[RU]

Настоящее изобретение относится к способу модулирования времени полужизни связывающего домена со специфичностью к сывороточному белку-переносчику посредством мутирования последовательности и модулированному связывающему домену со специфичностью к сывороточному белку-переносчику.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к способу модулирования времени полужизни связывающего домена со специфичностью к сывороточному белку-переносчику посредством мутирования последовательности и модулированному связывающему домену со специфичностью к сывороточному белку-переносчику.

---

Евразийское (21) 201892501 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.28
(51) Int. Cl. C07K16/18 (2006.01)
(54) СВЯЗЫВАЮЩИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ БЕЛОК-ПЕРЕНОСЧИК ДОМЕН СО СКОНСТРУИРОВАННОЙ АФФИННОСТЬЮ
(31) 1607636.6; 1607828.9
(32) 2016.05.01; 2016.05.04
(33) GB
(86) PCT/EP2017/060266
(87) WO 2017/191062 2017.11.09
(71) Заявитель:
ЮСБ БИОФАРМА СПРЛ (BE)
(72) Изобретатель:
Адамс Ральф, Хейвуд Сэм Филип (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к способу модулирования времени полужизни связывающего домена со специфичностью к сывороточному белку-переносчику посредством мутирования последовательности и модулированному связывающему домену со специфичностью к сывороточному белку-переносчику.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-552953ЕА/042
СВЯЗЫВАЮЩИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ БЕЛОК-ПЕРЕНОСЧИК ДОМЕН СО СКОНСТРУИРОВАННОЙ АФФИННОСТЬЮ
Настоящее изобретение относится к способу модуляции времени полужизни связывающего домена со специфичностью к сывороточному белку-переносчику посредством мутирования последовательности и модулированному связывающему домену со специфичностью к сывороточному белку-переносчику.
ПРЕДПОСЫЛКИ
Увеличение времени полужизни биологических лекарственных средств в сыворотке посредством нацеливания на сывороточные белки-переносчики, например, сывороточный альбумин человека (HSA), сейчас является общепризнанным1,2. HSA используют, поскольку его время полужизни составляет 19 суток. Он является наиболее распространенным белком в сыворотке крови (34-54 г/л) и широко распространен в тканях3. Следовательно, он является мишенью, которая легко доступна и безопасна для связывания, в частности, в этом подходе используют по существу небольшую процентную долю общего альбумина.
Среди белков сыворотки только IgG имеет аналогичное длительное время полужизни (21 сутки). Длительное время полужизни HSA и IgG в сыворотке в первую очередь обусловлено защитой от внутриклеточного лизосомального разрушения с помощью неонатального Fc-рецептора (FcRn)4,5. FcRn возвращает HSA и IgG на клеточную поверхность после неспецифического пиноцитоза плазмы в везикулы клетками эндотелия и гематопоэтическими клетками, выстилающими пространство сосудов. Пиноцитозные везикулы закисляются посредством слияния с ранней эндосомой, что позволяет HSA и IgG связываться с FcRn рН-зависимым образом. Везикулы, несущие мембранные рецепторы, в том числе FcRn, и связанные HSA и IgG, возвращаются на клеточную поверхность, тогда как остальной не связанный материал направляется в лизосому для разрушения. HSA и IgG слабо связываются с FcRn при нейтральном рН и поэтому возвращаются в циркуляцию, когда происходит экспонирование возвращенных везикул для нейтрального
рН крови2.
HSA можно использовать одним из двух путей. Один подход состоит в непосредственном сопряжении терапевтического белка с HSA, генетически или химически6,7. Второй подход состоит в использовании альбумин-связывающего домена. Примеры связывающих доменов, используемых на сегодняшний день, включают жирные кислоты (миристиновую кислоту)8, органические молекулы (Albutag) 9, синтетические пептиды10,11, бактериальные альбумин-связывающие домены (Albumod(tm)) 12,13, однодоменные антитела (Nanobody(tm), AlbudAb(tm)) 14~17 и Fab18.
Nguyen et al 2 00 6 исследовали время полужизни Fab-фрагментов, связанных с С-концевым альбумин-связывающим пептидом. Nguyen делает вывод, что сниженная аффинность к альбумину коррелирует со сниженным временем полужизни и более высокими скоростями клиренса. На фиг. 3 там предложена почти линейная зависимость. Также в этой публикации перешли к тому, чтоб заявлять, что очень небольшое отличие во фракции антитела, которое не связано, in vivo будет оказывать выраженный эффект на скорость клиренса.
Авторы настоящего изобретения исследовали корреляцию между аффинностью связывающих доменов, содержащих VH и VL, со специфичностью к сывороточному белку-переносчику и их временем полужизни in vivo. Они установили, что длительность времени полужизни для связывающих доменов значительно сложнее, чем ответ на альбумин-связывающие пептиды, в том отношении, что большие снижения в наблюдаемой аффинности часто переходят в умеренное снижение времени полужизни, и, в некоторых случаях, сниженная аффинность может вести к увеличению времени полужизни, что противоречит интуиции.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ РАСКРЫТИЯ
Таким образом предусмотрен связывающий домен, содержащий VH и VL, со специфичностью к сывороточному белку-переносчику, где домен мутируют посредством модификации в вариабельном домене легкой цепи (VL) , в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) и их сочетании, и мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для
немутированного связывающего домена, например, при условии, что мутация отлична от мутации, состоящей из I50A, Т56А, Т95А, V96A, Р97А, G98A, Y99A, S100A, ТЮОАа, YlOOCa, I50A и Т95А, I50A и G98A, I50A и Y99A, Т56А и Т95А, Т56А и G98A и Т56А и Y99A в SEQ ID N0: 1.
Таким образом предусмотрен связывающий домен, содержащий VH и VL, со специфичностью к сывороточному белку-переносчику, где домен мутируют посредством модификации, выбранной из одной или двух аминокислотных замен в вариабельном домене легкой цепи (VL), одной или двух мутаций в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) и их сочетания, и мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для немутированного связывающего домена, например, при условии, что мутация отлична от мутации, состоящей из I50A, Т56А, Т95А, V96A, Р97А, G98A, Y99A, S100A, ТЮОАа, YlOOCa, I50A и Т95А, I50A и G98A, I50A и Y99A, Т56А и Т95А, Т56А и G98A и Т56А и Y99A в SEQ ID N0: 1.
В одном из вариантов осуществления сывороточный белок-переносчик выбирают, например, из тироксинсвязывающего белка, транстиретина, кислого гликопротеина а.1, трансферрина, фибриногена и альбумина, или фрагмента любого из них, например, альбумина, в частности сывороточного альбумина человека.
В одном из вариантов осуществления связывающий домен обладает специфичностью к домену II альбумина.
В одном из вариантов осуществления мутация представляет собой модификацию в VL, например, где мутация представляет собой замену одной или двух аминокислот в VL, такую как модификация/замена в CDR, выбранной из LI, L2, L3 и их сочетания, в частности, где CDR представляет собой L1.
В одном из вариантов осуществления мутированную аминокислоту(ы) в CDRL1 независимо выбирают из положения 2 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35, такого как положение 30.
В одном из вариантов осуществления аминокислоту(ы) в релевантном положении(ях) в VL замещают гидрофобным остатком, например, выбранным из аланина, изолейцина, фенилаланина,
валина, пролина и глицина, таким как аланин.
В одном из вариантов осуществления мутации состоят из модификаций в VL. К удивлению, авторы настоящего изобретения установили, что в VL можно выполнять модификации, которые увеличивают Kd связывающего домена и снижают аффинность связывающего домена, но увеличивают время полужизни молекулы.
В одном из вариантов осуществления мутация(и) находится в домене VH, например, мутация представляет собой замену одной или двух аминокислот в VH, такую как мутация в CDR, выбранной из HI, Н2, НЗ и их сочетаний, в частности, где CDR представляет собой Н2 и/или НЗ, более конкретно где CDR представляет собой Н2.
В одном из вариантов осуществления мутированную аминокислоту(ы) в CDRH2 независимо выбирают из положения 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 и их сочетаний, которое, например, замещают гидрофобным остатком, в частности, независимо выбранным из аланина, изолейцина, фенилаланина, валина, пролина и глицина, таким как аланин.
В одном из вариантов осуществления мутированная аминокислота(ы) находится в CDR представляет собой НЗ и, в частности, мутированную аминокислоту(ы) независимо выбирают из положения 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 или 107, более конкретно мутируют остаток 101.
В одном из вариантов осуществления аминокислоту в релевантном положении(ях) в CDRH3 замещают гидрофобным остатком, например, независимо выбранным из аланина, изолейцина, фенилаланина, валина, пролина и глицина, таким как аланин.
В одном или нескольких вариантах осуществления одна или несколько замен аминокислот представляют собой неконсервативную аминокислотную замену, например, где неконсервативная аминокислота представляет собой выбор из природных аминокислот аланина, валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина, триптофана, треонина, аспарагина, глутамина, глицина, пролина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.
В одном из вариантов осуществления связывающий домен содержит вариабельный домен с пересаженной CDR.
В одном из вариантов осуществления связывающий домен гуманизируют, например, связывающий домен содержит каркас человека в VH и/или VL.
В одном из вариантов осуществления каркас VH относится к человеку (например, VH3, такой как VH3 1-3 3-23) и содержит 1, 2, 3, 4, 5 или б замен аминокислот, таких как аминокислоты, которые представляют собой остатки донора.
В одном из вариантов осуществления VH содержит
последовательность, выбранную из SEQ ID N0: 2, 3, 4 и 5, или
вариант любой одной из них же, с по меньшей мере 95, 96, 97, 98
или 99% сходством или идентичностью, такую как
последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 2, 3, 4, 5 или б (в частности, 5 или б).
В одном из вариантов осуществления каркас VL относится к человеку (например, VKI, такой как 2-l-(l)L5), например, содержащий 1, 2 или 3 замены аминокислот, таких как аминокислоты, которые представляют собой остатки донора.
В одном из вариантов осуществления домен VL содержит последовательность, выбранную из SEQ ID N0: б, 7, 8 и 9, или вариант любой одной из них, с по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% сходством или идентичностью.
В одном из вариантов осуществления последовательности VH и VL выбирают из комбинаций SEQ ID N0: 2иб, 2и7, 2и8, 2и9, 3 и б, 3 и 7, 3 и 8, 3 и 9, 4 и б, 4 и 7, 4 и 8, 4 и 9, 5 и б, 5 и 7, 5и8и5и9 или варианта или вариантов любых из них же с по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% сходством или идентичностью, в частности последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID N0: 9 и SEQ ID N0: 3, соответственно, или последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID N0: 8 и SEQ ID N0: 4, соответственно, или последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID N0: 9 и SEQ ID N0: 5, соответственно, или последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID N0: 9 и SEQ ID N0: 4.
В одном из вариантов осуществления связывающий домен относится к человеку.
В одном из вариантов осуществления аффинность партнеров связывания является высокой, 5 нМ или сильнее, такой как 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 или 10 пМ или сильнее.
В одном из вариантов осуществления предусмотрена молекула антитела, содержащая связывающий домен в соответствии с настоящим раскрытием, в частности, молекула полиспецифического антитела, например, биспецифическая.
В одном из вариантов осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая связывающий домен в соответствии с настоящим раскрытием или молекулу антитела, описанную в настоящем описании.
В дополнительном аспекте предусмотрен способ лечения пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества связывающего домена в соответствии с настоящим раскрытием, молекулы антитела, описанной в настоящем описании, или фармацевтической композиции, содержащей любое одно из них.
Также предусмотрены связывающий домен в соответствии с настоящим раскрытием, молекула антитела, описанная в настоящем описании, или фармацевтическая композиция, содержащая любое одно из них, для применения в лечении.
В одном из вариантов осуществления предусмотрены связывающий домен в соответствии с настоящим раскрытием, молекула антитела, описанная в настоящем описании, или фармацевтическая композиция, содержащая любое одно из них, для применения в лечении, в частности, лечении выбранного из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, связанного с инфекцией, артрита, такого как ревматоидный артрит, астмы, такой как тяжелая астма, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), воспалительного заболевания таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, целиакии, заболевания желчного пузыря, пилонидального заболевания, перитонита, псориаза, васкулита, хирургических спаек, инсульта, диабета I типа, болезни Лайма, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммунноопосредованных
воспалительных нарушений центральной и периферической нервной
системы, таких как рассеянный склероз, волчанка (такая как
системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, атопического
дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита,
Базедовой болезни, IgA-нефропатии, идеопатической
тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Миньера, пузырчатки,
первичного биллиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии,
гранулематоза Вегенера, других аутоиммунных нарушений,
панкреатита, травмы (хирургической), реакции трансплантат против
хозяина, отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая
ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также
атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбции кости,
остеопороза, остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии и
злокачественной опухоли, в том числе злокачественной опухоли
молочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной
опухоли желудка, злокачественной опухоли яичников,
гепатоцеллюлярной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли головы и шеи, почки, и злокачественной опухоли, в частности, почечноклеточной карциномы, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли печени, меланомы, саркомы, миеломы, нейробластомы, плацентарной хориокарциномы, злокачественной опухоли шейки матки и злокачественной опухоли щитовидной железы, а также их метастатических форм.
Применение связывающего домена в соответствии с настоящим раскрытием, молекулы антитела, описанной в настоящем описании, или фармацевтической композиции, содержащей их, при изготовлении лекарственного средства, например, для лечения выбранного из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, связанного с инфекцией, артрита, такого как ревматоидный артрит, астмы, такой как тяжелая астма, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), воспалительного заболевания таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, целиакии, заболевания
желчного пузыря, пилонидального заболевания, перитонита, псориаза, васкулита, хирургических спаек, инсульта, диабета I типа, болезни Лайма, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммунноопосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, таких как рассеянный склероз, волчанка (такая как системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, Базедовой болезни, IgA-нефропатии, идеопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Миньера, пузырчатки, первичного биллиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, гранулематоза Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы (хирургической), реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии и злокачественной опухоли, в том числе злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли яичников, гепатоцеллюлярной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли головы и шеи, почки и злокачественной опухоли, в частности почечноклеточной карциномы, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли печени, меланомы, саркомы, миеломы, нейробластомы, плацентарной хориокарциномы, злокачественной опухоли шейки матки и злокачественной опухоли щитовидной железы, а также их метастатических форм.
В независимом аспекте предусмотрен способ выбора связывающего сывороточный белок-переносчик домена для обеспечения обусловленного времени полужизни, включающий стадии: предоставления панели пар VH/VL со специфичностью к указанному сывороточному белку-переносчику, и
анализа их времени полужизни in vivo, и
выбора домена, который наиболее близко совпадает со
временем полужизни, необходимым для биологической молекулы, содержащей домен у человеческого субъекта.
В одном из вариантов осуществления сывороточный белок-
переносчик выбирают из тироксинсвязывающего белка,
транстиретина, кислого гликопротеина а.1, трансферрина,
фибриногена и альбумина или фрагмента любого из них, например,
альбумина, такого как сывороточный альбумин человека.
В одном из аспектов панель пар VH/VL получают посредством мутирования вариабельного домена в родительском антителе.
В одном из вариантов осуществления мутация представляет собой по меньшей мере одну модификацию в VL, например, где модификацию VL выбирают из одной или двух аминокислотных замен в вариабельном домене легкой цепи (VL), и мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для немутированного связывающего домена.
В одном из вариантов осуществления мутация в VL представляет собой мутации в CDRL1, CDRL2 и/или CDRL3, в частности в CDRL2 или CDRL3.
В одном из вариантов осуществления мутация(и) в связывающем домене состоит из модификации или модификаций в домене VL.
В одном из вариантов осуществления мутация представляет собой по меньшей мере одну модификацию в VH.
В одном из вариантов осуществления мутация представляет собой одну или две мутации в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) , где мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для немутированного связывающего домена (также обозначаемого в настоящем описании как родительское антитело).
В одном из вариантов осуществления мутация(и) находится в CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3, в частности, в CDRH2 или CDRH3.
В одном из вариантов осуществления способ в соответствии с раскрытием дополнительно включает стадию замены остатков гистидина в VH и/или VL (из панели или на панель) альтернативным аминокислотным остатком.
В одном из вариантов осуществления способ дополнительно
включает стадию оценки свойств одного или нескольких связывающих доменов, при двух или больше биологически релевантных рН, таких как приблизительно рН 5 и рН 7.
В одном из вариантов осуществления мутации увеличивают числовое значение Kd.
В одном из вариантов осуществления предусмотрен способ, в котором увеличивают аффинность.
В одном из вариантов осуществления предусмотрен способ, в котором уменьшают аффинность.
В одном из вариантов осуществления кристаллическую структуру сывороточного белка-переносчика с антителом, таким как родительское антитело, используют при решении о том, какие остатки модифицировать/мутировать.
В одном независимом аспекте настоящее раскрытие предусматривает способ, описанный в следующих абзацах:
1. Способ выбора связывающего сывороточный белок-переносчик домена для обеспечения обусловленного времени полужизни, включающий стадии: предоставления панели пар VH/VL со специфичностью к указанному сывороточному белку-переносчику, и
анализа их времени полужизни in vivo, и
выбора домена, который наиболее близко совпадает со временем полужизни, необходимым для биологической молекулы, содержащей домен, у человеческого субъекта.
2. Способ в соответствии с п. 1, в котором сывороточный белок-переносчик выбирают из тироксинсвязывающего белка, транстиретина, кислого гликопротеина а.1, трансферрина, фибриногена и альбумина или фрагмента любого из них.
3. Способ в соответствии с п. 2, в котором сывороточный белок-переносчик представляет собой альбумин.
4. Способ в соответствии с п. 3, в котором альбумин представляет собой сывороточный альбумин человека.
5. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 4, в котором панель пар VH/VL получают посредством мутирования вариабельного домена в родительском антителе.
6. Способ в соответствии с п. 5, в котором мутация
представляет собой по меньшей мере одну модификацию в VL.
7. Способ в соответствии с п. б, в котором модификацию VL выбирают из одной или двух аминокислотных замен в вариабельном домене легкой цепи (VL), и мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для немутированного связывающего домена.
8. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 5 до 7, в котором мутации находятся в CDRL1, CDRL2 и/или CDRL3, в частности в CDRL2 или CDRL3.
9. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 5 до 8, в котором мутация состоит из модификации или модификаций в домене VL.
10. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 8, в котором мутация представляет собой по меньшей мере одну модификацию в VH.
11. Способ в соответствии с п. 9, в котором мутация представляет собой одну или две мутации в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) и их сочетание, и мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для немутированного связывающего домена.
12. Способ в соответствии с пп. 10 или 11, в котором мутация(и) находится в CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3, в частности в CDRH2 или CDRH3.
13. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 12, который дополнительно включает стадию замены остатков гистидина в VH и/или VL, используемых в панели, на альтернативный аминокислотный остаток.
14. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 13, который дополнительно включает стадию оценки свойств одного или нескольких связывающих доменов, при двух или больше биологически релевантных рН, таких как приблизительно рН 5 и рН 7.
15. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 14, где мутация(и) увеличивает числовое значение Kd.
16. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 15, в котором аффинность увеличена.
17. Способ в соответствии с любым одним из пп. с 1 до 15, в
11.
котором аффинность уменьшают. ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ
К удивлению, авторы настоящего изобретения обнаружили, что последовательности VH и VL можно мутировать и соответствующее время полужизни не обязательно соответствует аффинности связывающего домена. В частности, можно выполнять модификации в VL, где сохраняют или снижают аффинность и увеличивают время полужизни.
Это позволяет проектировать и контролировать время полужизни молекулы, чтобы обеспечивать время полужизни, которое релевантно терапевтическому показанию. В некоторых вариантах осуществления может быть желательно длительное время полужизни. В некоторых вариантах осуществления может быть подходящим умеренное/среднее время полужизни. В других вариантах осуществления относительно короткое время полужизни может быть подходящим.
Обусловленное время полужизни, как используют в настоящем описании, представляет собой время полужизни, которое специально разработано для связывающего домена посредством его модификации.
"Связывающий домен или сайт", как используют в настоящем описании, представляет собой часть антитела, которая контактирует с антигеном. В одном из вариантов осуществления связывающий домен содержит по меньшей мере один вариабельный домен или его производное, например, пару вариабельных доменов или их производных, такую как когнатная пара вариабельных доменов или их производное.
В одном из вариантов осуществления связывающий домен содержит б CDR и каркас, и вместе эти элементы вносят вклад в специфичность связывающего взаимодействия антитела или связывающего фрагмента.
Вариабельные области (также обозначаемые в настоящем описании как вариабельные домены) в целом содержит 3 CDR и подходящий каркас.
Термин "антитело", как используют в настоящем описании, относится к молекуле иммуноглобулина, способной к специфическому связыванию с целевым антигеном, таким как углевод,
полинуклеотид, липид, полипептид, пептид и т. д., через по меньшей мере один участок узнавания антигена (также обозначаемый как сайт связывания в настоящем описании), расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина.
Как используют в настоящем описании, "молекула антитела" включает антитела и их связывающие фрагменты. Термин также распространяется на формат антител, содержащий любой один из них.
Родительское антитело, как используют в настоящем описании, относится к начальному антителу перед мутациями, выполняемыми для того, чтобы менять время полужизни. Родительское антитело может быть гуманизированным (что может включать включение обратных мутаций, содержащих так называемые остатки донора) или мутантным, например, для того, чтобы удалять остатки лизина из CDR или т. п. Однако модификации, присутствующие в родительском антителе, не служат цели изменения/модификации времени полужизни. Родительское антитело, как используют в настоящем описании, включает связывающие фрагменты антител.
"Фрагменты антител", как используют в настоящем описании, относятся к связывающим фрагментам антител, включая в качестве неограничивающих примеров Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2/ Fv, однодоменные антитела, scFv, двух-, трех- или четырехвалентные антитела, Bis-scFv, диатела, триатела, тетратела и эпитоп-связывающие фрагменты любого указанного выше (см., например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Способы создания и изготовления этих фрагментов антител хорошо известны в данной области (см., например, Verma et al. , 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181). Другие фрагменты антител для применения в настоящем раскрытии включают фрагменты Fab и Fab', описанные в международных патентных заявках WO05/003169, WO05/003170 и WO05/003171. Поливалентные антитела могут содержать несколько специфичностей, например, могут быть биспецифическими, или могут быть моноспецифическими (см.,
например, W092/22853, WO05/113605, WO2009/040562, W02010/035012 , WO2015/197772).
"Связывающий фрагмент", как используют в настоящем описании, относится к фрагменту, способному связывать целевой пептид или антиген с достаточной аффинностью, чтобы охарактеризовать фрагмент как специфичный к пептиду или антигену.
Специфичность (или специфичный), как используют в настоящем описании, относится к ситуации, когда партнеры при взаимодействии распознают только друг друга или имеют значительно более высокую аффинность друг к другу в сравнении с не партнерами, например, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 раз более высокую аффинность, например, чем фоновый уровень связывания.
Партнеры, как используют в настоящем описании, относятся к связыванию антигена и антитела или взаимоотношениям по типу связывания лиганда и рецептора.
По меньшей мере одна модификация, как используют в настоящем описании, относится к замене, добавлению или делеции аминокислоты, например, для того, чтобы менять свойства последовательности, например, изменять гидрофобность или тому подобное.
Остатки в вариабельных доменах антител стандартно нумеруют в соответствии с системой, разработанной Rabat et al., 1987. Эта система изложена в Rabat et al., 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далее "Rabat et al. (выше)") . Эту систему нумерации используют в настоящем описании, за исключением тех месте, где указано иное.
Обозначения остатков по Rabat не всегда непосредственно соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, чем строгая нумерация Rabat, что соответствует укорочению или инсерции в структурном компоненте, будь то каркас или определяющая комплементарность область (CDR) базовой структуры вариабельного домена. Правильную
нумерацию остатков по Rabat можно определять для заданного антитела посредством выравнивания гомологичных остатков в последовательности антитела со "стандартной" нумерованной последовательностью по Rabat.
CDR вариабельного домена тяжелой цепи расположены в остатках 31-35 (CDR-H1), остатках 50-65 (CDR-H2) и остатках 95102 (CDR-H3) в соответствии с системой нумерации по Rabat. Однако, в соответствии с Chothia (Chothia, С. и Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), петля, эквивалентная CDR-H1, идет от остатка 2 6 до остатка 32. Таким образом, если не указано иное, "CDR-H1", как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения остатков с 26 до 35, как описано с помощью комбинации системы нумерации по Rabat и топологического определения петель по Chothia.
Термин "Fab-фрагмент", как используют в настоящем описании, относится к фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи, содержащий VL (вариабельный легкий) домен и константный домен легкой цепи (CL) и VH (вариабельный тяжелый) домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи.
Fab'-фрагмент, как используют в настоящем описании, относится к Fab-фрагменту, дополнительно содержащему шарнирную область.
Термин "одноцепочечный Fv" или сокращенно "scFv", как используют в настоящем описании, относится к фрагменту антитела, который содержит домены VH и VL антитела, связанные (например пептидным линкером) для того, чтобы формировать единую полипептидную цепь. Константные области тяжелой и легкой цепи отсутствуют в этом формате. Одноцепочечный Fv, как используют в настоящем описании, включает свои стабилизированные дисульфидом версии, в которых в дополнение к пептидному линкеру присутствует дисульфидная связь между вариабельными областями.
Стабилизированный дисульфидом scFv может устранять предрасположенность некоторых вариабельных областей динамически дышать, что относится к вариабельным областям, которые разделяются и снова объединяются.
Термин "однодоменное антитело", как используют в настоящем описании, относится к фрагменту антитела, состоящему из одного мономерного вариабельного домена антитела. Примеры однодоменных антител включают VH или VL или VHH.
Если присутствуют, можно выбирать домены константных областей, учитывая предполагаемую функцию молекулы антитела, и, в частности, эффекторные функции, которые могут быть необходимы. Например, домены константных областей могут представлять собой домены IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, можно использовать домены константных областей IgG человека, в частности, изотипов IgGl и IgG3, когда молекула антитела предназначена для терапевтического применения и необходимы эффекторные функции антитела. Альтернативно, можно использовать изотипы IgG2 и IgG4, когда молекула антитела предназначена для терапевтических целей и эффекторные функции антитела не требуются. Следует принимать во внимание, что варианты последовательностей этих доменов константных областей также можно использовать. Например, можно использовать молекулы IgG4, в которых серии в положении 241 заменен на пролин, как описано в Angal et al. , 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108. Соответственно, в варианте осуществления, где антитело представляет собой антитело IgG4, антитело может содержать мутацию S2 41P.
В одном из вариантов осуществления связывающий фрагмент антитела не содержит Fc-область. "Не содержит Fc-область", как используют в настоящем описании, относится к отсутствию нижних константных доменов, таких как СН2, СНЗ и СН4. Однако могут присутствовать константные домены, такие как СН1, Ск/СХ.
Специалист в данной области также поймет, что антитело может подвергаться различным посттрансляционным модификациям. Тип и степень этих модификаций часто зависят от линии клеток-хозяев, используемых для того, чтобы экспрессировать антитело, а также условий культивирования. Такие модификации могут включать вариации гликозилирования, окисление метионина, образование дикетопиперазина, изомеризацию аспартата и дезамидирование
аспарагина. Частой модификацией является утрата
карбоксиконцевого основного остатка (такого как лизин или
аргинин) под действием карбоксипептидаз (как описано в Harris,
RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).
Соответственно, может отсутствовать С-концевой лизин тяжелой цепи антитела.
В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь антитела содержит домен СН1 и легкая цепь антитела содержит домен CL, к или X.
В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь антитела содержит домен СН1, домен СН2 и домен СНЗ и легкая цепь антитела содержит домен CL, к или X.
"Полиспецифическая молекула", как используют в настоящем
описании, относится к молекуле со способностью специфически
связывать по меньшей мере два отдельных антигена, например,
различных антигена. В одном из вариантов осуществления
полиспецифическая молекула является биспецифической,
триспецифической или тетраспецифической молекулой, в частности, биспецифической молекулой.
Примеры подходящих полиспецифических молекул известны в данной области.
В одном из вариантов осуществления полиспецифические форматы включают те, которые известны в данной области, и те, которые описаны в настоящем описании, например, где формат молекулы выбирают из группы, содержащей или состоящей из: диатела, одноцепочечного диатела, триатела, триотела, тетрател, тандемного scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, diFab, diFab', тандемного scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, одноцепочечного диатела-Fc, одноцепочечного диатела-СНЗ, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, Duobody и DVDIg, которые рассмотрены более подробно далее.
Молекулу, как используют в настоящем описании, используют в биохимическом смысле, чтобы отослать к группе атомов, образующих органическую, в частности, белковую массу, которые включают комплекс, подходящий для обращения в качестве единого целого при подходящих условия, когда комплекс сформирован.
Молекулу и конструкцию используют взаимозаменяемо в настоящем описании, пока контекст не указывает на иное. Хотя конструкцию можно применять более часто, чтобы отослать к полинуклеотидной молекуле, и молекулу можно применять более часто, чтобы отослать к сущности, в первую очередь содержащей аминокислотную последовательность.
Антигены, представляющие интерес, на которые можно направлять связывающий домен в молекуле антитела по настоящему раскрытию, также могут представлять собой любой медицински релевантный белок, такой как те белки, которые находятся под повышающей регуляцией во время заболевания или инфекции, например, рецепторы и/или соответствующие им лиганды. Конкретные примеры белков клеточной поверхности включают: молекулы адгезии, интегрины, такие как |31 интегрины (например, VLA-4), Е-селектин, Р-селектин или L-селектин, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CDW52, CD69, CD134 (ОХ40), ICOS, ВСМР7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, дудулин 2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA124 6, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, нектинподобный 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, эмбриональный опухолевый антиген (CEA), глобулин жира молока человека (HMFG1 и 2), антигены МНС I класса и МНС II класса и VEGF и, где это применимо, их рецепторы.
Растворимые антигены включают интерлейкины, такие как IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15,
IL-16 или IL-17, IL-21, IL-2 3, вирусные антигены, например
антигены респираторного синцитиального вируса или
цитомегаловируса, иммуноглобулины, такие как IgE, интерфероны,
такие как интерферон а, интерферон |3 или интерферон у, фактор
некроза опухоли-а, фактор некроза опухоли-р,
колониестимулирующие факторы, такие как G-CSF или GM-CSF, и тромбоцитарные факторы роста, такие как PDGF-a и PDGF-|3, и, где это применимо, их рецепторы. Другие антигены включают антигены бактериальной клеточной поверхности, бактериальные токсины, вирусы, например, гриппа, EBV, НерА, В и С, средства
биотерроризма, радионуклиды и тяжелые металлы, а также яды и токсины змей и пауков.
В контексте этого описания "содержит" следует интерпретировать как "включает".
Аспекты изобретения, содержащие определенные элементы, также предназначены для распространения на альтернативные варианты осуществления, "состоящие" или "состоящие по существу" из релевантных элементов.
Варианты осуществления и описания раскрытия можно и следует комбинировать, где технически подходит.
Любой положительный вариант осуществления или его сочетание, описанные в настоящем описании, может представлять собой основу для негативного исключения, т. е. дискламации.
ПРИМЕРЫ
Фиг. 1. Гуманизация и снижение аффинности антитела СА645. Последовательности тяжелых и легких цепей антитела СА645 выровнены с акцепторными каркасными последовательностями зародышевой линии человека VH3 1-3 3-23/JH4 и Vkl 2-1-(1) L5/JK4. Остатки кролика представлены красным, остатки человека представлены черным и CDR представлены синим (показаны остатки CDR J-области, но не CDR акцепторной V-области). Пересаженные последовательности VH (дН) и VL (gL) приведены под соответствующими им акцепторными каркасами зародышевой линии человека. Различия в каркасных последовательностях между каркасными последовательностями человека и кролика показаны звездочками. Каркасные остатки кролика, сохраненные в гуманизированных трансплантатах, выделены полужирным.
Фиг. 2. Связывание FcRn с HSA и MSA в присутствии или отсутствии СА645 gL4gH5 Fab. Связывание с HSA в отсутствие Fab (красный круг), связывание с HSA в присутствии Fab (красный треугольник), связывание с MSA в отсутствие Fab (синий квадрат), связывание с MSA в присутствии Fab (синий треугольник).
Фиг. 3. (А) Кристаллическая структура СА645 gL4gH5 Fab в комплексе с HSA. (В) Суперпозиция СА645 Fab-HSA и кристаллической структуры комплекса FcRn-HSA, код PDB 4N0F. FcRn
состоит из тяжелой цепи, показанной зеленым, и обычного (32-микроглобулина (J32M) , показанного оранжевым. (С) Суперпозиция СА64 5 Fab-HSA и кристаллических структур HSA в комплексе с миристиновой кислотой, код PDB 1BJ5, показана красным, ибупрофеном, код PDB 2BXG, показан синим, и варфарином, код PDB 2BXD, показан маджентой. Также в альбумине помечены 7 сайтов связывания жирных кислот (FA).
Фиг. 4. Суперпозиция CA645-HSA и RbSA. Увеличенный вид областей вокруг остатков альбумина в положениях (А) 364, (В) 320 и (С) 358. Тяжелая цепь СА645 показана синим; легкая цепь СА645 показана серебристым; HSA показан пшеничным; RbSA показан розовым. Нежелательные наложения определяют как два тяжелых атома из различных остатков, которые находят в пределах 2 ангстремов друг от друга, и обозначают черным кругом.
Фиг. 5. Фармакокинетика. СА64 5 Fab трансплантаты внутривенно инъецировали мышам по 10 мг/кг и определяли концентрации Fab в сыворотке в различные моменты времени с помощью ELISA. Данные нормализовали с учетом максимальной концентрации в первый момент времени.
Фиг. 6. Процентная доля трех СА645 Fab в крови в зависимости от аффинности к MSA. % свободных Fab вычисляли для диапазона KD 1-106 нМ (синие ромбы) с использованием решения квадратного уравнения действующих масс45. % свободного Fab для трансплантатов gL4gH5, gL5gH5, gL4gH37 и gL5gH47 с аффинностями к MSA 2,23161146 и 62400 нМ, соответственно, показаны красными квадратами.
Фиг. 7. Последовательности по раскрытию
Таблица 1. Профили активности антител против сывороточного альбумина человека (HSA). Скрининг по технологии флуоресцентного анализа в микрообъеме (FMAT) для секретируемых антител против HSA в супернатантах В-клеток на связывание со 100 нг/мл HSA в присутствии или в отсутствие 25 мкМ альбумин-связывающих соединений (варфарин, ибупрофен, миристиновая кислота и хлорид меди) и на связывание со 100 нг/мл сывороточного альбумина крысы (RSA) . РЪ=интенсивность флуоресценции. Равновесные константы
связывания (KD) Fab-фрагментов кролика против HSA с сывороточным альбумином человека и мыши (MSA), и эквивалентных гуманизированных антител IgG с HSA, MSA и RSA, которые определяли посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Таблица 2. Аффинность СА645 gL4gH5 Fab к сывороточному альбумину от различных биологических видов. Константы скорости ассоциации (ка) и диссоциации (kd) и равновесные константы связывания (KD) , которые определяли с помощью SPR.
Таблица 3. Совокупность рентгеновских данных и уточняющая статистика. Значения в круглых скобках для оболочки с самым высоким разрешением.
Таблица 4. Кинетика связывания и фармакокинетика СА645 Fab трансплантатов. Константы скорости ассоциации (ка) и диссоциации (kd) и равновесные константы связывания (KD) определяли с помощью SPR. 3 мышам (М1-3)/группа дозировали внутривенно 10 мг/кг каждого СА645 трансплантата. Приведены среднее и стандартное отклонение (SD) для каждой группы. *измерено в устойчивом состоянии.
Таблица 5. Представлена аффинность для различных трансплантатов.
Таблица б. Аффинность СА645 gL4gH5 Fab к HSA в диапазоне рН 5,0-7, 0
Таблица 7. (А) (В) (С) Кинетика связывания СА645 Fab трансплантатов. Константы скорости ассоциации (ка) и диссоциации (kd) и равновесные константы связывания (KD) определяли с помощью SPR.
Обнаружение антител
Двух кроликов Half Lop иммунизировали подкожно с использованием 200 мкг HSA (Jackson ImmunoResearch). Полный адъювант Фрейнда (Sigma Aldrich) вводили совместно с первой дозой, а последующие дозы содержали неполный адъювант Фрейнда. В-клетки собирали из сывороток кроликов и культивировали в течение 7 суток, чтобы индуцировать клональную экспансию и секрецию антител. Технологию флуоресцентного анализа в микрообъеме (FMAT) использовали для скрининга супернатантов на
связывание с HSA20-22. Супернатанты смешивали со стрептавидиновыми бусами (Bangs Laboratories, Inc), покрытыми биотинилированным Fc козы против кролика и Alexa Fluor 64 7 Chrompure Human Albumin (Jackson ImmunoResearch). Планшеты считывали на Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System. 48 лунок с наивысшим сигналом интенсивности флуоресценции (FL) переносили в один мастер-планшет и повторяли скрининг, как ранее, но с двумя дополнительными отсевами. В одном отсеве Alexa Fluor 647 Chrompure Human Albumin предварительно инкубировали в течение 1 часа с 25 мкМ раствором альбумин-связывающих средств; варфарина, ибупрофена, миристиновой кислоты и хлорида меди (все индивидуально получали из Sigma Aldrich) . Во втором отсеве HSA заменяли на сывороточный альбумин крысы (Sigma Aldrich) , которые метили с использованием набора для мечения моноклональных антител Alexa Fluor 647(r) (Molecular Probes).
Индивидуальные HSA-специфические В-клетки выделяли способом флуоресцентного фокуса20-22. В-клетки из положительных лунок смешивали со стрептавидиновыми бусами (Bangs Laboratories, Inc), покрытыми биотинилированным-HSA (Jackson ImmunoResearch) и конъюгатом Fc фрагмента козы против кролика и флуоресцеинизотиоцианата (Chemicon). После 1 часа инкубации при 37°С, антиген-специфические В-клетки можно идентифицировать по присутствию флуоресцентного гало, окружающего эту В-клетку. Микроскоп Olympus 1X7 0 и микроманипулятор Eppendorf использовали для того, чтобы идентифицировать и переносить индивидуальные В-клетки в пробирки для ПЦР. Гены вариабельных (V) областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов отдельных клеток амплифицировали посредством RT-ПЦР и клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих UCB, содержащие области тяжелого СН1 кролика и легкого Ск кролика, соответственно. После временной экспрессии в клетках НЕК2 93 проводили дополнительный скрининг рекомбинантных Fab против HSA в SPR анализах связывания с HSA и MSA.
Гуманизация
Альбумин-специфические антитела гуманизировали in silico
посредством трансплантации CDR из V-областей антител в каркасы
V-областей Vkl и VH3 антител человека эмбрионального типа. CDR,
трансплантированные из донорной в акцепторную
последовательность, представляли собой то, что определено в
Rabat et al.32, за исключением CDR-H1 (остатки 26-35), где
использовали комбинированные определения из Rabat et al. и
петлевую структуру23. Когда каркасный остаток различался между
донорной последовательностью кролика и акцепторной
последовательностью человека в положении, которое считали важным для сохранения связывания антигена, тогда остаток донора включали в начальный консервативный трансплантат21. Гены консервативных трансплантатов химически синтезировали в Entelechon, GmbH. Гены трансплантатов тяжелых цепей (gHl) клонировали в два экспрессирующих вектора UCB, один содержал домен yl СН1 человека и другой содержал полную константную область yl человека. Гены трансплантатов легких цепей (gLl)
клонировали в экспрессию UCB, содержащую константную область к человека (аллотип Rm3) . Впоследствии эти конструкции модифицировали посредством направляемого олигонуклеотидами мутагенеза для того, чтобы создавать определенное число различных вариантов для трансплантатов как тяжелых, так и легких цепей. Векторы тяжелых и легких цепей совместно трансфицировали в клетки HER2 93 и осуществляли скрининг рекомбинантных молекул Fab или IgG с использованием SPR анализа связывания для того, чтобы измерять аффинность к HSA, MSA, RSA, CSA, RbSA и BSA. Экспрессия антител
Антитела временно экспрессировали в клетках HER-2 93 с
использованием липидной трансфекции 293Fectin (Life
Technologies, № по каталогу 12347-019, по инструкциям
производителя) или клетках CHO-S ХЕ, клеточной линии, полученной
из CHO-R133, с использованием электропорации. Клетки HER-2 93
использовали для экспрессии в малом масштабе ( < 100 мл) для
того, чтобы получать антитела для SPR анализа. Клетки CHO-S ХЕ
использовали для экспрессии в большом масштабе (1 лит) для того,
чтобы получать антитела для кристаллографии и
фармакокинетических исследований in vivo. Очистка белка
Аффинную хроматографию использовали для того, чтобы очищать белок Fab от культуральных супернатантов. Супернатанты пропускали через колонку HiTrap Protein G (GE Healthcare) при скорости потока, которая давала время контакта с колонкой 25 мин. После стадии промывания в PBS рН 7,4, связанный материал элюировали с использованием 0,1 М глицина рН 2,7 и нейтрализовали с использованием 2 м Tris-HCl (рН 8,5) . Фракции, содержащие Fab, объединяли, определяли их количественно по поглощению при 280 нм и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra (Merck Millipore). Для выделения мономерной фракции использовали эксклюзионную хроматографию на колонке HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной в PBS, рН 7,4. Фракции, содержащие мономерный Fab, объединяли, определяли их количественно, концентрировали и хранили при 4°С.
Поверхностный плазмонный резонанс
Аффинности связывания и кинетические параметры для
взаимодействий антител определяли посредством поверхностного
плазмонного резонанса (SPR), который проводили на Biacore Т200
или Biacore 3000 с использованием чипов датчиков СМ5 (GE
Healthcare Bio-Sciences АВ) и подвижного буфера HBS-EP (10 мМ
HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% об./об. Р20, рН 7,4). Для
анализа при рН 7,0, 6,0, 5,5 и 5,0 использовали подвижный буфер
из 4 0 мМ лимонной кислоты, 8 0 мМ фосфата натрия, 50 мМ NaCl, 3
мМ EDTA, 0,05% об./об. Р20. Необходимого рН достигали
посредством изменения соотношения лимонной кислоты и фосфата
натрия. Все эксперименты осуществляли при 2 5°С. Образцы антител
захватывали на поверхности чипа датчика с использованием Fab
козы со специфичностью к F(ab')2 человека или Fc человека
(Jackson ImmunoResearch). Ковалентной иммобилизации
захватывающего антитела достигали с помощью стандартной реакции сочетания аминов до уровня в 6000-7000 единиц ответа (RU) .
Альбумин человека (Jackson ImmunoResearch, № по каталогу
009-000-051), мыши (Sigma Aldrich, № по каталогу А3559), крысы (Sigma Aldrich, № по каталогу А6414), кролика (Sigma Aldrich, № по каталогу А0764), коровы (Sigma Aldrich, № по каталогу 05470) и яванского макака (Equitech-Bio, № CMSA-0050) титровали поверх захваченного антитела в различных концентрациях от 50 нМ до 500 мкМ. Каждый цикл анализа состоял из начального захвата образца антитела с использованием 1 мин впрыска, перед фазой ассоциации, состоящей из 3 мин впрыска альбумина, после чего осуществляли мониторинг диссоциации. После каждого цикла захватывающую поверхность регенерировали с использованием двух 1 мин впрысков 40 мМ НС1, после чего следовал 5 мМ NaOH в течение 30 с. Используемые скорости потока составляли 10 мкл/мин для захвата, 3 0 мкл/мин для обеих фаз ассоциации и диссоциации и 10 мкл/мин для регенерации. Пустую проточную кювету использовали для вычитания эталона и впрыски пустого буфера включали для того, чтобы вычитать шум и дрейф прибора. Кинетические параметры определяли посредством одновременной глобальной аппроксимации получаемых сенсограмм к стандартной модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation v2.0.1 и программного обеспечения BIAEvaluation v4.1.1, за исключением СА645 gL5gH47, которое аппроксимировали в Prism с использованием модели аффинности в устойчивом состоянии.
Для того чтобы измерять эффект СА645 Fab, оказываемый на силу связывания FcRn с альбумином, посредством SPR, использовали прибор Biacore3000 с чипом СМ5, предварительно обработанным посредством иммобилизации HSA и MSA на отдельных проточных кюветах до уровней 270 RU и 247 RU, соответственно. Образцы FcRn получали в диапазоне от 50 нМ до 50 мкМ в подвижном буфере (100 мМ MES, 150 мМ NaCl, 0,05% об./об. Р20, рН 5,5), и также они содержали или 0 или 100 нМ СА645 Fab. Каждый цикл анализа проводили при скорости потока 10 мкл/мин, и он состоял или из 5 мин впрыска 100 нМ СА64 5 Fab в предварительно насыщенный иммобилизованный альбумин, после чего следовал 5 мин впрыск одного из вышеуказанных полученных растворов FcRn в присутствии СА645 Fab, или 5 мин впрыска подвижного буфера, после чего следовал 5 мин впрыск одного из вышеуказанных растворов FcRn в
отсутствие СА64 5 Fab. В любом случае третий 5 мин впрыск следовал незамедлительно в конце второго впрыска, при использовании режима "coinject", что включает соответственно, буфер или 100 нМ СА645 Fab. Пустую проточную кювету использовали для вычитания эталона и включали пустые циклы, где FcRn заменяли на буфер, чтобы вычитать дрейф и шум. Цикл регенерации проводили как и выше. Уровни связывания на плато, скорректированные по пустой пробе, для FcRn наносили на график в Prism и аппроксимировали к модели устойчивого состояния.
Кинетику связывания мутантных СА645 Fab и дикого типа при рН 5,5 также исследовали в обратном формате на Biacore3000 с использованием чипа с иммобилизованным альбумином. В этом случае проводили циклы, в которых впрыскивали растворы Fab в диапазоне от 5 до 5000 нМ с 5 мин фазами ассоциации и диссоциации. Буферные пустые циклы также включали для того, чтобы корректировать дрейф.
Кристаллография
Для того чтобы получать комплекс, очищенный СА645 Fab и HSA, не содержащий жирных кислот (Sigma Aldrich, № по каталогу А3782), смешивали в молярном соотношении 1:1 и инкубировали в течение ночи при 4°С. СА64 5 Fab и комплекс очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной с использованием 50 мМ NaCl, 25 мМ Tris, 5% (об./об.) глицерина. Фракции, содержащие СА645 Fab или комплекс, объединяли и концентрировали до 10 мг/мл и 7 0 мг/мл, соответственно. Условия, подходящие для роста кристаллов, идентифицировали с помощью способа паровой диффузии в сидячей капле с использованием коммерчески доступного скрининга кристаллизации (Qiagen).
Для того чтобы создавать кристаллы дифракционного качества, использовали способ паровой диффузии в сидячей капле, где 1 мкл раствора белка смешивали с 1 мкл резервуарного раствора. Для СА645 Fab резервуар содержал 500 мкл 2 М DL-яблочной кислоты. Кристаллы собирали и подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте без дополнительного криопротектора. Дифракционные данные
до 2,68 ангстрема собирали для монокристалла на оси пучка 104 в Diamond Light Source, Oxford, UK и обрабатывали с использованием MOSFLM и SCALA34~36. Структуру СА645 Fab разрешали посредством молекулярного замещения с использованием Phaser37, используя координаты структуры Fab собственной разработки в качестве модели поиска. Для комплекса резервуар содержал 500 мкл 0,1 М лимонной кислоты рН 4,4, 0,1 М гидрофосфата динатрия, 38% об./об. этанола и 5% об./об. полиэтиленгликоля 1000 (PEG1000). Кристаллы криозащищали посредством нескольких добавлений капли 1 мкл резервуарного буфера, содержащего 25% (об./об.) PEG1000, пока концентрация PEG1000 в капле не достигала 20%. Чтобы минимизировать напряжение в кристалле, каждое добавление отделяли по меньшей мере 1 часом. Кристаллы собирали и подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте. Дифракционные данные до 3,58 ангстрема собирали для монокристалла на оси пучка 102 в Diamond Light Source, Oxford, UK и обрабатывали с использованием XDS38. Структуру комплекса разрешали посредством молекулярного замещения с использованием Phaser и координат структуры СА645 Fab и HSA (код PDB 4G03)39 в качестве моделей поиска.
Обе начальные структуры уточняли с использованием итеративных циклов симуляции отжига, минимизации энергии и ручной перестройки с использованием CNS40,41 и COOT42. Из-за достаточно низкого разрешения комплекса модель ограничивали во время уточнения с использованием функции DEN из CNS. Геометрию модели валидировали с использованием Molprobity43. Молекулярную визуализацию выполняли с использованием Pymol44. Совокупность данных и уточняющая статистика сведены в таблице 3.
Коды доступа
Координаты и структурные факторы СА64 5 Fab и комплекса СА645 Fab-HSA депонировали в Protein Data Bank (PDB) с использованием кодов доступа, X и Y, соответственно.
Фармакокинетика у мышей
Трем самцам мышей BALB/c внутривенно дозировали антитело по 10 мг/кг. Серию образцов крови собирали через хвостовую венопункцию в несколько моментов времени вплоть до 100 ч после
дозы. Для получения сывороток образцы крови центрифугировали в течение 5 мин на 10000 об./мин при комнатной температуре и анализировали концентрацию антитела посредством ELISA. Антитело против антигена Fab и конъюгат против к цепи человека и пероксидазы хрена (Stratech) использовали в качестве захватывающего и вторичного антитела, соответственно. Очищенный образец антигена Fab использовали в качестве стандарта. Планшеты проявляли с использованием раствора ТМВ пероксидазы (Sigma-Aldrich) и считывали при 450 нм (эталон при 630 нм) . Фармакокинетические параметры вычисляли по массиву конечных данных с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin 6.2.
Вычисление свободного СА64 5 Fab
Для того чтобы определять концентрацию несвязанного Fab (молекулярная масса=47907 Да) в 2 мл крови 20 г мыши, после дозы 10 мг/кг использовали следующее уравнение31:
Концентрация свободного Fab х=(-b+SQRT(b2~4ac) )/2а
где:
Ь=(-(КА* [Tab] )+1+ (КА* [Tag] )) а=КА=1/ KD с=(-[ТаЬ] ) Кв=аффинность Fab
КА=равновесная константа ассоциации [Tab]=концентрация Fab (2 087 нМ) [Tag]=концентрация альбумина (600 мкМ) Для вычисления процентной доли свободного Fab % Free Fab=([свободный Fab]/ [Tab])*100 Результаты
Создание и определение характеристик mAb к сывороточному альбумину среди биологических видов
Для того чтобы создавать панель антител против HSA с межвидовой реактивностью, двух кроликов иммунизировали с использованием HSA. Из сывороток собирали В-клетки, культивировали их, стимулировали к секреции IgG и осуществляли скрининг с использованием технологии флуоресцентного анализа в
микрообъеме (FMAT) для того, чтобы идентифицировать антиген-специфические лунки20-22. Кроме того, в FMAT скрининге оценивали связывание с RSA и связывание с HSA в присутствии или в отсутствие известных альбумин-связывающих соединений; варфарина, ибупрофена, миристиновой кислоты и хлорида меди. Данные для пяти антител с наивысшими рангами приведены в таблице 1. Сигнал интенсивности флуоресценции для связывания с HSA был наименьшим для СА645. Однако СА645 сохранял 80% связывающей активности в присутствии соединений, тогда как СА646, СА647, СА648 и СА649 сохраняли только 40%. Уровни связывания с HSA и RSA наиболее близко совпадали для СА645 и СА64 6, находясь в пределах 5 крат. В отличие от этого, уровни связывания с RSA у СА64 7, СА64 8 и СА649 были в 9-18 раз ниже, чем с HSA.
Чтобы извлекать вариабельные области тяжелых и легких цепей пяти антител, способ флуоресцентного фокуса использовали для выделения отдельных В-клеток и затем осуществляли RT-ПЦР. Вариабельные области клонировали в экспрессирующие векторы, содержащие тяжелый СН1 и константные области легкой цепи кролика, и затем секвенировали ДНК. Так обнаруживали, что последовательности антител уникальны, за исключением СА64 5 и СА64 6, которые имели идентичные последовательности тяжелых цепей. Учитывая, что СА645 и СА64 6 должны связываться с одним и тем же эпитопом через тяжелую цепь, не ясно, почему на связывание СА64 6 больше влияло присутствие лигандов. Также при секвенировании определяли, что определяющие комплементарность области (CDR) всех антител не содержали остатки гистидина. Это важно для дальнейшего развития этих антител, поскольку гистидиновые остатки присоединяют протон при кислом рН и потенциально это может нарушать связывание антигена.
После трансфекции клеток НЕК2 93, рекомбинантные молекулы Fab анализировали посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на аффинность к HSA и сывороточному альбумину мыши (MSA). СА64 5 и СА64 6 демонстрировали самые сильные аффинности к HSA, при 0,31 нМ и 0,14 нМ, соответственно, и к MSA при 2,6 нМ и 1,6 нМ, соответственно (таблица 1) . Кроме того, их аффинности к HSA и MSA наиболее близко совпадали для всех
антител. Это соответствовало данным скрининга супернатантов В-клеток для HSA и RSA.
Гуманизация и отбор ведущего кандидата
Все пять антител гуманизировали посредством пересадки CDR в каркасы Vkl и VH3 человека и обратной мутации каркасных остатков в положениях, которые считали важными для сохранения связывающей активности23. Схема гуманизации для СА645 представлена на фиг. 1. Стоит отметить, что области каркаса три (остатки 66-94) донорных тяжелых цепей кролика были короче таковых акцепторных каркасных последовательностей человека. СА647 и СА649 короче на один остаток, тогда как СА645 и СА64 6 (идентичные последовательности) и СА64 8 короче на два остатка. Во всех случаях сохранялся пропуск в начальном консервативном gLlgHl трансплантате.
Консервативные трансплантаты экспрессировали в виде антител
IgGl человека и анализировали посредством SPR на связывание с
HSA, MSA и RSA. Гуманизированные IgG демонстрировали ту же
тенденцию связывания с HSA и MSA, как наблюдали для
рекомбинантных родительских Fab кролика (таблица 1) . Аффинности
к HSA у СА64 7, СА64 8 и СА64 9 схожи с таковыми у СА64 5 и СА64 6,
но при сравнении они демонстрировали б-10-кратное снижение
аффинности к MSA. Аффинности к RSA у СА64 8 и СА64 9 также
демонстрировали 5-10-кратное снижение по сравнению с СА64 5 и
СА64 6. СА64 6 демонстрировал немного более высокие аффинности к
HSA, MSA и RSA, чем СА64 5, но выход временной экспрессии в 4
раза ниже при 35 мг/мл по сравнению с 161 мг/мл (таблица 1) . На
основе почти максимального сохранения связывания с HSA в
присутствии известных альбумин-связывающих средств,
согласованной связывающей активности в отношении альбумина среди нескольких биологических видов и хорошего выхода при временной экспрессии, авторы изобретения выбирали СА645 в качестве своего ведущего кандидата на дальнейшее развитие. Дополнительные варианты трансплантатов СА645 gLlgHl создавали посредством замены донорных остатков кролика на акцепторные остатки человека и замены пропуска в каркасе три тяжелой цепи на эквивалентные остатки человека. Варианты трансплантатов оценивали по
аффинности к HSA и выходу временной экспрессии (данные не представлены). Финальная выбранная пара трансплантатов представляла собой gL4 и дН5 (фиг. 1).
Показано, что аффинности СА645 gL4gH5 Fab к HSA, MSA, RSA и сывороточному альбумину кролика (RbSA) составляют 4,6, 7,1, 54 и 162 нМ, соответственно (таблица 2) . Что значимо для полезности СА645 gL4gH5 Fab в токсикологических исследованиях у яванского макака и в моделях заболевания, аффинность к сывороточному альбумину яванского макака (CSA) очень схожа с таковой к HSA при 3,3 нМ. Кроме того, СА645 Fab не способен связываться с бычьим сывороточным альбумином.
Для того чтобы определять, вероятно останется ли СА645 gL4gH5 связанным с альбумином в кислой среде ранней эндосомы и будет возвращен на клеточную поверхность, аффинность измеряли при рН 5,0-7,0 (таблица S1). Аффинности СА645 gL4gH5 Fab к HSA при рН 5,0, рН 5,5, рН б,0 и рН 7,0 составляли 7,1, 10,7, 12,5 и 13,3 нМ, что указывает на то, что этот физиологически релевантный диапазон рН главным образом не влияет на связывание.
Для того чтобы определять, может ли HSA связываться с FcRn в присутствии СА645 gL4gH5 Fab, использовали SPR. Проводили кинетический анализ при рН 5,5, чтобы обеспечивать оптимальное связывание с альбумином посредством FcRn. HSA или MSA связывали непосредственно с чипом датчика, затем или СА645 gL4gH5 Fab, чтобы насыщать СА645 сайты связывания альбумина, или подвижный буфер впрыскивали в проточную кювету. За этим следовал впрыск FcRn+CA64 5 Fab или отдельно FcRn. СА64 5 Fab включали в совместный впрыск с FcRn для того, чтобы поддерживать насыщение СА64 5 сайтов связывания. На фиг. 2 представлены уровни связывания FcRn с HSA и MSA после вычитания сигналов для СА645. Присутствие СА645 gL4gH5 Fab не оказывало влияния на связывание FcRn с обоими альбуминами.
Кристаллография
Для того чтобы идентифицировать, где СА645 связывается с HSA, определяли кристаллическую структуру комплекса СА64 5 Fab-HSA. Препарат белка комплекса СА645 Fab-HSA концентрировали до 70 мг/мл24 и кристаллизовали с использованием этанола и PEG1000 в
качестве осадителей. Чтобы содействовать разрешению структуры комплекса с молекулярным замещением, авторы изобретения также определяли структуру несвязанного СА645 Fab. Авторы изобретения наблюдали отдельные копии и Fab и комплекса Fab-HSA в асимметричных ячейках соответствующих им кристаллов (таблица 3) . Структуру трех Fab уточняли до 2,68 ангстрема с конечным значением RWOrk 21,14% и значением Rfree 2 5,13%. Структуру комплекса уточняли до 3,6 ангстрема с конечным значением Rwork 21,38% и значением Rfree 2 5, 23%.
Кристаллическая структура комплекса СА64 5 Fab-HSA показывала, что СА645 связывается с доменом II из HSA (фиг. ЗА) . Суперпозиция кристаллической структуры FcRn в комплексе с HSA
(код PDB 4N0F)25 показывала, что СА645 не блокирует связывание HSA с FcRn (фиг. ЗВ). HSA содержит семь сайтов связывания жирных кислот (FA). Сайты FA7 и FA3/FA4 представляют собой два основных сайта связывания лекарственных средств26. Лекарственные средства также связываются с сайтами FA1, FA5 и FA6, но с более слабой аффинностью. Сайты связывания ионов металлов расположены между доменом I и II и в сайте на N-конце27. Суперпозиция комплекса и кристаллических структур HSA в комплексе с варфарином (код PDB 2BXD)28, ибупрофеном (код PDB 2BXG)28 и миристиновой кислотой (код PDB 1BJ5)29 показывала, что СА645 связывается близко к сайту FA6 и не закрывает основные сайты связывания лекарственных средств
(FA7 и FA3/FA4), жирных кислот или ионов металлов (фиг. ЗС).
Кинетику связывания СА645 gL4gH5 Fab с HSA в сравнении с таковой для MSA, CSA, RSA и RbSA (таблица 2) можно объяснять с помощью внимательного визуального исследования кристаллической структуры. Эпитоп на HSA формируют остатки F2 0 6, G2 07, R2 09, С316, К317, AEAKD 320-324, К351, Е354, Е358, К359, С361, А362 и A364. Аффинности СА64 5 к CSA (3,3 нМ) и MSA (7,1 нМ) очень схожи с аффинностью к HSA (4,6 нМ) . Вероятно, это обусловлено присутствием в CSA и MSA тех же остатков, которые образуют эпитоп в HSA. RSA имеет все эти остатки, за исключением положения 3 64, которое представляет собой глицин. Положение 3 64 расположено на кончике короткой петли (положения 3 62-3 65),
который соединяет две а-спирали (положения 366-398 и 342-361) вместе (фиг. 4А) . Эту короткую петлю связывают CDR 1 и 2 из тяжелой цепи СА645. Аффинность СА645 к RSA составляет приблизительно в 10 раз ниже, чем к HSA. Возможно, что отсутствие боковой цепи аланина увеличивает гибкость петли, по сравнению с таковой у HSA, и изменяет кинетику связывания.
RbSA имеет все остатки эпитопа HSA, за исключением положений 320, 358 и 364. Суперпозиция кристаллической структуры RbSA (код PDB 3V0 9)30 показывала явные нежелательные наложения с СА645 Fab в положениях 320 и 358, и потенциальное нежелательное наложение в положении 3 64. В RbSA положение 3 64 представляет собой аспарагиновую кислоту, и хотя не было явного нежелательного наложения, это положение представляет собой контактный остаток и, следовательно, вероятно, влияет на связывание с СА645. В HSA положение 320 представляет собой аланин, и оно образует гидрофобное взаимодействие с F58 в CDRH2 (фиг. 4В) . BRbSA положение 32 0 представляет собой глутаминовую кислоту, и оно нежелательные наложения с остатками CDRH2 W52 и F58. Остаток Е358 в HSA образует сеть водородных связей с S100 и ТЮОа в CDRH3 (фиг. 4С). Положение 358 в RbSA представляет собой лизин, и оно нежелательные наложения с Y99 в CDRH3. Более слабая аффинность СА64 5 к RbSA по сравнению с HSA полностью обусловлена 18-кратным снижением скорости ассоциации (таблица 2) . Вероятно, это обусловлено присутствием в RbSA более крупных боковых цепей в положениях 320 и 358 и, возможно, 364.
Фармакокинетика вариантов со сниженной аффинностью Чтобы исследовать корреляцию между временем полужизни СА64 5 и его аффинностью к альбумин, авторы изобретения создавали панель мутантов СА645 gL4gH5 Fab с широким диапазоном сниженных аффинностей и затем анализировали их фармакокинетические свойства у мышей. Мутации разрабатывали с использованием кристаллической структуры комплекса СА645 gL4gH5 Fab-HSA в качестве руководства. Направляемый олигонуклеотидами мутагенез использовали для того, чтобы генерировать двадцать вариантов в шести положениях остатков тяжелой цепи и двадцать семь вариантов
в шести положениях остатков легкой цепи (таблицы 4, S2A, S2B и S2C) . Мышам BALB/c дозировали, посредством одной внутривенной инъекции по 10 мг/кг, СА645 gL4gH5 Fab и поднабор из четырех вариантов Fab, gL5gH5, gL4gH37, gL5gH37 и gL5gH47. Брали образцы сыворотки крови в течение 103 часов и количественно определяли уровень Fab посредством ELISA.
СА645 gL5gH37 не демонстрировал, посредством SPR, поддающееся обнаружению связывание с HSA и подвергался быстрому выведению при времени полужизни в сыворотке только 0,48+0,06 ч (таблица 4) . Это согласуется с коротким временем полужизни (0,7 я) Fab против TNF, которое наблюдали у крыс19. В отличие от этого, gL4gH5 демонстрировал значительно увеличенное время полужизни 8 4+4,6 ч. Вариантом с самой слабой аффинностью, в фармакокинетическом профиле которого отсутствовало отличие от gL4gH5, являлся gL5gH5 (фиг. 5) . gL5gH5 содержал одну мутацию в легкой цепи, W30A, и его аффинность составляла 453 нМ. Эта аффинность в 368 раз слабее таковой у gL4gH5 (1,23 нМ) , но его время полужизни (96,7+20,4 ч) эквивалентно таковому у gL4gH5. Наблюдали изменение фармакокинетического профиля для gL4gH37. Он имеет одну мутацию в тяжелой цепи, F58E, и его аффинность составляла 955 нМ. Эта аффинность в 776 раз ниже, чем у gL4gH5, но время полужизни все же продлевалось до 61+16,8 ч. gL5gH47 содержал одну мутацию в легкой цепи, W3 0A, и одну мутацию в тяжелой цепи, TlOOaS, и имел аффинность 52 мкМ, как измеряют посредством SPR устойчивого состояния. Эта аффинность в 4227 6 раза слабее таковой у gL4gH5, однако фармакокинетический профиль не отличался значительно от gL4gH37 и время полужизни возрастало до 2 6, 3+3,1 ч .
Мутанты разрабатывали и отбирали на основе аффинности к HSA, но фармакокинетическая модель была мышиной. Следовательно, чтобы подтверждать, что аффинности мутантов к HSA отражали их аффинности к альбумину у мыши, повторяли SPR (таблица 5). Аффинности gL4gH5 и gL5gH5 составляли 1,8 и 254 нМ к HSA и, аналогичным образом, 2,2 и 316 нМ к MSA. Эти данные согласовывались с предварительно определенными аффинностями
gL4gH5 и gL5gH5 к HSA 1,23 и 453 нМ, соответственно.
Используя решение квадратного уравнения действующих масс, авторы изобретения могут оценивать процентную долю свободного Fab в крови для каждого из вариантов31. Если принять концентрацию MSA (65,9 кДа) 44 г/л и объем крови у 20 г мыши в 2 мл, то для дозы 10 мг/кг, концентрация СА645 Fab (47,9 кДа) составит 2087 нМ. На фиг. 6 представлен график процентной доли свободного Fab в зависимости от аффинности к альбумину в диапазоне 1-106 нМ. Предсказано, что при аффинности к MSA 2,2 нМ в крови не связано только 0,0003% gL4gH5 Fab. Аффинность к MSA у gL5gH5 Fab составляет 316 нМ. Он имеет фармакокинетический профиль и время полужизни, которые совпадают с таковыми у gL4gH5, и, по вычислениям, он имеет аналогично низкий уровень свободного Fab 0,05%. Авторы изобретения не смогли измерять аффинности gL4gH37 Fab и gL5gH47 Fab к MSA. Однако, поскольку аффинности обоих gL4gH5 и gL5gH5 к MSA в 1,2 раза слабее, чем к HSA (таблица 5), можно обоснованно предсказать, что аффинности gL4gH37 и gL5gH47 будут пропорционально слабее в 1,2 раза. Следовательно, при предсказанных аффинностях к MSA 1146 нМ и 62,4 мкМ, вычисляли, что потенциально в крови свободно 0,17% gL4gH37 и 8,57% gL5gH47, соответственно.
¦R-work/Rf гее
0,2114/0,2513
0,2138/0,2523
№ атомов
Белок
3311 (за исключением Н)
7870 (искл. Н)
Вода
В-факторы
Белок
31, 55
115,14
Вода
24,24
Среднеквадратичные отклонения
Длины связей (ангстрем)
0, 007
0, 010
Углы связей (°)
1,447
1,446
Таблица 4
Мутация
SPR
Время полужизни (ч)
Транспла Легкая Тяжелая
нтаты цепь цепь
СА64 5
gL4gH5 1 1
gL5gH5 W30A
gL4gH37 - F58E
gL5gH37
gL5gH47 W30A TlOOaS
W30A F58E
ka kd
xlO5 xlCT4
(1/Mc) (1/c)
1,39 1,72
1,26 571
0,61 583
(М)
1,23 ~~85 88 79 84 4,6
453 120 82 88 96, 7 20,4
955 55 48 80 61 16,8
52 27 23 29 26,3 3,1
мкМ*
NB 0,54 0,42 0,47 0,48 0,06
Таблица 5
KD (нМ)
5, 0
7,1
5, 5
10,7
6, 0
12,5
7,0
13,3
Трансплантат ы CA64 5
Мутация
легкой
цепи
Мутация тяжелой цепи
ках104 (1/Мс)
kdxl0-4 (1/с)
KDxlO-9 (М)
gL4gH5
5, 91
1, 61
2,72
gL15 gH5
S31R
6, 01
2,77
4, 62
gL16 gH5
S31W
5, 53
1, 69
3, 06
gL17 gH5
S31N
5, 88
3,23
5, 50
gL18 gH5
S31I
5, 32
8,23
15, 47
gL19 gH5
S31D
5,20
2, 60
5, 00
gL2 0 gH5
S31Q
5, 55
7, 94
14,30
gL21 gH5
S31E
5, 10
3,23
6, 34
gL22 gH5
S31H
5, 57
4,78
8,58
gL23 gH5
S31L
5,49
8, 14
14, 82
gL24 gH5
S31V
5, 47
8, 83
16, 14
gL25 gH5
S31F
5, 62
2, 17
3, 85
gL2 6 gH5
S31Y
6, 01
2,48
4, 13
gL4gH31
S54V
4, 00
1, 67
4, 18
gL4gH32
S54I
3,86
1, 69
4,38
gL4gH33
S54L
3, 89
2,40
6, 18
gL4gH34
S54Q
3, 85
4,22
10, 97
gL4gH35
S54E
2, 65
3, 99
15, 06
gL4gH5
5,86
1,58
2,70
Таблица 7С
Трансплантат ы СА64 5
Мутация
легкой
цепи
Мутация тяжелой цепи
ках104 (1/Мс)
kdxl0-4 (1/с)
KDxlO-9 (М)
gL4gH5
5, 62
1, 67
2, 97
gLll gH5
S28N
5, 64
2,49
4,42
gL2 8 дН5
S67L
5, 90
1, 09
1, 85
1. Kontermann RE. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics. Curr Opin Biotechnol 2011; 22: 868-876.
2. Sleep D, Cameron J, Evans LR. Albumin as a versatile platform for drug half-life extension. Biochim Biophys Acta 2013; 1830: 5526-5534.
3. Peters TJr. All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications 1996; San Diego, CA: Academic Press.
4. Chaudhury C, Mehnaz S, Robinson JM, Hayton WL, Pearl DK, Roopenian DC, Anderson CL. The major histocompatibility complex-related Fc receptor for IgG (FcRn) binds albumin and prolongs its lifespan. J Exp Med 2003; 197: 315-322.
5. Junghans RP, Anderson CL. The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 55125516.
6. Mtiller D, Karle A, Meissburger B, Hofig I, Stork R, Kontermann RE. Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibody molecules by fusion to human serum albumin. J Biol Chem 2007; 282: 12650-12660.
7. Elsadek B, Kratz F. Impact of albumin on drug delivery -New applications on the horizon. J Control Release 2012; 157: 428 .
8. S0rensen AR, Stidsen CE, Ribel U, Nishimura E, Sturis J, Jonassen I, Bouman SD, Kurtzhals P, Brand CL. Insulin detemir is a fully efficacious, low affinity agonist at the insulin receptor. Diabetes Obes Metab 2010; 12: 655-673.
1.
9. Trtissel S, Dumelin C, Frey K, Villa A, Buller F, Neri D. New strategy for the extension of the serum half-life of antibody fragments. Bioconjug Chem 2009; 20: 2286-2292.
10. Dennis MS, Zhang M, Meng Y G, Kadkhodayan M, Kirchhofer D, Combs D, Damico LA. Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem 2002; 277: 35035-35043.
11. Nguyen A, Reyes AE 2nd, Zhang M, McDonald P, Wong WL, Damico LA, Dennis MS. The pharmacokinetics of an albumin-binding Fab (AB.Fab) can be modulated as a function of affinity for albumin. Protein Eng Des Sel 2006; 9: 291-297.
12. Hopp J, Hornig N, Zettlitz KA, Schwarz A, Fuss N, Mtiller D, Kontermann RE. The effects of affinity and valency of an albumin-binding domain (ABD) on the half-life of a single-chain diabody-ABD fusion protein. Protein Eng Des Sel 2010; 23: 827-834.
13. Andersen JT, Pehrson, R, Tolmachev V, Daba, MB, Abrahmsen L, Ekblad C. Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain. J Biol Chem 2011; 286: 5234-5241.
14. Tijink BM, Laeremans T, Budde M, Stigter-van Walsum M, Dreier T, de Haard HJ, Leemans CR, van Dongen GAImproved tumor targeting of anti-epidermal growth factor receptor Nanobodies through albumin binding: taking advantage of modular Nanobody technology. Mol Cancer Ther 2008; 8: 2288-2297.
15. Van Roy M,Ververken C, Beirnaert E, Hoefman S, Kolkman J, Vierboom M, Breedveld E, Hart B, Poelmans S, Bontinck L, Hemeryck A, Jacobs S, Baumeister J, Ulrichts H. The preclinical pharmacology of the high affinity anti-IL-6R Nanobody(r) ALX-0061 supports its clinical development in rheumatoid arthritis. Arthritis Research & Therapy 2015.
16. Holt LJ, Basran A, Jones K, Chorlton J, Jespers LS, Brewis ND, Tomlinson IM. Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs. Protein Eng Des Sel 2008; 21: 283-288.
12.
17. О' Connor-Semmes RL, Lin J, Hodge RJ, Andrews S, Chism J, Choudhury A. Nunez DJ. GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (AlbudAb), extends systemic exposure of exendin-4: first study in humans-PK/PD and safety. Clin Pharmacol Ther 2014; 96: 704-712.
18. Flanagan RJ, Jones AL. Fab antibody fragments. Drug Safety 2004; 27: 1115-1133.
19. Smith BJ, Popplewell A, Athwal, D, Chapman AP, Heywood S, West SM, Carrington B, Nesbitt A, Lawson AD, Antoniw P, Eddelston A, Suitters A. Prolonged in vivo residence times of antibody fragments associated with albumin. Bioconjug Chem 2001; 12: 750-756.
20. Lightwood DJ, Carrington B, Henry AJ, McKnight, AJ, Crook K, Cromie K, Lawson AD. Antibody generation through В cell panning on antigen followed by in situ culture and direct RT-PCR on cells harvested en masse from antigen-positive wells. J Immunol Methods 2006; 316: 133-143.
21. Tickle S, Adams R, Brown D, Griffiths M, Lightwood DJ, Lawson AD. High-throughput screening for high affinity antibodies. J Lab Auto 2009; 14(5): 303-307.
22. Clargo AM, Hudson AR, Ndlovu W, Wootton RJ, Cremin LA, O'Dowd VL, Nowosad CR, Starkie DO, Shaw SP, Compson JE, White DP, MacKenzie B, Snowden JR, Newnham LE, Wright M, Stephens PE, Griffiths MR, Lawson AD, Lightwood DJ. The rapid generation of recombinant functional monoclonal antibodies from individual, antigen-specific bone marrow-derived plasma cells isolated using a novel fluorescence-based method. MAbs 2014; 6: 143-159.
23. Adair JR, Athwal DS, Emtage JS. Humanised Antibodies International Patent Publication. 1991; WO91/09967.
24. Curry S. Lessons from the crystallographic analysis of molecule binding to Human Serum Albumin. Drug Metab Pharmacokinet 2009; 24(4): 342-357.
25. Oganesyan V, Damschroder MM, Cook, KE, Li, Q, Gao C, Wu H, Dall'acqua WF. Structural insights into neonatal Fc receptor-based recycling mechanisms. J Biol Chem 2014; 289: 7812-7824.
26. Ascenzi, P. & Fasano, M. Allostery in a monomeric
protein: The case of human serum albumin. Biophys Chem 2010; 148: 16-22.
27. Bal W, Sokolowska M, Kurowska E, Faller P. Binding of transition metal ions to albumin: Sites, affinities and rates. Biochim Et Biophys Act 2013; 1830 (12): 5444-5445.
28. Ghuman J, Zunszain PA, Petitpas I, Bhattacharya AA, Otagiri M, Curry S. Structural basis of the drug-binding specificity of human serum albumin. J Mol Biol 2005; 353: 38-52.
29. Curry S, Mandelkow H, Brick P, Franks N. Crystal structure of human serum albumin complexed with fatty acid reveals an asymmetric distribution of binding sites. Nat Struct Biol 1998; 5: 827-835
30. Majorek KA, Porebski PJ, Dayal A, Zimmerman MD, Jablonska K, Stewart AJ, Chruszcz M, Minor W. Structural and immunologic characterization of bovine, horse, and rabbit serum albumins. Mol Immunol 2012; 52: 174-182
31. Steward MW, Steensgard J. Antibody affinity:
thermodynamic aspects and biological significance 1983. CRC
Press.
32. Rabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteins of immunological interest, 1991; 5th edit Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
33. Cain K, Peters S, Hailu H, Sweeney B, Stephens P, Heads J, Sarkar K, Ventom A, Page C, Dickson A. A CHO cell line
engineered to express XBP1 and EROl-La has increased levels of transient protein expression. Biotechnol Prog 2013; 29: 697-706.
34. Leslie AGW. Acta Cryst 2006; D62: 48-57
35. Leslie AGW, Powell HR. Evolving Methods for
Macromolecular Crystallography 2007; 245: 41-51; ISBN 978-1-
4020-6314-5
36. Evans P. Acta Cryst 2006; D62: 72-82
37. McCoy AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD, Winn MD, Storoni LC, Read RJ. Phaser crystallographic software. J Appl Cryst 2007; 40: 658-674
36.
38. Kabsch W. XDS. Acta Cryst 2010; D66: 125-132.
39. Cao H.L, Yin DC. High-resolution Crystal Structural Variance Analysis between Recombinant and Wild-type Human Serum Albumin. To be published. DOI:10.2210/pdb4g03/pdb
40. Brtinger AT, Adams PD, Clore GM, DeLano WL, Gros P, Grosse-Kunstleve RW, Jiang JS, Kuszewski J, Nilges M, Pannu NS, Read RJ, Rice LM, Simonson T. Warren GL. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 1998; 54 (Pt 5) : 905-21
41. Brtinger AT. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature Protocols 2007; 2: 2728-2733
42. Emsley P, Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2004; D60: 2126-32
43. Chen VB, Arendall III WB, Headd JJ, Keedy DA, Immormino RM, Kapral GJ, Murray LW, Richardson JS, Richardson DC. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2010; D66: 12-21
44. DeLano WL The PyMOL Molecular Graphics System 2002; DeLano Scientific LLC, San Carlos, CA.
36.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> UCB Biopharma SPRL
<120> СВЯЗЫВАЮЩИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ БЕЛОК-ПЕРЕНОСЧИК ДОМЕН СО СКОНСТРУИРОВАННОЙ АФФИННОСТЬЮ
<130> PF0083
<160> 9
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1 <211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VH
<400> 1
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Val
85 90 95
Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 2
<211> 119
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VH gH1
<400>
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
85 90 95
Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 3
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VH gH5
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 4
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VH gH37
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 5
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VH gH47 <400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Ala Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 6
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VL
<400> 6
Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln
65 70 75 80
Cys Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VL gL1
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VL gL4
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CA645 VL gL5
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Ala Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Связывающий домен, содержащий VH и VL со специфичностью к сывороточному белку-переносчику, где связывающий домен мутируют посредством модификации, выбранной из одной или двух замен аминокислот в вариабельном домене легкой цепи (VL), одной или двух мутаций в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) и их сочетания, и мутированный связывающий домен имеет время полужизни, которое выше или ниже, чем время полужизни для немутированного связывающего домена, при условии, что мутация отлична от мутации, состоящей из I50A, Т56А, Т95А, V96A, Р97А, G98A, Y99A, S100A, ТЮОАа, YlOOCa, I50A и Т95А, I50A и G98A, I50A и Y99A, Т56А и Т95А, Т56А и G98A и Т56А и Y99A в SEQ ID N0: 1 .
2. Связывающий домен по п. 1, в котором сывороточный белок-
переносчик выбирают из тироксин-связывающего белка,
транстиретина, кислого гликопротеина al, трансферрина,
фибриногена и альбумина или фрагмента любого из них.
3. Связывающий домен по п. 2, в котором сывороточный белок-переносчик представляет собой альбумин, например, сывороточный альбумин человека.
4. Связывающий домен по п. 3, в котором связывающий домен связывается с доменом II альбумина.
5. Связывающий домен по любому из пп. с 1 до 4, в котором мутация представляет собой по меньшей мере одну замену в VL.
6. Связывающий домен по п. 5, в котором мутация представляет собой замену одной аминокислоты в VL.
7. Связывающий домен по п. 5, в котором мутация представляет собой замену двух аминокислот в VL.
8. Связывающий домен по любому из пп. с 5 до 7, в котором мутация находится в CDR, выбранной из LI, L2, L3 и их сочетания.
9. Связывающий домен по п. 8, в котором CDR представляет собой L1.
10. Связывающий домен по п. 9, в котором мутированную
аминокислоту(ы) независимо выбирают из положения 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34 и 35.
11. Связывающий домен по п. 10, в котором положение представляет собой положение 30.
12. Связывающий домен по п. 10 или 11, в котором аминокислоту в релевантном положении(ях) замещают гидрофобным остатком, например, выбранным из аланина, изолейцина, фенилаланина, валина, пролина и глицина, таким как аланин.
13. Связывающий домен по любому из пп. с 5 до 11, в котором мутации состоят из модификаций в VL.
14. Связывающий домен по любому из пп. с 1 до 12, в котором мутация находится в домене VH.
15. Связывающий домен по п. 14, в котором мутация представляет собой замену одной аминокислоты в VH.
16. Связывающий домен по п. 14, в котором мутация представляет собой замену двух аминокислот в VH.
17. Связывающий домен по п. 15 или 16, в котором мутация находится в CDR, выбранной из HI, Н2, НЗ и их сочетаний.
18. Связывающий домен по п. 17, в котором CDR представляет собой Н2 и/или НЗ.
19. Связывающий домен по п. 18, в котором CDR представляет собой Н2.
20. Связывающий домен по любому из пп. с 14 до 19, в котором мутированную аминокислоту(ы) независимо выбирают из положения 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или б 5.
21. Связывающий домен по п. 20, в котором аминокислоту в релевантном положении(ях) замещают гидрофобным остатком, например, выбранным из аланина, изолейцина, фенилаланина, валина, пролина и глицина, таким как аланин.
22. Связывающий домен по любому из пп. с 18 до 21, в котором CDR представляет собой НЗ.
23. Связывающий домен по п. 22, в котором мутированную аминокислоту(ы) независимо выбирают из положения 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 или 107.
24. Связывающий домен по п. 23, в котором мутируют остаток
25. Связывающий домен по п. 2 3 или 24, в котором
аминокислоту в релевантном положении(ях) замещают гидрофобным остатком, например, выбранным из аланина, изолейцина, фенилаланина, валина, пролина и глицина, таким как аланин.
26. Связывающий домен по любому из предыдущих пп., в котором одна или несколько замен аминокислот представляют собой неконсервативные аминокислотные замены.
27. Связывающий домен по п. 2 6, в котором неконсервативная аминокислота представляет собой выбор из природных аминокислот аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан, треонин, аспарагин, глутамин, глицин, пролин, аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.
28. Связывающий домен по любому из пп. с 1 до 27, где связывающий домен содержит вариабельный домен с пересаженной CDR.
29. Связывающий домен по п. 28, где связывающий домен является гуманизированным.
30. Связывающий домен по п. 29, где гуманизированный связывающий домен содержит каркас человека в VH и/или VL.
31. Связывающий домен по п. 30, в котором каркас VH относится к человеку (например, VH3, такой как VH3 1-3 3-23), например, содержит 1, 2, 3, 4, 5 или б замен аминокислот, таких как аминокислоты, которые являются остатками донора.
32. Связывающий домен по п. 31, в котором VH имеет
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 или б
(в частности, 5 или б) , или вариант любой одной из них с по
меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% сходством идентичности, такую как последовательность, представленная SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 или б (в частности, 5 или 6).
33. Связывающий домен по любому из пп. с 3 0 до 31, в котором каркас VL относится к человеку (например, VKI, такой как 2-1- (1) L5) , например, содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, таких как аминокислоты, которые являются остатками донора.
34. Связывающий домен по любому из пп. с 1 до 33, в котором домен VL содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: б,
33.
7, 8 и 9, или вариант любой одной из них с по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% сходством или идентичностью, такую как последовательность, выбранная из SEQ ID NO: б, 7, 8 и 9 (в частности, 8 или 9).
35. Связывающий домен по п. 3 6, в котором
последовательности VH и VL выбирают из комбинаций SEQ ID NO: 2 и
6, 2 и 7, 2 и 8, 2 и 9, 3 и б, 3 и 7, 3 и 8, 3 и 9, 4 и б, 4 и
7, 4и8, 4и9, 5иб, 5и7, 5и8и5и9 или варианта или вариантов любых из них с по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% сходством или идентичностью.
36. Связывающий домен по п. 35, в котором последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 3, соответственно.
37. Связывающий домен по п. 35, в котором последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 4 соответственно.
38. Связывающий домен по п. 35, в котором последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 5 соответственно.
39. Связывающий домен по п. 35, в котором последовательности VL и VH представляют собой SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 4 соответственно.
40. Молекула антитела, содержащая связывающий домен по любому из пп. с 1 до 39.
41. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающий домен по любому из пп. с 1 до 3 9 или молекулу антитела по п. 40.
42. Способ лечения пациента, включающий введение
терапевтически эффективного количества связывающего домена по
любому из пп. с 1 до 39, молекулы антитела по п. 4 0 или
фармацевтической композиции по п. 41.
43. Связывающий домен по любому из пп. 1-3 9, молекула антитела по п. 4 0 или фармацевтическая композиция по п. 41 для применения в лечении.
44. Связывающий домен по любому из пп. 1-40, молекула антитела по п. 4 0 или фармацевтическая композиция по п. 41 для применения в лечении, в частности, лечении выбранного из группы,
43.
состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и
паразитарных), эндотоксического шока, связанного с инфекцией,
артрита, такого как ревматоидный артрит, астмы, такой как
тяжелая астма, хронического обструктивного заболевания легких
(COPD), воспалительного заболевания таза, болезни Альцгеймера,
воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного
колита, болезни Пейрони, целиакии, заболевания желчного пузыря,
пилонидального заболевания, перитонита, псориаза, васкулита,
хирургических спаек, инсульта, диабета I типа, болезни Лайма,
менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммунноопосредованных
воспалительных нарушений центральной и периферической нервной
системы, таких как рассеянный склероз, волчанка (такая как
системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, атопического
дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита,
базедовой болезни, IgA-нефропатии, идеопатической
тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Миньера, пузырчатки,
первичного биллиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии,
гранулематоза Вегенера, других аутоиммунных нарушений,
панкреатита, травмы (хирургической), реакции трансплантат против
хозяина, отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая
ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также
атеросклероза, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости,
остеопороза, остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии и
злокачественной опухоли, в том числе злокачественной опухоли
молочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной
опухоли желудка, злокачественной опухоли яичников,
гепатоцеллюлярной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли головы и шеи, почки и злокачественной опухоли, в частности, почечноклеточной карциномы, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли печени, меланомы, саркомы, миеломы, нейробластомы, плацентарной хориокарциномы, злокачественной опухоли шейки матки и злокачественной опухоли щитовидной железы, а также их метастатических форм.
45. Применение связывающего домена по любому из пп. 1-3 9,
молекулы антитела по п. 4 0 или фармацевтической композиции по п.
41 при изготовлении лекарственного средства, например, для
лечения выбранного из группы, состоящей из инфекций (вирусных,
бактериальных, грибковых и паразитарных) , эндотоксического шока,
связанного с инфекцией, артрита, такого как ревматоидный артрит,
астмы, такой как тяжелая астма, хронического обструктивного
заболевания легких (COPD), воспалительного заболевания таза,
болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника,
болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, целиакии,
заболевания желчного пузыря, пилонидального заболевания,
перитонита, псориаза, васкулита, хирургических спаек, инсульта,
диабета I типа, болезни Лайма, менингоэнцефалита, аутоиммунного
увеита, иммунноопосредованных воспалительных нарушений
центральной и периферической нервной системы, таких как
рассеянный склероз, волчанка (такая как системная красная
волчанка) и синдром Гийена-Барре, атопического дерматита,
аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, базедовой
болезни, IgA-нефропатии, идеопатической тромбоцитопенической
пурпуры, синдрома Миньера, пузырчатки, первичного биллиарного
цирроза, саркоидоза, склеродермии, гранулематоза Вегенера,
других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы
(хирургической), реакции трансплантат против хозяина, отторжения
трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические
заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероза,
внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза,
остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии и злокачественной
опухоли, в том числе злокачественной опухоли молочной железы,
злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли желудка,
злокачественной опухоли яичников, гепатоцеллюлярной
злокачественной опухоли, злокачественной опухоли ободочной
кишки, злокачественной опухоли поджелудочной железы,
злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли головы
и шеи, почки и злокачественной опухоли, в частности,
почечноклеточной карциномы, злокачественной опухоли
предстательной железы, злокачественной опухоли печени, меланомы, саркомы, миеломы, нейробластомы, плацентарной хориокарциномы,
злокачественной опухоли шейки матки и злокачественной опухоли щитовидной железы, а также их метастатических форм. По доверенности
(a) Выравнивание последовательности тяжелой цепи СА645
1 10 10 30 10
САо4 5 VH -QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVS GIPLSNYAIN WVRQAPGKGLEN1G
VH3 1-3 3-13 EVQLLESGGGLVQPGG3LRLSCAAS WVRQAPGKGLEWVS
gHl EVQ11ESGGG1VQPGGS1R1SCAVS GIDLSNYAIM WVRQAPGKG1EWIG
дН5 EVQ11ESGGG1VQPGGS1R1SCAVS GIP1SNYAIN WVRQAPGKG1EWIG
50 60 70 80 90
СА645 VH IIWASGTTFYATWAKG RFTFSRPST-- TVDLEMTSLTTADTATYFCAR
VH3 1-3 3-23 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
gHl 11WASGTТFYATWAKG RFTI3RDST--TVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
дН5 11WAS GT Т FYATWAKG RFTISRPNSKNTVYLOMN3LRAEDTAVYYCAR
100 110
CA64 5 VH TVPGYSTAPYFD1 WGPGTLVTVSS
JH4 YFDY WGQGT1VTVSS
gHl TVPGYSTAPYFD1 WGQGT1VTVSS
gH5 TVPGYSTAPYFD1 WGOGTLVTVSS
(b) Выравнивание последовательности легкой цепи СА645
1 10 20 30 40
СА64 5 VI AAVLTQTPSFVSAAVGGTVTINC QSSPSVWSNFLS WYQQKPGQPPKLLIY
VKI 2-1-(1) 15 PIQMTQSPSSVSASVGPRVTITC WYQQKPGKAPK11IY
gll DIVMTQSPSSV3ASVGDRVTITC QSSPSVWSNFLS WYQQKPGKAPKLLIY
gL4 DIQMTQSPS3V3ASVGDRVTITC QSSPSVWSNFLS WYQQKPGKAPKLLIY
50 60 70 60 ?0
CA64 5 VL EASKLTS GVPSRFKGSGSGTQFTLTISDYOCGDAATYYC GGGYSSISP
VKI 2-l-(l)L5 GVPSRF3GSGSGTDFTLTISSLQPEPFATYYC
gLl EASKLTS GVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEPFATYYC GGGYSSISP
gL4 EASKLTS GVPSRFSGSGSGTPFTLTISSLQPEPFATYYC GGGYSSISP
100
CA64 5 VL TYFGGGTKVWK
JK4 LTFGGGTKVEIK
gLl TTFGGGTKVEIK gL4 TTFGGGTK\'EIK
552953
60-,
cr--of 100
gL4gH5
gL5gH47
gL5gH5
gL4gH37
-gL4gH5 -glbgHS
-gl4gH37 gL5gH47 gL5gH37
gL5gH37
1
0 20 40 60 80 100 120
Кч)
ФИГ. 6
МнМ)
% свободного Fab
ФИГ. 7
SEQ ID NO: 1 CA645 VH
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKG RFTISRPSTTVDLEMTSLTTADTATYFCARTVPGYSTAPYFDLWGPGTLVTVSS
SEQ ID NO: 2 CA645 VH gHl
EVQLLE S GGGLVQPGGS LRLS CAVS GIDLSNYAIISTWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKG RFTISRDSTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 3 CA645 VH gH5
EVQLLE S GGGLVQPGGS LRLS CAVS GIDLSNYAIN WVRQAPGKGLEWIG 11WAS GT T FYATWAKG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR TVPGYSTAPYFDL WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 4 CA645 VH gH37
EVQLLE S GGGLVQPGGS LRLS CAVS GIDLSNYAIISTWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTAYATWAKGRFTI SRDNSKNTV YLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 5 CA645 VH gH47
EVQLLE S GGGLVQPGGS LRLS CAVS GIDLSNYAIN WVRQAPGKGLEWIG 11WAS GT T FYATWAKG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR TVPGYSAAPYFDL WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 6 CA645 VL
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGQPPKLLIYEASKLTS GVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCGDAATYYCGGGYSSISDTTFGGGTKVWK
SEQ ID NO: 7 CA645 VL gLl
DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTS GVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 8 CA645 VL gL4
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC QSSPSVWSNFLS WYQQKPGKAPKLLIY EASKLTS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC GGGYSSISP TTFGGGTKVEIK
ФИГ. 7 продолжение
SEQ ID NO: 9 CA645 VL gL5
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC QSSPSVASNFLS WYQQKPGKAPKLLIY EASKLTS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC GGGYSSISP TTFGGGTKVEIK
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
101.
1/7
ФИГ. 1
1/7
ФИГ. 1
2/7
ФИГ. 2
2/7
ФИГ. 2
ФИГ. 4
3/7
ФИГ. 3
ФИГ. 4
3/7
ФИГ. 3
ФИГ. 4
5/7
ФИГ. 5
6/7
6/7