EA201892447A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892447 Полный текст описания [**] EA201892447 20170427 Регистрационный номер и дата заявки JP2016-091116 20160428 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок JP2017/016728 Номер международной заявки (PCT) WO2017/188378 20171102 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] СПОСОБ ОЧИСТКИ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, И СПОСОБ ИХ РАЗМНОЖЕНИЯ Название документа [8] C12N 5/00, [8] C12N 5/0735, [8] C12N 5/10 Индексы МПК [JP] Ивата Хироо, [JP] Конагая Сюхэи Сведения об авторах [JP] ТАКЕДА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ ЛИМИТЕД Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892447a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Описан способ культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (A) трехмерного культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в среде, которая содержит (1) фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста (EGF), и/или фактор, относящийся к семейству фактора роста фибробластов (FGF), и (2) агонист Wnt; способ получения островковых клеток панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (E) индукции дифференцировки панкреатических клеток-предшественников, культивированных вышеуказанным способом, в островковые клетки; и способ криоконсервации панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (F) заморозки панкреатических клеток-предшественников, культивированных вышеуказанным способом.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Описан способ культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (A) трехмерного культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в среде, которая содержит (1) фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста (EGF), и/или фактор, относящийся к семейству фактора роста фибробластов (FGF), и (2) агонист Wnt; способ получения островковых клеток панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (E) индукции дифференцировки панкреатических клеток-предшественников, культивированных вышеуказанным способом, в островковые клетки; и способ криоконсервации панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (F) заморозки панкреатических клеток-предшественников, культивированных вышеуказанным способом.


Евразийское (21) 201892447 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.27
(51) Int. Cl.
C12N 5/00 (2006.01) C12N 5/0735 (2010.01) C12N 5/10 (2006.01)
(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ,
ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, И СПОСОБ ИХ РАЗМНОЖЕНИЯ
(31) 2016-091116
(32) 2016.04.28
(33) JP
(86) PCT/JP2017/016728
(87) WO 2017/188378 2017.11.02
(71) Заявитель:
ТАКЕДА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ ЛИМИТЕД (JP)
(72) Изобретатель:
Ивата Хироо, Конагая Сюхэи (JP)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Описан способ культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (A) трехмерного культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в среде, которая содержит (1) фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста (EGF), и/ или фактор, относящийся к семейству фактора роста фибробластов (FGF), и (2) агонист Wnt; способ получения островковых клеток панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюри-потентных стволовых клеток, способ, включающий этап (E) индукции дифференцировки панкреатических клеток-предшественников, культивированных вышеуказанным способом, в островко-вые клетки; и способ криоконсервации панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (F) заморозки панкреатических клеток-предшественников, культивированных вышеуказанным способом.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-553197ЕА/17
СПОСОБ ОЧИСТКИ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СПОСОБ ИХ РАЗМНОЖЕНИЯ
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу культивирования
панкреатических клеток-предшественников, полученных из
плюрипотентных стволовых клеток, к способу для получения
островковых клеток из панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и к способу для
криоконсервации панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Дополнительно,
настоящее изобретение относится к среде для культивирования
панкреатических клеток-предшественников, полученных из
плюрипотентных стволовых клеток.
Известный уровень техники
Пересадка поджелудочной железы и пересадка панкреатического островка являются эффективными терапевтическими способами при диабете (в частности, при инсулинозависимом диабете); однако, малое число донорства органов, необходимость приема иммуносупрессоров для подавления иммунологического отторжения, и т.д., являются большими проблемами. Таким образом, для решения таких проблем широко проводятся исследования для индукции дифференцировки в клетки островка из плюрипотентных стволовых клеток, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
(iPS-клетки) и эмбриональные стволовые (ES) клетки, и
панкреатические клетки-предшественники, выделенные из
организмов, с использованием клеток, полученных от мышей и людей
(например, NPL 1).
Для получения клеток островка, плюрипотентным стволовым клеткам позволяют дифференцироваться в панкреатические клетки-предшественники через мезоэндодермальные клетки и полностью эндодермальные, а затем дифференцироваться в эндокринные клетки-предшественники и островковые клетки, такие как а-клетки, |3-клетки, и 8-клетки. Хотя для трансплантации панкреатического островка необходимо много островковых клеток, дифференцированные островковые клетки имеют низкий потенциал к пролиферации. Напротив, недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки имеют пролиферативный потенциал; однако, индукция их
дифференцировки требует долгого периода времени. Кроме того, когда плюрипотентные стволовые клетки смешивают с островковыми клетками, используемыми для пересадки, остро стоит вопрос относительно образования опухоли после трансплантации. Таким образом, существует множество исследовательских отчетов о попытках пролиферации панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.
В этих исследованиях, для пролиферации панкреатических
клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых
клеток, проводят совместное культивирование с использованием
различных питающих клеток (например, NPL 2 и NPL 3) . Однако
использование таких питающих клеток и использование сыворотки
означает использованием материалов с неизвестными компонентами,
и это является проблемой, при которой сложно стабильно получать
панкреатические клетки-предшественники с однородными
характеристиками из-за различия в компонентах между партиями. Кроме того, когда применяют питающие клетки и сыворотку, полученные от гетерологичных животных, существует риск, что они могут быть источником заражения неизвестными патогенами, полученными от гетерологичных животных.
NPL 2 сообщает, что клетки-предшественники, полученные из ES-клеток, размножали без дифференцировки, путем совместного культивирования клеток-предшественников с мезенхимальными клетками.
NPL 3 сообщает, что панкреатические клетки-предшественники, полученные из ES-клеток размножали без дифференцировки, путем совместного культивирования с эндотелиальными клетками или культивирования в присутствии EGFL7; однако, их пролиферативный потенциал был недостаточным.
Также описано, что панкреатические клетки-предшественники, выделенные из организма, пролиферируют при культивировании ех vivo, однако, не была достигнута достаточная пролиферация в случае панкреатических клеток-предшественников, которые не были получены из плюрипотентных стволовых клеток.
Например, PTL 1 описывает культивирование фрагментов панкреатической ткани, выделенных из организма с использованием специфической среды для культивирования клеток. Однако PTL 1 не описывает использование панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и клеточная популяция, использованная для культивирования, не является
гомогенной клеточной популяцией. Культивируют различные клеточные популяции, полученные из панкреатической ткани, и PTL 1 не описывает культивирование гомогенной популяции панкреатических клеток-предшественников.
Список ссылок
Патентная литература
PTL 1: JP5722835B
Непатентная литература
NPL 1: A Rezania et al. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32 (11): 1121-1133
NPL 2: JB Sneddon et al. Nature. 2012 Nov; 491 (7426): 765768
NPL 3: DI Kao et al. Stem Cell Reports. 2015 Feb; 4 (2) : 181-189
Сущность изобретения Техническая задача
Целью настоящего изобретения является создание способа
культивирования панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток, при этом
панкреатические клетки-предшественники, полученные из
плюрипотентных стволовых клеток, могут эффективно
пролиферировать с одновременным подавлением их дифференцировки.
Другой целью по настоящему изобретению является создание способа
для получения островковых клеток из панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
которые получены этим способом культивирования, и способа
криоконсервации панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Еще одной целью
по настоящему изобретению является создание среды для
культивирования, в которой могут эффективно пролиферировать
панкреатические клетки-предшественники, полученные из
плюрипотентных стволовых клеток, с одновременным подавлением их дифференцировки.
Решение проблемы
В результате обширных исследований для достижения
вышеуказанных целей, авторы настоящего изобретения обнаружили,
что вышеуказанные цели можно достичь путем культивирования
панкреатических клеток-предшественников, полученных из
плюрипотентных стволовых клеток, в форме клеточных агрегатов в среде, содержащей эпидермальный фактор роста (EGF) и R-спондин
1, или в среде, содержащей различные сочетания FGF-7 и ингибитора GSK (CHIR99021).
Настоящее изобретение было завершено после дополнительного
исследования на основании этих открытий. Настоящее изобретение
относится к способу культивирования панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
способу получения островковых клеток из панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
способу криоконсервации панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток, среде для
культивирования панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и т.д., описанному далее. В дальнейшем, описание "(1-1)" включает (1-1-А), (I-1-B), и т.д., и то же самое относится к другим.
(I) Способ культивирования панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток
(1-1) Способ культивирования панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
способ, включающий этап (А) трехмерного культивирования
панкреатических клеток-предшественников, полученных из
плюрипотентных стволовых клеток, в среде, содержащей (1) фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста (EGF), и/или фактор, относящийся к семейству фактора роста фибробластов (FGF), и (2) агонист Wnt.
(I-1-A) Способ в соответствии с (1-1), где агонист Wnt представляет собой фактор, относящийся к семейству Wnt, фактор, относящийся к семейству R-спондина, норрин и/или ингибитор GSK.
(I-1-B) Способ в соответствии с (1-1), где агонист Wnt включает, по меньшей мере, один фактор, выбранный из группы, состоящей из Wnt-1/Int-l, Wnt-2/Irp, Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-lOa, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, CHIR99021, SB216763, SB415286, A1070722, BIO, BIO-ацетоксима, индирубин-З'-оксима, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TWS 119, миРНК, лития, кенпауллона, R-спондина 1, R-спондина 2, R-спондина 3, R-спондина 4 и норрина.
(1-2) Способ в соответствии с (1-1), где агонист Wnt представляет собой белок, относящийся к семейству R-спондина, и/или ингибитор GSK.
(I-2-A) Способ в соответствии с (1-1), (I-1-A), (I-1-B),
или (1-2), где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), представляет собой фактор, связывающийся с ErbBl, и/или фактор, связывающийся с FGFR2IIlb.
(I-2-B) Способ в соответствии с (1-1), (I-1-A), (I-1-B), или (1-2), где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), включает, по меньшей мере, один фактор, выбранный из группы, состоящей из EGF, трансформирующего фактора роста а (TGF-а), амфирегулина, гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста, фактора роста, полученного из шванномы, бетацеллюлина, фактора роста поксвируса, кислых факторов роста фибробластов (aFGF, FGF-1), основных факторов роста фибробластов (bFGF, FGF-2), FGF-3, факторов роста кератиноцитов (KGF, FGF-7), FGF-10 и FGF-22.
(1-3) Способ в соответствии с(1-1), где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), представляет собой EGF, и агонист Wnt (2) представляет собой R-спондин 1.
(1-4) Способ в соответствии с(1-2), где фактор, относящийся к семейству EGF, представляет собой EGF, фактор, относящийся к семейству FGF, представляет собой FGF-7, белок, относящийся к семейству R-спондина, представляет собой R-спондин 1, и ингибитор GSK представляет собой CHIR99021.
(1-5) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-4), где среда представляет собой бессывороточную среду.
(I-б) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-5), где культивирование представляет собой культивирование в отсутствие питающих клеток.
(1-7) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (I-б), где плюрипотентные стволовые клетки представляет собой iPS-клетки или ES-клетки.
(1-8) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-7), где плюрипотентные стволовые клетки получены от человека.
(1-9) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-8), где
трехмерное культивирование представляет собой суспензионное
культивирование агрегатов панкреатических клеток-
предшественников .
(1-10) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-9), который дополнительно включает этап (В) дополнительного субкультивирования панкреатических клеток-предшественников,
полученных на этапе А.
(1-11) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-10) для применения для очистки панкреатических клеток-предшественников.
(1-12) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-11), который дополнительно включает этап (С) получения iPS-клеток, где панкреатические клетки-предшественники, полученные из iPS-клеток, применяют на этапе А.
(1-13) Способ в соответствии с любым с (1-1) до (1-12), который дополнительно включает этап (D) индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические клетки-предшественники, где панкреатические клетки-предшественники применяют на этапе А.
(II) Способ получения островковых клеток из панкреатических
клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых
клеток
(II-1) Способ получения островковых клеток из
панкреатических клеток-предшественников, полученных из
плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (Е)
индукции дифференцировки панкреатических клеток-
предшественников, культивированных способом в соответствии с любым с (1-1) до (1-13), в островковые клетки.
(III) Способ криоконсервации панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток
(III-1) Способ криоконсервации панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
способ, включающий этап (F) заморозки панкреатических клеток-
предшественников, культивированных способом в соответствии с
любым с (1-1) до (1-13).
(IV) Среда для культивирования панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток
(IV-1) Среда для культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, среда, содержащая (1) фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF, и (2) агонист Wnt.
(IV-1-A) Среда в соответствии с (IV-1), где агонист Wnt представляет собой фактор, относящийся к семейству Wnt, фактор, относящийся к семейству R-спондина, норрин и/или ингибитор GSK.
(IV-1-B) Среда в соответствии с (IV-1), где агонист Wnt включает, по меньшей мере, один фактор, выбранный из группы, состоящей из Wnt-1/Int-l, Wnt-2/Irp, Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4,
Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-lOa, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, CHIR99021, SB216763, SB415286, A1070722, BIO, BIO-ацетоксима, индирубин-З'-оксима, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TWS 119, миРНК, лития, кенпауллона, R-спондина 1, R-спондина 2, R-спондина 3, R-спондина 4 и норрина.
(IV-2) Среда в соответствии с (Г\/-1), где агонист Wnt представляет собой белок, относящийся к семейству R-спондина, и/или ингибитор GSK.
(IV-2-A) Среда в соответствии с (IV-1), (IV-l-A), (IV-1-B), или (IV-2), где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), представляет собой фактор, связывающийся с ErbBl, и/или фактор, связывающийся с FGFR2IIlb.
(IV-2-B) Среда в соответствии с (IV-1), (IV-l-A), (IV-1-B), или (IV-2), где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), включает, по меньшей мере, один фактор, выбранный из группы, состоящей из EGF, трансформирующего фактора роста а (TGF-а), амфирегулина, гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста, фактора роста, полученного из шванномы, бетацеллюлина, фактора роста поксвируса, кислых факторов роста фибробластов (aFGF, FGF-1), основных факторов роста фибробластов (bFGF, FGF-2), FGF-3, факторов роста кератиноцитов (KGF, FGF-7), FGF-10 и FGF-22.
(IV-3) Среда в соответствии с (VI-1), где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), представляет собой EGF, и агонист Wnt (2) представляет собой R-спондин 1
(IV-4) Среда в соответствии с (IV-2), где фактор, относящийся к семейству EGF, представляет собой EGF, фактор, относящийся к семейству FGF, представляет собой FGF-7, белок, относящийся к семейству R-спондина, представляет собой R-спондин 1, и ингибитор GSK представляет собой CHIR99021.
(IV-5) Среда в соответствии с любым с (IV-1) до (IV-4), которая не содержит сыворотки.
(IV-б) Среда в соответствии с любым с (IV-1) до (IV-5) для культивирования в отсутствие питающих клеток.
(IV-7) Среда в соответствии с любым с (IV-1) до (IV-б), где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой iPS-клетки или ES-клетки.
(IV-8) Среда в соответствии с любым с (IV-1) до (IV-7), где плюрипотентные стволовые клетки получены от человека.
(IV-9) Среда в соответствии с любым с с (IV-1) до (IV-8), которая дополнительно содержит, по меньшей мере, один компонент выбранный из группы, состоящей из ингибитора сигнала Sonic Hedgehog, ингибитора рецептора TGF-|3 и ретиноевой кислоты.
(IV-10) Среда в соответствии с любым с (IV-1) до (IV-9) для применения для очистки панкреатических клеток-предшественниов.
(V) Применение панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в среде для культивирования
(V-1) Применение компонента в соответствии с любым с (IV-1) до (IV-4) и (IV-9) в среде для культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.
(VI) Фармацевтический препарат
(VI-1) Фармацевтический препарат, содержащий
панкреатические клетки-предшественники, культивированные
способом в соответствии с любым с (1-1) до (1-13) .
(VII) Культивирование
(VII-1) Изолированное культивирование, включающее (1) фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF, (2) агонист Wnt, и 5 масс% или больше, 10 масс% или больше, 15 масс% или больше, или 2 0 масс% или больше панкреатических клеток-предшественников. Полезные эффекты изобретения
В соответствии со способом культивирования по настоящему изобретению, можно эффективно размножать панкреатические клетки-предшественники, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, которые представляют собой популяцию клеток с высокой гомогенностью, с одновременным подавлением их дифференцировки, в условиях отсутствия сыворотки и питающих клеток. Поскольку культивирование проводят в условиях отсутствия сыворотки и питающих клеток, различие сред между партиями может быть снижено, и можно получать панкреатические клетки-предшественники со стабильным качеством.
Кроме того, поскольку способ культивирования по настоящему изобретению можно использовать для субкультивирований, можно размножать большие количества панкреатических клеток-предшественников, и панкреатические клетки-предшественники можно
очищать в процессе субкультивирования.
Кроме того, в панкреатических клетках-предшественниках, размноженных способом культивирования по настоящему изобретению, можно индуцировать дифференцировку в островковые клетки, в том числе в инсулин-продуцирующие клетки (|3-клетки) .
Панкреатические клетки-предшественники, размноженные
способом культивирования по настоящему изобретению, можно криоконсервировать, и можно размножать даже после размораживания также, как перед заморозкой.
Поскольку можно размножать большие количества
панкреатических клеток-предшественников способом культивирования по настоящему изобретению, способ культивирования является выгодным, потому что можно проводить скрининг клеток (например, удалять недифференцированные клетки или опухолевые клетки) и оценивать безопасность на стадии панкреатических клеток-предшественников; потому что время производства и себестоимость панкреатических клеток-предшественников могут быть уменьшены; и потому что можно поставлять большие количества островковых клеток с гарантированным качеством за короткий период времени.
Панкреатические клетки-предшественники, размноженные
способом культивирования по настоящему изобретению, или островковые клетки, полученные путем индукции дифференцировки из панкреатических клеток-предшественников, размноженных способом культивирования по настоящему изобретению, подходят в качестве клеточных фармацевтических препаратов или устройств для лечения диабета (типа 1 или типа 2) таким образом, что их имплантируют в пораженную область напрямую или после инкапсуляции.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены результаты анализа путем проточной цитометрии после индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники.
На фиг. 2 представлены фотографии, показывающие изображения фазово-контрастного микроскопа для клеток, культивированных в течение б суток в присутствии каждого фактора или их сочетания после индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники .
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий изменения числа клеток со временем, когда клетки культивируют в присутствии каждого фактора или их сочетания после индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники. На
вертикальной оси представлено относительная величина числа клеток, когда время начала культивирования отмечено как 1.
На фиг. 4 представлены результаты анализа клеток (не пересаженных) путем проточной цитометрии, культивированных в течение б суток в присутствии каждого фактора или их сочетания после индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники .
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий изменения числа клеток со временем, когда клетки культивируют путем адгезии после индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники. На вертикальной оси представлено относительная величина числа клеток, когда время начала культивирования отмечено как 1.
Фиг. б представляет собой график, показывающий уровень (%) SOX9- и BrdU-положительных клеток в каждом пассаже.
На фиг. 7 представлены результаты анализа клеток в каждом пассаже путем проточной цитометрии.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий уровень (%) SOX9- и PDX1- положительных клеток в каждом пассаже.
На фиг. 9 представлены фотографии, показывающие изображения фазово-контрастного микроскопа для клеточных агрегатов после пяти пассажей.
Фиг. 10 представляет собой график, показывающий изменения числа клеток со временем, когда клетки культивируют путем пассирования с интервалами в шесть суток после индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники. На вертикальной оси представлена относительная величина числа клеток, когда время начала культивирования отмечено как 1.
На фиг. 11 представлены фотографии, показывающие изображения иммуноокрашивания клеток после девятого пассажа.
На фиг. 12 представлены результаты анализа клеток после девятого пассажа путем проточной цитометрии.
На фиг. 13 представлены результаты анализа путем проточной цитометрии для клеток после индукции дифференцировки в островковые клетки.
Фиг. 14 представляет собой график, показывающий результаты теста на устойчивость к глюкозе на клетках после индукции дифференцировки в островковые клетки. На вертикальной оси представлено количество секретируемого С-пептида (пМ/25б агрегатов, 0,5 мл, 0,5 часа).
На фиг. 15 представлены фотографии, показывающие изображения иммуноокрашивания клеток после индукции дифференцировки в островковые клетки.
Фиг. 16 представляет собой график, показывающий коэффициент выживаемости клеток (%), когда панкреатические клетки-предшественники были заморожены с использованием различных растворов для криоконсервации, хранились при -19б°С, а затем были разморожены.
Фиг. 17 представляет собой график, показывающий изменения
числа клеток со временем, когда клетки, полученные из
размороженных после криоконсервации клеток, и не
криоконсервированные клетки культивируют в средах для размножения панкреатических клеток-предшественников. На вертикальной оси представлена относительная величина числа клеток, когда время начала культивирования отмечено как 1.
Фиг. 18 представляет собой график, показывающий изменения числа клеток со временем, когда панкреатические клетки-предшественники, полученные из линии RPChiPS771-2, культивируют с добавлением четырех факторов (EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021). На вертикальной оси представлена относительная величина числа клеток, когда время начала культивирования отмечено как 1.
На фиг. 19 представлены результаты анализа путем проточной цитометрии, когда панкреатические клетки-предшественники, полученные из каждой человеческой клеточной линии iPS, культивируют с добавлением четырех факторов (EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021).
Фиг. 2 0 представляет собой график, показывающий изменения числа клеток со временем, когда панкреатические клетки-предшественники, полученные из каждой человеческой клеточной линии iPS, культивируют с добавлением от двух до четырех факторов. На вертикальной оси представлена относительная величина числа клеток, когда время начала культивирования отмечено как 1.
Фиг. 21 представляет собой график, показывающий уровень (%) Ki67- и PDXl-положительных клеток, когда панкреатические клетки-предшественники, полученные из каждой человеческой клеточной линии iPS, культивируют с добавлением от двух до четырех факторов.
Настоящее описание включает содержание, изложенное в описании патентной заявки Японии №. 2016-091116 (поданной 28
апреля 2016 года), на которой основывается приоритет настоящей заявки.
Описание вариантов осуществления
Настоящее изобретение подробно описано далее.
В настоящем описании, термины "содержит" и "включает"
включают значение "по существу состоит из" и значение "состоит
из".
В настоящем описании, термин "культивирование" относится к поддержанию или/и пролиферации клеток в окружении in vitro. Термин "культивирование" относится к поддержанию или/и пролиферации клеток вне ткани или вне организма (например, в чашке или флаконе для клеточной культуры).
Плюрипотентные стволовые клетки
Плюрипотентные стволовые клетки представляют собой
стволовые клетки, которые обладают плюрипотентностью, т.е.
способностью дифференцироваться в любой из трех зародышевых
листков (эндодерму, мезодерму и эктодерму), и которые способны к
саморепликации. Плюрипотентные стволовые клетки конкретно не
ограничены. Примеры включают эмбриональные стволовые (ES)
клетки, клонированные полученные от эмбриона эмбриональные
стволовые (ntES) клетки, полученные путем пересадки ядра,
мультипотентные зародышевые стволовые клетки ("mGS-клетки"),
эмбриональные половые клетки ("EG-клетки"), индуцированные
плюрипотентные стволовые (iPS) клетки и т.д. Кроме того,
организм, из которого получают плюрипотентные стволовые клетки,
конкретно не ограничен. Примеры включают млекопитающих, таких
как люди, обезьяны, мыши, крысы, морские свинки, кролики,
коровы, свиньи, собаки, лошади, кошки, козы и овцы. Из них
предпочтительными являются плюрипотентные стволовые клетки,
полученные от человека. Плюрипотентные стволовые клетки, которые
можно использовать, включают коммерчески доступные
плюрипотентные стволовые клетки, которые получены от предопределенных организаций, и которые получены известным способом. ES-клетки и iPS-клетки можно предпочтительно использовать в качестве плюрипотентных стволовых клеток.
ES-клетки можно получать известным способом. ES-клетки, которые можно использовать, могут быть, например, клетками, полученными с использованием оплодотворенных яйцеклеток, которые получены в качестве материала при оплодотворении in vitro, иными чем клетки, полученные с использованием оплодотворенных
яйцеклеток, которые получены в качестве материала от матерей.
iPS-клетки можно получать известным способом, например, введением перепрограммирующих факторов в любые соматические клетки. Примеры перепрограммирующих факторов включают гены, такие как Oct3/4, Sox2, Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbxl5, ERas, ECAT15-2, Tell, бета-катенин, Lin28b, Salll, Sall4, Esrrb, Nr5a2, ТЬхЗ, и Glisl; и продукты генов. Эти перепрограммирующие факторы можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более факторов. Примеры комбинаций перепрограммирующих факторов
WO2009/075119, WO2009/101407, WO2009/126250, WO2010/009015, WO2010/050626, WO2010/102267,
WO2009/079007, WO2009/102983, WO2009/126251, WO2010/033906, WO2010/056831, WO2010/111409,
WO2009/091659, WO2009/114949, WO2009/126655, WO2010/033920, WO2010/068955, WO2010/111422,
WO2008/118820, WO2009/057831, WO2009/101084, WO2009/117439, WO2009/157593, WO2010/042800, WO2010/098419, WO2010/115050,
WO2010/124290, WO2010/147395, W02010/147612; Huangfu D et al. , Nat. Biotechnol. , 26:795-797 (2008); Shi Y et al. , Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008); Eminli S et al., Stem Cells. 26: 24672474 (2008); Huangfu D et al. , Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275
(2008) ; Shi Y et al., Cell Stem Cell, 3: 568-574 (2008); Zhao Y et al., Cell Stem Cell, 3:475-479 (2008); Marson A, Cell Stem Cell, 3:132-135 (2008); Feng В et al. , Nat. Cell Biol. 11:197203 (2009); Judson RL et al., Nat. Biotechnol., 27:459-461
(2009) ; Lyssiotis CA et al., Proc Natl Acad Sci U S A.106: 89128917 (2009); Kim JB et al., Nature. 461: 649-643 (2009); Ichida
(2008)
5: 491-503 (2009); Heng JC et al. , (2010); Han J et al. , Nature. 463: 1096-1100 (2010); Mali P et al., Stem Cells. 28: 713-720 (2010); и Maekawa M et al., Nature. 474: 225-229(2011).
Вышеуказанные соматические клетки конкретно не ограничены. Примеры включают соматические клетки плода, неонатальные соматические клетки, и зрелые здоровые и патологические соматические клетки; и также включают первично культивированные клетки, пересаженные клетки, и клетки устойчивой линии. Конкретные примеры соматических клеток включают (1) тканевые стволовые клетки (соматические стволовые клетки), такие как нейральные стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки,
мезенхимальные стволовые клетки, и стволовые клетки пульпы зуба;
(2) тканевые клетки-предшественники; и (3) дифференцированные клетки, такие как клетки крови (клетки периферической крови, клетки пуповинной крови и т.д.), лимфоциты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, мышечные клетки, фибробласты
(клетки кожи и т.д.), клетки волоса, клетки печени, клетки слизистой желудка, кишечные клетки, клетки селезенки, панкреатические клетки (панкреатические экзокринные клетки и т.д.), клетки головного мозга, клетки легкого, почечные клетки, и адипоциты.
Панкреатические клетки-предшественники
Панкреатические клетки-предшественники по настоящему изобретению относятся к клеткам, которые затем дифференцируются в островковые клетки. Панкреатические клетки-предшественники можно выявить, например, на основании того, являются ли клетки положительными по PDX1 (ген панкреатического дуоденального гомеобокса 1) (и положительными по S0X9).
Дополнительно, панкреатические клетки-предшественники по настоящему изобретению также можно выявлять на основании того, являются ли клетки отрицательными по NKX6.1, NGN3 (нейрогенин 3), и т.д.; однако, панкреатические клетки-предшественники по настоящему изобретению могут быть положительными по NKX6.1 и/или NGN3 .
Кроме того, в качестве индикаторов для панкреатических клеток-предшественников также можно использовать такие маркеры, как HNF6, HLXB9, PAX4 и/или NKX2-2.
Например, панкреатические клетки-предшественники по настоящему изобретению включают клетки, положительные по таким маркерам, как PDX1, HNF6 и HLXB9, или клетки, положительные по таким маркерам, как NKX6,1, NGN3, PAX4 и NKX2-2.
Панкреатические клетки-предшественники по настоящему
изобретению предпочтительно являются PDXl-положительными, и
более предпочтительно, PDXl-положительными и S0X9-
положительными.
Панкреатические клетки-предшественники по настоящему
изобретению особенно предпочтительно являются PDXl-
положительными, БОХЭ-положительными, и NKX6.1-отрицательными и/или ЫбЫЗ-отрицательными.
В другом варианте осуществления панкреатические клетки-
предшественники по настоящему изобретению особенно
предпочтительно являются PDXl-положительными, S0X9-
положительными, и NKX6.1-положительными и/или NGN3-
положительными.
Островковые клетки
Клетки панкреатического островка (островка Лангерганса) по
настоящему изобретению включают, по меньшей мере, одного
представителя из глюкагон-секретирующих а-клеток, инсулин-
секретирующих р-клеток, и соматостатин- секретирующих 8-клеток; и
предпочтительно включают, по меньшей мере, р-клетки. То, что
островковые клетки включают а-клетки, р-клетки, и 8-клетки, можно
подтверждать, например, при помощи иммуноокрашивания с
использованием антител к глюкагону, инсулину или С-пептиду, и
соматостатину, соответственно. р-клетки можно также выявлять
путем иммуноокрашивания с использованием антитела к С-пептиду. Р~
клетки можно также выявлять путем окрашивания дитизоном.
Островковые клетки могут дополнительно включать F-клетки,
секретирующие панкреатический полипептид, и клетки-
предшественники панкреатического островка.
Способ культивирования панкреатических клеток-
предшественников (Этап А)
Способ культивирования панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
по настоящему изобретению включает этап трехмерного
культивирования панкреатических клеток-предшественников,
полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в среде, содержащей (1) фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста (EGF), и/или фактор, относящийся к семейству фактора роста фибробластов (FGF), (далее в настоящем документе также обозначаемый как компонент (1)), и (2) агонист Wnt (далее в настоящем документе также обозначаемый как компонент (2)).
Панкреатические клетки-предшественники, используемые в способе культивирования по настоящему изобретению, получены из плюрипотентных стволовых клеток; то есть, они являются клетками, дифференцированными из плюрипотентных стволовых клеток.
Среда, применяемая в способе культивирования по настоящему изобретению, является средой, применяемой для культивирования клеток животных, которую применяют в качестве минимальной среды, и содержит, по меньшей мере, (1) фактор, относящийся к семейству FGF, и/или фактор, относящийся к семейству EGF, и (2) агонист Wnt. Минимальная среда конкретно не ограничена, при условии, что
ее можно использовать для культивирования клеток животных. Примеры включают среду IMDM, среду 199, и минимальную поддерживающую среду Игла (ЕМЕМ), среду а-МЕМ, среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), среду F12 Хэма, среду RPMI 1640, среду Фишера, среду MCDB 131, и их смеси. Таким образом, комбинированное использование компонента (1) и компонента (2) позволяет эффективно размножать панкреатические клетки-предшественники .
Фактор, относящийся к семейству EGF, конкретно не ограничен, при условии, что он может связываться с рецептором EGF и повышать его активность. Фактор, относящийся к семейству EGF, предпочтительно является фактором, связывающимся с ErbBl, который представляет собой рецептор EGF. Примеры включают EGF, трансформирующий фактор роста-а (TGF-а), амфирегулин, гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, фактор роста, полученный из шванномы, бетацеллюлин, и фактор роста поксвируса; и более предпочтительно EGF.
Эпидермальный фактор роста (EGF) представляет собой полипептид, состоящий из 53 аминокислот и способствующий пролиферации различных эпидермальных клеток и фибробластов, и имеет три внутримолекулярных дисульфидных связи. Эпидермальный фактор роста связывается с рецептором эпидермального фактора роста. Эпидермальный фактор роста также обозначается некоторыми японскими выражениями, такими как эпидермальный фактор пролиферации, фактор роста эпидермальных клеток, фактор роста кожи, и эпидермоидный фактор роста. Эпидермальный фактор роста по настоящему изобретению в широком смысле включает варианты природного эпидермального фактора роста, при условии, что они обладают природной активностью. Эпидермальный фактор роста может быть коммерческим продуктом или его можно получать известным способом.
Что касается фактора, относящегося к семейству FGF, то 22 типа FGF присутствуют у людей и мышей. FGF также обозначают как фактор роста фибробластов и гепарин-связывающий фактор роста. Примеры фактора, относящегося к семейству FGF, включают кислые факторы роста фибробластов (aFGF, FGF-1), основные факторы роста фибробластов (bFGF, FGF-2), FGF-3, факторы роста кератиноцитов (KGF, FGF-7), FGF-10, и FGF-22; предпочтительно, факторы, связывающиеся с FGFR2IIIb, который является рецептором FGF; и более предпочтительно, FGF-3, FGF-7, FGF-10 и FGF-22.
Агонист Wnt представляет собой вещество, которое активирует передачу сигнала через Wnt и которое активирует TCF/LEF-опосредованный перенос в клетки. Примеры включают вещества, индуцирующие активацию при связывании с рецепторами Frizzled, внутриклеточными ингибиторами деградации р-катенина, активаторами TCF/LEF, и т.п. Конкретные примеры включают факторы, относящиеся к семейству Wnt (например, белки, относящиеся к семейству Wnt, и низкомолекулярные соединения с тем же действием, что и семейство Wnt), факторы, относящиеся к семейству R-спондина (например, белки, относящиеся к семейству R-спондина (R-спондины от 1 до 4 и т.д.), низкомолекулярные соединения с тем же действием, что и семейство R-спондина) , норрин, и ингибиторы GSK; предпочтительно факторы, относящиеся к семейству R-спондина, и/или ингибиторы GSK; и более предпочтительно, белки, относящиеся к семейству R-спондина, и/или ингибиторы GSK.
Белок, относящийся к семейству Wnt, конкретно не ограничен. Примеры включают Wnt-1/Int-l, Wnt-2/Irp, Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-lOa, Wnt-10b/12, Wnt-11, и Wnt-16; и особенно Wnt-3a.
Ингибитор GSK конкретно не ограничен, при условии, что он является фактором, который ингибирует GSK-3P (гликоген синтазу киназу ЗР). Примеры включают CHIR99021, SB216763, SB415286, А1070722, BIO, BIO-ацетоксим, индирубин-З'-оксим, NSC 693868, ТС-G 24, TCS 2002, TWS 119, миРНК, литий, и кенпауллон; и предпочтительно CHIR99021.
Белок, относящийся к семейству R-спондина, предпочтительно является R-спондином 1. R-спондин 1 относится к семейству RSPO (RSP01-4) модуляторов Wnt, и представляет собой секретируемый белок, который регулирует передачу сигнала через Wnt/p-катенин. R-спондин 1 по настоящему изобретению в широком смысле включает варианты природного R-спондина 1, при условии, что что они обладают природной активностью. R-спондин 1 может быть коммерческим продуктом или его можно получать известным способом.
Среда содержит, по меньшей мере, два фактора, относящихся к семейству EGF, фактор, относящийся к семейству FGF, фактор, относящийся к семейству R-спондина (например, белок или низкомолекулярное соединение с тем же действием, что и семейство R-спондина), и ингибитор GSK. Среда может содержать 3 или
больше, или 4 или больше факторов, относящихся к семейству EGF, фактор, относящийся к семейству FGF, фактор, относящийся к семейству R-спондина (например, белок или низкомолекулярное соединение с тем же действием, что и семейство R-спондина), и ингибитор GSK.
Концентрация компонента (1) в среде конкретно не ограничена, при условии, что панкреатические клетки-предшественники могут пролиферировать. Например, концентрация компонента (1) предпочтительно составляет от 1 до 1000 нг/мл, и более предпочтительно, от 20 до 100 нг/мл. Кроме того, концентрация компонента (2) в среде конкретно не ограничена, при условии, что панкреатические клетки-предшественники могут пролиферировать. Например, концентрация компонента (2) предпочтительно составляет от 10 до 2000 нг/мл или от 0,1 до 50 мкМ, и более предпочтительно 200 до 1000 нг/мл или от 1 до 10 мкМ. Если среда в качестве ингибитора GSK содержит CHIR99021, концентрация CHIR99021 предпочтительно составляет от 1 до 20 мкМ, и более предпочтительно от 3 до 10 мкМ.
Концентрация эпидермального фактора роста в среде конкретно
не ограничена, при условии, что панкреатические клетки-
предшественники могут пролиферировать. Например, концентрация
эпидермального фактора роста предпочтительно составляет от 1 до
1000 нг/мл, и более предпочтительно, от 20 до 100 нг/мл. Кроме
того, концентрация R-спондина-! в среде конкретно не ограничена,
при условии, что панкреатические клетки-предшественники могут
пролиферировать. Например, концентрация R-спондина-!
предпочтительно составляет от 10 до 2000 нг/мл, и более предпочтительно от 200 до 1000 нг/мл.
Среда, применяемая в настоящем изобретении, предпочтительно дополнительно содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из ингибитора сигнала Sonic Hedgehog, ингибитора рецептора TGF-|3, и ретиноевой кислоты.
Ингибитор сигнала Sonic Hedgehog конкретно не ограничен, при условии, что он является фактором, который может ингибировать сигналы Sonic Hedgehog. Конкретные примеры включают SANT-1, джервин, циклопамин-KAAD, и т.п.
Ингибитор рецептора TGF-|3 конкретно не ограничен, при условии, что он является фактором, который может ингибировать функцию рецепторов TGF-|3. Конкретные примеры включают LDN19318 9, D4476, LY2157299, LY364947, SB525334, SB431542, SD208, и т.п.
Дополнительно, ингибиторы сигнала BMP, такие как дорсоморфин и Ноггин, также можно использовать вместо ингибитора рецептора TGF-p. Когда проводят длительное культивирование с повторяющимися пассажами, желательно добавить в среду ингибитор рецептора TGF-p и/или ингибитор сигнала BMP.
В качестве ретиноевой кислоты особенно предпочтительно использовать полностью транс-ретиноевую кислоту.
Дополнительно, среда, применяемая в настоящем изобретении, может содержать ингибитор ROCK (Rho-ассоциированная образующая суперспираль киназа/Кпо-связывающая киназа). Желательно, чтобы ингибитор ROCK добавляли в среду только через 1 или 2 суток после пассажа.
Ингибитор ROCK конкретно не ограничен, при условии, что он является фактором, который может ингибировать функцию ROCK. Конкретные примеры включают Y-27632, фасудил (или НА1077), Н-1152, Wf-536, Y-30141, и т.п.
Среда, применяемая в настоящем изобретении, может содержать сыворотку или может быть бессывороточной; предпочтительной является бессывороточная среда.
Среда, применяемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать заменители сыворотки (например, альбумин, трансферрин, нокаутный заменитель сыворотки (KSR), жирную кислоту, инсулин, предшественник коллагена, микроэлемент, 2-меркаптоэтанол, З'-тиолглицерин, и ITS-добавку). Заменители сыворотки можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более заменителей.
Среда, применяемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать одно или несколько веществ из В27-добавки, Ы2-добавки, липидов, глюкозы, аминокислот (не относящихся к незаменимым аминокислотам и т.д.), L-глутамина, глутамакса (Thermo Fisher Scientific), витаминов, факторов роста, цитокинов, антибиотиков, антиоксидантов, пировиноградной кислоты, буферов, неорганических солей, и т.д.
В качестве среды, применяемой в настоящем изобретении, желательно использовать среду с химически определенным составом, которая не содержит материалов с неизвестными компонентами, таких как сыворотка, поэтому можно снизить различия в средах между партиями, и можно получать панкреатические клетки-предшественники со стабильным качеством.
рН среды, применяемой в настоящем изобретении, в основном,
составляет от 7,0 до 7,8, и предпочтительно, от 7,2 до 7,6. Для того чтобы предотвратить загрязнение перед использованием, среду предпочтительно стерилизуют таким способом, как фильтрация, УФ-облучение, тепловая стерилизация, или радиация.
Среду, применяемую в настоящем изобретении, можно получать в форме раствора, в сухой форме, или в концентрированной форме (например, от 2х до ЮООх) . Среду в концентрированной форме можно использовать после надлежащего разведения до подходящей концентрации. Жидкость, которую используют для разведения среды в сухой форме, или в концентрированной форме, подходящим образом выбрана из воды, раствора буфера, физиологического раствора, и т.д.
Панкреатические клетки-предшественники по настоящему изобретению подвергают трехмерному культивированию. Трехмерное культивирование, упомянутое в настоящем документе, представляет собой способ культивирования, при котором проводят культивирование с толщиной в продольном направлении, в отличие от двухмерного культивирования, при котором проводят культивирование в монослое. Можно эффективно размножать панкреатические клетки-предшественники при проведении такого трехмерного культивирования. В качестве трехмерного способа культивирования, могут быть широко использованы известные способы без ограничения, при условии, что панкреатические клетки-предшественники могут размножаться. В частности, предпочтительным является культивирование в суспензии с использованием клеточных агрегатов панкреатических клеток-предшественников .
Способ культивирования, который формирует клеточные агрегаты панкреатических клеток-предшественников, объясняется далее.
Сначала, панкреатические клетки-предшественники
диссоциируют в диспергированные клетки (одиночные клетки или
массу из нескольких клеток). Диссоциацию в диспергированные
клетки можно проводить путем обработки с использованием
ферментов, таких как трипсин и коллагеназа, или хелатирующих
средств, таких как ЭДТА, или механическим способом, таким как
пипеттирование. Панкреатические клетки-предшественники,
диссоциировавшие в диспергированные клетки, суспендируют в среде, и высаживают в контейнер для культивирования с концентрацией клеток предпочтительно от 10 до 10000
клеток/лунку, и более предпочтительно, от 300 до 3000 клеток/лунку. Затем, клетки оставляют в этом состоянии в течение определенного периода времени (например, от 12 до 3 6 часов), тем самым формируя агрегаты. Размер (диаметр) агрегата, как правило, приблизительно составляет от 50 до 500 мкм, и предпочтительно приблизительно от 100 до 200 мкм. Количество клеток на агрегат, как правило, приблизительно составляет от 100 до 5000, и предпочтительно приблизительно, составляет от 500 до 2000.
В способе культивирования, который формирует клеточные агрегаты панкреатических клеток-предшественников, можно использовать контейнер для культивирования с лунками для культивирования с емкостью, например, от 0,001 до 10 мкл/лунку, от 0,001 до 1 мкл/лунку, от 0,005 до 0,5 мкл/лунку, от 0,01 до 0,5 мкл/лунку или от 0,01 до 0,1 мкл/лунку. Кроме того, предпочтительно использовать контейнеры для культивирования с такой формой лунок для культивирования, которая позволяет клеткам опускаться на дно и легко формировать агрегаты, например, полусферические лунки для культивирования с нижней частью, расширенной в направлении дна, или цилиндрические лунки для культивирования с полусферической нижней частью. Диаметр лунки для культивирования в контейнере для культивирования составляет, например, от 200 до 800 мкм или от 400 до 800 мкм. Кроме того, глубина такой лунки для культивирования составляет, например, от 400 до 1000 мкм или от 4 00 до 8 00 мкм. Множество панкреатических клеток-предшественников можно получать с использованием многолуночного контейнера для культивирования, имеющего множество лунок с вышеописанной формой.
Что касается контейнера для культивирования для формирования клеточных агрегатов панкреатических клеток-предшественников, для того чтобы проводить неадгезивное культивирование, поверхность контейнера для культивирования можно подвергать обработке во избежание адгезии клеток (например, контейнер для культивирования, сделанный из пластика (например, полистирола) который подвергли обработке во избежание адгезии клеток), но предпочтительно, поверхность сделана из материала, который позволяет культивировать клетки без адгезии. Такой материал предпочтительно является гидрофильным материалом с трехмерной структурой без цитотоксичности, и более предпочтительно прозрачным материалом, чтобы облегчить наблюдение за состоянием культивирования. Кроме того,
предпочтительными также являются гидрогели, содержащие гидрофильный полимер, используемый для неадгезивной обработки клеток.
Примеры материала, используемого для получения гидрогелей,
включают продукты синтетических полимеров, перекрестно сшитые
физическим или химическим путем, такие как поливиниловый спирт,
поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, поли-2-гидроксиэтил
метакрилат, поли-2-гидроксиэтил акрилат, полиакриламид,
полиакриловая кислота, и полиметакриловая кислота; перекрестно-сшитые продукты таких синтетических полимеров, полученные при помощи облучения; перекрестно-сшитые сополимеры из мономеров, составляющих вышеуказанные полимеры; и другие различные синтетические полимерные материалы, которые могут образовывать гидрогели. Кроме того, также возможно использовать натуральные полимеры, в том числе полисахариды (например, агарозу, альгиновую кислоту, декстран, и целлюлозу) и их производные; и перекрестно-сшитые продукты белков, таких как желатин и альбумин, и их производные. Из них в качестве материала, используемого для получения гидрогелей, предпочтительным является агарозный гель.
Примеры материала, применяемого для обработки, для того чтобы клетки можно было культивировать без адгезии, включают вышеупомянутые материалы для производства гидрогелей, полимерные материалы, содержащие в качестве главного компонента 2-метакрилоилоксиэтил фосфорилхолин (МРС), и т.п.
Условия культивирования в способе культивирования по настоящему изобретению могут быть такими же, как условия для обычного культивирования клеток. Температура культивирования составляет предпочтительно от 35 до 39°С, и более предпочтительно 37°С. Концентрация 02 составляет, как правило, приблизительно от 5 до 20%. Концентрация С02 составляет, как правило, приблизительно от 1 до 10%, и предпочтительно, приблизительно 5%. Такое культивирование можно проводить с использованием известного С02-инкубатора.
Время культивирования конкретно не ограничено. Например, время культивирования предпочтительно составляет от 3 до 10 суток, и более предпочтительно от 5 до 7 суток. Кроме того, предпочтительно заменять среду с интервалами от одних до трех суток во время культивирования.
Способ культивирования по настоящему изобретению
предпочтительно проводят в отсутствие питающих клеток. Поскольку способ культивирования по настоящему изобретению позволяет культивировать в отсутствие питающих клеток, не происходит примешивания неизвестных компонентов, и панкреатические клетки-предшественники с однородными свойствами могут стабильно размножаться.
Способом культивирования по настоящему изобретению можно эффективно размножать панкреатические клетки с пролиферативным потенциалом, большим, чем потенциал клеток, дифференцированных в островковые клетки и другие функциональные клетки, такие как клетки печени, нервные клетки, и панкреатические экзокринные клетки, и, таким образом, удобно использовать для очистки панкреатических клеток-предшественников.
Субкультивирование (Этап В)
В предпочтительном варианте осуществления способа культивирования по настоящему изобретению, способ дополнительно содержит этап субкультивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных на этапе А.
Субкультивирование можно проводить, собирая агрегаты
панкреатических клеток-предшественников, культивированных
вышеописанным способом, диссоциируя агрегаты на диспергированные клетки, высаживая диспергированные клетки в новую среду, и культивируя их. Диссоциация на диспергированные клетки, высаживание клеток, среда, способ культивирования, и т.д., те же, что и описанные выше.
Число пассажей составляет, например, от 1 до 10, от 1 до 5, или 2 или 3; и предпочтительно 3 или больше. В настоящем описании, первое культивирование обозначено как нулевой пассаж.
В способе культивирования по настоящему изобретению,
пролиферативный потенциал панкреатических клеток-
предшественников сохраняется, даже когда их субкультивируют; таким образом, можно получать большие количества панкреатических клеток-предшественников. Кроме того, поскольку число пассажей увеличивается, очистка панкреатических клеток-предшественников также улучшается.
Этап получения iPS-клеток (Этап С)
Способ культивирования по настоящему изобретению может дополнительно включать этап получения iPS-клеток.
Примеры способа получения iPS-клеток включают способы, описанные выше в разделе "Плюрипотентные стволовые клетки". iPS
клетки, полученные на этом этапе, можно дифференцировать в панкреатические клетки-предшественники, и панкреатические клетки-предшественники можно использовать для культивирования на этапе А.
В настоящем изобретении, когда используют плюрипотентные стволовые клетки, отличные от iPS-клеток, вместо iPS-клеток на этом этапе можно получать другие плюрипотентные стволовые клетки.
Этап индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники (Этап D)
Способ культивирования по настоящему изобретению может дополнительно включать этап индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические клетки-предшественники .
Панкреатические клетки-предшественники, дифференцированные на этом этапе, можно использовать для культивирования на этапе А.
На этапе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические клетки-предшественники, композицию раствора для культивирования можно менять со временем таким образом, чтобы имитировать процесс развития поджелудочной железы in vivo. Кроме того, этап индукции дифференцировки можно проводить путем культивирования в суспензии с использованием вышеописанных клеточных агрегатов или культивирования с адгезией.
В качестве такого способа, например, можно использовать способы, описанные в последующих документах, и версии этих способов, модифицированные подходящим образом. В соответствии со способом, описанным в ссылочном документе 2, плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в панкреатические клетки-предшественники, проводя стадии от 1 до 4.
Ссылочный документ 1: Rezania A, Bruin JE, Riedel MJ, Mojibian M, Asadi A, Xu J, Gauvin R, Narayan K, Karanu F, O'Neil JJ, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes 2012; 61: 2016-2029..
Ссылочный документ 2: Rezania A, Bruin JE, Arora P, Rubin A, Batushansky I, Asadi A, O'Dwyer S, Quiskamp N, Mojibian M, Albrecht T, Yang YH, Johnson JD, Kieffer TJ. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from
human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2014; 32: 11211133 .
Ссылочный документ 3: Hrvatin S, O'Donnell CW, Deng F, Millman JR, Pagliuca FW, Dilorio P, Rezania A, Gifford DK, Melton DA. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, P cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 3038-3043.
Ссылочный документ 4: Pagliuca FW, Millman JR, Gurtler M, Segel M, Van Dervort A, Ryu JH, Peterson QP, Greiner D, Melton DA. Generation of functional human pancreatic P cells in vitro. Cell. 2014; 159: 428-439..
Например, на начальной стадии предпочтительно добавлять активин А и Wnt3a, и также предпочтительно затем добавлять ретиноевую кислоту и ингибиторы сигнала hedgehog (например, SANT-1 и Cyclopamine-KAAD), факторы роста фибробластов, и т.д.
Кроме того, в процессе дифференцировки, для того чтобы имитировать процесс развития поджелудочной железы in vivo для получения панкреатических клеток-предшественников, можно добавлять в соответствующее время вещества, которые поддерживают недифференцированные свойства и способствуют пролиферации, вещества, которые подавляют пролиферацию и способствуют дифференцировке, белки, которые экспрессируются в поджелудочной железе in vivo, и т.д. Примеры таких веществ включают ингибиторы GSK-3P (Гликогенсинтаза Киназа ЗР) (например, CHIR99021), ингибиторы ALK (например, SB431542), ингибиторы сигнала Notch (например, DAPT), ингибиторы TGFP (например, LDN193189), ингибиторы сигнала АМРК и BMP (например, дорсоморфин), активаторы РКС (например, Pdbu), инсулиноподобный фактор роста-1, эпидермальные факторы роста, факторы роста гепатоцитов, глюкагоноподобный пептид-1, коммерчески доступные добавки, и т.п.
Этап индукции дифференцировки в островковые клетки (Этап Е)
Способ получения островковых клеток из панкреатических
клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых
клеток, по настоящему изобретению включает этап индукции
дифференцировки панкреатических клеток-предшественников,
культивированных вышеописанным способом, в островковые клетки.
На этапе дифференцировки панкреатических клеток-предшественников в островковые клетки, композицию раствора для культивирования можно менять со временем таким образом, чтобы имитировать процесс развития поджелудочной железы in vivo. Этап
индукции дифференцировки можно проводить путем культивирования в суспензии с использованием вышеописанных клеточных агрегатов.
В качестве такого способа, например, можно использовать способы, описанные в вышеуказанных ссылочных документах от 1 до 4, и версии этих способов, модифицированные подходящим образом. В соответствии со способом, описанным в ссылочном документе 2, панкреатические клетки-предшественники можно дифференцировать в островковые клетки, проводя стадии с 5 до 7.
Этап заморозки панкреатических клеток-предшественников (Этап F)
Способ криоконсервации панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
по настоящему изобретению включает этап заморозки
панкреатических клеток-предшественников, культивированных
вышеописанным способом.
Что касается панкреатических клеток-предшественников, можно использовать и клетки, культивированных вышеописанным способом культивирования, и дополнительно субкультивируемые клетки. Кроме того, желательно, чтобы панкреатические клетки-предшественники для криоконсервации были диссоциированы в диспергированные клетки. Способ для диссоциации панкреатических клеток-предшественников в диспергированные клетки является таким же, что и вышеописанный способ.
Раствор для криоконсервации конкретно не ограничен. Примеры
включают коммерчески доступные растворы для криоконсервации
(например, CELLBANKER (зарегистрированная торговая марка) 2
(Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), STEM-CELLBANKER
(зарегистрированная торговая марка) (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), и среду для заморозки StemSure (зарегистрированная торговая марка) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), среды для культивирования, к которым добавляют приблизительно от 5 до 2 0 об.% диметилсульфоксида (например, среда, используемая в вышеописанном способе культивирования), и т.п.
Криоконсервацию можно проводить путем замораживания, как правило, приблизительно от -70 до -19б°С, и предпочтительно от -10 0°С или ниже. Для длительного хранения, хранение можно проводить в жидком азоте, или в газообразной фазе над жидким азотом, в контейнере для хранения клеток в жидком азоте.
Криоконсервированные клетки можно размораживать путем быстрого нагревания на водяной бане, как правило, приблизительно
от 20 до 40°С, и предпочтительно приблизительно от 35 до 38°С.
Панкреатические клетки-предшественники, размноженные
способом культивирования по настоящему изобретению, сохраняют после криоконсервации пролиферативный потенциал, эквивалентный потенциалу до криоконсервации. Таким образом, ожидается, что этот способ будет применим к клеточным банкам панкреатических клеток-предшественников.
Примеры
Ниже приведены примеры для более подробного объяснения изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
В последующих примерах, когда не приведено название клеточной линии iPS, показаны экспериментальные результаты с использованием линии 253G1.
Получение агарозных микролунок
Агарозные микролунки получали с использованием 3D чашек Петри (произведены Microtissues, Inc.) на основании протокола, предоставленного производителем (http://www.funakoshi.co.jp/contents/5556). Применяли заливочную форму для 2 5 6-луночного гелевого планшета с диаметром лунок 4 00 мкм. Конкретно, агарозные микролунки получали следующим способом.
Сначала, подогретый раствор агарозы (агароза Lonza, 2,5% агароза/физиологический раствор) заливали в форму. Затем, форму охлаждали до комнатной температуры, и после превращения агарозы в гель, агарозные микролунки удаляли из формы. Агарозные микролунки переносили в 12-луночный полистироловый планшет для клеточной культуры, и добавляли среду (DMEM/F12) в непосредственной близости с агарозными микролунками, чтобы погрузить в нее планшет с агарозными микролунками. Планшет помещали в инкубатор (37°С, 5% С02) на одну ночь или больше, чтобы уравновесить планшет с агарозными микролунками со средой. Таким образом, получали агарозные микролунки с 256 лунками, каждая с цилиндрической частью (диаметр: 4 00 мкм) и полусферическим дном. Вышеописанный способ проводили в асептических условиях на чистом столе.
Образование агрегатов и индукция дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники
iPS-клетки (253G1, полученные из клеточного банка Riken) культивировали в среде Е8 (Thermo Fisher Scientific) от 3 до 4
суток с использованием контейнера для культивирования, покрытого Geltex (Thermo Fisher Scientific). После обработки с использованием TrypLE (Thermo Fisher Scientific) в условиях от 7 0 до 8 0% конфлюэнтности, клетки собирали в виде отдельных клеток. Клетки суспендировали в среде Е8, содержащей 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и высаживали в среднем по 2 50 0 клеток/лунку в 2 5 6-луночный планшет с агарозными микролунками, который получали, как описано выше, и помещали в одну лунку 12-луночного полистиролового планшета.
После того как планшет с агарозными микролунками оставляли в течение 10 минут для осаждения клеток на дно, добавляли среду
(среда Е8+ингибитор ROCK) в непосредственной близости с планшетом с агарозными микролунками, чтобы погрузить планшет в среду. Клетки культивировали при 37°С с 5% С02 в течение 24 часов
(5% С02, 37°С) для агрегации клеток, а затем культивировали в течение определенного периода времени для индукции дифференцировки. Конкретно, замену среды проводили таким образом, что среду отсасывали каждые сутки и добавляли новую среду, как описано ниже. Кроме того, композицию среды изменили на предопределенные сутки. Композицию среды и число суток культивирования в каждой среде определяли в соответствии с описанием A Rezania et al. Reversal of diabetes with insulin producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32 (11): 1121-33. Первая стадия (3 суток)
MCDB131 (Thermo Fisher Scientific)+1,5 г/л NaHC03 (Nacalai Tesque, Inc.)+0,5% обезжиренного БСА (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+2 мМ GlutaMax (Thermo Fisher Scientific)+10 мМ D-глюкозы (Nacalai Tesque, Inc.)+3 мкМ CHIR99021 (Tocris Bioscience)+100 нг/мл активина A (R &D Systems) (CHIR99021 добавляли к среде только на первые сутки).
Вторая стадия (2 суток)
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+2 мМ GlutaMax+Ю мМ О-глюкозы+50 нг/мл фактора роста фибробластов 7 (FGF-7, PeproTech)+0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich).
Третья стадия (2 суток)
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного бычьего сывороточного альбумина (обезжиренного БСА)+1/200 добавки ITS (Thermo Fisher Scientific)+2 мМ GlutaMax+20 мМ Б-глюкозы+50 нг/мл FGF-7+0,25 мкМ SANT-1 (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.)+0,1 мкМ LDN193189 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich)+0,2 мкМ TBP (активатор РКС; каталожный № 565740; EMD Chemicals Inc.)+0,25 мМ аскорбиновой кислоты.
Четвертая стадия (2 суток)
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки ITS+2 мМ GlutaMax+20 мМ Б-глюкозы+50 нг/мл FGF-7+0,25 мкМ SANT-1+0,2 мкМ LDN193189+0,1 мкМ ретиноевой кислоты+0,1 мкМ ТВР+0,25 мМ аскорбиновой кислоты.
TBP: ((2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-
пентадиеноиламино)бензолактам.
На фиг. 1 представлены результаты анализа путем проточной цитометрии для клеток, полученных вышеописанным культивированием с первой по четвертую стадии. На фиг. 1, SOX9 является маркером панкреатических клеток-предшественников, BrdU является маркером клеточной пролиферации (аналог нуклеиновой кислоты для маркировки ядер клеток с пролиферативным потенциалом), и PDX1 является маркером панкреатических клеток-предшественников и островковых клеток. Добавляли BrdU в раствор для культивирования, и проводили культивирование в течение 24 часов, с последующим окрашиванием и анализом проточной цитометрией. В качестве первичных антител применяли козлиное антитело к PDX1 (R &D systems), кроличье антитело к S0X9 (Merck Millipore) и мышиное антитело к BrdU (Dako). В качестве вторичных антител применяли FITC-меченое антитело к IgG мыши (Thermo Fisher Scientific), РЕ-меченое антитело к IgG козы (Thermo Fisher Scientific), FITC-меченое антитело к IgG кролика(BD Biosciences), и РЕ-меченое антитело к IgG мыши (BD Biosciences). Для измерения использовали Guava (зарегистрированная торговая марка) easyCyte (Merck Millipore).
Фиг. 1 указывает, что приблизительно 60% клеток
дифференцировались в PDXl-положительные панкреатические клетки,
и что после пролиферации было приблизительно 30% SOX9/BrdU-
положительных панкреатических клеток-предшественников. В
результате получали негомогенную клеточную популяцию.
Предполагали, что были недифференцированные клетки,
панкреатические клетки-предшественники (SOX9- и PDXl-положительные, и NKX6.1-отрицательные клетки), и клетки, созревшие в эндокринные клетки.
Размножение панкреатических клеток-предшественников
Клеточные агрегаты, полученные путем вышеописаннного культивирования со стадиями от первой до четвертой, диспергировали в отдельные клетки с использованием ферментативного раствора для диспергирования клеток TrypLE
(Thermo Fisher Scientific). Клетки суспендировали в следующей среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и высаживали по 1000 клеток/лунку
(1000x256=2,56x105/планшет) в 2 5 6-луночный планшет с агарозными микролунками, помещенный в лунку 12-луночного планшета. После того как планшет с агарозными микролунками оставляли в течение 10 минут для осаждения клеток на дно, добавляли следующую среду в непосредственной близости с агарозными микролунками, чтобы погрузить планшет в среду. После этого проводили культивирование в течение б суток при 37°С с 5% С02. Смену среды проводили через сутки.
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки ITS+2 мМ GlutaMax+2 0 мМ Б-глюкозы+50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+200 нг/мл r-спондина 1 (RSPD1, R &D Systems)+0,25 мкМ SANT-1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+0,2 мкМ LDN193189 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+0,1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich)
На фиг. со 2 no 4 показаны результаты. На фиг. 3, клетки пересаживали один раз через б суток. На фиг. 4, добавляли BrdU в раствор для культивирования, и проводили культивирование в течение 2 4 часов, с последующим окрашиванием и анализом проточной цитометрией. Клетки, размножавшиеся в течение 24-часового культивирования, были мечены BrdU. На фиг. 4, SOX9 является маркером панкреатических клеток-предшественников. Фиг. 2 и 3 указывают, что клетки хорошо размножаются, когда добавлены r-спондин 1 и EGF. Далее, фиг. 4 указывает, что соотношение ЭОХ9/В^и-положительных клеток было наивысшим, когда были добавлены r-спондин 1 и EGF. Уровень S0X9- и PDXl-положительных панкреатических клеток-предшественников был повышен (от 26,3% до 57,5%) по сравнению с уровнем до культивирования, и отбор в панкреатические клетки-предшественники прогрессировал.
Клетки, полученные путем вышеописаннного культивирования со стадиями от первой до четвертой, присоединялись к субстрату планшета с плотностью 20000 или 40000 клеток/см2 на б-луночный планшет, покрытый Geltrex, и было проведено адгезионное
культивирование тем же способом культивирования, что и способ, описанный выше в "Размножении панкреатических клеток-предшественников". Клетки культивировали в течение 12 суток при 37°С с 5% С02 • Клетки пересаживали через б суток после культивирования. Смену среды проводили через сутки. На фиг. 5 представлены результаты. Фиг. 5 указывает, что когда проводили адгезионное культивирование, множество клеток дифференцировалось в экзокринные клетки (данные не показаны), что пролиферативная способность клеток снизилась в середине повторяющихся пассажей, и что число клеток снизилось.
Очистка панкреатических клеток-предшественников
Клеточные агрегаты собирали из планшета с агарозными микролунками с интервалами в шесть суток, диспергировали в отдельные клетки, и высаживали в новый планшет с агарозными микролунками. Способ диспергирования клеток, композиция среды и условия культивирования были такими же, что и описанные выше в "Размножении панкреатических клеток-предшественников".
На фиг. б представлены результаты измерения соотношения S0X9- и BrdU-положительных клеток в каждом пассаже. На фиг. б, Р означает количество пассажей. Фиг. б указывает, что соотношение БОХЭ/В^и-положительных клеток увеличивалось с повторением пассажей, и повысилось до 60% после одного пассажа. Фиг. 7 и 8 показывают результаты измерения соотношения SOX9- и BrdU-положительных клеток в каждом пассаже. Соотношение панкреатических клеток-предшественников положительных по SOX9 и PDX1 увеличивалось с повторением пассажей, и повысилось до 90% после трех пассажей. Эти результаты позволяет предположить, что повысилась чистота клеток-предшественников с более высоким пролиферативным потенциалом, чем у зрелых клеток.
Длительное культивирование панкреатических клеток-
предшественников
Клеточные агрегаты собирали из планшета с агарозными микролунками с интервалами в шесть суток, диспергировали в отдельные клетки, включая SOX9- и PDXl-положительные панкреатические клетки-предшественники, а затем высаживали в новый планшет с агарозными микролунками. Способ диспергирования клеток, композиция среды и условия культивирования были такими же, что и описанные выше в "Размножении панкреатических клеток-предшественников" .
На фиг. с 9 до 12 показаны результаты. Левая фигура на фиг.
9 представляет изображение с фазово-контрастного микроскопа для клеточных агрегатов, культивированных на агарозных микролунках, и правая фигура показывает изображение с фазово-контрастного микроскопа для клеточных агрегатов, взятых с планшета с агарозными микролунками. На фиг. 11 и 12, BrdU является маркером клеточной пролиферации, PDX1 является маркером панкреатических клеток-предшественников и островковых клеток, S0X9 является маркером панкреатических клеток-предшественников, С-пептид является маркером р-клеток, и NKX6.1 является маркером эндокринных клеток. В клеточной популяции, содержащей различные клетки, агрегаты имели деформированную форму; однако, на фиг. 9 представлено, что полученные клеточные агрегаты имели форму, аналогичную сферической форме, и, таким образом, предположили, что клетки в агрегатах являются однородными панкреатическими клетками-предшественниками. Фиг. 10 указывает, что размножение было возможно в течение длительного периода времени (48 суток) без снижения пролиферативного потенциала клеток, и что число клеток повышалось в три раза для каждого пассажа, т.е., культивирования в течение б суток. Фиг. 11 и 12 указывают, что клетки, размножавшиеся в течение длительного периода времени, были положительны по маркерам для панкреатических предшественников, SOX9 и PDX1. Кроме того, когда добавляли BrdU к раствору для культивирования, и проводили культивирование в течение 2 4 часов, после окрашивания наблюдали множество пролиферирующих BrdU-положительных клеток. Однако, было только несколько клеток с прогрессирующим созреванием, положительных по С-пептиду в качестве маркера р-клеток и положительных по NKX6.1 в качестве маркера эндокринных клеток. Созревание в эндокринные клетки
Панкреатические клетки-предшественники, размноженные и культивированные в течение шести пассажей, высевали на планшет с агарозными лунками таким же образом, как и в "Размножении панкреатических клеток-предшественников" выше. Плотность посева составила 3000 клетки/лунку. Клетки созревали в эндокринные клетки способом, показанным в последующих стадиях, с первой по третью. Конкретно, композицию среды меняли со временем, как описано ниже. Среду отсасывали через сутки и заменяли новой средой. Кроме того, композицию среды меняли в предопределенные сутки. Композицию среды и число суток культивирования в каждой среде определяли в соответствии с описанием A Rezania et al.
Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32 (11): 1121-33.
Первая стадия (3 суток)
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки ITS + 2 мМ GlutaMax+20 мМ D-глюкозы+О, 2 5 мкМ SANT-1 + 0,2 мкМ LDN193189+0, 05 мкМ ретиноевой кислоты+1 мкМ ТЗ (гормон щитовидной железы, трийодтиронин, Sigma-Aldrich)+10 мкМ Alk5i II (ингибитор II рецепторов 5 киназы, подобной рецептору активина, Enzo Life Sciences, Inc.)+10 мкг/мл гепарина (Nacalai Tesque, Inc.)+10 мкМ сульфата цинка (Sigma-Aldrich)
Вторая стадия (7 суток)
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% гормон+1/200 добавки ITS+2 мМ GlutaMax+20 мМ D-глюкозы+О,2 мкМ LDN193189+1 мкМ ТЗ+10 мкМ Alk5i 11+10 мкг/мл гепарина+10 мкМ сульфата цинка+0,1 мкМ GSi XX (ингибитор XX гамма-секретазы, Merck Millipore) Третья стадия (7 до 14 суток)
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки ITS+2 мМ GlutaMax+20 мМ 0-глюкозы+1 мкМ ТЗ+10 мкМ Alk5i 11+10 мкг/мл гепарина+10 мкМ сульфата цинка+1 мМ N-Cys (N-ацетилцистеин, Sigma-Aldrich)+2 мкМ R428 (ингибитор Axl, Selleckchem)+10 мкМ Trolox (Merck Millipore)
Для исследования эффективности индукции дифференцировки,
исследовали С-пептид-положительные панкреатические р-клетки в
клеточных агрегатах, дифференцированные в островковые клетки. На
фиг. 13 представлены результаты. На фиг. 13, NKX6.1 является
маркером эндокринных клеток, и С-пептид является маркером р-
клеток. Фиг. 13 указывает, что когда использовали
панкреатические клетки-предшественники, размноженные и
культивированные в течение шести пассажей, клетки дифференцировались в С-пептид/ЫКХ6.1-положительные р-клетки в соотношении, эквивалентном для панкреатических клеток-предшественников без размножения.
Тест на устойчивость к глюкозе проводили на клеточных
агрегатах, дифференцированных в островковые клетки. Конкретно,
агрегаты погружали в растворы Кребса-Рингера, содержащие 2,5 мМ,
22,5 мМ, 2,5 мМ, и 22,5 мМ глюкозы в течение 30 минут, и
количественно определяли С-пептид, секретируемый в растворы
Кребса-Рингера, при помощи ELISA (твердофазного
иммуноферментного анализа). На фиг. 14 представлены результаты.
Фиг. 14 указывает, что в клетках, созревших из панкреатических клеток-предшественников, величина секреции С-пептида изменяется в зависимости от концентрации глюкозы. В результате, это указывает на то, что амплифицированные панкреатические клетки-предшественники могут дифференцироваться в панкреатические эндокринные клетки, включая р-клетки, и имеют свойство менять величину секреции инсулина в ответ на концентрацию глюкозы.
На фиг. 15 представлены результаты иммуноокрашивания клеточных агрегатов, дифференцированных в островковые клетки. На фиг. 15, глюкагон является маркером а-клеток, соматостатин является маркером 8-клеток, и инсулин является маркером р-клеток. Фиг. 15 указывает, что клеточные агрегаты, дифференцированные в островковые клетки, также включают глюкагон-положительные ос-клетки и соматостатин-положительные 8-клетки.
Криоконсервация панкреатических клеток-предшественников
- Замораживание
После пяти пассажей таким же образом, как в "Размножении панкреатических клеток-предшественников" выше, панкреатические клетки-предшественники диспергировали в отдельные клетки. Клетки замораживали способом медленной заморозки с использованием коммерчески доступного раствора для криоконсервации (CELLBANKER 2 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) или STEM-CELLBANKER (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)) или раствора, полученного добавлением 10% диметилсульфоксида к раствору для культивирования, используемому для пролиферации. Конкретно, 5х105 клеток суспендировали в 500 мкл раствора для криоконсервации, и инъецировали во флаконы для заморозки. Флаконы помещали в контейнер для заморозки (Bicell, Ninon Freezer Co., Ltd.), и хранили при -80°С в течение ночи. В случае длительного хранения, флаконы переносили в резервуар с жидким азотом и хранили в нем.
- Способ оттаивания
Флаконы для заморозки, которые хранили при -8 0°С в течение 1 суток и в резервуаре для хранения с жидким азотом в течение б часов, быстро размораживали при нагревании на водяной бане при 37°С. Размороженную клеточную суспензию добавляли к 10 мл раствора для культивирования (MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% 0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки ITS+2 мМ GlutaMax+20 мМ D-глюкозы). После удаления супернатанта путем центрифугирования, клетки суспендировали в среде, содержащей 10 мкМ Y-2 7 632 (MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки
ITS+2 мМ GlutaMax+20 мМ Б-глюкозы+50 нг/мл EGF+200 нг/мл г-спондина 1+0,25 мкМ SANT-1+0,2 мкМ LDN193189+0,1 мкМ ретиноевой кислоты+10 мкМ Y-2 7 632) . К среде добавляли краситель трипановый синий, и рассчитывали коэффициент выживаемости клеток после размораживания.
На фиг. 16 представлены результаты. На фиг. 16, СВ2 показывает результаты с использованием CELLBANKER 2 в качестве раствора для криоконсервации, SCB показывает результаты с использованием STEM-CELLBANKER в качестве раствора для криоконсервации, и DMSO показывает результаты с использованием среды+10% DMSO (самодельный раствор для криоконсервации) в качестве раствора для криоконсервации. Фиг. 16 указывает, что коэффициент выживаемости составил от 7 0 до 8 0% при использовании любого раствора для криоконсервации.
Далее, на фиг. 17 представлены изменения числа клеток, когда клетки после размораживания пересаживали с интервалами в шесть суток путем трехмерного культивирования таким же образом, как в "Размножении панкреатических клеток-предшественников" выше. На фиг. 17 представлены результаты клеток, криоконсервированных с использованием CELLBANKER 2. Результаты, показанные на фиг. 17, ясно указывают, что криоконсервированные клетки имеют пролиферативный потенциал, эквивалентный потенциалу не криоконсервированных клеток.
Индукция дифференцировки в панкреатические клетки-
предшественники, полученные из других клеточных линий iPS
В качестве iPS-клеток, полученных от человека, использовали линию 454Е2 (полученную из клеточного банка Riken), линию RPChiPS771-2 (ReproCELL, Inc.), и линию Р11025 (Takara Bio, Inc.).
Линию 454E2 культивировали в среде Е8 (Thermo Fisher Scientific) от 3 до 4 суток с использованием контейнера для культивирования, покрытого Geltex (Thermo Fisher Scientific). После обработки с использованием TrypLE (Thermo Fisher Scientific) в условиях конфлюэнтности от 70 до 80%, клетки собирали в виде отдельных клеток. Клетки суспендировали в среде Е8, содержащей 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и высаживали от 1,2 до 1,5х105 клеток/см2 в контейнер для культивирования, покрытый Geltex (Thermo Fisher Scientific). Линию 454E2 культивировали с адгезией для индукции дифференцировки в панкреатические клетки
предшественники. Индукцию дифференцировки проводили с использованием того же раствора для культивирования в течение того же периода для культивирования, как описано выше, за исключением того, что культивирование на четвертой стадии проводили в течение 3 суток.
Линию 771-2 культивировали в среде StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc.) от 3 до 4 суток с использованием контейнера для культивирования, покрытого Geltex (Thermo Fisher Scientific). После обработки с использованием TrypLE (Thermo Fisher Scientific), клетки собирали в виде отдельных клеток. Затем, клетки суспендировали в среде StemFit АК02 (Ajinomoto Co., Inc.), содержащей 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и высаживали от 1,2 до 1,5х105 клеток/см2 в контейнер для культивирования, покрытый Geltex (Thermo Fisher Scientific). Линию 771-2 культивировали с адгезией для индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники. Индукцию дифференцировки проводили с использованием того же раствора для культивирования в течение того же периода для культивирования, как описано выше, за исключением того, что культивирование на четвертой стадии проводили в течение 3 суток.
Линию Р11025 культивировали с использованием системы для культивирования DEF-CS (Takara Bio, Inc.) от 3 до 4 суток. После обработки с использованием TrypLE (Thermo Fisher Scientific), клетки собирали в виде отдельных клеток. Затем, клетки суспендировали в среде DEF-CS (Takara Bio, Inc.), содержащей 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и высаживали от 1,2 до 1,5х105 клеток/см2 в контейнер для культивирования, покрытый DEF-CS Coat (Takara Bio, Inc.). Линию P11025 культивировали с адгезией для индукции дифференцировки в панкреатические клетки-предшественники. Индукцию дифференцировки проводили с использованием того же раствора для культивирования в течение того же периода для культивирования, как описано выше, за исключением того, что культивирование на четвертой стадии проводили в течение 3 суток.
Размножение панкреатических клеток-предшественников,
полученных из других клеточных линий iPS
Панкреатические клетки-предшественники, полученные выше, диспергировали в отдельные клетки с использованием ферментативного раствора для диспергирования клеток TrypLE
(Thermo Fisher Scientific), как для линии 253G1. Клетки суспендировали в последующей среде, содержащей 10 мкМ Y-2 7 632
(ингибитор ROCK, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и высаживали по 1000 клеток/лунку (1000x256=2, 56x105/планшет) в 2 5 6-луночный планшет с агарозными микролунками, помещенный в лунку 12-луночного планшета. После того как планшет с агарозными микролунками оставляли в течение 10 минут для осаждения клеток на дно, добавляли следующую среду в непосредственной близости с планшетом с агарозными микролунками, чтобы погрузить планшет в среду. После этого проводили культивирование в течение 4 суток при 37°С с 5% С02 • Смену среды проводили через сутки. Культивирование также проводили с использованием среды, содержащей три фактора (EGF+RSPD1+CHIR99021 или EGF+RSPD1+FGF-7) или два фактора (FGF-7+CHIR99021), вместо среды, содержащей четыре фактора (EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021).
MCDB131+1,5 г/л NaHCO3+0,5% обезжиренного БСА+1/200 добавки ITS+2 мМ GlutaMax+2 0 мМ Б-глюкозы+50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+200 нг/мл r-спондина 1 (RSPD1, R &D Systems)+0,25 мкМ SANT-1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+0,2 мкМ LDN193189 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)+0,1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich) +4, 5 мкМ CHIR99021 (Tocris Bioscience)+50 нг/мл фактора роста фибробластов 7 (FGF-7, PeproTech)
На фиг. с 18 до 21 показаны результаты. На фиг. 18 представлены изменения количества панкреатических клеток-предшественников, полученных из линии 771-2, когда добавляли четыре фактора (EGF+RSPD1 + FGF-7 + CHIR99021) (культивирование в течение 8 суток). Из-за добавления четырех факторов, панкреатические клетки-предшественники, полученные из линии 7712, размножились приблизительно в два раза при культивировании в течение 4 суток. Кроме того, фиг. 19 указывает на то, что в трех клеточных линиях, приблизительно 7 0% клеток были положительными по маркеру панкреатических клеток PDX1 и маркеру клеточного деления Ki67, когда добавляли четыре фактора. Фиг. 2 0 и 21 показывают результаты добавления от двух до четырех факторов. Эти результаты демонстрируют, что клетки размножились приблизительно в два раза, при добавлении трех факторов
(EGF+RSPD1 + CHIR99021 или EGF+RSPD1 + FGF-7) , и при добавлении двух факторов (FGF-7 + CHIR99021) ; что 50% или больше клеток были положительны по PDX1 и Ki67; и что было возможно размножать
панкреатические клетки-предшественники.
После того как панкреатические клетки-предшественники, полученные из линии Р11025, были пересажены дважды в среду для выращивания с добавлением четырех факторов (EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021), клетки созревали в эндокринные клетки. Способ культивирования для созревания был таким же, что и способ для панкреатических клеток-предшественников, полученных из линии 253G1. В результате иммуноокрашивания дифференцированных клеток, клеточные агрегаты, дифференцированные в островковые клетки, содержали инсулин-положительные р-клетки, глюкагон-положительные а-клетки, и соматостатин-положительные 8-клетки.
Все публикации, патенты, и патентные заявки, процитированные в настоящем описании, непосредственно включены путем ссылки в настоящее описание.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ культивирования панкреатических клеток-
предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток,
способ, включающий этап (А) трехмерного культивирования
панкреатических клеток-предшественников, полученных из
плюрипотентных стволовых клеток, в среде, которая содержит (1)
фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста
(EGF), и/или фактор, относящийся к семейству фактора роста
фибробластов (FGF), и (2) агонист Wnt.
2. Способ по п. 1, где агонист Wnt представляет собой белок, относящийся к семейству R-спондина, и/или ингибитор GSK.
3. Способ по п. 1, где фактор, относящийся к семейству EGF, и/или фактор, относящийся к семейству FGF (1), представляет собой EGF, и агонист Wnt (2) представляет собой R-спондин 1.
4. Способ по любому из пп. с 1 до 3, где среда представляет собой бессывороточную среду.
5. Способ по любому из пп. с 1 до 4, где культивирование представляет собой культивирование в отсутствие питающих клеток.
6. Способ по любому из пп. с 1 до 5, где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой iPS-клетки или ES-клетки.
7. Способ по любому из пп. с 1 до б, где плюрипотентные стволовые клетки получены от человека.
8. Способ по любому из пп. с 1 до 7, где трехмерное культивирование представляет собой суспензионное культивирование агрегатов панкреатических клеток-предшественников.
9. Способ по любому из пп. с 1 до 8, дополнительно включающий этап (В) субкультивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных на этапе А.
10. Способ по любому из пп. с 1 до 9 для применения для очистки панкреатических клеток-предшественников.
11. Способ по любому из пп. 1 до 10, дополнительно включающий этап (С) получения iPS-клеток, где панкреатические клетки-предшественники, полученн из iPS-клеток, применяют на этапе А.
12. Способ по любому из пп. 1 до 11, дополнительно включающий этап (D) индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические клетки-предшественники, где панкреатические клетки-предшественники применяют на этапе А.
13. Способ получения островковых клеток из панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых
11.
клеток, способ, включающий этап (Е) индукции дифференцировки панкреатических клеток-предшественников, культивированнных способом по любому из пп. с 1 до 12, в островковые клетки.
14. Способ криоконсервации панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, способ, включающий этап (F) заморозки панкреатических клеток-предшественников, культивированных способом по любому из пп. с 1 до 12 .
15. Среда для культивирования панкреатических клеток-предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, среда, которая содержит фактор, относящийся к семейству эпидермального фактора роста (EGF), и/или фактор, относящийся к семейству фактора роста фибробластов (FGF), и (2) агонист Wnt.
По доверенности
553197
.1. г-
1> / Ю3 1С4 :'~
BrdU-PE
PDX1-PE
ФИГ. 2
без фактора
RSPD1
EGF
RSPD1+EGF
ФИГ.З
Время культивирования (день)
ФИГ. 4
Без фактора
RSPD1
т х
4! 'rt
ю1 ю* из3 id4
BrdU-PE
BrdU-PE
EGF
10" -)
•и I
ITC
u_ -СГ) .o: -
'".3
{ r..i
i 1
П III
10 -
EGF+RSPDl
BrdU-PE
BrdU-PE
3.5
3 2.5
2 1.5
О F>
-4С000
клеток/см2
2 С* ООО
клеток/см2
Время культивирования (день)
сг> х О
¦ Q1
¦ 5.43
PDX1-PE
Q2 90.23
- Q1
1 1.43
96.52
1 Q4
" II 4h
' ¦ : 1 54
10 20 30 40 50 6 Время культивирования (день)
BrdU BrdU I С-пептид
BrdU-PE
PDX1-PE
ФИГ. 13
Без пролиферации
После 6 пассажей
22 "Г
. ,
""1 Г'
С-пептид-РЕ
С-пептид-РЕ
ФИГ. 16
глюкоза глюкоза глюкоза глюкоза
100
-Не криоконсервированные
о I- CD
m I-
CJ> CD
О CD
zsz
CD со 10
ФИГ. 18
Время культивирования после разморозки (день)
Время культивирования (день)
hiPS P11025-PP
hiPS 771-2-PP
hiPS454E2-PP
Ю CO
PDX1-PE
PDX1-PE
PDX1-PE
(19)
(19)
(19)
1/13
ФИГ. 1
1/13
ФИГ. 1
1/13
ФИГ. 1
1/13
ФИГ. 1
2/13
2/13
2/13
2/13
2/13
2/13
3/13
ФИГ. 5
3/13
ФИГ. 5
ФИГ.
6/13
7/13
ФИГ. 9
8/13
ФИГ. 11
8/13
ФИГ. 11
9/13
9/13
9/13
10/13
11/13
ФИГ. 17
11/13
ФИГ. 17
11/13
ФИГ. 17
ФИГ. 20