[RU]

В настоящем описании раскрыта композиция, включающая в себя рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует синтетическое антитело к гемагглютинину вируса гриппа. В настоящем описании также раскрыт способ предотвращения и/или лечения у субъекта гриппа с использованием указанной композиции и способ создания.

(57) Реферат / Формула:

В настоящем описании раскрыта композиция, включающая в себя рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует синтетическое антитело к гемагглютинину вируса гриппа. В настоящем описании также раскрыт способ предотвращения и/или лечения у субъекта гриппа с использованием указанной композиции и способ создания.

---

Евразийское (21) 201892523 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.05
(51) Int. Cl.
C07K16/08 (2006.01) C07K16/00 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01)
(54) ДНК-МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА ВИРУС ГРИППА
(31) 62/332,381; 62/376,162
(32) 2016.05.05; 2016.08.17
(33) US
(86) PCT/US2017/031213
(87) WO 2017/192946 2017.11.09
(71) Заявитель:
ДЗЕ ТРАСТИЗ ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ; ДЗЕ УИСТАР ИНСТИТЬЮТ ОФ ЭНЭТОМИ ЭНД БАЙОЛОДЖИ; ИНОВИО ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Уэйнер Дэвид, Эллиотт Сара, Пател Ами, Янь Цзянь (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) В настоящем описании раскрыта композиция, включающая в себя рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует синтетическое антитело к гемагглютинину вируса гриппа. В настоящем описании также раскрыт способ предотвращения и/или лечения у субъекта гриппа с использованием указанной композиции и способ создания.
КОНСТРУКЦИЯ Ш!АЬ 5J8
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-553295ЕА/018 ДНК-МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА ВИРУС ГРИППА Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 62/332,381, поданной 5 мая 2016 г. и предварительной заявке США № 62/376,162, поданной 17 августа 2016 г., полное содержание которых включено в настоящий документ путем ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, для создания in vivo одного или более синтетических антител, включая антитела к гемагглютинину вируса гриппа и их функциональные фрагменты, а также к способам предотвращения и/или лечения заболевания у субъекта посредством введения указанной композиции.
Уровень техники
[0003] Несмотря на многообещающие инновации,
противогриппозные вакцины и противовирусные препараты не обеспечивают полной защиты от сезонной инфекции и практически не обеспечивают немедленной защиты от новых и потенциально пандемичных штаммов вируса. Были разработаны моноклональные антитела с широким спектром перекрестной защиты с целью обеспечения защиты от сильно дивергентных вирусов гриппа.
[0004] Таким образом, в данной области существует потребность в улучшенных композициях и способах лечения гриппа.
Сущность изобретения
[0005] Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей одно или более синтетических антител, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: а) нуклеотидной последовательности, кодирующей синтетическое антитело к гемагглютинину (НА) вируса гриппа; и Ь) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент синтетического антитела к НА.
[0006] В одном варианте реализации синтетическое антитело к НА выбирают из группы, состоящей из антитела, которое связывается с шаровидной головкой НА вируса гриппа и антитела, которое связывается с поддоменом слияния НА вируса гриппа.
[0007] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из первой нуклеотидной последовательности, кодирующей первое антитело к НА; и второй нуклеотидной последовательности, кодирующей второе антитело к НА.
[0008] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен расщепления.
[0009] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела к НА.
[0010] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи человеческого IgGlK.
[ООН] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела к НА; константную область тяжелой цепи человеческого IgGlK; домен расщепления; вариабельную область легкой цепи антитела к НА; и константную область легкой цепи IgGlK.
[0012] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность.
[0013] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит экспрессионный вектор.
[0014] В одном варианте реализации в изобретении предложена композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты. В одном варианте реализации композиция дополнительно содержит
фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
[0015] В одном варианте реализации в настоящем изобретении предложен способ предотвращения или лечения инфекции гриппа у субъекта, включающий введение субъекту нуклеиновой кислоты или композиции, описанной в настоящем документе. В одном варианте реализации инфекция гриппа представляет собой инфекцию гриппа типа А. В одном варианте реализации инфекция гриппа представляет собой инфекцию гриппа типа В.
[0016] В одном варианте реализации в настоящем изобретении предложены новые последовательности для продуцирования моноклональных антител в клетках млекопитающих или в вирусных векторах.
Краткое описание графических материалов
[0017] На фигуре 1 показаны вариабельные области гемагглютинина вируса гриппа, с которыми связывается антитело 5J8 к вирусу гриппа.
[0018] На фигуре 2 показаны вариабельные области гемагглютинина вируса гриппа, с которыми связывается антитело FI6 к вирусу гриппа.
[0019] На фигуре 3, которая включает фигуры ЗА и ЗВ, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что после введения конструкции плазмидной ДНК в клетках 2 93Т экспрессируются DMAb. На фигуре ЗА показаны результаты ELISA, причем в супернатанте и лизате определяли экспрессию человеческого IgGlK с помощью количественного анализа ELISA (N=3 повтора трансфекции, средний показатель ± СОС) . На фигуре ЗВ показан иллюстративный вестерн-блот, демонстрирующий расщепление пептида с тяжелой и легкой цепью в супернатанте и лизате.
[0020] На фигуре 4, которая включает фигуры 4А и 4В, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что после внутримышечной электропорации ДНК, в мышиной сыворотке экспрессируются DMAb. Мышам вводили посредством инъекции плазмидную ДНК 5J8 или FI6 с последующим проведением внутримышечной электропорации. Уровни антител IgGlK человека в сыворотке мыши определяли с помощью количественного анализа
ELISA. На фигуре 4А показаны результаты, демонстрирующие, что антитела DMAb к вирусу гриппа экспрессировались в концентрации в диапазоне от 53 нг/мл до 1,1 мкг/мл с дня 0 исходного уровня до дня перед кровопусканием (через семь дней после введения мышам линии BALB/c). Стратегии оптимизации доставки в целевую область и состав улучшили экспрессию DMAb в > 3 раза. На фигуре 4В показаны результаты увеличения дозы ДНК у голых мышей. После доставки 300 мкг плазмидной ДНК иммунокомпрометированным голым мышам, пик экспрессии FI6 достиг 2,6 мкг/мл. Экспрессия DMAb длилась более десяти недель. (N=5, средний показатель ± СОС.)
[0021] На фигуре 5 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb из мышиной сыворотки сохраняет способность связываться с антигеном гемагглютинина. Голым мышам вводили FI6 (300 мкг) плазмидной ДНК с помощью внутримышечной электропорации. Через четыре недели с помощью ELISA было определено связывание DMAb в сыворотке с рекомбинантным антигеном гемагглютинина HI вируса гриппа А. (N=5, средний показатель ± СОС.)
[0022] На фигуре б показаны филогенетические деревья штаммов вируса гриппа А и вируса гриппа В, демонстрирующие разнообразие клинически значимых вирусов гриппа.
[0023] На фигуре 7 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что выделенные человеческие моноклональные антитела (mAb), нацеленные на вирусы гриппа А и В, имеют широкую перекрестную реактивность. Специфическое в отношении вируса гриппа А моноклональное антитело FluA широко нейтрализует сезонные и пандемические вирусы в обеих группах: 1 и 2. Моноклональное антитело FluB эффективно нейтрализует вирусы из обеих линий вируса гриппа В.
[0024] На фигуре 8 показана схематично конструкция плазмиды DMAb и продукция функциональных mAb.
[0025] На фигуре 9 показана схема дизайна исследования заражения летальным вирусом гриппа.
[0026] На фигуре 10 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие экспрессию и функциональность DMAb FluA и FluB в
сыворотке. Сыворотку брали через 5 дней после электропорации (ЭП) DMAb FluA (верхний ряд) и DMAb FluB (нижний ряд) и оценивали на экспрессию человеческого IgG, активность связывания с различными белками НА и активность нейтрализации.
[0027] На фигуре 11 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluA защищает мышей от летальной инфекции вируса гриппа А на тех же уровнях, которые обеспечивает очищенный IgG FluA в дозе 0,3 мг/кг. Концентрация DMAb в сыворотке в сравнении с концентрацией очищенного IgG во время инфекции. Снижение массы тела и показатель выживаемости после заражения летальной инфекцией вируса гриппа А, * значительные преимущества в отношении выживаемости для DMAb FluA по сравнению с контрольным DMAb, р < 0,0001 с использованием логрангового критерия.
[0028] На фигуре 12 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluB защищает мышей от летальной инфекции вируса гриппа В на тех же уровнях, которые обеспечивает очищенный IgG FluB в дозе 1 мг/кг. Концентрация DMAb в сыворотке в сравнении с концентрацией очищенного IgG во время инфекции. Снижение массы тела и показатель выживаемости после заражения летальной инфекцией вируса гриппа В, * значительные преимущества в отношении выживаемости для DMAb FluB по сравнению с контрольным DMAb, р < 0,0001 с использованием логрангового критерия.
[0029] На фигуре 13 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что введение DMAb FluA и FluB в комбинации защищает мышей от летальной инфекции вируса гриппа А или В. Концентрации комбинаций DMAb Flu в сыворотке в сравнении с концентрацией комбинаций очищенных IgG во время инфекции. Специфическое количественное определение вируса гриппа А или В показывает, что комбинированное лечение DMAb приводит к аналогичным уровням экспрессии, что и при введении по отдельности. Показатель выживаемости после заражения летальной инфекцией вируса гриппа А или В, * значительные преимущества в отношении выживаемости для DMAb FluA+FluB по сравнению с контрольным DMAb, р < 0,0001 с использованием логрангового
критерия.
[0030] На фигуре 14, которая включает фигуры 14A-14F, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие in vitro и in vivo экспрессию конструкций кодируемого ДНК моноклонального антитела (DMAb). На фигуре 14А показана количественная оценка с помощью ELISA экспрессии человеческого IgG в супернатантах (слева) и лизатах (справа) клеток. Клетки 293Т трансфицировали плазмидными конструкциями DMAb FluA или FluB или пустой плазмидой (pVaxl) . (n=3, ± СОС) . На фигуре 14В показан вестерн-блот пептида с тяжелой и легкой цепью человеческого IgG в супернатантах (S) и лизатах (L) (слева) трансфицированных сниженным количеством DMAb клетках 2 93Т и очищенных белковых моноклональных антителах FluA и FluB (IgG, справа). На фигуре 14С показано DMAb IgG человека в сыворотке голых мышей линии CAnN.Cq-Foxnlnu/Crl после внутримышечной электропорации (В/М-ЭП)
(день 0) 100-300 мкг плазмидной ДНК FluA. (n=5, ± СОС). На фигуре 14D показано DMAb IgG человека в сыворотке голых мышей линии CAnN.Cq-Foxnlnu/Crl после внутримышечной электропорации (В/М-ЭП)
(день 0) 100-300 мкг плазмидной ДНК FluB. (n=5, ± СОС). На фигуре 14Е показаны уровни DMAb IgG человека в сыворотке мышей линии BALB/c через 5 дней после введения 100-300 мкг плазмидной ДНК DMAb FluA. Пунктирная линия указывает предел обнаружения (ПО) .
(n=5, ± СОС) . На фигуре 14F показаны уровни DMAb IgG человека в сыворотке мышей линии BALB/c через 5 дней после введения 100-300 мкг плазмидной ДНК DMAb FluB. Пунктирная линия указывает предел обнаружения (ПО). (n=5, ± СОС).
[0031] На фигуре 15, которая включает фигуры 15А-15С, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluA и DMAb FluB в сыворотке являются функциональными. Функциональные анализы выполняли с сывороткой, полученной от мышей линии BALB/c через 5 дней после введения 100-300 мкг плазмидной ДНК DMAb FluA или FluB. На фигуре 15А по результатам анализа ELISA показаны значения (обратное разведение) ЕС50 связывания для отдельных образцов мышиной сыворотки с белками НА вируса гриппа А из группы 1 (HI А/Калифорния/07/2009 H1N1, Н2
А/Миссури/2 00 6 H2N3, Н5 А/Вьетнам/1203/2004 H5N1, Нб А/дикий
птичий/Гонконг/1лГ312/97 H6N1, Н9 А/куриный/Гонконг/С9/1997 H9N2)
и группы 2 (НЗ А/Перт/16/2009 H3N2, Н7 А/Нидерланды/219/2003
H7N7) . На фигуре 15В по результатам анализа ELISA показаны
значения (обратное разведение) ЕС50 связывания для отдельных
образцов мышиной сыворотки с белками НА вируса гриппа В из линий
Ямагата (Yam В/Флорида/4/200б) и Виктория (Vic
В/Брисбан/60/2008). На фигуре 15С показаны значения (обратное разведение) IC50 нейтрализации для отдельных образцов мышиной сыворотки в отношении вирусов Yam В/Флорида/4/200б и Vic В/Малайзия/2506/2004. (n=5, ± СО).
[0032] На фигуре 16, которая включает фигуры 16A-16F, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluA защищает мышей при заражении различными типами летальной инфекции вируса гриппа А. Мышам линии BALB/c за 4-5 дней до интраназального инфицирования вирусом А/Калифорния/7/2009 H1N1
(А-С) или реассортантным вирусом гА/Гонконг/8/68хРК8 H3N1 (D-F) вводили плазмидную ДНК DMAb FluA (закрашенные символы) . За один день до инфицирования отдельным мышам внутрибрюшинно (в/б) вводили 0,03-1 мг/кг моноклонального антитела к белку FluA
(незакрашенные символы). Мышам вводили 30 0 мкг нерелевантного DMAb (DVSF-3) или 1 мг/кг неспецифического белкового моноклонального антитела (R347), которые служили в качестве контролей. На фигуре 16А показан человеческий IgG в сыворотке мыши во время инфекции гриппа. На фигуре 16В показаны кривые выживаемости Каплана - Мейера для мышей линии BALB/c, зараженных вирусом гриппа А. (п=10). На фигуре 16С показана масса тела мышей линии BALB/c после заражения вирусом гриппа А. Пунктирная линия указывает на 2 5%-ное максимальное снижение массы тела.
(n=10, ± СОС). На фигуре 16D показан человеческий IgG в сыворотке мыши во время инфекции гриппа. На фигуре 16Е показаны кривые выживаемости Каплана - Мейера для мышей линии BALB/c, зараженных вирусом гриппа А. (п=10). На фигуре 16F показана масса тела мышей линии BALB/c после заражения вирусом гриппа А. Пунктирная линия указывает на 2 5%-ное максимальное снижение массы тела.
(n=10, ± СОС).
[0033] На фигуре 17, которая включает фигуры 17A-17F, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluB защищает мышей при заражении различными типами летальной инфекции вируса гриппа В. Мышам линии BALB/c за 5 дней до инфицирования вирусом гриппа линии В/Малайзия/250б/2004 Виктория (А-С) или В/Флорида/4/200б Ямагата (D-F) вводили плазмидную ДНК DMAb FluB. За один день до инфицирования отдельным группам мышей вводили в/б 0,03-1 мг/кг белкового моноклонального антитела FluB. На фигуре 17А показан человеческий IgG в сыворотке мыши во время инфекции. Пунктирная линия указывает ПО. (n=10, ± СО) . На фигуре 17В показаны кривые выживаемости Каплана - Мейера для мышей линии BALB/c, зараженных вирусом гриппа В. (п=10). На фигуре 17С показана масса тела мышей линии BALB/C после заражения вирусом гриппа В. Пунктирная линия указывает на 2 5%-ное максимальное снижение массы тела. (n=10, ± СОС) . На фигуре 17D показан человеческий IgG в сыворотке мыши во время инфекции. Пунктирная линия указывает ПО. (n=10, ± СО) . На фигуре 17Е показаны кривые выживаемости Каплана - Мейера для мышей линии BALB/c, зараженных вирусом гриппа В. (п=10). На фигуре 17F показана масса тела мышей линии BALB/c после заражения вирусом гриппа В. Пунктирная линия указывает на 2 5%-ное максимальное снижение массы тела. (n=10, ± СОС).
[0034] На фигуре 18, которая включает фигуры 18A-18F,
показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что
совместное введение DMAb FluA и FluB защищает мышей при
заражении летальной инфекцией вируса гриппа А/В и повторном
инфицировании гомологичным вирусом гриппа. Мышам линии BALB/c
вводили оба DMAb: FluA и FluB. Отдельным мышам вводили оба
белковых моноклональных антитела FluA и FluB. Мышей изначально
заражали вирусом гриппа А/Калифорния/7/2009 или
В/Флорида/4/200б. На фигуре 18А показаны уровни общего человеческого IgG в сыворотке мышей во время инфекции. (n=8, ± СО) . На фигуре 18В показана количественная оценка человеческого IgG, специфического в отношении вируса гриппа А и специфического
в отношении вируса гриппа В, проведенная с помощью анализа ELISA связывания с НА в мышиной сыворотке во время инфекции. (n=8, ± СО). На фигуре 18С показаны кривые выживаемости Каплана - Мейера после первичного инфицирования вирусом А/Калифорния/07/2009. На фигуре 18D показаны кривые выживаемости Каплана - Мейера после первичного инфицирования вирусом В/Флорида/4/200б. На фигуре 18Е показаны эксперименты, в которых через двадцать восемь дней после первичного инфицирования выжившим мышам проводили повторное инфицирование гомологичным вирусом гриппа. Кривые выживаемости Каплана - Мейера после повторного инфицирования в сравнении с мышами, которым не проводили ни введение DMAb/IgG, ни первичное инфицирование (интактные). На фигуре 18F показаны эксперименты, в которых через двадцать восемь дней после первичного инфицирования выжившим мышам проводили повторное инфицирование гомологичным вирусом гриппа. Кривые выживаемости Каплана - Мейера после повторного инфицирования в сравнении с мышами, которым не проводили ни введение DMAb/IgG, ни первичное инфицирование (интактные).
[0035] На фигуре показаны результаты экспериментов, демонстрирующие усиление экспрессии DMAb in vivo. Экспрессия DMAb IgG человека в сыворотке у мышей через пять дней после последовательно пересмотренных введений 2 00 мкг плазмидной ДНК FluB. Плазмидную ДНК вводили мышам линии BALB/c посредством только внутримышечной электропорации (В/М-ЭП) или посредством В/М-ЭП в составе с гиалуронидазой (Гиал.+В/М-ЭП). Кроме того, последовательности с плазмидной трансгенной вставкой были оптимизированы кодонами ДНК и оптимизированы РНК для улучшения экспрессии (Опт.+Гиал.+В/М-ЭП). Все другие исследования выполняли как Опт.+Гиал.+В/М-ЭП. (п=5 животных на группу, средний показатель ± СОС).
[0036] На фигуре 20 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluA в мышиной сыворотке связывается с гемагглютинином НЮ вируса гриппа А. Выполняли серийное разведение сыворотки от мышей линии BALB/c, которую брали через 5 дней после введения 100-300 мкг плазмидной ДНК DMAb FluA, и
добавляли в 9б-луночные планшеты, покрытые рекомбинантным антигеном НЮ из группы 2 вируса гриппа А (А/Цзянси-Дунху/346/2013 H10N8) (IBT Bioservices). Связывание с DMAb определяли с помощью конъюгированного с HRP вторичного антитела осла к человеческому IgG (1: 5000) и проявляли с использованием субстрата SigmaFast OPD (о-фенилендиамин дигидрохлорид)(Sigma-Aldrich). Абсорбцию измеряли при 450 нм. Сыворотка от необработанных (интактных) мышей служила в качестве контроля. (п=5 животных на группу, средний показатель ± СО). [0037]
[0038] На фигуре 21, которая включает фигуру 21А и фигуру 21В, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что DMAb FluA и FluB, экспрессируемые in vivo, производят функциональные IgG на аналогичных уровнях, что и очищенные IgG. На фигуре 21А показана реакционная способность в отношении очищенного белка HI НА из штамма А/Калифорния/7/2009 HI в образцах сыворотки, полученных от животных, которым вводили плазмидную ДНК FluA, очищенное белковое антитело IgG к вирусу гриппа или нерелевантное контрольное DMAb (DVSF-3). Сыворотку собирали в день инфицирования вирусом гриппа и тестировали на реакционную способность в отношении НА путем ELISA связывания. На фигуре 2 0В показана реакционная способность в отношении белка НА линии Виктория из штамма В/БрисбанбО/2008 Виктория в образцах сыворотки, полученных от животных, которым вводили плазмидную ДНК FluB, очищенное белковое антитело IgG к вирусу гриппа или нерелевантное контрольное DMAb (DVSF-3). Сыворотку собирали в день инфицирования вирусом гриппа и тестировали на реакционную способность в отношении НА путем ELISA связывания.
[0039] На фигуре 22, которая включает фигуру 22А и фигуру 22В, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что FluB значительно снижает вирусную нагрузку гриппа В в легких. Мышам линии BALB/c за 5 дней до инфицирования вводили 2 00 мкг плазмидной ДНК DMAb FluB или нерелевантного контрольного DMAb (DVSF-3). За один день до инфицирования отдельным группам мышей вводили в/б 0,03-1 мг/кг очищенного белкового IgG FluB или
нерелевантного контрольного IgG R347. На фигуре 22А показаны легочные вирусные титры на день 5 после инфицирования вирусом В/Малайзия/2508/2004. На фигуре 22В показаны легочные вирусные титры на день 5 после инфицирования вирусом В/Флорида/4/200б. (n=4, ± СОС). Пунктирная линия указывает ПО. * Значительное снижение вирусных титров в сравнении с группой введения контрольного DMAb DVSF-3 с использованием t-критерия Стьюдента.
[0040] На фигуре 23, которая включает фигуры 23A-23D, показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что совместное введение DMAb FluA и FluB защищает мышей при заражении летальной инфекцией вируса гриппа и повторном инфицировании гомологичным вирусом гриппа. Мышам линии BALB/c вводили оба DMAb: FluA и FluB. За один день до инфицирования отдельным группам мышей вводили 0,1-1 мг/кг комбинации очищенного белкового IgG FluA и FluB. На фигуре 23А показано снижение массы тела у животных, инфицированных вирусом
А/Калифорния/7/2009 (n=10, +СОС). На фигуре 23В показано снижение
массы тела у животных, инфицированных вирусом В/Флорида/4/200б
(n=10, +СОС). На фигуре 23С показано снижение массы тела после
повторного заражения гомологичным вирусом гриппа
А/Калифорния/7/2009 у выживших мышей через 28 дней после первичного инфицирования. На фигуре 23D показано снижение массы тела после повторного заражения гомологичным вирусом гриппа В/Флорида/4/200б у выживших мышей через 28 дней после первичного инфицирования.
[0041] На фигуре 24, которая включает фигуры 2 4A-2 4D,
показаны результаты экспериментов, демонстрирующие реакционную
способность сыворотки у мышей, которым вводили DMAb, через 21
день после инфицирования. Функциональные анализы, выполненные с
сывороткой выживших мышей линии BALB/c, собранной через 21 день
после инфицирования вирусом А/Калифорния/7/2009 или
В/Флорида/4/200б. На фигуре 24А показана активность ингибирования гемагглютинации (обратное разведение) в зависимости от инфицирования вирусом А/Калифорния/07/2009. На фигуре 24В показаны значения ЕС50 (обратное разведение) анализа
ELISA связывания с белком НА вируса гриппа А/Калифорния/07/2009. На фигуре 2 4С показана активность ингибирования гемагглютинации (обратное разведение) в зависимости от инфицирования вирусом В/Флорида/4/200б. На фигуре 24D показаны значения ЕС50 (обратное разведение) анализа ELISA связывания с белком НА вируса гриппа В.
[0042]
Подробное описание изобретения
[0043] Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, ее фрагмент, ее вариант или их комбинацию. Композицию можно вводить нуждающемуся в этом субъекту для облегчения in vivo экспрессии и образования синтетического антитела, направленного против антигена вируса гриппа.
[0044] В частности, полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи, экспрессируемые с рекомбинантных последовательностей нуклеиновых кислот, могут быть собраны в синтетическое антитело. Полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, способного связывать антиген, являющийся более иммуногенным, по сравнению с антителом, не прошедшим описанную в данном документе сборку, и способного вызывать или индуцировать иммунный ответ против антигена.
[0045] Кроме того, эти синтетические антитела быстрее генерируются в организме субъекта, чем антитела, которые вырабатываются в ответ на индуцированный иммунизацией антигеном иммунный ответ. Синтетические антитела способны эффективно связывать и нейтрализовать ряд антигенов. Синтетические антитела являются высокоспецифичными в отношении мишени. Синтетические антитела также способны эффективно защищать от заболевания и/или стимулировать выживаемость при заболевании.
1. Определения
[004 6] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в данной
области техники. В случае противоречия, приоритет имеет настоящий документ, включая определения. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы на практике или при проверке настоящего изобретения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, в полном объеме включены посредством ссылки. Описанные в данном документе материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не подразумевают ограничения.
[0047] В контексте данного документа подразумевается, что термины "содержит (-ат)", "включает (-ют)", "имеющий", "имеет", "может" и их варианты являются открытыми переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможности наличия дополнительных действий или структур. Формы единственного числа включают отсылки к множественному числу, если иное четко не следует из контекста. В настоящем изобретении также предусмотрены другие варианты реализации, "содержащие", "состоящие из" и "состоящие преимущественно из" представленных в данном документе вариантов реализации или элементов, приведенных явным образом или нет.
[0048] "Антитело" может означать антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или их фрагменты или производные, включая Fab, F(ab')2, Fd и одноцепочечные антитела и их фрагменты. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из образца сыворотки млекопитающего, поликлональное антитело, прошедшее аффинную очистку антитело или их смеси, которые проявляют достаточную специфичность связывания с необходимым эпитопом или полученной из него последовательностью.
[0049] В контексте данного документа "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела, содержащей антигенсвязывающий участок или вариабельную область. Эта часть не включает константные домены тяжелой цепи (т. е. СН2, СНЗ или СН4 в зависимости от изотипа антитела) Fc-области интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются этим, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты
Fab'-SH, фрагменты F(ab')2, фрагменты Fd, фрагменты Fv, диатела, одноцепочечные молекулы Fv (scFv), одноцепочечные полипептиды, содержащие только один вариабельный домен легкой цепи, одноцепочечные полипептиды, содержащие три CDR вариабельного домена легкой цепи, одноцепочечные полипептиды, содержащие только одну вариабельную область тяжелой цепи, одноцепочечные полипептиды, содержащие три CDR вариабельной области тяжелой цепи.
[0050] "Антиген" относится к белкам, которые способны генерировать иммунный ответ в организме-хозяине. Антиген может распознаваться и связываться антителом. Антиген может иметь происхождение, связанное с организмом или внешней средой. В некоторых случаях антиген является антигеном вируса гриппа.
[0051] В контексте данного документа "кодирующая последовательность" или "кодирующая нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте (молекуле РНК или ДНК), которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую приведенное в данном документе антитело. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способными управлять экспрессией в клетках индивида или млекопитающего, которому вводят нуклеиновую кислоту. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать последовательности, которые кодируют сигнальные пептиды.
[0052] В контексте данного документа термин
"комплементарная" может означать нуклеиновую кислоту, характеризующуюся Уотсон-Криковским (например, A-T/U и C-G) или Хугстиновским спариванием оснований между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновых кислот.
[0053] В контексте данного документа термин "постоянный ток" используется для определения тока, проходящего или воздействующего на ткань или клетки, определяющие указанную ткань, в течение длительности электрического импульса, подаваемого на ту же самую ткань. Электрический импульс подается из описанных в данном документе устройств для электропорации.
Ток остается постоянным в указанной ткани в течение действия электрического импульса, так как предложенное в данном документе устройство для электропорации имеет цепь обратной связи, предпочтительно характеризующуюся мгновенной обратной связью. Цепь обратной связи может измерять сопротивление ткани (или клеток) во время длительности импульса и давать команду устройству для электропорации для изменения вырабатываемой электрической энергии (например, повышения напряжения) так, чтобы ток в одной ткани оставался постоянным в течение электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах реализации цепь обратной связи содержит контроллер.
[0054] В контексте данного документа термины "обратная
связь по току" или "обратная связь" могут использоваться
взаимозаменяемо и могут означать активный ответ предложенных
устройств для электропорации, который включает измерение тока в
ткани между электродами и соответствующее изменение
вырабатываемой устройством ЭП энергии, чтобы поддерживать ток на
постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается
пользователем до инициации последовательности импульсов или
электрической обработки. Обратная связь может осуществляться
электропорационным компонентом, например, контроллером,
устройства для электропорации, так как электрический контур в нем может непрерывно отслеживать ток в ткани между электродами и сравнивать этот отслеживаемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно проводить корректировку вырабатываемой энергии для поддержания отслеживаемого тока на заданном уровне. Контур обратной связи может характеризоваться мгновенным действием, так как он является аналоговым замкнутым контуром обратной связи.
[0055] В контексте данного документа термин
"децентрализованный ток" может означать профиль электрического тока, подаваемого из различных матриц с игольчатыми электродами описанных в данном документе устройств для электропорации, при этом профили минимизируют или, предпочтительно, устраняют появление связанного с электропорацией теплового стресса в любой
области электропорируемой ткани.
[0056] В контексте данного документа взаимозаменяемые
термины "электропорация", "электропермеабилизация" или
"электрокинетическое усиление" ("ЭП") могут относиться к применению трансмембранных электрических импульсов для индукции микроскопических путей (пор) в биомембране; их наличие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[0057] В контексте данного документа термин "эндогенное антитело" может относиться к антителу, генерируемому у субъекта, которому вводят эффективную дозу антигена для индукции гуморального иммунного ответа.
[0058] В контексте данного документа термин "механизм обратной связи" может относиться к процессу, осуществляемому программным обеспечением или аппаратным обеспечение (или техническим обеспечением), который заключается в получении и сравнении импеданса необходимой ткани (до, во время и/или после подачи импульса энергии) с заданным значением, предпочтительно током, и коррекции подаваемого импульса энергии для достижения заданного значения. Механизм обратной связи может осуществляться аналоговым замкнутым контуром.
[0059] "Фрагмент" может обозначать полипептидный фрагмент антитела, который является функциональным, т. е. может связываться с необходимой мишенью и имеет такое же предполагаемое действие, что и полноразмерное антитело. Фрагмент антитела может быть на 10 0% идентичным полноразмерному антителу, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты в N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в позиции 1 или без. Фрагменты могут содержать 2 0%
или более,
25%
или более, 3
0% или более
, 3 5 % или
более
, 40%
или
более,
45%
или
более,
50%
или
более,
55%
или
более,
60%
или
более,
65%
или
более,
70%
или
более,
75%
или
более,
80%
или
более,
85%
или
более,
90%
или
более,
91%
или
более,
92%
или
более,
93%
или
более,
94%
или
более,
95%
или
более,
96%
или
более,
97%
или
более,
98%
или
более,
99%
или
более
процентов
длины конкретного полноразмерного антитела, за исключением добавления любого гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать фрагмент полипептида, который на 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более идентичен антителу, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не был включен при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть связаны с фрагментом антитела.
[0060] Фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело, может быть на 100% идентичным полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида в 5' и/или 3' конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в позиции 1, или без. Фрагменты могут содержать 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, 50% или более, 55% или более, 60% или
более,
65%
или
более,
70%
или
более,
75%
или
более,
8 0 % или
более,
85%
или
более,
90%
или
более,
91%
или
более,
92% или
более,
93%
или
более,
94%
или
более,
95%
или
более,
9 6 % или
более,
97%
или
более,
98%
или
более,
99%
или
более
процентов
длины конкретной полноразмерной кодирующей последовательности, за исключением добавления любого гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать фрагмент, который кодирует полипептид, который на 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более идентичен антителу, и дополнительно, необязательно, содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не был включен при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может
быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.
[0061] В контексте данного документа термин "генетическая
конструкция" относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат
нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, такой
как антитело. Кодирующая последовательность содержит сигналы
инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными
элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования,
способными управлять экспрессией в клетках индивида, которому
вводят молекулу нуклеиновой кислоты. В контексте данного
документа термин "форма с возможностью экспрессии" относится к
генным конструкциям, которые содержат необходимые регуляторные
элементы, функционально связанные с кодирующей
последовательностью, которая кодирует белок так, что в случае присутствия в клетке индивида будет происходить экспрессия кодирующей последовательности.
[0062] Употребляемые в данном документа термины "идентичная" или "идентичность" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов могут означать, что последовательности имеют заданный процент остатков, являющихся одинаковыми на протяжении заданной области. Процент можно рассчитывать путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей на протяжении заданной области, определения числа позиций, в которых в обеих последовательностях находится идентичный остаток, для получения числа совпадающих позиций, деления числа совпадающих позиций на общее число позиций в заданной области и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В случае, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к получению одного или более ступенчатых концов и заданная область сравнения включает только одну последовательность, остатки этой одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель при расчете. При сравнении ДНК и РНК тимин (Т) и урацил (U) могут считаться эквивалентными. Идентичность можно оценивать вручную, или используя компьютерный алгоритм выравнивания последовательностей, такой как BLAST или BLAST 2.0.
[0063] В контексте данного документа термин "импеданс" может использоваться при обсуждении механизма обратной связи и может быть преобразован в значение силы тока по закону Ома, делая возможным сравнение с текущим значением силы тока.
[0064] В контексте данного документа термин "иммунный ответ" может означать активацию иммунной системы организма-хозяина, например, млекопитающего, в ответ на внесение одной или более нуклеиновых кислот и/или пептидов. Иммунный ответ может иметь форму клеточного или гуморального ответа или их обоих.
[0065] В контексте данного документа термины "нуклеиновая кислота" или "олигонуклеотид", или "полинуклеотид" могут означать по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных вместе. Описание одной цепи также определяет последовательность комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь описанной одной цепи. Много вариантов нуклеиновой кислоты можно использовать в тех же целях, что и заданную нуклеиновую кислоту. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементарные последовательности. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизироваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации.
[0066] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или
двухцепочечными или могут содержать части как двухцепочечной,
так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота
может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или
гибрид, когда нуклеиновая кислота может содержать комбинации
дезоксирибо- и рибонуклеотидов, и комбинации оснований, включая
урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин,
гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Термин "нуклеиновая
кислота" также охватывает аналоги нуклеиновых кислот и
ненативные нуклеиновые кислоты. Например, нуклеиновые кислоты
могут быть модифицированы, например, могут содержать одно или
более модифицированных нуклеиновых оснований или
модифицированных сахарных фрагментов. Основная цепь нуклеиновой
кислоты может содержать одну или более пептидных связей, как в пептидной нуклеиновой кислоте (ПНК). Нуклеиновая кислота может содержать аналог основания, например, непуриновый или непиримидиновый аналог или нуклеотидный аналог. Нуклеиновые кислоты можно получать методами химического синтеза или рекомбинантными методами.
[0067] В контексте данного документа выражение "функционально связанный" может означать, что экспрессия гена находится под управлением промотора, с которым он пространственно соединен. Промотор может располагаться 5' (выше) или 3' (ниже) гена, находящегося под его управлением. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же самым, что и расстояние между этим промотором и геном, которым он управляет, в гене, из которого получен промотор. Как известно в данной области техники это расстояние можно варьировать без потери функциональности промотора.
[0068] В контексте данного документа термины "пептид", "белок" или "полипептид" могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природными, синтетическими или представлять собой модификацию или комбинацию природных и синтетических.
[0069] В контексте данного документа термин "промотор" может означать синтетическую или полученную из природного источника молекулу, которая способна обеспечивать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических транскрипционных регуляторных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или для изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии. Промотор также может содержать удаленные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от начала участка транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусы, бактерии, грибы, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивным или дифференциальным образом по отношению к клетке, ткани или органу, в которых происходит
экспрессия, или по отношению к стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние стимулы, такие как физиологический стресс, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Типовые примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага ТЗ, промотор SP6, оператор-промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV4 0, ранний промотор SV4 0, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV4 0 или поздний промотор SV4 0 и промотор CMV IE.
[0070] Термины "сигнальный пептид" и "лидерная последовательность" взаимозаменяемо используются в данном документе и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана с амино-концом приведенного в данном документе белка. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности, как правило, управляют локализацией белка. Используемые в данном документе сигнальные пептиды/лидерные последовательности предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он вырабатывается. После секреции из клетки сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, часто называемого зрелым белком. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны с N-концом белка.
[0071] В контексте данного документа "жесткие условия
гибридизации" могут означать условия, в которых первая
последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет
гибридизироваться со второй последовательностью нуклеиновой
кислоты (например, мишенью), например, в комплексной смеси
нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от
последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Жесткие условия можно выбрать так, что они были на около 5-10°С ниже температуры плавления (Тп) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Тп может представлять собой температуру (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Тп, 50% зондов оказываются занятыми в
равновесном состоянии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 М ионов натрия, например, около 0,01-1,0 М концентрация ионов натрия
(или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (например, около 1050 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов
(например, более чем около 50 нуклеотидов). Жесткие условия также можно обеспечить путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для избирательной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примеры жестких условий гибридизации включает следующие: 50% формамид, 5х SSC и 1% ДСН, инкубация при 42°С, или 5х SSC, 1% ДСН, инкубация при 65°С с промывкой в 0,2х SSC и 0,1% ДСН при 65°С.
[0072] В контексте данного документа взаимозаменяемо используемые термины "субъект" и "пациент" относятся к любому позвоночному, включая, но не ограничиваясь этим, млекопитающее
(например, корову, свинью, верблюда, ламу, лошадь, козу, кролика, овцу, хомяков, морскую свинку, кошку, собаку, крысу и мышь, отличного от человека примата (например, обезьяну, такую как яванский или резус-макак, шимпанзе и т. д.) и человека). В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой человека или не человека. Субъект или пациент может проходить другие формы лечения.
[0073] В контексте данного документа выражение "по существу комплементарная" может означать, что первая последовательность по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична комплементарной цепи второй последовательности на протяжении 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируются в жестких условиях гибридизации.
[0074] В контексте данного документа выражение "по существу
идентичные" может означать, что первая и вторая последовательность идентичны по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% на протяжении области из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или более нуклеотидов или аминокислот, или, в случае нуклеиновых кислот, что первая последовательность является по существу комплементарной с комплементарной цепью второй последовательности.
[0075] В контексте данного документа термин "синтетическое антитело" относится к антителу, которое кодируется рекомбинантной последовательностью нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе, и вырабатывается в организме субъекта.
[0076] В контексте данного документа термин "лечение" может означать защиту субъекта от заболевания посредством предотвращения, супрессии, подавления или полного устранения заболевания. Предотвращение заболевания включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению до начала заболевания. Супрессия заболевания включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению после клинического проявления заболевания.
[0077] Термин "вариант", используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, может означать (i) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (ii) комплементарную цепь указанной нуклеотидной последовательности или ее часть; (iii) нуклеиновую кислоту, которая является по существу идентичной указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементарной цепи; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементарной цепью или последовательностью, по
существу идентичной ей.
[0078] Термин "вариант" в отношении пептида или
полипептида, который отличается по аминокислотной
последовательности вследствие вставки, делеции или
консервативной замены аминокислот, но сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая является по существу идентичной указанному белку с аминокислотной последовательностью, который сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Консервативные замены аминокислот, т. е. замещение аминокислоты другой аминокислотой с аналогичными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), известны в данной области техники как включающие, как правило, незначительные изменения. Эти незначительные изменения можно частично определить на основании индекса гидропатичности аминокислот, как известно в данной области техники. Kyte с соавт., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидропатичности аминокислоты основан на оценке ее гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с аналогичными индексами гидропатичности можно взаимно заменять с сохранением функции белка. В одном аспекте проводят замену аминокислот, имеющих индекс гидропатичности ± 2. Гидрофильность аминокислот также можно использовать для определения замен, которые бы привели к получению белков, сохраняющих биологическую функцию. Учет гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитывать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезным показателем, который, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101, в полном объеме включенный в данный документ посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих аналогичные значения гидрофильности, может привести к получению пептидов, сохраняющих биологическую активность, например, иммуногенность, как известно в данной области техники. Замены можно проводить с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности в пределах ± 2
относительно друг друга. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретный тип боковой цепи этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением понятно, что аминокислотные замены, совместимые с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, проявляемого в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.
[0079] Вариант может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по существу идентичной на протяжении всей длины последовательности всего гена или ее части. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть на 8 0%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной на протяжении всей длины последовательности гена или ее части. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, которая является по существу идентичной на протяжении всей длины аминокислотной последовательности или ее части. Аминокислотная последовательность может быть на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной на протяжении всей длины аминокислотной последовательности или ее части.
[0080] В контексте данного документа термин "вектор" может означать последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может представлять собой ДНК- или РНК-вектор. Вектор может представлять собой как самореплицирующийся внехромосомный вектор, так и вектор, который интегрируется в геном организма-хозяина.
[0081] В случае перечисления в данном документе числовых диапазонов явным образом и с той же степенью точности подразумевается и каждое промежуточное число. Например, в случае диапазона 6-9, кроме чисел б и 9 подразумеваются числа 7 и 8, а в случае диапазона 6,0-7,0, явным образом подразумеваются числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.
2. Композиция
[0082] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. При введении нуждающемуся в этом субъекту композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта. Синтетическое антитело может связывать молекулу-мишень (т. е. антиген вируса гриппа), присутствующую у субъекта. Такое связывание может нейтрализовать антиген, блокировать распознавание антигена другой молекулой, например, белком или нуклеиновой кислотой, и вызывать или индуцировать иммунный ответ на антиген.
[0083] В одном варианте реализации композиция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетическое антитело. В одном варианте реализации композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первое синтетическое антитело, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую второе синтетическое антитело. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен расщепления.
[0084] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой
кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую
антитело к НА. В одном варианте реализации нуклеотидная
последовательность, кодирующая антитело к НА, содержит кодон-
оптимизированные последовательности нуклеиновой кислоты,
кодирующие вариабельные области VH и VL антитела к НА. В одном
варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая
антитело к НА, содержит кодон-оптимизированные
последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие области СН и CL человеческого IgGlK.
[0085] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к НА вируса гриппа типа A (FluA) . В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит
нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к НА FluA. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела к НА FluA, и нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к НА FluA. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь FluB антитела к НА, и нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела к НА FluB.
[0086] В одном варианте реализации антитело к НА связывается с шаровидной головкой НА вируса гриппа. В одном варианте осуществления антитело к НА представляет собой FJ8. В одном варианте реализации антитело к НА связывается с поддоменом слияния НА вируса гриппа. В одном варианте реализации антитело к НА представляет собой FI6. В одном варианте реализации антитело к НА обладает перекрестной реактивностью к белкам НА Н5 и Н7 FluA. В одном варианте реализации антитело к НА реагирует с белками НА FluB.
[0087] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой
кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую
антитело к НА, содержащую аминокислотную последовательность,
выбранную из SEQ ID N0: 1-8, или ее вариант или ее фрагмент. В
одном варианте реализации нуклеиновая кислота, кодирующая
антитело к НА, содержит нуклеотидную последовательность с любой
из SEQ ID N0: 9-12, или ее вариант или ее фрагмент. В одном
варианте реализации нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к
НА, содержит молекулу РНК, транскрибированную из
последовательности ДНК, с любой из SEQ ID N0: 9-12, или ее вариант или ее фрагмент.
[0088] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к НА, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90% или по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью, выбранной из SEQ ID N0: 1-8. В одном
варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит
нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент антитела к
НА, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по
меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей
мере около 90% или по меньшей мере около 95% идентичности по
всей длине аминокислотной последовательности с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1-8.
[0089] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой
кислоты содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по
меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей
мере около 90% или по меньшей мере около 95% идентичности по
всей длине нуклеотидной последовательности с нуклеотидной
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9-16. В одном
варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит
фрагмент нуклеотидной последовательности, имеющий по меньшей
мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около
90% или по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине
нуклеотидной последовательности с нуклеотидной
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 9-16.
[0090] В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность РНК, транскрибированную из последовательности ДНК, имеющую по меньшей мере около 8 0%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90% или по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине с ДНК, выбранной из SEQ ID NO: 9-16. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит фрагмент последовательности РНК, транскрибированной из последовательности ДНК, имеющий по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90% или по меньшей мере около 95% идентичности по всей длине с ДНК, выбранной из SEQ ID N0: 9-16.
[0091] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к НА, содержит кодон-оптимизированные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области VH и VL антитела к НА. В одном варианте реализации область VH в НА содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, 7, 9 или 10, или ее вариант или
ее фрагмент. В одном варианте реализации область VH в НА содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% или более гомологичную SEQ ID NO: 5, 7, 9 или 10, или ее фрагмент. В одном варианте реализации область VL в НА содержит аминокислотную последовательность согласно одной из SEQ ID NO: 6-10, или ее вариант или ее фрагмент. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность вариабельной области VH в НА содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13 или 15, или ее вариант или ее фрагмент. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность вариабельной области VH в НА содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% или более гомологичную SEQ ID NO: 13 или 15, или ее вариант или ее фрагмент. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность вариабельной области VL в НА содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, 15 или 16, или ее вариант или ее фрагмент. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность вариабельной области VL в НА содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% или более гомологичную SEQ ID NO: 14, 15 или 16, ее фрагмент. В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность вариабельной области VL в НА содержит молекулу РНК, транскрибированную из последовательности ДНК с любой из SEQ ID NO: 14, 15 или 16, или ее вариант или ее фрагмент.
[0092] В одном варианте реализации композиция содержит по меньшей мере две молекулы нуклеиновых кислот. В одном варианте реализации молекулы нуклеиновых кислот выбирают из нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела FluA к НА, нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела FluA к НА, нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело FluA к НА и нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело FluB к НА. В одном варианте реализации молекулы нуклеиновых кислот выбирают из нуклеиновой кислоты, кодирующей одну из SEQ ID NO: 1-8. В одном варианте реализации молекулы нуклеиновых кислот выбирают из нуклеиновой кислоты,
кодирующей пептид, по меньшей мере на 90% гомологичный SEQ ID NO: 1-8. В одном варианте реализации композиция содержит нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, а также содержит нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации композиция содержит нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9, и нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 10.
[0093] Композиция настоящего изобретения может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от любой инфекции гриппа. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от инфекции вируса гриппа А. В некоторых вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от вируса гриппа А из группы HI или группы НЗ. В другом варианте реализации вируса гриппа А представляет собой вирус гриппа pmHl. В других вариантах реализации композиция может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от инфекции вируса гриппа В.
[0094] Синтетическое антитело может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от заболевания у субъекта, которому вводят композицию. Синтетическое антитело посредством связывания антигена может обеспечивать лечение, предотвращение и/или защиту от заболевания у субъекта, которому вводят композицию. Синтетическое антитело может способствовать выживаемости при заболевании у субъекта, которому вводят композицию. В одном варианте реализации синтетическое антитело может обеспечить повышенную выживаемость субъекта с заболеванием по сравнению с ожидаемой выживаемостью у имеющего заболевание субъекта, которому не вводили синтетическое антитело. В различных вариантах реализации синтетическое антитело может обеспечивать повышение выживаемости у субъекта с заболеванием, которому вводили композицию, по меньшей мере на около 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% больше по
сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии введения композиции. В одном варианте реализации синтетическое антитело может обеспечить повышенную защиту от заболевания у субъекта по сравнению с ожидаемой защитой у субъекта, которому не вводили синтетическое антитело. В различных вариантах реализации синтетическое антитело может обеспечивать защиту от заболевания у субъекта, которому вводили композицию, по меньшей мере на около 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% больше по сравнению с ожидаемой защитой при отсутствии введения композиции.
[0095] Композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта в течение по меньшей мере около 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, б часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 20 часов, 25 часов, 30 часов, 35 часов, 40 часов, 45 часов, 50 часов или 60 часов после введения композиции субъекту. Композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта в течение по меньшей мере около 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, б суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток или 10 суток после введения композиции субъекту. Композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта в течение от около 1 часа до около б суток, от около 1 часа до около 5 суток, от около 1 часа до около 4 суток, от около 1 часа до около 3 суток, от около 1 часа до около 2 суток, от около 1 часа до около 1 суток, от около 1 часа до около 72 часов, от около 1 часа до около 60 часов, от около 1 часа до около 48 часов, от около 1 часа до около 36 часов, от около 1 часа до около 24 часов, от около 1 часа до около 12 часов или от около 1 часа до около б часов после введения композиции субъекту.
[0096] При введении нуждающемуся в этом субъекту композиция может приводить к генерации синтетического антитела в организме субъекта быстрее, чем происходит генерация эндогенного антитела у субъекта, которому вводят антиген, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ. Композиция может приводить к
генерации синтетического антитела по меньше мере на около 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, б суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток или 10 суток раньше генерации эндогенного антитела у субъекта, которому вводят антиген, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ.
[0097] Композиция согласно настоящему изобретению может иметь характеристики, необходимые для эффективных композиций, такие как безопасность в том смысле, что композиция не приводит к болезни или смерти; защита от болезни; обеспечение легкости введения, небольшое количество побочных явлений, биологическая стабильность и низкая стоимость, приходящаяся на дозу.
3. Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты
[0098] Как описано выше, композиция может содержать
рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Антитело более подробно описано ниже.
[0099] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой
кислоты может представлять собой гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты. Рекомбинантная
последовательность нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты или одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.
[00100] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой
кислоты может представлять собой оптимизированную
последовательность нуклеиновой кислоты. Такая оптимизация может повышать или изменять иммуногенность антитела. Оптимизация также может улучшать транскрипцию и/или трансляцию. Оптимизация может включать в себя одно или более из следующего: лидерную последовательность с низким содержанием GC для повышения транскрипции; стабильность мРНК и оптимизацию кодонов; добавление последовательности Козака (например, GCC АСС) для повышения трансляции; добавление лидерной последовательности иммуноглобулина (Ig), кодирующей сигнальный пептид; и удаление по мере возможности цис-действующих мотивов последовательностей
(т. е. внутренних ТАТА-боксов).
а. Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты
[00101] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать одну или более конструкций рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более компонентов, которые более подробно описаны ниже.
[00102] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует
полипептид тяжелой цепи, его фрагмент, его вариант или их
комбинацию. Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует
полипептид легкой цепи, его фрагмент, его вариант или их
комбинацию. Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты также может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует участок
расщепления протеазой или пептидазой. Конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может содержать одну или
более лидерных последовательностей, причем лидерная
последовательность кодирует сигнальный пептид. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более промоторов, один или более интронов, одну или более областей терминации транскрипции, один или более инициирующих кодонов, один или более терминирующих или стоп-кодонов и/или один или более сигналов полиаденилирования. Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты также может содержать одну или более линкерных или метящих последовательностей. Метящая последовательность может кодировать гемагглютининовую (ГА) метку.
(1) Полипептид тяжелой цепи
[00103] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную нуклеиновую
кислоту, кодирующую полипептид тяжелой цепи, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Полипептид тяжелой цепи может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи (СН) . По меньшей мере одна константная область тяжелой цепи может содержать константную область тяжелой цепи 1 (СН1), константную область тяжелой цепи 2 (СН2) и константную область тяжелой цепи 3 (СНЗ) и/или шарнирную область.
[00104] В некоторых вариантах реализации полипептид тяжелой цепи может содержать область VH и область СН1. В других вариантах реализации полипептид тяжелой цепи может содержать область VH, область СН1, шарнирную область, область СН2 и область СНЗ.
[00105] Полипептид тяжелой цепи может содержать набор определяющих комплементарность областей ("CDR"). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области из области VH. Начиная с N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут вносить свой вклад в связывание или распознавание антигена.
(2) Полипептид легкой цепи
[00106] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид легкой цепи, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Полипептид легкой цепи может содержать вариабельную область легкой цепи (VL) и/или константную область легкой цепи (CL).
[00107] Полипептид легкой цепи может содержать набор определяющих комплементарность областей ("CDR"). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области из области VL. Начиная с N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут вносить свой вклад в связывание или распознавание антигена.
(3) Участок расщепления протеазой
[00108] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты также может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую участок расщепления протеазой. Участок расщепления протеазой может распознаваться протеазой или пептидазой. Протеаза может представлять собой эндопептидазу или эндопротеазу, например, но не ограничиваясь этим, фурин, эластазу, HtrA, кальпаин, трипсин, химотрипсин, трипсин и пепсин. Протеаза может представлять собой фурин. В других вариантах реализации протеаза может представлять собой сериновую протеазу, треониновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатную протеазу, металлопротеазу, протеазу глутаминовой кислоты или любую протеазу, которая расщепляет внутреннюю пептидную связь (т. е. не расщепляет N-концевую или С-концевую пептидную связь).
[00109] Участок расщепления протеазой может содержать одну или более аминокислотных последовательностей, которые стимулируют расщепление или повышают его эффективность. Одна или более аминокислотных последовательностей могут стимулировать или повышать эффективность образования или генерации дискретных полипептидов. Одна или более аминокислотных последовательностей могут содержать 2А пептидную последовательность.
(4) Линкерная последовательность
[00110] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать одну или более линкерных последовательностей. Линкерная последовательность может пространственно разделять или связывать один или более описанных в данном документе компонентов. В других вариантах реализации линкерная последовательность может кодировать аминокислотную последовательность, которая пространственно разделяет или связывает два или более полипептидов.
(5) Промотор
[00111] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более промоторов. Один или более промоторов могут представлять собой любой промотор, способный управлять генной экспрессией и регулировать генную экспрессию. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для
транскрипции с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Выбор промотора, применяемого для управления генной экспрессией, зависит от конкретного применения. Промотор может располагаться приблизительно на таком же расстоянии от точки начала транскрипции в конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, что и от точки начала транскрипции в своем природном окружении. При этом это расстояние можно варьировать без потери функциональности промотора.
[00112] Промотор может быть функционально связан с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи. Промотор может представлять собой промотор, эффективный для экспрессии в эукариотических клетках. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может представлять собой промотор ЦМВ, промотор вируса обезьян 40 (SV40), такой как ранний промотор SV4 0 и поздний промотор SV4 0, промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такой как промотор длинных концевых повторов (ДКП) бычьего вируса иммунодефицита (БВИ), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц (ВЛП), промотор цитомегаловируса (ЦМВ), такой как немедленно-ранний промотор ЦМВ, промотор вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) или промотор вируса саркомы Рауса (ВСР). Промотор также может представлять собой промотор из человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатинин, человеческий полиэдрин или человеческий металлотионеин.
[00113] Промотор может представлять собой конститутивный промотор или индуцибельный промотор, который инициирует транскрипцию, только когда клетка-хозяин подвергается воздействию некоторого внешнего стимула. В случае многоклеточного организма промотор также может быть специфическим в отношении конкретной ткани или органа, или стадии развития. Промотор также может быть тканеспецифическим промотором, таким как промотор, специфический в отношении мышц или кожи, природный или синтетический. Примеры таких промоторов
описаны в публикации заявки на патент США № US20040175727, содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00114] Промотор может быть связан с энхансером. Энхансер может располагаться выше кодирующей последовательности. Энхансер может представлять собой энхансер человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатинина или вирусный энхансер, например, из ЦМВ, FMDV, РСВ или ВЭБ. Энхансеры полинуклеотидной функции описаны в патентах США № 5593972, 5962428 и W094/016737, содержание которых в полном объеме включено посредством ссылки.
(6) Интрон
[00115] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более интронов. Каждый интрон может содержать функциональные донорные и акцепторные участки сплайсинга. Интрон может содержать энхансер сплайсинга. Интрон может содержать один или более сигналов, необходимых для эффективного сплайсинга.
(7) Область терминации транскрипции
[00116] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать одну или более областей терминации транскрипции. Область терминации транскрипции может располагаться ниже кодирующей последовательности, чтобы обеспечивать эффективную терминацию. Область терминации транскрипции может быть получена из того же гена, что и вышеописанный промотор, или может быть получена из одного или более других генов.
(8) Инициирующий кодон
[00117] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более инициирующих кодонов. Инициирующий кодон может располагаться выше кодирующей последовательности. Инициирующий кодон может находиться в рамке с кодирующей последовательностью. Инициирующий кодон может быть связан с одним или более сигналами, необходимыми для эффективной инициации трансляции, например, но не ограничиваясь этим, участком связывания рибосомы.
(9) Терминирующий кодон
[00118] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более терминирующих или стоп-кодонов. Терминирующий кодон может располагаться ниже кодирующей последовательности. Терминирующий кодон может находиться в рамке с кодирующей последовательностью. Терминирующий кодон может быть связан с одним или более сигналами, необходимыми для эффективной терминации трансляции.
(10) Сигнал полнаденилирования
[00119] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать один или более сигналов
полиаденилирования. Сигнал полиаденилирования может содержать
один или более сигналов, необходимых для эффективного
полиаденилирования транскрипта. Сигнал полиаденилирования может
располагаться ниже кодирующей последовательности. Сигнал
полиаденилирования может представлять собой сигнал
полиаденилирования SV4 0, сигнал полиаденилирования ДКП, сигнал
полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал
полиаденилирования человеческого гормона роста (hGH) или сигнал
полиаденилирования человеческого (3-глобина. Сигнал
полиаденилирования SV4 0 может представлять собой сигнал полиаденилирования из плазмиды рСЕР4 (Invitrogen, San Diego, СА) .
(11) Лидерная последовательность
[00120] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать одну или более лидерных
последовательностей. Лидерная последовательность может
кодировать сигнальный пептид. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина (Ig), например, но не ограничиваясь этим, сигнальный пептид IgG и сигнальный пептид IgE.
b. Компоновка конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты
[00121] Как описано выше, рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать одну или более конструкций
рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, при этом каждая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более компонентов. Один или более компонентов подробно описаны выше. Один или более компонентов, когда они включены в конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, могут располагаться в любом порядке по отношению друг к другу. В некоторых вариантах реализации один или более компонентов могут располагаться в конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты так, как описано ниже. (1) Компоновка 1
[00122] В одной компоновке первая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид тяжелой цепи, а вторая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи.
[00123] Первая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может быть помещена в вектор. Вторая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может быть помещена во второй или отдельный вектор. Размещение конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты в векторе более подробно описано ниже.
[00124] Первая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать
промотор, интрон, область терминации транскрипции, инициирующий
кодон, терминирующий кодон и/или сигнал полиаденилирования.
Первая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой
кислоты может дополнительно содержать лидерную
последовательность, причем лидерная последовательность
расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи. Соответственно, сигнальный пептид, кодируемый лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью
с полипептидом тяжелой цепи.
[00125] Вторая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать
промотор, инициирующий кодон, терминирующий кодон и сигнал
полиаденилирования. Вторая конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать лидерную последовательность, причем лидерная последовательность расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. Соответственно, сигнальный пептид, кодируемый лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом легкой цепи.
[00126] Соответственно, один пример компоновки 1 может
включать первый вектор (и, таким образом, первую конструкцию
рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты),
кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH и СН1, и
второй вектор (и, таким образом, вторую конструкцию
рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты),
кодирующий полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL.
Второй пример компоновки 1 может включать первый вектор (и,
таким образом, первую конструкцию рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH, СН1, шарнирную область, СН2 и СНЗ, и второй вектор (и, таким образом, вторую конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL.
(2) Компоновка 2
[00127] Во второй компоновке конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты может содержать
гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты,
кодирующую полипептид тяжелой цепи, и гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид тяжелой цепи, может располагаться выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности
нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. В альтернативном варианте гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид легкой цепи, может располагаться выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи.
[00128] Конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты можно помещать в вектор, как более подробно описано ниже.
[00129] Конструкция рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты может содержать гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую участок
расщепления протеазой и/или линкерную последовательность. При
включении в конструкцию рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты гетерологичная последовательность
нуклеиновой кислоты, кодирующая участок расщепления протеазой, может располагаться между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. Соответственно, участок расщепления протеазой позволяет разделять полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи на разные полипептиды после экспрессии. В других вариантах реализации при включении в конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты линкерной последовательности она может располагаться между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00130] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать промотор, интрон, область терминации транскрипции, инициирующий кодон, терминирующий кодон и/или сигнал полиаденилирования. Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один или более промоторов. Конструкция рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты также может содержать два промотора так, что один промотор может быть связан с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, а второй промотор может быть связан с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. В других вариантах реализации конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать один промотор, связанный с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00131] Конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать две лидерные последовательности, причем первая лидерная последовательность
расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, а вторая лидерная последовательность расположена выше (или на 5' конце) гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи. Соответственно, сигнальный пептид, кодируемый первой лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом тяжелой цепи, а второй сигнальный пептид, кодируемый второй лидерной последовательностью, может быть связан пептидной связью с полипептидом легкой цепи.
[00132] Соответственно, один пример компоновки 2 может
включать вектор (и, таким образом, конструкцию рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид
тяжелой цепи, который содержит VH и СН1, и полипептид легкой
цепи, который содержит VL и CL, в котором линкерная
последовательность расположена между гетерологичной
последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00133] Второй пример компоновки 2 может включать вектор
(и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH и СН1, и полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая участок расщепления протеазой, расположена между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00134] Третий пример компоновки 2 может включать вектор (и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующий полипептид тяжелой цепи, который содержит VH, СН1, шарнирную область, СН2 и СНЗ, и полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором линкерная последовательность расположена между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
[00135] Четвертый пример компоновки 2 может включать вектор
(и, таким образом, конструкцию рекомбинантной последовательности
нуклеиновой кислоты) , кодирующий полипептид тяжелой цепи,
который содержит VH, СН1, шарнирную область, СН2 и СНЗ, и
полипептид легкой цепи, который содержит VL и CL, в котором
гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты,
кодирующая участок расщепления протеазой, расположена между гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид тяжелой цепи, и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи.
с. Экспрессия из конструкции рекомбинантной
последовательности нуклеиновой кислоты
[00136] В других вариантах реализации конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может содержать, в числе одного или более компонентов, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид тяжелой цепи, и/или гетерологичную последовательность
нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи. Соответственно, конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида тяжелой цепи и/или полипептида легкой цепи.
[00137] В случае применения описанной выше компоновки 1 первая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида тяжелой цепи, а вторая конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида легкой цепи. В случае применения описанной выше компоновки 2 конструкция рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты может облегчать экспрессию полипептида тяжелой цепи и полипептида легкой цепи.
[00138] После экспрессии, например, но не ограничиваясь этим, в клетке, организме или млекопитающем, полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут формировать синтетическое антитело. В частности, полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, способного связывать антиген. В других вариантах реализации полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, являющегося более иммуногенным по сравнению с антителом, не прошедшим описанную в данном документе сборку. В других вариантах реализации полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи могут взаимодействовать друг с другом так, что сборка приводит к получению синтетического антитела, способного вызывать или индуцировать иммунный ответ против антигена.
d. Вектор
[00139] Описанную выше конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты можно помещать в один или более векторов. Один или более векторов могут содержать точку начала репликации. Один или более векторов могут представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Один или более
векторов могут представлять собой как самореплицирующийся внехромосомный вектор, так и вектор, который интегрируется в геном организма-хозяина.
[00140] Векторы включают, но не ограничиваются этим,
плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любую форму
рекомбинантного вектора "голой ДНК" и т. п. "Вектор" содержит
нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать,
трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Следует понимать, что вектор может представлять собой "голую" нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны
(например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т. д.) . Векторы включают, но не ограничиваются этим, репликоны
(например, репликоны РНК, бактериофаги), к которым могут быть прикреплены и становиться реплицированными фрагменты ДНК. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются этим, РНК, автономную самореплицирующуюся циркулярную или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т. п., см., например, патент США. № 5, 217, 879), и включают как экспрессионные, так и не экспрессионные плазмиды. В некоторых вариантах реализации вектор включает линейную ДНК, ферментативную ДНК или синтетическую ДНК. Когда рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описывается как хозяин "вектора экспрессии", это означает, что они включают как внехромосомную циркулярную, так и линейную ДНК, и ДНК, которые были включены в хромосому (-ы) хозяина. Когда вектор поддерживается в клетке-хозяине, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками во время митоза как автономная структура, либо может быть включен в геном хозяина.
[00141] Один или более векторов могут представлять собой гетерологичную экспрессионную конструкцию, которая в общем случае является плазмидой, которую используют для внесения конкретного гена в клетку-мишень. После того, как экспрессионный вектор попадает в клетку, полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, которые кодируются конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, начинают
вырабатываться рибосомальными комплексами клеточного аппарата транскрипции и трансляции. Один или более векторов могут экспрессировать большие количества стабильной матричной РНК и, следовательно, белков.
(1) Экспрессионный вектор
[00142] Один или более векторов могут представлять собой кольцевую плазмиду или линейную нуклеиновую кислоту. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны управлять экспрессией конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Один или более векторов, содержащих конструкцию рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть химерными, что означает, что по меньшей мере один из их компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из других его компонентов.
(2) Плазмида
[00143] Один или более векторов могут представлять собой плазмиду. Плазмиду можно применять для трансфекции клеток конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Плазмиду можно применять для внесения конструкции рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты в организм субъекта. Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для генной экспрессии в клетке, в которую внесена плазмида.
[00144] Плазмида также может содержать точку начала репликации млекопитающего для внехромосомной поддержки плазмиды и выработки множества копий плазмиды в клетке. Плазмида может представлять собой pVAX, рСЕР4 или pREP4 от Invitrogen (San Diego, СА) , которые могут содержать точку начала репликации вируса Эпштейна-Барр и область, кодирующую ядерный антиген EBNA-1, которая может обеспечивать многокопийную эписомальную репликацию без интеграции. Скелет плазмиды может представлять собой pAV0242. Плазмида может представлять собой дефективную по репликации аденовирусную плазмиду типа 5 (Ad5).
[00145] Плазмида может представлять собой pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которую можно использовать для выработки белка в Escherichia coli (Е. coli). Плазмида также
может представлять собой pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которую можно использовать для выработки белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Плазмида также может принадлежать полной бакуловирусной системе экспрессии М7АХВАС(tm) (Invitrogen, San Diego, Calif.), которую можно использовать для выработки белка в клетках насекомых. Плазмида также может представлять собой pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которые можно использовать для выработки белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка (СНО). (3) РНК
[00146] В одном варианте реализации нуклеиновая кислота
представляет собой молекулу РНК. В одном варианте реализации
молекула РНК транскрибирована из описанной в настоящем документе
последовательности ДНК. Например, в некоторых вариантах
реализации молекула РНК кодируется одной из SEQ ID NO: 9-16. В
другом варианте реализации нуклеотидная последовательность
содержит последовательность РНК, транскрибированную из
последовательности ДНК, кодирующей полипептидную
последовательность с SEQ ID N0: 9-16, или ее вариант или ее фрагмент. Соответственно, в одном варианте реализации в изобретении предложена молекула РНК, кодирующая одно или более DMAb. РНК может иметь дополнительную цепь. Соответственно, в некоторых вариантах реализации молекула РНК может быть транслирована клетками без необходимости каких-либо промежуточных этапов репликации, таких как обратная транскрипция. Молекула РНК, подходящая для использования в изобретении, может иметь 5'-кэп (например, 7-метилгуанозин). Этот кэп может усиливать трансляцию РНК in vivo. 5'-нуклеотид молекулы РНК, используемой в изобретении, может иметь группу трифосфата на 5'-конце. В кэппированной РНК она может быть связана с 7-метилгуанозином через мостик 5'-к-5'. Молекула РНК может иметь поли-А хвост на 3'-конце. Около своего 3'-конца она может также включать последовательность, отвечающую за распознавание поли-А полимеразы (например, AAUAAA). Молекула РНК, используемая в изобретении, обычно является одноцепочечной.
Молекула РНК, используемая в изобретении, может содержать синтетическую РНК.
(4) Кольцевой и линейный вектор
[00147] Один или более векторов могут представлять собой кольцевую плазмиду, которая может трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или существовать внехромосомно (например, автономно-реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации). Вектор может представлять собой pVAX, pcDNA3.О или provax, или любой другой экспрессионный вектор, способный экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты.
[00148] Также в данном документе предложена линейная нуклеиновая кислота или линейная экспрессионная кассета ("ЛЭК"), которую возможно эффективно доставлять субъекту путем электропорации и которая способна экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. ЛЭК может представлять собой любую линейную ДНК, в которой отсутствует какой-либо фосфатный остов. ЛЭК может не содержать каких-либо генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатный остов. ЛЭК может не содержать другие последовательности нуклеиновых кислот, не связанные с экспрессией необходимого гена.
[0014 9] ЛЭК может быть получена из любой плазмиды, которую возможно линеаризовать. Плазмида может быть способна экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Плазмида может представлять собой pNP (Пуэрто-Рико/34) или рМ2 (Новая Каледония/99) . Плазмида может представлять собой WLV009, pVAX, pcDNA3.О или provax, или любой другой экспрессионный вектор, способный экспрессировать полипептид тяжелой цепи и/или полипептид легкой цепи, кодируемые конструкцией рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты.
[00150] ЛЭК может представлять собой рсгМ2. ЛЭК может
представлять собой pcrNP. pcrNP и pcrMR могут быть получены из pNP (Пуэрто-Рико/34) и рМ2 (Новая Каледония/99) соответственно.
(5) Вирусные векторы
[00151] В одном варианте реализации предложены вирусные векторы, способные доставлять нуклеиновую кислоту настоящего изобретения в клетку. Экспрессионный вектор можно доставлять в клетку в форме вирусного вектора. Технологии вирусных векторов хорошо известны в данной области и описаны, например, у Sambrook et al. (2001), и у Ausubel et al. (1997), и в других справочниках по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, используемые в качестве векторов, включают, но не ограничиваются этим, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В основном, подходящий вектор содержит участок начала репликации, функциональный по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, подходящие участки узнавания рестрикционных эндонуклеаз и один или более селектируемых маркеров. (См., например, WO 01/96584; WO 01/29058; и патент США № 6,326,193). Вирусные векторы и особенно ретровирусные векторы стали наиболее широко используемым способом переноса генов в клетки млекопитающих, например клетки человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвируса, вируса простого герпеса I типа, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т. п. См., например, патент США №№ 5 350 674 и 5 585 362.
(6) Способ получения вектора
[00152] В данном документе предложен способ получения одного или более векторов, в которые была помещена рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты. После конечного этапа субклонирования вектор можно использовать для инокуляции клеточной культуры в крупномасштабном ферментационном чане с помощью известных в данной области техники способов.
[00153] В других вариантах реализации после конечного этапа субклонирования вектор можно использовать с одним или более устройствами для электропорации (ЭП) . Устройства для ЭП более подробно описаны ниже.
[00154] Один или более векторов можно готовить или
получать, используя комбинацию известных устройств и методик, но предпочтительно их получают с помощью методики получения плазмид, описанной в лицензированной, одновременно находящейся на рассмотрении предварительной заявке США № 60/939,792, поданной 2 3 мая 2 0 07 г. В некоторых примерах описанные в данном документе ДНК-плазмиды можно готовить в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Методики получения также включают применение различных устройств и протоколов, которые являются общеизвестными для специалистов в данной области техники, в дополнение описанным в заявке на патент США, серийный № 60/939792, включая описанные в лицензированном патенте США № 7,238,522, изданном 3 июля 2007 г. Вышеуказанные заявка и патент, серийный № 60/939,792 и патент США № 7,238,522, соответственно, в полном объеме включены в данный документ. 4. Антитело
[00155] Как описано выше, рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Антитело может связываться или вступать в реакцию с антигеном, который более подробно описан ниже.
[00156] Антитело может содержать набор определяющих комплементарность областей ("CDR") тяжелой цепи и легкой цепи, перемежающих соответственно набор каркасных областей ("FR") тяжелой цепи и легкой цепи, которые обеспечивают поддержку CDR и определяют пространственную взаимосвязь CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельные области из V-области тяжелой или легкой цепи. Начиная с N-конца тяжелой или легкой цепи, эти CDR обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3" соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий участок может включать шесть CDR, составляющих набор CDR из каждой V-области тяжелой и легкой цепи.
[00157] Протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с получением нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F(ab)) содержат ковалентный гетеродимер, который содержит интактный антигенсвязывающий участок. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с получением нескольких
фрагментов, включая фрагмент F(ab')2f который содержит оба антигенсвязывающих участка. Соответственно, антитело может представлять собой Fab или F(ab')2. Fab может содержать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может содержать область VH и область СН1. Полипептид легкой цепи Fab может содержать область VL и область CL.
[00158] Антитело может представлять собой иммуноглобулин (Ig) . Ig может представлять собой, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может содержать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может содержать область VH, область СН1, шарнирную область, область СН2 и область СНЗ. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может содержать область VL и область CL.
[00159] Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может представлять собой химерное антитело, одноцепочечное антитело, антитело с созревшей аффинностью, человеческое антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Гуманизированное антитело может представлять собой антитело от отличного от человека вида, которое связывает необходимый антиген, имеющее одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) от отличного от человека вида и каркасные области из молекулы человеческого иммуноглобулина.
[00160] Антитело может представлять собой биспецифическое антитело, более подробно описанное ниже. Антитело может представлять собой бифункциональное антитело, также более подробно описанное ниже.
[00161] Как описано выше, антитело может генерироваться у субъекта после введения субъекту композиции. Антитело может характеризоваться определенным временем полужизни в организме субъекта. В некоторых вариантах реализации антитело можно модифицировать, чтобы продлить или укоротить его время полужизни в организме субъекта. Такие модификации более подробно описаны ниже.
[00162] Антитело может быть дефукозилированным, как более
подробно описано ниже.
[00163] Антитело можно модифицировать, чтобы снизить или предотвратить антителозависимое усиление (АЗУ) заболевания, связанного с антигеном, как более подробно описано ниже.
a. Биспецифическое антитело
[00164] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать биспецифическое антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Биспецифическое антитело может связываться или вступать в реакцию с двумя антигенами, например, двумя антигенами, более подробно описанными ниже. Биспецифическое антитело может состоять из фрагментов двух описанных в данном документе антител, что, таким образом, позволяет биспецифическому антителу связываться или вступать в реакцию с двумя необходимыми молекулами-мишенями, которые могут включать антиген, который более подробно описан ниже, лиганд, включая лиганд для рецептора, рецептор, включая лиганд-связывающий участок на рецепторе, комплекс лиганд-рецептор и маркер, включая раковый маркер.
b. Бифункциональное антитело
[00165] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать бифункциональное антитело, его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Бифункциональное антитело может связываться или вступать в реакцию с описанным ниже антигеном. Бифункциональное антитело также можно модифицировать, чтобы придать антителу дополнительную функциональность помимо распознавания и связывания антигена. Такая модификация может включать, но не ограничивается этим, сопряжение с фактором Н или его фрагментом. Фактор Н представляет собой растворимый регулятор активации комплемента и, таким образом, может вносить свой вклад в иммунный ответ посредством комплемент-опосредованного лизиса (КОЛ).
c. Продление времени полужизни антитела
[00166] Как описано выше, антитело можно модифицировать, чтобы продлить или укоротить время полужизни антитела в организме субъекта. Модификация может продлевать или укорачивать время полужизни антитела в сыворотке субъекта.
[00167] Модификация может присутствовать в константной области антитела. Модификация может представлять собой одну или более аминокислотных замен в константной области антитела, которые продлевают время полужизни антитела по сравнению со временем полужизни антитела, не содержащего одну или более аминокислотных замен. Модификация может представлять собой одну или более аминокислотных замен в домене СН2 антитела, которые продлевают время полужизни антитела по сравнению со временем полужизни антитела, не содержащего одну или более аминокислотных замен.
[00168] В некоторых вариантах реализации одна или более аминокислотных замен в константной области могут включать замещение остатка метионина в константной области остатком тирозина, остатка серина в константной области остатком треонина, остатка треонина в константной области остатком глутамата или любую их комбинацию, продлевая, таким образом, время полужизни антитела.
[00169] В других вариантах реализации одна или более аминокислотных замен в константной области могут включать замещение остатка метионина в домене СН2 остатком тирозина, остатка серина в домене СН2 остатком треонина, остатка треонина в домене СН2 остатком глутамата или любую их комбинацию, продлевая, таким образом, время полужизни антитела.
d. Дефукозилирование
[00170] Рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать антитело, которое не является фукозилированным (т. е. дефукозилированное антитело или нефукозилированное антитело), его фрагмент, его вариант или их комбинацию. Фукозилирование включает добавление к молекуле сахара фукозы, например, присоединение фукозы к N-гликанам, 0-гликанам и гликолипидам. Соответственно, в дефукозилированном антителе фукоза не присоединена к углеводным цепям константной области. В свою очередь, это отсутствие фукозилирования может улучшать связывание FcyRIIIa и антителозависимую клеточную цитотоксическую (АЗКЦ) активность антитела по сравнению с
фукозилированным антителом. Следовательно, в некоторых вариантах реализации нефукозилированное антитело может проявлять повышенную активность АЗКЦ по сравнению с фукозилированным антителом.
[00171] Антитело можно модифицировать так, чтобы предотвратить или ингибировать фукозилирование антитела. В некоторых вариантах реализации такое модифицированное антитело может проявлять повышенную активность АЗКЦ по сравнению с немодифицированным антителом. Модификация может присутствовать в тяжелой цепи, легкой цепи или их комбинации. Модификация может представлять собой одну или более аминокислотных замен в тяжелой цепи, одну или более аминокислотных замен в легкой цепи или их комбинацию.
е. Сниженный ответ АЗУ
[00172] Антитело можно модифицировать, чтобы снизить или предотвратить антителозависимое усиление (АЗУ) заболевания, связанного с антигеном, но при этом нейтрализовать антиген.
[00173] В некоторых вариантах реализации антитело можно модифицировать так, чтобы оно содержало одну или более аминокислотных замен, которые снижают или предотвращают связывание антитела с FcyRla. Одна или более аминокислотных замен могут присутствовать в константной области антитела. Одна или более аминокислотных замен могут включать замещение остатка лейцина остатком аланина в константной области антитела, т. е. также называемое в данном документе LA, мутацией LA или заменой LA. Одна или более аминокислотных замен могут включать замещение каждого из двух остатков лейцина остатком аланина в константной области антитела, которое также называется в данном документе LALA, мутацией LALA или заменой LALA. Присутствие замен LALA может предотвращать или блокировать связывание антитела с FcyRla и, таким образом, модифицированное антитело не усиливает заболевание или не вызывает АЗУ заболевания, связанного с антигеном, но при этом нейтрализует антиген.
5. Антиген
[00174] Синтетическое антитело направлено на данный антиген или его фрагмент или вариант. Антиген может представлять собой
последовательность нуклеиновой кислоты, аминокислотную
последовательность или комбинацию. Последовательность
нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Аминокислотная последовательность может представлять собой белок, пептид, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
[00175] В некоторых вариантах реализации антиген является собственным антигеном. В одном варианте реализации антиген является НА вируса гриппа. В одном варианте реализации антиген является шаровидной головкой НА вируса гриппа. В одном варианте реализации антиген является поддоменом слияния НА вируса гриппа.
а. Чужеродные антигены
[00176] В некоторых вариантах реализации антиген является чужеродным. Чужеродный антиген представляет собой любое несобственное вещество (т. е. имеет происхождение за пределами организма субъекта), которое при внесении в организм способно стимулировать иммунный ответ.
(1) Вирусные антигены
[00177] Чужеродный антиген может представлять собой вирусный антиген, его фрагмент или его вариант.
[00178] Вирусный антиген может включать антиген, полученный из вируса гриппа. Антигены гриппа представляю антигены, способные вызывать иммунный ответ у млекопитающего против одного или более серотипов гриппа. Антиген может содержать полноразмерный продукт трансляции НАО, субъединицу НА1, субъединицу НА2, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Гемагглютининовый антиген гриппа может быть получен из нескольких штаммов гриппа А серотипа HI, серотипа Н2, гибридной последовательности, полученной из разных наборов из нескольких штаммов гриппа А серотипа HI, или получен из нескольких штаммов гриппа В. Гемагглютининовый антиген гриппа может быть получен из гриппа В.
[00179] Антиген гриппа также может содержать по меньшей мере один антигенный эпитоп, который может быть эффективным против конкретных иммуногенов гриппа, против которых можно индуцировать иммунный ответ. Антиген может обеспечивать полный
репертуар антигенных участков и эпитопов, присутствующих в интактном вирусе гриппа. Антиген может быть получен из последовательностей гемагглютининового антигена из множества штаммов вируса гриппа А одного серотипа, например, множества штаммов вируса гриппа А серотипа HI или серотипа Н2. Антиген может представлять собой гибридную последовательность гемагглютининового антигена, полученную при комбинации двух разных последовательностей гемагглютининового антигена или их частей. Каждая из двух разных последовательностей гемагглютининового антигена может быть получена из отличного набора множества штаммов вируса гриппа А одного серотипа, например, множества штаммов вируса гриппа А серотипа HI. Антиген может представлять собой последовательность гемагглютининового антигена, полученную из последовательностей гемагглютининового антигена из множества штаммов вируса гриппа В.
[00180] В некоторых вариантах реализации антиген гриппа может представлять собой антиген HI НА, Н2 НА, НЗ НА, Н5 НА или ВНА.
Ь. Собственные антигены
[00181] В некоторых вариантах реализации антиген является собственным антигеном. Собственный антиген может быть составляющей частью организма субъекта, которая способна стимулировать иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации собственный антиген не провоцирует иммунный ответ, если субъект не находится в состоянии заболевания, например, аутоиммунного заболевания.
[00182] Собственные антигены могут включать, но не ограничиваются этим, цитокины, антитела против вирусов, таких как перечисленные выше, включая ВИЧ и Денге, антигены, влияющие на прогрессирование или развитие рака, и рецепторы клеточной поверхности или трансмембранные белки.
6. Вспомогательные вещества и другие компоненты композиции
[00183] Композиция может дополнительно содержать
фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может представлять собой функциональные молекулы, такие как молекулы
базовых растворов, носителей или разбавителей. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может представлять собой облегчающий трансфекцию агент, который может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИМКОМ), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные облегчающие трансфекцию агенты.
[00184] Облегчающий трансфекцию агент представляет собой полианион, поликатион, включая поли-Ъ-глутамат (LGS), или липид. Облегчающий трансфекцию агент представляет собой поли-Ъ-глутамат, а поли-Ъ-глутамат может присутствовать в композиции в концентрации менее б мг/мл. Облегчающий трансфекцию агент, который также может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИМКОМ), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновую кислоту, также можно использовать для введения в сочетании с композицией. Композиция также может содержать облегчающий трансфекцию агент, такой как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосом (смотрите, например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные облегчающие трансфекцию агенты. Облегчающий трансфекцию агент представляет собой полианион, поликатион, включая поли-Ъ-глутамат (LGS), или липид. Концентрация трансфекционного агента в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[00185] Композиция может дополнительно содержать генетический вспомогательный агент, как описано в заявке на патент США № 021,579, поданной 1 апреля 1994 г., содержание которой в полном объеме включено путем ссылки.
[00186] Композиция может содержать ДНК в количестве от около 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от около 1 микрограмма до около 10 миллиграммов; или предпочтительно от около 0,1 микрограмма до около 10 миллиграммов; или более предпочтительно от около 1 миллиграмма до около 2 миллиграммов. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит от около 5 нанограмм до около 1000 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 10 нанограмм до около 8 00 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 0,1 до около 500 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 1 до около 350 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиция может содержать от около 25 до около 250 микрограмм, от около 100 до около 200 микрограмм, от около 1 нанограмма до 100 миллиграмм; от около 1 микрограмма до около 10 миллиграмм; от около 0,1 микрограмма до около 10 миллиграмм; от около 1 миллиграмма до около 2 миллиграмм, от около 5 нанограмм до около 1000 микрограмм, от около 10 нанограмм до около 800 микрограмм, от около 0,1 до около 500 микрограмм, от около 1 до около 350 микрограмм, от около 25 до около 250 микрограмм, от около 100 до около 2 00 микрограмм ДНК.
[00187] Композиция может быть приготовлена в соответствии с применяемым режимом введения. Инъекционная фармацевтическая композиция может быть стерильной, апирогенной и не содержать частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Добавки для придания изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Композиция может содержать сосудосуживающий агент. Изотонические растворы могут включать фосфатно-солевой буфер. Композиция может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение длительных периодов времени, включая LGS или поликатионы или полианионы.
7. Способ получения синтетического антитела
[00188] Настоящее изобретение также относится к способу генерации синтетического антитела. Этот способ может включать введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, применяя способ доставки, более подробно описанный ниже. Соответственно, синтетическое антитело генерируется в организме субъекта или in vivo после введения субъекту композиции.
[00189] Этот способ также может включать внесение композиции в одну или более клеток и, следовательно, синтетическое антитело может генерироваться или вырабатываться в одной или более клетках. Этот способ также может включать внесение композиции в одну или более тканей, например, но без ограничений, кожу и мышцы, и, следовательно, синтетическое антитело может генерироваться или вырабатываться в одной или более тканях.
8. Способ определения или скрининга антитела
[00190] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения или скрининга описанного выше антитела, которое вступает в реакцию или связывается с описанным выше антигеном. В способе определения или скрининга антитела можно использовать антиген с применением методик, известных специалистам в данной области техники, для определения или скрининга антитела. Такие методики включают, но не ограничиваются этим, выбор антитела из библиотеки (например, фагового дисплея) и иммунизацию животного с последующим выделением и/или очисткой антитела.
9. Способ доставки композиции
[00191] Настоящее изобретение также относится к способу доставки композиции нуждающемуся в этом субъекту. Способ доставки может включать введение композиции субъекту. Введение может включать, но не ограничивается этим, инъекцию ДНК с in vivo электропорацией или без нее, опосредованную липосомами доставку и облегчаемую наночастицами доставку.
[00192] Млекопитающее, получающее доставку композиции, может представлять собой человека, примата, отличного от человека примата, корову, крупный рогатый скот, овцу, козу, антилопу, бизона, буйвола, бизона, быков, оленя, ежей, слонов,
ламу, альпака, мышей, крыс и кур.
[00193] Композицию можно вводить разными путями, включая
пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный,
ректальный, трансмукозальный, местный, ингаляционный,
буккальный, интраплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и внутрисуставной или их комбинацию. В случае ветеринарного применения композицию можно вводить в подходящем приемлемом составе в соответствии с общепринятой ветеринарной практикой. Ветеринар может без труда определить режим дозирования и путь введения, которые наиболее подходит для конкретного животного. Композицию можно вводить с помощью традиционных шприцов, безыгольных устройств для инъекций, "пушек для бомбардировки микрочастицами" или других физических способов, таких как электропорация ("ЭП") , "гидродинамический способ" или ультразвук.
а. Электропорация
[00194] Введение композиции посредством электропорации можно осуществлять, используя устройства для электропорации, которые могут быть выполнены с возможностью подачи в необходимые ткани млекопитающего импульса энергии, эффективного для стимуляции образования обратимых пор в клеточных мембранах, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток, аналогичный предварительно заданному пользователем входному току. Устройство для электропорации может содержать электропорационный компонент и комплект электродов или комплект рукояток. Электропорационный компонент может содержать и включать один или более различных элементов устройств для электропорации, включая: контроллер, генератор формы тока, тестер импеданса, устройство регистрации формы сигнала, элемент ввода, элемент отчета о состоянии, порт связи, компонент памяти, источник питания и переключатель питания. Электропорацию можно осуществлять, используя устройство для in vivo электропорации, например, систему CELLECTRA ЕР (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) или электропоратор Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) , чтобы облегчить трансфекцию клеток
плазмидой.
[00195] Электропорационный компонент может функционировать как один элемент устройств для электропорации, а другие элементы являются отдельными элементами (или компонентами), связанными с электропорационным компонентом. Электропорационный компонент может функционировать как более чем один элемент устройств для электропорации, который может быть связан с другими элементами устройств для электропорации, отдельными от электропорационного компонента. Элементы и устройства для электропорации, являющиеся частями одного электромеханического или механического устройства, могут не ограничиваться, так как эти элементы могут функционировать как одно устройство или как отдельные элементы, связанные друг с другом. Электропорационный компонент может подавать импульс энергии, который обеспечивает постоянный ток в необходимой ткани, и содержит механизм обратной связи. Комплект электродов может включать матрицу из электродов, содержащую некоторое количество пространственно упорядоченных электродов, при этом комплект электродов получает импульс энергии от электропорационного компонента и доставляет его в необходимую ткань через электроды. По меньшей мере один из некоторого количества электродов является нейтральным во время подачи импульса энергии и измеряет импеданс в необходимой ткани и передает значение импеданса на электропорационный компонент. Механизм обратной связи может получать измеренное значение импеданса и может корректировать импульс энергии, подаваемый электропорационным компонентом, для поддержания постоянного тока.
[00196] Некоторое количество электродов могут подавать импульс энергии на децентрализованную схему. Некоторое количество электродов могут подавать импульс энергии на децентрализованную схему посредством управления электродами согласно программируемой последовательности, а программируемая последовательность вводится пользователем в электропорационный компонент. Программируемая последовательность может включать некоторое количество импульсов, подаваемых в последовательности, причем каждый импульс из некоторого количества импульсов
подается по меньшей мере двумя активными электродами с одним нейтральным электродом, который измеряет импеданс, а следующий импульс из некоторого количества импульсов подается другим из по меньшей мере двух активных электродов с одним нейтральным электродом, который измеряет импеданс.
[00197] Механизм обратной связи может осуществляться аппаратным или программным обеспечением. Механизм обратной связи может осуществляться аналоговым замкнутым контуром. Обратная связь происходит каждые 50 мкс, 2 0 мкс, 10 мкс или 1 мкс, но предпочтительно представляет собой обратную связь в режиме реального времени или мгновенную (т. е. по существу мгновенную по определению доступными методами определения времени ответа). Нейтральный электрод может измерять значение импеданса в необходимой ткани и передавать значение импеданса на механизм обратной связи, а механизм обратной связи в ответ на значение импеданса корректирует импульс энергии для поддержания значения постоянного тока, аналогичного предварительно заданному току. Механизм обратной связи может поддерживать постоянный ток непрерывно и мгновенно во время подачи импульса энергии.
[00198] Примеры устройств для электропорации и способов электропорации, которые могут облегчить доставку композиции согласно настоящему изобретению, включают описанные в патенте США № 7245963 авторства Draghia-Akli, с соавт., публикации патента США 2005/0052630, поданной Smith, с соавт., содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Другие устройства для электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для облегчения доставки композиции, включают предложенные в одновременно находящейся на рассмотрении заявке одних заявителей на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., которая заявляет приоритет согласно 35 USC 119(e) предварительных заявок США № 60/852,149, поданной 17 октября 2006 г., и 60/978,982, поданной 10 октября 2007 г., которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
[00199] В патенте США № 7245963 авторства Draghia-Akli, с соавт. описаны модульные системы электродов и их применение для
облегчения внесения биомолекул в клетки выбранной ткани в организме или растении. Модульные системы электродов могут содержать некоторое количество игольчатых электродов; гиподермическую иглу; электрический соединитель, который обеспечивает проводящее соединение программируемого импульсного контроллера постоянного тока с некоторым количеством игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может брать некоторое количество игольчатых электродов, которые находятся на опорной конструкции и плотно вставлять их в выбранную ткань в организме или растении. Затем происходит доставка биомолекул в выбранную ткань через гиподермическую иглу. Происходит активация программируемого импульсного контроллера постоянного тока и применение электрического импульса постоянного тока к некоторому количеству игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает внесение биомолекулы в клетку между некоторым количеством электродов. Полное содержание патента США № 7245963 включено в данный документ посредством ссылки.
[00200] В публикации патента США 2005/0052630, поданной Smith, с соавт., описано устройство для электропорации, которое можно использовать, чтобы эффективным образом облегчать внесение биомолекул в клетки выбранной ткани в организме или растении. Устройство для электропорации содержит электрокинетическое устройство ("ЭКУ устройство") , чья работа определяется программным или встроенным программным обеспечением. ЭКУ устройство создает ряд программируемых профилей импульсов постоянного тока между электродами в матрице под управлением пользователем и на основании введенных параметров импульсов и позволяет хранить и получать данные по форме тока. Устройство для электропорации также содержит сменный электродный диск, содержащий матрицу из игольчатых электродов, центральный инъекционный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Полное содержание публикации патента США 2005/0052630 включено в данный документ посредством ссылки.
[00201] Электродные матрицы и способы, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/0052630, можно
адаптировать для глубокого проникновения не только в ткани, такие как мышцы, но также в другие ткани или органы. Вследствие конфигурации электродной матрицы инъекционная игла (для доставки биомолекулы по выбору) также полностью вставляется в целевой орган, а инъекция проводится перпендикулярно целевой ткани в области, которая заранее намечена электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/005263, предпочтительно имеют длину 20 мм и калибр 21.
[00202] Кроме того, подразумевается, что в некоторых вариантах реализации, которые включают устройства для электропорации и их применение, используются устройства для электропорации, описанные в следующих патентах: патент США 5273525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6,110,161, выданный 2 9 августа 2000 г., 62 61281, выданный 17 июля 2 001 г., и 6958060, выданный 25 октября 2005 г., и патент США 6939862, выданный б сентября 2 0 05 г. Кроме того, в данном документе предусмотрено применение материалов из патентов, относящихся к предмету обсуждения, таких как патент США 6697 669, выданный 24 февраля 2004 г., который относится к доставке ДНК с помощью различных устройств, и патент США 7 328064, выданный 5 февраля 2 008, относящийся к способу инъекции ДНК. Вышеуказанные патенты в полном объеме включены посредством ссылки.
10. Способ лечения
[00203] Также в данном документе предложен способ лечения, защиты от и/или предотвращения заболевания у нуждающегося в этом субъекта путем генерации синтетического антитела в организме субъекта. Способ может включать введение композиции субъекту. Введение композиции субъекту можно осуществлять, используя описанный выше способ доставки.
[00204] В некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ лечения, защиты от и/или предотвращения инфекции гриппа или заболевания или расстройства, связанного с инфекцией гриппа. Например, в одном варианте реализации способ обеспечивает лечение, защиту от и/или предотвращение гриппа А. В одном варианте реализации способ обеспечивает лечение, защиту от и/или предотвращение респираторной инфекции. Примеры заболеваний
или расстройств, которые модно лечить или предотвращать путем введения композиции по изобретению, включают, без ограничений, вирусную или бактериальную пневмонию, обезвоживание, ушные инфекции и инфекции пазух.
[00205] После генерации синтетического антитела в организме субъекта синтетическое антитело может связываться или вступать в реакцию с антигеном. Такое связывание может нейтрализовать антиген, блокировать распознавание антигена другой молекулой, например, белком или нуклеиновой кислотой, и вызывать или индуцировать иммунный ответ на антиген, осуществляя, таким образом, лечение, защиту от и/или предотвращение заболевания, связанного с антигеном, у субъекта.
[00206] Доза композиции может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента/кг массы тела/время и может составлять от 2 0 мкг до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Композицию можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 сутки. Число доз композиции для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10.
[00207] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, проиллюстрированных следующими неограничивающими примерами.
11. Примеры
[00208] Настоящее изобретение дополнительно
проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя в них и указаны предпочтительные варианты реализации изобретения, приведены исключительно в иллюстративных целях. Из приведенного выше обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники может установить важные характеристики этого изобретения и, не выходя за рамки его сущности и объема, может осуществлять различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его под различные потребности и условия. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным в данном документе станут очевидны для специалистов в данной области техники из вышеприведенного описания. Также подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы
изобретения.
Пример 1
[00209] Представленные в данном документе исследования
демонстрируют генерацию функциональных "ДНК-моноклональных
антител" (DMAb) к IL-6 и к CD126 посредством внутримышечной
электропорации плазмидной ДНК. Кодон-оптимизированные
последовательности ДНК вариабельной области из моноклональных антител к IL-6 и антител к CD12 6 синтезировали в константном домене человеческого IgGl. Мышам линии BALB/c вводили плазмидную ДНК, кодирующую антитело (фигура 1). Это исследование поддерживает DMAb как альтернативу существующим биологическим препаратам и обеспечивает новый способ дальнейшего определения роли сигнализации IL-6 in vivo при патологических состояниях иммунной системы.
[00210] Далее будут описаны материалы и способы
Последовательности и клонирование ДНК антител
[00211] Ранее были опубликованы клональные
последовательности антител к вирусу гриппа 5J8 и FI6 (Krause et al., 2011, J virol 85 (20) :10905-8; Corti et al. , 2011, Science 333(6044):850-6). Последовательности ДНК вариабельной области были кодон-оптимизированы и синтезированы в константной области основной цепи IgGlK человека. Конструкции клонировали в модифицированную плазмиду экспрессии млекопитающих pVax-1. Сайт расщепления пептидом фурина/2А был включен для разделения пептидов тяжелых и легких цепей. (Фигура 1). Трансфекции
[00212] Клетки 293Т в количестве приблизительно 1х106 трансфицировали с использованием 0,5 мкг плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции GeneJammer (Agilent Technologies). Клеточные супернатанты и лизаты собирали через 4 8 часов.
Электропорация DMAb
[00213] 100-300 мкг плазмидной ДНК вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу бедра с последующим проведением электропорации с помощью устройства CELLECTRA(r) ЗР (Inovio
Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) , как было описано ранее (Flingai et al. , 2015, Sci Rep 29 (5) : 12616; Muthumani et al. , 2013, Hum Vaccin Immunother 9(10) :2253-62) . ELISA и вестерн-блот
[00214] Человеческий IgGlK связывался с антителами к Fc-фрагментам человека, и его обнаруживали с помощью антитела к легкой цепи каппа, конъюгированного с HRP (Bethyl), с проведением количественной оценки в сравнении со стандартным антителом IgGlK человека. Связывание с рекомбинантным НА (Immune-Technologies) обнаруживали с помощью вторичного антитела к IgG человека, конъюгированного с HRP (Sigma-Aldrich). Были разработаны вестерн-блоты с конъюгированным антителом к IgG человека с детекцией при 800 нм (Licor).
[00215] Ниже описаны результаты экспериментов
Внутримышечная электропорация плазмидной ДНК, кодирующей антитело к вирусу гриппа, генерирует in vivo моноклональные антитела
[00216] Проводили оптимизацию кодонов аминокислотных
последовательностей вариабельной области VH и VL моноклональных
антител. Кодон-оптимизированную ДНК синтезировали с
последовательностями ДНК константных областей СН и CL
человеческого антитела IgGlK. Сконструированную
последовательность ДНК клонировали в модифицированный экспрессионный вектор pVax-1. Плазмидную конструкцию вводили внутримышечно путем инъекции с последующим проведением электропорации с помощью устройства CELLECTRA(r) (Inovio Pharmaceuticals). Измеряли показатели экспрессии и функции человеческого DMAb IgGl, полученного in vivo.
Конструкции DMAb содержат вариабельные области из опубликованных моноклональных антител к вирусу гриппа
[00217] Конструкции DMAb содержат вариабельные области из моноклональных антител к вирусу гриппа 5J8 (антитело 5J8 к НА) и FI6 (антитело FI6 к НА). FJ8 связывается со связывающим карманом на вариабельной области шаровидной головки и перекрестно реагирует с множеством вирусов гриппа A HI. FI6 связывается с
относительно консервативным поддоменем слияния и обеспечивает широкую нейтрализацию вирусов гриппа А из группы 1 и группы 2 (фигура 2).
Конструкции DMAb экспрессируются и секретируются из трансфицированных клеток 2 93Т
[00218] Проводили эксперименты для оценки экспрессии и секреции антител к 5J8 и FI6 к НА вируса гриппа, кодируемых конструкциями DMAb. Клетки НЕК 2 93Т трансфицировали плазмидной ДНК, несущей конструкции 5J8 или FI6. Пустая плазмида служила в качестве отрицательного контроля. Экспрессию человеческого IgGlK определяли с помощью количественного анализа ELISA, а также проводили вестерн-блот для выявления расщепления и экспрессии пептида с тяжелой и легкой цепью в супернатанте и лизате (фигуры ЗА-ЗВ) . Как показано на фигуре ЗВ, в супернатанте НЕК 293Т и лизате НЕК 2 93Т присутствовали антитело 5J8 к НА и антитело FI6 к НА, что демонстрирует способность конструкций DMAb индуцировать экспрессию и секрецию антитела 5J8 к НА и антитела FI6 к НА.
После внутримышечной электропорации ДНК достигаются устойчивые уровни ДНК-моноклональных антител в сыворотке
[00219] Проводили эксперименты для оценки того, индуцирует ли DMAb экспрессию антитела 5J8 к НА и антитела FI6 к НА in vivo. Мышам линии BALB/c вводили посредством инъекции плазмидную ДНК 5J8 или FI6 с последующим проведением внутримышечной электропорации. Через семь дней с помощью ELISA определяли уровни человеческого антитела IgGlK в сыворотке. Как показано на фигуре ЗА и фигуре ЗВ, после электропорации ДНК в мышцу в мышиной сыворотке продуцируются высокие уровни антитела 5J8 к НА и антитела FI6 к НА.
ДНК-моноклональные антитела, произведенные после
внутримышечной электропорации ДНК, сохраняют свою способность связываться с различными мишенями-антигенами НА
[00220] Проводили эксперименты для исследования
функциональности экспрессированного антитела FI6 к НА. Мышам линии BALB/c вводили посредством инъекции 300 мкг плазмидной ДНК
с последующим проведением внутримышечной электропорации. Через четыре недели с помощью ELISA определяли связывание DMAb с рекомбинантным антигеном гемагглютинина HI вируса гриппа А. Как показано на фигуре 5, экспрессированные антитела связываются с антигенами-мишенями А/Брисбан/59/2007 и А/Калифорния/07/2009.
[00221] Представленные в настоящем документе эксперименты
демонстрируют, что после внутримышечной электропорации
конструкции плазмидной ДНК, экспрессирующей кодон-
оптимизированные последовательности вариабельной области антитела, в мышиной сыворотке in vivo экспрессируются ДНК-моноклональные антитела (DMAb) 5J8 к НА и FI6 к НА в высоких концентрациях. Антитела, полученные из мышечных клеток in vivo, являются функциональными и связывающими in vitro. DMAb обеспечивают безопасную, экономически выгодную, практическую альтернативу препаратам из очищенных белковых моноклональных антител, нацеленных на НА вируса гриппа.
[00222] DMAb имеют несколько преимуществ по сравнению очищенным белковым mAb и вирусными векторами. По сравнению с белковым mAb, DMAb является относительно недорогим в производстве; термически стабильным; легко распространяемым; модифицируемым; а также индуцирует постоянную экспрессию без необходимости частого повторного введения. По сравнению с вирусными векторами, DMAb является безопасным и не интегрируемым; неиммуногенным; его можно доставлять повторно; для него нет уже существующих серологических характеристик; вызывает быструю экспрессию вскоре после введения. Мощная и стойкая экспрессия DMAb обеспечивает существенные преимущества для лечения хронических состояний с потенциальной необходимостью повторного введения препаратов, таких как рак и аутоиммунное заболевание. Недорогое производство и распространение ДНК-вектора обеспечивает повышенную доступность, особенно в развивающихся странах, в которых существует затяжная нужда. Понятно, что вышеприведенное подробное описание и сопроводительные примеры являются всего лишь иллюстративными, и их не следует воспринимать как ограничение объема изобретения, который определяется исключительно прилагаемой формулой
изобретения и ее эквивалентами. Пример 2
[00223] Представленные в данном документе исследования демонстрируют текущую разработку альтернативного подхода к пассивной вакцине, который обеспечивает доставку полноразмерных человеческих антитела с широким спектром нейтрализующего действия против вирусов гриппа А и В посредством электропорации синтетической плазмидной ДНК (DMAb) in vivo.
[00224] Далее будут описаны материалы и способы.
[00225] Последовательности человеческого антитела, специфичного к вирусу гриппа А или В, были генетически оптимизированы и клонированы в плазмиду pGXOOl. Каждое потенциальное антитело вводили мышам линии BALB/c путем внутримышечной инъекции с последующей электропорацией (В/М-ЭП). Отслеживали экспрессию антитела in vivo, и подтверждали функциональную активность по связыванию с НА и нейтрализации вируса. В разное время после В/М-ЭП мышей заражали летальными дозами подтипов HI или НЗ вирусов гриппа А или гриппа В, происходящих из двух линий соответственно. Инфицированных животных контролировали в отношении выживания и снижения массы тела
Количественная оценка IgG и связывание с белком НА [00226] Количество IgG в мышиной сыворотке определяли посредством ELISA. Анализ ELISA связывания с НА выполняли на очищенных рекомбинантных тримерных белках НА из различных подтипов вируса гриппа А и линий вируса гриппа В. Анализ микронейтрализации
[00227] Активность нейтрализации измеряли относительно группы вирусов гриппа с использованием клеток MDCK, при этом измеряли активность нейраминидазы аналогично описанию, приведенному в публикации Kallewaard et al, 2016.
Эффективность in vivo
[00228] Мышам линии Balb/c вводили внутримышечную инъекцию плазмид (-ы) DMAb с последующей немедленной электропорацией при помощи адаптивного устройства постоянного тока CELLECTRA ЗР (Inovio Pharmaceuticals). Через четыре дня мышей заражали
летальной дозой вируса гриппа А (А/Калифорния/7/2009 3 х LD50, 7:1 А/Пуэрто-Рико/8/34:А/Гонконг/8/б8 7xLD50) или через пять дней вирусом гриппа В (В/Малайзия/250б/2004 10 х LD50, В/Флорида/4/200б 7xLD50) . Для сравнения с IgG группам мышей за один день до заражения вводили ступенчато изменяющиеся концентрации очищенного mAb путем в/б инъекции. Образцы сыворотки собирали в день инфицирования. В течение 12 дней после инфицирования контролировали снижение массы тела и выживаемость. Мышей подвергали эвтаназии при 2 5%-ном снижении исходной массы тела.
[00229] Исследования на животных были одобрены и проводились в соответствии рекомендациями, предоставленными Управлением по содержанию и использованию лабораторных животных медицинского отдела армии США, а также компанией Medlmmune и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Пеннсильванского университета
[00230] Ниже описаны результаты экспериментов
Продуцируемые in vivo кодированные ДНК антитела (DMAb) экспрессируют функциональные mAb FluA и FluB
[00231] Количественная оценка DMAb (фигура 8) в сыворотке подтверждает экспрессию IgG и указывает, что белок является функциональным. Сыворотку брали через 5 дней после электропорации DMAb FluA и DMAb FluB (фигура 9) и оценивали на экспрессию человеческого IgG, активность связывания с различными белками НА и активность нейтрализации. Антитела в сыворотке, полученной от обеих групп животных, которым вводили FluA-DMAb и FluB-DMAb, продемонстрировали связывание с НА и активность нейтрализации вируса, схожие с таковыми у mAb, полученных in vitro при сравнимых концентрациях IgG, указывая, что DMAb, продуцируемые мышечными клетками, были экспрессированы и являлись функциональными in vivo (фигура 10).
DMAb, сконструированные из антител mAb к вирусу гриппа А и вирусу гриппа В, защищают от летальной инфекции вируса гриппа на том же уровне, что и очищенные mAb IgG.
[00232] В исследованиях заражения вирусом гриппа А введение FluA-DMAb значительно защищало мышей от летальной вирусной
инфекции по сравнению с нерелевантным контрольным DMAb и уменьшало снижение массы тела. DMTAb FluA защищает мышей от летальной инфекции вируса гриппа А на таких же уровнях, что и очищенный IgG FluA в дозе 0,3 мг/кг (фигура 11) . Аналогичным образом, когда мышам вводили FluB-DMAb после заражения летальной инфекцией вируса гриппа В, введение FluB-DMAb приводило к 100% выживанию в сравнении с заражением летальной инфекцией вируса гриппа В из любой линии. Аналогично, DMAb FluB защищает мышей от летальной инфекции вируса гриппа В на тех же уровнях, которые обеспечивает очищенный IgG FluB в дозе 1 мг/кг (фигура 12).
Комбинированная терапия DMAb FluA и FluB приводит к защите при заражении любым из типов вируса гриппа: А или В
[00233] При введении DMAb FluA и FluB в комбинации, они обеспечивают защиту от обоих типов инфекции гриппа А и В. Комбинированное введение DMAb FluA и DMAb FluB обеспечивает экспрессию в сыворотке IgG к вирусу гриппа А и IgG к вирусу гриппа В. Животные были защищены от летальной инфекции гриппа А или В (фигура 13).
[00234] В совокупности эти исследования демонстрируют, что DMAb, сконструированные из антител mAb к вирусу гриппа с широким спектром нейтрализующего действия, экспрессируют полностью функциональные антитела in vivo на достаточных уровнях для предотвращения летальной мышиной инфекции гриппа, вызванной вирусами гриппа А и В. Эти результаты показывают, что доставка синтетической ДНК полноразмерных mAb IgG может быть осуществимой стратегией платформы универсальной иммунопрофилактики гриппа и может быть адаптирована к другим инфекционным патогенным микроорганизмам, для которых были определены характеристики перекрестнореактивных mAb.
Пример 3
[00235] Представленные в настоящем документе исследования демонстрируют создание синтетической плазмидной ДНК, кодирующей два новых и перекрестно защищающих моноклональных антитела с широким спектром действия. In vivo электропорация конструкций моноклональных антител (DMAb), кодированных плазмидной ДНК, обеспечивает создание в мышиной сыворотке устойчивых уровней
функциональных антител, направленных против вируса гриппа А и В. Животные, которым вводили DMAb к вирусу гриппа А, выжили при заражениях летальным вирусом гриппа А из группы 1 и группы 2, а животные, которым вводили DMAb к вирусу гриппа В, были защищены от заболеваемости и смертности в результате заражения летальным вирусом гриппа В линий Виктория и Ямагата. В дополнение к универсальному перекрестному защитному потенциалу этой методики, когда два DMAb вводили совместно, животные были успешно защищены от тяжелых инфекций гриппа А и В. Кроме того, доставка DMAb к вирусу гриппа давала немедленную защиту при заражении вирусом гриппа, но не подавляла защитный иммунитет хозяина против гриппа. DMAb, продуцируемое in vivo, и белковое моноклональное антитело, введенное внутрибрюшинно, обеспечивали аналогичную защиту от заражения летальным гриппом, представляя DMAb в качестве практической альтернативы для иммунопрофилактики тяжелой инфекции гриппа.
[00236] Далее будут описаны материалы и способы. Конструкции моноклональных антител, кодированных ДНК [00237] Моноклональные антитела выделяли с использованием методики, аналогичной той, что была описана ранее (Kallewaard et al., 2016, 166:596-608; Pappas et al., 2014, Nature 516:418-22; Traggiai et al. , 2004, Nat Med 10:871-5) . Перекрестно-реактивное моноклональное антитело к вирусу гриппа A (FluA) выделяли на основе перекрестно-реактивного связывания с белками Н5 и Н7 НА (Kallewaard et al., 2016, 166:596-608), а моноклональное антитело к вирусу гриппа В (FluB) выделяли на основе активности нейтрализации в отношении отдельных линий вируса гриппа В. Последовательности различных генов были выделены из перекрестно-реактивных клонов с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), клонированы и дополнительно модифицированы, чтобы восстановить несущественные изменения аминокислот каркаса не из зародышевой линии. Полноразмерный человеческий IgGlK временно экспрессировали в клетках СНО и очищали для использования в исследованиях in vivo. Создавали конструкции моноклональных антител (DMAb), кодированных
плазмидной ДНК, как описано ранее (Muthumani et al., 2016, J
Infect Dis 214:369-78; Flingai et al. , 2015, Sci Rep 5:12616).
Конструкции DM7Ab кодировали полностью человеческие
моноклональные антитела IgGlK DM7Ab FluA и DMAb FluB. Аминокислотные последовательности антител были оптимизированы кодонами ДНК и РНК-оптимизированы для экспрессии в организме человека/мыши, и полученные ДНК-трансгены были синтезированы о!е novo (Genscript, Picastaway, NJ, USA). Синтетические трансгены клонировали с ограничением в модифицированный экспрессирующий вектор млекопитающего pVaxl (Invitrogen) под управлением немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Были добавлены лидерные последовательности тяжелых и легких цепей IgE для клеточной переработки и секреции. В начальных исследованиях (фигуры 14-17) трансгены состояли из последовательностей тяжелых и легких цепей антител, разделенных последовательностью сайта расщепления пептидом фурина/пикорнавируса-2А (Р2А), что приводило к экспрессии пептидов тяжелой и легкой цепей из одиночной плазмиды в форме цис. В более поздних исследованиях с совместным введением DMAb FluA и FluB (фигура 18), две конструкции DMAb FluA, отдельно экспрессирующие пептиды с тяжелой цепью или легкой цепью FluA, смешивали для экспрессии пептидов с тяжелой и легкой цепью FluA их отдельных плазмид в форме транс.
Трансфекция и вестерн-блот
[00238] Клетки 293Т человека (АТСС) хранили в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (Invitrogen), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). За один день до трансфекции клетки высевали в количестве 0,25х106 клеток на лунку в 12-луночный планшет и трансфицировали с использованием 0,5 мкг плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции GeneJammer (Agilent Technologies). Через сорок восемь часов собирали супернатанты и лизировали адгезивные клетки с использованием 1 х раствора буфера для лизиса клеток (Cell Signaling) со смесью ингибиторов протеазы (Roche Boehringer Mannheim). Приблизительно 50 мкг общего белка супернаанта/лизата
и 10 мкг белка IgG загружали вместе с предварительно окрашенным белковым стандартом SeeBlue Plus2 (Thermo Fisher Scientific) в сборные 4-12% бис-трис-гели (Invitrogen) и переносили на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану Immobilon-FL (EMD Millipore) с использованием системы для сухого блоттинга iBlot 2 (Thermo Fisher Scientific). Пептиды с тяжелой и легкой цепью идентифицировали с использованием козьего антитела против человеческого IgG (H+L) с меткой IRDye 800CW (LI-COR Biosciences) (1: 10 ООО). Флуоресцентные блоты сканировали с помощью системы Odyssey CLx (LI-COR Biosciences). Количественный анализ ELISA
[00239] Как показано на фигуре 14 и фигуре 19, для количественной оценки общего IgGlK человека в клеточных лизатах, супернатантах клеток и сыворотке мыши, 9б-луночные планшеты MaxiSorp (Nunc) покрывали в течение ночи при 4 °С козьим антителом против Гс-фрагмента человеческого IgG в концентрации 10 мкг/мл (Bethyl Laboratories). Планшеты блокировали 10% ФБС в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Образцы разводили в 1х ФСБ+0,1% твин2о (ФСБТ) и добавляли в планшеты на 1 час. Стандартную кривую строили с использованием очищенного человеческого IgGlK (Bethyl Laboratories). Планшеты окрашивали конъюгированным с HRP вторичным антителом козы к человеческой легкой цепи каппа (Bethyl Laboratories) (1: 20 000) в течение 1 часа, проявляли с использованием субстрата SigmaFast 0PD (Sigma-Aldrich), и останавливали реакцию 2 н. раствором серной кислоты. Абсорбцию при 450 нм измеряли на спектрофотометре для считывания планшетов Synergy2 (Biotek).
[00240] Количественное определение человеческого IgG в исследованиях с заражением мышей проводили с использованием 384-луночных черных планшетов MaxiSorp (Nalgene Nunc), покрытых в течение ночи при температуре 4 °С козьим антителом против человеческого IgG (H+L) в концентрации 10 мкг/мл (Pierce) . Планшеты блокировали казеиновым блокирующим реактивом (Thermo), и серийно разводили образцы сыворотки и стандартные кривые (10 мкг/мл целой молекулы человеческого IgG ChromPure) (Jackson
Labs) . Планшеты промывали и окрашивали вторичным антителом осла против человеческого IgG, конъюгированным с HRP (Jackson) (1: 4000), и визуализировали с помощью реагента SuperSignal ELISA Pico (Thermo). Люминесценцию измеряли с использованием прибора Perkin Elmer Envision.
[00241] Количественную оценку специфического человеческого IgG к вирусу гриппа А или В в мышиной сыворотке выполняли так, как описано выше, с использованием в качестве реагента для покрытия 3 мкг/мл белка НА вируса А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1) или 3 мкг/мл белка НА вируса В/Флорида/4/200б (Ямагата). Очищенный белковый IgG FluA или FluB использовали в качестве стандартов для анализов на вирус гриппа А и В соответственно. ELISA связывания
[00242] Рекомбинантные гемагглютининовые (НА) белки экспрессировали и очищали, как описано ранее (Benjamin et al. , 2014, J Virol 88:6743-50) . Анализы связывания ELISA проводили с использованием 384-луночных черных планшетов MaxiSorp (Nunc) , покрытых 5 мкг/мл очищенного белка НА из вируса А/Перт/1б/2009
(H3N2), А/Гонконг/69/1997 (H9N2) и В/Брисбан/60/2008 (Виктория); или 3 мкг/мл очищенного белка НА из вируса А/Калифорния/07/2009
(H1N1), А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1), А/Нидерланды/2 0 03 (H7N7),
А/Миссури/2 00 6 (H2N3) и В/Флорида/4/2006 (Ямагата). Планшеты для
ELISA блокировали казеином (Thermo Scientific), и серийно
разведенные антитела инкубировали в течение одного часа при
комнатной температуре. Связанные антитела обнаруживали с
использованием конъюгированного с пероксидазой мышиного антитела
против человеческого IgG (KPL) (1: 10 000) с последующим
проявлением с помощью раствора ТМВ (KPL) и измерением абсорбции
при ОП 4 50 нм. Реакционную способность мышиной сыворотки к НА
устанавливали, как описано выше, за исключением использования
вторичного козьего антитела против мышиного IgG,
конъюгированного с пероксидазой (DAKO) (1: 5000).
Линии вирусов, нейтрализация in vitro и ингибирование гемагглютинации
[00243] Штаммы вируса гриппа дикого типа получали из Центров по лечению и профилактике заболеваний США или
приобретали в Американской коллекции тканевых культур. Реассортантный вирус НЗ, продуцируемый с помощью реверсивной генетики (гА/НК/68), содержал НА НЗ из вируса А/Гонконг/8/68
(H3N2), а остальные 7 сегментов гена из вируса А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1); причем НА этого вируса также содержал мутацию N165S, которая усиливает патогенез у мыши (Jin et al. , 2003, Virology 306:18-24) . Все вирусы размножали в куриных яйцах с эмбрионами, а титры вируса определяли по средней 50% инфекционной дозе в тканевой культуре (TCID50) на миллилитр. Анализ микронейтрализации выполняли так, как описано ранее
(Benjamin et al. , 2014, J Virol 88:6743-50). Коротко, 60 TCID50 вируса/лунка добавляли к трехкратным серийным разведениям сыворотки или очищенного антитела FluB, разведенного в интактной сыворотке, в 3 8 4-луночный планшет в полную среду MEM, содержащую 0,75 мкг/мл Ы-тозил-Ъ-фенилаланилхлорметилкетона (ТРСК) трипсина
(Worthington), с двумя повторами лунок. После инкубации в течение одного часа при 33°С с 5% С02, в планшет добавляли 2х104 клеток почек собак Мадин - Дарби (MDCK)/лунка. Планшеты инкубировали при 33 °С и 5% С02 в течение приблизительно 4 0 часов, и измеряли активность нейраминидазы (NA) посредством добавления в каждую лунку флуоресцентно-меченого субстрата метилумбеллиферил-Ы-ацетилнейраминовой кислоты (MU-NANA) (Sigma)
при температуре 37°С в течение 1 часа. Репликацию вируса, представленную активностью NA, определяли количественно путем считывания флуоресценции с использованием следующих настроек: возбуждение при 355 нм, эмиссия при 4 60 нм, 10 вспышек на лунку. Анализ ингибирования гемагглютинации проводили с сывороткой, собранной в день 21 после инфицирования, как описано выше. Внутримышечная электропорация ДНК
[00244] За тридцать минут до электропорации ДНК самкам мышей линии BALB/C и CAnN.Cq-Foxnlnu/Crl (Charles River) предварительно вводили в каждую область доставки внутримышечную инъекцию 12 единиц (30 мкл) фермента гиалуронидазы (Sigma-Aldrich). В начальных исследованиях (фигуры 14-17) в переднюю большеберцовую (ПБ) и/или четырехглавую (ЧГ) мышцу бедра путем
в/м инъекции вводили 100 мкг (30 мкл) плазмиды DM7Ab FluA или FluB; мыши получали 100 мкг ДНК в одну область (ПБ), 2 00 мкг ДНК в две области (правая ПБ+левая ПБ) или 300 мкг ДНК в три области (правая ПБ+левая ПБ+ЧГ). В более поздних исследованиях совместного введения (фигура 18), мышам вводили обе конструкции DMAb FluA и FluB. Дизайн конструкции FluA был модифицирован для экспрессии пептидов с тяжелой цепью и легкой цепью в отдельных плазмидах, создавая эквивалентные уровни IgG FluA в сыворотке из меньшего количества мест инъекции, чем при дизайне с одной плазмидой. В этом случае 100 мкг смеси 1: 1 (мае.: мае.) плазмиды с тяжелой цепью и легкой цепью FluA доставляли в две области (правая ПБ+правая ЧГ) , а 200 мкг плазмиды FluB доставляли в две области (левая ПБ+левая ЧГ) , как и раньше. Внутримышечную электропорацию (В/М-ЭП) проводили немедленно после каждой инъекции ДНК при помощи адаптивного устройства постоянного тока CELLECTRA ЗР (Inovio Pharmaceuticals). Заражение летальной инфекцией вируса гриппа
[00245] Мышам линии BALB/c в возрасте шесть-восемь недель (Harlan Laboratories) за 4-5 дней перед инфицированием вводили DMAb FluA, DMAb FluB или нерелевантное контрольное DMAb (DVSF-3, описано ранее в (Flingai et al., 2015, Sci Rep 5:12616)) посредством В/М-ЭП. За один день до заражения отдельным группам мышей вводили внутрибрюшинно (в/б) белковое моноклональное антитело IgG с аминокислотной последовательностью, идентичной той, которая кодируется плазмидой DMAb, в дозах от 0,03 мг/кг до 1,0 мг/кг. Контрольным мышам вводили в/б неспецифический белковый IgG R347. Мышей инфицировали интраназально с использованием 3 х LD50 вируса А/Калифорния/07/2009 (H1N1) (9,5х104 ТСЮзо/мышь) , 7 х LD50 вируса гА/НК/68 (НЗ) (1,2х105 ТСЮзо/мышь) , 10 х LD50 В/Малайзия/2506/2004 (Виктория) (3,6х104 ТСЮзо/мышь) или 7 х LD50 В/Флорида/4/2006 (Ямагата) (7,0х104 ТС1О50/мышь) . У всех мышей ежедневно в течение 12 дней контролировали снижение массы тела и выживание (мышей со снижение массы тела > 25% подвергали эвтаназии). В день инфицирования брали кровь для оценки количества человеческого
IgG в сыворотке. Для оценки вирусной нагрузки в легких через пять дней после инфицирования подвергали эвтаназии дополнительных мышей. Легкие полностью гомогенизировали в 10% (мае./об.) стерильной среде L15 (Invitrogen) и титровали на клетках MDCK для определения TCID50/rpaMM ткани. В исследованиях повторного инфицирования гомологичным вирусом образцы крови были взяты у всех выживших мышей через 21 день после первичного инфицирования, чтобы подтвердить выведение и отсутствие человеческого IgG. Через двадцать восемь дней после первичного инфицирования мышей подвергали повторному заражению летальной дозой штамма вируса, идентичного использованному при первичном инфицировании.
[0024 6] Содержание животных и эксперименты на них были утверждены и проведены в соответствии с рекомендациями, предоставленными Национальным институтом здоровья (НИЗ) США, Управлением по содержанию и использованию лабораторных животных медицинского отдела армии США, Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию медицинской школы Перельмана Пеннсильванского университета и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию компании Medlmmune. Все исследования на мышах проводили в соответствии с рекомендациями Ассоциации по аккредитации и уходу за лабораторными животными. (AAALAC) и в сертифицированной этой организацией лаборатории. Анализы и статистика
[00247] Стандартные кривые и графики были подготовлены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism б. Показатели ЕС50 и IC50 рассчитывали с использованием нелинейной регрессии log (обратного разведения сыворотки) в зависимости от ответа. Данные выживаемости выражали с использованием кривых выживаемости Каплана - Мейера с р-значениями, рассчитанными с использованием логрангового критерия (критерия Мантеля - Кокса).
[00248] Ниже описаны результаты экспериментов.
Моноклональные антитела (DMAb) против вирусов гриппа, кодированные ДНК, экспрессировали in vitro и in vivo
[0024 9] Моноклональные антитела с широким спектром
нейтрализующего действия против вируса гриппа A (FluA) и вируса гриппа В (FluB) выделяли из человеческих В-клеток памяти, как описано ранее (Pappas et al. , 2014, Nature, 516: 418-22; Traggiai et al. , 2004, Nat Med, 10: 871-875). Моноклональное антитело FluA тесно связано с недавно опубликованным моноклональным антителом с широким спектром нейтрализующего действия, которое демонстрирует широкий диапазон перекрестной реактивности к НА из-за связывания со стеблем НА, и способно нейтрализовать вирусы гриппа А как из группы 1, так и из группы 2 (средний показатель IC50 2,56 мкг/мл, данные не показаны)
(Kallewaard et al. , 2016, Cell, 6743-50) . Моноклональное антитело FluB идентифицировали и отбирали на основании его способности эффективно нейтрализовать вирусы гриппа В, принадлежащие к обеим линиям: Виктория и Ямагата (средний показатель 1С50 0,64 мкг/мл, данные не показаны). Это антитело связывается с консервативной областью шаровидной головки НА вируса гриппа В и может ингибировать вирусную гемагглютинацию эритроцитов. Чтобы проверить практичность доставки DMAb для предотвращения тяжелой инфекции гриппа, был синтезирован и клонирован в плазмиду экспрессии млекопитающих новый синтетический ДНК-трансген, кодирующий либо человеческий IgG FluA, либо FluB. Были выполнены многочисленные модификации для улучшения экспрессии DMAb, включая оптимизацию кодонов ДНК, оптимизацию РНК и композицию плазмидной ДНК (фигура 19)
(Muthumani et al., 2016, J Infect Dis 214:369-78; Flingai et
al. , 2015, Sci Rep 5:12616) . Количественный анализ ELISA
человеческого IgG в лизатах и супернатантах клеток почек
эмбриона человека 293Т, трансфицированных конструкциями DMAb,
подтвердил внутриклеточную экспрессию и внеклеточную секрецию
собранных антител FluA и FluB (фигура 14А) . Вестерн-блот
человеческого IgG также продемонстрировал, что в
трансфицированных супернатантах и лизатах клеток 2 93Т присутствовали тяжелая цепь и легкая цепь антитела (фигура 14В).
[00250] Плазмидную ДНК DMAb FluA или FluB вводили бестимусным голым мышам линии CAnN. Cq-Foxnlnu/Crl посредством внутримышечной инъекции в дозах от 100 мкг до 300 мкг, используя
внутримышечную электропорацию (В/М-ЭП) с составом с гиалуронидазой, чтобы улучшить доставку и экспрессию DMAb (фигура 19) . Пиковые уровни экспрессии в сыворотке голых мышей достигали среднего показателя 10,0 мкг/мл (±2,6 СОС) и 31,8 мкг/мл (+8,1 СОС) соответственно для DMAb FluA и DMAb FluB, причем значимая экспрессия человеческого IgG наблюдалась через 10 недель после доставки DMAb (фигуры 14С и 14D) и дольше.
[00251] Затем определяли экспрессию DMAb к вирусу гриппа у иммунокомпетентных мышей линии BALB/c (фигуры 14Е и 14F) , установленной модели заражения гриппом. Мышам линии BALB/c вводили от 100 мкг до 300 мкг плазмидной ДНК посредством В/М-ЭП. Конструкция DMAb FluA генерировала умеренные уровни человеческого IgG в сыворотке мышей линии BALB/c по результатам измерения через пять дней после введения (для 300 мкг плазмиды средний показатель составил 1,8 мкг/мл+0,3 СОС) . Подобно тому, что наблюдалось у голых мышей, через пять дней после введения экспрессия DMAb FluB была более устойчивой, чем экспрессия DMAb FluA (для 200 мкг средний показатель составил 5,4 мкг/мл±0, б СОС, для 300 мкг средний показатель составил 10 мкг/мл+1,9 СОС) . В отличие от стабильной экспрессии, наблюдаемой у голых мышей, уровни DMAb в сыворотке у мышей BALB/c через 10 дней после введения не определялись, вероятно, из-за адаптивных ответов мыши на IgG человека против экспрессированного DMAb. В совокупности эти данные четко продемонстрировали, что после введения плазмидных конструкций человеческий IgG DMAb продуцировался на значительных уровнях in vivo.
Экспрессируемые in vivo DMAb к вирусу гриппа являются функционально активными и демонстрируют широкую перекрестную реактивность
[00252] Для исследования функциональности DMAb,
сгенерированных in vivo, анализировали сыворотку, взятую у мышей BALB/c, которым вводили DMAb, на активность связывания in vitro. DMAb FluA из сыворотки, связывались с полным набором антигенов НА из группы 1 и группы 2 вирусов гриппа А, которые, как известно, заражают людей, включая рекомбинантный тримерный НА из
сезонных (HI, НЗ) и потенциально пандемических (Н2, Н5, Нб, Н7, Н9) изолятов вируса гриппа (фигура 15А), а также рекомбинантный мономерный НА НЮ (фигура 20) . DMAb FluB в мышиной сыворотке связывались с НА вируса гриппа В из двух линий вируса - Виктория и Ямагата (фигура 15В) . Полумаксимальные эффективные концентрации (ЕС50) обратных разведений сыворотки отражают более высокую связывающую активность в сыворотке мышей, получавших 300 мкг плазмидной ДНК в сравнении со 100 мкг, что отражает увеличение экспрессии DMAb у животных, получивших большую дозу плазмидной ДНК.
[00253] Возможности эффективной нейтрализации in vitro
исходного моноклонального антитела FluB позволили провести
исследование активности нейтрализации, тогда как эффективность
моноклонального антитела FluA не позволяла дифференциацию в
сравнении с неспецифическим влиянием мышиной сыворотки в анализе
микронейтрализации. Сыворотка от мышей, которые получали
плазмидные конструкции DMAb FluB, в клеточных анализах in vitro
эффективно нейтрализует обе линии вируса гриппа В: Ямагата и
Виктория (фигура 15С), причем модель реакционной способности
является аналогичной той, что наблюдается в анализах связывания.
После нормализации концентрации человеческого IgG в каждом
образце, рассчитанная полумаксимальная ингибирующая концентрация
(IC50) У мышей, которым вводили плазмиду DMAb FluB (0,015 мкг/мл
для вируса В/Флорида/4/200б и 0,030 мкг/мл для вируса
В/Малайзия/250б/2004), была схожей с таковой для очищенного
белкового моноклонального антитела FluB (0,011 мкг/мл для вируса
В/Флорида/4/200б и 0,047 мкг/мл для вируса
В/Малайзия/250б/2004), в пределах общей ошибки для этого клеточного анализа. Присутствие НА-связывающего человеческого IgG у мышей, которым вводили плазмидные конструкции DMAb FluA и FluB, и титры нейтрализации у мышей, которым вводили плазмидные конструкции DMAb FluB, подтвердили экспрессию функционального DMAb in vivo и продемонстрировали выдающуюся широкую перекрестную реактивность этих новых антител FluA и FluB к вирусу гриппа.
DMAb к вирусу гриппа защищают мышей при заражении летальным
вирусом гриппа разнообразных типов А и В
[00254] Чтобы оценить практичность методики in vivo, животных, которым вводили DMAb, оценивали в модели заражения летальной инфекцией вируса гриппа. Животным вводили 300 мкг DMAb FluA или нерелевантного контрольного DMAb (DVSF-3 (Flingai et al. , 2015, Sci Rep 5:12616)) посредством В/М-ЭП, а затем, через четыре дня после электропорации, заражали летальной дозой вируса А/Калифорния/7/2009 H1N1 (А/СА/09 HI) (фигура 16). Для непосредственного сравнения in vivo DMAb и белкового IgG готовили серию разведений белкового моноклонального антитела FluA и вводили в/б отдельным группам мышей за один день до инфицирования. Образцы сыворотки, полученные от всех животных во время инфекции, показали, что введение DMAb FluA приводило к сходным средним концентрациям человеческого IgG и активности связывания с НА в сравнении с теми, что наблюдались у мышей, получавших 0,3 мг/кг белкового IgG FluA (фигура 16А и фигура 21) . При заражении летальной дозой вируса А/Калифорния/7/2009 H1N1 (А/СА/0 9 HI) введение DMAb FluA обеспечивало преимущество 90% выживания, тогда как у всех животных, которым вводили контрольное DMAb к вирусу денге (DVSF-3), развивалась инфекция (фигура 16В) . В соответствии с уровнями экспрессии IgG человека введение DMAb FluA и 0,3 мг/кг очищенного белка FluA демонстрировало аналогичную защиту от летальности и вызванного гриппом снижения массы тела (фигура 16С).
[00255] Расширяя эти результаты с использованием другого клинически значимого вируса гриппа А, было проведено аналогичное исследование с использованием летального заражения вирусом гА/Гонконг/8/68 H3N1 (гА/НК/68 НЗ), проведенного через пять дней после введения DMAb. Опять же, во время инфекции уровни антител человека показали сходные концентрации при введении DMAb FluA и 0,3 мг/кг белкового IgG FluA (фигура 16D). После летального заражения вирусом гА/НК/68 НЗ животные, которым вводили DMAb FluA, имели значительное преимущество выживания по сравнению с теми, которым вводили контрольные DMAb (показатель выживаемости для DMAb FluA составляет 8 0% в сравнении с показателем выживаемости 0% для контрольного DMAb) (фигура 16Е) . Эти
результаты показывают, что DMAb FluA предотвращает летальную инфекцию вируса гриппа А с клинически релевантными подтипами HI и НЗ, известными как вызывающие заболевание у людей, и наглядно демонстрируют аналогичную in vivo функцию антитела FluA, полученного посредством использования платформы DMAb, в сравнении с очищенным антителом FluA, введенным в/б.
[00256] Для дальнейшего изучения профилактического потенциала методики DMAb были проведены аналогичные исследования летального заражения с целью оценки активности DMAb FluB. В этих исследованиях мышам вводили 2 00 мкг плазмидной конструкции DMAb FluB или контрольного DMAb посредством В/М-ЭП, а через пять дней заражали летальной дозой вируса из линии Виктория (В/Малайзия/2506/2004 (В/Ма1/04)) или Ямагата (В/Флорида/4/2006 (B/Fla/Об) ) (фигура 17) . Опять же, для прямого сравнения DMAb с очищенным белком, отдельным группам за день до инфицирования вводили в/б очищенное моноклональное антитело FluB. Количественная оценка человеческого IgG, присутствующего в мышиной сыворотке во время заражения вирусом В/Ма1/04, продемонстрировала, что DMAb FluB приводит к достижению сходных средних концентраций человеческого IgG и активности связывания НА, что и наблюдаемая у животных, которым вводили в/б 1 мг/кг белка FluB (фигура 17А и фигура 21) . Примечательно, что 100% мышей, которым вводили DMAb FluB, выжили при заражении летальным вирусом гриппа В линий Виктория и Ямагата, тогда как у всех животных, которым вводили неспецифические контрольные DMAb, к 8-му дню развивались оба вида инфекции (фигуры 17В и 17Е) . Кроме того, мыши, защищенные от заболеваемости, связанной с гриппом В, и пролеченные животные демонстрировали незначительную потерю массы тела (фигуры 17С и 17F) . Кроме того, мыши, которым вводили FluB, демонстрировали значительно более низкие вирусные нагрузки в легких, чем контрольные мыши (фигура 22). Выживаемость, снижение массы тела, вирусные нагрузки в легких и активность связывания in vitro в сыворотке мышей, которым вводили DMAb FluB, были близки к тем же параметрам у мышей, получавших 1 мг/кг очищенного белкового IgG FluB, снова подтверждая функциональную эквивалентность in vivo DMAb и очищенных белковых
моноклональных антител.
Совместное введение DMAb FluA и FluB защищает мышей при заражении вирусом гриппа А и В и при повторном заражении гомологичным вирусом
[00257] Вирусы гриппа А и В циркулируют совместно, и поэтому комплексная иммунопрофилактическая стратегия против сезонной инфекции должна быть нацелена на оба типа гриппа. Чтобы проверить способность платформы DMAb выполнять эту задачу, мышам BALB/c вводили совместно DMAb FluA и DMAb FluB. За пять дней до заражения мышам вводили DMAb FluB, а на следующий день вводили FluA DMAb. В группе сравнения животным за день до инфицирования вводили в/б смесь очищенных белковых моноклональных антител FluA и FluB. Мышей заражали летальной дозой вируса А/СА/0 9 HI или B/Fla/Об. Образцы сыворотки во время инфекции показали, что у животных, которым вводили DMAb, средний уровень общего человеческого IgG составил 3 мкг/мл (фигура 18А) . Специфические в отношении вируса гриппа А и В анализы ELISA показали, что оба DMAb демонстрировали уровни экспрессии, аналогичные тем, которые наблюдались ранее (фигура 18В), причем сывороточные уровни DMAb FluA приблизительно соответствовали сывороточным уровням при в/б введении 0,3 мг/кг белкового IgG FluA, а сывороточные уровни DMAb FluB приблизительно соответствовали сывороточным уровням при в/б введении 1 мг/кг белкового IgG FluB. В исследованиях с заражением все мыши, получавшие DMAb FluA и FluB, были защищены от летальной инфекции, тогда как у 90% и 100% мышей, получавших контрольный DMAb, развивались инфекции гриппа А и В, соответственно (фигуры 18С и 18D) . Опять же, введение DMAb и доставка белка IgG приводили к аналогичным уровням защиты, что очевидно как по уровню выживания, так и по уровню снижения массы тела (фигура 23).
[00258] Через двадцать один день после первичной инфекции в сыворотке выживших мышей линии BALB/c уровни человеческого IgG были необнаруживаемыми (данные не показаны), что указывает на то, что DMAb и рекомбинантный белок больше не присутствовали. Ингибирование гемагглютинации сыворотки (ИГС) и связывание мышиных антител к НА штамма инфекционного гриппа подтвердило,
что у мышей был установлен иммунный ответ хозяина на инфекцию (фигура 24). Мыши, которым вводили DMAb, смогли установить иммунные ответы хозяина против вируса в той же степени, что и животные, которым вводили очищенный IgG.
[00259] Существенно, что присутствие FluA и FluB in vivo не препятствовало защитным иммунным ответам хозяина против вируса, использованного для заражения. Через двадцать восемь дней после первичной инфекции всех выживших мышей (включая одну контрольную мышь DMAb, которая выжила после первичной инфекции вируса А/СА/09 HI) повторно заражали летальной дозой гомологичного вируса гриппа, чтобы подтвердить, что уровень иммунного ответа мыши-хозяина был защитным. Все ранее зараженные мыши выжили после летального повторного заражения гомологичным вирусом без существенной потери массы тела, тогда как 80-90% мышей соответствующего возраста, не инфицированных ранее и не получавших лечение, не выжили (фигура 18Е, фигура 18F и фигура 23) . Эти результаты демонстрируют наличие защитных ответов против гриппа у хозяина, которые развиваются в присутствии защитных уровней антител FluA и FluB, независимо от того, экспрессируются ли они in vivo, как DMAb, или вводятся в виде белковых моноклональных антител, показывая, что DMAb не вызывают антагонизм в отношении друг друга или в отношении иммунного ответа хозяина на грипп. ОБСУЖДЕНИЕ
[00260] Сезонная инфекция гриппа приводит к ежегодным средним уровням прямых медицинских расходов 10 миллиардов долларов США и экономическому бремени 8 0 миллиардов долларов США только в Соединенных Штатах (Molinari et al. , 2007, Vaccine 25:5086-96) . Несмотря на наличие противогриппозных вакцин и противовирусных лекарственных средств, большие подгруппы населения подвержены осложнениям, вызванным сезонной инфекцией гриппа. Почти 90% смертей, связанных с сезонным гриппом в Соединенных Штатах, происходят у взрослых людей в возрасте 65 лет и старше (Frieden et al. , 2010, MMWR 59), у населения, у которого оценочная эффективность вакцины в годы значительного антигенного дрейфа достигает всего 36%. Кроме постоянной
опасности из-за сезонной инфекции, вспышки пандемического гриппа угрожают опередить разработку вакцины. Поэтому инновационные универсальные вмешательства, направленные против гриппозной инфекции, являются насущной потребностью.
[00261] Большинство текущих усилий по созданию универсальной вакцины против гриппа были сфокусированы на разработке рекомбинантных антигенов, которые могут служить иммуногенами для стимуляции созревания антител с широкой перекрестной защитой от вируса гриппа (Yassine et al., 2015, Nat Med 21:1065-70; Impagliazzo et al. , 2015, Science 349:1301-6; Bommakanti et al., 2010, PNAS 107:13701-6). Здесь было предложено обойти иммунизацию и создать иммунитет с перекрестной защитой непосредственно in vivo. После внутримышечной электропорации конструкций плазмидной ДНК, кодирующих два антитела, нацеленных на НА, в мышиной сыворотке вырабатывались функциональные антитела с широкой перекрестной защитой от вируса гриппа, приводя к значительной защите при заражении летальной инфекцией вируса гриппа А и вируса гриппа В.
[00262] В продаже доступно множество белковых моноклональных антител для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и других хронических состояний; но, учитывая затраты на введение биологических препаратов и ограниченный период полужизни, только одно белковое моноклональное антитело широко используется профилактически против мишени-инфекционного заболевания (Group, 1998, Pediatrics 102:531-7). Методика DMAb является заслуживающим внимание альтернативным видом доставки, поскольку DMAb, продуцируемое в мышечных клетках in vivo, и очищенные белковые моноклональные антитела, изготовленные in vitro, обеспечивают одинаковый уровень защиты от летальной инфекции гриппа у мышей. Плазмидная ДНК не имеет ограничений, связанных с уже существующими серологическими антителами к векторам, и платформа DMAb может использоваться повторно для доставки дополнительных антител к вирусу гриппа для борьбы с уклонением вируса или антител, нацеленных на совершенно другие патогенные микроорганизмы (Muthumani et al. , 2016, J Infect Dis 214:369-78; Flingai et al. , 2015, Sci Rep 5:12616) . Плазмидная
ДНК также обладает небольшим риском геномной интеграции, и аналогичные конструкции плазмид продемонстрировали безопасность ДНК-вакцины в клинических исследованиях с участием людей.
[00263] Введение моноклональных антител на основе плазмидной ДНК является возможной альтернативой белковой терапии на каждом этапе цепочки поставок. В производстве DMAb являются недорогими по сравнению с белковыми моноклональными антителами (и вирусными векторами), поскольку репликация ДНК не требует культивирования клеток млекопитающих. В распространении потребителям холодовая цепь не требуется, что является огромным практическим преимуществом для развивающихся стран. ДНК легко масштабировать, она стабильна при хранении, что особенно важно в условиях ограниченных ресурсов. Потенциал долгосрочной экспрессии DMAb может обойти необходимость частых инъекций рекомбинантных антител, дополняя новые технологии удлинения периода полужизни антител. При доставке устойчивая экспрессия DMAb может обойти необходимость частых инъекций антител, тогда как белковые моноклональные антитела обычно демонстрируют короткие периоды полужизни in vivo; сильная экспрессия DMAb наблюдалась в течение нескольких месяцев после введения DMAb голым мышам. Очень важно, что мыши, которым вводили DMAb, пережили повторную инфекцию гомологичным вирусом, что указывает на то, что иммунные реакции хозяина на инфекцию гриппа остаются неизменными после введения DMAb FluA и DMAb FluB. Разумеется, что эти DMAb, специфичные для вируса гриппа, могут использоваться для усиления кампании по вакцинации, обеспечивая немедленную профилактику от тяжелой инфекции гриппа, при одновременном обеспечении адекватного зрелого иммунного ответа, вызванного вакциной. DMAb также может обеспечить жизненно важный вариант для людей с сильно ослабленным иммунитетом, неспособных устанавливать ответы в виде антител. С возможностью доставки эффективного функционального антитела с использованием плазмидной ДНК методика DMAb обеспечивает исключительно широкую платформу терапевтического потенциала. Пример 4
[00264] Здесь представлены идентификаторы
существование различных изменений и модификаций описанных вариантов реализации. Такие изменения и модификации, включая, без ограничения, относящиеся к химическим структурам, заместителям, производным, промежуточным соединениям, синтезу, композициям, составам или способам применения изобретения, можно осуществлять, не отступая от его сущности и объема.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Weiner, David Elliott, Sarah Patel, Ami Yan, Jian
<120> ДНК-моноклональные антитела, нацеленные на вирус гриппа <130> 206108-0061-00-WO.606334 <150> 62/332 381
<151> 05.05.2016
<150> 62/376 162
<151> 17.08.2016 <160> 16
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1 <211> 735
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9211
<400> 1
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val
35 40 45
Ser Ser Asn Asn Ala Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
65 70 75 80
Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr
85 90 95
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly His Ile Thr Val Phe Gly
115 120 125
Val Asn Val Asp Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
130
135
140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385
390
395
400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg
465 470 475 480
Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
485 490 495
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln
500 505 510
Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Asp Ile
515 520 525
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
530 535 540
Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr Leu His
545 550 555 560
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
565 570 575
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
580 585 590
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
595 600 605
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr
610 615 620
Lys Val Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
625 630 635 640
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
645 650 655
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
660 665 670
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
675 680 685
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys
690 695 700
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
705 710 715 720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730 735
<210> 2
<211> 745
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9212
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe
35 40 45
Leu Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Asn Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Asp Gly Pro Tyr Ser Asp Asp Phe Arg
115 120 125
Ser Gly Tyr Ala Ala Arg Tyr Arg Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp Gly
130 135 140
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
165 170 175
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
180 185 190
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
195 200 205
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
210 215 220
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
225 230 235 240
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
485 490 495
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
500 505 510
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
515 520 525
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser
530 535 540
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
545 550 555 560
Ile Ser Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
565 570 575
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
580 585 590
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
595 600 605
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn
610 615 620
Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr
625 630 635 640
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
645 650 655
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
660 665 670
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
675 680 685
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
705 710 715 720
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
725 730 735
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 740 745
<210> 3
<211> 736
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX222hc
<400> 3
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Asp Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Lys
65 70 75 80
Pro Ser Leu Glu Ser Arg Leu Gly Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Phe Val Ser Ala Ala Asp Thr Ala Val
100
105
110
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Val Arg Ser Gly Tyr Pro Asp Thr Ala Tyr
115 120 125
Tyr Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355
360
365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
465 470 475 480
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
485 490 495
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser
500 505 510
Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Ser Tyr Val Leu Thr Gln
515 520 525
Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu Thr Ala Arg Ile Ser Cys
530 535 540
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Thr Lys Val Leu His Trp Tyr Gln Gln Thr
545 550 555 560
Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro
565 570 575
Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala
580 585 590
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
595 600 605
Cys Gln Val Trp Asp Ile Ser Thr Asp Gln Ala Val Phe Gly Gly Gly
610 615 620
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr
625 630 635 640
Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu
645 650 655
Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp
660 665 670
Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro
675 680 685
Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu
690 695 700
Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr
705 710 715 720
His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
725 730 735
<210> 4
<211> 744
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX222lc
<400> 4
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Ala Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu
115 120 125
Trp Leu Ser Gln Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
145 150 155 160
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
165 170 175
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
195 200 205
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
210 215 220
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
225 230 235 240
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
340 345 350
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Gly
465 470 475 480
Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
485 490 495
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Gln Thr
500 505 510
Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Asp
515 520 525
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu
530 535 540
Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Phe Asn Tyr
545 550 555 560
Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
565 570 575
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg
580 585 590
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
595 600 605
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Arg
610 615 620
Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val
625 630 635 640
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
645 650 655
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
660 665 670
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
675 680 685
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
690 695 700
Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
705 710 715 720
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
725 730 735
477
Белок
Искусственная последовательность
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 740
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> pGX9223 <400> 5
Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 25 30
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu 1 5
Thr His Ala Gln Val Gln Leu 20
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr 35 40
Ser Ser Asn Asn Ala Val Trp Asn 50 55
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr
Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr
85 90 95
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly His Ile Thr Val Phe Gly
115 120 125
Val Asn Val Asp Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 6
<211> 229
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9231
<400> 6
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
100 105 110
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys 225
<210> 7
<211> 477
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9310
<400> 7
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val
Ser Ser Asn Asn Ala Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
65 70 75 80
Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr
85 90 95
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly His Ile Thr Val Phe Gly
115 120 125
Val Asn Val Asp Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 8
<211> 229
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9311
<400> 8
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
100 105 110
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys 225
<210> 9
<211> 2211
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9211 <400> 9
atggattgga cttggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac tcacgctcag 60
gtgcagctgc agcagtctgg acccggactg gtgaagcctt cacagactct gagcctgacc 120
tgcgccatct ccggcgactc tgtgagctcc aacaatgctg tctggaactg gattagacag 180
tccccatctc gggggctgga atggctggga cgaacatact ataggagcaa atggtacaat 240
gactatgctg agagtgtgaa gtcacgaatc acaattaacc cagatactag caagaatcag 300
ttctccctgc agctgaactc tgtgacaccc gaggatactg cagtctacta ttgcgcacgc 360
tccggacaca tcaccgtgtt cggagtcaat gtggacgcct ttgatatgtg gggacagggg 420
accacagtca cagtgtctag tgcaagtact aaaggcccat cagtgtttcc cctggcccct 480
tcaagcaaga gtacctcagg cggaacagcc gctctgggat gtctggtgaa ggactacttc 540
cctgagccag tcaccgtgag ctggaactcc ggagctctga ccagcggggt gcatacattt 600
cctgcagtcc tgcagtcctc tggcctgtac agcctgagtt cagtggtcac cgtgccaagc 660
tcctctctgg gaacacagac ttatatctgc aacgtgaatc acaaaccatc caatacaaag 720
gtcgacaaga aagtggaacc caaatcttgt gataagaccc atacatgccc tccctgtcca 780
gcacctgagc tgctgggcgg cccatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacaca 840
ctgatgatta gccggactcc cgaagtgacc tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggac 900
cccgaagtga agttcaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc caagaccaaa 960
cctagggagg aacagtacaa cagcacttat agagtcgtgt ccgtcctgac cgtgctgcac 1020
caggattggc tgaacgggaa ggagtataag tgcaaagtgt ccaacaaggc cctgccagct 1080
cccatcgaga agaccatttc taaggccaaa ggccagccac gggaacccca ggtgtacaca 1140
ctgcctccaa gccgcgacga gctgaccaaa aaccaggtga gcctgacatg tctggtcaag 1200
ggattctatc ctagtgatat cgctgtggag tgggaatcta atgggcagcc agaaaacaat 1260
tacaagacta cccctcccgt gctggactct gatggaagtt tctttctgta ttcaaaactg 1320
accgtggaca agagccgctg gcagcagggg aacgtcttta gctgctccgt gatgcacgag 1380
gccctgcaca atcattacac tcagaaatct ctgagtctgt cacccggaaa acgaggacga 1440
aagaggagaa gcggctccgg agctaccaac ttctccctgc tgaagcaggc aggggatgtg 1500
gaggaaaatc ctggcccaat ggtcctgcag acacaggtgt ttatctctct gctgctgtgg 1560
attagtggcg cttacggaga catccagatg actcagtctc ctagttcact gtctgcaagt 1620
gtcggcgatc gcgtgactat tacctgtcga acctcacaga gcctgagctc ctacctgcat 1680
tggtatcagc agaagcctgg gaaagcacca aagctgctga tctatgcagc ctctagtctg 1740
cagtccggcg tgccctctag gttctccggg tctggcagtg gaactgactt tacactgact 1800
atttcaagcc tgcagcctga ggatttcgct acctactatt gccagcagag cagaactttt 1860
gggcagggca ccaaagtcga aatcaagaca gtggctgcac catccgtctt catttttcca 1920
ccctctgacg agcagctgaa gagtggaact gcctcagtgg tgtgcctgct gaacaatttc 1980
tacccccggg aagccaaagt ccagtggaag gtggataacg ctctgcagtc aggcaatagc 2040
caggagtccg tgacagaaca ggactctaaa gatagtactt attcactgag caacaccctg 2100
acactgagca aggcagacta cgagaagcac aaagtgtatg cctgcgaagt gacccaccag 2160
gggctgagca gtccagtgac caaatctttc aacaggggag aatgttgata a 2211
<210> 10 <211> 2241 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9212 <400> 10
atggactgga cttggaggat tctgtttctg gtggccgccg caactggcac tcatgccgag 60
gtgcagctgg tggaatcagg gggaggactg gtgaagcctg gcggatcact gcgactgagc 120
tgcgcagctt ccggactgac cttcctgaac gcttggatga gctgggtgcg acaggcacca 180
gggaaaggcc tggaatgggt cgggcgcatc aagagcaata cagacggcgg aaccacagat 240
tacgcagccc ccgtgaaagg caggttcacc atttctcggg acgatagtaa gaacacactg 300
tatctgcaga tgagctccct gaaaaccgag gacacagccg tgtactattg cactaccgat 360
ggcccctaca gcgacgattt ccgctccgga tatgctgcac ggtaccgcta ttttgggatg 420
gacgtgtggg gacaggggac aactgtcaca gtgtctagtg catctactaa gggacctagc 480
gtgttcccac tggccccctc aagcaaatca actagcggag ggaccgccgc tctgggatgt 540
ctggtgaagg attacttccc cgagcctgtc accgtgagct ggaactccgg ggccctgacc 600
tccggagtgc acacatttcc tgctgtcctg cagtcctctg ggctgtactc tctgagttca 660
gtggtcacag tgccaagctc ctctctgggc actcagacct atatctgcaa cgtgaatcac 720
aaacctagca atactaaggt cgacaagaaa gtggaaccaa aaagctgtga taagacacat 780
acttgccctc cctgtccagc tccagagctg ctgggcggac catccgtgtt cctgtttcca 840
cccaagccca aagacaccct gatgatttcc cggacaccag aagtgacttg cgtggtcgtg 900
gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtgaag ttcaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg 960
cataatgcca agacaaaacc cagggaggaa cagtacaact caacttatag agtcgtgagc 1020
gtcctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtataagtg caaagtgagc 1080
aacaaggccc tgcctgctcc aatcgagaag actattagca aggctaaagg acagcctcgg 1140
gaaccacagg tgtacaccct gcctccatcc cgcgacgagc tgaccaaaaa ccaggtgtct 1200
ctgacatgtc tggtcaaggg cttctatccc tctgatatcg ccgtggagtg ggaaagtaat 1260
ggacagcctg aaaacaatta caagaccaca ccccctgtgc tggactctga tggcagtttc 1320
tttctgtata gtaaactgac cgtggacaag tcaagatggc agcagggaaa cgtgttttcc 1380
tgctctgtca tgcatgaggc cctgcacaat cattacaccc agaagagtct gtcactgagc 1440
ccaggaaaac gagggaggaa gaggagatcc ggctctggag ccacaaactt ctccctgctg 1500
aagcaggctg gagacgtgga ggaaaatccc gggcctatgg tgctgcagac ccaggtcttt 1560
atctccctgc tgctgtggat ttctggcgct tacggagata tccagatgac acagtctccc 1620
agttcagtca gtgcatcagt gggcgaccgc gtcaccatca catgtcgagc atcacaggat 1680
attagcacct ggctggcctg gtaccagcag aagcccggaa aagctcctaa gctgctgatc 1740
tatgcagcca gctccctgca gtccggagtg ccctctaggt tcagcgggtc cggctctgga 1800
acagacttta ctctgaccat ttctagtctg cagcctgagg atttcgcaac ttactattgc 1860
cagcaggcca acagcttccc acccactttt gggcagggca ccaaactgga aatcaagact 1920
gtggctgcac ctagcgtctt catttttcct ccatccgacg agcagctgaa gagtggcacc 1980
gcctcagtgg tgtgcctgct gaacaacttc tacccaagag aagcaaaagt gcagtggaag 2040
gtcgataacg ccctgcagtc aggcaatagc caggagtccg tgacagaaca ggactctaag 2100
gatagtactt atagtctgtc aaatacactg actctgagca aagctgacta cgagaagcat 2160
aaagtgtatg catgcgaggt cactcaccag ggactgtctt cacccgtcac caaatctttc 2220
aatagaggag aatgctgata a 2241
<210> 11 <211> 2214 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX222hc <400> 11
atggactgga catggagaat cctgttcctg gtcgccgccg ctactgggac tcacgcagaa 60
gtgcagctgg tcgaatcagg gcctgggctg gtgaagccct cagacatcct gagcctgacc 120
tgcgccgtgt ctggctacag tatcagctcc aactactatt ggggatggat tcggcagccc 180
cctggcaagg gactggaatg gatcgggtcc atctaccact caggcagcac ctactataaa 240
ccttcactgg agagccgcct gggaatttcc gtggacacat ctaagaatca gttcagcctg 300
aaactgtcct ttgtctctgc cgctgatact gcagtgtact attgcgcccg acatgtcagg 360
tccggctacc cagacaccgc ttactatttt gataagtggg ggcagggcac cctggtcaca 420
gtgtctagtg ctagcaccaa gggcccctcc gtgttccctc tggcaccatc aagcaaatcc 480
acatctggcg gaactgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc agagcccgtc 540
acagtgagtt ggaactcagg cgcactgact tctggagtcc acacctttcc cgccgtgctg 600
cagtcctctg gcctgtacag cctgagttca gtggtcacag tgcctagctc ctctctggga 660
actcagacct atatctgcaa cgtgaatcac aagccctcaa atactaaagt cgacaagaaa 720
gtggaaccta agtcttgtga taaaacacat acttgcccac catgtcctgc accagagctg 780
ctgggaggac caagcgtgtt cctgtttcct ccaaagccca aagacaccct gatgatctcc 840
agaacccctg aagtgacatg tgtggtcgtg gacgtctctc acgaggaccc cgaagtcaag 900
tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcta agacaaaacc ccgcgaggaa 960
cagtacaact caacctatcg agtcgtgagc gtcctgacag tgctgcacca ggactggctg 1020
aacggaaagg agtataagtg caaagtgagc aataaggcac tgcccgcccc tatcgagaaa 1080
actatttcca aggctaaagg gcagcccagg gaacctcagg tgtacaccct gcccccttct 1140
agagacgagc tgacaaagaa ccaggtcagt ctgacttgtc tggtgaaagg attttatcca 1200
agtgatatcg cagtggagtg ggaatcaaat gggcagcccg aaaacaatta caagaccaca 1260
ccacccgtgc tggacagcga tggcagcttc ttcctgtatt ccaagctgac cgtggacaaa 1320
tctcggtggc agcaggggaa cgtcttcagt tgctcagtga tgcacgaggc cctgcacaat 1380
cattacaccc agaagagcct gtccctgtct ccaggcaagc ggggacgcaa aaggagaagt 1440
ggatcagggg ccacaaactt ttccctgctg aaacaggctg gagatgtgga ggaaaatcca 1500
gggcccatgg tcctgcagac tcaggtgttc atcagcctgc tgctgtggat ttctggggcc 1560
tacggcagtt atgtgctgac acagcctcca agcgtctccg tggctcctgg cgaaactgca 1620
cgaatctcct gtggagggaa caatattggg actaaggtgc tgcattggta ccagcagacc 1680
ccaggacagg ctccagtgct ggtcgtgtat gacgatagtg acagaccttc aggcatcccc 1740
gagcggttct ctggaagtaa ctcagggaat accgccacac tgactatttc ccgcgtcgaa 1800
gtgggcgacg aagctgatta ctattgccaa gtgtgggaca tctctaccga tcaggccgtc 1860
ttcggcggag ggactaagct gaccgtgctg ggccagccca aagctgcacc ttccgtgaca 1920
ctgtttcccc ctagttcaga ggaactgcag gctaacaagg caaccctggt gtgtctgatt 1980
agcgacttct acccaggagc agtcacagtg gcatggaagg ctgatagctc ccctgtcaaa 2040
gccggcgtgg aaactaccac accatctaag cagagtaaca acaagtacgc cgcttctagt 2100
tatctgagcc tgacacctga gcagtggaag tcccacagga gctattcctg ccaagtgact 2160
catgagggca gtactgtcga aaaaaccgtg gccccaacag agtgtagctg ataa 2214
<210> 12
<211> 2238
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX222lc <400> 12
atggactgga cttggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactgggac acacgctcag 60 gtgcagctgg tcgagagtgg ggggggagtg gtccagccag ggcgatctct gaggctgagt 120
tgcgccgctt caggcttcac cttcagcact tacgcaatgc actgggtgcg gcaggctcca 180
ggaaagggac tggagtgggt cgccgtgatc tcttacgacg ctaactataa gtactatgca 240
gatagtgtga aaggcagatt caccattagc cgggacaact ccaagaatac actgtacctg 300
cagatgaatt ccctgcgagc agaagacacc gccgtgtact attgcgccaa agattctcag 360
ctgcgcagtc tgctgtattt cgagtggctg tctcaggggt actttgacta ttggggccag 420
ggaaccctgg tcacagtgag ctccgccagt accaagggcc catcagtgtt tcctctggct 480
ccatctagta aatctacaag tggcggaact gcagccctgg gctgtctggt gaaggattac 540
ttcccagagc ccgtcacagt gtcctggaac tctggagctc tgacttccgg ggtgcatacc 600
tttcctgcag tcctgcagtc aagcgggctg tactctctgt cctctgtggt caccgtgcca 660
agttcaagcc tgggcactca gacctatatc tgcaacgtga atcacaagcc ttccaataca 720
aaagtcgaca agaaagtgga accaaagtct tgtgataaaa cacatacttg ccccccttgt 780
cctgctccag agctgctggg aggaccaagc gtgttcctgt ttccacccaa gcccaaagac 840
accctgatga ttagcaggac cccagaagtg acatgtgtgg tcgtggacgt cagccacgag 900
gaccccgaag tgaagttcaa ctggtacgtg gatggcgtcg aggtgcataa tgccaagaca 960
aaacctaggg aggaacagta caacagcact tatagagtcg tgtccgtcct gaccgtgctg 1020
caccaggact ggctgaacgg aaaggagtat aagtgcaaag tgtccaataa ggccctgccc 1080
gctcctatcg agaaaaccat ttctaaggct aaagggcagc cccgggaacc tcaggtgtac 1140
acactgcctc caagccgcga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtc 1200
aaaggcttct atcccagtga tatcgccgtg gagtgggaat caaatggaca gcctgaaaac 1260
aattacaaga ccacaccccc tgtgctggac agtgatggct cattctttct gtattcaaag 1320
ctgaccgtgg acaaaagccg gtggcagcag ggaaacgtct tttcatgcag cgtgatgcat 1380
gaggctctgc acaatcatta cactcagaag tccctgtctc tgagtcccgg caagcgggga 1440
cgcaaaagga gatcagggag cggcgctaca aacttctccc tgctgaagca ggcaggcgat 1500
gtggaggaaa atccaggacc catggtcctg cagacacagg tgtttatctc tctgctgctg 1560
tggattagtg gggcctatgg cgacatcgtg atgactcaga gccctgattc cctggcagtg 1620
agcctgggag agcgagcaac aattaactgt aagtcctctc agagcgtgac tttcaactac 1680
aaaaattatc tggcatggta ccagcagaag cccggacagc cacccaaact gctgatctat 1740
tgggcctcaa ctcgcgaaag cggggtgcct gaccgattct ccggatctgg gagtggcacc 1800
gattttaccc tgacaattag ttcactgcag gctgaggacg tcgcagtgta ctattgccag 1860
cagcactaca ggactcctcc aaccttcgga caggggacaa aggtcgaaat caaaactgtg 1920
gctgcacctt ccgtcttcat ttttccccct tctgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc 1980
tctgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac ccaagagaag ccaaggtcca gtggaaagtg 2040
gataacgctc tgcagtctgg aaatagtcag gagtcagtga cagaacagga cagcaaggat 2100
tccacttatt cactgagcaa cactctgacc ctgagcaaag cagattacga gaagcacaaa 2160
gtgtatgcct gcgaagtcac tcatcaggga ctgagctccc ccgtgaccaa gagctttaat 2220
agaggggagt gttgataa 2238
<210> 13
<211> 1437 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9223 <400> 13
atggattgga cttggaggat tctgtttctg gtcgccgccg ctactggaac tcacgctcag 60
gtgcagctgc agcagtctgg acccggactg gtgaagcctt cacagactct gagcctgacc 120
tgcgccatct ccggcgactc tgtgagctcc aacaatgctg tctggaactg gattagacag 180
tccccatctc gggggctgga atggctggga cgaacatact ataggagcaa atggtacaat 240
gactatgctg agagtgtgaa gtcacgaatc acaattaacc cagatactag caagaatcag 300
ttctccctgc agctgaactc tgtgacaccc gaggatactg cagtctacta ttgcgcacgc 360
tccggacaca tcaccgtgtt cggagtcaat gtggacgcct ttgatatgtg gggacagggg 420
accacagtca cagtgtctag tgcaagtact aaaggcccat cagtgtttcc cctggcccct 480
tcaagcaaga gtacctcagg cggaacagcc gctctgggat gtctggtgaa ggactacttc 540
cctgagccag tcaccgtgag ctggaactcc ggagctctga ccagcggggt gcatacattt 600
cctgcagtcc tgcagtcctc tggcctgtac agcctgagtt cagtggtcac cgtgccaagc 660
tcctctctgg gaacacagac ttatatctgc aacgtgaatc acaaaccatc caatacaaag 720
gtcgacaaga aagtggaacc caaatcttgt gataagaccc atacatgccc tccctgtcca 780
gcacctgagc tgctgggcgg cccatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacaca 840
ctgatgatta gccggactcc cgaagtgacc tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggac 900
cccgaagtga agttcaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc caagaccaaa 960
cctagggagg aacagtacaa cagcacttat agagtcgtgt ccgtcctgac cgtgctgcac 1020
caggattggc tgaacgggaa ggagtataag tgcaaagtgt ccaacaaggc cctgccagct 1080
cccatcgaga agaccatttc taaggccaaa ggccagccac gggaacccca ggtgtacaca 1140
ctgcctccaa gccgcgacga gctgaccaaa aaccaggtga gcctgacatg tctggtcaag 1200
ggattctatc ctagtgatat cgctgtggag tgggaatcta atgggcagcc agaaaacaat 1260
tacaagacta cccctcccgt gctggactct gatggaagtt tctttctgta ttcaaaactg 1320
accgtggaca agagccgctg gcagcagggg aacgtcttta gctgctccgt gatgcacgag 1380
gccctgcaca atcattacac tcagaaatct ctgagtctgt cacccggaaa atgataa 1437
<210> 14 <211> 693
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9231 <400> 14
atggtcctgc agacacaggt gtttatctct ctgctgctgt ggattagtgg cgcttacgga 60
gacatccaga tgactcagtc tcctagttca ctgtctgcaa gtgtcggcga tcgcgtgact 120
attacctgtc gaacctcaca gagcctgagc tcctacctgc attggtatca gcagaagcct 180
gggaaagcac caaagctgct gatctatgca gcctctagtc tgcagtccgg cgtgccctct 240
aggttctccg ggtctggcag tggaactgac tttacactga ctatttcaag cctgcagcct 300
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag agcagaactt ttgggcaggg caccaaagtc 360
gaaatcaaga cagtggctgc accatccgtc ttcatttttc caccctctga cgagcagctg 420
aagagtggaa ctgcctcagt ggtgtgcctg ctgaacaatt tctacccccg ggaagccaaa 480
gtccagtgga aggtggataa cgctctgcag tcaggcaata gccaggagtc cgtgacagaa 540
caggactcta aagatagtac ttattcactg agcaacaccc tgacactgag caaggcagac 600
tacgagaagc acaaagtgta tgcctgcgaa gtgacccacc aggggctgag cagtccagtg 660
accaaatctt tcaacagggg agaatgttga taa 693
<210> 15
<211> 1437
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9310 <400> 15
atggattgga catggaggat tctgtttctg gtcgccgccg caactggaac tcacgctcag 60
gtgcagctgc agcagtcagg gcctggcctg gtgaagccca gccagaccct gtccctgaca 120
tgcgccatct ccggcgactc tgtgagctcc aacaatgccg tgtggaactg gatcaggcag 180
tccccttctc gcggcctgga gtggctggga aggacctact atagaagcaa gtggtacaat 240
gactatgccg agagcgtgaa gtccaggatc accatcaacc cagatacatc taagaatcag 300
ttcagcctgc agctgaactc cgtgaccccc gaggatacag ccgtgtacta ttgcgccaga 360
tccggccaca tcaccgtgtt cggcgtgaat gtggacgcct ttgatatgtg gggccagggc 420
accacagtga ccgtgtctag cgcctctaca aagggcccaa gcgtgtttcc actggcaccc 480
tcctctaaga gcacctccgg cggcacagcc gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc 540
ccagagcccg tgaccgtgtc ttggaacagc ggcgccctga ccagcggagt gcacacattt 600
cctgccgtgc tgcagagctc cggcctgtac tccctgtcta gcgtggtgac cgtgccatcc 660
tctagcctgg gcacccagac atatatctgc aacgtgaatc acaagccaag caatacaaag 720
gtggacaaga aggtggagcc caagtcctgt gataagaccc acacatgccc tccctgtcct 780
gcaccagagc tgctgggcgg cccaagcgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc 840
ctgatgatct ctcggacccc cgaggtgaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac 900
cccgaggtga agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag 960
cctagggagg agcagtacaa ctccacctat agagtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac 1020
caggattggc tgaacggcaa ggagtataag tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc 1080
cctatcgaga agaccatctc taaggcaaag ggacagcctc gggagccaca ggtgtacaca 1140
ctgcctccat cccgcgacga gctgaccaag aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag 1200
ggcttctatc cttctgatat cgccgtggag tgggagagca atggccagcc agagaacaat 1260
tacaagacca caccccctgt gctggactcc gatggctctt tctttctgta tagcaagctg 1320
accgtggaca agtcccgctg gcagcagggc aacgtgtttt cttgtagcgt gatgcacgaa 1380
gcactgcaca accattacac ccagaagtca ctgtcactgt ccccaggaaa atgataa 1437
<210> 16 <211> 693 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pGX9311 <400> 16
atggtgctgc agacccaggt gtttatttcc ctgctgctgt ggattagcgg cgcatacggc 60
gacattcaga tgactcagag cccttcaagc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtgacc 120
atcacatgca gaaccagcca gtccctgagc tcctacctgc actggtatca gcagaagcca 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgca gcctctagcc tgcagagcgg cgtgccttcc 240
cggttctctg gcagcggctc cggcaccgac tttaccctga caatctcctc tctgcagcca 300
gaggatttcg ccacatacta ttgccagcag tcccgcacct ttggccaggg cacaaaggtg 360
gagatcaaga ccgtggccgc cccctccgtg ttcatctttc ccccttctga cgagcagctg 420
aagtctggca cagccagcgt ggtgtgcctg ctgaacaatt tctaccctag ggaggccaag 480
gtgcagtgga aggtggataa cgccctgcag tccggcaatt ctcaggagag cgtgaccgag 540
caggactcca aggattctac atattctctg agcaacaccc tgacactgag caaggccgat 600
tacgagaagc acaaggtgta tgcctgtgag gtcactcacc aggggctgtc atcacccgtc 660
accaaatcct ttaatagggg agaatgttga taa 693
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая одно или более синтетических антител, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: а) нуклеотидной последовательности, кодирующей синтетическое антитело к гемагглютинину вируса гриппа (НА) ; и Ь) нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент синтетического антитела к НА вируса гриппа.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что синтетическое антитело к НА вируса гриппа выбирают из группы, состоящей из антитела, которое связывается с шаровидной головкой НА вируса гриппа, и антитела, которое связывается с поддоменом слияния НА вируса гриппа.
3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем,
что молекула нуклеиновой кислоты кодирует синтетическое антитело
к НА вируса гриппа, содержащее аминокислотную
последовательность, выбранную из последовательности по меньшей
мере на 90% гомологичной SEQ ID NO: 1-8, и ее фрагмент.
4. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательности по меньшей мере на 90% гомологичной SEQ ID NO: 9-16, и ее фрагмент.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, содержащая по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из первой нуклеотидной последовательности, кодирующей первое антитело к НА вируса гриппа; и второй нуклеотидной последовательности, кодирующей второе антитело к НА вируса гриппа.
6. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую домен расщепления.
7. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела к НА вируса гриппа.
8. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, содержащая
нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи человеческого IgGlK.
9. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, содержащая
нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид,
содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела к НА
вируса гриппа; константную область тяжелой цепи человеческого
IgGlK; домен расщепления; вариабельную область легкой цепи
антитела к НА вируса гриппа; и константную область легкой цепи
IgGlK.
10. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует лидерную последовательность.
11. Молекула нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 110, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты содержит экспрессионный вектор.
12. Композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 1-11.
13. Композиция по п. 12, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
14. Способ лечения инфекции гриппа у субъекта, который включает введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11 или композиции по любому из пп. 12-13.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что инфекция гриппа
выбрана из инфекции гриппа типа А и инфекции гриппа типа В.
По доверенности
Конструкция DMAb 5J8
Ж Mil
DMAb к вирусу гриппа содержат вариабельные области из опубликованных моноклональных антител к вирусу гриппа
5J8 (Krause et al, J Virol, 2011)
Связывается со связывающим карманом на вариабельной области шаровидной головки • Перекрестно реагирует с множеством Н1 вирусов гриппа А.
Гемагглютинин вируса гриппа
Конструкция DMAb Fli
DMAb к вирусу гриппа содержат вариабельные области из опубликованных моноклональных антител к вирусу гриппа
FI6 (Corti et al, Science, 2011)
• Связывается с относительно консервативным поддоменем слияния
• Обеспечивает широкую нейтрализацию вирусов гриппа А из группы 1 и группы 2
Гемагглютинин вируса гриппа
Конструкции DMAb экспрессируются и секретируются из трансфицированных
клеток 293Т in vitro
После внутримышечной электропорации ДНК достигаются устойчивые уровни ДНК-
моноклональных антител в сыворотке
Сыворотка мышей линии BALB/c
(День 7)
Сыворотка мышей линии FoxN1nu/CRL
FI6
1ООмкг
200 МКГ 300 мкг
5JS F1S
Конструкция DMAb
Дней после введения DMAb
После внутримышечной электропорации конструкций плазмидной ДНК в мышиной сыворотке обнаруживали антитела DMAb к вирусу гриппа.
ДНК-моноклональные антитела, произведенные после внутримышечной
электропорации ДНК, сохраняют свою способность связываться с различными мишенями-антигенами НА
Связывание с гемагглютинином
9 1- <Н
0.5-
А/Брисбан/59/2007 Перед кровопусканием
А/Калифорния/07/2009
Перед кровопусканием
0.0-
50 100 200 400 800 1600 3200 6400 Разведение сыворотки (Ш)
Разнообразие клинически значимых вирусов гриппа
Вирус гриппа А
Вирус гриппа В
Ямагата
Фигура 6
Выявление перекрестно-реактивных антител, специфичных к вирусу гриппа
Нейтрализация mAb FluA
Значения IC50 (мкг/мл)
10 -
0.1
Сезонные
Павдемнческие
Нейтрализация mAb FluB
Значения IC50 (мкг/мл)
10-|
Линия
Подтип НА
. Н2 Ш Н5 ' Н6
Z3 Н7
нэ
И ИИ ЧУЙ I
•Л "И " (•
Кгазнь
имиюртапизгавг /*~*\ ?
:ЕВУВ-ЬЧГ
I w 5
i * Банк крови
Выбор донора
В-клетки памяти
выбирали на основании связывания с белком НА Н5 и Н7 или на основании нейтрализации двух линий вируса гриппа в
I ш
Виктория
Ямагата
Нетипизировап пая
Увеличение клоков и'или
антител с помощью ОТ-ПЦР и экспрессии
- ми
со &лчее 1 югтодсЕ
Еы &оо по об"=ечу и эоо"е,-гти в-ностг
Новая платформа доставки: Электропорация синтетической плазмидной ДНК,
кодирующей антитела (DMAbJ
Системная циркуляция
Конструкция плазмиды DMAb'
Тяжелая цепь
г К
hCMV У
Оптимизация и вставка в каркас ДНК *
* Некоторые конструкции содержат тяжелую и
легкую цепи, вставленные а две разные плазмиды
Продукция DMAb в клетках скелетных мышц
* Доставка ДНК приводит к системной циркуляции полноразмерных моноклональных антител (Flingoi et а/. 2015 and Muthumani et al, 2016)
Дизайн исследования заражения летальным вирусом гриппа
Взятие СЫВОРОТКИ Вирусная инфекция
-D ИЛИ -4 t
Введение DMAb
В/м введение плазмид DMAb с
последующей ЭП
Конец исследования
~ 1
Кивз-ны> : регулярно
ГО-ГРОЛИРОЗДЛИ 3 OTHOLLS-M/I
выживание, клинических призыве и снижения ыаесь а
Введение очищенного 1а6 Внутрибрюшинное еведение
Фигура 9
Продуцируемые in VIVO кодированные ДНК антитела (DMAb) экспреесируют функциональные
mAb FluA и FluB
Экспрессия человеческого IgG
(DMAb FluA через S дней после ЭП)
Связывание DMAb FluA с НА
|й./Калифорния/2009 Н 1 НА;
Связывание DMAb FluA
100 мкг 200 мкг 300 у кг интактнуе
Н, 100 wr
2В0 мкг 300I
¦ДНК
| 15-
Экспрессия человеческого IgG (DMAb FluB через 5 дней после ЭП)
• ¦
100 мкг 2Ш мкг 300 I
Плазмидная ДНК
Связывание DMAb FluB с НА
(В/Флорида/2006 yam НА)
100 мкг
10 1Q0 1000 10000 10ОООО
Обратное разведение сыворотки
200 мкг 300 мкг инта-гные
,1000
.9 1"N
ш 10
АКТИВНОСТЬ DMAb FluB
1000
(Нейтрализация)
В, 5.",Лз:-'2С04 Vie
400
100 МКГ 200 МПЗС1ПГ
ИКТИТВЬ!
DMAb FluA обеспечивает такую же защиту при летальном заражении вирусом гриппа А, как и
очищенный IgG
Экспрессия человеческого IgG (А/Капифорния.;2009 Н1)
10:
0,1
DMafa
• Контр. (DVSF-3)
• FluA
Очищенный IgG FluA
О 1 мг/кг
О 0,3 мг/кг
о 0,1 мг/кг
о 0,03 мг/кг
О 1 мг/кг Контр. (R347)
Масса тепа (А/Калифорния/2009 Н1}
Показатель выживания
[А''КалифорнИй/2005 Н1)
Показатель выживания
СгА/Гонганг/68 НЗ)
100 80-1
6040200
-гт 1-1 1
01 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12
Дней после инфицирования
Фигура 11
DMAb FluB обеспечивает такую же защиту при летальном заражении вирусом гриппа В, как
и очищенный IgG
Экспрессия человеческого IgG
(В/Малайзия/2004 vie)
о 1
' и п ?
0.1
Масса тела
(В/Малайзия/2004 vie)
Показатель выживания
(В/Малс1йзия.'2004 vie)
Показатель выживания
(В/Флорида/2006 /am)
100 806040200 т-г
¦ *
--EJ
П . . . '
.....t-,-,-t-,-i-i-Ф-(-i-i-i
§ 1 2 3 4 5 6 7 8 Э tO 11 12 Дней после иномцировлнмя
1234 56789 10 11 12
Дней после инфицирования
Комбинированная терапия DMAb FluA и FluB приводит к защите при заражении любым из
типов вируса гриппа: А или В
I о 100
Экспрессия человеческогоIgG
DMAb
• FluA + FluB
• Контр. (DVSF-3)
Комбинация очищенных loG:
о 1 мг/кг
О 0,3 мг/кг О 0,1 мг/кг
О К347 2мг/кг
-е-
=1 " =1 g
щ о
13 100
1 -
Экспрессия IgG, специфических в отношении вируса гриппа
0.1
Показатель выживания
(А/Кал ифорния/2009 Н1)
го "О 0.1
Вирус гриппа А Вирус гриппа В
Показатель выживания (Б/Флорида/2006 yam)
со го
сг о
го ga Ф
ЈD Н I
i si
а г Е
100
40 20' 0
О 1
-т-У 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
Дней после инфицирования
а а
111
го ga Ф ш н I ^ Ф н
1 ? i
100 80 60 40 20 0
~f-T-f--r-r-r-1___^l~^__t___r_(
О 1 2 3 4 5 в J I НО 11 12
Дней после инфицирования
100
HI HA
H2 HA
HS HA
I *
H6HA
§ •
HS HA
50 ',
Группа 2
• НЗ НА
• H7 НА
100
20В
300
интакт
В. .
1 ос"
-, о §
т я
О 41
ф tu ш
го I т ГЛ
Ф 9
111
S § ?
е*5 Ф
00 ш -
C О 1 00 *
s "i
в -х
1 о
100 мкг 200 I
300 l
100 мкг 200 мкг 300 иг интакгн
0,1
DMab • Kc-re d;s=-2>
Очищенный FUA
1 \г,-
; - --
1 -л" j
1""
1 м
"'1
V. ? *
?! ;
r* %
DMAb
# '-"G-TC C'VSr-3i
• F.jA
Очищенный aG FluA 1
С i
С ' --
0.1
1 \---Jz
- --7)
.110
It i * 1 1 * i У ! 1 la 11 1> Дней г :см иъфицироинн*
DMAb
¦ Контр. (DVSF-3J
¦ FitS
3^пленный loG FluB
! мг.'-:-
C 3 M'.'-r С ! hi'!-:-
С СЗ мг/-:г
! МГ.'-:" К энтр, | Р 34~:
1"0 8(1 "в
C.f
S 110.
Т Г ~ < S ! 9 ! 5 Ч 1 1
I) 1 J 3 Н i ! 8 J 1И1 1?
Дней п-зсле иьфицирэиния
то.
if "
0.1
DMAb
4 Кгк-р iCViF-3)
* F Li Б
Счиие-н-ьй qG FluB
1 ?-;УГ
G 3 v/кг О 1 ?-/кг
• 1 ''-/;-:г К с t-тр, :R3i7i
..I
т т
1 -* 0°
МО 10
1 У) *
i. Jit-
и п и и n II тг Дней ю;ге 1-чфи1_ир;;га- <.1д
Фигура 17A-17F
-i г 1 1 я 1 % г 1 1 ^ f
1 2 J 4 5 6 ? 1 9 " 11 1?
?> е# после ш-фрцирова^и
0.1
" - + F..i=
* -:
L_ :
fat*
i -t io !I
I! ¦
I n
Вирус "риппл A
гг.пгз Ч
-r-r
a i / s J i & / s L' io 11 1/ Енег r -.-cm т-фуцир'.-иник
1 0
tt 1 /
Г i > t f. / d "t IB Ft 1/ ef no: л t икф'цироБо-ги
wo-§"
§ n
llTJllJlsil aoil llisi* 4iS*>
~~Г Г 1 1 1 I I
0 1 / 1 1 fj Ь / 1: <* 10 ? I U Днег п :-cл ь и-фгцир :-аа-ия
Предыдущий вид леденил
г 1 1 ¦ 1 1
,Л + F .15
Кеча5. -оч,1-=-=1л ее
- . - т = •; I
- - : ь - - 1 = <: 1 ¦¦' - - - 1 = z!
_i ¦'¦-•* If' •а-
15-
Предыдущий ВИД :
РЫаЬ
• F .¦ ¦- + F . ё •
^3 .1?.-.'-.l.' 04,1
1 -.г 1 = 1С 0.3 мг/иг (л = 10;
0.1 иго'кг (л = 91
"Т! 1 Г~
3 1 / J
г ' ; 1 i а
i 1 I. f tt Ч IS ?1 U
Интанп
(л = 1С
Д(-ей л с с л t снши^трсвзи'я
Фигура 18А- 18F
2. 1.5-
0.0
100 мкг FluA
200 мкг FluA 300 мкг FluA Интактные
25 50 100 200 400 800 1600 3200 Обратное разведение сыворотки {1одг)
Фигура 20
СС-
г*.
¦" ¦ т.:
" FluB
¦ Ко <--о. (DVSF-3) С'-,1швнный IgG FluA
1 МП'КГ
r> 0 3 МГ/КГ -я 0 МГ/КГ
ИГ/КГ
i-j-'fei , -а
1 МГ/КГ R347
ю го
Обратное разведение сыворотки (log)
1П-1
J о
- X
(О х>
- ш
_| К
DMAb * F LB
¦ Ко-те JDVSF-3} Очпщенчьй ^gG FluB
1 МГ'ЧГ О 0,3 МГ/К"
? 0,1 мг.'к-0,0-3 мг/кг
? 1 мг/кг KChTp (R347}
10-.
¦5 о 8
О О
"2 Ж <
* коню (CVSF-з; Оч.щечнь л oG FUB
* МГ/КГ
А 0 3 М--К-
Л 0 1 М'-'К'
_ 0 03 ьг/кг
1 мг/кг Контр. (R347)
1 1
I S
110-
DMAb
FluA + FluB
¦ c bA - FIJB
HB-
¦'cr.*-> -a-"' <= у-.и^-нык laG 1
3 3
0 1 r 1 2 \-.-- .P2i7
ПК"
S S "
I I г 3 I 5 S 7 t I II 11 11
Г i.-;.ifu"-^>
DMA.:
• FU,4-FJ5 ;- = •;.
-*- К'с--о D = 1)
.-'/-C'-.-i gG:
1 <- = -¦;• -:.з м- - = 1 :i i- - - = с
¦* Иняпми (л= 10)
^ 110
о J=
н 100
90 80 /0
S Ч- " • " *
4 m - . i - - . Б • - - '
0,1
¦ г"-;-тс C"5F-?i - • !
-•31-"= ¦ и - 131
if*
T-1 .1,4,1,1 1
(J 1 У J 4 *J 4t / S 3 Ю 11 1/
Дней после -инфицирования
Дие-й после инфицирования
10000 1
1000
100
DMAb- Интактн Кс w 6 и - э Кс м 5 ин а ди я С М At
KG up.
Ко У 6 и н a L,
ия ОУАЬ
10000
s,|?
"О ш
CP со =
^ 5 9
Й Й о
П> (D 5
ED W
1 I (D ЕЙ 1000
100
DM At
, ] -
<"с м 6 и - s Комбинация JAH очищенных D",1Ab IgG:
Конто см А о
Комбине
Ц <1Я
DMAb
(19)
(19)
(19)
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 2
Фигура 2
Фигура 2
Фигура 2
Фигура 3
Фигура 3
Фигура 4
Фигура 4
Фигура 4
Фигура 4
Фигура 4
Фигура 4
Фигура 5
Фигура 5
§,001
Фигура 7
§,001
Фигура 7
§,001
Фигура 7
§,001
Фигура 7
Фигура 8
Фигура 8
Фигура 8
Фигура 8
Фигура 10
Фигура 10
Фигура 10
Фигура 10
Фигура 10
Фигура 10
Фигура 12
Фигура 12
Фигура 12
Фигура 12
Фигура 12
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 13
Фигура 14А- 14F
Фигура 14А- 14F
300
Группа 1
300
Группа 1
Фигура 15А- 15С
Фигура 15А- 15С
300
Группа 1
300
Группа 1
Фигура 15А- 15С
Фигура 15А- 15С
300
Группа 1
300
Группа 1
Фигура 15А- 15С
Фигура 15А- 15С
300
Группа 1
300
Группа 1
Фигура 15А- 15С
Фигура 15А- 15С
300
Группа 1
300
Группа 1
Фигура 15А- 15С
Фигура 15А- 15С
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
10,
10,
Фигура 16A- 16F
Фигура 16A- 16F
Фигура 19
Фигура 19
Фигура 19
Фигура 19
Фигура 19
Фигура 19
Фигура 19
Фигура 21 А- 21В
Фигура 21 А- 21В
Фигура 22А-22В
Фигура 22А-22В
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 23А - 23D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D
Фигура 24А - 24D