(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к области медицины и иммунологии. В частности, оно относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам, которые могут быть использованы для лечения, предотвращения и/или задержки Синдрома Ушера типа II и/или связанной с USH2A несиндромной дегенерации сетчатки, особенно путем пропуска псевдоэкзона (PE40) между экзоном 40 и 41 в гене USH2A человека.
Евразийское (21) 201892431 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.25
(51) Int. Cl.
C12N15/113 (2010.01) C12N15/11 (2006.01) A61K 31/7115 (2006.01) A61K 31/712 (2006.01) A61K 31/7125 (2006.01)
(54) ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЛАЗ
(31) 1607141.7
(32) 2016.04.25
(33) GB
(86) PCT/EP2017/059830
(87) WO 2017/186739 2017.11.02
(71) Заявитель:
ПРОКЬЮЭР ТЕРАПЬЮТИКС II БИ.ВИ. (NL)
(72) Изобретатель:
Ван Дипен Хестер Катарина, Чань Хэ Ламь, Турунен Джанне Джуха (NL)
(74) Представитель:
Строкова О.В., Угрюмов В.М. (RU) (57) Изобретение относится к области медицины и иммунологии. В частности, оно относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам, которые могут быть использованы для лечения, предотвращения и/или задержки Синдрома Ушера типа II и/ или связанной с USH2A несиндромной дегенерации сетчатки, особенно путем пропуска псевдоэк-зона (PE40) между экзоном 40 и 41 в гене USH2A человека.
Пациент
Здч-poDi.rii контроль (ГС'ТСроЗНГОТНЫЙ РЕ4'ч
Контр Контр USH2A- ' USH2A- " Контр USH2A- USHZA- Огриц.
,:;,:гМ 10r.!lL4 /мтЫ 'Ом-М
ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЛАЗ
Область техники
Изобретение относится к области медицины и иммунологии. В частности, оно относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам для лечения, предотвращения и/или задержки синдрома Ушера типа II и/или связанной с USH2A несиндромной дегенерации сетчатки.
Уровень техники
Синдром Ушера (USH) и несиндромный пигментный ретинит (NSRP) являются дегенеративными заболеваниями сетчатки. USH является клинически и генетически гетерогенным и, безусловно, наиболее распространенным типом унаследованной глухо-слепоты у людей. Нарушение слуха у пациентов с USH, по большей части, стабильное и врожденное и частично компенсируется слуховыми аппаратами или кохлеарными имплантатами. NSRP более распространен, чем USH, и встречается в 1 случае на 4000 человек. Дегенерация фоторецепторных клеток при USH и NSRP является прогрессивной и часто приводит к полной слепоте между третьим и четвертым десятилетиями жизни, тем самым оставляя время для терапевтического вмешательства. Мутации в гене USH2A являются наиболее частыми причинами обоих расстройств. Диапазон мутаций распространяется по всем 72 экзонам USH2A и их фланкирующим интронным последовательностям и содержит несмысловые мутации и миссенс-мутации, делеции, дубликации, большие перестановки и варианты сплайсинга. Наиболее часто мутантным экзоном является экзон 13, который содержит две мутации-основателя (c.2299delG (p.E767SfsX21) у пациентов с Синдромом Ушера типа II (USH2) и c.2276G> T (p.C759F) у пациентов с NSRP). Для экзона 50 было зарегистрировано пятнадцать патогенных мутаций, из которых по меньшей мере восемь, очевидно, усекаются белком. О первой глубокой интронной мутации в интроне 40 USH2A (c.7595-2144A> G) сообщалось в Vache et al (2012. Hum Mutat 33:104-8). Эта мутация создает криптический высококачественный сплайсинговый сайт донора в интроне 40, что приводит к включению аберрантного экзона 152 bp в мутантную USH2A мРНК и приводит к преждевременной терминации трансляции (см. Фиг. 1А и В из WO 2016/005514).
USH и другие дистрофии сетчатки долгое время считались неизлечимыми расстройствами. Тем не менее, несколько клинических испытаний фазы I/II с использованием генной аугментационной терапии привели к обнадеживающим
результатам в отдельных группах пациентов с LCA/RP/USH с мутациями в генах RPE65 и MY07A. Размер кодирующей последовательности (15,606 bp) и альтернативный сплайсинг гена USH2A и мРНК соответственно препятствуют хэмпер-генной аугментационной терапии из-за ограниченного в настоящее время размера груза многих доступных векторов (напр., аденоассоциированных (AAV) и лентивирусных векторов).
Несмотря на широкий клинический потенциал терапии на основе антисмыслового олигонуклеотида (AON), она не часто используется для глаз позвоночных. AON являются малыми (16-25 нуклеотидных) полинуклеотидными молекулами, которые способны препятствовать сплайсингу, поскольку их последовательность комплементарна целевым молекулам пре-мРНК. При связывании AON целевая область пре-мРНК больше не доступна для факторов сплайсинга, что приводит к пропуску экзона, который нацелен на AON. Терапевтически эта методология может быть использована двумя способами: а) для перенаправления нормального сплайсинга генов, в которых мутации активируют криптические сплайсинговые сайты, и б) для пропуска экзонов, которые переносят мутации (белок-усечение) таким образом, что рамка считывания мРНК остается неповрежденной и производится (частично) функциональный белок. Для гена USH2A 28 из 72 экзонов могут быть потенциально пропущены без нарушения общей рамки считывания транскрипта. Оба метода на основе AON успешно применяются у пациентов с тяжелыми генетическими нарушениями. Liquori et al. (2016. Hum Mutat 37:184-193) показал, что AON может предотвратить включение 155 bp псевдо-экзона 50 (РЕ 50), вызванного мутацией c.9959.4159A> G в интроне 50, в мРНК гена USH2A.
Целью изобретения является предоставление удобной терапевтической стратегии для предотвращения, лечения или задержки USH и/или NSRP, вызванных мутацией c.7595-2144A> G, присутствующей в интроне между экзоном 40 и 41 гена USH2A человека. Ранее было предложено (Vache et al. 2012), а затем продемонстрировано (WO 2016/005514), что AON способны блокировать аберрантный сплайсинг USH2A пре-мРНК, который вызван этой мутацией, приводящей к включению псевдо-экзона 40: РЕ40. Отмечается, что существует потребность в дальнейших улучшенных альтернативах, которые лучше работают и обладают дополнительными полезными свойствами. Целью настоящего изобретения является предоставление таких альтернатив.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду (AON), который способен индуцировать пропуск псевдо-экзона 40 (РЕ40) из USH2A пре-мРНК человека, где включение псевдо-экзона обусловлено c.7595-2144A> G в гене USH2A и где
указанный AON содержит последовательность, выбранную из любой из следующих групп последовательностей: (i) SEQ Ш N0:6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37; (ii) SEQ Ш N0:3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36; и (iii) SEQ Ш N0:21, 27, 28, 29. Изобретение в другом варианте также относится к AON, который способен индуцировать пропуск РЕ40 из USH2A пре-мРНК человека, где указанный AON содержит последовательность, которая комплементарна по меньшей мере 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 последовательным нуклеотидам SEQ Ш N0:45, 46 или 47. В предпочтительном варианте выполнения изобретения AON по настоящему изобретению имеет длину от 18 до 143 нуклеотидов, предпочтительно от 18 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 18 до 24 нуклеотидов и наиболее предпочтительно состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ГО N0:6, 3, 4, 5, 7, 8, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36 и 37, предпочтительно выбранной из SEQ ГО N0:6, 3, 4, 5, 7, 8, 26, 34, 35 и 37, более предпочтительно выбранной из SEQ ГО N0:6, 3, 4, 5, 7, 8, 26 и 35. В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения AON по изобретению содержит 2'-(3-алкилфосфоротиоатный антисмысловой олигонуклеотид, такой как Т-О-метил, модифицированный рибозой (РНК), 2'-0-этил, модифицированный рибозой, Т-О-пропил, модифицированный рибозой и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные. Один или несколько нуклеотидов в AON по настоящему изобретению могут быть модифицированы 2'-0-метоксиэтильной модификацией. Изобретение также относится к набору AON, содержащему по меньшей мере два AON, как заявлено в настоящем документе. В другом варианте выполнения изобретение также относится к вирусному вектору, экспрессирующему AON по изобретению, при помещении в условия, благоприятные для экспрессии AON. В еще одном варианте выполнения изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей AON по изобретению, или набор AON по изобретению, или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Изобретение также относится к AON, набору, вектору или композиции по изобретению для применения при лечении связанного с USH2A заболевания или состояния, такого как Синдром Ушера типа II, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 показаны результаты обратной транскриптазы первоначального скрининга семи альтернативных антисмысловых олигонуклеотидов, которые сравнивались по эффективности пропуска экзона РЕ40 по сравнении с двумя известными антисмысловыми олигонуклеотидами из уровня техники (AON1 и AON2: R1 и R2
соответственно) и несвязанным контрольным олигонуклеотидом (контр.) с использованием конструкции репортера в клетках НЕК293, демонстрируя явное увеличение сигнала после введения USH2A-PE40-3, -5 и -7. Нижняя панель показывает приблизительные положения различных AON в отношении последовательности РЕ40.
На Фигуре 2 показана последовательность РЕ40 (жирная, и подчеркнутая, и разделенная на две части) от 5' до 3' и сайты связывания для различных AON, протестированных в настоящем документе. SEQ Ш N0 каждого тестируемого AON указывается в скобках, названия приведены в Таблице 1. Первый нуклеотид ниже последовательности РЕ40 представляет собой гуанозин (G), который представляет мутацию c.7595-2144A> G. Позиции для A0N1 (1) и A0N2 (2) приведены непосредственно под последовательностью РЕ40. Курсивные последовательности представляют собой последовательности вверх и вниз от РЕ40. Три области, представляющие интерес, как указано в примерах и как заявлено в настоящем документе, окружают USH2A-PE40-3 (SEQ ГО N0:19, жирный), USH2A-PE40-5 (SEQ ГО N0:21, жирный) и USH2A-PE40-7 (SEQ ГО N0:23, жирный) соответственно.
На Фигуре 3 показаны результаты обратной транскриптазы скрининга пропуска РЕ40 набора олигонуклеотидов, которые были основаны на USH2A-PE40-3, -5 и -7, показанных на Фиг. 1 и 2. Очевидно, что AON USH2A-PE40-8 и -11 (на основе USH2A-РЕ40-3) и USH2A-PE40-17 (на основе USH2A-PE40-7) демонстрируют дополнительную повышенную интенсивность, что указывает на дальнейшее улучшение по сравнению с известными олигонуклеотидами уровня техники.
На Фигуре 4 показаны результаты обратной транскриптазы скрининга пропуска РЕ40 набора олигонуклеотидов, которые были сделаны на один шаг дальше и были основаны на USH2A-PE40-8, -11 и -17. Короткий означает короче оригинала. 5шС означает 5-метилцитозин (см. также Таблицу 1). DAP означает 2,6-диаминопурин.
На Фигуре 5 показана диаграмма, представляющая количество капель, экспрессирующих РЕ40 (левые столбцы для каждого AON) по сравнению с продуктами дикого типа (правые столбцы для каждого AON), скорректированные на экспрессию бета-глюкуронидазы из гена GUSB (ген "домашнего хозяйства") в качестве стандарта и как обычно используется специалистом в данной области техники, в фибробластах пациентов с USH2, которым вводили восемь различных олигонуклеотидов, как описано в примере 1.
На Фигуре 6 показаны результаты оценки иммуногенности и иммунотоксичности указанных USH2A-PE40 AON в РВМС человека. А. Тепловая карта, изображающая кратность изменения и уровни значимости концентраций цитокинов в культуральном супернатанте после 24 ч стимуляции РВМС человека олигонуклеотидами, как описано в
настоящем документе, или положительный контроль LPS (100 нг/мл) и R848 (1 мкМ) по сравнению с обработанными физиологическим раствором РВМС человека. Каждый квадрат показывает кратность изменения в зависимости от условия введения для каждого измеренного цитокина. В. Относительное число жизнеспособных РВМС, выраженное как кратность изменения Резоруфиновой флуоресценции по сравнению с обработанными физиологическим раствором РВМС после 24 ч воздействия четыре различных антисмысловых олигонуклеотида USH2A-PE40 по настоящему изобретению или положительными контролями. Оценка жизнеспособной клетки проводилась при помощи набора CellTiter-Blue(r) (Promega) с использованием протоколов производителя. Для всех отдельных биологических репликаций кратности изменения были рассчитаны путем нормализации измеренного RFU по среднему геометрическому соответствующего трехкратного солевого контроля. Результаты показаны на отдельном доноре как среднее ±SEM от тройной кратности изменения, нормализованное по среднему его соответствующего контроля - физиологического раствора (пунктирная линия). Повторные измерения были выполнены посредством Однофакторного дисперсионного анализа (Oneway ANOVA) с критерием Даннетта (Dunnett test) для множественных поправок (по сравнению с физиологическим раствором).
На Фигуре 7 показаны результаты пропуска РЕ40 в USH2A пре-мРНК в оптических чашках, полученных из фибробластов, полученных из гетерозиготного пациента с USH2 после обработки USH2A-PE40-24. Четыре левые полосы показывают результаты в оптических чашках, полученных из фибробластов от здорового донора, а следующие три полосы показывают результаты в оптических чашках из фибробластов пациента с USH2. Контрольный олигонуклеотид представляет собой несвязанный олигонуклеотид, не комплементарный USH2A пре-мРНК. Отрицательный контроль справа не содержит материала нуклеиновых кислот. Контрольная полоса 5 показывает две доминирующие полосы, верхнюю полосу, представляющую мРНК, содержащую последовательность РЕ40, и нижнюю жирную полосу, представляющую мРНК, не содержащую последовательность РЕ40. Обработка USH2A-PE40-24 приводит к полному пропуску РЕ40 из пре-мРНК, поскольку никакие верхние полосы не обнаруживаются.
Подробное описание
Для целей изобретения термины "включение аберрантного псевдо-экзона", "включение аберрантного псевдо-экзона 40" или "включение аберрантного нуклеотидного псевдо-экзона 152 Ьр" считаются синонимами и считаются означающими включение псевдо-экзона 40 (РЕ40) гена USH2A в мРНК или включение его части или
последовательности, содержащей 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% этой последовательности USH2A в мРНК.
Термин "пропуск экзона" определяется в настоящем документе как индуцирование, продуцирование или увеличение продуцирования в клетке зрелой мРНК, которая не содержит конкретного экзона, который присутствует в зрелой мРНК без пропуска экзона. Пропуск экзона достигается путем обеспечения клетки, экспрессирующей пре-мРНК указанной зрелой мРНК, молекулой, способной интерферировать с последовательностями, такой как, например, (криптическая) сплайсинговая донорная или (криптическая) сплайсинговая акцепторная последовательность, необходимая для разрешения ферментативного процесса сплайсинга, или молекулой, которая способна интерферировать с сигналом включения экзона, необходимым для распознавания участка нуклеотидов в качестве экзона, который должен быть включен в зрелую мРНК; такие молекулы в настоящем документе называются молекулами пропуска экзона. В настоящем изобретении пропуск экзона относится к пропуску РЕ40.
Термин "пре-мРНК" относится к непроцессированной или частично процессированной мРНК-предшественнице, которая синтезируется из ДНК-матрицы клетки путем транскрипции, например, в ядре.
Термин "удерживание экзонов" относится к продуцированию внутри клетки зрелой мРНК, которая включает в себя конкретный экзон, когда не происходит пропуска экзона этого экзона при процессировании пре-мРНК через реакцию сплайсинга. Что касается настоящего изобретения, РЕ40, который обычно не присутствует в зрелой мРНК из гена USH2A человека, когда он является дикого типа, сохраняется в зрелой мРНК из гена USH2A человека, когда конкретная мутация делает невозможным сплайсинг РЕ40 из пре-мРНК, как это происходит в присутствии мутации c.7595-2144A> G, как подробно описано в настоящем документе. Целью настоящего изобретения является предотвращение, ингибирование или уменьшение удержания экзона РЕ40 в USH2A мРНК человека, тем самым предотвращая, задерживая и/или подвергая лечению синдром Ушера типа П.
Под термином "антисмысловой олигонуклеотид" (AON) понимается нуклеотидная последовательность, которая по существу комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в молекуле пре-мРНК, молекуле гетерогенной ядерной РНК (гяРНК) или молекуле мРНК. Целевые последовательности олигонуклеотидов по настоящему изобретению приведены в настоящем документе. Степень комплементарности (или существенной комплементарности) антисмысловой последовательности предпочтительно
такова, что молекула, содержащая антисмысловую последовательность, может образовывать стабильный гибрид с нуклеотидной последовательностью-мишенью в молекуле РНК при физиологических условиях. Термины "антисмысловой олигонуклеотид", его аббревиатура "AON" и термин "олигонуклеотид" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и понимаются как относящиеся к олигонуклеотиду, содержащему антисмысловую последовательность. Антисмысловой олигонуклеотид предпочтительно является одноцепочечным и предпочтительно не саморенатурирующие, ни к себе, ни к другому AON такого же типа.
Термин "по существу комплементарная", используемый в контексте изобретения, указывает на то, что некоторые несоответствия в антисмысловой последовательности допускаются до тех пор, пока функциональность, т.е. индуцирование пропуска РЕ40, остается все еще приемлемой.
Термин "пропуск псевдо-экзона" определяется в настоящем документе как побуждающий, стимулирующий, вызывающий, усиливающий, продуцирующий или увеличивающий продукцию в клетке зрелой мРНК, которая не содержит определенную интронную область или псевдо-экзон, которые присутствовали бы в зрелой мРНК без пропуска псевдо-экзона. Пропуск псевдо-экзона достигается путем обеспечения клетки, экспрессирующей пре-мРНК указанной зрелой мРНК, молекулой, способной вмешиваться в последовательности, такие как, например, (криптическая) сплайсинговая донор или (криптическая) сплайсинговая акцепторная последовательность, необходимая для обеспечения ферментативного процесса сплайсинга, или молекулой, которая способна вмешиваться в сигнал включения псевдо-экзона, необходимый для распознавания участка нуклеотидов в виде псевдо-экзона, который должен быть включен в зрелую мРНК; такие молекулы в настоящем документе называются молекулами пропуска псевдо-экзона.
Предпочтительно, чтобы комплементарность составляла от 90% до 100%. В общем случае допускается 1 или 2 несоответствия в олигонуклеотиде из 20 нуклеотидов или 1, 2, 3 или 4 несоответствия в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 несоответствий в олигонуклеотиде из 60 нуклеотидов и т.д.
В одном из вариантов выполнения изобретения AON с пропуском экзона, как определено в настоящем документе, может быть соединением, которое связывается и/или комплементарно с указанной последовательностью. Способы скрининга AON, которые связывают специфические нуклеотидные последовательности, описаны, например, в WO 2002/024906, US 6875736 и WO 2016/005514, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Связывание с определенными последовательностями, предпочтительно в контексте аберрантного 152-нуклеотидного USH2A псевдо-экзона 40
(РЕ40), может быть оценено с помощью методик, известных специалисту в данной области. Предпочтительной методикой является анализ сдвига подвижности геля, как описано в ЕР 1619249. В предпочтительном варианте выполнения изобретения говорится, что пропуск (псевдо) экзона AON связывается, как только связывание указанной молекулы с меченной последовательностью обнаруживается в анализе сдвига подвижности геля.
Во всех вариантах выполнения изобретения "молекула пропуска (псевдо) экзона" представляет собой AON. Разработка AON для целей настоящего изобретения имеет особое значение. В предпочтительном способе необходимо учитывать по меньшей мере один из следующих аспектов для конструирования, улучшения указанной молекулы пропуска экзона: (1) AON предпочтительно не содержит CpG или участок мотивов CpG; и (2) AON имеет приемлемую кинетику связывания с РНК и/или термодинамические свойства. Присутствие CpG или участка мотивов CpG в олигонуклеотиде обычно связано с повышенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида. Иммуногенность может быть оценена на животной модели путем оценки наличия клеток CD4+ и/или CD8+ и/или инфильтрации воспалительных мононуклеоцитов. Она также может быть оценена в крови животного или человека, которым вводили олигонуклеотид по изобретению, путем обнаружения присутствия нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа, известного специалисту в данной области. Воспалительную реакцию, образование интерферона, подобного типу I, образование IL-12 и/или увеличение иммуногенности можно оценить путем обнаружения присутствия или увеличения количества нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа.
Изобретение относится к AON с приемлемой кинетикой связывания с РНК и/или термодинамическими свойствами. Кинетика связывания с РНК и/или термодинамические свойства по меньшей мере частично определяются температурой плавления олигонуклеотида (Тш; рассчитанная с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index.html) для одноцепочечной РНК с использованием модели базовой Тт и ближайшего соседа) и/или свободной энергией экзонового комплекса AON-мишень (с использованием RNA structure version 4.5). Если Тт слишком высока, то ожидается, что олигонуклеотид будет менее специфичным. Приемлемые Тт и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Поэтому трудно дать предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров. Допустимая Тт может
находиться в диапазоне от 35 до 70°С, а приемлемая свободная энергия может находиться в диапазоне от 15 до 45 ккал/моль.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения сообщается, что AON индуцирует пропуск аберрантного 152-нуклеотидного USH2A псевдо-экзона 40 (SEQ Ш N0:5 в WO 2016/005514), когда процент пропуска аберрантного 152-нуклеотидного USH2A псевдо-экзон 40 по данным количественного анализа RT-PCR составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 60%, или при по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или 100%. Предпочтительные анализы для определения пропуска экзона и/или сохранения экзона описаны в приведенных в настоящем документе примерах.
Предпочтительно, AON согласно изобретению содержит последовательность, которая комплементарна или по существу комплементарна нуклеотидной последовательности РЕ40 (SEQ Ш N0:9 в настоящем документе) или ее части, так что (по существу) комплементарная часть составляет по меньшей мере 50% от длины олигонуклеотида согласно изобретению, более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% или даже более предпочтительно по меньшей мере 95% или даже более предпочтительно 98%, или даже более предпочтительно по меньшей мере 99%, или даже более предпочтительно 100%. Предпочтительно, AON согласно изобретению содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна части SEQ Ш N0:9, показанной ниже:
Псевдо-экзон 40; РЕ40 5' - CTTCCTCTCCAGAATCACACAAGTTAAAGGACCCTTCTGCAACAAGAGCAGCG AATCTACTCAGCCAGAGCAGGAAGCTAATAAAATGTATGCTGGCTTTTAAGGGGGA AACAAATCATGAAATTGAAATTGAACACCTCTCCTTTCCCAAG - 3' (SEQ ГО N0:9)
В качестве примера, AON может содержать последовательность, которая комплементарна части SEQ ГО N0:9, и дополнительные фланкирующие последовательности, особенно сайт сплайсинга на 3'-конце РЕ40. В более предпочтительном варианте выполнения изобретения длина указанной комплементарной части указанного AON составляет по меньшей мере 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, ПО, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотида. Дополнительные фланкирующие последовательности могут быть использованы для модификации связывания или для модификации термодинамического свойства AON, более предпочтительно для модификации аффинности связывания целевой РНК. Специалист в данной области знает, что нет необходимости, чтобы все основания в области комплементарности были способны спариваться с основаниями в противоположной нити. Например, при проектировании AON специалист может захотеть включить, например, остаток, который не является основанием в паре с основанием на комплементарной нити. Несоответствия могут в какой-то мере допускаться, если в сложившихся обстоятельствах в клетке участок нуклеотидов способен в достаточной мере гибридизоваться с комплементарной частью. В этом контексте "достаточно" предпочтительно означает, что с использованием анализа сдвига подвижности геля, как описано в примере 1 в ЕР 1619249, можно обнаружить связывание AON.
Необязательно, указанный AON может дополнительно тестироваться путем трансфекции в фибробласты или клетки сетчатки пациентов. Пропуск целевого экзона можно оценить с помощью RT-PCR (такого как, напр., описанного в ЕР 1619249). Комплементарные области предпочтительно сконструированы таким образом, что при объединении они специфичны для экзона в пре-мРНК. Такая специфичность может быть создана с разной длиной комплементарных областей, поскольку это зависит от конкретных последовательностей в других молекулах (пре) мРНК в системе. Риск того, что AON также сможет гибридизоваться с одной или несколькими другими молекулами пре-мРНК, уменьшается с увеличением размера AON. Ясно, что в изобретении могут быть использованы AON, содержащие несоответствия в области комплементарности, но которые сохраняют способность к гибридизации и/или связыванию с целевой областью(ями) в пре-мРНК. Однако предпочтительно, чтобы по меньшей мере комплементарные части не содержали таких несоответствий, поскольку AON с отсутствием несоответствий в комплементарной части, как правило, имеют более высокую эффективность и более высокую специфичность, чем AON, имеющие такие несоответствия в одной или более комплементарных областях. Считается, что более высокие силы гибридизации (т.е. увеличение числа взаимодействий с противоположной нитью) благоприятны для повышения эффективности процесса интерферирования со сплайсинговым механизмом системы. Предпочтительно, чтобы комплементарность составляла от 90% до 100%.
AON пропуска псевдо-экзона по изобретению предпочтительно находится в изолированной форме. Предпочтительный AON пропуска псевдо-экзона согласно
изобретению имеет длину от 18 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 60, более предпочтительно от 18 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 24 нуклеотидов, более предпочтительно 18 нуклеотидов, 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 21 нуклеотид, 22 нуклеотида, 23 нуклеотида или 24 нуклеотида. В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения AON по изобретению состоит из от 18 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 20 нуклеотидов или предпочтительно состоит из 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, ПО, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотидов.
Предпочтительно, чтобы AON пропуска экзона по изобретению содержал один или несколько остатков, которые были модифицированы для увеличения стойкости к нуклеазе и/или для увеличения аффинности AON к целевой последовательности. Следовательно, в предпочтительном варианте выполнения изобретения последовательность AON содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог или эквивалент, где нуклеотидный аналог или эквивалент определяется как остаток, имеющий модифицированное основание и/или модифицированную основную цепь, и/или неприродное интернуклеозидное связывание, или комбинацию этих модификаций.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения нуклеотидный аналог или эквивалент содержит модифицированную основную цепь. Примерами таких скелетов являются морфолиновые скелеты, карбаматные скелеты, силоксановые скелеты, сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты, формацетильные и тиоформацетильные скелеты, метиленформацетильные скелеты, рибоацетильные скелеты, алкенсодержащие скелеты, сульфаматные, сульфонатные и сульфонамидные скелеты, метилениминовые и метиленгидразиновые скелеты и амидные скелеты. Фосфородиамидатные морфолиновые олигомеры являются олигонуклеотидами с модифицированными скелетами, которые ранее были исследованы как антисмысловые агенты. Морфолиновые олигонуклеотиды имеют незаряженный скелет, в котором сахар дезоксирибоза ДНК заменен шестичленным кольцом, а фосфодиэфирная связь заменена фосфородиамидатной связью. Морфолиновые олигонуклеотиды устойчивы к ферментативному разложению и, по-видимому, действуют как антисмысловые агенты, останавливая трансляцию или интерферируя со сплайсингом пре-мРНК, а не активируя RNaseH. Морфолиновые олигонуклеотиды успешно доставляются в тканевые культуры клеток способами, которые физически разрушают клеточную мембрану, и одно
исследование по сравнению с несколькими из этих способов показало, что введение при соскабливании является наиболее эффективным способом доставки; однако, поскольку морфолиновый скелет незаряжен, катионные липиды не являются эффективными медиаторами поглощения морфолиновых олигонуклеотидов в клетках. Недавний отчет показал образование триплекса морфолиновым олигонуклеотидом, и из-за неионного скелета эти исследования показали, что морфолиновый олигонуклеотид способен образовывать триплекс в отсутствии магния. Кроме того, предпочтительно, чтобы связь между остатками в основной цепи не включала атом фосфора, как связь, которая образована короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одним или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит Пептидную Нуклеиновую Кислоту (ПНК), имеющую модифицированный полиамидный скелет. Молекулы на основе ПНК являются истинными имитаторами молекул ДНК в терминах распознавания пары оснований. Скелет ПНК составлен из Тч[-(2-аминоэтил)-глициновых единиц, связанных пептидными связями, где нуклеотидные основания связаны с основной цепью метиленкарбонильными связями. Альтернативный скелет содержит пирролидиновый мономер ПНК, удлиненный на один углерод. Поскольку скелет молекулы ПНК не содержит заряженных фосфатных групп, гибриды ПНК-РНК обычно более стабильны, чем гибриды РНК-РНК или РНК-ДНК, соответственно. Еще один предпочтительный скелет содержит аналог или эквивалент морфолинового нуклеотида, в котором сахар рибоза или дезоксирибоза заменен на 6-членное морфолиновое кольцо. Наиболее предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит фосфородиамидатный морфолиновый олигомер (РМО), в котором сахар рибоза или дезоксирибоза заменен 6-членным морфолиновым кольцом, а анионная фосфодиэфирная связь между смежными морфолиновыми кольцами заменена неионной фосфородиамидатной связью. В еще одном варианте выполнения изобретения нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит замещение одного из не-мостиковых кислородов в фосфодиэфирной связи. Эта модификация слегка дестабилизирует спаривание оснований, но добавляет значительную устойчивость к деградации нуклеазой. Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент включает фосфоротиоат, хиральный фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфоротриэфир, Н-фосфонат, метил и другой алкилфосфонат, включая 3'-алкиленфосфонат, 5'-алкиленфосфонат и хиральный фосфонат, фосфинат, фосфорамидат,
включая З'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидат, тионофосфорамидат, тионоалкилфосфонат, тионоалкилфосфотриэфир, селенофосфат или боранофосфат. Еще один предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит один или несколько сахарных фрагментов, которые являются моно- или дизамещенными в положении 2', 3' и/или 5', таком как -ОН; -F; замещенный или незамещенный линейный или разветвленный низший (С1-С10) алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аллил или аралкил, который может быть прерван одним или несколькими гетероатомами; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил; О-, S- или N-аллил; О-алкил-О-алкил, -метокси, -аминопропокси; метоксиэтокси; диметиламинооксиэтокси; и -диметиламиноэтоксиэтокси. Сахарный фрагмент может быть пиранозой или ее производным или дезоксипиранозой или ее производным, предпочтительно рибозой или ее производным, или дезоксирибозой или ее производным. Предпочтительный дериватизированный сахарный фрагмент содержит Запертую Нуклеиновую Кислоту (ЗНК), в которой 2'-углеродный атом связан с 3' или 4' атомом углерода сахарного кольца, образуя, таким образом, бициклический сахарный фрагмент. Предпочтительная ЗНК содержит 2'-0, 4'-С-этилен-мостиковую нуклеиновую кислоту. Эти замены отвечают за устойчивость нуклеотидного аналога или эквивалента к RNase Н и нуклеазе и увеличивают сродство к целевой РНК. В другом варианте выполнения изобретения нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит одну или несколько модификаций или замещений оснований. Модифицированные основания включают в себя синтетические и природные основания, такие как инозин, ксантин, гипоксантин и другие -аза, деаза, -гидрокси, -галоген, -тио, тиол, -алкил, -алкенил, -алкинил, тиоалкил производные пиримидиновых и пуриновых оснований, которые известны или будут известны в данной области техники. Специалист в данной области понимает, что не обязательно, чтобы все позиции в AON были изменены равномерно. Кроме того, более чем один из вышеупомянутых аналогов или эквивалентов может быть включен в единственный AON или даже в единственное положение в пределах AON. В некоторых вариантах выполнения AON по изобретению имеет по меньшей мере два разных типа аналогов или эквивалентов.
Предпочтительным AON пропуска псевдо-экзона по изобретению является 2'-0-алкилфосфоротиоатный AON, такой как модифицированная 2'-0-метил рибоза (РНК), модифицированная 2'-0-этил рибоза, модифицированная 2'-0-пропил рибоза и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные. Эффективный AON согласно изобретению содержит 2'-0-метил-рибозу с фосфоротиоатным скелетом.
Специалисту в данной области также будет понятно, что различные AON могут быть объединены для эффективного пропуска аберрантного 152-нуклеотидного псевдо-экзона USH2A. В предпочтительном варианте выполнения в способе по изобретению используется комбинация (или набор) по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 AON.
AON можно связать с фрагментом, который усиливает поглощение AON в клетках, предпочтительно клетках сетчатки. Примерами таких фрагментов являются холестерины, углеводы, витамины, биотин, липиды, фосфолипиды, проникающие в клетки пептиды, включая, но без ограничения, антеннапедию, ТАТ, транспортан и положительно заряженные аминокислоты, такие как олигоаргинин, полиаргинин, олиголизин или полилизин, связывающиеся с антигеном домены, такие как обеспечиваемые антителом, фрагментом антитела Fab, или одноцепочечным антигенсвязывающим доменом, таким как одноцепочечный домен камелоида антигенсвязывающего домена.
AON согласно изобретению может быть косвенно введен с использованием подходящих средств, известных в данной области. Он может быть, например, введен человеку или в клетку, ткань или орган указанного индивидуума в форме вектора экспрессии, где вектор экспрессии кодирует транскрипт, содержащий указанный AON. Вектор экспрессии предпочтительно вводится в клетку, ткань, орган или индивидууму с помощью носителя для доставки гена. В предпочтительном варианте выполнения изобретение относится к вектору экспрессии на основе вируса, содержащего кассету экспрессии или кассету транскрипции, которая управляет экспрессией или транскрипцией молекулы пропуска экзона, как определено в настоящем документе. Соответственно, изобретение относится к вирусному вектору, экспрессирующему AON по изобретению при помещении в условия, благоприятные для экспрессии AON. Клетка может быть снабжена AON, способным интерферировать с существенными последовательностями, что приводит к высокоэффективному пропуску аберрантного 152-нуклеотидного псевдо-экзона USH2A с помощью экспрессии AON, полученной на основе плазмиды, или вирусной экспрессии, обеспечиваемой аденовирусными или аденоассоциированными векторами на основе вирусов. Экспрессия может быть вызвана промотором полимеразы II (Pol II), таким как промотор U7 или промотором полимеразы III (Pol III), таким как промотор U6 РНК. Предпочтительным носителем для доставки является вирусный вектор, такой как аденоассоциированный вирусный вирус (AAV), или ретровирусный вектор, такой как вектор лентивируса, и тому подобное, все из которых подробно описаны в WO 2016/005514. Кроме того, плазмиды, искусственные хромосомы, плазмиды, используемые для нацеленной гомологичной рекомбинации и интеграции в клетки генома человека, могут быть соответствующим образом применены для доставки олигонуклеотида, как
определено в настоящем документе. Предпочтительными для настоящего изобретения являются те векторы, в которых транскрипция инициируется промоторами Pol-III и/или в которых транскрипты находятся в форме слияний с транскриптами U1 или U7, что дает хорошие результаты для доставки небольших транскриптов. Специалист в данной области в состоянии разработать подходящие транскрипты. Предпочтительными являются транскрипты, инициируемые Pol-III, предпочтительно в виде транскрипта слияния с транскриптом U1 или U7.
AON по изобретению может доставляться сам по себе. Однако AON также может кодироваться вирусным вектором. Как правило, он находится в форме транскрипта РНК, который содержит последовательность AON по изобретению в части транскрипта.
Предполагается, что усовершенствования средств для обеспечения индивидуума или клетки, ткани, органа указанного индивидуума с помощью AON по изобретению рассматриваются с учетом прогресса, который уже был достигнут. Разумеется, такие будущие улучшения могут быть включены для достижения упомянутого эффекта при реструктуризации мРНК с использованием способа по изобретению. AON по изобретению может быть доставлен индивидууму, клетке, ткани или органу указанного индивидуума. При введении AON по изобретению предпочтительно, чтобы молекула растворялась в растворе, который совместим со способом доставки. Сетчатка или внутренние клетки уха могут быть снабжены плазмидой для экспрессии AON путем предоставления плазмиды в водном растворе или через вирусный вектор или наночастицы, как подробно описано в WO 2016/005514. Предпочтительно, вирусные векторы или наночастицы доставляются в сетчатку или внутренние клетки уха. Специалист в данной области может выбрать и адаптировать любые из известных и/или других коммерчески доступных альтернативных эксципиентов и систем доставки для упаковки и доставки AON для использования в настоящем изобретении для его доставки для предотвращения, лечения или задержки заболевания или состояния, связанного с USH2A. "Предотвращение, лечение или отсрочка заболевания или состояния, связанного с USH2A", в настоящем документе предпочтительно определяют как предотвращение, остановку, прекращение прогрессирования или обращение частичного или полного нарушения зрения или слепоты, а также предотвращение, остановку, прекращение прогрессирования или обращение частичного или полного нарушения слуха или глухоты, вызванной генетическим дефектом в гене USH2A.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения AON по изобретению составляется в композиции или лекарственном средстве или композиции, которые предоставляются с по меньшей мере эксципиентом, и/или нацеливающим лигандом для
доставки, и/или устройством для доставки в клетку, и/или повышения его внутриклеточной доставки.
Следует понимать, что если композиция содержит дополнительный компонент, такой как вспомогательное соединение, то каждый компонент не может быть составлен в виде одной комбинации, или композиции, или препарата. В зависимости от их сущности специалист в данной области будет знать, какой тип состава является наиболее подходящим для каждого компонента, как определено в настоящем документе. Если требуется, AON по изобретению или вектор, предпочтительно вирусный вектор, экспрессирующий AON по изобретению, могут быть включены в фармацевтически активную смесь путем добавления фармацевтически приемлемого носителя.
Соответственно, изобретение также относится к композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей AON по изобретению или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Такая композиция может содержать один AON или вирусный вектор по изобретению, но также может содержать множество различных AON или вирусных векторов по изобретению. Такая фармацевтическая композиция может содержать любой фармацевтически приемлемый эксципиент, включая носитель, наполнитель, консервант, адъювант, солюбилизатор и/или разбавитель.
Предпочтительным путем введения является интравитреальная инъекция водного раствора или специально адаптированного состава для внутриглазного введения. В ЕР2425814 раскрыта эмульсия масло-в-воде, специально адаптированная для внутриглазного (интравитреального) введения лекарственных средств на основе пептидов или нуклеиновых кислот. Эта эмульсия менее плотная, чем стекловидная жидкость, так что эмульсия плавает поверх стекловидного тела, избегая того, что инъецируемое лекарственное средство будет ухудшать зрение.
Если используют несколько различных AON по изобретению, то концентрация или доза, определенные в настоящем документе, могут относиться к общей концентрации или дозе всех используемых олигонуклеотидов или к концентрации или дозе каждой используемой или добавленной молекулы пропуска экзона. Поэтому в одном варианте выполнения изобретение относится к композиции, в которой используемое каждое или общее количество AON по изобретению дозируется в количестве от 0,01 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 20 мг/кг. Подходящая интравитреальная доза будет составлять от около 0,05 до около 5 мг, предпочтительно от около 0,1 до около 1 мг на глаз, например, примерно на глаз: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг.
Предпочтительный AON по изобретению предназначен для лечения связанного с USH2A заболевания или состояния индивидуума. Во всех вариантах выполнения изобретения под термином "лечение" подразумевается предотвращение и/или задержка заболевания или состояния, связанного с USH2A. Индивидуум, которого можно лечить с использованием AON по изобретению, может уже быть диагностирован как имеющий заболевание или состояние, связанное с USH2A. Альтернативно, индивидуум, которого можно лечить с использованием AON по изобретению, возможно, еще не был диагностирован как имеющий заболевание или состояние, связанное с USH2A, но может быть индивидуумом, имеющим повышенный риск развития заболевания или состояния, связанного с USH2A, в будущем согласно его или ее генетическому фону. Предпочтительным индивидуумом является человек. В предпочтительном варианте выполнения изобретения заболевание или состояние, связанное с USH2A, является Синдромом Ушера типа П. Соответственно, настоящее изобретение относится к AON по изобретению или вирусному вектору по изобретению или композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для лечения связанного с USH2A заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга USH2A мРНК, и для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения, лечения или задержки заболевания или состояния, связанного с USH2A.
Изобретение далее относится к применению AON по изобретению, или вирусного вектора по изобретению, или композиции по изобретению для получения медикамента, для получения медикамента для лечения заболевания или состояния, связанного с USH2A, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК, и для получения медикамента для предотвращения, лечения или задержки заболевания или состояния, связанного с USH2A. Поэтому в следующем аспекте изобретение относится к применению AON, вирусного вектора или композиции, как определено в настоящем документе, для получения медикамента, для получения медикамента для лечения состояния, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК, и для получения медикамента для предотвращения, лечения или задержки заболевания или состояния, связанного с USH2A. Введение при применении или в способе по изобретению проводят по меньшей мере однократно, в течение одной недели, одного месяца, нескольких месяцев, одного года, 2, 3, 4, 5, 6 лет или дольше, например, пожизненно. Каждый AON, определенный в настоящем документе для применения по изобретению, может быть подходящим для непосредственного введения in vivo в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, уже затронутых или подверженных риску развития заболевания или состояния, связанного с USH2A, и может быть введен непосредственно in vivo, ex vivo или in vitro. Частота введения AON,
композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению может зависеть от нескольких параметров, таких как тяжесть заболевания, возраст пациента, мутация у пациента, количество AON (т.е. доза), состав с указанной молекулой, способ введения и т.д. Частота может варьироваться между ежедневными, еженедельными периодами, по меньшей мере один раз в две недели, или в три недели, или в четыре недели, или в пять недель, или более длительным периодом времени.
Диапазоны доз AON по изобретению предпочтительно созданы на основе исследований с увеличением дозы в клинических испытаниях (использование in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. AON, как определено в настоящем документе, может применяться в дозе, которая варьируется от 0,01 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 20 мг/кг. Подходящая интравитреальная доза может составлять от 0,05 до 5 мг, предпочтительно от 0,1 до 1 мг на глаз, например, примерно на глаз: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг. В предпочтительном варианте выполнения изобретения используют концентрацию AON, как определено в настоящем документе, которая находится в диапазоне от 0,1 нМ до 1 мкМ. Предпочтительно, этот диапазон предназначен для использования in vitro на клеточной модели, такой как на клетках сетчатки или ткани сетчатки. Более предпочтительно, используемая концентрация варьируется от 1 до 400 нМ, еще более предпочтительно от 10 до 200 нМ, еще более предпочтительно от 50 до 100 нМ. Если используется несколько AON, то эта концентрация или доза могут относиться к общей концентрации или дозе AON или к концентрации или дозе каждого AON. В предпочтительном варианте выполнения изобретения вирусный вектор, предпочтительно вектор AAV, как описано ранее в настоящем документе, в качестве носителя для доставки молекулы по изобретению, вводится в дозе от 1 х 109 - 1 х 1017 вирусных частиц на инъекцию, более предпочтительно от 1x1010 - 1x1012 вирусных частиц на инъекцию. Диапазоны концентрации или дозы AON, как указано выше, являются предпочтительными концентрациями или дозами для in vivo, in vitro или ex vivo применений. Специалист в данной области поймет, что в зависимости от используемого AON, целевой клетки, подлежащей лечению, генов-мишеней и уровней их экспрессии, используемой среды и условий трансфекции и инкубации, концентрация или доза используемых AON может еще более варьироваться и может потребоваться дальнейшая оптимизация.
Изобретение также относится к способу модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК в клетке, включающему приведение в контакт клетки, предпочтительно клетки сетчатки, с AON по изобретению, или с вирусным вектором по изобретению, или с композицией по изобретению. Особенности этого аспекта предпочтительно являются такими, которые
определены ранее в настоящем документе. Приведение в контакт клетки с AON по изобретению, или вирусным вектором по изобретению, или с композицией по изобретению может быть выполнено любым способом, известным специалисту в данной области. Включено применение способов для доставки AON, вирусных векторов и композиций, описанных в настоящем документе. Контактирование может быть прямым или косвенным и может быть in vivo, ex vivo или in vitro.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения связанного с USH2A заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК индивидуума, нуждающегося в этом (такого как синдром Ушера типа II), причем указанный способ включает контактирование клетки, предпочтительно клетки сетчатки, указанного человека с AON по изобретению или вирусным вектором согласно изобретению или композицией по изобретению. Особенности этого аспекта предпочтительно являются такими, которые определены ранее в настоящем документе. Приведение в контакт с клеткой, предпочтительно клеткой сетчатки, AON по изобретению, или вирусного вектора по изобретению, или композиции по изобретению может быть выполнено любым способом, известным специалисту в данной области. Включено применение способов доставки AON, вирусных векторов и композиций, описанных в настоящем документе. Контактирование может быть прямым или косвенным и может быть in vivo, ex vivo или in vitro. Предпочтительным заболеванием или состоянием, связанным с USH2A, является Синдром Ушера типа П. Если не указано иное, каждый вариант выполнения изобретения, описанный в настоящем документе, может быть объединен с другим вариантом выполнения изобретения, как в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду (AON), содержащему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0:6, 3, 4, 5, 7, 8, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36 и 37, предпочтительно выбранную из SEQ Ш N0:6, 3, 4, 5, 7, 8, 26, 34, 35 и 37, более предпочтительно выбранную из SEQ Ш N0:6, 3, 4, 5, 7, 8, 26 и 35. AON по настоящему изобретению способны индуцировать, стимулировать или усиливать пропуск псевдо-экзона 40 (РЕ40) в USH2A пре-мРНК, где включение РЕ40 обусловлено или вызвано c.7595-2144A> G, которая часто обнаруживается у пациентов с USH2. Следует понимать, и это подробно описано в примерах, а также на Фиг. 1-5 и в Таблице 1, что AON отсортированы не случайным образом, а образуют три "группы производных" на основе трех новых AON под названием USH2A-FIL40-3, -5 и -7 соответственно следующим образом:
- AON на основе USH2A-PE40-3 (SEQ Ш N0:19) представляют собой AON SEQ ГО N0:3, 5, 7, 24, 25, 26, 34, 35 и 36, с USH2A-PE40-8 (SEQ ГО N0:3), USH2A-PE40-11 (SEQ ГО N0:26), USH2A-PE40-20 (SEQ ГО N0:5), USH2A-PE40-22 (SEQ ГО N0:35) и USH2A-PE40-28 (SEQ ГО N0:7), которые лучше всего работают (см. Фигуру 4 и 5).
- AON на основе USH2A-PE40-5 (SEQ ГО N0:21) представляют собой AON SEQ ГО N0:27, 28 и 29.
- AON на основе USH2A-PE40-7 (SEQ ГО N0:23) представляют собой AON SEQ ГО N0:4, 6, 8, 30, 31, 32 и 37 с USH2A-PE40-17 (SEQ ГО N0:4), USH2A-PE40-24 (SEQ ГО N0:6) и USH2A-PE40-29 (SEQ ГО N0:8), наиболее эффективные (см. Фигуру 4 и 5), где даже USH2A-PE40-17 и -24 превосходят все остальные AON.
Перекрывающаяся последовательность, которая присутствует в очень эффективных AON SEQ ГО N0:6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37, представляет собой 5'-AGAUGAUCUCUUA-3 '(SEQ ГО N0:42), где Цитозин может быть заменен 5-метилцитозином (5шС).
Перекрывающаяся последовательность, которая присутствует в очень эффективных AON SEQ ГО N0:3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36, представляет собой 5'-CGCUGC-3' (SEQ ГО N0:43), где Цитозин может быть заменен 5-метилцитозином (5шС).
Перекрывающаяся последовательность, которая присутствует в очень эффективных AON SEQ ГО N0:21, 27, 28, 29 представляет собой 5'-AUUUCAAUUUCAUGAUUU-3' (SEQ ГО N0:44), где цитозин может быть заменен 5-метилцитозином (5шС).
Следовательно, изобретение также относится к AON, содержащему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:42, 43 и 44.
Целевая область очень эффективных AON SEQ ГО N0:6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37, которая включает предел сплайсинга на 3'-конце последовательности РЕ40, представляет собой 5'-UCCCAAGGUAAGAGAUCAUCUUUAAGAAAAGG-3' (SEQ ГО N0:45).
Целевая область очень эффективных AON SEQ ГО N0:3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36 представляет собой 5'-UCUGCAACAAGAGCAGCGAAUCUACUCAGC-3' (SEQ ГО N0:46).
Целевая область очень эффективных AON SEQ ГО N0:21, 27, 28, 29 представляет собой 5'-GGAAACААAUCAUGAAAUUGAAAUUGAACА-3' (SEQ ID N0:47).
Самый короткий AON, который нацеливается на любую последовательность SEQ ГО N0:45, 46 и 47, составлял 18 нуклеотидов (USH2A-PE40-23 (SEQ ГО N0:36). Таким
образом, изобретение также относится к AON, который способен индуцировать пропуск псевдо-экзона 40 (РЕ40) из USH2A пре-мРНК человека, где указанный AON содержит последовательность, которая комплементарна по меньшей мере 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 последовательным нуклеотидам SEQ Ш N0:45, 46 или 47.
В другом варианте выполнения изобретения оно относится к AON, который способен индуцировать, вызывать, стимулировать и/или усиливать пропуск РЕ40 из USH2A пре-мРНК человека, где указанный AON содержит или состоит из последовательности, выбранной из любой из следующих групп последовательностей: (i) SEQ Ш N0:6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37; (ii) SEQ ID N0:3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36; and (iii) SEQ ID N0:21, 27, 28, 29. В предпочтительном варианте выполнения изобретения указанный AON содержит или состоит из последовательности, выбранной из любой из следующих групп последовательностей: (i) SEQ Ш N0:6, 4, 8; и (ii) SEQ Ш N0:3, 5, 7, 26, 35. В высоко предпочтительном варианте выполнения изобретения указанный AON содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ Ш N0:6 и 4. В конкретном аспекте сохранение РЕ40 в USH2A пре-мРНК (или присутствие РЕ40 в мРНК после того, как сплайсинг завершен) связано с мутацией c.7595-2144A> G в гене USH2A, хотя это не может исключать, что существуют другие (идентифицированные или пока неидентифицированные) мутации в гене USH2A, которые также вызывают присутствие РЕ40 в USH2A мРНК. Предпочтительно, AON по настоящему изобретению представляет собой олигорибонуклеотид (олигонуклеотид РНК), который содержит по меньшей мере одну 2'-0-алкильную модификацию, такую как 2'-0-метил (2'-0-Ме), 2'-0-этил или Т -О-пропил. Другой предпочтительной модификацией является 2'-0-метоксиэтил (2'-0-МОЕ). В одном предпочтительном аспекте все нуклеотиды в AON по настоящему изобретению являются модифицированными 2'-0-метил. Предпочтительно, AON по настоящему изобретению имеет по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, и более предпочтительно все последовательные нуклеотиды в AON по настоящему изобретению связаны между собой фосфоротиоатными связями.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения AON по настоящему изобретению имеет длину от 18 до 143 нуклеотидов, предпочтительно от 18 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 18 до 24 нуклеотидов. В предпочтительном аспекте AON по изобретению содержит 2'-О-алкилфосфоротиоатный антисмысловой олигонуклеотид, такой как модифицированная 2'-0-метил рибоза (РНК), модифицированная 2'-0-этил рибоза, модифицированная Т-О-пропил рибоза и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные. Для повышения терапевтического эффекта может
оказаться полезным применять несколько AON по настоящему изобретению. Следовательно, в другом предпочтительном варианте выполнения изобретение относится к набору AON, причем указанный набор содержит по меньшей мере два AON по изобретению. В другом аспекте изобретение относится к вирусному вектору, экспрессирующему AON по настоящему изобретению при помещении в условия, благоприятные для экспрессии AON. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей AON, набор AON или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Предпочтительно, указанная фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и дозирована в количестве от 0,05 до 5 мг от общего количества AON на глаз. Более предпочтительно, указанная фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и дозирована в количестве от 0,1 до 1 мг от общего количества AON на глаз, например, около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг от общего количества AON на глаз. В еще одном аспекте изобретение относится к AON по изобретению, набору AON по изобретению и, как заявлено здесь, вектору по изобретению или композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно для применения в лечении или профилактике связанного с USH2A заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК. В еще одном аспекте изобретение относится к применению AON по изобретению, набора AON по изобретению, вектора по изобретению или композиции по изобретению для получения лекарственного средства для лечения связанного с USH2A заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК в клетке, причем указанный способ включает приведение в контакт указанной клетки с AON по изобретению, набором по изобретению, вектором по изобретению или композицией по изобретению. Указанная клетка может представлять собой клетку in vitro, клетку ex vivo или клетку in vivo. Указанная клетка, используемая в указанном способе, предпочтительно должна присутствовать в глазу или быть получена от субъекта (человека), страдающего расстройством, связанным с USH2A, или подверженным его риску. Следовательно, в другом предпочтительном аспекте изобретение относится к способу лечения связанного с USH2A заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга USH2A пре-мРНК, такого как синдром Ушера типа II, у индивидуума, страдающего от него, причем указанный способ включает приведение в контакт клетки указанного человека с AON по изобретению, набором по изобретению, вектором по изобретению или композицией по изобретению.
В еще одном аспекте изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду пропуска псевдо-экзона по изобретению, применению по изобретению или способу по изобретению, где связанное с USH2A заболевание или состояние, требующее модуляции сплайсинга USH2A, является синдромом Ушера Типа П. В наиболее предпочтительном аспекте псевдо-экзон, который пропускается при применении антисмысловых олигонуклеотидов по настоящему изобретению, представляет собой псевдо-экзон 40 (РЕ40, SEQ Ш N0:9), как описано в настоящем документе.
В этом документе и в формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используются в его неограничивающем смысле для обозначения того, что признаки, следующие за словом, включаются, а признаки, не упомянутые конкретно, не исключаются. Кроме того, ссылка на признаки с неопределенным артиклем "а" или "ап" не исключает возможности наличия более одного признака, если только контекст явно не требует наличия одного и только одного из признаков. Таким образом, неопределенный артикль "а" или "ап" обычно означает "по меньшей мере один". Слово "около" или "приблизительно" при использовании в сочетании с числовым значением (напр., около 10) предпочтительно означает, что значение может быть заданной величиной (10), более или менее 0,1% от значения. Информация о последовательности, указанная в настоящем документе, не должна быть настолько узко истолкована, что требуется включение ошибочно идентифицированных оснований. Специалист в данной области способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки. Все патентные и литературные ссылки, приведенные в настоящем описании, включены посредством ссылки во всей их полноте.
Примеры
Пример 1. Выбор антисмысловых олигонуклеотидов с улучшенными свойствами пропуска экзона.
Мутация интрона USH2A (c.7595-2144A> G) создает криптический сплайсинговый донорный сайт, который приводит к включению аберрантного экзона (РЕ40) в USH2A мРНК (см. Фигуру 1АВ WO 2016/005514). Добавление AON, направленное против аберрантного экзона, предотвратило бы введение этого экзона, предотвращая связывание факторов, которые необходимы для сплайсинга, таких как комплексы U1- и U2 snRNP и белки, обогащенные серином-аргинином, тем самым восстанавливая нормальный сплайсинг USH2A и синтез белка (Фигура 1С WO 2016/005514). AON могут нацеливать сплайсинговые сайты, а также последовательности экзонов. Было высказано
предположение, что существует положительная корреляция между способностью AON индуцировать пропуск экзона и наличием предсказанных сайтов связывания фактора сплайсинга SC35 в целевой последовательности. Для создания AON с высоким потенциалом пропуска экзона аберрантный экзон USH2A (152 нуклеотида последовательности экзона и 15 нуклеотидов интронной последовательности с каждой стороны) был тщательно изучен для мотивов улучшения связывания сплайсинга экзонов с использованием программы ESE finder 3.0. В пределах аберрантного экзона были предсказаны две области с соответственно тремя и двумя связывающими SC35 мотивами (данные не показаны). Следовательно, два AON были разработаны таким образом, чтобы они охватывали эти области с помощью мотивов SC35, обозначенных AON1 (SEQ Ш N0:1) и AON2 (SEQ ГО N0:2), и были комплементарны USH2A мРНК. В WO 2016/005514 исследован потенциал пропуска экзонов AON1 и AON2 (см. там Фигуру 2).
В этом примере показано, что могут быть идентифицированы, созданы и использованы еще более мощные AON, которые, как представляется, обладают еще более сильным потенциалом пропуска экзона, чем AON1 и AON2, которые были протестированы ранее. Обзор всех вновь проверенных олигонуклеотидов приведен в Таблице 1. Все использованные в настоящем документе антисмысловые олигонуклеотиды были приобретены у Eurogentec, MicroSynth или TriLink и сконструированы с Тт 58°С, и модифицированы 2'-0-метильной группой в цепи сахара и фосфоротиоатном (PS) скелете, и растворены в забуференном фосфатом физиологическом растворе перед применением.
На первом этапе скрининга эффект AON анализировали с использованием репортерной сплайсинговой конструкции pCI-Neo-USH2A-PE40 (WO 2016/005514). Эта конструкция содержит последовательность РЕ40, окруженную 500 нуклеотидами интронной последовательности, которая была вставлена в интрон между экзонами 3 и 5, полученными из гена родопсина. Сначала репортерные плазмиды трансфицировали в клетки НЕК293 с последующей отдельной трансфекцией AON. Репортерные плазмиды трансфицировали с использованием MaxPEI в качестве трансфекционного реагента, а последующие трансфекции AON проводили с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Life Technologies). После 24-часовой инкубации клетки собирали, и экстрагировали РНК с использованием ReliaPrep RNA miniprep kit (Promega), и кДНК получали с использованием Maxima cDNA synthesis kit (Thermo, #EP0734). Включение PE40 в зрелую мРНК анализировали с помощью RT-PCR с праймерами, расположенными во фланкированных экзонах 3 и 5 родопсина.
На Фигуре 1 показан начальный скрининг от USH2A-PE40-1 до -7, который был выполнен с использованием репортерной конструкции в клетках НЕК293 по сравнению с
контрольным олигонуклеотидом и двумя известными AON из WO 2016/005514 (AON1 и AON2). На этом начальном скрине USH2A-PE40-1, -2, -4 и -6 не показали улучшения по сравнению с пропуском экзона РЕ40, как определено с помощью AON1 и AON2 (показаны как R1 и R2 на этой Фигуре, соответственно). Удивительно, однако, что USH2A-PE40-3, -5 и -7 оказались значительно более эффективными, чем AON1 и AON2, причем наиболее эффективным является USH2A-PE40-7.
На Фигуре 2 показана последовательность РЕ40 (как РНК от 5 'до 3') и положения комплементарности AON, протестированных в настоящем документе. USH2A-PE40-1 (SEQ ГО N0:17), USH2A-PE40-2 (SEQ ГО N0:18) и USH2A-PE40-4 (SEQ ГО N0:20) перекрываются с положениями AON1 (SEQ ГО N0:1) и AON2 (SEQ ГО N0:2). Сайты связывания более эффективных USH2A-PE40-3 (SEQ ГО N0:19), USH2A-PE40-5 (SEQ ГО N0:21) и USH2A-PE40-7 (SEQ ГО N0:23) четко расположены в разных регионах от AON1 и AON2 и перекрываются с предполагаемыми ESE (USH2A-PE40-3 и -5) и с сайтом сплайсинга ниже (USH2A-PE40-7; см. также нижнюю панель на Фигуре 1). Следует отметить, что сайт связывания для USH2A-PE40-6 (SEQ ГО N0:22) также находится за пределами области, связанной с помощью A0N1 или A0N2, но перекрывает сайт связывания USH2A-PE40-5 (SEQ ГО N0:21), предполагая, что более эффективная область нацеливания расположена в направлении 5'-конца последовательности РЕ40 до этой области.
Основываясь на первоначальном эксперименте, показанном на Фигуре 1, было ясно показано, что в пределах последовательности РЕ40 имеются другие области, которые оказались более эффективными "горячими точками" для пропуска РЕ40, чем те, которые были нацелены на AON в уровне техники, был разработан еще один набор AON на основе трех выявленных областей, а также для упрощения синтеза, поглощения, эффективности и снижения иммуногенности: AON были укорочены или сдвинуты так, что они имели бы меньшую внутреннюю вторичную структуру. AON были дополнительно модифицированы путем включения изменений оснований, известных для улучшения аффинности связывания: 5-метилцитозин (5тС) вместо Цитозина и 2,6-диаминопурин (DAP) вместо Аденина, смотри Таблицу 1. Предполагается также, что 5тС-модификация улучшит безопасность AON, поскольку она была вовлечена в снижение иммуногенности РНК и AON. USH2A-PE40-8, -9, -10 и -11 были основаны на USH2А-РЕ40-3. USH2A-РЕ40-12, -13 и -14 были основаны на USH2A-PE40-5. USH2A-PE40-15, -16, -17 и -18 были основаны на USH2A-PE40-7. USH2A-PE40-20 и -21 были основаны на USH2A-PE40-8. USH2A-PE40-22 и -23 были основаны на USH2A-PE40-11. USH2A-PE40-24, -25, -26 и -27 были основаны на USH2A-PE40-17. Позиции различных недавно разработанных AON
также представлены на Фигуре 2. Результаты с дополнительными AON представлены на Фигурах 3 и 4. Это показывает, что модификации DAP привели к снижению эффективности (см. USH2A-PE40-26 и -27), и поэтому этот подход был оставлен. Напротив, 5шС-модифицированные AON обычно имели эффективность, аналогичную соответствующим AON с нормальным цитозином. Однако могут наблюдаться незначительные различия в обоих направлениях: 5шС-модифицированный USH2A-PE40-21 был несколько менее эффективным, чем соответствующий USH2A-PE40-8. Было обнаружено, что USH2A-PE40-25 несколько более эффективен, чем исходный USH2A-РЕ40-17. Кроме того, два AON, которые были укорочены с помощью двух нуклеотидов (USH2A-PE40-20 и -24 со ссылкой на -8 и -17, соответственно), показали практически тот же эффект, что и их оригинальные более длинные аналоги. Хотя они не были более эффективными, чем оригинальные, более длинные AON, укороченные версии считались превосходящими из-за того, что их легче синтезировать и они потенциально могли лучше поглощаться. Исходя из этого, наиболее эффективными AON в этих экспериментах являются укороченные олигонуклеотиды USH2A-PE40-20 и -24 (SEQ Ш N0:5 и 6 соответственно) и 5шС-модифицированный USH2A-PE40-22 (SEQ Ш N0:35) и USH2A-РЕ40-25 (SEQIDNO:37).
USH2a-PE40-9
GAUUCGCUGCUCUUGUUGCA
USH2a-PE40-10
GUAGAUUCGCUGCUCUUGUU
USH2a-PE40-ll
GAGUAGAUUCGCUGCUCUUG
USH2a-PE40-12
AUUUCAAUUUCAUGAUUUGUUUCC
USH2a-PE40-13
CAAUUUCAAUUUCAUGAUUUGUUU
USH2a-PE40-14
UGUUCAAUUUCAAUUUCAUGAUUU
USH2a-PE40-15
AAGAUGAUCUCUUACCUUGGGA
USH2a-PE40-16
UAAAGAUGAUCUCUUACCUUGG
USH2a-PE40-17
UUCUUAAAGAUGAUCUCUUACC
USH2a-PE40-18
CCUUUUCUUAAAGAUGAUCUCUUA
USH2a-PE40-19
CAAACCCCCACAAUACACAGC
USH2a-PE40-20
CGCUGCUCUUGUUGCAGA
USH2a-PE40-21
UUXGXUGXUXUUGUUGXAGA
USH2a-PE40-22
GAGUAGAUUXGXUGXUXUUG
USH2a-PE40-23
GCUGAGUAGAUUCGCUGC
USH2a-PE40-24
CUUAAAGAUGAUCUCUUACC
USH2a-PE40-25
UUXUUAAAGAUGAUXUXUUAXX
USH2a-PE40-26
UUCUUZZZGZUGZUCUCUUZCC
USH2a-PE40-27
UUXUUZZZGZUGZUXUXUUZXX
USH2a-PE40-28
XGXUGXUXUUGUUGXAGA
USH2a-PE40-29
XUUAAAGAUGAUXUXUUAXX
USH2A-PE40-8, -17, -20, -24, -28 и -29 (SEQ Ш NO:от 3 до 8) дополнительно тестировали на их эффективность в способности пропускать экзоны и на иммуногенность in vitro. Целевая нуклеотидная последовательность для олигонуклеотидов USH2A-PE40-8, -20 и -28 (с которой (частично) перекрываются олигонуклеотиды) представляет собой следующую: 5'-TCTGCAACAAGAGCAGCGAA-3' (SEQ ГО N0:10), расположенную в пределах РЕ40. Целевая нуклеотидная последовательность для олигонуклеотидов USH2A-РЕ40-17, -24 и -29 (с которой (частично) перекрываются олигонуклеотиды) представляет собой следующую: 5' -AGG*TAAGAGATC ATCTTTAAGAA-3' (SEQ ГО N0:11), расположенную частично в РЕ40 (подчеркнутый AG) и его фланкирующем участке, содержащем мутацию c.7595-2144A> G (жирный гуанозин со звездочкой).
Фибробласты собирали у пациента с USH2, несущего c.7595-2144A> G USH2A и гетерозиготную мутацию соединения c.2391_2392del. Клетки выдерживали при 37°С в
среде DMEM AQ, содержащей 20% FBS и 1% NaPyr (Sigma Life Sciences). Клетки высеивали с плотностью 1,0x106 клеток/лунку. AON объединяли с Lipofectamine 2000 (Life Technologies, lot: 1699509) в OptiMem (lot: 1697387) в течение 30 мин, а затем добавляли к фибробластам в концентрации 100 нМ. Инкубация продолжалась еще 24 ч. Клетки обрабатывали циклогексамидом в течение 4 ч в конце инкубационного периода, продолжавшегося 24 ч, для ингибирования расщепления нонсенсно-опосредованной мРНК. После 24 ч инкубации клетки собирали и РНК экстрагировали с использованием набора ReliaPrep RNA miniprep (Promega) по протоколу производителя. Затем кДНК готовили с использованием набора Maxima cDNA synthesis (Thermo, # EP0734, lot: 00335736), используя схему из Таблицы 2 и следуя протоколам производителя. Уровни РЕ40 и кДНК дикого типа определяли с использованием капельной цифровой PCR (ddPCR) (считыватель капель QX2000), применяя схему пипетирования из Таблицы 3 и праймеры из Таблицы 4. Данные были проанализированы с помощью Quanta Life Software и Excel. GUSB (Applied Biosystems, ot: PI60210-006 E01) использовали в качестве гена "домашнего хозяйства", используя способы, известные специалисту в данной области.
На Фигуре 5 показано количество капель, экспрессирующих РЕ40 по сравнению с диким типом, скорректированным на уровни экспрессии GUSB в фибробластах пациентов, обработанных восемью различными AON вместе с одним необработанным образцом (NT). Очевидно, что в первую очередь AON1, AON2, USH2A-PE40-17 (SEQ ГО N0:4) и USH2A-PE40-24 (SEQ ГО N0:6), на фигуре 5 обозначенные как USH-PE0-17 и USH-PE40-24, оказались наиболее эффективными в увеличении возникновения уровней дикого типа и превосходили два известных олигонуклеотида AON1 и AON2, тогда как другие четыре AON были менее эффективными. Важно отметить, что также наблюдалось, что USH2A-PE40-17 и USH2A-PE40-24 способны снижать уровни РЕ40, что не наблюдалось с AON1 и AON2, что свидетельствует о том, что эти два новых антисмысловых олигонуклеотида пропуска псевдо-экзона (USH2A-PE40-17 и USH2A-РЕ40-24) в этом сеттинге работают еще лучше, чем два известных олигонуклеотида. Кроме того, следует отметить, что другие четыре олигонуклеотида (USH2A-PE40-8, -20, -28 и -29 также способны понижать уровни РЕ40 по сравнению с двумя известными олигонуклеотидами AON1 и AON2, что делает эти четыре олигонуклеотида также превосходящими олигонуклеотиды из уровня техники.
Таблица 2: приготовление кДНК
На образец
На образец
Ген-специфический
Рандомные Гексам.
буфер синтеза 5Х кДНК
4 мкл
4 мкл
Смесь dNTP
2 мкл
2 мкл
ddPCR.USH2a-PE40.Rv2
1 мкл
Рандомные Гексамеры
1 мкл
Максимум Смеси Ферментов
1 мкл
1 мкл
Матрица (150-600 нг РНК)
Вода без нуклеазы
До 20 мкл с водой
До 20 мкл с водой
Общий объем
20 мкл
20 мкл
Генный специфический праймер использовался для образцов и Рандомных Гексамеров для GUSB "домашнего хозяйства".
SEQ Ш N0:13
ddPCR.USH2a-PE40.Rv4 SEQ Ш NO: 14
5' -GCC AGGTGACC AAC АТС ATT-3'
ddPCR.USH2a-PE40.FAM SEQ Ш N0:15
5'-/ 56-FAM / CAGCCAGAGCAGGAAGCT / 3BHQ1 / 3'
ddPCR.USH2a-WT.HEX SEQ Ш N0:16
5'-/ 5HEX / GCAGAGGACAAACCTGGA / 3BHQ1 / 3'
Пример 2. Токсичность in vitro новых антисмысловых олигонуклеотидов.
Олигонуклеотиды имеют потенциал вызывать активацию так называемых рецепторов распознавания паттерна (PRR) врожденной иммунной системы позвоночных (Bauer et al. 2008. Immunobiology 213:315-328). Наиболее хорошо изученное семейство PRR-рецепторов представляет собой Толл-подобные рецепторы (TLR). TLR представляют собой класс белков, которые играют ключевую роль во врожденной иммунной системе. Они представляют собой одинарные трансмембранные, некаталитические рецепторы, которые обычно экспрессируются в макрофагах и дендритных клетках, которые распознают структурно консервативные молекулы, полученные из микробов. TLR, которые активируются различными типами нуклеиновых кислот, представляют собой те, которые расположены на эндосомах: TLR3 распознает двухцепочечную РНК; TLR7/8 распознает двойную и одноцепочечную РНК.
После распознавания этих компонентов с помощью PRR, запускается специфический "антимикробный" иммунный ответ. Активация TLR приводит к активации усилителя ядерного фактора лёгкой каппа-цепи активированных В-клеток (NF-кВ), регуляторного фактора Интерферона 3 (IRF-3) и активаторного белка 1 (АР-1) (Kawasaki 2014. Front Immunol 25:461). Активация АР-1, IRF-3 и NF-кВ приводит к продуцированию воспалительных цитокинов, интерферонов типа I и других медиаторов врожденного иммунного ответа. Эти процессы не только инициируют немедленные реакции защиты организма, такие как воспаление, но также примированный и организованный антиген-специфичные адаптивные иммунные ответы.
In vitro воздействие первичных мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) использовалось для оценки (системных) специфических для лекарственного средства иммунных ответов и иммунотоксичности, как описано ранее (Lankveld 2010. Methods Mol Biol 598:401-423). Анализ in vitro с использованием РВМС представляет собой признанный доклинический тест с использованием получения (воспалительных) цитокинов в качестве суррогатного маркера системных иммунных
ответов. Анализ РВМС позволяет предсказать переносимость как фактор потенциала иммуногенности и аллергенности исследуемых соединений и может позволить оценить безопасный диапазон дозировки для этих соединений.
Для изучения USH2A РЕ40-20, USH2A РЕ40-24, USH2A РЕ40-28 и USH2A РЕ40-29 в "доме" использовали выделенные РВМС, полученные из лейкоцитарных плёнок здоровых доноров из банка крови. Получение ключевых провоспалительных цитокинов в супернатантной культуре оценивали через 24 ч стимуляции олигонуклеотидами в концентрациях 1 и 4 мкМ. Кроме того, анализировали жизнеспособность РВМС после обработки олигонуклеотидами путем измерения флуоресцентного резоруфина в супернатантной культуре для оценки потенциального цитотоксического эффекта AON USH2A-PE40. Жизнеспособные клетки превращают нефлуоресцентный ресазурин в флуоресцентный резоруфин (O'Brien et al. 2000. Eur J Biochem 267:5421-5426).
Стимуляция РВМС человека с положительными контролями LPS (агонист TLR4) при 100 нг/мл и R848 (агонист TLR7/8) при 1 мкМ приводила к значительному увеличению концентрации всех измеренных цитокинов, МСР-1, в супернатантной культуре. Кроме того, стимуляция с помощью R848 вызывала аналогичную картину цитокинов, хотя и в меньшей степени. Тепловая карта, изображающая уровни значимости концентраций цитокинов в супернатантной культуре после стимуляции олигонуклеотидами по настоящему изобретению или положительными контролями в сравнении с обработанными физиологическим раствором РВМС человека показана на Фигуре 6А. Важно отметить, что стимуляция РВМС человека олигонуклеотидами по настоящему изобретению в концентрации 1 и 4 мкМ не приводила к увеличению концентрации или приводила к очень незначительным повышенным концентрациям любого из измеренных цитокинов в супернатантной культуре. Наконец, не было признаков цитотоксичности через 24 часа после обработки олигонуклеотидами (Фигура 6В).
Пример 3. Пропуск РЕ40 в USH2A мРНК в глазных бокалах, полученных от пациента с USH2
Сетчатка не может быть получена у пациентов с USH2 и использоваться для исследований in vitro по очевидным причинам. В качестве альтернативы для таких доклинических исследований можно создавать органоиды, которые напоминают такой материал сетчатки пациента, и здесь называются глазными бокалами, а иногда также называются глазными чашками. Для получения глазных бокалов использовали фибробласты пациентов с Синдромом Ушера типа II, имеющих мутации USH2A с.7595
2144A> G (p.Lys2532Thrfs*56) и c.2299delG (p.Glu767Serfs*21) в сложной гетерозиготности. Фибробласты были перепрограммированы с использованием четырех лентивирусов, экспрессирующих Oct3/4, Sox2, Klf4 и с-Мус и великодушно предоставленных Radboud UMC Stem Cell Technology Center. Клоны криоконсервировали возле прохода 6 и дополнительно анализировали на экспрессию маркеров плюрипотентных стволовых клеток SSEA-4, NANOG, TRA1-81 и ОСТЗ/4 с помощью иммуноцитохимии. Всего было создано и сохранено 3 отдельных клона. Эти клоны прошли все определенные стадии контроля качества (активация маркеров стволовых клеток (RT-qPCR) и экспрессия маркеров стволовых клеток и плюрипотентности (ШС) (данные не показаны). Линию iPSC культивировали в глазных бокалах, как описано ранее (Zhong et al 2014. Nature Comm 5:4047;1-12). iPSC были дифференцированы в небольшие комки и культивированы в суспензии со средой mTeSRl и 10 мкМ Блеббистатина (Sigma) для индукции образования агрегатов. Агрегаты переносили в среду с нейральной индукцией, содержащей DMEM/F12, 1% добавки N2, 1 х минимальную необходимую среду - заменимые аминокислоты, 2 мкг мл"1 гепарина (Sigma). Агрегаты высевали на чашки с покрытием Matrigel. Среду меняли ежедневно. После четырехнедельной дифференцировки домены нейронной сетчатки вручную отделяли и культивировали в суспензии в среде DMEM/F12, дополненной 2% В27, 1 х NEAA и 1% антибиотиком-антимикотиком, в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Среду меняли два раза в неделю. В инкубаторе они постепенно формировали трехмерные глазные бокалы. После успешного создания глазных бокалов, полученных из iPSC, их обрабатывали USH2A-PE40-24 в течение одного месяца при 2 мкМ и 10 мкМ путем обновления среды, содержащей AON, через день. Анализ транскрипта USH2A проводили для определения включения РЕ40 в зрелую мРНК с праймерами 5'-GCTCTCCCAGATACCAACTCC-3' (SEQ Ш N0:40) и 5'-GATTCACATGCCTGACCCTC-3' (SEQ Ш N0:41), расположенными во фланкирующих экзонах 39 и 42 соответственно. Общую РНК выделяли из iPSC и глазных бокалов с использованием изоляционного набора Nucleospin RNA II (MACHEREY-NAGEL #740955.50, Diiren - Germany) в соответствии с предоставленным протоколом. Впоследствии использовали 0,5-1,0 мкг от общей РНК для синтеза кДНК с набором обратной транскриптазы Superscript VILO (ThermoFisher Scientific; cat.# 11755050; lotJ 1718541). USH2A, LIN28A, OCT3/4, NANOG и SOX2 затем амплифицировали с использованием прямых и обратных праймеров. В качестве сравнения использовался ген "домашнего хозяйства" GUSB. GoTaq (Promega А6001) использовали для амплификации USH2A, LIN28A, ОСТЗ/4, NANOG, SOX2 и GUSB кДНК в триплексе на машине qPCR. Необработанные глазные бокалы будут давать полосу дикого типа (900 bp)
и полосу, содержащую последовательность РЕ40 (1052 bp), которая легко различается в геле.
Результат, представленный на Фигуре 7, показывает, что обе концентрации (2 мкМ и 10 мкМ) олигонуклеотида USH2A-PE40-24 (SEQ Ш N0:6) при использовании на глазных бокалах, полученных из фибробластов пациента с USH2, были достаточными для индукции полного пропуска РЕ40, поскольку не может быть обнаружен никакой транскрипт, включая РЕ40. Неясно, какая конечная верхняя неспецифическая слабая полоса находится в контр-полосе.
Из этих результатов делается вывод о том, что антисмысловой олигонуклеотид, и в данном конкретном случае USH2A-PE40-24, способен эффективно пропускать РЕ40 из USH2A пре-мРНК в органоидах, которые напоминают сетчатку (гетерозиготный РЕ40) пациента, страдающего Синдромом Ушера типа П.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ПРОКЬЮЭР ТЕРАПЬЮТИКС II Би.Ви.
<120> ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЛАЗ <130> P068294WO
<140> <141>
Неизвестен 2017-04-25
<150> <151>
GB1607141.7 2016-04-25
<160> 48
<170> SeqWin2010, version 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 1
gugugauucu ggagaggaag cug
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400> 2
cccuuaaaag ccagcauaca
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400> 3
uucgcugcuc uuguugcaga
<210> <211> <212> <213>
22 РНК
Искуственная последовательность
Антисмысловой олигонуклеотид
<220> <223>
<400> 4
uucuuaaaga ugaucucuua cc
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 5
cgcugcucuu guugcaga 18
<210> 6
<211> 20
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 6
cuuaaagaug aucucuuacc 20
<210> <211> <212> <213>
18 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<220> <221> <222> <223>
misc_feature 1, 3, 6, 8, 15
X представляет собой 5-метилцитозин
(5mC)
<400> 7
xgxugxuxuu guugxaga
<210> <211> <212> <213>
20 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<220> <221> <222> <223>
misc_feature
1, 13, 15, 19, 20
X представляет собой 5-метилцитозин (5mC)
<400> 8
xuuaaagaug auxuxuuaxx
<210> 9
<211> 152
<212> ДНК
<213> Псевдо-экзон 40
<400> 9
cttcctctcc agaatcacac aagttaaagg tcagccagag caggaagcta ataaaatgta aaattgaaat tgaacacctc tcctttccca acccttctgc aacaagagca gcgaatctac 60 tgctggcttt taagggggaa acaaatcatg 120 ag 152
<212> ДНК
<213> Часть псевдо-экзона 40
<400> 10
tctgcaacaa gagcagcgaa
<210> 11
<211> 23
<212> ДНК
<213> Часть псевдо-экзона 40
<400> 11
aggtaagaga tcatctttaa gaa
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Мультиплексный праймер ddPCR и зонд
<400>
tccaatggat ttggcagtgc
<210> <211> <212> <213>
13 20 ДНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Мультиплексный праймер ddPCR и зонд
<400>
gttctcaagt atagacggcc
<210> <211> <212> <213>
14 20 ДНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Мультиплексный праймер ddPCR и зонд
<400>
gccaggtgac caacatcatt
<210> 15
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Мультиплексный праймер ddPCR и зонд
<400>
cagccagagc aggaagct
<210> 16
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<223> Мультиплексный праймер ddPCR и зонд
<400> 16
gcagaggaca aacctgga
<210> <211> <212> <213>
17 20 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 17
ggagaggaag cugaaagcag
<210> <211> <212> <213>
18 20 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 18
gaaggguccu uuaacuugug
<210> 19
<211> 19
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 19
agauucgcug cucuuguug
<210> 20
<211> 20
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 20
cauuuuauua gcuuccugcu
<210> 21
<211> 24
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
uucaauuuca auuucaugau uugu
Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 22
gagguguuca auuucaauuu c
<210> 23
<211> 22
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
cuuaaagaug aucucuuacc uu
<210> 24
<211> 20
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
gauucgcugc ucuuguugca
<210> 25
<211> 20
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
guagauucgc ugcucuuguu
<210> <211> <212> <213>
26 20 РНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
gaguagauuc gcugcucuug
<210> <211> <212> <213>
27 24 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
auuucaauuu caugauuugu uucc
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 28
caauuucaau uucaugauuu guuu
<210> 29
<211> 24
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
uguucaauuu caauuucaug auuu
<210> <211> <212> <213>
30 22 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
aagaugaucu cuuaccuugg ga
<210> <211> <212> <213>
31 22 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
uaaagaugau cucuuaccuu gg
<210> 32
<211> 24
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400>
ccuuuucuua aagaugaucu cuua
<210> 33
<211> 21
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 33
caaaccccca caauacacag c
<210> <211> <212> <213>
34 20
РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<220> <221> <222> <223>
misc_feature 3, 5, 8, 10, 17
X представляет собой 5-метилцитозин (5mC)
<400> 34
uuxgxugxux uuguugxaga
<210> <211> <212> <213>
35 20 РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Антисмысловой олигонуклеотид
<220> <221> <222> <223>
misc_feature
10, 12, 15, 17
X представляет собой 5-метилцитозин
(5mC)
<400> 35
gaguagauux gxugxuxuug
<210> 36
<211> 18
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<400> 36
gcugaguaga uucgcugc 18
<210> 37
<211> 22
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<222> 3, 15, 17, 21, 22
<223> X представляет собой 5-метилцитозин (5mC)
<400> 37
uuxuuaaaga ugauxuxuua xx 22
<210> 38
<211> 22
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 7, 8, 10, 13, 20
<223> Z is 2, 6-diaminopurine (DAP)
<400> 38
uucuuzzzgz ugzucucuuz cc 22
<210> 39
<211> 22
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<222> 3, 15, 17, 21, 22
<223> X представляет собой 5-метилцитозин (5mC)
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 7, 8, 10, 13, 20
<223> Z is 2, 6-diaminopurine (DAP)
<400> 39
uuxuuzzzgz ugzuxuxuuz xx 22
<210> 40
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Праймер ПЦР
<400> 40
gctctcccag ataccaactc c 21
<210> <211> <212> <213>
41 20 ДНК
Искуственная последовательность
<220>
<223> Праймер ПЦР <400> 41
gattcacatg cctgaccctc 20
<210> 42
<211> 13
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<223> Перекрывающаяся последовательность антисмыслового олигонуклеотида
<400> 42 agaugaucuc uua
<210> <211> <212> <213>
43 6
РНК
Искуственная последовательность
<220> <223>
Перекрывающаяся последовательность антисмыслового олигонуклеотида
<400>
cgcugc
<210> 44
<211> 18
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Перекрывающаяся последовательность антисмыслового олигонуклеотида
<400> 44
auuucaauuu caugauuu 18
<210> 45
<211> 32
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220> <223>
Целевая последовательность антисмыслового олигонуклеотида
<400>
ucccaaggua agagaucauc uuuaagaaaa gg
<210> <211> <212> <213>
46 30 РНК
Искуственная последовательность
<220>
<223> Целевая последовательность антисмыслового олигонуклеотида
<400> 46
ucugcaacaa gagcagcgaa ucuacucagc 30
<210> 47
<211> 30
<212> РНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Целевая последовательность антисмыслового олигонуклеотида
<400> 47
ggaaacaaau caugaaauug aaauugaaca
<210> 48
<211> 187
<212> ДНК
<213> Псевдо-экзон 40 и фланкирующие последовательности
<400> 48
ctgctttcag cttcctctcc agaatcacac aagttaaagg acccttctgc aacaagagca 60
gcgaatctac tcagccagag caggaagcta ataaaatgta tgctggcttt taagggggaa 120
acaaatcatg aaattgaaat tgaacacctc tcctttccca aggtaagaga tcatctttaa 180
gaaaagg 187
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антисмысловой олигонуклеотид (AON), способный индуцировать пропуск псевдо-экзона 40 (РЕ40) из USH2A пре-мРНК человека, где указанный AON содержит последовательность, которая комплементарна по меньшей мере 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 последовательным нуклеотидам SEQ Ш N0:45, 46 или 47.
2. Антисмысловой олигонуклеотид (AON), способный индуцировать пропуск псевдо-экзона 40 (РЕ40) из USH2A пре-мРНК человека, где указанный AON содержит последовательность, выбранную из любой из следующих групп последовательностей:
(i) SEQ Ш N0:6, 4, 8, 23, 30, 31, 32, 37;
(ii) SEQ Ш N0:3, 5, 7, 19, 24, 25, 26, 34, 35, 36; и
(iii) SEQ Ш N0:21, 27, 28, 29.
3. AON по п. 1 или 2, где появление РЕ40 в USH2A мРНК обусловлено мутацией C.7595-2144A> GB гене USH2A.
4. AON по любому одному из пп. 1-3, где указанный AON представляет собой олигорибонуклеотид (олигонуклеотид РНК), содержащий по меньшей мере одну Т-О-алкильную модификацию, такую как 2'-0-метил, 2'-0-этил или 2'-0-пропил.
5. AON по п. 4, в котором все нуклеотиды в указанном AON являются модифицированными 2'-0-метилом.
6. AON по любому одному из пп. 1-5, в котором указанный AON имеет по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь.
7. AON по п. 6, в котором все последовательные нуклеотиды связаны между собой фосфоротиоатными связями.
8. Вирусный вектор, экспрессирующий AON по любому одному из пп. 1-3 при помещении в условия, способствующие экспрессии AON.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая AON по любому одному из пп. 1-7 или вирусный вектор по п. 8 и фармацевтически приемлемый эксципиент, где фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения.
10. Фармацевтическая композиция по п. 9, где фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и дозируется в количестве от 0,05 мг до 5 мг, предпочтительно от 0,1 до 1 мг от общего количества AON на глаз, таком как около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг от общего количества AON на глаз.
11. AON по любому одному из пп. 1-7, вектор по п. 8 или композиция по п. 9 или 10 для применения в качестве лекарственного средства.
12. AON по любому одному из пп. 1-7, вектор по п. 8 или композиция по п. 9 или 10 для лечения, предотвращения или задержки заболевания, связанного с USH2A, такого как Синдром Ушера типа II, или состояния, требующего пропуска РЕ40 из USH2A пре-мРНК.
13. Применение AON по любому одному из пп. 1-7, вектора по п. 8 или композиции по п. 9 или 10, для производства лекарственного средства для лечения, предотвращения или задержки заболевания, связанного с USH2A, или состояния, требующего пропуска РЕ40 из USH2A пре-мРНК.
14. Способ пропуска РЕ40 из USH2A пре-мРНК человека в клетке, где указанный способ включает введение в указанную клетку AON по любому одному из пп. 1-7, вектора по п. 8 или композиции по п. 9 или 10; и позволяя AON индуцировать, вызывать или стимулировать пропуск РЕ40 из USH2A пре-мРНК человека.
15. Способ лечения заболевания, связанного с USH2A, или состояния, требующего пропуска РЕ40 из USH2A пре-мРНК у индивидуума, страдающего от него, где указанный способ включает введение в клетку указанного индивидуума AON по любому одному из пп. 1-7, вектора по п. 8 или композиции по п. 9 или 10, и позволяя указанному AON индуцировать, вызывать или стимулировать пропуск РЕ40 из USH2A пре-мРНК человека.
16. Применение по п. 13 или способ по п. 15, где заболевание, связанное с USH2A, или состояние, требующее пропуска РЕ40 из USH2A пре-мРНК, представляет собой Синдром Ушера Типа П.
400-
/"I т-
50 • IS -
PF40
PE40
5 ' -C[7GC[7[7[7CAGCUUCCUCUCCAGAAUCACACAAGUUAAAGGACCCUUCUGCAACAAGAGCAGCGAAUCUACUCAGCCAGAGCAGGAAGCUAAUA
3'-GUCGAAGGAGAGGUCUUAGUGUG-5 ' (1) 3'-GACGAAAGUСGAAGGAGAGG-5 ' (17)
3'-GUGUUCAAUUUCCUGGGAAG-5 ' (18)
(20) 3'-UCGUCCUUCGAUUAU 3'-AGACGUUGUUCUCGUCGCUU-5 ' (3) 3'-AGACGUUGUUCUCGUCGC-5' (5) 3'-AGAXGUUGUUXUXGUXGX-5 ' (7)
3'-GUUGUUCUCGUCGCUUAGA-5 ' (19) 3'-ACGUUGUUCUCGUCGCUUAG-5 ' (24)
3'-UUGUUCUCGUCGCUUAGAUG-5' (25) 3'-GUUCUCGUCGCUUAGAUGAG-5' (26) 3'-AGAXGUUGUUXUXGUXGXUU-5' (34)
3'-GUUXUXGUXGXUUAGAUGAG-5' (35)
3'-CGUCGCUUAGAUGAGUCG-5' (36)
AAAUGUAUGCUGGCUUUUAAGGGGGAAACAAAUCAUGAAAUUGAA UAAGAGAUCAUCUUUAAGAAAAGG
3'-ACAUACGACCGAAAAUUCCC-5 ' (2) UUUAC-5' (20)
3'-UGUUUAGUACUUUAACUUUAACUU-5 ' (21)
3'-CUUUAACUUUAACUUGUGGAG-5 ' (22) 3'-CCUUUGUUUAGUACUUUAACUUUA-5 ' (27) 3'-UUUGUUUAGUACUUUAACUUUAAC-5' (28)
3'-UUUAGUACUUUAACUUUAACUUGU-5' (29)
3'-CCAUUCUCUAGUAGAAAUUCUU-5 ' (4) 3'-CCAUUCUCUAGUAGAAAUUC-5 ' (6) 3'-XXAUUXUXUAGUAGAAAUUX-5 ' (8) 3'-UUCCAUUCUCUAGUAGAAAUUC-5 ' (23) 3'-AGGGUUCCAUUCUCUAGUAGAA-5 ' (30) 3'-GGUUCCAUUCUCUAGUAGAAAU-5 ' (31)
3'-AUUCUCUAGUAGAAAUUCUUUUCC-5 ' (32) 3'-XXAUUXUXUAGUAGAAAUUXUU-5 ' (37)
-лп-ш яОл. USH23-PE40-3 uSH2a-PtdC-5 U5H'2a~PE40-7
9 (3) 10 il 12 13 (5) 14 ,15 16 \7) 17 13 19
На основе 8
AON: - Контр. 8 20 21
Примечание : короткий 5тС
На основе 11 На основе 17
11 22 23 17 24 25 26 27
SmC короткий SmC DAP SmC-DAP
AON1 AON2 17 24 29 8 20 28
г ~
, tlStlftf
. ВЩ2"1
.IISIIiiF
\IM ¦
1 : MKM
; г.гк.м
~ мкМ
; мкМ
'.' ',¦ is: -j.ui
ll i.
l.if
: ¦
. ' - , ,
Н- If.
IBHHflB
I.G4
! ";
It и
[ t;,§4
Xs.Jr.S
• . •
Ц Я
1,62
i, :. ¦ 1
-: is
\w m
: ¦-
TNF a
1 • *"*
1.45
1 ¦-:
13*,'/0
If S-y
: i
'. v'
= c
\ i
i.SS
:s,5i
H •?
¦ ,i
1J4
i ¦•¦
. .
- '
'JLflll
¦ :..
Lit
JUL
M < И-J
1 ii-w - .
¦НИ
ИДИ
¦ВИД
2ih
г-'
А 1.5Н
S -в1
1.0
!Г1
I 1 0.5"
а, Ё
" о
0.0
1мкМ4мкМ 1 мкМ 4 мкМ 1 MK.V - -.п.М 1. nZ.l - мк.М LPS R848 Фн р-р
1 It II IE I
PE4Q-20 РЕ40-24 РЕ40-2Я РЕ40-29
Пациент
Здоровый контроль (гетерозиготный РЕ40)
Контр. Контр. USH2A- USH2A- Контр USH2A- USH2A-
2мкМ 10мк\1РЕ40-24 РЕ40"г4 10мкМРМ°-24 РИ0"г4
2ыкМ ЮмкМ 2МКМ ЮМКМ
(19)
(19)
(19)
<210> 5 <211> 18
<210> 5 <211> 18
<210> 5 <211> 18
<210> 5 <211> 18
<210> 5 <211> 18
<210> 10 <211> 20
<210> 10 <211> 20
<210> 10 <211> 20
<210> 10 <211> 20
<210> 10 <211> 20
<210> 10 <211> 20
<210> 10 <211> 20
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<210> 28 <211> 24
<220>
<220>
<220>
1/7
Фиг. 1
2/7
Фиг. 2
3/7
Фиг. 3
4/7
Фиг. 4
5/7
Фиг. 5
6/7
Фиг. 6
6/7
Фиг. 6
6/7
Фиг. 6
6/7
Фиг. 6
7/7
