(57) Реферат / Формула:
Описаны векторы, вакцины, композиции вакцин и комбинации вакцин для применения в качестве терапевтических средств против HPV18 и/или HPV16.
Евразийское (21) 201892488 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/12 (2006.01)
2019.04.30 C07K14/025 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.05.01
(54) КОМБИНАЦИИ ЛЕЧЕБНЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ВПЧ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
62/330,562; 62/447,094 2016.05.02; 2017.01.17
PCT/US2017/030338
WO 2017/192418 2017.11.09
Заявитель:
ЯНССЕН ВЭКСИНС ЭНД ПРЕВЕНШН Б.В. (NL); БАВАРИАН НОРДИК А/С (DK)
Изобретатель:
Кустерс Жером Х.х.в., Шепер Геррит С., Кан Селина (NL), Калла Маркус, Вайднер Катрин (DE), Банник Эвилин
М. (US)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-552926ЕА/042 КОМБИНАЦИИ ЛЕЧЕБНЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ВПЧ
Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] Эта заявка имеет право на приоритет в соответствии с 35 U.S.С. 119(e) предварительной заявки на патент США № 62/209091, поданной 24 августа 2015г., и предварительной заявки на патент США № 62/210,655, поданной 27 августа 2015г., раскрытие которых полностью включено ссылкой в данный документ.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Настоящее изобретение относится к области медицины и более конкретно - к конструкциям нуклеиновых кислот, полипептидам, векторам, вакцинам, комбинациям вакцин, которые можно применять в лечебных средств против вируса папилломы человека 18 типа и/или 16 типа.
Ссылка на перечень последовательностей, представленных в электронном виде
[0003] В этой заявке содержится перечень
последовательностей, который представлен электронно через посредство EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с названием "0269_US_P00_PRO_ST25", дата создания 25 апреля 2 016г., и имеющего размер примерно 64,7 00 байтов. Перечень последовательностей, представленный в электронном виде через посредство EFS-Web является частью данного описания и включен в данный документ ссылкой во всей своей полноте.
Предпосылки изобретения
[0004] Семейство вирусов папилломы человека (ВПЧ или HPV) состоит из более чем 100 типов (также называемых подтипами), которые способны инфицировать кератиноциты кожи или слизистых оболочек. Более 4 0 типов ВПЧ обычно передаются половым путем, и инфекции аногенитальной области, вызванные ВПЧ, широко распространены как у мужчин, так и у женщин. Некоторые типы ВПЧ, передающиеся половым путем, могут вызывать появление остроконечных бородавок. Упорные инфекции, вызываемые типами ВПЧ "высокого риска" (например, 16, 18, 31, 45 типами), отличными от
тех, которые вызывают кожные бородавки, могут прогрессировать до предраковых очагов и инвазивного рака, например, шейки матки, вульвы, влагалища, пениса, ротоглотки и ануса. Большинство инфекций, вызываемых ВПЧ, самопроизвольно проходят в течение одного-двух лет после инфицирования. У здоровых индивидуумов циркулирующие CD4+ Т-клетки типов ТЫ и Тп2, специфичные в отношении вирусных ранних белков Е2, Еб и Е7 ВПЧ 16 типа (HPV-16), а также специфичные в отношении Еб CD8+ Т-клетки мигрируют в кожу при контрольном заражении антигеном, что указывает на то, что успешная защита против инфекции, вызываемой HPV-16, обычно связана с системным эффекторным Т-клеточным ответом против этих вирусных ранних антигенов. У меньшинства (~1%) инфицированных индивидуумов инфекция, вызванная ВПЧ, сохраняется, что в конечном итоге приводит к злокачественным новообразованиям в половых органах. Среди ВПЧ высокого риска ВПЧ 16 типа (HPV16) и ВПЧ 18 типа (HPV18) являются основными причинами рака шейки матки, вместе вызывая приблизительно 70% случаев, а также эти два типа играют важную роль в других вызванных ВПЧ опухолях, таких как рак анального канала и рак ротоглотки. Во всем мире ВПЧ является одним из наиболее серьезных инфекционных агентов, вызывающих рак.
[0005] Вакцинация против ВПЧ считается оправданной стратегией снижения частоты возникновения или эффектов инфекции, вызываемой ВПЧ (van der Burg and Melief, 2011, Curr Opinion Immunol 23: 252-257).
[000 6] Профилактические вакцины против ВПЧ на основе вирусоподобных частиц (VLP), образованных (оболочечным) белком L1 ВПЧ 16 и 18 типов, очень эффективны для предупреждения упорной инфекции и связанного с ней заболевания, вызываемых HPV16 и HPV18. Считается, что эти вакцины обеспечивают стерильный иммунитет посредством индуцирования нейтрализующих антител против белков L1. Добавляя VLP на основе L1 из дополнительных типов ВПЧ высокого риска, можно еще больше расширить защиту, предоставляемую такими вакцинами.
[0007] Однако, в то время как такие вакцины могут предупреждать начальную инфекцию (т. е. они обеспечивают
профилактику), отсутствуют данные о положительном эффекте в отношении уже развившихся очагов в половых органах, вызванных HPV16 и HPV18, поэтому они не считаются лечебными вакцинами против ВПЧ (Hildesheim et al., 2007, JAMA 298: 743-53).
[0008] Несмотря на внедрение этих профилактических вакцин, большое количество людей уже заражены или для них все еще существует опасность развития упорных инфекций, вызванными ВПЧ с высоким уровнем риска, и, следовательно, они подвержены риску возникновения онкологических заболеваний. Лечебные вакцины для ликвидации развившихся инфекций, вызванных ВПЧ, и связанных с ними заболеваний являются насущной неудовлетворенной потребностью в медицине.
[0009] Были описаны некоторые попытки решить эту проблему. Например, клинические испытания проводили в отношении различных стратегий вакцинации, таких как составной белок, состоящий из белка теплового шока (Hsp) из Mycobacterium bovis и Е7 HPV-16, или составного белка Еб, Е7 и L2 из HPV-16 и HPV-18, химерные VLP L1-E7, рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие либо Еб и Е7 вирусов HPV-16 и HPV-18, либо Е2 вируса папилломы крупного рогатого скота, ДНК-вакцины, экспрессирующие CTL-эпитопы Еб и Е7 HPV-16 и HPV-18, живые аттенуированные листерии моноцитогенные (Lm), которые секретируют антиген Е7 HPV-16, и синтетические длинные пептиды (SLP), содержащие пептиды Еб и Е7 HPV-16. Хотя некоторые из этих подходов демонстрируют некоторую, но ограниченную, клиническую эффективность, большинство из них потерпело неудачу, что свидетельствует о необходимости совершенствования существующих в настоящее время стратегий.
[0010] Интеграция генов, кодирующих ранние ВПЧ белки Еб и Е7, является необходимой стадией в процессе от инфицирования до рака, и непрерывная экспрессия Еб и Е7 необходима для поддержания опухолевого фенотипа раковых клеток шейки матки. Поэтому Еб и Е7 считаются хорошими мишенями для терапевтической вакцинации. Как уже упоминалось, некоторые исследования показали, что терапевтическая вакцинация женщин, инфицированных ВПЧ высокого риска, может вызывать регрессию существующих очагов. Renter et al продемонстрировали, что с помощью SLP,
полученных из белков Еб и Е7 ВПЧ 16 типа (HPV16), и адъюванта в качестве терапевтической вакцины можно добиться стойкой и полной регрессии у 47% пациентов с интраэпителиальной неоплазией вульвы (VIN) (Renter et al., 2009, N Engl J Med 361: 1838-47). Аналогичным образом, исследование, в котором вакцину на основе белка (TA-CIN, состоящую из составного белка HPV16 Еб, Е7 и L2) комбинировали с местной иммуномодуляцией у 2/3 пациентов с VIN, продемонстрировало полную регрессию у 63% пациентов (Daayana et al. , 2010, Br J Cancer 102: 1129-36) . Возможные недостатки синтетических длинных пептидов в качестве вакцины включают возможность производства в промышленном масштабе и связанные с этим затраты, потребность во вспомогательном лекарственном средстве, потенциально вызывающем реакцию, что может вызывать неблагоприятные эффекты, связанные с иммунизацией (особенно боль и припухлость). В связи с высоким уровнем дискомфорта маловероятно, что SLP будут использоваться на ранней стадии заболевания, когда самопроизвольный иммунный клиренс все еще высок. Аналогичным образом, в связи с необходимостью местного лечения имиквимодом в случае лечения TA-CIN, переносимость является важным вопросом, так как большинство женщин испытывают местные и системные побочные эффекты, продолжающиеся на протяжении лечения имиквимодом, что может повлиять на повседневную деятельность.
[ООН] Возможной альтернативой для вакцинации является применение вакцинации на основе нуклеиновых кислот, таких как ДНК-вакцины или вирусные вакцины, кодирующие белок Еб и/или Е7 HPV.
[0012] Однако ВПЧ белки Еб и Е7 обладают онкогенным потенциалом и, таким образом, вакцинация вакцинами, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие эти белки, представляет собой опасность индуцирования клеточной трансформации вследствие возможности длительной экспрессии антигенов.
[0013] Поэтому в случае генетической вакцинации можно применять неонкогенные/детоксифицированные варианты Еб и/или Е7, чтобы исключить любую опасность клеточной трансформации в результате вакцинации. Устранения онкогенного потенциала Еб и Е7
дикого типа обычно достигают с помощью делеции и/или замены остатков, которые, как известно, важны для функционирования этих белков (например, Smahel et al. , 2001, Virology 281:231-38; Yan et al., 2009, Vaccine 27: 431-40; Wieking et al. , 2012, Cancer Gene Ther 19: 667-74) . Однако недостатком этих подходов является то, что с ними связан риск удаления важных Т-клеточных эпитопов из белков и/или введения новых нежелательных Т-клеточных эпитопов в них и, таким образом, они могут не приводить к требуемому иммунному ответу.
[0014] В альтернативной стратегии для устранения
онкогенного потенциала Еб и Е7 HPV16 были сконструированы
"перетасованные" варианты (т. е. полипептиды, в которых нарушен
порядок фрагментов белка дикого типа) белков Еб и Е7 (например,
Ohlschlager et al. , 2006, Vaccine 24: 2880-93; Oosterhuis et
al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406; Oosterhuis et al. , 2012,
Hum Gen Ther 23: 1301-12). Однако эти подходы по-прежнему
требуют получения, составления и введения многих молекул для
обеспечения включения всех возможных эпитопов обоих белков Еб и
Е7, что приводит к субоптимальной логистике и относительно
высоким затратам, и, кроме того, с помощью описанных стратегий
вводят потенциально сильные неприродные эпитопы, которые не
присутствуют в Еб и Е7, и поскольку иммунные ответы могут быть
перенаправлены от соответствующих эпитопов Е6/Е7 к этим
неприродным эпитопам, при этом описанные конструкции могут не
иметь оптимальных иммунологических характеристик. Также была
описана терапевтическая ДНК-вакцина, экспрессирующая
внутриклеточно нацеленный составной белок со встроенным генетическим адъювантом и ''перетасованными'' фрагментами Еб и Е7 как HPV16, так и HPV18, а также повышенная с помощью электропорации иммунизация с применением ее вызывает значительный специфичный в отношении Е6/Е7 Т-клеточный ответ у пациентов с CIN3 (Kim et al., 2014).
[0015] Таким образом, в данной области техники по-прежнему требуются лечебные вакцины против ВПЧ, предпочтительно имеющие меньше недостатков ранее описанных подходов.
Краткое описание изобретения
[0016] В настоящем изобретении предложены один или несколько векторов, вакцин и комбинаций вакцин, которые могут применяться для того, чтобы вызывать иммунный ответ против ВПЧ-инфекций. В различных вариантах осуществления в настоящее изобретение включены молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды, или составные белки, содержащие практически все возможные Т-клеточные эпитопы онкобелков Еб и Е7 HPV16 или HPV18, однако при этом они характеризуются сильно уменьшенной (по сравнению с Еб и Е7 дикого типа), вплоть до необнаруживаемой, трансформирующей активностью, с помощью включения фрагментов белков Еб и Е7 с "перетасованным" порядком, и в то же время содержат минимальное число нежелательных сильных неоэпитопов. Эти молекулы отличаются от молекул, ранее представленных другими исследователями. В настоящем изобретении предложены молекулы, которые можно применять в лечебных вакцинах против либо HPV16, либо HPV18.
[0017] В различных дополнительных вариантах осуществления векторы, вакцины и комбинации вакцин, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды, или составные белки, содержащие практически все возможные Т-клеточные эпитопы онкобелков Еб и Е7 HPV16 или HPV18, однако при этом характеризующиеся сильно уменьшенной (по сравнению с Еб и Е7 дикого типа), вплоть до необнаруживаемой, трансформирующей активностью. По меньшей мере один аспект осуществлен в виде векторов, вакцин и комбинаций вакцин, содержащих фрагменты белков Еб и Е7, которые были "перетасованы", но которые при этом содержат минимальное число нежелательных сильных неоэпитопов. Эти молекулы отличаются от молекул, ранее представленных другими исследователями. В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды или составные белки, кодируемые векторами, вакцинами или комбинациями вакцин дополнительно содержат белок Е2 HPV16 или HPV18 или его фрагменты. В настоящем изобретении предложены молекулы, которые можно применять в терапевтических вакцинах против либо HPV16, либо HPV18. Такие молекулы можно также комбинировать в терапевтических вакцинах как против HPV16, так и против HPV18.
[0018] В некоторых вариантах осуществления в изобретении, касающемся HPV16, предложены векторы вакцины и комбинации вакцин, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 8 или их комбинации. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления в изобретении, касающемся HPV16, предложены векторы вакцины и комбинации вакцин, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления для HPV18 в изобретении предложены векторы вакцины и комбинации вакцин, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 31 или их комбинации. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления для HPV18 в изобретении предложены векторы вакцины и комбинации вакцин, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 22.
[0019] В некоторых аспектах кодируемый полипептид данного
изобретения может дополнительно содержать лидерную
последовательность.
[0020] В определенных вариантах осуществления кодируемый
полипептид содержит по меньшей мере один эпитоп белка Е2 HPV16
или белка Е2 HPV18. Белок Е2 может быть инактивированным,
например в его трансактивирующем и/или ДНК-связывающем домене,
например, с помощью делеции, мутации или посредством структурной
перестройки различных частей белка. В определенных вариантах
осуществления для HPV16 кодируемый полипептид содержит
аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28.
В определенных вариантах осуществления для HPV18 кодируемый
полипептид содержит аминокислотную последовательность,
изложенную под SEQ ID NO: 31.
[0021] В определенных вариантах осуществления для HPV16
последовательность нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID N0: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или их комбинации. В определенных предпочтительных вариантах осуществления для HPV16 последовательность нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID N0: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 24.
[0022] В других предпочтительных вариантах осуществления для HPV18 последовательность нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 или их комбинации. В определенных предпочтительных вариантах осуществления для HPV18 последовательность нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 25.
[0023] В настоящем изобретении также предложены вакцины и комбинации вакцин, содержащие рекомбинантный вирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемое формообразующее. Рекомбинантный вирусный вектор содержит одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, где последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с промотором.
[0024] В определенных вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, такой как рекомбинантный поксвирусный вектор или рекомбинантный аденовирусный вектор. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный аденовирус или рекомбинантный MVA вирус. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления MVA вирус-вектор представляет собой MVA-BN или его производные. В дополнительных к этому предпочтительных вариантах осуществления аденовирусный вектор выбирают из гАо!2б и rAd35, и особенно предпочтительно он представляет собой гАо!2б.
[0025] В определенных предпочтительных вариантах осуществления представлена комбинация вакцин, включающая в себя:
а) первую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество одного или нескольких рекомбинантных аденовирусных
векторов, вместе составляющих первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
Ь) вторую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где вектор на основе MVA содержит MVA-BN или его производное.
[0026] Согласно вариантам осуществления данного изобретения первый полипептид и третий полипептид могут быть одинаковыми или разными. Например, один из первого и третьего полипептидов может содержать дополнительную аминокислотную последовательность, которая отсутствует в другом полипептиде, или первый и третий полипептиды могут содержать дополнительные аминокислотные последовательности, которые отличаются друг от друга. Сходным образом второй и четвертый полипептиды могут быть одинаковыми или разными. Первая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть одинаковыми или разными. Например, первая и третья нуклеиновые кислоты могут быть разными, потому что они кодируют разные первый и третий полипептиды и/или используют разные кодоны для одинаковых аминокислот. Сходным образом второй и четвертый нуклеиновые кислоты могут быть одинаковыми или разными.
[0027] В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления первая вакцина и вторая вакцина обоих а) и Ь) каждая дополнительно содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую пятый полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и нуклеиновую кислоту, кодирующую шестой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31. Как пятый, так и шестой полипептиды могут экспрессироваться независимо или, предпочтительно, как часть составного белка, содержащего полипептид Еб и В7 данного изобретения.
[0028] В других дополнительных предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1 обеих первой и второй вакцин, дополнительно кодирует пятый полипептид. Предпочтительно, чтобы полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и пятый полипептид экспрессировались вместе в составном белке, таком как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:3 или в SEQ ID N0:5. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 2 0 обеих первой и второй вакцин, предпочтительно кодирует шестой полипептид. Предпочтительно, чтобы полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, и шестой полипептид экспрессировались вместе в составном белке, таком как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:22.
[0029] В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0:1 одной или обеих первой и второй вакцин, являлся частью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3. В дополнительных к этому предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 2 0 одной или обеих первой и второй вакцин, являлся частью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22.
[0030] В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности,
представленной в SEQ ID NO: 2, и нуклеиновая кислота, кодирующая
полипептид, содержащий аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 20, по меньшей мере на 90% идентична
полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:
21. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота,
кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
[0031] В настоящем изобретении также предложен способ индуцирования иммунного ответа против HPV, в частности HPV16 или HPV18, или HPV16 и HPV18 у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту вектора, вакцины или комбинации вакцин в соответствии с данным изобретением. В настоящем изобретении также предложены вектор, вакцина или комбинация вакцин в соответствии с данным изобретением для применения при индуцировании иммунного ответа против HPV, в частности HPV16 или HPV18, или обоих HPV16 и HPV18, у субъекта, нуждающегося в этом.
[0032] В определенных вариантах осуществления векторы или вакцины в соответствии с настоящим изобретением вводят субъекту более одного раза.
[0033] В определенных вариантах осуществления вектор, вакцину или комбинацию вакцин в соответствии с данным изобретением вводят нуждающемуся в этом субъекту предпочтительно субъекту-человеку - по схеме прайм-буст (первичная и поддерживающая вакцины). В предпочтительном варианте осуществления схема прайм-буст включает в себя первичную вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество либо (i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, вместе с фармацевтически
приемлемым носителем; либо (ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Сюда же входит поддерживающая вакцина, содержащая иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара
(MVA), содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, предпочтительно кодирующую два разных полипептида в соответствии с данным изобретение, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
[0 034] В различных других вариантах осуществления схема прайм-буст включает в себя первичную вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара
(MVA), содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Сюда же входит поддерживающая вакцина, содержащая иммунологически эффективное количество либо (i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; либо (ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в соответствии с данным изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
[0035] В настоящем изобретении также предложен способ лечения любого из: упорной инфекции, вызванной HPV (в частности упорной инфекции, вызванной HPV16 или HPV18), интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки
(такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC)), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у субъекта, нуждающегося в лечении, при этом способ предусматривает введение субъекту вектора, вакцины или комбинации вакцин в соответствии с данным изобретением. В настоящем изобретении также предложены вектор, вакцина или комбинация вакцин в соответствии с данным изобретением для применения в лечении любого из: упорной инфекции, вызванной HPV
(в частности упорной инфекции, вызванной HPV16 или HPV18), интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки (такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC)), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у субъекта, нуждающегося в лечении.
Краткое описание графических материалов
[0036] Вышеизложенное краткое описание, а также нижеследующее подробное описание настоящего изобретения будут более понятны при их рассмотрении в сочетании с прилагаемыми графическими материалами. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, показанными на графических материалах.
[0037] Фиг. 1. Экспрессия составных белков Еб и Е7 HPV16. Клетки НЕК-2 93Т временно трансфицировали ДНК-векторами, экспрессирующими трансгены, указанные над фигурой. Через 2 4 ч. после трансфекции клетки собирали, и клеточные экстракты анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом к Е7 HPV16 (рисунок вверху). Контроль для нанесения, показывающий NF-kB (рисунок внизу), подтверждает аналогичное нанесение клеточных лизатов на всех дорожках. Слева показан маркер молекулярного веса. Ожидаемые размеры составных белков: E6E7SH прим. 38 кДа; E2E6E7SH и E6E7E2SH прим. 75 кДа, LSE2E6E7SH прим. 78 кДа.
[0038] Фиг. 2. Образование колонии в мягком агаре. А) Схематическое изображение постановки анализа в мягком агаре. В)
Иллюстративные микроскопические изображения при 4 0-х увеличении клеток в агаре через шесть недель после посева. Белые стрелки указывают на колонии, наблюдаемые у трансфицированных Е7 wt клеток. С) Определение количества колоний через шесть недель после посева в агар с использованием Gelcount(tm) и соответствующего программного обеспечения. *: р <0,05 (модель регрессии Пуассона); **: не самая меньшая эффективность
(обобщенная линейная модель с пределом не самой меньшей эффективности, составляющим 5%).
[0039] Фиг. 3. E6E7SH HPV16 с утраченными активностями Еб и Е7. А) Иллюстративный вестерн-блоттинг, на котором демонстрируется отсутствие разрушения р53 с помощью E6E7SH. Клетки человека NCI-H12 99 с нефункциональным р53 совместно трансфицировали плазмидой, экспрессирующей р53, в комбинации с плазмидой, экспрессирующей Еб HPV16 дикого типа, E6E7SH HPV16 или пустым вектором. Отсутствие TF указывает на нетрансфицированные клетки. Через 2 4 часа после трансфекции получали клеточные лизаты, и 3 0 мкг общего белка наносили на гель. Рисунок вверху - окрашивание р53, средний рисунок окрашивание Еб, рисунок внизу - окрашивание NF-kB (контроль для нанесения). (В) Количественная оценка уровней р53 в четырех независимых анализах. Сигнал р53 нормализовали по сигналу NF-KB. С) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий отсутствие разрушения pRb с помощью E6E7SH. Клетки Saos-2 с нефункциональным pRb трансфицировали плазмидой, экспрессирующей pRb, в комбинации с плазмидой, экспрессирующей Е7 HPV16 дикого типа, E6E7SH HPV16 или пустым вектором. Отсутствие TF указывает на нетрансфицированные клетки. Через 2 4 часа после трансфекции получали клеточные лизаты, и 10 мкг общего белка наносили на гель. Рисунок вверху - окрашивание pRb, средний рисунок окрашивание Е7, рисунок внизу - окрашивание NF-KB (контроль для нанесения). D) Количественная оценка уровней pRb в четырех независимых анализах. Сигнал pRb нормализовали по сигналу NF-KB. *: р <0,05 (модели ANOVA); **: не меньшая эффективность
(тестирование основано на доверительном интервале, составляющем
95%, полученном из моделей ANOVA. Предел не меньшей эффективности составлял 75%).
[0040] Фиг. 4. E6E7SH HPV16 не иммортализует первичные эпидермальные кератиноциты человека. Первичные эпидермальные кератиноциты человека трансдуцировали лентивирусами, кодирующими любое из открытой рамки считывания Еб и Е7 дикого типа из HPV16 (Е6Е7 wt), последовательности E6E7SH HPV16 или eGFP. Нетрансдуцированные донорные клетки использовали в качестве контроля. Только экспрессия Е6Е7 wt индуцирует иммортализацию первичных кератиноцитов, что подтверждается увеличенной продолжительностью жизни и активацией hTERT примерно в 2 0 0-й день (не показано). Обозначение в виде крестика указывает, что клетки погибали при старении, и их нельзя было в дальнейшем культивировать. Подробности см. в примере 2. Аналогичные результаты были получены у двух дополнительных доноров (не показаны).
[0041] Фиг. 5. Иммунный ответ, индуцированный E6E7SH HPV16
после ДНК-иммунизации - анализ IFNy ELISPOT. А. Схема
иммунизации. Мышей CB6F1 иммунизировали ДНК-плазмидами,
экспрессирующими E6E7SH HPV16, или плазмидами, не
экспрессирующими трансген (контроль). Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов, соответствующими Е7. В. Специфичные в отношении Е7 HPV16 иммунные ответы у отдельных мышей, измеренные с помощью анализов IFN ELISPOT, представлены как пятнообразующие единицы (SFU) на 106 спленоцитов.
[0042] Фиг. б. Иммуногенность E6E7SH HPV16 - анализ IFNy ELISPOT. (А) . Схема иммунизации. Мышей иммунизировали с помощью аденовекторов со вставками, как указано. Е7-специфические ответы анализировали при помощи IFNy ELISPOT в момент времени две недели (В) и в момент времени восемь недель (С) (представлены как пятнообразующие единицы (SFU) на 106 спленоцитов). Темные кружки представляют собой мышей, иммунизированных дозой, составляющей 1* 1010 vp, а светлые кружки представляют собой мышей,
иммунизированных с помощью 5*109 vp. Черная полоса представляет собой среднее геометрическое ответов. Пунктирная линия указывает нижний предел обнаружения в анализе ELISPOT. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли на данных с логарифмическим преобразованием. *: р <0,05. Подробности см. в примере 3.
[0043] Фиг. 7. Иммуногенность E2E6E7SH HPV16 - окрашивание Е7-тетрамера. (А). Схема иммунизации. Мышей CB6F1 иммунизировали с помощью 1*1010 vp аденовекторов, экспрессирующих трансгены, как указано. Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты анализировали в отношении присутствия клеток CD8 + , способных взаимодействовать с тетрамерами Е749_57-Н2-Db (В). Процент положительных по Е7-тетрамеру CD8+ Т-клеток указан на оси у. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли на данных с логарифмическим преобразованием, при этом различия между различными вариантами E6E7SH не были статистически значимыми.
[0044] Фиг. 8. Иммуногенность E2E6E7SH HPV16 - анализ IFNy ELISPOT. (А) . Схема иммунизации. Мышей CB6F1 иммунизировали с помощью аденовекторов, экспрессирующих трансгены, указанные под рисунками В и С. Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов, соответствующими Е2 (В) , Еб (не показано) или Е7 (С) . Ответы представлены в виде SFU на 106 спленоцитов. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли на данных с логарифмическим преобразованием. Ответ Е2, индуцированный аденовекторами, кодирующими только Е2, выше, чем ответ, индуцированный полипептидами по настоящему изобретению, которые включают фрагменты Еб и Е7. Различия были значимыми для Е2 по сравнению с E2E6E7SH и для Е2 по сравнению с E6E7E2SH (*: р <0,05). Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли на данных с логарифмическим преобразованием.
[0045] Фиг. 9. Устойчивые иммунные ответы в отношении HPV16
у иммунизированных мышей. В частности, (А) Схема иммунизации.
Мышей CB6F1 иммунизировали с помощью 1* 1010 vp векторов Ad35,
экспрессирующих варианты LSE2E6E7SH HPV16, E2E6E7SH HPV16,
E6E7SH HPV16, или с помощью аденовекторов, не экспрессирующих
трансген (пустых). Образцы крови брали каждые две недели для
определения процента Е7-специфичных CD8+ Т-клеток с помощью
окрашивания тетрамера. (В) Иммунные ответы через две недели
после иммунизации. Вектор, включающий лидерную
последовательность, индуцировал более высокий ответ, чем векторы без лидерной последовательности; LSE2E6E7SH по сравнению с E2E6E7SH (*: р <0,05). (С) Кинетика ответов. Апостериорный статистический анализ ANOVA с поправками Бонферрони выполняли на данных с логарифмическим преобразованием с использованием массива данных за 2 недели. Ответ на Е7, индуцируемый молекулами, включающими Е2, имеет тенденцию быть более высоким по сравнению с молекулой без Е2, хотя результаты не были статистически значимыми.
[0046] Фиг. 10. Применение различных аденовирусных векторов для стимулирования иммунных ответов. (А) . Схема иммунизации. Мышей CB6F1 иммунизировали с помощью вектора Ad2 6, экспрессирующего E2E6E7SH HPV16 (HPV16-Tx), или с помощью вектора Ad26, не экспрессирующего трансген (пустого). Через две недели иммунизацию повторяли с помощью векторов на основе Ad35, как указано ниже на фигуре. Через четыре недели после второй иммунизации мышей умерщвляли, и образцы крови использовали для определения процента Е7-специфичных CD8+ Т-клеток с помощью окрашивания тетрамера (В) . * обозначает сравнение Ad2 6.HPV16-Tx/Ad35.HPV1б-Тх и Ad2б.HPV1б-Тх/пустой Ad35, р <0,05 (Т-критерий Стьюдента на данных с логарифмическим преобразованием, с альфа=0,01 для множественных сравнений).
[0047] Фиг. 11. Клеточная иммуногенность E2E6E7SH HPV16 у
макаков-резус. (А) Схема иммунизации. Макаков-резус
иммунизировали в 0-й день. Восемь животных получали Ad2 6.HPV16-E2E6E7SH и два контрольных животных получали пустой Ad2 6 путем внутримышечной иммунизации (i.m.). Поддерживающую иммунизацию (Ad2б.HPV16-E2E6E7SH или пустым Ad26) проводили через 8 недель.
Через 16 недель животным проводили вторую поддерживающую иммунизацию векторами Ad35, экспрессирующими тот же E2E6E7SH HPV16, в то время как контрольные животные получали пустой Ad35. Доза аденовекторов составляла 1* 1011 vp на иммунизацию. Образцы крови брали в нескольких временных точках. (В) Клеточные иммунные ответы в РВМС измеряли с помощью IFNy ELISPOT. РВМС стимулировали с помощью пептидных пулов, соответствующих Е2, Еб или Е7 HPV16, и отображали количество пятнообразующих единиц (SFU) в 1* 106 РВМС. У животных с пустым контролем (п=2) не было выявлено ответа. Подробности см. в примере 4.
[0048] Фиг. 12. Терапевтический эффект аденовекторов,
экспрессирующих HPV16-E2E6E7SH. (А) Инъекция ТС-1 и схема
иммунизации. Мышам CB6F1 подкожно вводили 1* 105 ТС-1 клеток в 0-й
день. Через шесть дней, когда опухоли можно было пальпировать,
мышей иммунизировали двумя SLP, предусматривающими
иммунодоминантные эпитопы Еб и Е7 HPV16 (т. е. Еб HPV16, аа41-б5 (KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN; SEQ ID NO: 18) иЕ7 HPV16, аа 4 3-77 (GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 19) ) в концентрации, составляющей 150 мкг, в конечном объеме, составляющем 200 мкл, 0,9% солевого раствора, дополненного 5 нмоль ODN1826-CpG (В) или Ad2б.HPV16-E2E6E7SH (С) . Контрольные мыши получали либо только CpG (D) , либо пустой Ad26 (Е) . Всех мышей подвергали поддерживающей иммунизации на 20-й день. Мышей, которые получали векторы Ad2 6 при примирующей иммунизации, впоследствии иммунизировали соответствующими векторами Ad35. Другие мыши получали SLP с добавленным CpG в качестве адъюванта или только CpG, как при первичных иммунизациях. (В-Е) Измерение опухоли у мышей, которым вводили ТС-1. Объем опухоли рассчитывали как (ширина2 * длина)/2. Мышей умерщвляли, когда объемы опухолей превышали 1000 мм3. Двух мышей пришлось умертвить из-за потери веса более 20% (обозначены звездочками). (F-G) Увеличенное изображение рисунков В и С в первые 35 дней. (Н) Выживаемость после инъекции ТС-1. Выживаемость мышей, обработанных Ad.HPV16-E2E6E7SH существенно повышалась по сравнению с мышами, иммунизированными SLP и CpG (логарифмический
ранговый критерий р <0,05). Три мыши, иммунизированные Ad.HPV16-E2E6E7SH, не имели опухолей в конце эксперимента (в 92-й день).
[0049] Фиг. 13. При использовании аденовирусных векторов, несущих трансгены, кодирующие либо HPV Ад, либо LSE2E6E7SH, показаны повышенные выходы вирусов в клетках, способных подавлять экспрессию трансгена. А) Анализ выхода вируса для векторов Ad35. Клетки PER.Сб, PER.C6/CymR и PER.Сб/TetR инфицировали векторами Ad35, несущими трансгены, кодирующие GFP-Luc или HPVAg. Эти трансгены находятся под управлением промоторов CMV, содержащих либо СиО, либо TetO. Выходы вируса определяли через четыре дня после инфицирования Ad35 с помощью способа на основе гексон-специфичной qPCR. В) Анализ выхода вируса для векторов Ad26. Клетки PER.C6 и PER.Сб/TetR инфицировали векторами Ad2 6, несущими трансгены, кодирующие GFP-Luc, HPVAg или LSE2E6E7SH, все из которых находятся под управлением промоторов CMV, содержащих TetO. Выходы вируса определяли через три дня после инфицирования Ad2 6 с помощью способа на основе гексон-специфичной qPCR. Подробности см. в примере б.
[0050] Фиг. 14. Применение репрессорной системы для подавления экспрессии трансгена в ходе продуцирования вектора предотвращает нестабильность кассеты трансгена в аденовирусном векторе, несущем трансген, кодирующий HPVAg. Вектор Ad35, экспрессирующий HPVAg, под контролем CMVCuO "спасали" с помощью трансфекции ДНК на клеточных линиях либо PER.C6, либо PER.C6/CymR. Полученные в результате вирусные бляшки собирали -по пять на клеточную линию - и использовали для последовательных циклов инфицирования соответствующих клеточных линий. А) Анализ целостности области векторной кассеты трансгена с помощью ПЦР после 10 пассажей вируса. Продукты ПЦР, полученные из вирусных изолятов, пассированных на PER.C6 и PER.C6/CymR, показаны соответственно на рисунках в середине и справа. Наблюдаемые полноразмерные продукты ПЦР, полученные для пассированных на PER.Сб вирусных изолятов 1, 2, 4 и 5, и таковые, обнаруженные для изолятов с 1 по 5, пассированных на PER.C6/CymR, анализировали с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру. Анализ
следов хроматограммы (не показано) выявил, что все изоляты, выращенные на PER.C6, но не те, которые выращены на PER.C6/CymR, содержали либо небольшие делеции со сдвигом рамки считывания, либо мутации с образованием преждевременного стоп-кодона в кодирующей последовательности для HPVAg. В) Анализ способности векторов экспрессировать HPVAg после семи вирусных пассажей. Клетки А54 9 трансдуцировали вирусными изолятами, выращенными на PER.C6 и PER.C6/CymR, и экспрессию HPVAg анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела, специфичного в отношении Е7 HPV16. Прогнозируемый размер HPVAg составляет 8 3 кДа. Подробности см. в примере б.
[0051] Фиг. 15. Экспрессия составных белков Еб и Е7 HPV18. Клетки НЕК-2 93Т временно трансфицировали ДНК-векторами, экспрессирующими трансгены, указанные на фигуре выше. Через 24 ч. после трансфекции клетки собирали, и клеточные экстракты анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом к Еб HPV18 (рисунок вверху). Контроль для нанесения, показывающий NF-kB (рисунок внизу), подтверждает аналогичное нанесение клеточных лизатов на обеих дорожках. Слева показан маркер молекулярного веса, и стрелки указывают составные белки. Ожидаемые размеры: E6E7SH прим. 38 кДа; E2E6E7SH прим. 75 кДа.
[0052] Фиг. 16. Отсутствие образования колонии в мягком агаре с помощью сконструированной конструкции E6E7SH HPV18. А) Иллюстративные микроскопические изображения при 4 0-х увеличении клеток в агаре через шесть недель после посева. Большие колонии наблюдали у трансфицированных Е7 wt клеток. В) Определение количества колоний через шесть недель после посева в агар с использованием Gelcount(tm) и соответствующего программного обеспечения. *: р <0,05 (модель регрессии Пуассона); **: не самая меньшая эффективность (обобщенная линейная модель с пределом не самой меньшей эффективности, составляющим 5%).
[0053] Фиг. 17. E6E7SH HPV18 утратил способность разрушать р53 и pRb. А) Иллюстративный вестерн-блоттинг, демонстрирующий отсутствие разрушения р53 с помощью E6E7SH HPV18. Клетки человека NCI-H12 99 с нефункциональным р53 совместно трансфицировали плазмидой, экспрессирующей р53, в комбинации с
плазмидой, экспрессирующей Еб HPV18 дикого типа, E6E7SH или пустым вектором. Отсутствие TF указывает на нетрансфицированные клетки. Через 2 4 часа после трансфекции получали клеточные лизаты, и 3 0 мкг общего белка наносили на гель. Рисунок вверху -окрашивание р53, средний рисунок - окрашивание Еб, рисунок внизу - окрашивание NF-kB (контроль для нанесения). (В) Количественная оценка уровней р53 в четырех независимых анализах. Сигнал р53 нормализовали по сигналу NF-KB. С) Вестерн-блоттинг, на котором демонстрируется отсутствие разрушения pRb с помощью E6E7SH HPV18. Клетки Saos-2 с нефункциональным pRb трансфицировали плазмидой, экспрессирующей pRb, в комбинации с плазмидой, экспрессирующей Е7 HPV18 дикого типа, E6E7SH или пустым вектором. Отсутствие TF указывает на нетрансфицированные клетки. Через 2 4 часа после трансфекции получали клеточные лизаты, и 10 мкг общего белка наносили на гель. Рисунок вверху - окрашивание pRb, средний рисунок - окрашивание Е7, рисунок внизу окрашивание NF-KB (контроль для нанесения). D) Количественная оценка уровней pRb в четырех независимых анализах. Сигнал pRb нормализовали по сигналу NF-кВ. *: р <0,05 (модели ANOVA); **: не меньшая эффективность (тестирование основано на доверительном интервале 95%, полученном из моделей ANOVA. Предел не самой меньшей эффективности составлял 75%).
[0054] Фиг. 18. E6E7SH HPV18 не иммортализует первичные
генитальные кератиноциты человека. Первичные генитальные
кератиноциты человека трансдуцировали лентивирусами, кодирующими
любое из открытой рамки считывания Еб и Е7 дикого типа из HPV18
(Е6Е7 wt), последовательности E6E7SH или eGFP.
Нетрансдуцированные донорные клетки использовали в качестве контроля. Только экспрессия Е6Е7 wt HPV18 индуцирует иммортализацию первичных кератиноцитов, что подтверждается увеличенной продолжительностью жизни (и активацией hTERT примерно в 2 0 0-й день, данные не показаны). Обозначение в виде крестика указывает, что клетки погибали при старении, и их нельзя было в дальнейшем культивировать. Подробности см. в примере 8. Аналогичные результаты были получены у двух
дополнительных доноров (данные не показаны).
[0055] Фиг. 19. Иммуногенность вариантов E6E7SH HPV18
окрашивание внутриклеточных цитокинов. Мышей CB6F1
иммунизировали с помощью аденовекторов, экспрессирующих трансгены, указанные внизу рисунков. Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов, соответствующими Еб HPV18. Ответы представлены в виде процента IFN-положительных CD8+ Т-клеток.
[0056] Фиг. 20. Иммуногенность комбинированных векторов HPV16 и HPV18 - анализ IFNy ELISPOT. Мышей CB6F1 иммунизировали с помощью аденовекторов (тип 2 6), экспрессирующих трансгены E2E6E7SH как из HPV16 (кодирующего SEQ ID NO: 3), так и из HPV18 (кодирующего SEQ ID NO: 22). Через четыре недели после первичной иммунизации мышам проводили гетерологичную поддерживающую иммунизацию аденовирусными векторами типа 35 с теми же трансгенами E2E6E7SH. Через две недели после поддерживающей иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов, соответствующими Е7 HPV16 (А) или Еб HPV18 (В) . Ответы представлены в виде SFU на 106 спленоцитов.
[0057] Фиг. 21. Клеточная иммуногенность комбинированной вакцины против HPV16 и HPV18 у макаков-резус. Макаков-резус иммунизировали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 11, комбинацией сконструированных конструкций HPV16 и HPV18. В день 0: восемь животных получали смесь Ad2б.HPV16-E2E6E7SH и Ad26.HPV18-E2E6E7SH с помощью внутримышечной иммунизации (i.m). поддерживающую иммунизацию теми же векторами проводили через 8 недель. Через 16 недель животным проводили вторую поддерживающую иммунизацию с помощью смеси двух векторов Ad35, экспрессирующих те же составные белки E2E6E7SH HPV16 и HPV18. Доза аденовекторов составляла 1*1011 vp на вектор на иммунизацию. Образцы крови брали в нескольких временных точках. Клеточные иммунные ответы в РВМС измеряли с помощью IFNy ELISPOT. РВМС стимулировали с помощью пептидных пулов, соответствующих Е2, Еб или Е7 HPV16 и
HPV18, и определяли количество пятнообразующих единиц (SFU) в 1*106 РВМС. На фигуре показаны суммарные ответы для всех шести тестируемых пептидных пулов через 2 недели после каждой иммунизации. Подробности см. в примере 11.
[0058] Фиг. 22. Терапевтический эффект комбинированных аденовекторов, экспрессирующих E2E6E7SH HPV16 и HPV18. Мышам C57BL/6 подкожно вводили 5*104 ТС-1 клеток в 0-й день. Через шесть дней, когда опухоли можно было пальпировать, мышей иммунизировали с помощью Ad2б.HPV16-E2E6E7SH или смеси Ad2 б.HPV16-E2E6E7SH и Ad2б.HPV18-Е2Е6E7SH. Контрольные мыши получали пустой Ad2 6. Все мыши получали поддерживающую иммунизацию на 2 0-й день соответствующими векторами Ad35. Объем опухоли рассчитывали как (ширина2 * длина)/2. Мышей умерщвляли, когда объемы опухолей превышали 1000 мм3. На графике показана выживаемость после инъекции ТС-1. Три мыши, иммунизированные комбинированной вакциной против HPV16+HPV18, не имели опухолей в конце эксперимента. Медиана времени выживаемости мышей, обработанных Ad.HPV16-E2E6E7SH, значительно не отличалась по сравнению с мышами, иммунизированными Ad.HPV16/18-E2E6E7SH.
[0059] Фиг. 23. Применение векторов на основе модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA) для поддерживания иммунных ответов. (А) . Схема иммунизации. Мышей CB6F1 иммунизировали смесью вектора Ad2 6, экспрессирующего E2E6E7SH HPV16 (HPV16), и вектора Ad26, экспрессирующего E2E6E7SH HPV18, или с помощью вектора Ad26, не экспрессирующего трансген (пустого). Спустя восемь недель иммунизацию повторяли, используя вектор MVA-BN или Ad35, экспрессирующий тот же антиген, что и векторы Ad2 6. Контрольным животным проводили поддерживающую иммунизацию, используя вектор MVA-BN, не экспрессирующий трансген (контроль). Через две недели после второй иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов, соответствующими Е2, Еб или Е7 HPV16 и HPV18. На (В) показан полный IFNy ответ в каждой группе в виде SFU на 106 спленоцитов. (Т-критерий Стьюдента на данных с логарифмическим
преобразованием, с альфа=0,05, исключая отрицательный контроль).
[0060] Фиг. 24. Клеточная иммуногенность, индуцированная с помощью превичной Ао!2б и поддерживающей MVA иммунизации у макаков-резус. Макаков-резус иммунизировали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 24А, комбинацией созданных конструкций HPV16 и HPV18. В день 0: Несколько животных получали смесь Ad2 б.HPV16-E2E6E7SH и Ad2б.HPV18-Е2Е6E7SH путем внутримышечной иммунизации (i.m). Поддерживающую иммунизацию с использованием MVA-BN, кодирующего векторы HPV16 E2E6E7SH и HPV18 E2E6E7SH, производили на 8 неделе. Доза аденовекторов составляла 1* 1011 vp для каждого вектора. Доза MVA составляла 1,8 xlO8 TCID50. Образцы крови брали в нескольких временных точках. Клеточные иммунные ответы в РВМС измеряли с помощью IFNy ELISPOT. РВМС стимулировали с помощью пептидных пулов, соответствующих HPV16 Е2 (В), HPV16 Еб (С), HPV16 Е7 (D), HPV18 Е2 (Е), HPV18 Еб (F), HPV18 Е7 (G) , и определяли число пятнообразующих единиц (SFU) в 1* 106 РВМС, как показано на Фиг. 24B-24G, соответственно. На Фиг. 24Н показано число антигенов у каждого животного в каждой точке времени. Отсекаемый предел был принят за 50 SFU на 1*106 РВМС. На Фиг. 241 показаны суммарные ответы для всех шести тестируемых пептидных пулов в разных временных точках. Статистический анализ для рисунков В-Н: Знаковый ранговый критерий Уилкоксона для сравнения 13 недели с 2 неделей, и 2 4 недели с 13 неделей. Для 2-х сравнений применяли поправку по методу Бонферони (исправленные р-значения).
[0061] Фиг. 25. Терапевтический эффект первичной Ad26
иммунизации и поддерживающей иммунизации с использованием либо
Ad35, либо MVA векторов, экспрессирующих E2E6E7SH HPV16 и HPV18.
Мышам C57BL/6 подкожно вводили 5*104 ТС-1 клеток в 0-й день.
Через шесть дней, когда опухоли можно было пальпировать, мышей
иммунизировали смесью Ad2 б.HPV16-E2E6E7SH и Ad2 б.HPV18-Е2Е6E7SH.
Контрольные мыши получали пустой Ad2 6. Мыши получали
поддерживающую иммунизацию в день 2 0 векторами Ad35 или MVA,
кодирующими HPV16/18 E2E6E7SH. Контрольных животных
иммунизировали с использованием MVA, не кодирующим трансген.
Объем опухоли рассчитывали как (ширина2 * длина)/2. Мышей умерщвляли, когда объемы опухолей превышали 1000 мм3. На графике показана выживаемость после инъекции ТС-1. В конце эксперимента у одной мыши, получившей поддерживающую иммунизацию с использованием Ad35.HPV16 E2E6E7SH и Ad35.HPV18 E2E6E7SH, и одной мыши, получившей поддерживающую иммунизацию с использованием MVA-BN HPV16/18 E2E6E7SH, опухоли отсутствовали. Медиана времени выживаемости мышей, получивших поддерживающую иммунизацию с использованием Ad35.HPV16-18-E2E6E7SH, значительно не отличалась от мышей, получивших поддерживающую иммунизацию с использованием HPV16/18-E2E6E7SH.
Подробное описание изобретения
[00 62] Различные публикации, статьи и патенты цитируются или описываются в разделе "Предпосылки изобретения" и во всем описании; при этом каждый из этих литературных источников включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий ит. п., которое было включено в настоящее описание, предназначено для обеспечения контекста настоящего изобретения. Такое обсуждение не является признанием того, что любые или все из этих материалов являются частью предшествующего уровня техники относительно любых раскрытых или заявленных изобретений.
[0063] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В иных случаях определенные термины, используемые в данном документе, имеют значения, изложенные в описании. Все патенты, опубликованные заявки на патент и публикации, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены в данном документе. Следует отметить, что используемые в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если в контексте явно не указано иное.
[0064] Предполагается, если не указано иное, что к любому численному значению, такому как концентрация или интервал
концентраций, описанному в данном документе, во всех случаях применим термин "примерно". Так, численное значение обычно включает в себя значения ± 10% от указанного значения. Например, концентрация 1 мг/мл включает в себя все значения в интервале от 0,9 мг/мл до 1,1 мг/мл. Таким же образом интервал концентраций от 1% до 10% (вес/об.) включает в себя интервал от 0,9%
(вес/об.) до 11% (вес/об.). В данном контексте использование численного интервала однозначно включает в себя все возможные подинтервалы, все численные значения в этом интервале, включая целые числа в таких интервалах и дробные значения, если в контексте явно не указано иначе.
[00 65] В данном изобретении предложены один или несколько векторов, вакцин и комбинаций вакцин, которые могут применяться для того, чтобы вызывать иммунный ответ против ВПЧ-инфекций и связанных с ними заболеваний.
[00 66] Векторы, вакцины и комбинации вакцин вариантов осуществления настоящего изобретения включают в себя молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько полипептидов, которые являются тщательно сконструированными молекулами, содержащими практически полные аминокислотные последовательности Еб и Е7, а в некоторых вариантах осуществления - и Е2, вируса HPV16 в виде фрагментов, "перетасованных" и частично перекрывающихся таким образом, чтобы (в основном) присутствовали все Т-клеточные эпитопы белков Еб и Е7 HPV16. Векторы, вакцины и комбинации вакцин вариантов осуществления настоящего изобретения кроме того включают в себя молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько полипептидов, которые являются тщательно сконструированными молекулами, содержащими практически полные аминокислотные последовательности Еб и Е7, а в некоторых вариантах осуществления - и Е2, вируса HPV18 в виде фрагментов, "перетасованных" и частично перекрывающихся таким образом, чтобы
(в основном) присутствовали все Т-клеточные эпитопы белков Еб и Е7 HPV18. Другими исследователями ранее были описаны молекулы с некоторым потенциалом в качестве вакцин против HPV (например, Renter et al. , 2009, N Engl J Med 361: 1838-47; Daayana et al. ,
2010, Br J Cancer 102: 1129-36; Smahel et al. , 2001, Virology 281: 231-38; Yan et al., 2009, Vaccine 27: 431-40; Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Oosterhuis et al., 2011, Jnt J Cancer 129: 397-406; EP1183368, WO 2013/083287), однако каждая из этих молекул имеет один или несколько недостатков. Векторы, вакцины и комбинации вакцин настоящего изобретения усовершенствованны по меньшей мере в одном и, как правило, в нескольких аспектах по сравнению с ранее описанными подходами. В частности, преимущества настоящего изобретения включают, но не ограничиваются этим: (i) они характеризуются требуемым профилем безопасности, так как молекулы нуклеиновой кислоты характеризуются сильно уменьшенной (по сравнению с нативными белками Еб и Е7), вплоть до необнаруживаемой, трансформирующей активностью; (ii) они представляют собой молекулы с одной нуклеиновой кислотой, которые легко получать в промышленном масштабе экономически осуществимым образом, и не вызывают логистических проблем, в отличие от подходов с многими молекулами; (iii) кодируемые полипептиды вакцин и комбинаций вакцин содержат практически все Т-клеточные эпитопы нативных белков Еб и Е7 HPV16; (iv) конструирование кодируемых полипептидов сводит к минимуму внедрение нежелательных потенциально сильных неоэпитопов (т. е. эпитопов, не присутствующих в нативных белках Еб и Е7); (v) в определенных вариантах осуществления они не зависят от высокоактивных адъювантов для повышения требуемого иммунного ответа; и (vi) в определенных вариантах осуществления, как показано в данном документе, комбинированное введение (например, по схеме прайм-буст) аденовирусной вакцины и вакцины MVA обеспечивает усиленный иммунный ответ по сравнению с введением только одной вакцины.
[00 67] Так, векторы, вакцины и комбинации вакцин настоящего изобретения представляют собой большой шаг вперед благодаря объединению различных выгодных характеристик в единую конструкцию и являются превосходными кандидатами, в первую очередь для терапевтической вакцинации против HPV16 и HPV18. Эти векторы, вакцины и комбинации вакцин также можно применять в качестве профилактических вакцин против HPV16 и HPV18, что
означает, что они скорее всего будут предотвращать упорные инфекции, вызванные HPV16, HPV18 или обоими HPV16 и HPV18, у привитых субъектов.
[0068] При разработке определенных вариантов осуществления
авторы данного изобретения применяли IEDB-AR для определения
возможного образования неприродных сильных эпитопов, которые
можно вводить во вновь созданные сочленения между различными
фрагментами Еб и Е7. В определенных вариантах осуществления для
сконструированной молекулы HPV16 с помощью тщательного
конструирования количества неоэпитопов с длиной, составляющей
девять аминокислот, с прогнозируемой аффинностью связывания,
составляющей <50 нМ, в отношении 2 0 наиболее распространенных
HLA-A, 2 0 наиболее распространенных HLA-B и 2 0 наиболее
распространенных HLA-C аллелей в последовательностях
переупорядоченных Еб и Е7 HPV16 было минимизировано до всего
лишь 1. Это является значительным улучшением по сравнению с
конструкциями, описанными другими исследователями, которые для
одного "перетасованного'' белка Еб HPV16 уже содержали более 30
таких неоэпитопов, и такие конструкции, вероятно, будут
содержать еще несколько неоэпитопов в последовательностях,
которые были присоединены к этим конструкциям с целью
предупреждения потери эпитопов (Ohlschlager et al. , 2006,
Vaccine 24: 2880-93). Следовательно, конструкции по настоящему
изобретению характеризуются значительно улучшенным
иммунологическим профилем, поскольку вероятность измененного иммунного ответа по сравнению с нативными Еб и Е7 была сведена к минимуму в молекулах по настоящему изобретению по сравнению с подходами, описанными другими исследователями.
[00 69] Специалисты могут с помощью традиционных методик осуществлять нуклеотидные замены, которые не влияют на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами, описанными для отражения частоты использования кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды будут экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано иное, то выражение "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные
последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать в себя интроны.
[0070] В предпочтительном варианте осуществления молекулы
нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, или составные HPV
белки, согласно данному изобретению разработаны для оптимальной
экспрессии и эффективности в одном или нескольких векторах
настоящего изобретения. Например, молекула нуклеиновой кислоты,
кодирующей полинуклеотид HPV 16, который содержит аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, в некоторых
вариантах осуществления содержит полинуклеотидную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 2, молекула
нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотид HPV 16, который
содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ
ID N0:3, в некоторых вариантах осуществления содержит
полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID
N0:4 или SEQ ID N0:24, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей
полинуклеотид HPV 16, который содержит аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0:5, в некоторых
вариантах осуществления содержит полинуклеотидную
последовательность, представленную в SEQ ID N0:6. Кроме того,
молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотид HPV 18,
который содержит аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0:20, в некоторых вариантах
осуществления содержит полинуклеотидную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 21, и молекулы нуклеиновой кислоты,
кодирующей полинуклеотид HPV18, который содержит аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0:22, в некоторых
вариантах осуществления содержит полинуклеотидную
последовательность, представленную в SEQ ID N0:23 или SEQ ID N0:25.
[0071] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты согласно изобретению включают гомологичные или вариантные последовательности. Эти последовательности по определению в определенной степени, выраженной в процентах,
идентичны нуклеиновым кислотам данного изобретения.
[0072] Предпочтительно, последовательности таких гомологов или вариантов по меньшей мере на примерно 50%, по меньшей мере на примерно 60% или 65%, по меньшей мере на примерно 7 0% или 75%, по меньшей мере на примерно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89%, обычно по меньшей мере на примерно 90%, 91%, 92%, 93% или 94% или даже еще более типично по меньшей мере на примерно 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, скорее всего по меньшей мере на примерно 99% идентичны указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Термин гомолог или вариант также включает в себя усеченные, удаленные или другим образом модифицированные нуклеотидные последовательности.
[0073] Методики определения идентичности между
последовательностями нуклеиновых кислот известно в данной области техники. Две или более последовательности можно сравнивать путем определения их идентичности в процентном выражении. Идентичность двух последовательностей в процентах представляет собой число точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину наиболее коротких последовательностей и умноженное на 100.
[0074] "Идентичность последовательностей в процентах (%)"
или "степень идентичности (%)" в применении к нуклеотидной
последовательности или нуклеиновым кислотам по определению
представляет собой процент нуклеотидных остатков в
последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидным
остаткам в эталонной последовательности (т.е.,
последовательности нуклеиновой кислоты, из которой она получена), после выравнивания последовательностей и введения промежутков (гэпов), если это необходимо, для достижения максимальной степени идентичности, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения степени идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые входят в компетенцию в данной области техники, например, с использованием широкодоступных компьютерних программ BLAST, ALIGN или Megalign (DNASTAR).
Специалисты в данной области техники смогут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
[0075] Например, подходящее выравнивание
последовательностей нуклеиновых кислот можно выполнить,
используя алгоритм локальной гомологии, предложенный Smith и
Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2:482-489.
Этот алгоритм можно применять к аминокислотным
последовательностям с помощью матрицы замен, разработанной Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, и нормализованной в работе Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14 (6) :6745-6763. Иллюстративное применение этого алгоритма для определения степени идентичности последовательности предложено Genetics Computer Group (Madison, Wis.) в служебном приложении "BestFit". Параметры по умолчанию для этого метода описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)
(можно получить от Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Предпочтительным методом определения степени идентичность в контексте настоящего изобретения является использование пакета программ MPSRCH, принадлежащих Университету Эдинбурга
(University of Edinburgh), разработанных John F. Collins и Shane S. Sturrok, и распространяемых компанией IntelliGenetics, Inc.
(Mountain View, Calif.). С помощью этого пакета можно применять алгоритм Smith-Waterman, в котором параметры по умолчанию используют для таблицы баллов (например, штраф при открывании промежутка, равный 12, штраф за расширение промежутка, равный одному, и промежуток, принимаемый за шесть). Из этих данных получают "Match" (соответствие) , которое отражает "степень идентичности." В этой области техники известны и другие программы, подходящие для подсчета степени идентичности или сходства между последовательностями, например, другой программой для выравнивания является BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP можно применять, используя
следующие параметры по умолчанию: генетический код=стандартный;
фильтр=отсутствует; цепь=обе; отсечение=бО; ожидание=10;
матрица=ВЪ03иМб2; описание=50 последовательностей; отбор
по=высокий балл; базы данных=без резервирования,
GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss
protein+Spupdate+PIR. Подробности об этих программах можно найти
по следующему адресу на Интернете:
http://http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
[0076] Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать заново с помощью синтеза ДНК, который можно осуществлять с использованием стандартных процедур с участием компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
[0077] Специалисту будет понятно, что в белке можно производить изменения, например, с помощью замен, делеций, добавлений аминокислот и т. д., например с помощью традиционных методик молекулярной биологии. В целом, консервативные замены аминокислот можно применять без потери функции или иммуногенности полипептида. Это можно проверять на основании традиционных методик, хорошо известных специалисту.
[0078] В определенных вариантах осуществления кодируемые
полипептиды в соответствии с по меньшей мере одним аспектом
данного изобретения дополнительно содержат лидерную
последовательность, также называемую сигнальной
последовательностью или сигнальным пептидом. Она представляет
собой короткий (как правило, с длиной, составляющей 5-30
аминокислот) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь
синтезируемых белков, которые предназначены для поступления в
секреторный путь. Наличие такой последовательности может
приводить к увеличению экспрессии и иммуногенности.
Неограничивающими примерами, которые можно использовать,
являются лидерный пептид IgE (см., например US 6733994;
например, характеризующийся последовательностью
MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 7)) или лидерный пептид HAVT20
(например, характеризующийся последовательностью
MACPGFLWALVISTCLEFSMA (SEQ ID N0: 9) ) . Один из них может быть необязательно присоединен к N-концу полипептида по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления полипептид в соответствии с настоящим изобретением не содержит лидерную последовательность.
[0079] Существуют различные типы HPV (идентифицировано более 120 типов, и они указаны по их номеру) , и в целом для каждого типа, который должен быть охвачен вакциной, может быть необходимо включение в вакцину специфичных к данному типу антигенов, несмотря на то, что для определенных антигенов может существовать некоторая перекрестная реактивность. Типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82 являются канцерогенными HPV "высокого риска", передающимися половым путем, и могут приводить к развитию интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), интраэпителиальной неоплазии полового члена (PIN) и/или анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN). HPV в соответствии с настоящим изобретением (т. е. HPV, из которого получают фрагменты Еб и Е7 в кодируемом полипептиде) представляет собой HPV16 (для SEQ ID N0: 1-6), или HPV18 (для SEQ ID N0: 20-23). Его можно применять для субъектов, инфицированных соответственно HPV16 или HPV18. В определенных вариантах осуществления его также можно подходящим образом комбинировать с вакцинами против других типов HPV. В определенных вариантах осуществления такая комбинация представляет собой комбинацию с вышеописанной вакциной против типа HPV высокого риска, например вакцина против HPV16 с вакциной против HPV18. В других вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению комбинируют с вакциной против одного или нескольких из HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73 или -82. Такие комбинации можно применять, например, если точный тип инфекции, вызванной HPV, еще не определен, или если требуется иммунный ответ с профилактическим эффектом против более чем одного типа HPV. Также предложены комбинации вакцин данного изобретения с
вакцинами против типов HPV, вызывающих появление остроконечных бородавок, таких как HPV6 и/или HPV11. Последовательности таких типов HPV и белков, кодируемых ними (например, Еб, Е7, Е2), специалист может получить из общедоступных баз данных, таких как база данных последовательностей GenBank, предоставляемая Национальным центром биотехнологической информации (NCBI).
[0080] Полипептид согласно одному аспекту изобретения для HPV16 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, ив одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Полипептид согласно данному изобретению для HPV18 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, ив одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.
[0081] В данном документе последовательности приведены в направлении от 5' к 3' или от N- к С-концу, как принято в данной области техники.
[0082] Кодируемые олипептиды в соответствии с данным изобретением содержат эпитопы белков Еб и Е7 HPV16 или, в качестве альтернативы, эпитопы белков Еб и Е7 HPV18. В определенных вариантах осуществления полипептид в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит (и следовательно нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, дополнительно кодирует) по меньшей мере один дополнительный антиген или эпитоп(-ы) этого дополнительного антигена. Этот дополнительный антиген предпочтительно представляет собой антиген HPV, предпочтительно такого же типа HPV, как и белки Еб и Е7 в полипептиде, т. е. соответственно HPV16 или HPV18. Таким образом, этот дополнительный антиген может представлять собой белок HPV или его иммуногенный фрагмент, и в определенных вариантах осуществления содержит белок Е2 или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один эпитоп Е2 HPV, предпочтительно из HPV16 или HPV18. Такие дополнительные антигены или эпитопы
можно экспрессировать независимо от Еб или Е7 полипептида
согласно данному изобретению. Такие дополнительные антигены или
эпитопы можно также экспрессировать как часть составного белка,
например, помещая их между двумя фрагментами Еб и/или Е7 в
полипептиде, содержащем аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 20, но
предпочтительно присоединяя из е N-концу или С-концу полипептида
Е6/Е7, содержащего аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 20. В качестве альтернативы или дополнительно могут присутствовать аминокислотные последовательности, которые стимулируют иммунный ответ. Так, в определенных вариантах осуществления в данном изобретении предложены молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением, кодирующие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 20, и при этом полипептид дополнительно содержит по меньшей мере один другой антиген, например белок Е2 HPV или по меньшей мере один его эпитоп, но предпочтительно большее количество эпитопов. Одним преимуществом добавления антигена Е2 по настоящему изобретению является то, что Е2, как известно, экспрессируется на ранних стадиях инфекции/при низкой степени повреждений, когда экспрессия Еб и Е7 все еще очень низкая.
[0083] В ходе развития рака шейки матки экспрессия Е2 утрачивается, и в результате возрастают уровни Еб и Е7 (Yugawa and Kiyono, 2009, Rev Med Virol 19: 97-113). Объединение эпитопов из E2, Еб и E7 в одной вакцине обеспечивает лечение широкой целевой группы пациентов, начиная с пациентов с упорной инфекцией до пациентов с инвазивным раком шейки матки (или другими вызванными HPV16 формами рака). В определенных вариантах осуществления белок Е2 представляет собой белок Е2 дикого типа. В других определенных вариантах осуществления белок Е2 характеризуется делецией или одной или несколькими мутациями в его ДНК-связывающем домене (по сравнению с белком Е2 дикого типа) . Последовательность белков Е2 HPV16 и HPV18 можно найти в базе данных белков NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) под
номерами NP_041328.1 и ААР20597.1, соответственно. Как известно, несколько одиночных аминокислотных замен в Е2 HPV16, таких как G293V, К299М или C300R в С-концевой части этого белка, подавляют связывание ДНК. Для Е2 HPV18 соответствующими аминокислотными заменами являются G294V, К300М, C301R.
[0084] Преимущество применения варианта или фрагмента Е2,
лишенного ДНК-связывающей способности, заключается в том, что он
мог бы предотвращать непредсказуемые транскрипционные изменения
путем прямого связывания с ДНК клетки-хозяина в клетках, где он
экспрессируется. В дополнение или в качестве альтернативы к
вышеописанным мутациям в ДНК-связывающем домене, дополнительными
подходами для предотвращения активности Е2 являются введение
мутаций, которые подавляют активность более N-терминально
расположенного трансактивирующего домена Е2, и/или которые, как
сообщается, влияют на структуру полипептида Е2 . Для Е2 HPV16
неограничивающими примерами аминокислотных замен в положениях,
которые были описаны ранее (например, Brokaw et al, 1996; Sakai
et al, 1996) , являются R37A, I73A, W92A, E39A, W33A, P106A и
G156A, и при этом Е2 HPV16 в соответствии с настоящим
изобретением может необязательно содержать одну или несколько из
этих мутаций в трансактивирующем домене. В одном варианте
осуществления фрагмент HPV16 Е2 включает нуклеиновую кислоту,
кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28. В более
конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой
кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 28, содержит полинуклеотидную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29 или SEQ ID
NO: 30. Для E2 HPV18 соответствующими аминокислотными заменами
являются R41A, I77A, W96A, Е43А, W37A, Р110А и G161A, и при этом
Е2 HPV18 в соответствии с данным изобретением может, таким
образом, необязательно содержать одну или несколько из этих
мутаций в трансактивирующем домене. В одном варианте
осуществления фрагмент HPV18 Е2 включает нуклеиновую кислоту,
кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31. В более конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой
кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 31, содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 32 или SEQ ID N0: 33.
[0085] В определенных вариантах осуществления Е2 содержит мутации в трансактивирующем домене, в других вариантах осуществления Е2 содержит мутации в ДНК-связывающем домене, и в дополнительных вариантах осуществления Е2 содержит мутации как в трансактивирующем домене, так и в ДНК-связывающем домене. В еще одном альтернативном варианте осуществления полипептид Е2 в соответствии с настоящим изобретением разделен на фрагменты, которые являются переупорядоченными (" перетасованными''), для подавления активности Е2 при сохранении эпитопов Е2 для иммуногенности. Такой вариант осуществления можно необязательно комбинировать с одной или несколькими из вышеописанных мутаций, например в ДНК-связывающем домене и/или в трансактивирующем домене. Помимо полипептидов Е2 HPV дикого типа, все такие мутанты Е2 могут быть использованы в качестве белка Е2 или его части или варианта в соответствии с настоящим изобретением.
[0086] Белок Е2 или его часть или вариант, такие как те,
что описаны в данном документе, но не ограничиваясь ими, можно
добавлять внутрь, но предпочтительно сливать с N-концом или С-
концом полипептида данного изобретения, содержащего
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1
или SEQ ID N0: 20. В одном варианте осуществления для HPV16
молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения кодирует
полипептид, содержащий аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 3. В одном из вариантов
осуществления молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения
содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в
SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0:24. В другом варианте осуществления
для HPV16 молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения
кодирует полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 5. В одном из вариантов ее осуществления молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 6. В одном варианте осуществления
для HPV18 молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения
кодирует полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 22. В одном из вариантов ее осуществления молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
[0087] Также возможно производить дополнительные слияния сконструированных полипептидов по настоящему изобретению с дополнительными белками, например с так называемыми белками-носителями, такими как кальретикулин, белок-7 0 теплового шока Mycobacterium Tubercelosis, IP10 или фрагмент С столбнячного токсина (см. Oosterhuis et al., Human Gene Ther, 2012, выше, для большего количества примеров) , которые могут дополнительно усиливать иммунный ответ на эпитопы Еб и Е7 (и необязательно Е2) HPV. Таким образом, в настоящем изобретении также предложены эти дополнительные составные белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты.
[008 8] В определенных вариантах осуществления одна или несколько молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением включены в вектор. Термин "вектор" в данном контексте, как правило, представляет собой инструмент для искусственного переноса чужеродного генетического материала в другую клетку, где он может быть реплицирован и/или экспрессирован, и в соответствии с данным изобретением может представлять собой любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением. Его можно получать в соответствии с обычными методиками молекулярной биологии, такими как клонирование. Обычно такие векторы можно размножать по меньшей мере в одном типе подходящих хозяев, таких как бактерии, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих и т. п. Четыре основных типа векторов представляют собой плазмиды, вирусные векторы, космиды и искусственные хромосомы. Сам вектор обычно представляет собой последовательность ДНК, которая состоит из вставки (трансген, в данном изобретении - нуклеиновая кислота, кодирующая составной полипептид данного изобретения) и последовательности, которая
служит в качестве "остова" вектора. Цель вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, как правило, заключается в том, чтобы выделить, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени.
[0089] Предпочтительно, последовательность, кодирующая
полипептид, функционально связана с промотором в векторе.
Подразумевается, что термин "функционально связанный" означает,
что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес,
связана с промотором таким способом, который обеспечивает
экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в клетке-
хозяине, в случае если вектор введен в клетку-хозяина).
Регуляторные последовательности экспрессии могут быть
функционально связаны с трансгеном. В определенных вариантах
осуществления векторы сконструированы для экспрессии трансгена в
клетке-мишени, и как правило содержат промоторную
последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. В
определенных вариантах осуществления могут присутствовать один
или несколько из обычно используемых элементов вектора, таких
как последовательности терминатора транскрипции, хвостовые
последовательности полиаденилирования, последовательности Kozak,
UTR, точки начала репликации, множественные сайты клонирования,
генетические маркеры, устойчивость к антибиотикам и другие
последовательности, и при этом специалист может сконструировать
вектор таким образом, чтобы он обладал требуемыми свойствами,
например для репликации в определенных клетках с целью
распространения и размножения вектора и экспрессии трансгена
вектора в клетках-мишенях, в которые вводят вектор. Векторы,
содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в
соответствии с данным изобретением, предпочтительно
сконструированные для экспрессии в клетках млекопитающих,
пригодны в качестве вакцины в соответствии с данным
изобретением. В определенных вариантах осуществления вектор в
соответствии с настоящим изобретением представляет собой
плазмиду, космиду, искусственную хромосому дрожжей,
бактериальную искусственную хромосому, вирусный вектор или т. п. Специалист в данной области техники осведомлен о том, что для
достижения экспрессии гена в клетках-хозяевах можно использовать различные промоторы. Некоторые хорошо известные и наиболее часто используемые промоторы для экспрессии в эукариотических клетках включают в себя промоторы, полученные из вирусов, таких как аденовирус, например промотор Е1А, промоторы, полученные из цитомегаловируса (CMV), такие как предранний (IE) промотор CMV
(называемый в данном документе промотором CMV) (например, получаемый из pcDNA, Invitrogen), промоторы, полученные из вируса обезьян 4 0 (SV4 0) (например, получаемые из pIRES, № по кат. 631605, BD Sciences) и т. п. Из эукариотических клеток также можно получать подходящие промоторы, такие как промоторы генов металлотионеинов (МТ), промотор гена фактора элонгации 1а
(EF-loc) , промотор гена убиквитина С или UB6, промотор гена актина, промотор гена иммуноглобулина, промоторы генов теплового шока ит. п. (см., например, WO 2006/048459) . Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например предранний промотор CMV, например содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV, например промотора CMV, как предложено в данном документе, с последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 13. Сигнал полиаденилирования, например сигнал полиА гена бычьего гормона роста (US 5122458), может располагаться позади трансгена(-ов). В другом неограничивающем примере промотором может быть PrMVA13.51ong промотор (WO 2014/0 63 8 32) или PrHyb промотор (патенты США 8394385, 8613936), которые содержат полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 6 и SEQ ID NO: 27, соответственно, и которые особенно полезны для проведения экспрессии трансгенов в векторах MVA.
[0090] Также можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. В данном документе термин "регуляторная последовательность" используют взаимозаменяемо с термином "регуляторный элемент", и он относится к сегменту нуклеиновой кислоты, как правило, но без ограничения, ДНК, которая модулирует транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты,
с которой она функционально связана и таким образом действует как транскрипционный модулятор. Регуляторная последовательность часто содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые являются транскрипционными доменами связывания, которые распознаются доменами связывания нуклеиновых кислот транскрипционных белков и/или факторов транскрипции, энхансерами или репрессорами и т. д. Например, возможно функционально связать репрессорную последовательность с промотором, при этом репрессорная последовательность может быть связана репрессорным белком, который может уменьшать или предотвращать экспрессию трансгена в линии клеток-продуцентов, которая экспрессирует этот репрессорный белок. Это может улучшить генетическую стабильность и/или уровни экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты при пассировании и/или при продуцировании в больших количествах в линии клеток-продуцентов. Такие системы были описаны в уровне техники. Например, регуляторная последовательность может включать одну или несколько последовательностей операторов оперона тетрациклина (tetO) , так что экспрессия ингибируется в присутствии белка-репрессора оперона тетрациклина (tetR). В отсутствие тетрациклина белок tetR способен связываться с сайтами tetO и подавлять транскрипцию гена, функционально связанного с сайтами tetO. Однако в присутствии тетрациклина конформационное изменение белка tetR предотвращает его связывание с операторными последовательностями, что обеспечивает транскрипцию функционально связанных генов. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, например когда она присутствует в рекомбинантном аденовирусном векторе, согласно настоящему изобретению может необязательно включать tetO, функционально связанный с промотором, так что экспрессия одного или нескольких трансгенов ингибируется в рекомбинантных аденовирусах, которые продуцируются в линии клеток-продуцентов, в которых экспрессируется белок tetR. Впоследствии экспрессия не будет ингибироваться, если рекомбинантный аденовирус вводить субъекту или в клетки, которые не экспрессируют белок tetR (например, международная заявка на выдачу патента W0 07/073513). В других определенных вариантах осуществления молекула
нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например в случае если она присутствует в рекомбинантном аденовирусе, может необязательно включать систему переключения генов с использованием кумата, в которой регуляция экспрессии опосредуется связыванием репрессора (CymR) с сайтом оператором
(СиО), расположенным ниже промотора (например, Mullick et al.
ВМС Biotechnol. 2006 6:43) . Используемый в данном документе
термин "репрессор" относится к объектам (например, белкам или
другим молекулам), обладающим способностью ингибировать,
препятствовать, замедлять и/или подавлять продуцирование
гетерологичного белкового продукта рекомбинантного вектора
экспрессии. Например, с помощью воздействия на сайт связывания в
подходящем месте вдоль вектора экспрессии, как например в
кассете экспрессии. Примеры репрессоров включают tetR, CymR,
lac-репрессор, trp-репрессор, gal-penpeccop, лямбда-репрессор и
другие соответствующие репрессоры, известные из уровня техники.
В данном документе предложены примеры применения
операторной/репрессорной системы tetO/tetR и
операторной/репрессорной системы CuO/CymR. Подавление экспрессии трансгена вектора в ходе размножения вектора может предотвращать трансгенную нестабильность и в ходе продуцирования может увеличить выходы векторов, содержащих трансген по настоящему изобретению. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению содержат промотор, который может быть подавлен с помощью связывания репрессорного белка, например с помощью обеспечения промотора, который функционально соединен с репрессорной операторной последовательностью
(например, в неограничивающих вариантах осуществления
последовательностью, содержащей TetO, например, такой, как
изложена в полинуклеотидной последовательности, приведенной в
SEQ ID NO: 11, или последовательностью, содержащей СиО,
например, такой, как изложена в полинуклеотидной
последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 12), с которой репрессорный белок (например, белок TetR, например, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, или белок CymR, например, содержащий аминокислотную
последовательность, изложенную в SEQ ID N0: 17) может связываться.
[0091] В предпочтительных вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный вирусный вектор, который может быть способным к репликации или неспособным или малоспособным к репликации. В определенных вариантах осуществления вирусный вектор содержит рекомбинантный ДНК-геном. В определенных вариантах осуществления вектор согласно данному изобретению представляет собой, например, рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный поксвирус, такой как ортопоксвирус (например, вирус осповакцины - модифицированный вирус коровьей оспы анкара (MVA) ) .
[0092] В одном или нескольких предпочтительных вариантах осуществления вектор согласно данному изобретению представляет собой поксвирус, такой как, но не ограничиваясь этим, ортопоксвирус. Рекомбинантный ортопоксвирус может быть вирусом осповакцины (W) , штаммом Wyeth, АСАМ 1000, АСАМ 2 000, MVA или MVA-BN.
[0093] В более предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный поксвирус представляет собой MVA. В определенных предпочтительных вариантах осуществления MVA представляет собой MVA-BN. MVA-BN является репликативно-некомпетентным, что является значительным преимуществом по сравнению с другими типами MVA. MVA-BN зарегистрирован 30 августа 2000г. в Европейском собрании клеточных культур (the European Collection of Cell Cultures (ECACC) ) под № V00083008 и описан в Международной патентной заявке WO2002042480 (также см., например, патент № ЕР 1335987, патенты США №№ 6761893, 6913752, 7335364, 7459270, 7939086 и 8268325). Как описано в этих патентных публикациях, MVA-BN репродуктивно не воспроизводится в клеточных линиях 293, 143В, HeLa и HaCat.
[0094] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный MVA является производным MVA-BN. Такие "производные" включают вирусы, демонстрирующие в основном одинаковые характеристики воспроизводства, что и зарегистрированный штамм (ЕСАСС № V00083008), но имеют отличия в одной или нескольких частях их
генома. Производные MVA-BN в данном контексте характеризуются: i) способностью к репродуктивному воспроизводству в фибробластах клеток куриных эмбрионов (CEF) и клеточной линии почки детеныша хомяка (ВНК), но они не способны к репродуктивному воспроизводству в клеточных линиях человека HaCat, HeLa и 143В; и ii) неспособностью к репликации в мышиных штаммах, т.е. они не способны производить зрелые В и Т клетки и, как таковые, имеют сильно ослабленный иммунитет и в значительной степени восприимчивы к реплицирующему вирусу. Эти характеристики и способы их определения хорошо описаны в области техники (например, в WO2002042480, патентах США №№ 6761893 и 6913752).
[0095] В определенных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, описанные здесь, включены в разнообразные интеграционные сайты или межгенные области в геноме MVA или геноме MVA-BN. Молекулы нуклеиновой кислоты можно вставлять в рекомбинантный MVA или MVA-BN как отдельные транскрипционные единицы или составные гены, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты вставляют в один или несколько межгенных областей (IGR) вируса MVA или MVA-BN. IGR можно выбирать из IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 и IGR 148/149, предпочтительно из IGR64/65, IGR88/89 и/или IGR 148/149. Эти IGR дополнительно охарактеризованы в WO 03/097845 (также см., например, патент № ЕР 1407033 и патенты США №№ 7550147, 7964374, 8034354 и 8741308). Молекулы нуклеиновой кислоты можно дополнительно или в качестве альтернативы вставлять в один или несколько природных сайтов I, II, II, IV, V или VI вируса MVA или MVA-BN. В определенных вариантах осуществления менее чем 5, 4, 3 или 2 сайтов интеграции содержат молекулы нуклеиновой кислоты настоящего раскрытия.
[0096] Число интеграционных сайтов MVA или MVA-BN, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты может составлять 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 или более. Рекомбинантный MVA или MVA-BN может содержать молекулы нуклеиновой кислоты, вставленные в 4, 3, 2 и 1 интеграционные сайты.
[0097] В определенных вариантах осуществления молекулы
нуклеиновой кислоты настоящего раскрытия вставлены в единственный интеграционный сайт. В предпочтительном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, вставленные в единственный интеграционный сайт, представляют собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID N0: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22) и их комбинаций. В других предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, вставленные в единственный интеграционный сайт, кодируют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 3 и SEQ ID N0: 22. В других также предпочтительных вариантах молекула нуклеиновой кислоты, вставленные в единственный интеграционный сайт, представляет собой одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы состоящей из SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 4, SEQ ID N0: 6, SEQ ID N0: 21, SEQ ID N0: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, предпочтительно содержащей полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25. В еще более предпочтительных вариантах осуществления две или более молекулы нуклеиновой кислоты вставляют в единственный интеграционный сайт, причем последовательности молекул нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90% идентичны полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 24 и SEQ ID N0: 25, соответственно, предпочтительно содержат полинуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID N0: 24 и SEQ ID N0: 25, соответственно. В другом предпочтительном варианте осуществления единственный интеграционный сайт представляет собой IGR88/89.
[0098] Рекомбинантные MVA вирусы, предложенные в данном документе, можно создавать, используя обычные способы, известные в данной области техники. Способы получения рекомбинантных поксвирусов или вставки гетерологичных нуклеотидных
последовательностей в геном поксвируса хорошо известные специалисту в данной области техники. Например, способы стандартных методик молекулярной биологии, такие как методики клонирования ДНК, выделения ДНК и РНК, вестерн-блот анализа, амплификации с помощью ПЦР с обратной транскрипцией и ПЦР описаны в Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd Ed.) [J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], a методики обращения и операций с вирусами описаны в Virology Methods Manual [В. W. J. Mahy et al. (eds.), Academic Press
(1996)]. Сходным образом методики и умение обращения, операций и генной инженерии MVA описаны в Molecular Virology: A Practical Approach [A. J. Davison & R. M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(см., например, Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors)] и Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998)(см., например, Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)].
[0099] Для создания различных рекомбинантных MVA, раскрываемых в данном документе, могут быть применимы и другие способы. Нуклеотидные последовательности, предназначенные для вставки (интеграции) в вирус, можно помещать в конструкцию плазимиды E.coli, в которую вставлена ДНК, гомологичная отрезку ДНК MVA. Отдельно от этого, последовательность ДНК, предназначенную для вставки (интеграции), можно привязывать к промотору. Связь промотор-ген можно помещать в плазмидную конструкцию так, чтобы промотор-генная связь была фланкирована ДНК, гомологичной последовательности ДНК, фланкирующей область ДНК MVA, содержащую несущественный локус. Полученную плазмидную конструкцию можно амплифицировать путем выращивания в бактерии E.coli и выделения из нее. Выделенная плазмида, содержащая генную последовательность ДНК, предназначенную для вставки
(интеграции), можно трансфицировать в клеточную культуру, например, фибробласты куриных эмбрионов (CEF), одновременно инфицируя культуру с использованием MVA. Рекомбинацией между гомологичной ДНК MVA в плазмиде и вирусным геномом,
соответственно, можно создавать модифицированный MVA за счет присутствия чужеродных последовательностей ДНК.
[0100] Согласно предпочтительному варианту осуществления клетку подходящей клеточной культуры, такой как, например, клетки CEF, можно инфицировать поксвирусом. В инфицированную клетку можно затем трансфицировать первый плазмидный вектор, содержащий чужеродный ген или гены, предпочтительно под транскрипционным контролем контрольного элемента экспрессии поксвируса. Как объяснено выше, плазмидный вектор также содержит последовательности, способные направлять вставку экзогенной последовательности в выбранную часть генома поксвируса. По выбору, плазмидный вектор также содержит кассету, содержащую маркер и/или селективный ген, функционально связанный с промотором поксвируса. Подходящие маркер или селективный ген представляют собой, например, гены, кодирующие зеленый или красный флуоресцентный белок, бета-галактозидазу, неомицин-фосфорибозилтрансферазу, Ecogpt или другие маркеры. Применение селективной или маркерной кассет упрощает идентификацию и выделение созданного рекомбинантного поксвируса. Однако рекомбинантный поксвирус также можно идентифицировать с помощью технологии ПЦР. Затем следующую клетку можно инфицировать рекомбинантным поксвирусом, полученным, как описано выше, и трансфицировать вторым вектором, содержащим второй чужеродный ген или гены. В том случае, когда этот ген можно вводить в другой интеграционный сайт поксвирусного генома, поксвирус-гомологичные последовательности второго вектора, направляющие интеграцию второго чужеродного гена или генов в геном поксвируса, также являются другими. После завершения гомологичной рекомбинации можно выделять рекомбинантный вирус, содержащий два или более чужеродных гена. Для введения дополнительных чужеродных генов в рекомбинантный вирус, можно повторять стадии инфицирования и трансфекции, используя рекомбинантный вирус, выделенный в предыдущих стадиях, для инфицирования, используя для трансфекции следующий вектор, содержащий следующий чужеродный ген или гены.
[0101] В альтернативном варианте стадии инфицирования и
трансфекции, описанные выше, являются взаимозаменяемыми, т.е.
подходящие клетки можно сначала трансфицировать плазмидным
вектором, содержащим чужеродный ген, а затем инфицировать
поксвирусом. В качестве дополнительного альтернативного варианта
также можно вводить каждый чужеродный ген в разные вирусы,
одновременно инфицировать клетку всеми полученными
рекомбинантными вирусами и выявлять наличие рекомбинанта,
включающего в себя все чужеродные гены. Третьим альтернативным
вариантом является лигирование геномной ДНК и чужеродных
последовательностей in vitro и реконструкция геномной ДНК
рекомбинированного вируса осповакцины с использованием вируса-
помощника. Четвертым альтернативным вариантом является
гомологичная рекомбинация в E.coli или других видах бактерий
между геномом вируса осповакцины, клонированного в виде
искусственной бактериальной хромосомы (ВАС) и линейной
чужеродной последовательности, фланкированной
последовательностями ДНК, гомологичными последовательностям, фланкирующим требуемый сайт интеграции в геноме вируса осповакцины.
[0102] В других предпочтительных вариантах осуществления вектор в соответствии с данным изобретением представляет собой рекомбинантный аденовирус. Преимущества аденовирусов при применении в качестве вакцин включают легкость обращения с ними, хорошую технологичность производства в больших количествах и превосходные показатели безопасности, основанные на многолетнем опыте исследований, разработки, производства и клинических испытаний с многочисленными аденовирусными векторами, о которых сообщалось. Аденовирусные векторы, которые применяют в качестве вакцин, как правило, обеспечивают хороший иммунный ответ на белок, кодируемый трансгеном, в том числе клеточный иммунный ответ. Аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть основан на любом типе аденовируса и в некоторых вариантах осуществления представляет собой аденовирус человека, который может принадлежать любому серотипу. В других вариантах осуществления он представляет собой обезьяний аденовирус, такой как аденовирус шимпанзе или гориллы, который
может принадлежать любому серотипу. В определенных вариантах осуществления вектор в соответствии с данным изобретением представляет собой аденовирус человека серотипа 2 6 или 35. Получение рекомбинантных аденовирусных векторов хорошо известно из уровня техники. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением является дефектным по меньшей мере по одному существенно важному функциональному гену области Е1, например области Е1а и/или области Elb, аденовирусного генома, который требуется для вирусной репликации. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением является дефектным по меньшей мере по части области ЕЗ, не являющейся существенно важной. В определенных вариантах осуществления вектор является дефектным по меньшей мере по одному существенно важному функциональному гену области Е1 и по меньшей мере по области ЕЗ, не являющейся существенно важной.
[0103] Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в патентах США №№ 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913, и Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", Chapters 67 and 68, respectively, in Virology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), а также других источниках, упомянутых в данном документе. Как правило, конструирование аденовирусных векторов включает применение стандартных методик молекулярной биологии, таких как описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning,, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), а также других источниках, упомянутых в данном документе.
[0104] Особенно предпочтительными серотипами для рекомбинантного аденовируса являются серотип 35 человека или серотип 2 6 человека, наиболее предпочтителен серотип 2 6 человека
(rAd2 6) . Получение векторов гАо!2б описано, например, в WO 2007/104792 и в Abbink et al., 2007 Virology 81: 4654-63. Иллюстративные последовательности генома Ad2 6 находятся в GenBank под номером доступа EF 153474 и под SEQ ID NO: 1 в WO 2007/104792. Получение векторов rAd35 описано, например, в патенте США № 7270811, в WO 00/70071 и в Vogels et al. , 2003, J Virol 11: 8263-71. Иллюстративные последовательности генома Ad35 указаны в GenBank под номером доступа АС_000019 и на фиг. 6 из WO 00/70071.
[0105] В определенных вариантах осуществления аденовирус является репликативно-дефектным, например потому, что он содержит делецию в области Е1 генома. Как известно специалисту, в случае делеций существенно важных областей из генома аденовируса функциональные элементы, кодируемые этими областями, должны быть обеспечены в транс-положении, предпочтительно клеткой-продуцентом, т. е. если части или целые области El, Е2 и/или Е4 удалены из аденовируса, то они должны присутствовать в клетке-продуценте, например быть встроенными в ее геном или находиться в форме так называемого вспомогательного аденовируса или вспомогательной плазмиды. Аденовирус также может содержать делецию в области ЕЗ, которая не является существенной для репликации, и следовательно такую делецию не следует комплементировать.
[0106] Клетка-продуцент (также иногда называемая в уровне техники и в данном документе как "пакующая клетка" или "комплементирующая клетка"), которую можно использовать, может представлять собой любую клетку-продуцент, в которой требуемый аденовирус может быть размножен. Например, размножение векторов но основе рекомбинантного аденовируса осуществляют в клетках-продуцентах, которые комплементируют дефекты в аденовирусе. Предпочтительно, такие клетки-продуценты содержат в своем геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса, и таким образом они способны к комплементированию рекомбинантных аденовирусов с делецией в области Е1. Можно использовать любую Е1-комплементирующую клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки глаза человека, иммортализированные с помощью Е1, например,
клетки 911 или PER. Сб (см. патент США № 5994128), El-трансформированные амниоциты (см. патент ЕР № 1230354), El-трансформированные клетки А549 (см., например, WO 98/39411, патент США № 5891690), GH329: HeLa (Gao et al. , 2000, Hum Gene Ther 11: 213-19), 2 93 и т. п. В определенных вариантах осуществления клетками-продуцентами являются, например, клетки НЕК293, или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т. п. Продуцирование аденовирусных векторов в клетках-продуцентах описано в (Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681703) .
[0107] В определенных вариантах осуществления Е1-дефектный аденовирус содержит кодирующую последовательность E4-orf6 из аденовируса подгруппы С, такого как Ad5. Это обеспечивает возможность размножения таких аденовирусов в хорошо известных комплементирующих линиях клеток, которые экспрессируют гены Е1 из Ad5, таких как клетки 293 или клетки PER.C6 (см., например, Havenga et al. , 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467, включенные в данный документ во всей своей полноте с помощью ссылки).
[0108] ''Гетерологичная нуклеиновая кислота'' (также
называемая в данном документе ''трансгеном'') в векторах данного
изобретения представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в
природных условиях не присутствует в векторе, и в соответствии с
данным изобретением нуклеиновая кислота, кодирующая составной
полипептид данного изобретения, считается гетерологичной
нуклеиновой кислотой, если она присутствует в векторе. Ее вводят
в вектор с помощью, например, стандартных методик молекулярной
биологии. Например, ее можно клонировать в удаленные области Е1
или ЕЗ аденовирусного вектора или в область между областью Е4 и
rITR. Трансген обычно функционально связан с
последовательностями, контролирующими экспрессию. В
предпочтительных вариантах осуществления трансген клонируют в область Е1 аденовирусного вектора.
[0109] Продуцирование векторов, таких как MVA векторы или рекомбинантные аденовирусные векторы, может быть выполнено в соответствии с различными способами, хорошо известными
специалисту в данной области в свете настоящего раскрытия. Как правило, продуцирование предусматривает размножение в культивируемых клетках с получением значительного количества векторного материала с последующим сбором вектора из клеточной культуры и обычно с последующей дополнительной очисткой вектора с удалением других веществ и получением очищенных векторов, которые могут быть составлены в фармацевтические композиции (например, Hoganson et al. , 2002, BioProcessing J 1: 43-8; Evans et al. r 2004, J Pharm Sci 93:2458-75) . Например, способы сбора аденовируса из культур клеток-продуцентов были подробно описаны, например, в WO 2005/080556. Например, в WO 2010/060719 и WO 2011/098592, оба из которых включены в данный документ посредством ссылки, описаны подходящие способы получения и очистки больших количеств рекомбинантных аденовирусов.
[ОНО] В дополнительных аспектах данного изобретения дополнительно предложены вакцины и комбинации вакцин, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, векторы или рекомбинантные вирусы в соответствии с данным изобретением, где варианты осуществления для каждого из этих аспектов могут включать описанные в данном документе варианты. В определенных вариантах осуществления вакцина в соответствии с данным изобретением содержит молекулу нуклеиновой кислоты описанную в данном документе. В предпочтительных вариантах осуществления вакцина содержит вектор согласно данному изобретению, предпочтительно - рекомбинантный поксвирусный вектор, такой как MVA вектор, предпочтительно MVA-BN вектор или его производное, и/или рекомбинантный аденовирусный вектор, такой как вектор гАо!2б.
[0111] В определенных вариантах осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением, которая кодирует сконструированный полипептид HPV16, содержит дополнительные активные ингредиенты, например нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один эпитоп белка Еб и/или Е7 по меньшей мере одного типа HPV, отличного от HPV16, например типа HPV высокого риска, такого как HPV18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73 или -82. В определенных вариантах осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением,
которая кодирует сконструированный полипептид HPV18, содержит дополнительные активные ингредиенты, например нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один эпитоп белка Еб и/или Е7 по меньшей мере одного типа HPV, отличного от HPV18, например типа HPV высокого риска, такого как HPV16, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73 или -82.
[0112] Особенно предпочтительными являются векторы, вакцины
или комбинации вакцин, содержащие нуклеиновые кислоты, которые
кодируют сконструированные полипептиды как HPV16, так и HPV18 по
настоящему изобретению, например, кодирующие полипептид,
содержащий аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ ID NO: 1, а также полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, например,
кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, а также полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22. В таких векторах, вакцинах или комбинациях вакцин, компоненты HPV16 и HPV18 могут быть в одной и той же композиции в виде отдельных молекул, или они могут быть в одной и той же молекуле, например, кодируемыми на одном и том же векторе. Одним преимущество таких комбинаций является то, что такие вакцины могут действовать терапевтически в субъектах, которые инфицированы либо HPV16, либо HPV18 (два наиболее распространенных типа HPV высокого риска, которые вместе являются причиной большинства форм рака, вызванных HPV), так что такие вакцины характеризуются повышенной применимостью по сравнению с монотипными вакцинами, которые содержат сконструированные молекулы либо HPV16, либо HPV18.
[0113] В других вариантах осуществления компоненты HPV16 и HPV18 могут быть предоставлены в виде наборе или композиции отдельных частей с отдельным компонентом HPV16 и отдельным компонентом HPV18 для комбинированного использования при вакцинации, например, для восстановления перед введением, или для отдельного, но в целом одновременного введения. Одним преимуществом таких комбинаций является то, что такие вакцины могут иметь терапевтическое действие в субъектах, инфицированных
либо HPV16, либо HPV18. Термин "вакцина" относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, эффективный для индуцирования иммунитета у субъекта на определенный патоген или заболевание на профилактическом и/или терапевтическом уровне, в данном случае терапевтического ответа против HPV. Как правило, вакцина содержит молекулу нуклеиновой кислоты, или вектор, или рекомбинантный вирус в соответствии с данным изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель. После введения субъекту полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, будет экспрессироваться в организме субъекта, что приведет к возникновению иммунного ответа в отношении антигенных фрагментов, которые присутствуют в кодируемом полипептиде. Преимущество вакцины настоящего изобретения заключается в том, что присутствуют практически все Т-клеточные эпитопы Еб и Е7 HPV16 (например, SEQ ID N0: 1-6 и 24) или HPV18 (например, SEQ ID N0: 20-23 и 25), и необязательно эпитопы Е2 HPV16 или HPV18, и таким образом с помощью вакцины может быть обеспечен Т-клеточный ответ на любой эпитоп, присутствующий в Еб, или Е7, или необязательно Е2 дикого типа. Кроме того, вакцина обладает всеми преимуществами безопасности и эффективности, которые описаны выше для молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
[0114] Для введения людям могут применяться
фармацевтические композиции, содержащие вектор и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или наполнитель в используемых дозах и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или неблагоприятных эффектов у субъектов, которым их вводят. Эти фармацевтически приемлемые наполнители хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]) . Как правило, наполнитель
представляет собой фармакологически неактивное вещество, составленное с активным ингредиентом лекарственного препарата. Наполнители обычно используют для увеличения объемов составов, которые содержат сильнодействующие активные ингредиенты (которые часто называются "объемообразующими средствами", "заполнителями" или "разбавителями"), чтобы обеспечить удобное и точное распределение лекарственного средства при получении лекарственной формы. Они также могут служить для различных терапевтически-усиливающих целей, таких как облегчение абсорбции лекарственного средства или растворимость или других фармакокинетических факторов. Наполнители могут также быть пригодны в производственном процессе для упрощения обращения с активным веществом, относящегося, например, к обеспечению текучести порошка или обеспечению неадгезионных свойств, в дополнение к поддержанию стабильности in vitro, как например для предупреждения денатурации в течение ожидаемого срока хранения. Выбор подходящих наполнителей также зависит от пути введения и лекарственной формы, а также от активного ингредиента и других факторов.
[0115] Очищенные молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или
полипептид предпочтительно составляют и вводят в виде
стерильного раствора, хотя также возможно использование
лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают с
помощью стерилизующей фильтрации или с помощью других способов,
известных per se из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют
или заполняют ими контейнеры, предназначенные для лекарственных
форм. Значение рН раствора обычно находится в диапазоне рН 3,0-
9,5, например, рН 5,0-7,5. Как правило, молекула нуклеиновой
кислоты, или вектор, или полипептид находятся в растворе с
подходящим буфером, при этом раствор вектора может также
содержать соль. Необязательно может присутствовать
стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления вакцину можно составлять в виде инъекционного препарата. Эти составы, содержащие эффективные количества молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или
полипептида, являются либо стерильными жидкими растворами, жидкими суспензиями, либо лиофилизированными вариантами и необязательно содержат стабилизаторы или наполнители.
[0116] Например, рекомбинантный аденовирусный вектор можно хранить в буфере, который также используют для Adenovirus World Standard (Hoganson et al., 2002, Bioprocessing J 1: 43-8): 20 мМ Tris с рН 8, 25 мМ NaCl, 2,5% глицерин. Другой пригодный буфер для составления, подходящий для введения людям, представляет собой 20 мМ Трис, 2 мМ МдС12, 25 мМ NaCl, сахарозы 10% вес/об., полисорбата-80 0,02% вес/об. Другой буфер для составления, который подходит для рекомбинантного аденовируса, содержит 10-25 мМ цитратного буфера, рН 5,9-6,2, 4-6% (вес/вес) гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HBCD), 70-100 мМ NaCl, 0,018-0,035% (вес/вес) полисорбата-80 и необязательно 0,3-0,45% (вес/вес) этанола. Иллюстративный буфер для состава, пригодный для векторов MVA, может представлять собой 10 мМ Tris, 140 мМ NaCl, рН 7,7 (или 7,4) . Безусловно, можно применять множество других буферов, при этом известны некоторые примеры подходящих составов для хранения и для фармацевтического введения очищенных векторов.
[0117] В определенных вариантах осуществления композиция, содержащая вектор, дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, как известно из уровня техники, дополнительно повышают иммунный ответ на используемую антигенную детерминанту. Выражения "адьювант" и "иммуностимулятор" используют в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на полипептиды, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот в векторах по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия, и/или фосфат алюминия, и/или алюминия-калия фосфат; композиции, представляющие собой масляные эмульсии (или композиции типа "масло-в-воде") , в том числе водные эмульсии сквалена, например MF59 (см., например, WO 90/14837); сапониновые составы, например QS21, и комплексы с
иммуностимулирующими свойствами (ISCOM) (смотри, например, US
5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO
2005/002620); бактериальные или микробные производные, примерами
которых являются монофосфорил-липид A (MPL), 3-0-
деацетилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие бактериальные токсины или их мутанты, такие как термолабильный энтеротоксин LT Е. coli, холерный токсин СТ и т. п. Также можно использовать адъювант, кодируемый вектором, например с помощью использования гетерологичной нуклеиновой кислоты, которая кодирует слияние домена олигомеризации С4-связывающего белка (С4Ьр) с антигеном, представляющим интерес (например, Solabomi et al. , 2008, Infect Immun 16: 3817-23), или с помощью использования вектора, кодирующего как трансген, представляющий интерес, так и агонист TLR-3, такой как гетерологичная dsRNA (например, WO 2007/100908), или т. п.
[0118] В других вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению не содержат адъюванты.
[0119] Фармацевтические композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку. Как известно квалифицированному практикующему специалисту, общая доза активного компонента вакцины, получаемая субъектом при однократном введении, может быть различной, и для аденовируса, как правило, составляет от 1х107 вирусных частиц (vp) до lxlO12 vp, предпочтительно от 1х108 vp до lxlO11 vp, например, от ЗхЮ8 to 5х1010 vp, например, от 109 до ЗхЮ10 vp; в случае вируса MVA общая доза вакцины обычно составляет от lxlO5 TCID50 (доза инфицирования культуры ткани) до lxlO10 TCID50, предпочтительно от lxlO7 TCID50 до lxlO10, и более предпочтительно от lxlO8 TCID50 до lxlO9 TCID50.
Введение фармацевтических композиций можно осуществлять с
использованием стандартных путей введения. Неограничивающие
варианты осуществления включают парентеральное введение, такое
как инъекция, например, внутрикожная, внутримышечная и т. д.,
или подкожное или чрескожное введение или введение через
слизистые, например, интраназальное, пероральное,
интравагинальное, ректальное и т. п. В одном варианте осуществления композицию вводят с помощью внутримышечной инъекции, например в дельтовидную мышцу руки или латеральную широкую мышцу бедра. В определенных вариантах осуществления вакцина представляет собой ДНК-вакцину, и ее можно вводить например внутрикожно, например с помощью ДНК-татуирования (см., например, Oosterhuis et al., 2012, Curr Top Microbiol Immunol 351: 221-50). Этот путь также возможен для аденовирусных векторов и поксвирусных векторов. В определенных вариантах осуществления композиция в соответствии с данным изобретением содержит аденовирусный вектор или поксвирусный вектор, или как аденовирусный вектор, так и поксвирусный вектор, и ее вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, такой как вакцина, для индуцирования иммунного ответа на антиген(-ы), присутствующий(-ие) в вакцине.
[0120] Субъект в контексте данного документа, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например грызуна, например мышь, или отличного от человека примата, или человека. Предпочтительно, субъект является субъектом-человеком.
[0121] Вакцины данного изобретения можно применять для лечения пациентов, у которых наблюдается одна из многих стадий заболеваний, вызванных HPV (в частности 16 типа для вакцин, содержащих или кодирующих любую из SEQ ID NO: 1-6, 24 и 28, или 18 типа для вакцин, содержащих или кодирующих любую из SEQ ID NO: 2 0-2 3, 2 5 и 31, или обоими типами в случае вакцин, которые содержат или кодируют сконструированные молекулы как HPV16, так и HPV18, описанные в данном документе), от эпизодической и упорной инфекций, вызванных HPV, как таковых (например, при обнаружении с помощью тестирования на наличие ДНК HPV), таким образом, до формирующихся (пред)раковых поражений, а также интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN, также известной как дисплазия шейки матки и интерстициальная неоплазия шейки матки, которая представляет собой потенциально предопухолевую трансформацию и аномальный рост (дисплазию) чешуйчатых клеток на поверхности шейки матки) вплоть до, и включая, рака шейки матки
(например, плоскоклеточной карциномы шейки матки (SCC)). Кроме
того, мишенями могут быть другие HPV-индуцированные неоплазии,
такие как интраэпителиальная неоплазия вульвы (VIN),
интраэпителиальная неоплазия влагалища (VaIN),
интраэпителиальная неоплазия полового члена (PIN), анальная интраэпителиальная неоплазия (AIN), а также более поздние стадии рака ротоглотки (также известный как рак головы и шеи), рака полового члена, вагинального рака, рака вульвы и анального рака. Таким образом, вакцины по настоящему изобретению могут целенаправленно воздействовать на широкий спектр HPV-индуцированных поражений, и вероятно являются наиболее эффективными на предраковых стадиях HPV-индуцированного заболевания, например при (упорной) инфекции и/или стадиях неоплазии, когда экспрессия Е2, Еб и/или Е7 является наивысшей. Также возможно комбинировать лечение с использованием вакцины по настоящему изобретению с соединениями, которые противодействуют или способны преодолевать механизмы ускользания от иммунологического надзора клеток прогрессирующего рака, например, антителами к PD1/PD-L1, антителами к CTLA-4, такими как ипилимумаб, антителами к LAG-3, антителами к CD25, IDO-ингибиторами, CD40 агонистичными антителами, CD137 агонистичными антителами и т. д. (см., например, Hamid and Carvajal, 2013, Expert Opinion Biol Ther 13: 847-861; Mellman et al. , 2011, Nature Rev 480: 480-89).
[0122] Термин ''лечение'', используемый в данном документе, означает введение вакцины для индуцирования терапевтического иммунного ответа в отношении клеток, которые экспрессируют
(эпитопы) Еб и/или Е7, и/или необязательно Е2 HPV16 или 18 у пациента, что приводит по меньшей мере к снижению уровня и предпочтительно полному устранению инфекции, вызванной HPV16 или 18, что приводит в результате по меньшей мере к замедлению и предпочтительно к прекращению прогрессирования заболевания, вызванного HPV16 или HPV18, такого как виды неоплазии и/или ее симптомы. Предпочтительно, лечение с помощью вакцины приводит также к ремиссии более поздних стадий HPV-индуцированных форм рака. Предпочтительно вводить вакцину пациентам с развившейся
инфекцией, вызванной HPV известного типа, таким образом можно вводить вакцину, которая кодирует полипептид соответствующего типа HPV. При отсутствии скрининга вакцину можно также вводить той части населения, которая вероятно будет инфицирована HPV, т. е. сексуально активным людям. Также возможно вводить вакцину по настоящему изобретению субъектам, которые не были инфицированы HPV16 или 18, например для профилактических целей, возможно в комбинации с вакциной против другого типа HPV, которым был заражен пациент, или, в качестве альтернативы, неинфицированным субъектам. Вакцину по настоящему изобретению можно также вводить субъекту, который подвергается дополнительному лечению другими способами, например хирургическому вмешательству (устранению поражения, вызванного инфекцией, вызванной HPV16 или 18) или лечению имиквимодом (содержащим агонист TLR-7/8, см. например Dayaana et al. , 2010, Br J Cancer 102: 1129-36) . Эффект лечения можно оценить либо с помощью цитологического тестирования, либо с помощью тестирования на наличие HPV.
[0123] В некоторых вариантах осуществления вакцинация и
способы, описанные в данном документе, включают в себя по
меньшей мере однократное введение вакцины данного изобретения
субъекту или пациенту. Также можно проводить одно или несколько
поддерживающих введений одной или нескольких дополнительных
вакцин. Как правило, при проведении поддерживающей вакцинации
эту поддерживающую вакцинацию проводят одному и тому же субъекту
в период времени от одной недели до одного года, предпочтительно
от двух недель до четырех месяцев, после введения иммуногенной
композиции субъекту с тем же антигеном, что и в первый раз
(которое в данном случае называется первичной вакцинацией).
В альтернативных поддерживающих схемах также можно вводить
различные векторы, например одного или нескольких аденовирусов
различных серотипов или другие векторы, такие как на основе MVA,
или ДНК, или белка субъекту в качестве первичной или
поддерживающей вакцинации. В определенных вариантах
осуществления одну и ту же форму вакцины настоящего изобретения вводят по меньшей мере дважды одному и тому же пациенту по схеме прайм-буст, например, тем же рекомбинантным аденовирусом (таким
как Ad2 6) согласно данному изобретению.
[0124] В определенных предпочтительных вариантах осуществления вакцину данного изобретения вводят по меньшей мере дважды по схеме прайм-буст, но в вакцине используют другой вектор, например, используют два разных вирусных вектора, например, первичную вакцинацию проводят рекомбинантным Ad2 6, а поддерживающую - рекомбинантным поксвирусом, или наоборот. Неограничивающие варианты осуществления включают: а) первичную вакцинацию рекомбинантным вектором Ad2 6 и поддерживающую вакцинацию рекомбинантным вектором на основе MVA; Ь) первичную вакцинацию рекомбинантным вектором Ad2 6 и рекомбинантным вектором Ad35 и поддерживающую вакцинацию рекомбинантным вектором MVA; с) первичную вакцинацию рекомбинантным поксвирусным вектором (например, MVA) и поддерживающую вакцинацию рекомбинантным вектором Ad2 6; d) первичную вакцинацию рекомбинантным поксвирусным вектором (например, MVA) и поддерживающую вакцинацию рекомбинантным вектором Ad2 6 и рекомбинантным вектором Ad35; где в каждом случае каждый из первичных и поддерживающих векторов содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую сконструированный полипептид данного изобретения. В определенных предпочтительных вариантах осуществления каждый из первичных и поддерживающих векторов кодируют один и тот же сконструированный полипептид данного изобретения. Каждую из первичной и/или поддерживающей иммунизаций можно необязательно вводить более одного раза одному и тому же субъекту.
[0125] В некоторых вариантах осуществления вакцину или рекомбинантный вирус согласно данному изобретению вводят не менее трех раз по схеме прайм-буст, например, первый раз при первичной вакцинации, а второй и третий раз при двух последующих поддерживающих вакцинациях. В дополнительных вариантах осуществления в схему могут быть добавлены дополнительные поддерживающие вакцинации. Также возможно одновременно или практически одновременно (например, не более чем 10 минут) вводить аденовирусный вектор и вектор на основе MVA (который может находится либо в одной композиции, либо в различных
композициях), для индуцирования иммунного ответа (см., например, W0 2010/073043).
[0126] Также одним аспектом настоящего изобретения является индуцирование CTL-ответа против HPV16 или HPV18 у субъекта, включающее введение субъекту вектора, вакцины или комбинации вакцин согласно данному изобретению. Специалисту будет понятно, что вакцины, которые содержат последовательности HPV16 (например, кодирующие или содержащие любые из SEQ ID NO: 1-6, 2 4 и 28), лучше всего действуют и предназначены для применения против инфекции, вызванной HPV16, тогда как вакцины, которые содержат последовательности HPV18 (например, кодирующие или содержащие любые из SEQ ID NO: 20-23, 25 и 31), лучше всего действуют и предназначены для применения против инфекции, вызванной HPV18.
1. В настоящем изобретении также предусмотрены следующие неограничивающие варианты осуществления:
1) Комбинация вакцин, содержащая:
a) первую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество одного или нескольких рекомбинантных аденовирусных векторов, вместе составляющих первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
b) вторую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
2. где вектор на основе MVA содержит MVA-BN или его производное.
2.
2) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 1, где
обе первая вакцина и вторая вакцина дополнительно содержат
нуклеиновую кислоту, кодирующую пятый полипептид, содержащий
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:
28, и нуклеиновую кислоту, кодирующую шестой полипептид,
содержащий аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ ID N0: 31 .
3) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов
осуществления 1-2, где оба первый и третий полипептиды
дополнительно содержат SEQ ID N0:28, и где оба второй и
четвертый полипептиды дополнительно содержат SEQ ID N0: 31.
4) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 1, где
обе первая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота
кодируют полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 3 или SEQ ID
N0:5, и где обе вторая нуклеиновая кислота и четвертая
нуклеиновая кислота кодируют полипептид, содержащий
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:
22 .
5) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 1-4, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 2, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 21.
6) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 1-5, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 2, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 21.
7) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 1-6, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, содержит SEQ ID N0: 2, и
5)
нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, содержит SEQ ID N0: 21.
8) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 4, где
нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID
N0: 3, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной
последовательности, представленной в SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0:
24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ
ID N0: 22, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной
последовательности, представленной в SEQ ID N0: 23 или SEQ ID
N0: 25.
9) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4 и 8, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
10) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4 и 8-9, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, содержит SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, содержит SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
11) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4 и 8-10, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0: 4, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0: 23.
12) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4 и 8-11, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 4, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 23.
13) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4 и 8-12, где нуклеиновая кислота, кодирующая
9)
полипептид, содержащий SEQ ID NO: 3, содержит SEQ ID NO: 4, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 22, содержит SEQ ID NO: 23.
14) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4 и 8-10, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 3, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 22, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 25.
15) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4, 8-10 и 14, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 3, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 22, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 25.
16) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 4, 8-10 и 14-15, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 3, содержит SEQ ID NO: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 22, содержит SEQ ID NO: 25.
17) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 2-3, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.
18) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 2-3 и 17, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.
19) Комбинация вакцин согласно любому из вариантов осуществления 2-3 и 17-18, где нуклеиновая кислота, кодирующая
14)
полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, содержит SEQ ID NO: 2 9 или SEQ ID NO: 30, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, содержит SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.
20) Комбинация вакцин согласно вариантам осуществления 2-3 и 17-19, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 29, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 32.
21) Комбинация вакцин согласно вариантам осуществления 2-3 и 17-20, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 29, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 32.
22) Комбинация вакцин согласно вариантам осуществления 2-3 и 17-21, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, содержит SEQ ID NO: 2 9, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, содержит SEQ ID NO: 32.
23) Комбинация вакцин согласно вариантам осуществления 2-3 и 17-19, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 30, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 33.
24) Комбинация вакцин согласно вариантам осуществления 2-3, 17-19 и 23, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 30, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 33.
25) Комбинация вакцин согласно вариантам осуществления 2-3, 17-19 и 23-24, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 28, содержит SEQ ID NO: 2 9, и где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 31, содержит SEQ ID NO: 32.
2 6) Комбинации вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-25, где производные MVA-BN характеризуются: i) способностью к репродуктивному воспроизводству в фибробластах
клеток куриных эмбрионов (CEF) и клеточной линии почки детеныша хомяка (ВНК), но они не способны к репродуктивному воспроизводству в клеточных линиях человека HaCat, HeLa и 143В; и ii) неспособностью к репликации в мышиных штаммах, т.е. они не способны производить зрелые В и Т клетки и, как таковые, имеют сильно ослабленный иммунитет и в значительной степени восприимчивы к реплицирующему вирусу.
27) Комбинация вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-2 6, где рекомбинантный аденовирусный вектор выбран из группы, состоящей из гАо!2б и rAd35.
28) Комбинация вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-27, где рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б.
29) Комбинация вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-27, где рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой rAd35.
30) Комбинация вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-29, где первая вакцина содержит первый рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий SEQ ID NO: 1, и второй рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий SEQ ID NO: 20.
31) Вектор на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащий: (а) нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и (b) другую нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22;
где вектор на основе MVA представляет собой MVA-BN или его производное.
32) Вектор на основе рекомбинантного модифицированного
32)
вируса коровьей оспы анкара (MVA) согласно варианту осуществления 31, где вектор на основе MVA содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 2 0.
33) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому одному из вариантов осуществления 31-32, где вектор на основе MVA дополнительно содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 28, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 31.
34) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31-33, где полипептид, содержащий SEQ ID N0:1, дополнительно содержит SEQ ID N0: 28, и где полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, дополнительно содержит SEQ ID N0: 31.
35) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 31, где вектор на основе MVA содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22.
36) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 31, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, является частью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, и где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, является частью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, кодирующий SEQ ID N0: 22.
37) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31-36, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 2, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в
33)
SEQ ID NO: 21.
38) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31-37, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 2, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 21.
39) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31-38, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, содержит SEQ ID N0: 2, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, содержит SEQ ID N0: 21.
40) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31 и 35, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 90% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
41) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35 и 40, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
42) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35 и 40-41, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 3, содержит SEQ ID N0: 4 или SEQ ID N0: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 22, содержит SEQ ID N0: 23 или SEQ ID N0: 25.
43) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35 и 40-42, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 3, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0: 4, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID N0: 22, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0: 23.
38)
44) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35 и 40-43, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 3, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 4, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 22, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 23.
45) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35 и 40-44, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 3, содержит SEQ ID NO: 4, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 22, содержит SEQ ID NO: 23.
4 6) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35 и 40-42, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 3, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 22, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 25.
47) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35, 40-42 и 46, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 3, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 22, по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 25.
48) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31, 35, 40-42 и 46-47, где нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 3, содержит SEQ ID NO: 24, и нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 22, содержит SEQ ID NO: 25.
49) Вектор на основе рекомбинантного MVA, содержащий по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID N0:22, где по меньшей мере одна нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, содержащим по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 6, и нуклеиновую кислоту, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 27 .
47)
50) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 4 9, где промотор содержит по меньшей мере одну из SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0: 27.
51) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 49-50, где промотор представляет собой SEQ ID N0:26.
52) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 49-50, где промотор представляет собой SEQ ID N0:27.
53) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 49-51, где SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 3 функционально связана с SEQ ID N0: 26.
54) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 53, где SEQ ID N0: 3 функционально связана с SEQ ID N0: 26.
55) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 4 9-50 или 52, где SEQ ID N0: 2 0 или SEQ ID N0: 22 функционально связана с SEQ ID N0: 27.
56) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 55, где SEQ ID N0: 22 функционально связана с SEQ ID N0: 27.
57) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 4 9 и 53, где SEQ ID N0: 1 кодируется нуклеиновой кислотой в соответствии с любым из вариантов осуществления 5-7 и 36-39.
58) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 49 и 53-54, где SEQ ID N0: 3 кодируется нуклеиновой кислотой в соответствии с любым из вариантов осуществления 4, 8-16, 35, 36 и 40-48.
59) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 49 и 55, где SEQ ID N0: 20 кодируется нуклеиновой кислотой согласно любому из вариантов осуществления 3-7, 32, 34 и 36-39.
60) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 49 и 55-56, где SEQ ID N0: 22 кодируется нуклеиновой кислотой согласно любому из вариантов осуществления
47)
4, 8-16, 35, 36 и 40-48.
61) Вакцина, содержащая вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 31-60 и фармацевтически приемлемый носитель.
62) Способ лечения упорной инфекции, вызванной HPV, интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки (такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC)), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у субъекта, при этом способ предусматривает введение субъекту вектора, вакцины или комбинации вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-61.
63) Способ индуцирования иммунного ответа против вируса папилломы человека (HPV) у субъекта, при этом способ включает: (а) введение субъекту первой вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество либо
1. (i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, либо
2. (ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
Ь) введение субъекту второй вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий
полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где первую вакцину вводят субъекту в качестве первичной вакцины, а вторую вакцину вводят субъекту в качестве поддерживающей вакцины.
64) Способ индуцирования иммунного ответа против вируса папилломы человека (HPV) у субъекта, при этом способ включает: (а) введение субъекту первой вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество либо
3. (i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, либо (ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
Ь) введение субъекту второй вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где либо первую вакцину, либо вторую вакцину вводят субъекту в качестве первичной вакцины, а другую вакцину вводят
субъекту в качестве поддерживающей вакцины.
65) Способ согласно любому одному из вариантов
осуществления 63-64, где обе первая вакцина и вторая вакцина
дополнительно содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую пятый
полипептид, содержащий аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 28, и нуклеиновую кислоту,
кодирующую шестой полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 31.
66) Способ согласно любому из вариантов осуществления 63-
65, где и первый, и третий полипептиды дополнительно содержат
SEQ ID N0: 28, и где и второй, и третий полипептиды
дополнительно содержат SEQ ID N0: 31.
67) Способ согласно любому одному из вариантов
осуществления 63-66, где первая вакцина содержит первый
рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий первую
нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий
SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 3, и второй рекомбинантный
аденовирусный вектор, содержащий вторую нуклеиновую кислоту,
кодирующую второй полипептид, содержащий SEQ ID N0: 2 0 или SEQ
ID N0: 22 .
68) Способ согласно любому из вариантов осуществления 6367, где SEQ ID N0: 1 кодируется нуклеиновой кислотой в соответствии с любым из вариантов осуществления 5-7 и 36-39.
69) Способ согласно любому из вариантов осуществления 6367, где SEQ ID N0: 3 кодируется нуклеиновой кислотой в соответствии с любым из вариантов осуществления 4, 8-16, 35, 36 и 40-48.
70) Способ согласно любому из вариантов осуществления 6367, где SEQ ID N0: 20 кодируется нуклеиновой кислотой согласно любому из вариантов осуществления 3-7, 32, 34 и 36-39.
71) Способ согласно любому из вариантов осуществления 6367, где SEQ ID N0: 22 кодируется нуклеиновой кислотой согласно любому из вариантов осуществления 4, 8-16, 35, 36 и 40-48.
72) Способ согласно любому из вариантов осуществления 6566, где SEQ ID N0: 28 кодируется нуклеиновой кислотой согласно любому из вариантов осуществления 17-24.
68)
73) Способ согласно любому из вариантов осуществления 65-
66, где SEQ ID N0: 31 кодируется нуклеиновой кислотой согласно
любому из вариантов осуществления 17-24.
74) Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы,
состоящей из SEQ ID N0:24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID
N0: 33.
75) Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID N0:24.
7 6) Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID N0:25.
77) Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID N0: 30.
78) Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID N0:33.
79) Молекула нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 90% или 95% идентична молекулам нуклеиновой кислоты любого одного из вариантов осуществления 7478 .
80) Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты любого одного из вариантов осуществления 74-79.
81) Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты любого одного из вариантов осуществления 74-79.
82) Вектор согласно варианту осуществления 81, где вектор выбран из поксвируса и аденовируса.
83) Вектор согласно любому из вариантов осуществления 8182, где вектор представляет собой поксвирус.
84) Вектор согласно варианту осуществления 83, где поксвирус выбран из ортопоксвируса и авипоксвируса.
85) Вектор согласно варианту осуществления 84, где поксвирус представляет собой ортопоксвирус.
86) Вектор согласно варианту осуществления 85, где ортопоксвирус представляет собой вирус осповакцины.
87) Вектор согласно варианту осуществления 8 6, где вирус осповакцины представляет собой вирус на основе MVA.
88) Вектор согласно варианту осуществления 87, где вирус на основе MVA представляет собой MVA-BN или его производное.
89) Вектор согласно любому из вариантов осуществления 8182, где вектор представляет собой аденовирус.
87)
90) Вектор согласно варианту осуществления 89, где вектор выбран из гАо!2б и rAd35.
91) Комбинация вакцин, содержащая:
(а) первую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество либо
(i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, либо (ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
Ь) вторую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где либо первую вакцину, либо вторую вакцину вводят субъекту в качестве первичной вакцины, а другую вакцину вводят субъекту в качестве поддерживающей вакцины; и
где вектор на основе MVA содержит MVA-BN или его производное.
92) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 91, где полипептид, содержащий SEQ ID NO: 3, кодируется нуклеиновой кислотой в соответствии с любым из вариантов осуществления 4, 816, 35, 36 и 40-48.
92)
93) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 91, где полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, кодируется нуклеиновой кислотой согласно любому из вариантов осуществления 4, 8-16, 35, 36 и 40-48.
94) Применение любых из нуклеиновых кислот, полипептидов, векторов, вакцин или комбинаций вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-61 и 74-93 в лечении любого из: упорной инфекции, вызванной HPV, интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки (такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC)), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у субъекта, нуждающегося в лечении.
95) Применение любых из нуклеиновых кислот, полипептидов, векторов, вакцин или комбинаций вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 1-61 и 74-93 для приготовления фармацевтической композиции или лечебного средства для индуцирования иммунного ответа против вируса папилломы человека (HPV) у субъекта, нуждающегося в этом.
96) Набор, содержащий любые из нуклеиновых кислот,
полипептидов, векторов, вакцин или комбинаций вакцин согласно
любому одному из вариантов осуществления 1-61 и 74-93.
97) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 30, где первый рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б, и второй рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б.
98) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 97, где первый рекомбинантный аденовирусный вектор содержит первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, и второй рекомбинантный аденовирусный вектор содержит вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22.
99) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 91, где первая вакцина содержит иммунологически эффективное количество рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего
97)
первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
100) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 99, где рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой rAd2 б.
101) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 91, где первая вакцина содержит иммунологически эффективное количество первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
102) Комбинация вакцин согласно варианту осуществления 101, где первый рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б, и второй рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б.
103) Комбинация вакцин согласно любому одному из вариантов осуществления 91 и 99-102, где первая вакцина представляет собой первичную вакцину, и вторая вакцина представляет собой поддерживающую вакцину.
104) Способ лечения упорной инфекции, вызванной HPV,
интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной
цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии
влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN),
рака шейки матки (такого как плоскоклеточная карцинома шейки
матки (SCC)), рака ротоглотки, рака полового члена, рака
влагалища или рака анального канала у субъекта, нуждающегося в
этом лечении, при этом способ включает в себя: (а) введение
субъекту первой вакцины, содержащей иммунологически эффективное
количество либо
4. (i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ ID N0:1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, либо
5. (ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и второго рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
Ь) введение субъекту второй вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где первую вакцину вводят субъекту в качестве первичной вакцины, а вторую вакцину вводят субъекту в качестве поддерживающей вакцины.
105) Способ согласно любому одному из вариантов
осуществления 63, 64 или 104, где первая вакцина содержит
иммунологически эффективное количество первого рекомбинантного
аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту,
кодирующую первый полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, и второго
рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего вторую
нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий
SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
106) Способ согласно варианту осуществления 105, где первый
рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б, и
второй рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой
rAd2 6.
107) Способ согласно любому одному из вариантов
осуществления 63, 64 или 104, где первая вакцина содержит
иммунологически эффективное количество рекомбинантного
аденовирусного вектора, содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий SEQ ID NO: 1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий SEQ ID NO: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
108) Способ согласно варианту осуществления 107, где
рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б.
109) Способ согласно любому из вариантов осуществления 104108, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 1, является частью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий SEQ ID NO: 3, и где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий SEQ ID NO: 20, является частью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, кодирующий SEQ ID NO: 22.
110) Вектор на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащий: (а) нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и (b) нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22;
6. где по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из (а) и (Ь) вставлена в межгенную область (IGR) 88/89 MVA.
111) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 110, где нуклеиновые кислоты из обоих (а) и (Ь) вставлена в межгенную область (IGR) 88/89 MVA.
112) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 110-111, где MVA представляет собой MVA-BN или его производное.
113) Вектор на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA) согласно любому из вариантов осуществления 110-112, где вектор на основе MVA содержит
111)
нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 1, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20.
114) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому одному из вариантов осуществления 110-113, где вектор на основе MVA дополнительно содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 28, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 31.
115) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно любому из вариантов осуществления 110-114, где полипептид, содержащий SEQ ID N0:1, дополнительно содержит SEQ ID N0: 28, и где полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, дополнительно содержит SEQ ID N0: 31.
116) Вектор на основе рекомбинантного MVA согласно варианту осуществления 110, где вектор на основе MVA содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 3, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID N0: 22.
[0127] При осуществлении на практике данного изобретения будут применяться, если не указано иное, общепринятые методики иммунологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в компетенции специалистов в данной области техники. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988.
[0128] Настоящее изобретение дополнительно объясняется в нижеприведенных примерах. Примеры не ограничивают данное изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для объяснения данного изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструкция сконструированного полипептида,
содержащего практически все CTL-эпитопы Еб и Е7 HPV16
[0129] Авторы данного изобретения сконструировали новый,
неонкогенный полипептид (и кодирующую его нуклеиновую кислоту),
который содержит практически все CTL-эпитопы белков Еб и Е7
HPV16 и характеризуется минимальным количеством
ожидаемых/прогнозируемых сильных неоэпитопов (неоэпитопы в значении эпитопов, отсутствующих в белках дикого типа Еб и Е7 HPV16). Полипептид настоящего изобретения (также иногда называемый в данном документе ''E6E7SH'') для HPV16 содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая этот полипептид, представлена в SEQ ID NO: 2.
[0130] Молекулы данного изобретения представляют собой отдельные единичные молекулы, что обеспечивает преимущества в получении по сравнению со стратегиями, в которых применяется много молекул. Кроме того, полипептид настоящего изобретения содержит практически все предполагаемые CTL-эпитопы, которые присутствуют в Еб и Е7 дикого типа HPV16, и в то же время содержит минимальное количество ожидаемых/прогнозируемых сильных неоэпитопов, которые могут быть потенциально иммунодоминантными и, таким образом, перенаправлять иммунный ответ от соответствующих CTL-эпитопов дикого типа. Таким образом, конструкции по настоящему изобретению являются иммунологически более предпочтительными, чем молекулы, описанные другими исследователями, которые не содержат каких-либо возможных CTL-эпитопов, и/или содержат большее количество неоэпитопов, или более сильные неоэпитопы.
[0131] Например, конструкция, представленная в EQ ID NO: 1, содержит только один неоэпитоп длиной в девять аминокислот с предсказанным сродством связывания <50 нМ для 2 0 наиболее часто встречающихся HLA-A, 2 0 наиболее часто встречающихся HLA-B и 2 0 наиболее часто встречающихся HLA-C аллелей (HLA-A*01:01, HLA-А*02:01, HLA-A*02:03, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*23:01, HLA-A*24:02, HLA-A*2 6:01, HLA-A*2 9:02, HLA-A*30:01, HLA-A*30:02, HLA-A*31:01, HLA-A*32:01, HLA-A*33:01, HLA-A*33:03, HLA-A*34:01, HLA-A*68:01, HLA-A*68:02, HLA-B*07:02,
HLA-
¦B*07 :
:04,
HLA-B*0 8 :
:01,
HLA-B*13:
01,
HLA-B*15
:01,
HLA-B*
:01,
HLA-
¦B*35:
:01,
HLA-B*37 :
:01,
HLA-B*39:
01,
HLA-B*4 0
:01,
HLA-B*
: 02,
HLA-
¦B*40 :
: 06,
HLA-B*44
: 02,
HLA-B*44:
: 03,
HL-B*46:
:01,
HLA-B*
:01,
HLA-
¦B*51:
:01,
HLA-B*52:
:01,
HLA-B*53:
01,
HLA-B*58
:01,
HLA-C*
: 02,
HLA-
¦C*04 :
:01,
HLA-C*03:
:04,
HLA-C*01:
02,
HLA-C*07
:01,
HLA-C*
: 02,
HLA-
¦C*03 :
: 03,
HLA-C*0 8:
:01,
HLA-C*15:
02,
HLA-C*12
: 02,
HLA-C*
: 02,
HLA-
¦C*05:
:01,
HLA-C*14:
: 02,
HLA-C*03:
02,
HLA-C*16
:01,
HLA-C*
: 02,
HLA-
¦C*12 :
: 03,
HLA-C*04
: 03,
HLA-C*17
: 01
, HLA-C*14:03;
) , как
было
определено с
помощью
ANN
(Lundegaard
et al. r
2008,
Nucl
Acids
Res
36:
W509-12)
и метода SMM
(Peters
al.r
2003,
Bioinformatics 19: 1765-72) для HLA-A и HLA-B, а также метода
NetMHCpan (Hoof et al. r 2009, Immunogenetics 61: 1-13) для HLA-C
инструмента прогнозирования для "пептидного связывания с
молекулами МНС I класса'' на веб-сайте IEDB
(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc binding.html, версия 2009-09-01B).
[0132] В качестве неограничивающего примера, при использовании инструмента прогнозирования SMM на веб-сайте IEDB, ''перетасованные'' последовательности Еб и Е7, описанные в Oosterhuis et al. r 2011, Int J Cancer 129: 397-406 и Ohlschlager et al. r 2006, Vaccine 24: 2880-93, в основной части содержат девять потенциальных сильных уникальных неоэпитопов (ANN или SMM IC50 <50 нМ) для 2 0 наиболее распространенных HLA-A и -В. Это даже исключает добавления, используемые в данном подходе (в котором добавления будут также приводить к дополнительным неоэпитопам и могут упустить более нативные эпитопы МНС II из-за ограниченной длины "перекрывания"). Действительно, по имеющимся сведениям улучшенная молекула, содержащая вариант с "перетасованными" белками Еб и Е7, которые описаны в WO 2013/083287, содержит 22 уникальных неоэпитопа длиной девять аминокислот с прогнозируемой IC50 <50 нМ (ANN, SMM или NetMHCPan) для 2 0 наиболее распространенных HLA-A, 2 0 наиболее распространенных HLA-B и 2 0 наиболее распространенных HLA-C аллелей.
[0133] Следовательно, сконструированные молекулы по настоящему изобретению, несомненно, благоприятны тем, что они
содержат гораздо меньшее количество прогнозируемых неоэпитопов по сравнению с другими известными подходами, где Еб и Е7 "перетасованы" для удаления функциональности.
[0134] Синтезировали нуклеиновую кислоту, кодирующую сконструированную таким образом авторами настоящего изобретения молекулу E6E7SH HPV16 (т. е. полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1), последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 2, и фланкированную сайтом HindiII и последовательностью Kozak на 5'-конце и сайтом Xbal на 3'-конце (синтез по заказу и стандартное молекулярное клонирование в Invitrogen Life technologies, Германия).
[0135] Синтезированные фрагменты клонировали с
использованием HindiII и Xbal в стандартный вектор экспрессии pCDNA2004.Neo, несущий как бактериальный маркер устойчивости (к ампициллину), так и маркер устойчивости млекопитающих (к неомицину), для получения плазмидных векторов, кодирующих молекулу по настоящему изобретению, т. е. для экспериментов на основе (временных) трансфекций.
[013 6] Эти молекулы могут быть использованы как таковые, а
также в качестве основы для последующих молекул, в которых
предусмотрены дополнительные признаки. В качестве
неограничивающих примеров были получены некоторые дополнительные варианты, описанные ниже.
[0137] Последовательность составного белка E6E7SH HPV16
можно комбинировать с последовательностями других ранних белков
HPV16 для целенаправленного воздействия на организмы
индивидуумов с упорной инфекцией и для расширения иммунного
репертуара у иммунизированного индивидуума. Предполагается, что
иммунные ответы в отношении Е2 играют важную роль в устранении
инфекций, вызванных HPV16 (de Jong et al. , 2002, Cancer Res 62:
472-479) . Присоединение E2 к E6E7SH даст компонент вакцины,
который несет антигены против стадий HPV-ассоциированного рака
от упорной инфекции до инвазивного рака или
рецидивирующего/рефрактерного заболевания после операции LEEP. Таким образом, в качестве неограничивающего примера таких
вариантов осуществления авторами данного изобретения получена последовательность, кодирующая составной белок E6E7SH с Е2 на его N-конце. В последовательности Е2 можно выполнять модификации для подавления активности связывания ДНК, которая может влиять на экспрессию генов в клетках, экспрессирующих составной белок. Авторы данного изобретения подвергали мутации глицин в положении 293, лизин в положении 299 и цистеин в положении 300 белка Е2 wt HPV16 соответственно на валин, метионин и аргинин. Каждая из этих мутаций сама по себе уже полностью подавляла связывание Е2 с последовательностями ДНК, которые несут Е2-связывающие домены (Prakash et al., 1992, Genes Dev 6: 105-16).
[0138] Полученный полипептид обозначали как E2E6E7SH HPV16, и он содержал SEQ ID NO: 3. Получали кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую этот полипептид, и она представлена под SEQ ID NO: 4.
[0139] Авторы данного изобретения также сконструировали вариант, в котором тот же мутантный белок Е2 присоединяли к С-концу составного полипептида E6E7SH HPV16, что приводило к образованию полипептида, представленного как E6E7E2SH HPV16, который содержит SEQ ID NO: 5. Последовательность, кодирующая эту конструкцию, представлена как SEQ ID NO: 6.
[0140] Для целей контроля авторы данного изобретения также сконструировали последовательности, кодирующие полипептид, который содержит последовательности дикого типа для полноразмерных Еб и Е7 HPV16 в качестве составного белка (Еб от аа 1 до 158, непосредственно составленный с Е7 от аа 1 до 98, обозначенный в данном документе Е6Е7 wt).
[0141] Авторы данного изобретения также исследовали влияние добавления лидерных последовательностей к полипептиду. В качестве неограничивающего примера, последовательность, кодирующую лидерную последовательность IgE (см., например, US 6733994) [последовательность лидерного пептида представлена в SEQ ID NO: 7], сливали с N-концом некоторых конструкций, например в конструкции Е6Е7 wt, которая представлена LSE6E7 wt, и в конструкции E2E6E7SH, которая представлена LSE2E6E7SH. Под их влиянием существенно (р <0,05) увеличивалась иммуногенность по
сравнению с таким же антигеном без последовательности LS, что измеряли с помощью анализа Е7-тетрамера у иммунизированных мышей (как можно видеть, например, на Фиг. 9).
[0142] Последовательности, которые кодируют полипептиды E6E7SH по настоящему изобретению, с Е2 или без него, могут экспрессироваться, например, с ДНК-конструкций, с РНК или с вирусных векторов. На Фиг. 1 показана экспрессия в клетках НЕК-2 93Т при временной трансфекции ДНК-векторами, экспрессирующими трансгены, которые описаны выше. После трансфекции клетки собирали, и клеточные экстракты анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом к Е7 HPV16. В этом эксперименте видна экспрессия ожидаемых составных белков соответствующего размера после трансфекции векторов экспрессии.
[0143] Аденовирусные векторы можно использовать для экспрессии Е6Е7 либо с Е2, либо без него, и с дополнительными последовательностями или без них для повышения иммуногенности кодируемого составного белка.
[0144] Гены, кодирующие контроль, представляющий собой Е6Е7 wt HPV16, или вышеописанные сконструированные последовательности HPV16 подвергали генной оптимизации для экспрессии у человека и синтезировали согласно Geneart. Последовательность Kozak (5' GCCACC 3') включали непосредственно перед стартовым кодоном ATG, и при этом два стоп-кодона (5' TGA ТАА 3') добавляли в конце соответствующей кодирующей последовательности. Гены вставляли в плазмиду pAdApt35BSU и в плазмиду pAdApt26 (Havenga et al. , 2006, J Gen Virol 87, 2135-43) по сайтам HindiII и Xbal.
[0145] Все аденовирусы выращивали в клетках PER.Сб с помощью однократной гомологичной рекомбинации и получали, как описано ранее (относительно rAd35: Havenga et al. , 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; относительно rAd26: Abbink et al. , 2007, J Virol 81: 4654-63). Клетки PER.C6 (Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17) поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), дополненной 10 мМ МдС12.
[0146] Вкратце, клетки PER.C6 трансфицировали с помощью Ad-векторных плазмид с использованием липофектамина в соответствии
с инструкциями, представленными производителем (Life Technologies). Клетки собирали через один день после достижения полного цитопатического эффекта (СРЕ), подвергали замораживанию-размораживанию, центрифугировали в течение 5 мин. при 3000 об/мин и хранили при -2 0°С. Вирусы очищали методом бляшкообразования и амплифицировали в клетках PER.C6, культивируемых в отдельной лунке 24-луночного планшета для культуры тканей. Дальнейшую амплификацию проводили в клетках PER.C6, культивируемых в колбе для культуры тканей Т2 5 и затем в колбе для культуры тканей Т175. Неочищенные лизаты, приготовленные из клеток, полученных после культивирования в колбе Т175, 3-5 мл, использовали для инокуляции в 24 х Т1000 пятислойных колбах для культуры тканей, содержащих слои клеток PER.C6 с 7 0% конфлюэнтностью. Вирус очищали с помощью способа двухстадийной очистки с использованием CsCl. В заключение, вирус
хранили в аликвотах при -8 5°С.
[0147] Ad35.HPV16-E6E7 wt и Ad35.HPV16-E6E7SH являются
векторами на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 35
(Ad35), содержащими кодон-оптимизированные нуклеотидные
последовательности для экспрессии соответственно составного белка белков Еб и Е7 дикого типа HPV16 (Е6Е7 wt) и вышеописанного сконструированного составного белка, (E6E7SH, с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1). Комбинированные последовательности Еб и Е7 помещали под контроль промотора CMV в область Е1 генома аденовируса с удаленными Е1, ЕЗ. Ad2б.HPV16-Е6Е7 wt и Ad2б.HPV16-E6E7SH являются эквивалентными векторами на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 26.
[014 8] Аналогичным образом были получены рекомбинантные аденовирусные векторы на основе Ad2 6 и Ad35, которые кодируют вариант E2E6E7SH HPV16 (SEQ ID NO: 3). Аналогично были получены Ad26 и Ad35, кодирующие вариант E6E7E2SH HPV16 (SEQ ID NO: 5) . Также был получен вектор Ad35, кодирующий составной белок E2E6E7SH с лидерной последовательностью IgE на N-конце, названный Ad35.HPV16-LSE2E6E7SH. Также был получен контрольный
аденовирус с Е6Е7 wt, составленный с лидерной
последовательностью IgE на N-конце.
[014 9] Рекомбинантные аденовирусы получали на клетках PER.C6 и очищали центрифугированием на градиентах хлорида цезия.
[0150] Дополнительные примеры конструкций, которые были связаны с репрессорными системами, представлены в следующем ниже примере.
Пример 2. Отсутствие трансформирующей активности у сконструированных конструкций HPV16
[0151] Белки Еб и Е7 дикого типа HPV16 обладают онкогенным потенциалом, который проявляется как трансформирующая активность в определенных анализах, как например колониеобразование в анализе с мягким агаром (Massimi and Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Полипептид E6E7SH, описанный в примере 1, содержал фрагменты белков Еб и Е7 в переупорядоченном виде. Предположительно это приведет к устранению онкогенного потенциала, что можно определять, например, по значительно сниженной трансформирующей активности по сравнению с любым из белков Еб и Е7 wt в таких анализах.
[0152] Другие исследователи сообщали, что "генно-перетасованные" варианты Еб и Е7 HPV16 действительно теряли свой онкогенный потенциал (Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Henken et al. , 2012, Vaccine 30: 4259-66), что демонстрирует то, что "перетасовка генов" нейтрализует функции белков Еб и Е7 дикого типа.
[0153] Для оценки потери онкогенных свойств, авторы изобретения оценивали способность конструкций E6E7SH по настоящему изобретению придавать клеткам NIH ЗТЗ способность расти в мягком агаре (как описано, например, в Massimi and Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Трансфекция клеток NIH3T3 с помощью плазмиды, экспрессирующей Е7 дикого типа HPV16, неизменно приводила к колониеобразованию. В этих анализах экспрессия только Еб дикого типа HPV16 не вызывала колониеобразование выше фонового уровня. Это соответствует опубликованным наблюдениям, что в таком анализе Е7 wt намного эффективнее, чем Еб wt (Sedman et al. r 1991, J Virol 65: 4860
бб). Трансфекция с помощью конструкции E6E7SH по настоящему изобретению не приводила к росту колоний клеток в мягком агаре
(фиг. 2) в четырех независимых экспериментах, что продемонстрировало то, что нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид по настоящему изобретению, E6E7SH, утратили трансформирующую способность, которая связана с Е7.
[0154] Онкогенный потенциал Еб и Е7 связан с их способностью снижать уровни клеточных белков р53 и pRb, соответственно. Были проведены анализы разрушения р53 и pRb, чтобы продемонстрировать на молекулярном уровне отсутствие биологической активности, связанной с Еб и Е7 дикого типа, у нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид данного изобретения -конструкцию E6E7SH. Вкратце, Еб wt HPV16 и конструкция E6E7SH экспрессировались в клетках NCI-H1299, у которых отсутствовал эндогенный р53, для анализа разрушения р53. Для анализа разрушения pRb, Е7 wt HPV16 и конструкцию E6E7SH экспрессировали в клетках Saos-2 с нефункциональным pRb. Как можно видеть на фиг. 3, коэкспрессия р53 с Еб wt, но не с E6E7SH, приводила к снижению уровней р53 (рисунки А и В). Аналогично, на рисунках ЗС и 3D показано, что коэкспрессия pRb с Е7 wt, но не с E6E7SH, приводила к снижению уровней pRB. Эти данные демонстрируют, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, не обладает способностью колониеобразования в мягком агаре и не ограничивает биологические активности полипептидов Еб и Е7 дикого типа, а именно, инактивацию р53 и pRb, соответственно.
[0155] Чтобы дополнительно продемонстрировать безопасность
конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид данного
изобретения, авторы изобретения использовали первичные
кератиноциты крайней плоти человека, которые являются
естественными клетками-мишенями для HPV-опосредованной
трансформации. Для иммортализации первичных кератиноцитов человека необходимо действие как Еб, так и Е7 дикого типа
(Munger et al., 1989, J Virol 63: 4417-21) . Вероятно, этот анализ является физиологически наиболее важным анализом in vitro для демонстрации безопасности наших конструкций (Massimi and
Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Клетки,
трансдуцированные лентивирусами, экспрессирующими Еб и Е7 дикого
типа HPV16 (Е6Е7 wt), индуцировали иммортализацию первичных
кератиноцитов, что подтверждается увеличением их
продолжительности жизни по сравнению с нетрансдуцированными контрольными клетками (фиг. 4) и активацией hTERT каталитической субъединицы теломеразы (данные не показаны). Экспрессия полипептида данного изобретения (E6E7SH) не способна продлить продолжительность жизни по сравнению с GFP-трансдуцированными или нетрансдуцированными кератиноцитами. Аналогичные результаты были получены у двух дополнительных независимых доноров (данные не показаны). Все эти данные указывают на то, что наши конструкции утратили способность индуцировать иммортализацию первичных кератиноцитов человека, которые считаются в значительной степени физиологической моделью.
[0156] Другая конструкция, в которой сравнимые фрагменты Еб и Е7 HPV16 рекомбинировали в другом порядке, также была неспособна к иммортализации первичных кератиноцитов крайней плоти человека. Однако для этой конструкции наблюдалась продолжительность жизни, увеличенная до примерно 120-150 дней. Это указывает на некоторую непредсказуемость в данной области и показывает превосходство выбранных сконструированных молекул в соответствии с настоящим изобретением в данном аспекте, связанном с безопасностью.
[0157] Все вместе, эксперименты в данном примере
предоставляют убедительные доказательства отсутствия
трансформирующей активности нуклеиновых кислот, кодирующих сконструированные полипептиды HPV16 в соответствии с настоящим изобретением, и, таким образом, значительно улучшенной безопасности в сравнении с конструкциями Еб и Е7 HPV16.
Пример 3. Иммунные ответы на сконструированные конструкции HPV16 E6E7SH
[0158] Авторы данного изобретения получали ДНК-векторы и аденовирусные векторы, описанные в примере 1.
[0159] Авторы данного изобретения использовали линию мышей
CB6F1 для оценки иммунных ответов, основываясь на первоначальных экспериментах, в которых мышей иммунизировали ДНК-плазмидами, кодирующими Е2, или Еб, или Е7 дикого типа, и иммунизация антигенами Е2, Еб и Е7 HPV16 индуцировала более широкий клеточный иммунный ответ у CB6F1, чем у мышей линии C57BL/6 или мышей линии Balb/c. В отдельном эксперименте мышей иммунизировали ДНК-векторами, кодирующими молекулы по настоящему изобретению, и оценивали клеточные иммунные ответы. Специфичные в отношении Е7 HPV16 иммунные ответы можно оценивать у мышей, иммунизированных ДНК-плазмидами, экспрессирующими E6E7SH (фиг. 5) .
[0160] Следующие данные, показанные в данном примере, получены из экспериментов с мышами, которым были введены аденовирусные векторы.
[0161] Для оценки иммуногенности, индуцированной вакциной, мышей CB6F1 иммунизировали с помощью аденовекторов (Ad35) , экспрессирующих Е6Е7 wt HPV16, LSE6E7 wt, E6E7SH, и аденовекторов, не кодирующих трансген (пустых). Тестировали две дозы для введения мышам: 5*109 вирусных частиц (vp) и 1 * 1010 vp. Через две и восемь недель после иммунизации мышей умерщвляли, и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов Е7 HPV16. Е7-специфичные ответы через две недели и через восемь недель анализировали с помощью IFNy ELISPOT. Данные представлены на Фиг. б.
[0162] Из результатов видно, что иммунизация мышей с помощью Ad35.HPV16-E6E7SH индуцирует Е7-специфические иммунные ответы, которые измерены с помощью анализа ELISPOT. Кроме того, результаты на фиг. б демонстрируют возможность усиления иммунного ответа в отношении экспрессируемого аденовирусного трансгена с помощью добавления к трансгену N-концевой лидерной последовательности.
[0163] Затем исследовали эффект на иммуногенность от добавления Е2 HPV16 к полипептиду E6E7SH HPV16. Векторы Ad35 кодировали полипептиды, которые характеризовались наличием Е2, присоединенного либо к N-концу (E2E6E7SH), либо к С-концу
(E6E7E2SH). Мышей CB6F1 иммунизировали дозой, составляющей lxlO10 vp. На Фиг. 7 (Е7-тетрамерное окрашивание) и Фиг. 8 (рисунок С, IFNy ELISPOT) показаны иммунные ответы в отношении Е7, которые для оригинальных конструкций, включающих Е2, имели тенденцию к повышению по сравнению с конструкцией без Е2, хотя различия не были статистически значимыми. Ответ в отношении Е2 был выше для аденовирусных векторов, кодирующих только Е2, по сравнению с ответом на аденовирусные векторы, у которых Е2 составлен со сконструированным полипептидом E6E7SH (Фиг. 8В) , со значимыми различиями между Е2 и E2E6E7SH и между Е2 и E6E7E2SH (р-значение: <0,05).
[0164] Можно сделать вывод о том, что сконструированные конструкции, которые дополнительно включают Е2, способны все еще обеспечивать иммунный ответ в отношении Е7 и, кроме того, также обеспечивать иммунный ответ в отношении Е2, увеличивая таким образом широту иммунного ответа по сравнению с конструкциями, которые не включают в себя Е2.
[0165] Было показано, что добавление лидерной
последовательности приводит к более высоким Е7-специфичным
ответам при присоединении к N-концу составного белка Еб и Е7
дикого типа (Фиг. 6С) . Аналогичным образом определяли влияние
лидерной последовательности на иммуногенность составного белка
E2E6E7SH. Таким образом, для иммунизации мышей использовали
векторы Ad35, кодирующие сконструированный полипептид HPV16, с
N-концевым Е2 или без него, и вектор Ad35, кодирующий
LSE2E6E7SH, и при этом образцы крови брали с двухнедельными
интервалами для оценки Е7-специфичных иммунных ответов (фиг. 9)
Как показано на фиг. 7 и фиг. 8, присутствие Е2, слитого с
E6E7SH либо на N-конце, либо на С-конце, приводило к усилению
иммунных ответов. Добавление лидерной последовательности IgE
дополнительно усиливало Е7-специфичный ответ (фиг. 9В) . С
течением времени устойчивые иммунные ответы наблюдали для всех
трех аденовирусных векторов, которые кодировали
сконструированные молекулы в соответствии с настоящим изобретением, и самый высокий ответ после иммунизации
соответствовал самым высоким ответам в течение всего эксперимента.
[0166] Можно сделать вывод о том, что ответы, индуцируемые
сконструированной конструкцией, которая дополнительно включает
N-концевой Е2, могут быть усилены с помощью добавления
определенных последовательностей, например лидерной
последовательности IgE, которые нацеливают кодируемый белок на конкретные клеточные отделы.
[0167] Клеточный иммунный ответ в отношении пептид по настоящему изобретению можно индуцировать различными типами аденовирусных векторов. В предыдущем эксперименте авторы данного изобретения использовали векторы Ad35, тогда как в эксперименте на фиг. 10 мышей иммунизировали аденовирусным вектором Ad2 6, экспрессирующим E2E6E7SH HPV16. Данные показывают, что иммунизация с помощью вакцины на основе Ad2 6 также индуцировала Е7-специфичные Т-клетки. Кроме того, результаты показывают, что вторая иммунизация с помощью аденовирусного вектора Ad35, экспрессирующего E2E6E7SH HPV16, дополнительно стимулировала клеточные иммунные ответы (фиг. 10).
Пример 4. Иммуногенность сконструированных конструкций HPV16 у макаков-резус.
[0168] Для оценки способности аденовирусных векторов, экспрессирующих сконструированную последовательность по настоящему изобретению, индуцировать иммунные ответы у приматов, отличных от человека, макаков-резус иммунизировали с помощью внутримышечной инъекции аденовекторов (Ad2 6), экспрессирующих E2E6E7SH HPV16, или аденовекторов, не кодирующих трансген (пустых), с дозой, составляющей l*10N vp. Через восемь недель после иммунизации иммунные ответы стимулировали с помощью иммунизации векторами Ad2 6, экспрессирующими тот же антиген. На 16 неделе животные получали еще одну инъекцию, содержащую векторы Ad35, экспрессирующие тот же антиген. Образцы крови брали в нескольких моментах времени, и выделенные белые клетки крови стимулировали в течение ночи пулами пептидов, соответствующими Е2, Еб или Е7 HPV16. Специфичные ответы
оценивали с помощью IFNy ELISPOT. Данные представлены на фиг. 11. Кроме того, на 10 неделе и 18 неделе после первичной иммунизации оценивали клеточный иммунный ответ, специфичный в отношении пептидов, охватывающих новые сочетания в настоящем изобретении. Индуцирование ответа IFNy у всех животных было ниже предела обнаружения, составляющего < 50 SFU на 1 * 106 РВМС (данные не показаны).
[0169] Из данных видно, что иммунизация приматов, отличных от человека, с помощью Ad2б.HPV16-E2E6E7SH приводила к клеточным иммунным ответам на все три белка HPV16, которые присутствуют в кодируемом трансгене, но не против новых сочетаний. Ответы могли быть усилены за счет дополнительной иммунизации с помощью Ad2б.HPV16-E2E6E7SH, и дополнительная поддерживающая доза на 16 неделе с соответствующим вектором Ad35 дополнительно усиливала иммунные ответы, специфичные в отношении Е2, Еб и Е7 HPV16.
[0170] В отдельном эксперименте (не показан) макаков-резус иммунизировали с помощью интравагинального введения комбинации двух аденовирусных векторов, один из которых экспрессирует E6E7SH HPV16, а другой - белок LI HPV16. Низкие, но обнаруживаемые, клеточные ответы измеряли в периферических мононуклеарных клетках крови как в отношении Еб, так и в отношении Е7. В этих экспериментах были выявлены сильные клеточные иммунные ответы в отношении L1.
Пример 5. Терапевтическая эффективность на мышиной модели опухоли.
[0171] Полипептид данного изобретения для HPV16 (содержащий SEQ ID NO: 1) способен индуцировать HPV1б-специфичный клеточный иммунный ответ у животных, который может оказывать терапевтический эффект в отношении клеток, экспрессирующих Еб и/или Е7 HPV16. Терапевтическую иммунизацию, т. е. иммунизацию после начала роста опухоли, можно применять для демонстрации эффективности кандидата терапевтической вакцины против HPV. Терапевтический эффект векторов Ad2 6 и Ad35 исследовали на мышах, которым инъецировали клетки ТС-1 (клетки мыши, экспрессирующие Еб и Е7 HPV16) (Lin et al. r 1996, Cancer Res 56:
21-6) . Клетки ТС-1 образовывали солидную опухоль в течение от нескольких дней до недель после подкожной инъекции мышам. Без вакцины опухоли быстро росли и достигали предопределенного размера, составляющего 1000 мм3, в течение 30 дней (рисунки D и Е) . После достижения данного размера мышей умерщвляли из соображений этики.
[0172] Вместе с иммунизацией по схеме прайм-буст с помощью SLP (использованных в качестве положительного контроля; Renter et al., 2009, N Engl J Med 361:1838-47; Zwaveling et al. , 2002, J Immunol 169:350-8) или аденовирусных векторов, экспрессирующих HPV16-E2E6E7SH, наблюдали заметное снижение роста опухолей, индуцированных ТС-1 (Фиг. 12, рисунки В и С) . Более детальное изучение первых 3 0 дней после примирующих иммунизаций (рисунки F и G) показало, что иммунизация аденовекторами, экспрессирующими E2E6E7SH, характеризуется существенно большим воздействием на рост опухолей, чем иммунизация с помощью SLP. Начальная скорость роста являлась намного более низкой, и в большинстве случаев опухоли сжимались. У 3 из 11 мышей, иммунизированных аденовирусными векторами, опухоли были полностью устранены, что отображено на графике выживания (рисунок Н).
[0173] В заключение, иммунизация аденовирусными векторами, экспрессирующими сконструированный полипептид HPV16 по настоящему изобретению, значительно снижала рост опухолей или полностью устраняла развившиеся опухоли в общепринятой модели контрольного заражения для рака, индуцированного HPV16.
Пример 6. Применение репрессорных систем для улучшения продуктивности и генетической стабильности аденовирусных векторов, экспрессирующих антигены, полученные из HPV.
[0174] Ранее сообщалось о том, что трансгены, вставленные в аденовирусные векторы под контролем сильных конститутивно активных промоторов, могут, в зависимости от свойств трансгенного продукта, отрицательно воздействовать на продукцию векторов (Yoshida & Yamada, 1997, Biochem Biophys Res Commun 230:426-30; Rubinchik et al., 2000, Селе Ther 7:875-85; Matthews et al., 1999, J Gen Virol 80:345-53; Edholm et al. , 2001, J Virol 75:9579-84; Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73).
Примеры затруднений в отношении продуктивности векторов, зависящей от трансгенов, включают недостаточные "спасение" и рост векторов, низкие конечные выходы векторов и, в ряде случаев, быстрое увеличение количества вирусных мутантов с дефектными кассетами трансгена. Для решения этих затруднений с помощью множества исследований изучали возможность сайленсинга экспрессии трансгенов векторов во время репликации векторов в клетках-продуцентах (Matthews et al. , 1999, J Gen Virol 80:34553; Edholm et al., 2001, J Virol 75:9579-84; Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73; Cottingham et al. r 2012, Biotechnol Bioeng 109:719-28; Gilbert et al., 2014, J Virol Methods 208:177-88). В связи с этим, в случае Ad-векторов ранее внедряли различные репрессорные системы, и при этом действительно было показано, что они улучшают продуктивность векторов и генетическую стабильность векторов, кодирующих различные типы (ингибиторных) трансгенов.
[0175] Обнаружили, что у некоторых из аденовирусных векторов, описанных в данном документе, а также у некоторых других аденовирусных векторов, кодирующих определенные варианты антигенов HPV, проявлялись некоторые из затруднений в отношении продуктивности векторов, зависящей вышеописанных от трансгенов, и таким образом их возможно можно дополнительно улучшить в данном отношении. Таким образом, авторам данного изобретения хотелось изучить, может ли применение систем для репрессии экспрессии трансгенов векторов улучшить характеристики продукции Ad-векторов, экспрессирующих антигены, полученные из HPV, как те, что описаны в данном документе. С этой целью авторы данного изобретения внедряли две существующие системы репрессора-оператора, т.е. TetR/TetO (Yao & Eriksson, 1999, Hum Gene Ther 10:419-22, EP0990041B1) и CymR/CuO (Mullick et al. , 2006, BMC Biotechnol 6:43), в платформу аденовирусного вектора данного изобретения. Как систему TetR/TetO, так и систему CymR/CuO ранее применяли другие исследователи для улучшения продуктивности аденовирусных векторов посредством сайленсинга трансгенов векторов во время репликации векторов (Gall et al. r 2007, Mol Biotechnol 35:263-73; Cottingham et al. r 2012, Biotechnol Bioeng
109:719-28; Gilbert et al., 2014, J Virol Methods 208:177-88). Внедрение этих двух систем включало выработку аденовирусных векторов, экспрессирующих гены, представляющие интерес, под контролем промоторов CMV, содержащих последовательность либо TetO, либо СиО. Более того, внедрение предусматривало получение линий клеток, стабильно экспрессирующих соответствующие родственные репрессорные белки (т. е. TetR или CymR).
[0176] Получали несколько векторов на основе Ad26 и Ad35 с
удаленным Е1, в которых последовательности, кодирующие
гетерологичные полипептиды, были функционально связанны с
промотором CMV, содержащим последовательности либо оператора
TetO, либо опрератора СиО. Вначале, определенные
последовательности, содержащие TetO или CuO (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно) вставляли возле сайта начала транскрипции (TSS) промотора CMV (SEQ ID NO: 13) плазмид pAdapt26 и pAdapt35.Bsu (Abbink et al. , 2007, J Virol 81:465463; Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87:2135-43). Последовательности, содержащие оператор, вставляли точно в те же положения промотора CMV, как было ранее описано для двух систем (Yao & Eriksson, 1999, Human Gene Ther 10:419-22; ЕР 0990041 Bl; Mullick et al., 2006, BMC Biotechnol 6:43; EP 1385946 Bl). В частности, родственные с TSS последовательности (как первоначально установлено; Stenberg et al. 1984, J Virol 49:1909) , содержащие TetO и CuO, вставляли непосредственно ниже положений -20 и +7, соответственно. В SEQ ID NO: 13 эти два положения соответствуют положениям 716 и 742, соответственно. Полученные промоторы CMV, содержащие операторы, назвали соответственно CMVTetO и CMVCuO. Далее, различные трансгены вставляли ниже (модифицированных) промоторов CMV полученных конструкций с использованием сайтов рестрикции Hindlll и Xbal. Эти трансгены включали гены, кодирующие составной белок зеленого флуоресцентного белка и люциферазы (GFP-Luc), LSE2E6E7SH HPV16, описанный выше в примере 1, и другой полипептид с некоторым сходством с LSE2E6E7SH HPV16 (конструкция, называемся в данном примере ' 'HPVAg' ') . HPVAg содержит ту же лидерную последовательность, что и присутствующая в LSE2E6E7SH, а также
последовательности Е2, Еб и Е7 HPV16. С применением способов, описанных в данном документе, полученные модифицированные плазмиды pAdapt2 6 и pAdapt35.Bsu использовали для получения аденовирусных векторов, экспрессирующих вышеупомянутые репортер и трансгены HPV под контролем промотора либо CMVTetO, либо CMVCuO.
[0177] Линии клеток, экспрессирующих либо TetR, либо CymR,
получали с помощью стабильной трансфекции клеток PER.C6(r) с
использованием соответственно плазмиды pcDNA(tm)6/TR
(LifeTechnologies, V1025-20) и производного pcDNA(tm)6/TR, у которых последовательность, кодирующая TetR (SEQ ID NO: 14, которая кодирует полипептид SEQ ID NO: 15) заменена на кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую CymR (SEQ ID NO: 16, которая кодирует полипептид SEQ ID NO: 17). Получение стабильных линий клеток выполняли в основном как описано у поставщика pcDNA(tm)6/TR с использованием анализа, основанного на временной трансфекции, для скрининга в отношении клонов клеток, способных репрессировать экспрессию генов, которые находятся под управлением CMVTetO или CMVCuO. Полученные линии клеток PER.Сб/TetR и PER.C6/CymR анализировали в отношении их способности репрессировать экспрессию трансгена во время репликации векторов в этих клетках. Эксперименты, проводимые с векторами, экспрессирующими GFP-Luc под контролем промоторов CMV, содержащих операторы, показывают по меньшей мере 10-кратное снижение экспрессии гена люциферазы на протяжении полного цикла репликации вируса в линиях клеток, экспрессирующих репрессор, соответствующий соответственным последовательностям оператора
(данные не показаны). Это подтверждает то, что линии клеток PER.Сб/TetR и PER.C6/CymR были способны репрессировать экспрессию трансгена вектора в случае репликации аденовирусных векторов.
[0178] Эффект опосредованной TetR и CymR репрессии экспрессии трансгена аденовектора в отношении выходов векторов изучали для векторов на основе Ad35, экспрессирующих HPVAg (фиг. 13А) . С даной целью линии клеток PER.C6, PER.Сб/TetR и
PER.C6/CymR, высеянные при 3*105 клеток на лунку в лунки 24-луночного планшета, подвергали инфицированию в четырех параллельных анализах - по 1000 вирусных частиц на клетку и на протяжении трех часов - с помощью векторов, экспрессирующих HPVAg из промотора CMVTetO либо промотора CMVCuO. В качестве контролей, проводили параллельные инфицирования соответствующими векторами, экспрессирующими GFP-Luc вместо HPVAg. Через четыре дня после инфицирования неочищенные вирусные лизаты получали, подвергая содержимое лунок (т. е. инфицированные клетки и среду) двум циклам замораживания-размораживания. Титры аденовекторов последовательно определяли с помощью протокола, основанного на количественной ПЦР, специфичной к последовательности гексонов Ad35, при котором используется очищенный вектор Ad35 с известным титром вирусных частиц в качестве стандарта. Результаты показывают, что векторы Ad35, кодирующие HPVAg, которые содержат как TetO, так и СиО, по сравнению с контрольными векторами, экспрессирующими GFP-Luc, проявляли сниженные выходы векторов для нормальных клеток PER.Сб. Для сравнения, при получении в клетках, экспрессирующих их родственные репрессоры (т. е. соответственно TetR и CymR), те же векторы давали выходы столь же высокие, как и те, что получены с контрольными векторами. Эти данные показывают, что репрессия экспрессии трансгена во время продукции векторов в клетках-продуцентах может быть выгодной для продуктивности векторов Ad35, переносящих HPVAg в качестве трансгена.
[0179] Эффект в отношении того, что репрессия экспрессии трансгена аденовектора может влиять на выходы векторов, также изучали для векторов, полученных из аденовируса серотипа 2 6 (Ad2 6) (фиг. 13В) . В анализе, выполненном практически как описано выше для векторов Ad35, векторы Ad2 6, несущие трансгены, контролируемые промотором CMVTetO, кодирующие либо GFP-Luc, HPVAg либо LSE2E6E7SH, использовали для инфицирования клеток PER.C6 и PER.Сб/TetR при 1500 вирусных частицах на клетку. Через три дня области инфицирования собирали и титры вирусных частиц определяли с помощью способа, основанного на количественной ПЦР, специфичной к последовательности гексонов Ad2 6. Результаты
показывают, что для клеток PER.Сб выходы векторов, кодирующих HPVAg и LSE2E6E7SH, являются более низкими, чем наблюдаемые для контрольных векторов, кодирующих GFP-Luc. В противоположность этому, для клеток PER.Сб/TetR оба эти вектора продемонстрировали титры, которые являлись столь же высокими, как и те, что получали для контрольного вектора. Вместе с результатами выше (для векторов Ad35), данные продемонстрировали, что подавление экспрессии трансгена во время продукции аденовектора повышало выходы векторов, экспрессирующих HPVAg и LSE2E6E7SH.
[0180] Авторы данного изобретения наблюдали существенные затруднения, касающиеся генетической стабильности аденовирусного вектора, который нес трансген для HPVAg, управляемый промотором CMV. Например, было обнаружено, что после нескольких циклов пассирования данного вектора в PER.C6 большая часть популяции вектора состояла из мутантного вектора, который характеризовался крупной делецией в последовательности, кодирующей HPVAg (данные не показаны).
[0181] Авторы данного изобретения полагали, что использование репрессорной системы экспрессии трансгена, как например одной из двух вышеописанных, может предотвратить затруднения в отношении генетической стабильности, связанные с трансгенами, такими как HPVAg, которые являются ингибиторными для роста векторов. Чтобы изучить это, векторы на основе Ad35 с экспрессией HPVAg, управляемой промотором CMVCuO, оценивали в отношении стабильности кассеты трансгена при росте вектора либо в клетках PER.C6, либо в клетках PER.C6/CymR (фиг. 14). Коротко, ДНК вектора трансфицировали в две различные линии клеток, и полученным вирусным бляшкам обеспечивали возможность роста под агарозным слоем. Для каждой из двух трансфекций выделяли пять вирусных бляшек и дополнительно раздельно пассировали в той же линии клеток (т. е. в той же, которую использовали для трансфекции) в течение десяти последовательных вирусных пассажей. Целостность трансгена оценивали с помощью ПЦР-амплификации кассеты трансгена при вирусном пассаже номер десять (VPN10) и последующего анализа полученных продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза и секвенирования по Сэнгеру. В
дополнение, в VPN7 пассированные вирусные клоны оценивали в отношении их способности экспрессировать HPVAg. Это осуществляли с использованием пассированых вирусных изолятов для инфицирования клеток А54 9 при 1000 вирусных частицах на клетку, с лизисом клеток через 4 8 часов после инфицирования и последующим анализом экспрессии HPVAg с помощью вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела, направленного против Е7 HPV16 (Santa-Cruz Biotechnology). Результаты анализов гель-электрофореза и секвенирования продемонстрировали, что каждый из всех пяти вирусных изолятов, которые пассировали в PER.C6, характеризовались либо небольшими делециями со сдвигом рамки считывания, либо мутациями с образованием преждевременного стоп-кодона в пределах кассеты трансгена. Для сравнения, такие делеции или мутации нельзя выявить ни в одном из изолятов векторов, которые пассировали в линии клеток, экспрессирующей CymR (PER.Сб/CymR). В соответствии с этими данными, все размноженные в PER.Сб/CymR изоляты векторов были способны экспрессировать HPVAg, в то время как векторы, выращенные в PER.C6, полностью утрачивали эту способность, что позволило предположить наличие дефектных кассет трансгена для этих векторов. В заключение, данные авторов этого исследования демонстрируют, что использование репрессорной системы, как например системы CymR/CuO, для репрессии экспрессии трансгена вектора в ходе размножения вектора является эффективным средством для предотвращения серьезной нестабильности кассеты трансгена, как например той, которую наблюдали для векторов, несущих трансген, экспрессирующий HPVAg.
Пример 7. Конструкция сконструированного полипептида, содержащего практически все CTL-эпитопы Еб и Е7 HPV18
[0182] Подобно конструкции для Еб и Е7 HPV16 по настоящему
изобретению, авторы данного изобретения сконструировали новый,
неонкогенный полипептид (и кодирующую его нуклеиновую кислоту),
который содержит практически все CTL-эпитопы белков Еб и Е7
HPV18 и характеризуется минимальным количеством
ожидаемых/прогнозируемых сильных неоэпитопов (неоэпитопы в значении эпитопов, отсутствующих в белках дикого типа Еб и Е7
HPV18). Полипептид данного изобретения для HPV18 (также иногда называемый в данном документе ''E6E7SH'' HPV18) содержал аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20. Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая этот полипептид, представлена в SEQ ID NO: 21.
[0183] Молекулы по настоящему изобретению для HPV18 обладали теми же преимуществами, как описано в примере 1 для HPV16. Они представляют собой отдельные молекулы, что обеспечивает преимущества в получении по сравнению со стратегиями, в которых применяется много молекул. Кроме того, полипептид данного изобретения содержит практически все предполагаемые CTL-эпитопы, которые присутствуют в Еб и Е7 дикого типа HPV18, и в то же время содержит минимальное количество ожидаемых/прогнозируемых сильных неоэпитопов, которые могут быть потенциально иммунодоминантными и, таким образом, перенаправлять иммунный ответ от соответствующих CTL-эпитопов дикого типа. Таким образом, конструкции настоящего изобретения являются иммунологически более благоприятными, чем молекулы, описанные другими исследователями, которые не содержат каких-либо возможных CTL-эпитопов, и/или содержат большее количество неоэпитопов, или более сильные неоэпитопы.
[0184] Например, сконструированная конструкция HPV18 под SEQ ID NO: 2 0 содержит только пять неоэпитопов с длиной, составляющей девять аминокислот, с прогнозируемой аффинностью связывания, составляющей <50 нМ для 2 0 наиболее распространенных аллелей HLA-A, 2 0 наиболее распространенных HLA-B и 2 0 наиболее распространенных HLA-C, как описано в примере 1 для сконструированной конструкции HPV16 (содержащей SEQ ID NO: 1).
[0185] Синтезировали нуклеиновую кислоту, кодирующую сконструированную таким образом авторами данного изобретения молекулу E6E7SH HPV18 (т. е. полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID N0:20), последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 21, и фланкированную сайтом HindiII и последовательностью Kozak на 5'-конце и сайтом Xbal на 3'-конце (синтез по заказу и стандартное молекулярное клонирование в Invitrogen Life
technologies, Германия).
[018 6] Синтезированные фрагменты клонировали с
использованием HindiII и Xbal в стандартный вектор экспрессии pCDNA2004.Neo, несущий как бактериальный маркер устойчивости (к ампициллину), так и маркер устойчивости млекопитающих (к неомицину), для получения плазмидных векторов, кодирующих сконструированную молекулу HPV18 по настоящему изобретению, т. е. для экспериментов на основе (временных) трансфекций.
[0187] Эти молекулы могут быть использованы как таковые, а
также в качестве основы для последующих молекул, в которых
предусмотрены дополнительные признаки. В качестве
неограничивающих примеров были получены некоторые дополнительные варианты, описанные ниже.
[0188] Последовательность составного белка E6E7SH HPV18 можно комбинировать с последовательностями других ранних белков HPV18 для целенаправленного воздействия на организмы индивидуумов с упорной инфекцией и для расширения иммунного репертуара у иммунизированного индивидуума. В качестве неограничивающего примера таких вариантов осуществления авторы данного изобретения получали последовательность, кодирующую составной белок E6E7SH с Е2 на его N-конце. Авторы данного изобретения подвергали мутации глицин в положении 2 94, лизин в положении 300 и цистеин в положении 301 белка Е2 wt HPV18 (Genbank: ААР20597.1) соответственно на валин, метионин и аргинин для подавления активности связывания ДНК. Каждая из этих мутаций сама по себе уже полностью подавляла связывание Е2 с последовательностями ДНК, которые несут Е2-связывающие домены (Prakash et al., 1992, Genes Dev 6: 105-16).
[0189] Полученный полипептид обозначали как E2E6E7SH HPV18, и он содержал SEQ ID NO: 22. Получали кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую этот полипептид, и она представлена под SEQ ID NO: 23.
[0190] Последовательности, которые кодируют полипептиды E6E7SH HPV18 по настоящему изобретению, с Е2 или без него, могут экспрессироваться, например, с ДНК-конструкций, с РНК или с вирусных векторов. На Фиг. 15 показана экспрессия в клетках НЕК
2 93Т при временной трансфекции ДНК-векторами, экспрессирующими вышеописанные трансгены. После трансфекции клетки собирали, и клеточные экстракты анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом, которое распознает Еб HPV18. В этом эксперименте видна экспрессия ожидаемых составных белков соответствующего размера после трансфекции векторов экспрессии.
[0191] Аденовирусные векторы можно использовать для экспрессии Е6Е7 либо с Е2, либо без него, и с дополнительными последовательностями или без них для повышения иммуногенности кодируемого составного белка.
[0192] Гены, кодирующие вышеописанные сконструированные последовательности HPV18, подвергали генной оптимизации для экспрессии у человека и синтезировали согласно Geneart. Последовательность Kozak (5' GCCACC 3') включали непосредственно перед стартовым кодоном ATG, и при этом два стоп-кодона (5' TGA ТАА 3') добавляли в конце соответствующей кодирующей последовательности. Гены вставляли в плазмиду pAdApt35BSU и в плазмиду pAdApt26 (Havenga et al. , 2006, J Gen Virol 87, 213543) по сайтам HindiII и Xbal.
[0193] Ad35.HPV18- E6E7SH являлся вектором на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (Ad35), содержащим кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности для экспрессии вышеописанного сконструированного варианта составного белка HPV18 (E6E7SH HPV18, с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 20) . Комбинированные последовательности Еб и Е7 помещали под контроль промотора CMV в область Е1 генома аденовируса с удаленными Е1, ЕЗ. Ad2 6.HPV18-E6E7SH являлся эквивалентным вектором на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 26.
[0194] Аналогичным образом были получены рекомбинантные аденовирусные векторы на основе Ad2 6 и Ad35, которые кодируют вариант E2E6E7SH HPV18 (SEQ ID NO: 22).
[0195] Все аденовирусы выращивали, получали, очищали и хранили как описано в примере 1 выше.
Пример 8. Отсутствие трансформирующей активности у сконструированных конструкций HPV18
[0196] Белки Еб и Е7 HPV18 обладали онкогенным потенциалом, который проявлялся как трансформирующая активность в определенных анализах, как например колониеобразование при анализе с мягким агаром (Massimi and Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Полипептид E6E7SH, описанный в примере 7, содержал фрагменты белков Еб и Е7 в переупорядоченном виде. Предположительно это приводило к устранению онкогенного потенциала, что может быть определено, например, по отсутствию трансформирующей активности по сравнению с любым из белков Еб и Е7 wt в таких анализах.
[0197] Другие исследователи сообщали, что "генно-перетасованные" варианты Еб и Е7 HPV16 действительно теряли свой онкогенный потенциал (Ohlschlager et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Henken et al. , 2012, Vaccine 30: 4259-66), что демонстрировало то, что "перетасовка генов" нейтрализовала функции белков Еб и Е7 HPV16 дикого типа. В примере 2 авторы данного изобретения показали, что сконструированная конструкция для HPV16 по настоящему изобретению утратила свои активности Еб и Е7 .
[0198] Для оценки потери онкогенных свойств авторы данного изобретения оценивали способность конструкции E6E7SH HPV18 по настоящему изобретению придавать способность клеткам NIH ЗТЗ расти в мягком агаре (как описано, например, в Massimi and Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Трансфекция клеток NIH3T3 с помощью плазмиды, экспрессирующей Е7 дикого типа HPV18, неизменно приводила к колониеобразованию. Подобно результатам, полученным с помощью Еб HPV16, экспрессия только Еб дикого типа HPV18 не вызывала колониеобразование выше фонового уровня. Трансфекция с помощью конструкции E6E7SH HPV18 по настоящему изобретению не приводила к росту колоний клеток в мягком агаре (Фиг. 16) в четырех независимых экспериментах, что продемонстрировало то, что нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид данного изобретения, E6E7SH HPV18, утратили трансформирующую способность, которая связана с Е7.
[0199] Онкогенный потенциал Еб и Е7 связан с их способностью снижать уровни клеточных белков р53 и pRb,
соответственно. Анализы разрушения р53 и pRb проводили для демонстрации того, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид данного изобретения - E6E7SH HPV18 - не обладала биологической активностью на молекулярном уровне, связанной с Еб и Е7 дикого типа. Вкратце, для анализа разрушения р53, Еб wt HPV18 и конструкцию E6E7SH HPV18 по настоящему изобретению экспрессировали в клетках NCI-H1299, у которых отсутствовал эндогенный р53. Для анализа разрушения pRb Е7 wt HPV18 и конструкцию E6E7SH HPV18 экспрессировали в клетках Saos-2 с нефункциональным pRb. Как можно видеть на фиг. 17, коэкспрессия р53 с Еб wt HPV18, но не с E6E7SH HPV18, приводила к снижению уровней р53 (рисунки А и В) . Аналогично, на рисунках 17C,D показано, что коэкспрессия pRb с Е7 wt HPV18, но не с E6E7SH HPV18, приводит к снижению уровней pRB. Эти данные продемонстрировали, что нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированный полипептид HPV18 по настоящему изобретению, не обладает способностью колониеобразования в мягком агаре и не ограничивает основные биологические активности полипептидов Еб и Е7 дикого типа HPV18, а именно, инактивацию р53 и pRb, соответственно.
[0200] Для дополнительной демонстрации безопасности конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид по настоящему изобретению, авторы данного изобретения использовали первичные генитальные кератиноциты человека, полученные из неонатальной крайней плоти (клетки НЕКп), которые очень напоминают естественные клетки-мишени для HPV-опосредованной трансформации. Для иммортализации первичных кератиноцитов человека необходимо действие как Еб, так и Е7 дикого типа (Munger et al., 1989, J Virol 63: 4417-21) . Вероятно, этот анализ является физиологически наиболее важным анализом in vitro для демонстрации безопасности конструкций по настоящему изобретению (Massimi and Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 3813 95) . Клетки, трансдуцированные лентивирусами, экспрессирующими Еб и Е7 дикого типа HPV18 (Е6Е7 wt) , индуцировали иммортализацию первичных кератиноцитов, что подтверждается увеличением их продолжительности жизни по сравнению с нетрансдуцированными
контрольными клетками (фиг. 18) и активацией hTERT
каталитической субъединицы теломеразы (данные не показаны).
Экспрессия сконструированного полипептида HPV18 по настоящему
изобретению (E6E7SH HPV18) не способна продлить
продолжительность жизни по сравнению с GFP-трансдуцированными или нетрансдуцированными кератиноцитами. Аналогичные результаты были получены у двух дополнительных независимых доноров (данные не показаны). Все эти данные указывают на то, что конструкции по настоящему изобретению утратили способность индуцировать иммортализацию первичных кератиноцитов человека, которые считаются в значительной степени физиологической моделью.
[0201] Другая конструкция, в которой сравнимые фрагменты Еб и Е7 HPV18 рекомбинировали в другом порядке, также была неспособна к иммортализации первичных кератиноцитов крайней плоти человека. Однако, сходным образом с результатами для альтернативной последовательности Е6Е7 в случае HPV16 (см. пример 2), увеличенную продолжительность жизни наблюдали для альтернативной конструкции HPV18. Это указывает на некоторую непредсказуемость в данной области и показывает превосходство выбранных сконструированных молекул согласно данному изобретению в данном связанном с безопасностью аспекте.
[02 02] Все вместе эксперименты в данном примере дают убедительные доказательства отсутствия трансформирующей активности нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды согласно данному изобретению, и, таким образом, значительно улучшенной безопасности по сравнению с конструкциями Еб wt и Е7 HPV18.
Пример 9. Иммунные ответы на сконструированные конструкции HPV18 E6E7SH
[02 03] Авторы данного изобретения получали ДНК-векторы и
аденовирусные векторы, описанные в примере 7. Для оценки
иммуногенности, индуцированной вакциной, мышей CB6F1
иммунизировали с помощью аденовекторов (Ad35), экспрессирующих E6E7SH или E2E6E7SH HPV18, или аденовекторов, не кодирующих трансген (пустых) в качестве контролей. Через две недели после первичной иммунизации мышей умерщвляли и выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи пулами из 15-мерных пептидов Еб
HPV18. Еб-специфичные иммунные ответы анализировали с помощью окрашивания внутриклеточных цитокинов. В отдельном эксперименте мышей CB6F1 иммунизировали аденовекторами (Ad35 или Ad26), экспрессирующими E2E6E7SH HPV18, или аденовекторами, не кодирующими трансген (пустыми) в качестве контроля.
[0204] На Фиг. 19А показано, что иммунизация мышей с помощью Ad35.HPV18-E6E7SH индуцирует Еб-специфичные иммунные ответы, которые измерены с помощью анализа ICS. Кроме того, результаты на Фиг. 19А демонстрируют, что присоединение Е2 к N-концу сконструированной конструкции снижает иммуногенность, несмотря на более низкую экспрессию этого варианта Е2Е6Е7, что наблюдалось при трансфекции (фиг. 15). На Фиг. 19В показано, что иммунизация мышей с помощью Ad35.HPV18-E6E7SH или Ad26.HPV18-E2E6E7SH индуцирует сравнимый процент IFNy-продуцирующих HPV18-Еб-специфичных CD8 Т-клеток.
[02 05] Клеточный иммунный ответ на пептид данного изобретения можно индуцировать различными типами аденовирусных векторов. В эксперименте, представленном на Фиг. 19В, мышей иммунизировали аденовирусными векторами либо Ad2 6, либо Ad35, экспрессирующими E2E6E7SH HPV18. Данные показывают, что эти аденовирусные векторы индуцировали HPV18 Еб-специфичные Т-клетки на сравнимых уровнях.
Пример 10. Комбинирование аденовирусных векторов, экспрессирующих сконструированные конструкции HPV16 и HPV18
[0206] Комбинирование сконструированных конструкций для
различных типов HPV дает возможность получения лечебной вакцины
для разных типов HPV. Для оценки способности аденовирусных
векторов, экспрессирующих различные сконструированные
последовательности, индуцировать иммунные ответы, мышей иммунизировали с помощью внутримышечной инъекции аденовекторов (Ad26), экспрессирующих E2E6E7SH HPV16 (кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3), и с помощью Ad26, экспрессирующего E2E6E7SH HPV18 (кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 22), с дозой, составляющей 1 * 1010 vp
для каждого вектора или аденовекторов, не кодирующих трансген (пустой). Через четыре недели после иммунизации иммунные ответы стимулировали с помощью иммунизации векторами Ad35, экспрессирующими те же антигены. Иммунные ответы измеряли через две недели после поддерживающей иммунизации. Клетки стимулировали в течение ночи с помощью пептидных пулов, соответствующих Еб HPV18 или Е7 HPV16, и ответы измеряли с помощью IFNy ELISPOT. Данные представлены на Фиг. 20.
[0207] Данные показывают, что иммунизация мышей векторами Ad26/35, экспрессирующими E2E6E7SH HPV16 и E2E6E7SH HPV18, приводила к клеточным иммунным ответам на оба сконструированных белка (т.е. HPV16 и HPV18).
[02 08] В независимом эксперименте с похожей схемой иммунизации (Ad2 6 - первичная и Ad35 - поддерживающая) авторы данного изобретения сравнивали иммунный ответ, индуцированный совместно Ad, экспрессирующим E2E6E7SH HPV16 и Ad, экспрессирующим E2E6E7SH HPV18, с ответом, индуцированным у мышей, иммунизированных только Ad, экспрессирующим E2E6E7SH HPV16 или только Ad, экспрессирующим E2E6E7SH HPV18. Иммунные ответы измеряли через две недели после поддерживающей иммунизации и клетки стимулировали в течение ночи пептидными пулами, соответствующими Е2, Еб или Е7 HPV16 и HPV18, и ответы измеряли с помощью IFNy ELISPOT, а также окрашивания внутриклеточных цитокинов. Хотя совместное введение в одной композиции Ad, экспрессирующего E2E6E7SH HPV16, и Ad, экспрессирующего E2E6E7SH HPV18, приводило в целом к более низкому уровню ответов CD4 и CD8 по сравнению с животными, которых иммунизировали только отдельными компонентами вакцины, совместное введение индуцировало схожий спектр иммунных ответов (данные не показаны).
[0209] Таким образом, с помощью совместного введения E2E6E7SH HPV16 и E2E6E7SH HPV18, экспрессирующих конструкции согласно данному изобретению, можно индуцировать клеточные иммунные ответы как на HPV16, так и на HPV18.
Пример 11. Иммуногенность комбинированных сконструированных
конструкций у макаков-резус
[0210] Для оценки способности аденовирусных векторов, экспрессирующих сконструированные последовательности по настоящему изобретению, индуцировать иммунные ответы у приматов, отличных от человека, макаков-резус иммунизировали с помощью внутримышечной инъекции со смесью двух отдельных аденовекторов как в предыдущем примере, т. е. векторов Ао!2б, совместно экспрессирующих HPV16 и HPV18 E2E6E7SH, в дозе l*10N vp для каждого вектора, или аденовекторов, не кодирующих трансген (пустых). Через восемь недель после иммунизации животные получали поддерживающую иммунизацию векторами Ао!2б, экспрессирующими те же антигены. На 16 неделе животные получали еще одну инъекцию, содержащую векторы Ad35, экспрессирующие те же антигены. Образцы крови брали в нескольких моментах времени, и выделенные белые клетки крови стимулировали в течение ночи пулами пептидов, соответствующими Е2, Еб или Е7 обоих HPV16 и HPV18. Специфичные ответы оценивали с помощью IFNy ELISPOT. Данные представлены на Фиг. 21. Кроме того, на 10 неделе и 18 неделе после первичной иммунизации оценивали клеточный иммунный ответ, специфичный в отношении пептидов, охватывающих новые сочетания в сконструированных молекулах HPV18 по настоящему изобретению. Индуцирование ответа IFNy на эти соединительные пептидыв у всех животных была ниже предела обнаружения, составляющего <50 SFU на 1* 106 РВМС (данные не показаны) .
[0211] Данные показывают, что иммунизация приматов, отличных от человека, комбинацией векторов Ad2 6, совместно экспрессирующих E2E6E7SH HPV16 и E2E6E7SH HPV18, приводила к клеточным иммунным ответам на несколько белков HPV, которые присутствуют в кодируемых трансгенах. Ответы можно поддерживать с помощью дополнительной иммунизации векторами Ad2 6. Дополнительная поддерживающая иммунизация на 16 неделе соответствующим вектором Ad35 дополнительно усиливала иммунные ответы.
Пример 12. Терапевтическая эффективность комбинированных конструкций на мышиной модели опухоли
[0212] Полипептид данного изобретения, соответствующий Еб и
Е7 HPV16, способен индуцировать клеточные иммунные ответы у
мышей, что приводило к терапевтическому эффекту в модели ТС-1
(как показано в примере 5) . Терапевтический эффект комбинации
аденовирусных векторов, совместно экспрессирующих
сконструированные белки как HPV16, так и HPV18, исследовали в этой же модели. Без вакцины опухоли быстро росли и достигали предопределенного размера, составляющего 1000 мм3, в течение 30 дней, после чего мышей умерщвляли по этическим соображениям.
[0213] В этом эксперименте мышам C57BL/6 подкожно вводили 5*104 ТС-1 клеток в 0-й день. Через шесть дней, когда опухоли можно было пальпировать, мышей иммунизировали с помощью Ad2 б.HPV16-E2E6E7SH или смеси Ad2б.HPV16-E2E6E7SH и Ad26.HPV18-E2E6E7SH. Все мыши также получали поддерживающую иммунизацию на 2 0-й день соответствующими векторами Ad35. Наблюдалось, что первичная и поддерживающая иммунизации аденовирусными векторами, экспрессирующими E2E6E7SH HPV16, значительно продлевали выживание мышей (Фиг. 22). С комбинацией аденовирусных векторов, совместно экспрессирующих как E2E6E7SH HPV16, так и E2E6E7SH HPV18, наблюдали схожее среднее время выживания. В группе мышей, которые получали комбинированную вакцину, трое животных не имели опухолей в конце периода наблюдения, составившего 90 дней.
[0214] Результаты других экспериментов показали, что первичная и поддерживающая иммунизации аденовирусными векторами, совместно экспрессирующими HPV16 E2E6E7SH и HPV18 E2E6E7SH, также значительно продлевали выживание мышей, если первичную иммунизацию проводили раньше, например, через 4 дня после подкожного впрыскивания мышам клеток ТС-1 (данные не показаны).
[0215] В заключение, иммунизация с помощью комбинации аденовирусных векторов, совместно экспрессирующих HPV16- и HPV18-специфичные сконструированные полипептиды по настоящему изобретению, значительно снижала рост опухолей или полностью устраняла развившиеся опухоли в общепринятой модели контрольного заражения для рака, индуцированного HPV16.
Пример 13. Конструирование вектора на основе MVA для Е2Е6Е7 HPV16 и Е2Е6Е7 HPV18 (MVA-BN mBN411)
[0216] В данном примере нами создан вектор MVA-BN, включающий Е2Е6Е7 HPV16 и Е2Е6Е7 HPV18. Понятно, что векторы MVA-BN можно использовать для экспрессии Е6Е7 либо с Е2, либо без него, и с дополнительными последовательностями или без них для повышения иммуногенности кодируемого полипептида.
[0217] Нами разработана новая нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 24), кодирующая полипептид Е2Е6Е7 HPV16 (SEQ ID NO: 3), и новая нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 25), кодирующая полипептид Е2Е6Е7 HPV18 (SEQ ID NO: 22) . Нуклеиновые кислоты были сконструированы для экспрессии человеком и с минимальной гомологичностью между ними. Последовательности нуклеиновых кислот синтезировали в Geneart.
[0218] Промотор PrMVA13.51ong (SEQ ID NO: 2 6) включали перед стартовым кодоном ATG Е2Е6Е7 HPV16, и два стоп-кодона (5' TGA TGA 3') добавляли в конце кодирующей последовательности. Промотор PrHyb (SEQ ID NO: 27) включали перед стартовым кодоном ATG Е2Е6Е7 HPV18 и два стоп-кодона (5' TGA TGA 3') добавляли в конце кодирующей последовательности. Сигналы ранней терминации (5'ТТТТТАТ 3') вставляли позажи соответствующих стоп-кодонов последовательностей обеих нуклеиновых кислот.
[0219] Эти гены вставляли с помощью SacII и Nhel в pBNX2 02 вектор переноса, кодирующий IGR88/89 MVA-BN гомологичные области и, вследствие этого, осуществляющий вставку в сайт интеграции IGR8 8/8 9 MVA-BN путем гомологичной рекомбинации. Кроме того, pBNX2 02 кодирует mRFPl и Ecogpt для позитивной селекции, а также повторяющуюся последовательность гомологичной области Flank 2 IGR 88/89 MVA-BN для более позднего вырезания кассеты селекции путем гомологичной рекомбинации в отсутствие селективного давления.
[022 0] Векторы на основе MVA создавали в первичных куриных фибробластах (CEF) и получали, как описано в данном документе.
[0221] Клетки CEF понедельно отделяли от куриных эмбрионов и поддерживали в среде VP-SFM без FBS.
[0222] Вкратце, клетки CEF трансфицировали MVA-векторной плазмидой, используя Fugene согласно инструкции производителя
(Promega), и совместно с этим выполняли инфицирование, используя MVA-BN. Клетки собирали через два дня, обрабатывали ультразвуком и дополнительно очищали методом бляшкообразования. Вирус очищали путем бляшкообразования и амплифицировали в клетках CEF, культивированных в одиночной лунке в 24-луночном планшете для культивирования тканей или в одиночной лунке в 24-луночном планшете для культивирования тканей, соответственно. Последующую амплификацию выполняли в клетках CEF, культивированных в одиночной лунке б-луночного планшета для тканей, а затем - в колбе Т17 5 для тканевой культуры.
[0223] Для создания вируса mBN 411А были разработаны одиннадцать операций, из которых три операции относились к очистке путем бляшкообразования в среде VP-SFM, содержащей микофеноловую кислоту/ксантин и гипоксантин. Для создания mBN411B были разработаны семнадцать операций, из которых шесть операций относились к очистке путем бляшкообразования в среде VP-SFM без селективного давления для выполнения вырезание селективной кассеты путем гомологичной рекомбинации.
[0224] Вирус MVA mBN 411, таким образом, представляет собой MVA-BN, содержащий в своей области IGR8 8/8 9 нуклеиновую кислоту, кодирующую сконструированный полипептид HPV16 E2E6E7SH (SEQ ID NO: 3) под контролем промотора PrMVA13.51ong (SEQ ID NO: 2 6, и нуклеиновую кислоту, кодирующую сконструированный полипептид E2E6E7SH HPV18 (SEQ ID NO: 22) под контролем промотора PrHyb (SEQ ID NO: 27) . Вирус MVA mBN411 использовали в последующих экспериментах по схемам прайм-буст с аденовирусными векторами, кодирующими сконструированные полипептиды.
[0225] Пример 14. Иммуногенность сконструированных конструкций HPV16 и HPV18 при первичной Ad2 6 и поддерживающей MVA иммунизации у мышей.
[022 6] Оценивали HPV16- и HPV18-специфичные иммунные
ответы, индуцированные первичной иммунизацией аденовекторами
(Ad2 6) и поддерживающей иммунизацией модифицированным вирусом
коровьей оспы анкара (MVA). В качестве первичной иммунизации
мышам проводили вакцинацию путем внутримышечной инъекции
аденовектора (Ad26), экспрессирующего E2E6E7SH HPV16
(кодирующего белок, содержащий аминокислотную
последовательность, изложенную под SEQ ID N0: 3), и с помощью Ао!2б, экспрессирующего E2E6E7SH HPV18 (кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID N0: 22), при дозе, составляющей 1* 1010 vp для каждого вектора или аденовекторов, не кодирующих трансген (пустой). Через восемь недель после первичной иммунизации животным проводили поддерживающую иммунизацию, используя MVA, экспрессирующий те же самые антигены, что и в ходе первичной иммунизации (MVA BN mBN 411А, при дозе 8,9х107 ТСЮ50/мышь) , в то время как в другой группе мышей проводили иммунизацию векторами Ad35, экспрессирующими те же самые антигены, что и в ходе первичной иммунизации. Контрольным животным проводили поддерживающую иммунизацию вектром на основе MVA, не кодирующим трансген
(контроль).
[0227] Иммунные ответы измеряли через две недели после поддерживающей иммунизации. Клетки стимулировали в течение ночи с помощью пептидных пулов, соответствующих Е2, Еб или Е7 HPV16 или HPV18, и ответы измеряли с помощью IFNy ELISPOT. Данные представлены на фиг. 23.
[0228] Данные показывают, что иммунизация мышей либо векторами Ad2 6/Ad35, либо векторами Ad2 6/MVA, экспрессирующими E2E6E7SH HPV16 и E2E6E7SH HPV18, приводила к клеточным иммунным ответам на оба сконструированных белка (т.е. HPV16 и HPV18). Наиболее сильным был общий ответ у животных, получивших поддерживающую иммунизацию с применением MVA, экспрессирующим E2E6E7SH HPV16 и E2E6E7SH HPV18.
Пример 15. Иммуногенность сконструированных конструкций HPV16 и HPV18 при первичной Ad2 6 и поддерживающей MVA иммунизации у макаков-резус
[022 9] Нами оценена способность аденовирусных векторов и векторов на основе MVA к экспрессии сконструированных последовательностей данного изобретения для индуцирования иммунных ответов у приматов, отличных от человека. Макакам-резус (приматы, отличные от человека (NHP)) проводили первичную
иммунизацию путем внутримышечнной инъекции смесью двух разных аденовекторов, как в примере 11, т.е. Ао!2б, экспрессирующим E2E6E7SH HPV16, и Ad26, экспрессирующим E2E6E7SH HPV18, при дозе l*10N vp каждого аденовирусного вектора. Через восемь недель после первичной иммунизации животным проводили поддерживающую иммунизацию, используя MVA-BN (mBN 4 НА - вектор, экспрессирующий те же самые антигены, при дозе примерно 1,80х108 TCID50/NHP).
[0230] Образцы крови брали в нескольких временных точках, и выделенные белые клетки крови стимулировали в течение ночи пулами пептидов, соответствующими Е2, Еб или Е7 обоих HPV16 и HPV18. Специфичные ответы оценивают с помощью IFNy ELISPOT. Данные представлены на фиг. 24.
[0231] Данные показывают, что иммунизация макаков-резус векторами Ad/MVA, экспрессирующими E2E6E7SH HPV16 и E2E6E7SH HPV18, приводила к клеточным иммунным ответам на сконструированные антигены. Кроме того, наблюдали расширение индуцированных клеточных ответов при поддерживающей иммунизации с применением MVA, а именно ответы на 3-5 из б разных антигенов HPV16 и HPV18, которые экспрессируются векторами вакцин.
Пример 16. Терапевтическая эффективность сконструированных конструкций HPV16 и HPV18 при первичной Ad2 6 и поддерживающей MVA иммунизации у мышей
[0232] Терапевтический эффект первичной/поддерживающей иммунизации аденовирусными векторами и MVA, экспрессирующими сконструированные белки HPV16 и HPV18, исследовали в такой же модели ТС-1, как описана в примере 12. За ростом опухоли наблюдали в течение времени, животных умерщвляли по этическим соображениям, если объем опухоли превышал 1000 мм3.
Эксперимент спланирован следующим образом:
Опухолевыми
Группа День первичн. День поддерж.
клетками Умерщвление
(п=3 6 иммун-и Иммун-и 2 0
прививка (день)
всего) 6 (доза) (доза)
(день 0)
1. Позитив. 50000 клеток Ad26.HPV16- Ad35.HPV16-Tx 90 или ранее,
контроль ТС-1 Тх + + если
(n=12)
Ad2 6.HPV18-
Ad35.HPV18-Tx
объем опухоли
Тх (lxlO10 vp/
(lxlO10
> 1000 мм3
вектор)
vp/вектор)
Ad2 6.HPV16-
MVA-BN-
90 или ранее,
Тх +
. Испытание
50000 клеток
Ad2 6.HPV18-
HPV16/18-TX
если
(n=12)
ТС-1
(8,9xl07
объем опухоли
Тх (lxlO10 vp/
TCID50)
> 1000 мм3
вектор)
MVA-BN-
90 или ранее,
3. Отриц.
Ad2 6.пустой
50000 клеток
контроль
если
контроль
(lxlO10 vp/
ТС-1
(8,9xl07
объем опухоли
(n=12)
вектор)
TCID50)
> 1000 мм3
ГРУППЫ ОБРАБОТКИ. На день проведения первичной иммунизации опухоли прощупывались у минимум 50% животных. (HPV16-TX и HPV18-Тх являются обозначениями конструкций данного изобретения, кодирующих полипептиды, имеющие последовательность SEQ ID NO: 3 и SEQ ID N0:20 соответственно).
[0233] Пробы крови отбирали до прививки опухолевыми клетками ТС-1 на день 19 (т.е. за один день до поддерживающей иммунизации) и на день 34 (т.е. две недели после поддерживающей иммунизации), а у некоторых мышей кровь также брали на день 90 после прививки опухолевыми клетками ТС-1.
[0234] В этом эксперименте мышам C57BL/6 подкожно вводили 5*104 ТС-1 клеток в 0-й день. Через шесть дней, когда опухоли можно было пальпировать, мышей иммунизировали смесью Ad2 6.HPV16-E2E6E7SH и Ad26.HPV18-Е2Е6E7SH. Мышам проводили поддерживающую иммунизацию на 20 день, используя либо Ad2б.HPV16-E2E6E7SH и Ad2 б.HPV18-Е2Е 6E7SH, либо MVA-BN-HPV1б/18-Тх. Контрольным мышам проводили первичную иммунизацию, используя Ad2 6, не кодирующие трансген, и поддерживающую иммунизацию, используя MVA, не кодирующие трансген. Животных иммунизировали, используя либо Ad26/Ad35, кодирующий E2E6E7SH, либо MVA-BN, кодирующий HPV16/18 E2E6E7SH, что приводило к сравнимым продленным выживанию и медиане времени выживаемости; в обеих группах одна мышь оставалась живой и не имела опухоли в конце периода наблюдения, составлявшего 90 дней. Данные представлены на Фиг. 25.
[0235] Примеры в описании рассматриваются только как
иллюстративные, при этом истинный объем и сущность изобретения указаны в следующей формуле изобретения. Ссылки
Abbink Р, Lemckert АА, Ewald ВА, Lynch DM, Denholtz М, Smits S, Holterman L, Damen I, Vogels R, Thorner AR, O'Brien KL, Carville A, Mansfield KG, Goudsmit J, Havenga MJ, Barouch DH (2007) Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups В and D. J Virol 81:4654-4663
Ausubel FM (1995) Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols in molecular biology. Wiley, [Chichester]
Brokaw JL, Blanco M, McBride AA (1996) Amino Acids Critical for the Functions of the Bovine Papillomavirus Type 1 E2 Transactivator. J Virol 70: 23-29.
Cottingham MG, Carroll F, Morris SJ, Turner AV, Vaughan AM, Kapulu MC, Colloca S, Siani L, Gilbert SC, Hill AV (2012) Preventing spontaneous genetic rearrangements in the transgene cassettes of adenovirus vectors. Biotechnol Bioeng 109:719-728
Daayana S, Elkord E, Winters U, Pawlita M, Roden R, Stern PL, Kitchener HC (2010) Phase II trial of imiquimod and HPV therapeutic vaccination in patients with vulval intraepithelial neoplasia. Br J Cancer 102:1129-1136
de Jong A, van der Burg SH, Kwappenberg KM, van der Hulst JM, Franken KL, Geluk A, van Meijgaarden KE, Drijfhout JW, Renter G, Vermeij P, Melief CJ, Offringa R (2002) Frequent detection of human papillomavirus 16 E2-specific T-helper immunity in healthy subjects. Cancer Res 62:472-479
Edholm D, Molin M, Bajak E, Akusjarvi G (2001) Adenovirus vector designed for expression of toxic proteins. J Virol 75:9579-9584
Evans RK, Nawrocki DK, Isopi LA, Williams DM, Casimiro DR, Chin S, Chen M, Zhu DM, Shiver JW, Volkin DB (2004) Development of stable liquid formulations for adenovirus-based vaccines. J Pharm Sci 93:2458-2475
Fallaux FJ, Bout A, van der Velde I, van den Wollenberg DJ,
Hehir KM, Keegan J, Auger C, Cramer SJ, van Ormondt H, van der Eb AJ, Valerio D, Hoeben RC (1998) New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Hum Gene Ther 9:1909-1917
Fr0kjaer S, Hovgaard L (2000) Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins. Taylor & Francis, London
Gall JG, Lizonova A, EttyReddy D, McVey D, Zuber M, Kovesdi I, Aughtman B, King CR, Brough DE (2007) Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mol Biotechnol 35:263-273
Gao GP, Engdahl RK, Wilson JM (2000) A cell line for high-yield production of El-deleted adenovirus vectors without the emergence of replication-competent virus. Hum Gene Ther 11:213219
Gennaro AR (1990) Remington's pharmaceutical sciences. Mack
Gilbert R, Guilbault C, Gagnon D, Bernier A, Bourget L, Elahi SM, Kamen A, Massie В (2014) Establishment and validation of new complementing cells for production of El-deleted adenovirus vectors in serum-free suspension culture. J Virol Methods 208:177-188
Hamid 0, Carvajal RD (2013) Anti-programmed death-1 and anti-programmed death-ligand 1 antibodies in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther 13:847-861
Harlow E, Lane D (1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York
Havenga M, Vogels R, Zuijdgeest D, Radosevic K, Mueller S, Sieuwerts M, Weichold F, Damen I, Raspers J, Lemckert A, van Meerendonk M, van der Vlugt R, Holterman L, Hone D, Skeiky Y, Mintardjo R, Gillissen G, Barouch D, Sadoff J, Goudsmit J (2006) Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells. J Gen Virol 87:21352143
Henken FE, Oosterhuis K, Ohlschlager P, Bosch L, Hooijberg E, Haanen JB, Steenbergen RD (2012) Preclinical safety evaluation of DNA vaccines encoding modified HPV16 E6 and E7. Vaccine 30:4259-4266
Hildesheim A, Herrero R, Wacholder S, Rodriguez AC, Solomon D, Bratti MC, Schiller JT, Gonzalez P, Dubin G, Porras C, Jimenez SE, Lowy DR (2007) Effect of human papillomavirus 16/18 LI viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection: a randomized trial. JAMA 298:743-753
Hoganson DK, Ma JC, Asato L, Ong M, Printz MA, Huyghe BG, Sosnowshi BA, D'Andrea MJ (2002) Development of a stable adenoviral vector formulation. Bioprocess J 1:43-48
Hoof I, Peters B, Sidney J, Pedersen LE, Sette A, Lund 0, Buus S, Nielsen M (2009) NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics 61:1-13
Horwitz MS (1996) Adenoviruses. B: Fields BN, Knipe DM, Baines JD (eds) Virology. Raven Press Ltd, New York
Renter GG, Welters MJ, Valentijn AR, Lowik MJ, Berends-van der Meer DM, Vloon AP, Essahsah F, Fathers LM, Offringa R, Drijfhout JW, Wafelman AR, Oostendorp J, Fleuren GJ, van der Burg SH, Melief CJ (2009) Vaccination against HPV-16 oncoproteins for vulvar intraepithelial neoplasia. N Engl J Med 361:1838-1847
Kibbe AH (2000) Handbook of pharmaceutical excipients. Pharmaceutical Press, London
Kim TJ, Jin HT, Hur SY, Yang HG, Seo YB, Hong SR, Lee CW, Kim S, Woo JW, Park KS, Hwang YY, Park J, Lee IH, Lim KT, Lee KH, Jeong MS, Surh CD, Suh YS, Park JS, Sung YC (2014) Clearance of persistent HPV infection and cervical lesion by therapeutic DNA vaccine in CIN3 patients. Nat Commun 5:5317 (doi: 10.1038/ncomms6317)
Kovesdi I, Hedley SJ (2010) Adenoviral producer cells. Viruses 2:1681-1703
Lin KY, Guarnieri FG, Staveley-0'Carroll KF, Levitsky HI, August JT, Pardoll DM, Wu TC (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res 56:21-26
Lundegaard C, Lamberth K, Harndahl M, Buus S, Lund 0,
Nielsen M (2008) NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11. Nucleic Acids Res 36:W509-512
Massimi P, Banks L (2005) Transformation Assays for HPV Oncoproteins. B: Davy C, Doorbar J (eds) Human Papillomaviruses: Methods and Protocols. Vol 119: Methods in Molecular Medicine Springer, Berlin, pp 381-395
Matthews DA, Cummings D, Evelegh C, Graham FL, Prevec L (1999) Development and use of a 293 cell line expressing lac repressor for the rescue of recombinant adenoviruses expressing high levels of rabies virus glycoprotein. J Gen Virol 80 (Pt 2):345-353
McPherson MJ, Hames BD, Taylor GR (1995) PCR 2: a practical approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford
Mellman I, Coukos G, Dranoff G (2011) Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480:480-489
Mullick A, Xu Y, Warren R, Koutroumanis M, Guilbault C, Broussau S, Malenfant F, Bourget L, Lamoureux L, Lo R, Caron AW, Pilotte A, Massie В (2006) The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol 6:43
Munger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM, Schlegel R (1989) The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. J Virol 63:4417-4421
Ogun SA, Dumon-Seignovert L, Marchand JB, Holder AA, Hill F (2008) The oligomerization domain of C4-binding protein (C4bp) acts as an adjuvant, and the fusion protein comprised of the 19-kilodalton merozoite surface protein 1 fused with the murine C4bp domain protects mice against malaria. Infect Immun 76:38173823
Oosterhuis K, Aleyd E, Vrijland K, Schumacher TN, Haanen JB (2012a) Rational Design of DNA Vaccines for the Induction of Human Papillomavirus Type 16 E6- and E7-Specific Cytotoxic T-Cell Responses. Hum Gene Ther 23:1301-1312
Oosterhuis K, Ohlschlager P, van den Berg JH, Toebes M, Gomez R, Schumacher TN, Haanen JB (2011) Preclinical development
of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7. Int J Cancer 129:397-406
Oosterhuis K, van den Berg JH, Schumacher TN, Haanen JB (2012b) DNA vaccines and intradermal vaccination by DNA tattooing. Curr Top Microbiol Immunol 351:221-250
Peters B, Tong W, Sidney J, Sette A, Weng Z (2003) Examining the independent binding assumption for binding of peptide epitopes to MHC-I molecules. Bioinformatics 19:1765-1772
Prakash SS, Grossman SR, Pepinsky RB, Laimins LA, Androphy EJ (1992) Amino acids necessary for DNA contact and dimerization imply novel motifs in the papillomavirus E2 trans-activator. Genes Dev 6:105-116
Rubinchik S, Ding R, Qiu AJ, Zhang F, Dong J (2000) Adenoviral vector which delivers FasL-GFP fusion protein regulated by the tet-inducible expression system. Gene Ther 7:875-885
Sambrook JFEFMT (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Sakai H, Yasugi T, Benson JD, Dowhanick JJ, Howley PM (1996) Targeted Mutagenesis of the Human Papillomavirus Type 16 E2 Transactivation Domain Reveals Separable Transcriptional Activation and DNA Replication Functions. J Virol 70: 1602-1611.
Sedman SA, Barbosa MS, Vass WC, Hubbert NL, Haas JA, Lowy DR, Schiller JT (1991) The full-length E6 protein of human papillomavirus type 16 has transforming and trans-activating activities and cooperates with E7 to immortalize keratinocytes in culture. J Virol 65:4860-4866
Shenk T (1996) Adenoviridae and their Replication. B: Fields BN, Knipe DM, Baines JD (eds) Virology. Raven Press Ltd, New York
Smahel M, Sima P, Ludvikova V, Vonka V (2001) Modified HPV16 E7 Genes as DNA Vaccine against E7-Containing Oncogenic Cells. Virology 281:231-238
van der Burg SH, Melief CJ (2011) Therapeutic vaccination against human papilloma virus induced malignancies. Curr Opin Immunol 23:252-257
Watson JD (1992) Recombinant DNA. Scientific American Books, New York
Wieking BG, Vermeer DW, Spanos WC, Lee KM, Vermeer P, Lee WT, Xu Y, Gabitzsch ES, Balcaitis S, Balint JP, Jr., Jones FR, Lee JH (2012) A non-oncogenic HPV 16 E6/E7 vaccine enhances treatment of HPV expressing tumors. Cancer Gene Ther 19:667-674
Yan J, Reichenbach DK, Corbitt N, Hokey DA, Ramanathan MP, McKinney KA, Weiner DB, Sewell D (2009) Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen. Vaccine 27:431-440
Yao F, Eriksson E (1999) A novel tetracycline-inducible viral replication switch. Hum Gene Ther 10:419-427
Yoshida Y, Hamada H (1997) Adenovirus-mediated inducible gene expression through tetracycline-controllable transactivator with nuclear localization signal. Biochem Biophys Res Commun 230:426-430
Yugawa T, Kiyono T (2009) Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Rev Med Virol 19:97-113
Zwaveling S, Ferreira Mota SC, Nouta J, Johnson M, Lipford GB, Offringa R, van der Burg SH, Melief CJ (2002) Established human papillomavirus type 1б-expressing tumors are effectively eradicated following vaccination with long peptides. J Immunol 169:350-358
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Crucell Holland B.V.
Bavarian Nordic A/S BUNNIK, Evelien M CUSTERS, Jerome H.H.V. SCHEPER, Gerrit C. KHAN, Selina KALLA, Markus WEIDNER, Katrin
<120> Комбинации лечебных вакцин против ВПЧ
<130> 0269 US P00 PRO
<160> 33
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 328 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оригинальный полипептид HPV16-E6E7SH <400> 1
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1. 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
115 120 125
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
130 135 140
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
145 150 155 160
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His
165 170 175
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
210 215 220
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
225 230 235 240
Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln
245 250 255
Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile
260 265 270
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
275 280 285
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
290 295 300
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys
325
<210> 2
<211> 990
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид
HPV16-E6E7SH <400> 2
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gacccccagg aacggcccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tggaagatga gatcgacggc cctgctggcc aggccgaacc cgacagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgcggct gtgcgtgcag 240
agcacccacg tggacatccg gaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccccatct gcagccagaa gcccggcacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 360
tgcgacctgc tgatccggtg catcaactgc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 420
cggcacctgg acaagaagca gcggttccac aacatccggg gcagatggac aggcagatgc 480
atgagctgct gcagaagcag ccggaccaga cgggaaaccc agatgcacgg cgacaccccc 540
accctgcacg agtacatgct ggacctgcag cccgagacaa ccgacctgta ctgctacgag 600
cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac gagattgacg gacccgctgg acaggccgag 660
cctgaccggg ctcactataa catcgtgaca ttttgctgtc agctctgtac tgaactccag 720
acaacaattc acgatattat tctcgaatgt gtgtattgta aacagcagct cctgcggaga 780
gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctc tgcatcgtgt atcgggacgg caacccctac 840
gccgtgtgcg acaagtgcct gaagttctac agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc 900
tacagcctgt acggaacaac actcgaacag cagtataaca aaccactctg tgatctgctg 960
attcgctgta tcaattgtca gaagtgataa 990
<210> 3
<211> 693
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оригинальный полипептид E2E6E7SH HPV16
<400> 3
Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1. 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115
120
125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145 150 155 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
165 170 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
180 185 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225 230 235 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
245 250 255
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
275 280 285
Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg
290 295 300
Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305 310 315 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
325 330 335
Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
340 345 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile Met His Gln
355 360 365
Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu
370
375
380
Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu
385 390 395 400
Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
405 410 415
Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
420 425 430
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
435 440 445
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
450 455 460
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln
465 470 475 480
Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln
485 490 495
Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln
500 505 510
Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys
515 520 525
Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His Gly Asp Thr
530 535 540
Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp
545 550 555 560
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
565 570 575
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
580 585 590
Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
595 600 605
His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg
610 615 620
Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg
625
630
635
640
Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser
645 650 655
Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr
660 665 670
Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys
675 680 685
Ile Asn Cys Gln Lys
690
<210> 4 <211> 2085 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид
E2E6E7SH HPV16 <400> 4
atggaaaccc tgtgccagcg gctgaacgtg tgccaggaca agatcctgac ccactacgag 60
aacgacagca ccgacctgcg ggaccacatc gactactgga agcacatgcg gctggaatgc 120
gccatctact acaaggccag agagatgggc ttcaagcaca tcaaccacca ggtggtgccc 180
accctggccg tgtccaagaa caaggccctg caggccatcg agctgcagct gaccctggaa 240
accatctaca acagccagta cagcaacgag aagtggaccc tgcaggacgt gtccctggaa 300
gtgtacctga ccgctcccac cggctgcatc aagaaacacg gctacaccgt ggaagtgcag 360
ttcgacggcg acatctgcaa caccatgcac tacaccaact ggacccacat ctacatctgc 420
gaagaggcca gcgtgaccgt ggtggaaggc caggtggact actacggcct gtactacgtg 480
cacgagggca tccggaccta cttcgtgcag ttcaaggacg acgccgagaa gtacagcaag 540
aacaaagtgt gggaggtgca cgctggcggc caggtcatcc tgtgccccac cagcgtgttc 600
agcagcaacg aggtgtccag ccccgagatc atccggcagc acctggccaa tcaccctgcc 660
gccacccaca caaaggccgt ggccctgggc accgaggaaa cccagaccac catccagcgg 720
cccagaagcg agcccgacac cggcaatccc tgccacacca ccaagctgct gcaccgggac 780
agcgtggaca gcgcccctat cctgaccgcc ttcaacagca gccacaaggg ccggatcaac 840
tgcaacagca acaccacccc catcgtgcac ctgaaggtgg acgccaacac cctgatgcgg 900
ctgcggtaca gattcaagaa gcactgcacc ctgtacaccg ccgtgtcctc cacctggcac 960
tggaccggcc acaacgtgaa gcacaagagc gccatcgtga ccctgaccta cgacagcgag 1020
tggcagcggg accagttcct gagccaggtc aaaatcccca agaccatcac cgtgtccacc 1080
ggcttcatga gcatcatgca ccagaaacgg accgccatgt tccaggaccc ccaggaacgg 1140
cccagaaagc tgccccagct gtgcaccgag ctgcagacca ccatccacga catcatcctg 1200
gaatgcgtgt actgcaagca gcagctggaa gatgagatcg acggccctgc tggccaggcc 12 60
gaacccgaca gagcccacta caatatcgtg accttctgct gcaagtgcga cagcaccctg 1320
cggctgtgcg tgcagagcac ccacgtggac atccggaccc tggaagatct gctgatgggc 1380
accctgggca tcgtgtgccc catctgcagc cagaagcccg gcaccaccct ggaacagcag 1440
tacaacaagc ccctgtgcga cctgctgatc cggtgcatca actgccagaa acccctgtgc 1500
cccgaggaaa agcagcggca cctggacaag aagcagcggt tccacaacat ccggggcaga 1560
tggacaggca gatgcatgag ctgctgcaga agcagccgga ccagacggga aacccagatg 1620
cacggcgaca cccccaccct gcacgagtac atgctggacc tgcagcccga gacaaccgac 1680
ctgtactgct acgagcagct gaacgacagc agcgaggaag aggacgagat tgacggaccc 1740
gctggacagg ccgagcctga ccgggctcac tataacatcg tgacattttg ctgtcagctc 1800
tgtactgaac tccagacaac aattcacgat attattctcg aatgtgtgta ttgtaaacag 1860
cagctcctgc ggagagaggt gtacgacttc gccttccggg acctctgcat cgtgtatcgg 1920
gacggcaacc cctacgccgt gtgcgacaag tgcctgaagt tctacagcaa gatcagcgag 1980
taccggcact actgctacag cctgtacgga acaacactcg aacagcagta taacaaacca 2040
ctctgtgatc tgctgattcg ctgtatcaat tgtcagaagt gataa 2085
<210> 5 <211> 693
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оригинальный полипептид E6E7E2SH HPV16
<400> 5
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1. 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
115 120 125
Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
130 135 140
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
145 150 155 160
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Met His
165 170 175
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala
210 215 220
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
225 230 235 240
Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln
245 250 255
Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile
260 265 270
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
275 280 285
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
290 295 300
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu
325 330 335
Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr
340 345 350
Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys
355 360 365
Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His
370 375 380
Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala
385 390 395 400
Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser
405 410 415
Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr
420 425 430
Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln
435 440 445
Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His
450 455 460
Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val
465 470 475 480
Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe
485 490 495
Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp
500 505 510
Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe
515 520 525
Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala
530 535 540
Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu
545 550 555 560
Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly
565 570 575
Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser
580 585 590
Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn
595 600 605
Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn
610 615 620
Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr
625 630 635 640
Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His
645 650 655
Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp
660 665 670
Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr
675 680 685
Gly Phe Met Ser Ile 690
<210> 6
<211> 2085
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид E6E7E2SH HPV16
<400> 6
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gacccccagg aacggcccag aaagctgccc 60
cagctgtgca ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tggaagatga gatcgacggc cctgctggcc aggccgaacc cgacagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgcggct gtgcgtgcag 240
agcacccacg tggacatccg gaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccccatct gcagccagaa gcccggcacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 360
tgcgacctgc tgatccggtg catcaactgc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 420
cggcacctgg acaagaagca gcggttccac aacatccggg gcagatggac aggcagatgc 480
atgagctgct gcagaagcag ccggaccaga cgggaaaccc agatgcacgg cgacaccccc 540
accctgcacg agtacatgct ggacctgcag cccgagacaa ccgacctgta ctgctacgag 600
cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac gagattgacg gacccgctgg acaggccgag 660
cctgaccggg ctcactataa catcgtgaca ttttgctgtc agctctgtac tgaactccag 720
acaacaattc acgatattat tctcgaatgt gtgtattgta aacagcagct cctgcggaga 780
gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctc tgcatcgtgt atcgggacgg caacccctac 840
gccgtgtgcg acaagtgcct gaagttctac agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc 900
tacagcctgt acggaacaac actcgaacag cagtataaca aaccactctg tgatctgctg 960
attcgctgta tcaattgtca gaagatggaa accctgtgcc agcggctgaa cgtgtgccag 1020
gacaagatcc tgacccacta cgagaacgac agcaccgacc tgcgggacca catcgactac 1080
tggaagcaca tgcggctgga atgcgccatc tactacaagg ccagagagat gggcttcaag 1140
cacatcaacc accaggtggt gcccaccctg gccgtgtcca agaacaaggc cctgcaggcc 1200
atcgagctgc agctgaccct ggaaaccatc tacaacagcc agtacagcaa cgagaagtgg 1260
accctgcagg acgtgtccct ggaagtgtac ctgaccgctc ccaccggctg catcaagaaa 1320
cacggctaca ccgtggaagt gcagttcgac ggcgacatct gcaacaccat gcactacacc 1380
aactggaccc acatctacat ctgcgaagag gccagcgtga ccgtggtgga aggccaggtg 1440
gactactacg gcctgtacta cgtgcacgag ggcatccgga cctacttcgt gcagttcaag 1500
gacgacgccg agaagtacag caagaacaaa gtgtgggagg tgcacgctgg cggccaggtc 1560
atcctgtgcc ccaccagcgt gttcagcagc aacgaggtgt ccagccccga gatcatccgg 1620
cagcacctgg ccaatcaccc tgccgccacc cacacaaagg ccgtggccct gggcaccgag 1680
gaaacccaga ccaccatcca gcggcccaga agcgagcccg acaccggcaa tccctgccac 1740
accaccaagc tgctgcaccg ggacagcgtg gacagcgccc ctatcctgac cgccttcaac 1800
agcagccaca agggccggat caactgcaac agcaacacca cccccatcgt gcacctgaag 1860
gtggacgcca acaccctgat gcggctgcgg tacagattca agaagcactg caccctgtac 1920
accgccgtgt cctccacctg gcactggacc ggccacaacg tgaagcacaa gagcgccatc 1980
gtgaccctga cctacgacag cgagtggcag cgggaccagt tcctgagcca ggtcaaaatc 2040
cccaagacca tcaccgtgtc caccggcttc atgagcatct gataa 2085
<210> 7 <211> 18 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Лидерный пептид IgE
<400> 7
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5 10 15
His Ser
<210> 8
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид IgE
<400> 8
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gctgccgcaa cccgggtgca cagc 54
<210> 9
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Лидерный пептид HAVT20
<400> 9
Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu
1. 5 10 15
Glu Phe Ser Met Ala 20
<210> 10
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид HAVT20
<400> 10
atggcctgcc ccggctttct gtgggccctg gtcatcagca cctgtctgga attcagcatg 60 gcc 63
<210> <211> <212> <213>
11 54 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
2xTetO-содержащая последовательность
<400> 11
gagctctccc tatcagtgat agagatctcc ctatcagtga tagagatcgt cgac
<210> 12
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2xCuO-содержащая последовательность
<400> 12
aacaaacaga caatctggtc tgtttgta 28
<210> 13
<211> 829
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Промотор CMV
<400> 13
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780
aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattgga 829
<210> 14
<211> 657
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид TetR
<400> 14
atgtctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc cgcgtacagc ggatcccggg aattcagatc ttattaa 657
<210> 15
<211> 218
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептид TetR
<400> 15
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1. 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala
195 200 205
Tyr Ser Gly Ser Arg Glu Phe Arg Ser Tyr 210 215
<210> 16
<211> 612
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид CymR
<400> 16
atgtctccca aacgacggac tcaagcggaa agggcaatgg aaactcaggg taagctgatt 60
gccgcggctc tgggagtgct gcgagagaaa gggtatgccg ggtttcgcat agccgacgtt 120
cctggagctg caggcgtaag cagaggagcc caatctcatc actttccgac caagctggag 180
cttttgctgg ctaccttcga atggctgtac gagcagatca cggaaaggag tcgtgctagg 240
ctggccaagc tgaaacccga ggatgatgtc attcagcaga tgctggacga tgcagccgag 300
ttcttcctgg acgacgactt cagcatcagt ctcgacctca tcgtagccgc agatcgcgat 360
ccagctttgc gcgagggcat acagagaaca gtcgagcgga atcggtttgt ggtggaggac 420
atgtggcttg gtgttctggt gagcagaggc ctctcacggg atgatgccga ggacatcctg 480
tggctgatct ttaactccgt cagagggttg gcagtgaggt ccctttggca gaaggacaaa 540
gaacggtttg aacgtgtgcg aaactcaaca ctcgagattg ctagggaacg ctacgccaag 600
ttcaagagat ga 612
<210> 17
<211> 203
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептид CymR
<400> 17
Met Ser Pro Lys Arg Arg Thr Gln Ala Glu Arg Ala Met Glu Thr Gln
1. 5 10 15
Gly Lys Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu Lys Gly Tyr
20 25 30
Ala Gly Phe Arg Ile Ala Asp Val Pro Gly Ala Ala Gly Val Ser Arg
Gly Ala Gln Ser His His Phe Pro Thr Lys Leu Glu Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Phe Glu Trp Leu Tyr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Ser Arg Ala Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Leu Lys Pro Glu Asp Asp Val Ile Gln Gln Met Leu Asp
85 90 95
Asp Ala Ala Glu Phe Phe Leu Asp Asp Asp Phe Ser Ile Ser Leu Asp
100 105 110
Leu Ile Val Ala Ala Asp Arg Asp Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Arg Thr Val Glu Arg Asn Arg Phe Val Val Glu Asp Met Trp Leu Gly
130 135 140
Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Ser Arg Asp Asp Ala Glu Asp Ile Leu
145 150 155 160
Trp Leu Ile Phe Asn Ser Val Arg Gly Leu Ala Val Arg Ser Leu Trp
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Glu Arg Phe Glu Arg Val Arg Asn Ser Thr Leu Glu
180 185 190
Ile Ala Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Phe Lys Arg 195 200
<210> 18
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HPV16 E6 aa41-65
<400> 18
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1. 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn 20 25
<210> <211> <212> 19 35
БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HPV16 E7 aa43-77 <400> 19
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1. 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
<210> 20
<211> 331
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оригинальный полипептид HPV18-E6E7SH
<400> 20
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1. 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
50 55 60
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
65 70 75 80
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
85 90 95
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
100 105 110
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly
115 120 125
Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile
130 135 140
Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg
145 150 155 160
His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg
165 170 175
Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln
180 185 190
Arg Arg Arg Glu Thr Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile
195 200 205
Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys
210 215 220
His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly
225 230 235 240
Val Asn Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile
245 250 255
Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val
260 265 270
Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile
275 280 285
Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg
290 295 300
Glu Leu Arg His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys
305 310 315 320
Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile
325 330
<210> 21
<211> 999
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность nt сконструированной последовательности HPV18-E6E7SH
<400> 21
atggccagat tcgaggaccc caccagacgg ccctacaagc tgcccgacct gtgcaccgag 60
ctgaacacat ctctgcagga catcgagatc acatgcgtgt actgcaagac cgtgctggac 120
ctgctgtgcc acgagcagct gtccgactcc gaggaagaaa acgacgagat cgacggcgtg 180
aaccatcagc atctgcccgc cagacgggcc gagccccaga gacacaccat gctgtgcatg 240
tgctgcaagt gcgaggcccg gattgagctg gtggtggaaa gcagcgccga cgacctgcgg 300
gccttccagc agctctttct gaataccctg agcttcgtgt gcccttggtg cgccagccag 360
cactacagcg actccgtgta cggcgatacc ctggaaaagc tgaccaatac cggcctgtat 420
aacctgctga tccggtgcct gcggtgccag aagcccctga atcccgccga gaaactgaga 480
cacctgaacg agaagcggcg gttccacaat atcgccggcc actacagagg ccagtgccac 540
agctgctgca accgggccag acaggaacgg ctgcagcgga ggcgggaaac catgcacgga 600
cccaaggcca ccctccagga cattgtcctg cacctggaac cccagaacga gatccccgtc 660
gatctgctgt gtcatgaaca gctcagcgac agcgaagagg aaaatgacga aattgacggg 720
gtcaaccctg acctctgtac cgaactcaat accagtctcc aggatatcga aattacctgt 780
gtctactgta aaaccgtcct cgagctgacc gaggtgttcg agttcgcctt caaggacctg 840
tttgtggtgt acagagacag catcccccac gccgcctgcc acaagtgcat cgacttctac 900
agccggatca gagagctgcg gcactactcc gattctgtgt atggcgacac actcgagaag 960
ctcacaaaca caggactgta caatctgctc atctgataa 999
<210> 22
<211> 696
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированная последовательность HPV18-E2E6E7SH
<400> 22
Met Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu Arg Leu Ser Ala Leu Gln
1. 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp Ser Lys Asp Ile Asp Ser
20 25 30
Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp Glu Asn Ala Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu Asn His Gln Val Val Pro
50 55 60
Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His Lys Ala Ile Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Ala Tyr Lys Thr Glu Asp Trp
85 90 95
Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp Asn Thr Glu Pro Thr His
100
105
110
Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln Val Tyr Phe Asp Gly Asn
115 120 125
Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp Asp Ser Val Tyr Tyr Met
130 135 140
Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala Thr Cys Val Ser His Arg
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ile Glu Phe
165 170 175
Lys Ser Glu Cys Glu Lys Tyr Gly Asn Thr Gly Thr Trp Glu Val His
180 185 190
Phe Gly Asn Asn Val Ile Asp Cys Asn Asp Ser Met Cys Ser Thr Ser
195 200 205
Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Gln Leu Gln His Thr
210 215 220
Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly His Cys Gly Leu Ala Glu
245 250 255
Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Thr Pro
260 265 270
Thr Gly Asn Asn Lys Arg Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro
275 280 285
Ile Ile His Leu Lys Val Asp Arg Asn Ser Leu Met Arg Leu Arg Tyr
290 295 300
Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser Thr Trp
305 310 315 320
His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr
325 330 335
Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile
340 345 350
Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Met Thr Met Met Ala Arg
355
360
365
Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr
370 375 380
Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys
385 390 395 400
Lys Thr Val Leu Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu
405 410 415
Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala
420 425 430
Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys
435 440 445
Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu
450 455 460
Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro
465 470 475 480
Trp Cys Ala Ser Gln His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu
485 490 495
Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu
500 505 510
Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn
515 520 525
Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys
530 535 540
His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg
545 550 555 560
Glu Thr Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His
565 570 575
Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln
580 585 590
Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn Pro
595 600 605
Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr
610 615 620
Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe
625 630 635 640
Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala
645 650 655
Ala Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg
660 665 670
His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn
675 680 685
Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile
690 695
<210> 23
<211> 2094
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность nt, кодирующая сконструированную последовательность
HPV18-E2E6E7SH
<400> 23
atgcagaccc gaccactacg agatgggaga caggtggtgc atggccctgc acctgcgagg gtgcaggtgt gtgtactaca ggcctgtact gagaagtacg aacgacagca ctgcagcaca ggccagacca ggccctgtga ctgtgcagcg cggctgcggt ccaaagagac agaacgacag acgccatctt ccgcctacaa agggactggc aactgtggaa acttcgacgg tgaccgacgc acgtgaaaga gcaacaccgg tgtgcagcac cccccagccc gcgccgccac accctctgct gcaacaccac acagactgcg actgagcgag caaggacatc cttcgccgcc catcagcaag ccagagcgcc caccgagccc caacaaggac cggcacctgg gggctacaac cacatgggag cagcgacgac ctacagcagc cagacctgga gggagccgcc ccccatcatc gaagcacagc cggctgagcg gacagccaga agagagcacg agcaaggccc tacaagaccg acccactgct aactgcatga gacaagaccg accttctaca gtgcacttcg accgtgtccg accgtgtctg cactgtggcc acccccaccg cacctgaagg gaccactacc ccctgcagga tccagtactg gcatccagac acaaggctat aggactggac tcaagaaagg cctacgtggc ccacctgtgt tcgagttcaa gcaacaacgt ccacccagct tgggcaccgc tggccgagaa gcaacaacaa tggaccggaa gggacatcag caagatcatc gcagctgatc cctgaaccac cgagctgcag cctgcaggat cggccagacc ctgggacagc gtcccaccgg gagcgagtgc gatcgactgc ggtgaaacag caagacctac gcagcactgc gcggagaaag cagcctgatg cagcacctgg
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960
cactggaccg gcgctggcaa cgagaaaacc ggcatcctga ccgtgaccta ccacagcgaa 1020
acccagcgga ccaagttcct gaacaccgtg gccatccccg acagcgtgca gatcctggtg 1080
ggatatatga ccatgatggc cagattcgag gaccccacca gacggcccta caagctgccc 1140
gacctgtgca ccgagctgaa cacatctctg caggacatcg agatcacatg cgtgtactgc 1200
aagaccgtgc tggacctgct gtgccacgag cagctgtccg actccgagga agaaaacgac 1260
gagatcgacg gcgtgaacca tcagcatctg cccgccagac gggccgagcc ccagagacac 1320
accatgctgt gcatgtgctg caagtgcgag gcccggattg agctggtggt ggaaagcagc 1380
gccgacgacc tgcgggcctt ccagcagctc tttctgaata ccctgagctt cgtgtgccct 1440
tggtgcgcca gccagcacta cagcgactcc gtgtacggcg ataccctgga aaagctgacc 1500
aataccggcc tgtataacct gctgatccgg tgcctgcggt gccagaagcc cctgaatccc 1560
gccgagaaac tgagacacct gaacgagaag cggcggttcc acaatatcgc cggccactac 1620
agaggccagt gccacagctg ctgcaaccgg gccagacagg aacggctgca gcggaggcgg 1680
gaaaccatgc acggacccaa ggccaccctc caggacattg tcctgcacct ggaaccccag 1740
aacgagatcc ccgtcgatct gctgtgtcat gaacagctca gcgacagcga agaggaaaat 1800
gacgaaattg acggggtcaa ccctgacctc tgtaccgaac tcaataccag tctccaggat 1860
atcgaaatta cctgtgtcta ctgtaaaacc gtcctcgagc tgaccgaggt gttcgagttc 1920
gccttcaagg acctgtttgt ggtgtacaga gacagcatcc cccacgccgc ctgccacaag 1980
tgcatcgact tctacagccg gatcagagag ctgcggcact actccgattc tgtgtatggc 2040
gacacactcg agaagctcac aaacacagga ctgtacaatc tgctcatctg ataa 2094
<210> 24 <211> 2085 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая оригинальный полипептид E2E6E7SH HPV16
<400> 24
atggaaacgc tctgccagag actcaatgtc tgccaggata agattctcac gcattatgag 60
aacgattcca cggacctgcg cgatcacatt gattattgga aacacatgcg ccttgagtgt 120
gctatctatt ataaggctcg cgaaatgggt ttcaaacata tcaatcatca ggtcgtccct 180
accctcgccg tcagcaaaaa caaagctctg caggctattg aactccagct caccctcgag 240
acaatctaca attcccagta ctccaatgag aaatggacgc tccaggatgt gtctctcgag 300
gtctacctga cagctcctac aggatgtatt aagaaacacg ggtacacggt ggaagtccag 360
tttgatggcg atatatgtaa taccatgcat tatacgaatt ggacgcatat ctatatttgt 420
gaagaggcct ctgtgacagt ggtcgaggga caggtcgact attatgggct gtattatgtg 480
cacgaaggga tcagaacata ctttgtccag tttaaggatg atgctgagaa gtattctaag 540
aacaaagttt gggaagtcca tgccggtgga caagtgattc tgtgtcctac ctccgtgttc 600
agctctaatg aggtgtcctc tccagagatc attagacagc atctggccaa ccatcctgct 660
gctacacata ccaaggctgt ggctctggga acagaagaga cacagacaac aatccagagg 720
cctcggagcg agcctgatac aggcaaccct tgtcacacaa caaaactgct gcacagagac 780
tccgtggact ccgctcctat tctgacagcc tttaactcct cccacaaagg gagaatcaat 840
tgcaattcca ataccacgcc gatcgtccac ctcaaagtgg atgctaatac tctcatgcgg 900
ctccgctacc gcttcaagaa acactgtaca ctgtatacag ctgtgtccag cacatggcat 960
tggacgggac acaatgtgaa acataagtcc gccatcgtca cgctcacata cgattccgag 1020
tggcagagag atcagtttct gtcccaagtc aagattccga aaacgatcac cgtcagcacc 1080
ggctttatgt ctattatgca ccagaaacgc acggctatgt ttcaagatcc acaagagcga 1140
cccagaaaac tgcctcagct gtgtacagaa ctgcaaacaa ccatccatga catcattctt 1200
gagtgtgttt attgcaagca acagctcgag gacgaaatcg atggacctgc tggacaggcc 1260
gaacccgata gggctcacta caacatcgtc acgttttgtt gcaagtgtga ctccaccctg 1320
agactgtgtg tgcagtctac ccatgtggat atcagaaccc tcgaggacct gctcatggga 1380
acactcggta ttgtgtgtcc tatctgctcc cagaagcctg gaacaactct cgagcaacag 1440
tacaacaagc cgctctgtga tctcctgatc agatgcatta actgtcagaa gcctctctgc 1500
cctgaagaga agcagagaca cctcgataag aaacagcgct ttcacaatat cagaggccgg 1560
tggaccggca gatgcatgtc ctgctgtcgg agcagcagaa ccagacgcga gacacagatg 1620
catggcgata cacctacact ccatgagtat atgctcgatc tccagcctga aaccaccgat 1680
ctctactgtt atgagcagct caatgacagc agcgaagagg aagatgagat tgacggacca 1740
gctgggcaag ccgagccaga tcgcgcacat tacaatatcg ttaccttttg ttgtcagctc 1800
tgcacagagt tgcaaacgac gattcacgac attatattgg agtgcgtgta ctgtaaacaa 1860
cagctgctgc ggagagaagt ctacgatttc gcctttagag atctctgcat cgtctacaga 1920
gatgggaatc cctatgccgt ctgtgataag tgtctcaagt tttactccaa gatctccgag 1980
tatcgccatt actgttactc cctgtacggg acaaccttgg agcagcagta taacaagcca 2040
ttgtgtgatc tgctcattcg gtgtattaac tgccaaaagt gatga 2085
<210> 25 <211> 2094 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный полипептид E2E6E7SH HPV16
<400> 25
atgcagacgc cgaaagaaac cctgtccgag agactgagcg ctctccaaga taagattatt 60
gatcactatg agaatgactc caaggacatt gattcccaga ttcagtattg gcaacttatt 120
cgctgggaaa atgccatctt ctttgccgct cgggaacacg ggattcagac actgaatcat 180
caagtggtcc cagcctacaa tatctccaag tccaaagccc acaaagctat cgaactccaa 240
atggctctcc agggactggc tcagtccgct tataagacag aagattggac actccaggac 300
acgtgtgaag aactctggaa taccgaaccg acgcactgtt ttaagaaggg tggacagaca 360
gttcaagtct actttgatgg gaacaaagat aattgcatga catatgtcgc ttgggattcc 420
gtctactata tgacagatgc tgggacgtgg gataagacag ccacatgcgt cagccacaga 480
gggctgtact atgtcaaaga agggtataat acgttctata tcgagtttaa gtctgaatgc 540
gagaaatatg ggaatacggg aacctgggaa gtgcattttg ggaacaatgt catcgattgc 600
aatgactcca tgtgctccac ctccgatgac acagtcagcg ccacacagct cgtgaaacag 660
ctccagcata caccatctcc ctactcctcc actgtgtccg tgggaacagc caaaacatat 720
ggacagacct ccgctgccac acggcctggc cattgcggac tggccgagaa acagcattgt 780
ggaccagtca accctctgct gggagctgct actccaacag ggaacaacaa gaggcggaaa 840
ctgtgttccg gcaatacgac acctatcatt cacctcaagg tcgacagaaa ctccctgatg 900
agactgagat accggctgag aaagcactcc gatcactaca gagatatcag ctctacttgg 960
cattggacag gtgctggaaa cgaaaagaca gggatcctga cagtgacgta tcactccgag 1020
actcagcgca ccaaatttct caatactgtg gccattcccg attccgtgca gattcttgtc 1080
ggatatatga cgatgatggc tcgctttgag gatcctacaa gaaggcctta taagctccct 1140
gatctctgca ctgagcttaa caccagcctg caagacattg aaatcacttg tgtctattgc 1200
aaaacggtcc tggacctcct ctgtcacgaa caactgtctg atagtgaaga ggagaatgat 1260
gagatcgatg gtgtcaacca ccagcacctc cctgctcgga gagccgagcc tcagcggcat 1320
acaatgctct gtatgtgttg taaatgcgag gccagaatcg aactcgtggt cgagtcctcc 1380
gccgacgatc tgagagcttt tcagcaactg tttctcaaca ccctgtcctt tgtctgtcct 1440
tggtgtgcct cccagcatta ctccgattct gtgtatggcg acactctcga gaagctcact 1500
aacacgggac tgtataatct gctcatccgc tgtctgagat gccagaaacc tctgaatcct 1560
gccgagaaac tgcgccacct caatgagaag agaagattcc acaacattgc cggacattat 1620
cgaggccagt gtcactcctg ctgtaacaga gctcggcaag agagactgca gagaaggcgc 1680
gagacaatgc acggacctaa agccaccctc caggacattg tgctgcatct cgagcctcag 1740
aatgagattc ctgtcgactt gctctgccat gagcaactgt ccgattctga ggaagaaaat 1800
gacgaaatag atggcgtgaa ccctgacttg tgcactgaac tcaatacttc cctgcaagat 1860
atagagataa cgtgcgttta ctgtaagacg gtcctcgaac tcaccgaagt ctttgagttt 1920
gcctttaagg atctctttgt cgtctaccgc gactccatcc ctcacgctgc ttgtcacaaa 1980
tgtatcgatt tttactctcg catcagagaa ctgcggcact actctgactc agtgtatggc 2040
gatactttgg agaagcttac caatacgggc ctctataact tgctgatctg atga 2094
<210> 26
<211> 124
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Промотор PrMVA
<400> 26
taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agta
60 120 124
<210> 27
<211> 227
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Промотор PrHyb
<400> 27
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227
<210> 28
БЕЛОК
<211> 365
<212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> E2 фрагмент HPV 16
<400> 28
Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1. 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115 120 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145 150 155 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
165 170 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
180 185 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225 230 235 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
245 250 255
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
275 280 285
Val His Leu Lys Val Asp Ala Asn Thr Leu Met Arg Leu Arg Tyr Arg
290 295 300
Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305 310 315 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
325 330 335
Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
340 345 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
355 360 365
<210> 29 <211> 1095 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность nt, кодирующая E2 фрагмент HPV 16
<400> 29
atggaaaccc tgtgccagcg gctgaacgtg tgccaggaca agatcctgac ccactacgag 60
aacgacagca ccgacctgcg ggaccacatc gactactgga agcacatgcg gctggaatgc 120
gccatctact acaaggccag agagatgggc ttcaagcaca tcaaccacca ggtggtgccc 180
accctggccg tgtccaagaa caaggccctg caggccatcg agctgcagct gaccctggaa 240
accatctaca acagccagta cagcaacgag aagtggaccc tgcaggacgt gtccctggaa 300
gtgtacctga ccgctcccac cggctgcatc aagaaacacg gctacaccgt ggaagtgcag 360
ttcgacggcg acatctgcaa caccatgcac tacaccaact ggacccacat ctacatctgc 420
gaagaggcca gcgtgaccgt ggtggaaggc caggtggact actacggcct gtactacgtg 480
cacgagggca tccggaccta cttcgtgcag ttcaaggacg acgccgagaa gtacagcaag 540
aacaaagtgt gggaggtgca cgctggcggc caggtcatcc tgtgccccac cagcgtgttc 600
agcagcaacg aggtgtccag ccccgagatc atccggcagc acctggccaa tcaccctgcc 660
gccacccaca caaaggccgt ggccctgggc accgaggaaa cccagaccac catccagcgg 720
cccagaagcg agcccgacac cggcaatccc tgccacacca ccaagctgct gcaccgggac 780
agcgtggaca gcgcccctat cctgaccgcc ttcaacagca gccacaaggg ccggatcaac 840
tgcaacagca acaccacccc catcgtgcac ctgaaggtgg acgccaacac cctgatgcgg 900
ctgcggtaca gattcaagaa gcactgcacc ctgtacaccg ccgtgtcctc cacctggcac 960
tggaccggcc acaacgtgaa gcacaagagc gccatcgtga ccctgaccta cgacagcgag 1020
tggcagcggg accagttcct gagccaggtc aaaatcccca agaccatcac cgtgtccacc 1080
ggcttcatga gcatc 1095
<210> 30 <211> 1095 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая E2 фрагмент HPV 16
<400> 30
atggaaacgc tctgccagag actcaatgtc tgccaggata agattctcac gcattatgag 60
aacgattcca cggacctgcg cgatcacatt gattattgga aacacatgcg ccttgagtgt 120
gctatctatt ataaggctcg cgaaatgggt ttcaaacata tcaatcatca ggtcgtccct 180
accctcgccg tcagcaaaaa caaagctctg caggctattg aactccagct caccctcgag 240
acaatctaca attcccagta ctccaatgag aaatggacgc tccaggatgt gtctctcgag 300
gtctacctga cagctcctac aggatgtatt aagaaacacg ggtacacggt ggaagtccag 360
tttgatggcg atatatgtaa taccatgcat tatacgaatt ggacgcatat ctatatttgt 420
gaagaggcct ctgtgacagt ggtcgaggga caggtcgact attatgggct gtattatgtg 480
cacgaaggga tcagaacata ctttgtccag tttaaggatg atgctgagaa gtattctaag 540
aacaaagttt gggaagtcca tgccggtgga caagtgattc tgtgtcctac ctccgtgttc 600
agctctaatg aggtgtcctc tccagagatc attagacagc atctggccaa ccatcctgct 660
gctacacata ccaaggctgt ggctctggga acagaagaga cacagacaac aatccagagg 720
cctcggagcg agcctgatac aggcaaccct tgtcacacaa caaaactgct gcacagagac 780
tccgtggact ccgctcctat tctgacagcc tttaactcct cccacaaagg gagaatcaat 840
tgcaattcca ataccacgcc gatcgtccac ctcaaagtgg atgctaatac tctcatgcgg 900
ctccgctacc gcttcaagaa acactgtaca ctgtatacag ctgtgtccag cacatggcat 960
tggacgggac acaatgtgaa acataagtcc gccatcgtca cgctcacata cgattccgag 1020
tggcagagag atcagtttct gtcccaagtc aagattccga aaacgatcac cgtcagcacc 1080
ggctttatgt ctatt 1095
<210> 31
<211> 365
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> E2 фрагмент HPV 18
<400> 31
Met Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu Arg Leu Ser Ala Leu Gln
1. 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp Ser Lys Asp Ile Asp Ser
20 25 30
Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp Glu Asn Ala Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu Asn His Gln Val Val Pro
50 55 60
Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His Lys Ala Ile Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Ala Tyr Lys Thr Glu Asp Trp
85 90 95
Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp Asn Thr Glu Pro Thr His
100 105 110
Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln Val Tyr Phe Asp Gly Asn
115 120 125
Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp Asp Ser Val Tyr Tyr Met
130 135 140
Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala Thr Cys Val Ser His Arg
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ile Glu Phe
165 170 175
Lys Ser Glu Cys Glu Lys Tyr Gly Asn Thr Gly Thr Trp Glu Val His
180 185 190
Phe Gly Asn Asn Val Ile Asp Cys Asn Asp Ser Met Cys Ser Thr Ser
195 200 205
Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Gln Leu Gln His Thr
210 215 220
Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly His Cys Gly Leu Ala Glu
245 250 255
Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Thr Pro
260 265 270
Thr Gly Asn Asn Lys Arg 275
Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro 280 285
Ile Ile His Leu Lys Val Asp Arg Asn Ser Leu Met Arg Leu Arg Tyr
290 295 300
Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser Thr Trp
305 310 315 320
His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr
325 330 335
Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile
340 345 350
Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Met Thr Met
355 360 365
<210> 32 <211> 1095 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая E2 фрагмент HPV 18
<400> 32
atgcagaccc ccaaagagac actgagcgag cggctgagcg ccctgcagga caagatcatc 60
gaccactacg agaacgacag caaggacatc gacagccaga tccagtactg gcagctgatc 120
agatgggaga acgccatctt cttcgccgcc agagagcacg gcatccagac cctgaaccac 180
caggtggtgc ccgcctacaa catcagcaag agcaaggccc acaaggctat cgagctgcag 240
atggccctgc agggactggc ccagagcgcc tacaagaccg aggactggac cctgcaggat 300
acctgcgagg aactgtggaa caccgagccc acccactgct tcaagaaagg cggccagacc 360
gtgcaggtgt acttcgacgg caacaaggac aactgcatga cctacgtggc ctgggacagc 420
gtgtactaca tgaccgacgc cggcacctgg gacaagaccg ccacctgtgt gtcccaccgg 480
ggcctgtact acgtgaaaga gggctacaac accttctaca tcgagttcaa gagcgagtgc 540
gagaagtacg gcaacaccgg cacatgggag gtgcacttcg gcaacaacgt gatcgactgc 600
aacgacagca tgtgcagcac cagcgacgac accgtgtccg ccacccagct ggtgaaacag 660
ctgcagcaca cccccagccc ctacagcagc accgtgtctg tgggcaccgc caagacctac 720
ggccagacca gcgccgccac cagacctgga cactgtggcc tggccgagaa gcagcactgc 780
ggccctgtga accctctgct gggagccgcc acccccaccg gcaacaacaa gcggagaaag 840
ctgtgcagcg gcaacaccac ccccatcatc cacctgaagg tggaccggaa cagcctgatg 900
cggctgcggt acagactgcg gaagcacagc gaccactacc gggacatcag cagcacctgg 960
cactggaccg gcgctggcaa cgagaaaacc ggcatcctga ccgtgaccta ccacagcgaa 1020
acccagcgga ccaagttcct gaacaccgtg gccatccccg acagcgtgca gatcctggtg 1080
ggatatatga ccatg 1095
<210> 33 <211> 1095 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая E2 фрагмент HPV 18
<400> 33
atgcagacgc cgaaagaaac cctgtccgag agactgagcg ctctccaaga taagattatt 60
gatcactatg agaatgactc caaggacatt gattcccaga ttcagtattg gcaacttatt 120
cgctgggaaa atgccatctt ctttgccgct cgggaacacg ggattcagac actgaatcat 180
caagtggtcc cagcctacaa tatctccaag tccaaagccc acaaagctat cgaactccaa 240
atggctctcc agggactggc tcagtccgct tataagacag aagattggac actccaggac 300
acgtgtgaag aactctggaa taccgaaccg acgcactgtt ttaagaaggg tggacagaca 360
gttcaagtct actttgatgg gaacaaagat aattgcatga catatgtcgc ttgggattcc 420
gtctactata tgacagatgc tgggacgtgg gataagacag ccacatgcgt cagccacaga 480
gggctgtact atgtcaaaga agggtataat acgttctata tcgagtttaa gtctgaatgc 540
gagaaatatg ggaatacggg aacctgggaa gtgcattttg ggaacaatgt catcgattgc 600
aatgactcca tgtgctccac ctccgatgac acagtcagcg ccacacagct cgtgaaacag 660
ctccagcata caccatctcc ctactcctcc actgtgtccg tgggaacagc caaaacatat 720
ggacagacct ccgctgccac acggcctggc cattgcggac tggccgagaa acagcattgt 780
ggaccagtca accctctgct gggagctgct actccaacag ggaacaacaa gaggcggaaa 840
ctgtgttccg gcaatacgac acctatcatt cacctcaagg tcgacagaaa ctccctgatg 900
agactgagat accggctgag aaagcactcc gatcactaca gagatatcag ctctacttgg 960
cattggacag gtgctggaaa cgaaaagaca gggatcctga cagtgacgta tcactccgag 1020
actcagcgca ccaaatttct caatactgtg gccattcccg attccgtgca gattcttgtc 1080
ggatatatga cgatg 1095
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Комбинация вакцин, содержащая:
a) первую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество одного или нескольких рекомбинантных аденовирусных векторов, вместе составляющих первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и
b) вторую вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где вектор на основе MVA содержит MVA-BN или его производное.
2. Комбинация вакцин по п.1, где и первая вакцина, и вторая вакцина дополнительно содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую пятый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 28, и нуклеиновую кислоту, кодирующую шестой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 31.
3. Комбинация вакцин по любому из пп. 1-2, где и первый полипептид, и третий полипептид дополнительно содержат аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:28, и где и второй полипептид, и четвертый полипептид дополнительно содержат аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 31.
4. Комбинация вакцин по п.1, где и первая нуклеиновая кислота, и третья нуклеиновая кислота кодируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 3 или SEQ ID N0:5, где и вторая нуклеиновая кислота,
2.
и четвертая нуклеиновая кислота кодируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22 .
5. Комбинация вакцин по любому из пп. 1-4, где последовательности и первой нуклеиновой кислоты, и третьей нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90% идентичны полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и последовательности и второй нуклеиновой кислоты, и четвертой нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90% идентичны полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 21.
6. Комбинация вакцин по п.4, где последовательности и
первой нуклеиновой кислоты, и третьей нуклеиновой кислоты по
меньшей мере на 90% идентичны полинуклеотидной
последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:
24, и последовательности и второй нуклеиновой кислоты, и
четвертой нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90% идентичны
полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:
2 3 или SEQ ID NO: 25.
7. Комбинация вакцин по любому из пп. 1-6, где рекомбинантный аденовирусный вектор представляет собой гАо!2б.
8. Комбинация вакцин по любому из пп. 1-7, где первая вакцина содержит первый рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий первую нуклеиновую кислоту, и второй рекомбинантный аденовирус, содержащий вторую нуклеиновую кислоту.
9. Вектор на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащий: (а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и (b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22;
где вектор на основе MVA представляет собой MVA-BN или его
производное.
10. Вектор на основе рекомбинантного модифицированного
вируса коровьей оспы анкара (MVA) по п. 9, где первая нуклеиновая
кислота кодирует полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и вторая
нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:
20 .
11. Вектор на основе рекомбинантного MVA по п.9, где первая нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и вторая нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22 .
12. Вектор на основе рекомбинантного MVA по п.10, где
последовательность первой нуклеиновой кислоты по меньшей мере на
90% идентична полинуклеотидной последовательности,
представленной в SEQ ID NO: 2, и последовательность второй
нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90% идентична
полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:
21.
13. Вектор на основе рекомбинантного MVA по п.11, где
последовательность первой нуклеиновой кислоты по меньшей мере на
90% идентична полинуклеотидной последовательности,
представленной в SEQ ID N0: 4 или SEQ ID NO: 24, и
последовательность второй нуклеиновой кислоты по меньшей мере на
90% идентична полинуклеотидной последовательности,
представленной в SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 25.
14. Вектор рекомбинантного MVA, содержащий по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, содержащих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID N0:22, где no меньшей мере одна нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, содержащим по меньшей мере одну из полинуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 2 6 и SEQ ID NO:
11.
15. Вакцина, содержащая вектор на основе рекомбинантного MVA по любому из пп. 9-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. Способ лечения персистирующей инфекции, вызванной вирусом папилломы человека (HPV), интраэпителиальной неоплазии вульвы (VIN), интраэпителиальной цервикальной неоплазии (CIN), интраэпителиальной неоплазии влагалища (VaIN), анальной интраэпителиальной неоплазии (AIN), рака шейки матки (такого как плоскоклеточная карцинома шейки матки (SCC)), рака ротоглотки, рака полового члена, рака влагалища или рака анального канала у пациента, включающий введение пациенту вектора, вакцины или комбинации вакцин по любому из пп. 1-15.
17. Способ индукции иммунного ответа против вируса папилломы человека (HPV) у пациента, включающий:
(а) введение пациенту первой вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество либо
(i) рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего
первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид,
содержащий аминокислотную последовательность, представленную в
SEQ ID N0:1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй
полипептид, содержащий SEQ ID N0: 20, либо
(ii) первого рекомбинантного аденовирусного вектора,
содержащего первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый
полипептид, содержащий аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0:1, и второго рекомбинантного
аденовирусного вектора, содержащего вторую нуклеиновую кислоту,
кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20,
вместе с фармацевтически приемлемым носителем; и Ь) введение пациенту второй вакцины, содержащей иммунологически эффективное количество вектора на основе рекомбинантного модифицированного вируса коровьей оспы анкара (MVA), содержащего третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, и четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20, вместе с фармацевтически приемлемым носителем;
где первую вакцину вводят пациенту в качестве первичной вакцины, а вторую вакцину вводят пациенту в качестве поддерживающей вакцины.
18. Способ по п.17, где и первый полипептид, и третий
полипептид дополнительно содержат аминокислотную
последовательность, представленную в SEQ ID N0: 28, и где и
второй полинуклеотид, и четвертый полинуклеотид дополнительно
содержат аминокислотную последовательность, представленную в SEQ
ID N0: 31.
19. Способ по любому из пп. 17-18, где первая вакцина содержит первый рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 3, и второго рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 20 или SEQ ID N0: 22.
По доверенности
ПН) кЛа _
75 кДа -
50 к-Ла _
37 кДа -
^^^^^^
Антитело к NF-kB
День 0 День 2 2 недели
недель
E7WT
E6WT
I 6 7SI
С.(-Р
подвергавшиеся обработке
^ Л* # <^
50кДа _
50кДа - 37кДа -
20кДа - 15кДа - 75кДа -
Антитело к р53
Антитело к Еб HPV16
Антитело к NF-kB
150 кДа 100 кДа 37кДа
Антитело к pRb
Антитело к Е7 HPV16
15кДа 50кДа
37 кДа
Антитело к актину
Фиг. 3 - продолжение
160 -i
140 -
Дни после трансдукции
Фиг. 4
I V
I Первичная иммунизация
E6E7SH
Контроль
Фиг. 5
2 недели
I Первичная иммунизация V Умерщвление
4Ю •
0,".
E*5E7w! тЛж,7\?1 "5Р?$В Пустой
0.0*
--ч-- г--- 1 """
Пустом
I V
I Пер
вичная иммунизация
т ф ¦
,."".т."""^^ :,,у",
E2E6E7SH E6E7E2SH ЈSE7SH Е2 Пустой
Фиг. 7
I V I Первичная иммунизация
-| (-•
л о V Умерщвление
и I недели г
ЗШ-1
о в
200-
100-
E2E6E7SH E6E7E2SH
E6E7SH
Пустой
lOOOi ШЮ -600 -
400 -20О
0 ^ &ая"уад,в,"^
OEoF/Stt Ш7Е2$Н E6E7SH
t:2
Пустой
Фиг. 8
-#-
LSE2E6E7SH E2E6E7SH E6E7E2SH E6E7SH Пустой
Фиг. 9
Ad26 Ad35
Y У v Ў Первичная иммунизация
0 2 4 6 недели
Ч Поддерживающая иммунизация v Умерщвление
25-
+ 201
н о И
М _
Первичная иммунизация (Ad26): HPV16-Tx HPV16-TX Пустой SLP+CpG CpG Поддерживающая (Ad35): HPV16-Tx Пустой Пустой SLP+CpG CpG
иммуншации
Фиг. 10
1500 -
[ 2 недели после первичной иммунизации III 2 недели после 1-ой поддерживающей иммунизации FT 2 недели после 2-ой поддерживающей иммунизации
1000 -
500 -
HPV16-E2E6E7SH
Пустой
Фиг. 11
V f
О 6 20
90 дни
J ТС-1
? Первичная иммунизация
f Поддерживающая иммунизация
V Умерщвление
щ > а
1250 ц
с с
1250 -I
12*0
1250
1000
1000 -
750
750
О К
'Р 600
с; о
500
ю О
250
с о
г-3-" г-т г-I г-1 I-1
О 10 20 30 40 50 60 79 80 Ш
Дни после появления опухоли
|'":'Ч Г-Т "Г К "I ""'I-I
10 20 30 40 50 бО 70 80 90
Дни после появления опухоли
Фиг. 12
Дни после появления опухоли ФиГ. 12 - ПрОДОЛЖвНИе
PER.C6 PER.OS/fetR
Фиг. 13
PER.C6
PER.C6/CymR
PER.C6
PER.C6/CymR
98 кДа _
62 кДа - 49 кДа -
Антитело к NF-kB
Антитело к Еб HPV16/18
E7WT
Ш"7311 GlF
Iie подвергавшиеся обрабоikc
Фиг. 16
50кДа -
"St.
37 кДа _
20 кДа _
15кДа -
75 кДа -
Антитело к р53
Антитело к Еб IIPV18
Антитело к N F-kB
Антитело к pRb
Не самая меньшая эффективность51
1 р=0,0075*
Антитело к Е7 HPV18
Антитело к актину
Фиг. 17
Фиг. 18
о н о
+ ос О
иммунТзадия fAsi353 E2E6E7SH E6E7SH Пустой
HPV18
Первичная иммунизация
Ас" АсШ Ш АН"
HPVi8 E2E6E7SH Пустой
Фиг. 19 - продолжение
о-" -¦¦
Первичная HPV1S E2E6E7SH + ,' .,
иммунизация tMU Фиг. 20
Ответ HPVT8-E6
2000 ,
Z и.
1500-
1000-
500-
0-1
Первичная иммунизация
Поддерживающая /д иммунизация \маоэ;
HPV16 E2E6E7SH + HPV18 E2E6E7SH
HPV16 E2E6E7SH + HPV18 E2E6E7SH
Пустой Пустой
Фиг. 20 - продолжение
10001
800 ¦
800-
Ж HPV16-E2 О HPV16-E6 ? HPV16-E7
Ш HPV18-E2 О HPV18-E6 О HPV18-E7
% 400.
200- :
fi еде. tw
1(c)
Фиг. 21
-- Группа 1: I 21617411 HPV 16/18 -¦-Группа 2: E2E6E7S1I IIPV 16 -н-Группа 3: Пустой
-i-
0 20 40 60 80 100
Дни после появления опухоли
Фиг. 22
V у Первичная иммунизация
"4* у Поддерживающая иммунизация
10 недели у Умерщвление
Полный ответ
р=О.001
Ш HPV16-E2 Ш HPV16-ES
т HPV1S-67
Ш HPV18-E2
ЕЗ HPV18-E5 Ш HPV13-E7
2000
1000
(недО): АЛ2в.НРУ1вЛ8
лаге, пусто"
(явд81- MVA-BN Ad35, MVA-BN Контроль HPV1618 HPV1S/18
Фиг. 23
24 недели
? Первичная иммунизация
Ў Поддерживающая иммунизация
ответ на HPV16-E2
ответ на HPV18-E2
р----0,0312 ,, р=й,В312 ,
15001006
3 и.
1SW
Й 10
ответ на HPV16-ES
ответ на HPV18-E6
3BGS
1388
/ Л Г
1900-i
800 -|
soo-|
40S-I
a J:
в ю
неделя
ответ на HPV16-E7
неделя
ответ на HPV18-E7
i 188
488300-
¦ша-
Число антигенов на животное
i : 1
Общий ответ на HPV16/18 (Е2Е6Е7) с течением времени
неделя -4
13 16 24
Первичная Поддерживающая иммунизация Ad26 иммунизация MVA (недО) (недЗ)
О 20 40 80 to
Дни после появления опухоли
Фиг. 25
109
112
112
<220>
119
119
121
122
27 .
1/29
1/29
Фиг. 1
Фиг. 1
1/29
1/29
Фиг. 1
Фиг. 1
1/29
1/29
Фиг. 1
Фиг. 1
2/29
2/29
Фиг. 2
Фиг. 2
2/29
2/29
Фиг. 2
Фиг. 2
2/29
2/29
Фиг. 2
Фиг. 2
2/29
2/29
Фиг. 2
Фиг. 2
2/29
2/29
Фиг. 2
Фиг. 2
2/29
2/29
Фиг. 2
Фиг. 2
3/29
3/29
4/29
4/29
4/29
4/29
4/29
4/29
4/29
4/29
4/29
4/29
5/29
5/29
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
6/29
7/29
Фиг. 6
8/29
7/29
Фиг. 6
8/29
7/29
Фиг. 6
8/29
7/29
Фиг. 6
8/29
7/29
Фиг. 6
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
9/29
10/29
10/29
10/29
10/29
10/29
10/29
11/29
11/29
11/29
11/29
11/29
11/29
11/29
11/29
11/29
11/29
12/29
12/29
12/29
12/29
12/29
12/29
12/29
12/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
13/29
14/29
14/29
15/29
15/29
16/29
16/29
Фиг. 14
Фиг. 14
16/29
16/29
Фиг. 14
Фиг. 14
16/29
16/29
Фиг. 14
Фиг. 14
16/29
16/29
Фиг. 14
Фиг. 14
17/29
17/29
Фиг. 15
Фиг. 15
18/29
18/29
18/29
18/29
18/29
18/29
19/29
19/29
19/29
19/29
19/29
19/29
19/29
19/29
19/29
19/29
20/29
21/29
Фиг. 19
20/29
21/29
Фиг. 19
20/29
21/29
Фиг. 19
22/29
21/29
Фиг. 19
22/29
21/29
Фиг. 19
23/29
23/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
25/29
25/29
25/29
25/29
25/29
25/29
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
27/29
Фиг. 24
28/29
29/29
Фиг. 24
