(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к способам предупреждения активации нейтрофилов и к антиоксидантам, направленным на митохондрии. В изобретении описаны также способы профилактики или лечения различных воспалительных заболеваний и близких к воспалению состояний с использованием МТА.
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201892552 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки
2014.01.21
(51) Int. Cl.
A61K31/66 (2006.01) A61P39/06 (2006.01)
(54)
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИОКСИДАНТЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА МИТОХОНДРИИ
(31) (32)
61/755,234
2013.01.22
(62) (71)
(72)
(33) US
201591383; 2014.01.21
Заявитель:
ООО МИТОТЕХ (RU)
Изобретатель:
(74)
Скулачев Максим В., Скулачев Владимир П., Плотников Егор И., Зоров Дмитрий Б., Зиновкин Роман А., Лукашев Александр Н., Егоров Максим В., Ловат Максим Л. (RU)
Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к способам предупреждения активации нейтрофилов и к ан-тиоксидантам, направленным на митохондрии. В изобретении описаны также способы профилактики или лечения различных воспалительных заболеваний и близких к воспалению состояний с использованием МТА.
2420-553997ЕА/061 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИОКСИДАНТЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА МИТОХОНДРИИ
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущества предварительной заявки на патент США № 61/755234, озаглавленной "Способ лечения воспалительных состояний с помощью антиоксидантов, направленных на митохондрии" ("Method of Treatment of Inflammatory Conditions With Mitochondrially Targeted Antioxidants)", зарегистрированной 22 января 2013 г, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ [0002] Настоящее изобретение относится к области фармакологии и медицины и, в частности, к воспалению и родственному состоянию.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Инфильтрация лейкоцитов в ответ на бактериальную инвазию может привести к повреждению ткани (Gupta et al. (1996b) Kidney Int. 49:26-33). Инфильтрация лейкоцитов в ответ на инфекцию патогеном не приводит к патологическим изменениям в ткани, поскольку реакционноспособные виды кислорода (ROS), образованные макрофагами и лейкоцитами, остаются в фагоцитарных вакуолях внутри этих клеток. Однако основной механизм антипатогенного ответа (в случае воспаления, вызванного инфекцией) вовлекает образование ROS НАДФН оксидазами нейтрофилов и макрофагов (Sanmun et al. (2009) Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297:C621-631). Выход ROS из клеток становится разрушительным и ведет к повреждению и дисфункции ткани (Mundi et al. (1991) Infect. Immun, 59:4168-4172). Кроме высвобождения ROS, воспалительная реакция вовлекает также высвобождение цитокинов, эйкозаноидов, активацию комплемента и мобилизацию деструктивных ферментов (Nassar and Badr (1998) J. Nephrol. 11:177-184), и мононуклеарных клеток (MNC), т.е. макрофагов и моноцитов, которые играют определенную роль в таких повреждениях ткани (Friedewald and Rabb (2004) Kidney Int.
66:486-491). Так, например, было показано, что такой симптом повреждения ткани, как фиброз, намного меньше выражен, когда снижен уровень инфильтрации моноцитов в почки.
[0004] Острый пиелонефрит (APN) представляет собой пример расстройства, первоначально вызванного бактериальной инфекцией, в случае которого воспалительный ответ на инфекцию ведет к повреждению почки и дисфункции. Хотя в норме и почка, и мочевыводящие пути являются стерильными, в процессе жизни примерно у 40% женщин и 12% мужчин возникают инфекции мочевыводящих путей (UTI) (O'Hanley, (1996) In: Urinary Tract Infections: Molecular Pathogenesis and Clinical Management (Mobley et al. , eds), (Washington, DC: ASM Press), pp. 405-425). Острый пиелонефрит (APN) относится к потенциально опасным для жизни инфекциям мочевыводящих путей (UTI), который возникает, если инфекция развивается и захватывает верхние мочевыводящие пути. Чаще всего, уропатоген, связанный с этим заболеванием, относится к пиелонефритогенной подгруппе Escherichia colir которая обнаруживается в 85% случаев осложненных и неосложненных инфекций мочевыводящих путей (UTI) (Hill et al. (2005) Qbstet. Gynecol. 105:18-23).
[0005] Фармакологическое лечение острого пиелонефрита (APN) применяется для контроля реакций окислительного стресса, что дает терапевтический эффект в направлении предотвращения развития почечных патологий (Aydogdu et al. (2006) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33:119-124; Koyner et al. (2008) Nephron. Exp. Nephrol. 109:el09-l 17; Polo-Romero et al. (2004) Ren. Fail. 26:613-618: Rodrigo et al. (2004) Nephrol. Dial- Transplant. 19:2237-2244; Sadeghi et al. (2008) Pediatr. Nephrol. 23:1503-1510; Singh et al. (2004) Toxicology 201:143-151). Однако лечение такого рода осложняется многообразием механизмов образования множества ROS, а также их различным вкладом в создание защиты организма от инфекций и повреждений коллатеральных тканей. Митохондрии и НАДФР оксидазы представляют собой два основных источника ROS, хотя их относительный вклад в воспалительную патологию еще не совсем хорошо определен.
[0006] Таким образом, имеется потребность в усовершенствованных способах лечения, или подавления, или предупреждения повреждений тканей, связанных с высвобождением ROS, которые возникают в результате воспаления, сопровождающего некоторые заболевания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Было показано, что ключевым элементом в развитии некоторых воспалительных расстройств являются избыточное образование реакционноспособных видов кислорода (ROS), отмечаемое на всех стадиях прогрессирования патологического процесса. На основании этого открытия, были разработаны применяемые в настоящее время способы ослабления или снижения окислительного стресса в некоторых тканях за счет использования целевых МТА, направленных на митохондрии, как на мишени, в этих тканях. Было также обнаружено, что указанные МТА препятствуют активации нейтрофилов в ходе воспалительного процесса, что способствует снижению вредных воздействий воспаления при разного рода расстройствах и заболеваниях.
[0008] Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предупреждения активации нейтрофилов, включающему взаимодействие образца, содержащего нейтрофилы, с антиоксидантом, направленным на митохондрии, который описывается структурой:
где:
А обозначает эффекторную группировку следующей структуры:
Т * О
и/или ее восстановленные формы, где:
m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y выбран независимо из группы, состоящей из низшего алкила, низшего алкокси; или две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют следующую структуру:
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает
фармакологически приемлемый анион,
а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные
формы.
[0009] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанный МТА обозначает SkQl, SkQlH.2 SkQRl, SkQRlH.2 SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH.2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, используемый при этом образец представляет собой образец крови.
[0010] Настоящее изобретение, в другом своем аспекте,
относится к способу предотвращения высвобождения ММР-9 из
активированных нейтрофилов, включающему осуществление
взаимодействия активированных нейтрофилов с направленным на митохондрии антиоксидантом, имеющим структуру:
где:
А обозначает структуры:
эффекторную группировку указанной ниже
и/или ее восстановленные формы, где: m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, низшего алкокси; или две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют указанную ниже структуру:
RK ...'-ч
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от
5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает
фармакологически приемлемый анион,
а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные
формы.
[ООН] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанный антиоксидант обозначает SkQl, SkQlH.2, SkQRl, SkQRlH.2, SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH.2.
[0012] Настоящее изобретение, в другом своем аспекте, относится к способу лечения пациента с воспалительным расстройством, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества направленного на митохондрии антиоксиданта, описываемого следующей структурой:
и/или включающему ее восстановленные формы, где: А обозначает эффекторную группировку указанной ниже структуры:
и/или ее восстановленные формы, где: m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, низшего алкокси; или две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют указанную ниже структуру:
^чч> ,- --Ч 42 ^ ч> <
И/ИЛИ ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает
фармакологически приемлемый анион,
а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные
формы.
[0013] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанный антиоксидант обозначает SkQl, SkQlH.2, SkQRl, SkQRlH.2, SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH.2.
[0014] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанное воспалительное расстройство вызвано пиелонефритом, панкреатитом, диабетом, травмой, сепсисом, инфекцией или гепатитом. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, указанное воспалительное расстройство представляет собой хроническое или острое расстройство, или аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанное воспалительное расстройство вызвано бронхиальной астмой, хроническим обструктивным заболеванием легких, ишемией, острым расслоением аорты,
почечным заболеванием, диабетом, гипергликемией или бактериальной инфекцией. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, рассматриваемое лечение препятствует разобщению контактов по линии клетка-клетка в пораженной ткани (например, в ткани печени, почечной, дермальной ткани и ткани мозга), вызванному высоким уровнем глюкозы в крови, и/или препятствует повреждению ткани за счет предотвращения активации нейтрофилов.
[0015] Настоящее изобретение относится также к способу снижения проницаемости кровеносных сосудов у млекопитающего с нарушением метаболизма глюкозы, включающему введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества направленного на митохондрии антиоксиданта указанной ниже структуры:
где:
А обозначает эффекторную группировку указанной ниже структуры:
и/или ее восстановленные формы, где: m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, низшего алкокси; или две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют указанную ниже структуру:
RK A
." _ / N*4 ^ V J*" *.
n Q
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает фармакологически приемлемый анион, а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные формы, что препятствует разобщению, нарушающему контакт эндотелиальных клеток у млекопитающего.
[0016] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанный антиоксидант обозначает SkQl, SkQlH.2, SkQRl, SkQRlH.2, SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH.2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0017] Указанные выше и другие объекты настоящего изобретения, их различные характеристики, а также в целом само изобретения будут более полно представлены в приведенном ниже описании и станут более понятными, если его читать, просматривая сопровождающий описание графический материал, где:
[0018] на фиг.1А показана фотография нормальной почки из контрольного организма;
[0019] на фиг.1В показана фотография почки, пораженной
пиелонефритом;
[0020] на фиг.1С показана фотография почки, пораженной пиелонефритом, но при проведении лечения с использованием SkQRl;
[0021] на фиг.2А показана фотография гистологического среза коры почки от контрольной крысы, после его окрашивания гематоксилином и эозином;
[0022] на фиг.2В показана фотография гистологического среза коры почки от крысы с пиелонефритом;
[0023] на фиг.2С показана фотография гистологического среза коры почки от крысы с пиелонефритом, после лечения с использованием SkQRl;
[0024] На фиг.ЗА показана фотография гистологического среза мозгового вещества от контрольного организма, после окрашивания среза гематоксилином и эозином;
[0025] на фиг.ЗВ показана фотография гистологического среза мозгового вещества от крысы с пиелонефритом, после окрашивания среза гематоксилином и эозином;
[0026] на фиг.ЗВ показана фотография гистологического среза мозгового вещества от крысы с пиелонефритом, при проведении лечения с использованием SkQRl;
[0027] на фиг.4 приведен график, иллюстрирующий воспалительный индекс (см. методы) в мозговом веществе и коре почки, показанных на фиг. 2 и 3;
[0028] на фиг.5А приведен график, иллюстрирующий воспаление в почке, где указанное воспаление сопровождалось окислительным стрессом, как это было видно по уровню накопления MDA в ткани;
[0029] на фиг.5В приведен график, иллюстрирующий воспаление в почке, где указанное воспаление сопровождалось окислительным стрессом, на основании результатов определения активности МРТО (масштабное обозначение, 50 мкм. * - р <0,01, ** - р <0,05);
[0030] на фиг.6А приведена микрофотография
почечноканальцевых клеток (RTC) из контрольного организма, полученная с помощью конфокального микроскопа, с последующим
окрашиванием DCF-DA (масштабное обозначение, 50 мкм), где не отмечается какой-либо заметной флуоресценции DCF;
[0031] на фиг.6В приведено изображение контрольных
почечноканальцевых клеток (RTC), инкубированных с
активированными лейкоцитами (LC) вместе с бактериальным лизатом (BL) и окрашенных с использованием DCF-DA (масштабное обозначение, 50 мкм), где отмечается усиленная флуоресценция;
[0032] на фиг. 7А приведен график, показывающий количественные результаты и эффекты, относящиеся к RTC, которые были обработаны различными способами и затем окрашены с использованием DCF-DA (масштабное обозначение, 50 мкм);
[0033] на фиг. 7В приведен график, показывающий концентрацию нитрита как индикатора общей продукции N0 в RTC, которые были обработаны различными способами;
[0034] на фиг. 7С приведен график, иллюстрирующий образование N0 в RTC, по результатам оценки DAF-2FM флуоресценции в RTC, которые были обработаны различными способами;
[0035] на фиг. 7D приведен график, иллюстрирующий гибель клеток RTC и защитные эффекты некоторых лекарственных средств (* - р <0,01, ** - р <0,05);
[0036] на фиг. 8А приведен график, иллюстрирующий увеличенное число лейкоцитов в крови у контрольных крыс, у крыс с пиелонефритом и у крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0037] на фиг. 8В приведен график, иллюстрирующий увеличенное число нейтрофилов у контрольных крыс, у крыс с пиелонефритом и у крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0038] на фиг. 8С приведен график, показывающий концентрацию моноцитов в крови у контрольных крыс, у крыс с пиелонефритом и у крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl (*р < 0,05 в сравнении с контролем; **р < 0,05 в сравнении с группой APN);
[0039] на фиг. 8D приведен график, показывающий уровень лимфоцитов у контрольных крыс, у крыс с пиелонефритом и у крыс
с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl (*р < 0,05 в сравнении с контролем; **р < 0,05 в сравнении с группой APN) ;
[0040] на фиг. 8Е приведен график, показывающий уровень лимфоцитов у крыс после индукции пиелонефрита, где наблюдается продукция провоспалительного TNFa;
[0041] на фиг. 8F приведен график, показывающий концентрацию нейтрофилов в крови у крыс после индукции пиелонефрита и лечения с использованием SkQl;
[0042] на фиг. 8G приведен график, иллюстрирующий активность миелопероксидазы (МРО) у крыс через 7 дней после индукции пиелонефрита и лечения с использованием SkQl;
[0043] на фиг. 9А-9С приведены сканы, показывающие, что увеличение числа нейтрофилов сопровождается бурным ростом уровня ROS в этих клетках;
[0044] на фиг. 9D проиллюстрировано предотвращение воспалительных изменений в результате лечения с использованием SkQRl (* - р <0,01, ** - р <0.05);
[0045] на фиг. 10А приведено изображение результатов анализа в ДСН-геле, где наблюдается антиапоптозный Вс1-2 у контрольных крыс, у крыс с пиелонефритом и у крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0046] на фиг. 10В приведено изображение результатов анализа в ДСН-геле, где показан Вс1-2 в изолированных митохондриях из контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0047] на фиг. ЮС приведен график, иллюстрирующий результаты, показанные на фиг. 10А;
[0048] на фиг. 10D приведен график, иллюстрирующий результаты, показанные на фиг. 10В;
[0049] на фиг. 11 приведен график, иллюстрирующий уровень выживаемости для контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0050] на фиг. 12 приведена диаграмма, схематически иллюстрирующая изменения в количестве лейкоцитов и почечных
клеток и имеющихся в них митохондрий после бактериальной
инвазии (синим цветом обозначены элементы, относящиеся к
выжившим животным, и красные, к погибшим) . NOX = НАДФН
оксидаза; iNOS - индуцибельная NO-синтаза; TNFR - рецептор для
TNF-a; RIRR - ROS-индуцированный каскад высвобождения ROS; Р-
GSK-3|3 и GSK-3|3, относящиеся к характерным для выживающих
животных (фосфорилированные) и проапопоптозным
(дефосфорилированные) формам киназы гликоген-синтазы 3(3;
[0051] на фиг. 13А приведен график, иллюстрирующий продукцию TNFa в совместной культуре RTC и активированных лейкоцитов (LC+BL), которую не обрабатывали или обрабатывали с использованием Тролокса (Trolox), SkQRl, где видно, что уровень TNFa значительно выше в активированных LC, чем в контрольных LC, особенно в варианте совместной культуры с RTC, тогда как инкубирование с указанными лекарственными средствами не оказало никакого эффекта;
[0052] на фиг. 13В приведен график, иллюстрирующий продукцию TNFa в RTC в нормальной и кондиционированной лейкоцитами среде, по данным оценки флуоресценции DCF (* р <0,01);
[0053] на фиг. 14А приведена фотография ДСН-геля, на которой проиллюстрирована активация NF-кВ пути, на основании экспрессии 1кВа в лейкоцитах контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0054] на фиг. 14В приведена фотография ДСН-геля, показывающая экспрессию P-GSK3|3 в лейкоцитах контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0055] на фиг. 14С приведена фотография ДСН-геля, показывающая содержание 1кВ в лейкоцитах контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0056] на фиг. 14D приведена фотография ДСН-геля,
показывающая концентрацию фосфорилированного Akt в лейкоцитах контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0057] на фиг. 14Е приведена фотография ДСН-геля, показывающая уровни фосфо-СЭК-ЗР у контрольных крыс, крыс с пиелонефритом и крыс с пиелонефритом, которых лечили с использованием SkQRl;
[0058] на фиг. 15А приведена микрофотография изображения,
полученного с помощью сканирующего микроскопа, на которой видно
отсутствие взаимодействия в совместной культуре RTC и
активированных лейкоцитов, где стрелками показаны
взаимодействия в случае тесного контакта между RTC и лейкоцитами после 24 часов совместного культивирования (бар, 10 пм, 3 пм);
[0059] на фиг. 15А приведена микрофотография изображения, полученного с помощью сканирующего микроскопа, на которой видно наличие межклеточного взаимодействия в совместной культуре RTC и активированных лейкоцитов, где стрелками показаны взаимодействия в случае тесного контакта между RTC и лейкоцитами после 24 часов совместного культивирования (бар, 10 пм, 3 пм);
[0060] на фиг. 16 приведен график, иллюстрирующий выживание лейкоцитов после активации бактериальным лизатом, по результатам определения числа GFP-позитивных лейкоцитов на чашке Петри, где почечные клетки культивировали вместе с лейкоцитами, содержащими GFP, что помогало разграничить эти два вида клеток. В условиях совместного культивирования выживание активированных лейкоцитов было выше, чем это наблюдалось в варианте культивирования без почечных клеток (1- р <0,01);
[0061] на фиг. 17 приведен график, демонстрирующий противовоспалительный и антидиабетический эффекты разных концентраций SkQl и глюкозы на контакты эндотелиальных клеток, по данным определения относительного содержания VE-кадгерина;
[00 62] на фиг. 18 приведена схема, демонстрирующая противовоспалительный эффект различных концентраций SkQl и f-
MLP на нейтрофилы человека (активность желатиназы, определяемая по активности ММР9);
[0063] на фиг. 19 приведена схема, показывающая, что лечение с использованием SkQl предупреждает развитие отека поджелудочной железы, на экспериментальной модели острого панкреатита, где показан вес в граммах поджелудочной железы в 4 группах (приведено среднее значение и СКО). ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0064] В тексте настоящей заявки приводятся ссылки на различные патенты, заявки на патенты и публикации, которые включены полностью в настоящую заявку в качестве цитируемого материала, с тем, чтобы более обстоятельно охарактеризовать достигнутый уровень техники, согласно известным специалистам данным, имевшимся на момент написания и регистрации настоящего изобретения. В случае возникновения расхождения между данными, приведенными в патентах, заявках на патенты и публикации, и настоящим описанием следует рассматривать настоящее описание как приоритетный вариант.
Антиоксиданты, направленные на митохондрии (МТА)
[0065] В настоящем изобретении было показано, что направленные на митохондрии антиоксиданты (МТА) оказывают эффект в направлении предупреждения и лечения воспаления, ассоциированного с множеством заболеваний, расстройств и травм.
где:
А обозначает эффекторную группировку антиоксидантного действия, необязательно, следующей формулы:
[00 66] МТА представляет собой соединение приведенной ниже формулы:
и/или ее восстановленные формы, где: m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, низшего алкокси; или две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют указанную ниже структуру:
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает
фармакологически приемлемый анион,
а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные
формы.
[0067] Конкретные используемые МТА включают, без ограничения:
SkQRl
и их восстановленные формы: SkQlH.2 и SkQRlH.2, соответственно. Указанные МТА были описаны в PCT/RU2006/000394. Другие используемые варианты МТА включают, без ограничения, SkQ3 :
SkQ3
и его восстановленную (хинольную) форму SkQ3H.2; SkQRB:
..сн>
SkQRBH2
и его окисленную (хининовую) форму SkQRB; SkQBl:
SkQBl
и его восстановленную (хинольную) форму SkQBlH.2; SkQBPl:
SkQBPl
и его восстановленную (хинольную) форму SkQBPlH2.
[0068] Эти МТА применяются с целью профилактики и лечения патологических состояний воспалительной природы, достигаемых, по меньшей мере частично, за счет снижения или предупреждения поражения тканей, вызванного воспалением. Такие патологические состояния включают, без ограничения, пиелонефрит, панкреатит,
диабет и другие расстройства метаболизма глюкозы, гепатит, хроническое обструктивное заболевание легких, ишемию, острое расслоение аорты, почечную болезнь, травму, бактериальные инфекции, острые воспалительные расстройства, сепсис и аутоиммунные расстройства, такие как, без ограничения, бронхиальная астма.
Модели на основе пиелонефрита
[0069] Пиелонефрит исследовали в качестве репрезентативной патологии воспалительной природы, поскольку митохондриальные ROS представляют собой источник повреждения клеток почки, как это было показано на экспериментальной модели APN, как в рамках стандартной in vivo модели, полученной при инокуляции бактерий в мочевой пузырь, так и в варианте новой in vitro модели воспаления, основанной на взаимодействии лейкоцитов, активированных патогенном/эндотоксином, с эпителиальными клетками почки в клеточной культуре. В результате такого рода стресса, отмечалось прогрессирование окислительного стресса в клетках почки in vitro и гибель этих клеток. Указанный окислительный стресс вызывали лейкоциты, генерирующие ROS, а этот процесс, в свою очередь, инициировало их взаимодействие с бактериальными антигенами. После активации лейкоциты выделяли в среду ROS, N0 и TNF. Подавление НАДФР-оксидазы лейкоцитов приводило к резкому снижению уровня R0S в клетках, что можно рассматривать как аргумент в пользу того, что именно лейкоциты отвечают за избыточное образование R0S в почке при пиелонефрите.
[0070] Было обнаружено, что направленные на митохондрии антиоксиданты (МТА) (например, SkQl и SkQRl) способны оказывать протективные эффекты (пример 1). Обработка с использованием МТА предотвращала достижение "точки невозврата" на пути к клеточной гибели (Kroemer el al. (1995) FASЕВ J. 9:1277-1287).
[0071] Защита клеток почки под действием SkQl и SkQRl была еще более выраженной, чем это достигалось при использовании известного водорастворимого антиоксиданта, Тролокса (Trolox). Этот факт свидетельствует в пользу той роли, которую выполняет целевая направленность антиоксиданта на митохондрии в
предупреждении начала и развития патологии почки. Важно
отметить, что эти МТА не оказывали никакого эффекта на
образование TNFa лейкоцитами, контактирующими с бактериальным
лизатом, что позволяет предположить, что МТА не действуют за
счет подавления каких-либо стадий воспаления. Таким образом,
направленное воздействие на митохондриальные ROS благоприятно в
условиях имеющейся инфекции, когда стандартные
противовоспалительные средства действуют в направлении удаления микробов.
[0072] На экспериментальной in vivo модели APN была продемонстрирована роль опосредованного митохондриями окислительного стресса в поражении клеток почек. В одном из исследований уровень малондиальдегида (MDA), который является индикатором перекисного окисления липидов (Cherubini, et al. (2005) Free Radio. Biol. Med. 39:841-852; Gupta et al. (1996a) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 13:35-42), возрастал в почках крыс с экспериментальным APN, указывая на окислительное повреждение почки.
[0073] Кроме того, наблюдались повышенные уровни образования ROS в лейкоцитах крови у крыс с пиелонефритом. Направленный на митохондрии антиоксидант SkQRl нормализовал уровень ROS в лейкоцитах крови и в почках животных с пиелонефритом. Лечение с использованием SkQRl приводило также к подавлению инфильтрации нейтрофилов в пораженную заболеванием почку, а также уровня TNFa в ткани, указывая на высокую эффективность направленных на митохондрии антиоксидантов в предупреждении воспалительного повреждения почки.
[0074] В случае использования высокого титра бактерий, инъецируемых в мочевой пузырь, наблюдался высокий уровень гибели экспериментальных животных, что, в совокупности с высоким уровнем TNFa и с бактериемией, свидетельствовало о прогрессирующем сепсисе. МТА значительно повышали уровень выживаемости животных с тяжелым поражением APN.
[0075] Поражение почки в случае APN в основном вызвано воспалительным процессом, ассоциированным с инфекцией, а не
прямым воздействием самих бактерий на почку (Bennett et al. (1999) J. Urol. 161:1681-1684); Haraoka et al. (1994) J. Urol. 151:1078-1080); Imamoglu et al. (2006) Urology 67:1315-1319). Бактериальная инвазия в почку организма-хозяина запускает систему врожденной иммунной защиты. После распознавания бактерий сигнал, создаваемый Toll-подобным рецептором (Shirali and Goldstein, (2008) J. Am. Soc. Nephrol. 19:1444-1450), инициирует иммунный ответ, вовлекающий ядерный фактор кВ и продукцию цитокинов и хемокинов (Li et al. (2 002) Respir. Res. 3:23; Ragnarsdottir et al. (2008) Eur. J. Clin. Invest. 38(Suppl.) 2:12-20; Tullus et al. (1997) Acta Paediatr. 86:1198-1202).
[0076] Было показано, что в среде с культурой лейкоцитов, взятых от крыс с пиелонефритом, со временем повышается уровень TNFa, и что сама эта среда может вызвать окислительный стресс в клетках почки. Как в случае in vitro модели, так и в случае экспериментальной модели APN, отмечалось значительное повышение уровня toll-рецепторов в клетках почки и в лейкоцитах. Применение МТА, SkQRl, приводило к нормализации экспрессии этих рецепторов в разных зонах почки, активированных за счет APN. Кроме того, начало развития APN ассоциировано с активацией провоспалительных сигнальных путей в периферических лейкоцитах. Тогда как эта активация подавлялась у крыс, которым давали SkQRl.
[0077] На фиг. 11 проиллюстрирована модель патологических событий, происходящих в клетках почки и вокруг них при пиелонефрите. Эта модель поясняет возникновение повреждения в пораженных воспалением клетках и их гибель. Один из элементов в этой модели относится к роли митохондриальных ROS на всех стадиях развития патологического процесса. На большей части патологических (промежуточных) стадий, сигналы, связанные с гибелью клеток и выживанием, имеют отношение к функции митохондрий, и МТА представляют собой средства против пиелонефрита с высокой эффективностью, которые позволяют предотвратить сморщивание почек и их дисфункцию, в тех случаях,
когда непосредственное антибактериальное лечение ограничено (в случае детей, беременных женщин, лиц с первичным иммунодефицитом и др.) или неэффективно (в случае резистентных к антибиотикам бактериальных штаммов).
[0078] Защита организма-хозяина от инфекции может быть достигнута за счет активности механизмов резистентности и толерантности (Medzhitov et al. (2012) Science 335:936-941) . В настоящем исследовании (см., например, пример 1) показано, что митохондриальные ROS вносят важный вклад в повреждение ткани, вызванное воспалением, и что целенаправленное воздействие на митохондриальные ROS может повысить уровень выживаемости организма-хозяина в случае бактериальных инфекций, которые в ином варианте были бы летальными для этого организма.
Эффект МТА на проницаемость кровеносных сосудов [0079] Как показано в примере 2, лечение с использованием SkQl предотвращало разобщение контактов среди эндотелиальных клеток, вызванное применением высоких количеств глюкозы. Это выявлялось по содержанию VE-кадгерина при проведении анализа по методу иммуноблоттинга. Контакты эндотелиальных клеток по типу клетка-клетка легко нарушаются при разного рода патологических состояниях, включающих диабет, травмы, сепсис и другие воспалительные заболевания. Это ведет к повышению проницаемости кровеносных сосудов и может даже вызвать угрожающее для жизни состояние, поэтому в таких случаях следует снижать проницаемость сосудов. Было показано, что SkQl действует эффективно в направлении защиты эндотелиальных клеток и сосудов от воздействия высоких количеств глюкозы и от воспалительных цитокинов, присутствующих в кровотоке, и в этой связи SkQl полезен для профилактики и лечения патологических состояний, вызванных расстройствами в метаболизме глюкозы, включающими диабет и гипергликемию, сепсис, травму, а также хронические и острые воспалительные заболевания.
Эффект МТА на активацию нейтрофилов
[008 0] В примере 2 также показано, что применение для лечения SkQl предотвращает активацию нейтрофилов человека, вызванную fMet-Leu-Phe, который представляет собой аналог
бактериального продукта (что было показано путем зимографического анализа). Этот результат был неожиданным, поскольку нейтрофилы человека содержат малые количества митохондрий, которые к тому же характеризуются очень низкой метаболической активностью.
[0081] Нейтрофилы человека активируются компонентами
патогенов и разрушенных клеток человека, а также
провоспалительными цитокинами. ММР-9 представляет собой
металлопротеиназу, высвобождаемую из активированных
нейтрофилов. Избыточная активация нейтрофилов ведет к массивному повреждению тканей. Известно, что активированный ММР-9 вовлекается в патогенез бронхиальной астмы и хронического обструктивного заболевания легких (Takafuji et al. (2003) J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 13:50-55), ишемии (Gidday et al. (2005) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289:558-568), острого расслоения аорты (Kurihara et al. (2012) Circulation. 126:3070-3080), почечной болезни, травмы, сепсиса, воспаления и многих других заболеваний и патологических состояний, которые сопровождаются перестройкой ткани.
[0082] Представленные здесь данные указывают на повреждение тканей, ассоциированное с высвобождением ММР-9 из активированных нейтрофилов человека. Было показано, что SkQl эффективен в направлении защиты тканей человека от ММР-9-опосредованного повреждения и повреждения, вызванного патогенами и/или воспалительными цитокинами. Таким образом, SkQl может применяться с целью профилактики и лечения бронхиальной астмы, хронического обструктивного заболевания легких, ишемии, острого расслоения аорты, почечной болезни, травмы, сепсиса и других воспалительных заболеваний.
Эффект МТА, показанный на других моделях воспаления
[0083] Протективный эффект МТА был также показан на модели гепатита (пример 4) и на модели панкреатита (пример 5).
[0084] Далее будут приведены конкретные примеры, иллюстрирующие и поясняющие настоящее изобретение. Следует, однако, понимать, что указанные ниже примеры даны лишь с тем, чтобы проиллюстрировать некоторые варианты осуществления
настоящего изобретения, но они не направлены ни в коей мере на ограничение области настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Протективный эффект МТА, показанный на модели острого пиелонефрита
А. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
1. Первичная культура клеток почки крысы
[0085] Отбирали в асептических условиях почки от крыс 1-3-дневного возраста. Ткань измельчали и разрушали путем обработки коллагеназой (0,5%, 30 мин при температуре 37°С). Полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 50 д. Осадок ресуспендировали примерно в 10 мл среды DMEM/F12 (Gibco, USA) с добавкой 10% ФСТ (Gibco, США) и выдерживали 2 мин, после чего супернатант переносили в другую пробирку и осадок повторно ресуспендировали. Через 10 минут почечные канальцы осаждали центрифугированием, а диссоциированные клетки, остававшиеся в суспензии, удаляли. Указанные гранулы суспендировали в среде DMEM/F12 с добавкой 10% ФСТ и высевали в 24-ячеечные планшеты или на покровные стекла, помещенные в 35-мм чашки Петри со стеклянным дном.
2. Культивирование бактерий
[0086] Штамм Е. coli No. 85 культивировали в течение ночи в среде для культивирования, содержащей 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 1% NaCl (Sigma-Aldrich, США) . Среду, содержащую около 109 колониеобразующих единиц (КОЕ (CFU)) на мл, центрифугировали со скоростью 300 g в течение 3 мин. Бактериальный лизат получали при разбавлении 3 0 мл ночной культуры (ON), и с этой целью осадок разводили в 3 мл 0,9% NaCl, после чего все автоклавировали в течение 1,5 час при температуре 12 0°С.
3. Получение лейкоцитов из периферической крови
[0087] Тщательно наносили в виде слоя 5 мл гепаринизированной крови, взятой из яремной вены взрослых самцов крыс, на 5 мл Ficoll-Urografin (плотность 1,077 г/см3),
и далее проводили центрифугирование в течение 3 0 мин при 2 00 д. Эта процедура приводила к осаждению эритроцитов, тогда как мононуклеарная фракция лейкоцитов формировала межфазное кольцо на поверхности фиколла (Ficoll), которое осторожно отбирали. Полученные таким образом лейкоциты переносили в другую пробирку и центрифугировали в течение 3 мин при 2 00 д. Образующийся осадок ресуспендировали в 5 мл среды DMEM/F12. После подсчета числа клеток в гемоцитометре, указанные клетки разбавляли до конечной концентрации примерно 1x105 клеток на мл.
[008 8] Для получения нейтрофилов переносили
соответствующую фракцию из градиента, полученного на фиколле (Ficoll), в другую пробирку и смешивали с 10 мл среды DMEM/F12, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 2 00 д. Полученный в итоге осадок, содержащий нейтрофилы, ресуспендировали в 5 мл среды DMEM/F12, подсчитывали число клеток и далее разбавляли их до уровня 1х105 клеток на мл.
[008 9] Применяли такую же процедуру для получения лейкоцитов из мышей GFP.
4. Модель воспаления in vitro
[0090] В двухдневной культуре клеток почки культуральную среду заменяли средой DMEM/F12 (4 00 мкл на ячейку, 160 0 мкл на чашку Петри), с добавлением (в зависимости от цели): GSK-3P ингибитора LiCl (9 мМ) (Sigma-Aldrich, США) , водорастворимого антиоксиданта Тролокс (Trolox) (50 мкМ, 100 мкМ) (Sigma-Aldrich, США), МТА 10-(б-пластохинонил)децил-трифенилфосфония
(SkQl), синтезированного по методу Antonenko et al. (2008) Biochemistry (Mosc) 73:1273-87), 10 нМ, 100 нМ) и 10- (б'-пластохинонил)децилродамина 19 SkQRl), синтезированного по методу Antonenko (2 008) (1 нМ, 10 нМ или 100 нМ) . Клетки почки инкубировали в этой среде в течение 2 часов, с последующим добавлением в нее лейкоцитов или нейтрофилов в среде DMEM/F12 или только одной среды DMEM/F12, в случае контрольного образца
(4 00 мкл на ячейку, 160 0 мкл на чашку Петри) . Одновременно добавляли бактериальный лизат или раствор липополисахарида (100 нг/мл, ЛПС (LPS), Sigma-Aldrich, США) в среде DMEM/F12 или одну
только среду DMEM/F12, в случае контрольного образца (100 мкл на ячейку, 4 00 мкл на чашку Петри). Клетки почки и лейкоциты (нейтрофилы) культивировали вместе в течение 24 или 48 часов с бактериальным лизатом или ЛПС (LPS). Оценивали уровень погибших клеток (от некроза и апоптоза) с использованием набора Annexin-V FITC (Invitrogen, США).
5. In vivo модель APN на крысах
[0091] В данном примере использовали экспериментальную in vivo модель APN, где бактерии вводили в мочевой пузырь крысы (Gupta et al. (1995) J. Med. Microbiol. 43:33-36). Эксперименты проводили на самках нелинейных белых крыс (180-200 г), которых не ограничивали в пище, ad libitum. Использовали протоколы испытаний на животных, утвержденные соответствующими Институциональными наблюдательными советами (Institutional Review Boards). Крыс анестезировали с использованием хлоралгидрата (300 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б)). Далее, животных инфицировали через интрауретральный путь с использованием мягкого непроницаемого для излучения полиэтиленового катетера Intramedic (Clay Adams, США). Инокулят (5 мл на кг, 1x10 КОЕ/мл содержащих бактерии фекалий крысы) инъецировали медленно, с тем чтобы устранить возможность подтекания в мочевой пузырь. Контрольным животным не проводили инъекций. Использовали следующий терапевтический протокол, включающий SkQRl, для лечения этой патологии: в/б инъекция SkQRl (100 нмоль/кг веса тела) через 1 час после инъекции бактерий, с последующими инъекциями такого же количества SkQRl через 12, 24, 36 и 48 часов; при этом, в целом, каждое животное получало по 50 0 нмоль SkQRl на кг.
[0092] На второй день после инъекции отбирали образцы крови и удаляли почки для выделения из них митохондрий, определения уровня малондиальдегида (MDA) в ткани, проведения вестерн-блоттинга и гистопатологического исследования.
[0093] Митохондрии из почек выделяли путем гомогенизации и последующего дифференциального центрифугирования в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES-KOH, 1 мМ ЭГТА и 0,1%
БСА, рН7,4. Белок, содержащийся в митохондриях, определяли с использованием набора для анализа белка с бицинхониновой кислотой (Sigma-Aldrich, США) . Митохондрии из культуры клеток почки выделяли по указанному выше протоколу.
6. Определение уровня ROS, NO, MDA и TNFa
[0094] Чувствительный на R0S флуоресцентный зонд 2,7-DCF-DA (Molecular Probes, США), растворенный в среде DMEM/F12, не содержащей бикарбоната (конечная концентрация 10 пМ), добавляли к клеткам почки (500 мкл на ячейку 24-ячеечного планшета, 2 мл на чашку Петри) и инкубировали в течение 15 мин при температуре 37°С, с последующей промывкой средой DMEM/F12 без карбоната. Малондиальдегид (MDA) определяли по описанной в литературе процедуре (Mihara and Uchiyama (1978) Anal. Biochem. 86:271-8). Другой флуоресцентный зонд, DAF-2-DA (Calbiochem, San Diego, CA, США) , использовали для определения уровня NO в живых клетках. Использовали ту же процедуру, что и в случае 2,7-DCF-DA. Концентрацию нитрита/нитрата (как продуктов окисления N0) в культуральной среде определяли с использованием набора для анализа нитрита/нитрата (Nitrite/Nitrate Assay Kit (Sigma-Aldrich, США)). Уровень TNFa определяли с использованием набора для анализа TNFa у крыс по методу ИФТФА (ELISA Ready-SET-Go (Ebioscience, CIA)).
7. Конфокальная и сканирующая электронная микроскопия [0095] Клетки почки рассматривали с использованием
инвертированного конфокального микроскопа FSM510 (Carl Zeiss Inc., Jena, Германия), с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны эмиссии в диапазоне 500 нм-530 нм с диаметром диафрагмы 150 пм. Изображения обрабатывали с использованием пакета программного обеспечения ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, США).
[0096] Для проведения сканирующей электронной микроскопии, клетки почки и бактерии фиксировали с использованием 2,5% глутаральдегида в буфере Хенкса, не содержащем ионы Са2+ и Мд2+, с добавлением 5 мМ ЭДТА, 5 мМ фенилметилсульфонилфторида и 10 мМ HEPES, при рН 7,3. Далее, клетки подвергали следующей стадии
фиксации с использованием 1% тетроксида осмия в 0,1 М какодилате натрия с добавкой 0,1 М сахарозы, при рН 7,3 (без замены буфера, содержащего глутаральдегид), дегидратировали с помощью серии обработок ацетоном, затем проводили сушку в критической точке с использованием жидкого СОг в качестве переходной жидкости в аппарате Balzers, наносили методом напыления слой золота-палладия и рассматривали в сканирующем электронном микроскопе Camscan S-2 или JSM-6380 при 15 кВ.
8. Гистологический анализ почки и оценка степени
воспалительного поражения ткани
[0097] Почку отбирали сразу же после умерщвления животного и вносили ее в охлажденный льдом ФБР. Далее, полученную почку фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина, погружали в парафин и использовали для гистопатологического анализа. Срезы толщиной пять микрометров нарезали, депарафинировали, гидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы почки анализировали в режиме слепой пробы на наличие воспаления и лейкоцитарную инфильтрацию в почки у всех животных, которых подвергали лечению. Изучали минимум 10 полей зрения для каждого слайда с почечным образцом и оценивали тяжесть наблюдаемой патологии.
[0098] Оценивали выраженность индикаторов воспаления (т.е., количество проникших лейкоцитов в каждом слое и наличие абсцессов) при APN с использованием указанной ниже шкалы оценок:
0: нет; 1: 5-50 лейкоцитов в поле зрения; 3: > 100 в поле зрения; 4: абсцессы с гнойно-некротическим содержимым. Распределение воспалительных изменений (т.е., сравнительный анализ инфильтрации и абсцессов) оценивали с использованием следующих критериев: 0: нет ни в одном слое; 1: инфильтрация в медуллярном слое; 2: инфильтрация, достигающая коркового слоя.
9. Тест на миелопероксидазную активность
[0099] Гомогенаты почки для определения МРО
центрифугировали при 2 0000 g в течение 15 мин, осадок ресуспендировали в 50 мМ К-фосфатного буфера, содержащего 0,5% СТАВ. Далее, полученные образцы подвергали три раза процедуре
замораживания и оттаивания и затем центрифугировали при 10600 g в течение 10 мин. В супернатантах оценивали активность МРО при проведении хромогенной реакции с о-фенилендиамином (ОФД (OPD)). Смешивали 100 мкл образца с субстратным буфером (25 мМ Na-цитрат, 50 мМ Na-фосфат, 0,45 мг/мл ОФД, 0,1% Н202, рН 5,0) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре и затем определяли ОП при 4 92 нм.
10. Иммуноцитохимия
[0100] Клетки и почечные срезы промывали в ФБР, фиксировали в течение 3 0 мин в 4% формальдегиде с ФБР при температуре 4°С и пермеабилизировали в ФБР, содержащем 0,02%
Тритона Х-100, в течение 60 мин при температуре 4°С (0,5 мл на ячейку, 5 мл на срез) , после чего блокировали в ФБР с добавкой 0,5% бычьего сывороточного альбумина (ФБР-БСА) в течение 60 мин при комнатной температуре (0,5 мл на ячейку, 2 мл на срез) . После трех 15-минутных промываний в ФБР-БСА, клетки инкубировали в течение 1 часа с вторичным антителом, разбавленным в соотношении 1:200 (FITC-конъюгированный антикроличий IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories, США) . Промывали почечные срезы и покровные стекла с иммобилизованными клетками, помещали их на столик микроскопа с заливочной средой и закрепляли под покровными стеклами. Изображения в конфокальном микроскопе обрабатывали с использованием программного обеспечения ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, США) .
11. Анализ по методу вестерн-блоттинга
[0101] Образцы почечных гомогенатов наносили на 15% Трис-глицин-полиакриламидные гели (10-2 0 мкг суммарного белка на линию). После проведения электрофореза гели переносили методом блоттинга на ПВДХ (PVDF) мембраны (Amersham Pharmacia Biotech, UK). Мембраны блокировали с использованием 5% (вес/объем) нежирного молока в ФБР с содержанием 0,1% объемн. Твина 2 0 и затем инкубировали с подходящими первичными антителами. После этого мембраны обрабатывали соответствующими антимышиными или антикроличьими вторичными антителами. Конкретные полосы
визуализировали с использованием набора для вестерн-блоттинга (ECL Plus Western blotting kit (Amersham Pharmacia Biotech, UK)). После сканирования определяли плотность полученного окрашивания для каждой полосы с использованием программного обеспечения ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, США). 11. Статистический анализ
[0102] Все эксперименты проводили по меньшей мере с трехкратным повтором. Все данные представлены в виде среднего значения ± СКО. Сравнения между группами делали с использованием t-критерия Стьюдента, и значение Р менее 0,05 рассматривалось как указание на статистическую значимость результата.
В. РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Эффект МТА SkQRl на окислительный стресс в ткани, индуцированный APN
[0103] На модели APN было исследовано множество симптомов воспаления и окислительного повреждения ткани (фиг 1А-1С). В почках мышей с пиелонефритом (фиг. 1В) отмечалось образование большого числа абсцессов, что в значительно меньшей степени выявлялось у крыс, которых лечили с использованием SkQRl (фиг. 1С). Наблюдалась обширная инфильтрация лейкоцитов в почках (фиг. 2 и 3) . Интерстициальные инфильтраты были иногда локальными, но зачастую покрывали значительную часть паренхимы почки и возникали исключительно из проникших в нее полиморфноядерных лейкоцитов (нейтрофилов). В некоторых очагах инфильтраты захватывали также кровеносные сосуды. Серьезные и характерные изменения выявлялись также в почечных канальцах: они набухали, их клетки дегенерировали и часто выделялись в просвет канальцев. Зачастую, при этом, канальцы наполнялись гнойно-некротическим и бактериальным содержимым. Патологические изменения наблюдались в основном, и в большей мере, в медуллярной части почки (фиг. 2-4). Клубочковые и кортикальные канальцы в большинстве случаев оставались относительно интактными. Важно отметить, что лечение с использованием SkQRl подавляло как лейкоцитарную инфильтрацию во всех слоях почки,
так и распространение воспалительного процесса (фиг. 2-4).
[0104] Концентрация гидроперекисных продуктов, таких как малондиальдегид (MDA), которая рассматривается как показатель окислительного стресса в тканях всей почки, повышалась после индукции APN (фиг. 5А) , указывая на выраженное окислительное повреждение ткани. Тогда как концентрация MDA была значительно ниже у животных, которым давали SkQRl (фиг. 5А) , что указывало на защиту почечной ткани от окислительного стресса, созданную антиоксидантом, направленным на митохондрии.
[0105] Тканевая активность миелопероксидазы (МРО), как показатель инфильтрации нейтрофилов, серьезно возраста в почках, пораженных пиелонефритом, но снова в значительной мере подавлялась у крыс, которых лечили с использованием SkQRl (фиг. 5В) .
2. Окислительный и нитрозативный стресс и гибель клеток
почки
[0106] Опосредованный митохондриями окислительный стресс изучали на клеточной модели пиелонефрита, где проводили совместное культивирование почечноканальцевых клеток (RTC) с антигенами (лейкоциты, активированные бактериальным лизатом). При использовании этой модели было показано, что идет значительно более выраженный флуоресцентный сигнал от DCF, что указывало на опосредованную участием антигена продукцию ROS
(фиг. 6В), в отличие от контролей (фиг. 6А) . Конкретно, уровень ROS был примерно в 5 раз выше, чем в контрольных
(необработанных) клетках, что согласуется с предположением, согласно которому инициация окислительного стресса в почечных клетках опосредована участием активированных лейкоцитов. Неактивированные лейкоциты также вызывали усиление продукции ROS в клетках RTC (данные не показаны) , но эти показатели были почти в два раза ниже, чем в случае активированных лейкоцитов; это можно объяснить возможной активацией лейкоцитов в процессе их получения. При использовании конфокальной микроскопии было подтверждено, что усиленный ROS сигнал, выявляемый в совместной культуре активированных лейкоцитов и почечных клеток, идет в основном от почечных клеток (фиг. 6В).
[0107] В основном, для стимуляции лейкоцитов используется чистый ЛПС, выделенный из клеточной стенки бактерий (Sakaguchi et al. (2007) Int. Immunopharmacol. 7:191-197) . В этой связи проводили сравнение эффектов ЛПС и бактериального лизата. Использование ЛПС также вызывало активацию лейкоцитов и повышало уровень ROS в почечных клетках (фиг. 7А) . Конкретно, ЛПС в концентрации 100 нг/мл оказывал такой же эффект, как это наблюдалось в варианте с бактериальным лизатом. Однако утилизация бактериального лизата более приемлема с точки зрения имитации условий in vivo после инициации пиелонефрита. Бактериальные лизаты, как было показано, были более эффективны, чем выделенные из бактерий растворимые продукты, в направлении индукции активированного фенотипа в дендритных клетках человека. Как было показано в приведенных в настоящем описании экспериментах со специфическим ингибитором НАДФН оксидазы, дифениленйодонием (DPI) (0,5 мкМ) (Morandi et al. (2011) Immunol. Lett. 138:8 6-91), указанный фермент отвечает за первичную и/или вторичную продукцию ROS в системе, поскольку DPI ингибировал продукцию ROS внутри почечных клеток (фиг. 7А).
[0108] Для предотвращения окислительного стресса в
почечных клетках, а также для снижения показателей гибели
клеток использовали три лекарственных средства с мощной
антиокислительной активностью: Тролокс (Trolox),
водорастворимый аналог витамина Е и МТА - SkQl и SkQRl. Обработка с использованием каждого из этих средств приводила к резкому снижению уровней продукции ROS в почечных клетках (фиг. 7А). Предварительная обработка почечных клеток, с использованием 10 нМ SkQl, 10 нМ SkQRl или 100 мкМ Тролокса
(Trolox), в течение 2 часов приводила к подавлению продукции
ROS после их совместного культивирования с активированными
лейкоцитами, до уровней, близких к показателям, наблюдаемым в
контролях. Аналогично, предварительная обработка с
использованием LiCl также оказывала антиоксидантный эффект
(фиг. 7А).
[0109] В дополнение к эффекту, связанному с уровнем ROS, лейкоциты, активированные антигеном, могут продуцировать
значительные количества N0. После инкубации почечных клеток с лейкоцитами и бактериальным лизатом в течение 24 часов, уровень нитрата/нитрита (основных продуктов окисления N0) в среде вырастал более чем в 5 раз в сравнении с контролями (фиг. 7В) . Однако эффект активации лейкоцитов на продукцию N0 в почечных клетках, при оценке его по уровню флуоресцении DAF-2, представлялся менее выраженным (фиг. 7С). Нитрозативный стресс продемонстрировал менее выраженную реакцию в ответ на активацию лейкоцитов, чем окислительный стресс. Тем не менее, предварительная инкубация с тремя различными, указанными выше лекарственными средствами выявила некоторую супрессию в накоплении нитрата/нитрита (фиг. 7В).
[ОНО] В рамках описываемой здесь клеточной модели пиелонефрита, значительная гибель почечных клеток наблюдалась после их 4 8-часовой экспозиции с активированными лейкоцитами
(более 10% почечных клеток становились Annexin V-положительными). Преинкубация с тремя разными, указанными выше лекарственными средствами оказывала протективный эффект, при этом наибольшая эффективность была показана при использовании SkQRl (фиг. 7D). Сравнение протективных эффектов SkQRl и Тролокса (Trolox) на уровень окислительного стресса (фиг. 7А) и на показатели гибели клеток (фиг. 7А) продемонстрировало четкое различие между этими соединениями. В частности, МТА продемонстрировал самую высокую эффективность с точки зрения защиты почечных клеток от гибели. Аналогично, LiCl также защищал почечные клетки от гибели, и его эффект был более выраженным, чем эффект Тролокса (Trolox).
3. Эффект TNF на окислительный стресс в почке [0111] Бактериальный лизат индуцировал устойчивую продукцию TNF лейкоцитами (фиг. 12А) . Интересно отметить, что высвобождение TNF в среду было еще выше после совместного культивирования активированных лейкоцитов с почечными клетками
(фиг. 13А) , что указывает на роль взаимодействия между почечными клетками и лейкоцитами в индукции воспаления. Тролокс
(Trolox), LiCl и SkQRl не оказывали значимого эффекта на высвобождение TNF в совместной культуре RTC-лейкоцитов.
[0112] Затем следовало выяснить, мог ли высвобожденный TNF, сам по себе, оказать эффект на почечные клетки за счет индукции окислительного стресса. С этой целью среду, в которой лейкоциты обрабатывали бактериальным лизатом, центрифугировали и добавляли к почечным клеткам. Было показано, что содержащая TNF среда повышает уровень ROS в почечных клетках, хотя и в меньшей степени, чем это наблюдалось после совместного культивирования почечных клеток с активированными лейкоцитами (см. для сравнения фиг. 7А и фиг. 13В). Таким образом, следовало отметить, что непосредственное взаимодействие почечных клеток и культивируемых вместе с ними лейкоцитов играет важную роль в индукции окислительного стресса в почечных клетках.
4. Окислительный стресс и изменения в лейкоцитах крови [0113] Как было показано на in vivo модели APN, число лейкоцитов в крови через 3 дня после инфекции возрастало в два раза в сравнении с контрольным уровнем (фиг. 8А) . Предварительная обработка с использованием SkQRl предотвращала повышение уровня лейкоцитов (фиг. 8А). При этом лейкоцитоз коррелировал с нейтрофилией (уровень нейтрофилов был в три раза выше, фиг. 8В). Повышение концентрации лейкоцитов было связано, прежде всего, с увеличением доли нейтрофилов, поскольку их число возрастало почти в 5 раз (фиг. 8F) . Число нейтрофилов спонтанно снижалось на 7-ой день после индукции пиелонефрита у животных во всех группах. Число моноцитов было также выше у крыс с пиелонефритом (фиг. 8С), тогда как содержание лимфоцитов в крови было близким у животных во всех трех группах (фиг. 8D). На 3-ий день после индукции пиелонефрита, животным вводили внутрибрюшинно SkQl (100 ммоль/кг). При этом было показано, что эффекты APN подавлялись у тех крыс, которым вводили SkQRl, что приводило в целом к устранению лейкоцитоза и ослаблению других маркеров воспаления (фиг. 8А-8С), включая, в том числе, снижение концентрации нейтрофилов, которая уже на 7-ой день снижалась в два раза (фиг. 8F) , в сравнении с этим показателем у животных, которым не вводили SkQl. Таким образом, лечение с использованием SkQl значительно снижало концентрацию лейкоцитов
в крови исследуемых животных на 7-ой день от начала заболевания.
[0114] Кроме того, наблюдалось также воспаление в почечной ткани. В частности, значительно возрастала активность МРО, которая представляет собой нейтрофильный фермент, продуцирующий гипохлорит в процессе развития антибактериального ответа организма. МРО представляет собой основной фермент, отвечающий за инфильтрацию нейтрофилов и за развитие окислительного взрыва в воспаленной ткани. На 7-ой день развития пиелонефрита указанная энзиматическая активность в почечной ткани была примерно в 5 раз выше, чем в почках у здоровых животных (фиг. 8G) . Внутрибрюшинное введение SkQl на третий день после индукции пиелонефрита приводило к значительному подавлению воспаления в почечной ткани, что следовало из снижения активности МРО.
[0115] Зависимая от окислительного стресса вредная тенденция, обнаруженная в почечной ткани при остром пиелонефрите, в рамках исследования на модели in vivo, была подтверждена при анализе лейкоцитов крови. В дополнение к высокому уровню MDA продуктов в ткани почки, пораженной пиелонефритом (фиг. 5А) , было показано, что лейкоциты, взятые от крыс с APN, также характеризовались высоким уровнем R0S. Конкретно, анализ по методу проточной цитометрии показал, что средняя интенсивность флуоресценции DCF в популяции лейкоцитов, взятых от крыс с пиелонефритом, была почти в два раза выше, чем у контрольных животных (фиг. 9А, 9В). У больных животных лейкоциты находятся в более активированном состоянии. Фактически, добавление лейкоцитарных клеток, взятых от крыс с пиелонефритом, к культуре почечных клеток вызывало намного более выраженный окислительный стресс в почечных клетках, чем это наблюдалось при их совместном культивировании с лейкоцитами, взятыми от здоровых животных.
[0116] Поскольку МТА продемонстрировали высокую эффективность в направлении предотвращения окислительного стресса на модели пиелонефрита in vitro, была исследована их активность у крыс при APN, в рамках модели in vivo. Продукция
ROS, определяемая по флуоресценции DCF, при ее оценке в лейкоцитах, взятых от крыс с пиелонефритом, которым вводили SkQRl, была ниже, чем у животных, которых не лечили указанным средством (фиг. 9A-9D).
[0117] Аналогично, было показано, что предварительное лечение, проводимое с использованием SkQRl, снижает в почечной
ткани концентрацию TNFa, который выполняет важную роль в воспалительной реакции (Sanchez-Nino el al. (2010) Mediators Inflamm.). Конкретно, тогда как в рамках рассматриваемой модели APN уровень TNFa был в два раза выше, чем у контрольных животных, его уровень в почечной ткани у крыс с пиелонефритом, которым вводили для лечения SkQRl, был ниже, чем у крыс с APN, но которым не вводили SkQRl (фиг. 8Е). Активация продукции TNFa в лейкоцитах может быть опосредована NF-кВ-зависимым механизмом, поскольку уровень 1кВ в этих клетках ниже в случае крыс с нелеченным пиелонефритом, но не у крыс, которым вводили для лечения SkQRl (фиг. 14А).
5. Изменения в антиапоптозном Вс1-2 в ткани почки при пиелонефрите
[0118] ЗС1-2 представляет собой антиапоптозный (способствующий выживанию) белок, найденный в митохондриях, уровень которого падает во время окислительного стресса. Подавление Вс1-2 может индуцировать сниженную толерантность в связи с изменением проницаемости митохондрий в ответ на действие ROS, что ведет к росту уровня гибели клеток.
[0119] Оценивали баланс между апоптозной и антиапоптозной
активностью при пиелонефрите, имея в виду в качестве цели
ограничение окислительного стресса и его последствий в ткани
почки, пораженной пилоенефритом, что можно рассматривать в
контексте разработки защитной стратегии. Уровень
антиапоптозного белка Вс1-2 в канальцевых клетках почки снижался, в рамках рассматриваемой in vivo модели APN. В суммарных гомогенатах почки наблюдался существенно сниженный уровень Вс1-2 при индукции пиелонефрита, что отсутствовало в случае крыс с пиелонефритом, которым вводили SkQRl (фиг. 10А и
ЮС). К тому же, содержание Вс1-2 в митохондриях, выделенных из почек животных с пиелонефритом, было в 1,5 раза ниже, чем в контрольных митохондриях (фиг. 10А, ЮС) . При этом, дополнительно к ослаблению полосы для Вс1-2 со значением 2 6 кДа, наблюдалась пропорционально усиленная полоса для 15 кДа, которая положительно окрашивалась на Вс1-2 (фиг. 10В и 10D), что предположительно указывало на расщепление Вс1-2 в условиях пиелонефрита. Эти изменения уменьшались после лечения с использованием SkQRl (фиг. 10В, 10D) . Таким образом, можно сделать вывод, что пиелонефрит, сопровождаемый окислительным стрессом, вызывает существенное подавление уровней анти-апоптозного белка Вс1-2 в митохондриях, и этот эффект зависит от SkQRl.
6. Роль межклеточных контактов лейкоцитов и почечных клеток
[0120] Дополнительно исследовали морфологию совместно культивируемых клеток с помощью сканирующего электронного микроскопа. Почечные клетки характеризовались морфологией, типичной для эпителиальных клеток, которая в условиях рассматриваемого эксперимента выглядела как полумонослойная. После 24-часового культивирования вместе с фракцией белых клеток крови, было обнаружено, что некоторые лейкоцитарные клетки (моноциты согласно их морфологии) прикрепляются к почечным клеткам (фиг. 15В) . Было похоже, что эти моноциты прикрепляются либо к бесклеточному пластику, либо непосредственно к почечной клетке. В проведенном ранее исследовании было показано, с использованием рассматриваемого здесь метода, что имеет место взаимодействие лейкоцитов с поврежденными эндотелиальными клетками (Galkina el al. (2004) Med. Sci. Monit. 10:BR307-31б) . Как было показано в рамках используемой здесь модели пиелонефрита, происходит аналогичное взаимодействие. Тот факт, что высвобождение TNF возрастает после совместного культивирования с почечными клетками, который был продемонстрирован в чистой культуре активированных лейкоцитов (фиг. 14), указывает, предположительно, на вклад зависимой от непосредственного контакта клеточной коммуникации
между лейкоцитами и почечными клетками. Более того, активированные лейкоциты быстро погибали, и уровень гибели был в 5 раз ниже в условиях совместной культуры (фиг. 16).
[0121] Эксперименты, проведенные с индивидуальными лейкоцитами (LC) и почечными клетками (RTC), предоставили дополнительные данные, подтверждающие идею о необходимости непосредственного контакта двух указанных видов клеток для модуляции провоспалительной реакции и гибели клеток. В другой группе экспериментов клетки из совместной культуры разделяли на пористой ПЭТ (PET) мембране с размером пор 0,4 мкм (вставка клеточной культуры, SPL Lifesciences) , которая позволяет осуществлять коммуникацию через обмен диффундирующих соединений, но препятствует непосредственному контакту между клетками. В этой системе высвобождение TNF снижалось в сравнении с неограниченной в пространственном отношении совместной культурой (Таблица 1).
7. Выживаемость животных с острым пиелонефритом [0122] В рамках используемой в данном исследовании in vivo модели APN, показатель уровня смертности крыс был значительным из-за развития сепсиса (Giamarellos-Bourboulis et al. (2006) Shock 26:410-416). Примечателен тот факт, что использование для
лечения SkQRl уже в течение двух дней после инфекции приводило к заметному повышению показателя выживаемости животных (фиг. 10). Эти результаты указывают на то, что продукция митохондриальных ROS играет важнейшую роль в развитии APN-индуцированного повреждения почки и дальнейшей гибели в результате сепсиса. ПРИМЕР 2
Эффект SkQl на повреждение эндотелия
[0123] В данном эксперименте было показано, что в ходе воспалительного процесса и/или диабета возникает повреждение эндотелия.
[0124] Известно, что высокий уровень глюкозы и/или воспалительных цитокинов вызывает разобщение контактов эндотелиальных клеток через расщепление VE-кадгерина, что в сочетании с усиленным окислительным стрессом и воспалением сосудов ведет к дисфункции эндотелия и даже к полиорганной недостаточности.
[0125] Использовали линию эндотелиальных клеток человека EA.hy926 (АТСС Collection; номер в каталоге CRL-2922) в качестве модели повреждения эндотелия сосудов, которое происходит в ходе воспалительного процесса и/или при диабете. Эта клеточная линия аналогична первичной клеточной линии HUVEC (Edgell et al. (1983) PNAS, 80 (12): 3734-7; Edgell et al. (1990j_ In Vitro Cell Dev. Biol., 26(12) : 1167-72) и широко используется в качестве удобной и релевантной модели при исследовании процессов воспаления (Riesbeck et al. (1998) Clin. Vaccine Immunol., 5:5675-682).
[0126] Соответственно, линию эндотелиальных клеток человека EA.hy92 6 предварительно инкубировали с 2 нМ и 2 0 нМ раствора SkQl в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)) с добавкой 10% фетальной сыворотки (пример 1) в течение 4 дней. Далее, клетки инкубировали в течение 2 дней в среде DMEM, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 мМ D-глюкозы. После этого клетки инкубировали в течение 2 дней с 4 5 мМ D-глюкозы и затем
использовали для иммуноблоттинга с целью детекции VE-кадгерина.
[0127] Полученные в этом тесте результаты представлены в виде среднего значения по меньшей мере для 3 отдельных экспериментов. Как показано на фиг. 17, SkQl препятствует отрицательной регуляции VE-кадгерина, вызванной высоким уровнем глюкозы, в сравнении с контрольным вариантом, где использован носитель, но без SkQE. Таким образом, SkQl, как было показано, является эффективным соединением, защищающим эндотелиальные клетки от действия воспалительных цитокинов, и может использоваться для профилактики и лечения патологических состояний, вызванных расстройствами метаболизма глюкозы, включающими диабет и гипергликемию, сепсис, травму, а также хронические и острые воспалительные заболевания. ПРИМЕР 3
Эффект SkQl на повреждение ткани
[0128] Использовали нейтрофилы человека в качестве модельной системы повреждения ткани, возникающей в ходе воспалительного процесса и/или при травме.
[0129] Нейтрофилы человека выделяли из антикоагулированной крови здоровых доноров. Нейтрофилы инкубировали предварительно с 0,2 нМ, 2 нМ, 20 нМ, 200 нМ и 500 нМ раствора SkQl в среде RPMI-1640 с добавкой 10% фетальной сыворотки в течение 5 часов
при температуре 37°С в атмосфере 5% С02. Далее, клетки стимулировали с использованием 1 нМ N-формил-метионин-лейцин-фениламина (f-MLP) в течение 3 0 мин. Супернатанты, полученные на основе этих клеток, использовали для детектирования активности ММР-9 по методу зимографии (высвобождение ММР-9 рассматривали в качестве меры для оценки повреждения ткани). Полученные в этом тесте результаты показаны в виде среднего значения для 3 отдельных экспериментов.
[0130] Как показано на фиг. 18, SkQl в использованных концентрациях 0,2 нМ, 2 нМ и 2 00 нМ препятствовал активации нейтрофил-ММР-9, индуцируемой f-MLP, в сравнении с контролем, содержащим носитель, но без SkQl.
[0131] Таким образом, поскольку SkQl эффективен с точки
зрения защиты тканей человека от повреждений, вызванных патогенами и/или воспалительными цитокинами, он может применяться для профилактики и лечения бронхиальной астмы, хронического обструктивного заболевания легких, ишемии, острого расслоения аорты, болезни почек, травмы, сепсиса и других воспалительных заболеваний. ПРИМЕР 4
Защитный эффект МТА на модели гепатита
[0132] Экспериментальный гепатит индуцировали у 8-10-недельных крыс Вистар (Wistar) весом 80 г-12 0 г путем внутрибрюшинной инъекции 500 мг/кг D-галактозамина в 0,9% растворе NaCl. SkQl вводили в водном растворе с помощью зонда в дозе 10 нмоль/кг/день, 50 нмоль/кг/день, 250 нмоль/кг/день и 1250 нмоль/кг/день, начиная с 7 дня до индукции гепатита и заканчивая в день индукции. Животных умерщвляли через 24 часа после индукции гепатита. Степень воспаления оценивали в баллах для каждого животного по 3-факторной шкале в слепом эксперименте, используя окрашенные гематоксилином-эозином срезы печени.
[0133] Как показано на фиг. 19, SkQl в дозе 1250 нмоль/кг/день снижал степень воспаления, относительного медианного значения 2 в контрольной группе, до медианного значения 1 (р <0,001) . SkQl в дозе 50 нмоль/кг/день снижал степень воспаления до 1,5 (р <0,01). ПРИМЕР 5
Защитный эффект МТА на модели панкреатита
[0134] 42 крысы Вистар (Wistar) (возраст: 20-25 недель,
вес 400 г-750 г) распределяли по 4 экспериментальным группам с
близкими значениями среднего веса. SkQl вводили с питьевой
водой в расчетной дозе 250 нмоль/кг/день или 50 нмоль/кг/день.
Острый панкреатит индуцировали путем однократной
внутрибрюшинной (в/б) инъекции аргинина (100 мг/100 г веса животного; 20% раствор аргинина примерно в 2,5 мл фосфатного буфера).
[0135] Экспериментальные группы включали: (1) Группу интактных животных (п=10); (2) Контрольную группу (п=10), в
которой животным вводили аргинин в/б инъекцией; (3) SkQ250-SkQl в этой группе животных предварительно вводили дозу 250 нмоль/кг/день в течение 9 дней; на 9-ый день проводили в/б инъекцию аргинина и продолжали вводить SkQl в течение 24 часов (п=10); и (4) SkQ50-SkQl в этой группе животных предварительно вводили дозу 50 нмоль/кг/день в течение 9 дней. На 9-ый день проводили в/б инъекцию аргинина и продолжали вводить SkQl в течение 24 часов (п=10).
[0136] Результаты, приведенные на фиг. 19, показывают, что обе использованные дозы SkQl предотвращали повышение веса поджелудочной железы, что сказывалось на резком снижении отечности, вызванной воспалением.
[0137] Активность панкреатической миелопероксидазы (МРО) также определяли с использованием процедуры, описанной в примере 1 (применительно к почечной ткани).
[0138] Полученные результаты показывают, что применение для лечения SkQl значительно снижает активность МРО и, соответственно, воспаление в гомогенатах ткани поджелудочной железы (Таблица 2).
[0139] Гистопатологический анализ образцов поджелудочной железы крыс также продемонстрировал благоприятный эффект применения SkQl. Образцы поджелудочной железы фиксировали в 10% формалине и затем подготавливали для окрашивания эозином-гематоксилином, получая срезы толщиной 5 пм-б пм, с использованием стандартной методики. Окрашенные образцы (срезы)
изучали, рассматривая под световым микроскопом.
[0140] Интенсивность воспаления в образцах оценивали с использованием стандартной восходящей шкалы оценок от 0 до 3. Среднее значение показателя воспаления у крыс, которым не вводили SkQ, составлял 1,5. SkQl, используемый в лозе 250 нмоль/кг/день, в значительной мере снижал воспаление, в среднем до показателя 0,6 (р <0,01; тест Манна-Уитни (Mann-Whitney test)). Полученные результаты показаны в таблице 3.
Таблица 3
Средний показатель
воспаления
Контроль без панкреатита (п=7)
Нелеченный панкреатит (п=12)
1,5
SkQ50 (п= 11)
1,5
SkQ250 (п=9)
0,6 (р <0,01)
ЭКВИВАЛЕНТЫ
[0141] Для специалистов в данной области очевидно, или они смогут это понять с использованием простых стандартных операций, что возможно множество эквивалентов конкретных, описанных здесь вариантов осуществления настоящего изобретения. И все такие эквиваленты охватываются областью приводимой ниже формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ предотвращения активации нейтрофилов, включающий
взаимодействие образца, содержащего нейтрофилы, с
антиоксидантом, направленным на митохондрии, который описывается структурой:
где:
А обозначает эффекторную группировку следующей структуры:
и/или ее восстановленные формы, где:
m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y выбран независимо из группы, состоящей из
низшего алкила,
низшего алкокси; или
две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют следующую структуру:
fcЈ j *¦
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
а) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько
двойных или тройных связей; или
Ь) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает фармакологически приемлемый анион, а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные формы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQl:
0\.
кХ •--•'ч>
/ \ % J)
X /
,-"*
V Ч \
ч^
и его восстановленную (хинольную) форму SkQlH.2. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQRl: о
н3с.
и его восстановленную (хинольную) форму SkQRlH.2. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQ3:
SkQ3
и его восстановленную (хинольную) форму SkQ3H2. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQRB:
и его окисленную (хининовую) форму SkQRBH.2.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQBl:
и его восстановленную (хинольную) форму SkQBlH.2. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQBPl:
и его восстановленную (хинольную) форму SkQBPlH.2.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный образец
представляет собой образец крови.
где:
А обозначает эффекторную группировку следующей структуры:
9. Способ предотвращения высвобождения ММР-9 из
активированных нейтрофилов, включающий взаимодействие
активированных нейтрофилов с антиоксидантом, направленным на
митохондрии, который описывается структурой:
и/или ее восстановленные формы, где:
m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y выбран независимо из группы, состоящей из
низшего алкила,
низшего алкокси; или
две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют следующую структуру:
КГ"4'' >
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает фармакологически приемлемый анион, а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные формы.
и/или включающего ее восстановленные формы, где:
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQl, SkQlH.2 SkQRl, SkQRlH.2 SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH.2 .
11. Способ лечения пациента, страдающего воспалительным расстройством, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества направленного на митохондрии антиоксиданта, описываемого следующей структурой:
структуры:
и/или ее восстановленные формы, где:
m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из
низшего алкила,
низшего алкокси; или
две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют указанную ниже структуру:
.Is,
R2 v" Y Н О
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где:
Sk обозначает липофильный катион; и
Z обозначает фармакологически приемлемый анион,
а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные
формы.
где:
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQl, SkQlH.2 SkQRl, SkQRlH.2 SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH.2 .
13. Способ no n.ll, отличающийся тем, что указанное
воспалительное расстройство вызвано пиелонефритом,
панкреатитом, диабетом, травмой, сепсисом, инфекцией или
гепатитом.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное воспалительное расстройство представляет собой хроническое или острое воспалительное расстройство, или аутоиммунное заболевание.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанное воспалительное расстройство вызвано бронхиальной астмой, хроническим обструктивным заболеванием легких, ишемией, острым расслоением аорты, почечным заболеванием, диабетом, гипергликемией или бактериальной инфекцией.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанное лечение препятствует разобщению контактов по линии клетка-клетка в пораженной ткани, вызванному высоким уровнем глюкозы в ткани.
17. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное лечение препятствует повреждению ткани за счет предотвращения активации нейтрофилов.
18. Способ снижения проницаемости кровеносных сосудов у млекопитающего, страдающего нарушением метаболизма глюкозы, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества направленного на митохондрии антиоксиданта указанной ниже структуры:
И/ИЛИ ее восстановленные формы, где:
m обозначает целое число от 1 до 3;
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из
низшего алкила,
низшего алкокси; или
две соседние Y группы вместе с атомами углерода, к которым они присоединяются, образуют указанную ниже структуру:
и/или ее восстановленные формы, где:
R1 и R2 могут быть одинаковыми или могут различаться и обозначают, каждый независимо, низший алкил или низший алкокси; L обозначает линкерную группу, включающую:
a) линейную или разветвленную углеводородную цепь, которая может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями и необязательно содержит одну или несколько двойных или тройных связей; или
b) природную изопреновую цепь;
побозначает целое число от 1 до 40, или от 2 до 15, или от 5 до 11;
В обозначает направляющую группу, включающую Sk+Z~, где: Sk обозначает липофильный катион; и Z обозначает фармакологически приемлемый анион, а также их сольваты, соли, изомеры или пролекарственные формы, что препятствует разобщению, нарушающему контакт
эндотелиальных клеток у млекопитающего.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный антиоксидант представляет собой SkQl, SkQlH.2 SkQRl, SkQRlH.2 SkQ3, SkQ3H2, SkQRB, SkQRBH2, SkQBl, SkQBlH2, SkQBPl и/или SkQBPlH2 .
По доверенности
ФИГ.1А
ФИГ.1В
ФИГ.1С
Контроль
Пиелонефрит
Пиелонефрит + SkQRl
ФИГ.2А
ФИГ.2В
ФИГ.2С
¦мм
Инк
Hi Ир'Ш^ВВ^Н
иян
1Ш ' -A
Контроль
Пиелонефрит
Пиелонефрит + SkQRl
ФИГ.ЗА
ФИГ.ЗВ
ФИГ.ЗС
fiLSbau**'.-
Контроль
Пиелонефрит
Пиелонефрит + SkQRl
4 -t о
15 2,5 -
с; го
ю 2
S 1,5 с; го
О -I .
о 1 1
0,5 ¦ 0
• 3
ife I А' -
? Контроль
? Пиелонефрит
Пиелонефрит + SkQRl
Внутренний медуллярный слои
Наружный медуллярный слои
Корковый слой
1,8 1,6 ¦ 1,4 ¦
1 1
о 0,8 S 0,6
0,4 0,2 0
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит
+ SkQRl
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит
+ SkQRl
RTC, контроль RTC+LC+BL
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
NS-i
-NS-i-NS
контроль RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC +BL +LPC +BL +BL +BL +BL +BL
+DPI +Тролокс +SkQR1 SkQ1 +LiCI
ФИГ.7В
70 60 50 40 30 20 10 0
* ¦
контроль RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC +BL +BL +BL +BL +Тролокс +SkQR1 +LiCI
<
о ш о. о > >
7 6 5 4 3 2 1 О
контроль RTC+LC +BL
14 1
12 10
81 6
2 0
ih.
NS-
контроль RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC +BL +BL +BL +BL +Тролокс +SkQR1 +LiCI
ФИГ.8А
ФИГ.8В
ФИГ.8С
с 14
<# 12 о
^10 3~ 8 |6
§ 4 > s
? 2
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
0,5 ш 0,45 0,4 0,35 * 0,3 3 0,25 | 0,2 о 0,15' о 0,1 s 0,05 0
-NS
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
° 4
О о
а 1
ФИГ.80
14 12 10 8
• 61 4 2
ФИГ.8Е
Контроль Пиелонефрит
ФИГ.8Р
(а)
Пиелонефрит + SkQRl
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
ФИГ.86
(b)
о Т <
-8-о а.
л со та сг s
0 _
? -°
1 ш
? о о Q-о с х
30 -
20 -
<
Контроль APN APN+SkQ1
Контроль APN
APN+SkQ1
ФИГ.9А
ФИГ.9В
2500-:irtMi;i
_ 2000л
? 1500
i 1000 i \
500 0
0,1 1 10 100 1000 FL1-DCF Контроль
ФИГ.9С
5000 4000
2000 1000 0
^ 3000
0,1 1 10 100 1000 FL1-DCF Пиелонефрит
ФИГ.90
5000'-"-4000
^ 3000 I 2000 S 1000-
0,1 1 10 100 1000 FL1-DCF Пиелонефрит + SkQRl
ФИГ.10А
<
*
1,8 1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
ФИГ.10В
Bcl-2
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
15 кДа
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
ФИГ.10С
ФИГ.КШ
> 5Ь 1,4
1,2
ё § I 0,8 m 1 f 0,2
Q.8
2 *
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
-3 1,5 сц х _: го х -? х го <- и
g°5 1
Sii 0,5
о 0
Контроль
Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
120 !-100
¦А(tm)
4 й
Контроль
Пиелонефрит + SkQRl
8 60 I 40 m 20
I- Пиелонефрит
Дни
Бактерии
I:H"V-^I:H щ
f Ядро
Клетка почки
Выживание клетки
Ч f
Гибель клетки
NS-
NS'
NS-s
35'
301
25'
¦ ¦
20-
15-
10'
RTC LC LC+BL RTC+LC RTC+LC RTC+LC RTC+LC
+BL +BL +BL +BL +Тролокс SkQ1 +LiCI
ФИГ.13В
• 7
I 6
432
1 -S 0
RTC RTC+LC-кондиционированная среда
ФИГ.14А
ФИГ.14В
-*(tm) IkBa
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
* P-GSK3P
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
ФИГ.14С
ФИГ.140
- IkBa
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
Akt
ФИГ.14Е
^^^^^^^^^^^^Bl-*(tm) Akt
Контроль Пиело- Пиелонефрит нефрит + SkQRl
ФИГ.15А
ФИГ.15В
ФИГ.16
120i 100
40 i
20 0
Контроль LC LC+BL LC+RTC
+BL
ФИГ.18
грамм
и Интактная группа ш Контроль в SkQ250 н SkQ50
# - р=0,005 по сравнению с интактной группой
* - р=0,05 по сравнению с контролем
PATENT c'o' "rV.-vTlON ! Rl'ATY
-::т
INTERNA ! l4)N - I SEARCH UFi'OltT
This international search rtputt ha,> It-en nreptifed h < I.JI . '¦ eni.moujl S""K1IUO> Authonty and is transmitted to the applicant according to Article 1H A ecspv is heme transmuted in n,j п.. i i i.aiiul Hu.c.vu
This international search report consists of a total с I ".
I 1 It is also accompanied by a copy ofeach pner > it ument cileu Hi ibis report
(PCT Arii?', i!: "i"l Rules 43 and Ф!)
Applicant's or agent'i file reference MTO-019PC
FOR Пьинг,
{ sec Form PCT/iSA/220
as ucll is. where applicable, item '5 below.
International application No
Interndtionnl tilrv
f.u* 1,';у,',т <щгьу ar)
S Earliest) Priority Date (day/month/year)
PCT/US 14/12353
21 January 2t> 1-i '-:
-n f t4 4)
22 January 2013 (22.01.2013)
Applicant MITOTECH SA
"tilled OUl ¦> !! lllC bjSIS of'
U'lii'ii li wu.s filed
1. Bails of the report
a. - With regard to the language, ilic international ,> ч; 1,
which is the language of
the international application in :he |-,ы- п. a translation of the international sp ,h .-.u .
v . :n:.' ,-cftiilcdtioii of an obvious mistake
i ¦ ч\ I Rule -13 u/,'"'(a)j.
a translation lurni?lud for the риги.---, . i s; < чк.Ьопн! s.'.iicfi titulcs 12.3(a) and 23.1(b))
b. I I This intcmmmn il scau-ii report has Ken ";
. authorized bv or notified to thh Authoin, r.i,-.1
With regard to any iiuelentidp and/or awioi. иен! stijm-rire (lisd.w &l ш the international application, sec Box No. I
2 ? Certain claim j "се foil ml umnireht. bie , v I •. \..> . H)
3 lXl Unity ofiiive'.-.licn is f-.n-kin^ h-.tv Bex ,> .;
4. With regard (o the liilr.
I^J the tt-.\i is approved a- -ubmitud b\ the .'> !•'• <".",
? the text has been established In this Aiitbi ' ' .v; lollow.;
5. With regard to the jhvtmt i.
the text is approved as yonnitied b\ the . i.-r,1
the text has been eslaMbhed, aeeordirm u- !: n- .41 " .:v this Authority as it appears in Box No. IV. The applicant may. within one nwnin ftoni the date of m 4'lii.i of mis international search report submit comments to this Authority.
6 With regard to the drawing,
a. the figure of the Unuiings Ui rw- published \..;h > L ¦ 1 ;i
? a.s suggested bv ttji* applicant.
? .is selected H mi-, .^UIIK^'IV, br v*s 1, - > as selected t v tbi.1 .Autnoniv, b
none of the figure; is if hi published u-;tl v ''•">
" f.'iie-l s'L".'"t'V a 'igure Jtel v'-.ai ,i li-1'Л", the invention
Form PCT/1SA/2 ill (first sheet) (July ?.П(")
INTERNATIONAL SEARCH HVl" -,;Y J International application No.
J PCT/US 14/12353 ¦
Box No. II Observation!! where certain claims we.v г'шта > .i.searchable d'mi donation of item 2 оГ first sheet)
This international search report has not been established ш K--|; > < ertam claims under Article I7(2)(a) for the following reasons: b ? Claims Nos.:
because they relate to subject matter not lequm-J to hv ,i':v ched by tins Authority, namely:
Claims Nos.:
because they relate to pirt? of the internalmn.il apt> 'i .1 на "hat do not comply with the prescribed requirements to Such an extent that no meaningful .'iitemational .-.e.it.-b с •. i. ч 1, ted . nt jpeeili 'ally
3. LJ Claims Nos.:
becaust they are dependent claims and ,ne тч с i * im . < rda in uifh da- vecond and third sentences of Rule 6.4(a).
Box No. Ill Observations where unity of invention is i < < > • it ontin uation of Лет 3 of first sheet)
4. |^[ No required ndditiuttul scji <-ri fees woe '"гч!
restricted to tbe invention first mentioned in Ич
1-2 and 8
in - , Remark on Protest
1 IK additional s.v . 1 1 рал men! 01 ,1 protest le
I I rl e :il(.4iona! s-";. . h I
fee out pai'l ч i> . [~_~ I si, > ,rotcsl accniur.'i '
1 ' otnpan ed bv the applicant's protest and, where applicable, the
:. "л.грани. 1 b\ die applicant's protest but the applicable protest
' ,'. •. . ш it i J in tlu invitation. . [ of ;uo 4'i.u'l search fees.
Form PCT/ISA/210 (cotitimuu-i,, ol I.r-t -heet > J)t(Jul. -'> '.
international application No. PCT/US 14/12353
A. CLASSIFICA1 ION Oi- SI IBJFC1 MA Г1 i к
IPC(8) - A61K 31/66; A61P 39/06 (2014.01)
USPC- 514/125; 514/129, 668/9. 568/1 "J, ЫГ-1 ч According to International Patent Classification (IPC 1 ot t.> I •.! national classification and IPC
B. FIELDS SEARCHED
Minimum documentation scan he 2 (tl.vMtcetiei s\ -> tent tn'i USPC: 514/125
IPC(8): A61K 31/66, "1P 39/06 (?0'~ 011
Documentation searched other than ma ununi docuin <.ii' i t < .1 leM nvt such documents are included in the fields searched USPC: 514/129. 568 <9, 568/13, 36EM7 {Soc Search > N i Electronic data base eon F UK 4 ' t Google: Scholar/Patents sKql amio: ,i:nnt noufro(i'i'i-".
C. DOCUMEN Гь LUKSli t t> f Rf! П
[ j Further documents ate listed ч> u.c . otnintiatiot, !, <¦
cntcgones ot cited documents:
"A" document defining the ten ла! st,m ot the an "h Ji is IUH -to be ol'particular relevance
"E" earlier application or patent 'HI; pul^i -! "о on oi otter tV ¦ - ч j filing date
"L" document wh-eti M"" ОЧКИ doubt, HI рш> мч < i i • ¦ I cited to establish the j-ibi e.iiioi i. s. ol areih- oiih special reason ы чр, uln J i
"O" document retVrnni to m nr • is|> in. i> - • i i >
means
"P" document published рги r in ih rti i national 'ibn^ J.u, i> i ie.
the priority dale claimed _
hi'' v iroctii |> ui 1 > ,licd aftci Ihc imemationai filing date orpriority
" ' " ' bin cited to understand
Uitti u'i',1 not i" lOiifbct with the application Iht т.г. i - nr tlicon underlying the invention
ан и in! .! prticuiai relevance: the claimed invention cannot be musi ten ! ,v el nr tannot be considered to involve an inventive ¦ tep чк:, :> v Jiieumert is taken alone
"i " г. r i. h. nt (."laulai relevance; the claimed invention cannot be ' УЫ <"u ,p\snve an inventive step when the document is , и, ¦, I > \it • em or more other such documents, such combination > n. i.oeiOu i" л person skilled in the art
is.' o < imri number of the same patent family
Date of the actual complettim i> f the Jtiein ttioi,.il seit-h 25 June 2014 (25.06.2014) \ , Mle ul in tiliii" •' :!ic inlemational search report
' - ' ?014
t H'.l
Lee W. Young
Form PCT/ISA/210 (se. < no .neui July 2009)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No. PCT/US 14/12353
Attachment to Box.No.til:
This application contains the following inventions at ;jroups 'if In ."зл <тпь winch игл not so linked as to form a single general inventive concept under PCT Rule 13.1. In order for all inventions to EJ > -л"пгч> .а, trie appropriate additional examination fees must be paid.
Group l+, claims 1-8. directed to a method of preventing ntrUirop'nl activat.on comprising contacting a sample containing neutrophils with a mitochondrial^ targeted antioxidant having the strucluru A-[t -n-Q. Group It will be searched to the extent that it reads on the method wherein the antioxidant is SkQl a on its reduced (qui nolo I fomi > kO iH2 (claim 2) It is believed that claims 1-2 and 8 read on this first named invention. Applicants must tnlicoK if applicable, t i,- dum.: <..> nich reao on the restnctod invention if different than what was indicated above lor this group. Falun- to dearly ide'it.iy m., MI" r"> айФкш invention tees are to be applied to the "+" group(s) will result in only the first' claimed invention to be,;f;afdied.,'> -v , • < '.. ""-.TI !,-iv ,:' inti.jn would be a method of Group l+, wherein the antioxidant is SkQRl (: e. clfiiim, I, \ unj tl)
Group II, claims 9-10, drwcted to a ms'trad nf jrc-ven" vj -,I ¦¦'' ¦" - 'm,,, -i, ч-чм! nantiophils contacting a sample containing neutrophils with mitocriortefna,'y targeted antioxidant, 'mv.rr, ц .- -,i luce, A-i:.|n-J".
Group 111, claims 11-17, directeo to a .iiHtriod uf tioatir.y a ,i-.Sn--ii •¦u'Hirir> g (mm чп inflammatory disorder, comprising administering to the patient a therapeutically effective -miount of a mite -гк'ио.г. • <;otod antioxidant having the structure, A-[L]n-B.
. Group IV claims 18-19, directed lu a metiiod of Iowa U-j "\;к J vuss.f I pemwabi ity in a .nammal suffering from a glucose metabolism disorder comprising adrninisteriim to the momma1 a thuraoi/uti-vY, t ffi-r*vti в mount of и rnitochordnally targeted antioxidant having the • structure.
The inventions listed as Groups l+. ll-IV do not reraie to ч s irtlf -enl И'/еШсчо concept under PCT Rule 13.1 because, under PCT Rule 13.2, they lack the same c-corresprndinn special teon-1 * I '•¦-'[¦"•' foi thp M'owinq reasons
Special Technical Features:
.lion: s.rfren-,^ 'torn an inflammatory disorder, not required by any
The special technical fsutwc ofeoc.'i it^.Ttion oi Gro'ip • •; it.-- " J'HI- • tnictui.* о,Д aharud by any other invention of Group l+. The special technical feature of Gump I - is a -nathod of o,-- t no nwit'oj.h! activation, not rnqutred by any other Group. The special technical feature of Group > ! Ь a method or | ГА-. ..., i ч t tf.g r> Lias.' rrom activated neutrophils, not required by any other Group.
The special technical feature of Gro jp ,1н> a method oi v .> l. n ¦ other Group..
The special technical feature Ы :Jnrw "V mo'hnd jf trtv ', ¦ ^ Л '.в.. р.тльч-i1. I;tv :n a mammal su'fenng from i disorder, not 'fiquiroo ay 'f'iy o'hw i^tcup
M го o! i ni'-t ¦>
Common Technical features: Groups 1+ and ll-IV 'Лито thr ч г'ч.ч
Groups 1+ and II share the technical tealdro of -з trtetnr/.t ал p targeted antioxidant having the structure A-[L]n-B.
Groups III and IV sharp tne 'rormica' feature nf a method n m. mitochondrially targeted antkwtri-jnt hiving the z'.tur.u.n-, • ,i i-,
The inventions of Group t+ stun;- ti,e technical ftwUrt с' cl: .
However, these sharec leCinici.1 fpaturor < ulacb"'.'
;i- , '. • < [fr-nc.vi'ihv tr.i,i'ted antioxidant having the structure, A-[LJn ,i- . jnLidirij и sai iple containing neutrophils with a mitochondriatly
oi i- rriinibtL-'ini; to a subject a therapeutically effective amount of a
, i .' .i ov> '.- :г,н f no ли ж anticipated by US 2011/0053895 A1 to
Skulachev discloses J method of pn-\ > -nti ,у пиииот! ^'i1, i" " •.. .(" uwi,1)}- ы ttwprula MtMOled to the ischemic focus also actively
release superoxide find nydroip ¦> <> v > t a.; O'I *1ч Ья -ktr ' i t - ,-r* j .> ¦,.;'.•,! i:r-!i,'ery duniig reperfusion; para (0058J- prevent or
decelerate the dfve'npnion! nf . ;l \ -;ц ; t.i rr^1 1 cir ,ul ition disorders; t.e , prevent nuetrophil
activation), comprising > t'isrtc'.riri > plr con:¦•> ,,, no i -> r i ¦ <,,¦" ,'ышц ч" л u.ilufil a therapeutically effective amount of a
mitochondriatly targoL.d antK-xio-.; i , и lyttu ачч-.-ч"- : . ,( < - (Г ) !"]¦[;) < i$0j- ,-[l.'n-8. [0059]- (0066): [0059]- SkQ1 in vivo a
model of regional myocardial Ischemic jr.rw'.m- M im ., < ,a^- v",c usa,'; 'oOCaj-The obtained samples were scanned;
(0066)-a dose of 250 nmoLttg boov r, ".-lit'd-.y .'inl.b > л • ч i • i:,,-,^-^ t'^.i.nq disorders caused by dysregulation in blood
circulation and oxygen sjppV tu r <•,',-. ,fr> ^ ioor-1], [LHI' I, • < • ;
Therefore, the inventions uf Grnu^i " "p i •' ' r\'i.i;. ';;
Form PCT/1SA/210 lesvu slu^-ii J i,- > ¦ • <•
Form PCT/1SA/210 lesvu slu^-ii J i,- > ¦ • <•
Form PCT/1SA/210 lesvu slu^-ii J i,- > ¦ • <•
Form PCT/1SA/210 lesvu slu^-ii J i,- > ¦ • <•
А обозначает эффекторную группировку указанной ниже
А обозначает эффекторную группировку указанной ниже
А обозначает эффекторную группировку указанной ниже
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
1/15
3/15
ФИГ.5А
3/15
ФИГ.5А
3/15
ФИГ.5А
3/15
ФИГ.5А
3/15
ФИГ.5А
3/15
ФИГ.5А
5/15
ФИГ.7А
4/15
5/15
ФИГ.7А
4/15
5/15
ФИГ.7А
4/15
5/15
ФИГ.7А
4/15
5/15
ФИГ.7А
6/15
5/15
ФИГ.7А
6/15
7/15
7/15
2 -
2 -
7/15
7/15
2 -
2 -
7/15
7/15
2 -
2 -
7/15
7/15
2 -
2 -
7/15
7/15
2 -
2 -
7/15
7/15
2 -
2 -
7/15
7/15
2 -
2 -
8/15
8/15
8/15
8/15
8/15
8/15
8/15
8/15
8/15
8/15
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
9/15
ФИГ.11
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
10/15
ФИГ.13А
11/15
11/15
11/15
11/15
11/15
11/15
11/15
11/15
12/15
12/15
12/15
12/15
12/15
14/15
14/15
14/15
14/15
! <Л ,41^014/012353 28.07.2014
! <Л ,41^014/012353 28.07.2014
! <Л ,41^014/012353 28.07.2014
! <Л ,41^014/012353 28.07.2014
! <Л ,41^014/012353 28.07.2014
! <Л ,41^014/012353 28.07.2014
"'J f7US2014/012353 28.07.2014
"'J f7US2014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
ЧГ;/ J82014/012353 28.07.2014
PCT/US2014/012353 28.07.2014
PCT/US2014/012353 28.07.2014
PCT/US2014/012353 28.07.2014
PCT/US2014/012353 28.07.2014
