые в настоящем описании, имеют значения, общепринятые в данной области, если ниже специально не указано иное.
15 В контексте настоящего описания понятие "интерлейкин-2" или "IL-2",
если не указано иное, относится к любому нативному IL-2 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы). Под понятие подпадает непроцессированный IL-2, а также
20 любая форма IL-2, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты IL-2, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В качестве примера аминокислотная последовательность человеческого IL-2 представлена в SEQ ID NO: 1. Непроцессированный человеческий IL-2 дополнительно содержит
25 расположенный на N-конце состоящий из 20 аминокислот сигнальный пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 272, который отсутствует в зрелой молекуле IL-2.
Подразумевается, что понятие "мутант IL-2" или "мутантный полипептид IL-2" в контексте настоящего описания относится к любым мутантным формам 30 различных форм молекулы IL-2, включая полноразмерный IL-2, укороченные формы IL-2 и формы, в которых IL-2 сцеплен с другой молекулой, например, путем слияния или химической конъюгации. Подразумевается, что понятие "полноразмерный" при использовании касательно IL-2 означает зрелую
молекулу IL-2, которая имеет встречающуюся в естественных условиях длину. Например, полноразмерный человеческий IL-2 относится к молекуле, которая содержит 133 аминокислоты (см., например, SEQ ID NO: 1). Различные формы мутантов IL-2 отличаются наличием по меньшей мере одной аминокислотной 5 мутации, которая оказывает воздействие на взаимодействие IL-2 с CD25. Такая мутация может включать замену, делецию, укорочение или модификацию аминокислотного остатка дикого типа, локализованного в норме в этом положении. Предпочтительными являются мутации, полученные путем аминокислотной замены. Если не указано иное, то в настоящем описании мутант
10 IL-2 может быть обозначен как мутантная пептидная последовательность IL-2, мутантный полипептид IL-2, мутантный белок IL-2 или мутантный аналог IL-2.
В контексте настоящего описания обозначение различных форм IL-2 сделано относительно последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. В контексте настоящего описания для одной и той же мутации можно применять
15 различные обозначения. Например, мутацию, приводящую к замене
фенилаланина в положении 42 на аланин можно обозначать как 42А, А42, А42, F42A или Phe42Ala.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие "аминокислотная мутация" относится к аминокислотным заменам, делециям,
20 инсерциям и модификациям. Можно применять любую комбинацию замены, делеции, инсерции и модификации для создания конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, пониженной способностью связываться с CD25. Аминокислотная последовательность с делециями и инсерциями включает амино- и/или
25 карбоксиконцевые делеции и инсерции аминокислот. Примером концевой делеции является делеция остатка аланина в положении 1 полноразмерного человеческого IL-2. Предпочтительными аминокислотными мутациями являются аминокислотные замены. Для изменения, например, характеристик связывания полипептида IL-2, наиболее предпочтительными являются неконсервативные
30 аминокислотные замены, т.е. замена одной аминокислоты на другую
аминокислоту, имеющую другие структурные и/или химические свойства. Предпочтительные аминокислотные замены включают замену гидрофобной аминокислоты на гидрофильную. Аминокислотные замены включают замену на
не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты или на производные встречающихся в естественных условиях двадцати стандартных аминокислот (например, на 4-гидроксипролин, 3-метилгистидин, орнитин, гомосерин, 5-гидроксилизин). Аминокислотные мутации можно создавать с помощью 5 генетических или химических методов, хорошо известных в данной области.
Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и т.п. Подразумевается, что можно применять также методы изменения боковой группы аминокислоты, отличные от методов генетической инженерии, такие как химическая модификация.
10 В контексте настоящего описания форма "дикого типа" IL-2 представляет
собой форму IL-2, которая является такой же, что и мутантный полипептид IL-2, за исключением того, что в форме дикого типа присутствует аминокислота дикого типа в каждом аминокислотном положении мутантного полипептида IL-2. Например, если мутант IL-2 представляет собой полноразмерный IL-2 (т.е. IL-
15 2, не слитый или не конъюгированный с любой другой молекулой), то форма
дикого типа этого мутанта представляет собой полноразмерный нативный IL-2. Если мутант IL-2 представляет собой слияние IL-2 и другого полипептида, кодируемого по ходу транскрипции относительно IL-2 (например, цепь антитела), то форма дикого типа этого мутанта IL-2 представляет собой IL-2 с
20 аминокислотной последовательностью дикого типа, слитой с таким же
кодируемым по ходу транскрипции полипептидом. Кроме того, если мутант IL-2 представляет собой укороченную форму IL-2 (мутантная или модифицированная последовательность в неукороченной части IL-2), то форма дикого типа этого мутанта IL-2 представляет собой аналогично укороченный IL-2, который имеет
25 последовательность дикого типа. Для целей сравнения аффинности связывания IL-2-рецептора или биологической активности различных форм мутантов IL-2 и соответствующей формы дикого типа IL-2, под понятие дикий тип подпадают формы IL-2, содержащие одну или несколько аминокислотных мутаций, которые не влияют на связывание IL-2-рецептора по сравнению со встречающимся в
30 естественных условиях нативным IL-2, таких, например, как замена цистеина в положении, соответствующем остатку 125 человеческого IL-2, на аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения для целей настоящего изобретения форма дикого типа IL-2 содержит аминокислотную замену С125А
(см. SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид IL-2 дикого типа, с которым сравнивают мутантный полипептид IL-2, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления изобретения полипептид IL-2 дикого типа, с которым 5 сравнивают мутантный полипептид IL-2, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
В контексте настоящего описания понятие "CD25" или "а-субъединица рецептора IL-2", если не указано иное, относится к любой нативной CD25 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая
10 млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы). Под понятие подпадает "полноразмерная" непроцессированная CD25, а также любая форма CD25, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты CD25, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В
15 некоторых вариантах осуществления изобретения CD25 представляет собой
человеческую CD25. В качестве примера аминокислотная последовательность человеческой CD25 (с сигнальной последовательностью, Avi-меткой и His-меткой) представлена в SEQ ID NO: 278.
В контексте настоящего описания понятие "высокоаффинный рецептор IL-
20 2" относится к гетеротримерной форме рецептора IL-2, состоящей из
рецепторной у-субъединицы (которая известна также как общая у-субъединица цитокинового рецептора, ус, или CD 132), рецепторной Р-субъединицы (известной также как CD 122 или р70) и рецепторной а-субъединицы (известной также как CD25 или р55). В противоположность этому, понятие "рецептор IL-2 с
25 промежуточной аффинностью" относится к рецептору IL-2, который включает только у-субъединицу и Р-субъединицу, но не содержит а-субъединицы (см., например, обзор Olejniczak и Kasprzak, Med Sci Monit 14, 2008, RA179-189). Понятие "аффинность" относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы
30 (например, рецептора) и его партнера по связыванию (например, лиганда). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие "аффинность связывания" относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, рецептору и лиганду) аффинности связывания, отражающей
взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (Ко), которая представляет собой отношение констант скорости реакции диссоциации и ассоциации (k0ff и kon соответственно). Так, эквивалентные аффинности могут 5 соответствовать различным константам скорости, если соотношение констант скорости остается таким же. Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании.
Аффинность полипептида IL-2 мутантного или дикого типа в отношении
10 различных форм рецептора IL-2 можно определять с помощью изложенного в разделе "Примеры" метода резонанса поверхностного плазмона (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например, устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и рецепторные субъединицы, которые можно получать с помощью метода рекомбинантной экспрессии (см., например, Shanafelt и др.,
15 Nature Biotechnol 18, 2000, сс. 1197-1202). Альтернативно этому, аффинность связывания мутантов IL-2 с различными формами рецептора IL-2 можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известна способность к экспрессии одной или другого формы рецептора. Ниже описаны конкретные приведенные в качестве иллюстрации примеры вариантов измерения
20 аффинности связывания.
Под "регуляторной Т-клеткой" или "Тгеё-клеткой" подразумевается специализированный тип СВ4+-Т-клетки, которая может подавлять ответы других Т-клеток. Тгеё-клетки отличаются способностью экспрессировать а-субъединицу рецептора IL-2 (CD25) и фактор транскрипции forkhead box РЗ
25 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 2004, сс. 531-562), и они играют
решающую роль в индукции и поддержании периферической самотолерантности к антигенам, включая те, которые экспрессируются опухолями. Тгеё-клеткам требуется IL-2 для их функционирования и развития и индукции их способности оказывать подавляющее действие.
30 В контексте настоящего описания понятие "эффекторные клетки"
относится к популяции лимфоцитов, которые опосредуют цитотоксические действия IL-2. Эффекторные клетки представляют собой эффекторные Т-клетки,
такие как цитотоксические CD8 -Т-клетки, NK-клетки, лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK) и макрофаги/моноциты.
В контексте настоящего описания понятие "антигенсвязывающий фрагмент" относится к полипептидной молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью направлять субстанцию, к которой он присоединен (например, цитокин или второй антигенсвязывающий фрагмент), к сайту-мишени, например, к специфическому типу опухолевой клетки или стромы опухоли, несущей антигенную детерминанту. Антигенсвязывающие фрагменты включают антитела и их фрагменты, что будет дополнительно описано ниже. Предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты включают антигенсвязывающий домен антитела, который содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты могут включать константные области антитела, что будет дополнительно описано ниже и известно в данной области. Пригодные константные области тяжелых цепей включают любой из пяти изотипов: а, 8, s, у или \х. Пригодные константные области легких цепей включают любой из двух изотипов: к и X.
Понятие "специфически связывается" означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающего фрагмента связываться со специфической антигенной детерминантой можно определять с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или других методик, известных специалисту в данной области, например, с помощью методики на основе резонанса поверхностного плазмона (осуществляя анализ с помощью устройства BIAcore) (Liljeblad и др., Glyco J 17, 2000, сс. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, сс. 217-229).
В контексте настоящего описания понятие "антигенная детерминанта" является синонимом понятий "антиген" и "эпитоп" и относится к сайту (например, участку, состоящему из смежных аминокислот, или конформационной конфигурации, состоящей из различных областей несмежных аминокислот) на полипептидной макромолекуле, с которой связывается
антигенсвязывающий фрагмент с образованием комплекса антигенсвязывающий фрагмент-антиген. Пригодные антигенные детерминанты можно обнаружить, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности других больных клеток, в свободном состоянии 5 в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ЕСМ).
В контексте настоящего описания понятие "полипептид" относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (которые обозначают также как пептидные связи). Понятие "полипептид" относится к любой цепи, состоящей из двух или большего
10 количества аминокислот, и не подразумевает, что продукт имеет конкретную длину. Так, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, "белок", "аминокислотная цепь" или любое иное общепринятое понятие, относящееся к цепи, состоящей из двух или большего количества аминокислот, все подпадают под определение "полипептид", и понятие "полипептид" можно применять
15 вместо или взаимозаменяемо с любым из указанных понятий. Подразумевается также, что понятие "полипептид" относится в продуктам, которые несут пост-экспрессионные модификации полипептида, включая (но, не ограничиваясь только ими) гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с использованием известных
20 защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление или
модификацию с помощью не встречающихся в естественных условиях аминокислот. Полипептид можно получать из встречающегося в естественных условиях биологического источника или можно получать с помощью технологии рекомбинантной ДНК, и его не обязательно транслировать с созданной
25 нуклеотидной последовательности. Его можно создавать любым путем, включая химический синтез. Полипептид, предлагаемый в изобретении, может состоять примерно из 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь
30 различную трехмерную структуру, хотя они необязательно должны иметь
указанную структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой обозначают как полипептиды, имеющие укладку, а полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, но которые легче могут
адаптироваться к большому количеству различных конформаций, обозначают как полипептиды, не имеющие укладку.
Под "выделенным" полипептидом или его вариантом, или производным подразумевают полипептид, который не находится в его естественном 5 окружении. При этом не требуется какого-то конкретного уровня очистки. Например, выделенный полипептид можно удалять из его нативного или естественного окружения. Полученные путем рекомбинации полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, рассматриваются как выделенные для целей настоящего изобретения, если они представляют собой нативные или
10 рекомбинантные полипептиды, которые отделены, фракционированы или
частично или полностью очищены с помощью любого приемлемого метода.
"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые
15 идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какие-либо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей.
20 Сравнительный анализ для определения процента идентичности
аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в
25 данной области могут определять соответствующие параметры для
выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величину % идентичности аминокислотных последовательностей получают с
30 использованием предназначенной для сравнения последовательностей компьютерной программы ALIGN-2. Предназначенная для сравнения последовательностей компьютерная программа ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код помещен на хранение вместе с документацией
для пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером U.S. Copyright Registration № TXU510087. Программа ALIGN-2 представляет собой публично доступную программу фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, или 5 ее можно компилировать из исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую версию UNIX V4.0D. В программе ALIGN-2 все параметры для сравнения последовательностей являются заданными и не должны изменяться. В ситуациях, когда ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных
10 последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей
данной аминокислотной последовательности А относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б (которую другими словами можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или отличается определенным % идентичности аминокислотной
15 последовательности относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б), рассчитывают следующим образом:
100х частное X/Y,
20 где X обозначает количество аминокислотных остатков, оцененных
программой сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при сравнительном анализе последовательностей А и Б с помощью указанной программы, и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б. Должно быть очевидно, что, когда длина
25 аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной
последовательности Б, то % идентичности аминокислотной последовательности А относительно аминокислотной последовательности Б не должен быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно аминокислотной последовательности А. Если специально не указано иное, то в
30 контексте настоящего описания все величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают согласно процедуре, описанной в последнем из предшествующих параграфов, с помощью компьютерной программы ALIGN-2.
Понятие "полинуклеотид" относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкции, например, матричной РНК (мРНК), РНК вирусного происхождения или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или не традиционную связь (например, 5 амидную связь, такую, которая присутствует в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Понятие "молекула нуклеиновой кислоты" относится к любому одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
Под "выделенной" нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом
10 подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, т.е. ДНК или РНК, которая отделена от ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий входящий в вектор терапевтический полипептид, рассматривается как выделенный для целей настоящего изобретения. Другими примерами выделенного полинуклеотида являются рекомбинантные
15 полинуклеотиды, присутствующие в гетерологичных клетках-хозяевах, или
очищенные (частично или полностью) полинуклеотиды, находящиеся в растворе. Выделенный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, входящую в клетки, которые в норме содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида присутствует вне хромосомы или имеет локализацию в
20 хромосоме, отличную от ее локализации в хромосоме в естественных условиях.
Выделенные молекулы РНК включают полученные in vivo или in vitro РНК-транскрипты, предлагаемые в настоящем изобретении, а также формы с позитивной и негативной цепью и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем
25 изобретении, включают также указанные молекулы, полученные с помощью синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может представлять собой или может включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции. Под нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, имеющей/имеющим
30 нуклеотидную последовательность, которая, например, на 95% "идентична" нуклеотидной референс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того,
что полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 5 точечные мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для получения полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей 5 мере на 95% нуклеотидной референс-последовательности, вплоть до 5%
нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 5% нуклеотидов от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности
10 могут иметь место в положениях на 5' - или 3'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в ином положении между этими концевыми положениями, и их встраивают либо индивидуально между остатками в референс-последовательности, либо их встраивают в референс-последовательность в виде одной или нескольких смежных групп. На практике
15 решение вопроса о том, идентична ли конкретная полинуклеотидная
последовательность по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, можно решать, как правило, с использованием известных компьютерных программ, например, указанных выше для полипептидов
20 (например, ALIGN-2).
Понятие "кассета экспрессии" относится к полинуклеотиду, полученному с помощью рекомбинации или синтеза, который содержит серии специфических нуклеотидных элементов, которые обеспечивают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную кассету экспрессии
25 можно встраивать в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, рекомбинантная кассета экспрессии, представляющая собой часть экспрессионного вектора, включает среди прочих последовательностей подлежащую транскрипции нуклеотидную последовательность и промотор. В некоторых вариантах
30 осуществления изобретения кассета экспрессии, предлагаемая в изобретении,
содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты.
Понятие "вектор" или "экспрессионный вектор" является синонимом понятия "экспрессионная конструкция" и относится к молекуле ДНК, которую применяют для интродукции и обеспечения экспрессии конкретного гена, с которой он функционально связан в клетке-мишени. Понятие включает вектор, представляющий собой самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Экспрессионный вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит кассету экспрессии. Экспрессионные векторы позволяют осуществлять транскрипцию больших количеств стабильной мРНК. Когда экспрессионный вектор находится внутри клетки-мишени, то молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, который кодируется геном, продуцируется в результате клеточного механизма транскрипции и/или трансляции. В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит кассету экспрессии, которая включает полинуклеотидные последовательности, которые кодируют мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты.
Понятие "искусственный" относится к синтетической или не полученной из клетки-хозяина композиции, например, к синтезированному химически олигонуклеотиду.
В контексте настоящего описания понятия "клетка-хозяин", "клеточная линия-хозяин" и "клеточная культура-хозяин" используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. "Трансформанты" и "трансформированные клетки" клеток-хозяев включают первичные рассматриваемые клетки, а также культуры, выведенные из них, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка.
В контексте настоящего описания понятие "антитело" используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела,
поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
В контексте настоящего описания понятия "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "полное антитело" используются взаимозаменяемо, и они относятся к антителу, имеющему строение, практически сходное со строением нативного антитела, или имеющему тяжелые цепи, которые содержат указанную в настоящем описании Fc-область.
Понятие "фрагмент антитела" относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, димерные антитела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител. Обзор некоторых фрагментов антител см., например, у Hudson и др., Nat Med 9, 2003, сс. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у Pliickthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185; и U.S. №№ 5571894 и 5587458. Обсуждение Fab- и Р(аЬ')2-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладающих удлиненным временем полужизни in vivo, см. в U.S. № 5869046. Димерные антитела (диабоди) представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat Med 9, 2003, сс. 129-134; и Hollinger и др., Proc Natl Acad Sci USA 90, 1993, сс. 6444-6448. Тримерные (триабоди) и тетрамерные (тетрабоди) антитела описаны также у Hudson и др., Nat Med 9, 2003, сс. 129-134. Фрагменты антител можно создавать с помощью различных методик, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), как указано в настоящем описании.
Понятие "молекула иммуноглобулина" относится к белку, имеющему структуру встречающегося в естественных условиях антитела. Например, иммуноглобулины класса IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух 5 легких цепей и двух тяжелых цепей, связанные дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой расположены три константных домена (CHI, СН2 и СНЗ), которые называют также константной
10 областью тяжелой цепи. Аналогично этому, в направлении от N- конца к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой расположен константный домен легкой цепи (CL), который называют также константной областью легкой цепи. Тяжелая цепь
15 иммуноглобулина может относиться к одному из пяти классов, обозначенных как a (IgA), 8 (IgD), s (IgE), у (IgG) или [i (IgM), некоторые из которых дополнительно подразделяют на подклассы, например, yi (IgGi), У2 (IgG2), уз (L3G3), У4 (L3G4), ai (IgAi) и (Х2 (L3A2). Легкая цепь иммуноглобулина может относиться к одному из двух типов, обозначенных как каппа (к) и лямбда (к), на
20 основе аминокислотной последовательности ее константного домена.
Иммуноглобулин, как правило, состоит из двух молекул Fab и Fc-домена, которые соединены через шарнирную область иммуноглобулина.
Понятие "антигенсвязывающий домен" относится к части антитела, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся
25 комплементарной части антигена или полному антигену. Антигенсвязывающий домен может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями антитела). Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область
30 тяжелой цепи (VH) антитела.
Понятие "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, которая/который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой
цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 5 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена.
Понятие "гипервариабельный участок" или "HVR" в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательность которых являются гипервариабельной, и/или которые
10 образуют структуры в виде петель ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (HI, Н2, НЗ) и три в VL (LI, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из "определяющих комплементарность участков" (CDR), последние отличаются наиболее
15 выраженной вариабельностью последовательности и/или участвуют в
распознавании антигенов. Кроме CDR1, присутствующего в VH, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. Понятие "гипервариабельные участки" (HVR) относится также к "определяющим комплементарность участкам" (CDR), и в
20 контексте настоящего описания эти понятия используются взаимозаменяемо касательно положений вариабельной области, которые формируют антигенсвязывающие области. Эта конкретная область описана у Kabat и др., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1983 и у Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917, причем эти
25 определения относятся к перекрывающимся аминокислотным остаткам или
поднаборам аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Однако в контексте настоящего описания подразумевается возможность применения любого определения CDR антитела или его вариантов. Соответствующие аминокислотные остатки, из которых состоят CDR, как они определены в
30 каждой из процитированных выше ссылок, представлены в сравнении ниже в таблице 1. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области на основе данных об аминокислотной
последовательности вариабельной области антитела легко могут определить, какие остатки входят в конкретный CDR. Таблица 1. Определения CDR1
с номенклатурой, предложенной Кэботом с соавторами (см. ниже). 2
Обозначение "АЬМ" с прописной буквой "Ь", использованное в таблице 1, относится к
CDR, как они определены программой для моделирования антител "АЬМ" компании Oxford Molecular Group.
10 Кэбот с соавторами предложили также систему нумерации (номенклатуру)
последовательностей вариабельных областей, которую можно применять для любого антитела. Обычный специалист в данной области может однозначно применять эту систему "нумерации по Кэботу" к любой последовательности вариабельной области, не имея никаких экспериментальных данных, кроме
15 сведений о самой последовательности. В контексте настоящего описания
понятие "нумерация по Кэботу" относится к системе нумерации, описанной у Kabat и др., "Sequence of Proteins of Immunological Interest)), изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, 1983. Если не указано иное, то ссылки на нумерацию положений конкретных аминокислотных остатков в вариабельной области
20 антитела даны в соответствии с системой нумерации по Кэботу.
Нумерация полипептидных последовательностей в "Перечне последовательностей" (т.е. SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33 и т.д.) не представляет собой нумерацию в соответствии с системой Кэбота. Однако в компетенции обычного специалиста в данной области является превращение
25 нумерации последовательностей в "Перечне последовательностей" в нумерацию по Кэботу.
"Каркасные участки" или "FR"-y4acTKH представляют собой участки вариабельных доменов, отличные от остатков гипервариабельных участков
(HVR). FR вариабельного домена, как правило, представлены четырьмя FR-
доменами: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR,
как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FRl-Hl(Ll)-
FR2-H2(L2)-FR3 -НЗ (L3 )-FR4.
5 Понятие "класс" антител относится к типу константного домена или
константной области, характерному для тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgGi, L3G2, L3G3, L3G4, IgAi и L3A2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие 10 различным классам иммуноглобулинов, обозначают как а, 8, s, у и \х соответственно.
В контексте настоящего описания понятие "Fc-область" относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие относится к нативной
15 последовательности Fc-областей и вариантам Fc-областей. Хотя пограничные
последовательности Fc-области в тяжелой цепи IgG могут слегка варьироваться, как правило, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Рго230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может либо присутствовать, либо может не
20 присутствовать.
"Модификация, усиливающая гетеродимеризацию" представляет собой манипуляцию с пептидным каркасом или пост-трансляционные модификации полипептида, например, тяжелой цепи иммуноглобулина, которая уменьшает или препятствует ассоциации полипептида с идентичным полипептидом с
25 образованием гомодимера. В контексте настоящего описания модификация, усиливающая гетеродимеризацию, включает, прежде всего, различные модификации, осуществляемые с каждым из двух полипептидов, требуемые для образования димера, при этом, модификации дополняют друг друга таким образом, чтобы усиливать ассоциацию двух полипептидов. Например,
30 модификация, усиливающая гетеродимеризацию, может изменять структуру или заряд одного или обоих полипептидов, что требуется для образования димера, таким образом, чтобы улучшать их ассоциацию стерически или электростатически соответственно. Гетеродимеризация имеет место между
двумя неидентичными полипептидами, такими как тяжелые цепи двух иммуноглобулинов, при этом дополнительные компоненты иммуноконъюгата слитых друг с другом тяжелых цепей (например, полипептида IL-2) не являются одинаковыми. В иммуноконъюгатах, предлагаемых в настоящем изобретении, 5 модификация, усиливающая гетеродимеризацию, затрагивает тяжелую(ые) цепь(и), в частности, Fc-домен молекулы иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификация, усиливающая гетеродимеризацию, представляет собой аминокислотную мутацию, в частности, аминокислотную замену. В конкретном варианте осуществления изобретения
10 модификация, усиливающая гетеродимеризацию, представляет собой
индивидуальную аминокислотную мутацию, в частности, аминокислотную замену, в каждой из двух тяжелых цепей иммуноглобулина.
Понятие "эффекторные функции" при его использовании касательно антител относится к видам биологической активности, присущим Fc-области
15 антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: способность связываться с Clq и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), способность связываться с Fc-рецептором, антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP),
20 секреция цитокинов, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активация В-клеток.
"Активирующий Fc-рецептор" представляет собой Fc-рецептор, который после взаимодействия с Fc-областью антитела осуществляет процесс передачи сигналов, которые стимулируют несущую рецептор клетку осуществлять
25 эффекторные функции. Активирующие Fc-рецепторы включают FcyRIIIa (CD 16а), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) и FcaRI (CD89).
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятия "конструирование, сконструированный, инженерия" включают любую манипуляцию с пептидным каркасом или пост-трансляционные модификации
30 встречающегося в естественных условиях или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Инженерия включает модификации аминокислотной последовательности, схемы гликозилирования или группы боковых цепей индивидуальных аминокислот, а также комбинации указанных подходов.
В контексте настоящего описания понятие "иммуноконъюгат" относится к молекуле полипептида, которая включает по меньшей мере один фрагмент IL-2 и по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один фрагмент IL-2 и по меньшей мере два антигенсвязывающих фрагмента. Конкретные иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, практически состоят из одного фрагмента IL-2 и двух антигенсвязывающих фрагментов, сцепленных с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. Антигенсвязывающий фрагмент может быть сцеплен с фрагментом IL-2 с помощью различных взаимодействий и в широком разнообразии конфигураций, указанных в настоящем описании.
В контексте настоящего описания понятие "контрольный антигенсвязывающий фрагмент" относится к антигенсвязывающему фрагменту, который должен быть свободен от других антигенсвязывающих фрагментов и эффекторных фрагментов. Например, при осуществлении сравнения иммуноконъюгата Fab-IL2-Fab, предлагаемого в изобретении, с контрольным антигенсвязывающим фрагментом контрольный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой свободный Fab, при этом иммуноконъюгат Fab-IL2-Fab и свободная молекула Fab могут оба специфически связываться с одной и той же антигенной детерминантой.
В контексте настоящего описания понятия "первый" и "второй" касательно антигенсвязывающих фрагментов и др., применяют для удобства различия, когда присутствует более одного фрагмента каждого типа. Подразумевается, что применение этих понятий не определяет специфический порядок или ориентацию иммуноконъюгата, если специально не указано иное.
Понятие "эффективное количество" агента относится к количеству, необходимому для обеспечения физиологического изменения в клетке или ткани, в которую его вводят.
Понятие "терапевтически эффективное количество" агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество агента, например, элиминирует,
снижает, замедляет, минимизирует или предупреждает нежелательные явления заболевания.
"Индивидуум" или "субъект" представляет собой млекопитающее. Млекопитающие представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) 5 одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы кроме человека, такие как мартышки), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). Предпочтительно индивидуум или субъект представляет собой человека.
Понятие "фармацевтическая композиция" относится к препарату, который
10 находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, которые обладают неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.
15 "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к ингредиенту в
фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
20 В контексте настоящего описания понятие "лечение" (и его
грамматические вариации, такие как "лечить" или "процесс лечения") относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики или в процессе развития клинической патологии. Требуемыми
25 действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими)
предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или
30 улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
В основу настоящего изобретения положена задача создать мутантный полипептид IL-2, обладающий улучшенными свойствами для иммунотерапии. В частности, в основу изобретения положена задача элиминировать фармакологические свойства IL-2, которые участвуют в проявлении его 5 токсичности, но не имеют решающего значения для эффективности IL-2. Как указано выше, различные формы рецептора IL-2 состоят из различных субъединиц и характеризуются различной аффинностью к IL-2. Рецептор IL-2 с умеренной аффинностью, состоящий из Р- и у-субъединиц рецептора, экспрессируется на покоящихся эффекторных клетках и его присутствия
10 достаточно для обеспечения передачи сигналов IL-2. Высокоаффинный
рецептор IL-2, который дополнительно содержит а-субъединицу рецептора, экспрессируется главным образом на регуляторных Т-клетках (Treg), а также на активированных эффекторных клетках, при этом их взаимодействие с IL-2 может усиливать опосредуемую Тгеё-клетками иммуносупрессию или
15 индуцированную активацией клеточную гибель (AICD) соответственно. Таким образом, не ограничиваясь какой-либо теорией, можно предположить, что снижение или аннулирование аффинности IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 может снижать индуцируемую IL-2 понижающую регуляцию функции эффекторных клеток посредством регуляторных Т-клеток и развитие
20 толерантности опухолей с помощью процесса AICD. С другой стороны, сохранение аффинности рецептора IL-2 с промежуточной аффинностью поддерживает индукцию пролиферации и активацию эффекторных клеток типа NK и Т-клеток с помощью IL-2.
В данной области уже известно несколько мутантов IL-2, однако при
25 создании изобретения были обнаружены новые аминокислотные мутации полипептида IL-2 и их комбинации, которые являются наиболее предпочтительными для придания IL-2 характеристики, требуемых для иммунотерапии.
Первым объектом изобретения является мутантный полипептид
30 интерлейкина-2 (IL-2), содержащий аминокислотную мутацию, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида
IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
Мутанты человеческого IL-2 (hIL-2) с пониженной аффинностью к CD25 можно создавать, например, путем аминокислотной замены аминокислоты в 5 положении 35, 38, 42, 43, 45 или 72 или их комбинации. Примерами
аминокислотных замен являются К35Е, КЗ5 A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, К43Е, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K.
10 Конкретные мутанты IL-2, предлагаемые в изобретении, содержат мутацию в аминокислотном положении, соответствующем остатку 42, 45 или 72 человеческого IL-2 или их комбинации. Эти мутанты характеризуются практически одинаковой аффинностью к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью и обладают пониженной в значительной степени аффинностью к
15 а-субъединице рецептора IL-2 и высокоаффинному рецептору IL-2 по сравнению с формой дикого типа мутанта IL-2.
Другая характеристика перспективных мутантов может представлять собой способность индуцировать пролиферацию несущих рецептор IL-2 Т-клеток и/или NK-клеток, способность индуцировать передачу сигналов IL-2 в несущих
20 рецептор IL-2 Т-клетках и/или NK-клетках, способность воздействовать на
образование интерферона (IFN)-y в качестве вторичного цитокина NK-клетками, пониженную способность индуцировать выработку вторичных цитокинов, прежде всего IL-10 и TNF-a, мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС), пониженную способность активировать регулярные Т-клетки,
25 пониженную способность индуцировать апоптоз Т-клеток и пониженным профилем токсичности in vivo.
В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняет аффинность мутантного
30 полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, находится в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену. В одном из вариантов осуществления
изобретения аминокислотную замену выбирают из группы, включающей L72G,
L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, и L72K. В более конкретном
варианте осуществления изобретения аминокислотная мутация представляет
собой аминокислотную замену L72G.
5 Конкретным объектом изобретения является мутантный полипептид IL-2,
содержащий первую и вторую аминокислотную мутацию, которые аннулируют или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. В одном из вариантов
10 осуществления изобретения первая аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная первая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная первая аминокислотная мутация
15 представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы,
включающей L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой L72G. Указанная вторая аминокислотная мутация находится в положении, отличном от положения первой аминокислотной
20 мутации. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация находится в положении, выбранном из положений, соответствующих остаткам 35, 38, 42, 43 и 45 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену. В конкретном варианте
25 осуществления изобретения указанную аминокислотную замену выбирают из
группы, включающей К35Е, К35А, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, К43Е, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая
30 аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 42 или 45 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q,
F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену F42A или Y45A. В более конкретном варианте осуществления 5 изобретения указанная вторая аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 42 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R и F42K. В
10 более конкретном варианте осуществления изобретения указанная
аминокислотная замена представляет собой F42A. В другом варианте осуществления изобретения указанная вторая аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 45 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная вторая
15 аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену,
выбранную из группы, включающей Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная аминокислотная замена представляет собой Y45A. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2
20 содержит третью аминокислотную мутацию, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Указанная третья аминокислотная мутация находится в
25 положении, отличном от положений указанных первой и второй
аминокислотных мутаций. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная третья аминокислотная мутация находится в положении, выбранном из положений, соответствующих остаткам 35, 38, 42, 43 и 45 человеческого IL-2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная третья
30 аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 42 или 45 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная третья аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 42 человеческого IL-2. В другом варианте
осуществления изобретения указанная третья аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 45 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная третья аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену. В 5 конкретном варианте осуществления изобретения указанную третью
аминокислотную замену выбирают из группы, включающей К35Е, КЗ5A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, К43Е, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. В более конкретном варианте
10 осуществления изобретения указанную аминокислотную замену выбирают из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения указанная аминокислотная замена представляет собой F42A или Y45A. В одном из
15 вариантов осуществления изобретения указанная аминокислотная замена представляет собой F42A. В другом варианте осуществления изобретения указанная аминокислотная замена представляет собой Y45A. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 не содержит аминокислотную мутацию в положении, соответствующем остатку 38
20 человеческого IL-2.
Еще более конкретным объектом изобретения является мутантный полипептид IL-2, содержащий три аминокислотные мутации, которые аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2, но сохраняют аффинность мутантного полипептида
25 IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. В одном из вариантов
осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации находятся в положениях, соответствующих остаткам 42, 45 и 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены. В одном из вариантов
30 осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены, выбранные из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A,
L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные 5 аминокислотные мутации снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 по меньшей мере в 5 раз, в частности, по меньшей мере в 10 раз, более конкретном по меньшей мере в 25 раз. В вариантах осуществления изобретения, в которых присутствует более одной аминокислотной мутации, которая снижает аффинность мутантного полипептида
10 IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2, комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 50 раз или даже по меньшей мере в 100 раз. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация или комбинация
15 аминокислотных мутаций аннулирует аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2, в результате чего никакое связывание не удается обнаружить с помощью резонанса поверхностного плазмона, что будет описано ниже.
Считается, что достигается практически сходное связывание с рецептором с 20 промежуточной аффинностью, т.е. сохранение аффинности мутантного
полипептида IL-2 к указанному рецептору, когда для мутанта IL-2 характерна аффинность, составляющая более чем примерно 70% от аффинности формы дикого типа мутанта IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. Мутанты IL-2, предлагаемые в изобретении, могут характеризоваться 25 аффинностью, составляющей более чем примерно 80%, и даже более чем примерно 90% от указанной аффинности.
При создании изобретения было обнаружено, что уменьшение аффинности IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 в сочетании с элиминацией О-гликозилирования IL-2 позволяет получать белок IL-2 с улучшенными 30 свойствами. Например, элиминация сайта О-гликозилирования позволяет
получать более гомогенный продукт при экспрессии мутантного полипептида IL-2 в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО или НЕК.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, содержит дополнительную аминокислотную мутацию, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого 5 IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная
дополнительная аминокислотная мутация, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2, представляет собой аминокислотную замену. Примерами аминокислотных замен являются ТЗА, T3G, T3Q, ТЗЕ, T3N, T3D, T3R, ТЗК и ТЗР. В конкретном
10 варианте осуществления изобретения указанная дополнительная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену ТЗА.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 представляет собой практически полноразмерную молекулу IL-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2
15 представляет собой молекулу человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 1 по меньшей мере с одной аминокислотной мутацией, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность
20 мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2, который содержит SEQ ID NO: 1 без указанной мутации. В другом варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 3 по меньшей мере с одной аминокислотной мутацией, которая аннулирует или снижает аффинность
25 мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2, который содержит SEQ ID NO: 3 без указанной мутации.
В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид
30 IL-2 может вызывать один или несколько клеточных ответов, выбранных из группы, включающей: пролиферацию активированного Т-лимфоцита, дифференцировку активированного Т-лимфоцита, активность цитотоксической Т-клетки (CTL), пролиферацию активированной В-клетки, дифференцировку
активированной В-клетки, пролиферацию естественной клетки-киллера (NK),
дифференцировку NK-клетки, секрецию активированной Т-клетки или NK-
клетки и противоопухолевую цитотоксичность NK/лимфокин-активированной
клетки-киллера (LAK).
5 В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид
IL-2 обладает пониженной способностью индуцировать передачу сигналов IL-2 в регуляторных Т-клетках по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 индуцирует пониженную индуцированную активацией клеточную гибель (AICD)
10 Т-клеток по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 обладает пониженным профилем токсичности in vivo по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 обладает пролонгированным временем полужизни в плазме по сравнению с
15 полипептидом IL-2 дикого типа.
В частности, мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, содержит четыре аминокислотные замены в положениях, соответствующих остаткам 3, 42, 45 и 72 человеческого IL-2. Конкретные аминокислотные замены представляют собой ТЗА, F42A, Y45A и L72G. Как продемонстрировано в
20 приведенных ниже примерах, указанный несущий четыре мутации
(четырехмутантный) полипепид IL-2 характеризуется не выявляемым уровнем связывания с CD25, пониженной способностью индуцировать апоптоз Т-клеток, пониженной способностью индуцировать передачу сигналов IL-2 в Тгеё-клетках и пониженным профилем токсичности in vivo. Однако он сохраняет способность
25 активировать передачу сигналов IL-2 в эффекторных клетках, индуцировать
пролиферацию эффекторных клеток и создание NK-клетками IFN-y в качестве вторичного цитокина.
Кроме того, указанный мутантный полипептид IL-2 обладает дополнительными предпочтительными свойствами, такими как пониженная
30 гидрофобность поверхности, хорошая стабильность и высокий выход
экспрессии, что описано в примерах. Неожиданно было установлено, что указанный мутантный полипептид IL-2 обладает также пролонгированным временем полужизни в сыворотке по сравнению с IL-2 дикого типа.
Мутанты IL-2, предлагаемые в изобретении, помимо наличия мутаций в области IL-2, которая образует поверхность раздела между IL-2 и CD25, или в сайте гликозилирования, могут иметь также одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности, расположенной вне указанных областей. 5 Такие дополнительные мутации в человеческом IL-2 могут обеспечивать
дополнительные преимущества, такие как повышенный уровень экспрессии или стабильности. Например, цистеин в положении 125 можно заменять на нейтральную аминокислоту, такую как серии, аланин, треонин или валин, получая C125S IL-2, С125А IL-2, С125Т IL-2 или C125V IL-2 соответственно,
10 что описано в U.S. № 4518584. Как описано в указанном документе можно также изымать путем делеции N-концевой остаток аланина IL-2, получая такой мутант как des-Al C125S или des-Al С125А. Альтернативно этому или в дополнение к этому, мутант IL-2 может включать мутацию, при которой метионин, присутствующий в норме в положении 104 человеческого IL-2 дикого типа,
15 заменен на нейтральную аминокислоту, такую как аланин (см. U.S. № 5206344). Образовавшиеся мутанты, например, des-Al М104А IL-2, des-Al М104А C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-Al M104A C125A IL-2 или M104A C125S IL-2 (эти и другие мутанты описаны в U.S. № 5116943 и у Weiger и др., Eur J Biochem 180, 1989, сс. 295-300), можно применять в сочетании с
20 конкретными мутациями IL-2, предлагаемыми в изобретении.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, содержит дополнительную аминокислотную мутацию в положении, соответствующем остатку 125 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления
25 изобретения указанная дополнительная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену С125А.
Специалисту в данной области очевидно, как определять, какие дополнительные мутации могут обеспечивать дополнительные преимущества для целей изобретения. Например, должно быть очевидно, что аминокислотные
30 мутации в последовательности IL-2, которые снижают или аннулируют
аффинность IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, такие как D20T, N88R или Q126D (см., например, U.S. 2007/0036752), могут оказаться
непригодными для включения в мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, содержит последовательность, выбранную из 5 группы, включающей SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 19. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, содержит последовательность SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 19. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в
10 изобретении, содержит SEQ ID NO: 19.
Мутантные полипептиды IL-2, предлагаемые в изобретении, наиболее целесообразно применять в контексте слитых белков IL-2, таких как несущие IL-2 иммуноконъюгаты. Такие слитые белки содержат мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, слитый с не-1Ь-2-фрагментом. He-IL-2-фрагмент
15 может представлять собой синтетический или встречающийся в естественных условиях белок или его часть или вариант. Примерами не-1Ь-2-фрагментов являются альбумин, домены антител, такие как Fc-домены или антигенсвязывающие домены иммуноглобулинов.
Несущие IL-2 иммуноконъюгаты представляют собой слитые белки,
20 содержащие антигенсвязывающий фрагмент и фрагмент, представляющий собой IL-2. Они существенно повышают эффективность терапии на основе IL-2 в результате направленного переноса IL-2, например, в микроокружение опухоли. Согласно изобретению антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой полное антитело или иммуноглобулин или его часть или вариант,
25 обладающий биологической функцией, такой как специфическая аффинность к связыванию антигена.
Преимущества терапии с использованием иммуноконъюгатов достаточно очевидны. Например, антигенсвязывающий фрагмент иммуноконъюгата распознает специфический для опухоли эпитоп, и это приводит к направленному
30 переносу молекулы иммуноконъюгата к области опухоли. При этом можно обеспечивать высокие концентрации IL-2 в микроокружения опухоли, что позволяет достигать активации и пролиферации различных иммунных эффекторных клеток, указанных в настоящем описании, при использовании
существенно более низкой дозы иммуноконъюгата, по сравнению с требуемой для неконъюгированного IL-2. Кроме того, указанное применение IL-2 в форме иммуноконъюгатов позволяет снижать дозы самого цитокина, ограничивая тем самым потенциальное проявление нежелательных побочных действий IL-2, а 5 направленный перенос IL-2 к специфической области в организме с помощью иммуноконъюгата может приводить также к снижению системной экспозиции и в результате к уменьшенным побочным воздействиям по сравнению с получаемыми при использовании неконъюгированного IL-2. Кроме того, удлинение времени полужизни иммуноконъюгата в циркуляторном русле по
10 сравнению с неконъюгированным IL-2 важно для эффективности иммуноконъюгата. Однако эта характеристика содержащих IL-2 иммуноконъюгатов может вновь усугублять потенциальные побочные действия молекулы IL-2: поскольку при существенно удлиненном времени полужизни циркулирующего в кровотоке иммуноконъюгата, содержащего IL-2,
15 относительно неконъюгированного IL-2 возрастает вероятность того, что IL-2 или другие компоненты молекулы слитого белка будут активировать компоненты, которые обычно присутствуют в сосудистой сети. Это относится также и к другим слитым белкам, которые содержат IL-2, слитый с другим фрагментом, таким как Fc или альбумин, приводящим к удлинению времени
20 полужизни IL-2 в циркуляторном русле. По этой причине иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, с пониженной токсичностью по сравнению с формами IL-2 дикого типа является наиболее предпочтительным.
Таким образом, изобретение относится также к мутантному полипептиду
25 IL-2, описанному выше, который сцеплен по меньшей мере с одним не-1Ь-2-фрагментом. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 и не-1Ь-2-фрагмент образуют слитый белок, т.е. мутантный полипептид IL-2 объединен пептидной связью с не-1Ь-2-фрагментом. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 сцеплен с
30 первым и вторым не-1Ь-2-фрагментом. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом, а второй антигенсвязывающий фрагмент объединен амино- или
карбоксиконцевой пептидной связью либо I) с мутантным полипептидом IL-2, либо II) с первым антигенсвязывающим фрагментом. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен карбоксиконцевой пептидной связью с указанным первым не-1Ь-2-фрагментом и 5 аминоконцевой пептидной связью с указанным вторым не-1Ь-2-фрагментом. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный не-1Ь-2-фрагмент представляет собой обеспечивающий направленный перенос фрагмент. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный не-1Ь-2-фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент (образуя, тем самым, 10 иммуноконъюгат с мутантным полипептидом IL-2, который описан более подробно ниже). В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения
антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полноразмерное антитело. В
15 одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу иммуноглобулина, в частности, молекулу иммуноглобулина класса IgG, более предпочтительно молекулу иммуноглобулина подкласса IgGi. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен аминоконцевой пептидной
20 связью с одной из тяжелых цепей иммуноглобулина. В другом варианте
осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и
25 вариабельную область легкой цепи антитела. В более конкретном варианте
осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab или молекулу scFv. В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab. В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент
30 представляет собой молекулу scFv. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент направлен к антигену, присутствующему на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антиген выбран из
группы, включающей белок активации фибробластов (FAP), А1-домен тенасцина-С (TNC А1), А2-домен тенасцина-С (TNC А2), экстра-домен В фибронектина (EDB), карциноэмбриональный антиген (СЕА) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP). Если мутантный 5 полипептид IL-2 сцеплен более чем с одним антигенсвязывающим фрагментом, например, первым и вторым антигенсвязывающим фрагментом, то каждый антигенсвязывающий фрагмент можно независимо выбирать из различных форм антител или фрагментов антител. Например, первый антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу Fab, а второй
10 антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу scFv. В
конкретном варианте осуществления изобретения каждый из указанных первого и второго антигенсвязывающего фрагмента представляет собой молекулу scFv или каждый из указанных первого и второго антигенсвязывающего фрагмента представляет собой молекулу Fab. В конкретном варианте осуществления
15 изобретения каждый из указанных первого и второго антигенсвязывающего фрагмента представляет собой молекулу Fab. Аналогично этому, если мутантный полипептид IL-2 сцеплен более чем с одним антигенсвязывающим фрагментом, например, первым и вторым антигенсвязывающим фрагментом, то антиген, к которому направлен каждый антигенсвязывающий фрагмент, можно
20 выбирать независимо друг от друга. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный первый и второй антигенсвязывающие фрагменты направлены к различным антигенам. В другом варианте осуществления изобретения указанный первый и второй антигенсвязывающие фрагмент направлены к одному и тому же антигену. Как описано выше, антиген
25 предпочтительно представляет собой антиген, присутствующий на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки, более предпочтительно антиген выбран из группы, включающей белок активации фибробластов (FAP), А1-домен тенасцина-С (TNC А1), А2-домен тенасцина-С (TNC А2), экстра-домен В фибронектина (EDB), карциноэмбриональный антиген (СЕА) и ассоциированный
30 с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP). Антигенсвязывающая
область может дополнительно включать любые особенности, индивидуально или в сочетании друг с другом, которые описаны касательно антигенсвязывающих доменов иммуноконъюгатов.
Иммуноконъюгаты
Конкретным объектом изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2, который несет одну или несколько аминокислотных мутаций, аннулирующих или снижающих аффинность мутантного полипептида 5 IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, и по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора
10 IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, находится в положении, выбранном из положения, соответствующего остатку 42, 45 и 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену. В одном из вариантов
15 осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация представляет
собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K, более конкретно, аминокислотную замену,
20 выбранную из группы, включающей F42A, Y45A и L72G. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 42 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей F42A, F42G,
25 F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R и F42. И в еще более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой F42A. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 45 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная
30 аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену,
выбранную из группы, включающей Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой Y45A. В следующем
варианте осуществления изобретения аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, 5 включающей L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения указанная аминокислотная замена представляет собой L72G. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении, не содержит аминокислотную мутацию в положении,
10 соответствующем остатку 38 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2, входящий в иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере первую и вторую аминокислотную мутацию, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к а-субъединице рецептора IL-2 и
15 сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные первая и вторая аминокислотные мутации находятся в двух положениях, выбранных из положений, которые соответствуют остаткам 42, 45 и 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления
20 изобретения указанные первая и вторая аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные первая и вторая аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены, выбранные из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T,
25 Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные первая и вторая аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены, выбранные из группы, включающей F42A, Y45A и L72G. Мутантный полипептид IL-2 может также включать любые особенности,
30 индивидуально или в сочетании, описанные в предыдущих параграфах
касательно мутантных полипептидов IL-2, предлагаемых в изобретении. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с указанным
антигенсвязывающим фрагментом, который входит в иммуноконъюгат, т.е. иммуноконъюгат представляет собой слитый белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах 5 осуществления изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. Антигенсвязывающая область может дополнительно включать любые особенности, индивидуально или в сочетании друг с другом, которые описаны 10 касательно антигенсвязывающих доменов. Форматы иммуноконъюгатов
Наиболее приемлемые форматы иммуноконъюгатов описаны в публикации РСТ WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Такие иммуноконъюгаты содержат по меньшей мере два
15 антигенсвязывающих домена. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере первый мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании, и по меньшей мере первый и второй антигенсвязывающие фрагменты. В конкретном варианте осуществления
20 изобретения указанные первый и второй антигенсвязывающие фрагменты независимо выбраны из группы, включающей молекулу Fv, в частности, молекулу scFv, и молекулу Fab. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный первый мутантный полипептид IL-2 объединен амино-или карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим
25 фрагментом, а второй антигенсвязывающий фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо I) с мутантным полипептидом IL-2, либо II) с первым антигенсвязывающим фрагментом. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат практически состоит из первого мутантного полипептида IL-2 и первого и второго антигенсвязывающих
30 фрагментов, сцепленных с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. Указанные форматы обладают преимуществом, заключающимся в том, что они связываются с высокой аффинностью с антигеном-мишенью (таким как опухолевый антиген), но характеризуются лишь
мономерным связыванием с рецептором IL-2, что позволяет избегать направленного переноса иммуноконъюгата к несущим рецептор IL-2 иммунным клеткам, расположенным в областях, отличных от сайта-мишени. В конкретном варианте осуществления изобретения первый мутантный полипептид IL-2 5 объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со вторым антигенсвязывающим фрагментом. В другом варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и
10 дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со вторым антигенсвязывающим фрагментом. В другом варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент объединен аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединен карбоксиконцевой пептидной связью со вторым антигенсвязывающим
15 фрагментом. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первой вариабельной областью тяжелой цепи и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью тяжелой цепи. В другом варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-
20 2 объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первой вариабельной
областью легкой цепи и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью легкой цепи. В другом варианте осуществления изобретения первая вариабельная область тяжелой или легкой цепи сцеплена карбоксиконцевой пептидной связью с первым мутантным
25 полипептидом IL-2 и дополнительно сцеплена аминоконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью тяжелой или легкой цепи. В другом варианте осуществления изобретения первая вариабельная область тяжелой или легкой цепи сцеплена аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно сцеплена карбоксиконцевой пептидной
30 связью со второй вариабельной областью тяжелой или легкой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью первого Fab и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью с тяжелой или
легкой цепью второго Fab. В другом варианте осуществления изобретения тяжелая или легкая цепь первого Fab объединена карбоксиконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединена аминоконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью второго Fab. В 5 другом варианте осуществления изобретения тяжелая или легкая цепь первого Fab объединена аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединена карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью второго Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере первый
10 мутантный полипептид IL-2, объединенный аминоконцевой пептидной связью с одной или несколькими молекулами scFv, и дополнительно объединенный карбоксиконцевой пептидной связью с одной или несколькими молекулами scFv.
Другие наиболее приемлемые форматы иммуноконъюгатов содержат молекулу иммуноглобулина в качестве антигенсвязывающего фрагмента. В
15 одном из таких вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат
содержит по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании, и молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу IgG, более предпочтительно молекулу IgGi. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит не более одного мутантного
20 полипептида IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуноглобулина представляет собой человеческий иммуноглобулин. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с молекулой иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат практически
25 состоит из мутантного полипептида IL-2 и молекулы иммуноглобулина, в частности молекулы IgG, более предпочтительно молекулы IgGi, которые сцеплены с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 сцеплен на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой
30 аминокислотой одной из тяжелых цепей иммуноглобулина. В конкретных
вариантах осуществления изобретения молекула иммуноглобулина содержит в Fc-домене модификацию, усиливающую гетеродимеризацию двух неидентичных тяжелых цепей иммуноглобулина. Сайт наиболее сильного белок-белкового
взаимодействия двух полипептидных цепей Fc-домена человеческого IgG находится в СНЗ-домене Fc-домена. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения указанная модификация находится в СНЗ-домене Fc-домена. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная 5 модификация представляет собой модификацию типа "knob-in-hole" (типа "выступ-впадина"), которая включает модификацию, приводящую к образованию выступа в одной из тяжелых цепей иммуноглобулина, и модификацию, приводящую к образованию впадины в другой одной из тяжелых цепей иммуноглобулина. Технология "knob-into-hole" описана, например, в U.S.
10 № 5731168; U.S. № 7695936; у Ridgway и др., Prot Eng 9, 1996, сс. 617-621 и Carter, J Immunol Meth 248, 2001, сс. 7-15). В целом, метод включает интродукцию выпуклости ("выступ") на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости ("впадина") на поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость,
15 усиливая таким образом образование гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости создают путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного размера с
20 выпуклостями создают на поверхности раздела второго полипептида путем
замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин). Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза или
25 посредством синтеза пептидов. В конкретном варианте осуществления
изобретения модификация, приводящая к получению "выступа", представляет собой аминокислотную замену T366W в одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина, а модификация, приводящая к получению "впадины", представляет собой аминокислотные замены T366S, L368A и Y407V в другой
30 одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина. В более конкретном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая модификацию, приводящую к получению "выступа", дополнительно содержит аминокислотную замену S354C, а тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая
модификацию, приводящую к получению "впадины", дополнительно содержит аминокислотную замену Y349C. Интродукция этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя тяжелыми цепями, дополнительно стабилизирующего димер (Carter, J Immunol Methods 5 248, 2001, сс. 7-15).
В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 сцеплен с карбоксиконцевой аминокислотой тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей модификацию, приводящую к получению "выступа".
10 В альтернативном варианте осуществления изобретения модификация,
усиливающая гетеродимеризацию двух неидентичных полипептидных цепей, представляет собой модификацию, опосредующую определяемые электростатическим действием воздействия, например, описанные в публикации РСТ WO 2009/089004. В целом, указанный метод включает замену одного или
15 нескольких аминокислотных остатков на поверхности раздела двух
полипептидных цепей на заряженные аминокислотные остатки, в результате чего образование гомодимера становится электростатически невыгодным, а гетеродимеризация становится электростатически выгодной. Fc-домен придает иммуноконъюгату предпочтительные
20 фармакокинетически свойства, включая удлиненное время полужизни в сыворотке, что обусловливает достаточное накопление в ткани-мишени и предпочтительное соотношение распределения в ткани-крови. Однако в то же время это может приводить к нежелательному направленному переносу иммуноконъюгата к клеткам, экспрессирующим Fc-рецепторы, а не к
25 предпочтительным несущим антиген клеткам. Кроме того, совместная активация путей передачи сигналов Fc-рецептора может приводить к высвобождению цитокинов, которые в сочетании с полипептидом IL-2 и имеющим продолжительное время полужизни иммуноконъюгатом, приводят к избыточной активации рецепторов цитокинов и приводит к серьезным побочным действиям
30 при системном введении. В соответствии с этим описано, что с
иммуноконъюгатами, содержащими канонический IgG-IL-2, связаны реакции на инфузию (см., например, King и др., J Clin Oncol 22, 2004, сс. 4463-4473)).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу иммуноглобулина, которая входит в иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, создают так, чтобы она обладала пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором. В одном из таких вариантов осуществления 5 изобретения иммуноглобулин содержит в его Fc-домене одну или несколько аминокислотных мутаций, которые снижают аффинность связывания иммуноконъюгата с Fc-рецептором. Как правило, одна или несколько одинаковых аминокислотных мутаций присутствуют в каждой из двух тяжелых цепей иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения
10 указанные аминокислотные мутации снижают аффинность связывания
иммуноконъюгата с Fc-рецептором по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. Согласно вариантам осуществления изобретения, в которых имеет место более одной аминокислотной мутации, которые снижают аффинность связывания иммуноконъюгата с Fc-рецептором,
15 комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз или по меньшей мере в 50 раз. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, содержащий сконструированную молекулу иммуноглобулина, характеризуется менее чем 20%, в частности, менее
20 чем 10%, более предпочтительно менее чем 5% от аффинности связывания с Fc-рецептором, характерной для иммуноконъюгата, содержащего несконструированную молекулу иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор
25 представляет собой Fcy-рецептор, более конкретно FcyRIIIa-, FcyRI- или
FcyRIIa-рецептор. Предпочтительно уменьшается связывание с каждым из этих рецепторов. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения снижается также аффинность связывания с компонентом системы комплемента, в частности, аффинность связывания с Clq. Согласно одному из вариантов
30 осуществления изобретения не снижается аффинность связывания с
неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Практически такое же связывание с FcRn, т.е. сохранение аффинности связывания иммуноглобулина с указанным рецептором, достигается, когда иммуноглобулин (или иммуноконъюгат,
содержащий указанный иммуноглобулин) характеризуется аффинностью связывания с FcRn, составляющей более чем примерно 70% от аффинности связывания с FcRn несконструированной формы иммуноглобулина (или иммуноконъюгата, содержащего несконструированную форму 5 иммуноглобулина). Иммуноглобулины или иммуноконъюгаты, содержащие указанные иммуноглобулины, могут характеризоваться аффинностью, составляющей более чем примерно 80% и даже более чем примерно 90% от указанной выше аффинности. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену. В одном
10 из вариантов осуществления изобретения иммуноглобулин содержит
аминокислотную замену в положении Р329 тяжелой цепи иммуноглобулина (нумерация по Кэботу). В более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой Р329А или P329G, в частности P329G. В одном из вариантов осуществления изобретения
15 иммуноглобулин содержит дополнительную аминокислотную замену в
положении, выбранном из S228, Е233, L234, L235, N297 и Р331 тяжелой цепи иммуноглобулина. В более конкретном варианте осуществления изобретения дополнительная аминокислотная замена представляет собой S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В конкретном варианте
20 осуществления изобретения иммуноглобулин содержит аминокислотные замены в положениях Р329, L234 и L235 тяжелой цепи иммуноглобулина. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноглобулин содержит аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G (LALA P329G). Такая комбинация аминокислотных замен практически полностью аннулирует
25 связывание с F су-рецептором молекулы человеческого IgG и в результате снижает эффекторную функцию, включая антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC).
В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит один или несколько сайтов протеолитического расщепления,
30 локализованных между мутантным полипептидом IL-2 и антигенсвязывающими фрагментами.
Компоненты иммуноконъюгата (например, антигенсвязывающие фрагменты и/или мутантный полипептид IL-2) могут быть сцеплены
непосредственно или через различные линкеры, в частности, пептидные линкеры, содержащие одну или несколько аминокислот, как правило, примерно 2-20 аминокислот, которые представлены в настоящем описании или известны в данной области. Приемлемыми неиммуногенными линкерными пептидами 5 являются, например, линкерные пептиды (G4S)n, (SGzOn или G^SGzOn, в которых п обозначает число, как правило, от 1 до 10, как правило, от 2 до 4. Антигенсвязывающие фрагменты
Антигенсвязывающий фрагмент иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, как правило, представляет собой молекулу полипептида, которая
10 связывается со специфической антигенной детерминантой и обладает
способностью направлять субстанцию, с которой она соединена (например, мутантный полипептид IL-2 или второй антигенсвязывающий фрагмент) к сайту-мишени, например, к конкретному типу опухолевой клетки или стромы опухоли, которая несет антигенную детерминанту. Иммуноконъюгат может связываться с
15 антигенной детерминантой, например, присутствующей на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности других больных клеток, находящейся в свободном состоянии в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ЕСМ).
Примерами опухолевых антигенов являются (но не ограничиваясь только
20 ими) MAGE, MART-l/Melan-A, gplOO, дипептидилпептидаза IV (DPPIV), белок, связывающий аденозиндеаминазу (ADAbp), циклофилин Ь, антиген, ассоциированный с колоректальным раком (CRC)-C017-1 A/GA733, карциноэмбриональный антиген (СЕА) и его иммуногенные эпитопы САР-1 и САР-2, etv6, amll, простатический антиген (PSA) и его иммуногенные эпитопы
25 PSA-1, PSA-2 и PSA-3, простатический специфический мембранный антиген (PSMA), Т-клеточный рецептор/СОЗ-зета-цепь, семейство MAGE опухолевых антигенов (например, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-А10, MAGE-A11, MAGE-А12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-ХрЗ (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4),
30 MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), семейство GAGE
опухолевых антигенов (например, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), В AGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, тирозиназа, p53, семейство MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a
фетопротеин, Е-кадхерин, а-катенин, Р-катенин и у-катенин, pl20ctn, gplOO Pmelll7, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, белок аденоматозного полипоза coli (АРС), фодрин, коннексин 37, Ig-идиотип, р15, gp75, ганглиозиды GM2 и GD2, вирусные продукты, такие как белки человеческого вируса папилломы, семейство Smad опухолевых антигенов, lmp-1, PI А, кодируемый EBV ядерный антиген (EBNA)-l, гликогенфосфолипаза головного мозга, SSX-1, SSX-2 (НОМ-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 и СТ-7 и с-егЬВ-2.
Примерами вирусных антигенов являются (но не ограничиваясь только ими) гемагглютинин вируса гриппа, LMP-1 вируса Эпштейна-Барра, гликопротеин вируса гепатита С Е2, gpl60 ВИЧ, и gpl20 ВИЧ.
Примерами антигенов ЕСМ являются (но не ограничиваясь только ими) синдекан, гепараназа, интегрины, остеопонтин, белки семейства link, кадхерины, ламинин, ламинин типа EGF, лектин, фибронектин, белки семейства notch, тенасцин и матриксин.
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно связывать со следующими специфическими антигенами клеточной поверхности, включающими (но не ограничиваясь только ими): FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (поверхностный антиген Т-клеток), CD3 (гетеромультимер, ассоциированный с TCR), CD22 (В-клеточный рецептор), CD23 (низкоаффинный IgE-рецептор), CD30 (цитокиновый рецептор ), CD33 (поверхностный антиген клеток миелоидного ряда), CD40 (рецептор фактора некроза опухолей), IL-6R (1Ь6-рецептор), CD20, MCSP и PDGFPR (рецептор тромбоцитарного фактора роста Р).
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, где каждый из этих антигенсвязывающих фрагментов специфически связывается с одной и той же антигенной детерминантой. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, содержит два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, где каждый из этих антигенсвязывающих фрагментов специфически связывается с различными антигенными детерминантами.
Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело любого типа или его фрагмент, который сохраняет специфичность связывания с
антигенной детерминантой. Фрагменты антитела включают (но не ограничиваясь только ими) Ун-фрагменты, Уь-фрагменты, Fab-фрагменты, Р(аЬ')2-фрагменты, scFv-фрагменты, Fv-фрагменты, минитела (минибоди), димерные антитела, тримерные антитела и тетрамерные антитела (см., например, Hudson и Souriau, 5 Nature Med 9, 2003, сс. 129-134).
Наиболее приемлемые антигенсвязывающие фрагменты описаны в публикации РСТ WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат
10 содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими для экстра-домена В фибронектина (EDB). В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые могут
15 конкурировать с моноклональным антителом L19 за связывание с эпитопом EDB (см., например, публикацию РСТ WO 2007/128563 А1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, полученного из
20 моноклонального антитела L19, объединена карбоксиконцевой пептидной
связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, полученного из моноклонального антитела L19. В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в
25 которой легкая цепь первого Fab, полученного из моноклонального антитела L19, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, полученного из моноклонального антитела L19. В следующем варианте осуществления изобретения
30 иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой первый scFv, полученный из моноклонального антитела L19, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который
в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью со вторым scFv, полученным из моноклонального антитела L19.
В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность SEQ ID NO: 199 или ее вариант, 5 который сохраняет функциональность. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит легкую цепь Fab, полученного из моноклонального антитела L19. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
10 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 201 или ее варианту, который сохраняет функциональность. В еще одном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 201 или их вариантам, которые
15 сохраняют функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидным мостиком.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере один, как правило, два
20 или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими в отношении А1-домена тенасцина (TNC-A1). В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые могут конкурировать с моноклональным антителом F16 за
25 связывание с эпитопом TNC-A1 (см., например, публикацию РСТ WO
2007/128563 А1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими в
30 отношении А1- и/или А4-домена тенасцина (TNC-A1 или TNC-A4, или TNC-А1/А4). В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении А1-домена тенасцина, объединена
карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении А1-домена тенасцина. В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит 5 полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении А1-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении А1-домена тенасцина. В следующем
10 варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
полипептидную последовательность, в которой первый scFv, специфический в отношении А1-домена тенасцина, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью со вторым scFv, специфическим в
15 отношении А1-домена тенасцина. В другом варианте осуществления
изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении TNC-A1, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
20 В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие
фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 33, либо SEQ ID NO: 35 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом
25 варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты
иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 29, либо SEQ ID NO: 31 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В более конкретном варианте
30 осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 33, либо SEQ ID NO: 35 или их вариантам,
сохраняющим функциональность, и последовательность вариабельной области
легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 29, либо SEQ ID NO: 31
или их вариантам, сохраняющим функциональность.
5 В другом конкретном варианте осуществления изобретения
последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо SEQ ID NO: 34, либо SEQ ID NO:
10 36. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения
последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 34, либо SEQ ID NO: 36. В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность
15 вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов
иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 32. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области
20 легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется
полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 32.
В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере
25 примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична
SEQ ID NO: 203 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
30 идентична либо SEQ ID NO: 205, либо SEQ ID NO: 215 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере
примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 207, либо SEQ ID NO: 237 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит две 5 полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 205 и SEQ ID NO: 207 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит две полипептидные
10 последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 215 и SEQ ID NO: 237 или их вариантам, сохраняющим функциональность.
В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной
15 последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 204. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 204. В другом конкретном варианте
20 осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную
последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% идентична либо SEQ ID NO: 206, либо SEQ ID NO: 216. В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
25 полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной
последовательностью либо SEQ ID NO: 206, либо SEQ ID NO: 216. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
30 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо SEQ ID NO: 208, либо SEQ Ш NO: 238. Еще в одном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 208, либо SEQ ID NO: 238.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими в отношении А2-домена тенасцина (TNC-A2). В другом варианте осуществления 5 изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении А2-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении
10 А2-домена тенасцина. В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении А2-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с
15 легкой цепью второго Fab, специфического в отношении А2-домена тенасцина. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении TNC-A2, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
20 В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие
фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ
25 ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID N0:175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 187, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
30 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID N0:165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 и SEQ ID NO: 185, или их вариантам, сохраняющим
функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% 5 идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID N0:175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 187, или их вариантам, сохраняющим функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,
10 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID N0:165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 и SEQ ID NO: 185 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения
15 последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID
20 NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 и SEQ ID NO: 188. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ
25 ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 и SEQ ID NO: 188. В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на
30 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности,
выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 и SEQ ID NO: 186. Еще в одном конкретном варианте
осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 5 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 и SEQ ID NO: 186.
В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержат полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
10 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы,
включающей SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 и SEQ ID NO: 245, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержат полипептидную последовательность, которая по меньшей мере
15 примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична
последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 и SEQ ID NO: 251, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержат полипептидную
20 последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 и SEQ ID NO: 245, или их вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
25 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 и SEQ ID NO: 251, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит две полипептидные последовательности,
30 которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 241 и либо SEQ ID NO: 249, либо SEQ ID NO: 251, или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат,
предлагаемый в настоящем изобретении, содержит две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 243 и либо SEQ ID NO: 247, либо SEQ ID NO: 249, или их вариантам, сохраняющим 5 функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 245 и SEQ ID NO: 247, или их вариантам, сохраняющим функциональность.
10 В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат
содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 246. В
15 другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат
содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 246. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность,
20 кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 и SEQ ID NO: 252. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность,
25 кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 и SEQ ID NO: 252.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один, как правило, два или более количество антигенсвязывающих фрагментов, специфических в отношении фибробласт-
30 активирующего белка (FAP). В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении FAP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который
в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении FAP. В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в 5 отношении FAP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении FAP. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина,
10 специфического в отношении FAP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
15 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ
20 ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 и SEQ ID NO: 155, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат
25 последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO:
30 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 и SEQ ID
NO: 153, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 5 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ
10 ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 и SEQ ID NO: 155, или их вариантам, сохраняющим функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
15 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы,
включающей: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:
20 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 и SEQ ID NO: 153, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат
25 последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 41 и
последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 39. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 51 и последовательность вариабельной области легкой цепи
30 SEQ ID NO: 49. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 111 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 109. В
одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 143 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 141. В одном из вариантов осуществления 5 изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 151 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 149.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих
10 фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной
последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID
15 NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 и SEQ ID NO: 156. В следующем конкретном варианте
20 осуществления изобретения последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76,
25 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 и SEQ ID NO: 156. В другом конкретном варианте осуществления изобретения
30 последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из
группы, включающей: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID N0:58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ 5 ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 и SEQ ID NO: 154. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется
10 полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID N0:58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO:
15 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 и SEQ ID NO: 154.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную
20 последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 и SEQ ID NO: 229, или их вариантам, сохраняющим
25 функциональность. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 231, SEQ
30 ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 и SEQ ID NO: 239, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 219 или их вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 233 или ее 5 вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO:
10 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 и SEQ ID NO: 229, или их вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 231 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном
15 варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в
настоящем изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 213 и SEQ ID NO: 235 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте
20 осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем
изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 217 и SEQ ID NO: 239 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления
25 изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении,
содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 233 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления
30 изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении,
содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 221 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим
функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны 5 SEQ ID NO: 223 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны
10 SEQ ID NO: 225 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны
15 SEQ ID NO: 227 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим
функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны
20 SEQ ID NO: 229 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны
25 SEQ ID NO: 211 и SEQ ID NO: 233 или их вариантам, сохраняющим функциональность.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
30 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301 и SEQ ID NO: 315, или их вариантам, сохраняющим функциональность. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в
изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303 и SEQ ID NO: 317, или их вариантам, сохраняющим 5 функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 297 или ее варианту, сохраняющему функциональность, полипептидную последовательность, которая
10 по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 299 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 233 или ее варианту, сохраняющему функциональность.
15 В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 301 или ее варианту, сохраняющему функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей
20 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична SEQ ID NO: 303 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 231 или ее варианту, сохраняющему функциональность. В следующем конкретном
25 варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 315 или ее варианту, сохраняющему функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на
30 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 317 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 233 или ее варианту, сохраняющему функциональность.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую 5 полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID N0: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 и SEQ ID NO: 230. В следующем конкретном
10 варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 и SEQ ID NO: 230. В другом
15 конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 и SEQ
20 ID NO: 240. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 и SEQ ID NO: 240. В другом конкретном варианте осуществления изобретения
25 иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую
полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 и SEQ ID NO: 316. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения
30 иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 и SEQ ID NO: 316. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 и SEQ ID NO: 318. В 5 следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 и SEQ ID NO: 318.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат
10 содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, специфических в отношении ассоциированного с меланомой хондроитинсульфат-протеогликана (MCSP). В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab,
15 специфического в отношении MCSP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении MCSP. В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в
20 которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении MCSP,
объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении MCSP. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
25 полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении MCSP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной
30 области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 189, либо последовательности SEQ ID NO: 193 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления
изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 191, либо последовательности 5 SEQ ID NO: 197 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо последовательности SEQ ID
10 NO: 189, либо последовательности SEQ ID NO: 193 или их вариантам,
сохраняющим функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 191, либо последовательности SEQ ID NO: 197 или их вариантам, сохраняющим
15 функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 189, и последовательность
20 вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 191. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей
25 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 193, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 191.
30 В другом конкретном варианте осуществления изобретения
последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 190, либо последовательности SEQ ID NO: 194. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется 5 полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 190, либо SEQ ID NO: 194. В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%,
10 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 192, либо последовательности SEQ ID NO: 198. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 192, либо SEQ ID
15 NO: 198.
В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 253, либо SEQ ID NO: 257 или их
20 вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 255, либо SEQ ID NO: 261 или их вариантам, сохраняющим
25 функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 253, либо SEQ ID NO: 257 или их вариантам, сохраняющим функциональность, и
30 полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична либо SEQ ID NO: 255, либо SEQ ID NO: 261 или их вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат,
предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 253 или ее вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей 5 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична SEQ ID NO: 255 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
10 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 257 или ее вариантам, сохраняющим
функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 255 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения
15 иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую
полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 254, либо последовательности SEQ ID NO: 258. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения
20 иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 254, либо SEQ ID NO: 258. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на
25 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична либо
последовательности SEQ ID NO: 256, либо последовательности SEQ ID NO: 262. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 256, либо SEQ ID
30 NO: 262.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один, как правило, два или большее количество
антигенсвязывающих фрагментов, специфических в отношении карциноэмбрионального антигена (СЕА).
В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, 5 специфического в отношении СЕА, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении СЕА. В следующем варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, в
10 которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении СЕА,
объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который в свою очередь объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении СЕА. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
15 полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении СЕА, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей
20 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична последовательности SEQ ID NO: 313 или ее варианту, сохраняющему функциональность. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей
25 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична последовательности SEQ ID NO: 311 или ее варианту, сохраняющему функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей
30 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична последовательности SEQ ID NO: 313 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 311 или ее варианту, сохраняющему функциональность.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих 5 фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной
последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 314. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих
10 фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной
последовательностью SEQ ID NO: 314. В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на
15 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности
SEQ ID NO: 312. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 312.
20 В другом конкретном варианте осуществления изобретения
иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 319 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. В следующем
25 конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат,
предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 321 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. В следующем конкретном варианте
30 осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 323 или ее вариантам, сохраняющим
функциональность. В более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична 5 последовательности SEQ ID NO: 319 или ее вариантам, сохраняющим
функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 319 или ее вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей
10 мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична последовательности SEQ ID NO: 323 или ее вариантам, сохраняющим функциональность.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую
15 полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 320. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 320. В другом конкретном
20 варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит
полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 322. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат
25 содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 322. В другом конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или
30 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 324. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 324.
Антигенсвязывающие фрагменты, предлагаемые в изобретении, включают фрагменты, имеющие последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны пептидным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 23-261 (нечетные номера), 5 297-303 (нечетные номера), 311 и 313, включая их функциональные фрагменты или варианты. Изобретение относится также к антигенсвязывающим фрагментам, содержащим последовательности SEQ ID NO: 23-261 (нечетные номера), 297-303 (нечетные номера), 311 и 313 с консервативными аминокислотными заменами. 10 Полинуклеотиды
Изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, кодирующим мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2, которые представлены в настоящем описании.
Полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении, включают полинуклеотиды, 15 которые по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентичны последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24-262 (четные номера), 293296 и 298-324 (четные номера), включая их функциональные фрагменты или варианты.
20 Полинуклеотиды, кодирующие мутантные полипептиды IL-2, не
сцепленные с не-1Ь-2-фрагментом, как правило, экспрессируются в виде индивидуального полинуклеотида, кодирующего полный полипептид.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий мутантный полипептид IL-2, где
25 полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует
последовательность SEQ ID NO: 7, 11, 15 или 19 мутантного IL-2. Изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, кодирующему мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует последовательность SEQ ID NO: 7, 11, 15 или 19 мутантного IL-2 с
30 консервативными аминокислотными заменами.
Другим вариантом осуществления изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID 5 NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ
10 ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит нуклеотидную
15 последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:
20 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296. Другим вариантом
осуществления изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID
25 NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296.
Полинуклеотиды, кодирующие иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, могут экспрессироваться в виде индивидуального полинуклеотида, который кодирует полный иммуноконъюгат, или в виде нескольких (например,
30 двух или нескольких) полинуклеотидов, которые экспрессируются совместно. Полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые совместно экспрессируются, могут быть связаны посредством, например, дисульфидных мостиков или других средств, с образованием функционального
иммуноконъюгата. Например, область тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть иммуноконъюгата, содержащую область легкой цепи антигенсвязывающего фрагмента и мутантный полипептид IL-2. При совместной 5 экспрессии полипептиды тяжелой цепи должны быть ассоциированы с
полипептидами легкой цепи с образованием антигенсвязывающего фрагмента. Альтернативно этому, в другом примере область легкой цепи антигенсвязывающего фрагмента может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть иммуноконъюгата,
10 содержащую область тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента и
мутантный полипептид IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует фрагмент иммуноконъюгата, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления
15 изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует тяжелую цепь антигенсвязывающего фрагмента и мутантный полипептид IL-2. В другом варианте осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует легкую цепь антигенсвязывающего фрагмента и мутантный полипептид IL-2.
20 В конкретном варианте осуществления изобретения выделенный
полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует фрагмент иммуноконъюгата, содержащий по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2, и по меньшей мере один, предпочтительно два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, где первый мутантный полипептид IL-2
25 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с первым
антигенсвязывающим фрагментом, а второй антигенсвязывающий фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо с первым мутантным полипептидом IL-2, либо с первым антигенсвязывающим фрагментом. В одном из вариантов осуществления изобретения
30 антигенсвязывающие фрагменты независимо друг от друга выбраны из группы, включающей молекулу Fv, в частности, молекулу scFv, и молекулу Fab. В другом конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид кодирует тяжелые цепи двух антигенсвязывающих фрагментов и один
мутантный полипептид IL-2. В другом конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид кодирует легкие цепи двух антигенсвязывающих фрагментов и один мутантный полипептид IL-2. В другом конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид кодирует одну легкую цепь одного 5 из антигенсвязывающих фрагментов, одну тяжелую цепь второго
антигенсвязывающего фрагмента и один мутантный полипептид IL-2.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид кодирует тяжелые цепи двух
10 молекул Fab и мутантный полипептид IL-2. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид кодирует легкие цепи двух молекул Fab и мутантный полипептид IL-2. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенный полинуклеотид,
15 предлагаемый в изобретении, кодирует фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид кодирует тяжелую цепь одной молекулы Fab, легкую цепь другой молекулы Fab и мутантный полипептид IL-2.
В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует иммуноконъюгат,
20 содержащий по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2, сцепленный с
помощью его амино- и карбоксиконцевых аминокислот с одной или несколькими молекулами scFv.
В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует фрагмент
25 иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина, предпочтительно молекулы IgG, более предпочтительно молекулы IgGi, и мутантный полипептид IL-2. В более конкретном варианте осуществления изобретения выделенный полинуклеотид кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина и мутантный полипептид IL-2, где мутантный
30 полипептид IL-2 объединен аминоконцевой пептидной связью с тяжелой цепью иммуноглобулина.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат или его фрагмент,
где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует последовательность вариабельной области, представленную в SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 5 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 или 313. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит 10 последовательность, которая кодирует полипептидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217,
219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251,
253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 или 323. Другим
вариантом осуществления настоящего изобретения является также выделенный
15 полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат или его фрагмент, где
полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76,
20 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, ПО, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218,
220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252,
25 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 3 12, 314, 316, 318, 320, 322 или 324.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 30 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, ПО, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206,
208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 или 324. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий 5 иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит
последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,
10 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 или 313. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий
15 иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит
последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243,
20 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 или 323. Изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, кодирующему иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует последовательности вариабельной области SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55,
25 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 или 313 с консервативными аминокислотными заменами. Изобретение относится
30 также к выделенному полинуклеотиду, кодирующему иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует полипептидные последовательности SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243,
245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 или 323 с консервативными аминокислотными заменами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В других вариантах 5 осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Методы рекомбинации
10 Мутантные полипептиды IL-2, предлагаемые в изобретении, можно
получать путем делеции, замены, инсерции или модификации с использованием генетических или химическим методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайтспецифический мутагенез кодирующей последовательности ДНК, ПНР, синтез генов и т.п. Правильность
15 нуклеотидных изменений можно подтверждать, например, с помощью секвенирования. Для этой цели можно применять нуклеотидную последовательность нативного IL-2, описанную у Taniguchi и др., (Nature 302, 1983, сс. 305-310), и нуклеиновую кислоту человеческого IL-2, доступную из публичных депозитариев, таких как Американская коллекция типовых культур
20 (Роквилл, шт. Мэриленд). Последовательность нативного человеческого IL-2 представлена в SEQ ID NO: 1. Замена или инсерция может включать встречающиеся в естественных условиях, а также не встречающиеся в естественных условиях аминокислотные остатки. Аминокислотная модификация включает хорошо известные методы химической модификации, такие как
25 дополнительное введение сайтов гликозилирования или присоединения углеводов и т.п.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно получать, например, путем твердофазного пептидного синтеза или методом рекомбинации. Для рекомбинантного получения один или 30 несколько полинуклеотидов, кодирующих мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат (фрагмент), например, описанный выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дополнительного клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанный полинуклеотид легко выделять и
секвенировать с помощью общепринятых процедур. Одним из вариантов осуществления изобретения является вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Методы, хорошо известные специалистам в данной области, можно 5 применять для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата (фрагмента) наряду с приемлемыми контролирующими транскрипцию/трансляцию сигналами. Эти методы включают технологии рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и рекомбинации/генетической
10 рекомбинации in vivo (см., например, методы, описанные у Maniatis и др.,
Maniatis и др., Molecular Cloning A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; и Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Экспрессионный вектор может представлять собой часть плазмиды, вируса или
15 может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий мутантный IL-2 или иммуноконъюгат (фрагмент) (т.е. кодирующую область), клонируют с обеспечением функциональной связи с промотором и/или другими элементами, контролирующими транскрипцию или трансляцию. В контексте
20 настоящего описания "кодирующая область" представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он, в случае его присутствия, может рассматриваться как часть кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности,
25 например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и З'-нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или большее количество кодирующих областей может присутствовать в индивидуальной полинуклеотидной конструкции, например, индивидуальном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях,
30 например, отдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или большее количество кодирующих областей, например, вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, может кодировать один или несколько полипротеинов, которые
пост- или котранляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, предлагаемый/предлагаемая в изобретении, может кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с 5 первым или вторым полинуклеотидом, который кодирует полипептиды, предлагаемые в изобретении, их или варианты или производные. Гетерологичные кодирующие области включают (но не ограничиваясь только ими) специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
10 Функциональная связь имеет место, когда кодирующая область генного
продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под воздействием или контролем регуляторной(ых) последовательности(ей). Два ДНК-фрагмента (таких как кодирующая область
15 полипептида и ассоциированный с ней промотор) являются "функционально связанными", если индукция промоторной функции приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя ДНК-фрагментами не оказывает воздействия на способность регулирующих экспрессию последовательностей направлять экспрессию генного
20 продукта, или не оказывает воздействия на способность ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область должна быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор обладает способностью осуществлять транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический для клетки
25 промотор, который обеспечивает значительную транскрипцию ДНК только в предварительно отобранных клетках. Другие контролирующие транскрипцию элементы, помимо промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, можно функционально связывать с полинуклеотидом для обеспечения специфической для клетки транскрипции.
30 Приемлемые промоторы и другие контролирующие транскрипцию области
представлены в настоящем описании. Специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих транскрипцию областей. Они включают (но не ограничиваясь только ими) контролирующие транскрипцию области,
которые функционируют в клетках позвоночных животных, такие как (но не ограничиваясь только ими) сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном -А), обезьяньего вируса 40 (например, ранний промотор) и 5 ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контролирующие
транскрипцию области включают области, выведенные из генов позвоночных животных, таких как ген актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и кроличьего Р-глобина, а также другие последовательности, которые могут контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные
10 приемлемые контролирующие транскрипцию области включают
тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклином). Аналогично этому, обычным специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих трансляцию элементов. Они включают (но не ограничиваясь
15 только ими) сайты связывания рибосом, кодоны инициации трансляции и терминирующие кодоны и элементы, выведенные из вирусных систем (в частности внутренний сайт связывания (посадки) рибосом или IRES, который обозначают также как CITE-последовательность). Кассета экспрессии может включать также другие характерные структуры, такие как сайт инициации
20 репликации и/или интегрированные в хромосому элементы, такие как длинные
концевые повторы (LTR) ретровирусов, или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).
Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть ассоциированы с
25 дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом, предлагаемым в настоящем изобретении. Например, если требуется секреция мутантного полипептида IL-2, то ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, можно помещать против хода транскрипции
30 относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелые аминокислоты
мутантного IL-2. Этот же поход применим к иммуноконъюгатам, предлагаемым в изобретении, или их фрагментам. Согласно гипотезе, касающейся сигналов, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или
секреторную лидерную последовательность, который/которая отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Обычным специалистам в данной области должно быть очевидно, что полипептиды, секретируемые клетками 5 позвоночных животных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с образованием секретируемой или "зрелой" формы полипептида. Например, человеческий IL-2 транслируется с состоящей из 20 аминокислот сигнальной последовательностью на N-конце полипептида, которая затем отщепляется с
10 образованием зрелого состоящего из 133 аминокислот человеческого IL-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид IL-2 или сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное указанной последовательности, которое сохраняет способность
15 обеспечивать секрецию полипептида, функционально связанного с ним.
Альтернативно этому, можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменять на лидерную последовательность человеческого тканевого активатора плазминогена (TPА)
20 или мышиной Р-глюкуронидазы. Примеры аминокислотных и полинуклеотидных последовательностей секреторных сигнальных пептидов представлены в SEQ ID NO: 236-273.
ДНК, кодирующую короткую белковую последовательность, которую можно применять для облегчения дальнейшей очистки (например, гистидиновую
25 метку), или предназначенную для мечения мутантного IL-2 или
иммуноконъюгата, можно включать внутрь или на концы полинуклеотида, кодирующего мутантный IL-2 или иммуноконъюгат (фрагмент).
Дополнительным вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в
30 изобретении. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько векторов, предлагаемых в изобретении. Полинуклеотиды и векторы могут обладать любыми особенностями, индивидуально или в сочетании, указанными в настоящем
описании касательно полинуклеотидов и векторов соответственно. В одном из таких вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит (например, трансформирована или трансфектирована) вектором, содержащим полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении. В контексте настоящего описания понятие "клетка-хозяин" относится к любому типу клеточной системы, которую можно конструировать для получения мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, и их фрагментов. Клетки-хозяева, пригодные для репликации и для поддержания экспрессии мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, хорошо известны в данной области. Такие клетки можно трансфектировать или трансдуцировать соответствующим образом конкретным экспрессионным вектором и можно выращивать большее количество содержащих вектор клеток с целью внесения в ферментеры для крупномасштабных процессов получения мутанта IL-2 или иммуноконъюгата в достаточных для клинических применений количествах. Приемлемыми клетками-хозяевами являются прокариотические микроорганизмы, такие как Е. coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки насекомых или т.п. Например, полипептиды можно получать в бактериях, в частности, когда отсутствует потребность в гликозилировании. После экспрессии полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и можно дополнительно очищать. Помимо прокариот, в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют полипептид, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были "гуманизированы", что позволяет получать полипептид с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, сс. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, сс. 210-215). Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и соответствующие пригодные для
них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, U.S. №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES(tm) для получения антител в трансгенных растениях). В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных животных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны СVI, трансформированная с помощью SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL ЗА); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR -СНО-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства белка, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.К.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, сс. 255-268. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений (но не ограничиваясь только ими), а также клетки, находящиеся в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского
хомячка (СНО), клетку почки человеческого эмбриона (НЕК) или лимфоидную клетку (например, клетку YO, NSO, Sp20).
В данной области известны стандартные технологии для экспрессии чужеродных генов в этих системах. Клетки, экспрессирующие мутантный 5 полипептид IL-2, слитый либо с тяжелой, либо с легкой цепью
антигенсвязывающего домена, такого как антитело, можно конструировать таким образом, чтобы в них происходила экспрессия других цепей антитела, например, таким образом, чтобы экспрессируемый слитый продукт, содержащий мутантный IL-2, включал антитело, которое имеет как тяжелую, так и легкую 10 цепь.
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ получения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, который кодирует мутантный полипептид IL-2 или
15 иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, в условиях,
пригодных для экспрессии мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, и необязательно выделяют мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид
20 IL-2 сцеплен по меньшей мере с одним не-1Ь-2-фрагментом. Можно получать мутантный IL-2, в котором сегмент мутантного полипептида IL-2 сцеплен с одной или несколькими молекулами, такими как полипептид, белок, углевод, липид, нуклеиновая кислота, полинуклеотид или молекула, которая содержит любые комбинации этих молекул (например, гликопротеины, гликолипиды и
25 др )- Мутантный полипептид IL-2 можно соединять также с органическим фрагментом, неорганическим фрагментом или фармацевтическим лекарственным средством. В контексте настоящего описания фармацевтическое лекарственное средство представляет собой органическую субстанцию, содержащую соединение с молекулярной массой примерно 5000 Да или менее.
30 Мутантный полипептид IL-2 можно соединять также с любым биологическим агентом, включая терапевтические соединения, такие как антинеопластические средства, антимикробные средства, гормоны, иммуномодуляторы,
противовоспалительные средства и т.п. Можно применять также радиоизотопы, например, применяемые для визуализации, а также для терапии.
Мутантный полипептид IL-2 можно соединять также с множеством молекул одного и того типа или молекул нескольких типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула, которую соединяют с IL-2, может придавать способность обеспечивать направленность IL-2 к специфическим тканям или клеткам в организме животного и их называют в контексте настоящего описания "обеспечивающий направленный перенос фрагмент". В этих вариантах осуществления изобретения обеспечивающий направленный перенос фрагмент может обладать аффинностью к лиганду или рецептору в ткани- или клетке-мишени, направляя тем самым IL-2 к ткани- или клетке-мишени. В конкретном варианте осуществления изобретения обеспечивающий направленный перенос фрагмент направляет IL-2 к опухоли. Обеспечивающие направленный перенос фрагменты включают, например, антигенсвязывающие фрагменты (например, антитела и их фрагменты), специфические в отношении находящихся на клеточной поверхности или внутриклеточных белков, лигандов биологических рецепторов и т.п. Указанные антигенсвязывающие фрагменты могут быть специфическими в отношении ассоциированных с опухолью антигенов, таких как описанные выше антигены.
Мутантный полипептид IL-2 можно генетически сливать с другим полипептидом, например, одноцепочечным антителом или (частью) тяжелых или легких цепей антитела, или можно конъюгировать химически с другой молекулой. Слияние мутантного полипептида IL-2 с частью тяжелой цепи антитела описано в разделе "Примеры". Мутантный IL-2, который является компонентом слияния мутантного полипептида IL-2 и другого полипептида, можно создавать таким образом, что последовательность IL-2 слита с полипептидом непосредственно или опосредовано через линкерную последовательность. Состав и длину линкера можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области, и можно оценивать его эффективность. Примеры линкерной последовательности между IL-2 и тяжелой цепью антитела представлены, например, в последовательностях SEQ ID NO: 209, 211, 213 и т.д. Дополнительные последовательности можно включать также в сайт расщепления для разделения при необходимости индивидуальных
компонентов слияния, например, распознаваемую эндопептидазой последовательность. Кроме того, мутантный IL-2 или содержащий его слитый белок можно также синтезировать химически с использованием методов полипептидного синтеза, хорошо известных в данной области (например, 5 твердофазный синтез Меррифилда). Мутантные полипептиды IL-2 можно конъюгировать химически с другими молекулами, например, другим полипептидом, используя хорошо известные методы химической конъюгации. Для этой цели можно применять бифункциональные перекрестносшивающие реагенты, такие как гомофункциональные и гетерофункциональные
10 перекрестносшивающие реагенты, хорошо известные в данной области. Применяемый тип перекрестносшивающего реагента зависит от природы молекулы, подлежащей сочетанию с IL-2, и его могут легко идентифицировать специалисты в данной области. В альтернативном или дополнительном варианте мутантный IL-2 и/или молекулу, с которой его предполагается конъюгировать,
15 можно подвергать химической дериватизации таким образом, чтобы их обоих
можно было конъюгироваться с помощью отдельной реакции, что также хорошо известно в данной области.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 соединяют с одним или несколькими антигенсвязывающими фрагментами
20 (т.е. в виде части иммуноконъюгата), которые содержат по меньшей мере вариабельную область антитела, обладающую способностью связываться с антигенной детерминантой. Вариабельные области могут образовывать часть встречающихся в естественных условиях или не встречающихся в естественных условиях антител или их фрагментов или могут быть выведены из них. Методы
25 получения поликлональных антител и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Harlow и Lane, "Antibodies: а Laboratory Manual", изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). He встречающиеся в естественных условиях антитела можно создавать с помощью твердофазного пептидного синтеза, можно получать с помощью методов
30 рекомбинации (например, описанных в U.S. № 4186567) или можно получать, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей (см., например, U.S. №. 5969108 на имя McCafferty). Иммуноконъюгаты,
антигенсвязывающие фрагменты и методы их получения подробно описаны также в публикации РСТ WO 2011/020783, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Любые виды антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов 5 или вариабельных областей животного происхождения можно соединять с мутантным полипептидом IL-2. Примерами антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются (но не ограничиваясь только ими) конструкции, полученные из организма мышей, приматов или
10 человека. Если конъюгат или слияние мутантный IL-2/антитело
предназначен/предназначено для применения на человеке, то можно применять химерную форму антитела, в которой константные области антитела получают из человеческого антитела. Гуманизированную или полностью человеческую форму антитела можно приготавливать также с помощью методов, хорошо
15 известных в данной области (см., например, U.S. № 5565332 на имя Winter). Для осуществления гуманизации можно применять различные методы, такие как (но не ограничиваясь только ими) (а) трансплантация нечеловеческих (например, из антитела-донора) CDR в человеческий (например, антитело-реципиент) каркасный участок и константные области, сохраняющие или не сохраняющие
20 имеющие решающее значение остатки каркасного участка (например, остатки,
важные для сохранения хорошей антигенсвязывающей аффинности или функций антитела), (б) трансплантация нечеловеческих определяющих специфичность участков (SDR или a-CDR; остатки имеют решающее значение для взаимодействия антитело-антиген) в человеческий каркасный участок и
25 константные области, или (в) трансплантация полностью нечеловеческих вариабельных доменов и их "маскировка" напоминающим человеческий сегментом путем замены поверхностных остатков. Обзор гуманизированных антител и методов их получения см., например, у Almagro и Fransson, Front Biosci 13, 12008, сс. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и
30 др., Nature 332, 1988, сс. 323-329; Queen и др., Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989, сс. 10029-10033; U.S. №№ 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones и др., Nature 321, 1986, сс. 522-525; Morrison и др., Proc Natl Acad Sci 81, 1984, сс. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv Immunol 44, 1988, cc. 65-92; Verhoeyen и др.,
Science 239, 1988, сс. 1534-1536; Padlan, Molec Immun 31(3), 1994, cc.169-217; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34) (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 1991, cc. 489-498 (описание "повторного покрытия"); Dall'Acqua и др., Methods 36, 2005, сс. 43-60 (описание 5 "перестановки FR") и Osbourn и др., Methods 36, 2005, сс. 61-68, и Klimka и др., Br J Cancer 83, 2000, сс. 252-260 (описание подхода на основе "целенаправленной селекции" для перестановки FR). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать с помощью различных методик, известных в данной области. Человеческие антитела описаны в целом у
10 van Dijk и van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 2008, cc. 450-459). Человеческие вариабельные области могут образовывать часть человеческих моноклональных антител или могут быть получены из них с помощью метода гибридом (см., например, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New
15 York, 1987, cc. 51-63). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать также путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что может продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном (см.,
20 например, Lonberg, Nat Biotech 23, 2005, сс. 1117-1125). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных областей Fv-клона, отобранных из человеческих фаговых дисплейных библиотек (см., например, Hoogenboom и др. в: Methods in Molecular Biology, под ред. O'Brien и др., изд-во Human Press,
25 Totowa, NJ, 178, 2001, cc. 1-37); и McCafferty и др., Nature 348, 552-554; Clackson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628). Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv- (зсРу)-фрагментов, либо в виде Fab-фрагментов. Подробное описание получения антигенсвязывающих фрагментов для иммуноконъюгатов с помощью фагового дисплея представлено в примерах,
30 прилагаемых к публикации РСТ WO 2011/020783.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты, пригодные для применения согласно настоящему изобретению, создают так, чтобы они обладали повышенной аффинностью связывания,
например, с помощью методов, описанных в публикации РСТ WO 2011/020783 (см. примеры, касающиеся созревания аффинности) или публикации заявки на патент США № 2004/0132066, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Способность иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, связываться со специфической антигенной детерминантой можно оценивать количественно либо с помощью твердофазного ферментного анализа (ELISA), либо другими методиками, известными специалисту в данной области, например, с помощью метода резонанса поверхностно плазмона (осуществляя анализ с использованием системы BIACORE Т100 system) (Liljeblad и др., Glyco J 17, 2000, сс. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, сс. 217-229). Анализы в конкурентных условиях можно применять для идентификации антитела, фрагмента антитела, антигенсвязывающего домена или вариабельного домена, конкурирующего с референс-антителом за связывание с конкретным антигеном, например, антитела, которое конкурирует с антителом L19 за связывание с экстра-доменом В фибронектина (EDB). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается референс-антитело. Подробные приведенные в качестве примеров методы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены у Morris, "Epitope Mapping Protocols)), B:Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996. При осуществлении приведенного в качестве примера анализа в конкурентных условиях иммобилизованный антиген (например, EDB) инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с антигеном (например, антитело L19), и вторым немеченым антителом, которое подлежит тестированию в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют и оценивают количество метки,
ассоциированной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном, существенно снижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за 5 связывание с антигеном (см. Harlow и Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, гл. 14, 1988).
Может требоваться дополнительная модификация мутантного IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении. Например, проблемы, связанные с иммуногенностью и коротким временем полужизни, можно
10 преодолевать путем конъюгации с практически прямоцепочечными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоль (ППГ) (см., например, WO 87/00056).
Мутанты IL-2 и иммуноконъюгаты, полученные с помощью представленных в настоящем описании методов, можно очищать с
15 использованием известных в данной области методик, таких как жидкостная хроматография высокого разрешения, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, гель-фильтрация и т.п. Фактические условия, применяемые для очистки конкретного белка, зависят, в частности, от таких факторов, как чистый заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и они
20 должны быть очевидны специалисту в данной области. Для очистки антитела с помощью аффинной хроматографии можно использовать лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат. Например, можно использовать антитело, которое специфически связывается с мутантным полипептидом IL-2. Для очистки с
25 помощью аффинной хроматографии иммуноконъюгатов, предлагаемых в
изобретении, можно использовать матрикс с белком А или белком G. Например, последовательное применение аффинной хроматографии на белке А или G и гель-фильтрации можно применять для выделения иммуноконъюгата, практически согласно методу, описанному в разделе "Примеры". Чистоту
30 мутантных полипептидов IL-2 и содержание слитых белков можно определять с помощью любого из широкого разнообразия хорошо известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п. Например, установлено, что содержащие тяжелые цепи слитые
белки, которые экспрессировали согласно описанным в разделе "Примеры" методам, являются интактными и правильно собранными, что продемонстрировано с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях (см., например, фиг. 14). Разделяли две полосы, соответствующие примерно Mr 5 25000 и Mr 60000, которые соответствовали предсказанным молекулярным массам слитого белка, содержащего легкую и тяжелую цепь иммуноглобулина/1Ь-2. Анализы
Представленные в настоящем описании мутантные полипептиды IL-2 и 10 иммуноконъюгаты можно идентифицировать, подвергать скринингу или
характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различным анализов, известных в данной области.
Анализы аффинности
Аффинность полипептида IL-2, мутантного или дикого типа, к различным
15 формам рецептора IL-2 можно определять согласно методу, описанному в разделе "Примеры" с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например, устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и субъединицы рецептора, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии (см., например, Shanafelt и др., Nature
20 Biotechnol 18, 2000, сс. 1197-1202). Гетеродимер р/у-субъединиц
рекомбинантного рецептора IL-2 можно создавать путем слияния каждой из субъединиц с мономером Fc-домена антитела, модифицированного с помощью технологии "knobs-into-holes" (см., например, U.S. № 5731168) для усиления гетеродимеризации слитых белков, содержащих соответствующую рецепторную
25 субъединицу/Fc (см. SEQ ID NO: 102 и 103). Альтернативно этому, аффинность связывания мутантных IL-2 с различными формами рецептора IL-2 можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известна способность экспрессировать одну или другую форму рецептора. Конкретный иллюстративный и приведенный в качестве примера вариант измерения
30 аффинности связывания описан ниже в разделе "Примеры". Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величину Кц измеряли с помощью резонанса поверхностного плазмона с помощью устройства BIACORE(r) Т100 (фирма GE Healthcare) при 25°С с использованием рецепторов IL-2,
иммобилизованных на СМ5-чипах. В целом, метод состоял в следующем: биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активировали с помощью гидрохлорида ТчГ-этил-ТЧ'-р-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) 5 согласно инструкциям поставщика. Рекомбинантный рецептор IL-2 разводили ЮмМ ацетатом натрия, рН 5,5 до концентрации 0,5-30 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин для достижения примерно 200-1000 единиц ответа (RU) слитого белка (для а-субъединицы IL-2R) или 500-3000 RU (для гетеродимера IL-2R Ру, полученного технологией "knobs-into-holes"). После
10 инъекции рецептора IL-2 инъецировали 1М этаноламин для блокады
непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецировали трехкратные серийные разведения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата (диапазон от -0,3 до ЗООнМ) в буфере HBS-EP+ (фирма GE Healthcare, ЮмМ HEPES, 150мМ NaCl, ЗмМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта Р20, рН
15 7,4) при 25°С со скоростью потока примерно 30 мкл/мин. Скорость реакции
ассоциации (kon) и реакции диссоциации (k0ff) рассчитывали с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программа BIACORE (r) Т100 Evaluation Software, версия 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции
20 диссоциации (К^) рассчитывали как соотношение k0ff/kon (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, сс. 865-881).
Связывание иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, с Fc-рецепторами можно легко определять, например, с помощью ELISA или с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR), используя стандартную
25 инструментальную базу, например, устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и Fc-рецепторы, например, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии. Альтернативно этому, аффинность связывания Fc-доменов или иммуноконъюгатов, содержащих Fc-домен, с Fc-рецепторами можно оценивать, используя клеточные линии, которые, как известно, экспрессируют конкретные
30 Fc-рецепторы, такие как NK-клетки, экспрессирующие FcyIIIa-рецептор. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величину Кц измеряли с помощью метода резонанса поверхностного плазмона с использованием устройства BIACORE(r) Т100 (фирма GE Healthcare) при 25°С с
использованием Fc-рецепторов IL-2, иммобилизованных на СМ5-чипах. В целом, метод состоял в следующем: биосенсорные чипы из
карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активировали с помощью гидрохлорида ^этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида 5 (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Рекомбинантный Fc-рецептор разводили ЮмМ ацетатом натрия, рН 5,5 до концентрации 0,5-30 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин для достижения примерно 100 - 5000 единиц ответа (RU) слитого белка. После инъекции Fc-рецептора инъецировали 1М этаноламин для блокады 10 непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецировали 3-5-кратные серийные разведения иммуноконъюгата (диапазон от ~0,1 до ЗООнМ) в буфере HBS-EP+ (фирма GE Healthcare, ЮмМ HEPES, 150мМ NaCl, ЗмМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта Р20, рН 7,4) при 25°С со скоростью потока примерно 30-50 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (kon) и реакции диссоциации (k0ff) 15 рассчитывали с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программа BIACORE (r) Т100 Evaluation Software, версия 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Кц) рассчитывали в виде соотношения k0ff/kon (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, сс. 86520 881).
Анализы активности
Способность мутантного IL-2 связываться с рецепторами IL-2 можно оценивать опосредовано путем анализа воздействий иммунной активации, которые происходили в прямой зависимости от связывания с рецептором.
25 Одним из объектов изобретения являются анализы, предназначенные для
идентификации мутантных полипептидов IL-2, обладающих биологической активностью. Виды биологической активности включают, например, способность индуцировать пролиферацию несущих рецептор IL-2 Т- и/или NK-клеток, способность индуцировать передачу сигналов IL-2 в несущих рецептор
30 IL-2 Т- и/или NK-клетках, способность воздействовать на образование
интерферона (IFN)-y в качестве вторичного цитокина NK-клетками, пониженную способность индуцировать образование вторичных цитокинов, в частности IL-10 и TNF-a, мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС),
пониженную способность индуцировать апоптоз Т-клеток, способность индуцировать регресс опухолей и/или повышенную выживаемость и профиль пониженной токсичности, прежде всего пониженной проницаемости сосудов, in vivo. Предложены также мутантные полипептиды IL-2, обладающие указанной 5 биологической активностью in vivo и/или in vitro.
В некоторых вариантах осуществления изобретения оценивали биологическую активность мутантного полипептида IL-2, предлагаемого в изобретении. В данной области широко известны различные методы определения биологической активности IL-2, и подробное описание многих из 10 этих методов представлено в приведенном ниже разделе "Примеры". В разделе "Примеры" представлен приемлемый анализ оценки мутантных IL-2, предлагаемых в изобретении, в отношении их способности воздействовать на образование IFN-y NK-клетками. Культивируемые NK-клетки инкубировали с мутантным полипептидом IL-2 или иммуноконъюгатами, предлагаемыми в 15 изобретении, и затем определяли концентрацию IFN-y в культуральной среде с помощью ELISA.
Индуцируемая IL-2 передача сигналов индуцирует несколько путей передачи сигналов и включает сигнальные молекулы JAK (киназа Janus) и STAT (сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции). Взаимодействие IL-2 с 020 и у-субъединицами рецептора приводит к фосфорилированию рецептора и JAK1 и JAK3, которые ассоциированы с 0- и у-субъединицей соответственно. Затем происходит ассоциация STAT5 с фосфорилированным рецептором и его фосфорилирование на имеющем решающее значение остатке тирозина. Это приводит к диссоциации STAT5 от рецептора, димеризации STAT5 и 25 транслокации димеров STAT5 в ядро, где они усиливают транскрипцию генов-мишеней. Таким образом, способность мутантных полипептидов IL-2 индуцировать передачу сигналов через рецептор IL-2 можно оценивать, например, измеряя фосфорилирование STAT5. Подробности этого метода описаны в разделе "Примеры". РВМС обрабатывали мутантными плипептидами 30 IL-2 или иммуноконъюгатами, предлагаемыми в изобретении, и уровни
фосфорилированного STAT5 определяли с помощью проточной цитометрии.
Пролиферацию Т-клеток или NK-клеток в ответ на воздействие IL-2 можно оценивать путем инкубации Т-клеток или NK-клеток, выделенных из крови, с
мутантными полипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами, предлагаемыми в изобретении, с последующим определением содержания АТФ в лизате обработанных клеток. Перед обработкой Т-клетки можно предварительно стимулировать фитогемагглютинином (ФГА-М). Этот анализ, описанный в 5 разделе "Примеры", является чувствительным и позволяет определять
количество жизнеспособных клеток, хотя в данной области известны другие
приемлемые альтернативные анализы (например, анализ включения [ Н]-тимидина, Cell Titer Glo-анализы АТФ, анализ, основанный на применении Alamar Blue, WST-1-анализ, МТТ-анализ).
10 В разделе "Примеры" описан также анализ, предназначенный для оценки
апоптоза Т-клеток и AICD, при осуществлении которого Т-клетки обрабатывают индуцирующим апоптоз антителом после инкубации с мутантными полипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами, предлагаемыми в изобретении, и апоптозные клетки оценивают количественно на основе определения проточной
15 цитометрией по отложению фосфатидилсерина/аннексина. В данной области известны и другие анализы.
Воздействие мутантного IL-2 на рост опухолей и выживание можно оценивать с использованием различных созданных на животных моделей опухолей, известных в данной области. Например, ксенотрансплантаты
20 человеческих раковых линий клеток можно имплантировать мышам с
иммунодефицитом и обрабатывать их мутантными полипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами, предлагаемыми в изобретении, как описано в разделе "Примеры".
Токсичность мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов,
25 предлагаемых в изобретении, in vivo можно определять по смертности, с
помощью прижизненных наблюдений (оценка видимых симптомов
нежелательных явлений, таких, например, как поведение, вес тела, температура
тела) и клинической и анатомической патологии (например, определение
показателей химии крови и/или гистопатологические анализы).
30 Проницаемость сосудов, индуцированную обработкой IL-2, можно
оценивать на предварительно обработанной созданной на животных модели проницаемости сосудов. В целом, мутантный IL-2 или иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, вводят соответствующему животному, например,
мыши, и позднее животному инъецируют репортерную молекулу сосудистого просачивания, распространение которой из сосудистой сети отражает степень проницаемости сосудов. Репортерная молекула сосудистого просачивания предпочтительно является достаточно крупной для того, чтобы обнаруживать 5 проницаемость при использовании формы IL-2 дикого типа для предварительной обработки. Примером репортерной молекулы сосудистого просачивания может являться сывороточный белок, такой как альбумин или иммуноглобулин. Репортерную молекулу сосудистого просачивания предпочтительно метят с помощью выявляемой метки, такой как радиоизотоп, для облечения
10 количественного определения распределения молекулы в ткани. Сосудистую проницаемость можно измерять для сосудов, присутствующих в любом из различных внутренних органов тела, таких как печень, легкое и т.п., а также в опухоли, включая ксенотрансплантированную опухоль. Легкое является предпочтительным органом для измерения сосудистой проницаемости при
15 использовании полноразмерных мутантных IL-2.
Композиции, препаративные формы и пути введения Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любой из мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, например,
20 предназначенные для применения в любом из указанных ниже терапевтических методов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любой из мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения
25 фармацевтическая композиция содержит любой из мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.
Кроме того, представлен способ получения мутантного полипептида IL-2 30 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, в форме, пригодной для
введения in vivo, заключающийся в том, что (а) получают мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, и (б) объединяют в препаративной форме мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат по
меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, где приготовленный препарат мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, пригоден для применения in vivo.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, 5 содержат в эффективном количестве один или несколько мутантных
полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, который(ые) растворен(ы) или диспергирован(ы) в фармацевтически приемлемом носителе. Понятия "фармацевтически или фармакологически приемлемый" относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые, в целом нетоксичны для
10 реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, т.е. не вызывают вредные, аллергические или другие нежелательные реакции при введении при необходимости животному, такому, например, как человек. Приготовление фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат и необязательно
15 дополнительное действующее вещество, должно быть очевидно специалистам в данной области в свете настоящего описания, например, из справочника Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенного в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, очевидно, что препараты, предназначенные для введения животному (например,
20 человеку), должны удовлетворять требованиям стандартов стерильности,
пирогенности и общей безопасности и чистоты, разработанных отделением биологических стандартов (Управление контроля пищевых продуктов и лекарственных средств) FDA или соответствующим уполномоченным органом других стран. Предпочтительными композициями являются лиофилизированные
25 препаративные формы или водные растворы. Примеры композиций IL-2
приведены в U.S. №№ 4604377 и 4766106. В контексте настоящего описания "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты,
30 противогрибные агенты), агенты для придания изотоничности, замедляющие абсорбцию агенты, соли, белки, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, полимеры, гели, связующие вещества, эксципиенты, разрыхлители, замасливатели, подслащивающие вещества, корригенты,
красители и подобные материалы и их комбинации, которые должны быть известны обычному специалисту в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, сс. 1289-1329, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Любой 5 общепринятый носитель, если только он совместим с действующим веществом, можно применять в терапевтических или фармацевтических композициях.
Композиция может содержать различные типы носителей в зависимости от того, вводят ли ее в твердой, жидкой или аэрозольной форме, и от того, должна ли она быть стерильной, как в случае использования таких путей введений, как
10 инъекция. Мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, предлагаемые в настоящем изобретении (и дополнительное терапевтическое средство) можно вводить внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь повреждения, внутрь черепа, внутрь сустава, внутрь предстательной железы, внутрь селезенки, внутриренально, внутриплеврально,
15 внутритрахеально, внутриназально, внутрь стекловидного тела,
внутривагинально, внутриректально, внутрь опухоли, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, подконъюнкивально, интравезикулярно, в слизистую оболочку, интраперикардиально, внутрь пуповины, интраокулярно, орально, топикально, место, путем ингаляции (например, аэрозольной
20 ингаляции), инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, локализованной перфузии, омывающей непосредственно клетки-мишени, через катетер, посредством лаважа, в виде кремов, в липидных композициях (например, липосомах), или с помощью любого другого метода или любой комбинации вышеуказанных путей, известных обычному специалисту в данной области (см.,
25 например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Для введения молекул полипептидов, таких как мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, наиболее часто применяют парентеральное введение, в частности, внутривенную инъекцию.
30 Парентеральные композиции включают композиции, созданные для
введения путем инъекции, например, подкожной, внутрикожной, внутрь повреждения, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, подоболочечной или внутрибрюшинной инъекции. Для инъекции мутантные
полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно включать в препаративные формы в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический соляной буфер. Раствор может содержать 5 предназначенные для получения препаративной формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно этому, мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты могут находиться в порошкообразной форме, предназначенной для восстановления перед применением приемлемым наполнителем, например, стерильной не
10 содержащей пирогенов водой. Стерильные инъецируемые растворы
приготавливают путем включения полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости в сочетании с различными другими ингредиентами, перечисленными ниже. Стерильность можно легко достигать,
15 например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных действующих веществ в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, суспензий или
20 эмульсий предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка или сушка вымораживанием, которые позволяют получать порошок действующего вещества в сочетании с любым дополнительным требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованной фильтрацией жидкой среды. При необходимости жидкая среда перед применением должна быть
25 соответствующим образом забуферена и жидкому разбавителю сначала придана изотоничность с помощью достаточного количества соляного раствора или глюкозы. Композиция должны быть стабильной в условиях приготовления и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Принято поддерживать загрязнение эндотоксинами на
30 минимальном безопасном уровне, например, менее 0,5 нг/мг белка. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают (но не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и
метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид; бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол, резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); 5 низкомолекулярные (содержащие менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины;
10 хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Водные суспензии для инъекций могут содержать соединения, которые повышают
15 вязкость суспензии, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит, декстран или т.п. Необязательно суспензия может содержать также стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. Кроме того, суспензии действующих веществ можно получать в виде соответствующих масляных
20 предназначенных для инъекции суспензий. Приемлемые липофильные
растворители или наполнители включают жирные нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этиловые эфиры или триглицериды, или липосомы.
Действующие вещества можно заключать в микрокапсулы, например,
25 полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации,
например в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в
30 макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980. Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных
полимеров, включающие полипептид, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы. В конкретном варианте осуществления изобретения для достижения пролонгированной абсорбции инъецируемой композиции можно применять в 5 композиции агенты, замедляющие абсорбцию, такие, например, как моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.
Помимо описанных выше композиций, иммуноконъюгаты можно приготавливать также в виде препарата в форме депо. Указанные препаративные формы длительного действия можно применять путем имплантации (например,
10 подкожной или внутримышечной) или внутримышечной инъекции. Так,
например, мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно включать в препаративные формы в сочетании с приемлемыми полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных,
15 например, умеренно растворимой соли.
Фармацевтические композиции, содержащие мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать с помощью общепринятых процессов смешения, растворения, эмульгирования, капсулирования, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции
20 можно включать в препаративные формы с помощью общепринятого метода с
использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ, которые облегчают процессирование белков, с получением препаратов, которые можно применять в фармацевтических целях. Соответствующая форма зависит от выбранного пути
25 введения.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно включать в композиции в виде свободной кислоты или свободного основания, в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, которые практически сохраняют биологическую 30 активность свободной кислоты или свободного основания. Они включают кислотно-аддитивные соли, например, соли, образованные со свободными аминогруппами белковой композиции, или образованные с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислота, или такими
- по -
органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные со свободной карбоксильной группой, можно получать также из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли имеют тенденцию к более высокой растворимости в водных и других протонных растворителях по сравнению с соответствующими формами в виде свободных оснований.
Способы и композиции для терапевтического применения
Любые мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, представленные в настоящем описании, можно применять в терапевтических методах. Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве иммунотерапевтических агентов, например, при лечении различных видов рака.
Для применения в терапевтических способах мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав препаративных форм, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения болезненных состояний, на которые оказывает благоприятное воздействие стимуляция иммунной системы хозяина, в частности, состояний, при которых является желательным повышенный клеточный иммунный ответ. Они могут включать болезненные состояния, при которых иммунный ответ хозяина является неудовлетворительным или недостаточным. Болезненные состояния, при которых можно вводить мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, представляют собой, например, опухоль или инфекцию, при которой клеточный иммунный ответ должен представлять собой имеющий решающее значение механизм специфического иммунитета. Конкретные болезненные состояния, при
которых можно применять мутантные IL-2, предлагаемые в настоящем изобретении, включают рак, например, почечноклеточную карциному или меланому; иммунодефицит, в частности у ВИЧ-положительных пациентов, у пациентов с иммунодепрессией, хроническую инфекцию и т.п. Мутантные 5 полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно вводить индивидуально или в виде любой приемлемой фармацевтической композиции.
Одним из объектов изобретения являются мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, предназначенные для
10 применения в качестве лекарственного средства. Следующими объектами изобретения являются мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, предназначенные для применения для лечения заболевания. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении,
15 предназначенные для применения в способе лечения. Одним из вариантов осуществления изобретения является мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, предназначенный для применения при лечении заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является мутантный
20 полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предназначенный для применения в
способе лечения индивидуума, который имеет заболевание, заключающемся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет
25 собой пролиферативное нарушение. В предпочтительном варианте
осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, противораковое
30 средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Другими вариантами осуществления изобретения является мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предназначенный для применения для стимуляции иммунной системы. Некоторыми вариантами осуществления
изобретения является мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предназначенный для применения в способе стимуляции иммунной системы у индивидуума, заключающемся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат для стимуляции 5 иммунной системы. "Индивидуум" в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. "Стимуляция иммунной системы" в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение
10 иммунной функции, повышение Т-клеточной функции, повышение В-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение Т-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
15 Следующим объектом изобретения является применение мутантного
полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, для производства или приготовления лекарственного средства, которое предназначено для лечения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство
20 предназначено для применения в способе лечения заболевания, заключающемся в том, что вводят индивидууму, который имеет заболевание, в терапевтически эффективном количестве лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. В предпочтительном варианте
25 осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, противораковое средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет
30 собой рак. В следующем варианте осуществления изобретения лекарственное
средство предназначено для стимуляции иммунной системы. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе стимуляции иммунной системы у индивидуума,
заключающемся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве лекарственное средство для стимуляции иммунной системы. "Индивидуум" в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. "Стимуляция 5 иммунной системы" в контексте любого из указанных выше вариантов
осуществления изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение Т-клеточной функции, повышение В-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение Т-клеточной
10 реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Следующим объектом изобретения является способ лечения заболевания у индивидуума, заключающийся в том, что вводят указанному индивидууму в терапевтически эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или
15 иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении. В одном из вариантов
осуществления изобретения указанному индивидууму вводят композицию, которая содержит мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, в фармацевтически приемлемой форме. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее
20 лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например,
25 противораковое средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Следующим объектом изобретения является способ стимуляции иммунной системы у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат для стимуляции иммунной системы. "Индивидуум" в
30 контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. "Стимуляция иммунной системы" в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может включать один или несколько показателей,
таких как общее повышение иммунной функции, повышение Т-клеточной функции, повышение В-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение Т-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Должно быть очевидно, что любой из вышеуказанных терапевтических способов можно осуществлять с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, вместо или в дополнение к мутантному полипептиду IL-2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение, предпочтительно рак. Примерами рака являются (но не ограничиваясь только ими) рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак ободочной кишки, колоректальный рак, ректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточная карцинома, рак кости и рак почки. Другие нарушения клеточной пролиферации, которые можно лечить с использованием мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваясь только ими) неоплазмы, локализованные в: животе, кости, молочной железе, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечник, паращитовидная, гипофиз, яички, яичник, тимус, щитовидная), глазу, голове и шеи, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазовой области, коже, мягкой ткани, селезенке, грудном отделе и мочеполовой системе. Также под объем изобретения подпадают предраковые состояния или повреждения и метастазы рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбирают из группы, включающей почечноклеточный рак, рак кожи, рак легкого, колоректальный рак, рак молочной железы, рак головного мозга, рак головы и шеи. Аналогично этому, другие нарушения клеточной пролиферации можно также лечить с помощью мутантных полипептидов IL-2 и иммуноконъюгатов, предлагаемых в настоящем изобретении. Примерами таких нарушений
клеточной пролиферации являются (но не ограничиваясь только ими): гипергаммаглобулинемия, лимфопролиферативные нарушения, парапротеинемия, пурпура, саркоидоз, синдром Сезари, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь Гаучера, гистоцитоз и любое другое заболевание, 5 связанное с клеточной пролиферацией, помимо неоплазм, локализованных в указанных выше органах. В других вариантах осуществления изобретения заболевание связано с аутоиммунитетом, отторжением трансплантата, посттравматическим иммунным ответом и инфекционными заболеваниями (например ВИЧ). Более конкретно, мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты
10 можно применять для элиминации клеток, участвующих в опосредованных иммунными клетками нарушениях, таких как лимфома; аутоиммунитет, отторжение трансплантата, заболевание "трансплантат-против-хозяина", ишемия и "удар". Специалисту в данной области должно быть очевидно, что во многих случаях мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты не могут
15 обеспечивать исцеление, а могут только оказывать частичное благоприятное воздействие. В некоторых вариантах осуществления изобретения физиологические изменения, обладающие некоторым благоприятным действием, рассматриваются также как терапевтически ценные. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения количество мутантного полипептида IL-2
20 или иммуноконъюгата, которое обеспечивает физиологическое изменение, рассматривается как "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество". Субъект, пациент или индивидуум, нуждающийся в лечении, представляет собой, как правило, млекопитающее, более конкретно человека.
25 Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно применять также в
качестве диагностических реагентов. Связывание иммуноконъюгата с антигенной детерминантой можно легко выявлять, используя вторичное антитело, специфическое в отношении полипептида IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения вторичное антитело и иммуноконъюгат облегчают
30 выявление связывания иммуноконъюгата с антигенной детерминантой, локализованной на поверхности клетки или ткани.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, в
-Не-
эффективном количестве вводят в клетку. В других вариантах осуществления
изобретения мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, предлагаемые
в изобретении, вводят в терапевтически эффективном количестве индивидууму
для лечения заболевания.
5 Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза
мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении (при его применении индивидуально или в сочетании с один или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, пути введения, веса тела
10 пациента, типа полипептида (например, неконъюгированный IL-2 или
иммуноконъюгат), серьезности и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в превентивных или терапевтических целях, предшествующих или осуществляемых одновременно терапевтических вмешательств, истории болезни пациента и ответа на мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат и
15 предписания лечащего врача. Практикующий специалист, ответственный за
введение, в любом случае, должен определять концентрацию действующего(их) вещества(в) в композиции и соответствующую(ие) дозу(ы) для индивидуального пациента. Различные схемы введения доз включают (но не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты
20 времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Однократное введение неконъюгированного IL-2 может включать от примерно 50000 до примерно 1000000 МЕ/кг или более, более конкретно примерно 600000 МЕ/кг IL-2. Его можно повторять несколько раз в день (например, 2-3 раза), в течение нескольких дней (например, в течение примерно
25 3-5 последовательных дней) и затем можно повторять один или несколько раз после периода отдыха (например, примерно 7-14 дней). Таким образом, терапевтически эффективное количество может включать только одно введение или несколько введений в течение некоторого периода времени (например, примерно 20-30 введений индивидууму примерно 600000 МЕ/кг IL-2 каждый
30 раз, в течение примерно 10-20-дневного периода). При введении в форме иммуноконъюгата терапевтически эффективное количество мутантного полипептида IL-2 может быть ниже по сравнению с неконъюгированной формой мутантного полипептида IL-2.
Аналогично этому, иммуноконъюгат можно вводить пациенту в виде одной обработки или серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1- 10 мг/кг) иммуноконъюгата может представлять собой начальную возможную дозу для 5 введения пациенту, например, с использованием одного или нескольких
индивидуальных введений или с помощью непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от отмеченных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода в зависимости от
10 состояния лечение, как правило, должно продолжаться до достижения требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. В качестве примера, доза иммуноконъюгата может составлять от примерно 0,005 до примерно 10 мг/кг. В другом примере (но не ограничиваясь только указанным) доза на одно введение может составлять от примерно 1, примерно 5, примерно
15 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500
мкг/кг веса тела, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 до примерно 1000 мг/кг/веса тела или более, и находиться в любом указанном диапазоне. В качестве примеров (но не ограничиваясь только ими) указанного диапазона значений,
20 можно вводить от примерно 5 до примерно 100 мг/кг веса тела, от примерно 5
мкг/кг веса тела до примерно 500 мг/кг веса тела и т.д. с учетом указанных выше уровней доз. Так, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 5,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить прерывисто, например, каждую неделю или
25 каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз иммуноконъюгата). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу, после которой применять одну или несколько более низких доз. Однако можно использовать другие схемы введения доз. Успех такой терапии легко оценивать
30 с помощью общепринятых методик и анализов.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, как правило, следует применять в количестве, эффективном для достижения поставленной цели. При применении для лечения или
предупреждения болезненного состояния мутантные полипептиды IL-2 и
иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, или их фармацевтические
композиции, вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве.
Определение терапевтически эффективного количества находится в 5 компетенции специалистов в данной области, прежде всего в свете
представленного подробного описания изобретения.
Для системного введения терапевтически эффективную дозу можно сначала
определять с помощью анализов in vitro, например, анализов с использованием
клеточных культур. Затем дозу можно включать в форму для изучения на 10 животных моделях для достижения концентрации в кровотоке, находящейся в
диапазоне, включающем значение IC50, определенное на клеточной культуре.
Указанную информацию можно использовать для более точного определения
доз, которые можно применять на людях.
Начальные дозы можно оценивать также, исходя из данных, полученных in 15 vivo, например, на животных моделях, используя методики, хорошо известные в
данной области. Обычный специалист в данной области легко может
оптимизировать применение на людях на основе данных, полученных на
животных.
Уровень доз и интервал можно регулировать индивидуально для получения 20 уровней в плазме мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов,
которые являются достаточными для поддержания терапевтического действия. Обычные дозы, предназначенные для введения пациенту путем инъекции, составляют от примерно 0,1 to 50 мг/кг/день, как правило, от примерно 0,5 до 1 мг/кг/день. Для достижения терапевтически эффективных уровней в плазме 25 можно вводить несколько доз каждый день. Уровни в плазме можно оценивать, например, с помощью ЖХВР.
В случаях местного применения или избирательного поглощения эффективная местная концентрация иммуноконъюгатов может не соответствовать концентрации в плазме. Специалист в данной области может 30 оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без чрезмерных экспериментов.
Применение в терапевтически эффективной дозе мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, должно,
как правило, обеспечивать терапевтическую пользу, не вызывая существенной токсичности. Токсичность и терапевтическую эффективность мутантного IL-2 или иммуноконъюгата можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных 5 животных (см., например, примеры 8 и 9). Анализы на клеточных культурах или опыты на животных можно применять для определения значений LD50 (доза, смертельная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз, характеризующих токсические и терапевтические действия, обозначают как терапевтический индекс, который
10 можно выражать в виде соотношения LD50/ED50. Мутантные IL-2 и
иммуноконъюгаты, имеющие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, характеризуется высоким терапевтическим индексом. Данные,
15 полученные в анализах с использованием клеточных культур и в опытах на
животных, можно применять для определения диапазона доз, которые можно применять на людях. Доза лежит предпочтительно в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают ED50, обладающих невысокой токсичностью или не обладающих токсичностью. Доза может варьироваться в зависимости от
20 различных факторов, например, от применяемой лекарственной формы, применяемого пути введения, состояния индивидуума и т.п. Точную препаративную форму, путь введения и дозу может выбирать индивидуально врач в зависимости от состояния пациента (см., например, Fingl и др., в: The Pharmacological Basis of Therapeutics, гл.1, 1975, с 1, публикация полностью
25 включена в настоящее описание в качестве ссылки).
Лечащему врачу пациентов, которым вводят мутантные IL-2 или иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, должно быть очевидно, как и когда заканчивать, прерывать или регулировать введение из-за токсичности, дисфункции органов и т.п. И, наоборот, лечащему врачу должны быть очевидно,
30 как регулировать лечение в сторону применения более высоких доз, если клинический ответ является неадекватным (предотвращая токсичность). Величина вводимой дозы при лечении представляющего интерес нарушения должна варьироваться в зависимости от серьезности состояния, подлежащего
лечению, пути введения и т.п. Серьезность состояния можно, например, оценивать среди прочего с помощью стандартных прогностических методов оценки. Кроме того, доза и предполагаемая частота введения дозы должна также варьироваться в зависимости от возраста, веса тела и ответа индивидуального 5 пациента.
Максимальную терапевтическую дозу мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, содержащего указанный полипептид, можно повышать по сравнению с дозами, в которых применяют IL-2 дикого типа или иммуноконъюгат, содержащий IL-2 дикого типа соответственно.
10 Другие агенты и варианты лечения
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, при лечении можно вводить в сочетании с одним или несколькими другими агентами. Например, мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с
15 одним дополнительным терапевтическим средством. Понятие "терапевтическое средство" включает любое средство, которое вводят для лечения симптома заболевания у индивидуума, который нуждается в таком лечении. Указанное дополнительное терапевтическое средство может представлять собой любое действующее вещество, которое можно применять при конкретном показании,
20 подлежащем лечению, предпочтительно с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательное действие друг на друга. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой иммуномодулятор, цитостатическое средство, ингибитор клеточной адгезии, цитотоксическое средство, активатор клеточного
25 апоптоза или средство, повышающее чувствительность клеток к индукторам апоптоза. В конкретном варианте осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой противораковое средство, например, агент, разрушающий микротрубочки, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, интеркалятор ДНК, алкилирующий агент, средство
30 гормональной терапии, ингибитор киназ, антагонист рецептора, активатор апоптоза опухолевых клеток или антиангиогенное средство.
Указанные другие средства могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для указанных целей. Эффективное количество
указанных других средств зависит от количества применяемого мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, типа нарушения, подлежащего лечению, и других указанных выше факторов. Мутантные полипептиды и иммуноконъюгаты, как правило, применяют в таких же дозах и с 5 использованием указанных в настоящем описании путей введения, или в дозах, составляющих примерно от 1 до 99% от указанных в настоящем описании доз, или в любой дозе и с использованием любого пути введения, которые согласно эмпирическим/клиническим данным рассматриваются как приемлемые.
Отмеченные выше комбинированные терапии предусматривают совместное
10 введение (когда два или большее количество терапевтических средств включают в одну и ту же или в отдельные композиции) и раздельное введение, в этом случае введение мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта.
15 Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, предлагаемые в
изобретении, можно применять также в сочетании с лучевой терапией. Изделия
Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования
20 указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или прилагаются к нему. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного (IV) раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или
25 пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно
30 прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения
выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит 5 дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковке, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или 10 третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как
бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, 15 иглы и шприцы.
Как должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, вместо или в дополнение к мутантному полипептиду IL-2.
Краткое описание чертежей
20 На чертежах показано:
на фиг. 1 - схематическое изображение форматов иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab (А) и IgG-IL-2 (Б), содержащих мутантный полипептид IL-2;
на фиг. 2 - результаты очистки конструкции "оголенного" (неконъюгированного) IL-2 дикого типа. (А) Хроматограмма, полученная после 25 очистки с использованием His-метки, "оголенного" IL-2 дикого типа; (Б)
результаты ДСН-ПААГ-анализа очищенного белка (8-12% Бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 3 - результаты очистки конструкции "оголенного" IL-2 дикого типа. (А) Хроматограмма IL-2 дикого типа, полученная методом гель-30 фильтрации; (Б) результаты ДСН-ПААГ-анализа очищенного белка (8-12% Бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 4 - результаты, полученные методом аналитической гель-фильтрации IL-2 дикого типа, проведенной на колонке Супердекс 75, 10/300 GL.
Пул 1 содержал 74% видов с молекулярной массой 23 кДа и 26% видов с 20 кДа, Пул 2 содержал 40% видов с 22 кДа и 60% видов с 20 кДа;
на фиг. 5 - результаты очистки конструкции "оголенного" четырехмутантного IL-2. (А) Хроматограмма, полученная после очистки с 5 использованием His-метки, четырехмутантного IL-2; (Б) результаты ДСН-ПААГ-анализа, очищенного белка (8-12% Бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 6 - результаты очистки конструкции "оголенного" четырехмутантного IL-2. (А) Хроматограмма, полученная методом гель-10 фильтрации, четырехмутантного IL-2; (Б) результаты ДСН-ПААГ-анализа очищенного белка (8-12% Бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 7 - результаты, полученные методом аналитической гель-фильтрации четырехмутантного IL-2, проведенной на колонке Супердекс 75,
15 10/300 GL (Пул 2, 20 кДа);
на фиг. 8 - результаты, демонстрирующие одновременное связывание с IL-2R и человеческим FAP конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 29В11, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP. (А) Результат SPR-анализа; (Б) SPR-сенсограмма;
20 на фиг. 9 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию
высвобождения IFN-y №С92-клетками, при воздействии конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 4G8, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнение с пролейкином;
на фиг. 10 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию
25 пролиферации выделенных NK-клеток (внизу), при воздействии конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 4G8, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнение с пролейкином;
на фиг. 11 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию 30 пролиферации активированных СОЗ+-Т-клеток при воздействии конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 4G8, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнение с пролейкином;
на фиг. 12 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию индуцированной активацией клеточной гибели (AICD) избыточно стимулированных Т-клеток при воздействии конструкции на основе 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой 5 является FAP, по сравнение с пролейкином;
на фиг. 13 - результаты фосфо-БТАТб FACS-анализа в растворе с использованием конструкции на основе 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнению с пролейкином. (А) регуляторные Т-клетки (CD4+CD25+FOXP3+); (Б)
10 СБ8+-Т-клетки (CD3+CD8+); (В) СБ4+-Т-клетки (CD4+CD25"CD127+); (Г) NK-клетки (CD3"CD56+);
на фиг. 14 - результаты очистки иммуноконъюгата на основе 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции на колонке с белком G. (Б) Профиль элюции на колонке для гель-фильтрации с Супердекс
15 200. (В) Результаты ДСН-ПААГ-анализа (Novex Трис-глицин 4-20%) конечного продукта с использованием образца в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях;
на фиг. 15 - результаты очистки иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции на колонке с
20 белком А. (Б) Профиль элюции на колонке для гель-фильтрации с Супердекс
200. (В) Результаты электрофореза в NuPAGE Novex Бис-Трис-минигеле (фирма Invitrogen), подвижный MOPS-буфер, конечного продукта с использованием образца в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях;
на фиг. 16 - результаты очистки иммуноконъюгата Fab-IL2QM-Fab на
25 основе MHLG1 KV9, мишенью которого является MCSP. (А) Профиль элюции на колонке с белком А. (Б) Профиль элюции на колонке для гель-фильтрации с Супердекс 200. (В) Результаты электрофореза в минигеле NuPAGE Novex Бис-Трис (фирма Invitrogen), подвижный MOPS-буфер, конечного продукта с использованием образца в невосстанавливающих и восстанавливающих
30 условиях;
на фиг. 17 - результаты, демонстрирующие направленное связывание конструкций Fab-IL-2-Fab на экспрессирующих человеческий FAP НЕК 293-клетках;
на фиг. 18 - результаты, демонстрирующие направленное связывание конструкций Fab-IL-2-Fab на экспрессирующих человеческий FAP НЕК 293-клетках;
на фиг. 19 - результаты, демонстрирующие специфичность связывания 5 конструкций Fab-IL-2-Fab, которую определяли на экспрессирующих человеческую DPPIV НЕК 293-клетках и на НЕК 293-клетках, трансфектированных имитатором. Справа представлены результаты, демонстрирующие связывание специфического в отношении DPPIV (CD26) антитела;
10 на фиг. 20 - результаты анализа интернализации FAP при связывании
конструкций Fab-IL-2-Fab с FAP на фибробластах линии GM05389;
на фиг. 21 - результаты анализа индуцируемого IL-2 высвобождения IFN-y №С92-клетками в растворе;
на фиг. 22 - результаты анализа индуцируемого IL-2 высвобождения IFN-y 15 №С92-клетками в растворе;
на фиг. 23 - результаты анализа индуцируемой IL-2 пролиферации NK92-клеток в растворе;
на фиг. 24 - результаты сравнительной оценки Fab-IL-2-Fab на основе клонов 28Н1, 29В11 и 4G8 с помощью анализа в растворе фосфорилирования 20 STAT5 с использованием РВМС. (А) NK-клетки (CD3"CD56+); (Б) CD8+-T-клетки (CD3+CD8+); (В) СБ4+-Т-клетки (CD3+CD4+CD25"CD127+); (Г) регуляторные Т-клетки (CD4+CD25+FOXP3+);
на фиг. 25 - данные об эффективности иммуноконъюгатов 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на клеточной 25 линии человеческой почечноклеточной аденокарциномы ACHN;
на фиг. 26 - данные об эффективности иммуноконъюгатов 4G8 FAP-IL-2 qm-Fab и 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на клеточной линии мышиной легочной карциномы Льюиса LLC1;
на фиг. 27 - данные об эффективности иммуноконъюгатов 28Н1 Fab-IL-2 30 wt-Fab и 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на клеточной линии мышиной легочной карциномы Льюиса LLC1;
на фиг. 28 - изображения, полученные при небольшом увеличении (100х), легких мышей, обработанных наполнителем (контроль) (А) или взятыми в
концентрации 9 мкг/г wt IL-2 (Б) или qm IL-2 (В). В легких мышей, обработанных 9 мкг/г wt IL-2, виден вазоцентрический мононуклеарный инфильтрат, переместившийся в альвеолярные пространства. Имеют место отек и кровоизлияние. У мышей, обработанных qm IL-2, обнаружен маргинальный 5 инфильтрат вокруг нескольких сосудов;
на фиг. 29 - изображения, полученные при большем увеличении (200х), легких, показанных на фиг. 28. Краевое скопление (маргинация) и инфильтрация мононуклеарных клеток в кровеносных сосудах и вокруг них являются более серьезными у мышей, обработанных wt IL-2 (А), чем у мышей, обработанных qm 10 IL-2 (Б и В);
на фиг. 30 - изображения, полученные при небольшом увеличении (100х)з
печени мышей, обработанных наполнителем (контроль) (А) или взятыми в
концентрации 9 мкг/г wt IL-2 (Б) или qm IL-2 (В). У мышей, обработанных wt IL-
2, обнаружена вазоцентрическая инфильтрация;
15 на фиг. 31 - результаты анализа секреции IFN-y №С92-клетками после
инкубации с различными препаратами IL-2 дикого типа (wt) и четырехмутантного IL-2 (qm), в течение 24 (А) или 48 ч (Б);
на фиг. 32 - результаты анализа пролиферации №С92-клеток после инкубации с различными препаратами IL-2 дикого типа (wt) и 20 четырехмутантного IL-2 (qm) в течение 48 ч;
на фиг. 33 - результаты анализа пролиферации №С92-клеток после инкубации с различными препаратами IL-2 дикого типа (wt) и четырехмутантного IL-2 (qm) в течение 48 ч;
на фиг. 34 - результаты анализа пролиферации NK-клеток после инкубации 25 с различными иммуноконъюгатами 28Н1 IL-2, мишенью которых является FAP, или с пролейкином в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней;
на фиг. 35 - результаты анализа пролиферации СБ4-Т-клеток после
инкубации с различными иммуноконъюгатами 28Н1 IL-2, мишенью которых
является FAP, или с пролейкином в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней;
30 на фиг. 36 - результаты анализа пролиферации CDS-T-клеток после
инкубации с различными иммуноконъюгатами 28Н1 IL-2, мишенью которых является FAP, или с пролейкином в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней;
на фиг. 37 - результаты анализа пролиферации NK-клеток (A), CD4-T-клеток (Б) и CDS-T-клеток (В) при инкубации с различными иммуноконъюгатами IL-2 или с пролейкином в течение 6 дней;
на фиг. 38 -результаты анализа фосфорилирования STAT в NK-клетках (А), 5 СБ8-Т-клетках (Б), СБ4-Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, полученным на фирме-заявителе IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2;
на фиг. 39.-результаты анализа фосфорилирования STAT в NK-клетках (А), CDS-T-клетках (Б), СВ4-Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после 3010 минутной инкубации с пролейкином, IgG-IL-2, содержащим IL-2 дикого типа, или IgG-IL-2, содержащим четырехмутантный IL-2;
на фиг. 40 - данные о выживаемости мышей линии Black 6 после введения
(один раз в день в течение семи дней) иммуноконъюгатов IL-2, содержащих IL-2
дикого типа или четырехмутантный IL-2, в различных дозах;
15 на фиг. 41 - данные о концентрации в сыворотке иммуноконъюгатов IL-2
после однократного i.v.-введения конструкций IgG-IL-2, мишенью которых
является FAP (А), и "ненаправленных" (не имеющих специфической мишени)
(Б) конструкций IgG-IL-2, содержащих либо дикого типа (wt), либо
четырехмутантный (qm) IL-2;
20 на фиг. 42 - данные о концентрации в сыворотке иммуноконъюгатов IL-2
после однократного i.v.-введения "ненаправленных" конструкций Fab-IL-2-Fab, содержащих либо дикого типа (wt), либо четырехмутантный (qm) IL-2;
на фиг. 43 - результаты очистки четырехмутантного IL-2. (А) Хроматография с иммобилизованным ионом металла; (Б) гель-фильтрация; (В) 25 ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (NuPAGE Novex Бис-Трис-гель
(фирма Invitrogen), подвижный буфер MES); (Г) аналитическая гель-фильтрация (Супердекс 75 10/300 GL);
на фиг. 44 - результаты анализа пролиферации предварительно активированных CD8- (А) и CD4- (Б) Т-клеток после шестидневной инкубации с 30 различными иммуноконъюгатами IL-2;
на фиг. 45 - результаты анализа активации индуцированной клеточной гибели СОЗ+-Т-клеток после шестидневной инкубации с различными иммуноконъюгатами IL-2 и обработки в течение ночи антителом к Fas;
на фиг. 46 - результаты очистки иммуноконъюгата IgG-IL-2 (четырехмутантный, (qm)) на основе 4G8, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции, полученный на стадии аффинной хроматографии с белком А. (Б) Профиль элюции, полученный на стадии гель-фильтрации. (В) Анализ 5 конечного продукта с помощью аналитического ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Бис-Трис-минигель (фирма Invitrogen), подвижный буфер MOPS. Г) Аналитическая гель-фильтрация конечного продукта на колонке с Супердекс 200 (содержание мономера 97%);
на фиг. 47 - результаты очистки иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 10 28Н1, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции, полученный на
стадии аффинной хроматографии с белком А. (Б) Профиль элюции, полученный на стадии гель-фильтрации. (В) Анализ конечного продукта с помощью аналитического ДСН-ПААГ (восстанавливающие условия: NuPAGE Novex Бис-Tris-минигель (фирма Invitrogen), подвижный буфер MOPS; 15 невосстанавливающие условия: NuPAGE Трис-ацетат (фирма Invitrogen), подвижный Трис-ацетатный буфер). Г) Аналитическая гель-фильтрация конечного продукта на колонке с Супердекс 200 (содержание мономера 100%):
фиг. 48 - результаты анализа связывания иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, с человеческим FAP, 20 экспрессируемым в стабильно трансфектированных НЕК 293-клетках, по
данным FACS, в сравнении с соответствующей конструкцией Fab-IL-2 qm-Fab;
на фиг. 49 - результаты анализа высвобождения интерферона (IFN)-y на №С92-клетках в растворе, индуцированного иммуноконъюгатом IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, в сравнении с конструкцией Fab-25 IL-2 qm-Fab на основе 28Н1;
на фиг. 50 - результаты обнаружения фосфорилированного STAT5 с помощью FACS в различных типах клеток после 20-минутной стимуляции в растворе иммуноконъюгатом IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, в сравнении с конструкциямиРаЬ-1Х-2-РаЬ и Fab-IL-2 qm-Fab на 30 основе 28Н1, а также с пролейкином. А) NK-клетки (CD3 CD56+); Б) CD8-T-клетки (CD3+CD8+); В) СБ4+-Т-клетки (CD3+CD4+CD25"CD127+); Г) регуляторные Т-клетки (CD4+CD25+FOXP3+).
Примеры
Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в
изобретении. Как должно быть очевидно, можно осуществлять на практике
различные другие варианты осуществления изобретения с учетом
представленного выше описания изобретения в целом.
5 Пример 1
Общие методы
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring 10 Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяли согласно инструкциям производителей. Общую информацию, касающуюся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов, см. у: Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во NIH, публикация 15 No 91-3242, 1991.
Секвенирование ДНК
Последовательности ДНК определяли с помощью секвенирования двух цепей.
Синтез генов
20 Требуемые сегменты генов либо создавали с помощью ПЦР с
использованием соответствующих матриц, либо синтезировали на фирме Geneart AG (Регенсбург, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов посредством автоматического синтеза генов. В случаях, когда точная генная последовательность не была доступна, создавали олигонуклеотидные
25 праймеры на основе последовательностей ближайших гомологов и гены
выделяли с помощью ОТ-ПЦР из РНК, полученной из соответствующей ткани. Сегменты генов, фланкированные единичными сайтами, распознаваемыми рестриктазами, клонировали в стандартных клонирующих/секвенирующих векторах. Плазмидную ДНК очищали из трансформированных бактерий и
30 определяли концентрацию с помощью УФ-спектроскопии. Последовательность ДНК субклонированных фрагментов генов подтверждали ДНК-секвенированием. Создавали сегменты генов с требуемыми сайтами рестрикции, позволяющими субклонировать их в соответствующих экспрессионных векторах. Все
конструкции создавали с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей
лидерный пептид, который направляет секрецию белков в эукариотических
клетках. В SEQ ID NO: 263-273 представлены примеры лидерных пептидов и
кодирующих их полинуклеотидных последовательностей.
5 Получение слияний Ру-субъединица IL-2R -Fc и слияния g-субъединица IL-
2R -Fc
Для изучения аффинности связывания рецептора IL-2 создавали инструмент, который позволяет экспрессировать гетеродимерный рецептор IL-2; Р-субъединицу рецептора IL-2 сливали с молекулой Fc, которую создавали
10 таким образом, что она обладала способностью к гетеродимеризации
(Рс("впадина")) (см. SEQ ID NO: 274 и 275), используя технологию "knobs-into-holes" (Merchant и др., Nat Biotech. 16, 1998, сс. 677-68). Затем у-субъединицу рецептора IL-2 сливали с Рс("выступ")-вариантом (см. SEQ ID NO: 276 и 277), гетеродимеризованным с Рс("впадина"). Затем указанный гетеродимерный
15 содержащий Fc-слияние белок применяли в качестве субстрата для анализа взаимодействия 1Ь-2/1Ь-2-рецептор. а-Субъединицу IL-2R экспрессировали в виде мономерной цепи, несущей сайтрасщепления AcTev и Avi His-метку (SEQ ID NO: 278 и 279). Соответствующие субъединицы IL-2R кратковременно экспрессировали в клетках НЕК EBNA 293 с сывороткой в случае конструкции
20 Ру-субъединицы IL-2R и без сыворотки в случае конструкции а-субъединицы.
Конструкцию Ру-субъединицы IL-2R очищали на белке А (фирма GE Healthcare) с последующей гель-фильтрацией (фирма GE Healthcare, Супердекс 200). а-Субъединицу IL-2R очищали с использованием His-метки на колонке NiNTA (фирма Qiagen) с последующей гель-фильтрацией (фирма GE Healthcare,
25 Супердекс 75).
Получение иммуноконъюгатов
Более подробное описание получения и очистки иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, включая создание и созревание аффинности антигенсвязывающих фрагментов, представлено в разделе "Примеры", прилагаемом к публикации 30 РСТ WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Как описано в указанной публикации, различные антигенсвязывающие домены, мишенью которых является FAP, создавали с помощью метода фагового дисплея, включая клоны, обозначенные как 4G8, 3F2,
28Н1, 29В11, 14ВЗ и 4В9, которые применяли в описанных ниже примерах. Клон 28Н1 представлял собой антитело с созревшей аффинностью, основой которого является родительский клон 4G8, а клоны 29В11, 14ВЗ и 4В9 представляли собой антитела с созревшей аффинностью, основой которых являлся 5 родительский клон 3F2. Антигенсвязывающий домен, мишенью которого
является MCSP, обозначен в контексте настоящего описания как MHLG1 KV9.
Последовательности иммуноконъюгатов, содержащих IL-2 дикого типа, которые применяли в приведенных ниже примерах, представлены также в публикации РСТ WO 2011/020783. Последовательности, соответствующие
10 иммуноконъюгатам, которые содержали четырехмутантный IL-2, которые
применяли в приведенных ниже примерах, представляли собой: для 4G8: SEQ ID NO: 211 и 233; для 3F2: SEQ ID NO: 209 и 231; для 28Н1: SEQ ID NO: 219 и 233; для 29В11: SEQ ID NO: 221 и 231; для 14ВЗ: SEQ ID NO: 229 и 231; для 4В9: SEQ ID NO: 227 и 231; для MHLG1-KV9: SEQ ID NO: 253 и 255.
15 Последовательности ДНК создавали путем генного синтеза и/или классических методов молекулярной биологии и субклонировали в экспрессионных векторах млекопитающих (один для легкой цепи и один для тяжелой цепи слитого с IL-2 белка) под контролем промотора MPSV и против хода транскрипции относительно синтетического сайта полиА, каждый вектор нес
20 последовательность EBV OriP. Иммуноконъюгаты, которые применяли в описанных ниже примерах, получали путем контрасфекции клеток линии HEK293-EBNA, находящихся на экспоненциальной фазе роста, экспрессионными векторами млекопитающих, используя опосредуемую фосфатом кальция трансфекцию. Альтернативно этому, НЕК293-клетки,
25 растущие в суспензии, трансфектировали полиэтилеимином (ПЭИ) с
использованием соответствующих экспрессионных векторов. Альтернативно этому, для получения в бессывороточной среде применяли пулы стабильно трансфектированных СНО-клеток или клоны СНО-клеток. В то время как конструкции на основе 4G8, мишенью которых является FAP, такие как Fab-IL-
30 2-Fab, содержащие дикого типа или (четырех) мутантный IL-2, можно очищать с помощью аффинной хроматографии, используя в качестве матрикса белок А, конструкции с созревшей аффинностью на основе 28Н1, мишенью которых является FAP, такие как Fab-IL-2-Fab, очищали с помощью аффинной
хроматографии, используя в качестве матрицы белок G, при получении продукта в лабораторном масштабе.
В целом, метод состоял в следующем: конструкцию 28Н1 Fab-IL-2-Fab, мишенью которой является FAP, содержащую дикого или (четырех) мутантный 5 IL-2, очищали от супернатантов с помощью одной стадии аффинной
хроматографии (белок G) с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200, фирма GE Healthcare). Колонку с белком G уравновешивали с использованием 20мМ фосфата натрия, 20мМ цитрата натрия, рН 7,5, вносили супернатант и колонку промывали 20мМ фосфатом натрия, 20мМ цитратом натрия, рН 7,5.
10 Fab-IL-2-Fab элюировали с помощью 8,8мМ муравьиной кислоты, рН 3.
Элюированные фракции объединяли и очищали с помощью гель-фильтрации в буфере для конечной препаративной формы следующего состава: 25мМ фосфат калия, 125мМ хлорид натрия, ЮОмМ глицин, рН 6,7. Ниже представлены примеры результатов очистки и аналитических исследований.
15 Конструкции, мишенью которых является FAP, такие как 3F2 Fab-IL-2-Fab
или 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащие дикого типа или (четырех) мутантный IL-2, очищали аналогичным методом, включающим одну стадию очистки на белке А с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200, фирма GE Healthcare). Колонку с белком А уравновешивали с использованием 20мМ фосфата натрия, 20мМ
20 цитрата натрия, рН 7,5, вносили супернатант и колонку промывали 20мМ фосфатом натрия, 20мМ цитратом натрия, 500мМ хлоридом натрия, рН 7,5, после чего промывали 13,ЗмМ фосфатом натрия, 20мМ цитратом натрия, 500мМ хлоридом натрия, рН 5,45. Необязательно осуществляли третью промывку ЮмМ MES, 50мМ хлоридом натрия, рН 5. Fab-IL-2-Fab элюировали 20мМ цитратом
25 натрия, ЮОмМ хлоридом натрия, ЮОмМ глицином, рН 3. Элюированные
фракции объединяли и очищали с помощью гель-фильтрации в конечном буфере для препаративной формы? следующего состава: 25мМ фосфат калия, 125мМ хлорид натрия, ЮОмМ глицин, рН 6,7. Ниже более подробно представлены примеры процедур очистки и результаты для отобранных указанных ниже
30 конструкций.
Слитые белки IgG-IL-2 qm, мишенью которых является FAP, создавали на основе антител к FAP 4G8, 4В9 и 28Н1, в них один индивидуальный четырехмутантный (qm) IL-2, сливали с С-концом одной гетеродимерной
тяжелой цепи, как показано на фиг. 1Б. Для достижения направленного переноса к строме опухоли, в которой происходит избирательная экспрессия FAP, применяли Fab-область двухвалентного антитела (явление авидности). Для достижения гетеродимеризации в присутствии индивидуального 5 четырехмутантного IL-2 применяли технологию "knob-into-hole". Для того,
чтобы минимизировать создание гомодимерных слияний IgG-цитокин, цитокин сливали с С-концом (с делецией С-концевого остатка Lys) содержащей "выступ" тяжелой цепи IgG через G4-(SG4)2- или (048)з-линкер. Слияние антитело-цитокин обладало IgG-подобными свойствами. Для снижения связывания
10 FcyR/эффекторной функции и предупреждения коактивации FcR в Fc-домен интродуцировали мутации P329G L234A L235A (LALA). Последовательности этих иммуноконъюгатов представлены в SEQ ID NO: 297, 299 и 233 (28Н1), SEQ ID NO: 301, 303 и 231 (4B9) и SEQ ID NO: 315, 317 и 233 (4G8). Кроме того, создавали слитый белок, мишенью которого является СЕА, такой как IgG-IL-2 и
15 контрольный на основе DP47GS "ненаправленный" слитый белок IgG-IL-2 qm, в котором IgG не связывается со специфической мишенью. Последовательности этих иммуноконъюгатов представлены в SEQ ID NO: 305, 307 и 309 (DP47GS) и SEQ ID NO: 319, 321 и 323 (СН1А1А).
Конструкции IgG-IL-2 создавали путем кратковременной экспрессии в
20 клетках линии НЕК293 EBNA и очищали в целом согласно методу, описанному выше для конструкций Fab-IL-2-Fab. В целом, метод состоял в следующем: слитые белки IgG-IL-2 очищали с использованием одной стадии аффинной хроматографии на белке A (HiTrap ProtA, фирма GE Healthcare), уравновешивали с использованием 20мМ фосфата натрия, 20мМ цитрата натрия, рН 7,5. После
25 внесения супернатанта колонку сначала промывали 20мМ фосфатом натрия, 20мМ цитрата натрия, рН 7,5, а затем промывали 13,ЗмМ фосфатом натрия, 20мМ цитратом натрия, 500мМ хлоридом натрия, рН 5,45. Слитый белок IgG-цитокин элюировали с помощью 20мМ цитрата натрия, ЮОмМ хлорида натрия, ЮОмМ глицина, рН 3. Фракции нейтрализовали и объединяли и очищали гель-
30 фильтрацией (HiLoad 16/60 Супердекс 200, фирма GE Healthcare) в конечном
буфере для продукта, имеющем следующий состав: 25мМ фосфат калия, 125мМ хлорид натрия, ЮОмМ глицин, рН 6,7. Ниже представлены примеры результатов процедур очистки и результаты для отобранных указанных ниже конструкций.
Концентрацию белка в очищенных образцах белков определяли, измеряя оптическую плотность (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу иммуноконъюгатов анализировали с помощью 5 ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5мМ 1,4-дитиотреитол) или без него
и окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым (SimpleBlue(tm) SafeStain, фирма
(r)
Invitrogen). Гелевую систему NuPAGE Pre-Cast (фирма Invitrogen) применяли согласно инструкциям производителя (4-20% Трис-глициновые гели или 3-12% Бис-Трис). Содержание агрегатов в образцах иммуноконъюгатов анализировали 10 с использованием колонки для аналитической гель-фильтрации с Супердекс 200 10/300GL (фирма GE Healthcare) в подвижном буфере, содержащем 2мМ MOPS, 150мМ NaCl, 0,02% NaN3, рН 7,3, при 25°С. Аффинность связывания FAP
Способность связывать FAP расщепленных Fab-фрагментов, применяемых 15 в указанных примерах в качестве антигенсвязывающих фрагментов, определяли на основе резонанса поверхностного плазмона (SPR) с использованием устройства Biacore. В целом, метод состоял в следующем: антитело к His (Penta-His, фирма Qiagen 34660) иммобилизовали на СМ5-чипах для захвата ЮнМ человеческого, мышиного или обезьян циномолгус FAP-His (20 с). Температура 20 составляла 25°С и применяли HBS-EP в качестве буфера. Концентрация
анализируемого Fab составляла от 100 до 0,41нМ (с дублированием), скорость потока составляла 50 мкл/мин (ассоциация: 300 с, диссоциация: 600 с (4В9, 14ВЗ, 29В11, 3F2) или 1200 с (28Н1, 4G8), регенерация: 60 с,10мМ глицин рН 2). Аппроксимацию осуществляли на основе модели связывания 1:1, RI=0, 25 Rmax=лoкaльнoe значение (поскольку применяли формат захвата). В таблице 2 представлены данные об аффинности одновалентных компонентов по данным SPR.
KD в нМ
Человеческий FAP
FAP обезьян циномолгус
Мышиный FAP
14ВЗ Fab
0,47 0,47
0,61 0,59
4,7 4,7
29В11 Fab
0,19 0,19
0,21 0,2
1,3 1,2
3F2 Fab
6 6
4,7 5,3
8,9 9,5
28H1 Fab
2,6 2,6
3,7 3,7
0,13 0,18
4G8 Fab
53 (48 стационарное
состояние)
51 (48 стационарное
состояние)
33 (33 стационарное
состояние)
35 (34 стационарное
состояние)
0,07 0,07
Анализы биологической активности имеющих специфическую мишень (направленных) иммуноконъюгатов IL-2
Биологическую активность иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, мишенью 5 которых является FAP или MCSP, и иммуноконъюгатов IgG-IL-2, мишенью
которых является FAP, содержащих дикого типа или (четырех) мутантный IL-2, исследовали с использованием нескольких клеточных анализов в сравнении с поступающим в продажу IL-2 (пролейкин, фирма Novartis, Хирон).
Высвобождение IFN-y NK-клетками (в растворе)
10 №С92-клетки с недостаточной экспрессией IL-2 (100000 клетки/лунку в 96-
луночный планшет с U-образным дном) инкубировали с иммуноконъюгатами IL-2 в различных концентрациях, которые содержали дикого типа или (четырех) мутантный IL-2, в течение 24 ч в NK-среде (среда MEM-альфа фирмы Invitrogen (№ 22561-021), дополненная 10% FCS, 10% лошадиной сыворотки, 0,1мМ 215 меркаптоэтанолом, 0,2мМ инозитом и 0,02мМ фолиевой кислотой). Супернатанты собирали и высвобождение IFN-y анализировали с использованием набора II для ELISA, содержащего антитело к человеческому IFN-y, фирма Becton Dickinson (№ 550612). Пролейкин (фирма Novartis) служил в качестве положительного контроля при оценке опосредуемой IL-2 активации 20 клеток.
Пролиферация NK-клеток
Получали образцы крови здоровых добровольцев в содержащие гепарин шприцы и выделяли РВМС. Неповрежденные человеческие NK-клетки выделяли
из РВМС, используя набор II для выделения человеческих NK-клеток фирмы Miltenyi Biotec (№130-091-152). Экспрессирующие CD25 клетки оценивали с помощью проточной цитометрии. Для анализа пролиферации 20000 выделенных человеческих NK-клеток инкубировали в течение 2 дней во влажной камере при 5 37°С, 5% СО2 в присутствии различных иммуноконъюгатов IL-2, содержащих
дикого типа или (четырех)мутантный IL-2. Пролейкин (фирма Novartis) служил в качестве контроля. Через 2 дня содержание АТФ в клеточных лизатах измеряли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega (№ G7571/2/3). Процент роста рассчитывали, принимая 10 пролиферацию при наиболее высокой концентрации пролейкина за 100%, а пролиферацию необработанных нестимулированных IL-2 клеток за 0% Анализ фосфорилирования STAT5
Получали образцы крови здоровых добровольцев в содержащие гепарин шприцы и выделяли РВМС. РВМС обрабатывали иммуноконъюгатами IL-2,
15 содержащими дикого типа или (четырех) мутантный IL-2 в указанных
концентрациях или пролейкином (фирма Novartis) в качестве контроля. После 20-минутной инкубации при 37°С РВМС фиксировали предварительно нагретым Cytofix-буфером (фирма Becton Dickinson, № 554655) в течение 10 мин при 37°С, после чего повышали проницаемость клеток с помощью буфера III Phosflow
20 Perm (фирма Becton Dickinson, № 558050) в течение 30 мин при 4°С. Клетки отмывали дважды ЗФР, содержащим 0,1% БСА, перед осуществлением FACS-окрашивания, для которого использовали смеси антител для проточной цитометрии для выявления различных клеточных популяций и фосфорилирования STAT5. Образца анализировали с использованием устройства
25 FACSCantoII с HTS фирмы Becton Dickinson.
NK-клетки определяли как CD3 CD56+, С08-позитивные Т-клетки определяли как CD3+CD8+, С04-позитивные Т-клетки определяли как CD4+CD25"CD127+ и Тгеё-клетки определяли как CD4+CD25+FoxP3+. Пролиферация Т-клеток и AICD
30 Получали образцы крови здоровых добровольцев в содержащие гепарин
шприцы и выделяли РВМС. Неповрежденные Т-клетки выделяли с использованием набора для выделения Т-клеток Pan Т Cell Isolation Kit II фирмы Miltenyi Biotec (№ 130-091-156). Т-клетки предварительно стимулировали 1
мкг/мл ФГА-М (фирма Sigma Aldrich, № L8902) в течение 16 ч перед добавлением пролейкина или иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, содержащих дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, к промытым клеткам в течение еще 5 дней. Через 5 дней содержание АТФ в клеточных лизатах измеряли с помощью 5 люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы
Promega (№ G7571/2/3). Относительную пролиферацию рассчитывали, принимая пролиферацию при наиболее высокой концентрации пролейкина за 100%.
Экспозицию фосфатидилсерина (PS) и клеточную гибель Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии (FACSCantoII, фирма BD 10 Biosciences) с использованием клеток, окрашенных аннексином V (набор для окрашивания Annexin-V-FLUOS, фирма Roche Applied Science) и йодидом пропидиния (PI). Для индукции индуцированной активацией клеточной гибели (AICD) Т-клетки обрабатывали индуцирующим апоптоз антителом к Fas (фирма Millipore, клон Ch 11) в течение 16 ч после 16-часовой обработки ФГА-М и 515 дневной обработки иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab. Окрашивание аннексином V (Ann-V) осуществляли согласно инструкциям производителя. В целом, метод состоял в следующем: клетки отмывали Ann-V-связывающим буфером (1* маточный раствор: 0,01М Hepes/NaOH, рН 7,4, 0,14М NaCl, 2,5мМ СаС12) и окрашивали в течение 15 мин при КТ с помощью комплекса аннексии V-ФИТЦ 20 (фирма Roche). Клетки вновь отмывали Ann-V-связывающим буфером перед
добавлением 200 мкл/лунку Ann-V-связывающего буфера, содержащего PI (0,3 мкг/мл). Клетки немедленно анализировали с помощью проточной цитометрии. Связывание с экспрессирующими FAP клетками
Связывание иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью 25 которых является FAP, с человеческим FAP, экспрессируемым на стабильно трансфектированных НЕК293-клетках оценивали с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: 250000 клеток на лунку инкубировали с взятыми в указанных концентрациях иммуноконъюгатами в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°С и однократно отмывали ЗФР/0,1% БСА. 30 Связанные иммуноконъюгаты определяли после инкубации в течение 30 мин при 4°С с конъюгированным с ФИТЦ Р(аЬ')2-фрагментом козьего антитела, специфического в отношении F(ab')2, AffiniPure (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-097, рабочий раствор: разведение 1:20 в ЗФР/0,1% БСА,
свежеприготовленный), используя устройство FACS CantoII (программное обеспечение FACS Diva).
Анализ с помощью FACS интернализации FAP при связывании Для нескольких известных в данной области антител к FAP известно, что 5 они индуцируют интернализацию FAP при связывании (описано, например, у Baum и др., J Drug Target 15, 2007, сс. 399-406; Bauer и др., Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings (издание после конференции), 28 мая 2010 г. (дополнение от 20 мая), реферат № 13062 (2010); Ostermann и др., Clin Cancer Res 14, 2008, сс. 4584-4592). По этой причине при создании
10 изобретения анализировали способность к интернализации предлагаемых в изобретении иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab. В целом, метод состоял в следующем: клетки линии GM05389 (фибробласты легкого человека), которые культивировали в среде ЕМЕМ, дополненной 15% FCS, отделяли, промывали, подсчитывали, анализировали их жизнеспособность и высевали с плотностью
15 2x105 клеток/лунку в 12-луночные планшеты. На следующий день
иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, разводили холодной средой и давали связываться с клеточной поверхностью в течение 30 мин на льду. Избыток несвязанного антитела отмывали с помощью холодного ЗФР и клетки дополнительно инкубировали в 0,5 мл полной предварительно
20 нагретой среды при 37°С в течение указанных периодов времени. Через
различные моменты времени клетки переносили на лед, однократно отмывали холодным ЗФР и инкубировали с вторичным антителом (конъюгированное с ФИТЦ Р(аЬ')2-фрагментом козьего антитела, специфического в отношении F(ab')2, AffiniPure (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-097,
25 разведение 1:20) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали дважды
ЗФР/0,1% БСА, переносили в 96-луночный планшет, центрифугировали (400 х g) в течение 4 мин при 4°С и клеточный дебрис ресуспендировали путем интенсивного перемешивания. Клетки фиксировали, используя 100 мкл 2% PFA (параформальдегид). Для FACS-оценки клетки ресуспендировали, используя по
30 200 мкл ЗФР/0,1% БСА/образец, и осуществляли измерения с использованием протокола для планшетов для устройства FACS CantoII (программное обеспечение FACS Diva). Пример 2
При создании изобретения были разработаны мутантные версии IL-2, которые содержали одну или несколько следующих мутаций (по сравнению с последовательностью IL-2 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1):
1. ТЗА - обеспечивает "выключение" предсказанного сайта О-
5 гликозилирования,
2. F42A - обеспечивает "выключение" взаимодействия IL-2/IL-2R а,
3. Y45A - обеспечивает "выключение" взаимодействия IL-2/IL-2R а,
4. L72G - обеспечивает "выключение" взаимодействия IL-2/IL-2R а,
5. С125 А - ранее описанная мутация, препятствующая связыванию посредством 10 дисульфидного мостика димеров IL-2.
Мутантный полипептид IL-2 , содержащий все мутации 1-4, обозначен в контексте настоящего описания как четырехмутантный (qm) IL-2. Он может содержать также мутацию 5 (см. SEQ ID NO: 19).
Помимо трех мутаций F42A, Y45A и L72G, созданных для воздействия на
15 связывание с CD25, ТЗА-мутация выбрана для элиминации сайта О-гликозилирования и получения белкового продукта с более высокой гомогенностью и чистотой, когда полипептид или иммуноконъюгат IL-2 qm экспрессируется в эукариотических клетках, таких как СНО или НЕК293-клетки. С целью очистки Швб-метку интродуцировали на С-конец, соединяя через
20 VD-последовательность. Для сравнения создавали немутантную аналогичную версию IL-2, включающую только мутацию С145 А, препятствуя тем самым образованию нежелательных межмолекулярных дисульфидных мостиков (SEQ ID NO: 3). Соответствующие молекулярные массы без сигнальной последовательности составляли 16423 Да для "оголенного" IL-2 и 16169 Да для
25 "оголенного" IL-2 qm. IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 с His-меткой трансфектировали клетки линии НЕК EBNA в бессывороточной среде (среда F17) У профильтрованного супернатанта заменяли буфер посредством перекрестного потока перед его внесением в картридж NiNTA Superflow (5 мл, фирма Qiagen). Колонку промывали буфером для промывки: 20мМ фосфат
30 натрия, 0,5М хлорид натрия, рН 7,4 и элюировали буфером для элюции: 20мМ фосфат натрия, 0,5М хлорид натрия, 0,5М имидазол, рН 7,4. После загрузки колонку отмывали 8 объемами колонки (CV) буфера для отмывки, 10 CV 5% буфера для элюции (что соответствовало 25мМ имидазолу), затем элюировали с
использованием градиента имидазола вплоть до 0,5М. Объединенный элюат окончательно очищали с помощью гель-фильтрации на колонке HiLoad 16/60 с Супердекс75 (фирма GE Healthcare) в 2мМ MOPS, 150мМ хлорид натрия, 0,02% азида натрия, рН 7,3. На фиг. 2 представлена хроматограмма, полученная после 5 очистки с использованием His-метки "оголенного" IL-2 дикого типа. Пул 1 получали из фракций 78-85, пул 2 из фракций 86-111. На фиг. 3 представлена хроматограмма, полученная после гель-фильтрации IL-2 дикого типа, в каждом пуле объединены фракции 12-14. На фиг. 4 представлен результат аналитической гель-фильтрации IL-2 дикого типа на колонке с Супердекс 75,
10 10/300 GL (фирма GE Healthcare) в 2мМ MOPS, 150мМ хлорид натрия, 0,02% азида натрия, рН 7,3. В пул 1 и 2 входили два белка с молекулярной массой примерно 22 и 20 кДа. Пул 1 включал большее количество белка, имеющего больший размер, а пул 2 включал большее количество белка, имеющего меньший размер, предположительно такое различие является следствием
15 различий в О-гликозилировании. Выходы составляли примерно 0,5 мг/л
супернатанта на пул 1 и примерно 1,6 мг/л супернатанта на пул 2. На фиг. 5 представлена хроматограмма, полученная после очистки с использованием His-метки четырехмутантного IL-2. Пул 1 состоял из фракций 59-91, пул 2 из фракций 92-111. На фиг. 6 представлена хроматограмма, полученная после гель-
20 фильтрации четырехмутантного IL-2, при этом сохраняли только пул 2,
содержащий фракции 12-14. На фиг. 7 представлен результат аналитической гель-фильтрации четырехмутантного IL-2 на колонке с Супердекс 75, 10/300 GL (фирма GE Healthcare) в 2мМ MOPS, 150мМ хлорид натрия, 0,02% азида натрия, рН 7,3. Препарат "оголенного" четырехмутантного IL-2 включал только один
25 белок 20 кДа. У этого белка был "выключен" сайт О-гликозилирования. Аликвоты "оголенных" IL-2 дикого типа и четырехмутантного хранили в замороженном состоянии при -80°С. Выходы составляли примерно 0,9 мг/л супернатанта.
Вторую партию меченного с помощью His четырехмутантного IL-2 30 очищали согласно описанному выше методу с помощью аффинной
хроматографии на иммобилизованном металле (IMAC) и затем с помощью гель-фильтрации (SEC). Применяемые буферы для IMAC представляли собой буфер для уравновешивания и промывки колонки, содержащий 50мМ Трис, 20мМ
имидазол, 0,5М NaCl, рН 8, и буфер для элюции, содержащий 50мМ Трис, 0,5М
имидазол, 0,5 MNaCl, рН 8. Применяемый для SEC и конечный буфер для
продукта включал 20мМ гистидин, 140мМ NaCl, рН 6. На фиг. 43 представлены
результаты такой очистки. Выход составлял 2,3 мл/л супернатанта.
5 Затем определяли аффинность в отношении гетеродимера IL-2R Ру и а-
субъединицы IL-2R с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR). В целом, метод состоял в следующем: лиганд - либо а-субъединицу человеческого IL-2R (Fc2), либо гетеродимер IL2-R, включающий Р в качестве "выступа", у в качестве "впадины" (Fc3) -иммобилизовали СМ5-чипе. Затем "оголенные" IL-2
10 дикого типа (пул 1 и 2) или четырехмутантный IL-2 и пролейкин (фирма
Novartis/Chiron) наносили на чип в качестве анализируемых веществ при 25°С в HBS-EP-буфере в концентрациях от 300 до 1,2нМ (разведение 1:3). Скорость потока составляла 30 мкл/мин и применяли следующие условия: ассоциация 180 с, диссоциация: 300 с и регенерация: 2 х 30 с ЗМ MgC^ для гетеродимера IL2-R
15 Р "выступ", у "впадина", 10 с 50мМ NaOH для а-субъединицы IL-2R. Применяли модель связывания 1:1 для аппроксимации (связывание 1:1, RI^O,
25 Полученные данные демонстрируют, что "оголенный" четырехмутантный
IL-2 обладает требуемым поведением и утрачивает способность к связыванию с
Rmax=лoкaльнoe значение для IL-2R Ру, кажущаяся величина Ко, связывание 1:1, RI=0, Rmax = локальное значение для IL-2R а). В таблице 3 представлены соответствующие величины KQ, характеризующие связывание человеческого IL-20 2R дикого типа и четырехмутантного IL-2, а также пролейкина с IL-2R Ру и а-субъединицей IL-2R.
а-субъединицей IL-2R, в то время как связывание с IL-2R Ру сохраняется и является сопоставимым со связыванием соответствующей конструкции IL-2 дикого типа и пролейкина. Различия между пулами 1 и 2 IL-2 дикого типа, по-видимому, могут быть связаны с различиями в О-гликозилировании. Эту 5 вариабельность и гетерогенность можно преодолевать у четырехмутантного IL-2R путем интродукции мутации Т23А. Пример 3
Три мутации F42A, Y45A и L72G и мутацию ТЗА интродуцировали в формат Fab-IL-2-Fab (фиг. 1А), используя антитело к FAP 4G8 в качестве модели
10 обеспечивающего направленный перенос домена либо в виде конструкции с
одной мутацией: 1) 4G8 IL-2 ТЗА, 2) 4G8 IL-2 F42A, 3) 4G8 IL-2 Y45A, 4) 4G8 IL-2 L72G, либо их объединяли также в конструкциях Fab-IL-2 mt-Fab в виде: 5) трех мутаций F42A/Y45A/L72G, или 6) четырех мутаций 2ТЗA/F42A/Y45A/L72G для инактивации сайта О-гликозилирования. Для сравнения использовали
15 конструкцию Fab-IL-2 wt-Fab на основе 4G8. Все конструкции содержали
мутацию С145А, препятствующую образованию связанных дисульфидными мостиками димеров IL-2. Различные конструкции Fab-IL-2-Fab экспрессировали в НЕК 293-клетках и очищали согласно указанному выше методу с помощью белка А и гель-фильтрации, которые описаны выше. Затем аффинность
20 отобранных вариантов IL 2 в отношении гетеродимера человеческого и
мышиного IL-2R Ру и в отношении а-субъединицы человеческого и мышиного IL-2R определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) (фирма Biacore), используя рекомбинантный гетеродимер IL-2R Ру и мономерный содержащий а-субъединицу IL-2R, в следующих условиях: а-субъединицу IL-2R
25 иммобилизовали, используя две плотности иммобилизации, проточную ячейку с более высокой иммобилизацией применяли для мутантов, у которых утрачена способность связываться с CD25. Использовали следующие условия: химическая иммобилизация: гетеродимер человеческого IL-2R Ру - 1675 RU; гетеродимер мышиного IL-2R Ру - 5094 RU; а-субъединица человеческого IL-2R - 1019 RU; а-
30 субъединица человеческого IL-2R - 385 RU, а-субъединица мышиного IL-2R -1182 RU; а-субъединица мышиного IL-2R - 378 RU, температура: 25°С, анализируемые субстанции: варианты содержащих Fab конструкций Fab-IL-2 на основе 4G8 - от 3,1 до 200нМ, скорость потока - 40 мкл/мин, ассоциация: 180 с,
диссоциация: 180 с, регенерация: ЮмМ глицин,рН 1,5: 60 с, 40 мкл/мин.
Аппроксимация: реакционная модель двух состояний (конформационное
изменение), RI = 0 Rmax = локальное значение. Результаты кинетического
анализа представлены в таблице 4.
5 Таблица 4. Аффинность иммуноконъюгатов, мишенью которых является
FAP, содержащих мутантные полипептиды IL-2, к IL-2R с промежуточной аффинностью и к а-субъединице IL-2R (Кц)
Конструкция Fab-IL-2-Fab
Hu IL-2R Зу
Ни IL-2R а
Mu IL-2R Ру
Ми IL-2R а
4G8 IL-2 wt
3,8нМ
4,5нМ
45,6нМ
29нМ
4G8 IL-2 ТЗА
1,6нМ
4,9нМ
15,6нМ
15нМ
4G8 IL-2 F42A
4,7нМ
149нМ
57нМ
ЗбЗнМ
4G8 IL-2 Y45A
3,9нМ
22,5нМ
41,8нМ
369нМ
4G8 IL-2 L72G
45,ЗнМ
4G8 IL-2 трехмутантный F42A/Y45A/L72G
5,6нМ
нет связывания
68,8нМ
4G8 IL-2 четырехмутантный T3A/F42A/Y45A/L72G
5,2нМ
нет связывания
56,2нМ
нет связывания
Одновременное связывание с гетеродимером IL-2R Ру и FAP
10 продемонстрировано с помощью SPR. В целом, метод состоял в следующем:
конструкцию человеческого IL-2R Ру, созданную с помощью технологии "knob-into-hole", иммобилизовали химически на СМ5-чипе и ЮнМ конструкцию Fab-IL-2-Fab захватывали в течение 90 с. Человеческий FAP служил в качестве анализируемой субстанции и его использовали в концентрациях от 200 до 0,2нМ.
15 Использовали следующие условия: температура: 25°С, буфер: HBS-EP, скорость потока: 30 мкл/мин, ассоциация: 90 с, диссоциация: 120 с. Регенерацию осуществляли в течение 60 с, используя ЮмМ глицин, рН 2. Аппроксимацию осуществляли с использованием модели связывания 1:1, RI Ф 0, Rmax = глобальное значение. Анализ образования мостиков, проведенный с помощью
20 SPR, продемонстрировал, что конструкции Fab-IL-2-Fab, как дикого типа, так и четырехмутантные, а также полученный с помощью созревания аффинности к FAP связывающийся клон 28Н1 или его родительские антитела 3F2 или 4G8 в концентрации ЮнМ обладали способностью связываться одновременно с гетеродимером IL 2R Ру, иммобилизованном на чипе, а также и с человеческим
25 FAP, применяемым в качестве анализируемой субстанции (фиг. 8). Результаты определения аффинности представлены в таблице 5.
5 Взятые в совокупности, данные SPR-анализа демонстрируют, что I)
мутация ТЗА не влияет на связывание с CD25, II) три мутации F42A, Y45A и L72G не влияют на аффинность к гетеродимеру IL-2R Ру, но они снижают аффинность к CD25 следующим образом: wt = ТЗА > Y45A (примерно в 5 раз ниже) > L72G (примерно в 10 раз ниже) > F42A (примерно в 33 раза ниже); III)
10 комбинация трех мутаций F42A, Y45A и L72G в сочетании с воздействующей на сайт О-гликозилирования мутацией ТЗА или без указанной мутации приводит к полной потере способности связываться CD25 при определении в условиях SPR, IV) хотя аффинность человеческого IL-2 к мышиному гетеродимеру IL-2R Ру и а-субъединице IL-2R уменьшается примерно в 10 раз по сравнению с
15 человеческими рецепторами IL-2R, отобранные мутации не влияют на
аффинность к мышиному гетеродимеру IL-2R ру, но аннулируют связывание с а-субъединицей мышиного IL-2R соответственно. Этот результат свидетельствует о том, что мыши представляют собой приемлемую модель для изучения фармакологических и токсикологических воздействий мутантных IL-2, хотя в
20 целом IL-2 обладает меньшей токсичностью для грызунов, чем для человека.
Помимо утраты сайта О-гликозилирования одним из дополнительных преимуществ комбинации четырех мутаций ТЗА, F42A, Y45A, L72G является снижение поверхностной гидрофобности четырехмутантного IL-2 вследствие замены экспонируемых на поверхности гидрофобных остатков, таких как
25 фенилаланин, тирозин или лейцин, на аланин. Анализ температуры агрегации методом динамического рассеяния света продемонстрировал, что температура агрегации иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, которые содержат дикого типа или четырехмутантный IL-2, находилась в одинаковом диапазоне: примерно 57-58°С для Fab-IL-2-Fab на основе
родительского 3F2 и для производного 3F2 с созревшей аффинностью 29В11; и в диапазоне от 62-63°С для Fab-IL-2-Fab на основе родительского 4G8 и производных 4G8 с созревшей аффинностью 28Н1, 4В9 и 14ВЗ 4G8, что свидетельствует о том, что комбинация четырех мутаций не оказывает 5 отрицательного воздействия на стабильность белка. В подтверждение
предпочтительных свойств отобранных четырех мутаций IL-2, установлено, что выход после кратковременной экспрессии иммуноконъюгата в формате четырехмутантного Fab-IL-2 qm-Fab может даже превышать уровни экспрессии, обнаруженные при применении соответствующих конструкций Fab-IL-2 wt-Fab.
10 И, наконец, фармакокинетический анализ (ФК) продемонстрировал, что
конструкции на основе 4G8 как Fab-IL-2 qm-Fab, так и Fab-IL-2 wt-Fab обладают сопоставимыми ФК-свойствами (см. пример 9, ниже). На основе этих данных и данных клеточных анализов, которые описаны ниже в примере 4, четыре мутации ТЗА, F42A, Y45A, L72G отобраны в качестве идеальной комбинации
15 мутаций для того, что аннулировать связывание CD25 с IL-2 в обладающем направленным действием иммуноконъюгате Fab-IL-2-Fab. Пример 4
Иммуноконъюгаты Fab-IL 2-Fab на основе 4G8, мишенью которых является FAP, содержащие IL-2 дикого типа или имеющий одну мутацию 4G8 IL-2 ТЗА,
20 4G8 IL-2 F42A, 4G8 IL-2 Y45A, 4G8 IL-2 L72G или IL-2, имеющий
соответственно три мутации (F42A/Y45A/L72G) или четыре мутации (ТЗA/F42A/Y45A/L72G), последовательно тестировали с использованием описанных выше клеточных анализов в сравнении с пролейкином.
Индуцируемое IL-2 высвобождение IFN-y оценивали после инкубации NK-
25 клеток линии NK92 с указанными конструкциями (фиг. 9). №С92-клетки
экспрессируют на их поверхности CD25. Результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал меньшей эффективностью в отношении индукции высвобождения IFN-y, чем пролейкин, что является ожидаемым с учетом примерно в 10 раз более низкой аффинности
30 Fab-IL-2 wt-Fab к гетеродимеру IL-2R Ру. Интродукция индивидуальных
мутаций, влияющих на связывание с CD25, а также комбинации трех мутаций, влияющих на связывание с CD25, в трехмутантный IL-2 привела к получению конструкций Fab-IL-2-Fab, которые оказались сопоставимыми в пределах
Затем индукцию пролиферации выделенных человеческих NK-клеток иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab оценивали на основе анализа пролиферации (Cell Titer Glo, фирма Promega) (фиг. 10). В отличие от №С92-клеток свежевыделенные NK-клетки не экспрессируют CD25 (или экспрессируют очень
10 небольшие количества). Результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал примерно в 10 раз более низкой эффективностью в отношении индукции пролиферации NK-клеток, чем пролейкин, что является ожидаемым, учитывая примерно в 10 раз более низкую аффинность иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab к гетеродимеру IL-2R Ру.
15 Интродукция индивидуальных мутациях, влияющих на связывание с CD25, а также комбинации трех мутаций, влияющих на связывание с CD25, в трехмутантный IL-2 привела к получению конструкций Fab-IL-2-Fab, которые оказались сопоставимыми в пределах ошибки метода с конструкцией, содержащей IL-2 дикого типа, с позиций эффективности и абсолютной индукции
20 пролиферации; обнаружен лишь очень небольшой сдвиг эффективности у
трехмутантного Fab-IL-2-Fab. Во втором эксперименте оценивали индукцию пролиферация активированных ФГА Т-клеток после инкубации с взятыми в различных количествах пролейкином и иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab (фиг. 11). Поскольку активированные Т-клетки экспрессируют CD25, выраженное
25 снижение Т-клеточной пролиферации удалось обнаружить при инкубации с иммуноконъюгатами, содержащими IL-2 с одной из мутаций F42A, L72G или Y45A; в случае F42A продемонстрировано наиболее выраженное снижение,
далее в порядке убывания действия располагались мутации L72G и Y45A, в то время как при применении Fab-IL-2 wt-Fab или Fab-IL-2 (T3A)-Fab активация сохранялась практически на таком же уровне, что и при применении пролейкина. Эти данные свидетельствуют о снижении аффинности к CD25 при 5 оценке с помощью SPR (см. описанный выше пример). Комбинация трех
мутаций, влияющих на связывание с CD25, в трехмутантном IL-2 приводит к получению иммуноконъюгата, который опосредует значительное снижение индукции Т-клеточной пролиферации в растворе. В контексте этих результатов при создании изобретения оценивали клеточную гибель Т-клеток с
10 использованием окрашивания аннексином V/PI с последующей
сверхстимуляцией, индуцированной первой стимуляцией, которую осуществляли путем 16-часовой обработки 1 мкг/мл ФГА, второй стимуляцией путем обработки в течение 5 дней пролейкином или соответственно иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab, с последующей третьей стимуляцией путем
15 обработки 1 мкг/мл ФГА. С помощью такого процесса было обнаружено, что
индуцированная активацией клеточная гибель (AICD) у сверхстимулированных Т-клеток существенно снижалась при использовании иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, содержащих IL-2 с индивидуальными мутациями F42A, L72G и Y45A, влияющими на связывание с CD25, при этом при применении F42A и L72G
20 обнаружено наиболее сильное снижение, которое оказалось сходным со
снижением достигаемом при применении трех мутаций в иммуноконъюгате, содержащем трехмутантный IL-2 (фиг. 12). В последней серии экспериментов изучали воздействия Fab-IL-2 qm-Fab на индукцию фосфорилирования STAT5 в сравнении с Fab-IL-2 wt-Fab и пролейкином в человеческих NK-клетках, CD4-
25 Т-клетках, С08+-Т-клетках и Тгеё-клетках из человеческих РВМС (фиг. 13). Для NK-клеток и СВ8+-Т-клеток, для которых характерно отсутствие экспрессии или очень низкий уровень экспрессии CD25 (что означает, что передача сигналов IL-2R опосредуется гетеродимером IL-2R Ру), установлено, что формат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал примерно в 10 раз более низкой
30 эффективностью в отношении индукции фосфорилирования STAT5, чем
пролейкин, и что эффективность Fab-IL-2 qm-Fab оказалась сопоставимой с эффективностью конструкции Fab-IL-2 wt-Fab. В случае СВ4+-Т-клеток, для которых характерна быстрая повышающая регуляция CD25 при стимуляции,
иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab оказался менее эффективным, чем Fab-IL-2 wt-Fab, но все еще обладал сопоставимой способностью индуцировать передачу сигналов IL-2R при применении в насыщающих концентрациях. Это противоположно данным, полученным для Тгеё-клеток, для которых 5 эффективность Fab-IL-2 qm-Fab была существенно более низкой по сравнению с эффективностью иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab, из-за высокого уровня экспрессии на CD25 Тгеё-клетках и, как следствие, высокой аффинности связывания иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab с CD25 на Тгеё-клетках. В результате аннулирования способности связываться с CD25 у иммуноконъюгата
10 Fab-IL-2 qm-Fab передача сигналов IL-2 в Тгеё-клетках активируется только через гетеродимер IL-2R Ру при его применении в концентрациях, в которых передача сигналов IL-2R активирует СВ25-негативные эффекторные клетки через гетеродимер IL-2R Ру. В целом, установлено, что четырехмутантный IL-2, указанный в настоящем описании, обладает способностью активировать
15 передачу сигналов IL-2R через гетеродимер IL-2R Ру, но не приводит ни к AICD, ни к преимущественной стимуляции Тгеё-клеток по сравнению с другими эффекторными клетками. Пример 5
Основываясь на данных, описанных в примерах 2 и 3, создавали 20 иммуноконъюгаты с созревшей аффинностью (иммуноконъюгаты, содержащие Fab с созревшей аффинностью) Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на основе клонов 28Н1 или 29В11 и очищали их с использованием методов, описанных в разделе "Общие методы" В целом, созданный на основе 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP, очищали с использованием одной 25 стадии аффинной хроматографии (белок G) с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200). Для уравновешивания колонки использовали ЗФР и супернатант пула стабильных СНО-клеток (CDCHO среда) вносили на колонку с белком G (фирма GE Healthcare), колонку промывали ЗФР и затем образцы элюировали 2,5мМ НС1 и фракции немедленно нейтрализовали 10х ЗФР. Гель-30 фильтрацию осуществляли в конечном буфере для продукта, имеющем
следующий состав: 25мМ фосфат натрия, 125мМ хлорид натрия, ЮОмМ глицин, рН 6,7 на колонке Супердекс 200. На фиг. 14 представлены профили элюции
после очистки и результаты аналитической характеризации продукта с помощью ДСН-ПААГ (4-20% Бис-Трис-минигель NuPAGE Novex, фирма Invitrogen, подвижный буфер MOPS, восстанавливающие и невосстанавливающие условия). С учетом низкой связывающей способности 28Н1 Fab-фрагмента с белком G и 5 белком А применение дополнительных стадий захвата может приводить к более высоким выходам продукта.
Иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab на основе клонов 4G8, 3F2 и 29В11, мишенью которых является FAP, и Fab-IL-2 qm-Fab на основе клона MHLG1 KV9, мишенью которых является MCSP, очищали с помощью одной стадии
10 аффинной хроматографии (белок А) с последующей гель-фильтрацией
(Супердекс 200). Для уравновешивания колонки использовали 20мМ фосфат натрия, 20мМ цитрат натрия, рН 7,5 и супернатант вносили на колонку с белком А. Первую стадию промывки осуществляли с помощью 20мМ фосфата натрия, 20мМ цитрата натрия, рН 7,5, после чего осуществляли вторую стадию
15 промывки, используя: 13,ЗмМ фосфат натрия, 20мМ цитрат натрия, 500мМ хлорид натрия, рН 5,45. Иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab элюировали с помощью 20мМ цитрата натрия, ЮОмМ хлорида натрия, ЮОмМ глицина, рН 3. Гель-фильтрацию осуществляли в конечном буфере для продукта, имеющем следующий состав: 25мМ фосфат калия, 125мМ хлорид натрия, ЮОмМ глицин,
20 рН 6.7. На фиг. 15 представлены профили элюции после очистки и результаты аналитической характеризации продукта с помощью ДСН-ПААГ (4-20% Бис-Трис-минигель NuPAGE Novex, фирма Invitrogen, подвижный буфер MOPS, восстанавливающие и невосстанавливающие условия) иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, на фиг. 16 - иммуноконъюгата MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab.
25 Слитые белки IgG-IL-2 qm, мишенью которых является FAP, на основе
антител к FAP 4G8, 4В9 и 28Н1 и контрольный слитый "ненаправленный" белок на основе DP47GS IgG-IL-2 qm создавали согласно методам, описанным выше в разделе "Общие методы". На фиг. 46 и 47 соответственно представлены хроматограммы и профили элюции, полученные при очистке (А, Б) в также
30 результаты аналитического ДСН-ПААГ и гель-фильтрации конечных
очищенных конструкций (В, Г) иммуноконъюгатов на основе 4G8 и 28Н1. Выходы после кратковременной экспрессии составляли 42 мг/л для
иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и 20 мг/л для иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 28Н1.
Способность связывать FAP иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm на основе антител к FAP 4G8 и 28Н1 определяли с помощью метода резонанса 5 поверхностного плазмона (SPR) с использованием устройства Biacore в
сравнении с соответствующими немодифицированными антителами типа IgG. В целом, метод состоял в следующем: антитело к His (Penta-His, фирма Qiagen, № 34660) иммобилизовали СМ5-чипах для захвата ЮнМ меченного с помощью His человеческого FAP (20 с). Температура составляла 25°С и в качестве буфера
10 применяли HBS-EP. Концентрации анализируемой субстанции находились в
диапазоне от 50 до 0,05нМ, скорость потока составляла 50 мкл/мин (ассоциация: 300 с, диссоциация: 900 с, регенерация: 60 с помощью ЮмМ глицина, рН 2). Аппроксимацию осуществляли на основе модели связывания 1:1, RI = 0, Rmax = локальное значение (поскольку применяли формат захвата). В таблице 7
15 представленные оцененные кажущиеся величины аффинности (пМ, авидность), определенные с помощью SPR, аппроксимированные с использованием модели связывания 1:1, RI = 0, Rmax = локальное значение. Таблица 7
KD [пМ]
Hu FAP
4G8 IgG-IL-2 qm
100
4G8 IgG
28Н1 IgG-IL-2 qm
175
28H1 IgG
200
20 Полученные данные свидетельствуют о том, что в пределах ошибки метода
аффинность к человеческому FAP сохраняется у иммуноконъюгата на основе 28Н1 или слегка снижается у иммуноконъюгата на основе 4G8 по сравнению с соответствующими немодифицированными антителами. Пример 6
25 Аффинность иммуноконъюгатов с созревшей аффинностью Fab-IL-2-Fab на
основе 28Н1 и 29В11, мишенью которых является FAP, каждый из которых содержал дикого типа или четырехмутантный IL-2, и Fab-IL-2 wt-Fab на основе 3F2 определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) в отношении гетеродимера IL-2R Ру человека, мышей или обезьян циномолгус,
используя рекомбинантный гетеродимер IL-2R Ру в следующих условиях: лиганд: гетеродимер IL-2R Р"выступ"у"впадина" человека, мышей и обезьян циномолгус, иммобилизованный на СМ5-чипе, анализируемая субстанция: 28Н1 или 29В11 Fab-IL-2-Fab (содержащий дикого типа или четырехмутантный IL-2), 5 3F2 Fab-IL-2-Fab (содержащий IL-2 дикого типа), температура: 25°С или 37°С, буфер: HBS-EP, концентрации анализируемой субстанции: от 200 до 2,5нМ, скорость потока: 30 мкл/мин, ассоциация: 300 с, диссоциация: 300 с, регенерация: 60 с, ЗМ MgCl2, аппроксимация: модель связывания 1:1, RI^O, Rmax = глобальное значение. Аффинность иммуноконъюгатов на основе 28Н1 и
10 29В11 с созревшей аффинностью Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, каждый из которых содержал дикого типа или четырехмутантный IL-2, и Fab-IL-2 wt-Fab на основе 3F2 определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) в отношении а-субъединицы IL-2R человека, мышей или обезьян циномолгус, используя рекомбинантную мономерную а-субъединицу IL-2R в
15 следующих условиях: лиганд: а-субъединица IL-2R человека, мышей и обезьян циномолгус, иммобилизованная СМ5-чипе, анализируемая субстанция: 28Н1 или 29В11 Fab-IL-2-Fab (содержащий дикого типа или мутантный IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (содержащий IL-2 дикого типа), температура: 25°С или 37°С, буфер: HBS-EP, концентрации анализируемой субстанции: от 25 до 0,ЗнМ, скорость потока:
20 30 мкл/мин, ассоциация: 120 с, диссоциация: 600 с, регенерация: отсутствует, аппроксимация: модель связывания 1:1, RI Ф 0, Rmax = глобальное значение.
Результаты кинетического анализа с использованием гетеродимера IL-2R Ру представлены в таблице 8.
Таблица 8. Связывание иммуноконъюгатов, содержащих Fab с созревшей
25 аффинностью и мутантный IL-2, с гетеродимерами IL-2R Ру
KD в нМ
Hu IL-2R Py
(25°C)
Hu IL-2R Py
(37°C)
Cyno IL-2R Py (25°C)
Cyno IL-2R Py (37°C)
Mu IL-2R Py
(25°C)
Mu IL-2R Py
(37°C)
28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab
9,7 9
19 22
11,5 11,6
29,2 30,4
112
186 219
28H1 Fab-IL-2 qm-Fab
7,5 6,9
14,3 14,7
8,9 8,4
21,3 21,2
66 54
142 106
29B11 Fab-IL-2 wt-Fab
6,5 5,7
9,5 12,4
6,9 6,7
14 19
93 74
71 74
29B11 Fab-IL-2 qm-Fab
7,2 7,4
13,1 13
7,8 8,4
16,7 18,1
60 63
44 42
3F2 Fab-IL-2 wt-Fab
4,8
6,4 6,1
40 40
Установлено, что в то время как аффинность человеческого IL-2 к человеческому димеру IL-2R Ру составляла примерно 1нМ, иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab (содержащие дикого типа или четырехмутантный IL-2) оба 5 обладали пониженной аффинностью (от 6 до ЮнМ), и, как описано выше,
аффинность "оголенного" IL-2 к мышиному IL-2R была примерно в 10 слабее, чем к IL-2R человека и обезьян циномолгус.
Результаты кинетического анализа с использованием а-субъединицы IL-2R представлены в таблице 9. В выбранных условиях отсутствует выявляемое 10 связывание иммуноконъюгатов, содержащих четырехмутантный IL-2R с а-субъединицей IL-2R человека, мышей или обезьян циномолгус.
15 Аффинность иммуноконъюгатов на основе MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab,
мишенью которых является MCSP, содержащих дикого типа или четырехмутантный IL-2, определяли с помощью резонанса поверхностного
плазмона (SPR) в отношении человеческого гетеродимера IL-2R Ру, используя рекомбинантный гетеродимер IL-2R Ру, в следующих условиях: человеческий гетеродимер IL-2R Р"выступ"у"впадина", иммобилизованный на СМ5-чипе (1600 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab применяли в 5 качестве анализируемых субстанций при 25°С в буфере HBS-P. Концентрации анализируемых субстанций при изучении в отношении IL-2R Ру составляли от 300 до 0,4нМ (разведение 1:3), скорость протока 30 мкл/мин, (продолжительность ассоциации 180 с, продолжительность диссоциации 300 с). Регенерацию в случае IL-2R Ру осуществляли, используя 2x30 с ЗМ MgCl2.
10 Данные аппроксимировали на основе модели связывания 1:1, RI Ф 0, Rmax = локальное значение в случае IL-2R Ру.
Аффинность иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab на основе MHLG1-KV9, мишенью которых является MCSP, содержащих дикого типа или четырехмутантный IL-2, определяли с помощью резонанса поверхностного
15 плазмона (SPR) в отношении человеческой а-субъединицы IL-2R, используя рекомбинантную мономерную а-субъединицу IL-2R в следующих условиях: человеческая а-субъединица IL-2R, иммобилизованная на СМ5-чипе (190 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab применяли в качестве анализируемых субстанций при 25°С в буфере HBS-P. Концентрации
20 анализируемых субстанций при изучении в отношении IL-2R а составляли от 33,3 до 0,4нМ (разведение 1:3), скорость протока 30 мкл/мин, (продолжительность ассоциации 180 с, продолжительность диссоциации 300 с). Регенерацию в случае IL-2R а осуществляли в течение 10 с с использованием 50мМ NaOH. Данные аппроксимировали на основе модели связывания 1:1, RI Ф
25 0, Rmax = глобальное значение в случае IL-2R а.
Результаты кинетического анализа с использованием гетеродимера IL-2R Ру представлены в таблице 10.
Данные подтверждают, что иммуноконъюгат MHLG1-KV9 Fab-IL-2 qm-Fab,
мишенью которого является MCSP, сохранял аффинность к IL-2R Ру-рецептору,
в то время как аффинность связывания с CD25 утрачивалась по сравнению с
иммуноконъюгатом, содержащим IL-2 дикого типа.
5 Далее определяли аффинность иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm на основе
4G8 и 28Н1 к гетеродимеру IL-2R Ру и а-субъединице IL-2R с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR), осуществляя непосредственное сравнение с форматом Fab-IL-2 qm-Fab иммуноконъюгата. В целом, метод состоял в следующем: лиганды - либо а-субъединицу человеческого IL-2R, либо
10 гетеродимер человеческого IL-2R Ру - иммобилизовали на СМ5-чипе. Затем на чип наносили иммуноконъюгаты IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и 28Н1, либо иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8 и 28Н1 в качестве анализируемых субстанций при 25°С в HBS-EP-буфере в концентрациях от 300 до 1,2нМ (разведение 1:3.). Скорость потока составляла 30 мкл/мин и применяли
15 следующие условия: ассоциация: 180 с, диссоциация: 300 с и регенерация: 2 х 30 с при использовании ЗМ MgC^ в случае гетеродимера IL-2R Ру, 10 с при использовании 50мМ NaOH в случае а-субъединицы IL-2R. Для аппроксимации применяли модель связывания 1:1 (связывание 1:1, RI Ф 0, Rmax = локальное значение для IL-2R Ру, кажущаяся величина Ко, связывание RI = 0, Rmax =
20 локальное значение для IL-2R а). Соответствующие величины Ко представлены в таблице 11.
Таблица 11.
Кажущаяся величина KD [нМ]
Hu IL-2R Py
Hu IL-2R a
4G8 IgG-IL-2 qm
5,9
нет связывания
4G8 Fab-IL-2 qm-Fab
10,4
нет связывания
28H1 IgG-IL-2 qm
6,2
нет связывания
28H1 Fab-IL-2 qm-Fab
11,4
нет связывания
Данные демонстрируют, что иммуноконъюгатыЬзО-1Х-2 qm на основе 4G8 25 и 28Н1 связывались по меньшей мере с такой же высокой аффинностью, что и иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab, с гетеродимером IL-2R Ру, в то время как они не связывались с а-субъединицей IL-2R из-за интродукции мутаций, которые оказывают воздействие на связывание с CD25. По сравнению с соответствующими иммуноконъюгатами Fab-IL-2 qm-Fab аффинность слитых
белков IgG-IL-2 qm, вероятно, несколько повышается в пределах погрешности метода.
Пример 7
При создании изобретения в первой серии экспериментов при оценке с 5 помощью FACS было подтверждено, что иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab,
мишенью которых является FAP, содержащие либо дикого типа, либо мутантный
IL-2, обладали способностью связываться с экспрессирующими человеческий
FAP клетками линии НЕК 293-FAP (фиг. 17) и что наличие в IL-2 четырех
мутаций не влияло на связывание с экспрессирующими FAP клетками (фиг. 18).
10 Таблица 12. Связывание иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab с
экспрессирующими FAP НЕК-клетками
Значения ЕС50
(нМ)
28Н1 Fab-IL-2-Fab
0,64
28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab
0,70
29В11 Fab-IL-2-Fab
0,66
29В11 Fab-IL-2 qm-Fab
0,85
4G8 Fab-IL-2-Fab
0,65
В частности, в этих экспериментах по оценке связывания установлено, что связывающие FAP агенты в виде Fab-IL-2 qm-Fab 28Н1, 29В11, 14ВЗ и 4В9 с
15 созревшей аффинностью обладали повышенной абсолютной способностью к связыванию с клетками-мишенями НЕК 293-FAP по сравнению с иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab на основе родительских связывающих FAP агентов 3F2 (29В11, 14ВЗ, 4В9) и 4G8 (28Н1) (фиг. 17), сохраняя при этом высокую специфичность и отсутствие связывания с НЕК 293-клетками,
20 трансфектированными DPPIV, близким гомологом FAP, или НЕК 293-клетками, трансфектированными имитатором. В качестве положительного контроля применяли мышиное антитело к человеческому CD26-PE DPPIV, клон М-А261 (фирма BD Biosciences, №555437) (фиг. 19). Анализ способности к интерализации продемонстрировал, что связывание иммуноконъюгатов Fab-IL-
25 2-Fab не приводит к индукции интернализации FAP (фиг. 20).
В другом эксперименте с помощью FACS оценивали связывание иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8, мишенью которых является FAP, с человеческим FAP, который экспрессируется на
стабильно трансфектированных НЕК293-клетках. Результаты представлены на фиг. 48. Данные демонстрируют, что иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm связывается с экспрессирующими FAP клетками, что характеризуется значением ЕС50 составляющим 0,9нМ, сопоставимым со значением, которое соответствует 5 конструкции Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8 (0,7нМ).
Затем иммуноконъюгаты с созревшей аффинностью Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, содержащие IL-2 дикого типа или четырехмутантный IL-2, тестировали с использованием клеточных анализов в сравнении с пролейкином согласно методам, описанным выше в примерах.
10 Оценивали с помощью ELISA индуцируемое IL-2 высвобождение IFN-y в
супернатанте после инкубации NK-клеток линии NK92 с указанными иммуноконъюгатами (фиг. 21) в течение 24 ч. №С92-клетки экспрессируют на своей поверхности CD25. Результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, который содержал IL-2 дикого типа, обладал меньшей
15 способностью индуцировать высвобождение IFN-y по сравнению с пролейкином, что является ожидаемым с учетом примерно в 10 раз более низкой аффинности иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab к гетеродимеру IL-2R Ру. Иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab оказались практически сопоставимыми с соответствующей конструкцией дикого типа выбранного клона с позиций эффективности и
20 абсолютной индукции высвобождения IFN-y, несмотря на тот факт, что NK92-
клетки экспрессируют в некотором количестве CD25. Однако было установлено, что конструкция 29В11 Fab-IL-2 qm-Fab индуцировала меньший уровень высвобождения цитокина по сравнению с конструкциями 29В11 Fab-IL-2 wt-Fab, а также 28Н1- и 408-конструкциями, для которых обнаружен лишь небольшой
25 сдвиг эффективности Fab-IL-2 qm-Fab относительно Fab-IL-2 wt-Fab.
Кроме того, иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab на основе MHLG1-KV9, мишенью которого является MCSP, сравнивали с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1 и 29В11 с использованием анализа высвобождения IFN-y на №С92-клетках. Как продемонстрировано на фиг. 22, иммуноконъюгат Fab-IL-
30 2 qm-Fab на основе MHLG1-KV9, мишенью которого является MCSP,
практически сопоставим по способности индуцировать высвобождение IFN-y с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP.
Затем оценивали индукцию пролиферации №С92-клеток с помощью IL-2 в течение 3 дней с использованием анализа пролиферации, основанного на измерении АТФ, с помощью CellTiter Glo (фирма Promega) (фиг. 23). С учетом того, что №С92-клетки экспрессируют низкие уровни CD25, различие между 5 иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab, содержащими IL-2 дикого типа, и
иммуноконъюгатами, содержащими четырехмутантный IL-2, можно выявлять с помощью анализа пролиферации, однако в условиях насыщения обоими для достижения сходной абсолютной индукции пролиферации.
В следующем эксперименте оценивали воздействие иммуноконъюгата на
10 основе 28Н1 с созревшей аффинностью Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого
является FAP, на индукцию фосфорилирования STAT5 в сравнении с 28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab и пролейкином с использованием человеческих NK-клеток, CD4-T-клеток, СВ8+-Т-клеток и Тгеё-клеток из человеческих РВМС (фиг. 24). Для NK-клеток и СВ8+-Т-клеток, для которых характерно отсутствие или очень низкий
15 уровень экспрессии CD25 (т.е. передача сигналов IL-2R происходит через
гетеродимер IL-2R Ру), результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал примерно > 10 раз более низкой способностью индуцировать высвобождение IFN-y по сравнению с пролейкином и что иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab был лишь немного более
20 эффективным по сравнению с конструкцией Fab-IL-2 wt-Fab. На С04+-Т-клетках продемонстрирована быстрая повышающая регуляция CD25 при стимуляции, иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab оказался значительно менее эффективным, чем Fab-IL-2 wt-Fab, но все еще сохранял сопоставимую способность индуцировать передачу сигналов IL-2R при применении в насыщающих
25 концентрациях. Это противоположно действию, обнаруженному при применении Тгеё-клеток, для которых эффективность Fab-IL-2 qm-Fab оказалась существенно более низкой по сравнению с эффективностью конструкции Fab-IL-2 wt-Fab вследствие высокого уровня экспрессии CD25 на Тгеё-клетках и в результате этого высокой аффинности связывания конструкции Fab-IL-2 wt-Fab с CD25 на
30 Тгеё-клетках. В результате утраты способности связываться с CD25 у
иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab, передача сигналов IL-2 в Тгеё-клетках активируется только через гетеродимер IL-2R Ру при применении в
концентрациях, в которых передача сигналов IL-2R активируется в CD25-негативных эффекторных клетках через гетеродимер IL-2R Ру. Соответствующие значения ЕС50 (в пМ) представлены в таблице 13.
В другой серии экспериментов изучали биологическую активность иммуноконъюгатов на основе 4G8 IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью
10 которых является FAP, с использованием нескольких клеточных анализов.
Иммуноконъюгаты на основе 4G8 IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1, мишенью которых является FAP, исследовали в отношении индукции высвобождения IFN-y №С92-клетками, что индуцируется активацией передачей сигналов IL-2R Ру. На фиг. 49 продемонстрировано, что иммуноконъюгат IgG-
15 IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, обладал такой же эффективностью в отношении индукции высвобождения IFN-y, что и иммуноконъюгат с созревшей аффинностью Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1.
При создании изобретения изучали также воздействие иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, на индукцию
20 фосфорилирования STAT5 в сравнении с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1, а также пролейкином с использованием человеческих NK-клеток, СВ4+-Т-клеток, СВ8+-Т-клеток и Тгеё-клеток из человеческих РВМС. Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 50. Для NK-клеток и СВ8+-Т-клеток установлено, что иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm
25 на основе 4G8 обладал примерно > 10 раз более низкой способностью
индуцировать фосфорилирование STAT5 по сравнению с пролейкином, но несколько более высокой эффективностью по сравнению с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1. Для СБ4+-Т-клеток иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm на основе 4G8 оказался менее эффективным, чем
иммуноконъюгат Fab-IL-2 wt-Fab на основе 28Н1, но не несколько более эффективным, чем иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1, для этого иммуноконъюгата установлена также способность индуцировать передачу сигналов IL-2R при применении в насыщающих концентрациях, сопоставимая со 5 способностью пролейкина и Fab-IL-2 wt-Fab на основе 28Н1. Это
противоположно действию, обнаруженному при использовании Тгеё-клеток, для которых эффективность иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28Н1 оказалась несколько более низкой по сравнению с иммуноконъюгатом Fab-IL-2 wt-Fab.
10 Взятые в совокупности, полученные данные демонстрируют, что
четырехмутантный IL-2, представленный в настоящем описании, обладает способностью активировать передачу сигналов IL-2R через гетеродимер IL-2R Ру, аналогично способности IL-2 дикого типа, но не приводит к более преимущественной стимуляции Тгеё-клеток по сравнению с другими
15 эффекторными клетками. Пример 8
Противоопухолевое действие иммуноконъюгатов Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, оценивали in vivo в сравнении с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которых является FAP, на
20 моделях с использованием ксенотрансплантатов ACHN и сингенных моделей LLC1. Все иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP (содержащие дикого типа или четырехмутантный IL-2), распознавали мышиный FAP, а также мышиный IL-2R. Поскольку модели с использованием ксенотрансплантатов ACHN, созданные на SCID-мышах, трансгенных по
25 человеческому FcyRIII, давали выраженную позитивную реакцию на FAP при оценке методом иммуногистохимии (ИГХ), то указанная модель представляет собой модель с нарушенной иммунологической реактивностью и может отражать только иммунные эффекторные механизмы, опосредуемые NK-клетками и/или макрофагами/моноцитами, но лишенную опосредуемого Т-
30 клетками иммунитета, и поэтому эта модель не может отражать AICD или
действия, опосредуемые Тгеё-клетками. В отличие от вышеуказанной модели сингенная модель LLC1, созданная на полностью иммунокомпетентных мышах, может также отражать адаптивные опосредуемые Т-клетками иммунные
эффекторные механизмы, но отличается очень низким уровнем экспрессии FAP в мышиной строме. Таким образом, каждая из указанных моделей частично отражает ситуацию, характерную для человеческих опухолей. Модель, созданная с использованием ксенотрансплантата 5 почечноклеточной карциномы линии ACHN
Иммуноконъюгаты 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, тестировали с использованием клеток клеточной линии человеческой почечноклеточной аденокарциномы ACHN, которые инъецировали в почки SCID-мышей, трансгенных по человеческому FcyRIII. ACHN-клетки
10 исходно получали из АТСС (Американская коллекция типовых культур) и после размножения депонировали в собственном (внутреннем) банке клеток фирмы Glycart. ACHN-клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FCS, при 37°С в насыщенной водяными парами атмосфере с 5% СО2. Полученный in vitro пассаж 18 применяли для внутрипочечной инъекции, его жизнеспособность
15 составляла 98,4%. Делали небольшой надрез (2 см) в правой боковой области и брюшной стенке анестезированных SCID-мышей. Подкапсулярно в почку инъецировали 50 мкл суспензии (1 х 106 ACHN-клеток в среде AimV) (2мМ). Раны на коже и брюшную стенку закрывали с помощью скобок. Самок SCID-FcyRIII мышей (линия GLYCART-RCC), возраст которых в начале эксперимента
20 составлял 8-9 недель (осемененные на фирме RCC, Швейцария), содержали в специфических условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (Р 2008016). После доставки животных
25 выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для
обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья. Мышам инъецировали в почку в день опыта 0 по 1 х 106 ACHN-клеток, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab три
30 раза в неделю в течение трех недель. Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Мышам из группы, обработанной наполнителем, инъецировали ЗФР, мышам из групп обработки - иммуноконъюгат 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab или 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Для получения соответствующего количества
иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы разводили при необходимости ЗФР. На фиг. 25 продемонстрирована опосредуемая иммуноконъюгатами как 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, так и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab высокая эффективность на основе таких критериев, как повышенная медианная выживаемость, по 5 сравнению с обработанной наполнителем группой, при этом эффективность иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab оказалась более высокой, чем эффективность иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab.
10 Сингенная модель карциномы легкого Льюиса LLC1
Иммуноконъюгаты 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab и 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, тестировали с использованием клеточной линии мышиной карциномы легкого Льюиса LLC1, для создания которой осуществляли i.v.-инъекцию мышам линии Black 6. Исходные клетки карциномы легкого
15 Льюиса LLC1 получали из АТСС и после размножения депонировали во внутреннем банке клеток фирмы Glycart. Линию опухолевых клеток культивировали согласно общепринятым методам в среде DMEM, содержащей 10% FCS (фирма Gibco), при 37°С в насыщенной водяными парами атмосфере с 5% СОг. Пассаж 10 применяли для трансплантации, его жизнеспособность
20 составляла 97,9%. По 2х 105 клеток на животное инъецировали i.v. в хвостовую вену в 200 мкл среды для культуры клеток Aim V (фирма Gibco). Мышей линии Black 6 (фирма Charles River, Германия), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специфических условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам
25 (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (Р 2008016). После
доставки животных выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья. Мышам инъецировали i.v.в день опыта 0 по 2х 105 LLCl-клеток, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции 5 опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab или 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab три раза в неделю в течение трех недель. Всем мышам е инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Мышам из группы, обработанной наполнителем, инъецировали ЗФР, мышам из групп обработки -конструкцию 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab или 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab. Для получения
10 соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы разводили при необходимости ЗФР. На фиг. 26 продемонстрировано, что конструкция 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab или конструкция с созревшей аффинностью 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab обладали более высокой эффективностью согласно таким критериям, как повышенная медианная выживаемость, при сравнении с
15 обработанной наполнителем группой. Таблица 14-Б.
Соединение
Доза
Состав буфера
Концентрация
(мг/мл)
28Н1 Fab-IL-2-Fab четырехмутантны й, т.е. FAP 28Н1 qm
30 мкг
25мМ фосфат калия,
125мМ NaCl,
ЮОмМ глицин, рН 6,7
2,74
4G8 Fab-IL-2-Fab четырехмутантны й, т.е. FAP 4G8 qm
30 мкг
25мМ фосфат калия,
125мМ NaCl,
ЮОмМ глицин, рН 6,7
4,25
В другом эксперименте тестировали иммуноконъюгаты 28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab и 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, с использованием
20 такой же модели мышиной карциномы легкого Льюиса, созданной с помощью клеточной линии LLC1, для получения которой осуществляли i.v.-инъекцию мышам линии Black 6. Пассаж 9 применяли для трансплантации, его жизнеспособность составляла 94,5%. По 2х 105 клеток на животное инъецировали i.v. в хвостовую вену в 200 мкл среды для культуры клеток Aim V
25 (фирма Gibco). Мышам инъецировали i.v.в день опыта 0 по 2> <105 LLCl-клеток, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. 28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab или 28Н1
Fab-IL-2 qm-Fab три раза в неделю в течение трех недель. Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Мышам из группы, обработанной наполнителем, инъецировали ЗФР, мышам из групп обработки -конструкцию 28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab или 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы разводили при необходимости ЗФР. На фиг. 27 продемонстрировано, что иммуноконъюгаты 28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab и 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab обладали более высокой эффективностью согласно таким критериям, как повышенная медианная выживаемость, при сравнении с обработанной наполнителем группой, при этом эффективность иммуноконъюгата 28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab была несколько более высокой, чем иммуноконъюгата 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab.
Пример 9
Затем осуществляли семидневное сравнительное исследование иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8, мишенью которого является FAP, и иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab на основе 4G8, мишенью которого является FAP, для оценки токсичности при внутривенном введении и токсикокинетического анализа с использованием мышей линии Black 6. В таблице 15 представлен план эксперимента по оценке токсичности и токсикокинетического анализа.
Цель данного исследования заключалась в характеризации и сравнении профилей токсичности и проведении токсикокинетического анализа иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL2-Fab, содержащего интерлейкин-2 (IL-2) дикого типа, мишенью которого является FAP, и иммуноконъюгата G48 Fab-IL-2-Fab, 5 содержащего четырехмутантный IL-2 (qm), мишенью которого является FAP,
после ежедневных внутривенных введений не имеющим опухоль самцам мышей в течение 7 дней. Для этого исследования пяти группам по 5 самцов мышей/группу вводили внутривенно по 0 (используя наполнитель в качестве контроля), 4,5 или 9 мкг/г/день wt IL-2 или 4,5 или 9 мкг/г/день qm IL-2. Еще
10 четырем группам мышей по 6 самцов мышей/группу вводили 4,5 или 9 мкг/г/день wt IL-2 или 4,5 или 9 мкг/г/день qm IL-2 для осуществления токсикокинетических анализов. Продолжительность исследования варьировалась от 7 до 5 дней в зависимости от клинических признаков, обнаруженных у животных, которым вводили 4,5 и 9 мкг/г/день wt IL-2. Оценка
15 токсичности основывалась на смертности, прижизненных наблюдениях, весе тела и клинической и анатомической патологии. У животных в различные моменты времени отбирали образцы крови в группах, предназначенных для токсикокинетического анализа, для осуществления токсикокинетического анализа. Данные токсикокинетического анализа продемонстрировали, что у
20 мышей, обработанных wt IL-2 или qm IL-2, обнаружены выявляемые уровни в
плазме вплоть до момента последнего взятия образца крови, что свидетельствует о том, что мыши подвергаются воздействию соответствующими соединениями в процессе обработки. Значения AUCo-inf, полученные в день 1, позволяют предположить наличие сопоставимой экспозиции wt IL-2 и qm IL-2 при
25 применении в обеих дозах. Несколько образцов отбирали в день 5 и в них обнаружены концентрации в плазме, эквивалентные концентрациям, обнаруженным в день 1, что позволяет предположить отсутствие накопления любого соединения после 5 дней дозирования. Более конкретно, были получены следующие данные.
30 Токсикокинетика (ТК)
В таблице 16 обобщены усредненные токсикокинетические параметры в плазме для 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP, и 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которого является FAP, полученные с использованием
программы WinNonLin, версия 5.2.1 и поступающего в продажу каппа-специфического ELISA (набор для ELISA для количественной оценки человеческой каппа-цепи, фирма Bethyl Laboratories).
ТК-параметры рассчитывали с помощью программы WinNonLin, версия 5.2.1, используя некомпартментальный анализ
Индивидуальные концентрации в сыворотке представлены ниже:
Группа (доза)
День отбора
Время (ч)
Животные
Конц. в
Средняя конц.
крови
сыворотке
(нг/мл)
(нг/мл)
Группа 6 (4,5
64241
47198
мкг/г) 4G6 Fab-
30155
IL2-Fab WT
5,5
14693
15784
16875
318
419
520
5,5
13061
13335
13620
13325
Группа 7 (9
101208
97986
мкг/г) 4G6 Fab-
94764
IL2-Fab WT
5,5
35766
34062
32359
573
580
588
5,5
31779
37473
51143
53409
13562
Группа 8 (4,5
73326
60639
мкг/г) 4G6 Fab-
47953
IL2-Fab мутант
5,5
12168
13269
14371
494
490
487
5,5
6561
10957
15352
608
721
543
1298
437
Группа 6 (9
162970
146416
мкг/г) 4G6 Fab-
129862
IL2-Fab мутант
5,5
20475
24800
29125
478
493
509
Группа (доза)
День отбора
Время (ч)
Животные
Конц. в
Средняя конц.
крови
сыворотке
(нг/мл)
(нг/мл)
5,5
20504
48031
75557
634
703
796
661
719
Эти данные демонстрируют, что как 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, так и 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab обладали сопоставимыми фармакокинетическими свойствами, но для 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab имела место несколько более высокая экспозиция.
Смертность
В группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которого является FAP, в дозе 9 мкг/г, одно животное погибло в результате обработки, проведенной в день 5. Перед гибелью у него обнаружена пониженная активность, холодная кожа и сгорбленная поза. Указанное животное, вероятно, погибло в результате комбинации клеточной инфильтрации в легкое, которая сопровождалась отеком и кровоизлиянием, и заметного некроза костного мозга. Данные о смертности обобщены в таблице 17.
Клинические обследования
Такие признаки, как пониженная активность, холодная кожа и сгорбленная
поза, обнаружены у животных которых обрабатывали wt IL-2 в дозах 4,5 и 9
мкг/г/день. Данные клинических обследований обобщены в таблице 18.
5 Таблица 18. Клинические обследования в день 5
Группа
Тип
Доза [мкг/г]
Сгорбленная поза
Пониженная активность
Холодное на ощупь тело
D-ЗФР
0/5
0/5
0/5
4G8 Fab-IL-2 wt-
4.5
4/5
4/5
5/5
Fab
5/5
5/5
5/5
4G8 Fab-IL-2 qm-
4.5
0/5
0/5
0/5
Fab
0/5
0/5
0/5
4G8 Fab-IL-2 wt-
4.5
6/6
2/6
2/6
Fab
6/6
5/6
6/6
4G8 Fab-IL-2 qm-Fab
4.5
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Вес тела
Умеренное снижение веса тела обнаружено после 5 дней обработки у животных, которым вводили wt IL-2 в дозе 4,5 или 9 мкг/г/день (составлявшее
10 9% и 11% соответственно). Небольшое снижение веса тела обнаружено после 5 дней обработки у животных, которым вводили qm IL-2 в дозе 4,5 или 9 мкг/г/день (составлявшее 2% и 1% соответственно). Умеренное (9%) снижение веса тела обнаружено также в контрольной группе животных, обработанных наполнителем, после 5 дней обработки. Однако процент снижения должен
15 составлять 5%, если исключить погибшее животное (животное № 3). Снижение веса тела в обработанной наполнителем группе может быть связано со стрессом. Гематология
Пониженное содержание тромбоцитов обнаружено у животных, которым вводили в дозе 4,5 (~4,5-кратное) и 9 мкг/г/день (~11-кратное) 4G8 Fab-IL-2 wt-20 Fab, что коррелировало со снижением количества мегакариоцитов в костном
мозге, а также с системными истощающими действиями (фибрин) в селезенке и легком этих животных (см. раздел "Гистопатология", ниже). Эти данные свидетельствуют о том, что пониженное содержание тромбоцитов, вероятно, обусловлено объединенными воздействиями поглощения и снижения
производства/скученности в костном мозге из-за повышения производства лимфоцитов/миелоидных клеток вследствие непосредственного или косвенного воздействия IL-2.
Гематологические данные свидетельствуют о наличии нестрогой 5 взаимосвязи с введением соединения, они демонстрируют абсолютное снижение количества лимфоцитов при обработке 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 (~5-кратное) и 9 мкг/г (~3-кратное) по сравнению со средним количеством в обработанной наполнителем группе. Эти данные не свидетельствуют о четкой зависимости от дозы, но могут рассматриваться как вторичные, связанные с
10 эффектами, которые ассоциированы со стрессом, обнаруженным при
прижизненных исследованиях, или повышенным фармакологическим действием соединения (лимфоциты мигрируют в ткани). Не обнаружено связанных с обработкой гематологических изменений в ответ на введение 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Несколько отдельных гематологических данных статистически отличались
15 от соответствующих данных для контролей. Однако этих данных недостаточно для предположения, что они свидетельствуют о патологических изменениях. Макроскопическая патология и гистопатология Связанные с обработкой макроскопические признаки, включая увеличенную селезенку, обнаружены у 5/5 и 4/5 мышей из групп, которые
20 обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, соответственно, и у 1/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/г.
Связанные с обработкой гистопатологические признаки обнаружены в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и 4G8 Fab-IL-2
25 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, в легком, костном мозге, печени, селезенке и тимусе, они отличались по частоте встречаемости, серьезности стадии или природе изменений, что будет описано ниже.
Связанные с обработкой гистопатологические признаки в легком включали инфильтрацию мононуклеарных клеток от слабой до выраженной, которая
30 обнаружена у 5/5 мышей из групп, которых обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и маргинальную инфильтрацию у 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г. Инфильтрация мононуклеарных клеток включает инфильтрацию лимфоцитов (некоторые из
них, как установлено, имели цитоплазматические гранулы), а также реактивных макрофагов. Эти клетки, как установлено, часто имели вазоцентрическое распределение, часто их маргинация обнаруживалась внутри сосудов в легком. Установлено также, что эти клетки окружали также сосуд, но в более серьезных 5 случаях их распределение было более диффузным. Кровоизлияние от
маргинального до слабого обнаруженного у 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и маргинальным у 2/5 мышей из группы, которую обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/г. Хотя кровоизлияние наиболее часто являлось периваскулярным, в более
10 серьезных случаях оно было обнаружено в альвеолярном пространстве. Отек от слабого до умеренного обнаружен у 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и маргинальным у 5/5 мышей из группы, которую обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/г. Хотя отек часто являлся периваскулярным, в более серьезных случаях он обнаружен также
15 в альвеолярном пространстве. Маргинальная дегенерация клеток и кариорексис обнаружены у 2/5 и 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г соответственно, и они включали дегенерацию инфильтрующихся или реактивных лимфоцитов. Отобранные с помощью красителя MSB животные оказались позитивными по фибрину в легких
20 животных из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/г, что коррелировало со снижением количества тромбоцитов, обнаруженных у этих животных.
Связанные с обработкой признаки в костном мозге, включая увеличение от маргинальной до слабой общей насыщенности клетками костного мозга,
25 обнаружено у 5/5 мышей и 2/5 мышей из групп, обработанных как 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, так и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 4,5 мкг/г, и 5/5 мышей и 2/5 мышей из групп, обработанных каждой из указанной конструкций в дозе 9 мкг/г соответственно. Это характеризовалось повышением от маргинального до умеренного уровня лимфоцитарной-миелоцитарной гиперплазии в этих группах,
30 что подтверждалось, в частности, повышением количества CD3-позитивных Т-клеток в костном мозге и синусах (в частности, Т-лимфоцитов, что подтверждено с помощью иммуногистохимии с использованием рап-Т-клеточного маркера CD3 на отобранных животных). Увеличение CD3
позитивных Т-клеток было умеренным в обеих группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, и от маргинального до слабого в обеих группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Снижение от маргинального до слабого мегакариоцитов обнаружено у 2/5 мышей из группы, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 5 4,5 мкг/г, и 5/5 у мышей, обработанных этой же конструкцией в дозе 9 мкг/г, снижение от маргинального до умеренного эритроидных предшественников обнаружено у 3/5 мышей из группы, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/г, и у 5/5 мышей, обработанных этой же конструкцией в дозе 9 мкг/г. Некроз костного мозга обнаружен у 1/5 мышей в группе, обработанной 4G8 Fab-
10 IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/мг (минимальный) и у 5/5 мышей (от слабого до
выраженного), обработанных этой же конструкцией в дозе 9 мкг/г. Пониженное количество мегакариоцитов в костном мозге коррелировало с пониженным содержанием тромбоцитов, что может являться прямым результатом переполнения костного мозга в результате увеличения лимфоцитов/миелоидных
15 предшественниковБ и/или некроза костного мозга, и/или истощения тромбоцитов из-за воспаления в различных тканях (см. данные для селезенки и легкого). Обнаруженное в костном мозге снижение содержания эритроидных предшественников не коррелировало с данными гематологического исследования периферической крови, вероятно, из-за связанных со временем
20 факторов (исследования костного мозга проводили до оценки периферической крови) и более продолжительным временем полужизни периферических эритроцитов (по сравнению с тромбоцитами). Механизм некроза костного мозга в костном мозге может быть вторичным, являясь следствием выраженного сверхпереполнения полости мозга (из-за производства и роста лимфоцитов
25 /миелоидных клеток), системного или локального высвобождения цитокинов из находящихся на стадии пролиферации типов клеток, фактора, связанного с локальными воздействиями гипоксии, или других фармакологических действий соединения.
Связанные с обработкой признаки в печени, включая наличие от слабой до 30 умеренной первичной вазоцентрической инфильтрации мононуклеарных клеток и от маргинального до умеренного некроза индивидуальных клеток, обнаружено у 5/5 мышей, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг. Маргинальный некроз индивидуальных клеток обнаружен у 2/5 и 4/5 мышей,
обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг, соответственно. Мононуклеарный инфильтрат состоял в основном из лимфоцитов (в частности, Т-лимфоцитов, что подтверждено с помощью иммуногистохимии с использованием pan-T-клеточного маркера CD3, выполненной на отобранных 5 животных), для него наиболее часто характерно вазоцентрическое
расположение, а также очень редко расположение в центральных и портальных сосудах. Отобранных для иммуногистохимического исследования животных окрашивали F4/80, у них обнаружено повышенные количество и размер (активированных) макрофагов /клеток Купфера в гепатических синусоидах в 10 группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг.
Связанные с обработкой признаки в селезенке, включая наличие от умеренной до выраженной лимфоидной гиперплазии/инфильтрации и от слабой до умеренной гиперплазии/инфильтрации макрофагов, обнаружено в 5/5 мышей 15 в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг, и от слабой до умеренной лимфоидной гиперплазии/инфильтрации и от маргинальной до слабой гиперплазии/инфильтрации макрофагов - у 5/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг.
Иммуногистохимическое исследование, проведенное с использованием мышей, 20 обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг, с использованием pan-T-клеточного маркера CD3, а также маркера макрофагов F4/80 продемонстрировало различные картины. При применении 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг картина иммунореактивности Т-клеток и макрофагов сохранялась, прежде всего, в областях красной пульпы, поскольку архитектура 25 первичных фолликулов была изменена лимфоцитолизом и некрозом (что описано ниже). При применении 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг специальное окрашивание продемонстрировало наличие картины, сходной с обнаруженной у обработанных наполнителем контрольных мышей, но с распространением в периартериальные лимфоцитарные оболочки (PALS) белой 30 пульпы Т-клеточной популяции и наличием более крупной расширенной области красной пульпы. Позитивное в отношении Т-клеток и макрофагов окрашивание обнаружено также внутри красной пульпы, аналогичное по картине с окрашиванием в контрольной обработанной наполнителем группе, но
расширенное. Эти результаты коррелируют с данными макроскопических исследований увеличенной селезенки. Маргинальный некроз обнаружен у 3/5 мышей и от маргинального до слабого у 5/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг соответственно. Некроз, как правило, 5 был локализован вокруг области первичных фолликулов, и при окрашивании с помощью MSB отобранные животные давали положительную реакцию на фибрин в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/мг, что коррелировало, в частности, со сниженным содержанием тромбоцитов, обнаруженным у этих животных. Лимфоцитолиз обнаружен в
10 группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/г (от минимального до слабого) и 9 мкг/г (от умеренного до выраженного).
Связанные с обработкой признаки в тимусе, включая увеличение от минимального до слабого содержания лимфоцитов в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab как в дозе 4,5, так и 9 мкг/мг, и обработанной 4G8 Fab-IL-2 qm-
15 Fab в дозе 4,5 мкг/мг. Кору и мозговое вещество тимуса не исследовали по отдельности в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, однако иммуногистохимическое исследование с использованием рап-Т-клеточного маркера (CD3), проведенное на отобранных животных, которых обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг,
20 продемонстрировало сильное позитивное окрашивание большинства клеток в тимусе. Повышенное содержание лимфоцитов в тимусе рассматривается как непосредственное фармакологическое действие обоих соединений, при котором IL-2 индуцировал пролиферацию лимфоцитов, мигрирующих в тимус (Т-клетки) из костного мозга для дополнительной дифференцировки и клональной
25 экспансии. Это имело место во всех группах, кроме группы, обработанной 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг, в которой, вероятно, имело место временное действие. Лимфоцитолиз оказался слабым в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4 мкг/мг, и от умеренного до выраженного в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг. Умеренное истощение лимфоидных
30 элементов обнаружено в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах как 4,5, так и 9 мкг/мл. Поскольку эти результаты являются более значительными в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг, эти животные были отнесены к агонирующим в день 5, и лимфоцитолиз от слабого до
выраженного, а также умеренное лимфоидное истощение могут быть связаны с указанным прижизненным фактором (связанные со стрессом действия вследствие плохого физического состояния).
Гистопатологические признаки нестрогой взаимосвязи между введением 5 соединения и проявлениями в печени включают маргинальную
инфильтрацию/активацию смешанных клеток (лимфоцитов и макрофагов), обнаруженную в виде небольшого очага/микрогрануломатоза, произвольно расположенных в печени у 5/5 мышей из групп, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/мг. Это маргинальное изменение обнаружено
10 также в контрольной обработанной наполнителем группе, но реже и менее
серьезное. Расширение и атрофия железистой области желудка от маргинального до слабого обнаружены у 5/5 мышей, а маргинальная атрофия ворсинок подвздошной кишки обнаружена у 3/5 мышей, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг. Этот факт наиболее вероятно связан с плохим физическим
15 состоянием, обнаруженным при проведении прижизненных исследований на этих мышах, отражением которого был пониженный вес тела, прежде всего в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг.
Признаки в месте инъекции, включая инфильтрат смешанных клеток, периваскулярный отек и миодегенерацию, обнаружены как в обработанной
20 наполнителем контрольной группе, так и в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг, и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг. У одного животного обнаружен эпидермальный некроз. Эти признаки не связаны с самой(ими) обработкой(ами), а с ежедневными i.v.-инъекциями и манипуляциями с хвостом. У другого животного обнаружена инфильтрация
25 макрофагами скелетной мышцы (обнаружена на гистологическом срезе ткани легкого), ассоциированная с миодегенерацией и миорегенерацией, вероятно, вследствие хронического повреждения и не связанная с обработкой. Маргинальное лимфоидное истощение обнаружено у 3/5 и 4/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг соответственно, что
30 наиболее вероятно связано с нормальными физиологическими изменениями,
обнаруженными в тимусе мышей с увеличением их возраста (обнаружены также с аналогичной встречаемостью и серьезностью у 4/5 мышей из обработанной наполнителем контрольной группы животных).
В целом, ежедневное внутривенное введение 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab или 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 или 9 мкг/г/день в течение промежутка времени, составляющего вплоть до 5 дней, самцам мышей привело к сходным связанным с обработкой гистологическим признакам, характерным для обоих соединений. 5 Однако, изменения были более значительными и более серьезными при
применении иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которого является FAP, в легком (фиг. 28 и фиг. 29) (мононуклеарная инфильтрация лимфоцитами и реактивными макрофагами, кровоизлияние и отек), в костном мозге (лимфомиелогиперплазия и повышенная и повышенная насыщенность
10 клетками), в печени (фиг. 30) (некроз индивидуальных клеток, увеличение
количества и активация клеток Купфера/макрофагов), в селезенке (выраженное увеличение, инфильтрация/гиперплазия макрофагов и лимфоцитов) и в тимусе (повышенное содержание лимфоцитов). Кроме того, смертность, лимфоцитолиз, некроз или дегенерация клеток в легком, селезенке, костном мозге и тимусе, а
15 также снижение количества мегакариоцитов и эритроцитов в костном мозге и пониженное содержание тромбоцитов в периферической крови обнаружены только у животных, которых обрабатывали wt IL-2. На основе клинических и анатомических признаков, а также на основе клинических наблюдений и сопоставимой системной экспозиции обоих соединений, можно сделать
20 заключение о том, что qm IL-2 в условиях данного исследования обладал
существенно менее выраженной системной токсичностью после введения 5 доз, чем wt IL-2.
Пример 10
Индукция IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 секреции IFN-y NK-25 клетками
NK-92-клетки выдерживали в минимальной среде в течение 2 ч перед посевом из расчета 100000 клеток/лунку в 96-луночный плоскодонный планшет. Конструкции IL-2 добавляли титрометрически к высеянным NK-92-клеткам. Через 24 или 48 ч планшеты центрифугировали перед сбором супернатантов для 30 определения количества человеческого IFN-y, используя поступающий в продажу набор для IFN-y ELISA (фирма BD, № 550612).
Тестировали два различных, полученных при создании настоящего изобретения препарата IL-2 дикого типа (вероятно, несколько отличающихся по
профилям их О-гликозилирования см. пример 2), поступающий в продажу IL-2 дикого типа (пролейкин) и полученный при создании настоящего изобретения четырехмутантный IL-2 (первая партия).
На фиг. 31 продемонстрировано, что четырехмутантный IL-2 обладает 5 такой же эффективностью, что поступающий в продажу (пролейкин) или
полученный при создании изобретения IL-2 дикого типа в отношении индукции секреции IFN-y NK-клетками в течение 24 (А) или 48 ч (Б).
Пример 11
Индукция IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 пролиферации NK-10 клеток
NK-92-клетки выдерживали в минимальной среде в течение 2 ч перед посевом из расчета 100000 клеток/лунку в 96-луночный плоскодонный планшет. Конструкции IL-2 добавляли титрометрически к высеянным NK-92-клеткам. Через 48 ч оценивали содержание АТФ для определения количества
15 жизнеспособных клеток с использованием набора для анализа "CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay" фирмы Promega согласно инструкциям производителя.
Тестировали такие же препараты IL-2, что и в примере 10.
На фиг. 32 продемонстрировано, что все тестируемые молекулы обладали
20 способностью индуцировать пролиферацию NK-клеток. При применении в
низких концентрациях ( < 0,01М) четырехмутантный IL-2 оказался несколько менее активным, чем полученный при создании изобретения IL-2 дикого типа, а все полученные при создании изобретения препараты оказались менее активными, чем поступающий в продажу IL-2 дикого типа (пролейкин).
25 Во втором эксперименте тестировали следующие препараты IL-2: IL-2
дикого типа (пул 2), четырехмутантный IL-2 (первая и вторая партия).
На фиг. 33 продемонстрировано, что все тестируемые молекулы обладали примерно одинаковой способностью индуцировать пролиферацию NK-клеток, при этом два препарата, содержащие мутантный IL-2, оказались лишь
30 минимально менее активными, чем препараты IL-2 дикого типа, при применении в наиболее низких концентрациях.
Индукция пролиферации человеческих РВМС иммуноконъюгатами, содержащими IL-2 дикого типа или четырехмутантный IL-2
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали с 5 помощью Histopaque-1077 (фирма Sigma Diagnostics Inc., Сент-Луис, шт.
Миссури, США). В целом, метод состоял в следующем: образцы венозной крови здоровых добровольцев отбирали в гепаринизированные шприцы. Кровь разводили в соотношении 2:1 ЗФР, не содержащим кальций и магний, и наслаивали на Histopaque-1077. Градиент центрифугировали при 450 х g в
10 течение 30 мин при комнатной температуре (КТ) без перерыва. Собирали
содержащую РВМС интерфазу, и отмывали трижды ЗФР (350 х g, после чего центрифугировали при 300 х g в течение 10 мин при КТ).
Затем РВМС метили с помощью 40нМ CFSE (сложный сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина) в течение 15 мин при 37°С. Клетки отмывали 20 мл
15 среды перед выделением меченых РВМС в течение 30 мин при 37°С. Клетки
отмывали, подсчитывали и по 100000 клеток высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном. Предварительно разведенный пролейкин (поступающий в продажу IL-2 дикого типа) или 1Ь2-иммуноконъюгаты добавляли титрометрически к посеянным клеткам, которые инкубировали в течение
20 указанных промежутков времени. Через 4-6 дней клетки отмывали, окрашивали для выявления соответствующих маркеров клеточной поверхности и анализировали с помощью FACS, используя устройство BD FACSCantoII. NK-клетки определяли как CD3 /CD56+, С04-Т-клетки как CD3+/CD8 , a CD8-T-клетки как CD3+/CD8+.
25 На фиг. 34 продемонстрированы данные о пролиферации NK-клеток после
инкубации с различными иммуноконъюгатами 28Н1 IL-2, мишенью которых является FAP, в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней. Все тестируемые конструкции индуцировали пролиферацию NK-клеток в зависимости от концентрации. Пролейкин оказался более эффективным, чем иммуноконъюгаты
30 при применении в более низких концентрациях, однако это различие не обнаружено при более высоких концентрациях. В более ранние моменты времени (день 4), конструкции IgG-IL2 обладали несколько более высокой эффективностью, чем конструкции Fab-IL2-Fab. В более поздние моменты
времени (день 6) эффективность всех конструкций была сопоставимой, при этом конструкция Fab-IL2 qm-Fab обладала слабой эффективностью при применении в низких концентрациях.
На фиг. 35 продемонстрированы данные о пролиферации СВ4-Т-клеток 5 после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28Н1 IL-2, мишенью
которых является FAP, в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней. Все тестируемые конструкции индуцировали пролиферацию СВ4-Т-клеток в зависимости от концентрации. Пролейкин оказался более эффективным, чем иммуноконъюгаты, а иммуноконъюгаты, содержащие IL-2 дикого типа, обладали несколько более
10 высокой эффективностью, чем содержащие четырехмутантный IL-2. Также как и в случае NK-клеток, конструкция Fab-IL2 qm-Fab обладала наименьшей активностью. Наиболее вероятно, пролиферирующие СВ4-Т-клетки частично представляют собой регуляторные Т-клетки, по меньшей мере в случае конструкций, содержащих IL-2 дикого типа.
15 На фиг. 36 продемонстрированы данные о пролиферации СББ-Т-клеток
после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28Н1 IL-2, мишенью которых является FAP, в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней. Все тестируемые конструкции индуцировали пролиферацию CDS-T-клеток в зависимости от концентрации. Пролейкин оказался более эффективным, чем иммуноконъюгаты,
20 а иммуноконъюгаты, содержащие IL-2 дикого типа, обладали несколько более
высокой эффективностью, чем содержащие четырехмутантный IL-2. Также как и в случае NK-клеток и СВ4-Т-клеток, конструкция Fab-IL2 qm-Fab обладала наименьшей активностью.
На фиг. 37 представлены результаты другого эксперимента, в котором
25 осуществляли сравнение 28Н1 IgG-IL-2, мишенью которого является FAP, содержащий либо дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, и пролейкина. Продолжительность инкубации составляла 6 дней. Как продемонстрировано на чертеже, все три содержащие IL-2 конструкции индуцировали пролиферацию NK-клеток (А) и CDS-T-клеток (В) в зависимости от дозы с одинаковой
30 эффективностью. В отношении СВ4-Т-клеток (Б) иммуноконъюгат IgG-IL2 qm обладал более низкой активностью, особенно при применении в средних концентрациях, что может являться следствием отсутствия активности в
отношении СВ25-позитивных (включая регуляторные) Т-клеток, которые представляют собой подпопуляцию СВ4-Т-клеток. Пример 13
Активация эффекторных клеток IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 5 (pSTATS-анализ)
РВМС получали согласно описанному выше методу. 500000 РВМС/лунку высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном и выдерживали в течение 45 мин при 37°С в среде RPMI, содержащей 10% FCS и 1% глютамакса (фирма Gibco). Затем РВМС инкубировали с пролейкином, полученным при создании
10 изобретения IL-2 дикого типа или четырехмутантным IL-2, в указанных
концентрациях в течение 20 мин при 37°С для индукции фосфорилирования STAT5. Затем клетки немедленно фиксировали (фирма BD, Cytofix-буфер) в течение 10 мин при 37°С и однократно отмывали, затем осуществляли стадию повышения проницаемости (фирма BD , буфер III Phosflow Perm) в течение 30
15 мин при 4°С. Затем клетки отмывали ЗФР /0,1% БСА и окрашивали смесями применяемыми для FACS антител для выявления NK-клеток (CD3 /CD56+), СБ8+-Т-клеток (CD3+/CD8+), СБ4+-Т-клеток (CD3+/CD4+/CD25"/CD127+) или Тгеё-клеток (CD4+/CD25+/CD127"/FoxP3+), а также pSTAT5 в течение 30 мин при КТ в темноте. Клетки отмывали дважды ЗФР/0,1% БСА и ресуспендировали в
20 2% PFA перед анализом методом проточной цитометрии (фирма BD, устройство FACSCantoII).
На фиг. 38 продемонстрированы данные о фосфорилировании STAT в NK-клетках (А), CDS-T-клетках (Б), СВ4-Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, полученными при создании
25 изобретения IL-2 дикого типа (пул 2) и четырехмутантным IL-2 (партия 1). Все три препарата IL-2 обладали одинаковой эффективностью в отношении индукции фосфорилирования STAT в NK-клетках, а также в CDS-T-клетках. В СВ4-Т-клетках и даже еще в большей степени в регуляторных Т-клетках четырехмутантный IL-2 обладал более низкой активностью, чем препараты,
30 содержащие IL-2 дикого типа.
Активация эффекторных клеток иммуноконъюгатом IgG-IL-2, содержащим IL-2 дикого типа и четырехмутантный IL-2 (pSTATS-анализ)
Условия эксперимента соответствовали описанным выше (см. пример 13).
5 На фиг. 39 продемонстрированы данные о фосфорилировании STAT в NK-
клетках (А), CDS-T-клетках (Б), СВ4-Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, IgG-IL-2, содержащим IL-2 дикого типа, или IgG-IL-2 содержащим четырехмутантный IL-2. В клетках всех типов пролейкин обладал более высокой эффективностью в отношении 10 индукции фосфорилирования STAT, чем иммуноконъюгаты IgG-IL-2.
Конструкции IgG-IL-2, содержащие IL-2 дикого типа и четырехмутантный IL-2, обладали одинаковой эффективностью в NK-клетках, а также CDS-T-клетках. В СВ4-Т-клетках и даже еще в большей степени в регуляторных Т-клетках четырехмутантный IgG-IL-2 обладал более низкой активностью, чем 15 иммуноконъюгат IgG-IL-2, содержащий IL-2 дикого типа.
Пример 15
Максимальные переносимые дозы (MTD) иммуноконъюгатов Fab-IL2 wt-Fab и Fab-IL2 qm-Fab, мишенью которых является FAP
Проводили оценку воздействия возрастающих доз иммуноконъюгатов Fab-20 IL2-Fab, мишенью которых является FAP, содержащих либо дикого типа (wt), либо четырехмутантный (qm) IL-2, на не имеющих опухоли иммунокомпетентных мышах линии Black 6.
Самок мышей линии Black 6 (фирма Charles River, Германия), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специальных 25 условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (Р 2008016). После доставки животных выдерживали в течение одной недели для акклиматизации к новому окружению и для 30 обследования. В течение всего периода времени регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
Мышам инъецировали i.v. один раз в день в течение 7 дней 4G8 Fab-IL2 wt-Fab в дозах 60, 80 и 100 мкг/мышь или 4G8 Fab-IL2 qm-Fab в дозах 100, 200, 400,
600 и 1000 мкг/мышь. Всем мышам инъецировали i.v. 200 мкл соответствующего раствора. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили ЗФР.
На фиг. 40 продемонстрировано, что MTD (максимальная переносимая 5 доза) Fab-IL2 qm-Fab оказалась в 10 раз выше, чем Fab-IL2 wt-Fab, а именно, она составляла 600 мкг/мышь при ежедневном введении Fab-IL2 qm-Fab в течение 7 дней по сравнению с 60 мкг/мышь при ежедневном введении Fab-IL2 wt-Fab в течение 7 дней.
Пример 16
Фармакокинетические характеристики одноразовой дозы иммуноконъюгатов IgG-IL2 wt и qm, мишенью которых является FAP, и "ненаправленных" иммуноконъюгатов IgG-IL2 wt и qm
15 Фармакокинетическое (ФК) исследование одноразовой дозы
иммунокоъюгатов IgG-IL2, мишенью которых является FAP, содержащих либо дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, и "ненаправленных" иммуноконъюгатов IgG-IL-2, содержащих либо дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, осуществляли на не имеющих опухоли
20 иммунокомпетентных мышах линии 129.
Самок мышей линии 129 (фирма Harlan, Великобритания), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специальных условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального
25 исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (Р
2008016). После доставки животных выдерживали в течение одной недели для
акклиматизации к новому окружению и для обследования. В течение всего периода времени регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
Мышам однократно инъецировали i.v. иммуноконъюгаты, мишенью которых является FAP, такие как 28Н1 IgG-IL2 wt (2,5 мг/кг) или 28Н1 IgG-IL2 5 qm (5 мг/кг), или "ненаправленные" иммуноконъюгаты DP47GS IgG-IL2 wt (5 мкг/кг) или DP47GS IgG-IL2 qm (5 мг/кг). Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили ЗФР.
10 У мышей брали образцы крови в следующие моменты времени: 1, 8, 24, 48,
72, 96 ч, и после этого через каждые 2 дня в течение 3 недель. Сыворотку экстрагировали и хранили при -20°С до осуществления анализа ELISA. Концентрации иммуноконъюгатов в сыворотке определяли, применяя ELISA для количественной оценки антитела, входящего в содержащий IL-2
15 иммуноконъюгат (фирма Roche-Penzberg). Абсорбцию определяли, осуществляя измерения при длине волны 405 нм и длине референс-волны 492 нм (настраиваемый ридер для микропланшетов типа VersaMax, фирма Molecular Devices).
На фиг. 41 представлены результаты фармакокинетического исследования 20 указанных иммуноконъюгатов IL-2. Как конструкции, мишенью которых
является FAP (А), так и "ненаправленные" (Б) конструкции IgG-IL2 qm, имели более продолжительное время полужизни в сыворотке (примерно 30 ч) по сравнению с соответствующими конструкциями IgG-IL2 wt (примерно 15 ч).
Фармакокинетические характеристики одноразовой дозы "ненаправленных" иммуноконъюгатов Fab-IL2 wt-Fab и Fab-IL2 qm-Fab Фармакокинетическое (ФК) исследование одноразовой дозы 5 "ненаправленных" иммунокоъюгатов Fab-IL2-Fab, содержащих либо дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, осуществляли на не имеющих опухоли иммунокомпетентных мышах линии 129.
Самок мышей линии 129 (фирма Harlan, Великобритания), возраст которых при начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специальных 10 условиях без патогенов с суточным циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (Р 2008016). После доставки животных выдерживали в течение одной недели для акклиматизации к новому окружению и для 15 обследования. В течение всего периода регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
Мышам однократно инъецировали i.v. иммуноконъюгаты DP47GS Fab-IL2 wt-Fab в дозе 65 нмолей/кг или DP47GS Fab-IL2 qm-Fab в дозе 65нМ/кг. Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Для 20 получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили ЗФР.
У мышей брали образцы крови в следующие моменты времени: 0,5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96 ч; и после этого через каждые 2 дня в течение 3 недель. Сыворотку экстрагировали и хранили при -20°С до осуществления анализа ELISA. 25 Концентрации иммуноконъюгатов в сыворотке определяли, применяя ELISA для количественной оценки антитела, входящего в содержащий IL-2 иммуноконъюгат (фирма Roche-Penzberg). Абсорбцию определяли, осуществляя измерения при длине волны 405 нм и длине референс-волны 492 нм (настраиваемый ридер для микропланшетов типа VersaMax, фирма Molecular 30 Devices).
На фиг. 42 представлены результаты фармакокинетического исследования указанных иммуноконъюгатов IL-2. Конструкции Fab-IL2-Fab wt и qm имели время полужизни в сыворотке, составлявшее приблизительно 3-4 ч. Различие во
времени полужизни в сыворотке между конструкциями, содержащими IL-2
дикого типа или четырехмутантный IL-2, оказалось менее выраженным для Fab-
1Ь2-РаЬ-конструкций, чем для IgG-подобных иммуноконъюгатов, которые сами
имели более продолжительное время полужизни.
5 Таблица 21.
Соединение
Доза
Состав буфера
Концентрация (мг/мл)
DP47GS Fab-IL2 wt-Fab
65нМ/кг
ЮОмМ глицин, 125мМ NaCl,
25мМ КН2Р04, рН 6,7
3,84
(маточный раствор)
DP47GS Fab-IL2 qm-Fab
65нМ/кг
ЮОмМ глицин, 125мМ NaCl,
25мМ КН2Р04, рН 6,7
2,42
(маточный раствор)
Пример 18
Активация индуцированной клеточной гибели активируемых IL-2 РВМС Свежевыделенные из организма здоровых доноров РВМС предварительно
10 активировали в течение ночи с помощью ФГА-М в концентрации 1 мкг/мл в
среде RPMI1640, содержащей 10% FCS и 1% глутамина. После предварительной активации РВМС собирали, метили с помощью 40нМ CFSE в ЗФР и высевали в 96-луночные планшеты из расчета 100000 клеток/лунку. Предварительно активированные РВМС стимулировали, используя в различных концентрациях
15 иммуноконъюгаты IL-2 (4В9 IgG-IL-2 wt, 4В9 IgG-IL-2 qm, 4B9 Fab-IL-2 wt-Fab и 4B9 Fab-IL-2 qm-Fab). Через 6 дней после обработки с помощью IL-2 РВМС обрабатывали в течение ночи активирующим антителом к Fas в концентрации 0,5 мкг/мл. Через 6 дней анализировали пролиферацию CD4-(CD3+CD8 ) и CD8-(CD3+CD8+) Т-клеток, используя разведения CFSE. Процент живых Т-клеток
20 после обработки антителом к Fas определяли путем установки
дискриминационного окна на CD3+-, аннексии V-негативных живых клеток.
Как продемонстрировано на фиг. 44, все конструкции индуцировали пролиферацию предварительно активированных Т-клеток. При применении в низких концентрациях конструкции, содержащие IL-2 дикого типа (wt),
25 оказались более активными, чем содержащие IL-2 qm конструкции. IgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab и пролейкин обладали сходной активностью. Конструкция Fab-IL-2 qm-Fab обладала несколько более низкой активностью, чем IgG-IL-2 qm.
Конструкции, содержащие IL-2 дикого типа, обладали более высокой активностью в отношении СВ4-Т-клеток, чем в отношении СВ8-Т-клеток, наиболее вероятно из-за активации регуляторных Т-клеток. Конструкции, содержащие четырехмутантный IL-2, обладали сходной активностью в 5 отношении CD8- и СВ4-Т-клеток.
Как продемонстрировано на фиг. 45, Т-клетки, стимулированные IL-2
дикого типа в высоких концентрациях, обладали большей чувствительностью к
индуцируемому антителом к Fas апоптозу, чем Т-клетки, обработанные
четырехмутантным IL-2.
10 Хотя выше изобретение описано выше достаточно подробно с помощью
иллюстраций и примеров, приведенных для целей лучшего понимания, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Все процитированные в настоящем описании патентные и научные публикации полностью включены в него в качестве ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Роше Гликарт АГ
<120> Мутантные полипептиды интерлейкина-2
<130> 27307
<150> EP 11153964.9
<151> 2011-02-10
<150> EP 11164237.7
<151> 2011-04-29
<160> 324
<170> Patentln. версия 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr 130
<210> <211> <212>
399
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа
<400> 2
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 399
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа(C125A)
<400> 3
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
<210> 4
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа(C125A) (1)
<400> 4
gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacctggccc agtccaagaa cttccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggctccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210> 5
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа (C125A) (2)
<400> 5
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 6
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа (C125A) (3)
<400> 6
gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacctggccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 7
<211> 133
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A)
<400> 7
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr 130
<210> 8
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (1)
<400> 8
gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agtccaagaa cttccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggctccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210> 9
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (2) <400> 9
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 10
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (3) <400> 10
gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 11
<211> 133
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G / F42A (C125A)
<400> 11
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr 130
<210> 12
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 F42A / L72G (C125A) (1)
<400> 12
gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agtccaagaa cttccacctg
240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggctccgag 300 acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360 tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210> 13 <211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 F42A / L72G (C125A) (2)
<400> 13
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 14
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 F42A / L72G (C125A) (3) <400> 14
gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 15
<211> 133
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A)
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr 130
<210> 16
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (1) <400> 16
gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgagctga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agtccaagaa cttccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggctccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210> <211> <212>
399
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (2) <400> 17
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 18
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (3) <400> 18
gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 19
<211> 133
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A)
<400> 19
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr 130
<210> 20
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) (1) <400> 20
gctcctgcct cctccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgagctga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agtccaagaa cttccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggctccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210> 21
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) (2) <400> 21
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 22
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) (3) <400> 22
gctcctgcca gcagctccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10; VL
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 24
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10; VL <400> 24
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10(GS); VL
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 26
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10(GS); VL <400> 26
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10; VH
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> <211> <212> <213>
363 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10; VH
<400> 28
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11; VL <400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
1 5
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
<210> 30
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11; VL <400> 30
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcgtccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagt atactccccc cacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11(VI); VL
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<211> 324 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11(VI); VL <400> 32
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagt atactccccc cacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11; VH
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<211> 351 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11; VH <400> 34
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac atggccgtat attactgtgc gaaatggaga 300
tggatgatgt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 35
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11(MT); VH
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<211> 351 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11(MT); VH <400> 36
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaatggaga 300
tggatgatgt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2; VL
<400> 37
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 38
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2; VL <400> 38
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt atccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 39
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2(YS); VL
<400> 39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 40
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2(YS); VL
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2; VH
<400> 41
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 42
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 43
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9, VL
<400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Leu Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 44
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9, VL
<400> 44
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa
120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagc ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 45
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9, VH
<400> 45
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
351
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9, VH
<400> 46
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attggtgtta gtactggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9(TA); VH
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
351
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9(TA); VH
<400> 48
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attggtgtta gtactggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300 ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 49
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8; VL
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 50
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8; VL <400> 50
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc cgcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatcatt ggggcctcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggacg gacttcactc tcaccatcag cagactggag
240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 51
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8; VH
<400> 51
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 52
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8; VH <400> 52
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat
240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg
300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3; VL
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Tyr Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 54
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3; VL <400> 54
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcaattact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggcgcctaca tcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3; VH
<400> 55
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 56
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3; VH
<400> 56
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 57
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4D6; VL
<400> 57
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Gln Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 58 <211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4D6; VL <400> 58
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatccag ggcgcctcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> <211> <212>
117
PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4D6; VH
<400> 59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 60
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4D6; VH
<400> 60
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 61 <211> 108 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C6; VL <400> 61
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 62
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C6; VL <400> 62
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag caggctggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagc agattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 63
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Ala Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
351
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C6; VH
<400> 64
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggga gtgctggtta tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttgggaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 65
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<400> 65
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 66
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5H5; VL <400> 66
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agattccccc tacgttcggt 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 67
<211> 116
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5H5; VH <400> 67
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 68 <211> 348
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5H5; VH <400> 68
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatacca tgagctgggt ccgccggtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtg gtggtaggac atactacgca 180
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aggttggttt 300
acgccttttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagt 348
<210> 69
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C4; VL <400> 69
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 70
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C4; VL <400> 70
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agtaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcctcca ttagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agattccccc tacgttcggt 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 71
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C4; VH
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 72
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C4; VH <400> 72
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttacgcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 73
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2D9; VL <400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 74
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2D9; VL <400> 74
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agattccccc tacgttcggt 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 75
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2D9; VH
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 76
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2D9; VH <400> 76
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttacgcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 77
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B8; VL <400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 78 <211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B8; VL <400> 78
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 79
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B8; VH
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 80
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B8; VH <400> 80
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 81
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7A1; VL
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 82
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7A1; VL <400> 82
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagc agattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 83
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7A1; VH
<400> 83
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
351
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 7A1; VH
<400> 84
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttgggaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 85
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 13C2; VL
<400> 85
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Leu Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> <211> <212> <213>
324
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 13C2; VL
<400> 86
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagc ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 87
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 13C2; VH
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
351
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 13C2; VH
<400> 88
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 89
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 13E8; VL
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Pro
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 90
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 13E8; VL
<400> 90
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtctga atattccctc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 91
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 13E8; VH
<400> 91
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 92
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 13E8; VH
<400> 92
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ttgggtccgt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14C10; VL
<400> 93
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Ile Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
<210> 94
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14C10; VL <400> 94
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcata ttattccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 95
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14C10; VH
<400> 95
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Trp Met Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
<210> 96
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14C10; VH <400> 96
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagcttgg 300
atggggcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 97
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 17A11; VL
<400> 97
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Pro
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<211> 324 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 17A11; VL <400> 98
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtctga atattccctc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 99
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 17A11; VH
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<211> 351 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 17A11; VH <400> 100
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ttgggtccgt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19G1; VL
<400> 101
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 102
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19G1; VL <400> 102
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 103
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19G1; VH
<400> 103
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 104
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19G1; VH <400> 104
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg attattagta gtggtggtct cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 105
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 20G8; VL
<400> 105
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 106
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 20G8; VL
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 107
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 20G8; VH
<400> 107
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 108
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 20G8; VH
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcaa tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggga gtggtagtcg tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 109
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9; VL
<400> 109
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 110
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9; VL
<400> 110
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa
120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 111
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9; VH
<400> 111
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
112 351 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9; VH
<400> 112
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtgctag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300 tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 113
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5B8; VL
<400> 113
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 114
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5B8; VL <400> 114
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag
240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 115
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5B8; VH <400> 115
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 116
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5B8; VH
<400> 116
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct atttggggtg gtggtcgtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg
300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 117
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5F1; VL
<400> 117
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 118
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5F1; VL <400> 118
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 119
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5F1; VH <400> 119
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Ser Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 120
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 5F1; VH
<400> 120
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattagta gtggggctag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 121
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14B3; VL
<400> 121
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 122 <211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14B3; VL <400> 122
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> <211> <212>
123 117 PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14B3; VH
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Leu Ala Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 124
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14B3; VH
<400> 124
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attttggcta gtggtgcgat cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 125 <211> 108 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16F1; VL <400> 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 126
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16F1; VL <400> 126
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 127
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<400> 127
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
128 351 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 16F1; VH
<400> 128
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attattggta gtggtggtat cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 129
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<400> 129
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 130
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16F8; VL <400> 130
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 131
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16F8; VH <400> 131
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Leu Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 132 <211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16F8; VH <400> 132
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attcttggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 133
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O3C9; VL <400> 133
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 134
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O3C9; VL <400> 134
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 135
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O3C9; VH
<400> 135
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 136
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O3C9; VH
<400> 136
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttttgcca tgagctgggt ccgtcagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtagtaa cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 137
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O2D7; VL
<400> 137
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Thr Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 138
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O2D7; VL <400> 138
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcacccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggctatta tgcttcctcc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 139
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O2D7; VH
<400> 139
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 140
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O2D7; VH
<400> 140
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 141
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1; VL <400> 141
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 142
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1; VL <400> 142
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc cgcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcatt ggggcctcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 143
<211> 116
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1; VH
<400> 143
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 144
<211> 348
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1; VH <400> 144
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agtcatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct atttgggcta gtggggagca atactacgca 180
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agggtggctg 300
ggtaattttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagt 348
<210> 145
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 22A3; VL
<400> 145
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 146
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 22A3; VL <400> 146
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 147
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 22A3; VH
<400> 147
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
148 351 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 22A3; VH
<400> 148
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtagtat cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 149
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 29B11; VL
<400> 149
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> <211> <212> <213>
150 324 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 29B11; VL
<400> 150
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 151
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 29B11; VH
<400> 151
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212> <213>
152 351 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> 29B11; VH
<400> 152
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtggtat cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 153
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 23C10; VL
<400> 153
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 154
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 23C10; VL
<400> 154
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc cgcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcatt ggggcctcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 155
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 23C10; VH
<400> 155
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Thr Asn Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 156
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 23C10; VH
<400> 156
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttctgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtacta atggtaatta tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 157
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3B6; VL
<400> 157
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
<210> 158
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3B6; VL <400> 158
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 159
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3B6; VH
<400> 159
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
<210> 160
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3B6; VH <400> 160
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagct atcatcccga tccttggtat cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6A12; VL
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 162
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6A12; VL <400> 162
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 163
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6A12; VH
<400> 163
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 164
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6A12; VH <400> 164
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctatgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagtg atcatcccta tccttggtac cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3A6; VL
<400> 165
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<211> 321 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3A6; VL <400> 166
gacatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat tcgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 167
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3A6; VH
<400> 167
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_C3A6; VH <400> 168
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 169
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_D1A2_wt; VL
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> <211> <212>
170 321 ДНК
<220>
<223> 2B10_D1A2_wt; VL <400> 170
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca ggggattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 171
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_D1A2_wt; VH
<400> 171
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> <211> <212>
172 363
ДНК
<220>
<223> 2B10_D1A2_wt; VH
<400> 172
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 173
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_D1A2_VD; VL
<400> 173
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 174
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_D1A2_VD; VL
<400> 174
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca ggggattcgt aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 175
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_D1A2_VD; VH
<400> 175
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 176
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_D1A2_VD; VH
<400> 176
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_O7D8; VL
<400> 177
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 178
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 178
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gagcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gtgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 179
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_O7D8; VH
<400> 179
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 180
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 180
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 181
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_O1F7; VL
<400> 181
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 182
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc
atcacctgcc gggcaagtca gggcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcctgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 183
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_O1F7; VH
<400> 183
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 184
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 3 60
tca 363
<210> 185
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6H10; VL
<400> 185
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Gln Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 186
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6H10; VL
<400> 186
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc
atcacctgcc gggcaagtca gggcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatccaggct gctaccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 187
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6H10; VH
<400> 187
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 188
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_6H10; VH
<400> 188
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 189
<211> 122
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MHLG1; VH
<400> 189
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 190
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagt 366
<210> 191
<211> 109
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV9; VL
<400> 191
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105
<210> 192
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV9; VL
<400> 192
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc
atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120
gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacg 327
<210> 193
<211> 122
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MHLG; VH
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 194
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MHLG; VH
<400> 194
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggcgggtc cctgcggctc
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagt 366
<210> 195
<211> 109
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV1; VL
<400> 195
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105
<210> 196
<211> 330
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV1; VL
<400> 196
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca gggccagtca gaatgtggat actaacttag cttggtacca gcagaagcca
120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240 gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300 ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330
<210> 197
<211> 109
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV7; VL
<400> 197
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105
<210> 198
<211> 330
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV7; VL <400> 198
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60 atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120 gggaaagcac ctaagcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct
240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330
<210> 199
<211> 603
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> L19 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 199
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
260 265 270
Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
275 280 285
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
290 295 300
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
305 310 315 320
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
325 330 335
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
340 345 350
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu
370 375 380
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
385 390 395 400
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ser
405 410 415
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
420 425 430
Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
435 440 445
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
465 470 475 480
Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
485 490 495
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
500 505 510
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
515 520 525
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
530 535 540
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
545 550 555 560
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
565 570 575
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
580 585 590
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600
<210> 200 <211> 1809
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> L19 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 200
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agtttttcga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct atttccggta gttcgggtac cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 300
ccgtattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagcaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc
480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gataagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
tccggcggag gagggagcgg cggaggtggc tccggaggtg gcggagcacc tgcctcaagt 720
tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca gatgattttg 780
aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacagc caagtttgcc 840
atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga actcaaacct 900
ctggaggaag tgctaaatgg cgctcaaagc aaaaactttc acttaagacc cagggactta 960
atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac attcatgtgt 1020
gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat tacctttgcc 1080
caaagcatca tctcaacact gacttccggc ggaggaggat ccggcggagg tggctctggc 1140
ggtggcggag aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 1200
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gtttttcgat gagctgggtc 1260
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcta tttccggtag ttcgggtacc 1320
acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 1380
acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 1440
aaaccgtttc cgtattttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagtgct 1500
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 1560
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 1620
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 1680
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 1740
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa 1800
tcttgtgac 1809
<210> 201 <211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> L19, легкая цепь
<400> 201
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 202
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> L19, легкая цепь
<400> 202
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat tatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagacgggtc gtattcctcc gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 203
<211> 641
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F16 scFv-IL2 qm-scFv
<400> 203
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met
210 215 220
Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala Pro
245 250 255
Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu
260 265 270
Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
275 280 285
Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala
290 295 300
Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
305 310 315 320
Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro
325 330 335
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
340 345 350
Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
355 360 365
Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser
370 375 380
Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
420 425 430
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
435 440 445
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
450 455 460
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
465 470 475 480
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met
485 490 495
Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Val
515 520 525
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 530 535
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 545 550
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 540
Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met 555 560
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
565 570 575
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
580 585 590
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
595 600 605
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
610 615 620
Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
625 630 635 640
Ser
<211> 1923 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F16 scFv-IL2 qm-scFv
<400> 204
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cggtatggta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagcgcat 300
aatgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgagagg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg 420
tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc acatgccaag gagacagcct cagaagctat 480
tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa 540
aacaaccggc cctcagggat cccagaccga ttctctggct ccagctcagg aaacacagct 600
tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa gatgaggctg actattactg taactcctct 660
gtttatacta tgccgcccgt ggtattcggc ggagggacca agctgaccgt cctaggctct 720
tcctcatcgg gtagtagctc ttccggctca tcgtcctccg gagcacctgc ctcaagttct 780
acaaagaaaa cacagctaca actggagcat ttactgctgg atttacagat gattttgaat 840
ggaattaata attacaagaa tcccaaactc accaggatgc tcacagccaa gtttgccatg 900
cccaagaagg ccacagaact gaaacatctt cagtgtctag aagaagaact caaacctctg 960
gaggaagtgc taaatggcgc tcaaagcaaa aactttcact taagacccag ggacttaatc 1020
agcaatatca acgtaatagt tctggaacta aagggatctg aaacaacatt catgtgtgaa 1080
tatgctgatg agacagcaac cattgtagaa tttctgaaca gatggattac ctttgcccaa 1140
agcatcatct caacactgac ttccggcgga ggagggagcg gcggaggtgg ctctggcggt 1200
ggcggatcgt ctgagctcac tcaggaccct gctgtgtctg tggccttggg acagacagtc 1260
aggatcacat gccaaggaga cagcctcaga agctattatg caagctggta ccagcagaag 1320
ccaggacagg cccctgtact tgtcatctat ggtaaaaaca accggccctc agggatccca 1380
gaccgattct ctggctccag ctcaggaaac acagcttcct tgaccatcac tggggctcag 1440
gcggaagatg aggctgacta ttactgtaac tcctctgttt atactatgcc gcccgtggta 1500
ttcggcggag ggaccaagct taccgtacta ggctcaggag gcggttcagg cggaggttct 1560
ggcggcggta gcggatcgga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct 1620
ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttagccg gtatggtatg 1680
agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcagctat tagtggtagt
1740
ggtggtagca catactacgc agactccgtg aagggccggt tcaccatctc cagagacaat 1800
tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag ccgaggacac ggccgtatat 1860
tactgtgcga aagcgcataa tgcttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtg 1920
tcg 1923
<210> 205
<211> 603
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F16 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 205
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Ser Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala Pro Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
260 265 270
Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
275 280 285
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
290 295 300
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
305 310 315 320
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
325 330 335
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
340 345 350
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu
370 375 380
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
385 390 395 400
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly
405 410 415
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
420 425 430
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
435 440 445
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
450 455 460
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
465 470 475 480
Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
485 490 495
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
500 505 510
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
515 520 525
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
530 535 540
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
545 550 555 560
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
565 570 575
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
580 585 590
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600
ДНК
т/г ^ т"-
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F16 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 206
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cggtatggta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagcgcat
300
aatgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgagtgc tagcaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gataagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
tcttcctcat cgggtagtag ctcttccggc tcatcgtcct ccggagcacc tgcctcaagt 720
tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca gatgattttg 780
aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacagc caagtttgcc 840
atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga actcaaacct 900
ctggaggaag tgctaaatgg cgctcaaagc aaaaactttc acttaagacc cagggactta 960
atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac attcatgtgt 1020
gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat tacctttgcc 1080
caaagcatca tctcaacact gacttccggc ggaggaggga gcggcggagg tggctctggc 1140
ggtggcggag aggtgcaatt gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 1200
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagcc ggtatggtat gagctgggtc 1260
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtagc 1320
acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 1380
acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 1440
aaagcgcata atgcttttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt gtcgagtgct 1500
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 1560
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 1620
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 1680
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 1740
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 1800
tcttgtgac 1809
<210> 207 <211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F16, легкая цепь
<400> 207
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210
<210> 208
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F16, легкая цепь
tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 12 0
caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg taactcctct gtttatacta tgccgcccgt ggtattcggc 300
ggagggacca agctgaccgt cctaggtcaa cccaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 3 60
ccccccagca gcgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtctgcct gatcagcgac 420
ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480
gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540
agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 600
ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gc 642
<210> 209
<211> 605
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 209
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 210
<211> 1815
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 210
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gactccggcg gaggagggag cggcggaggt ggctccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcctccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caattccaag 1380
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattactgt 1440
gcgaaagggt ggtttggtgg ttttaactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 211
<211> 605
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 211
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 212 <211> 1815
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 212
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gactccggcg gaggagggag cggcggaggt ggctccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 9 60
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcctccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caattccaag 1380
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattactgt 1440
gcgaaagggt ggctgggtaa ttttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 213 <211> 605 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 213
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 214 <211> 1815 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 214
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attggtgtta gtactggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gactccggcg gaggagggag cggcggaggt ggctccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcctccgga ttcaccttta gcagttatgc tatgagctgg 1260
gtccgccaga ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattggtgt tagtactggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caattccaag 1380
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattactgt 1440
gcgaaaggtt ggctgggtcc ttttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 215
<211> 605
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 215
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 216 <211> 1815 <212>
ДНК
т/г ^ т"-
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaatggaga 300
tggatgatgt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 3 60
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gactccggcg gaggagggag cggcggaggt ggctccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 9 60
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcctccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caattccaag 1380
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acaccgccgt atattactgt 1440
gcgaaatgga gatggatgat gtttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<211> 605
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 217
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 218
<211> 1815
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 218
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gactccggcg gaggagggag cggcggaggt ggctccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcctccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caattccaag 1380
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattactgt 1440
gcgaaagggt ggctgggtaa ttttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 219 <211> 603 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 219
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
260 265 270
Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
275 280 285
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
290 295 300
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
325 330 335
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
340 345 350
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu
370 375 380
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
385 390 395 400
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala
405 410 415
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
420 425 430
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
435 440 445
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
450 455 460
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
465 470 475 480
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
485 490 495
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
500 505 510
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
515 520 525
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
530 535 540
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
545 550 555 560
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
580 585 590
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600
<210> 220
<211> 1809
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 220
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggaccctccg tgttccccct ggccccctcc agcaagtcta cctctggcgg caccgccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480
gccctgacca gcggcgtcca cacctttcca gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540
ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctccagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggaacccaa gtcctgcgac 660
agtggtgggg gaggatctgg tggcggaggt tctggcggag gtggcgctcc tgcctcctcc 720
agcaccaaga aaacccagct ccagctggaa catctcctgc tggatctgca gatgatcctg 780
aacggcatca acaactacaa gaaccccaag ctgacccgga tgctgaccgc caagttcgcc 840
atgcccaaga aggccaccga gctgaaacat ctgcagtgcc tggaagagga actgaagcct 900
ctggaagagg tgctgaacgg cgcccagtcc aagaacttcc acctgaggcc tcgggacctg 960
atctccaaca tcaacgtgat cgtgctggaa ctgaagggct ccgagacaac cttcatgtgc 1020
gagtacgccg acgagacagc taccatcgtg gaatttctga accggtggat caccttcgcc 1080
cagtccatca tctccaccct gacctccggt ggtggcggat ccgggggagg gggttctggc 1140
ggaggcggag aagtgcagct gctggaatcc ggcggaggcc tggtgcagcc tggcggatct 1200
ctgagactgt cctgcgccgc ctccggcttc accttctcct cccacgccat gtcctgggtc 1260
cgacaggctc caggcaaggg cctggaatgg gtgtccgcca tctgggcctc cggcgagcag 1320
tactacgccg actctgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaactc caagaacacc 1380
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgccaag 1440
ggctggctgg gcaacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt gtcctccgcc 1500
tctaccaagg gcccctccgt gttccctctg gccccctcca gcaagtctac ctctggcggc 1560
accgccgctc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 1620
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gtcctccggc 1680
ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccctccagct ctctgggcac ccagacctac 1740
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 1800
tcctgcgac 1809
<210> 221
<211> 605
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 29B11 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 221
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 222
<211> 1815
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 29B11 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 222
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ccggcggcat cacctactac 180
gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc caagggctgg 300
ttcggaggct tcaactactg gggacagggc accctggtca ccgtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccct ccgtgttccc cctggccccc tccagcaagt ctacctctgg cggcaccgcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga ccagcggcgt ccacaccttt ccagccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccctcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc 660
gacagtggtg ggggaggatc tggtggcgga ggttctggcg gaggtggcgc tcctgcctcc 720
tccagcacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctcc tgctggatct gcagatgatc 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagttc 840
gccatgccca agaaggccac cgagctgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag tccaagaact tccacctgag gcctcgggac 960
ctgatctcca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gctccgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agctaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagtcca tcatctccac cctgacctcc ggtggtggcg gatccggggg agggggttct 1140
ggcggaggcg gagaagtgca gctgctggaa tccggcggag gcctggtgca gcctggcgga 1200
tctctgagac tgtcctgcgc cgcctccggc ttcaccttct cctcctatgc catgtcctgg 1260
gtccgacagg ctccaggcaa gggcctggaa tgggtgtccg ccatcatcgg ctccggcggc 1320
atcacctact acgccgactc tgtgaagggc cggttcacca tctcccggga caactccaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaactccctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgt 1440
gccaagggct ggttcggagg cttcaactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 1500
tccgcctcta ccaagggccc ctccgtgttc cctctggccc cctccagcaa gtctacctct 1560
ggcggcaccg ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaact ctggcgccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagtcc 1680
tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagtcct gcgac 1815
<210> 223 <211> 605 <212> PRT
<220>
<223> 19G1 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 223
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 224 <211> 1815
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 19G1 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 224
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcagct ctggcggcct gacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gactccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggctccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgatc 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagttc 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact tccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcatcag ctctggcggc 1320
ctgacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacagcaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 225 <211> 605 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 20G8 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 225
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 226 <211> 1815 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 226
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcagccg gacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gactccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggctccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgatc 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagttc 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact tccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcatcgg ctctggcagc 1320
cggacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacagcaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 227
<211> 605
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 227
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 228 <211> 1815 <212>
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 228
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gactccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggctccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgatc 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagttc 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact tccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcatcgg ctctggcgcc 1320
agcacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacagcaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 229 <211> 605 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> 14B3 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 229
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Leu Ala Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala Ile Leu Ala Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 500
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 555 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
565 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 230
<211> 1815
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14B3 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 230
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcctggcct ctggcgccat cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gactccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggctccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgatc 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagttc 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact tccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcctggc ctctggcgcc 1320
atcacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacagcaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 231 <211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2, легкая цепь
<400> 231
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 232
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2, легкая цепь
<400> 232
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgacc tcctcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcaac gtgggcagtc ggagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggcatca tgctgccccc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca 360
ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaatccg tcaccgagca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg
540
accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagtccttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 233
<211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8, легкая цепь
<400> 233
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 234 <211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8, легкая цепь
<400> 234
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc cggtcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcatc ggcgcctcta ccagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tcatccctcc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca 360
ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaatccg tcaccgagca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg 540
accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcca gccccgtgac caagtccttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 235
<211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9, легкая цепь
<400> 235
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Leu Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 236
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3D9, легкая цепь
<400> 236
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagc ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 237
<211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11, легкая цепь
<400> 237
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 238
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2F11, легкая цепь
<400> 238
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagt atactccccc cacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 239
<211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3, легкая цепь
<400> 239
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Gly Ala Tyr Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 240
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B3, легкая цепь
<400> 240
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcaattact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggcgcctaca tcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag
240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 241
<211> 613
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 241
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
275 280 285
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
290 295 300
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
305 310 315 320
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
325 330 335
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
340 345 350
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
355 360 365
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
385 390 395 400
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
405 410 415
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
420 425 430
Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr
435 440 445
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
450 455 460
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe
485 490 495
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
500 505 510
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
515 520 525
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
530 535 540
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
545 550 555 560
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
565 570 575
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
580 585 590
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
595 600 605
Pro Lys Ser Cys Asp
610
<210> 242
<211> 1839
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 242
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgactccgg cggaggaggg agcggcggag gtggctccgg aggtggcgga 720
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 780
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 840
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 900
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 960
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 1020
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1080
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgactt ccggcggagg aggatccggc 1140
ggaggtggct ctggcggtgg cggacaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag 1200
aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc aaggcctccg gaggcacatt cagcagctac 1260
gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga caagggctcg agtggatggg agggatcatc 1320
cctatctttg gtacagcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagggtcac cattactgca 1380
gacaaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc 1440
gtgtattact gtgcgagact gtacggttac gcttactacg gtgcttttga ctactggggc 1500
caagggacca ccgtgaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1560
gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1620
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1680
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 1740
ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1800
accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa tcttgtgac 1839
<210> 243 <211> 613 <212> PRT
<220>
<223> C3B6 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 243
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
275 280 285
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
290 295 300
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
305 310 315 320
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
325 330 335
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
340 345 350
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
355 360 365
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
385 390 395 400
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
405 410 415
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
420 425 430
Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr
435 440 445
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
450 455 460
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
500 505 510
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
515 520 525
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
530 535 540
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
545 550 555 560
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
565 570 575
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
580 585 590
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
595 600 605
Pro Lys Ser Cys Asp
610
<210> 244
<211> 1839
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> C3B6 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 244
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagct atcatcccga tccttggtat cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgactccgg cggaggaggg agcggcggag gtggctccgg aggtggcgga 720
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 780
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 840
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 900
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 960
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 1020
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1080
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgactt ccggcggagg aggatccggc 1140
ggaggtggct ctggcggtgg cggacaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag 1200
aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc aaggcctccg gaggcacatt cagcagctac 1260
gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga caagggctcg agtggatggg agctatcatc 1320
ccgatccttg gtatcgcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagggtcac cattactgca 1380
gacaaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc 1440
gtgtattact gtgcgagact gtacggttac gcttactacg gtgcttttga ctactggggc 1500
caagggacca ccgtgaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1560
gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1620
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1680
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 1740
ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1800
accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa tcttgtgac 1839
<210> 245 <211> 613 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 6A12 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 245
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Leu Gly
50 55
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
65 70
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr 100
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 60
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
275 280 285
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
290 295 300
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
305 310 315 320
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
325 330 335
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
340 345 350
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
355 360 365
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
385 390 395 400
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
405 410 415
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
420 425 430
Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr
435 440 445
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
450 455 460
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe
485 490 495
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
500 505 510
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
515 520 525
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
530 535 540
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
545 550 555 560
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
565 570 575
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
580 585 590
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
595 600 605
Pro Lys Ser Cys Asp
610
<210> 246 <211> 1839
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 6A12 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 246
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctatgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagtg atcatcccta tccttggtac cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgactccgg cggaggaggg agcggcggag gtggctccgg aggtggcgga 720
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 780
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 840
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 900
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 960
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 1020
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1080
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgactt ccggcggagg aggatccggc 1140
ggaggtggct ctggcggtgg cggacaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag 1200
aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc aaggcctccg gaggcacatt cagcagctat 1260
gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga caagggctcg agtggatggg agtgatcatc 1320
cctatccttg gtaccgcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagggtcac cattactgca 1380
gacaaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc 1440
gtgtattact gtgcgagact gtacggttac gcttactacg gtgcttttga ctactggggc 1500
caagggacca ccgtgaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1560
gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1620
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1680
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 1740
ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1800
accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa tcttgtgac 1839
<210> 247
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10, легкая цепь
<400> 247
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 248
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10, легкая цепь
<400> 248
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 249
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> D1A2, легкая цепь
<400> 249
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 250 <211> 642 <212> ДНК
<220>
<223> D1A2, легкая цепь
<400> 250
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca ggggattcgt aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 251
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O7D8, легкая цепь
<400> 251
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 252
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> O7D8, легкая цепь
<400> 252
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gagcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gtgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<211> <212> <213>
615
PRT
<220>
<223> MHLG1 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 253
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305 310 315 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
420 425 430
Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly
435 440 445
Arg Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
450 455 460
Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His
485 490 495
Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
500 505 510
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
515 520 525
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
530 535 540
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
545 550 555 560
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
565 570 575
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
580 585 590
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
595 600 605
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 610 615
<210> 254 <211> 1845
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MHLG1 Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 254
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagtgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga taagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgactc cggcggagga gggagcggcg gaggtggctc cggaggtggc 720
ggagcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 780
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 840
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 900
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 960
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1020
gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1080
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga cttccggcgg aggaggatcc 1140
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggagaa gtgcagctgg tggagtctgg aggaggcttg 1200
gtcaagcctg gcgggtccct gcggctctcc tgtgcagcct ccggattcac atttagcaac 1260
tattggatga actgggtgcg gcaggctcct ggaaagggcc tcgagtgggt ggccgagatc 1320
agattgaaat ccaataactt cggaagatat tacgctgcaa gcgtgaaggg ccggttcacc 1380
atcagcagag atgattccaa gaacacgctg tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag 1440
gatacggccg tgtattactg taccacatac ggcaactacg ttgggcacta cttcgaccac 1500
tggggccaag ggaccaccgt caccgtctcc agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc 1560
cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 1620
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1680
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1740
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1800
agcaacacca aggtggataa gaaagttgag cccaaatctt gtgac 1845
<210> 255 <211> 214 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV9, легкая цепь
<400> 255
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 256
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV9, легкая цепь
<400> 256
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120
gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 257
<211> 615
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MHLG Fab-IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 257
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305 310 315 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
420 425 430
Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly
435 440 445
Arg Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
450 455 460
Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His
485 490 495
Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
500 505 510
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
515 520 525
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
530 535 540
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
545 550 555 560
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
565 570 575
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
580 585 590
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
595 600 605
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 610 615
<210> 258
<211> 1845
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MHLG Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 258
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggcgggtc cctgcggctc
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagtgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga taagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgactc cggcggagga gggagcggcg gaggtggctc cggaggtggc 720
ggagcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 780
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 840
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 900
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 960
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1020
gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1080
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga cttccggcgg aggaggatcc 1140
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggagaa gtgcagctgg tggagtctgg aggaggcttg 1200
gtccagcctg gcgggtccct gcggctctcc tgtgcagcct ccggattcac atttagcaac 1260
tattggatga actgggtgcg gcaggctcct ggaaagggcc tcgagtgggt ggccgagatc 1320
agattgaaat ccaataactt cggaagatat tacgctgcaa gcgtgaaggg ccggttcacc 1380
atcagcagag atgattccaa gaacacgctg tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag 1440
gatacggccg tgtattactg taccacatac ggcaactacg ttgggcacta cttcgaccac 1500
tggggccaag ggaccaccgt caccgtctcc agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc 1560
cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 1620
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1680
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1740
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1800
agcaacacca aggtggataa gaaagttgag cccaaatctt gtgac 1845
<210> 259 <211> 214 <212> PRT
<220>
<223> KV1, легкая цепь
<400> 259
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV1, легкая цепь
<400> 260
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca gggccagtca gaatgtggat actaacttag cttggtacca gcagaagcca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 261
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV7, легкая цепь
<400> 261
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 262
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> KV7, легкая цепь
<400> 262
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120
gggaaagcac ctaagcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 263
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 263
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 264
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 264
atggactgga cctggagaat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> <211> <212> <213>
265
ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 265
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> 266
<211> 22
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 266
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys 20
<210> <211> <212>
267
ДНК
<220>
<223> лидерная последовательность <400> 267
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgt 66
<210> 268
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 268
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 269
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 269
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcc 57
<210> 270
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 270
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcc 57
<210> 271
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 271
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtcgccacag ccaccggcgt gcactct
<210> 272
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 272
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser 20
<210> 273
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность
<400> 273
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 274
<211> 466
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-бета-Fc("впадина")
<400> 274
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys
20 25 30
Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly
35 40 45
Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg
50 55 60
Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr
85 90 95
Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp
100 105 110
Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu
115 120 125
Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys
130 135 140
Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His
145 150 155 160
Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu
165 170 175
Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu
180 185 190
Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala
210 215 220
Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Gly Ala Gln Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 275
<211> 1401
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-бета-Fc("впадина")
<400> 275
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60
aggtgtgcgg tgaatggcac ttcccagttc acatgcttct acaactcgag agccaacatc 120
tcctgtgtct ggagccaaga tggggctctg caggacactt cctgccaagt ccatgcctgg 180
ccggacagac ggcggtggaa ccaaacctgt gagctgctcc ccgtgagtca agcatcctgg 240
gcctgcaacc tgatcctcgg agccccagat tctcagaaac tgaccacagt tgacatcgtc 300
accctgaggg tgctgtgccg tgagggggtg cgatggaggg tgatggccat ccaggacttc 360
aagccctttg agaaccttcg cctgatggcc cccatctccc tccaagttgt ccacgtggag 420
acccacagat gcaacataag ctgggaaatc tcccaagcct cccactactt tgaaagacac 480
ctggagttcg aggcccggac gctgtcccca ggccacacct gggaggaggc ccccctgctg 540
actctcaagc agaagcagga atggatctgc ctggagacgc tcaccccaga cacccagtat 600
gagtttcagg tgcgggtcaa gcctctgcaa ggcgagttca cgacctggag cccctggagc 660
cagcccctgg ccttcagaac aaagcctgca gcccttggga aggacaccgg agctcaggac 720
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380
tccctgtctc cgggtaaatg a 1401
<210> 276
<211> 492
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-гамма-Fc("выступ")
<400> 276
Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu 115
Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Gly Ala Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
<210> 277 <211> 1479
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-гамма-Fc("выступ")
<400> 277
atgttgaagc catcattacc attcacatcc ctcttattcc tgcagctgcc cctgctggga 60
gtggggctga acacgacaat tctgacgccc aatgggaatg aagacaccac agctgatttc 120
ttcctgacca ctatgcccac tgactccctc agtgtttcca ctctgcccct cccagaggtt 180
cagtgttttg tgttcaatgt cgagtacatg aattgcactt ggaacagcag ctctgagccc 240
cagcctacca acctcactct gcattattgg tacaagaact cggataatga taaagtccag 300
aagtgcagcc actatctatt ctctgaagaa atcacttctg gctgtcagtt gcaaaaaaag 360
gagatccacc tctaccaaac atttgttgtt cagctccagg acccacggga acccaggaga 420
caggccacac agatgctaaa actgcagaat ctggtgatcc cctgggctcc agagaaccta 480
acacttcaca aactgagtga atcccagcta gaactgaact ggaacaacag attcttgaac 540
cactgtttgg agcacttggt gcagtaccgg actgactggg accacagctg gactgaacaa 600
tcagtggatt atagacataa gttctccttg cctagtgtgg atgggcagaa acgctacacg 660
tttcgtgttc ggagccgctt taacccactc tgtggaagtg ctcagcattg gagtgaatgg 720
agccacccaa tccactgggg gagcaatact tcaaaagaga atcctttcct gtttgcattg 780
gaagccggag ctcaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 9 60
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1200
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479
<210> 278
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Альфа-субъединица человеческого IL-2R + Avi-метка + His-метка
<400> 278
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala
20 25 30
Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu
35 40 45
Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu
50 55 60
Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro
85 90 95
Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln
100 105 110
Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro
Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln
130 135 140
Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr
165 170 175
Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
195 200 205
His Glu Ala Arg Ala His His His His His His 210 215
<210> 279
<211> 660
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Альфа-субъединица человеческого IL-2R + Avi-метка + His-метка
<400> 279
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
ctctgtgacg atgacccgcc agagatccca cacgccacat tcaaagccat ggcctacaag 120
gaaggaacca tgttgaactg tgaatgcaag agaggtttcc gcagaataaa aagcgggtca 180
ctctatatgc tctgtacagg aaactctagc cactcgtcct gggacaacca atgtcaatgc 240
acaagctctg ccactcggaa cacaacgaaa caagtgacac ctcaacctga agaacagaaa 300
gaaaggaaaa ccacagaaat gcaaagtcca atgcagccag tggaccaagc gagccttcca 360
ggtcactgca gggaacctcc accatgggaa aatgaagcca cagagagaat ttatcatttc 420
gtggtggggc agatggttta ttatcagtgc gtccagggat acagggctct acacagaggt 480
cctgctgaga gcgtctgcaa aatgacccac gggaagacaa ggtggaccca gccccagctc 540
atatgcacag gtgtcgacga acagttatat tttcagggcg gctcaggcct gaacgacatc 600
ttcgaggccc agaagatcga gtggcacgag gctcgagctc accaccatca ccatcactga 660
<210> 280
<211> 473
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-бета-Fc("впадина")
<400> 280
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ala Arg Cys Ala Val Lys
20 25 30
Asn Cys Ser His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser
35 40 45
Cys Met Trp Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val
50 55 60
His Ala Lys Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Val Arg Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe
85 90 95
Pro Glu Ser Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val
100 105 110
Val Cys Trp Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe
115 120 125
His Pro Phe Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val
130 135 140
Leu His Ile Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln
145 150 155 160
Val Ser His Tyr Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg
165 170 175
Leu Leu Gly His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln
180 185 190
Arg Gln Gln Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr
195 200 205
Glu Val Gln Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp
210 215 220
Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Asp Pro
225 230 235 240
Met Lys Glu Gly Ala Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<213> Искусственная последовательность
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-бета-Fc("впадина")
<400> 281
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt ccccctcctg 60
ctgctctggt tcccaggtgc caggtgtgca gtgaaaaact gttcccatct tgaatgcttc 120
tacaactcaa gagccaatgt ctcttgcatg tggagccatg aagaggctct gaatgtcaca 180
acctgccacg tccatgccaa gtcgaacctg cgacactgga acaaaacctg tgagctaact 240
cttgtgaggc aggcatcctg ggcctgcaac ctgatcctcg ggtcgttccc agagtcccag 300
tcactgacct ccgtggacct ccttgacata aatgtggtgt gctgggaaga gaagggttgg 360
cgtagggtaa agacctgcga cttccatccc tttgacaacc ttcgcctggt ggcccctcat 420
tccctccaag ttctgcacat tgatacccag agatgtaaca taagctggaa ggtctcccag 480
gtctctcact acattgaacc atacttggaa tttgaggccc gtagacgtct tctgggccac 540
agctgggagg atgcatccgt attaagcctc aagcagagac agcagtggct cttcttggag 600
atgctgatcc ctagtacctc atatgaggtc caggtgaggg tcaaagctca acgaaacaat 660
accgggacct ggagtccctg gagccagccc ctgacctttc ggacaaggcc agcagatccc 720
atgaaggagg gagctcagga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtgcaccct gcccccatcc 1140
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctctcgtgcg cagtcaaagg cttctatccc 1200
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctcgtga gcaagctcac cgtggacaag 1320
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422
<210> 282 <211> 500 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-гамма-Fc("выступ")
<400> 282
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ala Arg Cys Trp Ser Ser
20 25 30
Lys Val Leu Met Ser Ser Ala Asn Glu Asp Ile Lys Ala Asp Leu Ile
35 40 45
Leu Thr Ser Thr Ala Pro Glu His Leu Ser Ala Pro Thr Leu Pro Leu
50 55 60
Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Ile Glu Tyr Met Asn Cys Thr
65 70 75 80
Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Ala Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr
85 90 95
Arg Tyr Lys Val Ser Asp Asn Asn Thr Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr
100 105 110
Leu Phe Ser Lys Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Ile Gln Lys Glu Asp
115 120 125
Ile Gln Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Gln Lys
130 135 140
Pro Gln Arg Arg Ala Val Gln Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu Val Ile
145 150 155 160
Pro Arg Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Arg Trp Lys Ser Arg His Ile Lys Glu Arg Cys Leu Gln
180 185 190
Tyr Leu Val Gln Tyr Arg Ser Asn Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Leu
195 200 205
Ile Val Asn His Glu Pro Arg Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp Glu Leu
210 215 220
Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Tyr Asn Pro Ile Cys Gly
225 230 235 240
Ser Ser Gln Gln Trp Ser Lys Trp Ser Gln Pro Val His Trp Gly Ser
245 250 255
His Thr Val Glu Glu Asn Pro Ser Leu Phe Ala Leu Glu Ala Gly Ala
260 265 270
Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly Lys
500
<210> 283 <211> 1503
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-гамма-Fc("выступ") <400> 283
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt ccccctcctg 60
ctgctctggt tcccaggtgc caggtgttgg agttccaagg tcctcatgtc cagtgcgaat 120
gaagacatca aagctgattt gatcctgact tctacagccc ctgaacacct cagtgctcct 180
actctgcccc ttccagaggt tcagtgcttt gtgttcaaca tagagtacat gaattgcact 240
tggaatagca gttctgagcc tcaggcaacc aacctcacgc tgcactatag gtacaaggta 300
tctgataata atacattcca ggagtgcagt cactatttgt tctccaaaga gattacttct 360
ggctgtcaga tacaaaaaga agatatccag ctctaccaga catttgttgt ccagctccag 420
gacccccaga aaccccagag gcgagctgta cagaagctaa acctacagaa tcttgtgatc 480
ccacgggctc cagaaaatct aacactcagc aatctgagtg aatcccagct agagctgaga 540
tggaaaagca gacatattaa agaacgctgt ttacaatact tggtgcagta ccggagcaac 600
agagatcgaa gctggacgga actaatagtg aatcatgaac ctagattctc cctgcctagt 660
gtggatgagc tgaaacggta cacatttcgg gttcggagcc gctataaccc aatctgtgga 720
agttctcaac agtggagtaa atggagccag cctgtccact gggggagtca tactgtagag 780
gagaatcctt ccttgtttgc actggaagct ggagctcagg acaaaactca cacatgccca 840
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 9 60
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc 1260
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1500
tga 1503
<210> 284 <211> 213 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Альфа-субъединица мышиного IL-2R + Avi-метка + His-метка
<400> 284
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro Asn Ala
20 25 30
Thr Phe Lys Ala Leu Ser Tyr Lys Asn Gly Thr Ile Leu Asn Cys Glu
35 40 45
Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Leu Lys Glu Leu Val Tyr Met Arg Cys
50 55 60
Leu Gly Asn Ser Trp Ser Ser Asn Cys Gln Cys Thr Ser Asn Ser His
65 70 75 80
Asp Lys Ser Arg Lys Gln Val Thr Ala Gln Leu Glu His Gln Lys Glu
85 90 95
Gln Gln Thr Thr Thr Asp Met Gln Lys Pro Thr Gln Ser Met His Gln
100 105 110
Glu Asn Leu Thr Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys His Glu
115 120 125
Asp Ser Lys Arg Ile Tyr His Phe Val Glu Gly Gln Ser Val His Tyr
130 135 140
Glu Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala Ile Ser
145 150 155 160
Ile Cys Lys Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro Gln Leu
165 170 175
Thr Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu Asn
180 185 190
Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His
195 200 205
His His His His His
210
<210> 285 <211> 642 <212> ДНК
<220>
<223> Альфа-субъединица мышиного IL-2R + Avi-метка + His-метка
<400> 285
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgaa 60
ctgtgtctgt atgacccacc cgaggtcccc aatgccacat tcaaagccct ctcctacaag 120
aacggcacca tcctaaactg tgaatgcaag agaggtttcc gaagactaaa ggaattggtc 180
tatatgcgtt gcttaggaaa ctcctggagc agcaactgcc agtgcaccag caactcccat 240
gacaaatcga gaaagcaagt tacagctcaa cttgaacacc agaaagagca acaaaccaca 300
acagacatgc agaagccaac acagtctatg caccaagaga accttacagg tcactgcagg 360
gagccacctc cttggaaaca tgaagattcc aagagaatct atcatttcgt ggaaggacag 420
agtgttcact acgagtgtat tccgggatac aaggctctac agagaggtcc tgctattagc 480
atctgcaaga tgaagtgtgg gaaaacgggg tggactcagc cccagctcac atgtgtcgac 540
gaacagttat attttcaggg cggctcaggc ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagatc 600
gagtggcacg aggctcgagc tcaccaccat caccatcact ga 642
<210> 286
<211> 480
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) IL-2R-бета-Fc("выступ") + Avi-метка
<400> 286
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Val Asn Gly Thr Ser Arg Phe Thr Cys Phe Tyr Asn
20 25 30
Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln
35 40 45
Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn
50 55 60
Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn
65 70 75 80
Leu Ile Leu Gly Thr Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Ala Val Asp Ile
85 90 95
Val Thr Leu Arg Val Met Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Met Met
100 105 110
Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro
115 120 125
Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser
130 135 140
Trp Lys Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe
145 150 155 160
Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu
165 170 175
Met Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr
180 185 190
Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly
195 200 205
Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr
210 215 220
Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Gly Ala Gln Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser
450 455 460
Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
465 470 475 480
<210> 287 <211> 1443 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) IL-2R-бета-Fc("выступ") + Avi-метка
<400> 287
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgcg 60
gtcaacggca cttcccggtt cacatgcttc tacaactcga gagccaacat ctcctgtgtc 120
tggagccaag atggggctct gcaggacact tcctgccaag tccacgcctg gccggacaga 180
cggcggtgga accaaacctg tgagctgctc cctgtgagtc aagcatcctg ggcctgcaac 240
ctgatcctcg gaaccccaga ttctcagaaa ctgaccgcag tggatatcgt caccctgagg 300
gtgatgtgcc gtgaaggggt gcgatggagg atgatggcca tccaggactt caaacccttt 360
gagaaccttc gcctgatggc ccccatctcc ctccaagtcg tccacgtgga gacccacaga 420
tgcaacataa gctggaaaat ctcccaagcc tcccactact ttgaaagaca cctggagttt 480
gaggcccgga cgctgtcccc aggccacacc tgggaggagg cccccctgat gaccctcaag 540
cagaagcagg aatggatctg cctggagacg ctcaccccag acacccagta tgagtttcag 600
gtgcgggtca agcctctgca aggcgagttc acgacctgga gcccctggag ccagcccctg 660
gccttcagga caaagcctgc agcccttggg aaggacaccg gagctcagga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ccggaggcct gaacgacatc ttcgaggccc agaagattga atggcacgag 1440
tga 1443
<210> 288
<211> 489
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) IL-2R-гамма-Fc("впадина")
<400> 288
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp
20 25 30
Ala Thr Thr Asp Phe Phe Leu Thr Ser Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser
35 40 45
Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val
50 55 60
Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr
65 70 75 80
Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val
85 90 95
Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys
100 105 110
Gln Leu Gln Lys Lys Glu
Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln
Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu Arg
145 150 155 160
Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu
165 170 175
Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His
180 185 190
Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro
195 200 205
Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe
210 215 220
Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro
225 230 235 240
Ile His Trp Gly Ser Asn Ser Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala
245 250 255
Leu Glu Ala Gly Ala Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
275 280 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
290 295 300
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305 310 315 320
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
340 345 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
355 360 365
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
420 425 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
435 440 445
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
450 455 460
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
465 470 475 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 289 <211> 1470
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) IL-2R-гамма-Fc("впадина")
<400> 289
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccctg 60
aacacgacaa ttctgacgcc caatgggaat gaagacgcca caactgattt cttcctgacc 120
tctatgccca ctgactccct cagtgtttcc actctgcccc tcccagaggt tcagtgtttt 180
gtgttcaatg tcgagtacat gaattgcact tggaacagca gctctgagcc ccagcctacc 240
aacctcactc tgcattattg gtacaagaat tcggataatg ataaagtcca gaagtgcagc 300
cactatctat tctctgaaga aatcacttct ggctgtcagt tgcaaaaaaa ggagatccac 360
ctctaccaaa cgtttgttgt tcagctccag gacccacggg aacccaggag acaggccaca 420
cagatgctaa aactgcagaa tctggtgatc ccctgggctc cggagaacct aacacttcgc 480
aaactgagtg aatcccagct agaactgaac tggaacaaca gattcttgaa ccactgtttg 540
gagcacttgg tgcagtaccg gactgactgg gaccacagct ggactgaaca atcagtggat 600
tatagacata agttctcctt gcctagtgtg gatgggcaga aacgctacac gtttcgtgtc 660
cggagccgct ttaacccact ctgtggaagt gctcagcatt ggagtgaatg gagccaccca 720
atccactggg gctcaggaca tcagtcttcc gtcacatgcg gtggacggcg acgtaccgtg tacaagtgca gccaaagggc accaagaacc gtggagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctct ggagcaatag aaactcacac tcttcccccc tggtggtgga tggaggtgca tggtcagcgt aggtctccaa agccccgaga aggtcagcct agagcaatgg gctccttctt tcttctcatg ccctgtctcc ttcaaaagag atgcccaccg aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtc caaagccctc accacaggtg ctcgtgcgca gcagccggag cctcgtgagc ctccgtgatg gggtaaatga aatcctttcc tgcccagcac gacaccctca gaagaccctg acaaagccgc ctgcaccagg ccagccccca tgcaccctgc gtcaaaggct aacaactaca aagctcaccg catgaggctc tgtttgcatt ctgaactcct tgatctcccg aggtcaagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctatcccag agaccacgcc tggacaagag tgcacaacca ggaagccgga ggggggaccg gacccctgag caactggtac gtacaacagc tggcaaggag catctccaaa ggatgagctg cgacatcgcc tcccgtgctg caggtggcag ctacacgcag
780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1470
<210> 290
<211> 217
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Альфа-субъединица обезьяньего (циномогус) IL-2R + Avi-метка + His-метка
<400> 290
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Lys Ile Thr His Ala Thr Phe Lys
20 25 30
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
35 40 45
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Pro Tyr Met Leu Cys Thr Gly
50 55 60
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
65 70 75 80
Ala Ala Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
85 90 95
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Gln Met Gln Leu Ala Asp
100 105 110
Gln Val Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
115 120 125
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Thr Val Tyr
130 135 140
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
145 150 155 160
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
165 170 175
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
195 200 205
Ala Arg Ala His His His His His His 210 215
<210> 291
<211> 654
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Альфа-субъединица обезьяньего (циномогус) IL-2R + Avi-метка + His-метка
<400> 291
atgggatgga gatgacccgc atgttgaact ctctgtacag gctgctcgga accacagaaa agggaacctc cagacggttt agcgtctgca ggtgaagtcg gcccagaaga gctgtatcat caaaaatcac gtgaatgcaa gaaactctag acacaacaaa tgcaaagtca caccgtggga actaccagtg aaatgaccca acgaacagtt tcgagtggca cctcttcttg acatgccaca gagaggtttc ccactcgtcc acaagtgaca aatgcagctg aaatgaagcc cgtccaggga cgggaagaca atattttcag cgaggctcga gtagcaacag ttcaaagcca cgcagaataa tgggacaacc cctcaacctg gcggaccaag acagaaagaa tacagggctc agatggaccc ggcggctcag gctcaccacc ctaccggtga tggcctacaa aaagcgggtc aatgtcaatg aagaacagaa tgagccttcc tttatcattt tacacagagg agccccagct gcctgaacga atcaccatca gctctgtgac ggaaggaacc accctatatg cacaagctct agaaagaaaa aggtcactgc cgtggtgggg tcctgctgag catatgcaca catcttcgag ctga
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 654
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL-2 дикого типа(C125A) (4)
<400> 292
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 293
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (4)
<400> 293
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 294
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G / F42A (C125A) (4) <400> 294
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acagccaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 295
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (4)
<400> 295
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 296
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A /Y45A /L72G (C125A) (4)
<400> 296
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 297
<211> 593
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser
450 455 460
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
465 470 475 480
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
485 490 495
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
500 505 510
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
515 520 525
Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
530 535 540
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
545 550 555 560
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
565 570 575
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
580 585 590
Thr
<210> 298 <211> 1779
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 298
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtggcgg cggaggctcc ggaggcggag gttctggcgg aggtggctcc 1380
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 1440
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 1500
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 1560
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 1620
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 1680
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1740
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 1779
<210> 299
<211> 446
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 299
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 300 <211> 1338 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 300
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc 540
ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtaaa 1338
<210> 301
<211> 594
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 301
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465 470 475 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485 490 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr
500 505 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515 520 525
Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
530 535 540
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545 550 555 560
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
565 570 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
580 585 590
Leu Thr
<210> 302
<211> 1782
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 302
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 3 60
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 9 60
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtgg cggcggaggc tccggaggcg gaggttctgg cggaggtggc 1380
tccgcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 1440
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 1500
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 1560
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 1620
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1680
gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1740
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga ct 1782
<210> 303 <211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
ДНК
т/г ^ т"-
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 304
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac
180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 305 <211> 592 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 305
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 306 <211> 1776 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 306
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtggcggcgg aggctccgga ggcggaggtt ctggcggagg tggctccgca 1380
cctgcctcaa gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact gctggattta 1440
cagatgattt tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag gatgctcaca 1500
gccaagtttg ccatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa 1560
gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ggcgctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga 1620
cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca 1680
acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg 1740
attacctttg cccaaagcat catctcaaca ctgact 1776
<210> 307
<211> 445
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 307
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 308 <211> 1335
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 308
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccctccgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac agccgctctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa cagcggagcc 480
ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gttctggcct gtatagcctg 540
agcagcgtgg tcaccgtgcc ttctagcagc ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag ctgcgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctct cgtgcgcagt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 309
<211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DP47GS, легкая цепь
<400> 309
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 310
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DP47GS, легкая цепь <400> 310
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 311
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A; VL
<400> 311
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 312
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A; VL <400> 312
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300
cagggcacca agctcgagat caag 324
<210> 313
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A; VH
<400> 313
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 314
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A; VH
<400> 314
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agc 363
<210> 315
<211> 594
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 315
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe 100
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 170 175
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465 470 475 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485 490 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr
500 505 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515 520 525
Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
530 535 540
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545 550 555 560
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
565 570 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
580 585 590
<210> 316 <211> 1782
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 316
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtgg cggcggaggc tccggaggcg gaggttctgg cggaggtggc 1380
tccgcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 1440
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 1500
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 1560
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 1620
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1680
gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1740 agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga ct 1782
<210> 317
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 317
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 318
<211> 1341
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 318
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 319
<211> 600
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 319
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
465 470 475 480
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
485 490 495
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
500
Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala 505 510
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
515 520 525
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn
530 535 540
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
545 550 555 560
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
565 570 575
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala
580 585 590
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 595 600
<210> 320 <211> 1800 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc ("выступ")-^-2 qm
<400> 320
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agcgctagca ccaagggccc aagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcacaagc 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc acagtgccta gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga gctgctgggc 720
ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agccccggga ggaacagtac 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc cagagaaccc caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aagtccggag gcggaggctc cggcggcgga 1380
ggttctggcg gaggtggctc cgcacctgcc tcaagttcta caaagaaaac acagctacaa 1440
ctggagcatt tactgctgga tttacagatg attttgaatg gaattaataa ttacaagaat 1500
cccaaactca ccaggatgct cacagccaag tttgccatgc ccaagaaggc cacagaactg 1560
aaacatcttc agtgtctaga agaagaactc aaacctctgg aggaagtgct aaatggcgct 1620
caaagcaaaa actttcactt aagacccagg gacttaatca gcaatatcaa cgtaatagtt 1680
ctggaactaa agggatctga aacaacattc atgtgtgaat atgctgatga gacagcaacc 1740
attgtagaat ttctgaacag atggattacc tttgcccaaa gcatcatctc aacactgact 1800
<210> 321 <211> 451
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 321
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 322 <211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc ("впадина")
<400> 322
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agcgctagca ccaagggccc aagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcacaagc 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc acagtgccta gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga gctgctgggc 720
ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agccccggga ggaacagtac 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc cagagaaccc caggtgtgca ccctgccccc cagcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg gtgtccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353
<210> 323
<211> 215
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A, легкая цепь
<400> 323
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 324
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CH1A1A, легкая цепь
<400> 324
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300
cagggcacca agctcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антигенсвязывающий фрагмент, где указанный мутантный IL-2 полипептид представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащего аминокислотные замены F42A, Y45А и L72G (нумерация соответствует последовательности человеческого IL-2 SEQ Ш N0:1);
и где указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу иммуноглобулина субкласса IgGi, специфичного в отношении фибробласт-активирующего белка (FAP), содержащего (i) последовательность SEQ Ш N0:41 вариабельной области тяжелой цепи и последовательность SEQ Ш N0:39 вариабельной области легкой цепи; (ii) последовательность SEQ Ш N0:51 вариабельной области тяжелой цепи и последовательность SEQ Ш N0:49 вариабельной области легкой цепи; (iii) последовательность SEQ Ш NO: 111 вариабельной области тяжелой цепи и последовательность SEQ Ш N0:109 вариабельной области легкой цепи; (iv) последовательность SEQ Ш N0:143 вариабельной области тяжелой цепи и последовательность SEQ Ш N0:141 вариабельной области легкой цепи; или (iv) последовательность SEQ Ш N0:151 вариабельной области тяжелой цепи и последовательность SEQ Ш N0:149 вариабельной области легкой цепи.
2. Иммуноконъюгат по п. 1, где указанный мутантный полипептид IL-2 дополнительно содержит аминокислотные замены ТЗА и/или аминокислотную замену С125А.
3. Иммуноконъюгат по п.п. 1 или 2, где указанный мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ Ш N0:19.
4. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-3, где указанный мутантный полипептид IL-2 соединен его амино-концевой аминокислотой с карбокси-концевой аминокислотой одной из тяжелых цепей иммуноглобулина.
5. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-4, где иммуноконъюгат содержит не более одного мутантного полипептида IL-2.
6. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-5, где молекула иммуноглобулина субкласса IgGi содержит в Fc-домене модификацию, способствующую гетеродимеризации двух неидентичных тяжелых цепей иммуноглобулина.
7. Иммуноконъюгат по п. 6, где модификация представляет собой модификацию по типу "knob-in-hole" ("выступ-впадина"), содержащую модификацию "выступ" в одной из тяжелых цепей иммуноглобулина и модификацию "впадина" в другой тяжелой цепи иммуноглобулина.
8. Иммуноконъюгат по п. 7, где модификация "выступ" содержит аминокислотную замену T366W в одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина, и модификация "впадина" содержит аминокислотные замены T366S, L368A и Y407V в другой одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина.
2.
9. Иммуноконъюгат по п. 8, где тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая
модификацию "выступ", дополнительно содержит аминокислотную замену S354C, и
тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая модификацию "впадина", дополнительно
содержит аминокислотную замену Y349C.
10. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-9, где молекула IgGi содержит в своем Fc-домене одну или более аминокислотных мутаций, которые снижают связывающую аффинность иммуноконъюгата в отношении FcyRIIIa, FcyRI или FcyRIIa рецептора.
11. Иммуноконъюгат по п. 10, где молекула IgGi содержит аминокислотные мутации L234A, L235AH3329G.
12. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-11, содержащий (i) полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ Ш NO: 297, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ Ш NO: 299, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 233; (ii) полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 301, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 303, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 231; или (ш) полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 315, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 317, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ГО NO: 233.
13. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-12, где указанная молекула иммуноглобулина IgGi, специфичная к FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ГО NO: 111 и вариабельную область легкой цепи SEQ ГО NO: 109.
14. Иммуноконъгат по любому из п.п. 1-13, содержащий полипептидную последовательность SEQ ГО NO: 301, полипептидную последовательность SEQ ГО NO: 303 и полипептидную последовательность SEQ ГО NO: 231.
15. Иммуноконъюгат по любому из п.п. 29-35, в основном состоящий из мутантного полипептида IL-2 и молекулы IgGi, связанными последовательностью-линкером.
16. Изолированный полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат по любому из п.п.
1-15.
17. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 16.
18. Способ получения иммуноконъюгата, содержащего мутантный полипептид JL-2 и антигенсвязывающий фрагмент, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 17 в условиях, пригодных для экспрессии иммуноконъюгата.
19. Иммуноконъюгат, полученный способом по п. 18.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-15 или 19 и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Иммуноконъюгат по любому п.п. 1-15 или 19 для применения при лечении заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.
22. Иммуноконъюгат для применения при лечении заболевания по п. 21, где указанное заболевание представляет собой рак.
23. Применение иммуноконъюгата по любому из п.п. 1-15 или 19 для получения лекарственного средства для лечения заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.
24. Применение по п. 23, где указанное заболевание представляет собой рак.
25. Способ лечения заболевания у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей иммуноконъюгат по любому из п.п. 1-15 или 19 в фармацевтически приемлемой форме.
26. Способ по п. 25, где указанное заболевание представляет собой рак.
17.
вариабельный до1^ен константный дом
вариабельный домен
Fc-домен
мутантный полипептид IL-
константный домен
Фиг. 1
mAU 2500
2000
1500
21,5 кДа 14,4 кДа
Фиг. 2
пул 1
пул 2
mAU 400
300
200
100
MU,
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 мл
У^1
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 мл
21,5 кДа 14,4 кДа
Фиг. 3
mAU 4 ¦
пул 1
О О
mAU-
10;
8 6
4 20-
10 15 20 25
30 мин
пул 2
Фиг. 4
15 20
30 мин
mAU / 200
150
100
-50
21,5 кДа 14,4 кДа 21,5 кДа 14,4 кДа
Фиг. 5
21,5 кДа 14,4 кДа
Фиг. 6
mAU 12
Фиг. 7
мин
Фиг. 9
800700600500400300200 100
1.07E-11 6.43E-11 3.86E-10 2.31 E-09 1.39E-08
концентрация IL-2 [M]
8.33E-08
5.00E-07
-50 J
0 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
концентрация [нг/мл]
Фиг. 11
пролейкин
ТЗА
F42A
Y45A
L72G Тпр42/45/72
Фиг. 12
мутант
Fab-IL-2 qm-Fab
3000i
о Ф
2500-
О >
2000-
¦8- 1500-
1000-
500-
* \
j mAu
1000
800 _^ 600
400 200 0
14500
15000
15500 м п
100
250 150 100 75
50 37
25 20
Фиг.
невосстан восстан.
mAU 1500 1000 500 0
mAU 250
200
150
100
Ot±
О 50 100 150 200 250 300 350 мл
О 20 40 60 80 100 120 мл щ
200
200
16.3
116.3
97.4
97.4
66.3
66.3
55.4
55.4
36.5
36.5
21.5
21.5
Фиг. 15
невосстан. условия
восстан. условия
mAU 3000
2500
2000
1500
1000
500
5 mAU
2500
2000 1500 1000 500 О
О 50 100 150 200 250 300 350 мл
20 40 60 80
100 120 мл ^ СП
200
116.3 97.4
66.3 55.4
200
116.3 97.4
66.3
55.4
36.5 31
21.5
36.5 31
21.5
Фиг. 16
невосстан. условия
восстан. условия
Фиг. 17
| 100000 х
80000 60000
i 40000
° 20000
-Ф-4В9 Fab-IL-2 qm-Fab -¦-29В11 Fab-IL-2 qm-Fab -A- 14B3 Fab-IL-2 qm-Fab -?-28H1 Fab-IL-2 qm-Fab -0-3F2 Fab-IL-2-Fab -•-4G8 Fab IL-2 qm -Fab
¦ , ,-^г5 'М I Ш 1 Ш i-ш
400
3.2 0.64 0.128 0.0256
концентрация [нМ]
0.0051
Фиг. 18
-¦- 28Н1 Fab-IL-2-Fab -¦- 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab
5.44 3.75 1.36 0.94 0.34 0.23 0.08 0.06 0.02 0.01 0.005 0.004
концентрация [мкг/мл]
о ф
Q. О
¦в-
к к
300 250 200 150 100 50
¦ HEK-DPP IV ? НЕК-им
' У У У
л^ п# л^
^ ^ ^
Фиг. 19
^Ч | 80000
| 70000
g 60000 о.
g, 50000 ц
¦8- 40000 к
? 30000 ct
S. 20000 о
10000
CD26-PE lgG1-PE
Фиг. 20
145мин4°С П45 мин 4°С + 30 мин 37°С В 45 мин 4°С + 6 ч 37°С
безобраб. 3F2Fab- 4G8 Fab- 4В9 Fab- 14ВЗ Fab- 28H1 Fab- 29B11 Fab-IL2-Fab IL2qm-Fab IL2qm-Fab IL2qm-Fab IL2qm-Fab IL2qm-Fab
25001
¦28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab ¦28H1 Fab-IL-2 qm-Fab пролейкин ¦29B11 Fab-IL-2 wt-Fab ¦29B11 Fab-IL-2 qm-Fab -*-4G8 Fab-IL-2 wt-Fab -*-4G8 Fab-IL-2 qm-Fab
2000
¦I 1500
- 1000
500
100
200
300 400 концентрация [нМ]
500
600
Фиг. 21
Фиг. 23
28Н1 Fab-IL-2-Fab ¦О- 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab -*- 4G8 Fab-IL-2-Fab
4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ¦¦- 29B11 Fab-IL-2-Fab ¦°- 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab • ¦ пролейкин
1.00
0.1 0.01
концентрация [мкг/мл]
0.001
0.0001
0.00001
^ & су концентрация (пМ)
?> г?> <Ф С?5
"J ^ ^ ^ *VV
концентрация (пМ)
лО (чО г*
концентрация (пМ)
Фиг. 25
4G8 Fab-IL-2 qm-Fab
100 90 80 70 ¦ 60 ¦ 50 ¦ 40 ¦ 30 20 10
наполнитель
4G8 Fab-IL-2 wt-Fab
СЛ СЛ
11II1111II11111II1111II1111II11111II1111II11111II1111II1111II11111II11Г1II11111II1111II1111II11111II1111II11111Л 1111II1111II11111II1111II11111II1111II1111II111
10 20 30 40
50 60
80 90 100 110 120 130 140 150
Фиг. 26
28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab
Фиг. 27
28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab
наполнитель
Фиг. 28
Фиг. 31
IL-2 wt(nyn 1)
IL-2 wl (пул 2) -*-IL-2qm
пролейкин
CO СЛ
0.00002
0.00013
0.00077 0.00463 0.02778
концентрация IL-2 (мкМ)
0.16667
Фиг. 31
IL-2 wt (пул 1)
IL-2 Щпуп 2)
IL-2qm
пролейкин
1800 -г 1600 ¦ 1400 ¦ 1200 ¦ 1000 ¦
800 ¦
600 ¦
400
200
0.00002
0.00013
0.00077 0.00463 концентрация IL-2 (мкМ)
0.02778
0.16667
О 20 40 60 80 100 СО 20 40 60 80 100
концентрация (нМ)
концентрация (нМ) 55 концентрация (нМ)
концентрация(нМ)
концентрация (нМ)
Фиг. 37
1600 -I ь 1400 ¦ 1 i 1200 ¦ о J Ю00 ¦ ? й 800 ¦ к 5, 600 ¦
5 с
400 ¦
о 200 ¦ 0 ¦
0.001 1 1000 1000000
концентрация (пМ)
1600 т d концентрация (пМ)
1600 т г-
0 -I 1 1 1
0.001 1 1000 1000000
концентрация(пМ)
0.001 1 1000 1000000
концентрация (пМ)
о о
ш о
ф IX
к к
ct ф
о ф
2500 1
2000
1500
1000
500
.. пролейкин IgG-IL-2 wt IgG-IL-2 qm
о Ф
s °
5 c Ф
2500 -| Б 2000 1500 1000 500
0.001
1000
концентрация(пМ)
1000000
0.001
1 1000 1000000
концентрация (пМ)
о о
ш о
ф IX
к к
ct ф
о ф о. о
2500 -I
2000
1500
1000
500
0.001
пролейкин IgG-IL-2 wt IgG-IL-2 qm
AAA
1 1000 1000000
концентрация(пМ)
о Ф
Q. О
¦8л I-о о
ш о
ф IX
к к
ct ф о. о
2500 i 2000 1500 1000 500
0.001
пролейкин
IgG-IL-2 wt IgG-IL-2 qm
1 1000 1000000
концентрация(пМ)
Ф s
X Я
2 m
Ф s
m s
100 80 60 40 20 -I
m m m m
3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
Дни
-¦- 4G8 wt 60 мкг
4G8 wt 80 мкг -•-4G8 wt 100 мкг -¦- 4G8 qm 100 мкг -•- 4G8 qm 200 мкг
4G8 qm 400 мкг
~m- 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 600 мкг -•- 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 1000 мкг -К- ЗФР
Фиг. 40
р- > 10 i
о 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 К)
время после инъекции (в днях) СП
о 012345678
время после инъекции (в днях)
0.01 I i i i i i i i '
0 10 20 30 40 50 60 70 80
время после инъекции
Фиг. 42
О 5 10 15 20 25 30 мин
о н
3" 9. > ¦
CL CD
-8-о
-•- 4B9lgG-IL2wt -•- 4B9 lgG-IL2 qm -¦- 4B9 Fab-IL2 wt-Fab -¦- 4B9 Fab-IL2 qm-Fab
А пролейкин
H CD
3" 9. > ¦
CL CD
-8-о
100 i
4B9lgG-IL2wt 4B9lgG-IL2qm 4B9 Fab-IL2 wt-Fab 4B9 Fab-IL2 qm-Fab пролейкин
Фиг. 44
mAU
1500
1000
500
0 -L
mAu 140
120
100
О 50 100 150 200 250 300 мл!
О 20 40 60 80 100 мин
200
116.3 97.4
66.3 55.4
36.5 31
21.5 200
116.3 97.4
66.3 55.4
36.5 31
21.5
невосстан.ус восстан. ловия условия
mAU 5000
4000
3000
2000
1000
200
116.3 97.4
66.3 55.4
100
200 116.3 97.4 66.3 55.4
36.5 31
21.5
150
200 мл
36.5
невосстан. условия
восстан. условия
Фиг. 48
900
ФИГ. 49 -ф- 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab
IL-2 [нМ]
-Q- 4G8 IgG-IL-2 qm
320 650 6500 40000 200000
. ... 1600 8000 65000 концентрация (пМ)
СЛ СЛ
0 6.5 65 650 1600 концентрация (пМ)
8000 65000 1000000 6500 40000 200000
0 0.51 2.6 12.8 65 650 8000 200000 0.065 0.65 6.5 64 320 1600 40000 1000000 концентрация (пМ)
PATENT COOPERATION TREATY
PCT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
(PCT Article 18 and Rules 43 and 44)
Applicant's or agent's file reference 27307 WO
FOR FURTHER see FORM PCT/ISA/220
ACTION as we" as' wnere applicable, item 5 below.
International application No. PCT/EP2012/051991
International filing date (day/month/year) 07/02/2012
(Earliest) Priority Date (day/month/year) 10/02/2011
Applicant
ROCHE GLYCART AG
This international search report has been prepared by this International Searching Authority and is transmitted to the applicant according to Article 18. A copy is being transmitted to the International Bureau.
This international search report consists of a total of _
sheets.
It is also accompanied by a copy of each prior art document cited in this report.
1. Basis of the report
a. With regard to the language, the international search was carried out on the basis of: | X | the international application in the language in which it was filed
atranslation of the international application into_
of a translation furnished for the purposes of international search (Rules 12.3(a) and 23.1 (b))
Ь ?
This international search report has been established taking into account the rectification of an obvious mistake authorized by or notified to this Authority under Rule 91 (Rule 43.6b/s(a)).
With regard to any nucleotide and/or amino acid sequence disclosed in the international application, see Box No. I.
2. r~J Certain claims were found unsearchable (See Box No. II)
3. r~J Unity of invention is lacking (see Box No III)
4. With regard to the title,
| X | the text is approved as submitted by the applicant
| | the text has been established by this Authority to read as follows:
With regard to the abstract,
| X | the text is approved as submitted by the applicant
| | the text has been established, according to Rule 38.2(b), by this Authority as it appears in Box No. IV. The applicant may, within one month from the date of mailing of this international search report, submit comments to this Authority
With regard to the drawings,
a. the figure of the drawings to be published with the abstract is Figure No.
| | as suggested by the applicant
| | as selected by this Authority, because the applicant failed to suggest a figure
| | as selected by this Authority, because this figure better characterizes the invention
b. X none of the figures is to be published with the abstract
Form PCT/ISA/210 (first sheet) (July 2009)
International application No. PCT/EP2012/051991
Box No. I Nucleotide and/or amino acid sequence(s) (Continuation of item 1 .c of the first sheet)
1. With regard to any nucleotide and/or amino acid sequence disclosed in the international application and necessary to the claimed invention, the international search was carried out on the basis of:
a. (means)
| | on paper
| X | in electronic form
b. (time)
| X | in the international application as filed
| | together with the international application in electronic form
| | subsequently to this Authority for the purpose of search
2. I I In addition, in the case that more than one version or copy of a sequence listing and/or table relating thereto has been filed
| | or furnished, the required statements that the information in the subsequent or additional copies is identical to that in the
application as filed or does not go beyond the application as filed, as appropriate, were furnished.
3. Additional comments:
Form PCT/ISA/210 (continuation of first sheet (1)) (July 2009)
International application No
PCT/EP2012/051991
A. CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER
INV. C07K14/55 C12N15/26 A61K39/395 A61K47/48 ADD.
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B. FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
C07K A61K
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practical, search terms used)
EPO-Internal
C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
WO 2005/086798 A2 (CHIRON CORP [US]; AUKERMAN LEA [US]; DENIS-MIZE KIMBERLY [US]; HEISE C)
page page page
22 September 2005 (2005-09-22) page 8, line б - line 20 8, line 28 - line 29 26; table 1
54, paragraph 15 - paragraph 27
I- 6,
II- 13,
24-36
W0 2008/003473 A2 (MERCK PATENT GMBH [DE];
GILLIES STEPHEN D [US])
10 January 2008 (2008-01-10)
page 2, paragraph 7 - paragraphs 10, 17
1-36
-/-
Further documents are listed in the continuation of Box C.
See patent family annex.
* Special categories of cited documents :
"A" document defining the general state of the art which is not considered to be of particular relevance
"E" earlier document but published on or after the international filing date
"L" documentwhich may throw doubts on priority claim(s) or which is cited to establish the publication date of another citation or other special reason (as specified)
"O" document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
"T" later document published after the international filing date or priority date and not in conflict with the application but cited to understand the principle or theory underlying the invention
"X" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considered novel or cannot be considered to involve an inventive step when the document is taken alone
"Y" document of particular relevance; the claimed invention
cannot be considered to involve an inventive step when the document is combined with one or more other such documents, such combination being obvious to a person skilled in the art.
Category*
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
US 2003/166163 Al (GILLIES STEPHEN D [US] GILLIES STEPHEN D [US] ET AL) 4 September 2003 (2003-09-04) page 4, paragraph 36 page 6, paragraph 54
1-36
SHANAFELT А В ET AL: "A T-cel1-selective interleukin 2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo",
NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 18, no. 11,
1 November 2000 (2000-11-01), pages 1197-1202, XP002307306, ISSN: 1087-0156, D0I: 10.1038/81199 page 1198; figure 1
1-36
US 2003/124678 Al (EPSTEIN ALAN L [US] ET AL) 3 July 2003 (2003-07-03) page 1, paragraph 8 page 2, paragraph 26
1-36
US 2004/175357 Al (SHANAFELT ARMEN В [US] ET AL) 9 September 2004 (2004-09-09) cited in the application page 3, paragraphs 22, 23
1-36
Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (April 2005)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
Information on patent family members
International application No
PCT/EP2012/051991
Patent document cited in search report
Publication date
Patent family member(s)
Publication date
WO 2005086798 A2 22-09-2005
AU 2005220822 Al
AU 2005220872 Al
AU 2005227263 Al
BR PI0508424 A
BR PI0508455 A
BR PI0508470 A
CA 2557677 Al
CA 2558632 Al
CA 2564614 Al
EP 1723251 A2
EP 1730184 A2
EP 1817332 A2
JP 2007527242 A
JP 2007528728 A
JP 2008509651 A
KR 20070003934 A
US 2006160187 Al
US 2006269515 Al
W0 2005086751 A2
W0 2005086798 A2
W0 2005091956 A2
22-0922-0906-1024-0724-0731-0706-1022-0922-0922-1113-1215-0827-0918-1003-0405-0120-0730-1122-0922-0906-102005 2005 2005 2007 2007 2007 2005 2005 2005 2006 2006 2007 2007 2007 2008 2007 2006 2006 2005 2005 2005
W0 2008003473 A2 10-01-2008 AU 2007271398 Al 10-01-2008
CA 2656700 Al 10-01-2008
EP 2038417 A2 25-03-2009
JP 2009542592 A 03-12-2009
US 2008025947 Al 31-01-2008
W0 2008003473 A2 10-01-2008
2003166163
-09
-2003
2003166163
04-09-2003
2007036752
15-02-2007
2009098609
16-04-2009
2003124678
-07
-2003
2003124678
03-07-2003
2005201979
15-09-2005
2006292116
28-12-2006
2009274653
05-11-2009
2011091413
21-04-2011
US 2004175357 Al 09-09-2004 NONE
Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (April 2005)
(19)
(19)
(19)
- 4 -
- 2 -
-11 -
- 10 -
- 13 -
- 13 -
- 15 -
-16 -
- 18 -
- 18 -
-31 -
- 30 -
- 33 -
- 33 -
- Ill -
- Ill -
- 112 -
- 112 -
-113-
-113-
-115-
-118-
-118-
- 120 -
- 120 -
-161 -
- 160 -
- 163 -
- 163 -
- 165 -
-166 -
- 168 -
- 168 -
- 175 -
- 176 -
Пример 12
- 179 -
Пример 14
- 178 -
- 181 -
- 181 -
- 182 -
Пример 17
- 182 -
Пример 17
- 183 -
- 183 -
130
<400> 15
<400> 15
35 40 45
100
105
100
105
<210> 32
<210> 32
<210> 34
<210> 34
<210> 36
<210> 36
<400>
<400>
<220>
<223> 3F2; VH
<400>
<220>
<223> 3F2; VH
<400>
<220>
<223> 2C6; VH
<220>
<223> 2C6; VH
<220>
<223> 5H5; VL
<220>
<223> 5H5; VL
<220>
<223> 5H5; VL
<220>
<223> 5H5; VL
<220>
<223> 5H5; VL
<220>
<223> 5H5; VL
10 15
10 15
35 40 45
35 40 45
50 55 60
50 55 60
50 55 60
50 55 60
100
110
105
100
110
105
100
105
100
105
115
115
<210> 98
<210> 98
<210> 100
<210> 100
106
<400>
106
<400>
108
<400>
108
<400>
<220>
<223> 16F1; VH
<220>
<223> 16F1; VH
<220>
<223> 16F8; VL
<220>
<223> 16F8; VL
<220>
<223> 16F8; VL
<220>
<223> 16F8; VL
<220>
<223> 16F8; VL
<220>
<223> 16F8; VL
10 15
10 15
35 40 45
35 40 45
50 55 60
50 55 60
100
110
105
100
110
105
100
105
100
105
120
115
120
115
<210> 166
<210> 166
<210> 168
<210> 168
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2B10_O7D8; VL
<220>
<223> 2B10_O7D8; VL
<220>
<223> 2B10_O7D8; VH
<220>
<223> 2B10_O7D8; VH
<220>
182
<223> 2B10_O1F7; VL
<400>
<220>
182
<223> 2B10_O1F7; VL
<400>
<220>
184
<223> 2B10_O1F7; VH
<400>
<220>
184
<223> 2B10_O1F7; VH
<400>
<220>
190
<223> MHLG1; VH
<400>
195
200
205
195
200
205
450 455 460
450 455 460
145
150
160
155
145
150
160
155
405
410
415
405
410
415
<210> 204
<210> 204
<400> 208
<400> 208
<400> 208
210 215 220
210 215 220
465
470
480
475
465
470
480
475
130 135 140
130 135 140
385
390
400
395
385
390
400
395
<400> 216
<400> 216
<210> 217
<210> 217
50 55 60
50 55 60
305
310
320
315
305
310
320
315
565 570 575
565 570 575
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
225
230
240
235
225
230
240
235
485 490 495
485 490 495
145
150
160
155
145
150
160
155
405
410
415
405
410
415
<220>
<220>
50 55 60
35 40 45
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
225
230
240
235
225
230
240
235
485
490
495
485
490
495
115
120
125
115
120
125
115
120
125
115
120
125
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
100
110
105
100
110
105
<210> 253
<210> 253
Искусственная последовательность
Искусственная последовательность
Искусственная последовательность
Искусственная последовательность
35 40 45
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<210> 260
<210> 260
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
115 120 125
115 120 125
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
115
120
125
115
120
125
370 375 380
370 375 380
<210> 292 <211> 399
<400> 297
<400> 297
<400> 303
<400> 303
<400> 303
Leu Thr
Leu Thr
<220>
<220>
<220>
пул 1 пул 2
пул 1 пул 2
пул 1 пул 2
пул 1 пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
пул 1
пул 2
день опыта
день опыта
день опыта
день опыта
день опыта
день опыта
120
120
120
120
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 2 of 2
page 2 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 2 of 2
page 2 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 2 of 2
page 2 of 2
|
