[RU]

Изобретение относится к стабильным жидким композициям нейротоксинов, не содержащим животных белков, но содержащим поверхностно-активное вещество, аминокислоту, выбранную из триптофана и тирозина, буфер, включающий ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, при этом композиции имеют величину pH от 5,5 до 8 и стабильны в течение 2 месяцев. Такие композиции подходят для применения в терапии и, в частности, для введения пациенту для достижения требуемого терапевтического или эстетического эффекта. Изобретение также относится к применению аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, для защиты белкового нейротоксина от разрушения в жидкой композиции, не содержащей белков животного происхождения.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к стабильным жидким композициям нейротоксинов, не содержащим животных белков, но содержащим поверхностно-активное вещество, аминокислоту, выбранную из триптофана и тирозина, буфер, включающий ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, при этом композиции имеют величину pH от 5,5 до 8 и стабильны в течение 2 месяцев. Такие композиции подходят для применения в терапии и, в частности, для введения пациенту для достижения требуемого терапевтического или эстетического эффекта. Изобретение также относится к применению аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, для защиты белкового нейротоксина от разрушения в жидкой композиции, не содержащей белков животного происхождения.

---

Евразийское (21) 201892493 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.26
(51) Int. Cl.
A61K38/48 (2006.01) A61K 47/02 (2006.01) A61K 47/26 (2006.01) A61K31/405 (2006.01) A61K31/506 (2006.01) A61K 47/18 (2017.01)
(54) ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НЕЙРОТОКСИНА, СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ ТРИПТОФАНОМ ИЛИ ТИРОЗИНОМ
(31) PCT/EP2016/062085
(32) 2016.05.27
(33) EP
(86) PCT/EP2017/062785
(87) WO 2017/203038 2017.11.30
(71) Заявитель:
ИПСЕН БИОФАРМ ЛИМИТЕД (GB); НЕСТЛЕ СКИН ХЕЛС СА (CH)
(72) Изобретатель:
Ярстад Андерс, Фриис Анна, Шталь Ульф, Гурелль Анн, Агрен Барбро, Эдстром Эмилия, Пикетт Эндрю (SE)
(74) Представитель:
Хмара М.В., Осипов К.В., Липатова И.И., Новоселова С.В., Дощечкина В.В., Пантелеев А.С., Ильмер Е.Г. (RU)
(57) Изобретение относится к стабильным жидким композициям нейротоксинов, не содержащим животных белков, но содержащим поверхностно-активное вещество, аминокислоту, выбранную из триптофана и тирозина, буфер, включающий ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, при этом композиции имеют величину pH от 5,5 до 8 и стабильны в течение 2 месяцев. Такие композиции подходят для применения в терапии и, в частности, для введения пациенту для достижения требуемого терапевтического или эстетического эффекта. Изобретение также относится к применению аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, для защиты белкового нейротоксина от разрушения в жидкой композиции, не содержащей белков животного происхождения.
ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НЕЙРОТОКСИНА, СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ ТРИПТОФАНОМ ИЛИ ТИРОЗИНОМ
Область техники
Настоящее изобретение относится к жидким композициям нейротоксинов, 5 не содержащим животных белков. В частности, настоящее изобретение относится к жидким композициям ботулинического нейротоксина, не содержащим животных белков, стабилизированным небелковыми вспомогательными веществами.
Композиции нейротоксинов, описанные в данном контексте, могут 10 применяться в терапии и, в частности, могут вводиться пациенту для достижения требуемого терапевтического или эстетического эффекта.
Предшествующий уровень техники
Клостридиальные нейротоксины, продуцируемые в природе штаммами клостридий, являются одними из самых токсичных биологических агентов, 15 известных на сегодняшний день, и в то же время представляют собой мощное средство для лечения целого ряда нервно-мышечных расстройств и эндокринных нарушений, включая дистонию мышц шеи, мышечную спастичность, блефароспазм, гипергидроз или сиалорею. Они также находят применение в эстетической медицине для разглаживания морщин.
20 Для применения в качестве фармацевтического продукта композиция
нейротоксина должна быть такой, чтобы ее можно было хранить без существенной потери активности нейротоксина.
Во всех разрешенных в настоящее время к применению композициях ботулинических нейротоксинов в качестве стабилизатора используют животный 25 (в том числе, человеческий) белок, как правило, человеческий сывороточный альбумин (англ. HSA - human serum albumin).
Однако присутствие в фармацевтических композициях животных белков, таких как HSA, является нежелательным из-за риска, пусть даже минимального, случайной передачи пациенту переносимых животными инфекционных агентов, 30 таких как прионы.
В данной области техники раскрыты не содержащие животных белков композиции ботулинического токсина. Например, в патентном документе
WO0158472 описаны лиофилизированные композиции, в которых для стабилизации ботулинического токсина используют полисахарид, такой как 2-гидроксиметилкрахмал. В патентном документе WO2005007185 описаны композиции, в которых для стабилизации ботулинического токсина используют 5 поверхностно-активное вещество и смесь по меньшей мере двух аминокислот, выбранных из Glu и Gin или Asp и Asn.
Однако большинство композиций предшествующего уровня техники нестабильны в жидкой форме и поэтому хранятся в лиофилизированной или сублимированной форме. Такие композиции перед введением пациенту
10 необходимо восстанавливать стерильным физиологическим раствором. Подобная стадия восстановления сопряжена с потерей времени врача, риском ошибки при разведении, а также с риском загрязнения во время процесса восстановления. Кроме того, поставщик ботулинического токсина должен обучить врачей, чтобы гарантировать, что стадия восстановления выполнена
15 надлежащим образом.
Вследствие этого жидкие композиции являются предпочтительными, поскольку они избавляют врача от потери времени, позволяют исключить риск ошибки при разведении, риск загрязнения и необходимость в обеспечении обучения поставщиком.
20 Жидкие композиции, не содержащие HSA, описаны, например, в
патентном документе WO2006005910, раскрывающем жидкие композиции ботулинического токсина, содержащие поверхностно-активное вещество, хлорид натрия и дисахарид. В патентном документе WO2009008595 раскрыты жидкие композиции ботулинического токсина, содержащие Полисорбат 20 и метионин.
25 Целью настоящего изобретения является обеспечение предпочтительных
жидких композиций ботулинического нейротоксина, не содержащих животных белков, пригодных для хранения и для применения в терапии. В частности, стабилизирующая композиция должна поддерживать стабильность продукта, не должна содержать животных белков, а также должна быть пригодной для
30 стабилизации нейротоксина, не содержащего комполексообразующих белков.
Краткое описание сущности изобретения
Первым аспектом настоящего изобретения является жидкая композиция, содержащая или по существу состоящая из белкового нейротоксина,
поверхностно-активного вещества, аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, буфера, включающего ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, имеющая величину рН в диапазоне от 5,5 до 8, стабильная в течение продолжительного времени и не содержащая белков животного происхождения.
5 Другим аспектом является применение жидких композиций в соответствии
с изобретением в терапии и/или в косметических средствах.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является использование аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, для защиты белкового нейротоксина от разрушения в жидкой композиции, не содержащей белков 10 животного происхождения.
Подробное описание изобретения
Первым аспектом настоящего изобретения является жидкая композиция, содержащая или по существу состоящая из белкового нейротоксина, поверхностно-активного вещества, аминокислоты, выбранной из триптофана и 15 тирозина, буфера, включающего ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, имеющая величину рН в диапазоне от 5,5 до 8, стабильная в течение продолжительного времени и не содержащая белков животного происхождения.
Выражение "не содержащая животных белков" следует понимать как не содержащая белка животного, в том числе человеческого, происхождения.
20 Нейротоксин представляет собой вещество, воздействующее на нервную
клетку и поражающее неврологическую функцию. К белковым нейротоксинам относятся ботулинические токсины (BoNT) и столбнячный токсин (TeNT). Предпочтительно белковый нейротоксин является ботулиническим нейротоксином.
25 Ботулинические нейротоксины представляют собой металлопротеазы с
молекулярной массой 150 кДа, состоящие в их активной форме из легкой цепи (L) с молекулярной массой 50 кДа и тяжелой цепи (Н) с молекулярной массой 100 кДа, связанных дисульфидным мостиком. L цепь представляет собой цинк-протеазу, которая внутриклеточно расщепляет один из белков SNARE (англ.
30 soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor - растворимый, чувствительный к N-этилмалеиду рецептор стыковочных белков), участвующих в опосредованном везикулами выделении нейротрансмиттеров, тем самым нарушая опосредуемые нейротрансмиттерами механизмы. Тяжелая цепь
объединяет в себе два домена: N-концевой домен транслокации (HN) с молекулярной массой 50 кДа и С-концевой рецептор-связывающий домен (Нс) с молекулярной массой 50 кДа. Нс домен ботулинического нейротоксина содержит две различимые структурные единицы, называемые НСс и HCN доменами. 5 Считается, что аминокислотные остатки, занятые в связывании с рецептором, расположены главным образом в НСс домене.
Ботулинические нейротоксины классифицируют по 7 антигенно различимым серотипам (от А до G). Примеры аминокислотных последовательностей для каждого серотипа обозначены в данном контексте как 10 SEQ ID NO с 1 по 7.
Различные домены для каждой из последовательностей могут быть, например, следующими.
Серотип
L цепь
HN домен
HON домен
Нес домен
BoNT/A (SEQ ID NO 1)
1-448
449-871
872-1110
1111-1296
BoNT/B (SEQ ID N0 2)
1-440
441-858
859-1097
1098-1291
BoNT/C (SEQ ID NO 3)
1-441
442-866
867-1111
1112-1291
BoNT/D (SEQ ID N0 4)
1-445
446-862
863-1098
1099-1276
BoNT/E (SEQ ID NO 5)
1-422
423-845
846-1085
1086-1252
BoNT/F (SEQ ID N0 6)
1-439
440-864
865-1105
1106-1274
BoNT/G (SEQ ID N0 7)
1-441
442-863
864-1105
1106-1297
Специалистам будет понятно, что могут быть некоторые изменения в каждом из доменов ботулинического нейротоксина.
15 BoNT воздействуют, например, на нервно-мышечный синапс, подавляя
высвобождение ацетилхолина и, тем самым, препятствуя мышечному сокращению. Интоксикация нервных окончаний является обратимой и ее продолжительность варьируется для различных серотипов BoNT.
В природе BoNT продуцируется бактериями Clostridium botulinum и 20 другими видами клостридий, такими как С. butyricum, С. baratii и С. argentinense, в составе мультибелковых комплексов, защищающих нейротоксин от
протеолитического расщепления. Под "ботулиническим нейротоксином в форме комплекса" подразумевается ботулинический нейротоксин и один или более из белков, по своей природе являющихся частью таких мультибелковых комплексов (нейротоксин-ассоциированные белки или "NAP"). NAP состоят из нетоксических 5 негемагглютинина (NTNH) и гемагглютининов (НА-17, НА-33 и НА-70). Под "ботулиническим нейротоксином высокой степени чистоты" подразумевается ботулинический нейротоксин, по существу не содержащий NAP.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, ботулинический нейротоксин является ботулиническим нейротоксином в форме 10 комплекса. Согласно другому варианту осуществления, ботулинический нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин высокой степени чистоты.
Способ получения BoNT посредством культивирования природных клостридиальных штаммов и очистки их в форме комплекса либо в особо чистой 15 форме описаны, например, в работе Pickett, Andy "Botulinum toxin as a clinical product: manufacture and pharmacology (Ботулинический токсин как клинический продукт: получение и фармакологические характеристики)", Clinical Applications of Botulinum Neurotoxin (Клинические применения ботулинического нейротоксина). Springer New York, 2014, 7-49.
20 Особо чистый или по существу чистый ботулинический нейротоксин может
быть получен из белкового комплекса, содержащего ботулинический токсин, например, с помощью способа, описанного в работе Current topics in Microbiology and Immunology (Актуальные темы в микробиологии и иммунологии)(1995), 195, р. 151-154.
25 В качестве альтернативы, ботулинический нейротоксин высокой степени
чистоты может быть получен путем рекомбинантной экспрессии гена BoNT на гетерологичном хозяине, таком как Е. coli, с последующей очисткой от него.
Предпочтительно белковый нейротоксин является ботулиническим нейротоксином. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, 30 ботулинический нейротоксин является ботулиническим нейротоксином в форме комплекса. Согласно другому варианту осуществления, ботулинический нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин высокой степени чистоты.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, ботулинический нейротоксин является ботулиническим нейротоксином, очищенным из его природного клостридиального штамма. Согласно другому варианту осуществления, ботулинический нейротоксин является ботулиническим 5 нейротоксином, получаемым рекомбинантно на гетерологичном хозяине, таком как Е. coli.
Согласно настоящему изобретению, ботулинический нейротоксин может быть BoNT серотипов А, В, С, D, Е, F или G.
Согласно настоящему изобретению, ботулинический нейротоксин может 10 быть модифицированным ботулиническим нейротоксином. Согласно настоящему изобретению, "модифицироанный BoNT" означает BoNT, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичность последовательности с SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. Предпочтительно модифицироанный BoNT имеет аминокислотную 15 последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. Предпочтительно модифицироанный BoNT представляет собой BoNT, чья аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 менее чем на 600, 400, 200, 150, 100, 50 или 20 аминокислотных 20 замен, делеций или вставок , например, на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотные замены, делеций или вставки.
Согласно настоящему изобретению, рекомбинантный ботулинический нейротоксин может быть химерным ботулиническим нейротоксином. Согласно настоящему изобретению, "химерный BoNT" состоит из L, HN, HCN И НСС доменов,
25 не принадлежащих к одному и тому же серотипу. Например, химерный BoNT может состоять из L цепи одного серотипа и полной Н цепи (HN, HCN И НСС домены) другого серотипа. Химерный BoNT может также состоять из L цепи и HN домена ("LHN") одного серотипа и Нс домена (HCN И НСС) другого серотипа. Химерный BoNT может также состоять из L цепи и HN и HCN доменов
30 ("расширенный LHN") одного серотипа и НСс домена другого серотипа.
В соответствии с изобретением, домен легкой цепи (L) может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичность последовательности с одной из следующих аминокислотных
последовательностей и сохраняющую способность расщеплять один из белков SNARE, участвующих в выделении опосредованного везикулой нейротрансмиттера:
• аминокислота 1-448 последовательности SEQ ID N0 1,
5 • аминокислота 1-440 последовательности SEQ ID N0 2,
• аминокислота 1-441 последовательности SEQ ID N0 3,
• аминокислота 1-445 последовательности SEQ ID N0 4,
• аминокислота 1-422 последовательности SEQ ID N0 5,
• аминокислота 1-439 последовательности SEQ ID N0 6, 10 • аминокислота 1-441 последовательности SEQ ID N0 7.
В соответствии с изобретением, HN домен может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичность последовательности с одной из следующих аминокислотных последовательностей и сохраняющую 15 способность транслокации:
• аминокислота 449-871 последовательности SEQ ID N0 1,
• аминокислота 441-858 последовательности SEQ ID NO 2,
• аминокислота 442-866 последовательности SEQ ID N0 3,
• аминокислота 446-862 последовательности SEQ ID N0 4,
20 • аминокислота 423-845 последовательности SEQ ID N0 5,
• аминокислота 440-864 последовательности SEQ ID N0 6,
• аминокислота 442-863 последовательности SEQ ID N0 7.
В соответствии с изобретением, Нс домен может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, предпочтительно, по 25 меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичность последовательности с одной из следующих аминокислотных последовательностей и сохраняющую способность связываться с нервно-мышечной клеткой:
• аминокислота 872-1296 последовательности SEQ ID N0 1,
• аминокислота 859-1291 последовательности SEQ ID N0 2,
30 • аминокислота 867-1291 последовательности SEQ ID NO 3,
• аминокислота 863-1276 последовательности SEQ ID NO 4,
• аминокислота 846-1252 последовательности SEQ ID NO 5,
• аминокислота 865-1274 последовательности SEQ ID NO 6,
• аминокислота 864-1297 последовательности SEQ ID NO 7.
В соответствии с изобретением, НСс домен может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичность последовательности с 5 одной из следующих аминокислотных последовательностей и сохраняющую способность связываться с нервно-мышечной клеткой:
• аминокислота 1111-1296 последовательности SEQ ID NO 1,
• аминокислота 1098-1291 последовательности SEQ ID NO 2,
• аминокислота 1112-1291 последовательности SEQ ID NO 3,
10 • аминокислота 1099-1276 последовательности SEQ ID NO 4,
• аминокислота 1086-1252 последовательности SEQ ID NO 5,
• аминокислота 1106-1274 последовательности SEQ ID NO 6,
• аминокислота 1106-1297 последовательности SEQ ID NO 7.
Указанные выше эталонные последовательности следует рассматривать 15 как направляющие, поскольку в зависимости от подсеротипов могут иметь место незначительные изменения.
"Процент идентичности последовательностей" между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислотными последовательностями является функцией числа идентичных нуклеотидов /
20 аминокислот в идентичных положениях для выравненных последовательностей. Таким образом, % идентичности можно рассчитать как число идентичных нуклеотидов / аминокислот в каждом положении при выравнивании, поделенное на общее число нуклеотидов / аминокислот в выравненной последовательности, и умноженное на 100. При вычислении % идентичности последовательностей
25 могут также учитываться число гэпов и длина каждого гэпа, вводимого для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями может быть выполнено с использованием конкретных математических алгоритмов, таких как BLAST, хорошо знакомых
30 специалистам.
Поверхностно-активные вещества (или поверхностно-активные агенты) представляют собой соединения, способные снижать поверхностное натяжение между жидкостью и твердым веществом или между двумя жидкостями.
Поверхностно-активные вещества могут быть неионными, анионными, катионными или амфотерными. В композициях в соответствии с изобретением поверхностно-активное вещество предпочтительно является неионным поверхностно-активным веществом. Неионные поверхностно-активные вещества 5 включают простые алкиловые эфиры полиоксиэтилена, такие как простой монододециловый эфир октаэтиленгликоля или простой монододециловый эфир пентаэтиленгликоля; простые алкиловые эфиры полиоксипропиленгликоля; простые алкиловые эфиры глюкозидов, такие как децилглюкозид, лаурилглюкозид или октилглюкозид; простые октилфеноловые эфиры
10 полиоксиэтиленгликоля, такие как Triton Х-100; простые алкилфеноловые эфиры полиоксиэтиленгликоля, такие как Nonoxynol-9; сложные алкиловые эфиры глицерина, такие как глицериллаурат; сложные алкиловые эфиры полиоксиэтиленгликольсорбитана, такие как полисорбаты; сложные алкиловые эфиры сорбитана, такие как Spans; кокамид МЭА, кокамид ДЭА;
15 додецилдиметиламиноксид; блоксополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, такие как полоксамеры; полиэтоксилированный таловый амин (англ. РОЕА).
Согласно предпочтительному варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит неионное поверхностно-
20 активное вещество, представляющее собой полисорбат, предпочтительно Полисорбат 20 (PS20), Полисорбат 60 (PS60) или Полисорбат 80 (PS80). Наиболее предпочтительно неионное поверхностно-активное вещество представляет собой PS80. В случае, если поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат, его концентрация предпочтительно составляет
25 от 0,001% до 15 об.%, более предпочтительно от 0,005 до 2 об.%, более предпочтительно от 0,01 до 1% например, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 или 1 об.%. Согласно одному из вариантов осуществления, поверхностно-активное вещество представляет собой PS80 в концентрации от 0,05 до 0,2 об.%, например, приблизительно 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16,
30 0,17, 0,18, 0,19 или 0,20 об.%.
PS20 имеет плотность приблизительно 1,1 г/мл. PS60 имеет плотность приблизительно 1,044 г/мл. PS80 имеет плотность приблизительно от 1,06 до 1,09 г/мл.
Считается, что полисорбаты образуют мицеллы и предотвращают адсорбцию белков поверхностями и агрегацию белков. Не желая быть связанными теорией, можно предположить, что при разложении/окислении полисорбаты могут образовывать перекиси и кислоты, способные влиять на 5 стабильность белков. Поэтому считается предпочтительным, чтобы концентрация полисорбата в композиции продукта была как можно ниже. Таким образом, считается предпочтительным, чтобы концентрация полисорбата не более чем в 200 превышала его критическую мицеллярную концентрацию (англ. CMC), более предпочтительно она не должна превышать более чем в 100, 50, 10 20, 10 или 5 раз свою CMC.
Для PS20 (Mw 1227,5 г/моль) величина CMC составляет приблизительно 8х10"5 М при температуре 21 °С, то есть приблизительно 0,01 (мас./об.)%.
Для PS60 (Mw 1309 г/моль) величина CMC составляет приблизительно 21x10"6 М при температуре 21 °С, то есть приблизительно 0,003 (мас./об.)%.
15 Для PS80 (Mw 1310 г/моль) величина CMC составляет приблизительно
12x10"6 М при температуре 21 °С, то есть приблизительно 0,002 (мас./об.)%.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, концентрация полисорбата в 1-200 раз превышает его CMC при данной температуре, например, при температуре приблизительно 21 °С, предпочтительно в 2-100 раз 20 превышает его CMC, например, приблизительно в 20 или 50 раз превышает его CMC.
Жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит аминокислоту, являющуюся триптофаном или тирозином. Не желая быть связанными теорией, можно предположить, что триптофан или тирозин могут
25 предотвращать окисление активного белка, делающее его нефункциональным. В действительности, считается, что аминокислота, добавленная в молярном избытке по отношению к нейротоксину, будет окисляться в первую очередь, сохраняя нейротоксин. Можно также предположить, что триптофан или тирозин могут нейтрализовать реакционноспособные продукты разложения поверхностно-
30 активных веществ, таких как полисорбаты.
Предпочтительно аминокислота является триптофаном. Более предпочтительно аминокислота является L-триптофаном.
Концентрация аминокислоты предпочтительно составляет приблизительно от 0,1 до 5 мг/мл, более предпочтительно от 0,1 до 5 мг/мл, от 0,25 до 3 мг/мл, например, приблизительно 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 или 3 мг/мл.
Композиция в соответствии с изобретением содержит буфер, включающий 5 ионы натрия, хлорид- и фосфат-ионы. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что буферы, не содержащие ионов натрия, хлорид- и фосфат-ионов, снижали стабильность токсина. Предпочтительно буфер также содержит ионы калия.
Буфер может быть получен, например, объединением солей хлорида 10 натрия, хлорида калия и фосфата натрия. Концентрация хлорида натрия предпочтительно составляет от 10 до 500 мМ, предпочтительно приблизительно от 25 до 300 мМ, например, приблизительно 25, 50, 75, 100, 140, 150, 200, 250 или 300 мМ.
Концентрация фосфата натрия предпочтительно составляет от 1 до 100 15 мМ, предпочтительно от 2 до 50 мМ, например, приблизительно 2, 5, 10, 20, 30, 40 или 50 мМ.
Концентрация хлорида калия предпочтительно составляет от 1 до 50 мМ, предпочтительно от 1 до 10 мМ, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 10 мМ.
20 Композиция в соответствии с изобретением имеет величину рН в
диапазоне от 5,5 до 8. Согласно предпочтительному варианту осуществления, величина рН лежит в диапазоне от 6,0 до 7,5, например, составляет приблизительно 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45 или 7,5. Предпочтительно
25 величина рН отличается не более, чем на одну единицу от физиологического значения рН (которое составляет приблизительно 7,4).
Композиция в соответствии с изобретением является жидкой. Композиция предпочтительно содержит водный разбавитель, более предпочтительно воду, например, стерильную воду, воду для инъекций, очищенную воду, стерильную 30 воду для инъекций.
Предпочтительно композиция является изотонической и подходит для инъекции пациенту, в частности, пациенту человеку.
Количество ботулинического нейротоксина обычно выражают в мышиных единицах LD50 (летальная доза для 50% животных), определяемых как средняя летальная доза при внутрибрюшинном введении мышам.
Мышиная единица LD50 (MLD50) для ботулинических токсинов не 5 является стандартизированной единицей. В действительности, анализы, используемые разными производителями зарегистрированных для продажи токсинов различаются, в частности, выбором буфера для разведения. Например, в тесте, применяемом для Dysport(r), используется желатин-фосфатный буфер, тогда как в анализе, применяемом для BOTOX(r), в качестве разбавителя
10 используется солевой раствор. Можно предположить, что желатиновые буферы защищают токсин при высоких разведениях, используемых при анализах LD50. Напротив, использование в качестве разбавителя солевого раствора, как полагают, приводит к некоторой потере эффективности. Этим можно объяснить, почему при тестировании с помощью анализа, применяемого для Dysport(r), одна
15 единица BOTOX(r) была эквивалентна приблизительно трем единицам Dysport (Straughan, D. W., 2006, AT LA 34(3), 305-313; Hambleton и Pickett, Hambleton, P. и A. M. Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87,11: 719).
Предпочтительно буфер для разведения, используемый для определения мышиной LD50, является желатин-фосфатным буфером. Например, мышиная
20 LD50 может быть определена, как описано в работе Hambleton, P. et al. Production, purification and toxoiding of Clostridium botulinum type A toxin (Образование, очистка и токсоидирование токсина Clostridium botulinum типа А). Eds. G. Е. Jr Lewis, P. S. Angel. Academic Press, Inc., New York, USA, 1981, p. 248. Вкратце, образцы ботулинического токсина серийно разводят в буфере,
25 содержащем 0,2% (мас./об.) желатина и 0,07М Na2HP04 при рН 6,5. Группам мышей (например, от 4 до 8 мышей в группе) весом приблизительно по 20 г вводят внутрибрюшинно образец разбавленного токсина (например, по 0,5 мл каждому животному). Группы разведения, например, 5 групп разведения, выбирают таким образом, чтобы они включали дозу 50% летального исхода. За
30 мышами наблюдают в течение 96 часов и оценивают 50% мышиную летальную дозу (MLD50).
Композиция в соответствии с изобретением предпочтительно содержит от 4 до 10000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл, более предпочтительно от 10 до 2000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1
мл, например, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или 1500 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл.
Количество ботулинического нейротоксина также может быть выражено в нг. Композиция в соответствии с изобретением предпочтительно содержит 5 приблизительно от 0,01 до 75 нг ботулинического нейротоксина на 1 мл, более предпочтительно приблизительно от 0,03 до 20 нг ботулинического нейротоксина на 1 мл, более предпочтительно приблизительно от 0,1 до 15 нг ботулинического нейротоксина на 1 мл, например, приблизительно 0,15, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нг ботулинического нейротоксина на 1 мл.
10 Композиция в соответствии с изобретением не содержит животных белков.
В частности, композиции в соответствии с изобретением не содержат альбумина и, в частности, не содержат человеческого сывороточного альбумина. Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением не содержит животных продуктов, что означает, что она не содержит компонентов животного
15 (в том числе человеческого) происхождения. Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением не содержит белка, отличного от белкового нейротоксина. Согласно другому варианту осуществления, композиция в соответствии с изобретением не содержит белка, отличного от белкового нейротоксина и одного или более NAP (нейротоксин-ассоциированных белков).
20 Во избежание недоразумений следует отметить, что аминокислоты не являются белками.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, композиция не содержит сахаридов, в том числе моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов.
25 Жидкая композиция в соответствии с изобретением стабильна в течение
продолжительного времени. Например, она стабильна в течение 2 месяцев при температуре от 2 до 8°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 3 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно предпочтительному варианту осуществления, она
30 стабильна в течение 6 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 12 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 18 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно
одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 24 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 36 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов 5 осуществления, она стабильна в течение 3 месяцев при комнатной температуре, например, при температуре 25°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 6 месяцев при комнатной температуре, например, при температуре 25°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 2 месяцев при температуре 37°С.
10 Жидкую композицию в соответствии с изобретением предпочтительно
хранят при температуре от 0° до 30°С. Согласно предпочтительному варианту осуществления, ее хранят при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно другому варианту осуществления, ее хранят при комнатной температуре. Предпочтительно композицию не замораживают.
15 Стабильность можно оценить посредством сравнения активности
ботулинического нейротоксина в течение некоторого времени. Активность ботулинического нейротоксина может относиться к способности активности ботулинического нейротоксина связываться с его рецептором-мишенью на клетке, транслоцировать легкую цепь в клетку и/или расщеплять его мишени -
20 белки SNARE.
Способы измерения активности ботулинического нейротоксина хорошо известны в данной области техники. Активность ботулинического нейротоксина может быть оценена, например, при помощи теста летальности мышей (LD50), как описано выше, с помощью анализа на основе мышечной ткани, такого как
25 мышиный гемидиафрагмальный тест (например, как описано в работе Bigalke, Н. and Rummel A., Toxins 7,12 (2015):4895-4905), с использованием клеточного анализа (например, как описано в работах WO201349508 или WO2012166943) или анализа внеклеточной протеолитической активности, такого как BoTest(r) (набор для обнаружения ботулинического нейротоксина, доступный из компании
30 BioSentinel Inc.).
Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более определенного процента активности в течение данного периода времени и при данной температуре.
Согласно одному из вариантов осуществления, композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 30% внеклеточной протеолитической активности в течение 3, 6, 12, 18, 24 или 36 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, потеря не более 30% 5 внеклеточной протеолитической активности в течение 6 месяцев при температуре 5°С. Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 20% внеклеточной протеолитической активности в течение 3 месяцев при температуре 5°С, более предпочтительно в течение 6, 12, 18, 24 или 36 месяцев при температуре 5°С.
10 Согласно другому варианту осуществления, композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 40% внеклеточной протеолитической активности в течение 3 месяцев при комнатной температуре, например, при температуре 25°С. Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не
15 более 30% внеклеточной протеолитической активности в течение 3 месяцев при температуре 25°С, более предпочтительно в течение 6 месяцев при температуре 25°С. Согласно другому варианту осуществления, композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 50% внеклеточной протеолитической активности в течение 2 месяцев при
20 температуре 37°С. Внеклеточная протеолитическая активность может быть измерена с помощью анализа BoTest(r).
Согласно одному из вариантов осуществления, композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 30% в единицах MLD50 в течение 2, 3, 6, 12, 18, 24 или 36 месяцев при температуре от
25 2 до 8°С, например, потеря не более 30% в единицах MLD50 в течение 6 месяцев при температуре 5°С. Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 20% в единицах MLD50 в течение 2 месяцев при температуре 5°С, более предпочтительно в течение 3, 6, 12, 18, 24 или 36 месяцев при температуре 5°С.
30 Согласно другому варианту осуществления, композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 40% в единицах MLD50 в течение 2 или 3 месяцев при комнатной температуре, например, при температуре 25°С. Предпочтительно композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 30% в
35 единицах MLD50 в течение 3 месяцев при температуре 25°С, более
предпочтительно в течение 6 месяцев при температуре 25°С. Согласно другому варианту осуществления, композиция в соответствии с изобретением считается стабильной, если имеет место потеря не более 50% в единицах MLD50 в течение 2 месяцев при температуре 37°С. Единицы MLD50 могут быть измерены, как 5 указано выше.
Жидкие композиции в соответствии с изобретением могут храниться в герметичных флаконах или шприцах, например, в стеклянных флаконах или шприцах, предпочтительно в стеклянных флаконах или шприцах типа 1 (или "нейтральных для организма (body neutral)"). Предпочтительно кислород во
10 флаконе или шприце отсутствует либо присутствует в очень небольшом количестве. Флаконы или шприцы могут заполняться, например, в атмосфере с содержанием кислорода менее 100 м.д. (миллионные доли), предпочтительно менее 50 м.д., при этом в качестве защитной среды во флаконах может применяться газообразный азот. При использовании стеклянных флаконов они
15 могут быть закрыты, например, пробками из хлорбутилового или бромбутилового каучука, в качестве которых могут применяться пробки с покрытием FluroTec(r). Предпочтительно жидкие композиции в соответствии с изобретением хранят в стеклянных флаконах, закрытых пробками с покрытием FluroTec(r).
Согласно одному из вариантов осуществления, жидкая композиция в 20 соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о от 4 до 10000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл,
о от 0,001 до 15 об.% полисорбата,
о от 0,1 до 5 мг/мл триптофана,
о от 10 до 500 мМ NaCI,
25 о от 1 до 50 мМ KCI,
о от 1 до 100 мМ фосфата натрия,
имеет величину рН от 5,5 до 8 и стабильна в течение 6 месяцев при температуре 5°С.
Согласно одному из вариантов осуществления, жидкая композиция в 30 соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о от 10 до 2000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл, о от 0,005 до 2 об.% полисорбата, о от 0,1 до 5 мг/мл триптофана,
о от 25 до 300 мМ NaCI,
о от 1 до 10 мМ KCI,
о от 2 до 50 мМ фосфата натрия,
имеет величину рН от 6,0 до 7,5 и стабильна в течение 12 месяцев при температуре 5°С.
Согласно одному из вариантов осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о от 10 до 2000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл,
о от 0,05 до 0,2 об.% полисорбата 80,
о от 0,1 до 5 мг/мл триптофана,
о от 25 до 300 мМ NaCI,
о от 1 до 10 мМ KCI,
о от 2 до 50 мМ фосфата натрия,
имеет величину рН от 6,0 до 7,5 и стабильна в течение 12 месяцев при температуре 5°С.
Согласно одному из вариантов осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина А,
о 0,2 об.% полисорбата 80,
о 1 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,6.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксинп А,
о 0,04 об.% полисорбата 80,
о 1 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,9.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина В,
5 о 0,25 об.% полисорбата 20,
о 4 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
10 где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 7,4.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина А,
о 0,01 об.% полисорбата 80,
15 о 0,25 мг/мл триптофана,
о 255 мМ NaCI, о 2 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 7,2.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в 20 соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина А,
о 0,01 об.% полисорбата 80,
о 0,25 мг/мл триптофана,
о 255 мМ NaCI,
25 о 10 мМ KCI,
о 50 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,3.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
30 о ботулинического нейротоксина А,
о 1 об.% полисорбата 80, о 0,25 мг/мл триптофана,
о 255 мМ NaCI,
о 50 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,3.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в 5 соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина А,
о 1 об.% полисорбата 80,
о 3 мг/мл триптофана,
о 255 мМ NaCI,
10 о 10 мМ KCI,
о 50 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 7,2.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
15 о ботулинического нейротоксина А,
о 0,1 об.% полисорбата 80,
о 1,625 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
20 о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,75.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина А,
25 о 0,01 об.% полисорбата 80,
о 1 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
30 где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,75.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина А,
о 0,1 об.% полисорбата 80,
о 1 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
5 о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,75.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
10 о ботулинического нейротоксина А,
о 1 об.% полисорбата 80,
о 1 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
15 о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 6,75.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина В,
20 о 15 об.% полисорбата 20,
о 1 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
25 где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 7,4.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
о ботулинического нейротоксина В,
о 15 об.% полисорбата 20,
30 о 4 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 7,4.
Согласно другому варианту осуществления, жидкая композиция в соответствии с изобретением содержит или по существу состоит из:
5 о ботулинического нейротоксина В,
о 0,25 об.% полисорбата 20,
о 4 мг/мл триптофана,
о 140 мМ NaCI,
о 3 мМ KCI,
10 о 10 мМ фосфата натрия,
где величина рН указанной композиции составляет приблизительно 7,4.
Еще одним аспектом является применение жидких композиций в соответствии с изобретением в терапии.
Жидкие композиции в соответствии с изобретением могут применяться в
15 терапии для лечения или профилактики мышечных заболеваний,
нейромышечных заболеваний, неврологических заболеваний,
офтальмологических нарушений, болевых состояний, психологических расстройств, заболеваний суставов, воспалительных заболеваний, эндокринных нарушений или урологических заболеваний.
20 Например, жидкие композиции в соответствии с изобретением могут
применяться для лечения или профилактики заболевания, состояния или синдрома, выбранных из следующего перечня:
• офтальмологические нарушения, выбранные из группы, состоящей из блефароспазма, косоглазия (в том числе рестриктивного косоглазия или
25 миогенного косоглазия), амблиопии, осциллопсии, защитного птоза, терапевтического птоза для защиты роговицы, нистагма, эзотропии, диплопии, энтропиона, ретракции века, орбитальной миопатии, гетерофории, сопутствующего смещения осей, несопутствующего смещения осей, первичной или вторичной эзотропии или экзотропии, межъядерной офтальмоплегии, косую
30 девиацию, синдрома Дуэйна и ретракции верхнего века;
• двигательные расстройства, включая гемифациальный спазм, кривошею, мышечную спастичность у детей или взрослых (например, при церебральном параличе, после инсульта, рассеянном склерозе, у пациентов с
•
черепно-мозговой травмой или травмой спинного мозга), идиопатические фокальные дистонии, ригидность мышц, писчий спазм, дистонию рук, паралич VI нерва, оромандибулярную дистонию, тремор головы, позднюю дискинезию, позднюю дистонию, профессиональные судороги (в том числе судорогу у 5 музыкантов), паралич лицевого нерва, спазм сведения челюстей, лицевой спазм, синкинезию, тремор, первичный писчий тремор, миоклонию, синдром скованного человека, дистонию ступней, паралич лицевого нерва, синдром болезненности рук и движения пальцев, тиковые расстройства, дистонические тики, синдром Туретта, нейромиотонию, дрожь подбородка, паралич латеральной прямой
10 мышцы, дистонический выворот ступни, дистонию челюсти, синдром кролика, мозжечковое дрожание, паралич III нерва, нистагм мягкого нёба, акатизию, мышечные судороги, паралич IV нерва, симптом "застывания" при ходьбе, дистонию мышц-разгибателей туловища, синкинезию после паралича лицевого нерва, вторичную дистонию, болезнь Паркинсона, хорею Хантингтона,
15 эпилепсию, застойный период дистонии, лицевой столбняк, миокимию и доброкачественный синдром крампи-фасцикуляции;
• оториноларингологические заболевания, включая спастическую дисфонию, ушные заболевания, нарушение слуха, треск в ушах, шум в ушах, головокружение, синдром Меньера, дисфункцию улиткового нерва, заикание,
20 перстнеглоточную дисфагию, бруксизм, закрытие гортани при хронической аспирации, гранулему голосовой складки, вентрикулярную дистонию, вентрикулярную дисфонию, мутационную дисфонию, тризм, храп, тремор голоса, аспирацию, дистонию с протрузией языка, небный тремор, глубокий прикус и дистонию мышц гортани; синдром первого кусания (First Bite Syndrome);
25 • нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта, включая
ахалазию, анальную трещину, запор, дисфункцию височно-нижнечелюстного сустава, дисфункцию сфинктера Одди, стойкую гипертензию сфинктера Одди, нарушения кишечной мускулатуры, пуборектальный синдром, анизмус, спазм привратника желудка, дисфункцию жёлчного пузыря, дисфункцию двигательной
30 активности желудочно-кишечного тракта или пищевода, диффузный спазм пищевода и парез желудка;
• заболевания мочеполовой системы, включая детрузорно-сфинктерную диссинергию, гиперрефлексию детрузора, нейрогенную дисфункцию мочевого пузыря (например, у пациентов с болезнью Паркинсона,
35 спинномозговой травмой, инсультом или рассеянным склерозом), гиперактивный
мочевой пузырь, нейрогенную сверхактивность детрузора, спазмы мочевого пузыря, недержание мочи, задержку мочеисипускания, гипертрофированную шейку пузыря, дисфункцию опорожнения, интерстициальный цистит, вагинизм, эндометриоз, тазовую боль, увеличение предстательной железы 5 (доброкачественную гиперплазию предстательной железы), простатодинию, рак предстательной железы и приапизм;
• дерматологические заболевания, включая нарушения пролиферации клеток кожи, раневые дефекты кожного покрова, псориаз, розацеа, акне; редкие наследуемые кожные заболевания, такие как синдром
10 Фокса-Фордайса или болезнь Хейли-Хейли; уменьшение келоидных и гипертрофических рубцов; уменьшение размера пор; воспалительные состояния кожи; болезненные воспалительные состояния кожи;
• болевые состояния, включая боль в спине (боль в верхней части спины, боль в пояснице), миофасциальный болевой синдром, головную боль
15 напряжения, фибромиалгию, болевые синдромы, миалгию, мигрень, хлыстовую травму, боль в суставах, послеоперационную боль, боль, не связанную с мышечным спазмом, и боль, связанную с заболеваниями гладкой мускулатуры;
• воспалительные заболевания, включая панкреатит, нейрогенные воспалительные заболевания (в том числе подагра, тендинит, бурсит,
20 дерматомиозит и анкилозирующий спондилит);
• секреторные заболевания, такие как избыточные секреции желёз, гипергидроз (в том числе гипергидроз подмышечной области, гипергидроз ладоней и синдром Фрея), гиперсаливация, сиалорея, бромидроз, повышенная секреция слизи, повышенное слезотечение, дисфункция голокринной железы;
25 избыточное салоотделение;
• респираторные заболевания, включая риниты (в том числе аллергические риниты), ХОЗЛ (англ. COPD, Chronic Obstructive Pulmonary Disease -хроническое обструктивное заболевание легких), астму и туберкулез;
• гипертрофические заболевания, включая мышечную гипертрофию, 30 гипертрофию жевательной мышцы, акромегалию и нейрогенную гипертрофию
передней большеберцовой мышцы с миалгией;
• заболевания суставов, включая бурсит локтевого сустава ("теннисный" локоть) (или эпикондилит локтевого сустава), воспаление суставов, коксартроз, остеоартрит, патологию головки мышцы-вращателя плеча,
35 ревматоиднй артрит и синдром канала запястья;
• эндокринные нарушения, такие как диабет 2-го типа, гиперглюкагонемия, гиперинсулинизм, гипоинсулинизм, гиперкальциемия, гипокальциемия, заболевания щитовидной железы (в том числе болезнь Грейвса, тиреоидит, тиреоидит Хашимото, гипертиреоз и гипотиреоз), заболевания
5 паращитовидной железы (в том числе гиперпаратиреоз и гипопаратиреоз), синдром Кушинга и ожирение;
• аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка;
• пролиферативные заболевания, включая опухоли параганглиомы, рак предстательной железы и накостные опухоли;
10 • травматические повреждения, включая спортивные травмы, травмы
мышц, повреждения сухожилий и переломы костей; и
• применение в ветеринарии (например, иммобилизация млекопитающих, колики у лошадей, ахалазия животных или мышечные спазмы животных).
15 Жидкие композиции в соответствии с изобретением также могут
применяться в эстетической медицине (то есть для улучшения косметического внешнего вида), в частности, для лечения или профилактики появления морщин кожи, в частности, морщин лица, таких как межбровные морщины, морщины контура глаз, глабеллярные морщин, опущение уголков рта, морщины шеи
20 (платизмальные тяжи), морщины подбородка (подбородочная мышца, "апельсиновая корка", подбородок с ямочкой), морщины лба, морщины типа "поцарапанной кожи", лифтинг носа или складки после сна. Согласно данному аспекту изобретения, субъект, подлежащий лечению или профилактике с целью улучшения косметического внешнего вида, предпочтительно не страдает каким-
25 либо из заболеваний, состояний или синдромов, описанных выше. Более предпочтительно указанный субъект является здоровым субъектом (то есть не страдающим каким-либо заболеванием, состоянием или синдромом).
Жидкие композиции в соответствии с изобретением могут применяться в сочетании с другим терапевтическим соединением. Согласно одному из 30 вариантов осуществления, жидкие композиции в соответствии с изобретением вводят в сочетании с обезболивающим соединением для устранения боли, в частности, в сочетании с опиоидным производным, таким как морфин, как описано в патентном документе WO 2007/144493, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Согласно другому варианту
осуществления, жидкие композиции в соответствии с изобретением вводят в сочетании с гиалуроновой кислотой, например, для лечения рака предстательной железы, как описано в патентном документе WO 2015/0444416, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
5 Еще одним аспектом настоящего изобретения является использование
аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, для защиты белкового нейротоксина от разрушения в жидкой композиции, не содержащей белков животного происхождения.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, аминокислота 10 является триптофаном, более предпочтительно L-триптофаном.
Предпочтительно белковый нейротоксин является ботулиническим нейротоксином. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, ботулинический нейротоксин является ботулиническим нейротоксином в форме комплекса. Согласно другому варианту осуществления, ботулинический
15 нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин высокой степени чистоты. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, ботулинический нейротоксин является ботулиническим нейротоксином, очищенным из его природного клостридиального штамма. Согласно другому варианту осуществления, ботулинический нейротоксин является ботулиническим
20 нейротоксином, получаемым рекомбинантно на гетерологичном хозяине, таком как Е. coli. Согласно настоящему изобретению, ботулинический нейротоксин может быть BoNT серотипов А, В, С, D, Е, F или G. Согласно настоящему изобретению, ботулинический нейротоксин может быть модифицированным ботулиническим нейротоксином, как описано выше. Согласно настоящему
25 изобретению, рекомбинантный ботулинический нейротоксин может быть химерным ботулиническим нейротоксином, как описано выше.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, аминокислоту используют в сочетании с поверхностно-активным веществом и буфером, включающим ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, при этом жидкая 30 композиция имеет величину рН от 5,5 до 8. Предпочтительно поверхностно-активное вещество является неионным поверхностно-активным веществом, более предпочтительно полисорбатом, например, PS20, PS60 или PS80. Наиболее предпочтительно неионное поверхностно-активное вещество является PS80. Предпочтительно буфер также содержит ионы калия. Буфер может быть
получен, например, объединением солей хлорида натрия, хлорида калия и фосфата натрия. Согласно предпочтительному варианту осуществления, величина рН лежит в диапазоне от 6,0 до 7,5, например, составляет 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 5 7,3, 7,35, 7,4, 7,45 или 7,5. Предпочтительно величина рН отличается не более, чем на одну единицу от физиологической рН (составляющей приблизительно 7,4).
Согласно предпочтительному варианту применения в соответствии с изобретением, жидкая композиция стабильна в течение 2 месяцев. Например,
10 она стабильна в течение 2 месяцев при температуре от 2 до 8°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 3 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно предпочтительному варианту осуществления, она стабильна в течение 6 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному
15 из вариантов осуществления, она стабильна в течение 12 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 18 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 24 месяцев при температуре от 2 до
20 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 36 месяцев при температуре от 2 до 8°С, например, при температуре 5°С. Согласно одному из вариантов осуществления, она стабильна в течение 3 месяцев при комнатной температуре, например, при температуре 25°С. Согласно одному из вариантов осуществления,
25 она стабильна в течение 6 месяцев при комнатной температуре, например, при температуре 25°С.
Описание примеров осуществления изобретения
1. Приготовление стабильных жидких композиций ботулинического токсина
типа а
30 Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 15
нг/мл высокоочищенного BoNT/A, 15 об.% полисорбата 20, аминокислоту, выбранную из тирозина (Туг), триптофана (Тгр) и цистеина (Cys) или смеси метионина (Met), тирозина (Туг), триптофана (Тгр) и цистеина (Cys) (Sigma Aldrich), и фосфатно-солевой буфер (PBS из компании Calbiochem) (140 мМ NaCI,
10 мМ фосфата натрия и 3 мМ KCI с рН 7,4 при температуре 25°С), фильтровали при помощи фильтров из ПВДФ (поливинилиденфторида) с размером пор 0,22 мкм и хранили в силиконизированных стеклянных шприцах емкостью 2 мл в течение 6 дней при температуре 40°С, после чего для каждого препарата 5 проводили тест для оценки эффективности.
При выполнении теста для оценки эффективности содержимое шприцов с препаратами переносили в стеклянные флаконы емкостью 2 мл (Chromacol, Gold) с крышками, содержащими мембрану из каучука, обработанного ПТФЭ (Chromacol), или в пластиковые микроцентрифужные пробирки емкостью 1,7 мкм
10 (Axygen, Maximum Recovery), те и другие имеют низкую адсорбцию белка. После этого препараты разводили 0,9% раствором NaCI, содержащим 3% человеческого сывороточного альбумина (HSA). В тот же день, когда выполняли разведение, по 50 мкл образца каждого препарата вводили в икроножную мышцу мышей. За мышами наблюдали в течение 3 дней и регистрировали степень
15 паралича.
Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Испытание влияния добавок аминокислот на стабильность BoNT/A в условиях ускоренного старения (6 дней при температуре 40°С). Результаты паралича у 20 мышей: "-" не анализировали, WN - без замечаний, РА - паралич и | - смерть
Композиция
Тест для эффективности
оценки
Оценка активности
Буфер
Конц. BoNT/A
Аминокислот а
Разведение в 0,9 NaCI с 3% HSA
(кратность)
Инъеци руемая доза (нг)
День 1
День 2
День 3
PBS рН 7,4
15% полисо
Тгр 0,25 мг/мл +
Cys 0,25 мг/мл +
2 х
0,25
нг/мл
Met 0,25 мг/мл +
Туг 0,25 мг/мл
20 х
0,025
рбат 20
Cys 1 мг/мл
2 х
0,25
20 х
0,025
Туг 0,74
2 х
0,25
Резки
действие против разложения BoNT/A. Было обнаружено, что триптофан обладает самым сильным защитным действием. Цистеин, а также смесь, содержащая все четыре аминокислоты, не оказывали защитного действия.
1. Приготовление стабильной жидкой композиции ботулинического токсина типа В
Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 350 нг/мл высокоочищенного BoNT/B, 15 об.% полисорбата 20, аминокислоту, выбранную из тирозина (Туг), триптофана (Тгр) и цистеина (Cys) или смеси метионина (Met), тирозина (Туг), триптофана (Тгр) и цистеина (Cys), и фосфатно-солевой буфер (PBS), при рН 7,4, фильтровали при помощи фильтров с размером пор 0,22 мкм и хранили в силиконизированных стеклянных шприцах емкостью 2 мл в течение двух недель при температуре 40°С, после чего для каждого препарата проводили тест для оценки эффективности, как описано выше.
Результаты представлены в Таблице 2.
Испытание влияния добавок аминокислот на стабильность BoNT/B в условиях ускоренного старения (две недели при температуре 40°С). Результаты паралича у мышей: "-" - не анализировали, WN - без замечаний, РА - паралич и | - смерть
5 действие против разложения BoNT/B. Цистеин, а также смесь, содержащая все четыре аминокислоты, также обладали защитным действием, но в меньшей степени.
2. Оценка различных концентраций триптофана и полисорбата 20
Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 10 BoNT/A или BoNT/B высокой степени чистоты и различные концентрации полисорбата 20 (PS 20) и триптофана, и фосфатно-солевой буфер (PBS) при рН 7,4, фильтровали при помощи фильтров с размером пор 0,22 мкм и хранили в силиконизированных стеклянных шприцах емкостью 2 мл. Испытания эффективности в отношении паралича задней конечности проводили для каждого 15 препарата, как описано выше.
Результаты представлены в Таблице 3.
Оценка влияния концентраций Тгр и полисорбата 20 (PS20) на стабильность BoNT/A или BoNT/B. Результаты паралича у мышей: "-" - не анализировали, WN - без замечаний, РА - паралич и f - смерть
5 задней конечности; 3. Парализованы обе задние конечности; 4. Парализована задняя конечность; Элюирующий буфер от очистки (5): 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5, с 0,2% (об./об.) полисорбата 20 и 400 мМ хлорида натрия. * возможно, произошло смешивание двух разведений BoNT/A при 25°С 8 мг/мл Тгр, 0,25 % полисорбата 20.
10 3. Оценка различных концентраций солей в препаратах BoNT/B
Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 100 нг/мл высокоочищенного BoNT/B, полисорбат 20, триптофан от различных поставщиков аминокислот и буфер, выбранный из PBS с рН 7,4 (Calbiochem), 12 нМ фосфатного буфера с рН 7 (Apoteket) и 20 мМ ацетата натрия (NaAc) с рН 5,5 5 (NaAc фирмы Fluka и уксусная кислота фирмы Merck), фильтровали при помощи фильтров с размером пор 0,22 мкм и хранили в силиконизированных стеклянных шприцах емкостью 2 мл. Испытания эффективности в отношении паралича задней конечности проводили для каждого препарата, как описано выше.
Результаты представлены в Таблице 4.
10 Таблица 4
Оценка влияния различных концентраций солей на стабильность BoNT/B. Результаты паралича у мышей: "-" - не анализировали, WN - без замечаний, РА
- паралич и | - смерть
Конц.
BoNT/
(нг/мл)
Буфер
Поставщи к и конц. Тгр
PS20
(%)
Испытание эффективности
Оценка эффективности (1-Зд) для образцов, хранившихся с разной продолжительностью
Разведение в 0,9 NaCI с 3% HSA (кратность)
Инъе циру емая доза (нг)
40°С
2 недели
5 недель
100
PBS
рН 7,4
Ajinomoto 4 мг/мл
1 х
10 х
0,5
100
PBS
рН 7,4
Sigma Aldrich
4 мг/мл
1 х
10 х
0,5
100
PBS
рН 7,4
Sigma Aldrich
1 мг/мл
1 х
10 х
0,5
100
PBS
рН 7,4
Sigma Aldrich
4 мг/мл
0,25
1 х
10 х
0,5
РА2
100
12 мМ Phosphate
рН 7
Sigma Aldrich
4 мг/мл
1 х
10 х
0,5
WN1
100
20 мМ NaAc
рН 5,5
Sigma Aldrich
4 мг/мл
1 х
10 х
0,5
1. Некоторая потеря функции; 2. Слабый паралич
Результаты показывают, что препараты, содержащие PBS буфер (включающий ионы натрия, хлорид-ионы, фосфат-ионы и ионы калия), по-видимому, играют определенную роль в стабильности ботулинического токсина.
5 4. Оценка различных стабилизаторов
Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 15 нг/мл высокоочищенного BoNT/A, Полисорбат 20 (PS20) или Полисорбат 80 (PS80) или HSA, триптофан и PBS, фильтровали при помощи фильтров с размером пор 0,22 мкм и хранили в силиконизированных стеклянных шприцах 10 емкостью 2 мл. Испытания эффективности в отношении паралича задней конечности проводили для каждого препарата, как описано выше.
Результаты представлены в Таблице 5.
Таблица 5
15 Оценка воздействия различных поверхностно-активных веществ на
стабильность BoNT/A. Результаты паралича у мышей: "-" - не анализировали, WN - без замечаний, РА - паралич и | - смерть
Конц
BoN Т/А (нг/м л)
Буф ер
Тгр
Стабили затор
Испытание эффективности
Оценка эффективности (1-Зд) для образцов, хранившихся с разной продолжительностью
Разведение в 0,9 NaCI с 3% HSA (кратность)
Инъец ируема я доза (нг)
40°С
6 дней
4 недель
3 месяца
PBS
РН 7,4
мг/мл
PS 80 0,25%
1,7 х
0,45
РА3
15 х
0,05
PBS
РН 7,4
мг/мл
PS 20 0,25%
1,7 х
0,45
РА2
15 х
0,05
PBS
РН 7,4
HSA 1 мг/мл
1,7 х
0,45
15 х
0,05
РА1
1. Сильный паралич обеих задних конечностей; 2. Лапы расположены под углом; 3. Сильный паралич
5. Оценка различных композиций
Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 10 5 нг/мл высокоочищенного BoNT/A, 0,25% PS80, 1 мг/мл триптофана и PBS, как описано выше. Величину рН доводили до 6,6 и 7,0 с помощью добавления HCI. Каждый из препаратов хранили в течение 5 недель при температуре 40°С.
Каждый из препаратов разбавляли 10-кратно и проводили испытания эффективности в отношении паралича задней конечности, как описано выше 10 (0,05 нг на инъекцию). В обоих случаях паралич задней конечности наблюдался на 3 день. Паралич был более сильным при использовании препарата с величиной рН 6,6.
6. Оценка различных композиций
Готовили жидкие препараты ботулинического токсина, содержащие 0,3 15 нг/мл высокоочищенного BoNT/A, полисорбат, выбранный из PS20 и PS80, 1 мг/мл триптофана и 12 мМ PBS, при рН 7,4, как описано выше. Величину рН каждого препарата доводили до рН 6,6 или 6,9 с помощью добавления 1,2 М HCI.
Полисорбат 20 испытывали при одной концентрации, 0,2 (мас./об.)%, что соответствует примерно его 20-кратной CMC (критической мицеллярной 20 концентрации, составляющей приблизительно 0,01 (мас./об.)% при температуре 21 °С). Полисорбат 80 испытывали при концентрациях 0,04 и 0,2 (мас./об.)%, что соответствует приблизительно его 20- и 100-кратной CMC (составляющей приблизительно 0,002 (мас./об.)% при температуре 21 °С).
25 Выбор полисорбата и величины рН
По 0,5 мл каждого препарата заполняли в длинные стеклянные шприцы емкостью 1 мл (BD) и закрывали плунжером с фторуглеродным покрытием.
Эффективность определяли при помощи испытания в отношении паралича задней конечности у мышей, как описано выше.
5 Ни для одной из композиций не наблюдалось никакого снижения
эффективности по истечении 6 месяцев хранения при температуре 5°С и после 25°С.
7. Оценка различных композиций
Готовили девятнадцать различных композиций, содержащих 10 ботулинический нейротоксин типа А высокой степени очистки с различными концентрациями полисорбата 80, триптофана, фосфата натрия, хлорида натрия, хлорида калия и различными рН. Каждая композиция имела целевую номинальную эффективность 500 Ед/мл. Каждую композицию дегазировали, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и заполняли во флаконы. В 15 качестве защитной атмосферы внутри флаконов использовали газообразный азот. Заполнение осуществляли в анаэробной камере. Каждую композицию в виде аликвот по 1 мкл в атмосфере азота заполняли в стеклянные флаконы емкостью 2 мл, закрывали пробками FluroTec(r), запечатывали при помощи алюминиевых колпачков с отрывной накладкой и хранили в вертикальном 20 положении.
Стабильность 19 композиций оценивали при температурах 5°С, 25°С и 37°С, используя для измерения эффективности набор BoTest(r) .
Назва ние
приме ра
Фосфат натрия (мМ)
Триптофан (мг/мл)
Полисорб ат 80 (об.%)
NaCI (мМ)
KCI (мМ)
7,2
0,01
6,3
0,01
7,2
0,01
255
6,3
0,25
N10
7,2
0,25
255
N11
6,3
0,25
255
N12
7,2
0,25
N13
6,3
255
N14
7,2
N15
6,3
N16
7,2
255
N17
6,75
1,625
0,1
140
Для всех композиций раствор оставался прозрачным и, по большей части, 5 бесцветным.
Концентрации вспомогательных веществ, тестируемые в данном исследовании, по-видимому, не влияют на величину рН композиций в тестируемом промежутке времени. Результаты эффективности представлены в Таблице 9.
10 Таблица 9
Результаты определения эффективности с использованием BoTest
Исходная эффективность (Ед/мл) (BoTest)
0 месяцев
Остаточная эффективность по сравнению с исходной (BoTest)
2 месяца
37°С
6 месяцев
25°С
6 месяцев 5°С
Ед/мл
Ед/мл
Ед/мл
6,3
7,2
474
210
389
485
102
6,3
449
288
406
512
114
7,2
299
368
123
406
136
6,3
378
263
385
102
422
112
7,2
6,3
238
239
100
7,2
375
305
402
107
450
120
6,3
196
100
294
150
N10
7,2
354
201
408
115
411
116
N11
6,3
438
197
372
492
112
N12
7,2
411
295
417
101
N13
6,3
304
185
403
133
416
137
N14
7,2
206
183
N15
6,3
197
155
231
117
214
109
N16
7,2
476
227
390
685
144
N17
6,75
402
250
286
488
121
Для нескольких композиций имела место потеря не более 30% эффективности в течение 6 месяцев при температуре 5°С и/или не более приблизительно 40% эффективности в течение 3 месяцев при температуре 25°С и/или не более приблизительно 50% активности в течение 2 месяцев при
5 температуре 37°С .
8. Оценка PS 60
Готовили композицию, содержащую ботулинический нейротоксин типа А высокой степени очистки с 0,1% (об./об.) PS60, 1 мг/мл L-триптофана, 10 мМ фосфата натрия, 140 мМ хлорида натрия, 3 мМ хлорида калия и воду для 10 инъекций. Величину рН с помощью HCI доводили до 6,75. Композиция имела целевую номинальную эффективность 100 Ед/мл. Композицию дегазировали, фильтровали через фильтры с размером пор 0,2 мкм и заполняли во флаконы
емкостью 2 мл в асептических условиях в анаэробной камере с атмосферой азота при объеме наполнения 1 мл. Во флаконах в качестве защитной атмосферы использовали газообразный азот. Флаконы закрывали пробками с покрытием FluroTec(r), запечатывали при помощи алюминиевых колпачков с 5 отрывной накладкой.
Эффективность с течением времени при температурах 37°С и 25°С определяли с помощью теста MLD50, как описано в данном контексте.
10 При температуре 37°С остаточная эффективность по истечении 9 недель
составляла приблизительно от 50 до 55% от начальной эффективности.
При температуре 25°С остаточная эффективность по истечении 3 месяцев составляла приблизительно 80% от начальной эффективности.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> IPSEN BIOPHARM Ltd
NESTLE SKIN HEALTH SA
<120> КОМПОЗИЦИЯ НЕЙРОТОКСИНА
<130> IBGA 001-WO(2)
<150> PCT/EP2016/062085
<151> 2016-05-27
<160> 7
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 1296
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 1
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 2
<211> 1291
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 2
Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu
115 120 125
Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly
165 170 175
Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln
180 185 190
Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
245 250 255
Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
275 280 285
Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn
290 295 300
Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr
305 310 315 320
Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly
325 330 335
Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu
340 345 350
Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn lie Ala Glu Asn Tyr Lys lie Lys
355 360 365
Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys lie Lys
370 375 380
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr
420 425 430
Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp
435 440 445
Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser
450 455 460
Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn
465 470 475 480
Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr
500 505 510
Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys
515 520 525
Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln
530 535 540
Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp
545 550 555 560
Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp
565 570 575
Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly
580 585 590
Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser
595 600 605
Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile
610 615 620
Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu
625 630 635 640
Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro
645 650 655
Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile
660 665 670
Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys
675 680 685
Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp
690 695 700
Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr
705 710 715 720
Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr
725 730 735
Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp
740 745 750
Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile
755 760 765
Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met
770 775 780
Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn
785 790 795 800
Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr
805 810 815
Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu
820 825 830
Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile
835 840 845
Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile
850 855 860
Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly
865 870 875 880
Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys
885 890 895
Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr
900 905 910
Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val
915 920 925
Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn
930 935 940
Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser
945 950 955 960
Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile
965 970 975
Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg
980 985 990
Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr
995 1000 1005
Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu
1010 1015 1020
Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly
1025 1030 1035
Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe
1040 1045 1050
Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln
1055 1060 1065
Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr
1070 1075 1080
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr
1085 1090 1095
Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys
1100 1105 1110
Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn
1115 1120 1125
Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu
1130 1135 1140
Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp
1145 1150 1155
Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn
1160 1165 1170
Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu
1190 1195 1200
Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr
1205 1210 1215
Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp
1220 1225 1230
Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile
1235 1240 1245
Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr
1250 1255 1260
Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys
1265 1270 1275
Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu
1280 1285 1290
<210> 3
<211> 1291
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 3
Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn
1 5 10 15
Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu
20 25 30
Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp
35 40 45
Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val
50 55 60
Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp
65 70 75 80
Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg
85 90 95
Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp
115 120 125
Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn
130 135 140
Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly
145 150 155 160
Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr
165 170 175
Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile
180 185 190
Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp
195 200 205
Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile
210 215 220
Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile
245 250 255
Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala
260 265 270
Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr
275 280 285
Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu
290 295 300
Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser
325 330 335
Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn
340 345 350
Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn
355 360 365
Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr
370 375 380
Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn
385 390 395 400
Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser
405 410 415
Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu
420 425 430
Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn
435 440 445
Lys Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro
450 455 460
Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys
465 470 475 480
Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Ser
485 490 495
Val Asp Gln Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gln Leu
500 505 510
Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly
515 520 525
Glu Asn Gln Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gln Asn Val Asp Tyr Leu
530 535 540
Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu
545 550 555 560
Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala
565 570 575
Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly
580 585 590
Val Gln Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp
595 600 605
Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp
610 615 620
Val Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn
625 630 635 640
Ser Val Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val
645 650 655
Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly
660 665 670
Ala Phe Val Ile Tyr Ser Lys Val Gln Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys
675 680 685
Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gln Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser
690 695 700
Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gln Phe
705 710 715 720
Asn Asn Ile Ser Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gln Ala Gly
725 730 735
Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser
740 745 750
Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu
755 760 765
Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg
770 775 780
Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile
785 790 795 800
Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn
805 810 815
Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu
820 825 830
Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gln Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile
835 840 845
Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr
850 855 860
Phe Asn Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys
865 870 875 880
Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu
885 890 895
Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly
900 905 910
Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn
915 920 925
Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile
930 935 940
Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp
945 950 955 960
Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe
965 970 975
Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn
980 985 990
Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe
995 1000 1005
Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr
1010 1015 1020
Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr
1025 1030 1035
Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile
1040 1045 1050
Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met
1055 1060 1065
Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys
1070 1075 1080
Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val
1085 1090 1095
Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr
1100 1105 1110
Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser
1115 1120 1125
Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn
1130 1135 1140
Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn
1145 1150 1155
Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr
1160 1165 1170
Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met
1175 1180 1185
Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu
1190 1195 1200
Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile
1205 1210 1215
Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys
1220 1225 1230
Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly
1235 1240 1245
Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr
1250 1255 1260
Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu
1265 1270 1275
Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu
1280 1285 1290
<210> 4
<211> 1276
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 4
Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp
1 5 10 15
Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr
20 25 30
Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro
50 55 60
Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp
65 70 75 80
Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg
85 90 95
Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val
100 105 110
Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp
115 120 125
Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly
130 135 140
Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly
145 150 155 160
Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly
165 170 175
Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu
180 185 190
Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn
195 200 205
Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val
210 215 220
Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly
225
230
235
240
Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly
245 250 255
Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr
260 265 270
Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln
275 280 285
Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu
290 295 300
Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp
305 310 315 320
Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn
325 330 335
Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser
340 345 350
Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn
355 360 365
Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe
370 375 380
Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn
385 390 395 400
Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu
405 410 415
Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu
420 425 430
Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser
435 440 445
Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys
450 455 460
Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Asn Lys Ile Ile Thr Asp Glu
465 470 475 480
Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile
485 490 495
Leu Asp Gly Gln Val Pro Ile Asn Pro Glu Ile Val Asp Pro Leu Leu
500 505 510
Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Glu Glu Ile Val
515 520 525
Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr
530 535 540
Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu
545 550 555 560
Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr
565 570 575
Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly
580 585 590
Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn
595 600 605
Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Val Ile
610 615 620
Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg
625 630 635 640
Gly Asn Phe Asn Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu
645 650 655
Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe
660 665 670
Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn
675 680 685
Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met
690 695 700
Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Asn
705 710 715 720
Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala
725 730 735
Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn
740
745
750
Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile
755 760 765
Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val
770 775 780
Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn
785 790 795 800
Lys Phe Asp Leu Arg Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser
805 810 815
His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val
820 825 830
Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Met Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr
835 840 845
Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile
850 855 860
Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val
865 870 875 880
Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln
885 890 895
Leu Asn Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp
900 905 910
Lys Ile Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr
915 920 925
Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr
930 935 940
Asn Ser His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser
945 950 955 960
Gly Trp Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln
965 970 975
Asp Val Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser
980 985 990
Leu Ser His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr
995
1000
1005
Asn Asn Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu
1010 1015 1020
Lys Gln Ser Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp
1025 1030 1035
Lys Thr Ile Val Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln
1040 1045 1050
Met Leu Trp Ile Arg Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser
1055 1060 1065
Asn Glu Asp Ile Asn Ile Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn
1070 1075 1080
Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu
1085 1090 1095
Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro
1100 1105 1110
Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Pro Asp Arg Ser Lys
1115 1120 1125
Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys Ser Val Ser Asp Lys
1130 1135 1140
Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn Ile Ile Leu His
1145 1150 1155
Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg Asp Thr Asp
1160 1165 1170
Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Cys Val
1175 1180 1185
Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile Gly
1190 1195 1200
Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser
1205 1210 1215
Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp
1220 1225 1230
Ile Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro
1235
1240
1245
Val Ala Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser
1250 1255 1260
Phe Trp Lys Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu
1265 1270 1275
<210> 5
<211> 1252
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 5
Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg
1 5 10 15
Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser
20 25 30
Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile
35 40 45
Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly
50 55 60
Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys
65 70 75 80
Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn
85 90 95
Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro
100 105 110
Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp
115 120 125
Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu
130 135 140
Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His
165 170 175
Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe
180 185 190
Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala
210 215 220
Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu
225 230 235 240
Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr
260 265 270
Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys
275 280 285
Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu
290 295 300
Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn
305 310 315 320
Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu
325 330 335
Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile
340 345 350
Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile
355 360 365
Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe
370 375 380
Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr
385 390 395 400
Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val
405 410 415
Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly
420 425 430
Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile
435 440 445
Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr
450 455 460
Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala
465 470 475 480
Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala
485 490 495
Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His
500 505 510
Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val
515 520 525
Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala
530 535 540
Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile
545 550 555 560
Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile
565 570 575
Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr
580 585 590
Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu
595 600 605
Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala
610 615 620
Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu
625 630 635 640
Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser
645 650 655
Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys
660 665 670
Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn
675 680 685
Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met
690 695 700
Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu
705 710 715 720
Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn
725 730 735
Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser
740 745 750
Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser
755 760 765
Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu
770 775 780
Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His
785 790 795 800
Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr
805 810 815
Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp
820 825 830
Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys
835 840 845
Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp
850 855 860
Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys
865 870 875 880
Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser
885 890 895
Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr
900 905 910
Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn
915 920 925
Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg
930 935 940
Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile
945 950 955 960
Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn
965 970 975
Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe
980 985 990
Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn
995 1000 1005
Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile
1010 1015 1020
His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr
1025 1030 1035
Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu
1040 1045 1050
Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn
1055 1060 1065
Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp
1070 1075 1080
Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile
1085 1090 1095
Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser
1100 1105 1110
Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys
1115 1120 1125
Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg
1130 1135 1140
Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His
1145 1150 1155
Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys
1160 1165 1170
Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val
1175 1180 1185
Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn
1190 1195 1200
Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr
1205 1210 1215
Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr
1220 1225 1230
Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly
1235 1240 1245
Trp Gln Glu Lys 1250
<210> 6
<211> 1274
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 6
Met Pro Val Ala Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp
1 5 10 15
Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asn Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr
65 70 75 80
Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys
85 90 95
Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Lys Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser
100 105 110
Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Pro Ile Asp Glu Phe
115 120 125
Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Leu Ser Thr Asn
130 135 140
Val Glu Ser Ser Met Leu Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro
145 150 155 160
Asp Ile Phe Glu Ser Cys Cys Tyr Pro Val Arg Lys Leu Ile Asp Pro
165 170 175
Asp Val Val Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile
180 185 190
Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly
195 200 205
Gly His Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser
210 215 220
Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg
225 230 235 240
Gly Val Thr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Val Lys Gln Ala Pro Leu Met
245 250 255
Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly
260 265 270
Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn
275 280 285
Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Glu Val
290 295 300
Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe
305 310 315 320
Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val
325 330 335
Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr
340 345 350
Glu Ser Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr
355 360 365
Phe Ile Lys Tyr Glu Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp
370 375 380
Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn
385 390 395 400
Asn Arg Gly Gln Ser Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile
405 410 415
Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val
420 425 430
Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val
435 440 445
Asn Asn Ser Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu
450 455 460
Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn
465 470 475 480
Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser
485 490 495
Gln Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln
500 505 510
Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile
515 520 525
Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala
530 535 540
Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile
545 550 555 560
Asp Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ser Lys Asp Ile Phe Phe Ser Ser Glu
565 570 575
Phe Ile Asp Thr Ile Asn Lys Pro Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile Asp
580 585 590
Trp Ile Ser Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln Lys
595 600 605
Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Val
610 615 620
Gly Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Glu Ala Glu Lys Gly Asn Phe Glu
625 630 635 640
Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Val Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val Pro
645 650 655
Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr Ile
660 665 670
Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ser
675 680 685
Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile Val
690 695 700
Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu
705 710 715 720
Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr Ala
725 730 735
Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg Leu
740 745 750
Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys Lys
755 760 765
Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser Ser
770 775 780
Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Gly Lys Leu
785 790 795 800
Lys Lys Tyr Asp Asn His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asn Tyr Ile Leu
805 810 815
Asp His Arg Ser Ile Leu Gly Glu Gln Thr Asn Glu Leu Ser Asp Leu
820 825 830
Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser Tyr
835 840 845
Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys Lys
850 855 860
Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe
865 870 875 880
Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn Val
885 890 895
Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Ser Arg
900 905 910
Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Ser
915 920 925
Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys His
930 935 940
Tyr Lys Pro Met Asn His Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met
945 950 955 960
Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Thr Val Arg Asp
965 970 975
Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu Asn
980 985 990
Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Asn Arg Ile Ser Asn Tyr Ile Asn
995 1000 1005
Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser
1010 1015 1020
Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile Ser
1025 1030 1035
Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile
1040 1045 1050
Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys
1055 1060 1065
Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr
1070 1075 1080
Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asn Tyr Trp Gly Asn
1085 1090 1095
Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu Arg
1100 1105 1110
Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile Asn
1115 1120 1125
Gln Gln Arg Gly Val Thr Glu Gly Ser Val Phe Leu Asn Tyr Lys
1130 1135 1140
Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Pro Ile
1145 1150 1155
Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala
1160 1165 1170
Tyr Ile Asn Val Val Asp Arg Gly Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala
1175 1180 1185
Asp Thr Lys Ser Glu Lys Glu Lys Ile Ile Arg Thr Ser Asn Leu
1190 1195 1200
Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser Ile Gly Asn
1205 1210 1215
Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Ser Asn Ile Gly
1220 1225 1230
Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr
1235 1240 1245
Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp
1250 1255 1260
Ser Ser Ile Ser Lys Glu Asn Gly Trp Lys Glu 1265 1270
<210> 7
<211> 1297
<212> Белок
<213> Clostridium botulinum
<400> 7
Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn
1 5 10 15
Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu
35 40 45
Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly
50 55 60
Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys
65 70 75 80
Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile
100 105 110
Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys
115 120 125
Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln
130 135 140
Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile
165 170 175
Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met
180 185 190
Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe
245 250 255
Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile
275 280 285
Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn
290 295 300
Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys
325 330 335
Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met
340 345 350
Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr
355 360 365
Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys
370 375 380
Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala
385 390 395 400
Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn
405 410 415
Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg
420 425 430
Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu
435 440 445
Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys
450 455 460
Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn
465 470 475 480
Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile
485 490 495
Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr
500 505 510
Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys
515 520 525
Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu
530 535 540
Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu
545 550 555 560
Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr
565 570 575
Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala
580 585 590
Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser
595 600 605
Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile
610 615 620
Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala
625 630 635 640
Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu
645 650 655
Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr
660 665 670
Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser
675 680 685
Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu
690 695 700
Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile
705 710 715 720
Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu
725 730 735
Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met
740 745 750
Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser
755 760 765
Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser
770 775 780
Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu
785 790 795 800
Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp
805 810 815
Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys
820 825 830
Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr
835 840 845
Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn
850 855 860
Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu
865 870 875 880
Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val
885 890 895
Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu
900 905 910
Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser
915 920 925
Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr
930 935 940
Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
945 950 955 960
Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn
965 970 975
Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile
980 985 990
Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys
995 1000 1005
Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn
1010 1015 1020
Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn
1025 1030 1035
Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile
1040 1045 1050
Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn
1055 1060 1065
Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr
1070 1075 1080
Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn
1085 1090 1095
Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met
1100 1105 1110
Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu
1115 1120 1125
Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln
1130 1135 1140
Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn
1145 1150 1155
Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr
1160 1165 1170
Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val
1175 1180 1185
Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu
1190 1195 1200
Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile
1205 1210 1215
Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys
1220 1225 1230
Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe
1235 1240 1245
Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe
1250 1255 1260
Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn
1265 1270 1275
Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu
1280 1285 1290
Gly Trp Thr Glu 1295
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Жидкая композиция, содержащая белковый нейротоксин, поверхностно-активное вещество, аминокислоту, выбранную из триптофана и
5 тирозина, буфер, включающий ионы натрия, хлорид-ионы и фосфат-ионы, где указанная жидкая композиция имеет величину рН от 5,5 до 8, где указанная композиция не содержит белков животного происхождения,
где указанная жидкая композиция стабильна в течение продолжительного 10 времени.
2. Жидкая композиция по п. 1, где поверхностно-активное вещество является неионным поверхностно-активным веществом.
3. Жидкая композиция по п. 2, где неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат, предпочтительно Полисорбат 20,
15 Полисорбат 60 или Полисорбат 80.
4. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-3, где аминокислота представляет собой триптофан, предпочтительно L-триптофан.
5. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-4, где буфер дополнительно включает ионы калия.
20 6. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-5, где указанная
композиция имеет величину рН от 6,0 до 7,5.
7. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-6, где не более 30%
внеклеточной протеолитической активности теряется в течение 2, 3, 6, 12, 18, 24
или 36 месяцев при температуре 5°С.
25 8. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-7, где белковый
нейротоксин является ботулиническим нейротоксином, выбранным из природного
ботулинического нейротоксина в форме комплекса, природного ботулинического
нейротоксина высокой чистоты и рекомбинантного ботулинического
нейротоксина.
30 9. Жидкая композиция по п. 8, где ботулинический нейротоксин
представляет собой рекомбинантный ботулинический нейротоксин, выбранный из ботулинического нейротоксина типов А, В, С, D, Е, F или G, модифицированного ботулинического нейротоксина и химерного ботулинического нейротоксина.
10. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-9, где указанная
35 жидкая композиция содержит:
о от 4 до 10000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл,
о от 0,001 до 15 об.% полисорбата,
о от 0,1 до 5 мг/мл триптофана,
о от 10 до 500 мМ NaCI,
5 о от 1 до 50 мМ KCI,
о от 1 до 100 мМ фосфата натрия,
имеет величину рН в диапазоне от 5,5 до 8 и стабильна в течение 6 месяцев при температуре 5°С.
11. Жидкая композиция по п. 10, где указанная жидкая композиция 10 содержит:
о от 10 до 2000 единиц LD50 ботулинического нейротоксина на 1 мл,
о от 0,05 до 0,2 об.% полисорбата 80,
о от 0,1 до 5 мг/мл триптофана,
о от 25 до 300 мМ NaCI,
15 о от 1 до 10 мМ KCI,
о от 2 до 50 мМ фосфата натрия,
имеет величину рН в диапазоне от 6,0 до 7,5 и стабильна в течение 12 месяцев при температуре 5°С.
12. Жидкая композиция по любому из пунктов 1-11 для применения в 20 терапии.
13. Жидкая композиция по п. 12 для применения для лечения или профилактики мышечных заболеваний, нейромышечных заболеваний, неврологических заболеваний, офтальмологических заболеваний, болевых состояний, психологических расстройств, заболеваний суставов, воспалительных
25 заболеваний, эндокринных нарушений или урологических заболеваний.
14. Применение жидкой композиции по любому из пунктов 1-11 в эстетической медицине, например, для лечения или профилактики появления морщин кожи, в частности, морщин лица, таких как лицевые межбровные складки, морщины контура глаз, глабеллярные морщины, опущение уголков рта,
30 морщины шеи (платизмальные тяжи), морщины подбородка (подбородочная мышца, "апельсиновая корка", подбородок с ямочкой), морщины лба, морщины типа "поцарапанной кожи", лифтинг носа или складки после сна.
15. Применение аминокислоты, выбранной из триптофана и тирозина, для защиты белкового нейротоксина от разрушения в жидкой композиции, не содержащей белков животного происхождения.
16. Применение по п. 15, где аминокислота является триптофаном.
5 17. Применение по п. 15 или п. 16, где белковый нейротоксин является
ботулиническим нейротоксином.
18. Применение по п. 15, где аминокислоту используют в сочетании с
поверхностно-активным веществом и буфером, включающим ионы натрия,
хлорид-ионы и фосфат-ионы, при этом указанная жидкая композиция имеет
10 величину рН от 5,5 до 8.
(19)
(19)
(19)
Таблица 2
Таблица 3