[RU]

В настоящем документе раскрыты моно- и биспецифические ДНК-антитела (DMAb), нацеленные на Pseudomonas aeruginosa. В настоящем документе также раскрыт способ создания синтетического антитела у субъекта посредством введения субъекту DMAb. В настоящем описании также раскрыт способ предотвращения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, с использованием указанной композиции и способа создания.

(57) Реферат / Формула:

В настоящем документе раскрыты моно- и биспецифические ДНК-антитела (DMAb), нацеленные на Pseudomonas aeruginosa. В настоящем документе также раскрыт способ создания синтетического антитела у субъекта посредством введения субъекту DMAb. В настоящем описании также раскрыт способ предотвращения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, с использованием указанной композиции и способа создания.

---

Евразийское (21) 201892525 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.05
(51) Int. Cl.
A61K 39/40 (2006.01) C07K16/00 (2006.01) C07K16/12 (2006.01)
(54) КОНСТРУКЦИИ ДНК-АНТИТЕЛ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
62/332,363 2016.05.05
PCT/US2017/031449
WO 2017/193101 2017.11.09
Заявитель:
ДЗЕ ТРАСТИЗ ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ; ДЗЕ УИСТАР ИНСТИТЬЮТ ОФ ЭНЭТОМИ ЭНД БАЙОЛОДЖИ; ИНОВИО ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
Изобретатель:
Уэйнер Дэвид, Пател Ами, Янь Цзянь
(US)
Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) В настоящем документе раскрыты моно- и би-специфические ДНК-антитела (DMAb), нацеленные на Pseudomonas aeruginosa. В настоящем документе также раскрыт способ создания синтетического антитела у субъекта посредством введения субъекту DMAb. В настоящем описании также раскрыт способ предотвращения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, с использованием указанной композиции и способа создания.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-553292ЕА/026 КОНСТРУКЦИИ ДНК-АНТИТЕЛ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 62/332,363, поданной 5 мая 2016 г., полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, для создания in vivo одного или более синтетических антител, включая антитела к PcrV и биспецифические антитела к PcrV и Psl и их функциональные фрагменты, а также к способам предотвращения и/или лечения бактериальной инфекции у субъекта посредством введения указанной композиции.
Уровень техники
[0003] Бактерии Pseudomonas spp. с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) относятся к патогенным микроорганизмам, наиболее тяжело поддающимся лечению. Инфекции, вызванные бактериями Pseudomonas spp., являются основной причиной острой пневмонии и хронических легочных инфекций у лиц с муковисцидозом и наиболее частым источником инфекций ожоговых ран или других травм, где они могут приводить к смертности от сепсиса. Бактерии Pseudomonas spp. могут прикрепляться к поверхностям медицинских устройств, таких как медицинские имплантаты, катетеры и искусственные суставы, и вызывать многочисленные проблемы, например, закупоривание катетера или физическое повреждение имплантата. Поскольку бактерии рода Pseudomonas образуют биопленку, они обладают чрезвычайной устойчивостью к высоким концентрациям антибиотиков. В настоящее время для лечения множества заболеваний одобрены терапевтические антитела. К сожалению, производство и доставка очищенных антител являются дорогостоящими. Кроме того, эти лекарственные средства в виде антител необходимо вводить повторно с интервалом от
одного раза в неделю до одного раза в месяц, что представляет проблемы в свете лечения хронических состояний, например, для предотвращения образования биопленки на медицинском имплантате или для ее устранения.
[0004] Таким образом, в данной области существует потребность в улучшенных терапевтических средствах для предотвращения и/или лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa и образования биопленки. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность.
Сущность изобретения
[0005] В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей одно или более моноклональных ДНК-антител (DMAb), причем молекула нуклеиновой кислоты содержит одно или более из следующего: а) нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела DMAb к PcrV (DMAb-aPcrV) , или ее фрагмент или гомолог; Ь) нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной
области легкой цепи антитела DMAb к Psl (DMAb-aPsl), или ее фрагмент или гомолог; и с) нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи биспецифического DMAb к PcrV и к Psl (DMAb-BiSPA), или ее фрагмент или гомолог.
[0006] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен расщепления.
[0007] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи DMAb-aPcrV, или ее фрагмент или гомолог, представляет собой одно или более из следующего: а) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO:
16; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую
аминокислотную последовательность, выбранную из группы,
состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO:
16; с) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент
аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере около
95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности
с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO:
16; d) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент
аминокислотной последовательности, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO:
16; e) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере
около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной
последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной
из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и
SEQ ID NO: 15; f) фрагмент нуклеотидной последовательности,
имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине
нуклеотидной последовательности с нуклеотидной
последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15; g) нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15; и h) фрагмент нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15.
[0008] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая одно или более из вариабельной области
тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи DMAb-aPsl, или ее фрагмент или гомолог, представляет собой одно или более из следующего: а) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотой с SEQ ID N0: 2 0; b) нуклеотидную последовательность. кодирующую аминокислотную последовательность с SEQ ID N0: 20; с) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью с SEQ ID N0: 20; d) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности с SEQ ID N0: 20; е) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с SEQ ID N0: 19; е) фрагмент нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с SEQ ID N0: 19; f) нуклеотидную последовательность с SEQ ID N0: 19; и д) фрагмент нуклеотидной последовательности с SEQ ID N0: 19.
[0009] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой
кислоты, кодирующая одно или более из вариабельной области
тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи DMAb-BiSPA, или
ее фрагмент или гомолог, представляет собой одно или более из
следующего: а) нуклеотидную последовательность, кодирующую
аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около
95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности
с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22; b) нуклеотидную
последовательность, кодирующую аминокислотную
последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:
18 и SEQ ID N0: 22; с) нуклеотидную последовательность,
кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности, имеющей
по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине
аминокислотной последовательности с аминокислотной
последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22; d) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22; е) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19; f) фрагмент нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19; g) нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19; и h) фрагмент нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19.
[0010] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую элемент участка внутренней посадки рибосомы (IRES). В одном варианте реализации элемент IRES выбран из группы, состоящей из IRES вируса и IRES эукариотической клетки.
[ООН] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность.
[0012] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит экспрессионный вектор.
[0013] В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одно или более моноклональных ДНК-антител, выбранных из DMAb-aPcrV, DMAb-aPsl, DMAb-BiSPA, или их фрагмент или гомолог.
[0014] В одном варианте реализации композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
[0015] В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу предотвращения или лечения заболевания у
субъекта, причем способ включает введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты или композиции, содержащей одно или более моноклональных ДНК-антител, выбранных из DMAb-aPcrV, DMAb-aPsl, DMAb-BiSPA, или их фрагмент или гомолог.
[0016] В одном варианте реализации заболевание представляет собой инфекцию, вызванную Pseudomonas aeruginosa.
[0017] В одном варианте реализации способ дополнительно включает введение субъекту антибиотика. В одном варианте реализации после введения молекулы нуклеиновой кислоты или композиции антибиотик вводят менее 10 дней.
[0018] В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу предотвращения или устранения образования биопленки у субъекта, причем способ включает введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты или композиции, содержащей одно или более моноклональных ДНК-антител, выбранных из DMAb-aPcrV, DMAb-aPsl, DMAb-BiSPA, или их фрагмент или гомолог.
[0019] В одном варианте реализации биопленка представляет собой биопленку из Pseudomonas aeruginosa.
[0020] В одном варианте реализации способ дополнительно включает введение субъекту антибиотика. В одном варианте реализации после введения молекулы нуклеиновой кислоты или композиции антибиотик вводят менее 10 дней.
[0021] В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одно или более моноклональных ДНК-антител, которые являются биспецифическими, для создания одного или более антител in vivo, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит одно или более из следующего: а) нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи первого антигена, или ее фрагмент или гомолог; и Ь) нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи второго антигена, или ее фрагмент или гомолог.
[0022] В одном варианте реализации молекула
биспецифического антитела в соответствии с настоящим изобретением может иметь два участка связывания любой желаемой специфичности. В некоторых вариантах реализации один из участков связывания способен связываться с опухолеассоциированным антигеном. В некоторых вариантах реализации один из участков связывания способен связываться с маркером клеточной поверхности на иммунной клетке.
[0023] В одном варианте реализации биспецифическое антитело настоящего изобретения нацелено, среди прочего, на CD19/CD3, HER3/EGFR, TNF/IL-17, IL-la/ILip, IL-4/IL-13, HER2/HER3, GP100/CD3, ANG2/VEGFA, CD19/CD32B, TNF/IL17A, IL-17A/IL17E, CD30/CD16A, CD19/CD3, CEA/CD3, HER2/CD3, CD123/CD3, GPA33/CD3, EGRF/CD3, PSMA/CD3, CD28/NG2, CD28/CD20, EpCAM/CD3 или MET/EGFR.
Краткое описание графических материалов
[0024] На фигуре 1, которая включает фигуры 1А-1С, показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие доставку и экспрессию DMAb in vitro. На фигуре 1А показана принципиальная схема, демонстрирующая, что DMAb были разработаны для кодирования тяжелых и легких цепей антител IgG - клонов моноклональных антител V2L2MD и АВС123, в результате чего были получены конструкции DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA. Оптимизированные конструкции DMAb вводят мышам in vivo внутримышечно с последующей электропорацией (В/М-ЭП), и мышечные клетки синтезируют продуцируемое mAb. Секретируется полностью функциональное DMAb и проникает в системный кровоток. На фигуре 1В показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие, что клетки НЕК 2 93 Т трансфицировали с использованием 1 мкг/лунка DMAb-aPcrV, DMAb-BiSPA или контрольной плазмиды pGXOOOl; i) супернатант и ii) клеточные лизаты собирали через 4 8 часов. Проводили анализ образцов на IgG человека. На фигуре 1С показаны результаты иллюстративного вестерн-блота, выполненного с использованием клеточных лизатов из трансфицированных клеток. В общей сложности 10 мкг клеточного лизата загружали на каждую полосу и проводили электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-
ПААГ) с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану зондировали H+L антитела козы к человеческому IgG, конъюгированного с ферментом пероксидазы хрена (HRP). Образцы проявляли с использованием набора для хемилюминесценции ЭХЛ и визуализировали на пленке.
[0025] На фигуре 2, которая включает фигуры 2A-2D, показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие экспрессию DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA в скелетной мышце мыши. Мыши линии BALB/c получали инъекцию ДНК в переднюю большеберцовую
(ПБ) мышцу вместе с ДНК DMAb-aPcrV или DMAb-BiSpA с последующим проведением in vivo электропорации. На фигуре 2А показан пример изображения клеток, в которые ввели DMAb-aPcrV. На фигуре 2В показан пример изображения клеток, в которые ввели DMAb-BiSPA. На фигуре 2С показан пример изображения клеток, в которые ввели пустой векторный каркас pGXOOOl. На фигуре 2D показан пример изображения интактных мышечных клеток. Мышечную ткань собирали через 3 дня после инъекции DMAb и зондировали антителом козы к Fc IgG человека с последующим обнаружением конъюгированным с антителом к IgG козы красителем AF88 и DAPI.
[0026] На фигуре 3, которая включает фигуры 3A-3F, показаны
результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие
экспрессию DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA у мышей in vivo. На фигуре ЗА
показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие уровни человеческих IgG в сыворотке, которые отслеживали в течение 120 дней у мышей линии Вб.Cg-Foxnl /J
(п=5/группа), которым вводили 100 мкг DMAb-aPcrV посредством В/М-ЭП. На фигуре ЗВ показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие уровни в сыворотке на день 7 у мышей линии BALB/c (п=10/группа), которым вводили 100 мкг и 300 мкг DMAb-aPcrV. На фигуре ЗС показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие связывание белка PcrV в сыворотке на день 7 у мышей линии BALB/c (п=10/группа), которым вводили
100 мкг DMAb-aPcrV. На фигуре 3D показаны результаты
иллюстративных экспериментов, демонстрирующие уровни
человеческих IgG в сыворотке, которые отслеживали в течение 120
дней у мышей линии Вб.Cg-Foxnlnu/J (п=5/группа) , которым вводили
100 мкг DMAb-BiSPA посредством В/М-ЭП. На фигуре ЗЕ показаны
результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие уровни
в сыворотке на день 7 у мышей линии BALB/c (п=10/группа) ,
которым вводили 100 мкг и 300 мкг DMAb-BiSPA. На фигуре 3F
показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие связывание белка PcrV в сыворотке на день 7 у мышей линии BALB/c (п=10/группа), которым вводили 100 мкг DMAb-BiSPA.
[0027] На фигуре 4, которая включает фигуры 4А-4С, показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие фармакокинетику DMAb-aPcrV, DMAb-BiSPA и мышиного IgG2a DMAb у мышей линии BALB/c. Мышам BALB/c вводили инъекционно 100 мкг ДНК DMAb в ПБ мышцу с последующим проведением in vivo электропорации (п=10/группа). В течение 21 дня после инъекции DMAb отслеживали уровни IgGl человека в сыворотке и проводили их количественное определение с помощью ИФА. В течение 103 дней после инъекции DMAb отслеживали уровни мышиного IgG2a и проводили их количественное определение с помощью ИФА. На фигуре 4А показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие фармакокинетику DMAb-aPcrV. На фигуре 4В показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие фармакокинетику DMAb-BiSPA. На фигуре 4С показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие фармакокинетику контрольного IgG2A DMAb.
[0028] На фигуре 5, которая включает фигуры 5A-5D, показаны
результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие in vivo
функциональность и защиту, придаваемые DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA
мышам BALB/c, после испытания летальной пневмонией. На фигуре 5А
показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие уровни IgG в сыворотке мышей BALB/c, которым вводили 300 мкг DMAb-aPcrV, DMAb-BiSPA или IgG АВС123 (2 мг/кг). п=5 мышей/группа. У 2 животных, которым вводили DMAb-BiSPA, в анализе антицитотоксической активности уровни были ниже предела обнаружения. Уровни антител в сыворотке в день испытания
являются репрезентативными для DMAb. На фигуре 5В показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие in vivo защиту у мышей BALB/c после введения контроля DMAb-DVSF3 (черные незакрашенные круги), DMAb-aPcrV (красный круг), DMAb-BiSPA (зеленый круг) на день -5 или после введения mAb АВС123 (фиолетовый круг) на день -1 перед летальным испытанием (представлены данные из 2 независимых экспериментов, п=8/группа/эксперимент, всего п=1б). На фигуре 5С показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие защиту при введении различных доз DMAb-BiSPA: 100 мкг (фиолетовый круг) , 2 00 мкг (зеленый круг) , 300 мкг (красный круг) или DMAb-DVSF3 (контроль). п=8 мышей/группа. На фигуре 5D показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие концентрации DMAb в сыворотке при введении различных доз DMAb-BiSPA. п=8 мышей/группа.
[0029] На фигуре б, которая включает фигуры 6A-6D, показаны
результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие
защитный эффект для органов у животных, которым вводили DMAb-
aPcrV и DMAb-BiSPA после летального испытания P. aeruginosa. На
фигуре 6А показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие содержание бактерий P. Aeruginosa (КОЕ/мл) в
органах, которое определили количественно в легких, селезенке и
почках после испытания с летальной пневмонией у животных,
которым вводили DMAb-DVSF3, DMAb-aPcrV, DMAb-ABC123 или IgG
АВС123. На фигуре 6В показаны результаты иллюстративных
экспериментов, демонстрирующие массу легких у инфицированных
животных после введения DMAb. На фигуре 6С показаны результаты
иллюстративных экспериментов, демонстрирующие уровни
провоспалительных цитокинов и хемокинов в гомогенатах легких животных, которым вводили DMAb, после летального испытания. Для фигур 6А-6С, п=8 мышей/группа. Линия представляет среднее значение. Коробчатая диаграмма и диаграмма типа "ящик с усами" отображают все точки и столбцы, указывающие на минимальные и максимальные значения. На фигуре 6D показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие уровни IgG в
сыворотке для DMAb и IgG АВС123 у неинфицированных животных в сравнении с инфицированными животными через 2 4 часа после испытания с летальной пневмонией.
[0030] На фигуре 7, которая включает фигуры 7А-7Н, показаны
результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие
гистологическую картину острой пневмонии через 4 8 часов после
инфицирования бактерией P. aeruginosa штамма 6077 (гематоксилин
и эозин (НЕ) ) . На фигуре 7А показаны результаты иллюстративных
экспериментов, демонстрирующие постэлектропорацию DMAb-DVSF3,
где показаны сливающиеся области с выраженным альвеолярным
инфильтратом и кровоизлиянием (10-кратное увеличение). На фигуре
7В показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие альвеолы с выраженными нейтрофильными
инфильтратами, кровоизлияниями и областями некроза (вставка). На
фигуре 7С показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие легкую пневмонию и случайный бронхиолярный
дебрис с DMAb-aPcrV (10-кратное увеличение). На фигуре 7D
показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие альвеолярные инфильтраты, состоящие из смешанных
популяций нейтрофилов и макрофагов (вставка). На фигуре 7Е
показаны результаты иллюстративных экспериментов,
демонстрирующие легкий альвеолит в группе применения DMAb-BiSPA (10-кратное увеличение). На фигуре 7F показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие прежде всего нейтрофильные инфильтраты и легкое кровоизлияние в альвеолярных пространствах (вставка). На фигуре 7G показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие контрольную группу введения IgG АВС123 с умеренным альвеолитом (10-кратное увеличение). На фигуре 7Н показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие альвеолярные пространства, содержащие нейтрофилы, смешанные с клеточным дебрисом, и кровоизлияние (вставка). Репрезентативные данные от 5 мышей/группа.
[0031] На фигуре 8, которая включает фигуры 8А-8В, показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие схему
комбинации DMAb и антибиотика. На фигуре 8А показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие инъекционное введение мышам линии BALB/c контроля DMAb-DVSF3 (100 мкг), физиологического раствора+меропенема (MEM, 2,3 мг/кг), DMAb-BiSPA (100 мкг) или DMAb-BiSPA (100 мкг)+МЕМ (2,3 мг/кг) и последующее испытание летальной дозой штамма 6077 P. aeruginosa. MEM вводили через 1 час после летального испытания. За животными наблюдали в течение 144 часов после инфицирования. п=8 мышей/группа. На фигуре 7В показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие уровни DMAb в сыворотке у животных перед летальным испытанием. п=8 мышей/группа. Линия представляет среднее значение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение.
[0032] На фигуре 9 показаны результаты иллюстративных экспериментов, демонстрирующие оптимизацию экспрессии DMAb-V2L2 in vivo. Мышам линии BALB/c вводили однократную инъекцию ДНК в ПБ мышцу вместе с ДНК DMAb-aPcrV или DMAb-BiSpA с последующим проведением in vivo электропорации. Графики представляют уровни в сыворотке на день 7 у мышей BALB/c (п=5/группа), которым вводили 100 мкг, 2 00 мкг или 300 мкг DMAb-aPcrV соответственно, перед и после оптимизаций последовательности введения состава с гиалуронидазой (400 ЕД/мл) и электропорации. Подробное описание изобретения
[0033] Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, ее фрагмент, ее вариант или их комбинацию. Композицию можно вводить нуждающемуся в этом субъекту для облегчения in vivo экспрессии и образования синтетического антитела.
[0034] В частности, полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи, экспрессируемые с рекомбинантных последовательностей нуклеиновых кислот, могут быть собраны в синтетическое антитело. Полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, способного связывать антиген,
являющийся более иммуногенным, по сравнению с антителом, не прошедшим описанную в данном документе сборку, и способного вызывать или индуцировать иммунный ответ против антигена.
[0035] Кроме того, эти синтетические антитела более быстро генерируются в организме субъекта, чем антитела, которые вырабатываются в ответ на индуцированный антигеном иммунный ответ. Синтетические антитела способны эффективно связывать и нейтрализовать ряд антигенов. Синтетические антитела также способны эффективно защищать от и/или стимулировать выживаемость при заболевании.
1. Определения
[0036] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в данной области техники. В случае противоречия, приоритет имеет настоящий документ, включая определения. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы на практике или при проверке настоящего изобретения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, в полном объеме включены посредством ссылки. Описанные в данном документе материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не подразумевают ограничения.
[0037] В контексте данного документа подразумевается, что термины "содержит (-ат)", "включает (-ют)", "имеющий", "имеет", "может" и их варианты являются открытыми переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможности наличия дополнительных действий или структур. Формы единственного числа включают отсылки к множественному числу, если иное четко не следует из контекста. В настоящем изобретении также предусмотрены другие варианты реализации, "содержащие", "состоящие из" и "состоящие преимущественно из" представленных в данном документе вариантов реализации или элементов, приведенных явным образом или нет.
[0038] "Антитело" может означать антитело классов IgG, IgM,
IgA, IgD или IgE или их фрагменты или производные, включая Fab, F(ab')2, Fd и одноцепочечные антитела и их фрагменты. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из образца сыворотки млекопитающего, поликлональное антитело, прошедшее аффинную очистку антитело или их смеси, которые проявляют достаточную специфичность связывания с необходимым эпитопом или полученной из него последовательностью.
[0039] В контексте данного документа "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела, содержащей антигенсвязывающий участок или вариабельную область. Эта часть не включает константные домены тяжелой цепи (т. е. СН2, СНЗ или СН4 в зависимости от изотипа антитела) Fc-области интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются этим, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты Fab'-SH, фрагменты F(ab')2, фрагменты Fd, фрагменты Fv, диатела, одноцепочечные молекулы Fv (scFv), одноцепочечные полипептиды, содержащие только один вариабельный домен легкой цепи, одноцепочечные полипептиды, содержащие три CDR вариабельного домена легкой цепи, одноцепочечные полипептиды, содержащие только одну вариабельную область тяжелой цепи, одноцепочечные полипептиды, содержащие три CDR вариабельной области тяжелой цепи.
[0040] "Антиген" относится к белкам, которые способны генерировать иммунный ответ в организме-хозяине. Антиген может распознаваться и связываться антителом. Антиген может иметь происхождение, связанное с организмом или внешней средой.
[0041] В контексте данного документа "кодирующая
последовательность" или "кодирующая нуклеиновая кислота" могут
относиться к нуклеотидной последовательности (например, РНК или
ДНК) или к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую приведенное в
настоящем документе антитело. В одном варианте реализации
кодирующая последовательность содержит последовательность ДНК,
из которой транскрибируют последовательность РНК, кодирующую
антитело. В одном варианте реализации кодирующая
последовательность содержит последовательность РНК, кодирующую
антитело. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способными управлять экспрессией в клетках индивида или млекопитающего, которому вводят нуклеиновую кислоту. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать последовательности, которые кодируют сигнальные пептиды.
[0042] В контексте данного документа термин
"комплементарная" может означать нуклеиновую кислоту, характеризующуюся Уотсон-Криковским (например, A-T/U и C-G) или Хугстиновским спариванием оснований между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновых кислот.
[0043] В контексте данного документа термин "постоянный ток" используется для определения тока, проходящего или воздействующего на ткань или клетки, определяющие указанную ткань, в течение длительности электрического импульса, подаваемого на ту же самую ткань. Электрический импульс подается из описанных в данном документе устройств для электропорации. Ток остается постоянным в указанной ткани в течение действия электрического импульса, так как предложенное в данном документе устройство для электропорации имеет цепь обратной связи, предпочтительно характеризующуюся мгновенной обратной связью. Цепь обратной связи может измерять сопротивление ткани (или клеток) во время длительности импульса и давать команду устройству для электропорации для изменения вырабатываемой электрической энергии (например, повышения напряжения) так, чтобы ток в одной ткани оставался постоянным в течение электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах реализации цепь обратной связи содержит контроллер.
[0044] В контексте данного документа термины "обратная связь по току" или "обратная связь" могут использоваться взаимозаменяемо и могут означать активный ответ предложенных устройств для электропорации, который включает измерение тока в ткани между электродами и соответствующее изменение
вырабатываемой устройством ЭП энергии, чтобы поддерживать ток на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем до инициации последовательности импульсов или электрической обработки. Обратная связь может осуществляться электропорационным компонентом, например, контроллером, устройства для электропорации, так как электрический контур в нем может непрерывно отслеживать ток в ткани между электродами и сравнивать этот отслеживаемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно проводить корректировку вырабатываемой энергии для поддержания отслеживаемого тока на заданном уровне. Контур обратной связи может характеризоваться мгновенным действием, так как он является аналоговым замкнутым контуром обратной связи.
[0045] В контексте данного документа термин
"децентрализованный ток" может означать профиль электрического тока, подаваемого из различных матриц с игольчатыми электродами описанных в данном документе устройств для электропорации, при этом профили минимизируют или, предпочтительно, устраняют появление связанного с электропорацией теплового стресса в любой области электропорируемой ткани.
[0046] В контексте данного документа взаимозаменяемые
термины "электропорация", "электропермеабилизация" или
"электрокинетическое усиление" ("ЭП") могут относиться к применению трансмембранных электрических импульсов для индукции микроскопических путей (пор) в биомембране; их наличие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[0047] В контексте данного документа термин "эндогенное антитело" может относиться к антителу, генерируемому у субъекта, которому вводят эффективную дозу антигена для индукции гуморального иммунного ответа.
[0048] В контексте данного документа термин "механизм обратной связи" может относиться к процессу, осуществляемому программным обеспечением или аппаратным обеспечение (или техническим обеспечением), который заключается в получении и
сравнении импеданса необходимой ткани (до, во время и/или после подачи импульса энергии) с заданным значением, предпочтительно током, и коррекции подаваемого импульса энергии для достижения заданного значения. Механизм обратной связи может осуществляться аналоговым замкнутым контуром.
[004 9] "Фрагмент" может обозначать полипептидный фрагмент антитела, который является функциональным, т. е. может связываться с необходимой мишенью и имеет такое же предполагаемое действие, что и полноразмерное антитело. Фрагмент антитела может быть на 10 0% идентичным полноразмерному антителу, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты в N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в позиции 1 или без. Фрагменты могут содержать 2 0% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины конкретного полноразмерного антитела, за исключением добавления любого гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать фрагмент полипептида, который на 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более идентичен антителу, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не был включен при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть связаны с фрагментом антитела.
[0050] Фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело, может быть на 100% идентичным полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида в 5' и/или 3' конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в позиции 1, или без. Фрагменты могут содержать
20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или
более,
65%
или
более,
70%
или
более,
75%
или
более,
8 0 % или
более,
85%
или
более,
90%
или
более,
91%
или
более,
92% или
более,
93%
или
более,
94%
или
более,
95%
или
более,
9 6 % или
более,
97%
или
более,
98%
или
более,
99%
или
более
процентов
длины конкретной полноразмерной кодирующей последовательности,
за исключением добавления любого гетерологичного сигнального
пептида. Фрагмент может содержать фрагмент, который кодирует
полипептид, который на 95% или более, 96% или более, 97% или
более, 98% или более или 99% или более идентичен антителу, и
дополнительно, необязательно, содержать последовательность,
кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный
пептид, который не был включен при расчете процента
идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать
последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.
[0051] В контексте данного документа термин "генетическая
конструкция" относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат
нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, такой
как антитело. Термин "генетическая конструкция" может также
относиться к молекуле ДНК, из которой транскрибирована молекула
РНК. Кодирующая последовательность содержит сигналы инициации и
терминации, функционально связанные с регуляторными элементами,
включая промотор и сигнал полиаденилирования, способными
управлять экспрессией в клетках индивида, которому вводят
молекулу нуклеиновой кислоты. В контексте данного документа
термин "форма с возможностью экспрессии" относится к генным
конструкциям, которые содержат необходимые регуляторные
элементы, функционально связанные с кодирующей
последовательностью, которая кодирует белок так, что в случае присутствия в клетке индивида будет происходить экспрессия кодирующей последовательности. В одном варианте реализации
генетическая конструкция содержит последовательность РНК,
транскрибированную из описанной в настоящем документе
последовательности ДНК. Например, в одном варианте реализации
генетическая конструкция содержит молекулу РНК,
транскрибированную из молекулы ДНК, которая содержит последовательность, кодирующую антитело настоящего изобретения, его вариант или его фрагмент.
[0052] Употребляемые в данном документа термины "идентичная" или "идентичность" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов могут означать, что последовательности имеют заданный процент остатков, являющихся одинаковыми на протяжении заданной области. Процент можно рассчитывать путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей на протяжении заданной области, определения числа позиций, в которых в обеих последовательностях находится идентичный остаток, для получения числа совпадающих позиций, деления числа совпадающих позиций на общее число позиций в заданной области и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В случае, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к получению одного или более ступенчатых концов и заданная область сравнения включает только одну последовательность, остатки этой одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель при расчете. При сравнении ДНК и РНК тимин (Т) и урацил (U) могут считаться эквивалентными. Идентичность можно оценивать вручную, или используя компьютерный алгоритм выравнивания последовательностей, такой как BLAST или BLAST 2.0.
[0053] В контексте данного документа термин "импеданс" может использоваться при обсуждении механизма обратной связи и может быть преобразован в значение силы тока по закону Ома, делая возможным сравнение с текущим значением силы тока.
[0054] В контексте данного документа термин "иммунный ответ" может означать активацию иммунной системы организма-хозяина, например, млекопитающего, в ответ на внесение одной или более нуклеиновых кислот и/или пептидов. Иммунный ответ может
иметь форму клеточного или гуморального ответа или их обоих.
[0055] В контексте данного документа термины "нуклеиновая кислота" или "олигонуклеотид", или "полинуклеотид" могут означать по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных вместе. Описание одной цепи также определяет последовательность комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь описанной одной цепи. Много вариантов нуклеиновой кислоты можно использовать в тех же целях, что и заданную нуклеиновую кислоту. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементарные последовательности. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизироваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации.
[0056] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или гибрид, когда нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты можно получать методами химического синтеза или рекомбинантными методами.
[0057] В контексте данного документа выражение "функционально связанный" может означать, что экспрессия гена находится под управлением промотора, с которым он пространственно соединен. Промотор может располагаться 5' (выше) или 3' (ниже) гена, находящегося под его управлением. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же самым, что и расстояние между этим промотором и геном, которым он управляет, в гене, из которого получен промотор. Как известно в данной области техники это расстояние можно варьировать без потери функциональности промотора.
[0058] В контексте данного документа термины "пептид",
"белок" или "полипептид" могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природными, синтетическими или представлять собой модификацию или комбинацию природных и синтетических.
[0059] В контексте данного документа термин "промотор" может означать синтетическую или полученную из природного источника молекулу, которая способна обеспечивать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических транскрипционных регуляторных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или для изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии. Промотор также может содержать удаленные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от начала участка транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусы, бактерии, грибы, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивным или дифференциальным образом по отношению к клетке, ткани или органу, в которых происходит экспрессия, или по отношению к стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние стимулы, такие как физиологический стресс, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Типовые примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага ТЗ, промотор SP6, оператор-промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV4 0, ранний промотор SV4 0, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV4 0 или поздний промотор SV4 0 и промотор CMV IE.
[0060] Термины "сигнальный пептид" и "лидерная последовательность" взаимозаменяемо используются в данном документе и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана с амино-концом приведенного в данном документе белка. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности, как правило, управляют локализацией белка. Используемые в данном документе сигнальные пептиды/лидерные последовательности предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он вырабатывается. После секреции из клетки сигнальные
пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, часто называемого зрелым белком. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны с N-концом белка.
[0061] В контексте данного документа "жесткие условия
гибридизации" могут означать условия, в которых первая
последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет
гибридизироваться со второй последовательностью нуклеиновой
кислоты (например, мишенью), например, в комплексной смеси
нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от
последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Жесткие условия можно выбрать так, что они были на около 5-10°С ниже температуры плавления (Тп) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Тп может представлять собой температуру (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Тп, 50% зондов оказываются занятыми в равновесном состоянии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 М ионов натрия, например, около 0,01-1,0 М концентрация ионов натрия
(или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (например, около 1050 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов
(например, более чем около 50 нуклеотидов). Жесткие условия также можно обеспечить путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для избирательной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примеры жестких условий гибридизации включает следующие: 50% формамид, 5х SSC и 1% ДСН, инкубация при 42°С, или 5х SSC, 1% ДСН, инкубация при 65°С с промывкой в 0,2х SSC и 0,1% ДСН при 65°С.
[0062] В контексте данного документа взаимозаменяемо используемые термины "субъект" и "пациент" относятся к любому позвоночному, включая, но не ограничиваясь этим, млекопитающее
(например, корову, свинью, верблюда, ламу, лошадь, козу, кролика, овцу, хомяков, морскую свинку, кошку, собаку, крысу и мышь, отличного от человека примата (например, обезьяну, такую как яванский или резус-макак, шимпанзе и т. д.) и человека). В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой человека или не человека. Субъект или пациент может проходить другие формы лечения.
[0063] В контексте данного документа выражение "по существу комплементарная" может означать, что первая последовательность по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична комплементарной цепи второй последовательности на протяжении 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируются в жестких условиях гибридизации.
[0064] В контексте данного документа выражение "по существу идентичные" может означать, что первая и вторая последовательность идентичны по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% на протяжении области из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или более нуклеотидов или аминокислот, или, в случае нуклеиновых кислот, что первая последовательность является по существу комплементарной с комплементарной цепью второй последовательности.
[0065] В контексте данного документа термин "синтетическое антитело" относится к антителу, которое кодируется рекомбинантной последовательностью нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе, и вырабатывается в организме субъекта.
[0066] В контексте данного документа термин "лечение" может означать защиту субъекта от заболевания посредством
предотвращения, супрессии, подавления или полного устранения заболевания. Предотвращение заболевания включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению до начала заболевания. Супрессия заболевания включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению после клинического проявления заболевания.
[0067] Термин "вариант", используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, может означать (i) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (ii) комплементарную цепь указанной нуклеотидной последовательности или ее часть; (iii) нуклеиновую кислоту, которая является по существу идентичной указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементарной цепи; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементарной цепью или последовательностью, по существу идентичной ей.
[0068] Термин "вариант" в отношении пептида или
полипептида, который отличается по аминокислотной
последовательности вследствие вставки, делеции или
консервативной замены аминокислот, но сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая является по существу идентичной указанному белку с аминокислотной последовательностью, который сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Консервативные замены аминокислот, т. е. замещение аминокислоты другой аминокислотой с аналогичными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), известны в данной области техники как включающие, как правило, незначительные изменения. Эти незначительные изменения можно частично определить на основании индекса гидропатичности аминокислот, как известно в данной области техники. Kyte с соавт., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидропатичности аминокислоты основан на оценке ее
гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с аналогичными индексами гидропатичности можно взаимно заменять с сохранением функции белка. В одном аспекте проводят замену аминокислот, имеющих индекс гидропатичности ± 2. Гидрофильность аминокислот также можно использовать для определения замен, которые бы привели к получению белков, сохраняющих биологическую функцию. Учет гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитывать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезным показателем, который, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101, в полном объеме включенный в данный документ посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих аналогичные значения гидрофильности, может привести к получению пептидов, сохраняющих биологическую активность, например, иммуногенность, как известно в данной области техники. Замены можно проводить с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности в пределах ± 2 относительно друг друга. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретный тип боковой цепи этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением понятно, что аминокислотные замены, совместимые с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, проявляемого в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.
[0069] Вариант может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по существу идентичной на протяжении всей длины последовательности всего гена или ее части. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной на протяжении всей длины последовательности гена или ее части. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, которая является по существу идентичной на протяжении всей длины аминокислотной последовательности или ее
части. Аминокислотная последовательность может быть по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной на протяжении всей длины аминокислотной последовательности или ее части.
[0070] В контексте данного документа термин "вектор" может означать последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может представлять собой ДНК- или РНК-вектор. Вектор может представлять собой как самореплицирующийся внехромосомный вектор, так и вектор, который интегрируется в геном организма-хозяина.
[0071] В случае перечисления в данном документе числовых диапазонов явным образом и с той же степенью точности подразумевается и каждое промежуточное число. Например, в случае диапазона 6-9, кроме чисел б и 9 подразумеваются числа 7 и 8, а в случае диапазона 6,0-7,0, явным образом подразумеваются числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.
2. Композиция
[0072] Изобретение частично основано на создании новых
последовательностей для применения в получении моноклональных
или биспецифических антител в клетках млекопитающих. В одном
варианте реализации последовательности предназначены для
доставки в ДНК или РНК-векторы, включая бактериальные,
дрожжевые, а также вирусные векторы. Настоящее изобретение
относится к композиции, содержащей рекомбинантную
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. При введении нуждающемуся в этом субъекту композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта. Синтетическое антитело может связывать молекулу-мишень (т. е. антиген), присутствующую у субъекта. Такое связывание может нейтрализовать антиген, блокировать распознавание антигена другой молекулой, например, белком или нуклеиновой кислотой, и вызывать или индуцировать иммунный ответ на антиген.
[0073] В одном варианте реализации композиция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетическое антитело. В одном варианте реализации композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первое синтетическое антитело, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую второе синтетическое антитело. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен расщепления.
[0074] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к PcrV (DMAb-aPcrV). В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-aPcrV, содержит кодон-оптимизированные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области VH или VL в DMAb-aPcrV. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область VH в DMAb-aPcrV, кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 2. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область VL в DMAb-aPcrV, кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 4. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область VH в DMAb-aPcrV, кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 12. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область VL в DMAb-aPcrV, кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 16.
[0075] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к PcrV, кодирует вариабельную область VH, приведенную в SEQ ID N0: 2, и вариабельную область VL, приведенную в SEQ ID N0: 4. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к PcrV, кодирует вариабельную область VH, приведенную в SEQ ID N0: 12, и вариабельную область VL, приведенную в SEQ ID N0: 16. В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая антитело к PcrV, кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0: б, SEQ ID N0: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14.
[0076] В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая вариабельную область VH в DMAb-
cxPcrV, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 1.
В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность,
кодирующая вариабельную область VL в DMAb-aPcrV, содержит
последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 3. В одном варианте
реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая
вариабельную область VH в DMAb-aPcrV, содержит нуклеотидную
последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 11. В одном
варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая
вариабельную область VL в DMAb-aPcrV, содержит
последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 15.
[0077] В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая DMAb-aPcrV, содержит
последовательность вариабельной области VH, приведенную в SEQ ID
N0: 1, и последовательность вариабельной области VL, приведенную
в SEQ ID N0: 3. В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая DMAb-aPcrV, содержит
последовательность вариабельной области VH, приведенную в SEQ ID N0: 11, и последовательность вариабельной области VL, приведенную в SEQ ID N0: 15. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-aPcrV, содержит последовательность, выбранную из SEQ ID N0: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13.
[0078] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-aPcrV, функционально связана с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность. В различных вариантах реализации SEQ ID N0: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, функционально связанные с лидерной последовательностью,
являются такими, как приведенные в SEQ ID N0: 2 6, SEQ ID N0: 27, SEQ ID N0: 28, SEQ ID N0: 29, SEQ ID N0: 30, SEQ ID N0: 31, SEQ ID N0: 32, SEQ ID N0: 33, SEQ ID N0: 34, SEQ ID N0: 35, SEQ ID N0: 36, SEQ ID N0: 37, SEQ ID N0: 38, SEQ ID N0: 39, SEQ ID N0: 40 и SEQ ID N0: 41 соответственно.
[0079] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой
кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую
антитело к Psl (DMAb-aPsl). В одном варианте реализации
нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-aPsl, содержит
кодон-оптимизированные последовательности нуклеиновой кислоты,
кодирующие вариабельные области VH и VL в DMAb-aPsl. В одном
варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая
DMAb-aPsl, содержит кодон-оптимизированные последовательности
нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области VH и VL в
DMAb-aPsl. В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая DMAb-aPsl, кодирует
аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 20. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-aPsl, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 19.
[0080] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-aPsl, функционально связана с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность. В различных вариантах реализации SEQ ID N0: 19 и SEQ ID N0: 20, функционально связанные с лидерной последовательностью, являются такими, как приведенные в SEQ ID N0: 44 и SEQ ID N0: 45 соответственно.
[0081] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую биспецифическое антитело. В одном варианте реализации биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело к PcrV и к Psl (DMAb-BiSPA) . В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-BiSPA, содержит кодон-оптимизированные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области VH и VL в
DMAb-BiSPA. В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая DMAb-BiSPA, кодирует
аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 22. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая DMAb-BiSPA, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 21.
[0082] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая биспецифическое антитело, функционально связана с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность. В различных вариантах реализации SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, и SEQ ID NO: 22, функционально связанные с лидерной последовательностью, являются такими, как приведенные в SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47 соответственно.
[0083] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой
кислоты содержит молекулу РНК, содержащую рибонуклеотидную
последовательность. В одном варианте реализации молекула РНК
содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую
аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:
20, из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:
31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39;
SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 47. В
одном варианте реализации молекула РНК содержит транскрипт,
генерированный с молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную
последовательность, кодирующую аминокислотную
последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 47. В одном варианте реализации молекула РНК содержит транскрипт, генерированный с молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID
NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 46.
[0084] Композиция настоящего изобретения может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от заболевания, расстройства или состояния, связанного с бактериальной активностью. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от бактериальной инфекции. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от образования биопленки. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от образования биопленки, вызванного Pseudomonas aeruginosa. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от сепсиса.
[0085] Синтетическое антитело может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от заболевания у субъекта, которому вводят композицию. Синтетическое антитело посредством связывания антигена может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от заболевания у субъекта, которому вводят композицию. Синтетическое антитело может способствовать выживаемости при заболевании у субъекта, которому вводят композицию. В одном варианте реализации синтетическое антитело может обеспечить повышенную выживаемость субъекта с заболеванием по сравнению с ожидаемой выживаемостью у имеющего заболевание субъекта, которому не вводили синтетическое антитело. В различных вариантах реализации синтетическое антитело может обеспечивать повышение выживаемости у субъекта с заболеванием, которому вводили композицию, по меньшей мере на около 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% больше по
сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии введения композиции. В одном варианте реализации синтетическое антитело может обеспечить повышенную защиту от заболевания у субъекта по сравнению с ожидаемой защитой у субъекта, которому не вводили синтетическое антитело. В различных вариантах реализации синтетическое антитело может обеспечивать защиту от заболевания у субъекта, которому вводили композицию, по меньшей мере на около 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% больше по сравнению с ожидаемой защитой при отсутствии введения композиции.
[0086] Композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта в течение по меньшей мере около 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, б часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 20 часов, 25 часов, 30 часов, 35 часов, 40 часов, 45 часов, 50 часов или 60 часов после введения композиции субъекту. Композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта в течение по меньшей мере около 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, б суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток или 10 суток после введения композиции субъекту. Композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта в течение от около 1 часа до около б суток, от около 1 часа до около 5 суток, от около 1 часа до около 4 суток, от около 1 часа до около 3 суток, от около 1 часа до около 2 суток, от около 1 часа до около 1 суток, от около 1 часа до около 72 часов, от около 1 часа до около 60 часов, от около 1 часа до около 48 часов, от около 1 часа до около 36 часов, от около 1 часа до около 24 часов, от около 1 часа до около 12 часов или от около 1 часа до около б часов после введения композиции субъекту.
[0087] При введении нуждающемуся в этом субъекту композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта быстрее, чем происходит генерация эндогенного антитела у субъекта, которому вводят антиген, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ. Композиция может приводить к
генерации синтетического антитела по меньше мере на около 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, б суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток или 10 суток раньше генерации эндогенного антитела у субъекта, которому вводят антиген, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ.
[0088] Композиция согласно настоящему изобретению может иметь характеристики, необходимые для эффективных композиций, такие как безопасность в том смысле, что композиция не приводит к болезни или смерти; защита от болезни; обеспечение легкости введения, небольшое количество побочных явлений, биологическая стабильность и низкая стоимость, приходящаяся на дозу.
а. Биспецифические антитела
[0089] Как описано в других местах настоящего документа,
композиция может содержать рекомбинантную последовательность
нуклеиновой кислоты. Рекомбинантная последовательность
нуклеиновой кислоты может кодировать биспецифическое антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Антитело более подробно описано ниже. В изобретении предложены новые биспецифические антитела, содержащие первый антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с первой мишенью, и второй антигенсвязывающий участок, который специфически связывается со второй мишенью, с особенно предпочтительными свойствами, такими как воспроизводимость, стабильность, аффинность связывания, биологическая активность, специфическое нацеливание на определенные Т-клетки, эффективность нацеливания и сниженная токсичность. В некоторых случаях существуют биспецифические антитела, которые связываются с первой мишенью с высокой аффинностью, а со второй мишенью - с низкой аффинностью. В других случаях существуют биспецифические антитела, которые связываются с первой мишенью с низкой аффинностью, а со второй мишенью - с высокой аффинностью. В других случаях существуют биспецифические антитела, которые связываются с первой мишенью с желаемой аффинностью и со второй мишенью с желаемой аффинностью.
[0090] В одном варианте реализации биспецифическое антитело представляет собой двухвалентное антитело, которое содержит а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфически
связывающегося с первым антигеном, и Ь) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном.
[0091] Молекула биспецифического антитела в соответствии с
настоящим изобретением может иметь два участка связывания любой
желаемой специфичности. В некоторых вариантах реализации один из
участков связывания способен связываться с
опухолеассоциированным антигеном. В некоторых вариантах реализации участок связывания, включенный в Fab-фрагмент, представляет собой участок связывания, специфичный в отношении опухолеассоциированного поверхностного антигена. В некоторых вариантах реализации участок связывания, включенный в одноцепочечный Fv-фрагмент, представляет собой участок связывания, специфичный в отношении опухолеассоциированного антигена, такого как опухолеассоциированный поверхностный антиген.
[0092] В контексте данного документа термин
"опухолеассоциированный поверхностный антиген" относится к
антигену, который представлен или может быть представленным на
поверхности, расположенной на опухолевых клетках или внутри них.
Эти антигены могут быть представлены на клеточной поверхности
внеклеточной частью, которая часто сочетается с трансмембранной
и цитоплазматической частью молекулы. В некоторых вариантах
реализации эти антигены могут быть представлены только
опухолевыми клетками, а не нормальными (то есть неопухолевыми)
клетками. Опухолевые антигены могут быть экспрессированы
исключительно на опухолевых клетках или могут представлять
опухолеспецифическую мутацию по сравнению с неопухолевыми
клетками. В таком варианте реализации соответствующий антиген
может упоминаться как опухолеспецифический антиген. Некоторые
антигены представлены как опухолевыми клетками, так и
неопухолевыми клетками, и их можно отнести к
опухолеассоциированным антигенам. Эти опухолеассоциированные антигены могут быть сверхэкспрессированы на опухолевых клетках по сравнению с неопухолевыми клетками, или они являются доступными для связывания с антителом в опухолевых клетках из-за
менее компактной структуры опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой тканью. В некоторых вариантах реализации опухолеассоциированный поверхностный антиген расположен на сосудистой сети опухоли.
[0093] Иллюстративными примерами опухолеассоциированного поверхностного антигена являются CD10, CD19, CD20, CD22, CD33, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135) , протеогликан хондроитинсульфат 4 (CSPG4, связанный с меланомой протеогликан хондроитинсульфат), рецептор эпидермального фактора роста
(EGFR), Her2neu, НегЗ, IGFR, CD133, IL3R, белок, активирующий
фибробласты (FAP), CDCP1, дерлин 1, тенасцин, белки Фрайзлед 1-
10, сосудистые антигены VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309),
PDGFR-альфа (CD140a), PDGFR-бета (CD140b), эндоглин, CLEC14,
Teml-8 и Tie2. Дополнительные примеры могут включать АЗЗ,
САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген (СЕА),
карбоангидразу IX (MN/CA IX), CD21, CD25, CD30, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, связывающий фолат белок, G250, Fms-подобную тирозинкиназу 3
(FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, IL-2
рецептор, IL3R, MCSP (связанный с меланомой протеогликан
хондроитинсульфат клеточной поверхности), Мис-1, простатический
специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых
клеток предстательной железы (PSCA), простатический
специфический антиген (PSA) и TAG-72. Примерами антигенов, экспрессируемых на внеклеточной матрице опухолей, являются тенасцин и белок, активирующий фибробласты (FAP).
[0094] В некоторых вариантах реализации один из участков связывания молекулы антитела в соответствии с настоящим изобретением способен связываться со специфической рецепторной молекулой Т-клетки и/или со специфической рецепторной молекулой естественной клетки-киллера (NK-клетки). Специфический рецептор Т-клетки также называют "Т-клеточным рецептором" (TCR), который позволяет Т-клетке связываться и, при наличии дополнительных сигналов, активироваться и реагировать на эпитоп/антиген, представленный другой клеткой, называемой антигенпрезентирующей клеткой (АРС). Известно, что Т-клеточный рецептор напоминает
Fab-фрагмент встречающегося в природе иммуноглобулина. Он, как правило, является одновалентным и охватывает альфа- и бета-цепи, в некоторых вариантах реализации он охватывает гамма-цепи и дельта-цепи (выше). Соответственно, в некоторых вариантах реализации TCR представляет собой TCR (альфа/бета), а в некоторых вариантах реализации он представляет собой TCR
(гамма/дельта). Т-клеточный рецептор образует комплекс с корецептором Т-клеток CD3. CD3 представляет собой белковый комплекс и состоит из четырех разных цепей. У млекопитающих комплекс содержит цепь СБЗ-гамма, цепь CD3 6 и две цепи CD3E. Эти цепи связываются с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор
(TCR), и дзета-цепью, чтобы генерировать сигнал активации в Т-лимфоцитах. Поэтому в некоторых вариантах реализации специфический Т-клеточный рецептор представляет собой корецептор Т-клеток CD3. В некоторых вариантах реализации специфический Т-клеточный рецептор представляет собой CD2 8, белок, который также экспрессируется на Т-клетках. CD2 8 может обеспечивать костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-клеток. CD2 8 играет важную роль в пролиферации и выживаемости Т-клеток, производстве цитокинов и развитии Т-хелперов типа-2. Дополнительным примером специфического Т-клеточного рецептора является CD134, также называемый 0x40. Экспрессия CD134/OX40 происходит через 24-72 часа после активации и может быть использована для определения вторичной костимулирующей молекулы. Другим примером Т-клеточного рецептора является 4-1 ВВ, способный связываться с лигандом 4-1 ВВ на антигенпрезентирующих клетках (АРС), в результате чего генерируется костимулирующий сигнал для Т-клетки. Другим примером рецептора, преимущественно обнаруживаемого на Т-клетках, является CD5, который на низких уровнях также встречается на В-клетках. Другим примером рецептора, модифицирующего функции Т-клеток, является CD95, также известный как Fas-рецептор, который опосредует передачу апоптического сигнала Fas-лигандом, экспрессируемым на поверхности других клеток. Сообщается, что CD95 модулирует сигнальные пути, управляемые TCR/CD3, в находящихся в состоянии покоя Т-лимфоцитах.
[0095] Примером специфической рецепторной молекулы NK-клеток является CD16, низкоаффинный Fc-рецептор и NKG2D. Пример рецепторной молекулы, присутствующей на поверхности как Т-клеток, так и естественных клеток-киллеров (NK), является CD2 и другие представители суперсемейства CD2. CD2 на Т- и NK-клетках способен действовать как костимулирующая молекула.
[0096] В некоторых вариантах реализации первый участок
связывания молекулы антитела связывается с
опухолеассоциированным поверхностным антигеном, а второй участок связывания связывается со специфической рецепторной молекулой Т-клетки и/или специфической рецепторной молекулой естественной клетки-киллера (NK). В некоторых вариантах реализации первый участок связывания молекулы антитела связывается с одним из перечисленного: АЗЗ, САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген (СЕА) , карбоангидраза IX (MN/CA IX) , CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, НегЗ, протеогликан хондроитинсульфат 4 (CSPG4, связанный с меланомой протеогликан хондроитинсульфат), CLEC14, дерлин 1, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, эндоглин, Ep-CAM, белок, активирующий фибробласты (FAP), связывающий фолат белок, G250, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), белки Фрайзлед 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, IL-2 рецептор, IL3R, MCSP (связанный с меланомой протеогликан хондроитинсульфат клеточной поверхности), Мис-1, простатический специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), простатический специфический антиген (PSA), TAG-72, тенасцин, Teml-8, Tie2 и VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-альфа (CD140a), PDGFR-бета (CD140b), а второй участок связывания связывается со специфической рецепторной молекулой Т-клетки и/или специфической рецепторной молекулой естественной клетки-киллера (NK) . В некоторых вариантах реализации первый участок связывания молекулы антитела связывается с опухолеассоциированным поверхностным антигеном, а второй участок связывания связывается с одним из перечисленного: CD3, Т-клеточный рецептор (TCR),
CD28, CD16, NKG2D, 0x40, 4-1ВВ, CD2, CD5 и CD95.
[0097] В некоторых вариантах реализации первый участок связывания молекулы антитела связывается со специфической рецепторной молекулой Т-клетки и/или специфической рецепторной молекулой естественной клетки-киллера (NK), а второй участок связывания связывается с опухолеассоциированным поверхностным антигеном. В некоторых вариантах реализации первый участок связывания антитела связывается со специфической рецепторной молекулой Т-клетки и/или специфической рецепторной молекулой естественной клетки-киллера (NK), а второй участок связывания связывается с одним из перечисленного: АЗЗ, САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген (СЕА), карбоангидраза IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, НегЗ, протеогликан хондроитинсульфат 4 (CSPG4, связанный с меланомой протеогликан хондроитинсульфат), CLEC14, дерлин 1, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, эндоглин, Ep-CAM, белок, активирующий фибробласты (FAP), связывающий фолат белок, G250, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), белки Фрайзлед 110, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, IL-2 рецептор, IL3R, MCSP (связанный с меланомой протеогликан хондроитинсульфат клеточной поверхности), Мис-1, простатический специфический мембранный антиген (PSMA), простатический специфический антиген (PSA), TAG-72, тенасцин, Teml-8, Tie2 и VEGFR. В некоторых вариантах реализации первый участок связывания антитела связывается с одним из перечисленного: CD3, Т-клеточный рецептор (TCR), CD2 8, CD16, NKG2D, 0x40, 4-1ВВ, CD2, CD5 и CD95, а второй участок связывания связывается с опухолеассоциированным поверхностным антигеном.
[0098] В одном варианте реализации биспецифическое антитело настоящего изобретения нацелено, среди прочего, на CD19 и CD3, HER3 и EGFR, TNF и IL-17, IL-la и IL1|3, IL-4 и IL-13, HER2 и HER3, GP100 и CD3, ANG2 и VEGFA, CD19 и CD32B, TNF и IL17A, IL-17А и IL17E, CD30 и CD16A, CD19 и CD3, СЕА и CD3, HER2 и CD3, CD123 и CD3, GPA33 и CD3, EGRF и CD3, PSMA и CD3, CD28 и NG2,
CD2 8 и CD2 0, ЕрСАМ и CD3 или МЕТ и EGFR.
b. Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты
[0099] Как описано выше, композиция может содержать
рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Антитело более подробно описано ниже.
[00100] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой
кислоты может представлять собой гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты. Рекомбинантная
последовательность нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты или одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.
[00101] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой
кислоты может представлять собой оптимизированную
последовательность нуклеиновой кислоты. Такая оптимизация может повышать или изменять иммуногенность антитела. Оптимизация также может улучшать транскрипцию и/или трансляцию. Оптимизация может включать в себя одно или более из следующего: лидерную последовательность с низким содержанием GC для повышения транскрипции; стабильность мРНК и оптимизацию кодонов; добавление последовательности Козака (например, GCCACC) для повышения трансляции; добавление лидерной последовательности иммуноглобулина (Ig), кодирующей сигнальный пептид; и удаление по мере возможности цис-действующих мотивов последовательностей (т. е. внутренних ТАТА-боксов).
c. Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты
[00102] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать одну или более конструкций рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более компонентов, которые более подробно описаны ниже.
[00103] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует
полипептид тяжелой цепи, его фрагмент, его вариант или их
комбинацию. Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид легкой цепи, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует участок расщепления протеазой или пептидазой. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует участок внутренней посадки рибосомы (IRES). IRES может представлять собой IRES вируса или IRES эукариотической клетки. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать одну или более лидерных последовательностей, причем лидерная последовательность кодирует сигнальный пептид.
[00104] В одном варианте реализации сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность MDWTWRILFLVAAATGTHA
(SEQ ID N0: 24) . В одном варианте реализации сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность MVLQTQVFISLLLWISGAYG
(SEQ ID N0: 25). Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела настоящего изобретения, функционально связанные с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, включают, но не ограничиваются этим, нуклеотидные последовательности, приведенные в от SEQ ID NO: 2 6-SEQ ID NO: 47 .
[00105] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более промоторов, один или более интронов, одну или более областей терминации транскрипции, один или более инициирующих кодонов, один или более терминирующих или стоп-кодонов и/или один или более сигналов полиаденилирования. Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты также может содержать одну или более
линкерных или метящих последовательностей. Метящая
последовательность может кодировать гемагглютининовую (ГА) метку.
(1) Полипептид тяжелой цепи
[00106] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид тяжелой цепи, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Полипептид тяжелой цепи может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи (СН) . По меньшей мере одна константная область тяжелой цепи может содержать константную область тяжелой цепи 1 (СН1), константную область тяжелой цепи 2 (СН2) и константную область тяжелой цепи 3 (СНЗ) и/или шарнирную область.
[00107] В некоторых вариантах реализации полипептид тяжелой цепи может содержать область VH и область СН1. В других вариантах реализации полипептид тяжелой цепи может содержать область VH, область СН1, шарнирную область, область СН2 и область СНЗ.
[00108] Полипептид тяжелой цепи может содержать набор определяющих комплементарность областей ("CDR"). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области из области VH. Начиная с N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут вносить свой вклад в связывание или распознавание антигена.
(2) Полипептид легкой цепи
[00109] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид легкой цепи, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Полипептид легкой цепи может содержать вариабельную область легкой цепи (VL) и/или константную область легкой цепи (CL).
[00110] Полипептид легкой цепи может содержать набор определяющих комплементарность областей ("CDR"). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области из области VL. Начиная с
N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут вносить свой вклад в связывание или распознавание антигена.
(3) Участок расщепления протеазой
[00111] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую участок расщепления протеазой. Участок расщепления протеазой может распознаваться протеазой или пептидазой. Протеаза может представлять собой эндопептидазу или эндопротеазу, например, но не ограничиваясь этим, фурин, эластазу, HtrA, кальпаин, трипсин, химотрипсин, трипсин и пепсин. Протеаза может представлять собой фурин. В других вариантах реализации протеаза может представлять собой сериновую протеазу, треониновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатную протеазу, металлопротеазу, протеазу глутаминовой кислоты или любую протеазу, которая расщепляет внутреннюю пептидную связь (т. е. не расщепляет N-концевую или С-концевую пептидную связь).
[00112] Участок расщепления протеазой может содержать одну или более аминокислотных последовательностей, которые стимулируют расщепление или повышают его эффективность. Одна или более аминокислотных последовательностей могут стимулировать или повышать эффективность образования или генерации дискретных полипептидов. Одна или более аминокислотных последовательностей могут содержать 2А пептидную последовательность.
(4) Линкерная последовательность
[00113] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать одну или более линкерных последовательностей. Линкерная последовательность может пространственно разделять или связывать один или более описанных в данном документе компонентов. В других вариантах реализации линкерная последовательность может кодировать аминокислотную последовательность, которая пространственно разделяет или связывает два или более полипептидов.
(5) Промотор
(5)
[00114] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более промоторов. Один или более промоторов могут представлять собой любой промотор, способный управлять генной экспрессией и регулировать генную экспрессию. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для транскрипции с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Выбор промотора, применяемого для управления генной экспрессией, зависит от конкретного применения. Промотор может располагаться приблизительно на таком же расстоянии от точки начала транскрипции в конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, что и от точки начала транскрипции в своем природном окружении. При этом это расстояние можно варьировать без потери функциональности промотора.
[00115] Промотор может быть функционально связан с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи. Промотор может представлять собой промотор, эффективный для экспрессии в эукариотических клетках. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может представлять собой промотор ЦМВ, промотор вируса обезьян 40 (SV40), такой как ранний промотор SV4 0 и поздний промотор SV4 0, промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такой как промотор длинных концевых повторов (ДКП) бычьего вируса иммунодефицита (БВИ), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц (ВЛП), промотор цитомегаловируса (ЦМВ), такой как немедленно-ранний промотор ЦМВ, промотор вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) или промотор вируса саркомы Рауса (ВСР). Промотор также может представлять собой промотор из человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатинин, человеческий полиэдрин или человеческий металлотионеин.
[00116] Промотор может представлять собой конститутивный промотор или индуцибельный промотор, который инициирует транскрипцию, только когда клетка-хозяин подвергается
воздействию некоторого внешнего стимула. В случае многоклеточного организма промотор также может быть специфическим в отношении конкретной ткани или органа, или стадии развития. Промотор также может быть тканеспецифическим промотором, таким как промотор, специфический в отношении мышц или кожи, природный или синтетический. Примеры таких промоторов описаны в публикации заявки на патент США № US20040175727, содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00117] Промотор может быть связан с энхансером. Энхансер может располагаться выше кодирующей последовательности. Энхансер может представлять собой энхансер человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатинина или вирусный энхансер, например, из ЦМВ, FMDV, РСВ или ВЭБ. Энхансеры полинуклеотидной функции описаны в патентах США № 5593972, 5962428 и W094/016737, содержание которых в полном объеме включено посредством ссылки.
(6) Интрон
[00118] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более интронов. Каждый интрон может содержать функциональные донорные и акцепторные участки сплайсинга. Интрон может содержать энхансер сплайсинга. Интрон может содержать один или более сигналов, необходимых для эффективного сплайсинга.
(7) Область терминации транскрипции
[00119] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать одну или более областей терминации транскрипции. Область терминации транскрипции может располагаться ниже кодирующей последовательности, чтобы обеспечивать эффективную терминацию. Область терминации транскрипции может быть получена из того же гена, что и вышеописанный промотор, или может быть получена из одного или более других генов.
(8) Инициирующий кодон
[00120] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более инициирующих
кодонов. Инициирующий кодон может располагаться выше кодирующей последовательности. Инициирующий кодон может находиться в рамке с кодирующей последовательностью. Инициирующий кодон может быть связан с одним или более сигналами, необходимыми для эффективной инициации трансляции, например, но не ограничиваясь этим, участком связывания рибосомы.
(9) Терминирующий кодон
[00121] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более терминирующих или стоп-кодонов. Терминирующий кодон может располагаться ниже кодирующей последовательности. Терминирующий кодон может находиться в рамке с кодирующей последовательностью. Терминирующий кодон может быть связан с одним или более сигналами, необходимыми для эффективной терминации трансляции.
(10) Сигнал полнаденилирования
[00122] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать один или более сигналов
полиаденилирования. Сигнал полиаденилирования может содержать
один или более сигналов, необходимых для эффективного
полиаденилирования транскрипта. Сигнал полиаденилирования может
располагаться ниже кодирующей последовательности. Сигнал
полиаденилирования может представлять собой сигнал
полиаденилирования SV4 0, сигнал полиаденилирования ДКП, сигнал
полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал
полиаденилирования человеческого гормона роста (hGH) или сигнал
полиаденилирования человеческого р-глобина. Сигнал
полиаденилирования SV4 0 может представлять собой сигнал полиаденилирования из плазмиды рСЕР4 (Invitrogen, San Diego, СА) .
(11) Лидерная последовательность
[00123] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать одну или более лидерных
последовательностей. Лидерная последовательность может
кодировать сигнальный пептид. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина (Ig),
например, но не ограничиваясь этим, сигнальный пептид IgG и сигнальный пептид IgE.
d. Компоновка конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты
[00124] Как описано выше, рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать одну или более конструкций рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, при этом каждая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более компонентов. Один или более компонентов подробно описаны выше. Один или более компонентов, когда они включены в конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, могут располагаться в любом порядке по отношению друг к другу. В некоторых вариантах реализации один или более компонентов могут располагаться в конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты так, как описано ниже.
(1) Компоновка 1
[00125] В одной компоновке первая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид тяжелой цепи, а вторая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи.
[00126] Первая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может быть помещена в вектор. Вторая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может быть помещена во второй или отдельный вектор. Размещение конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты в векторе более подробно описано ниже.
[00127] Первая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать
промотор, интрон, область терминации транскрипции, инициирующий
кодон, терминирующий кодон и/или сигнал полиаденилирования.
Первая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой
кислоты может дополнительно содержать лидерную
последовательность, причем лидерная последовательность
расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи. Соответственно, сигнальный пептид, кодируемый лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом тяжелой цепи.
[00128] Вторая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать
промотор, инициирующий кодон, терминирующий кодон и сигнал
полиаденилирования. Вторая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать лидерную последовательность, причем лидерная последовательность расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. Соответственно, сигнальный пептид, кодируемый лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом легкой цепи.
[00129] Соответственно, один пример компоновки 1 может
включать первый вектор (и, таким образом, первую конструкцию
рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты),
кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH и СН1, и
второй вектор (и, таким образом, вторую конструкцию
рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты),
кодирующий полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL.
Второй пример компоновки 1 может включать первый вектор (и,
таким образом, первую конструкцию рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH, СН1, шарнирную область, СН2 и СНЗ, и второй вектор (и, таким образом, вторую конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL.
(2) Компоновка 2
[00130] Во второй компоновке конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может содержать
гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты,
кодирующую полипептид тяжелой цепи, и гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид тяжелой цепи, может располагаться выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. В альтернативном варианте гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид легкой цепи, может располагаться выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи.
[00131] Конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты можно помещать в вектор, как более подробно описано ниже.
[00132] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую участок
расщепления протеазой и/или линкерную последовательность. При
включении в конструкцию рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты гетерологичная последовательность
нуклеиновой кислоты, кодирующая участок расщепления протеазой, может располагаться между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. Соответственно, участок расщепления протеазой позволяет разделять полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи на разные полипептиды после экспрессии. В других вариантах реализации при включении в конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты линкерной последовательности она может располагаться между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00133] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты также может содержать промотор, интрон, область терминации транскрипции, инициирующий кодон, терминирующий кодон и/или сигнал полиаденилирования. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более промоторов. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать два промотора так, что один промотор может быть связан с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, а второй промотор может быть связан с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. В других вариантах реализации конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один промотор, связанный с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00134] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать две лидерные последовательности, причем первая лидерная последовательность расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, а вторая лидерная последовательность расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. Соответственно, сигнальный пептид, кодируемый первой лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом тяжелой цепи, а второй сигнальный пептид, кодируемый второй лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом легкой цепи.
[00135] Соответственно, один пример компоновки 2 может включать вектор (и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH и СН1, и полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором линкерная
последовательность расположена между гетерологичной
последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00136] Второй пример компоновки 2 может включать вектор (и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH и СН1, и полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая участок расщепления протеазой, расположена между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00137] Третий пример компоновки 2 может включать вектор (и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH, СН1, шарнирную область, СН2 и СНЗ, и полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором линкерная последовательность расположена между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00138] Четвертый пример компоновки 2 может включать вектор
(и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи,
который содержит VH, СН1, шарнирную область, СН2 и СНЗ, и
полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором
гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты,
кодирующая участок расщепления протеазой, расположена между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
е. Экспрессия из конструкции рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты
[00139] В других вариантах реализации конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать, в числе одного или более компонентов, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид тяжелой цепи, и/или гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи. Соответственно, конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида тяжелой цепи и/или полипептида легкой цепи.
[00140] В случае применения описанной выше компоновки 1 первая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида тяжелой цепи, а вторая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида легкой цепи. В случае применения описанной выше компоновки 2 конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида тяжелой цепи и полипептида легкой цепи.
[00141] После экспрессии, например, но не ограничиваясь этим, в клетке, организме или млекопитающем, полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут формировать синтетическое антитело. В частности, полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, способного связывать антиген. В других вариантах реализации полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, являющегося более иммуногенным по сравнению с антителом, не прошедшим описанную в данном документе сборку. В других вариантах реализации полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, способного вызывать или индуцировать иммунный ответ против антигена.
[00142] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать последовательность,
кодирующую лидерную последовательность. Лидерная
последовательность может располагаться в направлении 5'-конца кодирующей последовательности. В одном варианте реализации N-концевой лидер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0: 2 4 и SEQ ID N0: 25. Примеры последовательностей нуклеиновой кислоты и аминокислотных последовательностей настоящего изобретения, функционально связанных с лидерной последовательностью, приведены в SEQ ID N0: 26-SEQ ID NO: 47. f. Вектор
[00143] Описанную выше конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты можно помещать в один или более векторов. Один или более векторов могут содержать точку начала репликации. Один или более векторов могут представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Один или более векторов могут представлять собой как самореплицирующийся внехромосомный вектор, так и вектор, который интегрируется в геном организма-хозяина.
[00144] Векторы включают, но не ограничиваются этим,
плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любую форму
рекомбинантного вектора "голой ДНК" и т. п. "Вектор" содержит
нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать,
трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Следует понимать, что вектор может представлять собой "голую" нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны
(например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т. д.). Векторы включают, но не ограничиваются этим, репликоны
(например, репликоны РНК, бактериофаги), к которым могут быть прикреплены и становиться реплицированными фрагменты ДНК. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются этим, РНК, автономную самореплицирующуюся циркулярную или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т. п., см., например, патент
США. № 5, 217, 879), и включают как экспрессионные, так и не экспрессионные плазмиды. В некоторых вариантах реализации вектор включает линейную ДНК, ферментативную ДНК или синтетическую ДНК. Когда рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описывается как хозяин "вектора экспрессии", это означает, что они включают как внехромосомную циркулярную, так и линейную ДНК, и ДНК, которые были включены в хромосому (-ы) хозяина. Когда вектор поддерживается в клетке-хозяине, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками во время митоза как автономная структура, либо может быть включен в геном хозяина.
[00145] Один или более векторов могут представлять собой гетерологичную экспрессионную конструкцию, которая в общем случае является плазмидой, которую используют для внесения конкретного гена в клетку-мишень. После того, как экспрессионный вектор попадает в клетку, полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, которые кодируются конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, начинают вырабатываться рибосомальными комплексами клеточного аппарата транскрипции и трансляции. Один или более векторов могут экспрессировать большие количества стабильной матричной РНК и, следовательно, белков.
(1) Экспрессионный вектор
[00146] Один или более векторов могут представлять собой кольцевую плазмиду или линейную нуклеиновую кислоту. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны управлять экспрессией конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Один или более векторов, содержащих конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть химерными, что означает, что по меньшей мере один из их компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из других его компонентов.
(2) Плазмида
[00147] Один или более векторов могут представлять собой плазмиду. Плазмиду можно применять для трансфекции клеток конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Плазмиду можно применять для внесения конструкции
рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты в организм субъекта. Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для генной экспрессии в клетке, в которую внесена плазмида.
[00148] Плазмида также может содержать точку начала репликации млекопитающего для внехромосомной поддержки плазмиды и выработки множества копий плазмиды в клетке. Плазмида может представлять собой pVAX, рСЕР4 или pREP4 от Invitrogen (San Diego, СА) , которые могут содержать точку начала репликации вируса Эпштейна-Барр и область, кодирующую ядерный антиген EBNA-1, которая может обеспечивать многокопийную эписомальную репликацию без интеграции. Скелет плазмиды может представлять собой pAV0242. Плазмида может представлять собой дефективную по репликации аденовирусную плазмиду типа 5 (Ad5).
[00149] Плазмида может представлять собой pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которую можно использовать для выработки белка в Escherichia coli (Е. coli). Плазмида также может представлять собой pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которую можно использовать для выработки белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Плазмида также может принадлежать полной бакуловирусной системе экспрессии МАХВАС(tm) (Invitrogen, San Diego, Calif.), которую можно использовать для выработки белка в клетках насекомых. Плазмида также может представлять собой pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которые можно использовать для выработки белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка (СНО).
(3) РНК-векторы
[00150] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит молекулу РНК, кодирующую антитело настоящего изобретения. В одном варианте реализации молекула РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29,
SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 47. В одном варианте реализации молекула РНК содержит транскрипт, генерированный с молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 47. В одном варианте реализации молекула РНК содержит транскрипт, генерированный с молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 46. Соответственно, в одном варианте реализации в изобретении предложена молекула РНК, кодирующая одно или более антител настоящего изобретения. РНК может иметь дополнительную цепь. Соответственно, в некоторых вариантах реализации молекула РНК может быть транслирована клетками без необходимости каких-либо промежуточных этапов репликации, таких как обратная транскрипция. Молекула РНК, подходящая для использования в изобретении, может иметь 5'-кэп (например, 7-метилгуанозин). Этот кэп может усиливать трансляцию РНК in vivo. 5'-нуклеотид молекулы РНК, используемой в изобретении, может иметь группу трифосфата на 5'-конце. В кэппированной РНК она может быть связана с 7-метилгуанозином через мостик 5'-к-5'. Молекула РНК может иметь поли-А хвост на 3'-конце. Около своего 3'-конца она может также включать последовательность, отвечающую за распознавание поли-А полимеразы (например, AAUAAA). Молекула РНК, используемая в изобретении, обычно является одноцепочечной.
(4) Кольцевой и линейный вектор
[00151] Один или более векторов могут представлять собой
кольцевую плазмиду, которая может трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или существовать внехромосомно (например, автономно-реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации). Вектор может представлять собой pVAX, pcDNA3.О или provax, или любой другой экспрессионный вектор, способный экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты.
[00152] Также в данном документе предложена линейная нуклеиновая кислота или линейная экспрессионная кассета ("ЛЭК"), которую возможно эффективно доставлять субъекту путем электропорации и которая способна экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. ЛЭК может представлять собой любую линейную ДНК, в которой отсутствует какой-либо фосфатный остов. ЛЭК может не содержать каких-либо генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатный остов. ЛЭК может не содержать другие последовательности нуклеиновых кислот, не связанные с экспрессией необходимого гена.
[00153] ЛЭК может быть получена из любой плазмиды, которую возможно линеаризовать. Плазмида может быть способна экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Плазмида может представлять собой pNP (Пуэрто-Рико/34) или рМ2 (Новая Каледония/99). Плазмида может представлять собой WLV009, pVAX, pcDNA3.О или provax, или любой другой экспрессионный вектор, способный экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты.
[00154] ЛЭК может представлять собой рсгМ2. ЛЭК может представлять собой pcrNP. pcrNP и pcrMR могут быть получены из pNP (Пуэрто-Рико/34) и рМ2 (Новая Каледония/99) соответственно.
(5) Вирусные векторы
[00155] В одном варианте реализации предложены вирусные
векторы, способные доставлять нуклеиновую кислоту настоящего изобретения в клетку. Экспрессионный вектор можно доставлять в клетку в форме вирусного вектора. Технологии вирусных векторов хорошо известны в данной области и описаны, например, у Sambrook et al. (2001), и у Ausubel et al. (1997), и в других справочниках по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, используемые в качестве векторов, включают, но не ограничиваются этим, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В основном, подходящий вектор содержит участок начала репликации, функциональный по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, подходящие участки узнавания рестрикционных эндонуклеаз и один или более селектируемых маркеров. (См., например, WO 01/96584; WO 01/29058; и патент США № 6,326,193). Вирусные векторы и особенно ретровирусные векторы стали наиболее широко используемым способом переноса генов в клетки млекопитающих, например клетки человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвируса, вируса простого герпеса I типа, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т. п. См., например, патент США №№ 5 350 674 и 5 585 362. (6) Способ получения вектора
[00156] В данном документе предложен способ получения одного или более векторов, в которые была помещена рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты. После конечного этапа субклонирования вектор можно использовать для инокуляции клеточной культуры в крупномасштабном ферментационном чане с помощью известных в данной области техники способов.
[00157] В других вариантах реализации после конечного этапа субклонирования вектор можно использовать с одним или более устройствами для электропорации (ЭП) . Устройства для ЭП более подробно описаны ниже.
[00158] Один или более векторов можно готовить или получать, используя комбинацию известных устройств и методик, но предпочтительно их получают с помощью методики получения плазмид, описанной в лицензированной, одновременно находящейся на рассмотрении предварительной заявке США № 60/939,792,
поданной 2 3 мая 2 0 07 г. В некоторых примерах описанные в данном документе ДНК-плазмиды можно готовить в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Методики получения также включают применение различных устройств и протоколов, которые являются общеизвестными для специалистов в данной области техники, в дополнение описанным в заявке на патент США, серийный № 60/939,792, включая описанные в лицензированном патенте США № 7,238,522, изданном 3 июля 2007 г. Вышеуказанные заявка и патент, серийный № 60/939,792 и патент США № 7,238,522, соответственно, в полном объеме включены в данный документ. 3. Антитело
[00159] Как описано выше, рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Антитело может связываться или вступать в реакцию с антигеном, который более подробно описан ниже.
[00160] Антитело может содержать набор определяющих комплементарность областей ("CDR") тяжелой цепи и легкой цепи, перемежающих соответственно набор каркасных областей ("FR") тяжелой цепи и легкой цепи, которые обеспечивают поддержку CDR и определяют пространственную взаимосвязь CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельные области из V-области тяжелой или легкой цепи. Начиная с N-конца тяжелой или легкой цепи, эти CDR обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий участок может включать шесть CDR, составляющих набор CDR из каждой V-области тяжелой и легкой цепи.
[00161] Протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с получением нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F(ab)) содержат ковалентный гетеродимер, который содержит интактный антигенсвязывающий участок. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с получением нескольких фрагментов, включая фрагмент F(ab')2/ который содержит оба антигенсвязывающих участка. Соответственно, антитело может представлять собой Fab или F(ab')2. Fab может содержать полипептид
тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может содержать область VH и область СН1. Полипептид легкой цепи Fab может содержать область VL и область CL.
[00162] Антитело может представлять собой иммуноглобулин (Ig) . Ig может представлять собой, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может содержать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может содержать область VH, область СН1, шарнирную область, область СН2 и область СНЗ. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может содержать область VL и область CL.
[00163] Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может представлять собой химерное антитело, одноцепочечное антитело, антитело с созревшей аффинностью, человеческое антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Гуманизированное антитело может представлять собой антитело от отличного от человека вида, которое связывает необходимый антиген, имеющее одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) от отличного от человека вида и каркасные области из молекулы человеческого иммуноглобулина.
[00164] Антитело может представлять собой биспецифическое антитело, более подробно описанное ниже. Антитело может представлять собой бифункциональное антитело, также более подробно описанное ниже.
[00165] Как описано выше, антитело может генерироваться у субъекта после введения субъекту композиции. Антитело может характеризоваться определенным временем полужизни в организме субъекта. В некоторых вариантах реализации антитело можно модифицировать, чтобы продлить или укоротить его время полужизни в организме субъекта. Такие модификации более подробно описаны ниже.
[00166] Антитело может быть дефукозилированным, как более подробно описано ниже.
[00167] Антитело можно модифицировать, чтобы снизить или предотвратить антителозависимое усиление (АЗУ) заболевания, связанного с антигеном, как более подробно описано ниже.
a. Биспецифическое антитело
[00168] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать биспецифическое антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Биспецифическое антитело может связываться или вступать в реакцию с двумя антигенами, например, двумя антигенами, более подробно описанными ниже. Биспецифическое антитело может состоять из фрагментов двух описанных в данном документе антител, что, таким образом, позволяет биспецифическому антителу связываться или вступать в реакцию с двумя необходимыми молекулами-мишенями, которые могут включать антиген, более подробно описанный ниже, лиганд, включая лиганд для рецептора, рецептор, включая лиганд-связывающий участок на рецепторе, комплекс лиганд-рецептор и маркер.
b. Бифункциональное антитело
[00169] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать бифункциональное антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Бифункциональное антитело может связываться или вступать в реакцию с описанным ниже антигеном. Бифункциональное антитело также можно модифицировать, чтобы придать антителу дополнительную функциональность помимо распознавания и связывания антигена. Такая модификация может включать, но не ограничивается этим, сопряжение с фактором Н или его фрагментом. Фактор Н представляет собой растворимый регулятор активации комплемента и, таким образом, может вносить свой вклад в иммунный ответ посредством комплемент-опосредованного лизиса (КОЛ).
c. Продление времени полужизни антитела
[00170] Как описано выше, антитело можно модифицировать, чтобы продлить или укоротить время полужизни антитела в организме субъекта. Модификация может продлевать или укорачивать время полужизни антитела в сыворотке субъекта.
[00171] Модификация может присутствовать в константной области антитела. Модификация может представлять собой одну или более аминокислотных замен в константной области антитела, которые продлевают время полужизни антитела по сравнению со временем полужизни антитела, не содержащего одну или более
аминокислотных замен. Модификация может представлять собой одну или более аминокислотных замен в домене СН2 антитела, которые продлевают время полужизни антитела по сравнению со временем полужизни антитела, не содержащего одну или более аминокислотных замен.
[00172] В некоторых вариантах реализации одна или более аминокислотных замен в константной области могут включать замещение остатка метионина в константной области остатком тирозина, остатка серина в константной области остатком треонина, остатка треонина в константной области остатком глутамата или любую их комбинацию, продлевая, таким образом, время полужизни антитела.
[00173] В других вариантах реализации одна или более аминокислотных замен в константной области могут включать замещение остатка метионина в домене СН2 остатком тирозина, остатка серина в домене СН2 остатком треонина, остатка треонина в домене СН2 остатком глутамата или любую их комбинацию, продлевая, таким образом, время полужизни антитела.
d. Дефукозилирование
[00174] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать антитело, которое не является фукозилированным (т. е. дефукозилированное антитело или нефукозилированное антитело), его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Фукозилирование включает добавление к молекуле сахара фукозы, например, присоединение фукозы к N-гликанам, О-гликанам и гликолипидам. Соответственно, в дефукозилированном антителе фукоза не присоединена к углеводным цепям константной области. В свою очередь, это отсутствие фукозилирования может
улучшать связывание FcyRIIIa и антителозависимую клеточную цитотоксическую (АЗКЦ) активность антитела по сравнению с фукозилированным антителом. Следовательно, в некоторых вариантах реализации нефукозилированное антитело может проявлять повышенную активность АЗКЦ по сравнению с фукозилированным антителом.
[00175] Антитело можно модифицировать так, чтобы
предотвратить или ингибировать фукозилирование антитела. В некоторых вариантах реализации такое модифицированное антитело может проявлять повышенную активность АЗКЦ по сравнению с немодифицированным антителом. Модификация может присутствовать в тяжелой цепи, легкой цепи или их комбинации. Модификация может представлять собой одну или более аминокислотных замен в тяжелой цепи, одну или более аминокислотных замен в легкой цепи или их комбинацию.
е. Сниженный ответ АЗУ
[00176] Антитело можно модифицировать, чтобы снизить или предотвратить антителозависимое усиление (АЗУ) заболевания, связанного с антигеном, но при этом нейтрализовать антиген.
[00177] В некоторых вариантах реализации антитело можно модифицировать так, чтобы оно содержало одну или более аминокислотных замен, которые снижают или предотвращают связывание антитела с FcyRla. Одна или более аминокислотных замен могут присутствовать в константной области антитела. Одна или более аминокислотных замен могут включать замещение остатка лейцина остатком аланина в константной области антитела, т. е. также называемое в данном документе LA, мутацией LA или заменой LA. Одна или более аминокислотных замен могут включать замещение каждого из двух остатков лейцина остатком аланина в константной области антитела, которое также называется в данном документе LALA, мутацией LALA или заменой LALA. Присутствие замен LALA может предотвращать или блокировать связывание антитела с FcyRla и, таким образом, модифицированное антитело не усиливает заболевание или не вызывает АЗУ заболевания, связанного с антигеном, но при этом нейтрализует антиген.
4. Антиген
[00178] Синтетическое антитело направлено на данный антиген
или его фрагмент или вариант. Антиген может представлять собой
последовательность нуклеиновой кислоты, аминокислотную
последовательность, полисахарид или их комбинацию.
Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Аминокислотная последовательность может представлять собой
белок, пептид, его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Полисахарид может представлять собой полисахарид, кодируемый нуклеиновой кислотой.
[00179] Антиген может быть получен из бактерии. Антиген может быть связан с бактериальной инфекцией. В одном варианте реализации антиген может быть бактериальным фактором вирулентности.
[00180] В одном варианте реализации синтетическое антитело настоящего изобретения нацелено на два или более антигенов. В одном варианте реализации по меньшей мере один антиген для биспецифического антитела выбран из антигенов, описанных в настоящем документе. В одном варианте реализации два или более антигенов выбраны из антигенов, описанных в настоящем документе.
а. Бактериальные антигены
[00181] Бактериальный антиген может представлять собой
бактериальный антиген, его фрагмент или его вариант. Бактерии
могут принадлежать любому из следующих типов: Acidobacteria,
Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes, Caldiserica,
Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes,
Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus,
Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes,
Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira,
Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes,
Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae и
Verrucomicrobia.
[00182] Бактерия может быть грамположительной бактерией или грамотрицательной бактерией. Бактерия может быть аэробной бактерией или анаэробной бактерией. Бактерия может быть аутотрофной бактерией или гетеротрофной бактерией. Бактерия может быть мезофильной, нейтрофильной, экстремофильной, ацидофильной, алкалофильной, термофильной, психрофильной, галофильной или осмофильной.
[00183] Бактерия может представлять собой бактерию сибирской язвы, устойчивую к антибиотикам бактерию, болезнетворную бактерию, бактерию, вызывающую пищевое отравление, инфекционную бактерию, бактерию сальмонеллы,
бактерию стафилококка, бактерию стрептококка или бактерию столбняка. Бактерия может представлять собой микобактерию, Clostridium tetani, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, метициллин-резистентную Staphylococcus aureus (MRSA) или Clostridium difficile. Бактерия может представлять собой Pseudomonas aeruginosa.
(а) Антигены Pseudomonas aeruginosa
[00184] Бактериальный антиген может представлять собой антиген Pseudomonas aeruginosa, его фрагмент или его вариант. Антиген Pseudomonas aeruginosa может происходить из фактора вирулентности. Факторы вирулентности, связанные с Pseudomonas aeruginosa, включают, но не ограничиваются этим, структурные компоненты, ферменты и токсины. Фактор вирулентности Pseudomonas aeruginosa может представлять собой один из перечисленного: экзополисахарид, адгезии, липополисахарид, пиоцианин, экзотоксин А, экзотоксин S, цитотоксин, эластазу, щелочную протеазу, фосфолипазу С, рамнолипид и компоненты бактериальной системы секреции.
[00185] В одном варианте реализации антиген представляет
собой внеклеточный полисахарид (например, альгинат, Pel и Psl).
В одном варианте реализации антиген является одним из локусов
синтеза полисахаридов {psl), содержащимся в нем геном (например,
pslA, pslB, pslC, pslD, pslE, pslF, pslG, pslH, psll, pslJ,
pslK, pslL, pslM, pslN и pslO), кодированным им белком или
ферментом (например, гликозилтрансфераза,
фосфоманнозоизомераза/бБР-Б-маннозапирофосфорилаза, транспортер, гидролаза, полимераза, ацетилаза, дегидрогеназа и топоизомераза) или полученным из него продуктом (например экзополисахаридом Psl называемым "Psl").
[00186] В одном варианте реализации антиген является компонентом бактериальной системы секреции. В бактериях описаны шесть различных классов систем секреции (типы I-VI), пять из которых (типы I, II, II, V и VI) встречаются в грамотрицательных бактериях, включая Pseudomonas aeruginosa. В одном варианте реализации антиген представляет собой одно из гена (например, гена арг или has), или белка (например, AprD, AprE, AprF, HasD,
HasE, HasF и HasR), или секретируемого белка (например, АргА, АргХ и HasAp) системы секреции I типа. В одном варианте реализации антиген представляет собой одно из гена (например, xcpA/pilD, xphA, xqhA, хсрР до Q и xcpR до Z) , или белка
(например, GspC до М, GspAB, GspN, GspO, GspS, XcpT до ХсрХ, FppA), или секретируемого белка (например, LasB, LasA, PlcH, PlcN, PlcB, CbpD, ToxA, PmpA, PrpL, LipA, LipC, PhoA, PsAP, LapA) системы секреции II типа. В одном варианте реализации антиген представляет собой одно из гена (например, гена psc, per, pop или exs) , или белка (например, PscC, PscE до PscF, PscJ, PscN, PscP, PscW, PopB, PopD, PcrH и PcrV), или секретируемого белка (например, ExoS, ЕхоТ, ExoU и ExoY) системы секреции III типа. В одном варианте реализации антиген представляет собой регулятор системы секреции III типа
(например, ExsA и ExsC). В одном варианте реализации антиген представляет собой одно из гена (например, estA), или белка
(например, EstA, СирВЗ, СирВ5 и LepB), или секретируемого белка
(например, EstA, LepA, и CupB5) системы секреции V типа. В одном варианте реализации антиген представляет собой одно из гена
(например, ген HSI-I, HSI-II и HSI-III), или белка (например, Fhal, ClpVl, белка VgrG или белка Нср), или секретируемого белка
(например, Hcpl) системы секреции VI типа.
5. Вспомогательные вещества и другие компоненты композиции
[00187] Композиция может дополнительно содержать
фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может представлять собой функциональные молекулы, такие как молекулы базовых растворов, носителей или разбавителей. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может представлять собой облегчающий трансфекцию агент, который может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИМКОМ), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные облегчающие
трансфекцию агенты.
[00188] Облегчающий трансфекцию агент представляет собой полианион, поликатион, включая поли-Ъ-глутамат (LGS), или липид. Облегчающий трансфекцию агент представляет собой поли-Ъ-глутамат, а поли-Ъ-глутамат может присутствовать в композиции в концентрации менее б мг/мл. Облегчающий трансфекцию агент, который также может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИМКОМ), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновую кислоту, также можно использовать для введения в сочетании с композицией. Композиция также может содержать облегчающий трансфекцию агент, такой как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосом (смотрите, например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные облегчающие трансфекцию агенты. Облегчающий трансфекцию агент представляет собой полианион, поликатион, включая поли-Ъ-глутамат (LGS), или липид. Концентрация трансфекционного агента в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[00189] Композиция может дополнительно содержать генетический вспомогательный агент, как описано в заявке на патент США № 021,579, поданной 1 апреля 1994 г., содержание которой в полном объеме включено путем ссылки.
[00190] Композиция может содержать ДНК в количестве от около 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от около 1 микрограмма до около 10 миллиграммов; или предпочтительно от около 0,1 микрограмма до около 10 миллиграммов; или более предпочтительно от около 1 миллиграмма до около 2 миллиграммов. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит от около 5 нанограмм до около 1000 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 10 нанограмм до
около 8 00 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 0,1 до около 500 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 1 до около 350 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 25 до около 250 микрограмм, от около 100 до около 200 микрограмм, от около 1 нанограмма до 100 миллиграмм; от около 1 микрограмма до около 10 миллиграмм; от около 0,1 микрограмма до около 10 миллиграмм; от около 1 миллиграмма до около 2 миллиграмм, от около 5 нанограмм до около 1000 микрограмм, от около 10 нанограмм до около 800 микрограмм, от около 0,1 до около 500 микрограмм, от около 1 до около 350 микрограмм, от около 25 до около 250 микрограмм, от около 100 до около 2 00 микрограмм ДНК.
[00191] Композиция может быть приготовлена в соответствии с применяемым режимом введения. Инъекционная фармацевтическая композиция может быть стерильной, апирогенной и не содержать частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Добавки для придания изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Композиция может содержать сосудосуживающий агент. Изотонические растворы могут включать фосфатно-солевой буфер. Композиция может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение длительных периодов времени, включая LGS или поликатионы или полианионы.
6. Способ получения синтетического антитела
[00192] Настоящее изобретение также относится к способу генерации синтетического антитела. Этот способ может включать введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, применяя способ доставки, более подробно описанный ниже. Соответственно, синтетическое антитело генерируется в организме субъекта или in vivo после введения субъекту композиции.
[00193] Этот способ также может включать внесение композиции в одну или более клеток и, следовательно, синтетическое антитело может генерироваться или вырабатываться в
одной или более клетках. Этот способ также может включать внесение композиции в одну или более тканей, например, но без ограничений, кожу и мышцы, и, следовательно, синтетическое антитело может генерироваться или вырабатываться в одной или более тканях.
7. Способ определения или скрининга антитела
[00194] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения или скрининга описанного выше антитела, которое вступает в реакцию или связывается с описанным выше антигеном. В способе определения или скрининга антитела можно использовать антиген с применением методик, известных специалистам в данной области техники, для определения или скрининга антитела. Такие методики включают, но не ограничиваются этим, выбор антитела из библиотеки (например, фагового дисплея) и иммунизацию животного с последующим выделением и/или очисткой антитела.
8. Способ доставки композиции
[00195] Настоящее изобретение также относится к способу доставки композиции нуждающемуся в этом субъекту. Способ доставки может включать введение композиции субъекту. Введение может включать, но не ограничивается этим, инъекцию ДНК с in vivo электропорацией или без нее, опосредованную липосомами доставку и облегчаемую наночастицами доставку.
[00196] Млекопитающее, получающее доставку композиции, может представлять собой человека, примата, отличного от человека примата, корову, крупный рогатый скот, овцу, козу, антилопу, бизона, буйвола, бизона, быков, оленя, ежей, слонов, ламу, альпака, мышей, крыс и кур.
[00197] Композицию можно вводить разными путями, включая
пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный,
ректальный, трансмукозальный, местный, ингаляционный,
буккальный, интраплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и внутрисуставной или их комбинацию. В случае ветеринарного применения композицию можно вводить в подходящем приемлемом составе в соответствии с общепринятой ветеринарной
практикой. Ветеринар может без труда определить режим дозирования и путь введения, которые наиболее подходит для конкретного животного. Композицию можно вводить с помощью традиционных шприцов, безыгольных устройств для инъекций, "пушек для бомбардировки микрочастицами" или других физических способов, таких как электропорация ("ЭП"), "гидродинамический способ" или ультразвук, а. Электропорация
[00198] Введение композиции посредством электропорации можно осуществлять, используя устройства для электропорации, которые могут быть выполнены с возможностью подачи в необходимые ткани млекопитающего импульса энергии, эффективного для стимуляции образования обратимых пор в клеточных мембранах, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток, аналогичный предварительно заданному пользователем входному току. Устройство для электропорации может содержать электропорационный компонент и комплект электродов или комплект рукояток. Электропорационный компонент может содержать и включать один или более различных элементов устройств для электропорации, включая: контроллер, генератор формы тока, тестер импеданса, устройство регистрации формы сигнала, элемент ввода, элемент отчета о состоянии, порт связи, компонент памяти, источник питания и переключатель питания. Электропорацию можно осуществлять, используя устройство для in vivo электропорации, например, систему CELLECTRA ЕР (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) или электропоратор Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) , чтобы облегчить трансфекцию клеток плазмидой.
[00199] Электропорационный компонент может функционировать как один элемент устройств для электропорации, а другие элементы являются отдельными элементами (или компонентами), связанными с электропорационным компонентом. Электропорационный компонент может функционировать как более чем один элемент устройств для электропорации, который может быть связан с другими элементами устройств для электропорации, отдельными от электропорационного компонента. Элементы и устройства для электропорации, являющиеся
частями одного электромеханического или механического устройства, могут не ограничиваться, так как эти элементы могут функционировать как одно устройство или как отдельные элементы, связанные друг с другом. Электропорационный компонент может подавать импульс энергии, который обеспечивает постоянный ток в необходимой ткани, и содержит механизм обратной связи. Комплект электродов может включать матрицу из электродов, содержащую некоторое количество пространственно упорядоченных электродов, при этом комплект электродов получает импульс энергии от электропорационного компонента и доставляет его в необходимую ткань через электроды. По меньшей мере один из некоторого количества электродов является нейтральным во время подачи импульса энергии и измеряет импеданс в необходимой ткани и передает значение импеданса на электропорационный компонент. Механизм обратной связи может получать измеренное значение импеданса и может корректировать импульс энергии, подаваемый электропорационным компонентом, для поддержания постоянного тока.
[00200] Некоторое количество электродов могут подавать импульс энергии на децентрализованную схему. Некоторое количество электродов могут подавать импульс энергии на децентрализованную схему посредством управления электродами согласно программируемой последовательности, а программируемая последовательность вводится пользователем в электропорационный компонент. Программируемая последовательность может включать некоторое количество импульсов, подаваемых в последовательности, причем каждый импульс из некоторого количества импульсов подается по меньшей мере двумя активными электродами с одним нейтральным электродом, который измеряет импеданс, а следующий импульс из некоторого количества импульсов подается другим из по меньшей мере двух активных электродов с одним нейтральным электродом, который измеряет импеданс.
[00201] Механизм обратной связи может осуществляться аппаратным или программным обеспечением. Механизм обратной связи может осуществляться аналоговым замкнутым контуром. Обратная связь происходит каждые 50 мкс, 2 0 мкс, 10 мкс или 1 мкс, но
предпочтительно представляет собой обратную связь в режиме реального времени или мгновенную (т. е. по существу мгновенную по определению доступными методами определения времени ответа). Нейтральный электрод может измерять значение импеданса в необходимой ткани и передавать значение импеданса на механизм обратной связи, а механизм обратной связи в ответ на значение импеданса корректирует импульс энергии для поддержания значения постоянного тока, аналогичного предварительно заданному току. Механизм обратной связи может поддерживать постоянный ток непрерывно и мгновенно во время подачи импульса энергии.
[00202] Примеры устройств для электропорации и способов электропорации, которые могут облегчить доставку композиции согласно настоящему изобретению, включают описанные в патенте США № 7245963 авторства Draghia-Akli, с соавт., публикации патента США 2 0 05/0052630, поданной Smith, с соавт., содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Другие устройства для электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для облегчения доставки композиции, включают предложенные в одновременно находящейся на рассмотрении заявке одних заявителей на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., которая заявляет приоритет согласно 35 USC 119(e) предварительных заявок США № 60/852,149, поданной 17 октября 2006 г., и 60/978,982, поданной 10 октября 2007 г., которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
[00203] В патенте США № 7245963 авторства Draghia-Akli, с соавт. описаны модульные системы электродов и их применение для облегчения внесения биомолекул в клетки выбранной ткани в организме или растении. Модульные системы электродов могут содержать некоторое количество игольчатых электродов; гиподермическую иглу; электрический соединитель, который обеспечивает проводящее соединение программируемого импульсного контроллера постоянного тока с некоторым количеством игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может брать некоторое количество игольчатых электродов, которые находятся на опорной конструкции и плотно вставлять их в выбранную ткань в организме
или растении. Затем происходит доставка биомолекул в выбранную ткань через гиподермическую иглу. Происходит активация программируемого импульсного контроллера постоянного тока и применение электрического импульса постоянного тока к некоторому количеству игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает внесение биомолекулы в клетку между некоторым количеством электродов. Полное содержание патента США № 7245963 включено в данный документ посредством ссылки.
[00204] В публикации патента США 2005/0052630, поданной Smith, с соавт., описано устройство для электропорации, которое можно использовать, чтобы эффективным образом облегчать внесение биомолекул в клетки выбранной ткани в организме или растении. Устройство для электропорации содержит электрокинетическое устройство ("ЭКУ устройство") , чья работа определяется программным или встроенным программным обеспечением. ЭКУ устройство создает ряд программируемых профилей импульсов постоянного тока между электродами в матрице под управлением пользователем и на основании введенных параметров импульсов и позволяет хранить и получать данные по форме тока. Устройство для электропорации также содержит сменный электродный диск, содержащий матрицу из игольчатых электродов, центральный инъекционный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Полное содержание публикации патента США 2005/0052630 включено в данный документ посредством ссылки.
[00205] Электродные матрицы и способы, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/0052630, можно адаптировать для глубокого проникновения не только в ткани, такие как мышцы, но также в другие ткани или органы. Вследствие конфигурации электродной матрицы инъекционная игла (для доставки биомолекулы по выбору) также полностью вставляется в целевой орган, а инъекция проводится перпендикулярно целевой ткани в области, которая заранее намечена электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/005263, предпочтительно имеют длину 20 мм и калибр 21.
[00206] Кроме того, подразумевается, что в некоторых
вариантах реализации, которые включают устройства для электропорации и их применение, используются устройства для электропорации, описанные в следующих патентах: патент США 5273525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6110161, выданный 2 9 августа 2000 г., 62 61281, выданный 17 июля 2 001 г., и 6958060, выданный 25 октября 2005 г., и патент США 6939862, выданный б сентября 2 0 05 г. Кроме того, в данном документе предусмотрено применение материалов из патентов, относящихся к предмету обсуждения, таких как патент США 6697 669, выданный 24 февраля 2004 г., который относится к доставке ДНК с помощью различных устройств, и патент США 7 328064, выданный 5 февраля 2 008, относящийся к способу инъекции ДНК. Вышеуказанные патенты в полном объеме включены посредством ссылки. 9. Способ лечения
[00207] Также в данном документе предложен способ лечения, защиты от и/или предотвращения заболевания у нуждающегося в этом субъекта путем генерации синтетического антитела в организме субъекта. Способ может включать введение композиции субъекту. Введение композиции субъекту можно осуществлять, используя описанный выше способ доставки.
[00208] В некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ лечения, защиты от и/или предотвращения бактериальной инфекции. В одном варианте реализации способ обеспечивает лечение, защиту от и/или предотвращение образования бактериальной биопленки. В одном варианте реализации способ обеспечивает лечение, защиту от и/или предотвращение инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, или образования биопленки. В одном варианте реализации способ обеспечивает лечение, защиту от и/или предотвращение инфицирования раны бактерией Pseudomonas aeruginosa.
[00209] После генерации синтетического антитела в организме субъекта синтетическое антитело может связываться или вступать в реакцию с антигеном. Такое связывание может нейтрализовать антиген, блокировать распознавание антигена другой молекулой, например, белком или нуклеиновой кислотой, и вызывать или индуцировать иммунный ответ на антиген, осуществляя, таким
образом, лечение, защиту от и/или предотвращение заболевания, связанного с антигеном, у субъекта.
[00210] Доза композиции может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента/кг массы тела/время и может составлять от 2 0 мкг до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Композицию можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 сутки. Число доз композиции для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10.
10. Применение в комбинации с антибиотиками
[00211] В настоящем изобретении также предложен способ лечения, защиты от и/или предотвращения заболевания у нуждающегося в этом субъекта путем введения комбинации синтетического антитела и терапевтического антибиотика.
[00212] Синтетическое антитело и антибиотик можно вводить, используя любой подходящий способ, так, чтобы обе составляющие комбинации синтетического антитела и антибиотика присутствовали в организме субъекта. В одном варианте реализации способ может включать введение первой композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению, любым из способов, подробно описанных выше, и введение второй композиции, содержащей антибиотик, менее чем через 1, менее чем через 2, менее чем через 3, менее чем через 4, менее чем через 5, менее чем через б, менее чем через 7, менее чем через 8, менее чем через 9 или менее чем через 10 суток после введения синтетического антитела. В одном варианте реализации способ может включать введение первой композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению, любым из способов, подробно описанных выше, и введение второй композиции, содержащей антибиотик, более чем через 1, более чем через 2, более чем через 3, более чем через 4, более чем через 5, более чем через б, более чем через 7, более чем через 8, более чем через 9 или более чем через 10 суток после введения синтетического антитела. В одном варианте реализации способ может включать введение первой композиции, содержащей антибиотик, и введение второй композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению, любым из способов,
подробно описанных выше, менее чем через 1, менее чем через 2, менее чем через 3, менее чем через 4, менее чем через 5, менее чем через б, менее чем через 7, менее чем через 8, менее чем через 9 или менее чем через 10 суток после введения антибиотика. В одном варианте реализации способ может включать введение первой композиции, содержащей антибиотик, и введение второй композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению, любым из способов, подробно описанных выше, более чем через 1, более чем через 2, более чем через 3, более чем через 4, более чем через 5, более чем через б, более чем через 7, более чем через 8, более чем через 9 или более чем через 10 суток после введения антибиотика. В одном варианте реализации способ может включать введение первой композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению, любым из способов, подробно описанных выше, и введение второй композиции, содержащей антибиотик, одновременно. В одном варианте реализации способ может включать введение первой композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению, любым из способов, подробно описанных выше, и введение второй композиции, содержащей антибиотик, одновременно. В одном варианте реализации способ может включать введение одной композиции, содержащей синтетическое антитело согласно изобретению и антибиотик.
[00213] Неограничивающие примеры антибиотиков, которые можно использовать в комбинации с синтетическим антителом согласно изобретению, включают аминогликозиды (например, гентамицин, амикацин, тобрамицин), хинолоны (например, ципрофлоксацин, левофлоксацин), цефалоспорины (например, цефтазидим, цефепим, цефоперазон, цефпиром, цефтобипрол), антипсевдомонадные пенициллины: карбоксипенициллины (например, карбенициллин и тикарциллин) уреидопенициллины (например, мезлоциллин, азлоциллин и пиперациллин), карбапенемы (например, меропенем, имипенем, дорипенем), полимиксины (например, полимиксин В и колистин) и монобактамы (например, азтреонам).
[00214] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, проиллюстрированных следующими неограничивающими примерами.
11. Примеры
[00215] Настоящее изобретение дополнительно
проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя в них и указаны предпочтительные варианты реализации изобретения, приведены исключительно в иллюстративных целях. Из приведенного выше обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники может установить важные характеристики этого изобретения и, не выходя за рамки его сущности и объема, может осуществлять различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его под различные потребности и условия. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным в данном документе станут очевидны для специалистов в данной области техники из вышеприведенного описания. Также подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
EXAMPLE 1: Сконструированное биспецифическое, кодированное ДНК антитело IgG (DMAb) защищает от Pseudomonas aeruginosa в модели испытания с летальной пневмонией
[00216] В представленных в настоящем документе исследованиях описана разработка и анализ синтетических DMAb, кодирующих моноспецифическое антитело IgG к PcrV (DMAb-aPcrV) и биспецифическое антитело АВС123 (DMAb-BiSPA), потенциально пригодное для использования в клинических условиях для продукции и активности in vivo. Производство DMAb in vivo может быстро продуцировать функциональные и защитные титры обеих конструкций. Эти DMAb могут сохраняться и иметь схожую эффективность с mAb, полученными в ходе биопроцесса, наряду с сопоставимым предотвращением колонизации основных органов бактерией Р. aeruginosa.
[00217] В настоящем исследовании показано, что mAb к Р. aeruginosa может кодироваться в синтетических ДНК-векторах, DMAb, и продуцироваться in vivo скелетными мышцами. DMAb к Pseudomonas эффективно связываются с терапевтическими мишенями и оказывают защитное действие в мышиной модели летальной пневмонии, вызванной агрессивным штаммом P. aeruginosa. При
введении однократной дозы DMAb временно экспрессируется в течение 3-4 месяцев, и при этом защита от летальной инфекции сравнима с защитой, обеспечиваемой введением мышам очищенного IgG. Это является значительным прогрессом по сравнению с долгосрочным применением mAb, поскольку DMAb могут непрерывно экспрессироваться в мышцах до полного исчезновения плазмиды. В дополнение к обычному применению еще одно предсказуемое преимущество DMAb к P. Aeruginosa будет наблюдаться у пациентов из группы высокого риска с рецидивирующими инфекциями, связанными с хроническими заболеваниями или имплантированными устройствами, где DMAb могут уменьшить потребность в применении схем длительного лечения антибиотиками. Кроме того, показано, что DMAb также могут функционировать синергично с обычно применяемым антибиотиком меропенемом. Синергичный эффект комбинации DMAb и антибиотиков означает, что эта стратегия может иметь потенциал уменьшения применения схем лечения антибиотиками, тем самым уменьшая продолжительность воздействия антибиотиков на пациентов. Эта дополнительная активность эквивалентна активности, наблюдаемой с белковым IgG в предыдущих исследованиях (DiGiandomenico et al., 2014, Sci Transl Med 6, 262ral55). В совокупности эти результаты означают, что доставка ДНК полноразмерных mAb IgG является многообещающей стратегией платформы для профилактики серьезных бактериальных инфекций и, возможно, для других терапевтических показаний. Было показано, что все полученные биологическими методами mAb IgG к псевдомонадам (антитело к Psl, антитело к PcrV и АВС123), защищают от клинических изолятов P. aeruginosa, полученных из различных серотипов, множественных фенотипов секреции 3-го типа (цититоксический штамм в сравнении с инвазивным; ExoU+, ExoS-; ExoU-, ExoS+ соответственно), и из множественных мест локализации инфекции (DiGiandomenico et al. , 2012, J Exp Med 209, 1273-1287; Warrener et al. , 2014, Antimicrob Agents Chemother 58, 4384-4391; DiGiandomenico et al. , 2014, Sci Transl Med 6, 262ral55; Thaden et al., 2016, J Infect Dis 213, 640-648; Zegans er al., 2016, JAMA Ophthalmol 134, 383-389).
[00218] Далее будут описаны материалы и способы
[00219] Клеточные линии и бактерии
[00220] Клетки почек эмбриона человека (НЕК) 293Т поддерживали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко
(DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Клеточные линии поддерживали в условиях без микоплазмы. Обычное исследование проводили в Университете Пенсильвании. Все клетки поддерживали с низким количеством пересевов. Для всех экспериментов по инфицированию использовали клинический изолят 6077 (РА 6011) кератита, вызванного цитотокическим штаммом
(ExoU+) P. aeruginosa.
[00221] Конструкция и экспрессия DMAb
[00222] Получали последовательности белка PcrV - антитела к P. Aeruginosa с одной специфичностью (клон V2L2MD) (Warrener et al., 2014, Antimicrob Agents Chemother 58, 4384-4391) и сконструированное биспецифическое антитело к P. aeruginosa (с двойной специфичностью к PcrV и Psl, клон АВС123) (DiGiandomenico et al. , 2014, Sci Transl Med 6, 262ral55) . Для увеличения экспрессии в клетках млекопитающих кодоны нуклеотидной последовательности каждой из тяжелой цепи человеческого IgGl и легкой цепи 1дк были оптимизированы для смещений, характерных как для мыши, так и человека (Graf et al., 2004, Methods Mol Med 94, 197-210; Demi et al., 2001, J Virol 75, 10991-11001) . РНК последовательностей также оптимизировали для улучшения стабильности мРНК и эффективной трансляции на рибосоме (Schneider et al. , 1997, J Virol 71, 4892-4903; Andre et al., 1997, J Virol 72, 1497-1503), что приводило к увеличению выхода белка (Fath et al. , 2011, PLoS One 6, е1759б) . Затем оптимизированные гены тяжелой и легкой цепей вставляли в экспрессионный вектор ДНК pGXOOOl под контролем промотора человеческого цитомегаловируса (hCMV) и поли-А бычьего гормона роста (BGH).
[00223] Оба гена кодировались в cis, разделенные сайтом расщепления фурином и пептидом Р2А. В результате получали две плазмиды: DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA. Клетки НЕК 293Т трансфицировали ДНК DMAb с использованием реагента для
трансфекции GeneJammer (Agilent, Wilmington, DE) . Клеточные супернатанты и клеточные лизаты собирали через 4 8 часов после трансфекции и анализировали в отношении продукции человеческого IgG с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ИФА) и вестерн-блота.
[00224] Иммунофлуоресценция мышечной ткани мышей
[00225] Мышам линии BALB/c вводили 100 мкг DMAb посредством В/М инъекции в ПБ мышцу с последующим проведением В/М-ЭП. Ткани собирали через 3 дня после инъекции, фиксировали в 4% нейтральном буферном формалине (ВВС Biochemical, Washington State) и погружали в 30% (мае./об.) сахарозу (Sigma, МО) в деионизированной (ДИ) воде. Затем ткани заливали в соединение с оптимальной температурой для нарезания (О.С.Т.) (Sakura Finetek, СА) и мгновенно замораживали. Блоки замороженной ткани нарезали на срезы толщиной 18 мкм. Срезы мышц инкубировали с блокирующим буфером (0,3% (об./об.) тритон-Х (Sigma), 2% (об./об.) ослиной сыворотки в фосфатно-солевом буферном растворе [ФСБР]) в течение 30 мин, покрывали парафильмом. Антитело козы к человеческому IgG-Fc-фрагменту (А-80-104А, Bethyl, Texas) разводили в соотношении 1:100 в буфере для инкубирования (1% (мае./об.) БСА (Sigma), 2% (об./об.) ослиной сыворотки, 0,3% (об./об.) тритона-X (Sigma) и 0,025% (об./об.) 1 г/мл азида натрия (Sigma) в ФСБР). К каждому срезу добавляли 50 мкл раствора для окрашивания и инкубировали в течение 2 ч. Срезы трижды промывали по 5 мин в 1-кратном ФСБР. Ослиное антитело к козьему IgG AF488 (аЫ50129, Abeam, USA) разводили в соотношении 1:200 в буфере для инкубирования, и добавляли по 50 мкл к каждому срезу. После 1 часа инкубирования срезы промывали, помещали на стекло в среду Fluoromount с DAPI (SouthernBiotech, AL) и накрывали.
[00226] Экспрессию in vivo конструкций DMAb визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа ВХ51 (Olympus), оснащенного монохроматической камерой Retiga3000 (Qlmaging).
[00227] Количественное определение человеческого IgG с помощью ИФА и посредством антицитотоксической активности
[00228] На девяностошестилуночные планшеты для ИФА со способностью высокого связывания наносили 10 мкг/мл очищенного
антитела к человеческому IgG-Fc и инкубировали в течение ночи при 4 ° С. На следующий день планшеты промывали и блокировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 часа с использованием ФСБР, содержащего 10% фетальную бычью сыворотку (ФБС) . Выполняли серийное двукратное разведение образцов, переносили их в заблокированный планшет и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве стандарта использовали IgGK человека. После инкубации образцы зондировали антителом к IgGK человека, конъюгированным с пероксидазой хрена, в разведении 1:20000. Планшеты проявляли с использованием субстрата о-фенилендиаминдигидрохлорида, и останавливали реакцию с помощью 2 н. раствора H2S04. Для считывания планшетов при ОП 450 нм использовали спектрофотометр BioTek Synergy2. Альтернативно проводили количественное определение уровня человеческого IgG в сыворотке, как описано выше, за исключением использования антиидиотипических антител mAb (0,05 мкг/лунка, суспендированного в 0,2 М буфера бикарбоната натрия, рН 9,4), специфичном для V2L2MD или АВС123 в качестве реагента для захвата. В качестве стандарта использовали очищенное V2L2MD или АВС123.
[00229] Также проводили количественное определение уровня DMAb в сыворотке с использованием 3 8 4-луночных черных планшетов MaxiSorp (с нанесением 10 мкг/мл антитела козы к человеческому IgG (H+L). Планшеты промывали и блокировали в течение 1-2 часов при комнатной температуре с помощью блокатора казеина в ФСБР. После блокирования стандарт, содержащий АВС12 3 или V2L2MD, серийно разводили в планшете в соотношении 1:2, в то время как образцы сыворотки разводили в соотношении 1:20, 1:40, 1:80 и 1:160. Затем в течение 1 часа при комнатной температуре инкубировали планшеты, содержащие образцы. После промывки планшеты зондировали антителом осла к человеческому IgG-HRP в разведении 1:4000 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки иммунную реакцию проявляли путем добавления реагента SuperSignal ELISA Pico и считывали флуоресценцию на приборе Perkin Elmer Envision.
[00230] Проводили количественное определение уровня DMAb в сыворотке на основе антицитотоксической активности, опосредованной DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA, которая позволяет измерять защиту клеток А549 от цитотоксических эффектов РА 6077. Активность мышиной сыворотки сравнивали со стандартной кривой интактной мышиной сыворотки с добавлением IgG V2L2MD.
[00231] ИФА связывания
[00232] На девяностошестилуночные планшеты для ИФА на ночь наносили белок PcrV Pseudomonas в концентрации 0,5 мкг/мл. На следующий день выполняли серийное двукратное разведение образцов сыворотки от животных, которым вводили DMAb, после чего образцы переносили в заблокированный планшет. Образцы зондировали антителом к человеческому IgG H+L, конъюгированному с HRP, в разведении 1:5000, и проявляли с использованием OPD-субстрата.
[00233] Вестерн-блот
[00234] Клеточные лизаты клеток, трансфицированных DMAb, собирали в буфер для лизиса клеток. Образцы центрифугировали при скорости 2 0 000 об/мин и собирали супернатант, содержащий белковую фракцию. Проводили количественную оценку образцов с использованием анализа с бицинхониновой кислотой (ВСА), и загружали 10 мкг общего лизата на 4-12% гель Bis-Tris для проведения электрофореза ДСН-ПААГ. Гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием системы iBlot2. Мембрану блокировали в 5% сухом обезжиренном молоке+0,5% твин-20, а затем зондировали с использованием антитела осла к H+L человека, конъюгированного с HRP. Полосы проявляли с использованием хемилюминесцентной системы и визуализировали на пленке.
[00235] Мыши
[00236] Самок мышей линии Вб.Cg-FoxnlnuJ и BALB/c в возрасте от шести до восьми недель приобретали в компании The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) и размещали в вивариях университета Пенсильвании или компании Medlmmune, AstraZeneca. Все протоколы по использованию животных были одобрены институциональным комитетом университета Пенсильвании и
институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) компании Medlmmune в соответствии с рекомендациями организации ALAAC, борющейся с жестоким обращением с животными. Дальнейший надзор был предоставлен IACUC Управлением по наблюдению за животными и их использованием (ACURO). Животным вводили внутримышечно (В/М) предварительную инъекцию гиалуронидазы (400 ЕД/мл, Sigma Aldrich) за 30 минут-1 час перед В/М инъекцией DMAb-aPcrV или DMAb-BiSPA в дозе 100 мкг-3 0 0 мкг в ПБ или четырехглавую мышцу бедра с последующей электропорацией (В/М-ЭП). После введения контролировали уровни DMAb в сыворотке.
[00237] Испытание с летальной пневмонией
[00238] Мышам линии BALB/c (п= 8/группа) в день -5 перед испытанием посредством В/М-ЭП вводили 100 мкг или 300 мкг DMAb-aPcrV или DMAb-BiSPA. В качестве контроля использовали DMAb-DVSF3 20 к неродственному вирусу денге. Четвертой группе животных на день -1 перед испытанием вводили внутрибрюшинную (В/Б) инъекцию очищенного белка IgG АВС123 (2 мг/кг). На день 0 животным проводили интраназальное испытание с использованием 9,75е5-1,0еб колониеобразующих единиц (КОЕ) агрессивного, стойкого к действию антимикробных средств штамма 6077 бактерии Pseudomonas aeruginosa. За животными наблюдали в течение б дней после интраназального испытания в отношении выживания, как описано в 16. Коротко говоря, животным проводили анестезию кетамином и ксилазином с последующим интраназальным введением бактериального инокулята, содержащегося в 0,05 мл. Для анализа нагрузок на органы у животных, получавших DMAb, через 2 4 часа после инфицирования собирали легкие, селезенки и печени, а затем гомогенизировали и высевали в планшеты с агаром Луриа для подсчета КОЕ бактерий. В супернатантах гомогенатов легких проводили количественное определение IL-ip, IL-б и KC/GRO с использованием мультиплексного набора (Meso Scale Diagnostics) в соответствии с инструкциями производителя. Для экспериментов по комбинации DMAb и меропенема (MEM) через 4 часа после инфицирования вводили подкожно MEM.
[00239] Гистопатология
[00240] Легкие собирали через 48 часов после инфицирования и фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине в течение не менее 4 8 часов. Фиксированные ткани затем подвергали стандартной обработке, заливали в парафин, нарезали на срезы толщиной 3 мкм и окрашивали гематоксилином Джилла и эозином для гистологической оценки патологоанатомом, заслепленным в отношении условий эксперимента.
[00241] Статистические данные
[00242] Все статистические анализы выполняли с помощью
программного обеспечения GraphPad Prism б. О или SPSS. Расчет
размера выборки для двух независимых пропорций рассчитывали с
показателем альфа 0,05 и мощностью 0,90. Для обеспечения
достаточной мощности выполняли расчеты не менее чем для п=5
мышей. В случае необходимости оценивали Т-критерий Стьюдента или
выполняли однофакторный дисперсионный анализ (AN0VA). Данные по
выживаемости были представлены кривой выживаемости Каплана
Мейера, значимость рассчитывали с использованием
логарифмического теста и однофакторного анализа AN0VA с коррекцией для множественных сравнений. Данные считались значимыми при р < 0,05. Линии на всех графиках представляют среднее значение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение. Из анализа не были исключены образцы или животные. Для исследований на животных рандомизацию не проводили. Маскировку образцов и животных перед выполнением каждого эксперимента не проводили.
[00243] Ниже описаны результаты экспериментов
[00244] Разработка и in vitro экспрессия моноклональных антител против P. aeruginosa с доставкой посредством ДНК (DMAb)
[00245] Два гена антител mAb к P. aeruginosa подлежали повторной кодировке для оптимальной экспрессии в системе вектора экспрессии ДНК на основе их ранее описанной эффективной защитной активности in vivo против летальной инфекции P. aeruginosa. Последовательности (Fab- и Fc-фрагменты) тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина гамма-1 человека (IgGl) были оптимизированы в отношении нуклеотидной и аминокислотной последовательности с
учетом кодонов как человека, так и мыши, и закодированы как единая полицистронная единица в ДНК плазмидного каркаса pGXOOOl, что привело к получению двух конструкций: DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA (фигура 1А) . Тяжелую и легкую цепь экспрессировали как один транскрипт мРНК, а затем расщепляли после трансляции на участке расщепления свиного тешовируса-1 2А (Р2А). Для гарантии полного удаления Р2А из конечного выработанного in vivo антитела также включали сайт расщепления фурином (RGRKRRS; SEQ ID N0: 23) .
[00246] Способность каждой конструкции экспрессировать полноразмерное человеческое антитело IgGl оценивали после трансфекции in vitro клеток НЕК2 93Т. Через 4 8 часов собирали, трансфицированные DMAb клетки и супернатанты, и для проверки продукции и секреции DMAb IgG выполняли ИФА на общие IgG в клеточных лизатах и в среде (фигура 1В, панели i и ii) . Кроме того, был проведен анализ вестерн-блот, чтобы подтвердить, что были экспрессированы как тяжелые, так и легкие цепи антитела. Тяжелая цепь биспецифического DMAb имеет более высокую молекулярную массу, поскольку она кодирует две специфичности вариабельной области (фигура 1С). В качестве отрицательного контроля включали вектор ДНК pGXOOOl, а в качестве положительного контроля - очищенное антитело IgGl к PcrV.
[00247] Экспрессия антител DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA к Р. aeruginosa у мышей
[00248] После подтверждения экспрессии in vitro исследовали экспрессию доставленных ДНК антител DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA, у мышей. Для подтверждения экспрессии в мышцах мышей DMAb мышам линии BALB/c посредством внутримышечной (В/М) инъекции в переднюю большеберцовую (ПБ) мышцу с последующей внутримышечной электропорацией (В/М-ЭП) вводили: антитело DMAb-aPcrV к Р. aeruginosa (100 мкг), DMAb-BiSPA (100 мкг), контрольное DMAb-DVSF3 (100 мкг) или контрольный пустой вектор pGXOOOl (100 мкг). Мышечную ткань собирали через 3 дня после инъекции и зондировали срезы антителом козы к Fc IgG человека с последующим обнаружением конъюгированным с красителем AF4 8 8 антителом осла к
IgG козы (фигура 2). После подтверждения экспрессии in vivo были проведены дополнительные эксперименты для анализа уровней DMAb в системном кровотоке. Человеческий IgGl индуцирует у иммунокомпетентных мышей ответ против антитела, поскольку он распознается иммунной системой мыши не как собственный. Поэтому экспрессию оценивали у иммунокомпрометированных бестимусных (голых) мышей Вб.Cg-Foxnlnu/J с иммунной недостаточностью с отсутствием Т-клеток и наличием нефункциональных В-клеток. Голым мышам (п=5/группа) вводили В/М в ПБ или четырехглавую мышцу бедра антитело к P. aeruginosa DMAb-aPcrV (100 мкг) или DMAb-BiSPA (100 мкг) с последующей В/М-ЭП. Для отслеживания длительной экспрессии человеческого IgGl в кровотоке собирали сыворотку крови. Экспрессия обоих DMAb наблюдалась в течение 100-120 дней после введения, поддерживая гипотезу о том, что эти новые mAb, доставленные ДНК, могут продуцироваться в скелетных мышцах в значительных количествах, обнаруживаемых в системном кровотоке, с экспрессией в течение нескольких недель (фигура ЗА и фигура 3D ).
[00249] Затем оценивали экспрессию DMAb у
иммунокомпетентных мышей BALB/c, поскольку они обычно используются в качестве модели для инфекции P. aeruginosa. Мышам (п=10/группа) вводили DMAb-aPcrV или DMAb-BiSPA в дозах 100 мкг и 300 мкг (в 3 места введения инъекции по 100 мкг) посредством В/М-ЭП. Пиковые уровни экспрессии DMAb наблюдались на 7-й день после инъекции и составляли 7,1-17,1 мкг/мл и 2,9-7,2 мкг/мл при введении DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA в дозе 100 мкг и 31,2-49,7 мкг/мл и 3,2-12,7 мкг/мл при введении в дозе 300 мкг соответственно (фигура ЗВ и фигура ЗЕ) . Экспрессия DMAb IgGl человека у мышей BALB/c была устранена иммунной системой мыши ко дню 14 (фигура 4А и фигура 4В). Для сравнения также было разработано антитело DMAb IgG2a мыши. Оно продемонстрировало длительную экспрессию > 100 дней у иммунокомпетентных мышей BALB/c, демонстрируя при этом длительную экспрессию DMAb без устранения иммунной системой (фигура 4С). Чтобы подтвердить целевую антигенную специфичность DMAb, также проводили анализ
сыворотки, взятой на 7-й день после введения, и подтверждали связывание с рекомбинантным белком PcrV с помощью ИФА (фигура ЗС и фигура 3F).
[00250] Оценка DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA в модели летальной пневмонии
[00251] Исследования экспрессии in vitro и in vivo показали, что DMAb образуют полноразмерные человеческие IgGl-антитела, которые связываются с рекомбинантным белком PcrV. Для решения вопросов функциональной активности in vivo DMAb, доставленных ДНК, оценивали защиту от высокопатогенного и цитотоксического штамма 6077 P. aeruginosa (РА 6011) с использованием модели инфекции летальной пневмонии у мышей. За пять дней перед испытанием с РА 607 7 мышам выполняли инъекцию DMAb-aPcrV (300 мкг), DMAb-BiSPA (300 мкг) или неродственного контрольного антитела DMAb-DVSF3 (300 мкг), мишенью которого является вирус денге (Flingaiet al. , 2015, Sci Rep 5, 12616) . Также была включена группа положительного контроля, в которой мышам за один день до испытания вводили белок IgG АВС123 (2 мг/кг). Случайно выбранных животных из группы животных, которым вводили DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA, подвергали эвтаназии для отслеживания уровней экспрессии DMAb в сыворотке во время испытания, а также для оценки эффективности экспрессированных DMAb. Как показано на фигуре 5А, при количественном определении общего IgG человека в сыворотке, медианные титры как моноспецифического DMAb-aPcrV, так и биспецифического DMAb-BiSPA составляли приблизительно 16 и 8 мкг/мл соответственно. Эффективность in vivo экспрессированных DMAb-aPcrV и DMAb-BiSPA оценивали путем количественного определения экспрессии антител на основе антицитотоксической активности в сыворотке. Не наблюдалось различий в методах количественной оценки, что указывает на то, что экспрессированные in vivo моноспецифические и биспецифические DMAb-IgG полностью функциональны и эквивалентны по активности в сравнении с полученным биологическими методами IgG (фигура 5А) . Затем оставшимся животным в каждой группе проводили испытание с введением
летальной дозы P. aeruginosa путем интраназальной инокуляции и последующим контролем выживания в течение б дней после инфицирования (144 часа). У животных, получавших контрольное DMAb-DVSF3, инфекция развивалась в течение 24-55 часов. Напротив, приблизительно 94% животных (15/16), которые получали либо DMAb-aPcrV, либо DMAb-BiSPA, выживали после испытания (фигура 5В, р < 0, 0001 по сравнению с DMAb-DVSF3). Как и ожидалось, все животные, соответствующие положительному контролю, получавшие IgG АВС123 (2 мг/кг), выживали после испытания. Кроме того, в результате введения мышам DMAb-BiSPA в дозе 100 мкг (1 место 100 мкг), 200 мкг (2 места по 100 мкг) или 300 мкг (3 места по 100 мкг) с последующим инфицированием бактерией P. aeruginosa, наблюдалось зависимое от концентрации выживание (фигура 5С) . Эти результаты согласуются с количественной оценкой экспрессии DMAb-BiSPA в сыворотке, полученной от этих животных, в которой с уменьшением количества введенной путем электропорации ДНК уменьшалась концентрация сывороточного белка DMAb-BiSPA (фигура 5D).
[00252] Была проанализирована способность антител DMAb к Pseudomonas к снижению бактериальной нагрузки в легких и к предотвращению системной бактериальной диссеминации. Легкие, селезенку и почки анализировали через 24 часа после испытания с заражением бактерией P. aeruginosa с последующей количественной оценкой колониеобразующих единиц (КОЕ) в каждой ткани. Значительное снижение нагрузки КОЕ в легких наблюдалось у животных, которым вводили DMAb-BiSPA, но не DMAb-aPcrV (фигура 6А) . Важно отметить, что бактериальная нагрузка в легких животных, которым вводили DMAb-BiSPA, была похожа на нагрузку в легких, наблюдаемую у мышей, получавших белок IgG АВС123, и оба антитела DMAb к Pseudomonas уменьшали диссеминацию бактерий в селезенку и почки по сравнению с контрольным DMAb-DVSF3 (фигура 6А) . Кроме того, по результатам измерения массы легких DMAb-cxPcrV, DMAb-BiSPA и IgG АВС123 эффективно предотвращали отек легких у инфицированных животных по сравнению с мышами, которым вводили контрольное DMAb-DVSF3 (фигура 6В) . В соответствии с
этими результатами у мышей, которым вводили антитело DMAb к Pseudomonas и белок IgG, также уменьшались уровни провоспалительных цитокинов IЪ- 1 (3 и IL-6 и хемокина KC/GRO по сравнению с животными, которым вводили DMAb-DVSF3 (фигура 6С) . Через 24 часа после испытания с введением РА 6077 сравнивали уровни IgG в сыворотке неинфицированных животных и инфицированных животных (фигура 6D) . В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что mAb, доставленные ДНК, вырабатываемые in vivo в скелетных мышцах, опосредуют защитную активность и проявляют схожую эффективность с экзогенно продуцируемыми mAb IgG.
[00253] Гистопатология легких после испытания [00254] Гистопатологическое исследование легких, собранных через 4 8 часов после инфицирования, продемонстрировало выраженный альвеолит у животных, которым вводили DMAb-DVSF3, с инфильтратами нейтрофилов и макрофагов в альвеолярном и периваскулярном пространствах, а также участки кровоизлияний и альвеолярного некроза. Напротив, у животных, которым вводили DMAb-BiSPA, наблюдалось явное уменьшение воспаления с умеренными популяциями в основном нейтрофилов и меньшим количеством макрофагов, согласующееся с уменьшением провоспалительных цитокинов и хемокинов из супернатантов легких, описанных выше, причем аналогичные изменения наблюдали также и в группах введения DMAb-aPcrV и контрольного IgG АВС123 (фигура 7). [00255] Комбинация DMAb с антибиотиками
[00256] При подозрении на инфекцию, вызванную грамположительными бактериями или P. aeruginosa, вводят антибиотики широкого спектра из семейства карбапенемна, например меропенем (MEM). Дополнительные схемы лечения резервными антибиотиками, такими как колистин, связаны с высокой токсичностью у людей (Falagas et al., 2005, ВМС Infect Dis 5, 1; Lim et al. , 2010, Pharmacotherapy 30, 1279-1291), и при этом существует вероятность приобретения бактериями дополнительной резистентности к антимикробным средствам (Hirsch и Тат, 2010, Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res 10, 441-451; Lister et al.,
2009, Clin Microbiol Rev 22, 582-610; Breidenstein et al., 2011, Trends Microbiol 19, 419-426). Поэтому были бы весьма желательны альтернативные и дополнительные стратегии снижения этих рисков. Оценивали потенциал применения DMAb-BiSPA в комбинации с MEM. Для этих экспериментов была использована субтерапевтическая доза MEM (2,3 мг/кг) для имитации недостаточного воздействия лекарственного средства, встречающегося у пациентов, инфицированных резистентной бактерией, и субтерапевтическая доза DMAb-BiSPA (100 мкг, указана на фигуре 5С) . Объединение этих субтерапевтических доз приводило к выживанию 67% животных по сравнению с 10% животных, которые получали только DMAb-BiSPA (р=0,02б, фигура 8) . Контрольные мыши, которым вводили только MEM или DMAb-DVSF3, не выжили после летального испытания. В совокупности это расширяет возможности лечения с применением DMAb как отдельного вида лечения или в сочетании с существующими схемами лечения антибиотиками. Кроме того, эти данные подтверждают гипотезу о том, что введение DMAb оказывает действие, схожее с действием очищенных mAb IgG, и при комбинации со стандартными схемами лечения антибиотиками может опосредовать усиленную защитную активность.
[00257] Область разработки mAb динамически развивается, и доставка DMAb предлагает дополнительную стратегию, которая помогает быстро транспортировать биологически функциональные mAb in vivo. В дополнение к очевидным клиническим преимуществам, экспрессия нетрадиционных биспецифических изоформ mAb in vivo, представленная в данном документе, подчеркивает универсальность мышц, которые следует задействовать в качестве фабрик по производству белка. Важно отметить, что экспрессия DMAb является временной, и имеет схожую эффективность при доставке других терапевтических средств. Возможно разработать индуцируемую систему, которая будет устранять плазмиду ДНК после того, как в ней отпадет необходимость. Альтернативно, ДНК DMAb можно потенциально вводить повторно неограниченное количество раз, поскольку не существует связанных с ней анти-векторных ответов, что позволяет проводить длительную терапию путем повторного введения (Hirao et al., 2010, Molecular therapy: the journal of
the American Society of Gene Therapy 18, 1568-1576; Williams, 2013, Vaccines 1, 225-249; Schmaljohn et al. , 2014, Virus research 187, 91-96) . Доставка DMAb представляет собой значительный успех в отношении не только методик терапии mAb и доставки ДНК, но и в отношении новых подходов патоген-специфического лечения для усиления иммунитета хозяина.
[00258] Недавно сообщалось о доставке ДНК-кодированных антител, которые нацелены на Нег2 в мышиной модели рака молочной железы человека (Kim et al. , 2016, Cancer Gene Ther 23, 341347) . В этом исследовании была продемонстрирована противоопухолевая эффективность, сопоставимая с эффективностью белка IgG, что дополнительно подтвердило концепцию, что mAb, кодированное геном, может иметь функциональность. Это первая демонстрация доставки ДНК-кодированного mAb (DMAb), которое защищает от бактериальной мишени, и первая доставка сконструированной изоформы IgG. Ранние исследования антител, кодированных ДНК-плазмидой, продемонстрировали осуществимость, но продемонстрировали низкую экспрессию IgG в сыворотке (Tjelle et al., 2004, Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 9, 328-336; Perez et al. , 2004, Genet Vaccines Ther 2, 2). Ранее была исследована защитная эффективность DMAb, нацеленных на вирусные инфекции, причем в исследованиях наблюдалась быстрая защита от инфекций, вызванных вирусом чикунгунья (Muthumani et al., 2016, J Infect Dis 214, 369-378) и вирусом денге (DENV) (Flingai et al. , 2005, Sci Rep 5, 12 616). Нацеливание DMAb на DENV также не стимулировало антителозависимую активацию заболевания. Эти две модели инфекционных заболеваний не требуют высоких уровней IgG в сыворотке, однако желательно наличие оптимизированных композиций DMAb для увеличения уровней экспрессии, чтобы обеспечить продолжительный охват после однократного введения DMAb. С этой целью были оптимизированы уровни экспрессии DMAb сыворотки для использования против Pseudomonas aeruginosa (фигура 9). Эта работа включала введение гиалуронидазы в состав композиции, что позволило увеличить экспрессию IgG в обработанной мышце.
[00259] Хотя для переноса на людей требуется дальнейшее
исследование, DMAb являются этапом на пути к обеспечению обычной доставки mAb с возможностью расширения доступности для различных сообществ во всем мире. Перенос дозы на более крупных животных и людей будет иметь важное значение для изучения в будущих исследованиях, в частности, для понимания ограничений дозы ДНК при введении DMAb. Это исследование включает изучение различных видов оптимизации доставки и состава, которые улучшат экспрессию ДНК in vivo. Одна из стратегий может заключаться в использовании других ферментов внеклеточного матрикса для облегчения проникновения ДНК в мышечные клетки 37. Дальнейшее изучение приматов, не являющихся людьми, может помочь понять порог дозы ДНК и воздействие на фармакокинетические уровни. Было бы целесообразно провести дополнительные исследования с оценкой моделей гликозилирования человеческих IgG DMAb, продуцируемых в мышцах, для сравнения с полученным биологическими методами белком IgG, однако в контексте текущего исследования не наблюдалось никакой разницы в функциональности между DMAb и его белковым аналогом IgG.
[00260] В заключение, описанная в настоящем документе
работа может иметь огромное значение для лечения резистентных к
действию антимикробных средств инфекций (AMR), особенно
вызванных патогенными микроорганизмами из группы ESKAPE
(Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и
Enterobacter sp.), которые являются устойчивыми при применении
многих схем терапии антибиотиками широкого спектра действия.
DMAb являются универсальными и могут доставлять
моноспецифические IgG против множества антигенных мишеней, а также кодировать новые биспецифические IgG. Минимальные установившиеся уровни mAb в сыворотке после однократного введения дозы DMAb согласуются с функциональностью и защитными уровнями, обеспечиваемыми полученным биологическими методами белком IgG in vivo. Быстрое развитие этой платформы и длительная переходная экспрессия из мышц благоприятны по сравнению со схемами применения белка mAb IgG, поскольку могли бы обеспечить менее частое введение mAb. Кроме того, DMAb устойчивы к действию
температуры, что позволяет их транспортировку, долговременное хранение и введение в более широких популяциях. Эти привлекательные особенности в сочетании с профилем безопасности доставки ДНК у людей поддерживают дальнейшие исследования DMAb в моделях более крупных животных в качестве специфического для патогена подхода к нацеливанию на инфекционные заболевания и другие потенциальные терапевтические мишени.
pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); DMAb-aPcrV
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в pGXOOOl; DMAb-aPcrV
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в pGXOOOl; DMAb-aPcrV
нуклеотидная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); DMAb-aPcrV
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); DMAb-aPcrV
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9213: биспецифическая Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9213: биспецифическая Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9215: Pseudo-Psl0096; DMAb-aPsl
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9215: Pseudo-Psl0096; DMAb-aPsl
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9259: биспецифическая Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE только pGXOOOl; DMAb-BiSPA
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9259: биспецифическая Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE только pGXOOOl; DMAb-BiSPA
последовательность расщепления фурином
аминокислотная последовательность тяжелой цепи лидерной последовательности
аминокислотная последовательность легкой цепи лидерной последовательности
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9308:
V2L2MD, функционально связанная с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9308: V2L2MD, функционально связанная с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9309: V2L2MD, функционально связанная с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9309: V2L2MD, функционально связанная с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9214: Pseudo-V2L2MD; DMAb-aPcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9214: Pseudo-V2L2MD; DMAb-aPcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9247: V2L2 с Fc Rhesus в pGXOOOl; DMAb-aPcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9247: V2L2 с Fc Rhesus в pGXOOOl; DMAb-aPcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9248: Pseudo-V2L2MD rbFc; DMAb-aPcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9248: Pseudo-V2L2MD rbFc; DMAb-aPcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-
тяжелая цепь); DMAb-aPcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность тяжелой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); DMAb-aPcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в pGXOOOl; DMAb-aPcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в pGXOOOl; DMAb-aPcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); DMAb-aPcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); DMAb-aPcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9213: Биспецифическая Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9213: Биспецифическая Pseudomonas (Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9215:
[00263] Для специалистов в данной области техники очевидно существование различных изменений и модификаций описанных вариантов реализации. Такие изменения и модификации, включая, без ограничения, относящиеся к химическим структурам, заместителям, производным, промежуточным соединениям, синтезу, композициям, составам или способам применения изобретения, можно осуществлять, не отступая от его сущности и объема.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Weiner, David Patel, Ami Yan, Jian
<120> КОНСТРУКЦИИ ДНК-АНТИТЕЛ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA <130> 206108-0058-00-WO.606335 <150> US 62/332,363
<151> 05.05.2016
<160> 47
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 1362
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9308: V2L2MD
<400> 1
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgaggctg 60
tcctgcgcag catctggctt cacctttagc tcctatgcaa tgaactgggt gcgccaggca 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgtctgcc atcacaatga gcggcatcac cgcctactat 180
acagacgatg tgaagggcag gtttaccatc agcagagaca actccaagaa tacactgtac 240
ctgcagatga atagcctgag agccgaggat accgccgtgt actattgcgc caaggaggag 300
ttcctgcccg gcacacacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtg 360
accgtgtcta gcgcctccac aaagggacct agcgtgttcc cactggcacc ctcctctaag 420
tccacctctg gcggcacagc cgccctgggc tgtctggtga aggattattt cccagagccc 480
gtgaccgtgt cttggaacag cggcgccctg acctctggag tgcacacatt tccagccgtg 540
ctgcagagct ccggcctgta tagcctgtct agcgtggtga ccgtgccctc ctctagcctg 600
ggcacccaga catacatctg caacgtgaat cacaagccat ctaatacaaa ggtggacaag 660
aaggtggagc ccaagagctg tgataagacc cacacatgcc ctccctgtcc tgcaccagag 720
ctgctgggcg gcccatccgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaggacac cctgatgatc 780
tcccggaccc cagaggtgac atgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaggtg 840
aagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ccaagaccaa gccacgggag 900
gagcagtata acagcaccta ccgcgtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 960
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg agcaataagg ccctgcccgc ccctatcgag 1020
aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct agggagccac aggtgtatac actgcctcca 1080
agcagagacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacat gtctggtgaa gggcttctac 1140
ccttccgata tcgccgtgga gtgggagtct aatggccagc cagagaacaa ttataagacc 1200
acaccccctg tgctggactc cgatggctct ttctttctgt actctaagct gaccgtggat 1260
aagagccgct ggcagcaggg caacgtgttt agctgttccg tgatgcacga ggccctgcac 1320
aatcactaca cacagaagtc tctgagcctg tcccctggca ag 1362
<210> 2
<211> 454
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9308: V2L2MD
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180
185
190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 3
<211> 642 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9309: V2L2MD
<400> 3
gcaatccaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacatgca gagcctctca gggcatccgg aacgatctgg gctggtacca gcagaagcca 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctattct gccagcaccc tgcagtctgg agtgcccagc 180
cggttctccg gctctggcag cggaacagac tttaccctga caatctctag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctacta ttgcctgcag gattacaatt atccatggac ctttggccag 300
ggcacaaagg tggagatcaa gcgcacagtg gccgccccca gcgtgttcat ctttccccct 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420
cctagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caattcccag 480
gagtctgtga ccgagcagga cagcaaggat tccacatatt ccctgtctaa caccctgaca 540
ctgagcaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgcat gcgaggtgac ccaccaggga 600
ctgtcctctc ccgtgacaaa gtcctttaat aggggcgagt gt 642
<210> 4
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9309: V2L2MD
<400> 4
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 5
<211> 2151
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9214: Pseudo-V2L2MD; антитело DMAb к PcrV
<400> 5
gaggtgcagc tgctggagtc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggatc actgcgactg 60 agctgcgcag cttccggctt caccttcagc agctatgcca tgaactgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgagtgca atcaccatgt cagggattac tgcctactat 180
accgacgatg tgaaaggccg attcactatc tctagggaca acagtaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga attccctgcg cgctgaggat acagcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgccag ggactcacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcaagcac aaaaggcccc tccgtgtttc ccctggcccc ttcaagcaag 420
tctacaagtg ggggcactgc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccctgagcca 480
gtcaccgtga gctggaactc cggcgccctg acttccggag tccatacctt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagt tcagtggtca ccgtcccaag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacatctg caacgtgaat cacaaaccaa gcaatacaaa ggtcgacaag 660
aaagtggaac ccaaatcctg tgataagacc catacatgcc ctccctgtcc agcacctgag 720
ctgctgggag ggccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaagacac actgatgatt 780
tctcggaccc ccgaagtcac atgcgtggtc gtggacgtga gccacgagga ccccgaagtc 840
aagtttaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagaccaa accacgagag 900
gaacagtata actctacata cagggtcgtg agtgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 960
ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg tccaacaagg ccctgccagc tcccatcgag 1020
aagaccattt ctaaggccaa aggccagcca agagaacccc aggtgtatac actgcctcca 1080
agtcgggacg agctgactaa aaaccaggtc tctctgacct gtctggtgaa gggattctac 1140
ccttccgata tcgctgtgga gtgggaatct aatgggcagc cagaaaacaa ttataagact 1200
acccctcccg tgctggactc tgatggaagt ttctttctgt actccaaact gaccgtggac 1260
aagtctagat ggcagcaggg gaacgtcttt tcatgcagcg tgatgcatga ggccctgcac 1320
aatcattaca ctcagaaatc cctgtctctg agtcctggga aacggggccg caagaggaga 1380
tcaggaagcg gggccaccaa cttctccctg ctgaagcagg ctggcgatgt ggaggaaaat 1440
cctggaccaa tggtcctgca gactcaggtg tttatctcac tgctgctgtg gattagcgga 1500
gcatacgggg ccattcagat gacccagtcc cccagttcac tgtccgcttc tgtcggcgac 1560
agagtgacta tcacctgtcg ggcaagccag ggaattcgca acgatctggg gtggtatcag 1620
cagaagcctg ggaaagctcc aaagctgctg atctacagtg catcaactct gcagtcagga 1680
gtgcctagcc ggttcagcgg ctccggatct ggaaccgact ttacactgac tattagctcc 1740
ctgcagccag aggacttcgc cacatattac tgcctgcagg attataatta cccctggaca 1800
tttggccagg gaactaaagt ggaaatcaag cgcacagtcg ctgcacctag cgtgttcatc 1860
tttccaccct cagacgagca gctgaagtcc ggaactgctt ctgtggtgtg cctgctgaac 1920
aatttctatc caagggaagc aaaagtccag tggaaggtgg ataacgccct gcagtcaggc 1980
aatagccagg agtccgtgac cgaacaggac tctaaagata gtacatacag tctgtcaaac 2040
accctgacac tgagcaaggc tgattatgag aagcacaaag tgtacgcatg cgaagtcacc 2100
caccaggggc tgtcctcacc agtcacaaaa tctttcaatc ggggagaatg c 2151
<210> 6 <211> 717
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9214: Pseudo-V2L2MD; антитело DMAb к PcrV
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225
230
235
240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
465 470 475 480
Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu
485
490
495
Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
500 505 510
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
515 520 525
Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
530 535 540
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly
545 550 555 560
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
565 570 575
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
580 585 590
Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
595 600 605
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
610 615 620
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
625 630 635 640
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
645 650 655
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
660 665 670
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
675 680 685
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
690 695 700
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
705 710 715
<210> 7
<211> 2154
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9247: V2L2 с Fc Rhesus в
pGX0001;
антитело DMAb к PcrV
<400> 7
gaggtgcagc tcctggaaag tgggggaggg ctggtgcagc ccggcgggtc cctcagactg 60
tcttgcgccg ctagtggctt cacctttagc tcctatgcaa tgaactgggt gcggcaggca 120
cctgggaaag gactggagtg ggtgagcgcc atcaccatgt ccggcattac tgcatactat 180
accgacgatg tgaaagggag gttcacaatc tcaagagaca acagcaagaa tactctctac 240
ctgcagatga atagcctgcg cgctgaggat actgcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgccag gcacccacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcttctac aaaagggccc agcgtgttcc cactggcacc ctcaagcagg 420
agtacatcag agagcactgc agccctcgga tgtctggtga aggattactt ccccgaacct 480
gtcaccgtgt cctggaactc cggatctctc acttctggcg tccacacctt tcccgccgtg 540
ctgcagtcct ctgggctcta tagcctgagt tcagtggtca ccgtgcctag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacgtctg caacgtgaat cataagccat ccaatacaaa ggtcgacaaa 660
agagtggaga tcaaaacctg tggaggcggg tctaagcccc ctacatgccc accctgtcca 720
gcaccagaac tgctcggagg cccaagcgtg ttcctctttc ctccaaagcc caaagacacc 780
ctgatgattt cccggacccc agaggtcaca tgcgtggtcg tggacgtgag ccaggaagac 840
cctgatgtca aattcaactg gtacgtgaat ggcgccgagg tgcaccatgc tcagacaaag 900
cccagagaaa ctcagtataa ctcaacctac cgggtcgtga gcgtcctcac cgtgacacac 960
caggactggc tgaacggcaa agagtataca tgcaaagtga gcaataaggc cctgcctgct 1020
ccaatccaga agactattag caaggataaa gggcagcctc gcgaaccaca ggtgtacacc 1080
ctgcctccca gcagggagga actgactaaa aaccaggtca gcctcacctg tctggtgaag 1140
ggcttctacc cttccgacat cgtcgtggag tgggaaagtt caggccagcc agagaatacc 1200
tacaagacta ccccacccgt gctggactct gatggaagtt atttcctcta cagcaaactg 1260
acagtggata agtccagatg gcagcagggc aacgtcttta gttgctcagt gatgcatgag 1320
gccctccaca atcattacac acagaaaagc ctgtccgtgt ctccccgggg caggaagagg 1380
agaagtggat caggcgcaac taacttcagc ctgctcaagc aggcagggga cgtggaggaa 1440
aatcccggac ctatggtcct gcagacccag gtgtttatct ccctgctcct gtggatttct 1500
ggcgcatacg gggccatcca gatgacacag agccccagct ccctgagcgc ctccgtcggc 1560
gaccgggtga ctatcacctg tcgcgctagc cagggaatta ggaacgatct gggctggtat 1620
cagcagaagc ccggcaaagc ccctaagctc ctgatctact ctgctagtac actgcagtcc 1680
ggggtgcctt ctaggttctc agggagcggc agcggcactg acttcaccct cactatttct 1740
agtctgcagc cagaggactt cgcaacctat tactgcctgc aggattataa ttacccctgg 1800
acatttgggc agggaactaa agtggagatc aagcgcgctg tcgctgcacc tagcgtgttc 1860
atctttcctc caagtgaaga ccaggtcaag agtggcaccg tgtcagtggt gtgcctcctg 1920
aacaatttct atccaaggga ggcctccgtg aagtggaaag tcgatggggt gctgaaaaca 1980
ggaaactcac aggagagcgt gactgaacag gacagtaagg ataataccta ctcactgtca 2040
agcaccctca cactgtcctc taccgactat cagtctcaca acgtgtacgc ttgcgaagtc 2100
acccaccagg ggctcagtag tccagtcaca aaatctttca atagaggcga atgt 2154
<210> 8
<211> 718
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9247: V2L2 с Fc Rhesus в
pGX0001;
антитело DMAb к PcrV
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145
150
155
160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ile
210 215 220
Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Thr
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Thr His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys Asp Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Thr
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Val Ser Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser
450 455 460
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
465 470 475 480
Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu
485 490 495
Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
500 505 510
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
515 520 525
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
530 535 540
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser
545 550 555 560
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
565 570 575
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
580 585 590
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
595 600 605
Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
610 615 620
Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly Thr Val Ser Val Val Cys Leu Leu
625 630 635 640
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp Lys Val Asp Gly
645 650 655
Val Leu Lys Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
660
665
670
Lys Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Thr
675 680 685
Asp Tyr Gln Ser His Asn Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
690 695 700
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
705 710 715
<210> 9 <211> 2127
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9248: Pseudo-V2L2MD rbFc; антитело DMAb к PcrV
<400> 9
gaagtgcagc tgctggaatc tggagggggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
tcctgcgccg ccagcggctt caccttctcc agctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgtccgcc atcaccatga gcggcatcac cgcctactac 180
accgacgacg tgaagggccg cttcaccatc tcccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggaggag 300
ttcctgccag gaacccacta ctactacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccaccgtg 360
accgtgtcca gcggccagcc caaggccccc agcgtgttcc cactggcccc atgctgcggc 420
gacaccccct ccagcaccgt gaccctggga tgcctggtga agggatacct gccagagcca 480
gtgaccgtga cctggaactc cggcaccctg accaacggcg tgaggacctt cccaagcgtg 540
cgccagtcca gcggactgta ctccctgtcc agcgtggtga gcgtgacctc cagctcccag 600
ccagtgacct gcaacgtggc ccacccagcc accaacacca aggtggacaa gaccgtggcc 660
ccaagcacct gctccaagcc aacctgccct cctcccgagc tgctgggcgg cccctccgtg 720
ttcatcttcc ctcccaagcc caaggacacc ctgatgatct ccaggacccc agaggtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggacgac cccgaggtgc agttcacctg gtacatcaac 840
aacgagcagg tgcggaccgc ccgccctccc ctgcgcgagc agcagttcaa ctccaccatc 900
cgggtggtga gcaccctgcc aatcacccac caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag 960
tgcaaggtgc acaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccagg 1020
ggccagccac tggagcccaa ggtgtacacc atgggccctc cccgcgagga gctgagctcc 1080
aggagcgtgt ccctgacctg catgatcaac ggcttctacc ccagcgacat ctccgtggag 1140
tgggagaaga acggcaaggc cgaggacaac tacaagacca ccccagccgt gctggacagc 1200
gacggctcct acttcctgta caacaagctg tccgtgccca ccagcgagtg gcagcggggc 1260
gacgtgttca cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 1320
atctccagga gccccggcaa gaggggaagg aagcgccggt ccggcagcgg agccaccaac 1380
ttcagcctgc tgaagcaggc cggcgacgtg gaggagaacc caggaccaat ggtgctgcag 1440
acccaggtgt tcatctccct gctgctgtgg atcagcggag cctacggagc catccagatg 1500
acccagtccc ccagctccct gtccgccagc gtgggcgaca gggtgaccat cacctgcagg 1560
gccagccagg gcatcaggaa cgacctgggc tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 1620
aagctgctga tctactccgc cagcaccctg cagtccggag tgcccagccg gttctccggc 1680
agcggctccg gaaccgactt caccctgacc atcagctccc tgcagcccga ggacttcgcc 1740
acctactact gcctgcagga ctacaactac ccctggacct tcggccaggg caccaaggtg 1800
gagatcaaga ggcagccagc cgtgacccca tccgtgatcc tgttccctcc ctcctccgag 1860
gagctgaagg acaacaaggc caccctggtg tgcctgatct ccgacttcta cccccgcacc 1920
gtgaaggtga actggaaggc cgacggaaac agcgtgaccc agggagtgga caccacccag 1980
ccaagcaagc agtccaacaa caagtacgcc gccagctcct tcctgcacct gaccgccaac 2040
cagtggaaga gctaccagtc cgtgacctgt caggtcaccc acgaagggca caccgtcgaa 2100
aaatctctgg cccccgccga atgttct 2127
<210> 10 <211> 709
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9248: Pseudo-V2L2MD rbFc; антитело DMAb к PcrV
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser
130 135 140
Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr
165 170 175
Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys
210 215 220
Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg
275 280 285
Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser
290 295 300
Thr Leu Pro Ile Thr His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly
340 345 350
Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met
355 360 365
Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn
370 375 380
Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu
405 410 415
Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys Arg
435 440 445
Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
450 455 460
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln
465 470 475 480
Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly
485 490 495
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
500 505 510
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
515 520 525
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
530 535 540
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
545 550 555 560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
565 570 575
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
580 585 590
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gln Pro Ala Val
595 600 605
Thr Pro Ser Val Ile Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Lys Asp
610 615 620
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Arg Thr
625 630 635 640
Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser Val Thr Gln Gly Val
645 650 655
Asp Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
660 665 670
Ser Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gln Trp Lys Ser Tyr Gln Ser Val
675 680 685
Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys Ser Leu Ala
690 695 700
Pro Ala Glu Cys Ser 705
<210> 11 <211> 1362 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в
pGX0003
(sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV
<400> 11
gaggtgcagc
tgctggagtc
aggaggagga
ctggtgcagc
ccggcggatc
actgcgactg
agctgcgcag
cttccggctt
caccttcagc
agctatgcca
tgaactgggt
ccgacaggct
120
cctggcaagg
gactggaatg
ggtgagtgca
atcaccatgt
cagggattac
tgcctactat
180
accgacgatg
tgaaaggccg
attcactatc
tctagggaca
acagtaagaa
taccctgtac
240
ctgcagatga
attccctgcg
cgctgaggat
acagcagtgt
actattgcgc
caaggaggaa
300
ttcctgccag
ggactcacta
ctattacgga
atggacgtgt
ggggacaggg
aaccacagtc
360
accgtgtcta
gtgcaagcac
aaaaggcccc
tccgtgtttc
ccctggcccc
ttcaagcaag
420
tctacaagtg
ggggcactgc
agccctggga
tgtctggtga
aggattactt
ccctgagcca
480
gtcaccgtga
gctggaactc
cggcgccctg
acttccggag
tccatacctt
tcctgctgtg
540
ctgcagtcct
ctggcctgta
tagcctgagt
tcagtggtca
ccgtcccaag
ctcctctctg
600
ggaacacaga aaagtggaac ctgctgggag tctcggaccc aagtttaact gaacagtata ctgaacggga aagaccattt agtcgggacg ccttccgata acccctcccg aagtctagat aatcattaca cttacatctg ccaaatcctg ggccaagcgt ccgaagtcac ggtacgtgga actctacata aggagtacaa ctaaggccaa agctgactaa tcgctgtgga tgctggactc ggcagcaggg ctcagaaatc caacgtgaat tgataagacc gttcctgttt atgcgtggtc tggcgtcgag cagggtcgtg gtgcaaagtg aggccagcca aaaccaggtc gtgggaatct tgatggaagt gaacgtcttt cctgtctctg cacaaaccaa catacatgcc ccacccaagc gtggacgtga gtgcataatg agtgtcctga tccaacaagg agagaacccc tctctgacct aatgggcagc ttctttctgt tcatgcagcg agtcctggga gcaatacaaa ctccctgtcc ctaaagacac gccacgagga ccaagaccaa ctgtgctgca ccctgccagc aggtgtatac gtctggtgaa cagaaaacaa actccaaact tgatgcatga
aa ggtcgacaag agcacctgag actgatgatt ccccgaagtc accacgagag ccaggactgg tcccatcgag actgcctcca gggattctac ttataagact gaccgtggac ggccctgcac
660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1362
<210> 12 <211> 454
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность тяжелой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в
pGX0003
(sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100
105
110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 13 <211> 2151
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в
pGX0001; антитело DMAb к PcrV
<400> 13
gaggtgcagc tgctggagtc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggatc actgcgactg 60
agctgcgcag cttccggctt caccttcagc agctatgcca tgaactgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgagtgca atcaccatgt cagggattac tgcctactat 180
accgacgatg tgaaaggccg attcactatc tctagggaca acagtaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga attccctgcg cgctgaggat acagcagtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgccag ggactcacta ctattacgga atggacgtgt ggggacaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcaagcac aaaaggcccc tccgtgtttc ccctggcccc ttcaagcaag 420
tctacaagtg ggggcactgc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccctgagcca 480
gtcaccgtga gctggaactc cggcgccctg acttccggag tccatacctt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagt tcagtggtca ccgtcccaag ctcctctctg 600
ggaacacaga cttacatctg caacgtgaat cacaaaccaa gcaatacaaa ggtcgacaag 660
aaagtggaac ccaaatcctg tgataagacc catacatgcc ctccctgtcc agcacctgag 720
ctgctgggag ggccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ctaaagacac actgtacatt 780
actcgggagc ccgaagtcac atgcgtggtc gtggacgtga gccacgagga ccccgaagtc 840
aagtttaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagaccaa accacgagag 900
gaacagtata actctacata cagggtcgtg agtgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 9 60
ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg tccaacaagg ccctgccagc tcccatcgag 1020
aagaccattt ctaaggccaa aggccagcca agagaacccc aggtgtatac actgcctcca 1080
agtcgggacg agctgactaa aaaccaggtc tctctgacct gtctggtgaa gggattctac 1140
ccttccgata tcgctgtgga gtgggaatct aatgggcagc cagaaaacaa ttataagact 1200
acccctcccg tgctggactc tgatggaagt ttctttctgt actccaaact gaccgtggac 1260
aagtctagat ggcagcaggg gaacgtcttt tcatgcagcg tgatgcatga ggccctgcac 1320
aatcattaca ctcagaaatc cctgtctctg agtcctggga aacggggccg caagaggaga 1380
tcaggaagcg gggccaccaa cttctccctg ctgaagcagg ctggcgatgt ggaggaaaat 1440
cctggaccaa tggtcctgca gactcaggtg tttatctcac tgctgctgtg gattagcgga 1500
gcatacgggg ccattcagat gacccagtcc cccagttcac tgtccgcttc tgtcggcgac 1560
agagtgacta tcacctgtcg ggcaagccag ggaattcgca acgatctggg gtggtatcag 1620
cagaagcctg ggaaagctcc aaagctgctg atctacagtg catcaactct gcagtcagga 1680
gtgcctagcc ggttcagcgg ctccggatct ggaaccgact ttacactgac tattagctcc 1740
ctgcagccag aggacttcgc cacatattac tgcctgcagg attataatta cccctggaca 1800
tttggccagg gaactaaagt ggaaatcaag cgcacagtcg ctgcacctag cgtgttcatc 1860
tttccaccct cagacgagca gctgaagtcc ggaactgctt ctgtggtgtg cctgctgaac 1920
aatttctatc caagggaagc aaaagtccag tggaaggtgg ataacgccct gcagtcaggc 1980
aatagccagg agtccgtgac cgaacaggac tctaaagata gtacatacag tctgtcaaac 2040
accctgacac tgagcaaggc tgattatgag aagcacaaag tgtacgcatg cgaagtcacc 2100
caccaggggc tgtcctcacc agtcacaaaa tctttcaatc ggggagaatg c 2151
<210> 14 <211> 717
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в
pGX0001; антитело DMAb к PcrV
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275
280
285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
465 470 475 480
Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu
485 490 495
Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
500 505 510
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
515 520 525
Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
530 535 540
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly
545 550 555 560
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
565 570 575
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
580 585 590
Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
595 600 605
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
610 615 620
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
625 630 635 640
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
645 650 655
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
660 665 670
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
675 680 685
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
690 695 700
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
705 710 715
<210> 15
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в
pGX0003
(sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV
<400> 15
gccattcaga tgacccagtc ccccagttca ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgact 60 atcacctgtc gggcaagcca gggaattcgc aacgatctgg ggtggtatca gcagaagcct 120
gggaaagctc caaagctgct gatctacagt gcatcaactc tgcagtcagg agtgcctagc
180
cggttcagcg gaggacttcg ggaactaaag tcagacgagc ccaagggaag gagtccgtga ctgagcaagg ctgtcctcac gctccggatc ccacatatta tggaaatcaa agctgaagtc caaaagtcca ccgaacagga ctgattatga cagtcacaaa tggaaccgac ctgcctgcag gcgcacagtc cggaactgct gtggaaggtg ctctaaagat gaagcacaaa atctttcaat tttacactga gattataatt gctgcaccta tctgtggtgt gataacgccc agtacataca gtgtacgcat cggggagaat ctattagctc acccctggac gcgtgttcat gcctgctgaa tgcagtcagg gtctgtcaaa gcgaagtcac
gc cctgcagcca atttggccag ctttccaccc caatttctat caatagccag caccctgaca ccaccagggg
240 300 360 420 480 540 600 642
<210> 16 <211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в
pGX0003
(sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV
<400> 16
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 17 <211> 2949
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9213: биспецифическая Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA <400> 17
gaagtgcagc tgctggagtc agggggaggg ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgactg 60
tcttgcgccg ctagtggctt caccttcagc agctatgcta tgaactgggt ccgacaggca 120
ccaggaaagg gactggaatg ggtgtctgcc atcaccatga gtggaattac agcttactat 180
actgacgatg tgaaggggag attcacaatc tcacgggaca acagcaaaaa tactctgtac 240
ctgcagatga atagcctgag ggcagaggat accgccgtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgcctg gcacacacta ctattacgga atggacgtgt ggggccaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcttcaac aaaggggcca agcgtgtttc cactggcacc ctcaagcaaa 420
tcaaccagcg ggggcacagc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccccgagcct 480
gtcaccgtgt catggaacag cggagccctg acctccggag tccacacatt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctgggctgta ttctctgagt tcagtggtca cagtcccaag ctcctctctg 600
ggcacacaga cttacatctg caacgtgaat cataagccat ccaatactaa ggtcgacaaa 660
cgggtggagc ccaaatcttg tggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag ccaggtccag 720
ctgcaggaga gcggacctgg actggtgaag ccatccgaaa cactgtctct gacctgcacc 780
gtgagcggcg gcagcatctc tccatattac tggacttgga ttaggcagcc ccctggcaag 840
tgtctggagc tgatcgggta cattcacagt tcaggctata ccgactacaa cccctccctg 900
aagtctagag tgactatcag tggcgatacc tcaaagaaac agttctccct gaaactgagc 960
tccgtcactg ctgcagacac cgccgtgtat tactgcgcac gcgccgactg ggatcgactg 1020
cgcgctctgg atatctgggg acaggggact atggtcaccg tgtctagtgg gggcggaggg 1080
agtggcggag ggggctcagg agggggcgga agcgggggcg gagggtccga cattcagctg 1140
acccagagcc cctcaagcct gagtgcctca gtcggcgatc gcgtgactat cacctgtcga 1200
gctagccagt ccattaggtc ccatctgaac tggtatcagc agaagcccgg aaaagcacct 1260
aagctgctga tctacggcgc cagcaatctg cagtccggag tgccctctag gttctctggc 1320
agtggatcag ggacagactt tacactgact atttcctctc tgcagcctga ggatttcgca 1380
acttattact gccagcagag caccggcgcc tggaactggt ttggctgtgg aaccaaggtg 1440
gaaatcaaag gcggaggggg ctctggaggg ggcggaagtg acaagaccca cacatgccca 1500
ccctgtccag caccagagct gctgggcggc ccatccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 1560
aaagatacac tgatgattag cagaacaccc gaagtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtcc 1620
cacgaggacc ccgaagtcaa gtttaactgg tacgtggacg gcgtcgaggt gcataatgcc 1680
aagaccaaac cccgagagga acagtataac tcaacctaca gggtcgtgag cgtcctgaca 1740
gtgctgcatc aggattggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaagtgtc taataaggct 1800
ctgcctgcac caatcgagaa aactattagc aaggccaaag gccagcctag agaaccacag 1860
gtgtataccc tgcccccttc tcgggaggaa atgacaaaga accaggtcag cctgacttgt 1920
ctggtgaaag gcttctaccc ttctgacatc gctgtggagt gggaaagtaa tggacagcca 1980
gaaaacaatt ataagactac cccacccgtc ctggacagtg atggctcatt ctttctgtac 2040
agtaagctga ccgtggataa atcaaggtgg cagcagggaa acgtctttag ctgctccgtg 2100
atgcacgagg ccctgcacaa tcattacaca cagaagtctc tgagtctgtc acctggcaag 2160
cgaggaagga aaaggagaag cgggtccgga gcaaccaact tcagcctgct gaaacaggct 2220
ggggacgtgg aggaaaatcc cggccctatg gtcctgcaga cccaggtgtt tatctccctg 2280
ctgctgtgga tttctggggc ctacggcgct atccagatga cacagtctcc tagttcactg 2340
tctgcaagtg tcggcgacag agtgactatc acctgtcggg cttcccaggg aattcgcaac 2400
gatctggggt ggtatcagca gaaaccagga aaggctccca aactgctgat ctactcagca 2460
agcacactgc agagtggggt gccatcaaga ttctccggat ctgggagtgg cactgacttc 2520
accctgacta ttagctccct gcagccagag gacttcgcca cctattactg cctgcaggat 2580
tataattacc cctggacatt tggacagggg actaaggtgg agatcaaacg gactgtcgcc 2640
gctcccagcg tgttcatttt tcctccatcc gacgaacagc tgaagagcgg aaccgcatcc 2700
gtggtgtgcc tgctgaacaa tttctatcct cgcgaagcaa aggtccagtg gaaagtggat 2760
aacgccctgc agagcggcaa ttcccaggag tctgtgactg aacaggacag taaggattca 2820
acctacagcc tgtctagtac cctgacactg tccaaagctg actatgagaa gcataaagtg 2880
tacgcatgtg aggtcaccca ccaggggctg tccagtccag tcaccaagtc tttcaatagg 2940
ggcgaatgc 2 949
<210> 18
<211> 983
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9213: биспецифическая Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
225 230 235 240
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr
260 265 270
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp
325 330 335
Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
340 345 350
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
370 375 380
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
385 390 395 400
Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser
420 425 430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
450 455 460
Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val
465 470 475 480
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr
485 490 495
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
515 520 525
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
530 535 540
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
725 730 735
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu
740 745 750
Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr
755 760 765
Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
770 775 780
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn
785 790 795 800
Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
805 810 815
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
820 825 830
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
835 840 845
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro
850 855 860
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
865 870 875 880
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
885 890 895
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
900 905 910
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
915 920 925
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
930 935 940
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
945 950 955 960
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
965 970 975
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 980
<210> 19 <211> 2136 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9215: Pseudo-Ps10096; антитело DMAb к Psl
<400> 19
caggtgcagc tgcaggagtc tggacccgga ctggtcaagc ctagcgaaac tctgtccctg 60
acttgcaccg tgtccggcgg atcaatcagc ccatactatt ggacctggat tcgccagccc 120
cctggcaagg gactggagct gatcggctac attcacagct ccggatacac cgactataac 180
ccatcactga aaagccgagt gacaatctct ggcgatacta gtaagaaaca gttcagcctg 240
aagctgtcta gtgtcacagc cgctgacact gcagtgtact attgcgcccg cgctgactgg 300
gatcgactgc gcgctctgga tatttggggg cagggcacta tggtcaccgt gagcagcgcc 360
tcaaccaaag gccctagcgt gtttccactg gcaccctcct ctaagtccac ctctgggggc 420
acagcagccc tgggatgtct ggtgaaggac tacttccccg agcctgtcac agtgtcctgg 480
aactctggag ccctgacctc cggggtccat acatttcccg ctgtgctgca gagttcaggg 540
ctgtactctc tgagctccgt ggtcaccgtg ccttctagtt cactgggcac acagacttat 600
atctgcaacg tgaatcacaa accttccaat acaaaggtcg acaagaaagt ggaaccaaaa 660
tcttgtgata agacccatac atgcccaccc tgtccagcac cagagctgct gggagggcca 720
tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcccaaa gacaccctga tgattagccg gactccagaa 780
gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtcccac gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac 840
gtggatggcg tcgaggtgca taatgccaag acaaaacccc gagaggaaca gtacaactcc 900
acttataggg tcgtgtctgt cctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cgggaaggag 960
tataagtgca aagtgtctaa caaggccctg cctgccccaa tcgagaagac cattagcaag 1020
gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg tacacactgc cccctagtcg ggacgagctg 1080
actaaaaacc aggtcagcct gacctgtctg gtgaagggct tctatccctc agatatcgct 1140
gtggagtggg aatctaatgg acagcctgaa aacaattaca agaccacacc acccgtgctg 1200
gacagtgatg gatcattctt tctgtatagc aaactgaccg tggacaagtc cagatggcag 1260
caggggaacg tctttagttg ctcagtgatg cacgaggccc tgcacaatca ttacactcag 1320
aaaagcctgt ccctgtctcc cggcaaacga ggaaggaaga ggagaagtgg atcaggggcc 1380
acaaacttca ctgcagacac cagctgactc tgtcgggctt gctcctaagc tcaggcagcg ttcgcaacat aaagtggaaa gagcagctga gaagcaaaag gtgacagaac aaggctgact agtccagtca gcctgctgaa aggtgtttat agtcccctag ctcagagtat tgctgatcta gcagcggaac actattgcca tcaagcgcac agtctggcac tccagtggaa aggacagtaa acgagaagca ctaagtcctt gcaggctggg cagtctgctg ctccctgagc tcgcagccat tggagcatca cgactttaca gcagtccact agtcgctgca cgccagtgtg ggtggataac ggattcaact caaagtgtat caatagggga gatgtggagg ctgtggattt gcctccgtcg ctgaactggt aatctgcaga ctgactattt ggcgcctgga cctagcgtgt gtgtgcctgc gccctgcaga tactctctga gcatgcgagg gaatgc aaaatcccgg caggggccta gagatagagt accagcagaa gcggagtgcc ctagtctgca actggtttgg tcatctttcc tgaacaattt gcggaaattc gtaacaccct tcacccacca ccctatggtc tggcgacatc gactatcacc gcccgggaaa atcccggttc gcccgaggat cggagggacc tccaagtgac ctacccaagg ccaggagtct gacactgagc ggggctgtcc
1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2136
<210> 20 <211> 712
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9215: Pseudo-Ps10096; антитело DMAb к Psl
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100
105
110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355
360
365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
450 455 460
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val
465 470 475 480
Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala
485 490 495
Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
500 505 510
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg
515 520 525
Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
530 535 540
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
545 550 555 560
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
565 570 575
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Gly Ala
580 585 590
Trp Asn Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
595 600 605
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
610
615
620
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
625 630 635 640
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
645 650 655
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
660 665 670
Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
675 680 685
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
690 695 700
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 705 710
<210> 21 <211> 2949
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9259: биспецифическая
Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE только pGX0001; DMAb-BiSPA
<400> 21
gaagtgcagc tgctggagtc agggggaggg ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgactg 60
tcttgcgccg ctagtggctt caccttcagc agctatgcta tgaactgggt ccgacaggca 120
ccaggaaagg gactggaatg ggtgtctgcc atcaccatga gtggaattac agcttactat 180
actgacgatg tgaaggggag attcacaatc tcacgggaca acagcaaaaa tactctgtac 240
ctgcagatga atagcctgag ggcagaggat accgccgtgt actattgcgc caaggaggaa 300
ttcctgcctg gcacacacta ctattacgga atggacgtgt ggggccaggg aaccacagtc 360
accgtgtcta gtgcttcaac aaaggggcca agcgtgtttc cactggcacc ctcaagcaaa 420
tcaaccagcg ggggcacagc agccctggga tgtctggtga aggattactt ccccgagcct 480
gtcaccgtgt catggaacag cggagccctg acctccggag tccacacatt tcctgctgtg 540
ctgcagtcct ctgggctgta ttctctgagt tcagtggtca cagtcccaag ctcctctctg 600
ggcacacaga cttacatctg caacgtgaat cataagccat ccaatactaa ggtcgacaaa 660
cgggtggagc ccaaatcttg tggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag ccaggtccag 720
ctgcaggaga gcggacctgg actggtgaag ccatccgaaa cactgtctct gacctgcacc 780
gtgagcggcg gcagcatctc tccatattac tggacttgga ttaggcagcc ccctggcaag 840
tgtctggagc tgatcgggta cattcacagt tcaggctata ccgactacaa cccctccctg 900
aagtctagag tgactatcag tggcgatacc tcaaagaaac agttctccct gaaactgagc 960
tccgtcactg ctgcagacac cgccgtgtat tactgcgcac gcgccgactg ggatcgactg 1020
cgcgctctgg atatctgggg acaggggact atggtcaccg tgtctagtgg gggcggaggg 1080
agtggcggag ggggctcagg agggggcgga agcgggggcg gagggtccga cattcagctg 1140
acccagagcc cctcaagcct gagtgcctca gtcggcgatc gcgtgactat cacctgtcga 1200
gctagccagt ccattaggtc ccatctgaac tggtatcagc agaagcccgg aaaagcacct 1260
aagctgctga tctacggcgc cagcaatctg cagtccggag tgccctctag gttctctggc 1320
agtggatcag ggacagactt tacactgact atttcctctc tgcagcctga ggatttcgca 1380
acttattact gccagcagag caccggcgcc tggaactggt ttggctgtgg aaccaaggtg 1440
gaaatcaaag gcggaggggg ctctggaggg ggcggaagtg acaagaccca cacatgccca 1500
ccctgtccag caccagagct gctgggcggc ccatccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 1560
aaagatacac tgtatattac tagagagccc gaagtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtcc 1620
cacgaggacc ccgaagtcaa gtttaactgg tacgtggacg gcgtcgaggt gcataatgcc 1680
aagaccaaac cccgagagga acagtataac tcaacctaca gggtcgtgag cgtcctgaca 1740
gtgctgcatc aggattggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaagtgtc taataaggct 1800
ctgcctgcac caatcgagaa aactattagc aaggccaaag gccagcctag agaaccacag 1860
gtgtataccc tgcccccttc tcgggaggaa atgacaaaga accaggtcag cctgacttgt 1920
ctggtgaaag gcttctaccc ttctgacatc gctgtggagt gggaaagtaa tggacagcca 1980
gaaaacaatt ataagactac cccacccgtc ctggacagtg atggctcatt ctttctgtac 2040
agtaagctga ccgtggataa atcaaggtgg cagcagggaa acgtctttag ctgctccgtg 2100
atgcacgagg ccctgcacaa tcattacaca cagaagtctc tgagtctgtc acctggcaag 2160
cgaggaagga aaaggagaag cgggtccgga gcaaccaact tcagcctgct gaaacaggct 2220
ggggacgtgg aggaaaatcc cggccctatg gtcctgcaga cccaggtgtt tatctccctg 2280
ctgctgtgga tttctggggc ctacggcgct atccagatga cacagtctcc tagttcactg 2340
tctgcaagtg tcggcgacag agtgactatc acctgtcggg cttcccaggg aattcgcaac 2400
gatctggggt ggtatcagca gaaaccagga aaggctccca aactgctgat ctactcagca 2460
agcacactgc agagtggggt gccatcaaga ttctccggat ctgggagtgg cactgacttc 2520
accctgacta ttagctccct gcagccagag gacttcgcca cctattactg cctgcaggat 2580
tataattacc cctggacatt tggacagggg actaaggtgg agatcaaacg gactgtcgcc 2640
gctcccagcg tgttcatttt tcctccatcc gacgaacagc tgaagagcgg aaccgcatcc 2700
gtggtgtgcc tgctgaacaa tttctatcct cgcgaagcaa aggtccagtg gaaagtggat 2760
aacgccctgc agagcggcaa ttcccaggag tctgtgactg aacaggacag taaggattca 2820
acctacagcc tgtctagtac cctgacactg tccaaagctg actatgagaa gcataaagtg 2880
tacgcatgtg aggtcaccca ccaggggctg tccagtccag tcaccaagtc tttcaatagg 2940
ggcgaatgc 2949
<210> 22
<211> 983
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9259: биспецифическая
Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE только pGX0001; DMAb-BiSPA
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
225 230 235 240
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr
260 265 270
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile Gly Tyr Ile
275 280 285
His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
290 295 300
Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp
325 330 335
Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
340 345 350
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
370 375 380
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
385 390 395 400
Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
405 410 415
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser
420
425
430
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
450 455 460
Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val
465 470 475 480
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr
485 490 495
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg
515 520 525
Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
530 535 540
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675
680
685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
725 730 735
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu
740 745 750
Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr
755 760 765
Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
770 775 780
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn
785 790 795 800
Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
805 810 815
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
820 825 830
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
835 840 845
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro
850 855 860
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
865 870 875 880
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
885 890 895
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
900 905 910
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
915 920 925
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
930
935
940
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
945 950 955 960
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
965 970 975
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 980
<210> 23
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность расщепления фурином
<400> 23
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
<210> 24
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность сигнального пептида
<400> 24
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala
<210> 25
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность сигнального пептида
<400> 25
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly 20
<210> 26 <211> 1419
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9308: V2L2MD, функционально
связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность
IgE
<400> 26
atggactgga cctggagaat cctgttcctg gtggcagcag caaccggaac acacgcagag 60
gtgcagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcctg gcggcagcct gaggctgtcc 120
tgcgcagcat ctggcttcac ctttagctcc tatgcaatga actgggtgcg ccaggcacca 180
ggcaagggac tggagtgggt gtctgccatc acaatgagcg gcatcaccgc ctactataca 240
gacgatgtga agggcaggtt taccatcagc agagacaact ccaagaatac actgtacctg 300
cagatgaata gcctgagagc cgaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggagttc 360
ctgcccggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtgacc 420
gtgtctagcg cctccacaaa gggacctagc gtgttcccac tggcaccctc ctctaagtcc 480
acctctggcg gcacagccgc cctgggctgt ctggtgaagg attatttccc agagcccgtg 540
accgtgtctt ggaacagcgg cgccctgacc tctggagtgc acacatttcc agccgtgctg 600
cagagctccg gcctgtatag cctgtctagc gtggtgaccg tgccctcctc tagcctgggc 660
acccagacat acatctgcaa cgtgaatcac aagccatcta atacaaaggt ggacaagaag 720
gtggagccca agagctgtga taagacccac acatgccctc cctgtcctgc accagagctg 780
ctgggcggcc catccgtgtt cctgtttcca cccaagccta aggacaccct gatgatctcc 840
cggaccccag aggtgacatg cgtggtggtg gacgtgtctc acgaggaccc cgaggtgaag 900
ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc acgggaggag 960
cagtataaca gcacctaccg cgtggtgtcc gtgctgacag tgctgcacca ggactggctg 1020
aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc aataaggccc tgcccgcccc tatcgagaag 1080
accatctcca aggccaaggg ccagcctagg gagccacagg tgtatacact gcctccaagc 1140
agagacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacatgtc tggtgaaggg cttctaccct 1200
tccgatatcg ccgtggagtg ggagtctaat ggccagccag agaacaatta taagaccaca 1260
ccccctgtgc tggactccga tggctctttc tttctgtact ctaagctgac cgtggataag 1320
agccgctggc agcagggcaa cgtgtttagc tgttccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 1380
cactacacac agaagtctct gagcctgtcc cctggcaag 1419
<210> 27 <211> 473
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9308: V2L2MD, функционально
связанная с лидерной последовательностью IgE
<400> 27
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 28
<211> 702
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9309: V2L2MD, функционально
связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность
IgE
<400> 28
atggtgctgc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
gcaatccaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga cagggtgacc 120
atcacatgca gagcctctca gggcatccgg aacgatctgg gctggtacca gcagaagcca 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctattct gccagcaccc tgcagtctgg agtgcccagc 240
cggttctccg gctctggcag cggaacagac tttaccctga caatctctag cctgcagcct 300
gaggacttcg ccacctacta ttgcctgcag gattacaatt atccatggac ctttggccag 360
ggcacaaagg tggagatcaa gcgcacagtg gccgccccca gcgtgttcat ctttccccct 420
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 480
cctagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caattcccag 540
gagtctgtga ccgagcagga cagcaaggat tccacatatt ccctgtctaa caccctgaca 600
ctgagcaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgcat gcgaggtgac ccaccaggga 660
ctgtcctctc ccgtgacaaa gtcctttaat aggggcgagt gt 702
<210> 29 <211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9309: V2L2MD, функционально
связанная с лидерной последовательностью IgE
<400> 29
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
100 105 110
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 30
<211> 2208
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9214: Pseudo-V2L2MD; антитело DMAb к PcrV,
функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
<400> 30
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac ccacgccgag 60 gtgcagctgc tggagtcagg aggaggactg gtgcagcccg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggcttcac cttcagcagc tatgccatga actgggtccg acaggctcct
180
ggcaagggac tggaatgggt gagtgcaatc accatgtcag ggattactgc ctactatacc 240
gacgatgtga aaggccgatt cactatctct agggacaaca gtaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgcgc tgaggataca gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggga ctcactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg caagcacaaa aggcccctcc gtgtttcccc tggccccttc aagcaagtct 480
acaagtgggg gcactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc tgagccagtc 540
accgtgagct ggaactccgg cgccctgact tccggagtcc atacctttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtatag cctgagttca gtggtcaccg tcccaagctc ctctctggga 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcac aaaccaagca atacaaaggt cgacaagaaa 720
gtggaaccca aatcctgtga taagacccat acatgccctc cctgtccagc acctgagctg 780
ctgggagggc caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacacact gatgatttct 840
cggacccccg aagtcacatg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agaccaaacc acgagaggaa 960
cagtataact ctacatacag ggtcgtgagt gtcctgactg tgctgcacca ggactggctg 1020
aacgggaagg agtacaagtg caaagtgtcc aacaaggccc tgccagctcc catcgagaag 1080
accatttcta aggccaaagg ccagccaaga gaaccccagg tgtatacact gcctccaagt 1140
cgggacgagc tgactaaaaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtgaaggg attctaccct 1200
tccgatatcg ctgtggagtg ggaatctaat gggcagccag aaaacaatta taagactacc 1260
cctcccgtgc tggactctga tggaagtttc tttctgtact ccaaactgac cgtggacaag 1320
tctagatggc agcaggggaa cgtcttttca tgcagcgtga tgcatgaggc cctgcacaat 1380
cattacactc agaaatccct gtctctgagt cctgggaaac ggggccgcaa gaggagatca 1440
ggaagcgggg ccaccaactt ctccctgctg aagcaggctg gcgatgtgga ggaaaatcct 1500
ggaccaatgg tcctgcagac tcaggtgttt atctcactgc tgctgtggat tagcggagca 1560
tacggggcca ttcagatgac ccagtccccc agttcactgt ccgcttctgt cggcgacaga 1620
gtgactatca cctgtcgggc aagccaggga attcgcaacg atctggggtg gtatcagcag 1680
aagcctggga aagctccaaa gctgctgatc tacagtgcat caactctgca gtcaggagtg 1740
cctagccggt tcagcggctc cggatctgga accgacttta cactgactat tagctccctg 1800
cagccagagg acttcgccac atattactgc ctgcaggatt ataattaccc ctggacattt 1860
ggccagggaa ctaaagtgga aatcaagcgc acagtcgctg cacctagcgt gttcatcttt 1920
ccaccctcag acgagcagct gaagtccgga actgcttctg tggtgtgcct gctgaacaat 1980
ttctatccaa gggaagcaaa agtccagtgg aaggtggata acgccctgca gtcaggcaat 2040
agccaggagt ccgtgaccga acaggactct aaagatagta catacagtct gtcaaacacc 2100
ctgacactga gcaaggctga ttatgagaag cacaaagtgt acgcatgcga agtcacccac 2160
caggggctgt cctcaccagt cacaaaatct ttcaatcggg gagaatgc 2208
<210> 31 <211> 736
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9214: Pseudo-V2L2MD; антитело DMAb к PcrV,
функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
<400> 31
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
465 470 475 480
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
485 490 495
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser
500 505 510
Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln
515 520 525
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
530 535 540
Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
545 550 555 560
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
580 585 590
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
595 600 605
Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
610 615 620
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
625 630 635 640
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
645 650 655
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
660 665 670
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
675 680 685
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser
690 695 700
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
705 710 715 720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730 735
<210> 32 <211> 2217
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9247: V2L2 с Fc Rhesus в
pGX0001;
антитело DMAb к PcrV, функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную
последовательность IgE
<400> 32
atggactgga catggagaat cctgttcctg gtcgccgccg ctactgggac tcacgccgag 60
gtgcagctcc tggaaagtgg gggagggctg gtgcagcccg gcgggtccct cagactgtct 120
tgcgccgcta gtggcttcac ctttagctcc tatgcaatga actgggtgcg gcaggcacct 180
gggaaaggac tggagtgggt gagcgccatc accatgtccg gcattactgc atactatacc 240
gacgatgtga aagggaggtt cacaatctca agagacaaca gcaagaatac tctctacctg 300
cagatgaata gcctgcgcgc tgaggatact gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggca cccactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg cttctacaaa agggcccagc gtgttcccac tggcaccctc aagcaggagt 480
acatcagaga gcactgcagc cctcggatgt ctggtgaagg attacttccc cgaacctgtc 540
accgtgtcct ggaactccgg atctctcact tctggcgtcc acacctttcc cgccgtgctg 600
cagtcctctg ggctctatag cctgagttca gtggtcaccg tgcctagctc ctctctggga 660
acacagactt acgtctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atacaaaggt cgacaaaaga 720
gtggagatca aaacctgtgg aggcgggtct aagcccccta catgcccacc ctgtccagca 780
ccagaactgc tcggaggccc aagcgtgttc ctctttcctc caaagcccaa agacaccctg 840
atgatttccc ggaccccaga ggtcacatgc gtggtcgtgg acgtgagcca ggaagaccct 900
gatgtcaaat tcaactggta cgtgaatggc gccgaggtgc accatgctca gacaaagccc 960
agagaaactc agtataactc aacctaccgg gtcgtgagcg tcctcaccgt gacacaccag 1020
gactggctga acggcaaaga gtatacatgc aaagtgagca ataaggccct gcctgctcca 1080
atccagaaga ctattagcaa ggataaaggg cagcctcgcg aaccacaggt gtacaccctg 1140
cctcccagca gggaggaact gactaaaaac caggtcagcc tcacctgtct ggtgaagggc 1200
ttctaccctt ccgacatcgt cgtggagtgg gaaagttcag gccagccaga gaatacctac 1260
aagactaccc gtggataagt ctccacaatc agtggatcag cccggaccta gcatacgggg cgggtgacta cagaagcccg gtgccttcta ctgcagccag tttgggcagg tttcctccaa aatttctatc aactcacagg accctcacac caccaggggc cacccgtgct ccagatggca attacacaca gcgcaactaa tggtcctgca ccatccagat tcacctgtcg gcaaagcccc ggttctcagg aggacttcgc gaactaaagt gtgaagacca caagggaggc agagcgtgac tgtcctctac tcagtagtcc ggactctgat gcagggcaac gaaaagcctg cttcagcctg gacccaggtg gacacagagc cgctagccag taagctcctg gagcggcagc aacctattac ggagatcaag ggtcaagagt ctccgtgaag tgaacaggac cgactatcag agtcacaaaa ggaagttatt gtctttagtt tccgtgtctc ctcaagcagg tttatctccc cccagctccc ggaattagga atctactctg ggcactgact tgcctgcagg cgcgctgtcg ggcaccgtgt tggaaagtcg agtaaggata tctcacaacg tctttcaata tcctctacag gctcagtgat cccggggcag caggggacgt tgctcctgtg tgagcgcctc acgatctggg ctagtacact tcaccctcac attataatta ctgcacctag cagtggtgtg atggggtgct atacctactc tgtacgcttg gaggcgaatg caaactgaca gcatgaggcc gaagaggaga ggaggaaaat gatttctggc cgtcggcgac ctggtatcag gcagtccggg tatttctagt cccctggaca cgtgttcatc cctcctgaac gaaaacagga actgtcaagc cgaagtcacc ttgataa
1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2217
<210> 33 <211> 737
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9247: V2L2
pGX0001;
антитело DMAb к PcrV, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
<400> 33
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
с Fc Rhesus в
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser
145 150 155 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Asp Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Thr His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys Asp
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Ser Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg
465 470 475 480
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
485 490 495
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile
500 505 510
Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr
515 520 525
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
530 535 540
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln
545 550 555 560
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr
565 570 575
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
580 585 590
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
595 600 605
Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
610 615 620
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
625 630 635 640
Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly Thr Val Ser Val Val
645 650 655
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp Lys
660 665 670
Val Asp Gly Val Leu Lys Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
675 680 685
Gln Asp Ser Lys Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
690 695 700
Ser Ser Thr Asp Tyr Gln Ser His Asn Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
705 710 715 720
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
725 730 735
Cys
<210> 34
<211> 2184
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9248: Pseudo-V2L2MD rbFc; антитело DMAb к PcrV,
функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
<400> 34
atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg ccaccggaac ccacgccgaa 60
gtgcagctgc tggaatctgg agggggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgtcc 120
tgcgccgcca gcggcttcac cttctccagc tacgccatga actgggtgcg ccaggcccca 180
ggcaagggac tggagtgggt gtccgccatc accatgagcg gcatcaccgc ctactacacc 240
gacgacgtga agggccgctt caccatctcc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccaa ggaggagttc 360
ctgccaggaa cccactacta ctacggaatg gacgtgtggg gacagggaac caccgtgacc 420
gtgtccagcg gccagcccaa ggcccccagc gtgttcccac tggccccatg ctgcggcgac 480
accccctcca gcaccgtgac cctgggatgc ctggtgaagg gatacctgcc agagccagtg 540
accgtgacct ggaactccgg caccctgacc aacggcgtga ggaccttccc aagcgtgcgc 600
cagtccagcg gactgtactc cctgtccagc gtggtgagcg tgacctccag ctcccagcca 660
gtgacctgca acgtggccca cccagccacc aacaccaagg tggacaagac cgtggcccca 720
agcacctgct ccaagccaac ctgccctcct cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 780
atcttccctc ccaagcccaa ggacaccctg atgatctcca ggaccccaga ggtgacctgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca ggacgacccc gaggtgcagt tcacctggta catcaacaac 900
gagcaggtgc ggaccgcccg ccctcccctg cgcgagcagc agttcaactc caccatccgg 960
gtggtgagca ccctgccaat cacccaccag gactggctga ggggcaagga gttcaagtgc 1020
aaggtgcaca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatcagcaa ggccaggggc 1080
cagccactgg agcccaaggt gtacaccatg ggccctcccc gcgaggagct gagctccagg 1140
agcgtgtccc tgacctgcat gatcaacggc ttctacccca gcgacatctc cgtggagtgg 1200
gagaagaacg gcaaggccga ggacaactac aagaccaccc cagccgtgct ggacagcgac 1260
ggctcctact tcctgtacaa caagctgtcc gtgcccacca gcgagtggca gcggggcgac 1320
gtgttcacct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcatc 1380
tccaggagcc ccggcaagag gggaaggaag cgccggtccg gcagcggagc caccaacttc 1440
agcctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaacccag gaccaatggt gctgcagacc 1500
caggtgttca tctccctgct gctgtggatc agcggagcct acggagccat ccagatgacc 1560
cagtccccca gctccctgtc cgccagcgtg ggcgacaggg tgaccatcac ctgcagggcc 1620
agccagggca tcaggaacga cctgggctgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag 1680
ctgctgatct actccgccag caccctgcag tccggagtgc ccagccggtt ctccggcagc 1740
ggctccggaa ccgacttcac cctgaccatc agctccctgc agcccgagga cttcgccacc 1800
tactactgcc tgcaggacta caactacccc tggaccttcg gccagggcac caaggtggag 1860
atcaagaggc agccagccgt gaccccatcc gtgatcctgt tccctccctc ctccgaggag 1920
ctgaaggaca acaaggccac cctggtgtgc ctgatctccg acttctaccc ccgcaccgtg 1980
aaggtgaact ggaaggccga cggaaacagc gtgacccagg gagtggacac cacccagcca 2040
agcaagcagt ccaacaacaa gtacgccgcc agctccttcc tgcacctgac cgccaaccag 2100
tggaagagct accagtccgt gacctgtcag gtcacccacg aagggcacac cgtcgaaaaa 2160
tctctggccc ccgccgaatg ttct 2184
<210> 35 <211> 728
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9248: Pseudo-V2L2MD rbFc; антитело DMAb к PcrV,
функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
<400> 35
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp
145 150 155 160
Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly
180 185 190
Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn
210 215 220
Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro
225 230 235 240
Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp
275 280 285
Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg
290 295 300
Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Thr His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys
325 330 335
Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr
355 360 365
Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Lys Leu Ser Val Pro
420 425 430
Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro
450 455 460
Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
465 470 475 480
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
485 490 495
Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly
500 505 510
Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
515 520 525
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
530 535 540
Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
545 550 555 560
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
565 570 575
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
580 585 590
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn
595 600 605
Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gln
610 615 620
Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Ile Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
625 630 635 640
Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
645 650 655
Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser Val Thr
660 665 670
Gln Gly Val Asp Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
675 680 685
Ala Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gln Trp Lys Ser Tyr
690 695 700
Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys
705 710 715 720
Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser 725
<210> 36
<211> 1419 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в
pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV, функционально
связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность
IgE
<400> 36
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac ccacgccgag 60
gtgcagctgc tggagtcagg aggaggactg gtgcagcccg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggcttcac cttcagcagc tatgccatga actgggtccg acaggctcct 180
ggcaagggac tggaatgggt gagtgcaatc accatgtcag ggattactgc ctactatacc 240
gacgatgtga aaggccgatt cactatctct agggacaaca gtaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgcgc tgaggataca gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggga ctcactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg caagcacaaa aggcccctcc gtgtttcccc tggccccttc aagcaagtct 480
acaagtgggg gcactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc tgagccagtc 540
accgtgagct ggaactccgg cgccctgact tccggagtcc atacctttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtatag cctgagttca gtggtcaccg tcccaagctc ctctctggga 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcac aaaccaagca atacaaaggt cgacaagaaa 720
gtggaaccca aatcctgtga taagacccat acatgccctc cctgtccagc acctgagctg 780
ctgggagggc caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacacact gatgatttct 840
cggacccccg aagtcacatg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agaccaaacc acgagaggaa 960
cagtataact ctacatacag ggtcgtgagt gtcctgactg tgctgcacca ggactggctg 1020
aacgggaagg agtacaagtg caaagtgtcc aacaaggccc tgccagctcc catcgagaag 1080
accatttcta aggccaaagg ccagccaaga gaaccccagg tgtatacact gcctccaagt 1140
cgggacgagc tgactaaaaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtgaaggg attctaccct 1200
tccgatatcg ctgtggagtg ggaatctaat gggcagccag aaaacaatta taagactacc 1260
cctcccgtgc tggactctga tggaagtttc tttctgtact ccaaactgac cgtggacaag 1320
tctagatggc agcaggggaa cgtcttttca tgcagcgtga tgcatgaggc cctgcacaat 1380
cattacactc agaaatccct gtctctgagt cctgggaaa
1419
<210> 37 <211> 473
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность тяжелой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV,
функционально
связанная с лидерной последовательностью IgE
<400> 37
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 38 <211> 2208 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в
pGX0 0 01; антитело DMAb к PcrV функционально связанное с последовательностью, кодирующей
лидерной последовательностью IgE
<400> 38
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac ccacgccgag 60
gtgcagctgc tggagtcagg aggaggactg gtgcagcccg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggcttcac cttcagcagc tatgccatga actgggtccg acaggctcct 180
ggcaagggac tggaatgggt gagtgcaatc accatgtcag ggattactgc ctactatacc 240
gacgatgtga aaggccgatt cactatctct agggacaaca gtaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgcgc tgaggataca gcagtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgccaggga ctcactacta ttacggaatg gacgtgtggg gacagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg caagcacaaa aggcccctcc gtgtttcccc tggccccttc aagcaagtct 480
acaagtgggg gcactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc tgagccagtc 540
accgtgagct ggaactccgg cgccctgact tccggagtcc atacctttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtatag cctgagttca gtggtcaccg tcccaagctc ctctctggga 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcac aaaccaagca atacaaaggt cgacaagaaa 720
gtggaaccca aatcctgtga taagacccat acatgccctc cctgtccagc acctgagctg 780
ctgggagggc caagcgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacacact gtacattact 840
cgggagcccg aagtcacatg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcca agaccaaacc acgagaggaa 960
cagtataact ctacatacag ggtcgtgagt gtcctgactg tgctgcacca ggactggctg 1020
aacgggaagg agtacaagtg caaagtgtcc aacaaggccc tgccagctcc catcgagaag 1080
accatttcta aggccaaagg ccagccaaga gaaccccagg tgtatacact gcctccaagt 1140
cgggacgagc tgactaaaaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtgaaggg attctaccct 1200
tccgatatcg ctgtggagtg ggaatctaat gggcagccag aaaacaatta taagactacc 1260
cctcccgtgc tctagatggc cattacactc ggaagcgggg ggaccaatgg tacggggcca gtgactatca aagcctggga cctagccggt cagccagagg ggccagggaa ccaccctcag ttctatccaa agccaggagt ctgacactga caggggctgt tggactctga agcaggggaa agaaatccct ccaccaactt tcctgcagac ttcagatgac cctgtcgggc aagctccaaa tcagcggctc acttcgccac ctaaagtgga acgagcagct gggaagcaaa ccgtgaccga gcaaggctga cctcaccagt tggaagtttc cgtcttttca gtctctgagt ctccctgctg tcaggtgttt ccagtccccc aagccaggga gctgctgatc cggatctgga atattactgc aatcaagcgc gaagtccgga agtccagtgg acaggactct ttatgagaag cacaaaatct tttctgtact tgcagcgtga cctgggaaac aagcaggctg atctcactgc agttcactgt attcgcaacg tacagtgcat accgacttta ctgcaggatt acagtcgctg actgcttctg aaggtggata aaagatagta cacaaagtgt ttcaatcggg ccaaactgac tgcatgaggc ggggccgcaa gcgatgtgga tgctgtggat ccgcttctgt atctggggtg caactctgca cactgactat ataattaccc cacctagcgt tggtgtgcct acgccctgca catacagtct acgcatgcga gagaatgc cgtggacaag cctgcacaat gaggagatca ggaaaatcct tagcggagca cggcgacaga gtatcagcag gtcaggagtg tagctccctg ctggacattt gttcatcttt gctgaacaat gtcaggcaat gtcaaacacc agtcacccac
1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2208
<210> 39 <211> 736
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9258: Psuedo-V2L2MD-YTE только в
pGX0001; антитело DMAb к PcrV функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
<400> 39
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
465 470 475 480
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
485 490 495
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser
500 505 510
Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln
515 520 525
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
530 535 540
Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
545 550 555 560
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
580 585 590
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
595 600 605
Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
610 615 620
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
625 630 635 640
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
645 650 655
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
660 665 670
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
675 680 685
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser
690 695 700
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
705 710 715 720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730 735
<210> 40 <211> 702
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV, функционально
связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность
IgE
tcagacgagc agctgaagtc cggaactgct tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctat
480
ccaagggaag caaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc tgcagtcagg caatagccag
540
gagtccgtga ccgaacagga ctctaaagat agtacataca gtctgtcaaa caccctgaca
600
ctgagcaagg ctgattatga gaagcacaaa gtgtacgcat gcgaagtcac ccaccagggg
660
ctgtcctcac cagtcacaaa atctttcaat cggggagaat gc
702
<210> 41 <211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9257: Pseudo-V2L2MD в pGX0003 (sCMV-легкая цепь, hCMV-тяжелая цепь); антитело DMAb к PcrV,
функционально
связанная с лидерной последовательностью IgE
<400> 41
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
100 105 110
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 42
<211> 3006
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9213: биспецифическая Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA, функционально связанное с последовательностью,
кодирующей лидерную последовательность IgE
<400> 42
atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg caactggaac ccacgccgaa 60
gtgcagctgc tggagtcagg gggagggctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgactgtct 120
tgcgccgcta gtggcttcac cttcagcagc tatgctatga actgggtccg acaggcacca 180
ggaaagggac tggaatgggt gtctgccatc accatgagtg gaattacagc ttactatact 240
gacgatgtga aggggagatt cacaatctca cgggacaaca gcaaaaatac tctgtacctg 300
cagatgaata gcctgagggc agaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgcctggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gccagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg cttcaacaaa ggggccaagc gtgtttccac tggcaccctc aagcaaatca 480
accagcgggg gcacagcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc cgagcctgtc 540
accgtgtcat ggaacagcgg agccctgacc tccggagtcc acacatttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg ggctgtattc tctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggc 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atactaaggt cgacaaacgg 720
gtggagccca aatcttgtgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca ggtccagctg 780
caggagagcg gacctggact ggtgaagcca tccgaaacac tgtctctgac ctgcaccgtg 840
agcggcggca gcatctctcc atattactgg acttggatta ggcagccccc tggcaagtgt 900
ctggagctga tcgggtacat tcacagttca ggctataccg actacaaccc ctccctgaag 960
tctagagtga ctatcagtgg cgatacctca aagaaacagt tctccctgaa actgagctcc 1020
gtcactgctg cagacaccgc cgtgtattac tgcgcacgcg ccgactggga tcgactgcgc 1080
gctctggata tctggggaca ggggactatg gtcaccgtgt ctagtggggg cggagggagt 1140
ggcggagggg gctcaggagg gggcggaagc gggggcggag ggtccgacat tcagctgacc 1200
cagagcccct caagcctgag tgcctcagtc ggcgatcgcg tgactatcac ctgtcgagct 1260
agccagtcca ttaggtccca tctgaactgg tatcagcaga agcccggaaa agcacctaag 1320
ctgctgatct acggcgccag caatctgcag tccggagtgc cctctaggtt ctctggcagt 1380
ggatcaggga cagactttac actgactatt tcctctctgc agcctgagga tttcgcaact 1440
tattactgcc agcagagcac cggcgcctgg aactggtttg gctgtggaac caaggtggaa 1500
atcaaaggcg gagggggctc tggagggggc ggaagtgaca agacccacac atgcccaccc 1560
tgtccagcac cagagctgct gggcggccca tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaaa 1620
gatacactga tgattagcag aacacccgaa gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtcccac 1680
gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag 1740
accaaacccc gagaggaaca gtataactca acctacaggg tcgtgagcgt cctgacagtg 1800
ctgcatcagg attggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aagtgtctaa taaggctctg 1860
cctgcaccaa tcgagaaaac tattagcaag gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg 1920
tataccctgc ccccttctcg ggaggaaatg acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg 1980
gtgaaaggct tctacccttc tgacatcgct gtggagtggg aaagtaatgg acagccagaa 2040
aacaattata agactacccc acccgtcctg gacagtgatg gctcattctt tctgtacagt 2100
aagctgaccg tggataaatc aaggtggcag cagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 2160
cacgaggccc tgcacaatca ttacacacag aagtctctga gtctgtcacc tggcaagcga 2220
ggaaggaaaa ggagaagcgg gtccggagca accaacttca gcctgctgaa acaggctggg 2280
gacgtggagg aaaatcccgg ccctatggtc ctgcagaccc aggtgtttat ctccctgctg 2340
ctgtggattt ctggggccta cggcgctatc cagatgacac agtctcctag ttcactgtct 2400
gcaagtgtcg gcgacagagt gactatcacc tgtcgggctt cccagggaat tcgcaacgat 2460
ctggggtggt atcagcagaa accaggaaag gctcccaaac tgctgatcta ctcagcaagc 2520
acactgcaga gtggggtgcc atcaagattc tccggatctg ggagtggcac tgacttcacc 2580
ctgactatta gctccctgca gccagaggac ttcgccacct attactgcct gcaggattat 2640
aattacccct ggacatttgg acaggggact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgccgct 2700
cccagcgtgt tcatttttcc tccatccgac gaacagctga agagcggaac cgcatccgtg 2760
gtgtgcctgc tgaacaattt ctatcctcgc gaagcaaagg tccagtggaa agtggataac 2820
gccctgcaga gcggcaattc ccaggagtct gtgactgaac aggacagtaa ggattcaacc
2880
tacagcctgt ctagtaccct gacactgtcc aaagctgact atgagaagca taaagtgtac 2940 gcatgtgagg tcacccacca ggggctgtcc agtccagtca ccaagtcttt caataggggc 3000 gaatgc 3006
<210> 43 <211> 1002
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9213: биспецифическая Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096); DMAb-BiSPA, функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
<400> 43
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
260 265 270
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr
275 280 285
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile
290 295 300
Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
325 330 335
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr
385 390 395 400
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
405 410 415
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln
420 425 430
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn
435 440 445
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
450 455 460
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly
485 490 495
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
515 520 525
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
530 535 540
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
545 550 555 560
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
565 570 575
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
580 585 590
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
595 600 605
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
610 615 620
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
625 630 635 640
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
645 650 655
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
660 665 670
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
675 680 685
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
690 695 700
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
705 710 715 720
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
725 730 735
Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
740 745 750
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
755 760 765
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
770 775 780
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
785 790 795 800
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
805 810 815
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
820 825 830
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
835 840 845
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
850 855 860
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
865 870 875 880
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
885 890 895
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
900 905 910
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
915 920 925
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
930 935 940
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
945 950 955 960
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
965 970 975
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
980 985 990
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 995 1000
<210> 44 <211> 2193
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9215: Pseudo-Ps10096; антитело DMAb к Psl,
функционально связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность IgE
<400> 44
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtggccgccg ctactggaac ccacgctcag 60
gtgcagctgc aggagtctgg acccggactg gtcaagccta gcgaaactct gtccctgact 120
tgcaccgtgt ccggcggatc aatcagccca tactattgga cctggattcg ccagccccct 180
ggcaagggac tggagctgat cggctacatt cacagctccg gatacaccga ctataaccca 240
tcactgaaaa gccgagtgac aatctctggc gatactagta agaaacagtt cagcctgaag 300
ctgtctagtg tcacagccgc tgacactgca gtgtactatt gcgcccgcgc tgactgggat 360
cgactgcgcg ctctggatat ttgggggcag ggcactatgg tcaccgtgag cagcgcctca 420
accaaaggcc ctagcgtgtt tccactggca ccctcctcta agtccacctc tgggggcaca 480
gcagccctgg gatgtctggt gaaggactac ttccccgagc ctgtcacagt gtcctggaac 540
tctggagccc tgacctccgg ggtccataca tttcccgctg tgctgcagag ttcagggctg 600
tactctctga gctccgtggt caccgtgcct tctagttcac tgggcacaca gacttatatc 660
tgcaacgtga atcacaaacc ttccaataca aaggtcgaca agaaagtgga accaaaatct 720
tgtgataaga cccatacatg cccaccctgt ccagcaccag agctgctggg agggccatcc 780
gtgttcctgt ttcctccaaa gcccaaagac accctgatga ttagccggac tccagaagtc 840
acctgcgtgg tcgtggacgt gtcccacgag gaccccgaag tcaagttcaa ctggtacgtg 900
gatggcgtcg aggtgcataa tgccaagaca aaaccccgag aggaacagta caactccact 960
tatagggtcg tgtctgtcct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 1020
aagtgcaaag aaaggccagc aaaaaccagg gagtgggaat agtgatggat gggaacgtct agcctgtccc aacttcagcc cagacacagg ctgactcagt cgggcttctc cctaagctgc ggcagcggca gcaacatact gtggaaatca cagctgaagt gcaaaagtcc acagaacagg gctgactacg ccagtcacta tgtctaacaa ctagagaacc tcagcctgac ctaatggaca cattctttct ttagttgctc tgtctcccgg tgctgaagca tgtttatcag cccctagctc agagtattcg tgatctatgg gcggaaccga attgccagca agcgcacagt ctggcaccgc agtggaaggt acagtaagga agaagcacaa agtccttcaa ggccctgcct acaggtgtac ctgtctggtg gcctgaaaac gtatagcaaa agtgatgcac caaacgagga ggctggggat tctgctgctg cctgagcgcc cagccatctg agcatcaaat ctttacactg gtccactggc cgctgcacct cagtgtggtg ggataacgcc ttcaacttac agtgtatgca taggggagaa gccccaatcg acactgcccc aagggcttct aattacaaga ctgaccgtgg gaggccctgc aggaagagga gtggaggaaa tggatttcag tccgtcggag aactggtacc ctgcagagcg actatttcta gcctggaact agcgtgttca tgcctgctga ctgcagagcg tctctgagta tgcgaggtca tgc agaagaccat ctagtcggga atccctcaga ccacaccacc acaagtccag acaatcatta gaagtggatc atcccggccc gggcctatgg atagagtgac agcagaagcc gagtgccatc gtctgcagcc ggtttggcgg tctttcctcc acaatttcta gaaattccca acaccctgac cccaccaggg tagcaaggcc cgagctgact tatcgctgtg cgtgctggac atggcagcag cactcagaaa aggggccaca tatggtcctg cgacatccag tatcacctgt cgggaaagct ccggttctca cgaggatttc agggaccaaa aagtgacgag cccaagggaa ggagtctgtg actgagcaag gctgtccagt
1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2193
<210> 45 <211> 731
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9215: Pseudo-Ps10096; антитело DMAb к Psl,
функционально связанное с лидерной последовательностью IgE
<400> 45
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Pro Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Ile Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr
465 470 475 480
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
485 490 495
Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile
500 505 510
Ser Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
515 520 525
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
530 535 540
Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
545 550 555 560
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro
565 570 575
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
580 585 590
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
595 600 605
Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
610 615 620
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
625 630 635 640
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
645 650 655
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
660 665 670
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
675 680 685
Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
690 695 700
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
705 710 715 720
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 725 730
<210> 46
<211> 3006
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи pGX9259: биспецифическая
Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE только pGX0001; DMAb-BiSPA, функционально
связанное с последовательностью, кодирующей лидерную последовательность
IgE
<400> 46
atggactgga catggagaat cctgtttctg gtcgccgccg caactggaac ccacgccgaa 60 gtgcagctgc tggagtcagg gggagggctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgactgtct 120
tgcgccgcta gtggcttcac cttcagcagc tatgctatga actgggtccg acaggcacca
180
ggaaagggac tggaatgggt gtctgccatc accatgagtg gaattacagc ttactatact 240
gacgatgtga aggggagatt cacaatctca cgggacaaca gcaaaaatac tctgtacctg 300
cagatgaata gcctgagggc agaggatacc gccgtgtact attgcgccaa ggaggaattc 360
ctgcctggca cacactacta ttacggaatg gacgtgtggg gccagggaac cacagtcacc 420
gtgtctagtg cttcaacaaa ggggccaagc gtgtttccac tggcaccctc aagcaaatca 480
accagcgggg gcacagcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc cgagcctgtc 540
accgtgtcat ggaacagcgg agccctgacc tccggagtcc acacatttcc tgctgtgctg 600
cagtcctctg ggctgtattc tctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggc 660
acacagactt acatctgcaa cgtgaatcat aagccatcca atactaaggt cgacaaacgg 720
gtggagccca aatcttgtgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca ggtccagctg 780
caggagagcg gacctggact ggtgaagcca tccgaaacac tgtctctgac ctgcaccgtg 840
agcggcggca gcatctctcc atattactgg acttggatta ggcagccccc tggcaagtgt 900
ctggagctga tcgggtacat tcacagttca ggctataccg actacaaccc ctccctgaag 960
tctagagtga ctatcagtgg cgatacctca aagaaacagt tctccctgaa actgagctcc 1020
gtcactgctg cagacaccgc cgtgtattac tgcgcacgcg ccgactggga tcgactgcgc 1080
gctctggata tctggggaca ggggactatg gtcaccgtgt ctagtggggg cggagggagt 1140
ggcggagggg gctcaggagg gggcggaagc gggggcggag ggtccgacat tcagctgacc 1200
cagagcccct caagcctgag tgcctcagtc ggcgatcgcg tgactatcac ctgtcgagct 1260
agccagtcca ttaggtccca tctgaactgg tatcagcaga agcccggaaa agcacctaag 1320
ctgctgatct acggcgccag caatctgcag tccggagtgc cctctaggtt ctctggcagt 1380
ggatcaggga cagactttac actgactatt tcctctctgc agcctgagga tttcgcaact 1440
tattactgcc agcagagcac cggcgcctgg aactggtttg gctgtggaac caaggtggaa 1500
atcaaaggcg gagggggctc tggagggggc ggaagtgaca agacccacac atgcccaccc 1560
tgtccagcac cagagctgct gggcggccca tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaaa 1620
gatacactgt atattactag agagcccgaa gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtcccac 1680
gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag 1740
accaaacccc gagaggaaca gtataactca acctacaggg tcgtgagcgt cctgacagtg 1800
ctgcatcagg attggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aagtgtctaa taaggctctg 1860
cctgcaccaa tcgagaaaac tattagcaag gccaaaggcc agcctagaga accacaggtg 1920
tataccctgc ccccttctcg ggaggaaatg acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg 1980
gtgaaaggct tctacccttc tgacatcgct gtggagtggg aaagtaatgg acagccagaa 2040
aacaattata agactacccc acccgtcctg gacagtgatg gctcattctt tctgtacagt 2100
aagctgaccg tggataaatc aaggtggcag cagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 2160
cacgaggccc tgcacaatca ttacacacag aagtctctga gtctgtcacc tggcaagcga 2220
ggaaggaaaa ggagaagcgg gtccggagca accaacttca gcctgctgaa acaggctggg 2280
gacgtggagg aaaatcccgg ccctatggtc ctgcagaccc aggtgtttat ctccctgctg 2340
ctgtggattt ctggggccta cggcgctatc cagatgacac agtctcctag ttcactgtct 2400
gcaagtgtcg gcgacagagt gactatcacc tgtcgggctt cccagggaat tcgcaacgat 2460
ctggggtggt atcagcagaa accaggaaag gctcccaaac tgctgatcta ctcagcaagc 2520
acactgcaga gtggggtgcc atcaagattc tccggatctg ggagtggcac tgacttcacc 2580
ctgactatta gctccctgca gccagaggac ttcgccacct attactgcct gcaggattat 2640
aattacccct ggacatttgg acaggggact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgccgct 2700
cccagcgtgt tcatttttcc tccatccgac gaacagctga agagcggaac cgcatccgtg 2760
gtgtgcctgc tgaacaattt ctatcctcgc gaagcaaagg tccagtggaa agtggataac 2820
gccctgcaga gcggcaattc ccaggagtct gtgactgaac aggacagtaa ggattcaacc 2880
tacagcctgt ctagtaccct gacactgtcc aaagctgact atgagaagca taaagtgtac 2940
gcatgtgagg tcacccacca ggggctgtcc agtccagtca ccaagtcttt caataggggc 3000
gaatgc 3006
<210> 47 <211> 1002
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислотная последовательность легкой цепи pGX9259: биспецифическая Pseudomonas
(Bis4-V2L2MD/Psl0096)-YTE только pGX0001; DMAb-BiSPA, функционально связанная с лидерной последовательностью IgE
<400> 47
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
260 265 270
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Pro Tyr
275 280 285
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Leu Ile
290 295 300
Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
325 330 335
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
340 345 350
Arg Ala Asp Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr
385 390 395 400
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
405 410 415
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln
420 425 430
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn
435 440 445
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
450 455 460
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Gly Ala Trp Asn Trp Phe Gly Cys Gly
485 490 495
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
515 520 525
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
530 535 540
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
545 550 555 560
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
565 570 575
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
580 585 590
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
595 600 605
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
610 615 620
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
625 630 635 640
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
645 650 655
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
660 665 670
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
675 680 685
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
690 695 700
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
705 710 715 720
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
725 730 735
Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
740 745 750
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
755 760 765
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
770 775 780
Gly Ala Tyr Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
785 790 795 800
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
805 810 815
Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
820 825 830
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
835 840 845
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
850 855 860
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr
865 870 875 880
Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
885 890 895
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
900 905 910
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
915 920 925
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
930 935 940
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
945 950 955 960
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
965 970 975
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
980 985 990
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 995 1000
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая одно или более моноклональных ДНК-антител (DMAb), причем молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: а) нуклеотидной последовательности, кодирующей одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела DMAb к PcrV (DMAb-cxPcrV) , или ее фрагмента или гомолога; Ь) нуклеотидной последовательности кодирующей одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела DMAb к Psl (DMAb-aPsl), или ее фрагмента или гомолога; и с) нуклеотидной последовательности кодирующей одно или более из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи биспецифического антитела DMAb к PcrV и к Psl (DMAb-BiSPA) , или ее фрагмента или гомолога.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую домен расщепления.
3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, дополнительно
содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую
сигнальный пептид.
4. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что п. а) выбран из группы, состоящей из:
a) нуклеотидной последовательности, кодирующей
аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около
95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности
с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID N0: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO:
16;
b) нуклеотидной последовательности, кодирующей
аминокислотную последовательность, выбранную из группы,
состоящей из SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 4, SEQ ID N0: 6, SEQ ID
NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID N0: 12; SEQ ID N0: 14 и SEQ ID N0:
16;
a)
c) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16;
d) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16;
e) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15;
f) фрагмента нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15;
g) нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15; и
h) фрагмента нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что п. Ь) выбран из группы, состоящей из:
а) нуклеотидной последовательности, кодирующей
аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около
95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотой с SEQ ID N0: 20;
b) нуклеотидной последовательности, кодирующей
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 20;
c) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0: 20;
d) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID N0: 20;
e) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с SEQ ID N0: 19;
f) фрагмента нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с SEQ ID N0: 19;
g) нуклеотидной последовательности SEQ ID N0: 19; и
h) фрагмента нуклеотидной последовательности SEQ ID N0: 19.
б. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем,
что п. с) выбран из группы, состоящей из:
a) нуклеотидной последовательности, кодирующей
аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около
95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности
с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22;
b) нуклеотидной последовательности, кодирующей
аминокислотную последовательность, выбранную из группы,
состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22;
c) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22;
d) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 18 и SEQ ID N0: 22;
c)
e) нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19;
f) фрагмента нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19;
g) нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19; и
h) фрагмента нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 17 и SEQ ID N0: 19.
7. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую элемент участка внутренней посадки рибосомы (IRES).
8. Молекула нуклеиновой кислоты по п. б, отличающаяся тем, что элемент IRES выбран из группы, состоящей из IRES вируса и IRES эукариотической клетки.
9. Молекула нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 18, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 24 и SEQ ID N0: 25.
10. Молекула нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 19, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу рибонуклеиновой кислоты.
11. Молекула нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 110, содержащая экспрессионный вектор.
12. Композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 1-11.
13. Композиция по п. 12, дополнительно содержащая
фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
14. Способ лечения заболевания у субъекта, который включает
введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.
1-11 или композиции по любому из пп. 12-13.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что заболевание представляет собой инфекцию, вызванную бактерией Pseudomonas aeruginosa.
16. Способ по п. 14, дополнительно включающий введение субъекту антибиотика.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что после введения молекулы нуклеиновой кислоты или композиции антибиотик вводят менее 10 дней.
18. Способ предотвращения или устранения образования биопленки у субъекта, который включает введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11 или композиции по любому из пп. 12-13.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что биопленка представляет собой биопленку, образованную Pseudomonas aeruginosa.
20. Способ по п. 18, дополнительно включающий введение субъекту антибиотика.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что после введения молекулы нуклеиновой кислоты или композиции антибиотик вводят менее 10 дней.
22. Композиция для создания синтетического биспецифического антитела у субъекта, содержащая одну или большее количество молекул нуклеиновых кислот, кодирующих одно или большее количество антител или их фрагментов, причем биспецифическое антитело связывается с первой и второй мишенями.
23. Композиция по п. 22, отличающаяся тем, что первая мишень представляет собой опухолеассоциированный антиген.
Композиция по п. 22, отличающаяся тем, что вторая мишень представляет собой маркер клеточной поверхности на иммунной клетке.
По доверенности
Репрессия DMAb в супернатанте клеток 2ЭЗТ
3,02.5-2.D-1
Г го К ¦о >
1,00.5-0.D-
X о
а -о
3.5-1 3.6 2.5 241.5 1.D-0.5 0.0 -
Эспрессия DMAb в лизагге клеток 293Т
X о
¦о >
Фигуры
1В(tm)1С
Фигуры 2A-2D
20 40 60 80 100 120 Дней после инъекции
6040200
100 мкг
300 мкг
jg*-w -- DMAb-aPcrV
Щ .;> ... -*- poxooci
24 25 26 27 2а 29 210 211 212
Разведение
Дней после инъекции ' '* Разведение
Фигуры 3A-3F
А. ФК DMAb-aPcrV {мыши BALB/c) В. ФК DMAb-BiSPA (мыши BALB/c)
О 3 5 7 10 12 14 21 О 3 5 7 10 12 14 21
Дней после инъекции Дней после инъекции сл
С. мышиное DMAb IgG2a (BALB/c)
к 6
О 3 7 10 17 24 31 46 60 76103
День после инъекции
А В
I16 I 8
Количественное определение IgG в сыворотке
-О DMAb-DVSF3
-f г
DMAb-aPcrV в DMAb-BiSPA • MEDI33Q2 fiflGj
<в.о
-I-
-О- DMAb-DVSF3 "*~ DMAb-aPcrV DMAb-BiSPA MEDI3902 (IqG)
Общий IgG человека Антицитотоксическая
активность
0 14 48 72 ii 120 144 Часов после инфицирования
100 <
Fi-
ll-
-O DMAb-DVSF3 -*OMAb-BiSPAM00 мкт) "¦DMAb-BiSPA (200 мкт) ~* DMAb-BiSPA (300 мкт)
Количественное определение IgG в сыворотке
32 и
16В- О
'j DMAb-DVSF3
DMAb-BiSPA (100 мкг) DMAb-BiSPA (200 мкг) DMAb-BiSPA (300 "кг)
-s m )
0 24 48 72 96
Часов после инфицирования
120 144
0.50.25.
Экспериментальная группа
II в'
* i
Сел
ПОЧКИ -J Df,'Ab-3VSF3
9 CVAb-aF*-.-
• Db'Ab-5 SF.i
* (/EDI39C2 g-3 '2 чг •
I, ""
2 № Й
ft* 0a
J Df.'AbOVSFS i CI.A.b-uF:!'.
• Cr.'Ab-5SF.a
* IVEDI3aC2 gG \2 ¦
Предел обнаружение
G^poBHM цитокинов и хемокинов в гомогенатах легких вон, "дают
ж 20000
40000-
§ "о"
7 WW ¦о
а" тт <
~ 4000
10D0O
змо
Н Df.'Ab-DVSF3 О DH'Ab-aPcrV П Dt.'Ab-5SP,i п ГЕ0159С2 дС-|2 м- кг-
20000-
I U
Концентрация IgG человека 44ч
•1 Г"Т
• DMAb-DVSF3
• OMAb-aPtrV DMAWBiSPP
e MEDI3902 igG
Предел оонаружения 0,2 мкг мл
Неинфициреван. 24 ч после инфицирования
Контроль
DMAb-DVSF3
4" . -J-
il Л ,. - . < * * - j
DMAb-BiSPA .-V,;:
MEDI3902igG
72 96 120 Часов после инфицирования
Человеческий IgG
-О DMAb-DVSF3 (100 мет;
¦UM О-С - VIEVI -2 ? МГ--Т. -Ф- DMAb-BiSPA (100 мкг;
DMAb-BiSРА (100 мкг; * MEM
(2.3 мг/кг)
41 210.50.250.1250625-
О DMAb-DVSF3 (100 мкг;
:tl-1- 0-С - VIEVI :2 ? УГ--Г.
• DMAb-BiSPA (100 мкг:
в DMAb-BiSPA (100 мкг; +¦ MEM {2,3 мг/кг)
Предел обнаружения = 0,1
Оптимизация DMAb-aPcrV
501
ДНК без ЭП
Неоптими з. ДНК +
Оптимизированная ДНК + ЭП
Оптимизированная ДНК +
композиция + ЭП
40-
1 30-
20-
* i
CD CD
X Ох
Фигура 9
(19)
(19)
(19)
Фигуры 4А-4С
Фигуры 4А-4С
Фигуры 4А-4С
Фигуры 4А-4С
Фигуры 4А-4С
Фигуры 4А-4С
Фигуры 5A-5D
Фигуры 5A-5D
Фигуры 5A-5D
Фигуры 5A-5D
Фигуры 5A-5D
Фигуры 5A-5D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 6A-6D
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 7A-7H
Фигуры 8А-8В
Фигуры 8А-8В
Фигуры 8А-8В
Фигуры 8А-8В