EA201892452A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892452 Полный текст описания [**] EA201892452 20170616 Регистрационный номер и дата заявки LU93112 20160617 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2017/064729 Номер международной заявки (PCT) WO2017/216324 20171221 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа [8] C07K 16/30, [8] A61K 35/17, [8] C07K 14/725, [8] A61P 35/00, [8] A61K 39/00 Индексы МПК [DE] Эллингер Кристиан, [DE] Венер Карина, [DE] Вайс Манон, [DE] Вильде Сусанне, [DE] Шендель Долорес Сведения об авторах [DE] МЕДИДЖИН ИММУНОТЕРАПИС ГМБХ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892452a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. В частности, в настоящем изобретении предусматриваются антигенспецифические T-клеточные рецепторы (TCR). Кроме того, в настоящем изобретении охватываются кодирующие их полинуклеотиды и векторы, содержащие указанные полинуклеотиды. Также предусматриваются клетки-хозяева, содержащие молекулы по настоящему изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении предусматриваются средства и способы диагностики и терапии, в частности рака.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. В частности, в настоящем изобретении предусматриваются антигенспецифические T-клеточные рецепторы (TCR). Кроме того, в настоящем изобретении охватываются кодирующие их полинуклеотиды и векторы, содержащие указанные полинуклеотиды. Также предусматриваются клетки-хозяева, содержащие молекулы по настоящему изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении предусматриваются средства и способы диагностики и терапии, в частности рака.


Евразийское (21) 201892452 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.06.16
(51) Int. Cl.
C07K16/30 (2006.01) A61K35/17 (2015.01) C07K14/725 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) A61K39/00 (2006.01)
(54) T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 93112; 17160260.0
(32) 2016.06.17; 2017.03.10
(33) LU; EP
(86) PCT/EP2017/064729
(87) WO 2017/216324 2017.12.21
(71) Заявитель:
МЕДИДЖИН ИММУНОТЕРАПИС ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Эллингер Кристиан, Венер Карина, Вайс Манон, Вильде Сусанне, Шендель Долорес (DE)
(74) Представитель:
Носырева Е.Л. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. В частности, в настоящем изобретении предусматриваются антигенспецифические T-клеточные рецепторы (TCR). Кроме того, в настоящем изобретении охватываются кодирующие их полинуклеотиды и векторы, содержащие указанные полинуклеотиды. Также предусматриваются клетки-хозяева, содержащие молекулы по настоящему изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении предусматриваются средства и способы диагностики и терапии, в частности рака.
Первоначально поданное описание изобретения
Р51449512ЕА
Т-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Уровень техники
[1] Т-лимфоциты (или Т-клетки), которые образуют часть клеточно-опосредованной иммунной системы, играют сосновую роль в уничтожении патогенов. Т-клетки развиваются в тимусе и экспрессируют молекулы Т-клеточных рецепторов на своей поверхности, которые способствуют распознаванию пептидов, презентируемых на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС), которые экспрессируются на ядросодержащих клетках (презентация антигена). Антигены патогенов, т. е. чужеродные антигены, презентируемые молекулами МНС, будут вызывать выраженный Т-клеточный ответ, в то время как аутоантигены обычно не вызывают Т-клеточный ответ благодаря негативному отбору Т-клеток, специфичных к аутоантигенам, в тимусе во время развития таких Т-клеток. Таким образом, иммунная система может различать ядросодержащие клетки, презентирующие чужеродные антигены и аутоантигены, и специфично нацеливаться на инфицированные клетки и уничтожать их за счет активного высвобождения цитокинов и за счет механизмов клеточной цитотоксичности Т-клеток.
[2] Потенциал иммунной системы был признан в качестве перспективного средства для терапии рака в будущем. В последнее десятилетие были начаты исследования относительно использования уникальных свойств Т-клеток с помощью адаптивного переноса клеток (ACT), который включает введение полученных от доноров лимфоцитов, экспансированных ex vivo. ACT представляет собой перспективную концепцию лечения рака, поскольку для нее не требуется иммунокомпетентность у пациентов, а специфичность
переносимых лимфоцитов может быть направлена против немутировавших и таким образом недостаточно иммуногенных опухолевых антигенов, которые обычно неспособны эффективно запускать аутологичные Т-клеточные ответы. Несмотря на то, что ACT зарекомендовала себя в качестве перспективного лечения различных типов рака, ее широкое применение в качестве клинического лечения было приостановлено необходимостью индивидуального выделения и определения характеристик опухолеспецифических Т-клеток у каждого пациента - процесс, который может быть не только сложным и требующим много времени, но который также зачастую не приводит к получению высокоавидных Т-клеток (Xue et al. Clin Exp Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248.
[3] Генетический перенос опухолевых антигенспецифических Т-клеточных рецепторов (TCR) в первичные Т-клетки может преодолевать имеющиеся в настоящее время ограничения в ACT, поскольку он обеспечивает возможность быстрого получения опухолереактивных Т-клеток с определенной специфичностью к антигену даже у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако идентификация подходящих клонов Т-клеток, несущих TCR, которые специфично распознают опухолевые антигены и проявляют необходимые противоопухолевые эффекты in vivo, по-прежнему является задачей текущих исследований. Учитывая, что в 2012 г. в мире возникло приблизительно 14,1 миллиона новых случаев рака и что рак в настоящее время является причиной приблизительно 14,6% всех смертей людей в мире, незамедлительно требуются новые и эффективные варианты лечения. Целью настоящего изобретения является удовлетворение требований, изложенных выше.
Краткое описание изобретения
[4] В настоящем изобретении предусмотрены антигенспецифические Т-клеточные рецепторы, а также нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, содержащие их; и различные варианты их использования и применения.
[5] В первом аспекте настоящее изобретение относится к Т-клеточному рецептору (TCR), содержащему (i) участок, определяющий комплементарность 3 (CDR3), вариабельного участка альфа-цепи TCR, содержащего аминокислотную последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:1, или состоящего из нее, и/или (и) CDR3 вариабельного участка бета-цепи TCR, содержащего аминокислотную последовательность С AS S THRGQTN YG YTF (SEQ ID NO: 2) или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:2, или состоящего из нее.
[6] TCR, предусмотренные в данном документе, способны связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31) или его НЬА-А*02-связанной форме, предпочтительно с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) или ее МНС-связанной форме. Вышеупомянутая аминокислотная последовательность соответствует аминокислотам в положениях 100-108 PRAME (предпочтительно экспрессируемом антигене при меланоме), который, как считается, экспрессируется при множестве различных видов рака.
[7] TCR в соответствии с настоящим изобретением, может, например, содержать (i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или (и) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее. TCR по настоящему изобретению могут также содержать константный участок в альфа-цепи TCR и/или бета-цепи TCR.
[8] В частности, TCR, предусмотренные в данном документе, могут содержать (i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или состоящую из нее, и/или (и) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.
[9] TCR по настоящему изобретению могут иметь множество форм, например, TCR может представлять собой нативный TCR, вариант TCR, фрагмент TCR или TCR-конструкцию. В данном документе предусмотрены гетеродимеры и мультимеры, содержащие альфа- и бета-цепи TCR, ковалентно связанные друг с другом, а также TCR-конструкции, содержащие один или более слитых компонентов. Применимая TCR-конструкция содержит, например, альфа-цепь TCR, бета-цепь TCR (обе ковалентно связанные друг с другом) и антитело или фрагмент антитела, такой как svFv, которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов (например, CD3, CD28, CD5, CD 16 или CD56) и слит с цепями TCR посредством линкера.
[10] Другие применимые фрагменты, которые могут быть ковалентно связаны с TCR по настоящему изобретению, содержат различные метки. TCR по настоящему изобретению также могут быть представлены в растворимой форме.
[11] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая любой из TCR, представленных в данном документе, при этом указанная нуклеиновая кислота, например, содержит последовательность
нуклеиновой кислоты из любой из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или состоит из нее.
[12] Кроме того, в данном документе предусмотрен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением. Иллюстративные векторы включают вирусные векторы, например, лентивирусные или гамма-ретровирусные векторы.
[13] В данном документе также предусмотрены клетки-хозяева, содержащие TCR, нуклеиновую кислоту или вектор по настоящему изобретению. Применимые клетки-хозяева включают лимфоциты, такие как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клетки.
[14] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ получения TCR по настоящему изобретению.
[15] Также в данном документе предусмотрена фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая TCR, нуклеиновую кислоту, вектор и/или клетку-хозяина по настоящему изобретению. Также предусмотрено применение разработанных TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции в качестве лекарственного препарата или диагностического средства, и, в частности, для выявления, диагностики, прогнозирования, предупреждения и/или лечения рака. Применимый способ предупреждения или лечения рака предусматривает следующие стадии: (а) обеспечения одного или более из TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции, раскрываемых в данном документе, и (Ь) введения одного или более из вышеупомянутого нуждающемуся в этом субъекту. Настоящее изобретение также охватывает следующее: (а) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты, (Ь) обеспечение одного или более из TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции, раскрываемых в данном документе, и (с) их введение в лимфоциты, полученные
на стадии (а), за счет чего получают модифицированные лимфоциты, (d) введение модифицированных на стадии (с) лимфоцитов нуждающимся в этом субъекту или пациенту.
[16] Настоящее изобретение также относится к способу выявления in vitro наличия рака у субъекта in vitro, предусматривающему (а) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток, (Ь) приведение указанного образца в контакт с TCR, нуклеиновой кислотой, вектором или клеткой-хозяином, за счет образуется комплекс, и (с) выявление комплекса, где выявление комплекса свидетельствует о наличии рака у субъекта.
Описание графических материалов
[17] На фиг. 1 изображен схематический обзор подхода на основе примирования с использованием зрелых дендритных клеток. PRAME-трансфицированные зрелые дендритные клетки использовали для de novo индукции PRAME-специфических CD8 Т-клеток в репертуаре аутологичного здорового донора.
[18] На фиг. 2 изображен мультиплексный анализ секреции цитокинов (IFN-гамма, IL-2, TNF-альфа, IL-5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4, IL-1-бета) клона PRAMEioo-108-специфических Т-клеток Т4.8-1-29, совместно культивируемых с нагруженными пептидом Т2-клетками (PRAMEioo-ios "VLD-пептидом" или PRAME300-309 "ALY-пептидом" в качестве отрицательного контроля, н.о. = не выявлено). Клон Т4.8-1-29 характеризуется наличием CDR3 в своем вариабельном участке альфа-цепи TCR, как показано в SEQ ID NO: 1, и/или наличием CDR3 в своем вариабельном участке бета-цепи TCR, как показано в SEQ ID NO: 2.
[19] На фиг. 3 изображено высвобождение IFN-гамма из клона PRAMEioo-ios-специфических Т-клеток Т4.8-1-29, совместно культивируемых с различными линиями опухолевых клеток человека, экспрессирующими HLA-A*02:01, где, как указано в подписи к фиг. 3, некоторые из линий опухолевых клеток
экспрессируют PRAME (столбцы зеленого цвета). Линии опухолевых клеток, не экспрессирующих PRAME, служат в качестве отрицательного контроля (столбцы красного цвета). Положительный контроль: Т2-клетки, нагруженные "VLD-пептидом" (столбец черного цвета), фоновый уровень Т-клеток без стимуляции указан с помощью столбцов белого цвета ("н. в. = не выявлено").
[20] На фиг. 4 изображено высвобождение IFN-гамма клоном РР\АМЕюо-ю8-специфических Т-клеток Т4.8-1-29, совместно культивируемых с клетками Т2-клетками, нагруженными титруемыми количествами РР\АМЕюо-ю8-пептида. Пунктирная линия указывает концентрацию пептида, которая приводит к полумаксимальной секреции IFN-гамма, составляющей 10"9-10"10 моль/л [М] в качестве показателя функциональной авидности исследуемого клона Т-клеток.
[21] Фиг. 5. Для доказательства образования пар и функциональности трансгенного TCR специфическое высвобождение IFN-гамма PRAMEioo-ios-специфическими TCR Т4.8-1-29-трансфицированными реципиентными CD8+ Т-клетками (клон реципиентных Т-клеток + Т4.8-1-29 /v/РНК) при совместном культивировании с PRAME100-108 (УЬБ)-пептид-нагруженными Т2-клетками или Т2-клетками, нагруженными нерелевантным пептидом, измеряли с помощью стандартного ELISA.
[22] На фиг. 6 изображено специфическое высвобождение IFN-гамма из PRAMEioo-108-специфических CD8+ обогащенных РВМС, сконструированных в целях экспрессии РР\АМЕ10о-ю8-специфического TCR Т4.8-1-29 при совместном культивировании с аутопептид-нагруженными (в общей сложности 131 универсальный аутопептид, связывающийся с кодируемыми HLA-A*02:01 молекулами) Т2-клетками, измеренное с помощью стандартного ELISA.
[23] На фиг. 7 изображен лизис Т2-клеток, нагруженных PRAMEi0o-io8-пептидом ("VLD-пептидом") или нерелевантным пептидом SLLQHLIGL ("SLL-пептидом") с помощью CD 8+ обогащенных РВМС, сконструированных для экспрессии РР\АМЕ10о-ю8-специфического TCR Т4.8-1-29.
[24] На фиг. 8 изображен лизис PRAMEioo-108-экспрессирующих целевых клеток с помощью человеческих РВМС, экспрессирующих РР\АМЕюо-ю8-специфический TCR Т4.8-1-29. (А) Лизис НЬА-А*02:01-трансфицированных эндогенно PRAME-положительных человеческих К562 опухолевых клеток, дополнительно нагруженных РР\АМЕюо-ю8-пептидом ("VLD-пептидом"). (В) HLA-A*02 отрицательные эндогенно PRAME-положительные человеческие К562-клетки, дополнительно трансфицированные /v/РНК, кодирующей PRAME, в качестве отрицательного контроля не лизируются. (С) Изображен лизис HLA-А*02-трансфицированных эндогенно PRAME-положительных человеческих К562-клеток, дополнительно трансфицированных /v/РНК, кодирующей PRAME. (D) Изображен лизис НЕА-А*02-трансфицированных эндогенно PRAME-положительных человеческих К562-клеток.
[25] На фиг. 9 изображены аминокислотные последовательности из применяемого примера альфа- и бета-цепи Т-клеточного рецептора (SEQ ID NO 11 и 12) и аминокислотная последовательность человеческого PRAME (SEQ ID NO. 33). В альфа- и бета-цепи последовательности CDR1 и CDR2 подчеркнуты, а последовательности CDR3 выделены серым цветом и жирным шрифтом, вариабельные участки - обычным шрифтом, константные участки - курсивом.
[26] На фиг. 10 изображено распознание различных HLA-A*02- и PRAME-положительных линий опухолевых клеток CD8+ обогащенными РВМС, экспрессирующими TCR T4.8-1-29HLA-A*02, о чем свидетельствует индуцированное активацией высвобождение IFN-гамма и которое измерено с помощью стандартного ELISA.
[27] На фиг. 11 изображены нетрансдупированные РВМС здорового донора и те же РВМС здорового донора, трансдуцированные плазмидой, содержащей конструкцию ТСТ Т4.8-1-29, описанную в данном документе.
[28] На фиг. 12 изображена функциональная авидность Т-клеток по отношению к PRAME100-108 (VLD)-nenrHny, измеряемая с помощью выявления секреции IFN-гамма после совместного культивирования либо с клоном Т
клеток T4.8-1-29 (пунктирная кривая), либо с эффекторными РВМС, трансдуцированными Т4.8-1-29 (сплошная кривая) с помощью пептид-нагруженных Т2-клеток.
[29] На фиг. 13 изображен анализ специфичности к антигену Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторных РВМС и нетрансдупированных контрольных РВМС. Линии опухолевых клеток ОРМ-2 и U937 (НЬА-А2-отрицательные и PRAME-отрицательные) исследовали либо немодифицированными, либо трансфицированными /v/РНК, кодирующей HLA-A2.
[30] На фиг. 14 изображен анализ специфичности к антигену, Т4.8-1-29-трансдуцированные эффекторные РВМС и нетрансдуцированные контрольные РВМС совместно культивировали с различными линиями целевых клеток. Тестировали линии опухолевых клеток К562 (HLA-A2- отрицательные и PRAME-положительные), а также К562 А2 и Mel 624.38 (HLA-A-положительные и PRAME-положительные) и 647-V (НЬА-А2-положительные и PRAME-отрицательные).
[31] На фиг. 15 изображен анализ цитотоксической активности Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторов в отношении опухолевых клеток с помощью системы для анализа живых клеток IncuCyte ZOOM(r) (Essenbiosciences), системы на основе микроскопа, которая позволяет визуализацию живых клеток.
[32] На фиг. 16 изображен анализ профиля безопасности Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС.
Подробное описание изобретения
[33] Авторы настоящего изобретения идентифицировали клоны Т-клеток, которые способны специфически распознавать клетки, экспрессирующие опухолеассоциированный антиген (ТАА) PRAME; и которые характеризуются преимущественными эффекторными функциями, такими как продуцирование цитокинов и цитолиз целевых клеток. Таким образом, указанные клоны Т-клеток и их Т-клеточные рецепторы являются перспективными средствами для
высокоспецифичного и эффективного лечения рака. Таким образом, идентифицированные PRAME-специфические TCR являются подходящими для адаптивной Т-клеточной терапии рака. Таким образом, идентификация TCR, который способен связываться с PRAME высокоспецифичным образом, обеспечивает возможность "вооружения" Т-клеток ex vivo и повторное их введение донору, где они могут эффективно распознавать и специфически элиминировать PRAME-экспрессирующие раковые клетки. Кроме того, антигенсвязывающие участки нового TCR, предусмотренные в данном документе, могут быть использованы для разработки растворимых конструкций, содержащих дополнительные функциональные фрагменты (такие как, лекарственные средства, метки или дополнительные связывающие домены, притягивающие другие иммунные клетки), которые легко доступны для прямого введения.
Вариабельный участок CDR3-flOMeHbi
[34] Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к Т-клеточному рецептору (TCR), содержащему (i) CDR3 альфа-цепи Т-клеточного рецептора, содержащий последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) или состоящий из нее, и/или (ii) CDR3 бета-цепи Т-клеточного рецептора, содержащий аминокислотную последовательность CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO. 2), или состоящий из нее.
[35] В данном документе дополнительно предусмотрены варианты последовательности TCR, содержащие альфа-цепь CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 1, или состоящую из нее, и/или бета-цепь CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95%
идентична SEQ ID NO: 2, или состоящую из нее, при условии, что TCR сохраняет предпочтительные способности TCR, оцениваемые в прилагаемых примерах, т. е. способен связываться с антигенной мишенью, определенной в данном документе.
[36] Термин "Т-клеточный рецептор" или "TCR", используемый в данном документе, включает нативные TCR, а также варианты, фрагменты и конструкции TCR. Таким образом, данный термин включает гетеродимеры, содержащие альфа- и бета-цепи TCR, а также мультимеры и одноцепочечные конструкции, необязательно содержащие дополнительные домены и/или фрагменты.
[37] В своей нативной форме TCR существует в виде комплекса из нескольких белков на поверхности Т-клеток. Т-клеточный рецептор состоит из двух (отдельных) белковых цепей, которые продуцируются в результате функционирования генов альфа- и бета-цепей Т-клеточного рецептора (TCR а и TCR Р) и называются альфа-(а-) и бета-(Р-)цепями. Каждая цепь TCR имеет один N-концевой иммуноглобулин-подобный (1§)-вариабельный (V) домен/участок, один подобный Ig-подобный-константный (С) домен/участок, трансмембранный/клеточномембранный-перекрывающий участок, заякоривающий цепь в плазматической мембране, и короткий цитоплазматический хвост на С-конце.
[38] Специфичность к антигену придается вариабельными участками альфа- и бета-цепи. Оба вариабельных домена альфа-цепи и бета-цепи TCR содержат три гипервариабельных или определяющих комплементарность участка (CDR1-альфа/бета, CDR2-aльфa/бeтa и CDR3-альфа/бета), окруженные каркасными (FR) участками. CDR3 представляет собой примированную детерминанту распознавания антигена и специфичности к нему (т. е. способность распознавать и взаимодействовать со специфическим антигеном), в то время как CDR1 и CDR2 главным образом взаимодействуют с молекулой МНС, презентирующей антигенный пептид.
[39] Нативные TCR распознают антигенные пептиды, связанные
("презентированные/отображающиеся на") с молекулами
(молекулами/молекулах) главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Антигенный пептид, презентированный на молекуле МНС, также обозначается в данном документе как "пептид:комплекс МНС". Существует два различных класса молекул МНС: МНС I и МНС II, которые презентируют пептиды из различных клеточных компартментов. Молекулы МНС I класса экспрессируются на поверхности всех ядросодержащих клеток во всем организме человека и отображают пептидные или белковые фрагменты из внутриклеточных компартментов цитотоксическим Т-клеткам. У человека МНС также называется человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA). Существует три основных типа МНС I класса: HLA-A, HLA-B и HLA-C. При связывании TCR со своим специфическим пептидом комплексом МНС Т-клетка активируется и проявляет биологические эффекторные функции.
[40] TCR, предусмотренные в данном документе, предпочтительно способны (специфично) распознавать PRAME, в частности PRAMEioo-ios, в своей МНС-связанной форме, как будет подробно рассмотрено ниже. Считается, что антигенный пептид присутствует в своей "МНС-связанной форме", если он образует комплекс с молекулой МНС (которая может присутствовать на поверхности антигенпрезентирующей клетки, такой как дендритная клетка или опухолевая клетки, или он может быть иммобилизован, например, путем нанесения с осаждением на гранулу или планшет).
CDR1- и CDR2-flOMeHbi
[41] Как изложено ранее, TCR по настоящему изобретению особенно предусмотрены для распознавания их антигенной мишени PRAMEioo-ios при презентации на молекуле МНС, в частности молекуле MHC-I, и в частности HLA-A, предпочтительно HLA-A*02, и в частности молекулах HLA-A2, кодируемых аллелем HLA-A*02:01 (считается, что Т-клетка или TCR "ограничены" определенной молекулой МНС). Не исключена вероятность того,
что TCR по настоящему изобретению распознают свою антигенную мишень, презентированную другими аллелями HLA-A*02. Как отмечено ранее, считается, что CDR1 и CDR2 альфа- и бета-цепей TCR главным образом вовлечены в распознавание МНС. Существует ограниченный "пул" последовательностей CDR1 и CDR2, которые, как известно, вовлечены в распознавание НЬА-А*02-ограниченного антигена, и предполагается, что CDR3-домены по настоящему изобретению могут в принципе сочетаться с любым из CDR1- и CDR2-flOMeHOB, представленных в SEQ ID NO: 34-224, при условии, что TCR сохраняет свою способность распознавать свою антигенную мишень, предпочтительно в его НЬА-А*02-связанной форме, в аналогичной, такой же самой или даже более высокой степени, что и TCR, оцениваемую в прилагаемых примерах. Применимые примеры CDR1- и CDR2-доменов включают CDR1-альфа, содержащий последовательность VSGLRG, представленную в SEQ ID NO: 5, или состоящий из нее, CDR2-aльфa, содержащий последовательность LYSAGEE, представленную в SEQ ID NO: 3, или состоящий из нее, CDRl-бета, содержащий последовательность SGDLS, представленную в SEQ ID NO: 6, или состоящий из нее, и CDR2-6eTa, содержащий последовательность YYNGEE, представленную в SEQ ID NO: 4, или состоящий из нее. Указанные последовательности CDR также показаны на фиг. 9.
[42] В соответствии с вышеизложенным в настоящем изобретении, в частности, предусмотрены TCR, содержащие две полипептидные цепи, каждая из которых содержит человеческий вариабельный участок, содержащий по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (т. е. в частности, CDR3, и предпочтительно CDR1, и/или CDR2) TCR. TCR с определенными предпочтительными свойствами (показанными в прилагаемых примерах) содержит первую полипептидную цепь, содержащую CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR 1-альфа), или состоящий из нее, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR2-aльфa), или состоящий из нее, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR3-альфа), или состоящий из нее, и вторую полипептидную цепь, содержащую CDR1,
содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDRl-бета), или состоящий из нее, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR2-6eTa), или состоящий из нее, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR3-6eTa), или состоящий из нее.
Полные вариабельные участки
[43] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен TCR, содержащий вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее. Указанные последовательности альфа- и бета-цепи также показаны на фиг. 9 (обычный шрифт).
[44] Варианты последовательности TCR, содержащие вариабельные участки альфа-цепи, содержащие аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 15, и/или вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее, также предусмотрены в данной документе, при условии, что TCR сохраняет предпочтительные способности TCR, оцениваемые в прилагаемых примерах, т. е. способен связываться с антигенной мишенью, определенной в данном документе.
Константный участок
[45] TCR может дополнительно содержать константный (С) участок в своей альфа- и/или бета-цепи. Константный участок может представлять собой
человеческий константный участок или происходить от других видов, образуя "химерный" TCR. Например, человеческие альфа- и/или бета-цепи могут быть замещены своими мышиными аналогами ("муринизация"), что, как было выявлено, усиливает поверхностную экспрессию человеческих TCR путем поддерживающего предпочтительного образования пар альфа- и бета-цепей TCR и более стабильной ассоциации с CD3 корецептором. Подходящие константные участки альфа-цепи, например, могут быть выбраны из SEQ ID NO: 17 (человеческой), 19 (минимально муринизированной) и 21 (мышиной). Подходящие константные участки бета-цепи могут быть выбраны из SEQ ID NO: 18 (человеческой), 20 (минимально муринизированной) и 22 (мышиной). Вместо замены полных человеческих участков их мышиными аналогами, также можно заменять лишь некоторые аминокислоты в человеческих константных участках на соответствующие аминокислоты мышиного константного участка ("минимальная муринизация"), как дополнительно поясняется в разделе "Варианты последовательности TCR" в данном документе.
Альфа- и бета-цепи
[46] Применимые примеры TCR по настоящему изобретению включают такие, которые содержат альфа-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрен, в частности, TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или состоящую из нее, TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или состоящую из нее,
TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, или состоящую из нее (обе также показаны на фиг. 9); и TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, или состоящую из нее.
[47] Варианты последовательности TCR, содержащие альфа-цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или состоящую из нее, и/или бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее, также предусмотрены в данной документе, при условии, что TCR сохраняет предпочтительные способности TCR, оцениваемые в прилагаемых примерах, т. е. способен связываться с антигенной мишенью, определенной в данном документе.
Антигенная мишень
[48] TCR, предусмотренные в данном документе, предпочтительно способны связываться с (человеческим) PRAME. PRAME (антиген меланомы, предпочтительно экспрессируемый в опухолях, номер доступа в Uniprot Р78395), также обозначаемый как МАРЕ (антиген меланомы, предпочтительно экспрессируемый в опухолях) и OIP4 (ОРА-взаимодействующий белок 4), был описан в качестве раково-тестикулярного антигена (СТА) с неизвестной функцией.
[49] В частности, в настоящем изобретении предусмотрены TCR, которые способны (специфично) связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 100-108 аминокислотной последовательности PRAME, представленной в SEQ ID NO: 33 (фиг. 9) жирным шрифтом. Пептид PRAME, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 32, также обозначается в данном документе как PRAMEioo-ios или "антигенная мишень" или "VLD-пептид". Как изложено в других разделах данного документа, TCR по настоящему изобретению будет предпочтительно распознавать PRAMEioo-ios при связывании МНС, в частности HLA-A*02.
[50] Термин "положение" при использовании в соответствии с настоящим
изобретением означает либо положение аминокислоты в аминокислотной
последовательности, описанной в данном документе, либо положение
нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в данном
документе. Термин "соответствующий", используемый в данном документе,
также включает то, что положение не только определяется количеством
предшествующих нуклеотидов/аминокислот, а скорее рассматривается в
контексте прилегающей части последовательности. Соответственно, положение
определенной аминокислоты или нуклеотида в соответствии с настоящим
раскрытием, может варьироваться за счет делеции или добавления аминокислот
или нуклеотидов в других участках в последовательности. Таким образом, когда
положение обозначается как "соответствующее положение" в соответствии с
настоящим раскрытием, следует понимать, что нуклеотиды/аминокислоты могут
отличаться с точки зрения обозначенного номера, но могут все еще иметь
аналогичные соседние нуклеотиды/аминокислоты. Чтобы определить,
соответствует ли аминокислотный остаток (или нуклеотид) в определенной
последовательности определенному положению в аминокислотной
последовательности "родительской" аминокислотной/нуклеотидной
последовательности, специалист в данной области может использовать средства и способы, хорошо известные в данной области, например, выравнивание
последовательности, либо вручную, либо с помощью компьютерных программ, таких как приведенных в качестве примера в данном документе.
[51] Термин "эпитоп" в целом относится к сайту в антигене, как правило, к (поли)пептиду, который распознает связывающий домен. Термин "связывающий домен" в своем наиболее широком смысле относится к "антигенсвязывающему участку", т. е. характеризует домен молекулы, которая связывает специфичный эпитоп/взаимодействует с ним в антигенной мишени. Антигенная мишень может содержать один эпитоп, однако, как правило, содержит по меньшей мере два эпитопа и может включать любое количество эпитопов в зависимости от размера, конформации и типа антигена. Термин "эпитоп" в целом охватывает линейные эпитопы и конформационные эпитопы. Линейные эпитопы представляют собой смежные эпитопы, содержащиеся в аминокислотной первичной последовательности и, как правило, включают по меньшей 2 аминокислоты или больше. Конформационные эпитопы образуются несмежными аминокислотами, соединенными за счет фолдинга целевого антигена, и, в частности, определенного целевого (поли)пептида.
[52] В контексте настоящего изобретения термин "связывающий домен", в частности, относится к вариабельному участку альфа- и/или бета-цепи TCR и, в частности, CDR3-альфа и CDR3-6eTa TCR.
[53] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что минимальная аминокислотная последовательность, распознаваемая TCR по настоящему изобретению, соответствует аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31), при этом X выбрано из любой аминокислоты. В частности, было показано, что TCR по настоящему изобретению (специфично) распознают аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32), или состоящую из нее, показанную в прилагаемых примерах. Таким образом, TCR по настоящему изобретению способны связываться с аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотную
последовательность X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31), или состоящую из нее, предпочтительно содержащую аминокислотную последовательность VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) или ее МНС-связанную форму, или состоящую из нее. Например, предусмотрено, что распознаваемый пептид может содержать дополнительные С-аминокислоты, расположенные на С- и/или N-конце мотива распознавания, представленного в SEQ ID NO: 31, и, в частности, SEQ ID NO: 32. В частности, TCR, описанный в данном документе, предусмотрен для распознавания по меньшей мере одного эпитопа в вышеупомянутых аминокислотных последовательностях. Термины "связывающийся с" и "распознающий" во всех грамматических формах используются в данном документе взаимозаменяемо. Предусмотрено, что антигенная мишень, в частности, подлежит распознаванию TCR по настоящему изобретению при связывании молекулой МНС I класса, в частности, молекулой HLA-A, и предпочтительно молекулой HLA-A*02, в частности, молекулой HLA-A*02:01. Указанная молекула МНС, в частности, молекулы HLA-A и HLA-A*02, может присутствовать на поверхности клетки, например, опухолевой клетки, или на (твердом) носителе.
[54] Предпочтительно TCR по настоящему изобретению специфично связываются со своей антигенной мишенью. Термин "специфическое(специфично) связывание(связывающийся)", как правило, указывает на то, что TCR связывается с помощью своего антигенсвязывающего участка более легко со своей предполагаемой антигенной мишенью, чем со случайным неродственным нецелевым антигеном. В частности, термин "специфически связывается" указывает на то, что специфичность связывания TCR будет по меньшей мере приблизительно в 5 раз, предпочтительно в 10 раз, более предпочтительно в 25 раз, еще более предпочтительно в 50 раз и наиболее предпочтительно в 100 раз больше со своей антигенной мишенью, чем его связывание с нецелевым антигеном.
[55] Эффекторные клетки-хозяева, экспрессирующие нативный TCR, описанный в данном документе, предусмотрены для связывания своей
антигенной мишени (т. е. предпочтительно PRAMEioo-ios, презентированого HLA-A*02 с помощью антигенпрезентирующих клеток) с высокой функциональной авидностью. Термин "функциональная авидность" относится к способности TCR-экспрессирующих клеток (в частности, Т-клеток, экспрессирующих нативные TCR, описанные в данном документе) отвечать in vitro на определенную концентрацию лиганда и, как считается, коррелировать с эффекторной способностью TCR-экспрессирующих клеток in vivo. По определению TCR-экспрессирующие клетки с высокой функциональной авидностью отвечают в исследованиях in vitro на очень низкие дозы антигена, в то время как такие клетки с более низкой функциональной авидностью требуют более высоких количеств антигена перед тем, как они вызывают иммунный ответ, аналогичный такому TCR-экспрессирующих клеток с высокой авидностью. Таким образом, функциональная авидность может рассматриваться в качестве количественной детерминанты порога активации TCR-экспрессирующей клетки. Это определено в результате воздействия на такие клетки in vitro различных количеств когнатного антигена. TCR-экспрессирующие клетки с высокой функциональной авидностью отвечают на низкие дозы антигена. Например, будет считаться, что в типичных случаях TCR-экспрессирующая клетка связывается с "высокой" функциональной авидностью со своей антигенной мишенью, если она секретирует по меньшей мере приблизительно 200 пг/мл или больше (например, 200 пг/мл или больше, 300 пг/мл или больше, 400 пг/мл или больше, 500 пг/мл или больше, 600 пг/мл или больше, 700 пг/мл или больше, 1000 пг/мл или больше, 5000 пг/мл или больше, 7000 пг/мл или больше, 10000 пг/мл или больше или 20000 пг/мл или больше) интерферона гамма (IFN-гамма) при совместном культивировании с антиген-отрицательными НЬА-А*02-экспрессирующими целевыми клетками, нагруженными PRAMEioo-ios пептидом в низкой концентрации, варьирующей в диапазоне от приблизительно 10~5 до приблизительно 10"ПМ (т. е. от приблизительно 0,05 нг/мл до приблизительно 5 нг/мл, 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,5 нг/мл, 1 нг/мл или 5 нг/мл), при этом молекулярная масса PRAMEioo-ios пептида составляет 956 г/моль.
[56] Другие способы определения специфического связывания TCR по настоящему изобретению включают в себя анализа высвобождения 51Сг, описанный Gertner-Darderme et al. J Immunol 188(9): 4701-4708, мобилизацию CD107a/b, описанную Leisegang et al., Clin. Cancer Res 2010. 16. 2333-2343 и анализы связывания пептида:мультимера МНС, описанные Wilde et al., J Immunol 2012; 189:598-605.
Варианты
[57] Как отмечено ранее, термин "TCR" охватывает варианты TCR, которые включают варианты последовательности, фрагменты TCR и TCR-конструкции. Предусмотрено, что все варианты TCR являются функциональными вариантами TCR по настоящему изобретению. Термин "функциональный вариант", используемый в данном документе, относится к TCR, полипептиду или белку, имеющему существенную или значительную идентичность или сходство последовательности с родительским TCR, его вариабельными участками или его антигенсязывающими участками, и сохраняющему его биологическую активность, т. е. его способность специфично связываться с антигенной мишенью, к которому родительский TCR по настоящему изобретению имеет антигенную специфичность, в аналогичной, той же самой или даже большей степени, как и TCR, раскрываемый в данном документе, и оцениваемую в прилагаемых примерах.
Варианты последовательности
[58] Термин "варианты TCR" включает "варианты последовательности" TCR, раскрываемых в данном документе, т. е. варианты, которые фактически содержат аминокислотную последовательность TCR по настоящему изобретению, описанного выше (также обозначаемую как "родительский" TCR), но содержащие по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (т. е. замену, делению или вставку) по сравнению с аминокислотной последовательностью "родительского" TCR, при условии, что вариант предпочтительно сохраняет антигенную специфичность "родительского" TCR
по настоящему изобретению. Варианты последовательности TCR по настоящему изобретению, как правило, получают с помощью осуществления соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновых кислотах, кодирующих "родительский" TCR, или с помощью пептидного синтеза. Как правило, вышеупомянутые аминокислотные модификации могут быть введены в вариабельный участок или константный участок TCR или могут присутствовать в таких, и могут служить для модуляции свойств, например, силы и специфичности связывания, посттрансляцинного процессинга (например, гликозилирования), термодинамической стабильности, растворимости, поверхностной экспрессии или сборки TCR.
[59] Как изложено ранее, аминокислотные модификации включают, например, делеции остатков, и/или вставки в остатки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях родительского TCR. Иллюстративные варианты TCR со вставками по настоящему изобретению включают слитые продукты указанного TCR, а также фермент или другой функциональный полипептид. Иллюстративные TCR с заменами по настоящему изобретению представляют собой такие, которые включают аминокислотные замены в вариабельных участках или CDR альфа- и/или бета-цепи, каркасном участке или константном участке. В частности, в данном документе предусмотрены консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области и включают аминокислотные замены, в которых одна аминокислота, имеющая определенные физические и/или химические свойства, заменена на другую аминокислоту, которая имеет те же самые химические или физические свойства. Например, консервативная аминокислотная замена может быть в аминокислоте, замещенной на другую аминокислоту (например, Asp или Glu), аминокислоте с неполярной боковой цепью, замещенной на другую аминокислоту с неполярной боковой цепью (например, Ala, Gly, Val, Не, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val и пр.), основной аминокислоте, замещенной на другую основную аминокислоту (Lys, Arg и пр.), аминокислоте с полярной боковой цепью, замещенной на другую аминокислоту с полярной боковой цепью (Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Туг и пр.) и др., что может
быть выполнено, например, на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы включенных остатков.
Модификация цистеина
[60] Было описано, что добавление дисульфидной связи в константном участке способствует надлежащему образованию пар альфа- и бета-цепей TCR (Kuball J et al. Blood. 2007 Mar 15; 109(6):2331-8.). Таким образом, добавление одной или более цистеиновых связей в константном участке также предусмотрено в данном документе.
Муринизация
[61] Как отмечено ранее, муринизация TCR (т. е. замена человеческих константных участков в альфа- и бета-цепях их мышиными аналогами) представляет собой методику, которая широко используется в целях повышения экспрессии TCR клеточной поверхностью в клетках-хозяевах. Не ограничиваясь определенной теорией, считается, что муринизированные TCR ассоциируются более эффективно с СБЗ-корецепторами; и/или, что предпочтительно, образуют пары друг с другом и менее подвержены образованию смешанных TCR на человеческих Т-клетках, сконструированных ex vivo, для экспрессии TCR с необходимой антигенной специфичностью, однако все еще сохраняющих и экспрессирующих свои "оригинальные" TCR.
[62] Недавно были идентифицированы девять аминокислот, ответственных за повышенную экспрессию муринизированных TCR (Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31), и предусмотрена замена одного или всех аминокислотных остатков в константном участке альфа- и/или бета-цепи TCR на их мышиные остатки-аналоги. Эта методика также называется как "минимальная муринизация" и обеспечивает преимущество, связанное с усилением экспрессии на клеточной поверхности, при этом одновременно снижается количество "чужеродных" аминокислотных остатков в
аминокислотной последовательности и тем самым риск проявления иммуногенности.
[63] Как правило, предусмотрены варианты последовательности TCR, которые содержат по меньшей мере одно из CDR1, CDR2, CDR3, вариабельных участков альфа-цепи, вариабельных участков бета-цепи, альфа-цепи и/или бета-цепи, раскрываемых в данном документе, или содержащие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична аминокислотным последовательностям, раскрываемым в данном документе, при условии, что указанные варианты характеризуются сопоставимыми, такими же самыми или улучшенными характеристиками связывания по сравнению с TCR, оцениваемыми в прилагаемых примерах.
[64] Используемый в данном документе термин "идентичность последовательности" указывает на степень, в которой две (нуклеотидные или аминокислотные) последовательности имеют идентичные остатки в тех же самых положениях при выравнивании, и часто выражается в виде процента. Предпочтительно идентичность определяют по всей длине последовательностей, подлежащих сравнению. Таким образом, две копии точно такой же последовательности характеризуются 100% идентичностью, но последовательности, которые в меньшей степени высоко консервативны и имеют делеции, добавления или замещения, могут характеризоваться меньшей степенью идентичности. Специалистам в данной области будет понятно, что для определения идентичности последовательностей с использованием стандартных параметров доступны несколько алгоритмов, например, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Смита-Уотермана (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) и ClustalW.
[65] Соответственно, например, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 могут служить в качестве "последовательности для сравнения" или "эталонной последовательности", в то время как аминокислотная последовательность CDR3, отличная от них, может служить в качестве "искомой последовательности".
Конструкции и фрагменты
[66] Термин "TCR", используемый в данном документе, дополнительно подразумевает TCR-конструкции. Термин "конструкция" включает белки или полипептиды, содержащие по меньшей мере один антигенсвязывающий домен TCR по настоящему изобретению, однако они не обязательно имеют общую структуру с нативным TCR (т. е. вариабельными доменами, включенными в альфа-цепь TCR и бета-цепь TCR, образующими гетеродимер). Конструкции и фрагменты TCR получают, как правило,с помощью стандартных способов генной инженерии, и их часто конструируют искусственно для того, чтобы они содержали дополнительные функциональные белковые или полипептидные домены. В соответствии с вышеизложенным предусмотрены конструкции и фрагменты TCR по настоящему изобретению, содержащие по меньшей мере один CDR3-альфа и/или по меньшей мере один CDR3-6eTa, описанные в других разделах данного документа. В данном документе предусмотрены дополнительные конструкции и фрагменты, содержащие по меньшей мере один CDRl-альфа, CDR2-aльфa, CDRl-бета, CDR2-6eTa, вариабельный участок альфа-цепи, вариабельный участок бета-цепи, альфа-цепь и/или бета-цепь или их комбинации, необязательно в сочетании с дополнительными белковыми доменами или фрагментами, приведенными в качестве примеров в данном документе. Предусмотрено, что конструкции и фрагменты TCR, предусмотренные в данном документе, способны специфично связываться с той же самой антигенной мишенью, что и TCR по настоящему изобретению, описанные выше и оцениваемые в прилагаемых примерах.
Мультимеры
[67] Термин "TCR-конструкция" охватывает гетеродимеры и мультимеры, в которых по меньшей мере один варибельный участок альфа-цепи TCR или альфа-цепь TCR и по меньшей мере один вариабельный участок бета-цепи TCR ковалентно связаны друг с другом. В наиболее простой форме мультивалентная конструкция TCR в соответствии с настоящим изобретением содержит мультимер из двух, или трех, или четырех или больше TCR, ассоциированных (например, ковалентно или иным образом связанных) друг с другом, предпочтительно с помощью линкерной молекулы.
[68] Подходящие линкерные молекулы включают без ограничения мультивалентные соединяющие молекулы, такие как авидин, стрептавидин, нейтравидин и экстравидин, каждая из которых имеет четыре связывающих сайта для биотина. Таким образом, биотинилированные TCR могут быть превращены в мультимеры, имеющие множество TCR-связывающих участков. Количество TCR в мультимере будет зависеть от количества TCR по отношению к количеству линкерных молекул, используемых для получения мультимеров, и также от присутствия или отсутствия любых других биотинилированных молекул. Иллюстративные мультимеры представляют собой димерные, тримерные, тетрамерные или пентамерные TCR-конструкции или такие конструкции более высокого порядка. Мультимеры по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные функциональные фрагменты, такие как метки, или лекарственные средства, или (твердые) носители.
[69] Термин "конструкция на основе TCR" также охватывает молекулы TCR, которые связаны с помощью подходящего линкера со сферическим объектом, предпочтительно однородной гранулой, более предпочтительно полистирольной гранулой, наиболее предпочтительно биосовместимой полистирольной гранулой. Такие конструкции на основе TCR также могут содержать TCR по настоящему изобретению и гранулу, имеющую предварительно определенный флуоресцентный краситель, включенный в гранулу.
Слитые белки
[70] Термин "TCR-конструкция" также относится к слитым белка или полипептидам, содержащим по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, вариабельный участок альфа-цепи TCR или CDR3-альфа и/или по меньшей мере одну бета-цепь TCR, вариабельный участок бета-цепи TCR или CDR3-6eTa; и дополнительно один или более слитых компонентов. Применимые компоненты включают Fc-рецепторы; Fc-домены (происходящие из IgA, IgD, IgG, IgE и IgM); цитокины (такие как IL-2 или IL-15); токсины; антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (такие как антитела к CD3, антитела к CD28, антитела к CD5, антитела к CD 16 или антитела к CD56 или их антигенсвязывающие фрагменты); CD247 (СОЗ-дзета), CD28-, CD137-, CD 134-домены; или любые их комбинации.
[71] Иллюстративные фрагменты антител, которые можно использовать в качестве слитых компонентов, включают фрагменты или полноразмерные антитела, такие как (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 или "r IgG" ("полуантитело"); модифицированные фрагменты антител, такие как scFv, di-scFv или bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-молния, scFab, Fab2, Fab3, диатела, одноцепочечные диатела, тандемные диатела (Tandab), тандемные di-scFv, тандемные tri-scFv, минитела, мультитела, такие как триатела или тетратела, и однодоменные антитела, такие как нанотела или антитела с одним вариабельным доменом, содержащие только один вариабельный домен, который может представлять собой VHH, VH или VL.
[72] TCR-конструкции по настоящему изобретению могут быть слиты с одним
или более антителами или фрагментами антитела, что приводит к образованию
моновалентных, бивалентных и поливалентных/мультивалентных конструкций и
таким образом моноспецифических конструкций, специфично связывающихся
только с одним целевым антигеном, а также биспецифических и
полиспецифиических/мультиспецифических конструкций, которые
специфически связываются более чем с одним целевым антигеном, например, двумя, тремя или больше, с помощью различающихся антигенсвязывающих участков.
[73] Необязательно линкер может быть введен между одним или более из доменов или участков TCR-конструкции по настоящему изобретению, т. е. между CDR3 альфа-цепи TCR, вариабельным участком альфа-цепи TCR и/или альфа-цепью TCR, CDR3 бета-цепи TCR, вариабельным участком бета-цепи TCR и/или бета-цепью TCR, и/или одним или более слитыми компонентами, описанными в данном документе. Линкеры известны в данной области и были описаны в обзоре, в частности, в Chen et al. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369. Как правило, линкеры включают подвижные, расщепляемые и жесткие линкеры и могут быть выбраны в зависимости от типа конструкции и предполагаемого использования/применения. Например, для терапевтического применения неимуногенные подвижные линкеры часто являются предпочтительными с тем, чтобы обеспечить определенную степень гибкости или взаимодействия между доменами, при этом снижается риск побочных иммуногенных реакций. Такие линкеры, как правило, состоят из небольших неполярных (например, Gly) или полярных (например, Ser или Thr) аминокислот и включают в себя "GS"-линкеры, состоящие из участков Gly- и Ser-остатков. В примере наиболее широко используемого гибкого линкера, который, как предусмотрено, также используется для применения в TCR-конструкции по настоящему изобретению, имеется последовательность (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 225). Другие подходящие линкеры включают в себя, например, KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 226) и EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 227) и GS AGS A AGS GEF (SEQ ID NO: 228).
[74] Особенно применимыми TCR-конструкциями, предусмотренными в соответствии с настоящим изобретением, являются такие, которые содержат по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, вариабельный участок альфа-цепи TCR или CDR3-альфа, определенные в данном документе, по меньшей мере одну бета-цепь TCR, вариабельный участок бета-цепи TCR или CDR3-6eTa, определенные в данном документе, необязательно связанные друг с другом или слитые необязательно с помощью линкера по меньшей мере с одним антителом или фрагментом антитела (таким как, фрагмент одноцепочечного антитела (scFv)), направленными против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов.
Применимые антигенные мишени, распознаваемые антителом или фрагментом антитела (например, scFv), включают CD3, CD28, CD5, CD 16 и CD56. Указанная конструкция в целом может иметь любую структуру в тех условиях, когда "участок TCR" (т. е. альфа- и бета-цепь TCR или их CDR3) сохраняет свою способность распознавать антигенную мишень, определенную в данном документе, а "участок антитела" связывается с необходимым поверхностным антигеном или эпитопом, за счет чего осуществляется рекрутинг соответствующего лимфоцита и его нацеливание на клетку-мишень. Такие конструкции могут предпочтительно выступать в качестве "адаптеров", соединяющих вместе антигенпрезентирующую клетку, демонстрирующую антигенную мишень (такую как опухолевая клетка), и лимфоцит (такой как цитотоксическая Т-клетка или NK-клетка). Примером такого слитого белка является конструкция, разработанная в соответствии с принципом привлекающего Т-клетки биспецифического активатора (BiTE(r)), состоящего из двух одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) различных антител, на одной пептидной цепи, размером приблизительно 55 килодальтон (кД). Соответственно, TCR-конструкция по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один антигенсвязывающий домен TCR, описанный в данном документе (к примеру, вариабельный домен альфа-цепи и вариабельный домен бета-цепи TCR, слитые друг с другом), связанный с scFv (или другим связывающим доменом) с необходимой специфичностью связывания, например, CD3 или CD56. scFv (или другой связывающий домен) связывается с Т-клетками, например, посредством CD3-рецептора, или с CD56 в случае NK-клеточной активации, а другой с опухолевой клеткой с помощью антигенной мишени, специфично экспрессируемой на опухолевой клетке. Также в данном документе предусмотрены триатела, содержащие по меньшей мере один антигенсвязывающий домен TCR, описанный в данном документе, scFv (или другой связывающий домен) и дополнительный домен, например, для целенаправленного воздействия конструкции на сайт воздействия в организме (например, Fc-домен).
Выделенная форма
[75] TCR по настоящему изобретению могут быть предусмотрены в "выделенной" или "фактически чистой" форме. Термины "выделенный" или "фактически чистый" при использовании в данном документе означает, что TCR были идентифицированы отделенными от и/или извлеченными из компонента своей среды процуцирования, так что "выделенный" TCR не содержит или фактически не содержит других контаминирующих компонентов из своей среды продуцирования, которые могут нарушить его терапевтическое или диагностическое применение. Контаминирующие компоненты могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Таким образом, "выделенные" TCR будут получены с помощью по меньшей мере одной стадии очистки, удаляющей или фактически удаляющей эти контаминирующие компоненты. Вышеупомянутое определение в равной степени применимо к "выделенным" полинуклеотидам/нуклеиновым кислотам с соответствующими поправками.
Растворимые формы
[76] TCR по настоящему изобретению могут быть предусмотрены в растворимой форме. Растворимые TCR применимы в качестве диагностических средств и носителей или "адаптеров", которые специфически нацеливают терапевтические средства или эффекторные клетки, например, на раковую клетку, экспрессирующую антигенную мишень, распознаваемую растворимым TCR. Растворимые TCR (sTCR), как правило, будут представлять собой фрагменты или конструкции, содержащие альфа- и/или бета-цепи TCR или их вариабельные участки или CDR, и необязательно стабилизированы с помощью дисульфидных связей или ковалентно связаны с помощью линкерной молекулы, например, описанной выше в контексте TCR-конструкций по настоящему изобретению. Например, в типичном случае они не будут содержать трансмембранный участок. При некоторых обстоятельствах аминокислотные модификации в полипептидной последовательности могут быть введены с целью усиления растворимости молекул, и/или коррекции фолдинга и образования пар альфа- и бета-цепей (при необходимости), в частности, при продуцировании в
рекомбинантном хозяине, который не обеспечивает вышеупомянутые характеристики. Например, при использовании Е. coli в качестве клеток-хозяев для продуцирования, фолдинг и образование пар альфа- и бета-цепей TCR, как правило, осуществляется in vitro. Таким образом, TCR в соответствии с настоящим изобретением могут содержать, например, дополнительные цистеиновые остатки, описанные в других разделах в данном документе.
[77] Помимо дополнительных цистеиновых мостиков, другие применимые модификации включают, например, добавление лейциновых змеек и/или последовательностей ухода с рибосомы, например, последовательности 2А из пикорнавируса, описанной в Walseng et al. (2015), PLoS ONE 10(4): eOl 19559, в целях повышения фолдинга, экспрессии и/или спаривания альфа- и/или бета-цепей TCR.
Модификации
[78] TCR по настоящему изобретению могут дополнительно содержать одну или более модификаций, описанных ниже. Модификации, описанные ниже, как правило, будут представлять собой ковалентные модификации и могут быть выполнены с помощью стандартных методик, известных в данной области. При некоторых обстоятельствах аминокислотные модификации в TCR могут потребоваться с целью облегчения введения указанных модификаций.
Метки
[79] TCR, в частности (растворимые) TCR по настоящему изобретению могут быть мечеными. Применимые метки известны в данной области и могут быть связаны с TCR или вариантом TCR с помощью стандартных способов, необязательно с помощью линкеров различной длины. Термин "метка" или "группа для мечения" относится к любой детектируемой метке. Как правило, метки разделяются на несколько классов, в зависимости от анализа, в котором они подлежат выявлению; следующие примеры включают без ограничения изотопные метки, которые могут представлять собой радиоактивные или
тяжелые изотопы, такие как радиоизотопы или радионуклиды (например, Н,
14^ 15хт 35с 89гу 90Лг 99гт, 111т 125т 131ТЛ /
С, N, S, Zr, Y, 1с, In, 1, 1); магнитные метки (например, магнитные частицы); редокс-активные фрагменты; оптические красители (в том числе без ограничения хромофоры, фосфоры и флуорофоры), такие как флуоресцентные группы (например, FITC, родамин, соединения лантаноидов с фосфором), хемилюминесцентные группы и флуорофоры, которые могут представлять собой как "низкомолекулярные" флуорофоры, так и белковые флуорофоры; ферментативные группы (например, пероксидазу хрена, Р-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу; биотинилированные группы; или предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парными последовательностями с лейциновыми застежками, связывающими сайтами для вторичных антител, металл-связывающими доменами, эпитопными метками и т. д.). В частности, мечение предусмотрено в том случае, когда TCR, варианты TCR или особенно растворимые TCR-конструкции (такие как конструкции, содержащие по меньшей мере одну альфа-цепь TCR и/или бета-цепь TCR, описанные в данном документе), предназначены для диагностического применения.
Функциональные фрагменты
[80] TCR, в частности, растворимые TCR по настоящему изобретению, могут быть модифицированы с помощью присоединения дополнительных функциональных фрагментов, например, для снижения иммуногенности, повышения гидродинамического размера (размера в растворе), растворимости и/или стабильности (например, в результате повышенной защиты к протеолитическому разрушению) и/или увеличения периода полужизни в сыворотке.
[81] Иллюстративные функциональные фрагменты для применения в соответствии с настоящим изобретением включают пептидные или белковые домены, связывающиеся с другими белками в организме человека (такими как сывороточный альбумин, Fc-участок иммуноглобулина или неонатальный Fc
рецептор (FcRn), полипептидные цепи различной длины (например, технология XTEN или ПАСилирование(r)), небелковые полимеры, в том числе без ограничения различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль (ПЕГилирование), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, или углеводов, таких как гидроксиэтиловый крахмал (например, ГЭСилирование(r)), или полисиаловая кислота (например, технология РоГуХеп(r)).
Другие применимые функциональные фрагменты включают "суицидальные" или "предохранительные выключатели", которые могут быть использованы для отключения эффекторных клеток-хозяев, несущих TCR по настоящему изобретению в организме пациента. Примером является "предохранительный выключатель" индуцибельной каспазы 9 (iCasp9), описанный Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235. Вкратце эффекторные клетки-хозяева модифицируют с помощью хорошо известных способов с целью экспрессии домена каспазы 9, димеризация которого зависит от низкомолекулярного димеризующего препарата, такого как AP1903/CIP, и приводит к быстрой индукции апоптоза в модифицированных эффекторных клетках. Такая система, например, описана в ЕР2173869 (А2). Примеры других "суицидальных" и "предохранительных выключателей" известны в данной области, например, тиамидинкиназа простого вируса герпеса (HSV-TK), экспрессия CD20 и последующее истощение с помощью антитела к CD20 или myc-метки (Kieback et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jan 15;105(2):623-8).
Гликозилирование
[82] В данном документе также предусмотрены TCR с измененным паттерном гликозилирования. Как известно в данной области, паттерны гликозилирования могут зависеть от аминокислотной последовательности (например, присутствия или отсутствия определенных аминокислотных остатков, рассматриваемых ниже) и/или клетки-хозяина или организма, в котором белок продуцируется. Гликозилирование полипептидов, как правило, является либо N-связанным, либо
О-связанным. N-связанное относится к связыванию углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Добавление N-связанных сайтов гликозилирования к связывающей молекуле легко осуществляется путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более трипептидных последовательностей, выбранных из аспарагин-Х-серина и аспарагин-Х-треонина (где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина). Сайты О-связанного гликозилирования могут быть введены путем добавления или замены одного или более треониновых остатков в исходной последовательности.
[83] Другим средством гликозилирования TCR является химическое или ферментативное связывание гликозидов к белку. В зависимости от используемого способа связывания, сахар(сахара) может(могут) быть присоединен(присоединены) к (а) аргинину и гистидину, (Ь) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (d) свободным гидроксильным группам, таким как, группы серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина.
[84] Аналогично дегликозилирование (т. е. удаление углеводных фрагментов, присутствующих на связывающей молекуле) можно осуществлять химически, например, в результате воздействия на TCR трифторметансульфоновой кислоты, или ферментативно в результате использования эндо- или экзогликозидаз.
Лекарственные конъюгаты
[85] К TCR, в частности, к растворимым TCR по настоящему изобретению, также можно добавить лекарственное средство, такое как низкомолекулярное соединение. Связывание можно осуществить с помощью ковалентных связей или нековалентных взаимодействий, например, с помощью электростатических сил. Различные линкеры, известные в данной области, могут быть использованы в целях образования лекарственных конъюгатов.
Метки
[86] TCR, в частности, растворимые TCR по настоящему изобретению, могут быть модифицированы с введением дополнительных доменов, которые способствуют идентификации, трекингу, очистке и/или выделению соответствующей молекулы (меток). Неограничивающие примеры таких меток включают пептидные мотивы известные как Мус-метка, НАТ-метка, НА-метка, ТАР-метка, GST-метка, хитин-связывающий домен (CBD-tag), мальтоза-связывающий домен (MBP-tag), Flag-метка, Strep-метка и их варианты (например, Strep П-метка), His-метка, CD20, Her2/neu метки, myc-метка, FLAG-метка, Т7-метка, НА(геммаглютинин)-метка или GFP-метка.
[87] Эпитопные метки являются применимыми примерами меток, которые могут быть включены в TCR по настоящему изобретению. Эпитопные метки представляют собой короткие последовательности аминокислот, которые способствуют связыванию специфического антитела и тем самым обеспечивают идентификацию и трекинг связывания и движения растворимых TCR или клеток-хозяев в организме пациента или культивируемых клетках (хозяевах). Выявление эпитопной метки и, следовательно, меченого TCR может быть достигнуто с помощью ряда различных методик. Примеры таких методик включают иммуногистохимический анализ, иммунопреципитацию, проточную цитометрию, иммунофлуоресцентную микроскопию, ELISA, иммуноблоттинг ("вестерн") и аффинную хроматографию. Эпитопные метки, например, могут иметь длину от 6 до 15 аминокислот, в частности от 9 до 11 аминокислот. Также можно включать более одной эпитопной метки в TCR по настоящему изобретению.
[88] Метки могут быть дополнительно использованы для стимуляции и экспансии клеток-хозяев, несущих TCR по настоящему изобретению, с помощью культивирования клеток в присутствии связывающих молекул (антител), специфических для указанной метки. Нуклеиновая кислота
[89] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, описанные в данном документе. В частности, в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие альфа- или бета-цепи TCR, вариабельные участки альфа- или бета-цепей TCR и CDR3-альфа и CDR3-6eTa TCR, а также варианты, конструкции и фрагменты TCR по настоящему изобретению.
[90] Термин "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в данном документе, включает последовательность полирибонуклеотидов и полидезоксирибонуклеотидов, например, модифицированные или немодифицированные РНК или ДНК, каждую в однонитевой и/или двунитевой форме, линейную или кольцевую, или их смеси, в том числе гибридные молекулы. Таким образом, нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением содержат ДНК (такую как днРНК, онДНК, кДНК), РНК (такую как днРНК, онРНК, мРНК, /v/РНК), их комбинации и их производные (такие как ПНК).
[91] Полинуклеотид может содержать стандартную фосфодиэфирную связь или нестандартную связь (например, амидную связь, такую как встречается в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут также содержать одно или более модифицированных оснований, таких как, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Другие модификации, в том числе химические, ферментативные или метаболические модификации, также допустимы в том случае, если только связывающая молекула по настоящему изобретению может быть экспрессирована из полинуклеотида. Полинуклеотид может быть обеспечен в выделенной форме, описанной в других разделах данного документа. Полинуклеотид может включать регуляторные последовательности, такие как элементы контроля транскрипции (в том числе промоторы, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции), участок связывания рибосомы, интроны и т. п.
[92] В частности, в настоящем изобретении предусмотрен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая на по меньшей мере приблизительно 80%, на приблизительно 85%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98%, на приблизительно 99% или на 100% идентична эталонной полинуклеотидной последовательности, или состоящий из нее, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.
[93] Полинуклеотиды, описанные выше, могут содержать или могут не содержать дополнительные или измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие, например, измененные аминокислотные остатки, сигнальный пептид для управления секрецией кодируемого TCR, константных участков или других гетерологичных полипептидов, описанных в данном документе. Таким образом, такие полинуклеотиды могут кодировать слитые полипептиды, фрагменты, варианты и другие производные связывающих молекул, описанных в данном документе.
[94] Кроме того, настоящее изобретение включает композиции, содержащие один или более из полинуклеотидов, описанных выше. В данном документе также предусмотрены композиции, содержащие первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, где указанный первый полинуклеотид кодирует вариабельный участок альфа-цепи TCR, описанный в данном документе, и где второй полинуклеотид кодирует вариабельный участок бета-цепи TCR, описанный в данном документе.
[95] Последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть кодон-оптимизированными для оптимальной экспрессии в требуемой клетке-хозяине, например, лимфоците человека; или для экспрессии в клетках бактерий, дрожжей или насекомых, которые особенно предпочтительны для экспрессии растворимых TCR по настоящему изобретению. Ко дон-оптимизация относится к замене в представляющей интерес последовательности
кодонов, которые, как правило, редко встречаются в высокоэкспрессируемых генах определенного вида, на кодоны, которые, как правило, часто встречаются в высокоэкспрессируемых генах таких видов, при этом такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и кодоны, которые заменяются. Таким образом, выбор оптимальных кодонов зависит от использования кодонов генома хозяина и присутствия нескольких желательных и нежелательных мотивов последовательности.
Вектор
[96] В данном документе дополнительно предусмотрен вектор, содержащий один или более из полинуклеотидов, описанных в данном документе. "Вектор" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, используемую для переноса (чужеродного) генетического материала в клетку-хозяина, где он может, например, быть реплицирован и/или экспрессирован.
[97] Термин "вектор" охватывает без ограничения плазмиды, вирусные векторы (в том числе ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса полиомиелита и аденовирус-ассоциированные векторы (AAV)), фаги, фагмиды, космиды и искусственные хромосомы (в том числе ВАС и YAC). Собственно вектор, как правило, представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно последовательность ДНК, которая содержит вставку (трансген) и более длинную последовательность, которая выступает в качестве "остова" вектора. Сконструированные векторы, как правило, содержат точку начала репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах (если требуется стабильная экспрессия полинуклеотида), селективные маркеры и сайты для расщепления рестриктазами (например, сайт множественного клонирования, MCS). Вектор может дополнительно содержать промоторы, генетические маркеры, репортерные гены, нацеливающие последовательности и/или метки для очистки белка. Как известно специалистам в данной области, большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной
области и многие являются коммерчески доступными. Примеры подходящих векторов предусмотрены в J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012) и включают в себя следующие.
Направленные векторы
[98] Направленные векторы можно использовать для интеграции полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина с помощью способов, известных в данной области, таких как описаны J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012). Вкратце, подходящие средства включают в себя гомологическую рекомбинацию или использование гибридной рекомбиназы, которая специфически целенаправленно воздействует на последовательности в участках интеграции. Направленные векторы, как правило, являются кольцевыми или линеаризованными перед использованием для гомологической рекомбинации. В качестве альтернативы чужеродные полинуклеотиды могут представлять собой фрагменты ДНК, соединенные с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, или синтетически сконструированные фрагменты ДНК, которые затем рекомбинируют в клетку-хозяина. Также можно использовать гетерологическую рекомбинацию, которая приводит к случайной или нецелевой интеграции.
[99] В настоящем изобретении также предусмотрен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе.
Векторы экспрессии
[100] Вектор по настоящему изобретению может также представлять собой вектор экспрессии. "Векторы экспрессии" или "конструкции для экспрессии" можно применять для транскрипции гетерологичных нуклеотидных последовательностей, например, таких последовательностей, которые кодируют TCR по настоящему изобретению, и трансляции своей мРНК в подходящей
клетке-хозяине. Этот процесс также называется как "экспрессия" TCR по настоящему изобретению.
[101] Помимо точки начала репликации, селективных маркеров и участков расщепления рестриктазами, векторы экспрессии, как правило, включают в себя одну или более регуляторных последовательностей, функционально связанных с гетерологичным полинуклеотидом, подлежащим экспрессии.
[102] Термин "регуляторная последовательность" относится к
последовательности нуклеиновой кислоты, необходимой для экспрессии
функционально связанной кодирующей последовательности (гетерологичного)
полинуклеотида в определенных организме-хозяине или клетке-хозяине, и таким
образом включает регуляторные последовательности транскрипции и
трансляции. Как правило, регуляторные последовательности, требующиеся для
экспрессии гетерологичных полинуклеотидных последовательностей в
прокариотах, включают в себя промотор(промоторы), необязательно
последовательность(последовательности) оператора(операторов) и
участок(участки) связывания рибосом. У эукариот, как правило, требуются промоторы, сигналы полиаденилирования, энхансеры и необязательно сигналы сплайсинга. Кроме того, специфические сигналы инициации и секреторные сигналы могут быть введены в вектор для обеспечения секреции полипептида, представляющего интерес, в среду для культивирования.
[103] Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", если она размещена в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, в частности на одной и той же полинуклеотидной молекуле. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, если он способен воздействовать на экспрессию этой кодирующей последовательности. Промотор, как правило, расположен выше гена, кодирующего полинуклеотид, представляющий интерес, и регулирует экспрессию указанного гена.
[104] Иллюстративные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса обезьян 40 (S V40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и вируса полиомиелита. Как изложено ранее, векторы экспресии также могут включать точки начала репликации и селективные маркеры.
[105] Как упомянуто ранее, векторы по настоящему изобретению могут
дополнительно содержать один или более селективных маркеров. Подходящие
селективные маркеры для применения с эукариотическими клетками-хозяевами
включают без ограничения гены тимидинкиназы (tk) простого вируса герпеса,
гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (hgprt) и
аденинфосфорибозилтрансферазы (aprt). Другие гены включают в себя dhfr (ген устойчивости к метотрексату), gpt (ген устойчивости к микофеноловой кислоте), пео (ген устойчивости к G-418) и hygro (ген устойчивости к гидромицину). Для повышения уровней экспрессии можно использовать амплификацию вектора. Как правило, ген селективного маркера можно быть либо непосредственно связан с полинуклеотидными последовательностями, подлежащими экспрессии, либо введен в ту же клетку-хозяину в результате совместной трансформации.
[106] В связи с вышеизложенным, в настоящем изобретении также дополнительно предусмотрены одна или более нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, вставленных в вектор (т. е. содержащихся в векторе). В частности, в настоящем изобретении предусмотрены (реплицируемые) векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую TCR по настоящему изобретению, или его альфа- или бета-цепь, или вариабельный домен альфа- или бета-цепи, или CDR3-альфа или CDR3-6eTa, функционально связанные с промотором.
[107] Специалист в данной области сможет легко выбрать подходящий вектор экспрессии на основе, например, клетки-хозяина, предусмотренной для экспрессии TCR. Примеры подходящих векторов экспрессии представляют собой вирусные векторы, такие как ретровирусные векторы, например, векторы на основе МР71 или SIN-векторы на основе ретровирусов; и лентивирусные векторы или SIN-векторы на основе лентивирусов. Вирусные векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие TCR по настоящему изобретению, например, способны инфицировать лимфоциты, которые, как предусмотрено, затем экспрессируют гетерологичный TCR. Другим примером подходящего вектора экспрессии является плазмидная система ДНК транспозазы транспозона Sleeping Beauty (SB), плазмида ДНК SB. Нуклеиновые кислоты и/или, в частности, конструкции экспрессии по настоящему изобретению также могут быть перенесены в клетки в результате транзиентной трансфекции РНК.
[108] В настоящее время вирусные векторы для нативной экспрессии TCR в типичном случае связывают гены альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR в одном векторе либо с помощью последовательности внутреннего участка связывания рибосомы (IRES), либо последовательности 2А-пептида, происходящего из тесковируса свиней, приводя к экспрессии в одной молекуле матричной РНК (мРНК) под контролем промотора вируса в трансдуцированной клетке.
Клетка-хозяин
[109] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена клетка-хозяин, содержащая TCR, нуклеиновую кислоту или вектор, описанный в данном документе.
[110] Множество клеток-хозяев может быть использовано в соответствии с настоящим изобретением. Используемый в данном документе термин "клетка-хозяин" охватывает клетки, которые могут представлять собой реципиентов полинуклеотидов или векторов, описанных в данном документе, или были такими, и/или экспрессируют (и необязательно секретируют) TCR по настоящему изобретению. Термины "клетка" и "клеточная культура"
используются взаимозаменяемо для определения источника TCR, если четко не указано иное. Термин "клетка-хозяин" также включает "линии клеток-хозяевов".
[111] Как правило, термин "клетка-хозяин" включает прокариотические или эукариотические клетки, а также включает без ограничения бактериальные клетки, клетки дрожжей, растительные клетки и клетки животных, такие как клетки насекомых и клетки млекопитающих, например, клетки мыши, крысы, макаки или человека.
[112] В связи с вышеизложенным, таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены, в частности, клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор, например, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую TCR или TCR-конструкцию, описанную в данном документе.
[113] Полинуклеотиды и/или векторы по настоящему изобретению можно вводить в клетки-хозяева с помощью стандартных способов, известных в данной области, например, трансфекции, трансформации и т. п.
[114] "Трансфекция" представляет собой процесс намеренного введения молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (в том числе векторов) в целевые клетки. Пример представляет собой трансфекцию РНК, т. е. процесс введения РНК (такой как транскрибированной in vitro РНК, ivtPHK) в клетку-хозяина. Термин главным образом используется для невирусных способов в эукариотических клетках. Термин "трансдукция" часто используется для описания опосредованного вирусом переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов. Трансфекция клеток животных, как правило, включает открытие транзиентных пор или "отверстий" в клеточной мембране для обеспечения захвата материала. Трансфекцию можно проводить с использованием фосфата кальция, путем электропорации, путем сжатия клетки или с использованием катионного липида с материалом для получения липосом, которые сливаются с клеточной мембраной и депонируют свой груз внутри.
Иллюстративные методики переноса в эукариотические клетки-хозяева включают опосредованный липидными пузырьками захват, опосредованный тепловым шоком захват, опосредованная фосфатом кальция трансфекция (фосфат кальция/копреципитация ДНК), микроинъекцию и электропорацию.
[115] Термин "трансформация" используется для описания невирусного переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (в том числе векторов) в бактерии, а также в эукариотические клетки помимо животных, в том числе растительные клетки. Таким образом, трансформация представляет собой генетическое изменение бактериальной или эукариотической клетки, происходящей не от животного, полученное в результате прямого переноса через клеточную(клеточные) мембрану(мембраны) из ее окружения и последующего включения экзогенного генетического материала (молекул нуклеиновой кислоты). На трансформацию можно воздействовать различными искусственными средствами. Чтобы трансформация произошла, клетки или бактерии должны пребывать в состоянии компетентности, которое может происходить в виде ограниченного во времени ответа на условия окружающей среды, такие как голодание или плотность клеток. В случае прокариотической трансформации методики могут включать опосредованный тепловым шоком захват, слияние бактериального протопласта с интактными клетками, микроинъекцию и электропорацию. Методики в случае растительной трансформации включают опосредованный Agrobacterium перенос, например, A. tumefaciens, быстро двигающиеся микрочастицы вольфрама или золота, электропорацию, микроинъекцию и опосредованный полиэтиленгликолем захват.
[116] Таким образом, ввиду вышеизложенного в настоящем изобретении дополнительно предусмотрены клетки-хозяева, содержащие по меньшей мере полинуклеотидную последовательность и/или вектор, описываемые в данном документе.
[117] В случае экспрессии TCR по настоящему изобретению клетку-хозяина можно выбрать таким образом, что она модулирует экспрессию встроенных полинуклеотидных последовательностей, и/или модифицирует и осуществляет процессинг генного продукта (т. е. РНК и/или белка), если это необходимо. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) генных продуктов могут быть важными для функции TCR. Различные клетки-хозяева имеют характеристики и определенные механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы-хозяева могут быть выбраны с целью обеспечения надлежащих модификации и процессинга продукта. В связи с этим можно применять эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащих процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта.
[118] В данном документе предусмотрено обеспечение (а) клеток-хозяев для экспрессии и получения TCR по настоящему изобретению, в частности в растворимой форме ("клетки-хозяева для продуцирования") и (Ь) клеток-хозяев, экспрессирующих TCR по настоящему изобретению и имеющих эффекторную функцию ("эффекторные клетки-хозяева"). Такие "эффекторные клетки-хозяева" являются особенно пригодными для применений в терапии и предусмотрены для введения нуждающемуся в этом субъекту. Предпочтительные "эффекторные клетки-хозяева" включают лимфоциты, такие как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клетки.
"Клетка-хозяин для продуцирования"
Клетки
[119] "Клетки-хозяева для продуцирования", используемые для экспрессии растворимых TCR по настоящему изобретению, предпочтительно способны экспрессировать высокие количества рекомбинантного белка.
[120] Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих, которые могут быть использованы в качестве "клеток-хозяев для продуцирования" включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО), в том числе дефектные по DHFR клетки СНО, такие как клетки DG44 и DUXB1 1, NSO, COS (производное СVI с Т-антигеном SV40), НЕК293 (почка человека) и SP2 (миелома мыши). Другие иллюстративные линии клеток-хозяев включают без ограничения HELA (карцинома шейки матки человека), CVI (линия клеток почки обезьян), VERY, ВНК (почка новорожденного хомячка), MDCK, 293, WI38, R1610 (фибробласт китайского хомячка), BALBC/3T3 (фибробласт мыши), НАК (линия клеток почки хомячка), P3x63-Ag3.653 (миелома мыши), BFA-IcIBPT (эндотелиальные клетки крупного рогатого скота) и RAJI (лимфоциты человека). Линии клеток-хозяев, как правило, доступны из коммерческих служб, Американской коллекции тканевых культур (АТСС) или из опубликованной литературы.
[121] Клетки, отличные от клеток млекопитающих, такие как клетки бактерий, дрожжей, насекомых или растений также легко доступны и могут быть использованы в качестве "клеток-хозяев для продуцирования", описанных в данном документе. Иллюстративные бактериальные клетки-хозяева включают Enterobacteriaceae, такие как Escherichia coli, Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenza. Другие клетки-хозяева включают клетки дрожжевых грибов, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Клетки насекомых включают без ограничения клетки Spodoptera frugiperda.
[122] В соответствии с вышеизложенным приемлемые системы экспрессии (т. е. клетки-хозяева, содержащие вышеописанный вектор экспрессии) включают микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, векторами экспрессии на основе плазмидной ДНК плазмиды или космидной ДНК; дрожжевые клетки (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжевых клеток; системы на основе клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами
экспрессии (например, бакуловируса); системы на основе растительных клеток, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Ti-плазмиды). Часто предпочтительными являются системы экспрессии млекопитающих, несущие рекомбинантные конструкции для экспрессии, содержащие промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; 7.5К-промотор вируса осповакцины, главный промотор немедленно раннего ответа (CMV) цитомегаловируса (MIEP)). Подходящие клетки-хозяева млекопитающих могут быть выбраны из известных клеточных линий (например, клеток COS, СНО, BLK, 293, ЗТЗ), однако также приемлемо использовать лимфоциты, такие как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клеток.
[123] В соответствии с вышеизложенными в настоящем изобретении также предусмотрен способ продуцирования и получения TCR, описанного в данном документе, предусматривающий стадии (i) инкубации клетки-хозяина (т. е. клетки-хозяина для продуцирования) в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR, и (и) очистки указанного TCR.
Культивирование
[124] Клетки-хозяева, несущие вектор экспрессии, выращивают в условиях, подходящих для продуцирования TCR, предусмотренных в данном документе, в частности, альфа-цепей и/или бета-цепей, описанных в других разделах данного документа, и проводят анализ на предмет синтеза белков альфа- и/или бета-цепи. В случае экспрессии двуцепочечных TCR векторы, кодирующие как альфа-, так и бета-цепи, могут быть совместно экспрессированы в клетке-хозяине для экспрессии целой молекулы.
Очистка
[125] После экспрессии TCR по настоящему изобретению он может быть очищен с помощью любого способа очистки, известного в данной области, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной хроматографии (например, хроматографии с гидроксиапатитом), аффинной хроматографии, в частности, аффинной хроматографии на основе связывания с белком А, белком G или лектином, эксклюзионной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости, хроматографии с гидрофобным взаимодействием или с помощью любой другой стандартной методики для очистки белков. Специалисты в данной области смогут легко выбрать подходящий способ очистки на основе индивидуальных характеристик TCR, подлежащего извлечению.
"Эффекторная клетка-хозяин"
[126] Как упоминалось ранее, в настоящем изобретении также предусмотрены "эффекторные клетки-хозяева", содержащие нуклеотидную последовательность, вектор или TCR по настоящему изобретению. Указанные эффекторные клетки-хозяева модифицируют с помощью стандартных способов для того, чтобы они содержали последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR по настоящему изобретению, и они предусмотрены для экспрессии TCR, описанного в данном документе, в частности на поверхности клеток. Для целей настоящего изобретения термин "модифицированные клетки-хозяева, экспрессирующие TCR по настоящему изобретению", как правило, относится к клеткам-хозяева (эффекторным или для продуцирования), обработанным или измененным с целью экспрессии TCR в соответствии с настоящим изобретением, например, с помощью РНК-трансфекции, описанной в прилагаемых примерах. Также предусмотрены другие способы модификации, или трансфекции, или трансдукции, такие как описанные в других разделах данного документа. Таким образом, термин "модифицированная клетка-хозяин" включает "трансфицированные", "трансдуцированные" и "генетически
сконструированные" клетки-хозяева, предпочтительно экспрессирующие TCR по настоящему изобретению.
[127] Предпочтительно такие "(модифицированные) эффекторные клетки-хозяева" (в частности, "(модифицированные) эффекторные лимфоциты") способны опосредовать эффекторные функции за счет внутриклеточной передачи сигнала при связывании TCR со своей специфической антигенной мишенью. Такие эффекторные функции включают, например, высвобождение перфорина (которые создает отверстия в мембране клетки-мишени), гранзимов (которые представляют собой протеазы, действующие внутри клетки с активацией апоптоза), экспрессию Fas-лиганда (который активирует апоптоз в Fas-несущей клетке-мишени) и высвобождение цитокинов, предпочтительно цитокинов Thl/Tcl, таких как IFN-y, IL-2 и TNF-a. Таким образом, эффекторная клетка-хозяин, сконструированная для экспрессии TCR по настоящему изобретению, которая способна распознавать и связываться со своей антигенной мишенью у субъекта, подлежащего лечению, предусмотрена для осуществления вышеупомянутых эффекторных функций, за счет чего уничтожаются клетки-мишени (например, раковые). Цитолиз целевых клеток можно оценить, например, с помощью флуоресцентного киллинг-анализа CTL (CTL, США), выявляющего исчезновение флуоресцентно меченых целевых клеток в ходе совместного культивирования с TCR-трансфицированными реципиентными Т-клетками.
[128] В связи с вышеизложенным эффекторные клетки-хозяева предпочтительно экспрессируют функциональный TCR, т. е. который, как правило, содержит альфа- и бета-цепь TCR, описанные в данном документе; а также субъединицы для трансдуцирования сигнала CD3-гамма, дельта, эпсилон и зета (CD3-комплекс). Кроме того, также может потребоваться экспрессия корецепторов CD4 или CD8. Как правило, лимфоциты, несущие требуемые гены, вовлеченные в связывание антигена, активацию рецептора и нисходящую передачу сигнала (например, Lck, FYN, CD45 и/или Zap70) Т-клетки, являются особенно подходящими в качестве эффекторных клеток-хозяев. Однако в
данном документе также предусмотрены эффекторные клетки-хозяева, экспрессирующие TCR по настоящему изобретению в качестве "связывающего домена" без субъединицы трансдуцирования сигнала CD3 и/или вышеупомянутых нисходящих сигнальных молекул (т. е. способных распознавать антигенную мишень, описанную в данном документе, но, не влияя на функции, опосредуемые CD3 и/или вышеупомянутыми нисходящими сигнальными молекулами). Такие эффекторные клетки предусмотрены для возможности распознавания антигенной мишени, описанной в данном документе, и необязательного воздействия на другие функции, не ассоциированные с передачей сигнала с помощью CD3 и/или передачей сигнала вышеупомянутыми нисходящими сигнальными молекулами. Примеры включают NK- или NKT-клетки, экспрессирующие TCR по настоящему изобретению, способные, например, высвобождать цитотоксические гранулы при распознавании своей антигенной мишени.
[129] Таким образом, цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клетки считаются применимыми лимфоцитарными эффекторными клетками-хозяевами. Такие лимфоциты, экспрессирующие рекомбинантный TCR по настоящему изобретению, также обозначены в данном документе как "модифицированные эффекторные лимфоциты". Однако специалист в данной области легко признает, что, как правило, любой компонент пути сигнального пути TCR, приводящий к необходимой эффекторной функции, может быть введен в подходящую клетку-хозяина с помощью способов рекомбинантной генной инженерии, известных в данной области.
[130] Эффекторные клетки-хозяева, в частности лимфоциты, такие как Т-клетки, могут быть аутологичными клетками-хозяевами, которые получены от подлежащего лечению субъекта, и трансформированы или трансдуцированы для экспрессии TCR по настоящему изобретению. Как правило, рекомбинантная экспрессия TCR будет осуществляться с помощью вирусного вектора,
описанного в прилагаемых примерах. Методики получения и выделения клеток от пациента, хорошо известны в данной области.
[131] Как упоминалось ранее, эффекторные клетки-хозяева, предусмотренные в данном документе, особенно предпочтительны для применений в терапии. Дополнительные генетические модификации клетки-хозяина могут быть необходимыми для повышения терапевтической эффективности. Например, при использовании аутологичных CD8+ Т-клеток в качестве "эффекторных клеток-хозяев" подходящие дополнительные модификации включат снижение эндогенной экспрессии TCR, CTLA-4 и/или PD-1; и/или амплификации костимулирующих молекул, таких как CD28, CD 134, CD 137. В данной области были описаны средства и способы достижения вышеупомянутых генетических модификаций.
Способы целевого геномного конструирования клеток-хозяев известны в данной области и включат в себя, помимо нокдауна гена с помощью миРНК, применение так называемых "программируемых нуклеаз", таких как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатором транскрипции (TALEN), и направляемые РНК сконструированные нуклеазы (RGEN), происходящие из систем бактериальных коротких палиндромных повторов, регулярно расположенными группами (CRISPR)-Cas (CRISPR-ассоциированных), как, в частности, описано в Kim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321-334 (2014). Например, программируемые нуклеазы, такие как TALEN, могут быть использованы для разрезания участков ДНК, которые кодируют "нежелательные" белки, такие как PD-1, CTLA-4 или эндогенный TCR, за счет чего снижается их экспрессия. Если Т-клетки используются в качестве (эффекторных) клеток-хозяев, снижение экспрессии эндогенного TCR имеет преимущество, проявляющееся в снижении нежелательного "ошибочного спаривания" эндогенных и экзогенных альфа-/бета-цепей TCR.
Фармацевтическая композиция/диагностика
[132] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена фармацевтическая композиция в виде одного или нескольких активных средств, TCR, нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина, описанных в данном документе, и необязательно одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Соответственно, применение указанных TCR, нуклеиновой кислоты, вектора и клетки-хозяина для изготовления фармацевтической композиции или лекарственного препарата также предусмотрено в данном документе.
[133] Термин "фармацевтическая композиция", в частности,относится к композиции, подходящей для введения человеку. Однако композиции, подходящие для введения животным, отличным от человека, как правило, также охвачены данным термином.
[134] Фармацевтическая композиция и ее компоненты (т. е. активные средства и необязательно вспомогательные вещества) являются предпочтительно фармацевтически приемлемыми, т. е. способными вызывать необходимый терапевтический эффект, не вызывая нежелательные местные или системные эффекты у реципиента. Фармацевтически приемлемые композиции по настоящему изобретению, например, могут быть стерильными. В частности, термин "фармацевтически приемлемый" может обозначать одобренный регуляторным органом или другой общепризнанной фармакопеей для применения у животных и более конкретно у человека.
[135] Активное средство, описанное в вышеизложенном (например, клетка-хозяин или TCR), предпочтительно присутствует в фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве. Под "терапевтически эффективным количеством" понимается количество активного средства, которое вызывает необходимый терапевтический эффект. Терапевтическая эффективность и токсичность могут быть определены с помощью стандартных процедур, например, в клеточной культуре или у исследуемых животных,
например, ED50 (доза, терапевтически эффективная у 50% популяции) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции). Соотношение дозы терапевтических и токсических эффектов представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено в виде соотношения ED5o/LD5o. Фармацевтические композиции, которые характеризуются высокими терапевтическими индексами, являются предпочтительными.
Дозировка
[136] Точная дозировка полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина для TCR будет установлено специалистом в данной области с помощью известных методик. В подходящих дозировках предусмотрены достаточные количества активного средства по настоящему изобретению и они предпочтительно являются терапевтически эффективными, т. е. вызывают необходимый терапевтический эффект.
[137] Как известно в данной области, может потребоваться корректировка с
целью лечения (например, для поддержания ремиссии или лечения острого
приступа заболевания), пути, времени и частоты введения, времени и частоты
введения состава, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, питания,
тяжести патологического состояния, лекарственной(лекарственных)
комбинации(комбинаций), реакций чувствительности и
переносимости/устойчивости к терапии. Подходящие диапазоны дозировок, например, в случае растворимых TCR, могут быть определены с помощью данных, полученных на основе анализа клеточных культур и исследований на животных и могут включать ED50. Как правило, дозы могут варьироваться от 0,1 до 100000 микрограмм, до общей дозы, составляющей приблизительно 2 г, в зависимости от способа введения. Иллюстративные дозировки активного средства по настоящему изобретению находятся в диапазоне от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно
0,01 мг/кг до приблизительно 1 мг/кг или от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 1 мг/кг. Руководство касательно конкретных дозировок и способов доставки приведено в литературе. Следует признать, что для лечения может потребоваться одно введение терапевтически эффективной дозы или несколько введений терапевтически эффективной дозы активного средства по настоящему изобретению. Например, некоторые фармацевтические композиции можно вводить каждые 3-4 дня, каждую неделю или один раз в две недели, или один раз в месяц в зависимости от состава, периода полужизни и скорости выведения определенной композиции.
[138] Как изложено ранее, фармацевтическая композиция может необязательно содержать одно или несколько вспомогательных веществ и/или одно или несколько дополнительных активных средств.
Вспомогательные вещества
[139] Термин "вспомогательное вещество" включает наполнители, связывающие вещества, разрыхлители, покрывающие вещества, сорбенты, вещества, препятствующие склеиванию, скользящие вещества, консерванты, антиоксиданты, ароматизаторы, красители, подсластители, растворители, сорастворители, буферные средства, хелатирующие средства, средства, придающие вязкость, поверхностно-активные вещества, разбавители, смачивающие средства, носители, консерванты, эмульгаторы, стабилизиторы и регуляторы тоничности. Выбор подходящих вспомогательных веществ для получения необходимой фармацевтической композиции по настоящему изобретению находится в пределах компетенции специалиста в данной области. Иллюстративные носители для применения в фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают солевой раствор, буферный солевой раствор, декстрозу и воду. Как правило, выбор подходящих вспомогательных веществ, в частности, зависит от используемого активного средства, заболевания, подлежащего лечению, и необходимого состава лекарственного композиции.
Дополнительные активные средства
[140] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько активных средств по настоящему изобретению, описанные выше (например, клетку-хозяина или TCR-конструкцию), и одно или несколько дополнительных активных средств, которые подходят для лечения и/или профилактики заболевания, подлежащего лечению. Предпочтительные примеры активных ингредиентов, подходящих для комбинаций, включают противоопухолевые препараты, такие как цисплатин, производные майтансина, рахелмицин, калихеамецин, доцетаксел, этопозид, гемцитабин, ифосфамид, иринотекан, мельфалан, митоксантрон, сорфимер натрия фотофрин II, темозоломид, топотекан, триметреат глюкуронат, ауристатин Е, винкристин и доксорубицин; и пептидные цитотоксины, такие как рицин, дифтерийный токсин, бактериальный экзотоксин синегнойной палочки А, ДНКазу и РНКазу; радионуклиды, такие как йод 131, рений 186, индий 111, иттрий 90, висмут 210 и 213, актиний 225 и астат 213; пролекарства, такие как антитело-направленные ферментативные пролекарства; иммуностимуляторы, такие как IL-2, хемокины, такие как IL-8, тромбоцитарный фактор 4, белок, стимулирующий рост меланомы, и т. д., антитела или их фрагменты, такие как антитела к CD3 или их фрагменты, активаторы комплемента, домены ксеногенных белков, домены аллогенных белков, вирусные/бактериальные белковые домены и вирусные/бактериальные пептиды.
Введение
[141] Множество путей применимы для введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, введение будет выполняться парентерально. Способы парентеральной доставки включают местное, интраартериальное, внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное, интраперитонеальное, внутриматочное, интравагинальное, подъязычное или интраназальное введение.
Получение препарата
[142] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены в различных формах в зависимости, в частности, от используемого активного средства (например, растворимого TCR), например, в твердой, жидкой, газообразной или лиофилизированной форме, и могут быть представлены, в частности, в форме мази, крема, трансдермальных пластырей, геля, порошка, таблетки, раствора, аэрозоля, гранул, пилюль, суспензий, эмульсий, капсул, сиропов, жидкостей, эликсиров, экстрактов, настойки или жидких экстрактов или в форме, которая является особенно подходящей для необходимого способа введения. Сами способы, известные для получения лекарственных препаратов, представлены в 22-м издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012) и могут включать, например, способы стандартного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофизизация. Фармацевтические композиции, содержащие, например, клетки-хозяева или растворимый TCR, описанные в данном документе, как правило, будут представлены в жидкой форме, и предпочтительно содержать фармацевтически приемлемый буфер.
[143] После получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению они могут быть помещены в соответствующий контейнер и маркированы этикеткой, как предназначенные для лечения указанного состояния. Такая этикетка, будет включать, например, указание количества, частоты и способа введения.
Лечение
[144] Таким образом, в свете вышеизложенного в настоящем изобретении предусмотрены TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяина, описанные в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.
[145] TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин, как правило, могут быть использованы для выявления, диагностики, прогнозирования, предупреждения и/или лечения заболеваний или нарушений. Термин "лечение" во всех своих грамматических формах включает терапевтическое или профилактическое лечение нуждающегося в этом субъекта. Термин "терапевтическое или профилактическое лечение" подразумевает профилактическое лечение, направленное на полное предупреждение клинических и/или патологических проявлений, или терапевтическое лечение, направленное на нормализацию или ремиссию клинических и/или патологических проявлений. Таким образом, термин "лечение" также включает нормализацию или предупреждение заболеваний.
[146] Термины "субъект", или "индивидуум", или "животное", или "пациент" используются взаимозаменяемо в данном документе для обозначения любого субъекта, особенно субъекта-млекопитающего, которому необходима терапия. Субъекты-млекопитающие, как правило, включают человека, приматов, отличных от человека, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупный рогатый скот, коров и т. п. Однако легко будет понять, что TCR, нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и фармацевтические композиции, представленные в данном документе, особенно предусмотрены для лечения субъектов-людей, в частности таких, которые являются HLA-A2-положительными.
Прямое введение
[147] В случае терапии с использованием TCR, в частности растворимыми TCR по настоящему изобретению, нуклеиновые кислоты, векторы (такие как вирусные векторы) или клетки-хозяева по настоящему изобретению можно вводить непосредственно нуждающемуся в этом субъекту. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены TCR, нуклеиновая кислота, вектор или клетки-хозяева для применения в способе выявления, диагностики, прогнозирования, предупреждения и/или лечения субъекта. Такой способ может
предусматривать стадии (а) обеспечения одного или более из (i) TCR, (ii) нуклеиновой кислоты, (Hi) вектора, (iv) клетки-хозяина и/или (v) фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и (Ь) введения одного или более из (i) - (v) нуждающемуся в этом субъекту. Необязательно способ предусматривает дополнительную стадию терапии рака, например, лучевую терапию или введение одного или более противоопухолевых средств.
Лечение ex vivo
[148] Лечение в соответствии с настоящим изобретением может также предусматривать стадии (а) обеспечения образца субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты; (Ь) обеспечения одного или более TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению; (с) введения одного или более (i) - (v) из стадии (Ь) в лимфоциты из стадии (а), за счет чего получают модифицированные лимфоциты, (d) введения модифицированных лимфоцитов из стадии (с) нуждающимся в этом субъекту или пациенту.
[149] Лимфоциты, полученные на стадии (а), в частности, предусмотрены в качестве "эффекторных клеток-хозяев", описанных в вышеизложенных разделах, и предпочтительно выбраны из Т-клеток, NK-клеток и/или NKT-клеток, особенно CD8+ Т-клеток; и могут быть получены на предыдущей стадии (а') из образца, в частности образца крови, субъекта с помощью стандартных способов, известных в данной области. Однако также приемлемо применение лимфоцитов, которые предпочтительно способны экспрессировать TCR по настоящему изобретению и проявлять необходимые биологические эффекторные функции, описанные в данном документе. Кроме того, указанные лимфоциты, как правило, будут выбраны для совместимости с иммунной системой субъекта, т. е. они не будут предпочтительно вызывать иммуногенный ответ. Например, приемлемо использовать "универсальные реципиентные клетки", т. е. универсально совместимые лимфоциты, проявляющие необходимые биологические эффекторные функции, которые могут быть
выращены и размножены in vitro. Таким образом, применение таких клеток будет устранять необходимость в получении и предоставлении собственных клеток субъекта на стадии (а).
[150] Введение ex vivo на стадии (с) может быть проведено путем введения нуклеиновой кислоты или вектора, описанных в данном документе, с помощью электропорации в лимфоциты, или путем инфицирования лимфоцитов вирусным вектором, таким как лентивирусный или ретровирусный вектор, описанные ранее в контексте эффекторной клетки-хозяина. Другие приемлемые способы включают применение реагентов для трансфекции, таких как липосомы, или транзиентной РНК-трансфекции. Перенос генов антигенспецифических TCR в (первичные) Т-клетки с помощью (ретро)вирусных векторов или транзиентной трансфекции РНК представляет собой перспективное средство для генерации опухоль-ассоциированных антигенспецфических Т-клеток, которые затем могут быть повторно введены в донора, где они специфически нацеливаются на опухолевые клетки, экспрессирующие указанный антиген, и разрушают их. В настоящем изобретении указанный опухолеассоциированынй антиген представляет собой PRAMEioo-ios, в частности в своей HLA-A*02 связанной форме.
[151] В связи с вышеизложенным в дополнительном аспекте настоящего изобретения предусмотрено применение TCR, последовательности нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина, описанных в других разделах данного документа, для получения модифицированных лимфоцитов. Средства и способы введения, например, нуклеиновой кислоты и вектора в лимфоциты, были описаны в других разделах данного документа.
Диагностическая композиция
[152] В настоящем изобретении предусмотрена диагностическая композиция, содержащая одно или более диагностических средств, TCR, нуклеиновую кислоту, вектор и/или клетку-хозяина, описанные в данном документе. Как правило, указанное диагностическое средство будет предусматривать средства
для выявления своего связывания со своей антигенной мишенью, например меткой, описанной в контексте TCR-конструкций по настоящему изобретению. Что касается клетки-хозяина, например, считается приемлемым использование модифицированных клеток-хозяев, содержащих краситель или контрастное средство, которое высвобождается (вместо цитотоксических гранул) при распознавании антигена.
Применение
[153] В настоящем изобретении предусмотрено применение диагностических средств, описанных в выше, для выявления, диагностики и/или прогнозирования рака у субъекта, которое может быть осуществлено in vivo или in vitro.
[154] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена диагностическая композиция для применения в выявлении, диагностике и/или прогнозировании рака у субъекта in vivo, при этом указанная композиция содержит в качестве диагностического средства TCR, нуклеиновую кислоту, вектор и/или клетку-хозяина по настоящему изобретению. Способ, как правило, предусматривает (а) введение указанного диагностического средства субъекту и (Ь) выявление связывания указанного диагностического средства с его антигенной мишенью.
[155] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ выявления, диагностики и/или прогнозирования рака у субъекта in vitro. В соответствии с настоящим изобретением также предусмотрен способ выявления наличия рака у субъекта, предусматривающий стадии (а) обеспечения образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток; (Ь) приведения указанного образца в контакт с TCR, нуклеиновой кислотой, вектором и/или клеткой-хозяином по настоящему изобретению, за счет чего образуется комплекс, и (с) выявления комплекса. Предусмотрено, что указанный комплекс является показателем связывания диагностического средства с его антигенной мишенью и наличия (раковой) клетки, экспрессирующей указанную антигенную мишень.
[156] В обоих способах связывания диагностического средства со своей антигенной мишенью может быть определен с помощью стандартных способов, известных в данной области, и будет, в частности, зависеть от конкретного используемого диагностического средства. Подходящие метки, которые могут быть связаны с диагностическим средством по настоящему изобретению, приведены в качестве примера в разделе, относящемуся к меченым TCR-конструкциям. Применение для получения модифицированных лимфоцитов
[157] Следует отметить, что используемые в данном документе формы единственного числа включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, упоминание "реагента" включает один или более таких различных реагентов, и упоминание "способа" включает упоминание эквивалентных стадий и способов, известных специалистам в данной области, которые могут быть модифицированы или заменены способами, описанными в данном документе.
[158] Если не указано иное, выражение "по меньшей мере", предшествующее ряду элементов, следует понимать как относящееся к каждому элементу в данном ряду. Специалистам в данной области будут понятны многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, или с помощью проведения только лишь обычных экспериментов они будут способны определить такие эквиваленты. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.
[159] Выражение "и/или", где бы оно не использовалось, включает значение "и", "или" и "все или любая комбинация из элементов, связанных указанным термином".
[160] Выражение "приблизительно" или "примерно", используемое в данном документе, означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% от конкретного значения или диапазона. Однако он также включает конкретное число, например, "приблизительно 20" включает 20.
[161] Выражение "менее" или "более" включает конкретное число. Например, менее 20 означает менее чем 20 или равно 20. Аналогично более чем или выше чем означает более чем или равно или выше чем или равно соответственно.
[162] По всему настоящему описанию и в нижеследующей формуле изобретения, если контекст не подразумевает иное, слово "содержать" и варианты, такие как "содержит" и "содержащий", будут подразумевать включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, а не исключение какого-либо другого целого числа или стадии или группы целых чисел или шагов. При использовании в данном документе термин "содержащий" можно заменить термином "включающий" или "включающий в себя" или иногда при использовании в данном документе термином "имеющий".
[163] При использовании в данном документе "состоящий из" исключает любые элемент, стадию или ингредиент, не указанные в элементе пункта формулы изобретения. При использовании в данном документе "состоящий фактически из" не исключает материалы или стадии, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики пункта формулы изобретения.
[164] В каждом случае в данном документе любые из выражений "содержащий", "состоящий фактически из" и "состоящий из" можно заменить любым из других двух выражений.
[165] Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничено определенной методологией, протоколами, материалом, реагентами и веществами и т. д., описанными в данном документе, и таким образом может варьироваться. Терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь для описательных целей конкретных вариантов осуществления, но не предполагает ограничение объема настоящего изобретения, который определен исключительно формулой изобретения.
[166] Все публикации и патенты, цитируемые в тексте данного описания (в том числе все патенты, заявки на патент, научные публикации, технические
паспорта, инструкции и т. д.), будь то выше или ниже, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Ничего в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права преподносить такое изобретение в силу предшествующего изобретения. В той степени, в которой материал, включенный посредством ссылки, противоречит настоящему описанию или несовместим с ним, настоящее описание будет превалировать над любым таким материалом.
[167] Лучшее понимание настоящего изобретения и его преимуществ будет получено, исходя из следующего примера, представленного только с иллюстративными целями. Данный пример никоим образом не предусматривает ограничение объема настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также характеризуется следующими пунктами. 1. Т-клеточный рецептор (TCR), содержащий:
(i) CDR3 вариабельного участка альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 1, или состоящий из нее,
и/или
(ii) CDR3 вариабельного участка бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность С AS S THRGQTN YG YTF (SEQ ID NO: 2)
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:2, или состоящий из нее.
2. TCR по п. 1, где указанный TCR способен связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID N0:31) или ее МНС-связанной форме, предпочтительно эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID N0:32) или ее МНС-связанной форме.
3. TCR по любому из п. 1 или п. 2, содержащий:
(i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 15, или состоящий из нее, и/или
(и) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 16, или состоящий из нее.
4. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий: (i) константный участок альфа-цепи TCR и/или
(и) константный участок бета-цепи TCR.
5. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:
(i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из
SEQ ID N0: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13,
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0: 7, 11,9 или 13, или состоящую из нее, и/или
(и) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID N0: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14,
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.
6. TCR по любому из предыдущих пунктов, при этом указанный TCR выбран из нативного TCR, варианта TCR, фрагмента TCR или TCR-конструкции.
7. TCR-конструкция по п. 6, содержащая по меньшей мере одну альфа-цепь(-4enn)TCR и по меньшей мере одну 6eTa-4enb(-4enn)TCR, ковалентно связанные друг с другом с образованием гетеродимеров или мультимеров TCR.
8. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий один или более слитых компонентов, необязательно выбранных из Fc-рецепторов; Fc-доменов, в том числе IgA, IgD, IgG, IgE и IgM; цитокинов, в том числе IL-2 или IL-15; токсинов; антител или их антигенсвязывающих фрагментов, в том числе антител к CD3, к CD28, к CD5, к CD 16 или к CD56 или их антигенсвязывающих фрагментов; CD247- (СОЗ-дзета), CD28-, CD137-,
CD 13 4-домена или их комбинаций, необязательно дополнительно содержащих по меньшей мере один линкер.
9. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:
(i) по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, определенную в любом из пп. 1-4, и
(и) по меньшей мере одну бета-цепь TCR, определенную в любом из пп. 1-4,
(ш) антитело или фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов,
где альфа-цепь(-цепи) TCR и бета-цепь(-цепи) TCR связаны друг с другом и слиты с указанным антителом или scFv необязательно посредством линкера.
10. TCR по n. 9, где указанный антиген выбран из CD3, CD28, CD5, CD 16 или CD56.
11. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий по меньшей мере одну метку.
12. TCR по любому из предыдущих пунктов, который является растворимым.
13. Нуклеиновая кислота, кодирующая TCR по любому из предыдущих пунктов.
14. Нуклеиновая кислота по п. 13, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.
15. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из п. 13 или п. 14.
16. Клетка-хозяин, содержащая TCR по любому из пп. 1-12, последовательность нуклеиновой кислоты по п. 12 или п. 13 или вектор по п. 14.
17. Клетка-хозяин по п. 16, которая выбрана из лимфоцитов, в том числе без ограничения цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, естественных киллерных (NK) клеток, естественных киллерных (NKT) Т-клеток, гамма/дельта-Т-клеток.
18. Способ получения TCR по любому из пп. 1-12, предусматривающий:
(i) инкубацию клетки-хозяина по п. 17 в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR,
(и) очистку указанного TCR.
19. Фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая одно или более из:
(i) TCR по любому из пп. 1-12,
(и) нуклеиновой кислоты по любому из пп. 13-14;
(iii) вектора по п. 15 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 16 или п. 17,
и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества).
20. TCR по любому из пп. 1-12, нуклеиновая кислота по любому из п. 13 или п. 14, вектор по п. 15 и/или клетка-хозяин по п. 16 или п. 17 для применения в качестве лекарственного препарата.
21. TCR по любому из пп. 1-12, нуклеиновая кислота по любому из п. 13 или п. 14, вектор по п. 15 и/или клетка-хозяин по п. 16 или п. 17 для применения в выявлении, диагностике, прогнозировании, предупреждении и/или лечении рака.
22. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п. 21, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:
(a) обеспечение одного или более из (i) TCR по любому из пп. 1-12,
(и) нуклеиновой кислоты по любому из п. 13 или п. 14,
(iii) вектора по п. 15 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 16 или п. 17,
(v) фармацевтической композиции по п. 19, и
(b) введение по меньшей мере одного из (i) - (v) нуждающемуся в этом субъекту.
23. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п. 21, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:
(а) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты,
(b) обеспечение одного или более из (i) TCR по любому из пп. 1-12,
(и) нуклеиновой кислоты по любому из п. 13 или п. 14,
(iii) вектора по п. 15 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 16 или п. 17,
(v) фармацевтической композиции по п. 19,
(c) применение одного или более из (i) - (v) из стадии (Ь) по отношению к лимфоцитам из стадии (а), за счет чего обеспечивается получение модифицированных лимфоцитов,
(d) введение модифицированных лимфоцитов из стадии (с) нуждающимся в этом субъекту или пациенту.
24. Способ выявления наличия рака у субъекта in vitro, предусматривающий:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток,
(b) приведение указанного образца в контакт с (i) TCR по любому из пп. 1-12,
(и) нуклеиновой кислотой по любому из п. 13 или п. 14,
(iii) вектором по п. 15 и/или
(iv) клеткой-хозяином по любому из п. 16 или п. 17,
(v) фармацевтической композицией по п. 19,
за счет чего образуется комплекс, и
(c) выявление комплекса,
(c)
где выявление комплекса свидетельствует о наличии рака у субъекта.
25. Применение TCR по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по любому из п. 13 или п. 14 и/или вектора по п. 15 для получения модифицированных лимфоцитов.
Примеры
Аббревиатуры и синонимы
(m)DC
(зрелая) дендритная клетка
/v/RNA
In vitro транскрибируемая РНК
АРС
(Х)р08или(Х)+
антигенпрезентирующая клетка
экспрессирующий X
VLD- или VLD-пептид PRAME
100-108
Соотношение Е:Т
Пептид SLL или SLL
Пептид ALY или ALY
Пептид ELA или ELA
[М]
РВМС
Соотношение эффекторных клеток и целевых клеток
Пептид, нерелевантный, SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229).
Пептид, нерелевантный, ALYVDSLFFL (SEQ ID NO: 230).
Пептид, нерелевантный, ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 231).
Концентрация молярная [моль/л]
Мононуклеарная клетка периферической крови, т. е. ядросодержащие клетки в периферической крови; представляют собой PBL (лимфоциты периферической крови), такие как Т-клетки.
Пример 1. Выделение PRAME-специфического клона Т-клеток
[168] Авторы настоящего изобретения использовали подход примирования in vitro для выделения клонов Т-клеток с любым требуемым ограничением по МНС и специфичностью к антигену. В системе примирования используются зрелые дендритные клетки (mDC) в качестве антигенпрезентирующих клеток и аутологические СБ8+-обогащенные Т-клетки в качестве клеток-респондеров. In vitro транскрибированная РНК (/v/PHK), кодирующая полноразмерную аминокислотную последовательность PRAME человека в качестве эталонной в SEQ ID NO: 33, служит в качестве источника специфического антигена. После электропорации в mDC /v/РНК транслируется в полноразмерный белок, который затем процессируется и презентируется в виде пептидов молекулами МНС mDC. Совместное культивирование in vitro Т-клеток с /v/PHK-трансфицированными mDC от одного и того же донора приводит к индукции de novo антигенспецифических Т-клеток, которые служат в качестве источника соответствующих TCR. Антигенспецифические Т-клетки могут быть обогащены с помощью ряда способов и клонированы путем предельного разведения или выращивания отдельных клеток на основе FACS.
Пример 1.1. Подход примирования с использованием зрелых дендритных клеток
[169] Примирование Т-клеток с помощью DC высокоаффинным TCR осуществляли с использование пептидной презентации аутологичными молекулами МНС в соответствии со следующими протоколом (фиг. 1):
• примирование HLA-A*02:01/PRAME,
• через 8 дней получали mDC с использованием подходящих смесей для DC,
• загрузка АРС: /v/РНК,
• обогащение с помощью мультимера HLA-A*02:01 PRAMEioo-ios,
• сортировка одиночных клеток с использованием технологии FACS.
Пример 2. Анализ функций/специфичности
[170] После идентификации кандидатного клона Т-клеток (клон Т-клеток Т4.8-1-29), который распознает необходимый эпитоп PRAME (PRAMEioo-ios), выполняли полное определение характеристик относительно функции и специфичности. Анализы включали определение паттерна секреции цитокинов выделенного клона Т-клеток (клона Т-клеток Т4.8-1-29) при совместном культивировании с разными линиями опухолевых клеток человека, способности клона специфически распознавать разные клетки-мишени, функциональной авидности клона и цитотоксичности в отношении Т2 и опухолевых клеток.
Пример 2.1. Анализ исходного клона Т-клеток Т4.8-1-29
Пример 2.1.1. Анализ полицитокинов
Схема эксперимента: стимуляция нагруженными пептидом Т2-клетками
[171] Высвобождение цитокинов измеряли в соответствии со следующим протоколом:
• анализ цитокинов Multiplex(r) выполняли с выявлением IFN-гамма, IL-2, TNF-альфа, IL-5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4 и IL-1-бета,
стимулирующие клетки: Т2-клетки (НЬА-А*02ПОЛОЖ), нагруженные насыщающими количествами (10° М) PRAME100 .108 пептида ("VLD-пептида") или нерелевантного PRAME300-309, т- е- пептида ALYVDSLFFL ("ALY-пептида", SEQ ID NO: 230).
• Супернатанты Т-клеточных совместных культур с Т2-клетками, нагруженными релевантным и нерелевантным пептидом, собирали через 24 часа и затем измеряли с помощью анализа цитокинов Multiplex(r).
Результаты
• Кандидатный клон секретировал IFN-гамма, IL-2 и TNF-альфа (цитокины Thl/Tcl) выше фоновых уровней. Паттерн экспрессии цитокинов отражает
фенотип Thl, который связан с высокой противоопухолевой эффекторной функцией (фиг. 2).
• Секрецию IL-5 и IL-13 (цитокины Th2/Tc2) не определяли (н. о.). Пример 2.2. Распознание опухолевых клеток
Схема эксперимента: стимуляция линиями опухолевых клеток
• ELISA IFN-гамма использовали для оценки секреции цитокинов после стимуляции группой линий опухолевых клеток человека (статус экспрессии PRAME выявляли с помощью анализа NanoString nCounter(r)).
• Супернатанты собирали через 24 часа после совместного культивирования клона Т-клеток Т4.8-1-29 с К562-А2, Mel-624.38, Colo-678, 647-V и SuDHL-6 (все НЕА-А*02ПОЛОЖ). Специфическую секрецию IFN-гамма оценивали с помощью стандартного ELISA.
• Клетки-мишени:
о К562-А2 (HLA-A*02noJIO5K, PRAME1(tm)), о Mel-624.38 (HLA-A*02noJIO5K, PRAME1(tm)), о Colo-678 (HLA-A*02noJIO5K, РР\АМЕотриц), о 647-V (HLA-A*02noJIO5K, РР\АМЕотриц), о SuDHL-6 (HLA-A*02noJIO5K, РР\АМЕотриц).
Результаты
• Клон Т-клеток Т4.8-1-29 характеризовался высокой секрецией IFN-гамма при совместном культивировании с PRAMEn0JI05K, линиями HLA-A*02noJIO5K опухолевых клеток К562-А2 и Mel-624.38 (положительный контроль: активированные пептидами Т2-клетки).
• Линии РР\АМЕотриц, НЕА-А*02ПОЛОЖ опухолевых клеток не распознавались клоном Т-клеток Т4.8 (отрицательные контроли; н. о., не определено).
• Только линии опухолевых клеток, экспрессирующие HLA-A*02 и PRAME, распознавались самоограниченным клоном Т-клеток Т4.8-1-29, свидетельствуя о специфичности к антигену (фиг. 3).
Пример 2.3. Функциональная авидность
Схема эксперимента: стимуляция активированных пептидом Т2-клеток
• Функциональную авидность Т-клеток в отношении распознавания PRAMEioo-ios (VLD)-nemrma измеряли путем выявления секреции IFN-гамма после совместного культивирования клона Т4.8-1-29 с нагруженными пептидом Т2-клетками.
• Клетки-мишени: Т2-клетки (НЬА-А*02ПОЛОЖ, РР\АМЕотриц), нагруженные титруемыми количествами экзогенного PRAMEioo-ios (VLD)-nemrma (от 10~5 М до 10"12 М).
• Соотношение эффектор-мишень (Е:Т) составляет 1:1.
• Относительное высвобождение IFN-гамма выражено в процентах от максимального высвобождения. Полумаксимальная секреция IFN-гамма, определяющая функциональную авидность, указана штрих-пунктирными линиями.
• Супернатанты культур собирали через ~24 часа после совместного культивирования и оценивали с помощью стандартного ELISA.
Результаты
• Клон Т4.8-1-29 характеризовался полумаксимальной секрецией IFN-гамма при концентрации от приблизительно 1х10"9 до 1х10"10 моль/л [М] PRAMEioo-ios пептида (среднее значение из двух независимых экспериментов), что лежит в пределах физиологического диапазона для вирус-специфических Т-клеток и, как сообщается, представляет собой необходимую функциональную авидность для высокой противоопухолевой эффективности (Aleksic, М et al. Eur. J. Immunol.;42 (12):3174-3179).
• -> TCR T4.8-1-29: ~ lxlO"9 моль/л [M] (фиг. 4).
Пример 2.3. Анализ трансгенного Т-клеточного рецептора: TCR Т4.8-1-29
[172] После идентификации РР\АМЕ100"108-специфического клона Т-клеток Т4.8-1-29 следующая стадия включала выделение последовательности ДНК,
кодирующей информацию о соответствующих цепях TCR, перенос клонированного TCR в соответствующие реципиентные Т-клетки и последующий функциональный анализ TCR-сконструированных Т-клеток.
Пример 2.3.1. Анализ последовательности Т-клеточного рецептора
[173] Последовательности ДНК альфа- и бета-цепей TCRncxoflHoro клона Т4.8-1-29 анализировали в собственной лаборатории с помощью секвенирования нового поколения (NGS-TCRseq). Соответствующие последовательности ДНК альфа- и бета-цепей TCR реконструировали с помощью синтеза генов на основе ДНК (GeneArt, Регенсбург) и клонировали в каркасы вектора pGEM для продуцирования /v/РНК, а также ретровирусные векторы для стабильной трансдукции.
Пример 2.3.2. Функциональная проверка трансгенного TCR
Перенос последовательности TCR клона Т-клеток Т4.8-1-29 в реципиентные клетки
Последовательности ДНК TCR исходного клона Т-клеток Т4.8-1-29 либо транскрибировали in vitro в РНК, кодирующую полноразмерные последовательности Т4.8-1-29 TCR для транзиентной трансфекции реципиентных эффекторых клеток путем электропорации, либо использовали для стабильной трансдукции эффекторных клеток с помощью конструкций на основе ретровирусных векторов, также кодирующих последовательность полного TCR Т4.8-1-29.
Схема эксперимента: стимуляция активированных пептидом Т2-клеток
• Специфическую секрецию IFN-гамма TCR Т4.8-1-29-трансфицированными реципиентными Т-клетками (клон CD8n0JI05K реципиентных Т-клеток + Т4.8-1-29 /v/РНК) при совместном культивировании с активированными PRAMEioo-ios (УЬБ)-пептидом Т2-клетками, измеряли с помощью стандартного ELISA.
• Клетки-мишени: Т2-клетки (HLA-A *02полож, РЫАМЕотриц), активированные 10"5 М VLD (релевантным) или "ELA-пептидом" (нерелевантным) (ELAGIGILTV, MelanA, SEQ ID NO: 231).
Результаты
• TCR Т4.8-1-29-трансфицированные реципиентные Т-клетки характеризовались высоким распознаванием Т2-клеток, нагруженных релевантным пептидом, однако распознавание в том случае, когда Т2-клетки нагружали нерелевантным пептидом, отсутствовало.
• Последовательности ДНК альфа- и бета-цепей TCR Т4.8-1-29 реконструировали корректным образом и они характеризовались высокой эффективностью в качестве трансгенов (фиг. 5).
Пример 2.4. Анализ распознавания аутопептидов
Схема эксперимента: секреция INF-гамма CD8+ обогащенными РВМС, экспрессирующими TCR Т4.8-1-29 при совместном культивировании с нагруженными пептидом Т2-клетками
Секрецию INF-гамма CD8+ обогащенными РВМС, экспрессирующими Т-клеточный рецептор клона Т4.8-1-29, совместно культивированных с клетками-мишенями Т2 (HLA-A*02noJIO5K, РР\АМЕотриц), нагруженными 10"5 М PRAME100-io8 VLD-пептида или универсальными аутопептидами, элюированными из HLA-А*02 (131 аутопептид), определяли с помощью анализа ELISA.
Результаты
• CD8 обогащенные РВМС, экспрессирующие Т-клеточный рецептор клона Т4.8-1-29, характеризовались отсутствием секреции INF-гамма в случае совместного культивирования с Т2-клетками (HLA-A*02noJIO5K, PRAME0TpHI1), нагруженными универсальными аутопептидами (положительный контроль: нагруженные PRAME 100-108 Т2-клетки), отражающей высокую специфичность TCR 4.8-1-29 (фиг. 6).
Пример 2.5. Анализ цитотоксичности
Схема эксперимента: лизис активированных пептидом Т2-клеток
• Лизис активированных PRAMEioo-ios (VLD) пептидом Т2-клеток измеряли с помощью флуоресцентного киллинг-анализа TVA (CTL, Cellular Technology Limited, США), определяющего исчезновение флуоресцентно меченых клеток-мишеней в ходе совместного культивирования с CD8 обогащенными РВМС, экспрессирующими Т4.8-1-29 TCR.
• Клетки-мишени: Т2-клетки (HLA-A*02noJIO5K, PRAME0TpHI1), активированные 10"5 М PRAME100-io8 VLD (релевантным) или SLL (SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229), PRAME, нерелевантным) пептидом, совместно культивируемым с TCR Т4.8-1-29, экспрессирующими РВМС при оцененных соотношениях Е:Т.
Результаты
• Т4.8-1-29, экспрессирующие РВМС, характеризовались эффективным лизисом Т2-клеток, нагруженных релевантным (VLD) пептидом даже при низких соотношениях Е:Т.
• Т2-клетки, нагруженные нерелевантным SLL-пептидом (PRAME), не лизировались (отрицательный контроль) при любом соотношении Е:Т (фиг. 7).
Схема эксперимента: лизис опухолевых клеток
• Цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток анализировали с помощью флуоресцентного киллинг-анализа TVA (CTL, Cellular Technology Limited, США), выявляющего исчезновение флуоресцентно меченых клеток-мишеней в ходе совместного культивирования с РВМС, экспрессирующими трансгенный TCR клона Т-клеток Т4.8-1-29.
Клетки-мишени: для экспериментов использовали линию опухолевых клеток человека К562. Клетки К562 трансфицировали с использованием /v/PHK, кодирующей HLA-A*02:01 человека, и/или РНК, кодирующей PRAME человека. Клетки К562 человека характеризуются эндогенной экспрессией PRAME (определенной с помощью Nanonstring и описанной в литературе). Кроме того,
экспрессия PRAME повышалась в результате трансфекции клеток К562 /v/PHK, кодирующей PRAME человека, или в результате загрузки PRAMEioo-ios VLD-пептида.
о К562, трансфицированные /v/РНК, кодирующей HLA-A*02 :01, или нагруженные PRAMEioo-ios (УЬБ)-пептидом: К562- (PRAME+/A2 )+А2-/vfPHK+VLD пептид (фиг. 8А).
о К562, транс дуцированные /v/РНК, кодирующие PRAME: К562-(PRAME+/A2 )+PRAME-n*PHK (фиг 8В).
о К562, трансфицированные /v/РНК, кодирующей PRAME, и /v/PHK, кодирующей HLA-A*02: К562- (PRAME+/A2 )+А2-п*РНК (фиг. 8С). о К562, трансфицированные /v/РНК, кодирующей HLA-A*02 /v/РНК: К562-(PRAME+/A2 )+А2-/^РНК + PRAME ntfPHK (фиг 8D)
• опухолевые клетки, кокультивируемые с TCR Т4.8-1-29-экспрессирующими РВМС в оцененных соотношениях Е:Т.
Результаты
• Трансфекция PRAME /v/РНК, а также VLD-пептидом, нагруженным HLA-А*02:01-экспрессирующими К562-клетками, повышала специфический лизис РВМС, экспрессирующих трансгенный TCR Т4.8-1-29 (фиг. 8A-D).
Пример 2.5. Распознавание опухолевых клеток CD8+ обогащенными РВМС-экспрессирующими TCR Т4.8-1-29
Схема эксперимента: стимуляция линиями опухолевых клеток
• ELISA IFN-гамма использовали для оценки секреции цитокинов после стимуляции группой линий опухолевых клеток человека (статус экспрессии PRAME выявляли с помощью анализа NanoString nCounter(r)).
• Супернатанты собирали через 24 часа совместного культивирования CD8+ обогащенных РВМС, экспрессирующих Т-клеточный рецептор Т4.8-1-29 с К562-В35, К562-А2, Mel-624.38, Colo-678 и SKMEL23. Специфическую секрецию IFN-гамма оценивали с помощью стандартного ELISA.
• Клетки-мишени:
о К562-В35 (НЬА-А*02отриц, PRAME(tm)), о К562-А2 (HLA-A*02(tm), PRAME1(tm)),
о К562-А2 (НЬА-А*02ПОЛОЖ, PRAME1(tm)), нагруженные VLD-пептидом, о Mel-624.38 (НЬА-А*02ПОЛОЖ, PRAME1(tm)), о SkMEL23 (HLA-A*02(tm), PRAME(tm)).
Результаты
• CD8+ обогащенные РВМС, экспрессирующие Т-клеточный рецептор Т4.8-1-29, характеризовались высокой секрецией IFN-гамма при совместном культивировании с PRAMEpos, линиями HLA-A*02pos опухолевых клеток К562-А2, К562-А2, дополнительно нагруженными VLD-пептидом, промежуточной секрецией INF-гамма при совместном культивировании с PRAMEn0JI05K, HLA-А*02полож Ме1_624 38 и SkMEL23.
• Экспрессия PRAMEn0JI05K К562 с HLA-B*35 не индуцировала секрецию INF-гамма, что подтверждало ограничение HLA-A*02 TCR Т4.8-1-29 (фиг. 10).
Пример 2.6. Трансдукция РВМС TCR Т4.8-1-29
• С08-обогащенные РВМС здорового донора трансдуцировали плазмидой, содержащей конструкцию TCR Т4.8-1-29. Для анализа эффективности трансдукции TCR осуществляли FACS-анализ после окрашивания нетрансдуцированных и TCR Т4.8-1-29-трансдуцированных РВМС. Клетки окрашивали антителами, специфическими к CD8 и к вариабельному участку TCR В-цепи TCR (TRBV9). В популяции контрольных эффекторных клеток присутствовало 8% эндогенно TRBV9-3KcnpeccHpyioni,Hx Т-клеток, в то время как после трансдукции 60% Т-клеток экспрессировали TRBV9. Это указывает на эффективность трансдукции, которая составляла более 50% (фиг. 11). Пример 2.7. Функциональная авидность Т-клеток по отношению к PRAME100-108 (VLD) пептиду с использованием клона Т-клеток Т4.8-1-29 и РВМС, трансдуцированных TCR Т4.8-1-29
• Функциональную авидность Т-клеток по отношению к распознаванию PRAMEioo-ios (VLD)-nemrma измеряли путем выявления секреции IFN-гамма после совместного культивирования либо с клоном Т-клеток Т4.8-1-29 (сплошная кривая), либо с эффекторными РВМС, трансдуцированными Т4.8-1-29 (пунктирная кривая) с помощью нагруженных пептидом Т2-клеток. Т2-клетки нагружали титруемыми количествами пептида, концентрация которого
5 12
варьировала от 10" М до 10" М. Супернатанты совместной культуры собирали через J24 часа после совместного культивирования и оценивали с помощью стандартного ELISA, при этом относительное высвобождение IFN-гамма выражено в процентах от максимального высвобождения. Полумаксимальная секреция IFN-гамма (ЕС50), определяющая функциональную авидность, указана штрих-пунктирной линией. Функциональная авидность клона исходных Т-клеток и трансгенных TCR является весьма схожей (фиг. 12). Пример 2.8. Анализ специфичности к антигену РВМС, трансдуцированных TCR Т4.8-1-29, и нетрансдуцированных контрольных РВМС с различными целевыми клетками (ОРМ-2 и U937)
• Для анализа специфичности к антигену, Т4.8-1-29-трансдуцированные эффекторные РВМС и нетрансдуцированные контрольные РВМС совместно культивировали с различными целевыми клетками. Линии опухолевых клеток ОРМ-2 и U937 (НЕА-А2-отрицательные и PRAME-отрицательные) тестировали либо немодифицированными, либо трансфицированными /v/РНК, кодирующей HLA-A2. Кроме того, клетки также тестировали после трансфекции комбинацией /v/РНК, кодирующей HLA-A2 и PRAME, или HLA-A2 и нерелевантного антигена. В качестве контроля эффекторные клетки также совместно культивировали с Т2-клетками, нагруженными PRAMEVLD пептидом (10"5М) или нерелевантным PRAMESLL пептидом (10"5М). Через 24 часа совместного культивирования супернатанты собирали и секретированные количества IFN-гамма измеряли с помощью стандартного ELISA. Высокие количества IFN-гамма измеряли в случае TCR-трансдуцированных РМВС в совместной культуре с VLD-нагруженными Т2-клетками. Кроме того, обе из линий опухолевых клеток, трансфицированные HLA-A2 и антигеном PRAME,
индуцировали секрецию IFN-гамма TCR-трансдуцированными РВМС. Таким образом, лишь опухолевые клетки, экспрессирующие HLA-A2 в качестве необходимого элемента ограничения МНС, в комбинации с антигеном PRAME, распознавались и приводили к активации Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС (фиг. 13).
Пример 2.9. Анализ специфичности к антигену РВМС, трансдуцированных TCR Т4.8-1-29, и нетрансдуцированных контрольных РВМС с различными клетками-мишенями (К562, К562 А2 и Mel 624.38)
• Для анализа специфичности к антигену, Т4.8-1-29-трансдуцированные эффекторные РВМС и нетрансдуцированные контрольные РВМС совместно культивировали с различными линиями клеток-мишеней. Тестировали линии опухолевых клеток К562 (HLA-A2- отрицательные и PRAME-положительные), а также К562 А2 и Mel 624.38 (HLA-A-положительные и PRAME-положительные) и 647-V (НЬА-А2-положительные и PRAME-отрицательные). В качестве контроля эффекторные клетки также совместно культивировали с Т2-клетками, нагруженными PRAMEVLD пептидом (10"5М) или нерелевантным PRAMESLL пептидом (10"5М). Через 24 часа совместного культивирования супернатанты собирали и секретированные количества IFN-гамма измеряли с помощью стандартного ELISA. Высокие количества IFN-гамма измеряли в случае TCR-трансдуцированных РМВС в совместной культуре с VLD-нагруженными Т2-клетками.
Измеренные значения IFN-гамма указывали на активацию TCR Т4.8-1-29-трансдуцированных РВМС Т2-клетками, нагруженными VLD-пептидом, и линиями опухолевых клеток К562 А2 и Ме1624.38. Таким образом, только HLA-А2-положительные эндогенно PRAME-экспрессирующие линии опухолевых клеток распознавались трансдуцированными РВМС, в то время как отсутствие либо HLA-A2, либо антигена предупреждало активацию (фиг. 14). Пример 2.10. Анализ цитотоксической активности Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторов в отношении опухолевых клеток
• Цитотоксическую активность Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторов в отношении опухолевых клеток анализировали с помощью системы для анализа
живых клеток IncuCyte ZOOM(r) (Essenbiosciences), системы на основе микроскопа, которая позволяет визуализацию живых клеток. TCR Т4.8-1-29-трансдуцированные и нетрансдуцированыне эффекторные РВМС совместно культивировали с НЬА-А2-положительной, PRAME-положительной клеточной линией меланомы Ме1624.38. Клетки меланомы высевали в 96-луночный планшет и при достижении конфлюентности, составляющей J50%, добавляли эффекторные клетки. Для визуализации гибели клеток также добавляли красный V-краситель аннексии и изображения снимали ежедневно в течение 4 дней. Линию клеток меланомы Ме1624.38 в совместной культуре с нетрансдуцированными эффекторами (верхний ряд) выращивали в динамике, и при этом могли отмечаться только редкие случаи гибели клеток, в то время как TCR-трансдуцированные эффекторы предупреждали разрастание опухолевых клеток и приводили к образованию скоплений клеток с высоким количеством погибающих клеток. Это указывает на то, что Т4.8-1-29-экспрессирующие эффекторные клетки могут эффективно лизировать PRAME-экспрессирующие опухолевые клетки и предупреждать рост опухолевых клеток в течение нескольких дней.
Пример 2.11. Анализ профиля безопасности Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС
• Для анализа профиля безопасности Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС, необходимо было исключить распознавание нормальных тканей человека. Таким образом, Т4.8-1-29-трансдуцированные РВМС, происходящие от двух различных доноров, совместно культивировали с клетками, происходящими из нормальных тканей НЬА-А2-положительных доноров. В качестве примера трансдуцированные, а также нетрансдуцированные РВМС совместно культивировали с эпителиальными клетками капилляров почек человека (HRCEpC). В качестве контроля клетки HRCEp дополнительно нагружали VLD-пептидом (10"5М). Через 24 часа совместного культивирования супернатанты собирали и секретированные количества IFN-гамма измеряли с помощью стандартного ELISA. TCR-трансдуцированные РВМС активировались только при совместном культивировании с нагруженными пептидом целевыми
клетками, в то время как распознавание немодифицированных клеток HRCEp отсутствовало.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Медиджен Имьюнотерапиз ГмбХ
<120> T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> MED15669PCT
<160> 231
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> CDR3-альфа
<400> 1
Cys Ala Val His Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> CDR3-бета
<400> 2
<210> 3 <211> 7 <212>
Cys Ala Ser Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> CDR2-альфа
<400> 3
Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> CDR2 бета
<400> 4
<210> 5 <211> 6 <212>
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu 1 5
БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика
<223> CDR1 альфа <400> 5
Val Ser Gly Leu Arg Gly
1 5
<210> 6 <211> 5 <212>
БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> CDR1-бета
<400> 6
Ser Gly Asp Leu Ser 1 5
<210> 7
<211> 274
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика
<223> полноразмерный TCR-альфа дикого типа
<400> 7
Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val His
100 105 110
Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Ser Val Ser Ser Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 8
<211> 311
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> полноразмерный TCR-бета дикого типа
<400> 8
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 305 310
<210> 9
<211> 274
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> полноразмерный TCR-альфа humC
<400> 9
Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val His
100 105 110
Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Ser Val Ser Ser Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 10
<211> 311
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR бета humC full length
<400> 10
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 305 310
<210> 11
<211> 274
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR альфа mmcys full length
<400> 11
Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val His
100 105 110
Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Ser Val Ser Ser Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser
210 215 220
Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 12
<211> 311
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR бета mmcys full length
<400> 12
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr
260 265 270
His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 305 310
<210> 13
<211> 270
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> полноразмерный TCR-альфа murC
<400> 13
Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val His
100 105 110
Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Ser Val Ser Ser Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser
180 185 190
Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp
195 200 205
Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys
210 215 220
Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 14
<211> 307
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> полноразмерный TCR-бета murC
<400> 14
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys
130 135 140
Val Thr Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser
195 200 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe
210 215 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro
225 230 235 240
Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp
245 250 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val
260 265 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
275 280 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys
290 295 300
Lys Asn Ser
305
<210> 15
<211> 134
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> вариабельный TCR-альфа
<400> 15
Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val His
100 105 110
Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Ser Val Ser Ser Asn
130
<210> 16
<211> 134
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR бета variable
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> вариабельный TCR-бета
<400> 16
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val 130
<211> 140
<212>
БЕЛОК
<213> homo sapiens
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> константный TCR-альфа дикого типа
<400> 17
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 18
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> константный TCR-бета дикого типа
<400> 18
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 19
<211> 140
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> константный TCR-альфа минимально муринизированный
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> константный TCR-альфа mmcys
<400> 19
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 20
<211> 177
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> минимально муринизированный TCR-бета C
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> константный TCR-бета mmcys
<400> 20
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 21
<211> 136
<212> БЕЛОК
<213> mus musculus
Иная_характеристика
<220> <221>
<223> константный TCR-альфа murC
<400> 21
Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser
1 5 10 15
Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn
20 25 30
Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val
35 40 45
Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val
100 105 110
Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu
115 120 125
Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135
<210> 22 <211> 173
<212> БЕЛОК
<213> mus musculus
Иная_характеристика <223> константный TCR-бета murC
<400> 22
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser 165 170
<210> 23 <211> 825
<212> ДНК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> TCR-альфа дикого типа
<400> 23
atggagaaaa tgttggagtg tgcattcata gtcttgtggc ttcagcttgg ctggttgagt 60
ggagaagacc aggtgacgca gagtcccgag gccctgagac tccaggaggg agagagtagc 120
agtcttaact gcagttacac agtcagcggt ttaagagggc tgttctggta taggcaagat 180
cctgggaaag gccctgaatt cctcttcacc ctgtattcag ctggggaaga aaaggagaaa 240
gaaaggctaa aagccacatt aacaaagaag gaaagctttc tgcacatcac agcccctaaa 300
cctgaagact cagccactta tctctgtgct gtgcactcca cagcccaggc aggaactgct 360
ctgatctttg ggaagggaac caccttatca gtgagttcca atatccagaa ccctgaccct 420
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gctga 825
<210> 24
<211> 936
<212> ДНК
<213> homo sapiens
<220>
<221> Иная_характеристика <223> TCR-бета дикого типа
<400> 24
atgggcttca ggctcctctg ctgtgtggcc ttttgtctcc tgggagcagg cccagtggat 60
tctggagtca cacaaacccc aaagcacctg atcacagcaa ctggacagcg agtgacgctg 120
agatgctccc ctaggtctgg agacctctct gtgtactggt accaacagag cctggaccag 180
ggcctccagt tcctcattca gtattataat ggagaagaga gagcaaaagg aaacattctt 240
gaacgattct ccgcacaaca gttccctgac ttgcactctg aactaaacct gagctctctg 300
gagctggggg actcagcttt gtatttctgt gccagcagca cacacagggg gcagactaac 360
tatggctaca ccttcggttc ggggaccagg ttaaccgttg tagaggacct gaacaaggtg 420
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480
gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacggacc cgcagcccct caaggagcag 600
cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720
gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780
ggtagagcag actgtggctt tacctcggtg tcctaccagc aaggggtcct gtctgccacc 840
atcctctatg agatcctgct agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt cagcgccctt 900
gtgttgatgg ccatggtcaa gagaaaggat ttctga 936
<210> 25 <211> 825 <212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR-альфа humC кодон-оптимизированный
<400> 25
atggaaaaga tgctggaatg cgccttcatc gtgctgtggc tgcagctggg atggctgagc 60
ggagaggacc aagtgaccca gtctcccgag gccctgagac tgcaggaagg cgagagcagc 120
agcctgaact gcagctacac cgtgtccggc ctgagaggcc tgttctggta cagacaggac 180
cccggcaagg gccccgagtt cctgttcaca ctgtactctg ccggcgagga aaaagagaaa 240
gagcggctga aggccaccct gaccaagaaa gagagcttcc tgcacatcac cgcccccaag 300
cctgaggaca gcgccacata tctgtgcgcc gtgcactcta cagcccaggc cggaaccgcc 360
ctgatctttg gcaagggcac caccctgagc gtgtccagca acatccagaa tccggaccct 420
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gctga 825
<211> 936 <212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR-бета humC кодон-оптимизированный
<400> 26
atgggcttta gactgctgtg ctgcgtggcc ttctgcctgc tgggagctgg ccctgtggat 60
agcggcgtga cccagacacc caagcacctg atcacagcca ccggccagcg cgtgaccctg 120
agatgttctc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaac gggccaaggg caacatcctg 240
gaacggttca gcgcccagca gttccccgat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300
gaactgggcg acagcgccct gtacttctgt gccagcagca cccacagagg ccagaccaac 360
tacggctaca ccttcggcag cggcaccaga ctgaccgtgg tggaggacct gaacaaagtg 420
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480
gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacggacc cgcagcccct caaggagcag 600
cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720
gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780
ggtagagcag actgtggctt tacctcggtg tcctaccagc aaggggtcct gtctgccacc 840
atcctctatg agatcctgct agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt cagcgccctt 900
gtgttgatgg ccatggtcaa gagaaaggat ttctga 936
<210> 27 <211> 825 <212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR-альфа mmcys кодон-оптимизированный
<400> 27
atggaaaaga tgctggaatg cgccttcatc gtgctgtggc tgcagctggg atggctgagc 60
ggagaggacc aagtgaccca gtctcccgag gccctgagac tgcaggaagg cgagagcagc 120
agcctgaatt gcagctacac cgtgtccggc ctgcggggcc tgttctggta tagacaggac 180
cctggcaagg gccccgagtt cctgtttacc ctgtactctg ccggcgaaga gaaagaaaaa 240
gagcggctga aggccacact gaccaagaaa gagagcttcc tgcacatcac cgcccccaag 300
cctgaggaca gcgccacata tctgtgcgcc gtgcactcta cagcccaggc cggaaccgcc 360
ctgatcttcg gcaagggcac aaccctgtcc gtgtccagca acatccagaa ccccgacccc 420
gccgtgtacc agctgagaga cagcaagagc agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac 480
ttcgacagcc agacaaacgt gtcccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgataag 540
tgcgtgctgg acatgcggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggtccaac 600
aagagcgatt tcgcctgcgc caacgccttc aacaacagca ttatccccga ggacacattc 660
ttccccagct ccgacgtgcc ctgcgacgtg aagctggtgg aaaagagctt cgagacagac 720
accaacctga acttccagaa tctgagcgtg atcggcttca gaatcctgct gctgaaggtg 780
gccggcttca atctgctgat gaccctgcgg ctgtggtcca gctga 825
<210> 28 <211> 935 <212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR-бета mmcys кодон-оптимизированный
<400> 28
atgggcttcc ggctgctgtg ttgcgtggcc ttctgtctgc tgggagccgg ccctgtggat 60
agcggcgtga cacagacacc caagcacctg atcaccgcca ccggccagcg cgtgacactg 120
agatgtagcc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaac gggccaaggg caacatcctg 240
gaacggttca gcgcccagca gttccccgat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300
gaactgggcg acagcgccct gtacttctgt gccagcagca cccacagagg ccagaccaac 360
tacggctaca ccttcggcag cggcaccaga ctgaccgtgg tggaagatct gaacaaggtg 420
ttccccccag aggtggccgt gttcgagcct agcaaggccg agatcgccca cacccagaaa 480
gccaccctcg tgtgtctggc caccggcttt ttccccgacc acgtggaact gtcttggtgg 540
gtcaacggca aagaggtgca ctccggcgtg tgcaccgatc cccagcctct gaaagaacag 600
cccgccctga acgacagccg gtactgcctg tccagcagac tgagagtgtc cgccaccttc 660
tggcagaacc cccggaacca cttcagatgc caggtgcagt tctacggcct gagcgagaac 720
gacgagtgga cccaggacag agccaagccc gtgacccaga tcgtgtctgc cgaagcctgg 780
ggcagagccg attgtggcat caccagcgcc agctaccatc agggcgtgct gagcgccacc 840
atcctgtacg agatcctgct gggcaaggcc accctgtacg ccgtgctggt gtctgccctg 900
gtgctgatgg ccatggtcaa gcggaaggac tttga 935
<210> 29
<211> 813
<212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> TCR-альфа murC кодон-оптимизированный
<400> 29
atggaaaaga tgctggaatg cgccttcatc gtgctgtggc tgcagctggg atggctgagc 60
ggagaggacc aagtgaccca gtctcccgag gccctgagac tgcaggaagg cgagagcagc 12 0
agcctgaact gcagctacac cgtgtccggc ctgagaggcc tgttctggta cagacaggac 180
cccggcaagg gccccgagtt cctgttcaca ctgtactctg ccggcgagga aaaagagaaa 240
gagcggctga aggccaccct gaccaagaaa gagagcttcc tgcacatcac cgcccccaag 300
cctgaggaca gcgccacata tctgtgcgcc gtgcactcta cagcccaggc cggaaccgcc 360
ctgatctttg gcaagggcac caccctgagc gtgtccagca acatccagaa ccccgagccc 420
gccgtgtacc agctgaagga ccctagaagc caggacagca ccctgtgcct gttcaccgac 480
ttcgacagcc agatcaacgt gcccaagacc atggaaagcg gcaccttcat caccgacaag 540
acagtgctgg acatgaaggc catggacagc aagagcaacg gcgccattgc ctggtccaac 600
cagaccagct tcacatgcca ggacatcttc aaagagacaa acgccaccta ccccagcagc 660
gacgtgccct gcgacgccac cctgaccgag aagagcttcg agacagacat gaacctgaat 720
ttccagaacc tgagcgtgat gggcctgcgg atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaac 780
ctgctgatga ccctgcggct gtggagcagc tga 813
<210> 30 <211> 924 <212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> Кодон-оптимизированный TCR-бета murC
<400> 30
atgggcttta gactgctgtg ctgcgtggcc ttctgcctgc tgggagctgg ccctgtggat 60
agcggcgtga cccagacacc caagcacctg atcacagcca ccggccagcg cgtgaccctg 120
agatgttctc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaac gggccaaggg caacatcctg 240
gaacggttca gcgcccagca gttccccgat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300
gaactgggcg acagcgccct gtacttctgt gccagcagca cccacagagg ccagaccaac 360
tacggctaca ccttcggcag cggcaccaga ctgaccgtgg tggaagatct gcggaacgtg 420
acccccccca aggtgaccct gttcgagccc agcaaggccg agatcgccaa caagcagaaa 480
gccaccctgg tctgcctggc caggggcttc ttccccgacc acgtggagct gtcttggtgg 540
gtgaacggca aagaggtgca cagcggagtc agtaccgacc cccaggccta caaagagagc 600
aactacagct actgcctgag cagcaggctg agagtgagcg ccaccttctg gcacaacccc 660
cggaaccact tccggtgcca ggtgcagttc cacggcctga gcgaagagga caagtggcct 720
gagggcagcc ccaagcccgt gacccagaac atcagcgccg aggcctgggg cagagccgac 780
tgcggcatca ccagcgccag ctaccaccag ggcgtgctgt ccgccaccat cctgtacgag 840
atcctgctgg gcaaggccac cctgtacgcc gtgctggtgt ccggcctggt gctgatggcc 900
atggtgaaga agaagaacag ctga 924
<210> 31
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> Минимальная последовательность распознавания
<220>
<221> Иная_характеристика
<222>
<223> X может быть выбран из любой аминокислоты
<220>
<221> Иная_характеристика
<222> (3)..(3)
<223> X может быть выбран из любой аминокислоты
<220>
<221> Иная_характеристика
<222> (7)..(7)
<223> X может быть выбран из любой аминокислоты
<400> 31
Xaa Leu Xaa Gly Leu Asp Xaa Leu Leu 1 5
<210> 32
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 32
Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu 1 5
<210> 33
<211> 509
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 33
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg
50 55 60
His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys
65 70 75 80
Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr
85 90 95
Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val
100 105 110
Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser
115 120 125
His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr
130 135 140
Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu
165 170 175
Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe
180 185 190
Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu
195 200 205
Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys
210 215 220
Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu
245 250 255
Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala
260 265 270
Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe
275 280 285
Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val
305 310 315 320
Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu
325 330 335
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
355 360 365
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
370 375 380
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
420 425 430
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
435 440 445
Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
450 455 460
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
465 470 475 480
Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
485 490 495
Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn 500 505
<210> 34
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Thr Ser Gly Phe Tyr Gly 1 5
<210> 35
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 35
Thr Ser Gly Phe Asn Gly
1 5
<210> 36
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 36
Val Ser Asn Ala Tyr Asn 1 5
<210> 37
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 37
Val Ser Gly Asn Pro Tyr 1 5
<210> 38
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 38
Asn Ile Ala Thr Asn Asp Tyr 1 5
<210> 39
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 39
Asp Ser Ser Ser Thr Tyr 1 5
<210> 40
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 40
Asn Tyr Ser Pro Ala Tyr 1 5
<210> 41
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 41
Val Ser Arg Phe Asn Asn 1 5
<210> 42
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 42
Tyr Gly Gly Thr Val Asn 1 5
<210> 43
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 43
Ser Ser Tyr Ser Pro Ser 1 5
<210> 44
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 44
Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr 1 5
<210> 45
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 45
Ser Ser Val Pro Pro Tyr 1 5
<210> <211> <212> 46 6
БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ser Ser Val Ser Val Tyr
<210> <211>
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 47
Thr Thr Gln Tyr Pro Ser 1 5
<210> <211>
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 48
Ala Thr Gly Tyr Pro Ser 1 5
<210> 49
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 49
Val Ser Pro Phe Ser Asn
<210> 50
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 50
Glu Arg Thr Leu Phe Asn
<210> <211>
51 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 51
Asn Ser Ala Ser Gln Ser 1 5
<211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 52
Asp Arg Gly Ser Gln Ser 1 5
<210> 53
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 53
Asn Ser Ala Phe Gln Tyr
<210> 54
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 54
Asp Ser Ala Ser Asn Tyr
<210> 55
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 55
Asn Ser Ala Ser Asp Tyr 1 5
<210> 56
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 56
Thr Ser Asp Pro Ser Tyr Gly 1 5
<210> 57
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 57
Tyr Ser Gly Ser Pro Glu 1 5
<210> 58
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 58
Thr Ser Ile Asn Asn 1 5
<210> 59
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 59
Ser Ser Tyr Ser Thr Phe 1 5
<210> 60
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 60
Thr Arg Asp Thr Thr Tyr Tyr 1 5
<210> 61
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 61
Val Ser Gly Leu Arg Gly
1 5
<210> 62
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 62
Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 1 5
<210> 63
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 63
Asp Ser Val Asn Asn
<210> 64
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 64
Asn Thr Ala Phe Asp Tyr 1 5
<210> 65
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 65
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala 1 5
<210> 66
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 66
Thr Thr Leu Ser Asn 1 5
<210> 67
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 67
Thr Ile Ser Gly Asn Glu Tyr 1 5
<210> 68
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 68
Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr 1 5
<210> 69
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Ser Val Phe Ser Ser 1 5
<210> 70
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 70
Asn Ser Met Phe Asp Tyr 1 5
<210> 71
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 71
Lys Ala Leu Tyr Ser 1 5
<210> 72
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 72
Lys Thr Leu Tyr Gly 1 5
<210> 73
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 73
Ser Ile Phe Asn Thr 1 5
<210> 74
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 74
Val Thr Asn Phe Arg Ser 1 5
<210> 75
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 75
Thr Ser Glu Asn Asn Tyr Tyr 1 5
<210> <211>
76 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 76
Thr Ser Glu Ser Asp Tyr Tyr 1 5
<210> <211>
77 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 77
Thr Thr Ser Asp Arg 1 5
<210> <211>
78 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 78
Ser Thr Gly Tyr Pro Thr 1 5
<210> 79
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 79
Val Gly Ile Ser Ala
<210> 80
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 80
Ser Asn His Leu Tyr 1 5
<210> 81 <211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens <400> 81
Leu Gly His Asp Thr 1 5
<210> 82
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 82
Met Gly His Arg Ala
1 5
<210> 83
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 83
Leu Gly His Asn Ala 1 5
<210> 84
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 84
Leu Gly His Asn Ala 1 5
<210> 85
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 85
Ser Gly His Arg Ser 1 5
<210> 86
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 86
Ser Gly His Asn Thr 1 5
<210> 87
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 87
Ser Gly His Lys Ser
1 5
<210> 88
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 88
Ser Gly His Asp Thr 1 5
<210> 89
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 89
Ser Gly His Thr Ser
1 5
<210> 90
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 90
Met Asn His Asn Ser 1 5
<210> 91
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 91
Met Asn His Glu Tyr 1 5
<210> 92
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 92
Met Asn His Glu Tyr 1 5
<210> 93
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 93
Met Arg His Asn Ala 1 5
<210> 94
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 94
Met Asn His Glu Tyr 1 5
<210> 95
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 95
Met Asn His Asn Tyr 1 5
<210> 96
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 96
Met Asn His Gly Tyr 1 5
<210> 97
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 97
Met Asn His Gly Tyr 1 5
<210> 98
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Ser Gly His Thr Ala
1 5
<210> 99
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 99
Ser Gly His Thr Ala
1 5
<210> 100
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 100
Ser Gly His Val Thr
1 5
<210> 101
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 101
Ser Gly His Val Ser
1 5
<210> 102
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 102
Ser Ser His Ala Thr 1 5
<210> 103
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 103
Ser Gly His Val Ser
1 5
<210> 104
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 104
Ser Glu His Asn Arg 1 5
<210> 105
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 105
Ser Gly Asp Leu Ser 1 5
<210> 106
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 106
Trp Asn His Asn Asn 1 5
<210> 107
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 107
Trp Ser His Ser Tyr 1 5
<210> 108
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 108
Glu Asn His Arg Tyr 1 5
<210> 109
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 109
Ser Gly His Ala Thr
1 5
<210> <211> <212> 110 5
БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 110
Ser Gly His Ala Thr
1 5
<210> 111
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 111
Ser Gly His Asn Thr 1 5
<210> 112
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 112
Ser Gly His Asn Asp 1 5
<210> 113
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 113
Phe Gly His Asn Phe 1 5
<210> 114
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 114
Ser Gly His Asn Ser 1 5
<210> 115
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 115
Ser Gly His Asp Tyr 1 5
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 116
Leu Gly His Asn Thr 1 5
<210> 117
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 117
Pro Arg His Asp Thr 1 5
<210> 118
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 118
Ser Gly His Asp Asn 1 5
<210> 119
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 119
Leu Asn His Asn Val 1 5
<210> 120
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 120
Lys Gly His Ser Tyr 1 5
<210> 121
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 121
Lys Gly His Ser His 1 5
<210> 122
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 122
Leu Asn His Asp Ala 1 5
<210> 123
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 123
Asp Phe Gln Ala Thr Thr 1 5
<210> 124
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 124
Lys Gly His Asp Arg 1 5
<210> 125
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 125
Met Gly His Asp Lys 1 5
<210> 126
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 126
Met Asn His Glu Tyr 1 5
<210> 127
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 127
Met Asp His Glu Asn
<210> 128
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 128
Ser Gln Val Thr Met
1 5
<210> 129
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 129
Gly Thr Ser Asn Pro Asn 1 5
<210> 130
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 130
Asn Ala Leu Asp Gly Leu 1 5
<210> 131
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 131
Asn Val Leu Asp Gly Leu 1 5
<210> 132
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 132
Gly Ser Lys Pro
<210> 133
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val 1 5
<210> 134
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 134
Gly Tyr Lys Thr Lys
<210> 135
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 135
Ile Phe Ser Asn Met Asp Met
<210> 136
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 136
Ile Arg Glu Asn Glu Lys Glu 1 5
<210> 137
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 137
Met Tyr Ser Ala Gly Tyr Glu 1 5
<210> 138
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 138
Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val 1 5
<210> 139
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 139
Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val 1 5
<210> 140
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 140
Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val 1 5
<210> 141
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 141
Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val 1 5
<210> 142
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 142
Tyr Leu Ser Gly Ser Thr Leu Val 1 5
<210> 143
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 143
Ala Met Lys Ala Asn Asp Lys
<210> 144
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 144
Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys 1 5
<210> 145 <211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 145
Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr 1 5
<210> 146
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 146
Ile Gln Ser Ser Gln Lys Glu
1 5
<210> 147
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 147
Val Tyr Ser Ser Gly Asn 1 5
<210> 148
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 148
Ile Tyr Ser Asn Gly Asp 1 5
<210> 149
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 149
Thr Tyr Ser Ser Gly Asn 1 5
<210> 150
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 150
Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu
1 5
<210> 151
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 151
Ile Arg Ser Asn Met Asp Lys 1 5
<210> 152
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 152
Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn
<210> 153
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 153
His Ile Ser Arg
<210> 154
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 154
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu 1 5
<210> 155
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 155
Ser Ser Glu Asn Gln Glu
1 5
<210> 156
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 156
Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn 1 5
<210> 157
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 157
Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu
1 5
<210> 158
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 158
Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu
1 5
<210> 159
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 159
Ile Pro Ser Gly Thr 1 5
<210> 160
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 160
Ile Arg Pro Asp Val Ser Glu 1 5
<210> 161
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 161
Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu 1 5
<210> 162
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Leu Val Lys Ser Gly Glu Val 1 5
<210> 163
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 163
Gly Leu Lys Asn Asn 1 5
<210> 164
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 164
Gly Leu Thr Ser Asn
<210> 165
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 165
Val Val Thr Gly Gly Glu Val
<210> 166
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 166
Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys 1 5
<210> 167
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 167
Leu Leu Lys Gly Gly Glu Gln
1 5
<210> 168
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 168
Leu Gln Lys Gly Gly Glu Glu
1 5
<210> 169
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 169
Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu
<210> 170
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 170
Leu Thr Ser Ser Gly Ile Glu
1 5
<210> 171
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 171
Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn
<210> 172
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 172
Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn
1 5
<210> 173
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 173
Leu Leu Ser Asn Gly Ala Val 1 5
<210> <211> <212> 174 4
БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 174
Glu Thr Met Glu
<210> 175
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 175
Leu Ser Ser Gly Lys 1 5
<210> 176
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 176
Phe Tyr Asn Asn Glu Ile 1 5
<210> 177
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 177
Tyr Asn Asn Lys Glu Leu 1 5
<210> 178
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 178
Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu 1 5
<210> 179
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 179
Tyr Asn Phe Lys Glu Gln 1 5
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 180
Tyr Ser Leu Glu Glu Arg 1 5
<210> 181
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 181
Tyr Phe Ser Glu Thr Gln 1 5
<210> 182
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 182
Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu 1 5
<210> 183
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 183
Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu 1 5
<210> 184
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 184
Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 185
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 185
Tyr Asp Glu Gly Glu Glu
1 5
<210> 186
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 186
Ser Ala Ser Glu Gly Thr
<210> 187
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 187
Ser Val Gly Glu Gly Thr
1 5
<210> 188
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 188
Ser Val Gly Glu Gly Thr
1 5
<210> 189
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 189
Ser Asn Thr Ala Gly Thr 1 5
<210> 190
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 190
Ser Val Gly Ala Gly Ile
<210> 191
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 191
Ser Val Gly Ala Gly Ile
<210> 192
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 192
Ser Ala Ala Ala Gly Thr
1 5
<210> 193
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 193
Ser Val Ala Ala Gly Ile
1 5
<210> 194
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 194
Phe Gln Gly Asn Ser Ala
1 5
<210> 195
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 195
Phe Gln Gly Thr Gly Ala
1 5
<210> 196
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 196
Ser Gln Ser Asp Ala Gln
1 5
<210> 197
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Phe Asn Tyr Glu Ala Gln 1 5
<210> 198
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 198
Phe Asn Tyr Glu Ala Gln
<210> 199
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 199
Phe Gln Asn Glu Ala Gln
<210> 200
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 200
Phe Gln Asn Glu Ala Gln
1 5
<210> 201
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 201
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu 1 5
<210> 202
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 202
Ser Tyr Gly Val Gln Asp
1 5
<210> 203
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 203
Ser Ala Ala Ala Asp Ile 1 5
<210> 204
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 204
Ser Tyr Gly Val Lys Asp 1 5
<210> 205
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 205
Phe Gln Asp Glu Ser Val
1 5
<210> 206
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 206
Phe Gln Asn Asn Gly Val
1 5
<210> 207
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 207
Tyr Glu Asn Glu Glu Ala
1 5
<210> 208
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 208
Phe Cys Ser Trp Thr Leu 1 5
<210> 209 <211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 209
Phe Arg Ser Ser Ile 1 5
<210> 210
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 210
Phe Asn Asn Asn Val Pro 1 5
<210> 211
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 211
Phe Asn Asn Asn Val Pro
<210> 212
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 212
Phe Arg Asn Arg Ala Pro
<210> 213
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> homo sapiens
<400> 213
Phe Tyr Glu Lys Met Gln
<210> 214
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 214
Phe Val Lys Glu Ser Lys 1 5
<210> 215
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 215
Phe Val Lys Glu Ser Lys 1 5
<210> 216
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 216
Phe Gln Asn Glu Asn Val
1 5
<210> 217
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 217
Leu Gln Lys Glu Asn Ile 1 5
<210> 218
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 218
Ser Gln Ile Val Asn Asp 1 5
<210> 219
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 219
Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala 1 5
<210> 220
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 220
Ser Phe Asp Val Lys Asp 1 5
<210> 221
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 221
Ser Tyr Gly Val Asn Ser 1 5
<210> 222
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 222
Ser Met Asn Val Glu Val
1 5
<210> 223
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 223
Ser Tyr Asp Val Lys Met 1 5
<210> 224
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 224
Ser Val Gly Ile Gly
1 5
<210> 225
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> линкер
<400> 225
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 226
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> линкер <400> 226
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 227
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> линкер
<400> 227
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 228
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> линкер
<400> 228
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 229
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> пептид SLL
<400> 229
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5
<210> 230
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> пептид ALY
<400> 230
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
1 5 10
<210> 231
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственный
<220>
<223> пептид ELA
<400> 231
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
Первоначально поданная формула изобретения
Формула изобретения
1. Т-клеточный рецептор (TCR), содержащий:
(i) CDR3 вариабельного участка альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:1, или состоящий из нее,
и/или
(ii) CDR3 вариабельного участка бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2)
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:2, или состоящий из нее,
при этом указанный TCR способен связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID N0:31) или ее МНС-связанной форме, предпочтительно эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID N0:32) или ее МНС-связанной форме.
2. TCR по п. 1, содержащий:
(i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или
(ii) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее.
3. TCR по любому из п. 1 или п. 2, дополнительно содержащий:
(i) константный участок альфа-цепи TCR и/или
(ii) константный участок бета-цепи TCR.
4. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:
(i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13,
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 11, 9 или 13, или состоящую из нее, и/или
(ii) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14,
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.
5. TCR по любому из предыдущих пунктов, при этом указанный TCR выбран из нативного TCR, варианта TCR, фрагмента TCR или TCR-конструкции.
6. TCR-конструкция по п. 5, содержащая по меньшей мере одну альфа-цепь(-цепи) TCR и по меньшей мере одну бета-цепь(-цепи) TCR, ковалентно связанные друг с другом с образованием гетеродимеров или мультимеров TCR.
7. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий один или более слитых компонентов, необязательно выбранных из Fc-рецепторов; Fc-доменов, в том числе IgA, IgD, IgG, IgE и IgM; цитокинов, в том числе IL-2 или IL-15; токсинов; антител или их антигенсвязывающих фрагментов, в том числе антител к CD3, к CD28, к CD5, к CD 16 или к CD56 или их антигенсвязывающих фрагментов; CD247- (СОЗ-дзета), CD28-, CD137-, СБ134-домена или их комбинаций, необязательно дополнительно содержащих по меньшей мере один линкер.
8. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:
(i) по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, определенную в любом из пп. 1-3, и
(й) по меньшей мере одну бета-цепь TCR, определенную в любом из пп. 1-3,
(iii) антитело или фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов,
где альфа-цепь(-цепи) TCR и бета-цепь(-цепи) TCR связаны друг с другом и слиты с указанным антителом или scFv необязательно посредством линкера.
9. TCR по п. 8, где указанный антиген выбран из CD3, CD28, CD5, CD16 или CD56.
10. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий по меньшей мере одну метку.
11. TCR по любому из предыдущих пунктов, который является растворимым.
12. Нуклеиновая кислота, кодирующая TCR по любому из предыдущих пунктов.
13. Нуклеиновая кислота по п. 12, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.
14. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из п. 12 или п. 13.
15. Клетка-хозяин, содержащая TCR по любому из пп. 1-11, последовательность нуклеиновой кислоты по п. 12 или п. 13 или вектор по п. 14.
16. Клетка-хозяин по п. 15, которая выбрана из лимфоцитов, в том числе без ограничения цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, естественных киллерных (NK) клеток, естественных киллерных (NKT) Т-клеток, гамма/дельта-Т-клеток.
17. Способ получения TCR по любому из пп. 1-11, предусматривающий:
(i) инкубацию клетки-хозяина по п. 15 или п. 16 в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR,
(ii) очистку указанного TCR.
18. Фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая одно или более из:
(i) TCR по любому из пп. 1-11,
(й) нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13,
(iii) вектора по п. 14 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 15 или п. 16,
и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества).
19. TCR по любому из пп. 1-11, нуклеиновая кислота по п. 12 или п. 13, вектор по п. 14 и/или клетка-хозяин по п. 15 или п. 16 для применения в качестве лекарственного препарата.
19.
20. TCR по любому из пп. 1-11, нуклеиновая кислота по п. 12 или п. 13, вектор по п. 14 и/или клетка-хозяин по п. 15 или п. 16 для применения в выявлении, диагностике, прогнозировании, предупреждении и/или лечении рака.
21. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п. 20, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:
(a) обеспечение одного или более из (i) TCR по любому из пп. 1-11,
(и) нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13,
(iii) вектора по п. 14 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 15 или п. 16,
(v) фармацевтической композиции по п. 18, и
(b) введение по меньшей мере одного из (i) - (v) нуждающемуся в этом субъекту.
22. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п. 20, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит
лимфоциты,
(b) обеспечение одного или более из
(i) TCR по любому из пп. 1-11,
(й) нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13,
(iii) вектора по п. 14 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 15 или п. 16,
(v) фармацевтической композиции по п. 18,
(iii)
(c) применение одного или более из (i) - (v) из стадии (Ь) по отношению к
лимфоцитам из стадии (а), за счет чего обеспечивается получение
модифицированных лимфоцитов,
(d) введение модифицированных лимфоцитов из стадии (с) нуждающимся в
этом субъекту или пациенту.
23. Способ выявления наличия рака у субъекта in vitro, предусматривающий:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток,
(b) приведение указанного образца в контакт с (i) TCR по любому из пп. 1-11,
(й) клеткой-хозяином по любому из п. 15 или п. 16 и/или (iii) фармацевтической композицией по п. 18, за счет чего образуется комплекс, и
(c) выявление комплекса,
где выявление комплекса свидетельствует о наличии рака у субъекта.
24. Применение TCR по любому из пп. 1-11, нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13 и/или вектора по п. 14 для получения модифицированных лимфоцитов.
24.
Формула изобретения, измененная по ст. 19 РСТ
Формула изобретения
1. Т-клеточный рецептор (TCR), содержащий:
(i) CDR3 вариабельного участка альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:1, или состоящий из нее,
и/или
(ii) CDR3 вариабельного участка бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2)
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID N0:2, или состоящий из нее,
при этом указанный TCR способен связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID N0:31) или ее МНС-связанной форме, предпочтительно эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID N0:32) или ее МНС-связанной форме.
2. TCR по п. 1, содержащий:
(i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или
(ii) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее.
(i)
3. TCR по любому из п. 1 или п. 2, дополнительно содержащий:
(i) константный участок альфа-цепи TCR и/или
(ii) константный участок бета-цепи TCR.
4. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:
(i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13,
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 11, 9 или 13, или состоящую из нее, и/или
(ii) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14,
или аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно на по меньшей мере 85% идентична, более предпочтительно на 90% или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.
5. TCR по любому из предыдущих пунктов, при этом указанный TCR выбран из нативного TCR, варианта TCR, фрагмента TCR или TCR-конструкции.
6. TCR-конструкция по п. 5, содержащая по меньшей мере одну альфа-цепь(-цепи) TCR и по меньшей мере одну бета-цепь(-цепи) TCR, ковалентно связанные друг с другом с образованием гетеродимеров или мультимеров TCR.
7. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий один или более слитых компонентов, необязательно выбранных из Fc-рецепторов; Fc-доменов, в том числе IgA, IgD, IgG, IgE и IgM; цитокинов, в том числе IL-2 или IL-15; токсинов; антител или их антигенсвязывающих
фрагментов, в том числе антител к CD3, к CD28, к CD5, к CD 16 или к CD56 или их антигенсвязывающих фрагментов; CD247- (СОЗ-дзета), CD28-, CD137-, СБ134-домена или их комбинаций, необязательно дополнительно содержащих по меньшей мере один линкер.
8. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:
(i) по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, определенную в любом из пп. 1-3, и
(й) по меньшей мере одну бета-цепь TCR, определенную в любом из пп. 1-3,
(iii) антитело или фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов,
где альфа-цепь(-цепи) TCR и бета-цепь(-цепи) TCR связаны друг с другом и слиты с указанным антителом или scFv необязательно посредством линкера.
9. TCR по п. 8, где указанный антиген выбран из CD3, CD28, CD5, CD16 или CD56.
10. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий по меньшей мере одну метку.
11. TCR по любому из предыдущих пунктов, который является растворимым.
12. Нуклеиновая кислота, кодирующая TCR по любому из предыдущих пунктов.
13. Нуклеиновая кислота по п. 12, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.
14. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из п. 12 или п. 13.
15. Клетка-хозяин, содержащая TCR по любому из пп. 1-11, последовательность нуклеиновой кислоты по п. 12 или п. 13 или вектор по п. 14.
16. Клетка-хозяин по п. 15, которая выбрана из лимфоцитов, в том числе без ограничения цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, естественных киллерных (NK) клеток, естественных киллерных (NKT) Т-клеток, гамма/дельта-Т-клеток.
17. Способ получения TCR по любому из пп. 1-11, предусматривающий:
(i) инкубацию клетки-хозяина по п. 15 или п. 16 в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR,
(ii) очистку указанного TCR.
18. Фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая одно или более из:
(i) TCR по любому из пп. 1-11,
(й) нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13,
(iii) вектора по п. 14 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 15 или п. 16,
и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества).
19. TCR по любому из пп. 1-11, нуклеиновая кислота по п. 12 или п. 13, вектор по п. 14 и/или клетка-хозяин по п. 15 или п. 16 для применения в качестве лекарственного препарата.
20. TCR по любому из пп. 1-11, нуклеиновая кислота по п. 12 или п. 13, вектор по п. 14 и/или клетка-хозяин по п. 15 или п. 16 для применения в выявлении, диагностике, прогнозировании, предупреждении и/или лечении рака.
21. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п. 20, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:
19.
(a) обеспечение одного или более из
(i) TCR по любому из пп. 1-11,
(и) нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13,
(iii) вектора по п. 14 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 15 или п. 16,
(v) фармацевтической композиции по п. 18, и
(b) введение по меньшей мере одного из (i) - (v) нуждающемуся в этом субъекту.
22. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п. 20, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты,
(b) обеспечение одного или более из (i) TCR по любому из пп. 1-11,
(й) нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13,
(iii) вектора по п. 14 и/или
(iv) клетки-хозяина по любому из п. 15 или п. 16,
(v) фармацевтической композиции по п. 18,
(c) применение одного или более из (i) - (v) из стадии (Ь) по отношению к
лимфоцитам из стадии (а), за счет чего обеспечивается получение
модифицированных лимфоцитов,
(d) введение модифицированных лимфоцитов из стадии (с) нуждающимся в
этом субъекту или пациенту.
23. Способ выявления наличия рака у субъекта in vitro, предусматривающий:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток,
(b) приведение указанного образца в контакт с (i) TCR по любому из пп. 1-11,
(й) клеткой-хозяином по любому из п. 15 или п. 16 и/или (iii) фармацевтической композицией по п. 18, за счет чего образуется комплекс, и
(c) выявление комплекса,
где выявление комплекса свидетельствует о наличии рака у субъекта.
24. Применение TCR по любому из пп. 1-11, нуклеиновой кислоты по любому из п. 12 или п. 13 и/или вектора по п. 14 для получения модифицированных лимфоцитов.
24.
HLA-A2
полож
донора
антиген-РНК
HLA-A2 (эндогенный)
HLA-2 представляет собой эндогенный ген
Фиг. 1
3000
н. в.н. B.EXSH. в.н. в. н. в.
]Н. В.Н. В.Н. В.н. В.Н. B.f^-njH. в.н. в. н. в.
III. п .iliiifalU
I I IL-2 Ш TNF-a IL-5 IL-10
g us
IL12p70 IL-4
IL~1b
н. в. = не выявляемый
'-/I
4,'
Фиг. 2
ы о
о о\ л-
<1 ы
8000-1
6000-
"g 4000-
Р-н
2000-
К562-А2(А2П0Л0Ж + PRAMEn0JI05K) Ме1624.38(А2полож- + PRAME1(tm))
Colo-678 (А2П0Л0Ж + PRAME0Tp) 647-V (А2П0Л0Ж'+ PRAME0Tp) SuDHL-6 (А2П0Л0Ж + PRAME0Tp ) Т2+специфичный пептид
? Без АРС
н. в. = не выявляемый
н. в. н. в. н. B.
н. в. н. в.н. в.н. в.н. в.. н. в. H. B.
T4.8-1-29
Без Т-клеток
Фиг. 3
WO 2017/216324 PCT/EP2017/064729
5/15
2000^ mm Клон реципиентных Т-клеток + T4.8-1 -29
iKnoH реципиентных Т-клеток без ivtPHK
Фиг. 5
Р-н
1000
[Uiiijiitiiiiiiniiiiniiiiiiiiiiiiiiiiiii uiiiiiiiii iiniiiii'iiiiiiiiiiiim цимй"
131 HLA-A2 аутологичные пептиды
Соотношение Е:Т
Фиг. 6
Положительный контроль
-1-29
Отрицательный контроль
К562 (PRAMEVA2) + PRAME-ivtPHK
Эффекторы: TCR+/CD8+ Т-клетки
•"РВМС + TCR Т4.8-1-29 *-РВМС ф TCR
Фиг. 8
f-ч
о аз
ф со
I §
С о
К562 (PRAMEVA2)
+ A2-ivtPHK + PRAME-ivtPHK
100
Эффекторы: TCR+/CD8+ Т-клетки
•-РВМС + TCR Т4.8-1-29 "г РВМС ф TCR
о о о
С о
100
К562 (PRAME+/A2) + A2-ivtPHK
Эффекторы:
TCR+/CD8+ Т-клетки *РВМС + TCR Т4.8-1-29 *-PBMCфTCR
Фиг. 8 (продолжение)
SEQ ID NO: II TCR альфа
1161: 120 180 240
III
SEQ ID NO: 12 TCR бета
ITA.TGQRVTI: LHSELNLSSL SKAE.TAHTGK SSRLBVSATF SYHQGVLSAT
RCS PRSGJDU3 VYWYQQSLDQ
ATLVCLA TGF' 'ЁшЪтЬЗШ WQNPRNHFRC QVQFYGLSEN ILYEILLGKA TLYAVLVSRL
120 180 24 0 300 3.1.1
SEQ ID NO: 33 (PRAME)
1Q 20
Фиг.
16000-
15000-
1400040003000200010000
"•л
Ш К562-В35 (PRAMEn0JI05K А20триц) а К562-А2 (PRAMEn0JI0> K А20триц) О К562-А2 (PRAME(tm) А2П0Л0Ж) + Ме1624.38 (PRAMEn0JI°* А2П0Л0Ж)
SkMel23(PRAMEn0JI05K А2П0Л0Ж) Только эффекторы
Нетрансдуцированные эффекторы
TCR- s
ы о
трансдуцированные |
эффекторы ?
Фиг. 14
Культивированные
совместно с нетрансдуцирован-ными эффекторами
Культивированные совместно с TCR-трансдуцированными
эффекторами
е =
О Н
ы о
Время в днях
о о\ л-
<1 ы
40001
3000
S 2000-
HRCEpC HRCEpC + VLD
ТОЛЬКО эффекторы
1000
-~r~
<4 <
Фиг. 16
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
(19)
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
(19)
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
(19)
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
(19)
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
(19)
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 68 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 68 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 68 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 68 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
<210> 17
<210> 17
<210> 17
<210> 26
<400> 34
<400> 34
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<210> 52
<400>
<400> 98
<210> 116
<400> 133
<400> 133
<400> 133
<400> 133
<400> 133
<400> 133
<400> 162
<400> 162
<400> 162
<400> 162
<210> 180
<210> 180
<210> 180
<210> 180
<210> 180
<210> 180
<210> 180
<400> 197
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 5 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 5 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324 5 PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
1/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
1/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
1/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
1/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
1/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
1/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
6/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
6/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
6/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
6/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
6/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
6/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
7/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
7/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
7/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
7/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
7/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
9/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
9/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
9/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
9/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
9/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
8/15
PCT7EP2017/064729
WO 2017/216324
12/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
12/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
13/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
13/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
13/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
15/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
15/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
15/15
PCT/EP2017/064729
WO 2017/216324
15/15
PCT/EP2017/064729