EA201892499A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892499 Полный текст описания [**] EA201892499 20170523 Регистрационный номер и дата заявки GB1609193.6 20160525 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2017/062334 Номер международной заявки (PCT) WO2017/202806 20171130 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] НОВЫЕ ПЕПТИДЫ, КОМБИНАЦИЯ ПЕПТИДОВ В КАЧЕСТВЕ МИШЕНЕЙ И СРЕДСТВ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ИММУНОТЕРАПИИ РАКА ЖЕЛЧНОГО ПУЗЫРЯ И ХОЛАНГИОКАРЦИНОМЫ И ДРУГИХ ВИДОВ РАКА Название документа [8] A61K 38/17, [8] A61K 39/00, [8] C12N 9/12 Индексы МПК [DE] Махр Андреа, [DE] Вайншенк Тони, [DE] Вибе Анита, [DE] Шур Оливер, [DE] Фритше Дженс, [DE] Сингх Харприт Сведения об авторах [DE] ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892499a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к пептидам, белкам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится далее к опухолеассоциированным пептидным эпитопам T-клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые могут, например, служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, стимулирующих противоопухолевые иммунные ответы, или стимулировать T-клетки ex vivo с их перенесением в организм пациента. Пептиды, связанные с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), или пептиды в отдельности могут быть также мишенями антител, растворимых T-клеточных рецепторов и других связывающих молекул.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к пептидам, белкам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится далее к опухолеассоциированным пептидным эпитопам T-клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые могут, например, служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, стимулирующих противоопухолевые иммунные ответы, или стимулировать T-клетки ex vivo с их перенесением в организм пациента. Пептиды, связанные с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), или пептиды в отдельности могут быть также мишенями антител, растворимых T-клеточных рецепторов и других связывающих молекул.


Евразийское (21) 201892499 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.23
(51) Int. Cl.
A61K38/17 (2006.01) A61K39/00 (2006.01) C12N 9/12 (2006.01)
(54) НОВЫЕ ПЕПТИДЫ, КОМБИНАЦИЯ ПЕПТИДОВ В КАЧЕСТВЕ МИШЕНЕЙ И
СРЕДСТВ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ИММУНОТЕРАПИИ РАКА ЖЕЛЧНОГО ПУЗЫРЯ И ХОЛАНГИОКАРЦИНОМЫ И ДРУГИХ ВИДОВ РАКА
(31) 1609193.6; 62/341,367
(32) 2016.05.25
(33) GB; US
(86) PCT/EP2017/062334
(87) WO 2017/202806 2017.11.30
(71) Заявитель:
ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ
ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Махр Андреа, Вайншенк Тони, Вибе Анита, Шур Оливер, Фритше Дженс, Сингх Харприт (DE)
(74) Представитель:
Глухарёва А.О., Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Дементьев В.Н., Строкова О.В., Христофоров А.А., Гизатуллина Е.М. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к пептидам, белкам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится далее к опухолеассоциированным пептидным эпитопам T-клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые могут, например, служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, стимулирующих противоопухолевые иммунные ответы, или стимулировать T-клетки ex vivo с их перенесением в организм пациента. Пептиды, связанные с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), или пептиды в отдельности могут быть также мишенями антител, растворимых T-клеточных рецепторов и других связывающих молекул.
Новые пептиды, комбинация пептидов в качестве мишеней и средств для применения в иммунотерапии рака желчного пузыря и холангиокарциномы
и других видов рака
Настоящее изобретение относится к пептидам, белкам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится далее к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые могут, например, служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, стимулирующих противоопухолевые иммунные ответы, или стимулировать Т-клетки ex vivo с их перенесением в организм пациента. Пептиды, связанные с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), или пептиды в отдельности могут быть также мишенями антител, растворимых Т-клеточных рецепторов и других связывающих молекул.
Настоящее изобретение относится к нескольким новым пептидным последовательностям и их вариантам, образованным из молекул HLA I класса человеческих опухолевых клеток, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов или в качестве мишеней для разработки фармацевтически / иммунологически активных соединений и клеток.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Наиболее распространенной формой рака желчевыводящих путей является аденокарцинома эпителия желчных протоков и включает холангиокарциному (ХГК) и аденокарциному желчного пузыря (РЖП). Оба заболевания характеризуются ростом уровня заболеваемости и неблагоприятным исходом. Холангиокарцинома является вторым наиболее распространенным видом рака печени после гепатоклеточной аденокарциномы (ГКК). Холангиокарцинома может
развиваться в любой части системы желчных протоков и поэтому подразделяется на внутрипеченочную, перихилярную и дистальную. Уровень заболеваемости в мире чрезвычайно различен; наиболее высокий уровень приходится на северовосточную часть Таиланда (> 80 на 100 ООО человек), а наиболее низкий - на страны Запада (0,3-3 на 100 000 человек) (Bridgewater et al., 2014). Хотя это заболевание не очень часто встречается в западных странах, уровень заболеваемости растет в связи со старением населения. Вследствие демографических изменений уровень смертности от ХГК в Германии возрос более чем в три раза в период с 1998 по 2008 гг. (von Hahn et al., 2011). Средний возраст людей, которым ставится диагноз ХГК, составляет около 70 лет (American Cancer Society, 2015).
Факторы риска заболевания холангиокарциномой включают хронические болезни печени и желчевыводящих путей, такие как первичный склерозирующий холангит, гепатолитиаз, камни желчных протоков, полипы желчного пузыря, фасциолез, цирроз, но также и инфекции гепатита В или С, воспалительные заболевания кишечника, пожилой возраст, ожирение, воздействие радиоактивного вещества торотраст, семейный анамнез, сахарный диабет и употребление алкоголя (World Cancer Report, 2014).
Холангиокарцинома в большей степени распространена в странах Юго-Восточной Азии, где паразитарные инфекции китайской двуусткой (Clonorchis) и кошачьей двуусткой (Opisthorchis) носят эндемический характер. За пределами данных регионов, характеризующихся высоким уровнем заболеваемости фасциолезом, передающимся через пищевые продукты и вызывающим хроническое воспаление желчных протоков, холангиокарцинома - спорадическое заболевание, до сих пор не очень распространенное и даже редкое.
Холангиокарцинома выявляется, в основном, на поздних стадиях, поскольку ее сложно диагностировать. Симптомы являются неспецифическими, и постановка диагноза с указанием желчевыводящих путей в качестве источника заболевания остается сложной, поскольку не существует специфического антигенного маркера.
Поэтому диагноз ХГК требует клинического и радиологического исключения метастазов из других очагов. Увеличивающийся уровень сывороточных маркеров, таких как СА19-9 и СЕА, может быть полезен для пациентов, имеющих в анамнезе заболевания печени (World Cancer Report, 2014).
Онкогенез ХГК на молекулярном уровне включает множество известных онкогенов и сигнальных путей. При ХГК обычно обнаруживаются активирующие мутации KRAS, мутации с потерей функции ТР53, гибридные гены FGFR2, мутации IDH1/2, гиперметилирование p16INK4A и SOCS3, активация JAK-STAT, избыточная экспрессия EGFR/HER2, аберрантная активация MAPK/ERK и избыточная экспрессия c-Met. Связью между хронической инфекцией желчевыводящих путей и онкогенезом ХГК является, как считается, активация сигнального пути ИЛ-б/БТАТЗ. ИЛ-6 не только секретируется опухолевыми клетками, усиливая рост клеток по аутокринным механизмам, но и также регулирует экспрессию других генов, таких как EGFR (World Cancer Report, 2014). Тем не менее, молекулярная стратификация на основе данных этих генетических аномалий еще не готова для использования в клинической практике (Bridgewater et al., 2014).
Холангиокарцинома трудно поддается лечению и обычно приводит к летальному исходу. Единственным вариантом лечения является полная резекция (R0). К сожалению, лишь около 30% опухолей являются резектабельными. Большинство опухолей 0, I и II стадии и некоторые опухоли III стадии являются резектабельными в зависимости от их точного расположения, тогда как другие опухоли III стадии и большинство опухолей IV стадии являются нерезектабельными (American Cancer Society, 2015). 5-летняя выживаемость после радикальной резекции (R0) составляет 40%. Свидетельств о том, что адъювантная химиотерапия увеличивает 5-летнюю выживаемость после резекции опухоли, не существует. Поражение лимфатических узлов наблюдается у одной трети пациентов, пригодных для хирургической операции, и ассоциируется с неблагоприятным исходом хирургического вмешательства. 5-летняя выживаемость после нерадикальной резекции (R1) составляет 20%. При наличии ее прогностического значения
рекомендуется лимфаденэктомия регионарных лимфатических узлов. Тогда как стадия N1 иногда рассматривается как подходящая для хирургического вмешательства, для заболеваний на стадиях N2 и М1 хирургическая операция противопоказана (Bridgewater et al., 2014).
Если резекция не осуществима, то варианты лечения остаются крайне ограниченными. Свое применение находят различные химиотерапевтические паллиативные препараты, такие как 5-фтороурацил, гемцитабин, цисплатин, капецитабин, оксалиплатин (American Cancer Society, 2015). Стандартной паллиативной химиотерапией является комбинация гемцитабина и цисплатина. Медианная выживаемость после химиотерапии составляет лишь 12 месяцев.
Трансплантация печени может быть показана пациентам с нерезектабельными опухолями на ранней стадии, однако по этому поводу ведется противоречивая дискуссия.
Данные об эффективности биологических лекарственных препаратов при раковых заболеваниях желчевыводящих путей носили противоречивый характер. В настоящее время для лечения ХГК исследуются лекарственные препараты, направленные на подавление роста кровеносных сосудов, такие как сорафениб, бевацизумаб, пазопаниб и регорафениб. Кроме того, в клинических исследованиях в комбинации с химиотерапией применяются лекарственные средства, мишенями которых является EGFR (American Cancer Society, 2015). В случае большинства лекарственных средств, испытанных до настоящего времени, существенного улучшения показателей по контролю заболевания и общей выживаемости не наблюдалось, тем не менее, сейчас проводятся дальнейшие исследования.
Рак желчного пузыря является наиболее распространенным и агрессивным злокачественным заболеванием желчевыводящих путей в мире. Неспецифические клинические проявления также ведут к задержке постановки диагноза и к тому, что лишь 10% всех пациентов являются кандидатами для проведения хирургической
операции. В связи с анатомической сложностью желчевыделительной системы и высоким уровнем рецидивов хирургическая операция дает терапевтический результат лишь в меньшинстве случаев. Факторы риска аналогичны ХГК, но РЖП встречается в три раза чаще у женщин. Кроме патологий желчного пузыря распространенными факторами риска являются инфекции сальмонеллой или Helicobacter. РЖП распространен среди населения Южной Америки, Индии, Пакистана, Японии и Кореи, тогда как он редко встречается в западных странах. Генетические изменения при РЖП плохо изучены. Считается, что в онкогенезе РЖП задействованы такие молекулярные изменения, как мутация р53, избыточная экспрессия СОХ2, инактивация CDKN, мутации KRAS, но и также микросателлитная нестабильность (Kanthan et al., 2015).
В случае рака желчного пузыря лишь 10% опухолей являются резектабельными, и даже после операции большинство из них прогрессирует с развитием метастазов, прогноз при этом даже хуже, чем для холангиокарциномы, и 5-летняя выживаемость составляет менее 5%. Хотя большинство опухолей являются нерезектабельными, до сих пор не существует эффективной адъювантной терапии (Rakic et al., 2014). В некоторых исследованиях было продемонстрировано, что комбинация химиотерапевтических препаратов или таргетной терапии (анти-VEGFR/EGFR препараты) с химиотерапией приводила к увеличению общей выживаемости и может быть многообещающим вариантом лечения в будущем (Kanthan et al., 2015).
В связи с редкостью карцином желчевыводящих путей в целом проводится лишь немного посвященных конкретно РЖП или ХГК клинических исследований, тогда как большинство из них включает все виды рака желчевыводящих путей. Это является причиной того, что способ лечения не улучшился на протяжении последних десятилетий, и резекция R0 остается до сих пор единственным вариантом радикального лечения.
Данные неудовлетворительные варианты лечения и низкий уровень выживаемости отражают нужду в инновационном способе лечения. Проводится несколько клинических исследований с применением иммунотерапии для лечения ХГК и РЖП. Об успехах сообщалось в случае лечения ХГК с метастазами в лимфатические узлы с помощью операции с последующей иммунотерапией на основе CD3-активированных Т-клеток и лизата опухоли (Higuchi et al., 2006).
Вакцины для лечения ХГК и РЖП на основе пептидов, мишенями которых являются WT1, NUF2, CDH3, KIF20A, LY6K, ТТК, IGF2BP3 или DEPDC1, как в виде три-/тетравакцины, так и монотерапии в комбинации с гемцитабином, в рамках клинических исследований I фазы увеличивали общую выживаемость на 9-12 месяцев. Вакцины на основе пептидов, по всей видимости, хорошо переносятся, но демонстрируют лишь умеренное противоопухолевое воздействие, когда вводятся в виде монотерапии. Вакцины на основе дендритных клеток, мишенями которых являются MUC1 или WT1 показали еще более многообещающие результаты. Виды лечения с применением монотерапии на основе цитокин-индуцированных киллерных клеток или инфильтрующих опухоль лимфоцитов проходят испытание в клинических исследованиях I/II фазы (Marks and Yee, 2015).
Принимая во внимание серьезные побочные эффекты и высокие расходы, связанные с лечением рака, существует необходимость идентифицировать факторы, которые могут быть использованы для лечения рака вообще и рака желчного пузыря и холангиокарциномы в частности. Также существует необходимость идентифицировать факторы, представляющие собой биомаркеры рака в целом и рака желчного пузыря и холангиокарциномы в частности, что позволит лучше ставить диагноз, составлять прогноз и предсказывать успех лечения.
Иммунотерапия рака представляет собой вариант специфического воздействия на раковые клетки при снижении до минимума побочных эффектов. В иммунотерапии рака находит применение существование опухолеассоциированных антигенов.
Актуальная классификация опухолеассоциированных антигенов (ТАА) включает следующие основные группы:
а) Раково-тестикулярные антигены: первые в истории идентифицированные ТАА,
которые могут распознаваться Т-клетками, принадлежат к этому классу,
называвшемуся первоначально "раково-тестикулярные антигены" (СТ), так как его
члены экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях
человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях
семенника и изредка в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют
молекулы HLA I и II класса, то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками
в нормальных тканях и поэтому могут рассматриваться как иммунологически
опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются
члены семейства MAGE и NY-ESO-1.
б) Антигены дифференциации: Данные ТАА встречаются в опухолевых и
нормальных тканях, из которых образуется опухоль. Большинство из известных
антигенов дифференциации обнаружено в меланомах и нормальных меланоцитах.
Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе
меланина и поэтому не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на
это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают, но
не ограничиваются, тирозиназой и Melan-A/MART-1 для меланомы или ПСА для
рака предстательной железы.
в) Избыточно экспрессируемые ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные
ТАА, были обнаружены в различных по гистологической структуре опухолях, а
также во многих нормальных тканях, в основном, с более низким уровнем
экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально
презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для
распознавания Т-клетками, в то время как их избыточная экспрессия в опухолевых
клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся
ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Нег-
2/neu, сурвивин, теломераза или WT1.
г) Опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются в
результате мутаций нормальных генов (таких как р-катенин, CDK4 и т. д.).
Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической
трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены, в
основном, способны индуцировать сильные иммунные ответы, не заключая в себе
риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой
стороны, данные ТАА в большинстве случаев подходят только для определенной
опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими
для многих отдельных опухолей. Опухолевая специфичность (или ассоциация)
пептида может также возникнуть, если пептид образован из опухолевого (опухоль-
ассоциированного) экзона в случае белков с опухоль-специфическими (-
ассоциированными) изоформами.
д) ТАА, образующиеся в результате аномальных пост-трансляционных
модификаций: такие ТАА могут образоваться из белков, которые не являются ни
специфическими, ни избыточно экспрессируемыми в опухолях, однако, несмотря
на это, становятся опухолеассоциированными в ходе пост-трансляционных
процессов, происходящих преимущественно в опухолях. Примеры для этого класса
возникают в результате изменения характера гликозилирования, приводящему к
появлению новых эпитопов в опухолях, как в случае MUC1, или при таких событиях
как белковый сплайсинг во время деградации, которые могут быть
опухолеспецифическими или могут не быть ими.
е) Онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть
ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не
человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ.
Примерами таких белков являются вирусные белки вируса папилломы человека
типа 16, Е6 и Е7, которые экспрессированы в карциноме шейки матки.
Мишенями иммунотерапии, основанной на Т-клетках, являются пептидные эпитопы, полученные из опухолеассоциированных или опухолеспецифических белков, которые презентируются молекулами главного комплекса гистосовместимости человека (МНС). Антигены, которые распознаются
опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т. д., которые экспрессируются и, по сравнению с не измененными клетками того же происхождения, обычно имеют повышенный уровень в клетках соответствующей опухоли.
Существуют два класса молекул МНС, МНС I класса и МНС II класса. Молекулы МНС I класса состоят из альфа-тяжелой цепи и бета-2-микроглобулина, молекулы МНС II класса - из альфа- и бета-цепи. Их трехмерная конформация образует связывающую бороздку, которая используется для нековалентного взаимодействия с пептидами.
Молекулы МНС I класса встречаются на большинстве клеток, имеющих ядро. Они презентируют пептиды, образующиеся при протеолитическом расщеплении преимущественно эндогенных белков, дефектных рибосомных продуктов (DRIP) и более крупных пептидов. Однако пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС I класса. Этот неклассический способ презентации I классом в литературе называется кросс-презентацией. (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и, в первую очередь, презентировать пептиды экзогенных или трансмембранных белков, которые поглощаются АПК, например, во время эндоцитоза и впоследствии процессируются.
Комплексы пептида и молекул МНС I класса распознаются С08-положительными Т-клетками, несущими подходящий Т-клеточный рецептор (ТКР), тогда как комплексы пептида и молекул МНС II класса распознаются С04-положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.
С04-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в индуцировании и поддержании эффективных ответов С08-положительных цитотоксических Т-клеток. Идентификация С04-положительных Т-клеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), имеет огромное значение для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Gnjatic et al., 2003). В месте локализации опухоли Т-хелперные клетки поддерживают благоприятное для ЦТЛ цитокиновое окружение (Mortara et al., 2006) и привлекают эффекторные клетки, к примеру, ЦТЛ, естественные киллерные клетки (NK), макрофаги, гранулоциты (Hwang et al., 2007).
При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно ограничена клетками иммунной системы, в особенности профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), например, моноцитами, образованными из моноцитов клетками, макрофагами, дендритными клетками. Было обнаружено, что опухолевые клетки больных раком пациентов экспрессируют молекулы МНС II класса (Dengjel et al., 2006).
Удлиненные (более длинные) пептиды по изобретению могут выступать в качестве активных эпитопов МНС II класса.
Т-хелперные клетки, активированные эпитопами МНС II класса, играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции С08-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих комплексы опухолеассоциированный пептид / МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
На моделях млекопитающих животных, например, мышах, было показано, что даже при отсутствии С08-положительных Т-лимфоцитов, С04-положительных Т-клеток достаточно для ослабления клинических проявлений опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ИНФ-гамма). (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg etal., 1999). Существуют доказательства того, что CD4 Т-клетки являются эффекторными клетками прямого противоопухолевого действия (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
Так как конститутивная экспрессия молекул HLA II класса обычно ограничена иммунными клетками, то выделение пептидов II класса непосредственно из первичных опухолей ранее считалось невозможным. Тем не менее, Dengjel с соавторами удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС II класса непосредственно из опухолей (WO 2007/028574, ЕР 1 760 088 В1).
Так как оба вида ответов, зависящие от CD8 и от CD4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и синергически, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как CD8+ Т-клетками (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и CD4-положительными хелперными Т-клетками (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин.
Для того чтобы пептид МНС I класса инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он также должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС I класса, как правило, имеют 8-12 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка ("якори") в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет "связывающий мотив", определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой.
В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны затем распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР).
Для того чтобы белки были распознаны Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифических или -ассоциированных антигенов, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками и не экспрессироваться или экспрессироваться в сравнительно малом количестве здоровыми тканями. В предпочтительном варианте осуществления пептид должен избыточно презентироваться опухолевыми клетками по сравнению с нормальными здоровыми тканями. Кроме того, желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т. е. несколько копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с их функцией, например, при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза. Кроме того, нисходящие мишени белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, быть косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (Singh-Jasuja et al., 2004). Необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, чтобы гарантировать, что такой пептид ("иммуногенный пептид"), образованный из опухолеассоциированного антигена, ведет к Т-клеточному ответу in vitro или in vivo.
В сущности, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.
Поэтому антигены ТАА являются отправной точкой для разработки терапии на основе Т-клеток, включающей противоопухолевые вакцины, но не ограничивающейся ими. Методы идентификации и определения характеристики ТАА обычно основаны на использовании Т-клеток, которые могут быть выделены из организма пациентов или здоровых субъектов, или же они могут быть основаны на генерировании различающихся транскрипционных профилей или различающихся паттернов экспрессии пептидов между опухолевыми и нормальными тканями. Однако идентификация генов, избыточно экспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения важно выбрать только те пептиды, презентируемые в избытке или селективно, против которых может быть обнаружена функциональная и/или пролиферирующая Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена посредством клонирования и способна к выполнению эффекторных функций ("эффекторная Т-клетка").
В случае нацеливания на комплексы пептида с МНС специфических ТКР (например, растворимых ТКР) и антител или других связывающихся с ними молекул
(каркасов) в соответствии с изобретением иммуногенность лежащих в основе пептидов является второстепенной. В таких случаях презентация является определяющим фактором.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32, или его варианту, который по меньшей мере на 77%, предпочтительно, по меньшей мере на 88% гомологичен (предпочтительно, по меньшей мере на 77% или по меньшей мере на 88% идентичен) последовательности с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32, где указанный вариант связывается с МНС и/или индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, или его фармацевтически приемлемой соли, где указанный пептид не является базовым полипептидом полной длины.
Настоящее изобретение относится далее к пептиду по настоящему изобретению, включающему последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO 32, или его варианту, который по меньшей мере на 77%, предпочтительно, по меньшей мере на 88% гомологичен (предпочтительно, по меньшей мере на 77% или по меньшей мере на 88% идентичен) последовательности с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO 32, где указанный пептид или его вариант обладает общей длиной, составляющей 8-100, предпочтительно 8-30 и, наиболее предпочтительно, 8-14 аминокислот.
В последующих таблицах представлены пептиды в соответствии с настоящим изобретением, соответствующие им SEQ ID NO и потенциальные исходные (лежащие в основе) гены для данных пептидов. Все пептиды Таблицы 1 и Таблицы 2 связываются с HLA-A*02. Пептиды из Таблицы 2 были раскрыты ранее в виде обширных списков в качестве результатов скринингов с высокой пропускной способностью с высокой долей ошибок или были вычислены с помощью алгоритмов, однако ранее ни в коей мере не были ассоциированы с раковыми
заболеваниями. Пептиды из Таблицы 3 являются дополнительными пептидами, которые могут быть полезны в комбинации с другими пептидами по изобретению. Пептиды Таблиц 4А и 4В полезны также для диагностики и/или лечения различных других злокачественных заболеваний, которые включают избыточную экспрессию или избыточную презентацию соответствующего базового полипептида.
Таблица 1:
Пептиды в соответствии с настоящим изобретением.
SEQ ID No.
Последовательность
Идент. номер(а) гена
Официал ьный(ые) символ(ы)гена
YAAEIASAL
6446, 23678, 100533105
SGK1, SGK3, C8orf44-SGK3
AAYPEIVAV
348654
GEN1
EMDSTVITV
26137
ZBTB20
FLLEAQNYL
149281
METTL11B
GLIDEVMVLL
54905
CYP2W1
LLLPLLPPLSPS
347252
IGFBPL1
LLLSDPDKVTI
3700, 375346
ITIH4, ТМЕМ110
LSASLVRIL
55655
NLRP2
RLAKLTAAV
283209
PGM2L1
SAFPFPVTVSL
79939
SLC35E1
SIIDFTVTM
1767
DNAH5
TILPGNLQSW
80317, 387032
ZKSCAN3, ZKSCAN4
VLPRAFTYV
5314
PKHD1
YGIEFVVGV
56670
SUCNR1
SVIDSLPEI
79830
ZMYM1
AVMTDLPVI
23041
MON2
VLYDNTQLQL
389072
PLEKHM3
SLSPDLSQV
2153
TAYPQVWV
57494
RIMKLB
VLQDELPQL
1953
MEGF6
IAFPTSISV
5036
PA2G4
SAFGFPVIL
54741
LEPROT
SLLSELLGV
11135
CDC42EP1
SEQ ID No.
Последовательность
Идент. номер(а) гена
Официал ьный(ые) символ(ы) гена
NLSETASTMAL
25897
RNF19A
TAQTLVRIL
3608
ILF2
ALAEQVQKA
79078
C1orf50
YASGSSASL
5339
PLEC
FASEVSNVL
8027
STAM
FASGLIHRV
200185
KRTCAP2
IAIPFLIKL
26090
ABHD12
YVISQVFEI
10447, 51384
FAM3C, WNT16
Настоящее изобретение относится также в общем к пептидам в соответствии с настоящим изобретением для применения при лечении пролиферативных заболеваний, например, острого миелогенного лейкоза, меланомы, мелкоклеточного рак легких, немелкоклеточного рак легких, неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы и рака почки.
Особенно предпочтительными являются пептиды - в отдельности или в комбинации - в соответствии с настоящим изобретением, выбранные из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32. Более предпочтительными являются пептиды - в отдельности или в комбинации -выбранные из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 16 (см. Таблицу 1) и их применение в иммунотерапии рака желчного пузыря и холангиокарциномы, острого миелоидного лейкоза, меланомы, мелкоклеточного
рака легких, немелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы и рака почки и, предпочтительно, рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Как показано в последующих Таблицах 4А и Б, многие из пептидов в соответствии с настоящим изобретением присутствуют в других видах опухолей и могут, таким образом, применяться в иммунотерапии при других показаниях. См. также Фигуру 1 и Пример 1.
Таблица 4А: Пептиды в соответствии с настоящим изобретением и их конкретное применение при других пролиферативных заболеваниях, в особенности при других раковых заболеваниях. Для выбранных пептидов таблица демонстрирует, на каких дополнительных видах опухолей они были обнаружены и имели либо избыточную презентацию на более чем 5% исследованных опухолевых образцов, либо презентацию на более чем 5% исследованных опухолевых образцов с соотношением среднего геометрического для опухоли и для нормальных тканей, составляющим более 3. Избыточная презентация определяется как более высокая представленность на опухолевом образце по сравнению с образцом нормальной ткани с наивысшей презентацией. Нормальными тканями, в сравнении с которыми проводили испытание на избыточную презентацию, были: жировая ткань, ткани надпочечной железы, артерии, костного мозга, головного мозга, центрального нерва, толстой кишки, двенадцатиперстной кишки, пищевода, глаз, желчного пузыря, сердца, почки, печени, легких, лимфатических узлов, мононуклеарные лейкоциты, ткань поджелудочной железы, паращитовидной железы, периферического нерва, брюшной полости, гипофиза, плевры, прямой кишки, слюнной железы, скелетных мышц, кожи, тонкой кишки, селезенки, желудка, щитовидной железы, трахеи, мочеточника, мочевого пузыря, вены.
SEQ ID No.
Последовательность
Другие релевантные органы / заболевания
YAAEIASAL
ОМЛ, меланома
LLLPLLPPLSPS
МРЛ, РПЖ
LLLSDPDKVTI
ГКК
AVMTDLPVI
ХЛЛ, НХЛ, ОМЛ
SEQ ID No.
Последовательность
Другие релевантные органы / заболевания
VLYDNTQLQL
НХЛ, ОМЛ
SLSPDLSQV
ГКК, НХЛ, ОМЛ
VLQDELPQL
НМРЛ, НХЛ, ОМЛ, ПлККГШ, РЯ
IAFPTSISV
РМЖ
NLSETASTMAL
МРЛ, НХЛ, рак мочевого пузыря
TAQTLVRIL
ХЛЛ, РМЖ
YASGSSASL
ПКК, ОМЛ, меланома
FASEVSNVL
МРЛ, ПКК, ХЛЛ, ОМЛ, меланома
FASGLIHRV
ХЛЛ, ОМЛ
IAIPFLIKL
МРЛ, НХЛ
YVISQVFEI
ХЛЛ,меланома
НМРЛ= немелкоклеточный рак легких, МРЛ= мелкоклеточный рак легких, ПКК= рак почки, ГКК= рак печени, РПЖ= рак поджелудочной железы, РМЖ= рак молочной железы, ХЛЛ= хронический лимфоцитарный лейкоз, ОМЛ= острый миелоидный лейкоз, НХЛ= неходжкинская лимфома, РЯ= рак яичника, ПлККГШ= рак головы и шеи.
Таблица 4Б: Пептиды в соответствии с настоящим изобретением и их конкретное применение при других пролиферативных заболеваниях, в особенности при других раковых заболеваниях. Для выбранных пептидов таблица демонстрирует, на каких дополнительных видах опухолей они были обнаружены и имели либо избыточную презентацию на более чем 5% исследованных опухолевых образцов, либо презентацию на более чем 5% исследованных опухолевых образцов с соотношением среднего геометрического для опухоли и для нормальных тканей, составляющим более трех. Избыточная презентация определяется как более высокая представленность на опухолевом образце по сравнению с образцом нормальной ткани с наивысшей презентацией. Нормальными тканями, в сравнении с которыми проводили испытание на избыточную презентацию, были: жировая ткань, ткани надпочечной железы, артерии, костного мозга, головного мозга, центрального нерва, толстой кишки, пищевода, глаза, желчного пузыря, сердца, почки, печени, легких, лимфатических узлов, лейкоциты, ткань поджелудочной железы, паращитовидной железы, периферического нерва, брюшины, гипофиза, плевры, прямой кишки, слюнной железы, скелетных мышц, кожи, тонкой кишки,
селезенки, желудка, вилочковой железы, щитовидной железы, трахеи, мочеточника, мочевого пузыря, вены.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 1, 16, 17, 18, 20, 28, 29 и 30 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения острого миелоидного лейкоза.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 1, 28, 29 и 32 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения меланомы.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 6, 25, 29 и 31 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения мелкоклеточного рака легких.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 32 и 20 - в одном предпочтительном
варианте осуществления в комбинации - для лечения немелкоклеточного рака легких.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 16, 17, 18, 20, 25 и 31 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения неходжкинской лимфомы.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 16, 26, 29, 30 и 32 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 6 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака поджелудочной железы.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 7, 31 и 18 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака печени.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 17 и 20 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака яичника.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 20 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака головы и шеи.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 17 и 25 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака мочевого пузыря.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 21, 31 и 26 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака молочной железы.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 28 и 29 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения рака почки.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного пептида по настоящему изобретению в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 17 и 24 - в одном предпочтительном варианте осуществления в комбинации - для лечения ХЛЛ.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к применению пептидов в соответствии с настоящим изобретением - предпочтительно в комбинации - при лечении пролиферативного заболевания, выбранного из группы: рак желчного пузыря и холангиокарцинома, острый миелоидный лейкоз, меланома, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, неходжкинская лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз, рак поджелудочной железы, рак
печени, рак яичника, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы и рак почки.
Настоящее изобретение, более того, относится к пептидам в соответствии с настоящим изобретением, имеющим способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса или - в удлиненной форме, такой как вариант по длине - МНС II класса.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с настоящим изобретением, где указанные пептиды (каждый из них) состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с настоящим изобретением, где указанный пептид модифицирован и/или включает непептидные связи.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с настоящим изобретением, где указанный пептид является частью слитого белка, в частности слитого с N-терминальными аминокислотами HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (N), или слитого с антителом (или встроенный в последовательность), таким как, например, антителом, специфичным для дендритных клеток.
Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей пептиды в соответствии с настоящим изобретением. Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте в соответствии с настоящим изобретением, которая является ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинациями.
Настоящее изобретение далее относится к вектору экспрессии, способному к экспрессии и/или экспрессирующему нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к пептиду в соответствии с настоящим изобретением, к нуклеиновой кислоте в соответствии с настоящим изобретением или к вектору экспрессии в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении заболеваний и в медицине, в частности, в лечении рака.
Настоящее изобретение далее относится к антителам, которые является специфическими по отношению к пептидам в соответствии с настоящим изобретением или комплексам указанных пептидов в соответствии с настоящим изобретением и МНС и способам их получения.
Настоящее изобретение далее относится к Т-клеточным рецепторам (ТКР), в частности, к растворимым ТКР и клонированным ТКР, встроенным в аутологичные или аллогенные Т-клетки, и способам их получения, а также к естественным киллерным клеткам (NK) или другим клеткам, несущим указанный ТКР или вступающим в перекрестную реакцию с указанными ТКР.
Антитела и ТКР являются дополнительными вариантами осуществления иммунотерапевтического применения пептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением или вектор экспрессии, описанный ранее. Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину в соответствии с настоящим изобретением, которая является антигенпрезентирующей клеткой, предпочтительно - дендритной клеткой.
Настоящее изобретение далее относится к способу получения пептида в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный способ включает культивацию клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением и выделение пептида из указанной клетки-хозяина или его культуральной среды.
Настоящее изобретение далее относится к указанному способу в соответствии с настоящим изобретением, где антиген нагружен на молекулы МНС I или II класса, экспрессированные на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной антигенпрезентирующей клетки, при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.
Настоящее изобретение далее относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, где антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии, способный экспрессировать или экспрессирующий указанный пептид, содержащий последовательность с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No.: 32, предпочтительно содержащий SEQ ID No. 1 no SEQ ID No. 16 или его вариантную аминокислотную последовательность.
Настоящее изобретение далее относится к активированным Т-клеткам, полученным способом в соответствии с настоящим изобретением, где указанная Т-клетка селективно распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий любую аминокислотную последовательность в соответствии с настоящим изобретением, причем способ включает введение пациенту эффективного числа Т-клеток, полученных в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к применению любого описанного пептида, нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, клетки в соответствии с настоящим изобретением, активированного Т-лимфоцита, Т-клеточного рецептора или антитела или других молекул, связывающихся с пептидом и/или комплексом пептид-МНС в соответствии с настоящим изобретением в качестве медикамента или в производстве медикамента. Предпочтительно, если указанный медикамент обладает активным противораковым действием.
Предпочтительно, если указанный медикамент предназначен для клеточной терапии, является вакциной или белком на основе растворимого ТКР или антителом.
Настоящее изобретение относится далее к применению в соответствии с настоящим изобретением, где упомянутые раковые клетки являются клетками рака желчного пузыря и холангиокарциномы, острого миелоидного лейкоза, меланомы, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы и рака почки и, предпочтительно, рака желчного пузыря и холангиокарциномы.
Настоящее изобретение далее относится к биомаркерам на основе пептидов в соответствии с настоящим изобретением, в контексте изобретения называемые "мишенями", которые могут быть использованы при постановке диагноза рака, предпочтительно рака желчного пузыря и холангиокарциномы. В роли маркера может выступать избыточная презентация самого(их) пептида(ов) или избыточная экспрессия соответствующего(их) гена(ов). Эти маркеры могут также использоваться для предсказания вероятности успеха лечения, предпочтительно иммунотерапии, и, наиболее предпочтительно, иммунотерапии, направленной на ту же мишень, которая была идентифицирована биомаркером. Например, для
окрашивания срезов опухоли для выявления присутствия интересующего пептида в комплексе с МНС может использоваться антитело или растворимый ТКР.
Факультативно, антитело обладает дополнительной эффекторной функцией, например, несет иммуностимулирующий домен или токсин.
Настоящее изобретение относится также к применению этих новых мишеней в контексте лечения рака.
Как терапевтические способы применения против других видов раковых заболеваний, так и диагностическое применение раскрыты в последующем более подробном описании продуктов экспрессии (полипептидов), лежащих в основе пептидов в соответствии с изобретением.
CDC25B известен как нисходящая мишень онкогенного фактора транскрипции FoxMl Уровень FoxM1 и его нисходящих мишеней-эффекторов снижен при раке желудка, глиомах, холангиокарциноме и остром миелоидном лейкозе (Zhang et al., 2014а; Chan-On et al., 2015; Niu et al., 2015; Li et al., 2016). Как было показано, микроРНК-211 является прямым негативным регулятором CDC25B в клетках трижды негативного рака молочной железы. Утрата миРНК-211 и - как результат -повышение уровня экспрессии CDC25B приводит к увеличению геномной нестабильности (Song and Zhao, 2015). Уровень CDC25B, как было продемонстрировано, повышен в клетках рака желудка за счет сайленсинга YWHAE, вызывающего пролиферацию, инвазию и миграцию клеток (Leal et al., 2016). Уровень CDC25B, как было показано, понижен за счет ингибитора бромодомена JQ1, который подавляет рост протоковой аденокарциномы поджелудочной железы моделях ксенотрансплантатов, полученных у пациентов (Garcia et al., 2016). Как было показано, уровень CDC25B понижен при нейроэндокринных опухолях тонкой кишки (Kim et al., 2016b).
CYP2W1 избыточно экспрессируется в ряду раковых опухолей человека, включая гепатоклеточный, колоректальный рак и рак желудка. Избыточная экспрессия CYP2W1 ассоциируется с прогрессированием опухоли и плохой выживаемостью (Aung et al., 2006; Gomez et al., 2010; Zhang et al., 2014b). В связи с опухолеспецифической экспрессией CYP2W1 является интересной мишенью для лекарственных средств или ферментным активатором пролекарственных средств во время терапии рака (Karlgren and Ingelman-Sundberg, 2007; Nishida et al., 2010).
Сообщалось о рекуррентной мутации гена DNAH5 при миеломе, и его экспрессия, как было показано, обычно нарушена при колоректальном раке (Walker et al., 2012; Xiao et al., 2015).
Как было продемонстрировано, венозная тромбоэмболия (VTE) часто встречается среди пациентов, больных раком. Комбинация вариантов F5, которые ассоциируются с VTE и раком синергически повышает риск развития VTE (Gran et al., 2016). Прокоагуляционный статус при раке повышает риск развития тромбоза, а также способствует прогрессированию опухоли. Четыре однонуклеотидных полиморфизма гена F5, как было показано, ассоциируются с раком молочной железы. Таким образом, использование в качестве мишени процесса коагуляции имеет большую значимость при раке (Tinholt et al., 2014). Было показано, что мутация F5 является фактором риска развития тромбоэмболии у детей с острым лимфобластным лейкозом (Sivaslioglu et al., 2014). Как было показано, F5 является кандидатом в сывороточные биомаркеры при аденокарциноме предстательной железы (Klee et al., 2012).
Изменения в экспрессии FAMC3 были замечены в клетках, образованных из раковых клеток поджелудочной железы (RefSeq, 2002). При меланоме FAMC3 был идентифицирован как кандидат на роль биомаркера аутофагии, важного механизма выживаемости опухолевых клеток (Kraya et al., 2015). FAMC3 играет незаменимую роль в эпителиально-мезенхимальном переходе, который коррелирует с агрессивностью, развитием метастазов и плохой выживаемостью, в особенности
при гепатоклеточном раке, колоректальном раке, раке легких и молочной железы (Csiszaret al., 2014; Gao et al., 2014; Song et al., 2014; Chaudhury et al., 2010; Lahsnig et al., 2009).
Мутации гена GEN1, как сообщалось, ассоциируются с риском развития рака молочной железы, однако другие исследования не могли подтвердить роль GEN1 как гена предрасположенности к раку молочной железы (Kuligina et al., 2013; Sun et al., 2014; Turnbull et al., 2010).
IGFBPL1 является регулятором инсулиновых факторов роста и его уровень понижен в клеточных линиях рака молочной железы вследствие аберрантного гиперметилирования. Метилирование гена IGFBPL1 четко ассоциировалось с худшей общей выживаемостью и выживаемостью без признаков заболевания (Smith et al., 2007).
ILF2, также известный как NF45, кодирует фактор транскрипции, требующийся для экспрессии на Т-клетках гена интерлейкина 2 (RefSeq, 2002). Уровень ILF2, как было показано, повышен гепатоклеточной карциноме, протоковой аденокарциноме поджелудочной железы и немелкоклеточном раке легких (Ni et al., 2015; Wan et al., 2015; Cheng et al., 2016). Сообщалось, что экспрессия ILF2 в клетках рака печени ассоциируется с регуляцией роста клеток и апоптозом за счет регуляции Bcl-2, Вок, ВАХ и clAP1 (Cheng et al., 2016). Уровень экспрессии ILF2, как было показано коррелирует с размером опухоли, гистологической дифференциацией и стадиями TNM, тогда как избыточная экспрессия ILF2, как было показано, ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы. Дифференцированная экспрессия ILF2 в клеточных культурах протоковой аденокарциномы поджелудочной железы демонстрировала влияние на ход клеточного цикла (Wan et al., 2015). Повышенный уровень экспрессии ILF2 при немелкоклеточном раке легких, как было показано, ассоциируется с пролиферацией опухолевых клеток и неблагоприятным прогнозом (Ni et al., 2015).
ITIH4 является членом семейства ITI ингибиторов плазменной протеазы, которые способствуют стабильности внеклеточного матрикса за счет ковалентного соединения с гиалуронаном. Уровень ITIH4 был понижен в нескольких опухолевых тканях, включая толстую кишку, желудок, яичник, легкие, почки, прямую кишку и предстательную железу (Hamm et al., 2008). Сывороточные уровни ITIH4 снижены у пациентов с ГКК по сравнению с пациентами с хроническим гепатитом В и циррозом, и низкие уровни ITIH4 в сыворотке ассоциировались с более коротким сроком выживаемости у пациентов с ГКК, ассоциированной с вирусом гепатита В (Noh et al., 2014).
KRTCAP2 кодирует кератиноцит-ассоциированный белок 2 и локализован на хромосоме 1q22 (RefSeq, 2002). В исследованиях была выявлена химерная РНК, которой обогащены раковые клетки, как результат сплайсинга между MUC1, TRIM46 и KRTCAP2 в клетках серозного рака яичника высокой степени злокачественности (HGSC), которая может использоваться в качестве клинического биомаркера и терапевтической мишени (Kannan et al., 2015).
MEGF6, также известны как EGFL3, кодирует белок 6 со многими EGF-подобными доменами и локализован на хромосоме 1р36.3 (RefSeq, 2002). MEGF6 описывали как ген, связанный с гепатоклеточной карциномой, в котором наблюдаются несколько полиморфизмов в тканях гепатоклеточных карцином (Wang et al., 2005).
NLRP2 (также известный как NALP2) кодирует члена семейства NLR белок 2, содержащий домен пирина, и участвует в активации каспазы-1 и может также образовывать белковые комплексы, активирующие провоспалительные каспазы. NLRP7 - это паралог NLRP2 (RefSeq, 2002; Wu et al., 2010; Slim et al., 2012). Домен PYRIN гена NLRP2 ингибирует пролиферацию клеток и рост опухолевых клеток глиобластомы (Wu et al., 2010). ATM/NLRP2/MDC1-зависимый сигнальный путь может останавливать транскрипцию рибосомных генов в ответ на разрывы хромосомы (Kruhlak et al., 2007). Мутации гена NLRP2 могут вызывать редкие нарушения у человека, связанные с геномным импринтингом, такие как семейная
хорионаденома, синдром Беквита-Видеманна и семейный транзиторный неонатальный сахарный диабет (Aghajanova et al., 2015; Dias and Maher, 2013; Ulker etal., 2013). NLRP2 ингибирует активацию NF-каппаВ (Kinoshita etal., 2005; Kinoshita et al., 2006; Fontalba et al., 2007; Bruey et al., 2004).
PA2G4 кодирует белок 2G, ассоциированный с пролиферацией, РНК-связывающий белок, участвующий в регуляции роста и, возможно, участвующий в сборке рибосомы. Он задействован в индукции дифференциации раковых клеток человека (RefSeq, 2002). Пониженный уровень PA2G4, как было установлено, наблюдался при плоскоклеточной карциноме пищевода. Избыточная экспрессия PA2G4 ингибировала онкогенез и рост клеток и индуцировала апоптоз. Данные результаты указывают на то, что PA2G4 может подавлять рост клеток карциномы пищевода (Jiang et al., 2016). Как было показано, уровень PA2G4 повышен в тканях рака шейки матки, и в комбинации с уровнями экспрессии р53 он может быть эффективным предсказательным фактором метастатического потенциала и прогноза для пациента (Liu et al., 2015с; Liu et al., 2015b). Уровень PA2G4, как было показано, повышен при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы и может служить в качестве прогностического индикатора и потенциальной мишени (Gong et al., 2015). Принудительная экспрессия PA2G4, как было показано, подавляет рост, миграцию и инвазию клеток рака щитовидной железы за счет повышения уровня важного супрессора опухоли RASAL (Liu et al., 2015а). Сообщалось, что уровень PA2G4 понижен при гепатоклеточной карциноме (ГКК) и, возможно, может служить в качестве прогностического маркера и многообещающей терапевтической мишени при лечении ГКК (Ни et al., 2014).
PKHD1 кодирует белок 1 поликистозной болезни почек и болезни печени. Мутации этого гена вызывают аутосомно-рецессивную поликистозную болезнь почек (RefSeq, 2002). Мутации с потерей функции PKHD1 наблюдались при анапластической карциноме щитовидной железы (Jeon et al., 2016).
PLEC кодирует плектин, члена семейства плакинов, белок, задействованный в поперечной сшивке и организации цитоскелета и комплексов адгезии (Bouameur et al., 2014). PLEC экспрессируется в избытке клетками колоректальной аденокарциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи и рака поджелудочной железы (Lee et al., 2004; Katada et al., 2012; Bausch et al., 2011).
RNF19A кодирует белок с доменом "ringfinger" 19А, ЕЗ-убиквитинлигазу типа RBR. Этот кодируемый белок может участвовать в боковом амиотрофическом склерозе и болезни Паркинсона (RefSeq, 2002). Уровни мРНК RNF19A, как было показано, в 2 раза выше в крови пациентов с раком предстательной железы, чем у здоровых лиц группы контроля. Поэтому RNF19A может быть значимым биомаркером для выявления рака предстательной железы (Bai et al., 2012). Было установлено, что RNF19A дифференцированно экспрессируется в ассоциированных с раком фибробластах, которые важны для развития и прогрессирования рака (Bozoky et al., 2013).
SGK1 кодирует серин-/треониновую протеинкиназу, которая играет важную роль в клеточной реакции на стресс. Он активирует определенные калиевые, натриевые и хлоридные каналы, позволяя предположить его участие в регуляции таких процессов, как выживаемость клеток, нейрональная возбудимость и выведение натрия почками. Высокие уровни ее экспрессии могут способствовать таким состояниям, как гипертензия и диабетическая нефропатия. SGK1 может активироваться инсулиноподобным и эпидермальным факторами роста за счет сигнальных путей PI3K и PDK1 (RefSeq, 2002). Экспрессия SGK1 быстро повышается за счет введения глюкокортикоидов, снижающих эффективность химиотерапии при раке яичника. В свою очередь, изофлавиноид генистеин, как было обнаружено, оказывает ингибирующее воздействие на колоректальный рак, снижая экспрессию SGK1 (Melhem et al., 2009; Qin et al., 2015). Повышенный уровень экспрессии SGK1 был выявлен в нескольких видах опухолей человека, включая карциному предстательной железы, немелкоклеточный рак легких и
гепатоклеточную карциному. SGK1 обладает антиапоптотическими свойствами и регулирует выживаемость, пролиферацию и дифференциацию клеток за счет фосфорилирования MDM2, что приводит к убиквитинированию и протеасомной деградации р53. Прямое ингибирование SGK1 может быть эффективным при терапии рака печени, либо в отдельности, либо в комбинации с лучевой терапией (Lang et al., 2010; Abbruzzese et al., 2012; Isikbay et al., 2014; Talarico et al., 2015).
SGK3 кодирует фосфопротеин семейства Ser/Thr протеинкиназ, который фосфорилирует несколько белков-мишеней и играет роль в транспорте нейтральных аминокислот и активации калиевого и натриевого каналов (RefSeq, 2002). Функция SGK3, как было продемонстрировано, ассоциируется с онкогенным драйвером INPP4B при раке толстой кишки и раке молочной железы (Gasser et al., 2014; Guo et al., 2015). Сообщалось, что SGK3 является медиатором нисходящего онкогенного сигнального пути фосфатидилинозитол 3-киназы, опосредующего ведущие роли в прогрессе онкогенеза при различных видах рака, включая рак молочной железы, рак яичника и гепатоклеточную карциному (Hou et al., 2015). Сообщалось, что SGK3 служит как важнейший индикатор, взаимодействующий с многочисленными молекулами при пролиферации, росте, миграции клеток и ангиогенезе опухоли (Hou et al., 2015). SGK3, как было продемонстрировано, способствует росту и выживаемости гепатоклеточной карциномы за счет деактивации гликоген-синтазы киназы-3 бета и Bcl-2-ассоциированного промотора гибели, соответственно (Liu et al., 2012). SGK3, как было показано, ассоциируется с неблагоприятным исходом для пациентов с гепатоклеточной карциномой (Liu et al., 2012). Таким образом, SGK3 может стать прогностическим биомаркером для предсказания исхода при гепатоклеточной карциноме и новой терапевтической мишенью (Liu et al., 2012). SGK3 описывали в качестве важного медиатора активности PDK1 в клетках меланомы, который способствует росту меланом с мутациями в BRAF и может быть потенциальной терапевтической мишенью (Scortegagna et al., 2015). SGK3 описывали в качестве транскрипционной мишени рецептора андрогенов, которая способствует пролиферации клеток предстательной железы за счет активации киназы р70 S6 и повышения уровня
циклина D1 (Wang et al., 2014). Нокдаун SGK3, как было показано, ослабляет пролиферацию клеток LNCaP рака предстательной железы, ингибируя переход от G1 к S-фазе клеточного цикла (Wang et al., 2014). SGK3, как было показано, ассоциируется с экспрессией рецепторов эстрогенов при раке молочной железы, и его экспрессия, как было продемонстрировано, положительно коррелирует с прогнозом развития опухоли (Xu et al., 2012).
SLC35E1 кодирует белок 35 семейства транспортеров растворенных веществ, члена Е1, и локализован на хромосоме 19р13.11 (RefSeq, 2002). SLC35E1, как было показано, ассоциируется с ответом на неоадъювантную химиолучевую терапию при карциноме прямой кишки (Rimkus et al., 2008).
STAM кодирует члена семейства адапторных молекул, трансдуцирующих сигнал, который опосредует передачу сигналов рецепторами цитокинов внутрь клетки и также играет роль в транспорте ЭР в комплекс Гольджи. STAM ассоциируется с субстратами, регулируемыми фактором роста гепатоцитов, с образованием эндосомного сортировочного комплекса, необходимого для транспорта белка 0 (ESCRT-0), который сортирует убиквитинированные мембранные белки с образованием комплекса ESCRT-1 в целях деградации лизосомами (RefSeq, 2002). STAM, как было обнаружено, избыточно экспрессируется при локально распространенном раке шейки матки и опухолях у молодых пациентов со спинальными эпендимомами (Korshunov et al., 2003; Campos-Parra et al., 2016). STAM является нисходящей мишенью ZNF331, гена, уровень которого понижен при раке желудка, что затем так же приводит к снижению уровня STAM (Yu et al., 2013). STAM ассоциируется с неблагоприятной делецией 11 q при хроническом лимфоцитарном лейкозе (Aalto et al., 2001).
Ген WNT16 бескрылого типа семейства сайта интеграции MMTV, член 16, кодирует секретируемый сигнальный белок, участвующий в онкогенезе и в нескольких процессах развития, в том числе регулировании клеточной судьбы и формировании паттерна генов во время эмбриогенеза (RefSeq, 2002). Как было показано,
экспрессия WNT16 повышена при остром лимфобластоидном лейкозе (ОЛЛ) с хромосомной транслокацией t (1; 19), и играет важную роль в лейкемогенезе (Casagrande et al., 2006; Mazieres et al., 2005). Исследование клеточных линий ОЛЛ и образцов пациентов с ОЛЛ продемонстрировало, что повышенный уровень WNT16 и нескольких других генов-мишеней сигнального пути Wnt был вызван метилированием ингибиторов Wnt, который, кроме того, ассоциировался с значительно меньшей 10-летней выживаемостью без признаков заболевания и общей выживаемостью (Roman-Gomez et al., 2007).
ZBTB20 кодирует белок 20 с доменом "zinc finger" и ВТВ и локализуется на хромосоме 3q13.2 (RefSeq, 2002). ZBTB20 способствует пролиферации клеток при немелкоклеточном раке легких за счет подавления FoxOI (Zhao et al., 2014). Уровень экспрессии ZBTB20 повышен при гепатоклеточной карциноме и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом (Wang et al., 2011). Полиморфизм гена ZBTB20 ассоциируется с раком желудка (Song et al., 2013).
ZKSCAN3 кодирует белок 3 с доменом "zinc finger" с доменами KRAB и SCAN и локализуется на хромосоме 6р22.1 (RefSeq, 2002). Уровень ZKSCAN3 повышен в клетках инвазивных опухолей толстой кишки и их метастазов в печень. ZKSCAN3 экспрессируется в большинстве образцов рака предстательной железы, но не в нормальных тканях предстательной железы. Амплификация гена ZKSCAN3 наблюдается при метастатическом раке предстательной железы и метастазах в лимфатические узлы, но не при первичном раке предстательной железы. ZKSCAN3 играет важную роль в стимуляции миграции клеток рака предстательной железы (Zhang et al., 2012). ZKSCAN3 является движущей силой прогрессирования рака толстой кишки, которой регулируется экспрессия нескольких генов, способствующих прогрессированию опухоли (Yang et al., 2008). Мутация гена ZKSCAN3 вносит свой вклад в миеломагенез, а также в трансформацию миеломы в экстрамедуллярное заболевание с клиническими проявлениями, такое как вторичный плазмоклеточный лейкоз (Egan et al., 2012). Супрессия ZKSCAN3 снижает уровни циклина D2 и ингибирует пролиферацию линий клеток миеломы.
Избыточная экспрессия ZKSCAN3 индуцирует циклин D2 в линиях клеток и первичных образцах миеломы (Yang et al., 2011).
ZKSCAN4, также известный под названием ZNF307, кодирует белок 4 с доменом "zincfinger" с доменами KRAB и SCAN и локализуется на хромосоме 6р21 (RefSeq, 2002). ZKSCAN4, возможно, подавляет сигнальный путь р53-р21 за счет активации экспрессии MDM2 и ЕР300 и индукции деградации р53 (Li et al., 2007).
ZMYM1 кодирует белок 1 с доменом "zinc finger" типа MYM и локализуется на хромосоме 1р34.3 (RefSeq, 2002). ZMYM1 является основным партнером по взаимодействию с ZNF131, который выполняет функции в сигнальных путях эстрогенов и пролиферации клеток рака молочной железы (Oh and Chung, 2012; Kim et al., 2016a).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы управления обеими ветвями иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение Т-клеток из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, С08-положительные Т-клетки, которые распознают пептиды, связанные с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), играют важную роль в этом ответе. Эти пептиды обычно состоят из 8-10 аминокислотных остатков, полученных из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIP), находящихся в цитозоле. Молекулы
МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA).
Понятие "Т-клеточный ответ" означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом in vitro или in vivo. Для цитотоксических Т-клеток, рестриктированных по МНС I класса, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней, нагруженных пептидом, нагруженных предшественником пептида, или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид; секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, TNF-альфа или ИЛ-2, индуцированная пептидом; секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция.
Понятие "пептид" в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом обычно пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Пептиды предпочтительно имеют длину в 9 аминокислот, но могут быть короче - 8 аминокислот в длину, и длиннее - 10, 11 или 12 или длиннее и в случае пептидов, связанных с молекулами МНС II класса (удлиненные варианты пептидов по изобретению), они могут иметь длину в 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более аминокислот.
Кроме того, понятие "пептид" включает в себя соли серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом обычно пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Предпочтительно, если соли являются фармацевтически приемлемыми солями пептидов, такими как, например, хлорид или ацетат (трифторацетат). Было замечено, что соли пептидов в соответствии с настоящим изобретением существенно отличаются от пептидов в их состоянии(ях) in vivo, так как пептиды не являются солями in vivo.
Понятие "пептид" включает также понятие "олигопептид". Понятие "олигопептид" в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом обычно пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды обычно бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 15 аминокислот в длину.
Понятие "полипептид" обозначает серии аминокислотных остатков, обычно связанных друг с другом пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов "пептид" или "олигопептид", термин "полипептид" введен для обозначения молекул, содержащих более приблизительно 30 аминокислотных остатков.
Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий такую молекулу, является "иммуногенным" (и, таким образом, "иммуногеном" в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, "иммуноген" будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать Т-клеточный ответ. В другом аспекте иммуноген может быть пептидом, комплексом пептида и МНС, олигопептидом и/или белком, используемым для получения специфических антител или ТКР против него.
Для Т-клеточного "эпитопа" I класса необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I класса, образующим трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС I класса, бета-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом
МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и, особенно типично, длину в 9 аминокислот.
У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют молекулы МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA)): HLA-A, HLA-B и HLA-C. HLA-А*01, HLA-A*02 и HLA-A*07 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.
Аллель
Популяция
Рассчитанный фенотип по частоте аллеля
DR6
Европеоидная раса (Северная Америка)
26,7%
DR7
Европеоидная раса (Северная Америка)
24,8%
DR8
Европеоидная раса (Северная Америка)
5,7%
DR9
Европеоидная раса (Северная Америка)
2,1%
DR1
Афроамериканцы (Северная Америка)
13,20%
DR2
Афроамериканцы (Северная Америка)
29,80%
DR3
Афроамериканцы (Северная Америка)
24,80%
DR4
Афроамериканцы (Северная Америка)
11,10%
DR5
Афроамериканцы (Северная Америка)
31,10%
DR6
Афроамериканцы (Северная Америка)
33,70%
DR7
Афроамериканцы (Северная Америка)
19,20%
DR8
Афроамериканцы (Северная Америка)
12,10%
DR9
Афроамериканцы (Северная Америка)
5,80%
DR1
Монголоиды (Северная Америка)
6,80%
DR2
Монголоиды (Северная Америка)
33,80%
DR3
Монголоиды (Северная Америка)
9,20%
DR4
Монголоиды (Северная Америка)
28,60%
DR5
Монголоиды (Северная Америка)
30,00%
DR6
Монголоиды (Северная Америка)
25,10%
DR7
Монголоиды (Северная Америка)
13,40%
DR8
Монголоиды (Северная Америка)
12,70%
DR9
Монголоиды (Северная Америка)
18,60%
DR1
Латиноамериканцы (Северная Америка)
15,30%
DR2
Латиноамериканцы (Северная Америка)
21,20%
DR3
Латиноамериканцы (Северная Америка)
15,20%
DR4
Латиноамериканцы (Северная Америка)
36,80%
DR5
Латиноамериканцы (Северная Америка)
20,00%
DR6
Латиноамериканцы (Северная Америка)
31,10%
DR7
Латиноамериканцы (Северная Америка)
20,20%
DR8
Латиноамериканцы (Северная Америка)
18,60%
DR9
Латиноамериканцы (Северная Америка)
2,10%
А*24
Филиппины
65%
А*24
Русские ненцы
61%
А*24:02
Япония
59%
А*24
Малайзия
58%
Аллель
Популяция
Рассчитанный фенотип по частоте аллеля
А*24:02
Филиппины
54%
А*24
Индия
47%
А*24
Южная Корея
40%
А*24
Шри-Ланка
37%
А*24
Китай
32%
А*24:02
Индия
29%
А*24
Западная Австралия
22%
А*24
США
22%
А*24
Россия, Самара
20%
А*24
Южная Америка
20%
А*24
Европа
18%
Пептиды по изобретению, предпочтительно когда они включены в состав вакцины по изобретению согласно описанию в настоящем документе, связываются с аллелью А*02. Вакцина также может включать универсальные пептиды, связывающиеся с МНС II класса. Поэтому вакцина по изобретению может применяться для лечения рака у пациентов, которые являются А*02-положительными, причем в связи с универсальной по связыванию природе данных пептидов не нужен подбор аллотипов МНС II класса.
Если пептиды А*02 по изобретению скомбинировать с пептидами, связывающимися с другим аллелем, например А*24, лечение может пройти более высокий процент любой популяции пациентов по сравнению с вакцинацией для каждого аллеля МНС I класса в отдельности. Тогда как в большинстве популяций любым одним аллелем могут быть охвачены менее чем 50% пациентов, вакциной, включающей эпитопы HLA-A*24 и HLA-A*02 можно лечить не менее 60% пациентов любой соответствующей популяции. Говоря конкретно, следующие процентные доли пациентов будут положительными по меньшей мере для одного из этих аллелей в различных регионах: США - 61 %, Западная Европа - 62%, Китай - 75%, Южная Корея - 77%, Япония - 86% (рассчитано по данным www.allelefrequencies.net).
В предпочтительном варианте осуществления понятие "нуклеотидная последовательность" относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный пептид, олигопептид или полипептид, может быть встречающейся в природе или может быть синтезирована. В целом, сегменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для получения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробного или вирусного оперона.
В контексте настоящего описания понятие "нуклеотид, кодирующий пептид", относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, включая искусственные (сделанные человеком) старт- и стоп-кодоны, совместимые с биологической системой, которой должна экспрессироваться последовательность, например, дендритная клетка или другая клеточная система, пригодная для получения ТКР.
Используемая в контексте данного описания ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты включает как однонитевую, так и двухнитевую нуклеиновую кислоту. Таким образом, например, для ДНК специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двухнитевая ДНК) и комплементу такой последовательности.
Понятие "кодирующая область" относится к тому участку гена, который в естественных или обычных условиях кодирует продукт экспрессии того гена в его естественном геномном окружении, т. е., участку, кодирующему in vivo нативный продукт экспрессии гена.
Кодирующая область может быть получена из не мутировавшего ("нормального"), мутировавшего или измененного гена или может даже быть получена из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам области синтеза ДНК.
Понятие "продукт экспрессии" означает полипептид или белок, являющийся природным продуктом трансляции гена и любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует эквиваленты, образующиеся в результате вырождения генетического кода и, таким образом, кодирует ту/те же самую(ые) аминокислоту(ы).
Понятие "фрагмент", если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК, включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого по существу сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии полной кодирующей области.
Понятие "сегмент ДНК" относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, выделенной по меньшей мере один раз в по существу чистой форме, т.е., без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и восстановление сегмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие сегменты предлагаются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними не-транслированными последовательностями или интронами, которые обычно присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут присутствовать за открытой рамкой считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.
Понятие "праймер" означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК с получением свободного конца З'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь.
Понятие "промотор" означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.
Понятие "выделенный" означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является выделенным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть выделены, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения.
Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением, могут также быть в "очищенной" форме. Понятие "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее оно предназначено для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой, в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, выделенные из библиотеки кДНК, как обычно очищались до электрофоретической гомогенности. Очистка исходного материала или природного материала от примесей по меньшей мере на один порядок величины, предпочтительно два или три порядка, и, более предпочтительно, четыре или пять порядков величины определенно рассматривается в изобретении. Более того, определенно включен заявленный полипептид, чистота которого составляет,
предпочтительно, 99,999% или по меньшей мере 99,99% или 99,9%; и даже желательно 99% по массе или более.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды как продукты экспрессии, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в "обогащенной форме". Используемый здесь термин "обогащенный" означает, что концентрация материала по меньшей мере приблизительно в 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01%, по массе, предпочтительно, по меньшей мере, около 0,1% по массе. Рассматриваются также обогащенные препараты с концентрацией примерно 0,5%, 1%, 5%, 10% и 20% по массе. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут быть предпочтительно в обогащенной форме или выделенными. Понятие "активный фрагмент" означает фрагмент - обычно пептида, полипептида или последовательности нуклеиновой кислоты, - который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или факультативно с подходящим адъювантом или в векторе животному, такому как млекопитающее, например, кролику или мыши, также включая человека; причем такой иммунный ответ принимает форму стимуляции Т-клеточного ответа у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно "активный фрагмент" может также быть использован для инициации ответа Т-клетки in vitro.
В контексте настоящего описания понятия "участок", "сегмент" и "фрагмент", если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять
участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. При использовании по отношению к полинуклеотидам эти понятия относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из эндонуклеаз.
В соответствии с настоящим изобретением понятие "процентная доля идентичности" или "идентичный с процентной долей", если оно относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после выравнивания сравниваемой последовательности ("Сравниваемая последовательность") с описанной или заявленной последовательностью ("Контрольная последовательность"). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:
процентная доля идентичности = 100 [1 -(C/R)]
где "С" является числом различий между Контрольной последовательностью и
Сравниваемой последовательностью по длине выравнивания между Контрольной
последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где
(i) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности,
которые не имеют соответствующего выравненного основания или аминокислоты в
Сравниваемой последовательности, и
(и) каждая брешь в Контрольной последовательности и
(iii) каждое выравненное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие; и
(iiii) выравнивание должно начинаться с позиции 1 выравненных последовательностей;
и "R" - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине выравнивания со Сравниваемой последовательностью с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.
Если существует противопоставление между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчетам выше, приблизительно равна или выше установленной минимальной Процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать выравнивания, в которых подсчитанная здесь выше процентная доля идентичности меньше, чем установленная процентная доля идентичности.
Как было упомянуто выше, в настоящем изобретении, таким образом, предложен пептид, включающий последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32 или ее вариант, который на 88% гомологичен последовательностям с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32, или их варианту, который индуцирует перекрестную реакцию Т-клеток с указанным пептидом. Пептиды по изобретению обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса или -удлиненные версии упомянутых пептидов - с МНС II класса.
В настоящем изобретении термин "гомологичный" относится к степени идентичности (см. выше, Процентная доля идентичности) между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т. е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее "гомология" определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях для сравниваемых последовательностей. Такая гомология последовательностей может быть подсчитана с помощью создания выравнивания, например, по алгоритму ClustalW. Широко распространено программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, Vector NTI, GENETYX или другие инструменты, предоставляемые банками данных свободного доступа.
Специалист данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом конкретного пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Аррау et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba etal., 1997).
Под "вариантом" данной аминокислотной последовательности авторы изобретения имеют в виду, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков, изменены (например, путем их замещения боковой цепью остатка другой встречающейся в природе аминокислоты или какой-либо другой боковой цепью) так, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он по меньшей мере сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться со связывающей бороздкой подходящей молекулы МНС, такой как HLA-A*02 или -DR, и, таким образом, он по меньшей мере сохранит, если не улучшит, способность связываться с ТКР активированных Т-клеток.
Данные Т-клетки могут затем вступать в перекрестную реакцию с клетками и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит природную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения. По информации из научной литературы и банков данных (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), конкретные позиции связывающихся с HLA пептидов являются типичными якорными остатками, формирующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу рецептора HLA, который определяется полярными, электрофизическими, гидрофобными и пространственными свойствами полипептидных цепей, образующих связывающую бороздку. Так, специалист данной области будет в состоянии модифицировать аминокислотные последовательности с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32, сохраняя известные якорные остатки, и будет в состоянии определить, сохранят ли такие варианты способность
связываться с молекулами МНС I или II класса. Варианты по настоящему изобретению сохраняют способность связываться с ТКР активированных Т-клеток, которые могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию и уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид, который содержит природную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах настоящего изобретения.
Исходные (немодифицированные) пептиды, раскрываемые в данном описании, могут быть модифицированы путем замены одного или нескольких остатков в различных, возможно отобранных, участках по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Предпочтительно, если такие замены расположены на конце аминокислотной цепи. Такие замены могут носить консервативный характер, например, когда одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, также как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативной будет замена аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, как, например, при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замены аминокислот допускаются чаще, чем другие, и они часто связаны со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобное(tm) между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа определения "консервативных замен".
Консервативные замены определены в контексте настоящего описания как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); группа 2 -полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Asp, Asn, Glu, Gin); группа 3 - полярные, положительно заряженные остатки (His, Arg, Lys); группа 4 -крупные, алифатические, неполярные остатки (Met, Leu, Не, Val, Cys); и группа 5 -крупные, ароматические остатки (Phe, Туг, Тгр).
Менее консервативные замены могут охватывать замену одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замены аланина остатком изолейцина. Высоко неконсервативные замены могут охватывать замену кислой аминокислоты полярной, или даже такой, которая имеет основный характер. Такие "радикальные" замены не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замены могут неожиданно привести к благоприятным эффектам, не предсказуемым исходя из обычных химических принципов.
Разумеется, в таких заменах могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных L-аминокислот. Таким образом, D-аминокислоты могут быть заменены L-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, нестандартные аминокислоты (т. е. отличающиеся от повсеместно встречающихся протеиногенных аминокислот) могут быть также использованы в целях замены для получения иммуногенов и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Если были произведены замены в более чем одной позиции с получением пептида с по существу эквивалентной или большей антигенной активностью, как определено ниже, то комбинации таких замен будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замен к дополнительным или синергическим эффектам по отношению к антигенное(tm) пептида. По большей части не более 4 позиций внутри пептида должны замещаться одновременно.
Пептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности, как указано в настоящей заявке, может иметь замену одной или двух неякорных аминокислот (см. ниже относительно якорного мотива), так что способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса не будет существенно изменена или подвергнута негативному
влиянию по сравнению с немодифицированным пептидом. В другом варианте осуществления в пептиде, состоящем, по существу, из аминокислотной последовательности, как указано в настоящей заявке, одна или две аминокислоты могут быть заменены партнерами по консервативной замене (см. информацию ниже), так что способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса не будет существенно изменена или подвергнута негативному влиянию по сравнению с немодифицированным пептидом.
Аминокислотные остатки, которые не вносят существенный вклад во взаимодействие сТ-клеточным рецептором, могут быть модифицированы заменой на другую аминокислоту, включение которой существенно не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связывание с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в этот термин авторы изобретения включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.
Позиция
Позиция
SEQ ID NO. 5
Варианты
Позиция
SEQ ID NO. 7
Варианты
Позиция
Более длинные (удлиненные) пептиды также могут быть пригодными. Возможно, чтобы эпитопы, связывающиеся с молекулами МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8 и 11 аминокислотами, были получены при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к истинному эпитопу, существенно не влияли на протеолитическое расщепление, необходимое для презентации истинного эпитопа во время процессинга.
Пептиды по изобретению могут быть удлинены с помощью вплоть до четырех аминокислот, это значит, что 1, 2, 3 или 4 аминокислоты могут быть добавлены к одному из концов в любой комбинации, представленной между 4:0 и 0:4.
Комбинации элонгаций в соответствии с изобретением могут быть взяты из Таблицы 7.
Аминокислотами для элонгации/удлинения могут быть пептиды исходной последовательности белка или любая(ые) другая(ие) аминокислота(ы). Элонгация может быть использована для повышения стабильности или растворимости пептидов.
Таким образом, эпитопы настоящего изобретения могут быть идентичны встречающимся в природе опухолеассоциированным или опухолеспецифическим эпитопам или могут включать эпитопы, отличающиеся не более чем четырьмя остатками от контрольного пептида, при условии, что они имеют, по существу, идентичную антигенную активность.
В альтернативном варианте осуществления пептид удлинен с одной или другой стороны или с двух сторон одновременно добавлением более 4 аминокислот, предпочтительно, до общей длины вплоть до 30 аминокислот. Это может привести к образованию пептидов, связывающихся с МНС II класса. Связывание с МНС II класса может быть проверено известными из уровня техники способами.
Соответственно, в настоящем изобретении предлагаются пептидные эпитопы и эпитопы пептидных вариантов, связывающихся с молекулами МНС I класса, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и, наиболее предпочтительно, между 8 и 14, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 аминокислот, в случае удлиненных пептидов, связывающихся с молекулами МНС II класса, длина может также быть 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 аминокислоты.
Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено способами, известными из уровня техники.
Предпочтительно, чтобы Т-клетки, специфичные для пептида в соответствии с настоящим изобретением были испытаны относительно замещенных пептидов; концентрация пептида, при которой замещенные пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно, не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно, не более чем около 1 нМ, и еще более предпочтительно не более чем около 100 пМ и, наиболее предпочтительно, не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещенный пептид распознавался Т-клетками более чем одного индивида, по меньшей мере двух и, более предпочтительно, трех индивидов.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид состоит или по существу состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32.
"Состоит по существу из" подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо любой из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32, или его вариант, содержит дополнительные находящиеся на N- и/или С
конце фрагменты последовательности аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для молекул МНС.
Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептид является частью слитого белка, которая включает, например, 80 N-терминальных аминокислот антиген-ассоциированной инвариантной цепи (рЗЗ, в дальнейшем "li") HLA-DR, как взятый из банка данных NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number Х00497. В других видах слияния пептиды по настоящему изобретению могут быть слиты с антителом, описанным в настоящем документе, или его функциональной частью, в частности встроены в последовательность антитела, так чтобы быть специфической мишенью указанного антитела, или, например, слиты с или встроены в антитело, являющееся специфичным для дендритных клеток, описанных в настоящей заявке.
Кроме того, пептид или вариант может быть дополнительно модифицирован для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение реверсированных пептидных или непептидных связей.
В реверсированной пептидной связи аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-CO-NH-), а пептидная связь реверсируется. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Meziere и соавт. (1997) (Meziere et al., 1997), включенной в настоящее описание по ссылке. Этот подход охватывает получение псевдопептидов, которые содержат изменения, охватывающие остов, но не ориентацию боковых цепей. Meziere и соавт. (Meziere et al., 1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для связывания с МНС и индукции ответов Т
хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, намного более устойчивы к протеолизу.
Непептидной связью является, например, -CH2-NH, -CH2S-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -CH2SO-. В патенте США № 4 897 445 предлагается метод твердофазного синтеза непептидных связей (-CH2-NH) в полипептидных цепях, который включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии ЫаСЫВНз.
Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным концам пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-флуоренилметокси-карбонильная группа может быть размещена на аминных концах пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным концам пептидов.
Кроме того, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, может быть использован D-изомер одного или нескольких аминокислотных остатков пептида, а не обычный L-изомер. Более того, по меньшей мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.
Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции отдельных аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004), которая включена в описание по ссылке. Химическая модификация аминокислот включает, но без ограничения, модификацию с помощью ацилирования, амидинирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), амидную модификацию карбоксильных групп и сульфгидрильную модификацию с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образование производных ртути, образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцию с малеимидом, карбоксиметилирование йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилирование цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 в работе Current Protocols In Protein Science, Eds. Hassan и соавт. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.
Вкратце, модификация, например, аргинильных остатков в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион, с образованием аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. Веб-сайты компаний, таких как Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com), предоставляют информацию по конкретным реагентам.
Распространено также избирательное восстановление дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и окислены во время тепловой обработки биофармацевтических средств. К-реагент Вудворда может использоваться для модификации определенных остатков глютаминовой кислоты. Ы-(3-(диметиламинопропил)-Ы'-этилкарбодиимид может использоваться для образования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты. Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации гистидильных остатков в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненаля. Реакция остатков лизина и других а-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или поперечной сшивке белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения полиэтиленгликоля и основным сайтом модификации при гликозилировании белков. Остатки метионина в белках могут быть модифицированы, например, с помощью йодацетамида, бромэтиламина и хлорамина Т.
Тетранитрометан и N-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации тирозильных остатков. Поперечная сшивка посредством образования дитирозина может быть произведена с помощью перекиси водорода/ионов меди.
В последних исследованиях по модификации триптофана использовались N-бромсукцинимид, 2-гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-ЗН-индол (BPNS-скатол).
Успешная модификация терапевтических белков и пептидов ПЭГ (полиэтиленгликолем) часто связана с увеличением полупериода циркуляции, тогда как поперечная сшивка белков глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для получения гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.
Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным вариантом осуществления изобретения. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к не встречающемуся в природе пептиду, где указанный пептид состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID No: 1 по SEQ ID No: 32 и был получен синтетическим способом (например, синтезирован) в виде фармацевтически приемлемой соли. Способы синтетического получения пептидов хорошо известны в данной области. Соли пептидов в соответствии с настоящим изобретением существенно отличаются от пептидов по своему состоянию(ям) in vivo, так как синтезированные пептиды не являются солями in vivo. Не встречающаяся в природе солевая форма пептида опосредует растворимость пептида, в частности, в контексте фармацевтических композиций, включающих пептиды, например вакцин на основе пептидов, раскрытых в настоящем описании. Достаточная и по меньшей мере существенная растворимость пептида(ов) необходима для эффективного введения пептидов субъекту, подлежащему лечению. Предпочтительно, если соли являются фармацевтически приемлемыми солями пептидов. Соли в соответствии с изобретением включают щелочные и щелочноземельные соли, такие как соли рядов Гофмейстера, включающие в качестве анионов РСч3", S042-, СНзСОО, CI", Br, N03", CICV, \; SCN" и в качестве катионов NH4+, Rb+, К+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ и Ba2+. В частности, соли выбраны из (NH4)3P04, (NH4)2HP04, (NH4)H2P04, (NH4)2S04, NH4CH3COO, NH4CI, NH4Br, NH4N03, NH4CI04, NH4I, NH4SCN, Rb3P04, Rb2HP04, RbH2P04, Rb2S04, Rb4CH3COO, Rb4CI, Rb4Br, Rb4N03, Rb4CI04, Rb4l, Rb4SCN, K3P04, K2HP04, KH2P04, K2S04, KCHsCOO, KCI, KBr, KN03, KCI04, Kl, KSCN, Na3P04, Na2HP04, NaH2P04, Na2S04, NaCH3COO, NaCI, NaBr, NaN03, NaCI04, Nal, NaSCN, ZnCI2 Cs3P04, Cs2HP04, CsH2P04, Cs2S04, CsCHsCOO, CsCI, CsBr, CsNOs, CsCI04, Csl, CsSCN, Li3P04, Li2HP04, LiH2P04, Li2S04, LiCH3COO, LiCI, LiBr, LiN03, LiCI04, Lil, LiSCN, Cu2S04, Mg3(P04)2, Mg2HP04, Mg(H2P04)2, Mg2S04, Mg(CH3COO)2, MgCI2, MgBr2, Mg(N03)2, Mg(CI04)2, Mgl2, Mg(SCN)2, MnCI2, Ca3(P04), Ca2HP04, Ca(H2P04)2, CaS04, Ca(CH3COO)2, CaCI2, CaBr2, Ca(N03)2, Ca(CI04)2, Cal2, Ca(SCN)2, Ba3(P04)2, Ba2HP04, Ba(H2P04)2, BaS04, Ba(CH3COO)2, BaCI2, BaBr2, Ba(N03)2, Ba(CI04)2, Bal2
и Ba(SCN)2. Особенно предпочтительными являются ацетат NH, МдС1г, КН2РО4, Na2S04, KCI, NaCI и СаС1г, такие как например, хлоридные или ацетатные (трифторацетатные) соли.
Как правило, пептиды и варианты (по меньшей мере те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Fmoc-полиамидным способом твердофазного синтеза пептидов, как раскрыто у Lukas и соавт. (Lukas et al., 1981) и в прилагающихся ссылках. Временная защита N-аминогруппы производится 9-флуоренилметилоксикарбонильной (Fmoc) группой. Повторное расщепление этой высоко щелочелабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в N, N-диметилформамиде. Функциональные группы боковой цепи могут быть защищены получением таких соединений, как их бутиловые эфиры (в случае серина, треонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбонильное производное (в случае лизина и гистидина), тритильное производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Если глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты амидогруппы боковой цепи используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламиде, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (каркасный мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (компонент для перекрестной сшивки, линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Для образования легкорасщепляемой связи пептида и смолы используется нестойкое к действию кислот производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются в виде предварительно синтезированных симметричных ангидридных производных за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением обратной реакции соединения, опосредованной N, Ы-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью методов контроля с применением нингидрина,
тринитробензолсульфоновой кислоты или изотина. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя с сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50 % смеси поглотителей. Обычно используемые поглотители включают этандитиол, фенол, анизол и воду, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезируемого пептида. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов синтеза пептидов (см., например, (Bruckdorfer et al., 2004), и прилагаемые ссылки).
Трифторуксусную кислоту удаляют выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые присутствующие поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая позволяет получить сырой пептид без поглотителей после лиофилизации водной фазы. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например, в Calbiochem-Novabiochem (Ноттингем, Великобритания).
Очистка может быть произведена любой методикой или комбинацией таких методик как перекристаллизация, эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения в системе ацетонитрил/вода.
Анализ пептидов может быть произведен при помощи тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при бомбардировке быстрыми атомами (FAB), а также масс-спектрометрического анализа MALDI и ESI-Q-TOF.
В целях выбора презентируемых в избытке пептидов был рассчитан профиль презентации, позволяющий оценить медианное значение презентации образца, а
также вариации повторных измерений. В профиле сравниваются образцы опухолевой формы, представляющей интерес, с фоновым уровнем образцов нормальной ткани. Каждый из этих профилей может быть затем консолидирован в показатель избыточной презентации путем расчета значения р по линейной модели со смешанными эффектами (Pinheiro et al., 2015), скорректировав ее для повторных анализов на уровень ложноположительных обнаружений (Benjamini and Hochberg, 1995)(ср. Пример 1, Фигура 1).
Для идентификации и относительной количественной оценки лигандов HLA с помощью масс-спектрометрического анализа молекулы HLA из подвергнутых шоковой заморозке образцов тканей были очищены и из них выделены HLA-ассоциированные пептиды. Выделенные пептиды были разделены и последовательности были идентифицированы с помощью методов жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC-MS) с ионизацией электрораспылением (nanoESI) в режиме реального времени. Полученные пептидные последовательности подтверждали сравнением картины фрагментации природных опухолеассоциированных пептидов (TUMAP), записанной на образцах рака желчного пузыря и холангиокарциномы (N = 17 А*02-положительный образец), с картинами фрагментации соответствующих синтетических контрольных пептидов с идентичными последовательностями. Поскольку пептиды были идентифицированы непосредственно в качестве лигандов молекул HLA первичных опухолей, то эти результаты дают прямое доказательство естественного процессирования и презентации идентифицированных пептидов на ткани первичной раковой опухоли, полученной от 17 пациентов, больных раком желчного пузыря и холангиокарциномой.
Технологическая платформа лекарственных средств, находящихся в разработке, XPRESIDENT(r) v2.1 (см., например, патентную заявку США 2013-0096016, включенную в настоящее описание в своей полноте путем ссылки) позволяет произвести идентификацию и выбор соответствующих избыточно презентируемых пептидов в качестве кандидатов для вакцины, основываясь на прямом
относительном количественном определении уровней HLA-рестриктированных пептидов на раковой ткани в сравнении с несколькими различными нераковыми тканями и органами. Это было осуществлено путем разработки дифференциального количественного определения на основе данных ЖХ-МС без использования изотопной метки (label-free), обработанных запатентованной технологической платформой для анализа данных, объединяющей алгоритмы для идентификации последовательности, спектральной кластеризации, подсчета ионов, выравнивания времени удерживания, деконволюции по состояниям заряда и нормализации.
Для каждого пептида и образца были подсчитаны уровни презентации, включающие оценки погрешности. Были идентифицированы пептиды, презентируемые исключительно на опухолевой ткани, и пептиды, избыточно презентируемые на опухолевых тканях в сравнении с не пораженными раком тканями и органами.
Комплексы HLA-пептид из образцов опухолевой ткани рака желчного пузыря и холангиокарциномы были очищены и HLA-ассоциированные пептиды были выделены и проанализированы методом ЖХ-МС (см. примеры). Все TUMAP, содержащиеся в настоящей патентной заявке, были идентифицированы с помощью данного подхода на образцах первичного рака желчного пузыря и холангиокарциномы, что подтверждает их презентацию на клетках первичного рака желчного пузыря и холангиокарциномы.
Пептиды TUMAP, идентифицированные на многочисленных образцах рака желчного пузыря и холангиокарциномы и нормальных тканях, были подвергнуты количественному анализу с помощью ЖХ/МС без изотопной метки, с использованием подсчета ионов. Метод основан на предположении, что площади пика пептида при анализе методом ЖХ/МС коррелируют с его содержанием в образце. Все количественные сигналы пептида в различных экспериментах с использованием ЖХ/МС были нормализованы, исходя из основной тенденции,
было вычислено их среднее значение на образец, и сведены в гистограмму в т. н. профиль презентации. В профиле презентации консолидированы различные методы анализа, такие как поиск в банке данных белков, спектральная кластеризация, деконволюция состояния заряда (разряд) и выравнивание времени удерживания и нормализация.
Кроме избыточной презентации пептида была исследована экспрессия мРНК исходного гена. Данные по мРНК, полученные с помощью секвенирования РНК (RNASeq) нормальных тканей и раковых тканей (ср. Пример 2, Фигуру 2). Дополнительным источником данных о нормальных тканях служил общедоступный банк данных по экспрессии РНК из приблизительно 3000 образцов нормальных тканей (Lonsdale, 2013). Пептиды, которые получены из белков, которые кодируются мРНК, демонстрирующей высокую степень экспрессии в раковой ткани, но ее очень низкий уровень или отсутствие в жизненно важных нормальных тканях, были включены как предпочтительные в настоящее изобретение.
В настоящем изобретении предложены пептиды, которые пригодны для лечения раковых заболеваний / опухолей, предпочтительно рака желчного пузыря и холангиокарциномы, клетки которых презентируют в избытке или исключительно пептиды по изобретению. Как показал масс-спектрометрический анализ, эти пептиды естественно презентировались молекулами HLA на образцах первичного рака желчного пузыря и холангиокарциномы человека.
Многие из исходных генов/белков (называемых также "белками полной длины" или "базовыми белками"), из которых были получены пептиды, были в высокой степени избыточно экспрессированы в клетках рака по сравнению с нормальными тканями - понятие "нормальные ткани" в связи с настоящим изобретением подразумевает здоровые клетки желчного пузыря или желчных протоков или другие нормальные клетки ткани, демонстрирующие высокую степень ассоциации исходных генов с опухолью (см. Пример 2). Более того, сами пептиды в высшей степени избыточно презентируются на опухолевой ткани - понятие "опухолевая ткань" в связи с
настоящим изобретением подразумевает образец ткани пациента, страдающего раком желчного пузыря и холангиокарциномой, но не на нормальных тканях (см. Пример 1).
Связанные с HLA пептиды могут распознаваться иммунной системой, конкретно Т-лимфоцитами. Т-клетки могут разрушать клетки, презентирующие распознанный комплекс HLA/пептид; к примеру, клетки рака желчного пузыря и холангиокарциномы, презентирующие полученные пептиды.
Было показано, что пептиды по настоящему изобретению способны стимулировать Т-клеточные ответы и/или избыточно презентируются и, поэтому, могут использоваться для получения антител и/или ТКР, такие как растворимые ТКР, в соответствии с настоящим изобретением (см. Пример 3, Пример 4). Кроме того, пептиды, если находятся в комплексе с соответствующей молекулой МНС, могут быть использованы для получения антител и/или ТКР, в частности растворимых ТКР, в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующие способы хорошо известны специалисту данной области, а также могут быть найдены в соответствующих литературных источниках Таким образом, пептиды по настоящему изобретению пригодны для генерирования иммунного ответа в организме пациента для уничтожения опухолевых клеток. Иммунный ответ у пациента может быть индуцирован при непосредственном введении описанных пептидов или подходящих веществ-предшественников (к примеру, удлиненных пептидов, белков или нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды) пациенту, в идеальном случае в комбинации с веществом, усиливающим иммуногенность (т. е. адъювантом). Можно ожидать, что иммунный ответ, вызванный такой терапевтической вакцинацией, будет высоко специфично направлен против опухолевых клеток, так как целевые пептиды по настоящему изобретению не презентируются на нормальных тканях в сравнимом количестве копий, предотвращая, тем самым, риск нежелательных аутоиммунных реакций против нормальных клеток у пациента.
Настоящее описание далее относится к Т-клеточным рецепторам (ТКР), включающим альфа-цепь и бета-цепь ("альфа/бета-ТКР"). Также предложены пептиды, способные связываться с ТКР и антителами, если они презентируются молекулой МНС. Настоящее описание также относится к нуклеиновым кислотам, векторам и клеткам-хозяевам для экспрессии ТКР и пептидам по настоящему изобретению; и методам их применения.
Понятие "Т-клеточный рецептор" (аббревиатура ТКР) относится к гетеродимерной молекуле, включающей альфа-полипептидную цепь (альфа-цепь) и бета-полипептидную цепь (бета-цепь), где гетеродимерный рецептор способен связываться с пептидным антигеном, презентируемым молекулой HLA. Это понятие включает также так называемые гамма/дельта-ТКР.
В одном варианте осуществления согласно описанию предложен способ получения ТКР, согласно настоящему описанию, при чем способ включает культивацию клетки-хозяина, способной экспрессировать ТКР в условиях, подходящих для стимуляции экспрессии ТКР.
Настоящее описание в другом аспекте далее относится к способам в соответствии с настоящим описанием, где антиген нагружен на молекулы МНС I или II класса, экспрессированные на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной антигенпрезентирующей клетки, при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой, или же антиген нагружен на тетрамеры МНС I или II класса путем тетрамеризации комплексов антиген-мономер МНС I или II класса.
Альфа- и бета-цепи альфа-/бета-ТКР и гамма- и дельта-цепи гамма-/дельта-ТКР, как правило, считаются такими, что каждая из них имеет два "домена", а именно вариабельные и константные домены. Вариабельный домен состоит из последовательно расположенных вариабельного сегмента (V) и соединительного сегмента (J). Вариабельный домен может также включать лидерный сегмент (L).
Бета- и дельта-цепи могут также включать сегменты разнообразия (D). Константные домены альфа и бета могут также включать С-терминальные трансмембранные (ТМ) домены, которые заякоривают альфа- и бета-цепи на клеточной мембране.
В отношении гамма-/дельта-ТКР, понятие "гамма вариабельный домен ТКР", используемый в контексте данного изобретения, относится к соединению сегмента гамма V ТКР (TRGV) без лидерного сегмента (L) и сегмента ТКР гамма J (TRGJ), а понятие "константный домен ТКР гамма" относится к внеклеточному сегменту TRGC или С-терминальной усеченной последовательности TRGC. В равной степени понятие "дельта вариабельный домен ТКР" относится к соединению сегмента ТКР дельта V (TRDV) без лидерного сегмента (L) и сегмента ТКР дельта D/J (TRDD/TRDJ), а понятие "константный домен ТКР-дельта" относится к внеклеточному сегменту TRDC или С-терминальной усеченной последовательности.
ТКР по настоящему изобретению предпочтительно связываются с комплексом пептида и молекулы HLA с аффинностью связывания (KD) околоЮО мкМ или ниже, около 50 мкМ или ниже, около 25 мкМ или ниже или около 10 мкМ или ниже. Более предпочтительными являются высокоаффинные ТКР с аффинностью связывания, составляющей около 1 мкМ или ниже, около 100 нМ или ниже, около 50 нМ или ниже, около 25 нМ или ниже. Неограничивающие примеры диапазонов предпочтительной аффинности связывания для ТКР по настоящему изобретению включают значения от около 1 нМ до около 10 нМ; от около 10 нМ до около 20 нМ; от около 20 нМ до около 30 нМ; от около 30 нМ до около 40 нМ; от около 40 нМ до около 50 нМ; от около 50 нМ до около 60 нМ; от около 60 нМ до около 70 нМ; от около 70 нМ до около 80 нМ; от около 80 нМ до около 90 нМ; и от около 90 нМ до около 100 нМ.
Понятие "специфическое связывание", используемое в связи с понятием ТКР по настоящему изобретению, и его грамматические варианты используются для
обозначения ТКР с аффинностью связывания (KD) для комплекса пептида и молекулы HLA 100 мкМ или ниже.
Альфа/бета гетеродимерные ТКР согласно настоящему описанию могут иметь введенную дисульфидную связь между их константными доменами. Предпочтительные ТКР этого вида включают те, что имеют последовательность константного домена TRAC и последовательность константного домена TRBC1 или TRBC2, кроме тех случаев, когда Thr 48 домена TRAC и Ser 57 доменов TRBC1 или TRBC2 замещены остатками цистеина, причем указанные остатки цистеина образуют дисульфидную связь между последовательностью константного домена TRAC и последовательностью константного домена TRBC1 или TRBC2 ТКР.
С введением межцепочечной связи, упомянутой выше, или без нее альфа/бета гетеродимерные ТКР по настоящему изобретению могут иметь последовательность константного домена TRAC и последовательность константного домена TRBC1 или TRBC2, и последовательность константного домена TRAC и последовательность константного домена TRBC1 или TRBC2 ТКР может быть связана встречающейся в природе дисульфидной связью между Cys4 экзона 2 домена TRAC и Cys2 экзона 2 домена TRBC1 или TRBC2.
ТКР по настоящему изобретению могут включать поддающуюся обнаружению метку, выбранную из группы, состоящей из радионуклида, флуорофора и биотина. ТКР по настоящему изобретению могут конъюгированы с терапевтически активным ингредиентом, таким как радионуклид, химиотерапевтическим средством или токсином.
В одном варианте осуществления ТКР по настоящему изобретению, имеющий по меньшей мере одну мутацию альфа-цепи и/или имеющий по меньшей мере одну мутацию бета-цепи, обладает модифицированным гликозилированием в сравнении с ТКР без мутаций.
В одном варианте осуществления ТКР, содержащий по меньшей мере одну мутацию в альфа-цепи ТКР и/или бета-цепи ТКР, имеет аффинность связывания по отношению к и/или полупериод связывания по отношению к комплексу пептида и молекулы HLA, которые по меньшей мере вдвое выше, чем у ТКР, содержащего альфа-цепь ТКР без мутаций и/или бета-цепь ТКР без мутаций. Усиление аффинности опухолеспецифических ТКР, а также ее использование, опирается на существование "окна" с оптимальными показателями аффинности для ТКР. Существование такого окна основано на наблюдениях, что ТКР, специфические для Н1_А-А2-рестриктированных патогенов, обладают показателями KD, которые, в основном, примерно в 10 раз ниже по сравнению с ТКР, специфическими для HLA-А2-рестриктированных опухолеассоциированных аутоантигенгов. Сейчас известно, хотя опухолевые антигены имеют иммуногенный потенциал, поскольку опухоли возникают из собственных клеток индивида, только мутантные белки или белки с изменениями в трансляционном процессинге будут восприниматься иммунной системой как чужеродные. Антигены, уровень которых повышен или которые экспрессируются в избытке (так называемые аутоантигены), не будут в обязательном порядке вызывать функциональный иммунный ответ против опухоли: Т-клетки, экспрессирующие ТКР, которые являются высоко активными по отношению к данным антигенам, будут подвергаться отрицательному отбору внутри вилочковой железы в процессе, известном как центральная толерантность, что означает, что останутся лишь Т-клетки с низкоаффинными ТКР к аутоантигенам. Поэтому аффинность ТКР или вариантов согласно настоящему описанию по отношению к пептидам в соответствии с настоящим изобретением может быть усилена способами, хорошо известными из уровня техники.
Настоящее описание относится далее к способу идентификации и выделения ТКР в соответствии с настоящим описанием, причем указанный способ включает инкубацию МКПК Н1_А-А*02-отрицательных здоровых доноров с А2/пептидными мономерами, инкубацию МКПК с тетрамер-фикоэритрином (РЕ) и выделение Т-клеток с высокой авидностью с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS)-Calibur.
Настоящее описание относится далее к способу идентификации и выделения ТКР в соответствии с настоящим описанием, причем указанный способ включает получение трансгенной мыши с целыми человеческими локусами гена TCRap (1,1 и 0,7 млн. п. н.), Т-клетки которой экспрессируют различные ТКР человека, компенсируя недостаток ТКР у мыши, иммунизацию мыши пептидом, представляющим интерес, инкубацию МКПК, полученных у трансгенной мыши, тетрамер-фикоэритрином (РЕ) и выделение Т-клеток с высокой авидностью с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS)-Calibur.
В одном аспекте для получения Т-клеток, экспрессирующих ТКР согласно настоящему описанию, нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи ТКР-альфа и/или ТКР-бета согласно настоящему описанию, клонируют в векторы экспрессии, такие как гамма-ретровирус или -лентивирус. Рекомбинантные вирусы получают и проводят испытание их функциональности, такой как антигенная специфичность и функциональная авидность. Аликвота конечного продукта затем используется для трансдукции целевой популяции Т-клеток (как правило, очищенных от МКПК пациента), которую культивируют перед инфузией пациенту. В другом аспекте для получения Т-клеток, экспрессирующих ТКР согласно настоящему описанию, РНК ТКР синтезируют с помощью методик, известных из уровня техники, например, транскрипционные системы in vitro. Синтезированные in vitro РНК ТКР затем вводят с помощью электропорации в первичные CD8+ Т-клетки, полученные у здоровых доноров, в целях повторной экспрессии альфа- и/или бета-цепей опухолеспецифических ТКР.
Для увеличения уровня экспрессии нуклеиновые кислоты, кодирующие ТКР согласно настоящему описанию, могут быть функционально связаны с сильными промоторами, такими как длинные терминальные повторы ретровируса (LTR), цитомегаловируса (CMV), вируса стволовых клеток мыши (MSCV) U3, фосфоглицерат-киназой (PGK), р-актином, убиквитином и комбинированным промотором вируса обезьян 40 (SV40)/CD43, фактором элонгации (EF)-1a и
промотором вируса некроза селезёнки (SFFV). В предпочтительном варианте осуществления промотор является гетерологичным по отношению к экспрессируемой нуклеиновой кислоте. В дополнение к сильным промоторам экспрессионные кассеты ТКР согласно настоящему описанию могут содержать дополнительные элементы, которые могут усиливать экспрессию трансгена, включая центральный полипуриновый тракт (сРРТ), который способствует ядерной транслокации лентивирусных конструкций (Follenzi et al., 2000), и посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (wPRE), который повышает уровень экспрессии трансгена за счет увеличения стабильности РНК (Zufferey etal., 1999).
Альфа- и бета-цепи ТКР по настоящему изобретению могут кодироваться нуклеиновыми кислотами, локализованными в отдельных векторах, или могут кодироваться полинуклеотидами, локализованными в одном и том же векторе.
Для достижение высоких уровней экспрессии ТКР на поверхности требуется транскрипция высоких уровней как цепей ТКР-альфа, так и ТКР-бета, введенного ТКР. Для этого цепи ТКР-альфа и ТКР-бета согласно настоящему описанию могут быть клонированы в бицистронные конструкции в одном векторе, который, как было показано, способен преодолеть данное препятствие. Использование участка внутренней посадки рибосомы вируса (IRES) между цепями ТКР-альфа и ТКР-бета приводит к скоординированной экспрессии обеих цепей, поскольку цепи ТКР-альфа и ТКР-бета образуются из одного транскрипта, который разделяется на два белка во время транскрипции, обеспечивая получение равного молярного соотношения цепей ТКР-альфа и ТКР-бета. (Schmitt et al. 2009). (Schmitt et al. 2009).
Нуклеиновые кислоты, кодирующие ТКР согласно настоящему описанию, могут быть кодон-оптимизированы для увеличения экспрессии клеткой-хозяином. Избыточность генетического кода позволяет кодирование некоторых аминокислот более чем одним кодоном, однако некоторые конкретные кодоны менее "оптимальны", чем другие, по причине относительной доступности подходящих
тРНК, а также других факторов (Gustafsson и соавт., 2004). Как было показано, модификации последовательностей генов ТКР-альфа и ТКР-бета, так чтобы каждая аминокислота кодировалась оптимальным кодоном для экспрессии генов млекопитающих, а также удаление нестабильных мотивов мРНК или криптических сайтов сплайсинга, существенно усиливали экспрессию генов ТКР-альфа и ТКР-бета (Scholten и соавт., 2006).
Кроме того, нарушение комплементарное(tm) между введенными и эндогенными цепями ТКР может привести к приобретению специфичности, которая будет представлять значительный риск для аутоиммунное(tm). Например, формирование смешанных димеров ТКР может снизить число молекул CD3, имеющихся в наличии для формирования правильно спаренных комплексов ТКР, и, таким образом, может существенно снизить функциональную авидность клеток, экспрессирующих введенный ТКР (Kuball и соавт., 2007).
Для снижения ошибочного спаривания С-концевой домен введенных цепей ТКР согласно настоящему описанию может быть модифицирован в целях стимуляции межцепочечной аффинности, при этом снижая способность введенных цепей спариваться с эндогенным ТКР. Данные стратегии могут включать замещение С-концевых доменов ТКР-альфа и ТКР-бета-цепей человека их мышиными эквивалентами (С-концевой "муринизированный" домен ); получение второй межцепочечной дисульфидной связи в С-концевом домене за счет введения второго остатка цистеина в обе цепи: ТКР-альфа и ТКР-бета введенного ТКР (модификация цистеином); обмен взаимодействующими остатками в С-концевом домене ТКР-альфа и ТКР-бета-цепей ("выступ-во-впадину"); и слияние вариабельных доменов цепей ТКР-альфа и ТКР-бета непосредственно в CD3Ј (слияние CD3Q. (Schmitt et al. 2009).
В одном варианте осуществления клетка-хозяин генетически модифицирована, чтобы экспрессировать ТКР согласно настоящему описанию. В предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин является человеческой Т-клеткой или
предшественником Т-клетки. В одних вариантах осуществления Т-клетка или предшественник Т-клетки получены у пациента, больного раком. В других вариантах осуществления Т-клетка или предшественник Т-клетки получены у здорового донора. Клетки-хозяева согласно настоящему описанию могут быть аллогенными или аутологичными в отношении пациента, подлежащего лечению. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является гамма/дельта Т-клеткой, трансформированной для экспрессии альфа-/бета-ТКР.
"Фармацевтическая композиция" является композицией, подходящей для введения человеку в медицинском учреждении. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция является стерильной и произведена в соответствии с правилами GMP (надлежащей производственной практики).
Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли (см. также выше). Используемое в контексте данного изобретения понятие "фармацевтически приемлемая соль" относится к производным раскрытых пептидов, причем пептид модифицирован путем получения кислых или основных солей вещества. Например, кислые соли получают из свободного основания (как правило, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -NH2) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислых солей включают как органические кислоты, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, п-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и подобные, так и неорганические кислоты, например, соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и тому подобные. И наоборот, приготовление основных солей кислотных компонентов, которые могут присутствовать на пептиде, производится при
использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин и тому подобных.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты (ацетаты), трифторацетатов или соляной кислоты (хлориды).
Предпочтительно, если медикамент по настоящему изобретению является иммунотерапевтическим препаратом, таким как вакцина. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или системно в/к, в/м, п/к, в/б и в/в или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфицированными, чтобы совместно экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть по существу чистым или в комбинации с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или же вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и (Longenecker et al., 1993)). Пептид может быть также меченым или может быть слитым белком или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют CD4+ или CD8+ Т-клетки. Тем не менее, стимуляция CD8 Т-клеток более эффективна в присутствии поддержки, предоставляемой CD4 хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют CD8 Т-клетки, партнеры в слиянии или участки гибридной молекулы надлежащим образом предоставляют эпитопы, которые стимулируют С04-положительные Т
клетки. CD4- и С08-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.
В одном аспекте вакцина включает по меньшей мере один пептид, имеющий аминокислотную последовательность с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No 32, и по меньшей мере один дополнительный пептид, предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 20 и, наиболее предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать или восемнадцать пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть получен(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС I класса.
В еще одном аспекте изобретения предлагается нуклеиновая кислота (например, полинуклеотид), кодирующая пептид или вариант пептида по изобретению. Полинуклеотид может быть, например, ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинациями, как одно-, так и/или двухнитевыми; природными или стабилизированными формами полинуклеотидов, такими как, например, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, и может содержать или не содержать интроны при условии, что полинуклеотид кодирует пептид. Разумеется, только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, соединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. В другом аспекте изобретения предложен вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.
Был разработан ряд способов связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью комплементарных липких концов. К примеру, к сегменту ДНК могут быть добавлены комплементарные гомополимерные хвосты для встраивания в векторную ДНК. Этот вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между комплементарными гомополимерными хвостами, образуя молекулы рекомбинантной ДНК.
Синтетические линкеры, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические линкеры, содержащие ряд сайтов распознавания рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая International Biotechnologies Inc, Нью-Хейвен, Коннектикут, США.
В желаемом способе модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, используется полимеразная цепная реакция, как раскрыто в работе Saiki RK и соавт. (Saiki et al., 1988). Этот способ может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при конструировании в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются вирусные векторы, то предпочтительными являются поксвирусные или аденовирусные векторы.
Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящем хозяине для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными методиками, модифицированными соответствующим образом с учетом раскрытых в данном описании идей, для конструирования вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие методики включают те, что раскрыты, например, в патентах США №№ 4 440 859, 4 530 901, 4 582 800, 4 677 063, 4 678 751, 4 704 362, 4 710 463, 4 757 006, 4 766 075 и 4 810 648.
ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в соответствующего хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина,
способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли поддержание в эписомальной или интеграционной форме.
Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с соответствующей ориентацией и правильной рамкой считывания для экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть соединена с соответствующими нуклеотидными последовательностями, обеспечивающими координацию транскрипции и трансляции, распознаваемыми желательным хозяином, хотя такие контрольные элементы обычно имеются в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выделить трансформированные клетки-хозяева. Одна из методик отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, которая кодирует выбранный признак в трансформированной клетке, такой как устойчивость к антибиотикам.
В качестве альтернативы ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для совместной трансформации желаемой клетки-хозяина.
Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируют затем в течение достаточного времени и при соответствующих условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых в данном описании идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть выделен.
Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. coli и Bacillus subtilis), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae), мицелиальные грибы (например, Aspergillus spec), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих,
такими как клетки СНО, имеющимися в наличии в Американской коллекции типовых культур АТСС.
Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих для конститутивной экспрессии включает промотор CMV или SV40 с подходящим концевым участком поли-А и маркером устойчивости, таким как неомицин. Одним примером является pSVL, имеющимся в наличии в компании Pharmacia, Пискатеуэй, Нью-Джерси, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является pMSG, также имеющийся в наличии в Pharmacia. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются pRS403-406 и pRS413-416, и они, как правило, имеются в наличии у компании Stratagene Cloning Systems, Ла Джолла, Калифорния 92037, США. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (Yips) и включают дрожжевые селектируемые маркеры HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды pRS413-416 являются дрожжевыми плазмидами с центромерами (Yep). Основанные на промоторе CMV векторы (например, компании Sigma-Aldrich) обеспечивают кратковременную или устойчивую экспрессию, цитоплазматическую экспрессию или секрецию и N-терминальную или С-терминальную маркировку в различных комбинациях FLAG, 3xFLAG, c-myc или МАТ. Данные слитые белки позволяют проводить выявление, очистку и анализ рекомбинантного белка. Слияния с двойной меткой обеспечивают гибкость при выявлении.
Сильный регуляторный участок промотора цитомегаловируса человека (CMV) повышает уровни конститутивной экспрессии белка, достигающие 1 мг/л в клетках COS. Для менее активных клеточных линий белковые уровни обычно составляют -0,1 мг/л. Присутствие точки начала репликации SV40 будет приводить к высоким уровням репликации ДНК в пермиссивных клетках COS. Векторы CMV, например, могут содержать точку начала репликации рМВ1 (производное pBR322) в бактериальных клетках, ген бета-лактамазы для отбора устойчивости к ампициллину у бактерий, polyA гормона роста человека, и точку начала репликации f1. Векторы, содержащие лидерную последовательность препротрипсина (РРТ),
могут направлять секрецию слитых белков FLAG в культуральной среде для очистки с использованием антител к FLAG, смол и планшетов. Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.
В другом предпочтительном варианте осуществления кодируются два или более пептида или варианта пептидов по изобретению и, таким образом, они экспрессируются последовательно (как в случае структуры типа "бусины на нити"). В этих целях пептиды или варианты пептидов могут быть соединены или слиты воедино с помощью фрагментов линкерных аминокислот, таких как, например, LLLLLL, или же могут быть соединены без какого(их)-либо дополнительного(ых) пептида(ов) между ними. Эти структуры могут быть также использованы в противораковой терапии и, возможно, индуцировать иммунные ответы с участием как молекул МНС I, так и МНС II класса.
Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной конструкции по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и обычно являются штаммом Е. coli, таким как, например, Е. coli штамма DH5, имеющимся в наличии в Bethesda Research Laboratories Inc., Бетесда, Мэриленд, США, и RR1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типовых культур ("Атепсап Type Culture Collection* (АТСС), Роквил, Мэриленд, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как линии фибробластных клеток и клеток толстой кишки таких видов как мышь, крыса, обезьяна или человек. Дрожжевые клетки-хозяева включают YPH499, YPH500 и YPH501, которые, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, Ла Джола, Калифорния 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в
наличии в АТСС как CCL61, эмбриональные клетки швейцарской мыши линии NIH/3T3, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1658, клетки COS-1 из почек обезьяны, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1650, и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками почек эмбрионов человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки Sf9, которые могут трансфицироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Обзор в отношении выбора подходящих клеток-хозяев для экспрессии представлен, например, в учебном пособии авторов Paulina Balbas и Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols ", часть первая, второе издание, ISBN 978-1-58829-262-9, и другой литературе, известной специалисту данной области.
Трансформация соответствующих клеток-хозяев с помощью ДНК-конструкции по настоящему изобретению производится при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, работу Cohen и соавт. (Cohen et al., 1972) и (Green and Sambrook, 2012). Трансформация дрожжевых клеток описывается в работе Sherman и соавт. (Sherman et al., 1986). Также подходит метод Бигса (Beggs) (Beggs, 1978) . Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например, фосфат кальция и DEAE-декстран или липосомальные составы, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems или Life Technologies Inc., Гейтерсберг, Мэриленд 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.
Успешно трансформированные клетки, т. е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР. Альтернативно наличие белка в супернатанте может быть выявлено с применением антител.
Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, в конкретных терапевтических методах могут использоваться другие клетки-хозяева. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на подходящие молекулы МНС. Таким образом, в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.
В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. АПК, нагруженные рекомбинантным слитым белком, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), были одобрены Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствам США (FDA) 29 апреля 2010 г. для применения при лечении метастатического HRPC (гормон-рефрактерного рака предстательной железы), протекающего бессимптомно или с минимально выраженными симптомами (сипулейцел-Т) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
В другом аспекте изобретения предложен способ получения пептида или его варианта, причем способ включает культивацию клетки-хозяина и выделение пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.
В другом варианте осуществления пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению применяются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенного (в/в) введения, подкожного (п/к) введения, внутрикожного (в/к) введения, внутрибрюшинного (в/б) введения, внутримышечного (в/м) введения. Предпочтительные способы введения пептидов включают п/к, в/к, в/б, в/м и в/в. Предпочтительные способы введения ДНК включают в/к, в/м, п/к, в/б и в/в. Вводиться могут, к примеру, дозы от 50 мкг до 1,5 мг,
предпочтительно от 125 мкг до 500 мкг пептида или ДНК, в зависимости от соответствующего пептида или ДНК. Дозировка в данном диапазоне успешно использовалась в предыдущих клинических исследованиях (Walter et al., 2012).
Полинуклеотид, применяемый в активной вакцинации, может быть по существу чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, например, в работе Teufel и соавт. (Teufel et al., 2005). Полинуклеотидные вакцины просто получить, однако механизм действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понятен не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "генного пистолета". Пептид или пептиды, кодируемые нуклеиновой кислотой, могут быть слитым белком, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки против соответствующего противоположного определяющего комплементарность участка CDR, как описывается выше.
Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювантов. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные CD8-положительными Т-клетками или хелперными Т-клетками (ТН) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте по настоящему изобретению. Подходящие адъюванты включают, но без ограничения, 1018 ISS, соли алюминия, AMPLIVAX(r), AS15, BCG, СР-870,893, CpG7909, СуаА, dSLIM, флагеллин или лиганды TLR5, полученные из флагеллина, лиганд FLT3, ГМ-КСФ,
IC30, IC31, имиквимод (ALDARA(r)), резимиквимод, ImuFact IMP321, интерлейкины, такие как ИЛ-2, ИЛ-13, ИЛ-21, интерферон-альфа или бета или их пегилированные производные, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, иммуностимулирующие комплексы ISCOM, Juvlmmune(r), LipoVac, MALP2, MF59, монофосфорил липид А, Монтанид IMS 1312, Монтанид ISA 206, Монтанид ISA 50V, Монтанид ISA-51, эмульсии "вода в масле" и "масло в воде", ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ONTAK, OspA, векторную систему PepTel(r), основанные на поли-(лактид когликолиде) [PLG] и декстране микрочастицы, талактоферрин SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкан, Pam3Cys, стимулон Aquila QS21, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитаторы бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как Detox компании Ribi, Quil или Superfos. Предпочтительными адъювантами являются такие как адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфических для дендритных клеток, и их получение были описаны ранее (Allison and Krummel, 1995). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были непосредственно соотнесены с влиянием на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, TNF-D), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США № 5 849 589, специально включенный сюда в полном объеме путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ИЛ-7, ИНФ-альфа, ИНФ-бета) (Gabrilovich etal., 1996).
Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах CpG также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Не желая быть связанными соответствием какой-либо конкретной теории, авторы полагают, что CpG-олигонуклеотиды при активации врожденной (не приобретенной) иммунной системы действуют с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR), в основном, TLR9. Вызванная CpG активация TLR9 усиливает антиген-специфичные гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные
клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к повышенной активации клеток типа ТН1 и интенсивной выработке цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи со стороны CD4 Т-клеток. Активация ТН1, вызванная стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют активации ТН2. CpG-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся в организм вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или в подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена приблизительно на два порядка в сравнении с ответами антитела на полную дозу вакцины без CpG, что наблюдалось в некоторых экспериментах (Krieg, 2006). В патенте США № 6 406 705 В1 описывается комбинированное применение CpG-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Антагонистом CpG TLR9 является dSLIM (иммуномодулятор со структурой типа двуцепочечный стебель-петля) компании Mologen (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с TLR, такие как TLR 7, TLR 8 и/или TLR 9, связывающиеся с РНК.
Другие примеры пригодных к использованию адъювантов включают, но без ограничения, химически модифицированные CpG (например, CpR, Idera), аналоги dsPHK, такие как поли-(1:С) и их производные (например, AmpliGen(r), Hiltonol(r), поли-(1С1_С), поли(Ю^), поли(1:С1211), бактериальные ДНК или РНК, отличные от CpG, а также иммуноактивные малые молекулы и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб(r), целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, XL-999, CP
547632, пазопаниб, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, анти-С~П_А4, другие антитела, нацеленные на основные структуры иммунной системы (например, антитела к CD40, TGF6eTa, рецептору ТЫРальфа) и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъюванты. Количества и концентрации адъювантов и добавок, пригодных для использования в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.
Предпочтительными адъювантами являются анти-СО40, имиквимод, резиквимод, ГМ-КСФ, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, интерферон-альфа, CpG олигонуклеотиды и их производные, поли-(1:С) и ее производные, РНК, силденафил и составы из твердых микрочастиц с PLG или виросомы.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамид, имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамид, имиквимод и резиквимод. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является циклофосфамид, имиквимод или резиквимод. Еще более предпочтительными адъювантами являются монтанид IMS 1312, монтанид ISA 206, монтанид ISA 50V, монтанид ISA-51, поли-ICLC (Hiltonol(r)) и моноклональные антитела к CD40 или их комбинации.
Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или для перорального введения. Для этого пептиды и - факультативно - другие молекулы растворяют или суспендируют в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном, носителе. Помимо того, композиция может содержать вспомогательные вещества, такие как буферы, связующие агенты, балластные вещества, разбавители, ароматизаторы, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими агентами, такими как цитокины. Обширный список вспомогательных веществ, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из работы A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (Kibbe, 2000). Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний. Примеры фармацевтических композиций могут быть взяты, например, из ЕР2112253.
Важно понимать, что иммунный ответ, вызванный вакциной в соответствии с изобретением, направлен на раковые клетки на различных стадиях клеточного цикла и различных стадиях развития опухоли. Кроме того, атака направлена на различные сигнальные пути, ассоциированные с раковым заболеванием. Это является преимуществом в сравнении с вакцинами, направленными только на одну или немногие мишени, что может привести к тому, что опухоль легко приспособится к такой атаке (ускользание опухоли). Кроме того, не все отдельные опухоли имеют одинаковые паттерны экспрессии антигенов. Поэтому комбинация нескольких опухолеассоциированных пептидов гарантирует, что на каждой отдельной опухоли имеются по меньшей мере некоторые из этих мишеней. Композиция разработана исходя из того, что, как ожидается, каждая опухоль экспрессирует несколько антигенов и охватывает несколько независимых сигнальных путей, необходимых для роста и сохранения опухоли. Таким образом, вакцина в виде "готовой к применению" может быть легко использована для более крупной популяции пациентов. Это означает, что предварительный отбор пациентов для лечения вакциной может быть ограничен HLA-типированием, не требуя никакого дополнительного анализа биомаркеров экспрессии антигена, однако при этом
остается гарантия одновременного воздействия на несколько мишеней в виде индуцированного иммунного ответа, что важно для эффективности (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
В контексте настоящего описания понятие "каркас" относится к молекуле, которая специфически связывается с (например, антигенной) детерминантой. В одном варианте осуществления каркас способен направлять единицу, к которой он прикреплен (например, (второй) антиген-связывающий элемент) к сайту-мишени, например, к конкретному виду опухолевых клеток или стромы опухоли, несущих антигенную детерминанту (например, комплекс пептида с МНС в соответствии с настоящей патентной заявкой). В другом варианте осуществления каркас способен активировать пути передачи сигналов за счет его антигена-мишени, например, антигена комплекса Т-клеточного рецептора. Каркасы включают, но без ограничения, антитела и их фрагменты, антигенсвязывающие домены антитела, включающие вариабельный участок тяжелой цепи антитела и вариабельный участок легкой цепи антитела, связывающие белки, включающие по меньшей мере один мотив анкиринового повтора и однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы, аптамеры, (растворимые) ТКР и (модифицированные) клетки, такие как аллогенные или аутологичные Т-клетки. Чтобы оценить, является ли молекула каркасом, связывающимся с мишенью, может быть проведен анализ связывания.
"Специфическое" связывание обозначает, что каркас связывается с представляющим интерес комплексом пептида с МНС лучше, чем с другими встречающимися в природе комплексами пептида с МНС, в такой степени, что каркас, снабженный активной молекулой, способной уничтожать клетку, несущую специфическую мишень, не способен уничтожить другую клетку без специфической мишени, но презентирующую иной(ые) комплекс(ы) пептида с МНС. Связывание с другими комплексами пептида с МНС не играет роли, если пептид перекрестно реагирующего комплекса пептида с МНС не является встречающимся в природе, т. е. не образован из человеческого HLA-пептидома. Испытания для оценки потенциала уничтожения клетки-мишени хорошо известны из уровня техники. Они
должны проводиться с использованием клеток-мишеней (первичные клетки или клеточные линии) с неизмененной презентацией комплексов пептида с МНС или клеток, нагруженных пептидами, таким образом, что будет достигаться уровень встречающихся в природе комплексов пептида с МНС.
Каждый каркас может включать метку, которая обеспечивает возможность обнаружения связанного каркаса за счет определения наличия или отсутствия сигнала, подаваемого меткой. Например, каркас может быть помечен флуоресцентным красителем или любой другой применимой маркерной молекулы клетки. Такие маркерные молекулы хорошо известны из области техники. Например, флуоресцентное мечение, например, с помощью флуоресцентного красителя, может обеспечивать визуализацию связанного аптамера посредством флуоресцентной или лазерной сканирующей микроскопии или проточной цитометрии.
Каждый каркас может быть конъюгирован со второй активной молекулой, такой как, например, ИЛ-21, антитело к CD3 и антитело к CD28.
Для получения дополнительной информации о полипептидных каркасах см., например, раздел уровня техники патентной заявки WO 2014/071978А1 и цитируемую в ней литературу.
Настоящее изобретение далее относится к аптамерам. Аптамеры (см., например, заявку WO 2014/191359 и цитируемую в ней литературу) - это короткие одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, которые могут сворачиваться в определенные трехмерные структуры и распознавать специфические структуры-мишени. Оказалось, что они представляют собой подходящую альтернативу для разработки таргетной терапии. Как было продемонстрировано, аптамеры селективно связываются с различными сложными мишенями с высокой аффинностью и специфичностью.
Аптамеры, распознающие молекулы, которые находятся на поверхности клеток, были идентифицированы в последнее десятилетие и предоставляют возможность для разработки диагностических и терапевтических подходов. Так как было продемонстрировано, что аптамеры практически не обладают токсичностью и иммуногенностью, они являются многообещающими кандидатами для биомедицинского применения. Действительно, аптамеры, например, аптамеры, распознающие простатический специфический мембранный антиген, были успешно задействованы в таргетной терапии и продемонстрировали функциональность в моделях с ксенотрансплантатами in vivo. Кроме того, были идентифицированы аптамеры, распознающие конкретные опухолевые линии.
Могут быть отобраны ДНК-аптамеры, проявляющие широкий спектр свойств по распознаванию различных раковых клеток, и, в частности, клеток, образованных из солидных опухолей, тогда как неопухолегенные и первичные здоровые клетки не распознаются. Если идентифицированные аптамеры распознают не только конкретный опухолевый подтип, но и взаимодействуют с различными опухолями, это делает возможным применение аптамеров в качестве так называемых диагностических и терапевтических средств широкого спектра действия.
Более того, исследование поведения по связыванию с клетками с помощью проточной цитометрии показало, что аптамеры проявляли очень хорошую кажущуюся аффинность, которая выражалась на наномолярном уровне.
Аптамеры пригодны для диагностических и терапевтических целей. Кроме того, как могло быть продемонстрировано, некоторые аптамеры захватываются опухолевыми клетками и, таким образом, могут действовать в качестве молекулярных носителей для направленной доставки противораковых средств, таких как миРНК, в опухолевые клетки.
Могут быть отобраны аптамеры к сложным мишеням, таким как клетки и ткани и комплексы пептидов, включающих, предпочтительно состоящих из
последовательности в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID NO 1 по SEQ ID NO 32, в соответствии с представленным изобретением с молекулой МНС, используя метод cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment - систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении).
Пептиды по настоящему изобретению могут использоваться для получения и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть "нацеливание" радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точной локализации пораженных тканей.
Таким образом, в другом аспекте изобретения предложен способ получения рекомбинантного антитела, специфически связывающегося с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с рестриктированным по HLA антигеном, причем способ включает: иммунизацию генетически модифицированного, не являющегося человеком млекопитающего, содержащего клетки, экспрессирующие молекулы указанного главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса с растворимой формой молекулы МНС I или II класса в комплексе с указанным рестриктированным по HLA антигеном; выделение молекул мРНК из продуцирующих антитела клеток указанного не являющегося человеком млекопитающего; создание библиотеки фагового отображения, содержащей фаги, экспонирующие белковые молекулы, закодированные указанными молекулами мРНК; и выделение, по меньшей мере, одного фага из указанной библиотеки фагового отображения, причем указанный, по меньшей мере, один фаг, экспонирует на поверхности указанное антитело, специфически связывающееся с указанным главным комплексом
гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с указанным рестриктированным по HLA антигеном.
В другом аспекте изобретения предложено антитело, которое специфически связывается с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с рестриктированным по HLA антигеном, где антитело предпочтительно является поликлональным антителом, моноклональным антителом, биспецифичным антителом и/или химерным антителом.
Соответствующие способы получения таких антител и одноцепочечных главных комплексов гистосовместимости I класса, в равной степени как и другие инструменты для получения данных антител, раскрыты в патентных заявках WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 и в опубликованных работах (Cohen et al., 2003а; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003), которые все в целях настоящего изобретения в явном виде включены во всей полноте путем ссылки.
Предпочтительно, если антитело связывается с аффинностью связывания ниже 20 наномолей, предпочтительно ниже 10 наномолей, с комплексом, который также называется "специфическим" в контексте настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к пептиду, включающему последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO 1 по SEQ ID NO 32 или их вариант, который по меньшей мере на 88% гомологичен (предпочтительно, если он идентичен) последовательности с SEQ ID NO 1 по SEQ ID NO 32, или их варианту, который индуцирует перекрестную реакцию Т-клеток с указанным пептидом, где указанный пептид не является базовым полипептидом полной длины.
Настоящее изобретение далее относится к пептиду, включающему последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из
последовательностей с SEQ ID NO 1 no SEQ ID NO 32 или их вариант, который по меньшей мере на 88% гомологичен (предпочтительно, если он идентичен) SEQ ID NO 1 по SEQ ID NO 32, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину от 8 до 100, предпочтительно от 8 до 30 и, наиболее предпочтительно, от 8 до 14 аминокислот.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с изобретением, способным связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с изобретением, где пептид состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с изобретением, где пептид модифицирован (химическим способом) и/или включает непептидные связи.
Настоящее изобретение далее относится к пептидам в соответствии с изобретением, где пептид является частью слитого белка, в частности включающим N-терминальные аминокислоты HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (N), или где пептид слит с антителом (или слит с последовательностью антитела), например, таким антителом, которое является специфичным для дендритных клеток.
Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей пептиды в соответствии с изобретением, при условии, что пептид не является полностью (целиком) человеческим белком.
Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте в соответствии с изобретением, которая является ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинациями.
Настоящее изобретение далее относится к вектору экспрессии, способному экспрессировать нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к пептиду в соответствии с настоящим изобретением, к нуклеиновой кислоте в соответствии с настоящим изобретением или к вектору экспрессии в соответствии с настоящим изобретением для применения в медицине, в частности, в лечении рака желчного пузыря и холангиокарциномы.
Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину в соответствии с настоящим изобретением, которая является антигенпрезентирующей клеткой, предпочтительно - дендритной клеткой.
Настоящее изобретение далее относится к способу получения пептида в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный способ включает культивацию клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением и выделение пептида из указанной клетки-хозяина или его культуральной среды.
Настоящее изобретение далее относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, где антиген нагружен на молекулы МНС I или II класса, экспрессированные на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки, при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.
Настоящее изобретение далее относится к способу в соответствии с изобретением, где антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии,
способный экспрессировать указанный пептид, содержащий последовательность с SEQ ID N0: 1 по SEQ ID N0: 32 или указанную вариантную аминокислотную последовательность.
Настоящее изобретение далее относится к активированным Т-клеткам, полученным способом в соответствии с настоящим изобретением, где указанные Т-клетки селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий любую аминокислотную последовательность в соответствии с настоящим изобретением, причем способ включает введение пациенту эффективного числа Т-клеток в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение далее относится к применению любого описанного пептида, нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, клетки в соответствии с настоящим изобретением или активированного цитотоксического Т-лимфоцита в соответствии с настоящим изобретением в качестве медикамента или в производстве медикамента. Настоящее изобретение далее относится к способу применения в соответствии с настоящим изобретением, где медикамент проявляет противораковую активность.
Настоящее изобретение далее относится к способу применения в соответствии с изобретением, где медикамент является вакциной. Настоящее изобретение далее относится к способу применения в соответствии с изобретением, где медикамент проявляет противораковую активность.
Настоящее изобретение относится далее к применению в соответствии с изобретением, где указанные раковые клетки являются клетками рака желчного пузыря и холангиокарциномы или других солидных или гематологических опухолей, например, острого миелоидного лейкоза, меланомы, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы и рака почки.
Настоящее изобретение далее относится к конкретным белкам-маркерам и биомаркерам, основанным на пептидах в соответствии с настоящим изобретением, в контексте изобретения называемые "мишенями", которые могут быть использованы при постановке диагноза и/или составлении прогноза течения рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Настоящее изобретение относится также к применению этих новых мишеней для лечения рака.
Понятие "антитело" или "антитела" используется в контексте данного изобретения в широком смысле и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. В дополнение к интактным или "полным" молекулам иммуноглобулина в понятие "антитела" включены также фрагменты (например, участки CDR, фрагменты Fv, Fab и Fc) или полимеры таких молекул иммуноглобулина и гуманизированные версии молекул иммуноглобулина, при условии, что они проявляют любое из желаемых свойств (например, специфически связываются с (поли)пептидным маркером рака желчного пузыря и холангиокарциномы, доставляют токсин к клетке рака желчного пузыря и холангиокарциномы, экспрессирующей раковый ген-маркер на повышенном уровне и/или ингибируют активность полипептида-маркера рака желчного пузыря и холангиокарциномы) в соответствии с изобретением.
Если возможно, антитела по изобретению могут быть куплены в коммерческих источниках. Антитела по изобретению могут быть также получены при использовании хорошо известных способов. Опытному специалисту будет понятно,
что для получения антител по изобретению могут использоваться как полипептидные маркеры рака желчного пузыря и холангиокарциномы полной длины, так и их фрагменты. Полипептид, необходимый для получения антитела по изобретению, может быть частично или полностью очищенным из природного источника или же может быть получен с использованием методики рекомбинантной ДНК.
Например, кДНК, кодирующая пептид в соответствии с настоящим изобретением, такой как пептид с последовательностью с SEQ ID N0: 1 по SEQ ID N0: 32, полипептид или вариант или его фрагмент может быть экспрессирована в прокариотических клетках (например, бактерий) или эукариотических клетках (например, дрожжей, насекомых или клетках млекопитающих), после чего рекомбинантный белок может быть очищен и использован в получении препарата из моноклональных или поликлональных антител, которые специфически связываются с полипептидным маркером рака желчного пузыря и холангиокарциномы, использованным для получения антитела по изобретению.
Специалисту данной области будет понятно, что получение двух или более различных наборов моноклональных или поликлональных антител увеличивает вероятность получения антитела со специфичностью и аффинностью, необходимыми для предназначенного для него использования (например, для ELISA, иммуногистохимии, визуализации in vivo, терапии на основе иммунотоксина). Антитела испытывают на желаемую для них активность с помощью известных методов в соответствии с целью применения антител (например, ELISA, иммуногистохимия, иммунотерапия и т. д.; для получения дальнейшей информации по генерированию и испытанию антител см., например, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Например, антитела могут быть исследованы с помощью ELISA или метода иммунного блоттинга (Western-blot), иммуногистохимического окрашивания зафиксированных формалином образцов раковых тканей или замороженных тканевых срезов. После первоначального определения их характеристик in vitro антитела, предназначаемые для
терапевтического или диагностического применения in vivo исследуют в соответствии с известными методами клинического исследования.
Понятие "моноклональное антитело" в контексте настоящего изобретения обозначает антитело, полученное из, по существу, гомогенной популяции антител, т. е. отдельные антитела внутри популяции идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут быть представлены в небольших количествах. Моноклональные антитела в контексте настоящего изобретения специфически включают "химерные" антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из конкретного вида или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) часть(и) цепи идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям антител, полученных из другого вида или относящихся к другому классу или подклассу антител, в равной степени как и фрагментов таких антител, пока они проявляют желаемую антагонистическую активность (Патент США № 4 816 567, который включен в настоящее описание в полном объеме).
Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены при использовании гибридомного метода. В рамках гибридомного метода мышь или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируется иммунизирующим веществом, чтобы инициировать лимфоциты, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим веществом. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro.
Моноклональные антитела могут быть также получены с помощью технологий рекомбинантных ДНК, таких как описываемые в патенте США № 4 816 567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, может быть легко выделена и секвенирована с помощью стандартных методик (например, при
использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител).
In v/fro-методы также подходят для получения моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в особенности Fab-фрагментов, может быть произведено при использовании стандартных методик, известных из уровня техники. К примеру, расщепление может производиться при использовании папаина. Примеры расщепления под воздействием папаина описываются в заявке WO 94/29348 и в патенте США № 4 342 566. Расщепление антител под воздействием папаина обычно приводит к двум идентичным фрагментам, связывающимся с антигеном и называемым Fab-фрагментами, каждый из которых имеет отдельный антиген-связывающий сайт и остаточный Fc-фрагмент. В результате обработки пепсином получается фрагмент F(ab')2 и фрагмент pFc'.
Фрагменты антител, как связанные с другими последовательностями, так и не связанные, могут также включать вставки, делеции, замещения или другие выбранные модификации конкретных участков или аминокислотных остатков при условии, что активность фрагмента незначительно изменена или повреждена по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела. Данные модификации могут внести некоторые дополнительные свойства, такие как добавление/удаление аминокислот, способных к дисульфидному связыванию, увеличение их биологической стойкости, изменение их секреторных характеристик и т. д. В любом случае, фрагмент антитела должен обладать свойством биологической активности, таким как активностью связывания, регуляцией связывания на связывающем домене и т. д. Функциональные или активные участки антитела могут быть идентифицированы при мутагенезе конкретного участка белка с последующей экспрессией и исследованием экспрессированного полипептида. Такие способы полностью очевидны для опытного специалиста данной области и могут включать сайт-специфический мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела.
Антитела по изобретению могут далее включать гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител - это химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab' или другие антиген-связывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из комплементарных детерминантных областей (CDR) реципиента замещены остатками из CDR биологических видов, не являющихся человеком (донорское антитело), таких как мыши, крысы или кролики, имеющими желаемую специфичность, аффинность и связывающая способность. В некоторых случаях остатки Fv-каркаса (FR) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированном CDR или каркасных последовательностях. Как правило, гуманизированное антитело будет включать по сути все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по сути все из участков FR являются таковыми консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Оптимально, чтобы гуманизированное антитело содержало также по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина.
Способы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны из уровня техники. В целом, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотный остаток, введенный в него из источника, не являющегося человеческим. Такие аминокислотные остатки нечеловеческого происхождения часто называются "импортированными" остатками, которые обычно берутся из "импортированного" вариабельного домена. Гуманизация может быть по существу произведена
посредством замены участков CDR или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США № 4 816 567), где существенно меньшая часть, чем один интактный человеческий вариабельный домен была заменена соответствующей последовательностью видов, не являющихся человеком. На практике гуманизированные антитела являются обычно человеческими антителами, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, остатки FR заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов.
Использоваться могут трансгенные животные (например, мыши), которые способны при иммунизации вырабатывать полный спектр человеческих антител при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена, кодирующего участок присоединения тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных мышей зародышевой линии, приводит к полному ингибированию выработки эндогенных антител. Перенос генной матрицы иммуноглобулина клеток зародышевой линии человека в таких мутантных мышей зародышевой линии будет приводить к выработке человеческих антител после антигенной стимуляции. Человеческие антитела могут быть также получены в библиотеках фагового отображения.
Антитела по изобретению предпочтительно вводятся субъекту в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящее количество фармацевтически приемлемой соли обычно используется в составе для придания композиции изотоничности. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают физиологический раствор, раствор Рингера и раствор глюкозы. Уровень рН раствора составляет, предпочтительно, от около 5 до около 8 и, более предпочтительно, от около 7 до около 7,5. Кроме того, предлагаются носители, включающие препараты пролонгированного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, матрицы которых имеют вид профилированных объектов, к примеру, пленки, липосомы или микрочастицы. Для
специалиста данной области будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости от, например, способа введения и концентрации вводимого антитела.
Антитела могут вводиться субъекту, пациенту или в клетку посредством инъекции (например, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно) или другими способами, такими как вливание, которое гарантирует доставку к кровотоку эффективным образом. Антитела также могут вводиться внутритуморальными или перитуморальными способами, чтобы вызвать местные, а также и системные терапевтические эффекты. Предпочтительными являются местное или внутривенное введение.
Эффективная дозировка и режим введения антител могут быть определены эмпирически, а принятие таковых решений под силу специалисту данной области. Специалистам данной области будет понятно, что дозировка антител, которые должны быть введены, будет варьироваться в зависимости от, например, субъекта, которому будет вводиться антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других вводимых медикаментов. Типичная суточная доза антител при монотерапии антителами может варьироваться от около 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг массы тела или более в день, в зависимости от факторов, упоминаемых выше. После введения антитела, предпочтительно для лечения рака желчного пузыря и холангиокарциномы, эффективность терапевтического антитела может быть оценена различными способами, известными компетентному специалисту данной области. Например, размер, количество и/или распределение рака у субъекта, проходящего лечение, может контролироваться с помощью стандартных методов визуализации опухоли. Введенное в терапевтических целях антитело, которое блокирует рост опухоли, приводит к уменьшению размера и/или предотвращает развитие новых опухолей в сравнении стечением болезни, которое бы имело место без введения антитела, и является эффективным антителом для лечения рака.
В другом аспекте изобретения предложен способ получения растворимого Т-клеточного рецептора (ТКР), распознающего конкретный комплекс пептида и МНС. Такие растворимые Т-клеточные рецепторы могут быть получены из специфических Т-клеточных клонов, и их аффинность может быть повышена за счет мутагенеза, направленного на определяющие комплементарность участки. Для выбора Т-клеточного рецептора может использоваться фаговое отображение (заявка США 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). В целях стабилизации Т-клеточных рецепторов в процессе фагового отображения и в случае практического применения в качестве лекарственного средства альфа- и бета-цепи могут быть связаны, например, посредством не встречающихся в природе дисульфидных связей, других ковалентных связей (одноцепочечный Т-клеточный рецептор) или с помощью доменов димеризации (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). В целях выполнения определенных функций на клетках-мишенях Т-клеточный рецептор может быть связан с токсинами, лекарственными средствами, цитокинами (см., например, заявку США 2013/0115191) и доменами, рекрутирующими эффекторные клетки, такими как анти-СОЗ домен, и т. д. Более того, он может быть экспрессирован на Т-клетках, используемых для адоптивного переноса. Дополнительную информацию можно найти в патентных заявках WO 2004/033685А1 и WO 2004/074322А1. Комбинация растворимых ТКР описывается в патентной заявке WO 2012/056407А1. Другие способы получения описаны в патентной заявке WO 2013/057586А1.
Помимо того, пептиды и/или ТКР или антитела или другие связывающиеся молекулы настоящего изобретения могут быть использованы для подтверждения диагноза рака, поставленного патоморфологом на основании исследования биоптата.
Эти антитела или ТКР могут также применяться для диагностики in vivo. Как правило, антитело помечают радионуклеотидом (таким как111 In, "Тс, 14С,1311,3Н,32 Р или 35 S), так что опухоль может быть локализована с помощью иммуносцинтиграфии. В одном варианте осуществления антитела или их
фрагменты связываются с внеклеточными доменами двух или более мишеней белка, выбранного из группы, состоящей из указанных выше белков, при показателе аффинности (Кс!) ниже чем 1x10 мкМ.
Антитела для диагностических целей могут помечаться зондами, подходящими для обнаружения различными способами визуализации. Способы обнаружения зондов включают, но без ограничения, флуоресценцию, световую, конфокальную и электронную микроскопию; магнитно-резонансную томографию и спектроскопию; флюороскопию, компьютерную томографию и позитронно-эмиссионную томографию. Подходящие зонды включают, но без ограничения, флуоресцеин, родамин, эозин и другие флюорофоры, радиоизотопы, золото, гадолиний и другие лантаноиды, парамагнитное железо, фтор-18 и другие позитронно-активные радионуклиды. Более того, зонды могут быть би- или мультифункциональными и обнаруживаться более чем одним из приведенных способов. Данные антитела могут быть помечены напрямую или опосредованно указанными зондами. Присоединение зондов к антителам включает ковалентное присоединение зонда, внедрение зонда в антитело и ковалентное присоединение хелатирующего соединения для присоединения зонда, среди других широко признанных методов в данной области. Для иммуногистохимических исследований образец пораженной ткани может быть свежим или замороженным или может быть залит парафином и зафиксирован таким консервантом как формалин. Зафиксированный или залитый срез приводят в контакт с помеченным первичным антителом и вторичным антителом, где антитело используется для обнаружения экспрессии белков in situ.
Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения активированных Т-клеток in vitro, причем способ включает контактирование Т-клеток in vitro с нагруженными антигеном молекулами МНС человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом Т-клетки, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением.
Предпочтительно, если с антигенпрезентирующей клеткой применяется достаточное количество антигена.
Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не имеется пептидного транспортера ТАР или имеется его пониженный уровень или пониженная функциональная активность. Подходящие клетки с дефицитом пептидного транспортера ТАР, включают Т2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, связанный с процессингом антигена.
Линия человеческих клеток с недостаточностью Т2, на которые загружаются пептиды, имеется в наличии в Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталожным номером CRL 1992; клеточная линия дрозофилы, линия Schneider 2 имеется в наличии в АТСС под каталожным номером CRL 19863; клеточная линия мыши RMA-S описывается в работе Ljunggren и соавт. (Ljunggren and Karre, 1985).
Предпочтительно, если до трансфекции указанная клетка-хозяин, по существу, не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для обеспечения сигнала костимуляции для Т-клеток, такую как любая из В7.1, В7.2, ICAM-1 и LFA 3. Последовательности нуклеиновых кислот многочисленных молекул МНС I класса и костимуляторных молекул общедоступны в банках данных GenBank и EMBL.
В случае использования эпитопа МНС I класса в качестве антигена, Т-клетки являются С08-положительными Т-клетками.
Если антигенпрезентирующая клетка трансфицирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащий SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 32 или вариант такой аминокислотной последовательности.
Для получения Т-клеток in vitro могут быть использованы многие другие способы. Например, для получения ЦТЛ используются аутологичные опухоль-инфильтрующие лимфоциты. Plebanski и соавт. (Plebanski et al., 1995) для получения Т-клеток использовали аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). Кроме того, возможно получение аутологичных Т-клеток посредством нагрузки дендритных клеток пептидом или полипептидом или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Для получения аутологичных Т-клеток также можно использовать В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных Т-клеток могут быть использованы макрофаги, нагруженные пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. S. Walter и соавт. (Walter et al., 2003) описывают прайминг Т-клеток in vitro с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (иАПК), что является также подходящим способом получения Т-клеток против выбранного пептида. В настоящем изобретении иАПК были получены прикреплением предварительно образованных комплексов МНС-пептид к поверхности полистироловых частиц (микросфер) с помощью биохимического способа с биотином-стрептавидином. Данная система допускает точный контроль плотности МНС на иАПК, который позволяет селективно вызвать высоко- или низкоавидные антигенспецифические Т-клеточные ответы с высокой эффективностью в образцах крови. Кроме комплексов МНС-пептид, иАПК должны нести другие белки с костимуляторной активностью, такие как антитела к CD28, прикрепленные к их поверхности. Кроме того, такая основанная на иАПК система часто требует добавления соответствующих растворимых факторов, к примеру, цитокинов, таких как интерлейкин-12.
При получении Т-клеток могут быть также использованы аллогенные клетки, и этот способ подробно описывается в патентной заявке WO 97/26328, включенной сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи и инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть
использованы растительные вирусы (см., например, работу Porta и соавт. (Porta et al., 1994), в которой описывается разработка мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивной системы презентации чужеродных пептидов.
Активированные Т-клетки, которые направлены против пептидов по изобретению, пригодны для терапии. Таким образом, в другом аспекте изобретения предложены активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми способами по изобретению.
Активированные Т-клетки, полученные с помощью приведенного выше способа, будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO 32.
Предпочтительно, чтобы Т-клетка распознавала клетку при взаимодействии посредством ее ТКР с комплексом HLA/пептид (например, при связывании). Т-клетки пригодны для способа уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно Т-клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. Под "здоровым индивидом" авторы изобретения имеют в виду, что индивид имеет хорошее общее состояние здоровья, предпочтительно, чтобы он имел компетентную иммунную систему и, более предпочтительно, не страдал ни одним заболеванием, которое можно легко проконтролировать и выявить.
Клетками-мишенями in vivo для С08-положительных Т-клеток в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда
экспрессируют молекулы МНС II класса) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют молекулы МНС II класса;; (Dengjel et al., 2006)).
Т-клетки по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, в изобретении предложен также способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, причем способ включает введение пациенту эффективного числа Т-клеток, как определено выше.
Под понятием "аберрантно экспрессированный" авторы изобретения подразумевают также, что полипептид экспрессирован в избытке по сравнению с уровнями экспрессии в нормальных тканях, или что ген является "молчащим" в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием "экспрессирован в избытке" авторы изобретения понимают, что полипептид представлен на уровне, который, по меньшей мере, в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза и, более предпочтительно, по меньшей мере, в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.
Т-клетки могут быть получены способами, известными из уровня техники, к примеру, теми, что описаны выше.
Протоколы для этого так называемого адоптивного переноса Т-клеток хорошо известны из уровня техники. С обзорами можно ознакомиться в работах Gattioni и соавт. и Morgan и соавт. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
Другой аспект настоящего изобретения включает применение пептидов в комплексе с МНС для получения Т-клеточного рецептора, нуклеиновая кислота которого клонирована и введена в клетку-хозяин, предпочтительно Т-клетку.
Данная сконструированная Т-клетка может быть затем введена пациенту для лечения рака.
Любая молекула по изобретению, т. е. пептид, нуклеиновая кислота, антитело, вектор экспрессии, клетка, активированная Т-клетка, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, пригодна для лечения нарушений, характеризующихся клетками, ускользающими от иммунного ответа. Поэтому любая молекула по настоящему изобретению может применяться в качестве медикамента или в производстве медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами).
В настоящем изобретении предложен также медикамент, который полезен в лечении рака, в частности, рака желчного пузыря и холангиокарциномы и других злокачественных заболеваний.
В настоящем изобретении также предложен комплект, включающий:
(а) контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, как описанная
выше, в виде раствора или в лиофилизированной форме;
(б) факультативно - второй контейнер, содержащий разбавитель или
восстанавливающий раствор для лиофилизированного состава; и
(в) факультативно - инструкции по (i) применению раствора или (и) восстановлению
раствора и/или по применению лиофилизированного состава.
Кроме того, комплект может также включать один или более (iii) буферов, (iv) разбавителей, (v) фильтров, (vi) игл или (v) шприцев. Контейнер является, предпочтительно, бутылью, флаконом, шприцем или пробиркой; и он может быть контейнером многоразового применения. Фармацевтическая композиция предпочтительно является лиофилизированной.
Комплект согласно настоящему изобретению предпочтительно включает лиофилизированный состав по настоящему изобретению в подходящем контейнере и инструкции для его восстановления и/или по его применению. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, (например, двухкамерные флаконы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть изготовлен из разных материалов, таких как стекло или пластмасса. Предпочтительно, если комплект и/или контейнер содержит(ат) инструкции по применению контейнера или связанные с ним инструкции, которые дают указания по восстановлению и/или применению. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизированный состав должен быть восстановлен до таких концентраций пептидов, как описано выше. На этикетке далее может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.
Контейнер с составом может быть флаконом многоразового использования, который позволяет повторное введение (например, от 2 до 6 введений) восстановленного состава. Комплект может дополнительно включать второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).
После смешивания разбавителя и лиофилизированного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по меньшей мере 0,15 мг/мл/пептида (=75 мкг) и, предпочтительно, не более чем 3 мг/мл/пептида (=1500 мкг). Комплект может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
Комплекты по настоящему изобретению могут включать один контейнер, который содержит лекарственную форму фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с другими компонентами или без них (например, другие
соединения или фармацевтические композиции этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.
Комплект по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, упакованный для применения в комбинации с совместным введением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, природного продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора ангиогенеза; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты комплекта до введения пациенту могут быть предварительно смешаны, или же каждый компонент может находиться в отдельном контейнере. Компоненты комплекта могут быть предоставлены в виде одного или нескольких жидких растворов, предпочтительно, водного раствора, более предпочтительно, стерильного водного раствора. Компоненты комплекта также могут быть предоставлены в виде твердой формы, которая может быть превращена в жидкость при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительно, предоставляются в другом, отдельном, контейнере.
Контейнер терапевтического комплекта может быть флаконом, пробиркой, колбой, бутылью, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеется более одного компонента, комплект содержит второй флакон или другой контейнер, что позволяет произвести отдельное введение. Комплект может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Лечебный комплект будет предпочтительно содержать аппарат (например, одну или более игл, шприцы, глазные пипетки, пипетки и т. д.), который обеспечивает введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего комплекта.
Настоящий состав подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, глазной, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или чрескожный способ.
Предпочтительно, чтобы введение было п/к и, наиболее предпочтительно, введение в/к с помощью инфузионного насоса.
Так как пептиды по изобретению были выделены из клеток рака желчного пузыря и холангиокарциномы, медикамент по изобретению предпочтительно используется для лечения рака желчного пузыря и холангиокарциномы.
Кроме того, настоящее изобретение далее относится к способу получения персонализированного фармацевтического препарата для отдельного пациента, включающий производство фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из хранилища предварительно прошедших скрининг пептидов TUMAP, где по меньшей мере один пептид, используемый в фармацевтической композиции, выбран по его пригодности для отдельного пациента. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция является вакциной. Способ может быть адаптирован для получения Т-клеточных клонов для дальнейшего применения, например, при выделении ТКР или растворимых антител или других методов лечения.
"Персонализированный фармацевтический препарат" подразумевает разработанные специально для отдельного пациента терапевтические средства, которые будут применяться исключительно для лечения такого пациента, включая активно персонализированные противораковые вакцины и средства адоптивной клеточной терапии с использованием аутологичной ткани пациента.
В контексте настоящего изобретения термин "хранилище" относится к группе или набору пептидов, которые предварительно прошли скрининг на иммуногенность и/или избыточную презентацию в конкретном виде опухоли. Понятие "хранилище" не подразумевает, что конкретные пептиды, включенные в вакцину, были изготовлены заблаговременно и хранились в реальном помещении, хотя эта возможность также принимается во внимание. Во внимание определенно принимается тот факт, что пептиды могут быть изготовлены de novo для каждой
производимой индивидуализированной вакцины, или могут быть получены заранее и находиться на хранении. Хранилище (например, в форме банка данных) состоит из опухолеассоциированных пептидов, которые в высокой степени избыточно экспрессировались в опухолевой ткани пациентов с раком желчного пузыря и холангиокарциномы с различными HLA-A, HLA-B и HLA-C-аллелями. Оно может содержать пептиды, связанные с молекулами МНС I класса и МНС II класса или удлиненные пептиды, связанные с молекулами МНС I класса. Помимо опухолеассоциированных пептидов, собранных из нескольких тканей рака желчного пузыря и холангиокарциномы, хранилище может содержать маркерные пептиды, связанные с HLA-A*02 и HLA-A*24. Эти пептиды позволяют произвести количественное сравнение интенсивности Т-клеточного иммунного ответа, индуцированного пептидами TUMAP, и, следовательно, позволяют сделать важный вывод о способности вакцины вызывать противоопухолевые ответы. Во-вторых, они выполняют функцию важных пептидов положительного контроля, полученных "не из собственного" антигена в случае, если у пациента не наблюдаются вызванные вакциной Т-клеточные ответы на пептиды TUMAP, полученные из "собственных" антигенов. И в-третьих, оно может позволить сделать заключения относительно статуса иммунокомпетентности пациента.
Пептиды TUMAP для хранилища были идентифицированы с помощью интегрированного подхода функциональной геномики, комбинирующего анализ экспрессии генов, масс-спектрометрию и Т-клеточную иммунологию (XPresident (r)). Этот подход гарантирует, что только те пептиды TUMAP, которые действительно присутствуют в большом проценте опухолей, но не экспрессируются или экспрессируются лишь минимально на нормальной ткани, были выбраны для последующего анализа. В целях первоначального отбора пептидов образцы ткани рака желчного пузыря и холангиокарциномы пациентов и кровь здоровых доноров были проанализированы поэтапно:
1. HLA-лиганды из злокачественного материала идентифицировали с помощью масс-спектрометрии.
2. Для идентификации экспрессированных в избытке генов в злокачественной ткани (рак желчного пузыря и холангиокарцинома) по сравнению с рядом нормальных органов и тканей применяли анализ экспрессии информационной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) всего генома.
3. Идентифицированные HLA-лиганды сравнивали сданными по экспрессии генов. Пептиды, презентируемые в избытке или селективно презентируемые на опухолевой ткани, предпочтительно кодируемые селективно экспрессированными или экспрессированными в избытке генами, выявленными на этапе 2, считали подходящими TUMAP-кандидатами для мультипептидной вакцины.
4. Было произведено изучение литературы для выявления дополнительных свидетельств, подтверждающих релевантность идентифицированных в качестве TUMAP пептидов.
5. Релевантность избыточной экспрессии на уровне мРНК подтверждали повторным обнаружением выбранных на этапе 3 пептидов TUMAP на опухолевой ткани и отсутствием (или нечастым обнаружением) на здоровых тканях.
6. В целях оценки того, может ли быть осуществима индукция in vivo Т-клеточных
ответов выбранными пептидами, были проведены анализы иммуногенности in vitro
при использовании человеческих Т-клеток здоровых доноров, а также пациентов,
больных раком желчного пузыря и холангиокарциномой.
В одном из аспектов пептиды предварительно прошли скрининг на иммуногенность до их включения в хранилище. В качестве примера, но не для ограничения изобретения, иммуногенность пептидов, включенных в хранилище, определяется способом, включающим прайминг Т-клеток in vitro посредством повторных стимуляций CD8+ Т-клеток здоровых доноров клетками, презентирующими искусственный антиген, нагруженными комплексами пептид-МНС и антителами к CD28.
Этот способ является предпочтительным для редких видов рака и пациентов с редким профилем экспрессии. В отличие от мультипептидных коктейлей с постоянным составом, уже разработанных на данное время, "хранилище"
позволяет достигнуть существенно более высокого соответствия фактической экспрессии антигенов в опухоли составу вакцины. Выбранные отдельные пептиды или комбинации из нескольких "готовых к применению" пептидов будут использоваться для каждого пациента в рамках мультитаргетного подхода. Теоретически, подход, основанный на выборе, например, 5 различных антигенных пептидов из библиотеки из 50 экземпляров, уже приведет приблизительно к 17 миллионам возможных составов лекарственного препарата (ЛП).
В одном аспекте для включения в вакцину пептиды выбирают по их пригодности для отдельного пациента на основе способа в соответствии с настоящим изобретением, как описано в настоящем документе или как изложено ниже.
Фенотип HLA, данные транскриптомики и протеомики собирают с опухолевого материала и образцов крови пациентов для идентификации наиболее подходящих пептидов для каждого пациента, в состав которых входят пептиды TUMAP как из хранилища, так и уникальные для пациента (т. е. мутированные). Выбирать будут те пептиды, которые селективно или избыточно экспрессируются в опухолях пациентов и, где это возможно, проявляют сильную иммуногенность in vitro при анализе с индивидуальными МКПК пациента.
Предпочтительно, чтобы пептиды, включенные в вакцину, были идентифицированы способом, включающим: (а) идентификацию опухолеассоциированных пептидов (TUMAP), презентируемых опухолевым образцом отдельного пациента; (б) сравнение идентифицированных на этапе (а) пептидов с хранилищем (банком данных) пептидов, как описано выше; и (в) выбор по меньшей мере одного пептида из хранилища (банка данных), который коррелирует с опухолеассоциированным пептидом, идентифицированным у пациента. Например, пептиды TUMAP, презентируемые опухолевым образцом, идентифицируют с помощью: (а1) сравнения данных по экспрессии в опухолевом образце с данными нормальной ткани, соответствующей типу ткани опухолевого образца, для идентификации белков, которые в опухолевом образце
экспрессируются в избытке или аберрантно; и (а2) установления корреляции между данными экспрессии и последовательностями лигандов МНС, связанных с молекулами МНС I и/или II класса в опухолевом образце, в целях идентификации лигандов МНС, которые получены из белков, избыточно или аберрантно экспрессируемых опухолью. Предпочтительно, если последовательности лигандов МНС идентифицируются с помощью элюирования связанных пептидов из молекул МНС, выделенных из опухолевого образца, и секвенирования элюированных лигандов. Предпочтительно, если опухолевый образец и нормальная ткань получены от одного и того же пациента.
Помимо этого, или в качестве альтернативы этому, при выборе пептидов с использованием модели хранилища (банка данных) пептиды TUMAP могут быть идентифицированы у пациента de novo и затем быть включены в вакцину. В качестве одного примера: пептиды-кандидаты TUMAP могут быть идентифицированы у пациента с помощью (а1) сравнения данных по экспрессии в опухолевом образце с данными нормальной ткани, соответствующей типу ткани опухолевого образца, для идентификации белков, которые в опухолевом образце экспрессируются в избытке или аберрантно; и (а2) установления корреляции между данными экспрессии и последовательностями лигандов МНС, связанных с молекулами МНС I и/или II класса в опухолевом образце, в целях идентификации лигандов МНС, которые получены из белков, избыточно или аберрантно экспрессируемых опухолью. В качестве другого примера: могут быть идентифицированы белки, имеющие мутации, являющиеся уникальными для опухолевого образца, соотносимого с соответствующей нормальной тканью отдельного пациента, и могут быть идентифицированы пептиды TUMAP, специфической мишенью которых является мутация. Например, геном опухоли и соответствующей нормальной ткани могут быть секвенированы методом полногеномного секвенирования: для обнаружения несинонимичных мутаций на кодирующих белок участках генов геномную ДНК и РНК экстрагируют из опухолевых тканей, а нормальную, не имеющую мутаций геномную ДНК зародышевой линии экстрагируют из мононуклеарных клеток периферической крови (МПК).
Применяемый подход секвенирования нового поколения (NGS) заключается в повторном секвенировании кодирующих белок участков (повторное секвенирование экзома). В этих целях экзонную ДНК из человеческих образцов фиксируют с помощью поставляемых изготовителем наборов для обогащения целевыми фрагментами, за чем следует секвенирование, например, с помощью системы HiSeq2000 (lllumina). В дополнение к этому опухолевую мРНК секвенируют для прямого количественного определения генной экспрессии и подтверждения того, что мутировавшие гены экспрессированы в опухолях пациентов. Считывание полученных в результате миллионов последовательностей осуществляется алгоритмами программного обеспечения. Получаемый список содержит мутации и экспрессию генов. Опухолеспецифические соматические мутации определяют сравнением с вариантами зародышевой линии из МПК и устанавливают приоритетность. Идентифицированные de novo пептиды могут быть затем испытаны на иммуногенность, как описывается выше в случае хранилища, и пептиды-кандидаты TUMAP, обладающие подходящей иммуногенностью, выбирают для включения в вакцину.
В отдельном варианте осуществления изобретения пептиды, включенные в вакцину, идентифицируют с помощью: (а) идентификации опухолеассоциированных пептидов (TUMAP), презентируемых опухолевым образцом отдельного пациента способами, описанными выше; (б) сравнения пептидов, идентифицированных на этапе (а) с хранилищем пептидов, как описано выше, которые предварительно прошли скрининг на иммуногенность и избыточную презентацию в опухолях по сравнению с соответствующими нормальными тканями; (в) выбора по меньшей мере одного пептида из хранилища, который коррелирует с опухолеассоциированным пептидом, идентифицированным у пациента; и (г) факультативно, выбора по меньшей мере одного пептида, идентифицированного de novo на этапе (а) с подтверждением его иммуногенности.
В отдельном варианте осуществления изобретения пептиды, включенные в вакцину, идентифицируют с помощью: (а) идентификации
опухолеассоциированных пептидов (TUMAP), презентируемых опухолевым образцом отдельного пациента; и (б) выбора по меньшей мере одного пептида, идентифицированного de novo на этапе (а) и подтверждения его иммуногенности.
После того, как отобраны пептиды для персонализированной вакцины на основе пептидов, изготавливают вакцину. Вакцина - это предпочтительно жидкая лекарственная форма, состоящая из отдельных пептидов, растворенных в ДМСО в концентрации 20-40%, предпочтительно около 30-35%, такой как около 33% ДМСО.
Каждый пептид, включаемый в продукт, растворяют в ДМСО. Концентрация отдельных пептидных растворов должна выбираться в зависимости от числа пептидов, предназначенных для включения в продукт. Растворы отдельных пептидов в ДМСО смешивают в равном соотношении для получения раствора, содержащего все пептиды, предназначенные для включения в продукт, с концентрацией -2,5 мг/мл на пептид. Смешанный раствор затем разбавляют водой для инъекций в соотношении 1:3 для достижения концентрации 0,826 мг/мл на пептид в 33% ДМСО. Разбавленный раствор фильтруют через стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Получают конечный нерасфасованный раствор.
Конечный нерасфасованный раствор разливают во флаконы и хранят при -20°С до использования. Один флакон содержит 700 мкл раствора, содержащего 0,578 мг каждого пептида. Из них 500 мкл (прибл. 400 мкг на пептид) будут вводить с помощью внутрикожной инъекции.
Кроме того, пептиды по настоящему изобретению пригодны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из клеток рака желчного пузыря и холангиокарциномы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют или присутствуют в небольшом количестве в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для диагностики наличия рака.
Присутствие заявленных пептидов на тканевых биоптатах и в образцах крови может помочь патоморфологу в постановке диагноза рака. Выявление конкретных пептидов с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, могут дать патоморфологу свидетельства того, что образец ткани является злокачественной или воспаленной или пораженной заболеванием вообще, или же может использоваться в качестве биомаркера рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Присутствие групп пептидов может позволить классифицировать или выделить подклассы пораженных тканей.
Обнаружение пептидов на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о пользе от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного контроля. Таким образом, присутствие пептидов показывает, что этот механизм не используется проанализированными клетками.
Пептиды по настоящему изобретению могут использоваться в анализе ответов лимфоцитов на действие этих пептидов, таких как Т-клеточные ответы или ответы в виде антител к пептиду или пептиду в комплексе с молекулами МНС. Данные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров ответов в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивным переносом лимфоцитов. В условиях, когда проводится генная терапия, в целях оценки побочных эффектов могут быть проанализированы ответы лимфоцитов на пептиды. Мониторинг реакций лимфоцитов может также быть ценным инструментом для обследований в рамках последующего наблюдения после
трансплантации, к примеру, для выявления реакций "хозяин против трансплантата" и "трансплантат против хозяина".
Настоящее изобретение будет описано ниже с помощью примеров, которые описывают его предпочтительные варианты осуществления, со ссылкой на сопровождающие фигуры, тем не менее, не ограничивая объема изобретения. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитируемые источники включены в данное описание во всей полноте путем ссылки.
ФИГУРЫ
На Фигурах1А-Ю представлена избыточная презентация различных пептидов в нормальных тканях (белые столбцы) и тканях рака желчного пузыря и холангиокарциномы (черные столбцы). Фигура 1А: символ гена: MON2, пептид: AVMTDLPVI (SEQ ID NO.: 16); ткани слева направо: 6 жировых тканей, 8 надпочечных желез, 24 образца клеток крови, 17 кровеносных сосудов, 10 костных мозгов, 15 головных мозгов, 8 молочных желез, 4 хрящевые ткани, 7 пищеводов, 2 глаза, 16 сердец, 19 почек, 21 толстая кишка, 25 печеней, 49 легких, 8 лимфатических узлов, 13 нервов, 3 яичника, 11 поджелудочных желез, 6 паращитовидных желез, 1 брюшина, 6 гипофизов, 7 плацент, 1 плевра, 3 предстательные железы, 7 слюнных желез, 10 скелетных мышц, 12 образцов кожи, 6 тонких кишок, 12 селезенок, 5 желудков, 7 семенников, 2 вилочковые железы, 2 щитовидные железы, 14 трахей, 7 мочеточников, 8 мочевых пузырей, 6 маток, 3 желчных пузыря, 17 образцов рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Кроме того, пептид был выявлен на клетках 5/18 острых миелолейкозов, 7/48 доброкачественных гиперплазий предстательной железы, 4/17 хронических лимфоцитарных лейкозов, 1/29 колоректальных раков, 3/34 раков головного мозга, 4/21 рака печени, 4/10 раков головы и шеи, 4/18 меланом, 12/20 неходжкинских лимфом, 10/90 немелкоклеточных раков легких, 6/20 раков яичника, 2/18 раков пищевода, 3/19 раков поджелудочной железы, 3/23 раков почки, 6/17 мелкоклеточных раков легких, 3/15 раков мочевого пузыря и 6/16 раков матки. Фигура 1В: символ гена: CDC25B, пептид: ISAPLVKTL (SEQ ID NO.:24), ткани слева
направо: 6 жировых тканей, 8 надпочечных желез, 24 образца клеток крови, 17 кровеносных сосудов, 10 костных мозгов, 15 головных мозгов, 8 молочных желез, 4 хрящевые ткани, 7 пищеводов, 2 глаза, 16 сердец, 19 почек, 21 толстая кишка, 25 печеней, 49 легких, 8 лимфатических узлов, 13 нервов, 3 яичника, 11 поджелудочных желез, 6 паращитовидных желез, 1 брюшина, 6 гипофизов, 7 плацент, 1 плевра, 3 предстательные железы, 7 слюнных желез, 10 скелетных мышц, 12 образцов кожи, 6 тонких кишок, 12 селезенок, 5 желудков, 7 семенников, 2 вилочковые железы, 2 щитовидные железы, 14 трахей, 7 мочеточников, 8 мочевых пузырей, 6 маток, 3 желчных пузыря, 17 образцов рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Кроме того, пептид был выявлен на клетках 1/20 раков яичника. Фигура 1С: символ гена: RNF19A, пептид: NLSETASTMAL (SEQ ID NO.: 25); ткани слева направо: 6 жировых тканей, 8 надпочечных желез, 24 образца клеток крови, 17 кровеносных сосудов, 10 костных мозгов, 15 головных мозгов, 8 молочных желез, 4 хрящевые ткани, 7 пищеводов, 2 глаза, 16 сердец, 19 почек, 21 толстая кишка, 25 печеней, 49 легких, 8 лимфатических узлов, 13 нервов, 3 яичника, 11 поджелудочных желез, 6 паращитовидных желез, 1 брюшина, 6 гипофизов, 7 плацент, 1 плевра, 3 предстательные железы, 7 слюнных желез, 10 скелетных мышц, 12 образцов кожи, 6 тонких кишок, 12 селезенок, 5 желудков, 7 семенников, 2 вилочковые железы, 2 щитовидные железы, 14 трахей, 7 мочеточников, 8 мочевых пузырей, 6 маток, 3 желчных пузыря, 17 образцов рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Кроме того, пептид был выявлен на клетках 1/21 рака печени, 4/90 немелкоклеточных раков легких, 1/17 мелкоклеточных раков легких, 1/20 неходжкинских лимфом, 1/20 раков яичника и 1/15 раков мочевого пузыря. Фигура 1D: символ гена: MEGF6, пептид: VLQDELPQL (SEQ ID NO.: 20), образцы слева направо: 12 нормальных тканей (1 пищевод, 2 печени, 3 легких, 1 прямая кишка, 1 кожа, 1 тонкая кишка, 1 селезенка, 2 трахеи), 45 раковых тканей (3 рака желчных протоков, 1 рак молочной железы, 1 рак пищевода, 4 рака желчного пузыря, 5 раков головы и шеи, 3 рака почки, 4 лейкоцитарных лейкоза, 2 рака печени, 9 раков легких, 2 рака лимфатических узлов, 1 рак миелоидных клеток, 2 рака яичника, 3 рака поджелудочной железы, 4 рака предстательной железы, 1 рак мочевого пузыря). На Фигурах 1E-G представлена избыточная презентация различных пептидов в
различных раковых тканях (черные точки). Верхняя часть: Медианные показатели интенсивности МС-сигналов технических репликатов нанесены в виде точек для единичных Н1_А-А*02-положительных образцов нормальной ткани (серые точки) и опухолевых образцов (черные точки), на которых был обнаружен пептид. Опухолевые и нормальные образцы сгруппированы по органам происхождения, а на диаграммах размаха ("ящик с усами") представлены медиана, 25-ый и 75-ый процентили (ящик) и минимум и максимум (усы) нормализованного уровня интенсивности сигнала для нескольких образцов. Нормальные органы расположены в соответствии с категориями риска (клетки крови, кровеносные сосуды, головной мозг, печень, легкие: высокий уровень риска, серые точки; органы репродуктивной системы, молочная железа, предстательная железа: низкий уровень риска, серые точки; все остальные органы: средний уровень риска; серые точки). Нижняя часть: Относительная частота обнаружения пептида в каждом органе представлена в виде столбчатой диаграммы. Цифры под графиком обозначают число образцов, на которых был обнаружен пептид из общего числа проанализированных образцов для каждого органа (N = 526 для образцов нормальных тканей, N = 562 для образцов опухолевых тканей). Если пептид был обнаружен на образце, но по техническим причинам не могло быть проведено количественное определение, образец включали в данный график репрезентации частоты обнаружения, но в верхней части фигуры точку не обозначали. Ткани (слева направо): Нормальные образцы: клетки крови; кров, сосуды (кровеносные сосуды); головной мозг; сердце; печень; легкие; жировая ткань; надпочечник; желчн. прот. (желчные протоки); мочев. п. (мочевой пузырь); КМ (костный мозг); хрящ, ткань (хрящевая ткань); пищевод; глаз; желчн. п. (желчный пузырь); голова и шея; почка; толст, киш. (толстый кишечник); ЛУ (лимфатический узел); нерв; подж. жел. (поджелудочная железа); паращит. (паращитовидная железа); брюшина; гипофиз; плевра; скел. мышца (скелетная мышца); кожа; тонк. киш. (тонкий кишечник); селезенка; желудок; шитов. жел. (щитовидная железа); трахея; мочеточник; молочн. жел. (молочная железа); яичник; плацента; предст. жел. (предстательная железа); семенник; вилочк. жел. (вилочковая железа); матка Опухолевые образцы: ОМЛ: острый миелоидный лейкоз; РМЖ: рак молочной
железы; ХГК: холангиоклеточная карцинома; ХЛЛ: хронический лимфоцитарный лейкоз; КРК: колоректальный рак; РЖП: рак желчного пузыря; ГБМ: глиобластома; РЖ: рак желудка; РКЖП: рак кардиального отдела желудка и пищевода; ГКК: гепатоклеточная карцинома; ПлККГШ: рак головы и шеи; МЕЛ: меланома; НХЛ: неходжкинская лимфома; НМРЛ: немелкоклеточный рак легких; РЯ: рак яичника; РП: рак пищевода; РПЖ: рак поджелудочной железы; РПрЖ: рак предстательной железы; ПКК: почечно-клеточная карцинома; МРЛ: мелкоклеточный рак легких; КМП: карцинома мочевого пузыря; РЭМ: рак эндометрия матки. Фигура 1Е) символ гена: PLEKHM3, пептид: VLYDNTQLQL (SEQ ID NO.: 17), Фигура 1F) символ гена: ILF2, пептид: TAQTLVRIL (SEQ ID NO.: 26), Фигура 1G) символ гена: STAM, пептид: FASEVSNVL (SEQ ID NO.: 29).
На Фигурах 2А-2С представлены примеры профилей экспрессии исходных генов настоящего изобретения, которые в высокой степени экспрессированы в избытке или исключительно экспрессированы при раке желчного пузыря и холангиокарциномы в ряду нормальных тканей (белые столбцы) и 10 образцах рака желчного пузыря и холангиокарциномы (черные столбцы). Ткани слева направо: 6 артерий, 2 образца клеток крови, 5 головных мозгов, 3 сердца, 3 печени, 3 легких, 2 вены, 1 жировая ткань, 1 надпочечная железа, 1 желчный проток, 5 костных мозгов, 1 хрящевая ткань, 1 толстая кишка, 1 пищевод, 2 глаза, 2 желчных пузыря, 2 слюнные железы, 1 почка, 6 лимфатических узлов, 4 поджелудочные железы, 1 паращитовидная железа, 2 периферических нерва, 2 брюшины, 2 гипофиза, 2 плевры, 1 прямая кишка, 2 скелетные мышцы, 1 кожа, 1 тонкая кишка, 1 селезенка, 1 желудок, 1 щитовидная железа, 7 трахей, 2 мочеточника, 1 мочевой пузырь, 1 молочная железа, 5 яичников, 5 плацент, 1 предстательная железа, 1 семенник, 1 вилочковая железа, 1 матка, 11 образцов рака желчного пузыря и холангиокарциномы. Фигура 2А) символ гена: CYP2W1, В) символ гена: PKHD1, С) символ гена: SUCNR1.
На Фигуре 3 показаны типичные данные по иммуногенности: результаты проточного цито метрического анализа после пептид-специфического окрашивания мультимеров.
На Фигуре 4 представлены типичные результаты пептид-специфических ответов in vitro CD8+ Т-клеток здорового HLA-A*02+ донора. CD8+ Т-клетки примировали с помощью искусственных АПК, стимулированных моноклональными антителами к CD28 и HLA-A*02 в комплексе с пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 13 (А, левая секция), пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 16 (В, левая секция) и пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 25 (С, левая секция), соответственно. После трех циклов стимуляции обнаружение клеток, реагирующих с пептидом, производилось с помощью двойного окрашивания мультимеров, используя A*02/SeqlD No 13 (A),A*02/SeqlD No 16 (В) или A*02/SeqlD No 25 (С). Правые секции (А, В и С) представляют собой контрольное окрашивание клеток, простимулированных нерелевантными комплексами пептида и А*02. Из числа отдельных жизнеспособных клеток путем гейтирования выделяли CD8+ лимфоциты. Гейты Буля помогали исключить ложно-положительные ответы, обнаруженные с помощью мультимеров, специфических в отношении различных пептидов. Указывается частота выявления специфических мультимер-положительных клеток среди CD8+ лимфоцитов.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1:
Идентификация и количественное определение опухолеассоциированных пептидов, презентируемых на поверхности клетки
Образцы тканей
Опухолевые ткани пациентов были получены из: Conversant Healthcare Systems Inc., Хантсвилл, Алабама, США); ProteoGenex Inc. (Кальвер-Сити, Калифорния, США); Tissue Solutions Ltd (Глазго, Великобритания), Университетской клиники
г. Тюбинген (Тюбинген, Германия) Нормальные ткани были получены из компаний Asterand (Детройт, Мичиган, США и Ройстон, Хартфордшир, Великобритания); Bio-Options Inc. (Бри, Калифорния, США); BioServe (Белтсвиль, Мэриленд, США); Capital Bioscience Inc. (Роквилл, Мэриленд, США); Geneticist Inc. (Глендейл, Калифорния, США); Медицинского университета префектуры Киото (KPUM) (Киото, Япония); ProteoGenex Inc. (Кальвер-Сити, Калифорния, США), Tissue Solutions Ltd (Глазго, Великобритания), Университетской клиники г. Женева (Женева, Швейцария), Университетской клиники г. Гейдельберг (Гейдельберг, Германия), Университетской клиники г. Мюнхен (Мюнхен, Германия); Университетской клиники г. Тюбинген (Тюбинген, Германия).
Перед проведением хирургического операции или аутопсии было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после удаления ткани были подвергнуты шоковой заморозке и хранились до выделения TUMAP-пептидов при температуре -70°С или ниже.
Выделение пептидов HLA из образцов тканей
Пулы пептидов HLA из подвергнутых шоковой заморозке образцов тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) при использовании HLA-A*02-cпeцифичecкoгo антитела BB7.2 или HLA-A, -В, -С-специфического антитела W6/32, CNBr-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.
Масс-спектрометрический анализ
Полученные пулы комплексов пептид-HLA были разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазовой хроматографией (nanoAcquity UPLC system, Waters), и элюированные пептиды анализировали на гибридных масс-спектрометрах LTQ-velos и -fusion (ThermoElectron), снабженном источником ESI. Пулы пептидов наносили непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм в/д х 250 мм) с обращеннофазовым
сорбентом 1,7 мкм С18 (Waters) с применением скорости потока в 400 нл в минуту. Затем пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10% до 33% растворителя В при скорости потока 300 нл в минуту. Для создания градиента использовали растворитель А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворитель В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (PicoTip, New Objective) использовали для введения в источник наноЕБ!. Масс-спектрометры LTQ-Orbitrap работали в информационно-зависимом режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре Orbitrap (R = 30 000), за чем следовало сканирование МС/МС также на Orbitrap (R = 7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали при помощи программы SEQUEST с дополнительным контролем вручную. Идентифицированную пептидную последовательность подтверждали сравнением полученной картины фрагментации природного пептида с картиной фрагментации синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью.
Относительное количественное определение методом ЖХ/МС без изотопных меток проводили путем подсчета ионов, т. е. с помощью экстракции и анализа результатов ЖХ/МС (Mueller et al., 2007). Этот метод основан на предположении, что площадь пика ЖХ/МС сигнала пептида коррелирует с его концентрацией в образце. Извлеченные характеристики обрабатывали с помощью деконволюционного анализа состояния заряда и путем выравнивания времени удерживания (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Наконец, все результаты спектров ЖХ/МС были сопоставлены методом перекрестных ссылок с результатами по идентификации последовательности, чтобы объединить количественные данные различных образцов и тканей в профили презентации пептидов. Количественные данные были нормализованы с применением двухуровневой системы в соответствии с центральной тенденцией с целью учета вариабельности внутри технических и биологических повторных измерений. Таким
образом, каждый идентифицированный пептид может быть ассоциирован с количественными данными, позволяющими провести относительную количественную оценку образцов и тканей. Кроме того, все количественные данные, полученные для пептидов-кандидатов, были проконтролированы вручную в целях обеспечения взаимосогласованности данных и для проверки точности автоматического метода анализа. Для каждого пептида был рассчитан профиль презентации, показывающий средний уровень презентации в образце, а также вариабельность репликатов. В профиле сравниваются образцы различных тканей рака желчного пузыря и холангиокарциномы с фоновым уровнем образцов нормальной ткани. Профили презентации типичных пептидов, презентируемых в избытке, показаны на Фигуре 1. Показатели презентации отдельных пептидов показаны в Таблице 8.
Таблица 8: Показатели презентации. В таблице представлены пептиды, которые в очень высокой степени избыточно презентируются на опухолях в сравнении с панелью нормальных тканей (+++), в высокой степени избыточно презентируются на опухолях в сравнении с панелью нормальных тканей (++) или избыточно презентируются на опухолях в сравнении с панелью нормальных тканей (+). Панель нормальных тканей, рассматриваемых как подходящие для сравнения с опухолями, состояла из: жировая ткань, ткани надпочечной железы, артерии, костного мозга, головного мозга, центрального нерва, толстой кишки, пищевода, глаза, желчного пузыря, сердца, почки, печени, легких, лимфатических узлов, лейкоциты, ткань поджелудочной железы, паращитовидной железы, периферического нерва, брюшины, гипофиза, плевры, прямой кишки, слюнной железы, скелетных мышц, кожи, тонкой кишки, селезенки, желудка, щитовидной железы, трахеи, мочеточника, мочевого пузыря, вены.
SEQ ID No.
Последовательность
Презентация пептида
YAAEIASAL
+++
AAYPEIVAV
+++
EMDSTVITV
+++
Определение профиля экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению Избыточной презентации или специфической презентации пептида на опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками достаточно для его пригодности в иммунотерапии, и некоторые пептиды являются опухолеспецифическими, несмотря на присутствие их исходных белков также и в нормальных тканях. Тем не менее, выявление профилей экспрессии мРНК привносит дополнительный уровень безопасности при отборе пептидных мишеней для иммунотерапии. В особенности в случае терапевтических методов с высокой степенью риска для безопасности, таких как ТКР с созревшей аффинностью, идеальный целевой пептид будет
получен из белка, являющегося уникальным для опухоли и не встречающегося на нормальных тканях.
Источники и приготовление РНК
Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены различными организациями, которые перечислены выше (см. Пример 1) после получения письменной формы информированного согласия от каждого пациента. Препараты опухолевой ткани были мгновенно заморожены после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных образцов с использованием реагента TRI (Ambion, Дармштадт, Германия) с последующей очисткой на RNeasy (QIAGEN, Хильден, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.
Суммарная РНК здоровых тканей человека для экспериментов по секвенированию РНК (RNASeq) была получена из: компаний Asterand (Детройт, Мичиган, США и Ройстон, Хартфордшир, Великобритания), BioCat GmbH (Гейдельберг, Германия), BioServe (Белтсвиль, Мэриленд, США); Capital Bioscience Inc. (Роквиль, Мэриленд, США), Geneticist Inc. (Глендейл, Калифорния, США), Istituto Nazionale Tumori "Pascale" (Неаполь, Италия), ProteoGenex Inc. (Кальвер-Сити, Калифорния, США), Университетской клиники г. Гейдельберг (Гейдельберг, Германия).
Суммарная РНК опухолевых тканей для экспериментов RNASeq была получена из: Компаний ProteoGenex Inc. (Кальвер-Сити, Калифорния, США); Tissue Solutions Ltd (Глазго, Великобритания), Университетской клиники г. Тюбинген (Тюбинген, Германия).
Качество и количество всех образцов РНК оценивали на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent, Вальдбронн, Германия) с использованием набора RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).
Эксперименты по секвенированию РНК
Анализ экспрессии гена в образцах РНК опухолевой и нормальной ткани поводили способом секвенирования следующего поколения (RNAseq) лабораторией CeGaT (Тюбинген, Германия). Вкратце, библиотеки секвенирования подготавливали при использовании набора реактивов lllumina HiSeq v4 согласно протоколу производителя (lllumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), в который входит фрагментация РНК, синтез кДНК и добавление адаптеров секвенирования. Библиотеки, полученные из многочисленных образцов, смешивали в эквимолярном соотношении и секвенировали на системе компании lllumina HiSeq 2500 согласно инструкциям производителя, получая одноконцевые риды длиной 50 пар оснований. Обработанные риды картируют на человеческий геном (GRCh38) с помощью программного обеспечения STAR. Данные по экспрессии представляются на уровне транскриптов в виде RPKM (число ридов на тысячу пар нуклеотидов, отнесенное на миллион картированных ридов с помощью программного обеспечения Cufflinks) и на уровне экзонов (общее число ридов, получаемых с помощью программного обеспечения Bedtools), на основании идентификаций по банку данных последовательностей ensembl (Ensembl77). Для получения значений RPKM риды экзонов нормализованы по длине экзона и размеру выравнивания.
Типичные профили экспрессии исходных генов, предложенных в настоящем изобретении, которые в высокой степени экспрессированы в избытке или исключительно экспрессированы в клетках рака желчного пузыря и холангиокарциномы, представлены на Фигуре 2. Показатели экспрессии других отдельных генов показаны в Таблице 9.
Таблица 9: Показатели экспрессии. В таблице представлены пептиды, полученные из генов, которые в очень высокой степени избыточно экспрессируется в опухолях в сравнении с панелью нормальных тканей (+++), в высокой степени избыточно экспрессируется в опухолях в сравнении с панелью нормальных тканей (++) или избыточно экспрессируется в опухолях в сравнении с панелью нормальных тканей (+). Фоновый уровень данного балла рассчитывали по измерениям следующих
соответствующих нормальных тканей: жировая ткань, надпочечник, артерия, желчные протоки, клетки крови, костный мозг, головной мозг, хрящевая ткань, толстая кишка, пищевод, глаз, желчный пузырь, слюнная железа, сердце, почка, печень, легкие, лимфатический узел, поджелудочная железа, паращитовидная железа, периферический нерв, брюшина, гипофиз, плевра, прямая кишка, скелетная мышца, кожа, тонкая кишка, селезенка, желудок, щитовидная железа, трахея, мочеточник, мочевой пузырь и вена. В случае, если в наличии имелись данные для нескольких образцов одного и того же вида ткани, для расчетов использовали среднее арифметическое всех соответствующих образцов.
SEQ ID No
Последовательность
Экспрессия гена
GLIDEVMVLL
+++
LSASLVRIL
+++
VLPRAFTYV
+++
YGIEFWGV
+++
ПРИМЕР 3:
Иммуногенность in vitro для пептидов, презентируемых МНС I класса Для получения информации об иммуногенности пептидов TUMAP по настоящему изобретению заявители провели исследования с использованием прайминга Т-клеток in vitro на основе повторных стимуляций CD8+ Т-клеток искусственными антигенпрезентирующими клетками (иАПК), нагруженными комплексами пептид-МНС и антителом к CD28. Таким образом заявители могли показать иммуногенность для рестриктированных по Н1_А-А*0201 пептидов TUMAP по изобретению, демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека имеются CD8+ Т-клетки-предшественники (Таблица 10).
Прайминг CD8+ Т-клеток in vitro
В целях проведения стимуляций in vitro искусственными антигенпрезентирующими клетками, нагруженными комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом к CD28, заявители сначала выделили CD8+ Т-клетки из свежего продукта лейкафереза HLA-A*02 методом позитивной селекции с помощью микросфер CD8 (Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия). Кровь была получена от здоровых доноров
(после подписания формы информированного согласия) из Университетской клиники г. Мангейм, Германия.
МКПК и выделенные CD8+ лимфоциты инкубировали до использования в Т-клеточной среде (ТСМ), состоящей из RPMI-Glutamax (Invitrogen, Карлсруэ, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (PAN-Biotech, Эйденбах, Германия), 100 Ед/мл пенициллина / 100 мкг/мл стрептомицина (Cambrex, Кёльн, Германия), 1 мМ пирувата натрия (СС Pro, Обердорла, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (Cambrex). 2,5 нг/мл ИЛ-7 (PromoCell, Гейдельберг, Германия) и 10 Ед/мл ИЛ-2 (Novartis Pharma, Нюрнберг, Германия) также добавляли на этом этапе в среду ТСМ.
Получение микросфер, покрытых рМНС и антителами к CD28, стимуляции Т-клеток и считывание производили на хорошо исследованной системе in vitro, используя четыре различные молекулы рМНС для каждого цикла стимуляций и 8 различных молекул рМНС для каждого цикла считывания.
Очищенный костимуляторный lgG2a мыши к антителам человека CD28 АЬ 9.3 (Jung et al., 1987) был химически биотинилирован с использованием сульфо-N-гидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (Perbio, Бонн, Германия). Использованные микросферы представляли собой полистирольные частицы размером 5,6 мкм, покрытые стрептавидином (Bangs Laboratories, Иллинойс, США).
рМНС, использованные для положительных и отрицательных контрольных стимуляций, были A*0201/MLA-001 (пептид ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 39) из модифицированного Melan-A/MART-1) и A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI из DDX5, SEQ ID NO. 40), соответственно.
800 000 микросфер / 200 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета в присутствии 4 х 12,5 нг другого биотинилированного комплекса рМНС, промывали и затем
добавляли 600 нг биотинилированных антител к CD28 в объеме 200 мкл. Стимуляцию проводили в 96-луночных планшетах путем совместной инкубации 1x106 CD8+ Т-клеток с 2x105 промытых покрытых микросфер в 200 мкл среды ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (PromoCell) в течение 3 дней при 37°С. Половина среды была затем заменена на свежую среду ТСМ с добавлением 80 Ед/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 4 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций производили в общей сложности три раза. Для считывания с рМНС-мультимеров использовали 8 различных молекул рМНС на цикл. Использовался двумерный комбинаторный подход к кодировке, как было описано ранее (Andersen et al., 2012) с незначительными изменениями, относящимися к мечению с 5 различными флуорохромами. Наконец, проводили анализ мультимеров посредством окрашивания клеток набором для определения жизнеспособности клеток при воздействии ближнего ИК-излучения с красителем Live/dead (Invitrogen, Карлсруэ, Германия), клоном SK1 антител CD8-FITC (BD, Гейдельберг, Германия) и мультимерами рМНС с флуоресцентными метками. Для анализа использовали цитометр BD LSRII SORP, снабженный подходящими лазерами и фильтрами. Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля от всех CD8+ клеток. Оценку результатов анализа мультимеров проводили с помощью программы FlowJo (Tree Star, Орегон, США). Прайминг in vitro специфических мультимер-положительных CD8+ лимфоцитов оценивали сравнением со стимуляциями отрицательного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была определена, если было обнаружено, что по меньшей мере в одной подлежащей оценке простимулированной in vitro лунке одного здорового донора содержалась специфическая CD8+ Т-клеточная линия после стимуляции in vitro (т. е. когда данная лунка содержала по меньшей мере 1% специфичных мультимер-положительных среди С08-положительных Т-клеток и процентная доля специфичных мультимер-положительных клеток была по меньшей мере в 10 раз выше медианного значения стимуляций отрицательного контроля).
Иммуногенность in vitro для пептидов рака желчного пузыря и холангиокарциномы
Для проанализированных пептидов, связанных с молекулами HLA I класса, иммуногенность in vitro могла быть продемонстрирована генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий. Типичные результаты проточного цито метрического анализа после TUMAP-специфического окрашивания мультимеров для 2 пептидов по изобретению показаны на Фиг. 3 вместе с соответствующими отрицательными контролями. Дополнительные типичные результаты проточного цитометрического анализа после TUMAP-специфического окрашивания мультимеров для двух пептидов по изобретению показаны на Фиг. 4 вместе с соответствующими отрицательными контролями. Результаты для пяти пептидов по изобретению обобщаются в Таблице 10А. Дополнительные результаты для четырех пептидов по изобретению обобщаются в Таблице 10Б.
Таблица 10А: Иммуногенность in vitro пептидов HLA I класса по изобретению Типичные результаты экспериментов по иммуногенности in vitro, проведенных заявителем для пептидов по изобретению. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; > = 70 % = ++++
Seq ID
Последовательность
лунки
ILGTEDLIVEV
LLWGNLPEI
GLIDEVMVL
ILVDWLVQV
KIQEILTQV
SEQ ID No
Последовательность
Положительные лунки[%]
NLSETASTMAL
ПРИМЕР 4: Синтез пептидов
Все пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза пептидов с использованием Fmoc-методики. Идентичность и чистоту каждого отдельного пептида определяли с помощью масс-спектрометрии и аналитической ОФ ВЭЖХ. Были получены пептиды в виде белого или грязно-белого лиофилизата (соль трифторацетата) со степенью чистоты > 50%. Все пептиды TUMAP предпочтительно вводят в виде солей трифторацетатов или ацетатов, возможны также другие солевые формы.
ПРИМЕР 5:
Анализ связывания МНС
Пептиды-кандидаты для Т-клеточной терапии в соответствии с настоящим изобретением далее были испытаны на их способность связываться с МНС (аффинность). Отдельные комплексы пептида и молекулы МНС были получены с помощью реакции обмена лигандами под воздействием УФ-излучения, при которой УФ-чувствительный пептид расщепляется под воздействием УФ-излучения, и получается продукт обмена с исследуемым пептидом. Только пептиды-кандидаты, которые могут эффективно связываться и стабилизировать восприимчивые к пептиду молекулы МНС, предотвращают диссоциацию комплексов с МНС. Для определения выхода продукта реакции обмена проводили анализ методом ELISA на основе обнаружения легкой цепи (82т) стабилизированных комплексов с МНС. Этот анализ производили, в основном, как описано у Роденко и соавт. (Rodenko et al., 2006).
В 96-луночные планшеты MAXISorp (NUNC) на ночь вносили 2 мкг/мл стрептавидина в PBS при комнатной температуре, промывали 4 раза и блокировали
в течение 1 часа при 37°С в 2% БСА, содержащем блокирующий буфер. Полученные в результате рефолдинга мономеры Н1_А-А*02:01/М1_А-001 служили в качестве стандарта, покрывающего диапазон 15-500 нг/мл. Мономерные комплексы пептид-МНС после реакции обмена под воздействием УФ-излучения100-кратно разводили в блокирующем буфере. Образцы инкубировали в течение 1 ч при 37°С, промывали четыре раза, инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 2 мкг/мл пероксидазы хрена, конъюгированной с антителом к 82т, снова промывали и проводили обнаружение с помощью раствора ТМБ; реакцию останавливали NH2SO4. Величину поглощения измеряли при длине волны 450 нм. Пептиды-кандидаты, которые демонстрировали высокий выход реакции обмена (предпочтительно более 50%, наиболее предпочтительно, более 75%) обычно являются предпочтительными для генерирования и получения антител или их фрагментов и/или Т-клеточных рецепторов или их фрагментов, поскольку они проявляют достаточную авидность по отношению к молекулам МНС и предотвращают диссоциацию комплексов МНС.
Таблица 11: Показатели связывания с молекулами МНС I класса. Связывание рестриктированных по молекулам HLA I класса пептидов с Н1_А-А*02:01 распределено по выходу пептидного обмена: > 10% = +; > 20% = ++; > 50 = +++; > 75% = ++++
SEQ ID No
Последовательность
Пептидный обмен
YAAEIASAL
+++
AAYPEIVAV
+++
EMDSTVITV
+++
FLLEAQNYL
++++
GLIDEVMVLL
++++
LLLPLLPPLSPS
++++
LLLSDPDKVTI
++++
LSASLVRIL
RLAKLTAAV
++++
SAFPFPVTVSL
SIIDFTVTM
++++
TILPGNLQSW
VLPRAFTYV
++++
YGIEFVVGV
++++
SVIDSLPEI
++++
AVMTDLPVI
++++
VLYDNTQLQL
++++
SLSPDLSQV
+++
TAYPQVVVV
VLQDELPQL
++++
IAFPTSISV
+++
SAFGFPVIL
SLLSELLGV
++++
ISAPLVKTL
NLSETASTMAL
++++
TAQTLVRIL
ALAEQVQKA
+++
YASGSSASL
FASEVSNVL
++++
FASGLIHRV
+++
IAIPFLIKL
++++
YVISQVFEI
++++
Список цитируемой литературы
Aalto, Y. et al., Leukemia 15 (2001): 1721-1728 Abbruzzese, C. et al, J Exp.Clin Cancer Res 31 (2012): 4 Aghajanova, L. et al, Hum.Reprod. 30 (2015): 232-238
Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933 American Cancer Society, (2015), www.cancer.org Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902 Appay, V. et al, Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814 Aung, P. P. et al, Oncogene 25 (2006): 2546-2557 Bai, V. U. et al., PLoS.One. 7 (2012): e34875 Banchereau, J. et al, Cell 106 (2001): 271-274 Bausch, D. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 302-309 Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282 Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series В (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300
Bouameur, J. E. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014): 885-894
Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711
Bozoky, B. et al., Int.J Cancer 133 (2013): 286-293
Braumuller, H. et al., Nature (2013)
Bridgewater, J. et al., J Hepatol. 60 (2014): 1268-1289
Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599
Bruckdorfer, T. etal., Curr.Pharm.Biotechnol. 5(2004): 29-43
Bruey, J. M. et al, J Biol Chem 279 (2004): 51897-51907
Campos-Parra, A. D. etal, Gynecol.Oncol 143 (2016): 406-413
Card, K. F. et al, Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357
Casagrande, G. etal, Haematologica91 (2006): 765-771
Chan, Y. W. et al., Nat Commun. 5 (2014): 4844
Chan-On, W. et al, Drug Des Devel.Ther. 9 (2015): 2033-2047
Chanock, S. J. etal., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223
Chaudhury, A. et al., Nat Cell Biol. 12 (2010): 286-293
Cheng, S. etal., Int.J Mol.Sci. 17 (2016)
Cohen, C. J. et al., J Mol Recogmt. 16 (2003a): 324-332
Cohen, C. J. et al, J Immunol 170 (2003b): 4349-4361
Cohen, S. N. etal., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114
Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)
Colombetti, S. et al, J Immunol. 176 (2006): 2730-2738
Csiszar, A. et al., Breast Cancer Res 16 (2014): 433
Dengjel, J. et al, Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170
Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207
Dias, R. P. etal., Epigenomics. 5 (2013): 331-340
Egan, J. B. etal., Blood 120 (2012): 1060-1066
Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296
Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814
Fontalba, A. et al, J Immunol. 179 (2007): 8519-8524
Gabnlovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103
Gao, M. et al, PLoS.One. 7 (2012): e49687
Gao, Z. H. et al., Histopathology 65 (2014): 527-538
Garcia, P. L. et al, Oncogene 35 (2016): 833-845
Gasser, J. A. et al., Mol.Cell 56 (2014): 595-607
Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393
Gnjatic, S. et al, Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867
Godkin, A. et al, Int.Immunol 9 (1997): 905-911
Gomez, A. etal., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 1004-1011
Gong, C. etal., Tumour.Biol 36 (2015): 9189-9199
Gran, О. V. etal., Haematologica 101 (2016): 1046-1053
Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)
Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)
Guo, S. T. et al, Oncogene (2015)
Hamm, A. et al., BMC.Cancer 8 (2008): 25
Higuchi, R. etal, Surg.Today 36 (2006): 559-562
Hou, M. et al., Oncol Lett. 10 (2015): 23-26
Ни, B. et al., Mol.Cell Biochem. 396 (2014): 175-185
Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838
Isikbay, M. et al, Horm.Cancer 5 (2014): 72-89
Jeon, M. J. et al., Thyroid 26 (2016): 683-690
Jiang, H. et al., Sheng Li Xue.Bao. 68 (2016): 740-746
Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611 -4615
Kannan, K. etal, Cancers (Basel) 7 (2015): 2083-2093
Kanthan, R. et al., J Oncol 2015 (2015): 967472
Karlgren, M. etal., Expert.Opin.Ther.Targets. 11 (2007): 61-67
Katada, K. et al, J Proteomics. 75 (2012): 1803-1815
Kibbe, A. H, Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)
Kim, J. H. et al, J Prev.Med.Pubhc Health 49 (2016a): 61-68
Kim, M. К et al., Pancreas 45 (2016b): 528-532
Kinoshita, T. et al., Int.Immunol. 18 (2006): 1701-1706
Kinoshita, T. et al., J Biol Chem 280 (2005): 21720-21725
Klee, E. W. et al, Clin Chem 58 (2012): 599-609
Korshunov, A. et al., Am. J Pathol. 163 (2003): 1721-1727
Kraya, A. A. et al, Autophagy. 11 (2015): 60-74
Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484
Kruhlak, M. et al., Nature 447 (2007): 730-734
Kuligina, E. S. et al, Fam.Cancer 12 (2013): 129-132
Lahsnig, C. et al., Oncogene 28 (2009): 638-650
Lang, F. etal., Int.J Biochem.Cell Biol 42 (2010): 1571-1575
Leal, M. F. et al., Oncotarget. (2016)
Lee, K. Y. et al, J Med. 35 (2004): 141-149
Li, J. etal, Biochem.Biophys.Res Commun. 363 (2007): 895-900
Li, L. Q. et al, FEBS Lett. 590 (2016): 445-452
Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987
Liu, H. etal., Tumour.Biol 36 (2015a): 8325-8331
Liu, L. etal., Genet.Mol.Res 14 (2015b): 11860-11866
Liu, L. et al., Genet.Mol.Res 14 (2015c): 5496-5500
Liu, M. et al, Hepatology 55 (2012): 1754-1765
Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759
Longenecker, В. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291
Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585
Lukas, T. J. etal., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795
Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)
Marks, E. I. et al., World J Gastrointest.Oncol 7 (2015): 338-346
Mazieres, J. et al, Oncogene 24 (2005): 5396-5400
Melhem, A. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 3196-3204
Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237
Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129
Mori, M. etal., Transplantation64 (1997): 1017-1027
Mortara, L. etal., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443
Mueller, L. N. et al, J Proteome.Res 7 (2008): 51-61
Mueller, L. N. et al, Proteomics. 7 (2007): 3470-3480
Mumberg, D. etal., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638
Ni, T. etal., JMol.Histol. 46 (2015): 325-335
Nishida, C. R. et al, Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502
Niu, M. etal., J Pharmacol. Sci. 128 (2015): 131-136
Noh, С. K. etal., Clin Biochem. 47 (2014): 1257-1261
Oh, Y. etal, J Biol. Chem 287 (2012): 17517-17529
Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)
Plebanski, M. et al, Eur. J Immunol 25 (1995): 1783-1787 Porta, C. etal., Virology 202 (1994): 949-955 Qin, J. et al., Cell Physiol Biochem. 35 (2015): 2069-2077 Rakic, M. etal, Hepatobiliary.Surg.Nutr. 3 (2014): 221-226 Rammensee, H. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219
RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/books/NBK21091 /
Rimkus, C. et al., Clin Gastroenterol.Hepatol. 6 (2008): 53-61
Rim, В. I. et al, Cancer 107 (2006): 67-74
Rock, K. L. etal., Science 249 (1990): 918-921
Rodenko, B. etal., NatProtoc. 1 (2006): 1120-1132
Roman-Gomez, J. et al., Blood 109 (2007): 3462-3469
Saiki, R. K. etal., Science 239 (1988): 487-491
Scortegagna, M. etal., Cancer Res 75 (2015): 1399-1412
Seeger, F. H. et al, Immunogenetics 49 (1999): 571-576
Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)
Singh-Jasuja, H. etal., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195
Sivaslioglu, S. etal., Clin Appl.Thromb.Hemost. 20 (2014): 651-653
Slim, R. et al., Mol.Hum.Reprod. 18 (2012): 52-56
Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094
Smith, P. et al, Clin Cancer Res 13 (2007): 4061-4068
Song, G. Q. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 5001-5009
Song, H. R. et al., Mol.Carcinog 52 Suppl 1 (2013): E155-E160
Song, Q. etal., Tumour.Biol. 35 (2014): 1377-1382
Sturm, M. et al, BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163
Sun, L. et al., J Biochem.Mol.Toxicol. 28 (2014): 450-455
Talanco, C. etal., Oncotarget. 6 (2015): 37511-37525
Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762
Tinholt, M. et al, BMC.Cancer 14 (2014): 845
Tran, E. etal., Science344 (2014): 641-645
Turnbull, C. et al, Breast Cancer Res Treat. 124 (2010): 283-288
Ulker, V. et al., Eur.J Obstet.Gynecol.Reprod.Biol 170 (2013): 188-192
von Hahn, T. et al., Scand.J Gastroenterol. 46 (2011): 1092-1098
Walker, B. A. et al, Blood 120 (2012): 1077-1086
Walter, S. etal., J Immunol 171 (2003): 4974-4978
Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261
Wan, C. et al., Mol.Cell Biochem. 410 (2015): 25-35
Wang, J. etal., Hepatobiliary.Pancreat.Dis.Int. 4 (2005): 398-402
Wang, Q. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 271
Wang, Y. et al., Mol.Endocnnol. 28 (2014): 935-948
Willcox, В. E. etal., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423
World Cancer Report, (2014)
Wu, G. Q. et al, Plasmid 64 (2010): 41-50
Xiao, W. H. et al., Cancer Gene Ther. 22 (2015): 278-284
Xu, J. et al., Breast Cancer Res Treat. 134 (2012): 531-541
Yang, L. etal., Oncogene30 (2011): 1329-1340
Yang, L. et al., J Biol Chem 283 (2008): 35295-35304
Yu, J. et al., Oncogene 32 (2013): 307-317
Zaremba, S. et al, Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577
Zhang, J. R. etal., J Mol.Med (Berl) 92 (2014a): 1319-1330
Zhang, K. et al., Tumour.Biol 35 (2014b): 7669-7673
Zhang, X. etal., Int.JBiochem.CellBiol 44 (2012): 1166-1173
Zhao, J. G. et al., FEBS Lett. 588 (2014): 4536-4542
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ
<120> Новые пептиды, комбинация пептидов в качестве мишеней и средств для
применения в иммунотерапии рака желчного пузыря и холангиокарциномы и других видов рака
<130> I32967WO
<150> GB 1609193.6 <151> 2016-05-25
<150> US 62/341,367
<151> 2016-05-25 <160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 9 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Ala Ala Glu Ile Ala Ser Ala Leu 1 5
<210> 2
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ala Tyr Pro Glu Ile Val Ala Val
<210> 3
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Met Asp Ser Thr Val Ile Thr Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Phe Leu Leu Glu Ala Gln Asn Tyr Leu 1 5
<210> 5
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Leu Ile Asp Glu Val Met Val Leu Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 6
Leu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Pro Leu Ser Pro Ser
1 5 10
<210> <211>
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 7
Leu Leu Leu Ser Asp Pro Asp Lys Val Thr Ile
1 5 10
<210> <211>
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens <400> 8
Leu Ser Ala Ser Leu Val Arg Ile Leu 1 5
<210> <211>
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 9
Arg Leu Ala Lys Leu Thr Ala Ala Val 1 5
<210> 10
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ser Ala Phe Pro Phe Pro Val Thr Val Ser Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ser Ile Ile Asp Phe Thr Val Thr Met 1 5
<210> <211>
12 10
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 12
Thr Ile Leu Pro Gly Asn Leu Gln Ser Trp
1 5 10
<210> <211>
13 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 13
Val Leu Pro Arg Ala Phe Thr Tyr Val 1 5
<210> 14
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 14
Tyr Gly Ile Glu Phe Val Val Gly Val
<210> 15
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ser Val Ile Asp Ser Leu Pro Glu Ile 1 5
<210> 16
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ala Val Met Thr Asp Leu Pro Val Ile 1 5
<210> <211>
17 10
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 17
Val Leu Tyr Asp Asn Thr Gln Leu Gln Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ser Leu Ser Pro Asp Leu Ser Gln Val
<210> 19
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 19
Thr Ala Tyr Pro Gln Val Val Val Val
<210> <211>
20 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 20
Val Leu Gln Asp Glu Leu Pro Gln Leu 1 5
<210> <211>
21 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 21
Ile Ala Phe Pro Thr Ser Ile Ser Val 1 5
<210> 22
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ser Ala Phe Gly Phe Pro Val Ile Leu 1 5
<210> 23
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ser Leu Leu Ser Glu Leu Leu Gly Val
<210> <211>
24 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ile Ser Ala Pro Leu Val Lys Thr Leu 1 5
<210> <211>
25 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 25
Asn Leu Ser Glu Thr Ala Ser Thr Met Ala Leu
1 5 10
<210> <211>
26 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 26
Thr Ala Gln Thr Leu Val Arg Ile Leu 1 5
<210> 27
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 27
Ala Leu Ala Glu Gln Val Gln Lys Ala
1 5
<210> <211> <212> 28 9
БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 28
Tyr Ala Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu
<210> 29
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 29
Phe Ala Ser Glu Val Ser Asn Val Leu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 30
Phe Ala Ser Gly Leu Ile His Arg Val 1 5
<210> 31
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 31
Ile Ala Ile Pro Phe Leu Ile Lys Leu
<210> 32
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 32
Tyr Val Ile Ser Gln Val Phe Glu Ile
<210> <211>
33 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 33
Ile Leu Gly Thr Glu Asp Leu Ile Val Glu Val
1 5 10
<210> 34
<211> 9 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens <400> 34
Leu Leu Trp Gly Asn Leu Pro Glu Ile 1 5
<210> 35
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 35
Gly Leu Ile Asp Glu Val Met Val Leu
<210> 36
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ile Leu Val Asp Trp Leu Val Gln Val
<210> 37
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 37
Lys Ile Gln Glu Met Gln His Phe Leu
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 38
Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 39
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 40
Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 32 и вариант, последовательности которого по меньшей мере на 88% гомологичны последовательностям с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 32, и где указанный вариант связывается с молекулой(-ами) главного комплекса гистосовместимости МНС и/или индуцирует перекрестную реакцию Т-клеток с указанным вариантным пептидом; и его фармацевтически приемлемая соль, где указанный пептид не является полипептидом полной длины.
2. Пептид в соответствии с п. 1, где указанный пептид имеет способность связываться с молекулой МНС I или II класса, и где указанный пептид, когда он связан с указанной молекулой МНС, в состоянии распознаваться Т-клетками CD4 и/или CD8.
3. Пептид или его вариант в соответствии с п. 1 или 2, где его аминокислотная последовательность включает непрерывный фрагмент аминокислот в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 32.
4. Пептид или его вариант в соответствии с любым из пп. 1-3, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину от 8 до 100, предпочтительно от 8 до 30, и более предпочтительно от 8 до 16 аминокислот, и, наиболее предпочтительно, где пептид состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из последовательностей с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 32.
5. Пептид или его вариант в соответствии с любым из пп. 1-4, где указанный пептид модифицирован и/или включает непептидные связи.
6. Пептид или его вариант в соответствии с любым из пп. 1-5, где указанный пептид является частью слитого белка, в частности, включающим N-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (li) HLA-DR.
7. Антитело, в частности растворимое или связанное с мембраной антитело, предпочтительно моноклональное антитело или его фрагмент, которое специфически распознает пептид или его вариант в соответствии с любым из пп. 15, предпочтительно пептид или его вариант в соответствии с любым из пп. 1-5, когда он связан с молекулой МНС.
8. Т-клеточный рецептор, предпочтительно растворимый или связанный с мембраной, или его фрагмент, который реагирует с HLA-лигандом, причем указанный лиганд является пептидом или его вариантом в соответствии с любым из пп. 1-5, предпочтительно пептидом или его вариантом в соответствии с любым из пп. 1-5, когда он связан с молекулой МНС.
9. Т-клеточный рецептор в соответствии с п. 8, где указанная аминокислотная последовательность лиганда по меньшей мере на 88% идентична любой из последовательностей с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 54, или где аминокислотная последовательность указанного лиганда состоит из любой из последовательностей с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 54.
10. Т-клеточный рецептор в соответствии с п. 8 или п. 9, где указанный Т-клеточный рецептор представлен в виде растворимой молекулы и, необязательно, обладает дополнительной эффекторной функцией, например, несет иммуностимулирующий домен или токсин.
11. Аптамер, который специфически распознает пептид или его вариант в
соответствии с любым из пп. 1-5, предпочтительно пептид или его вариант в
соответствии с любым из пп. 1-5, который связан с молекулой МНС.
12. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или его вариант в соответствии с любым из пп. 1-5, антитело или его фрагмент в соответствии с п. 7, Т-клеточный рецептор или его фрагмент в соответствии с п. 8 или п. 9, необязательно связанная с гетерологичной последовательностью промотора, или вектор экспрессии, экспрессирующий указанную нуклеиновую кислоту.
13. Рекомбинантная клетка-хозяин, включающая пептид в соответствии с любым из пп. 1-6, антитело или его фрагмент в соответствии с п. 7, Т-клеточный рецептор или его фрагмент в соответствии с п. 8 или п. 9 или нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с п. 12, где указанная клетка-хозяин предпочтительно является антигенпрезентирующей клеткой, такой как дендритная клетка, Т-клетка или NK-клетка.
14. Способ получения активированных Т-лимфоцитов in vitro, где способ включает контактирование Т-клеток in vitro с нагруженными антигеном молекулами МНС человека I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, на период времени, достаточного для активации указанных Т-клеток антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с любым из пп. 1-4.
15. Активированный Т-лимфоцит, полученный с помощью способа в соответствии сп. 14, который селективно распознает клетку, которая презентирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп. 1-4.
16. Фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из пептида в соответствии с любым из пп. 1-6, антитела или его фрагмента в соответствии с п. 7, Т-клеточного рецептора или его фрагмента в соответствии с п. 8 или п. 9, аптамера в соответствии с п. 11, нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии в соответствии сп. 12, клетки-хозяина в соответствии с п. 13 или активированного Т-лимфоцита в
12.
соответствии с п. 15 или конъюгированного или меченного активного ингредиента и фармацевтически приемлемого носителя, и необязательно фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и/или стабилизаторов.
17. Способ получения пептида или его варианта в соответствии с любым из пп. 16, антитела или его фрагмента в соответствии с п. 7 или Т-клеточного рецептора или его фрагмента в соответствии с п. 8 или п. 9, причем способ включает культивацию клетки-хозяина в соответствии с п. 13 и выделение пептида или его варианта, антитела или его фрагмента или Т-клеточного рецептора или его фрагмента из указанной клетки-хозяина и/или ее культуральной среды.
18. Пептид в соответствии с любым из пп. 1-6, антитело или его фрагмент в соответствии с п. 7, Т-клеточный рецептор или его фрагмент в соответствии с п. 8 или п. 9, аптамер в соответствии с п. 11, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии в соответствии с п. 12, клетка-хозяин в соответствии с п. 13 или активированный Т-лимфоцит в соответствии с п. 15 для применения в медицине.
19. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени
презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,
данную в любом из пп. 1-4, где способ включает введение пациенту эффективного
числа активированных Т-клеток, как определено в п. 15.
20. Пептид в соответствии с любым из пп. 1-6, антитело или его фрагмент в соответствии с п. 7, Т-клеточный рецептор или его фрагмент в соответствии с п. 8 или п. 9, аптамер в соответствии с п. 11, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии в соответствии с п. 12, клетка-хозяин в соответствии с п. 13 или активированный Т-лимфоцит в соответствии с п. 15 для применения в диагностике и/или лечении рака или для применения в производстве медикамента против рака.
21. Применение в соответствии с п. 20, где указанное раковое заболевание выбрано из группы: рак желчного пузыря и холангиокарцинома, острый
20.
миелоидный лейкоз, меланома, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, неходжкинская лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз, рак поджелудочной железы, рак печени, рак яичника, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы и рак почки и других опухолей, которые демонстрируют избыточную экспрессию белка, из которого получен пептид с последовательностью с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 32.
22. Комплект, включающий:
а) контейнер, включающий фармацевтическую композицию, содержащую
пептид(ы) или вариант в соответствии с любым из пп. 1-6, антитело или его
фрагмент в соответствии с п. 7, Т-клеточный рецептор или его фрагмент в
соответствии с п. 8 или п. 9, аптамер в соответствии с п. 11, нуклеиновую кислоту
или вектор экспрессии в соответствии с п. 12, клетку-хозяина в соответствии с п. 13
или активированный Т-лимфоцит в соответствии с п. 15 в виде раствора или в
лиофилизированной форме;
б) необязательно - второй контейнер, содержащий разбавитель или
восстанавливающий раствор для лиофилизированной лекарственной формы;
в) необязательно - по меньшей мере еще один пептид, выбранный из группы,
состоящей из пептидов в соответствии с SEQ ID No. 1 по SEQ ID No. 38, и
г) необязательно - инструкции по (i) применению раствора или (и) восстановлению
и/или по применению лиофилизированной лекарственной формы.
23. Комплект в соответствии с п. 22, дополнительно включающий один или более (iii) буферов, (iv) разбавителей, (v) фильтров, (vi) игл или (v) шприцев.
24. Способ получения персонализированной противораковой вакцины или
медикаментозной и/или клеточной терапии для отдельного пациента, где
указанный способ включает:
а) идентификацию опухолеассоциированных пептидов (TUMAP), презентируемых опухолевым образцом указанного отдельного пациента;
б) сравнение пептидов, идентифицированных на этапе а), с хранилищем пептидов,
которые предварительно прошли скрининг на иммуногенность и/или избыточную
презентацию в опухолях по сравнению с нормальными тканями;
в) выбор по меньшей мере одного пептида из хранилища, который соответствует
пептиду TUMAP, идентифицированному у пациента; и
г) производство и/или приготовление лекарственной формы персонализированной
вакцины или препарата для медикаментозной или клеточной терапии на основании
этапа в).
25. Способ в соответствии с п. 24, где указанные пептиды TUMAP идентифицируют с помощью:
сравнения данных по экспрессии в опухолевом образце с данными образца нормальной ткани, соответствующей типу ткани опухолевого образца, для идентификации белков, которые в опухолевом образце экспрессируются в избытке или аберрантно; и
а2) установление корреляции между данными экспрессии и последовательностями лигандов МНС, связанных с молекулами МНС I и/или II класса в опухолевом образце, в целях идентификации лигандов МНС, которые получены из белков, избыточно или аберрантно экспрессируемых опухолью.
26. Способ в соответствии с п. 24 или п. 25, где последовательности лигандов МНС идентифицируют с помощью элюирования связанных пептидов из молекул МНС, выделенных из опухолевого образца, и секвенирования элюированных лигандов.
27. Способ в соответствии с любым из пп. 24-26, где нормальную ткань, соответствующую типу ткани опухолевого образца, получают у одного и того же пациента.
28. Способ в соответствии с любым из пп. 24-27, где пептиды, включенные в хранилище, идентифицируют на основании следующих этапов:
27.
аа. Проведение анализа экспрессии информационной рибонуклеиновой кислоты
(мРНК) всего генома с помощью методов с высокой степенью параллелизма, таких
как выявление профилей экспрессии на основе микрочипов или секвенирования,
включающих идентификацию генов, которые в избытке экспрессируются в
злокачественной ткани по сравнению с нормальной тканью или тканями;
аб. Выбор пептидов, которые кодируются генами, экспрессируемыми селективно
или в избытке, как было обнаружено на этапе аа, и
ав. Определение индукции in vivo Т-клеточных ответов выбранными пептидами,
включая анализ иммуногенности in vitro при использовании человеческих Т-клеток
здоровых доноров или указанного пациента; или
ба. Идентификация HLA-лигандов из указанного опухолевого образца с помощью
масс-спектрометрии;
бб. Проведение анализа экспрессии информационной рибонуклеиновой кислоты
(мРНК) всего генома с помощью методов с высокой степенью параллелизма, таких
как выявление профилей экспрессии на основе микрочипов или секвенирования,
включающих идентификацию генов, которые в избытке экспрессируются в
злокачественной ткани по сравнению с нормальной тканью или тканями;
бв. Сравнение идентифицированных HLA-лигандов с данными экспрессии
указанных генов;
бг. Выбор пептидов, которые кодируются генами, экспрессируемыми селективно
или в избытке, обнаруженными на этапе бв.;
бд. Повторное обнаружение отобранных пептидов TUMAP этапа бг. на опухолевой
ткани и нечастое обнаружение или их отсутствие на здоровых тканях и
подтверждение релевантности избыточной экспрессии на уровне мРНК; и
бе. Определение индукции in vivo Т-клеточных ответов выбранными пептидами,
включая анализы иммуногенности in vitro при использовании человеческих Т-клеток
здоровых доноров или указанного пациента.
29. Способ в соответствии с любым из пп. 24-28, где иммуногенность пептидов, включенных в хранилище, определяют способом, включающим анализ иммуногенности in vitro, контроль иммунного статуса пациента на наличие
связывания отдельных пептидов с молекулами HLA, окрашивание МНС-мультимеров, анализ методом ELISPOT и/или внутриклеточное окрашивание цитокинов.
30. Способ в соответствии с любым из пп. 24-29, где указанное хранилище включает множество пептидов, выбранных из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID No 1 по SEQ ID No 32.
31. Способ в соответствии с любым из пп. 24-30, дополнительно включающий идентификацию по меньшей мере одной мутации, являющейся уникальной для опухолевого образца по сравнению с нормальной соответствующей тканью отдельного пациента, и выбор пептида, который коррелирует с мутацией, для включения в вакцину или получения средств клеточной терапии.
32. Способ в соответствии с п. 31, где указанную по меньшей мере одну мутацию идентифицируют методом полногеномного секвенирования.
30.
Пептид: AVMTDLPVf (А*02)
Seq ID NO; 16
л I m о
о >
к s з-го н
ф to ф о. с
к го
ф н
о о
S Z S
391 нормальная ткань
6 жировых тканей, 8 надпочечных желез, 24 образца клеток крови, 17 кровеносных сосудов, 10 костных мозгов, 15 головных мозгов, 8 молочных желез, 4 хрящевые ткани, 7 пищеводов, 2 глаза, 16 сердец, 19 почек, 21 толстая кишка, 25 печеней, 49 легких, 8 лимфатических узлов, 13 нервов, 3 яичника, 11 поджелудочных желез, 6 паращитовидных желез, 1 брюшина, 6 гипофизов, 7 плацент, 1 плевра, 3 предстательные железы, 7 слюнных желез, 10 скелетных мышц, 12 образцов кожи, 6 тонких кишок, 12 селезенок, 5 желудков, 7 семенников, 2 вилочковые железы, 2 щитовидные железы, 14 трахей, 7 мочеточников, 8 мочевых пузырей, 6 маток, 3 желчных пузыря
образцов РЖП ХГК
Пептид: ISAPLVKTL (А*02)
Seq ID NO: 24
л I m о
> ; К
га r^i
8 I
с Ч
к (r)
га z л
ф н
о о
391 нормальная ткань
6 жировых тканей, 8 надпочечных желез, 24 образца клеток крови, 17 кровеносных сосудов, 10 костных мозгов, 15 головных мозгов, 8 молочных желез, 4 хрящевые ткани, 7 пищеводов, 2 глаза, 16 сердец, 19 почек, 21 толстая кишка, 25 печеней, 49 легких, 8 лимфатических узлов, 13 нервов, 3 яичника, 11 поджелудочных желез, 6 паращитовидных желез, 1 брюшина, 6 гипофизов, 7 плацент, 1 плевра, 3 предстательные железы, 7 слюнных желез, 10 скелетных мышц, 12 образцов кожи, 6 тонких кишок, 12 селезенок, 5 желудков, 7 семенников, 2 вилочковые железы, 2 щитовидные железы, 14 трахей, 7 мочеточников, 8 мочевых пузырей, 6 маток, 3 желчных пузыря
образцов РЖП ХГК
Пептид: NLSETASTMAL (А*02)
Seq ID NO: 25
ш л I ш о
К S
га r^i
8 I
с Ч
к (r)
га z л
ф н
о о
391 нормальная ткань
6 жировых тканей, 8 надпочечных желез, 24 образца клеток крови, 17 кровеносных сосудов, 10 костных мозгов, 15 головных мозгов, 8 молочных желез, 4 хрящевые ткани, 7 пищеводов, 2 глаза, 16 сердец, 19 почек, 21 толстая кишка, 25 печеней, 49 легких, 8 лимфатических узлов, 13 нервов, 3 яичника, 11 поджелудочных желез, 6 паращитовидных желез, 1 брюшина, 6 гипофизов, 7 плацент, 1 плевра, 3 предстательные железы, 7 слюнных желез, 10 скелетных мышц, 12 образцов кожи, 6 тонких кишок, 12 селезенок, 5 желудков, 7 семенников, 2 вилочковые железы, 2 щитовидные железы, 14 трахей, 7 мочеточников, 8 мочевых пузырей, 6 маток, 3 желчных пузыря
образцов РЖП ХГК
Пептид: VLQ DELPHI (А~02) SEQ ID NO: 20
Пептид, выявленный на
12 нормальных тканях (1 пищевод, 2 печени, 3 легких, 1 прямая кишка, 1 кожа, 1 тонкая кишка, 1 селезенка, 2 трахеи), 45 раковых тканях (3 рака желчных протоков, 1 рак молочной железы, 1 рак пищевода, 4 рака желчного пузыря, 5 раков головы и шеи, 3 рака почки, 4 лейкоцитарных лейкоза, 2 рака печени, 9 раков легких, 2 рака лимфатических узлов, 1 рак миелоидных клеток, 2 рака яичника, 3 рака поджелудочной железы, 4 рака предстательной железы, 1 рак мочевого пузыря) (слева направо)
Пептид: VLYDNTQLQL (А"02)
SEQ ID NO: 17
3 x
о с u > J
к s =r
re r^i
8 I & I
re x л с ф
s u о
Высокий ' риск
Средний риск
Презентация пептида 4 HV > : i
Низкий риск
Рак
1*Е
с; ш
ail
* О ,s
s u о
^ Я 5 си -о си
=Г I S
и с ^
ГО I
S °
§¦ ^
с 5 -0
3" ос
Q. X
О (tm) CD ? си
_: ос го
с О) 2С
х з 5
? (tm) с
си го
v; СО
* О
: ^ Э? ?= ^ 2=' с
Q.1- iCS1^ О. С ^
о со т
- t
Пептид: TAOTLVRIL (Ая02)
SEQ ID NO: 26
Средний риск
Высокий риск
л х со о
га r^i
" I Ф 5
о. s
с Ч К в
га х
ф н
о о
Презентация пептида Itf 2 ¦ 001
Низкий риск
Рак
. т
с; со к л со
100"
О. и S * О ,^
си .о
i си
=Г I
с[ си
Q- 7.
О. СО С 01
I т
го s
I о
ГО СО
Q. X
5 I
CO ^
¦J го СП го го го
t i s а. =г ?
(tm) I ° о- 9 1 га о.
3- s -е- со з §
з э о си = 5?
3 о
S со
X 2
т о
х i
u a
СГ О)
О) <->
с ^ Э? с
355
Q. Q. Q. ^
Пептид: FASEVSNVL {А* 02)
SEC) ID NO: 29
Высокий Средний риск ' риск
Презентация пептида > w с
Низкий риск Рак
Ф л I ш о
га н
ф to ф о. с
к га
ф н
о о
X л
S Z S
с; ш
- as all
* О JS
s u о ? со 1
I- S ш
ш Я о too* 5 §" §
_1 I ^
и Е 4
i s
ГО I
F- 5
S °
1 ?
S с
о. си
. 3"
I о 0J
О (tm) со > си
П о.
о> го
v; СО * О
=1 > Я d
lJ га сп
s i s
| s -в-
(tm) 1 °
о- 9 1
ГО Q. ?
1= ю
то то ГС О. ZT ?
S i §
О) и
X О
х ct
О) > .
О) с!)
0> и
X го
о ¦
I- I
си з-
3- О
2 ^
сс го
8 §
^ X ?Е ^ of х ^ с s ? с
? X ш * X о_ 1-
3 ^ S ^ SF
Н ш X Q. Q.
^ 5 I
F эе эе *
О. С С Q.
^ С 2 ^ ^ CL
о со т
'.1 о с о
- ( -т
-• - о
Ген: CYP2W1 (Пептид: GLIDEVMVLL, SEQ ID N0: 5)
о о ф о. с
Образцы нормальных тканей (каждый образец представляет собой совокупность образцов нескольких доноров):
6 артерий, 2 образца клеток крови, 5 головных мозгов, 3 сердца, 3 печени, 3 легких, 2 вены, 1 жировая ткань, 1 надпочечная железа, 1 желчный проток, 5 костных мозгов, 1 хрящевая ткань, 1 толстая кишка, 1 пищевод, 2 глаза, 2 желчных пузыря, 2 слюнные железы, 1 почка, 6 лимфатических узлов, 4 поджелудочные железы, 1 паращитовидная железа, 2 периферических нерва, 2 брюшины, 2 гипофиза, 2 плевры, 1 прямая кишка, 2 скелетные мышцы, 1 кожа, 1 тонкая кишка, 1 селезенка, 1 желудок, 1 щитовидная железа, 7 трахей, 2 мочеточника, 1 мочевой пузырь, 1 молочная железа, 5 яичников, 5 плацент, 1 предстательная железа, 1 семенник, 1 вилочковая железа, 1 матка (слева направо)
образцов РЖП ХГК
Ген: PKHD1 (Пептид: VLPRAFTYV, SEQ, ID N0: 13)
Образцы нормальных тканей (каждый образец представляет собой совокупность образцов нескольких доноров):
6 артерий, 2 образца клеток крови, 5 головных мозгов, 3 сердца, 3 печени, 3 легких, 2 вены, 1 жировая ткань, 1 надпочечная железа, 1 желчный проток, 5 костных мозгов, 1 хрящевая ткань, 1 толстая кишка, 1 пищевод, 2 глаза, 2 желчных пузыря, 2 слюнные железы, 1 почка, 6 лимфатических узлов, 4 поджелудочные железы, 1 паращитовидная железа, 2 периферических нерва, 2 брюшины, 2 гипофиза, 2 плевры, 1 прямая кишка, 2 скелетные мышцы, 1 кожа, 1 тонкая кишка, 1 селезенка, 1 желудок, 1 щитовидная железа, 7 трахей, 2 мочеточника, 1 мочевой пузырь, 1 молочная железа, 5 яичников, 5 плацент, 1 предстательная железа, 1 семенник, 1 вилочковая железа, 1 матка (слева направо)
Ген: SUCNR1 Пептид: YGIEFVVGV, SEQ ID NO: 14)
Образцы нормальных тканей (каждый образец представляет собой совокупность образцов нескольких доноров):
6 артерий, 2 образца клеток крови, 5 головных мозгов, 3 сердца, 3 печени, 3 легких, 2 вены, 1 жировая ткань, 1 надпочечная железа, 1 желчный проток, 5 костных мозгов, 1 хрящевая ткань, 1 толстая кишка, 1 пищевод, 2 глаза, 2 желчных пузыря, 2 слюнные железы, 1 почка, 6 лимфатических узлов, 4 поджелудочные железы, 1 паращитовидная железа, 2 периферических нерва, 2 брюшины, 2 гипофиза, 2 плевры, 1 прямая кишка, 2 скелетные мышцы, 1 кожа, 1 тонкая кишка, 1 селезенка, 1 желудок, 1 щитовидная железа, 7 трахей, 2 мочеточника, 1 мочевой пузырь, 1 молочная железа, 5 яичников, 5 плацент, 1 предстательная железа, 1 семенник, 1 вилочковая железа, 1 матка (слева направо)
эа 3
Стимуляция
АРС А'02"$ЕО 1С No: 37
Стимуляция Стимуляция
-lA-A'IO SEC ID КС 3S HLA-A/02 отриц. контроль
1.81cv
0.08%
А Стимуляция
о HLA-A'C2 Seq О No !3
--~"СЗ.01%3
О 4
ю <
Стимуляция
HLA-A'Ci'Seq D No 1
4.19%
Стимуляция
HL^ -Д <~2 отриц. контроль
Q.0G9I
?Е ' А'С2 Seq ID No 'ъ
Стимуляция
¦^LA-A402;Sea 1С No 25
(19)
(19)
(19)
-4-
-3 -
-7 -
-7 -
-8-
-8-
-11 -
- 10 -
- 13 -
- 13 -
- 15 -
-16 -
- 18 -
- 18 -
-20 -
-20 -
-29 -
-30-
-32 -
-32 -
-33-
-33-
-37 -
-36-
-39-
-39-
-40 -
-40 -
-50-
-50-
-51
-51
-52 -
-52 -
-53-
-53-
-57 -
-56-
-59-
-59-
-60 -
-60 -
-69 -
-70-
-72 -
-72 -
-73-
-73-
-77 -
-76-
-79-
-79-
-81 -
-81 -
-83-
-83-
-87 -
-86-
-89-
-89-
-91 -
-91 -
-93-
-93-
-97 -
-96-
-99-
-99-
-101 -
-101 -
-103-
-103-
-107 -
-106-
-109-
-109-
-111 -
-111 -
-113-
-113-
-117 -
-116-
-119-
-119-
-121 -
-121 -
-123-
-123-
-127 -
-126-
-132 -
-132 -
-133-
-133-
-137 -
-136-
-137 -
-136-
-137 -
-138-
-139-
-139-
-141 -
-141 -
-142 -
-142 -
-143-
-143-
-144-
-144-
-147 -
-146-
-149-
-149-
-151 -
-151 -
1/13
Фигура 1А
1/13
Фигура 1А
2/13
Фигура IB
2/13
Фигура IB
3/13
Фигура 1С
3/13
Фигура 1С
4/13
Фигура ID
4/13
Фигура ID
5/13
Фигура IE
5/13
Фигура IE
5/13
Фигура IE
5/13
Фигура IE
6/13
Фигура IF
6/13
Фигура IF
6/13
Фигура IF
6/13
Фигура IF
7/13
Фигура 1G
7/13
Фигура 1G
7/13
Фигура 1G
7/13
Фигура 1G
7/13
Фигура 1G
7/13
Фигура 1G
8/13
Фигура 2А
8/13
Фигура 2А
8/13
Фигура 2А
8/13
Фигура 2А
9/13
Фигура 2В
9/13
Фигура 2В
10/13
Фигура 2С
10/13
Фигура 2С
11/13
Стимуляция ?? Н1А-А'С2 отриц. контроль
11/13
Стимуляция ?? Н1А-А'С2 отриц. контроль
11/13
Стимуляция ?? Н1А-А'С2 отриц. контроль
11/13
Стимуляция ?? Н1А-А'С2 отриц. контроль
12/13
Фигура 4
Стимуляция
HLA-A"C2 отриц. контроль
12/13
Фигура 4
Стимуляция
HLA-A"C2 отриц. контроль
12/13
Фигура 4
Стимуляция
HLA-A"C2 отриц. контроль
12/13
Фигура 4
Стимуляция
HLA-A"C2 отриц. контроль
13/13
Фигура 4 (продолж.)
Стимуляция
-LA-A'02/отриц. контроль
13/13
Фигура 4 (продолж.)
Стимуляция
-LA-A'02/отриц. контроль
13/13
Фигура 4 (продолж.)
Стимуляция
-LA-A'02/отриц. контроль
13/13
Фигура 4 (продолж.)
Стимуляция
-LA-A'02/отриц. контроль