EA201892554A1 20190430

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea201892554a*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение, в целом, относится к мутантным белкам CD200, связывающимся с рецептором CD200 с более высокой аффинностью, чем CD200 дикого типа, в частности изобретение относится к мутантному белку CD200, содержащему мутацию в положении аминокислотного остатка 130 и/или 131. Настоящее изобретение также относится к слитому белку, содержащему белок, как определено в настоящем описании, слитый с не-CD200 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части, фармацевтической композиции, содержащей белок, как определено в настоящем описании, и их применению.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское (21) 201892554 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.10
(51) Int. Cl.
C07K14/705 (2006.01) C12N15/62 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01)
(54) МУТАНТ CD200 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 1608197.8
(32) 2016.05.10
(33) GB
(86) PCT/GB2017/051303
(87) WO 2017/194941 2017.11.16
(71) Заявитель: ДЬЮСЕНТИС
БАЙОТЕРАПЬЮТИКС ЛТД. (GB)
(72) Изобретатель:
Хаксли Филип, Шеридан Джозеф, Хил Джонатан (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение, в целом, относится к мутантным белкам CD200, связывающимся с рецептором CD200 с более высокой аффинностью, чем CD200 дикого типа, в частности изобретение относится к мутантному белку CD200, содержащему мутацию в положении аминокислотного остатка 130 и/или 131. Настоящее изобретение также относится к слитому белку, содержащему белок, как определено в настоящем описании, слитый с ^-CD200 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части, фармацевтической композиции, содержащей белок, как определено в настоящем описании, и их применению.
Результаты исследования зависимости от дозы, в котором сравнивали ингибирование стимулированного РМАокислительного взрыва в выделенных нейтрофилах человека посредством CD200-FC дикого типа и K130Y
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-553255ЕА/041
МУТАНТ CD200 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в целом, относится к мутантным белкам CD2 00, связывающимся с более высокой аффинностью с рецептором CD200, чем CD200 дикого типа, в частности, изобретение относится к мутантному белку CD2 00, содержащему мутацию в положении аминокислотного остатка 130 и/или 131. Настоящее изобретение также относится к слитому белку, содержащему белок, как определено в настоящем описании, слитый с He-CD200 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части, фармацевтической композиции, содержащей белок, как определено в настоящем описании, и их применению.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Аутоиммунные заболевания являются второй по
распространенности причиной хронических заболеваний в мире и основной причиной заболеваемости у женщин в США. Согласно международному исследованию 2 008 года, хронически больные пациенты в США по сравнению с другими странами чаще остаются без надлежащего лечения по причине высоких расходов (Schoen, С. et al. , (2008) Health Affairs Web Exclusive, wl-wl6) . Кроме того, более вероятно, что эти пациенты столкнутся с самыми высокими показателями медицинских ошибок, проблемами с координацией оказания помощи и высокими затратами на оказание помощи из собственных средств.
В настоящее время по оценкам American Autoimmune Related Disease Association (AARDA) 50 миллионов американцев страдают аутоиммунными заболеваниями. Эпидемиологических данных не хватает для определения полных прямых и косвенных затрат общей системы здравоохранения на аутоиммунные заболевания. Однако, в 2001 году директор National Institutes of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Dr. Anthony Fauci заявил, что ежегодные затраты на лечение аутоиммунных заболеваний превышают 100 миллиардов долларов. Хотя затраты в 100 миллиардов долларов внушают страх, это, вероятно, представляет собой огромное преуменьшение
истинных затрат на аутоиммунные заболевания, т.к. ежегодные затраты только на семь из более чем 100 известных аутоиммунных заболеваний, болезнь Крона, язвенный колит, системную красную волчанку (SLE), рассеянный склероз (MS), ревматоидный артрит (RA) , псориаз и склеродермию, оценивают по результатам эпидемиологических исследований всего в размере 51,8-70,6 миллиардов долларов ежегодно. Кроме того, в эти оценки не входят затраты на иммуносупрессивную терапию при трансплантации.
Аутоиммунные заболевания являются хроническими состояниями
без возможности излечения, возникающими, когда иммунная система
решает, что здоровые клетки являются чужеродными, и атакует их.
В зависимости от типа, аутоиммунное заболевание может поражать
один или множество различных типов тканей организма и может
вызывать аномальный рост органов и изменения функционирования
органов. Нормальная регуляция иммунной системы, в значительной
степени, является результатом взаимодействия пар
рецептор/лиганд, включающих белки, экспрессируемые клетками, участвующими в иммунном ответе. Однако эти пары рецептор/лиганд зачастую входят в каскады передачи сигнала, что является препятствием для лечения аутоиммунных заболеваний. Существующее лечение аутоиммунных заболеваний включает попытки контроля процесса заболевания и снижения симптомов, особенно в течение обострений.
Мембранный гликопротеин ОХ-2, также названный CD2 0 0
(кластер дифференцировки 200), является белком человека,
кодируемым геном CD200, экспрессирующимся во множестве типов
клеток (Barclay, А. N. (1981) Immunology 44, 727) и имеющим
высокую степень гомологии с молекулами семейства
иммуноглобулиновых генов. Белок, кодируемый этим геном, является
мембранным гликопротеином типа 1, содержащим два
иммуноглобулиновых домена и связывающимся с рецептором CD2 0 0 (CD200R).
CD200R экспрессируется на миелоидных клетках (моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и эозинофилах) и Т-клетках (Wright, et al. , (2000), Immunity 12, 233-242; Wright, et al. , (2003), J.Immunol, 111, 3034-3046).
Связывание CD2 0 0 с CD2 0 0R вызывает передачу ингибиторного сигнала в миелоидные клетки и Т-клетки, таким образом, проявляя иммуносупрессорный эффект в отношении врожденной и адаптивной частей иммунной системы (Rahim S.A., (2 005) AIDS, 19, 1907-192 5; Shiratori, I., (2005) J.Immunol, 175, 4441-4449; Misstear, K., et al., (2012), Journal of Virology, 86(11), 6246-6257).
Показано, что агонисты CD2 0 0R снижают патологию в широком диапазоне моделей заболеваний, например, артрита (Gorczynski, et al. , (2001) Clin.Immunol. 101, 328-34; Gorczynski, et al.,
(2002) Clin.Immunol. 104, 256-264), отторжения трансплантата
(Gorczynski, et al. , (2002) 73 Transplantation 1948-1953),
неудачной беременности (Gorczynski, et al., (2002)
Am. J. Reprod.Immunol., 48, 18-26), контактной
гиперчувствительности (Rosenblum, et al. , (2004) 103 Blood 26918), вызванного вирусом гриппа воспаления легких (Snelgrove, et al., (2008) Nat.Immunol. , 9, 1074-1083) и HSV-индуцированного воспалительного повреждения (Sarangi, et al., (2009) Clin.Immunol. 131, 31-40).
Кроме того, у мышей CD200~/~, которым вводили вирус гриппа, развивалось более тяжелое заболевание, ассоциированное с повышенной инфильтрацией легких и повреждением эндотелия легких по сравнению с контролями дикого типа (Rygiel. Т. P., et al.
(2009) J.Immunol. 183(3), 1990-1996). У мышей CD200-/-развивались иммунные ответы, которые могли контролировать вирусную нагрузку, что позволяет предполагать, что тяжелое заболевание было вызвано чрезмерным иммунным ответом. Заболевание можно было предотвращать посредством истощения Т-клеток перед заражением вирусом, несмотря на значительно повышенную возникшую вирусную нагрузку. Rygiel. Т. P., et al.
(2 009) делали вывод о том, что Т-клетки необходимы для манифестации симптомов заболевания при гриппе, и что отсутствие нисходящей модулирующей передачи сигнала CD2 0 0-CD2 0 0R, а не вирусная нагрузка, усиливает иммунную патологию.
Профилирующие исследования показали, что экспрессия hCD2 0 0 отрицательно регулируются в различных популяциях пациентов, таких как пациенты с рассеянным склерозом (Koning, et al.,
(2007) Ann. Neurol. 62, 504-514), обострением астмы (Aoki, et al.r (2009) Clin.Exp.Allergy 39, 213-221), болезнью Альцгеймера
(Walker, et al.r (2009) Exp.Neurol. 215, 5-19), первичной гипертрофической остеоартропатией (Ren, et al., (2013) Rheumatol. Int. 33(10), 2509-2512), неудачной беременностью
(Clark (2009) Am.J.Reprod. Immunol. 61, 75-84) и плоским фолликулярным лишаем (облысением) (Harries, et al. r (2013) J.Pathol. 231(2), 236-247).
Агонисты белков CD2 0 0 описаны, например, в WO 2000/061171 и WO 2008/089022. В литературе описано применение молекул CD200 дикого типа для модуляции функций иммунных клеток. Настоящее изобретение относится к мутантным белкам CD2 00, связывающимся с рецептором CD200 с более высокой аффинностью, чем CD200 дикого типа.
Таким образом, существует потребность в обеспечении улучшенной клинической эффективности при более низких дозах, что позволит преодолеть проблемы, связанные с доступным в настоящее время лечением аутоиммунных заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящее изобретение относится к мутантному белку CD2 00, содержащему мутацию в положении аминокислотного остатка 130 и/или 131.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему белок, как определено в настоящем описании, слитый с не-СБ2 0 0 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему белок, как определено в настоящем описании.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок, как определено в настоящем описании.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к белку, как определено в настоящем описании, или композиции, как определено в настоящем описании, для применения в лечении аутоиммунного заболевания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1: гели после электрофореза в присутствие SDS с WT-CD200-FC, K130Y и I131Y.
Фигура 2: А: Эксклюзионная хроматография K13 0Y. В: Эксклюзионная хроматография I131Y.
Фигура 3: Иммобилизация антитела против Fc человека на поверхности сенсорного чипа.
Фигура 4: Фиксация герцептина и ассоциация/диссоциация hCD200R.
Фигура 5: А: Сенсограмма, на которой показаны фазы ассоциации и диссоциации связывания CD2 0 0R с зафиксированным CD200 дикого типа.
В: Сенсограмма, на которой показаны фазы ассоциации и диссоциации связывания CD2 0 0R с зафиксированным K13 0Y.
Фигура 6: Результаты исследования зависимости от дозы, в котором сравнивали ингибирование стимулированного РМА окислительного взрыва в выделенных нейтрофилах человека посредством CD200-FC дикого типа и K130Y.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящее изобретение относится к мутантному белку CD2 00, содержащему мутацию в положении аминокислотного остатка 130 и/или 131. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что мутации во внеклеточном домене CD2 0 0 в этих конкретных аминокислотных остатках приводят к получению мутантного CD2 0 0 с повышенной аффинностью связывания с рецептором CD2 0 0 (CD2 0 0R). Кроме того, мутантные белки CD2 00, как представлено в настоящем описании, обладают значительными преимуществами, в частности, в отношении лечения с большей клинической эффективностью и в более низких дозах.
В рамках изобретения термин "белок CD200" относится к белку CD200 дикого типа.
В рамках изобретения термин "дикий тип" относится к белкам, пептидам, аминокислотным и нуклеотидным последовательностям, встречающимся в природе. Например, в рамках изобретения термин "белок CD200 дикого типа" относится к любой полноразмерной изоформе CD200 (UNIPROT Р41217 OX2G HUMAN; SEQ ID NO: 1) или
любой ее части, связывающейся с рецептором CD200. Белок CD200 также известен как мембранный гликопротеин ОХ-2.
CD200 дикого типа является белком поверхности клетки, имеющим N-концевой внеклеточный домен и короткий трансмембранный и цитоплазматический домены. Внеклеточный домен связывается с рецепторами-мишенями, такими как рецептор CD200. В одном из вариантов осуществления белок CD200 представляет собой внеклеточный домен CD2 0 0 или любую его часть, связывающуюся с рецептором CD200. В дополнительном варианте осуществления белок CD200 представляет собой внеклеточный домен (SEQ ID N0: 2) CD200 дикого типа, который в полноразмерном белке, включающем сигнальную последовательность, начинается с глутамина в положении +31 и заканчивается лизином в положении +231 (SEQ ID N0: 1).
В рамках изобретения термин "положение" относится к номеру остатка в аминокислотной последовательности, где 1 является первой транслируемой аминокислотой.
В рамках изобретения термин "мутантный" или "мутация"
относится к белкам, пептидам, аминокислотным и нуклеотидным
последовательностям, подвергнувшимся изменению по своей форме с
эквивалента дикого типа в мутантный. Например, мутантный белок
может подвергаться изменению в аминокислотной и/или нуклеотидной
последовательности по сравнению с соответствующей
последовательностью дикого типа, такое изменение также можно обозначать как мутацию.
Распространенные мутации включают замены, делеции, добавления, укорочения, транслокации и инверсии. Таким образом, в одном из вариантов осуществления мутация является заменой, транслокацией или инверсией. В дополнительном варианте осуществления мутация является заменой. В дополнительном варианте осуществления указанная замена представляет собой K130Y и/или I131Y.
Специалисту в этой области будет понятно, что мутацию в нуклеотидной последовательности, не изменяющую аминокислотную последовательность, все равно будут рассматривать как мутацию. Таким образом, мутацию в нуклеотидной последовательности, не
изменяющую аминокислотную последовательность, все равно будут рассматривать как мутацию.
В рамках изобретения термин "мутантный белок CD2 00", относится к полноразмерному белку CD2 00 или любым его частям, связывающимся с рецептором CD2 00, содержащему мутантный аминокислотный остаток или множество мутантных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности таким образом, что он является схожим, но уже не идентичным белку CD2 0 0 дикого типа.
В одном из вариантов осуществления мутантный белок CD2 0 0 можно получать синтетически или рекомбинантно. В дополнительном варианте осуществления мутантный белок CD2 0 0 можно получать синтетически. В альтернативном варианте осуществления мутантный белок CD2 0 0 можно получать рекомбинантно.
В одном из вариантов осуществления мутантный белок CD2 0 0 связывается с рецептором CD200 с более высокой аффинностью, чем CD200 дикого типа.
В одном из вариантов осуществления мутантный белок CD2 0 0 может содержать биологически или химически активный He-CD2 0 0 компонент или может быть присоединенным к нему.
В одном из вариантов осуществления мутантный белок CD2 0 0 может являться растворимым (т.е. циркулирующим) или связанным с поверхностью. В дополнительном варианте осуществления мутантный белок CD200 является растворимым. В альтернативном варианте осуществления мутантный белок CD200 связан с поверхностью.
В одном из вариантов осуществления мутантный белок CD2 0 0 может включать целый внеклеточный домен CD2 0 0 или его части.
В рамках изобретения термин "часть" со ссылкой на белки, пептиды и аминокислотные и нуклеотидные последовательности относится к фрагментам и производным, являющимся функциональными, т.е. связывающимся со своей мишенью.
В рамках изобретения термин "фрагмент" относится к части
белка, пептида, аминокислотной или нуклеотидной
последовательности, распознающей и связывающейся со своей мишенью, такой как рецептор.
В рамках изобретения термин "производное" и "мутант"
относится к белку, пептиду, аминокислотной или нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70% (например, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%) сходства последовательности с эквивалентом дикого типа и функционирующей подобно ему. Таким образом, мутант может являться производным эквивалента дикого типа. В дополнительном варианте осуществления мутантный белок CD200 является частью внеклеточного домена CD200 дикого типа, начинающейся с глутамина в положении +31 и заканчивающейся лизином в положении +231.
В рамках изобретения термин "аминокислотный остаток" относится к мономерной единицей в полимерной цепи, т.е. одной аминокислотой в белке.
В одном из вариантов осуществления белок дополнительно содержит одну или более мутаций, присутствующих в аминокислотной последовательности, например, 1-15 мутаций.
В дополнительном варианте осуществления указанный мутантный белок содержит одну или более дополнительных мутаций, таких как мутации, выбранные из G12 9I, F12 8R и/или N81K.
В одном из вариантов осуществления белок, как определено в настоящем описании, содержит внеклеточный домен (ECD) указанного белка. В дополнительном варианте осуществления белок, как определено в настоящем описании, содержит последовательность SEQ ID N0: 3 или SEQ ID N0: 4.
В одном из вариантов осуществления белок, как определено в настоящем описании, содержит полноразмерную последовательность CD200. В дополнительном варианте осуществления белок, как определено в настоящем описании, содержит последовательность SEQ ID N0: 12 или SEQ ID N0: 13.
Как показано на фигуре 5 и в таблице 2, мутантные белки CD2 00, представленные в настоящем описании, сильнее связываются с рецептором CD2 0 0 и демонстрируют большее время удержания на рецепторе, чем белок CD200 дикого типа.
Слитый белок
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему белок, как определено в настоящем описании, слитый с He-CD2 0 0 белок-кодирующей частью посредством
необязательной линкерной части.
В рамках изобретения термин "слитый белок" относится к одной или более аминокислотным последовательностям, пептидам и/или белкам, соединенным способами, хорошо известными в этой области и описанными, например, в патентах США №№ 5434131 и 5637481. Соединенные аминокислотные последовательности, пептиды или белки, таким образом, образуют один слитый белок.
В одном из вариантов осуществления белок по настоящему изобретению подвергают слиянию на N- или С-конце с He-CD200 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части. В дополнительном варианте осуществления белок по настоящему изобретению подвергают слиянию на N-конце с не-СБ200 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части. В альтернативном варианте осуществления белок по настоящему изобретению подвергают слиянию на С-конце с не-СБ200 белок-кодирующей частью посредством необязательной линкерной части
В одном из вариантов осуществления указанная линкерная часть является пептидом, содержащим от 1 до 15 аминокислот. В дополнительном варианте осуществления линкер является линкером из 10 аминокислот, начинающимся с глицина и заканчивающимся серином. В дополнительном варианте осуществления изобретения линкер является пептидом, содержащим последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID N0: 11).
В рамках изобретения термин "He-CD200 белок-кодирующая часть" относится к любому пептиду или белку, не связывающемуся с рецептором CD200 и не мешающим связыванию CD200 с его мишенью. Неограничивающие примеры включают константную область иммуноглобулина (Ig) или ее часть.
В дополнительном варианте осуществления указанная не-СБ200 белок-кодирующая часть является антителом или его фрагментом. В дополнительном варианте осуществления указанная не-СБ200 белок-кодирующая часть является Fc-фрагментом. Таким образом, мутантный слитый белок CD2 00, как представлено в настоящем описании, также можно обозначать как мутант CD200-FC. В дополнительном варианте осуществления Fc-фрагмент получают из
млекопитающего, такого как человек или обезьяна, например, С(гамма)1 человека, включающий шарнирную области, области СН2 и СНЗ. Считают, что Fc-фрагмент обеспечивает преимущество, состоящее в повышении времени полужизни (т.е. занятости рецептора) мутантных белков CD2 0 0 по изобретению. Специалисту в этой области будет понятно, что Fc-область можно подвергать мутагенезу для снижения ее эффекторных функций (см. например, патенты США №№ 5637481 и 6132992).
Т.к. мутантные белки CD2 0 0 имеют более высокую аффинность для рецептора CD2 0 0 по сравнению с белками CD2 0 0 дикого типа или немутантными белками CD2 00, как представлено в настоящем описании на фигуре 5 и в таблице 2, любая слитая не-СБ2 0 0 белок-кодирующая часть также получит преимущества благодаря этому признаку. Это приносит значительную пользу в отношении фармацевтических композиций и терапевтических средств, как представлено в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления слитый белок, как определено в настоящем описании, содержит последовательность SEQ ID N0: 6 или SEQ ID N0: 7.
Белки по настоящему изобретению, предпочтительно, получают способами рекомбинантной ДНК посредством встраивания последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный белок CD2 0 0 или любую его часть, в рекомбинантный экспрессирующий вектор и экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты в рекомбинантной системе экспрессии в условиях, способствующих экспрессии. Таким образом, в одном из вариантов осуществления полинуклеотид, кодирующий слитый белок, дополнительно содержит вектор, такой как pcDNA 3.4. В одном из вариантов осуществления слитый белок фланкирован одним или более участками распознавания ферментов рестрикции, таких как Hind III и/или Xho I. В дополнительном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий слитый белок, фланкирован участками рестрикции Hind III и Xho I.
В одном из вариантов осуществления слитый белок содержит один или более участков распознавания ферментов рестрикции, таких как Bam HI.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему белок, как определено в настоящем описании. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белки по настоящему изобретению, можно собирать из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или серии олигонуклеотидов для получения синтетического гена, который можно встраивать в рекомбинантный экспрессирующий вектор и экспрессировать в рекомбинантной транскрипционной единице.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы включают
синтетические или полученные из кДНК фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие мутантный CD2 00, функционально связанные с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, полученными из генов млекопитающего, микроорганизма, вируса или насекомого. Такие регуляторные элементы включают транскрипционный промотор, необязательную последовательность оператора для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие участки связывания рибосомы на мРНК, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. Дополнительно можно включать способность реплицироваться в хозяине, как правило, придаваемую участком начала репликации, и селективный ген для облегчения определения трансформантов.
Терапевтическое применение
Настоящее изобретение имеет конкретное применение в терапии, т.к. взаимодействие между белком CD2 0 0 и рецептором CD2 0 0 отличается высокой скоростью "прямой реакции" и высокой скоростью диссоциации ("обратной реакции"), что, в свою очередь, снижает аффинность CD200 к рецептору CD200. Таким образом, повышение аффинности мутантного белка CD2 0 0 к рецептору CD2 00, как представлено в настоящем описании, можно использовать в производстве фармацевтических композиций с более сильными свойствами.
Кроме того, производственные затраты в случае рекомбинантных белков высоки, и мутантный белок CD2 00, имеющий более высокую аффинность, можно использовать в фармацевтических композициях в значительно более низких дозах, чем CD200 дикого
типа или не-мутантный белок CD2 00, для достижения терапевтического эффекта. Применение мутантного белка CD200, таким образом, может быть экономически более эффективным, а также клинически более эффективным.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок, как определено в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления мутантный белок CD2 00, как определено в настоящем описании, является модулятором рецептора CD200. В рамках изобретения термин "модулятор" относится к веществу, приводящему к кинетическому изменению, например, модулятор белка может приводить к повышению или снижению активности указанного белка. Что касается свойств мутантных белков CD2 0 0 по изобретению, считают, что они являются агонистами рецептора CD2 0 0 и, таким образом, найдут применение в лечении аутоиммунного заболевания. Таким образом, в дополнительном варианте осуществления мутантный белок CD2 00, как определено в настоящем описании, является агонистом рецептора CD200.
Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к белку, как определено в настоящем описании, или композиции, как определено в настоящем описании, для применения в лечении аутоиммунного заболевания.
Слитые белки, содержащие мутантные белки CD2 00, определенные в настоящем описании, могут дезактивировать активированные иммунные клетки с более высокой эффективностью, чем слитые белки, содержащие CD2 0 0 дикого типа или не-мутантные белки CD2 00.
В одном из вариантов осуществления аутоиммунное заболевание выбрано из аутоиммунных заболеваний, поражающих нервномышечную систему, сосудистую систему, глаз, пищеварительный тракт, легкие, почки, печень, периферическую или центральную нервную систему, кости, хрящи или суставы.
В дополнительном варианте осуществления аутоиммунное заболевание является одним или более аутоиммунными заболеваниями, выбранными из: острого диссеминированного
энцефаломиелита (ADEM); острого некротизирующего
геморрагического лейкоэнцефалита; болезни Аддисона;
агаммаглобулинемии; гнездной алопеции; амилоидоза;
анкилозирующего спондилита; нефрита против GBM/против ТВМ;
антифосфолипидного синдрома (APS); аутоиммунного
ангионевротического отека; аутоиммунной апластической анемии;
аутоиммунной дизавтономии; аутоиммунного гепатита; аутоиммунной
гиперлипидемии; аутоиммунного иммунодефицита; аутоиммунного
заболевания внутреннего уха (AIED); аутоиммунного миокардита;
аутоиммунного оофорита; аутоиммунного панкреатита; аутоиммунной
ретинопатии; аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры (АТР);
аутоиммунного заболевания щитовидной железы; аутоиммунной
крапивницы; аксональной и нейрональной невропатии; болезни Бало;
болезни Бехчета; буллезного пемфигоида; кардиомиопатии; болезни
Кастлемана; целиакии; болезни Шагаса; хронической воспалительной
демиелинизирующей полиневропатии (CIDP); хронического
рецидивирующего множественного остеомиелита (CRMO); синдрома
Чарга-Стросса; рубцующегося пемфигоида/доброкачественного
пемфигоида слизистой оболочки; болезни Крона; синдрома Когана;
болезни Холодовых агглютининов; врожденной блокады сердца;
миокардита Коксаки; CREST-синдрома; первичной криоглобулинемии
смешанного типа; демиелинизирующий невропатий; герпетиформного
дерматита; дерматомиозита; болезни Девика (нейромиелита
зрительного нерва); дискоидной волчанки; синдрома Дресслера;
эндометриоза; эозинофильного эзофагита; эозинофильного фасцита;
нодозной эритемы; экспериментального аллергического
энцефаломиелита; синдрома Эвана; фиброзирующего альвеолита;
гигантоклеточного артериита (височного артериита);
гигантоклеточного миокардита; гломерулонефрита; синдрома
Гудпасчера; гранулематоза с полиангиитом (GPA) (ранее известного
как гранулематоз Вегенера); болезни Грейвса; синдрома Гийена-
Барре; энцефалита Хашимото; тиреоидита Хашимото; гемолитической
анемии; болезни Шенлейн-Геноха; герпеса беременных;
гипогаммаглобулинемии; идиопатической тромбоцитопенической
пурпуры (ITP); IgA-нефропатии; связанного с IgG4 склероза; иммунорегуляторных липопротеинов; миозита с тельцами включения;
интерстициального цистита; ювенильного артрита; ювенильного
диабета (диабета 1 типа); ювенильного миозита; синдрома
Кавасаки; синдрома Ламберта-Итона; лейкоцитокластического
васкулита; красного плоского лишая; склеротического лишая;
деревянистого конъюнктивита; линейного IgA-зависимого
заболевания (LAD); системной красной волчанки (SLE); хронической
болезни Лайма; болезни Меньера; микроскопического полиангиита;
смешанного заболевания соединительной ткани (MCTD); язвы Мурена;
болезни Мухи-Габерманна; рассеянного склероза; миастении;
миозита; нарколепсии; нейромиелита зрительного нерва (болезни
Девика); нейтропении; рубцующегося пемфигоида глаза; неврита
зрительного нерва; палиндромного ревматизма; PANDAS
(педиатрических аутоиммунных психоневрологических расстройств, связанных со Streptococcus); паранеопластической дегенерации мозжечка; пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH); синдрома Парри-Ромберга; синдрома Персонейджа-Тернера; парспланита
(периферического увеита); пемфигоида; периферической невропатии; перивенозного энцефаломиелита; пернициозной анемии; POEMS-синдрома; нодозного полиартериита; аутоиммунных полигландулярных синдромов типа I, II и III; ревматической полимиалгии; полимиозита; постинфарктного синдрома; посткардиотомного синдрома; прогестеронового дерматита; первичного биллиарного цирроза; первичного склерозирующего холангита; псориаза; псориатического артрита; идиопатического легочного фиброза; гангренозной пиодермии; истинной эритроцитарной аплазии; феномена Рейно; реактивного артрита; рефлекторной симпатической дистрофии; синдрома Рейтера; рецидивирующего полихондрита; синдрома беспокойных ног; ретроперитонеального фиброза; ревматической лихорадки; ревматоидного артрита; саркоидоза; синдрома Шмидта; склерита; склеродермии; синдрома Шегрена; аутоиммунитета к сперме и тестикулярного аутоиммунитета; синдрома скованного человека; подострого бактериального эндокардита (SBE); синдрома Сусака; симпатической офтальмии; артериита Такаясу; височного артериита/гигантоклеточного артериита; тромбоцитопенической пурпуры (ТТР); синдрома Толоса-Ханта; поперечного миелита; диабета 1 типа; язвенного колита;
недифференцированного заболевания соединительной ткани (UCTD); увеита; васкулита; везикулобуллезного дерматоза; витилиго и гранулематоз Вегенера (в настоящее время называющегося гранулематозом с полиангиитом (GPA).
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающему введение белка по изобретению индивидууму, имеющему по меньшей мере одно аутоиммунное заболевание.
Следует понимать, что белок по изобретению можно вводить в качестве единственного терапевтического средства или его можно вводить в виде комбинированного лечения с одним или более другими соединениями (или терапевтическими средствами) для лечения аутоиммунного заболевания.
Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок, как определено в настоящем описании, в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими средствами.
В случае лечения аутоиммунного заболевания белок по изобретению, предпочтительно, можно использовать в комбинации с одним или более другими лекарственными средствами, более конкретно, с одним или более иммуносупрессирующими средствами или адъювантами в иммуносупрессивной терапии.
Неограничивающие примеры других терапевтических средств, которые можно вводить вместе (одновременно или с различными временными интервалами) с соединениями по изобретению включают: азатиоприн; метотрексат; циклоспорин; моноклональные антитела (басиликсимаб, даклизумаб и муромонаб) и кортикостероиды.
Каждое из терапевтических средств, присутствующих в комбинациях по изобретению, можно вводить индивидуально по различным схемам введения и разными путями. Кроме того, дозировка каждого из двух или более средств может отличаться: каждое из них можно вводить одновременно или в разное время. Специалисту в этой области будут понятны схемы введения доз и способы комбинированного лечения для применения. Например, белок по изобретению можно использовать в комбинации с одним или более другими средствами, вводимыми в соответствии с существующими
комбинированными схемами лечения.
Как правило, белки, представленные в настоящем описании,
будут применять в очищенной форме вместе с фармакологически
приемлемыми эксципиентами или носителями. Как правило, эти
эксципиенты или носители включают водные или спиртовые/водные
растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический
раствор и/или забуференные среды. Парентеральные наполнители
включают раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера,
декстрозу и хлорид натрия и лактат Рингера. Подходящие
физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо
поддерживать полипептидный комплекс в суспензии, можно выбирать
из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза,
поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Путь введения фармацевтических композиций по изобретению может являться любым из путей, известных специалистам в этой области. В случае терапии, включающей, в качестве неограничивающих примеров, иммунотерапию, белки по изобретению можно вводить любому пациенту стандартными способами. Введение можно осуществлять любым способом, в том числе парентерально, внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально, трансдермально, легочно или также, соответствующим образом, посредством прямой инфузии с использованием катетера. Доза и частота введения будут зависеть от пола, возраста и состояния пациента, сопутствующего введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, учитываемых лечащим врачом.
Белки по изобретению можно лиофилизировать для хранения и восстанавливать в подходящем носителе перед использованием. Показано, что этот способ эффективен, и можно использовать известные в этой области способы лиофилизации и восстановления. Специалисту в этой области следует понимать, что лиофилизация и восстановление могут приводить к разным степеням утраты активности, что может потребовать коррекции уровней в сторон повышения.
В следующих исследованиях и протоколах проиллюстрированы варианты осуществления способов, представленных в настоящем описании.
Пример 1: Производство мутантных молекул CD200-FC и молекул CD200-FC дикого типа Синтез гена
Последовательность ДНК, кодирующую остатки 1-231 мутантного
CD200 или CD200 дикого типа человека из Uniprot Р412178
(0X2G_Human), включающую N-концевую сигнальную
последовательность, подвергали слиянию на С-конце с Fc IgGl, остатками 99-330 из Р01857 (IHGl_Human) с линкерной последовательностью GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11) между 2 доменами белка. Синтез гена осуществляли в GeneArt для конструкций дикого типа и мутантных конструкций.
Экспрессирующие конструкции получали с использованием экспрессирующего вектора млекопитающего pcDNA3.4 с 5' Hind III и 3' Xho. Внутренний участок Bam HI встраивали для облегчения замены доменов Fc.
Препарат в миди-формате
После получения лиофилизированные конструкции ДНК для целевых белков CD200-FC (белков CD200-FC дикого типа и мутантных белков CD200-Fc) суспендировали в 50 мкл MQ и трансформировали клетки DH5a. Выбирали одну колонию для каждого целевого белка и инокулировали ее в 5,0 мл LB, содержащего ампициллин. Затем выделяли ДНК из 2,0 мл культуры для подтверждения и анализировали посредством электрофореза в агарозном геле. Конструкции подтверждали посредством расщепления ДНК с использованием Hind III и Xhol. Каждую мутантную конструкцию или конструкцию дикого типа культивировали в 100 мл LB для получения препарата ДНК в миди-формате. ДНК выделяли с использованием набора PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit.
Экспрессия белка
Целевые белки CD200-Fc получали с использованием системы экспрессии Thermo Fisher Gibco(tm) ExpiCHO(tm) по инструкциям производителя для объема культуры 2 5 мл. Собирали супернатант сред, содержащий экспрессируемый CD200-FC, и хранили его при -8 0°С перед дальнейшим использованием.
Очистка белка
Осуществляли замену буфера с использованием обессоливающей колонки Hiprep (ХК26/10), упакованной 53 мл SephadexG25, для кондиционирования сред для очистки на аффинной колонке. Обессоливающие колонки уравновешивали буфером А (150 мМ NaCl, содержащего 20 мМ фосфат натрия, рН 7,4) с использованием платформы АКТА Explorer. 3 0 мл очищенных сред для культивирования наносили на две обессоливающие колонки, соединенные последовательно, со скоростью 1 мл/мин. Белок элюировали со скоростью 2 мл/мин и собирали фракции. Объединяли фракции, демонстрирующие максимальное поглощение и рН 7,4-7,2. Исключали фракции, имеющие более низкий рН. После обессоливания образцы разводили для получения приблизительно 4 5 мл супернатанта CD200-FC дикого типа или мутантного CD200-FC. Всю очистку осуществляли на льду при 4°С.
Колонку промывали 10 объемами колонки буфера А (10 мл 2 0 мМ фосфата натрия, рН 7,4, 150 мМ NaCl). Белок CD200-FC элюировали при градиенте рН 7,4-3,5 с использованием 10 объемов колонки с использованием 20 мМ фосфата натрия рН7,4, 150 мМ NaCl и 100 мМ цитратного буфера, рН 3,5, с линейным градиентом. Выделяли фракции CD200-FC, содержащие димерную форму белка массой140 кДа, учитывая данные электрофореза в ПААГ в присутствие SDS. Буфер белка заменяли с использованием фильтра Amicon Ultra Centricon с отсечкой по 10 кДа и концентрировали белок до 1 мг/мл.
На фигуре 1 показаны гели SGS для CD200-FC дикого типа, K130Y и I131Y. Перед осуществлением анализа связывания использовали эксклюзионную хроматографию для демонстрации того, что полученные белки CD200-FC не образовывали агрегаты в растворе (фигура 2).
Пример 2: Анализ связывания молекул CD200-FC дикого типа и мутантных молекул CD200-FC
Эксперименты с использованием анализа Biacore осуществляли в Syngene International Ltd. (Biocon Park, Plot No 2 &3, Bommasandra Industrial Area, Bommasadra-Jigani Link Road, Bangalore - 560099, India).
Принципы анализа
В устройстве BIAcore используют оптический способ, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), для измерения характеристик связывания двух взаимодействующих молекул; в этом случае, связывания CD200-FC дикого типа или мутантов CD200-FC с рецептором CD200 (CD200R). Этим способом измеряют изменения коэффициента преломления одной из двух взаимодействующих молекул, зафиксированных на чипе (сенсоре), когда вторая молекула протекает в растворе относительно зафиксированного партнера по связыванию. В этих экспериментах CD200-FC иммобилизовали на поверхности чипа (сенсора) и инъецировали CD200R в водный буфер относительно зафиксированного CD200-FC в условиях непрерывного потока. Изменения коэффициента преломления в случае CD200-FC после связывания CD200R измеряли в реальном времени и строили график результатов в виде единиц ответа (RU) относительно времени для получения сенсограмм (фигуры 5а и 5Ь).
Устройство и реагенты
Эксперименты осуществляли с помощью GE Healthcare BIAcore Т200. В таблице 1 приведены реагенты, используемые в осуществлении анализа.
Антитело против Fc человека ковалентно иммобилизовали на сенсорном чипе BIAcore СМ5 посредством присоединения по
аминогруппе с использованием набора GE Healthcare по инструкциям производителя. За целевую максимальную иммобилизацию принимали 10000-15000 RU. На фигуре 3 показана фиксация антитела против Fc человек на поверхности чипа. Проточную кювету 1 без иммобилизованного лиганда использовали в качестве референса для осуществления вычета неспецифического связывания на поверхности чипа. Fc-лиганды разводили до 0,5 мкг/мл в подвижном буфере BIAcore (HBS-EP+: 10 мМ забуференный HEPES физиологический раствор, содержащий 2 мМ ЭДТА и 0,05% поверхностно-активного вещества Р-20). На конечной стадии иммобилизации CD200-FC дикого типа, мутантным CD200-FC и неродственным контрольным белком (герцептином/трастузумабом) омывали чип (с использованием проточных кювет 2, 3 и 4 соответственно) в течение 120 секунд в концентрации, приводящей минимум к 250 единицам ответа (RU), с последующей стабилизацией поверхности в подвижном буфере в течение 120 секунд. Фиксацию CD200-FC повторяли для каждой концентрации CD2 0 0R. На фигуре 4 показано, что, как и ожидали, рецептор CD2 0 0 не связывался с герцептином, иммобилизованным на поверхности чипа.
Омывание поверхности СО200-Ес-связанного чипа с помощвю CD200R
После фиксации Fc-меченых белков CD2 0 0R (в различных концентрациях) омывали фиксированный CD200-FC и контрольные белки в течение 12 0 секунд (для анализа ассоциации), а затем омывали подвижным буфером в течение 12 0 секунд (для анализа диссоциации). Затем поверхность чипа восстанавливали с использованием 10 мМ глицина-HCl (рН 2) в течение 30 секунд (скорость потока 30 мкл/мин) с последующей стабилизацией поверхности в течение 60 секунд с использованием подвижного буфера BIAcore перед следующим циклом. Все концентрации CD200R анализировали в двух параллелях в следующих концентрациях: 1 мкМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, 31,25 нМ, 15,6 и 0 нМ.
Анализ данных
Результаты представлены в виде сенсограммы, построенной в виде зависимости единиц ответа или резонансных единиц (RU) от времени. Экспериментальные сенсограммы анализировали с
использованием программного обеспечения BIAevaluation версии 1.0 (GE Healthcare). Аппроксимацию кривой осуществляли с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1. Уравнения скорости со стандартными параметрами (например, концентрации лиганда, времени) использовали для итеративной аппроксимации кривой. Точность аппроксимации определяли с помощью алгоритмов, предоставленных производителем в программном обеспечении BIAevaluation версии 1.0. Результаты
На фигуре 4 показано, что, как и ожидали, рецептор CD200 не связывался с герцептином, иммобилизованном на поверхности чипа. На фигуре 5 представлены сенсограммы для связывания рецептора CD200 с CD200-FC дикого типа (фигура 5А) и мутантом CD200-FC K13 0Y (фигура 5В). Из сравнения сенсограмм на фигуре 5 очевидно, что K130Y связывается с рецептором CD200 с более высокой аффинностью и меньшей скоростью обратной реакции, чем CD200-FC дикого типа. В таблице 2 приведены скорости прямой реакции (М_1с_ 1) , скорости обратной реакции (с-1) и значения аффинности связывания (нМ) для молекул CD200-FC дикого типа и мутантных молекул CD200-Fc: WT, K130Y, I131Y, G129I, F128R, N81K. Время полужизни вычисляли с использованием соотношения t1/2 (м)=0, 693/koff (с-1) .
Таблица 2: Скорости прямой реакции (М_1с-1) , скорости обратной реакции (с-1) и значения аффинности связывания (нМ) для мутантных молекул CD200-FC
SEQ ID NO:
Мутация
Скорость прямой реакции (М^сг1)
Скорость обратной реакции (с-1)
Аффинность (нМ)
tl/2 (с)
SEQ ID N0:5
2,4Е+05
2,7Е-02
111,00
25,6
SEQ ID NO: 6
K130Y
4,ОЕ+05
3,2Е-03
8, 07
216, 6
SEQ ID N0:7
I131Y
1,8Е+05
9,1Е-03
49,00
76, 6
SEQ ID NO: 8
G129I
1,58 Е 5
1,7Е-02
108,00
40,8
SEQ ID
F128R
1,63Е 5
1,8Е-02
109
39,2
0,5 мл буфера для анализа. Клетки анализировали посредством проточной цитометрии (BD FACSVerse, BD Biosciences, New Jersey, US) . Строили график данных с использованием средней интенсивности флуоресценции клеток, обработанных только РМА, и сравнивали с клетками, обработанными РМА и тестируемыми соединениями (CD200-FC дикого типа или мутантом CD200-Fc). Для анализа данных использовали GraphPad Prism версии 6.0.
Кластер нейтрофилов гейтировали с помощью программы для анализа с использованием прямого и бокового светорассеяния (FSC vs SSC) для обеспечения сбора данных о соответствующей популяции клеток. В конечном итоге, гистограммы флуоресценции анализировали для количественного определения эффекта белков CD200-FC дикого типа и мутантных белков CD200-FC в отношении окислительного взрыва.
Анализ данных
CD200-Fc-onocpeflOBaHHoe ингибирование окислительного взрыва измеряли с использованием формулы:
Процент ингибирования=100-(100х(среднее значение для тестируемого соединения - среднее значение для отрицательного контроля)/(среднее значение для положительного контроля среднее значение для отрицательного контроля)
Значения в указанной выше формуле получают из значений средней интенсивности флуоресценции для гейтированной популяции клеток. Данные анализировали на статистическую значимость посредством одностороннего ANOVA с поправкой Бонферрони для сравнения всех колонок.
Результаты
В таблице 3 приведены значения средней интенсивности флуоресценции для гейтированной популяции клеток в случае CD2 0 0-Fc дикого типа, K130Y и положительные и отрицательные контроли. На фигуре б приведено сравнение эффектов CD200-FC дикого типа и K130Y в анализе окислительного взрыва.
Из фигуры б очевидно, что мутант CD200-Fc K130Y ингибирует стимулированный РМА окислительный взрыв в анализе окислительного взрыва более активно и в более низких дозах, чем CD200-FC дикого
типа. Кроме того, это повышение функциональной активности можно приписать мутации K13 0Y, т.к. два белка идентичны, за исключением мутации K13 0Y. Известно, что нейтрофилы в больших количествах обнаруживают в воспаленной ткани (например, в суставах и синовиальной жидкости при ревматических заболеваниях) и, кроме того, они обладают огромным потенциалом в отношении прямого повреждения ткани, кости и хряща в результате секреции протеаз и токсических метаболитов кислорода, а также запуска воспаления посредством презентации антигена и секреции цитокинов, хемокинов, простагландинов и лейкотриенов (Wright, H.L., et al. , (2010) 49 Rheumatology 1618-1631) . Таким образом, можно ожидать, что средства, ингибирующие активацию нейтрофилов, будут полезными средствами для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, при которых патология полностью или частично опосредована аномальной активацией нейтрофилов.
Таблица 3: Значения средней интенсивности флуоресценции для гейтированной популяции клеток в случае CD200-FC дикого типа, K13 0Y и положительных и отрицательных контролей. Значения SD для параллельных экспериментов приведены в скобках.
Авторы настоящего изобретения утверждают, что ни в одном из документов, процитированных в Отчете о международном поиске, не описывают мутантный белок CD2 00, содержащий мутацию в положении
аминокислоты 130 и/или 131, соответствующем SEQ ID NO: 1, где указанная мутация является заменой, выбранной из K13 0Y и/или I131Y. Кроме того, как описано Экспертом, на современном уровне техники не существует идеи, объясняющей повышение аффинности CD200 к CD200R в результате мутации в положениях аминокислот 130 и/или 131, особенно в свете того, что мутации в положениях аминокислот 12 8 и/или 12 9 не вызывают повышения аффинности.
Таким образом, авторы настоящего изобретения утверждают, что пункт 1 формулы изобретения является новым и патентоспособным по сравнению с предшествующим уровнем техники, описанным Экспертом, и что все зависимые пункты формулы изобретения являются новыми и патентоспособными в результате зависимости от пункта 1 формулы изобретения.
В свете того, что ссылка на SEQ ID NO: 1 включена в пункт 1 формулы изобретения, авторы настоящего изобретения утверждают, что возражение, выраженное Экспертом, более не актуально.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Ducentis Biotherapeutics Ltd.
<120> МУТАНТ CD200 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> DUC-C-P2019PCT
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 278
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapien
<400> 1
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180
185
190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Tyr Trp Phe Ser Val Pro Leu Leu
225 230 235 240
Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu
245 250 255
Leu Tyr Trp Lys Arg His Arg Asn Gln Asp Arg Gly Glu Leu Ser Gln
260 265 270
Gly Val Gln Lys Met Thr 275
<210> 2
<211> 201
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapien
<400> 2
Gln Val Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ser Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val
20 25 30
Thr Trp Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe
35 40 45
Ser Glu Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile
50 55 60
Asn Ile Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn
65 70 75 80
Ile Thr Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe
85 90 95
Gly Phe Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln
100 105 110
Pro Arg Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn
145 150 155 160
Gly Thr Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn
165 170 175
Gln Val Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val
180 185 190
Thr Asp Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys 195 200
<210> 3
<211> 201
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 3
Gln Val Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ser Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val
20 25 30
Thr Trp Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe
35 40 45
Ser Glu Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile
50 55 60
Asn Ile Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn
65 70 75 80
Ile Thr Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe
85 90 95
Gly Phe Gly Tyr Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln
100 105 110
Pro Arg Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn
145 150 155 160
Gly Thr Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn
165 170 175
Gln Val Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val
180 185 190
Thr Asp Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys 195 200
<210> 4
<211> 201
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 4
Gln Val Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ser Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val
20 25 30
Thr Trp Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe
35 40 45
Ser Glu Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile
50 55 60
Asn Ile Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn
65 70 75 80
Ile Thr Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe
85 90 95
Gly Phe Gly Lys Tyr Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln
100 105 110
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Thr Cys Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val
130 135 140
Pro Arg Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn
145 150 155 160
Gly Thr Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn
165 170 175
Gln Val Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val
180 185 190
Thr Asp Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys 195 200
<210> 5
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 5
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 6
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 6
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Gly Tyr Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 7
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 7
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Gly Lys Tyr Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 8
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 8
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Ile Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 9
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 9
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Arg
115 120 125
Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 10
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 10
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Lys His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 11
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 278
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 12
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Gly Tyr Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Tyr Trp Phe Ser Val Pro Leu Leu
225 230 235 240
Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu
245 250 255
Leu Tyr Trp Lys Arg His Arg Asn Gln Asp Arg Gly Glu Leu Ser Gln
260 265 270
Gly Val Gln Lys Met Thr 275
<210> 13 <211> 278
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Искусственный
<400> 13
Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val
20 25 30
Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser
35 40 45
Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp
50 55 60
Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Gly Lys Tyr Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Tyr Trp Phe Ser Val Pro Leu Leu
225 230 235 240
Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu
245 250 255
Leu Tyr Trp Lys Arg His Arg Asn Gln Asp Arg Gly Glu Leu Ser Gln
260 265 270
Gly Val Gln Lys Met Thr 275
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутантный белок CD2 00, содержащий мутацию в положении аминокислотного остатка 130 и/или 131.
2. Белок по п. 1, где указанная мутация является заменой.
3. Белок по п. 2, где указанная замена представляет собой K130Y и/или I131Y.
4. Белок по любому из пп. 1-3, содержащий одну или более дополнительных мутаций, таких как мутации, выбранные из G12 9I, F128R и N81K.
5. Белок по любому из пп. 1-4, содержащий
последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13.
6. Белок по любому из пп. 1-5, содержащий внеклеточный
домен (ECD) указанного белка.
7. Белок по любому из пп. 1-6, содержащий
последовательность SEQ ID N0: 3 или SEQ ID N0: 4.
8. Слитый белок, содержащий белок по любому из пп. 1-7, слитый с He-CD2 0 0 белок-кодирующей части посредством необязательной линкерной части.
9. Белок по п. 8, где указанная линкерная часть является пептидом, содержащим от 1 до 15 аминокислот.
10. Белок по п. 8 или 9, где указанная He-CD200 белок-кодирующая часть является антителом или его фрагментом.
11. Белок по любому из пп. 8-10, где указанная He-CD200 белок-кодирующая часть является Fc-фрагментом.
12. Белок по любому из пп. 8-11, содержащий
последовательность SEQ ID N0: б или SEQ ID N0: 7.
13. Белок по любому из пп. 1-12, являющийся модулятором рецептора CD200.
14. Белок по любому из пп. 1-12, являющийся агонистом рецептора CD200.
15. Полинуклеотид, кодирующий белок по любому из пп. 1-14.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по любому из пп. 1-15.
17. Белок по любому из пп. 1-14 или композиция по п. 16 для применения в лечении аутоиммунного заболевания.
По доверенности
553255
12 3
12 3
97кДа * •
#7 кДа
45кДа
45кДа
зокДа
ш кДа
гокДа
здкДа
Дорожка 1: Белковый стандарт небольшого диапазона (Biorad) Дорожка 2: WTCD200-Fc Дорожка 3: K130Y
Дорожка 1: Белковый стандарт небольшого диапазона (Biorad) Дорожка 2: WTCD200-Fc Дорожка 3: I131Y
ФИГ. 1
А: Эксклюзионная хроматография K130Y
4.0J28O ни, 4 нм
В: Эксклюзионная хроматография I131Y
] нм, 4 нм
Иммобилизация антитела против Fc человека на поверхности сенсорного чипа
RU 65000 -г
60000 -55000 -50000 -О 45000 -40000 -35000 -30000 -
шАЬ против человека (GE)
3 }
-+¦
О ,1
-+¦
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
Время
2000
ФИГ.З
Кинетика фиксации связывания hCD200R с герцептином
Фш .. -герце
Концентрация (нМ)
Ассоциация
Диссоциация hCD200R
- 2f О
- 500
732
100В 11 и
Время
ФИГ. 4
Сенсограмма, на которой показаны фазы ассоциации и диссоциации связывания CD200R с
зафиксированным CD200 WT
Единицы ответа
120
Концентрация (нМ)
100 80 60 40 20 О
-20
825
875
925
Время
975
1025
1075
Сенсограмма, на которой показаны фазы ассоциации и диссоциации связывания CD200R с
зафиксированным K130Y
Концентрация (нМ)
Единицы ответа
140 п
120 -
100 -
80 -
60 -
40 -
20 -
0 -
-20 -
-'-1-
835 865 895 925 945 985 1015 1045 1075
Врбмя
ФИГ. 5
Результаты исследования зависимости от дозы, в котором сравнивали ингибирование стимулированного РМА окислительного взрыва в выделенных нейтрофилах человека посредством CD200-FC дикого типа и K130Y
Нестимулирован- Стимуляция РМА 10мкг/мл 1мкг/мл °'1мкг/мл °'01мкг/мл 0,001 мкгУмл
ные (отрицатель- (положительный ный контроль) контроль)
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Thr Cys Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val
130 135 140
Thr Cys Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val
130 135 140
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile
115 120 125
Thr Cys Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val
130 135 140
Thr Cys Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val
130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
1/6
1/6
2/6
2/6
3/6
3/6
3/6
3/6
3/6
3/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
4/6
5/6
5/6
5/6
5/6
5/6
5/6
5/6
5/6