(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции, содержащей синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, к способу ее получения и ее применению при лечении синдрома сухого глаза.
Евразийское (21) 201892389 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.28
(51) Int. Cl.
A61K 9/00 (2006.01) A61P 27/04 (2006.01) A61K 47/36 (2006.01)
(54) ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СИНЕРГИЧЕСКУЮ КОМБИНАЦИЮ ГЛИКОГЕНА И ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛИ
(31) 16168464.2
(32) 2016.05.05
(33) EP
(86) PCT/EP2017/060158
(87) WO 2017/191041 2017.11.09
(71) Заявитель:
АЦЬЕНДЕ КИМИКЕ РЬЮНИТЕ АНДЖЕЛИНИ ФРАНЧЕСКО
А.К.Р.А.Ф. С.П.А. (IT)
(72) Изобретатель:
Либерати Элиза, Руссо Винченцо, Раньи Лорелла, Санто Джузеппе, Тонджани Серена (IT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции, содержащей синерги-ческую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, к способу ее получения и ее применению при лечении синдрома сухого глаза.
24 ч
72 ч
НСЕ
ПОВРЕЖДЕННАЯ НСЕ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-552670ЕА/019
ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СИНЕРГИЧЕСКУЮ КОМБИНАЦИЮ ГЛИКОГЕНА И ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛИ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции, содержащей синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее соли, к способу ее получения и ее применению при лечении синдрома сухого глаза.
В частности, настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции, в которой гликоген и гиалуроновая кислота (НА) или ее фармацевтически приемлемая соль присутствуют в количествах, которые обеспечивают синергическое увеличение в терапевтической эффективности.
Офтальмологическая композиция настоящего изобретения полезна при облегчении симптомов дискомфорта в глазах, являющегося результатом хронического отсутствия достаточного смазывания и увлажнения глаза, связанных с возможным повреждением поверхности эпителия.
Уровень техники
Слезная пленка представляет собой относительно стабильную, тонкую пленку, образованную поверхностным липидным слоем и водным слоем, смешанным со слизистым гелеобразным слоем, который является частичным разделительным слоем между поверхностью эпителия роговицы и конъюнктивы. Естественная слезная пленка имеет большое значение для смазывания и сохранения поверхности глаза.
Синдром сухого глаза (DES) представляет собой многофакторное заболевание, характеризующееся неспособностью глаза поддерживать слой слезы, достаточный для его смазывания должным образом. DES характеризуется дисфункцией одного или более компонентов слезной пленки, приводя к потере стабильности слезной пленки, повышению осмолярности слезной пленки и воспалению поверхности глаза. Это состояние связано с симптомами глазного дискомфорта, такими как зуд, раздражение, ощущение инородного тела, покраснение, светобоязнь и боль. Эти симптомы
часто обостряются в конце дня или после продолжительных периодов времени, требующих зрительного внимания, таких как чтение, вождения или работа на компьютере.
DES может быть результатом одной из следующих причин: снижение выработки слезной жидкости, чрезмерное испарение слезной пленки, нарушение в выработке слизи или липидов, обычно обнаруживаемое в слезном слое. Недостаточная выработка слезной жидкости слезной железой может быть результатом возраста, гормональных изменений или различных аутоиммунных заболеваний, таких как основной синдром Шегрена, ревматоидный артрит или волчанка. Потеря водянистости слезного слоя обычно является результатом недостаточности вышележащего липидного слоя. Некоторые лекарственные препараты, такие как антигистаминные средства, антидепрессанты, бета-блокаторы и пероральные контрацептивы могут уменьшить выработку слезной жидкости. LASIK и другие процедуры коррекции зрения могут вызвать сухость глаз, после того, как они доходят до поверхности глаз и уменьшают чувствительность роговичного нерва. После этого глаза не в состоянии ощутить потребность в смазывании, и в результате, недостаточно вырабатывают слезную жидкость.
DES, если не лечить и не корректировать, может привести к постоянному повреждению глаз с деградацией поверхностных глазных тканей или распаду ткани роговицы, требуя, в крайних случаях, пересадки роговицы.
Наиболее распространенное лечение глазного дискомфорта,
являющегося результатом хронического отсутствия достаточного
смазывания и влаги глаза, включает облегчение симптомов путем
местного введения заменителя слезы, который добавляет объем
жидкости в передней поверхности глаза. Искусственными слезами
пытаются заменить природные слезы, имитируя их высокое
содержание в воде и их физико-химические свойства (осмолярность,
рН, вязкость, смачивающую способность). Типичные заменяющие
слезы композиции состоят из водорастворимых водных полимерных
композиций. В местно вводимых офтальмологических композициях
были использованы многие полимеры. Среди них включенными
являются целлюлозные полимеры, такие как
гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза и
этилгидроксиэтилцеллюлоза. Кроме того, включенными являются синтетические полимеры, такие как карбоксивиниловые полимеры и поливиниловый спирт. Другие еще включают полисахариды, такие как ксантановая камедь, гуаровая камедь, декстран и гиалуроновая кислота. Комбинации полимеров также использовались в офтальмологических композициях. Определенные комбинации полимеров известны, как обеспечивающие синергическое воздействие на вязкость и, в некоторых случаях, даже на фазовый переход от жидкости в гель.
Искусственные слезы доставляют в глаза в виде капель, и они подвергаются быстрому дренажу через носослезный канал. Чтобы преодолеть эту проблему, искусственные слезы состоят из ингредиентов, которые увеличивают время контакта с глазной поверхностью. Эти ингредиенты предназначены для придания мукоадгезивных свойств. Одной из проблем является высокая вязкость данных ингредиентов. Во многих случаях, когда состав содержит достаточно высокую концентрацию активных ингредиентов, настолько вязких, что такое применение доставляет неудобство для пациента, и высокая вязкость приводит к таким проблемам, как раздражение и затуманенное зрение. Были реализованы различные стратегии формулирования композиций в попытках преодолеть недостатки использования высоковязких материалов.
Одной из стратегий является использование менее вязкого состава, который опирается на его мукоадгезивные свойства, чтобы остаться на поверхности глаза. Гиалуронат натрия обладает мукоадгезивными свойствами, являясь вязкоэластичным полимером, и обладает противовоспалительными свойствами, которые могут быть полезны при лечении поверхностного воспаления, распространенного при DES. Он представляет собой высокомолекулярный полимер, и его растворы являются высоковязкими. Попытки использовать только НА сталкивались с проблемой, заключающейся в том, что данный ингредиент, как правило, вызывает раздражение глаз при его применении в достаточно высокой концентрации для лечения DES.
В W0 2009/044423 описаны офтальмологические растворы для применения в качестве заменителей слез, содержащих комбинацию
0,4% гиалуроновой кислоты и 0,2% полисахарида, известного как TSP (полисахарид семян тамаринда индийского (Tamarindus indica)), которая способна при ведении вместе в комбинации, синергически воздействовать на стимуляцию возвращения к нормальному состоянию слизистой оболочки конъюнктивы, затронутой синдром сухого глаза.
В ЕР 1069885 описан увлажняющий и смачивающий раствор для офтальмологического применения, на основе гликогенполисахарида, такого как раствор, показывающий низкую вязкость и низкое онкотическое давление, и оказывающий приятный освежающий, смазывающий и увлажняющий эффект на роговице.
Сущность изобретения
Авторы столкнулись с проблемой получения офтальмологической композиции для лечения и/или профилактики DES.
В частности, авторы столкнулись с проблемой получения офтальмологической композиции, которая являлась бы низковязкой, мукоадгезивной, при этом не вызывая раздражения при лечении DES.
После тщательного исследования авторы с удивлением обнаружили, что композиция, содержащая гликоген и гиалуронат натрия показывает улучшенную эффективность в уменьшении воспалительных параметров, связанных с симптомами дискомфорта в глазах, являющихся результатом хронического отсутствия достаточного смазывания и увлажнения глаза, в защите глаз от чрезмерной деградации матрицы и в промотировании реэпителизации роговицы, являющейся результатом повреждения поверхности эпителия, чем можно было ожидать от композиции, содержащей эквивалентное количество либо только одного компонента, либо от комбинации свойств двух компонентов.
Наблюдаемый синергетический эффект между этими двумя компонентами позволяет сформулировать композицию, в которой они присутствуют в низких концентрациях, обычно в следующем порядке, 0,15% для гиалуроновой кислоты (обычно в виде гиалуроната натрия) и 3% для гликогена.
Композиция, содержащая объединенный гиалуронат натрия и гликоген, имеет дополнительное преимущество, состоящее в мукоадгезивности, псевдопластичности и низкой вязкости.
Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции, содержащей синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, где указанная композиция содержит указанный гликоген в количестве от 1% до б% масс./масс, и указанную гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в количестве от 0,05% до 0,3% масс./масс.
Если специально не указано иное, все проценты масс./масс. (% масс./масс.) выражены по массе, исходя из общей массы офтальмологической композиции.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции для применения при лечении синдрома сухого глаза, содержащей синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение также
относится к способу лечения синдрома сухого глаза, включающему
нанесение терапевтически эффективного количества
офтальмологической композиции, содержащей синергическую
комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, пациенту, нуждающемуся в этом.
Краткое описание фигур
На фиг.1 проиллюстрированы SEM фотографии при увеличении 2000х, ЮОООх и 20000х поверхностей эпителия роговицы человека (НСЕ) после лечения согласно примеру 3,1Ь.
На фиг.2 проиллюстрированы фотографии световой микроскопии при увеличении 2 Ох фрагментов НСЕ после лечения согласно примеру 3, 2Ь.
На фиг.3 проиллюстрированы SEM фотографии при увеличении 2000х поверхностей НСЕ после лечения согласно примеру 3,2с. Подробное описание изобретения
Офтальмологическая композиция настоящего изобретения
содержит синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли.
Гликоген, используемый в офтальмологической композиции настоящего изобретения, получают из природного гликогена, который может быть экстрагирован из животных или растений или химически и ферментативно синтезирован. Моллюски, в частности мидии (Mytilus edulis и Mytilus gallus provincialis), являются особенно полезным источником гликогена, потому что они доступны в больших количествах при низкой стоимости и содержат разумное количество гликогена (в среднем от 2,5% до 3,9% по массе). Другие природные источники гликогена включают другие моллюски, такие как двустворчатые моллюски, устрицы, некоторые виды брюхоногих или морских улиток, например, улитку-блюдечко (Crepidula fornicata), а также органы позвоночных животных, которые богаты гликогенами, такие как печень и мышцы. Другим источником гликогена является крахмал, который может быть преобразован в гликоген с помощью специфических ферментов (как описано в ЕР1813678).
Гликоген, используемый в офтальмологической композиции настоящего изобретения, может быть использован как таковой, полученный по указанным выше способам экстракции и химического или ферментативного синтеза, или может быть подвергнут последующим методам очистки. Качество коммерческого гликогена зависит от присутствия большего или меньшего количества остатков белков (измеряется количество азота, выраженное в ч.млн) и восстанавливающих Сахаров.
Для целей настоящего изобретения использование гликогена, имеющего низкий уровень содержания восстанавливающих Сахаров и азота, является предпочтительным. Примерами коммерческих продуктов, предпочтительно используемых в настоящем изобретении, являются гликогены, производимые и распространяемые фирмой Sigma-Aldrich.
Предпочтительно, гликоген, используемый в настоящем изобретении, состоит из менее чем 1% по массе, и более предпочтительно, менее чем 0,25% по массе восстанавливающих Сахаров, измеренных согласно методу F.D. Snell и Snell,
"Colorimetric Methods of Analysis", New York, 1954, vol. Ill, p. 204 .
Предпочтительно гликоген, используемый в настоящем изобретении, состоит из менее чем 1000 и, более предпочтительно, менее чем 100 ч.млн азота, измеренного согласно методу Kjeldahl.
Предпочтительно, гликогеном, используемым в настоящем
изобретении, является гликоген Polglumyt(tm), торговое название депротеинированного гликогена, производимого и распространяемого фирмой A.C.R.A.F. S.p.A., Rome, Italy, и полученного согласно методике очистки, описанной в патенте ЕР 654048 В1.
Офтальмологическая композиция настоящего изобретения содержит гликоген в количестве от 1% до б% масс./масс, предпочтительно, от 2% до 5% масс./масс, и более предпочтительно, от 3% до 4% масс./масс.
Предпочтительно, офтальмологическая композиция настоящего изобретения содержит гликоген в количестве примерно 3% масс./масс.
Гиалуроновая кислота химически определяется как неразветвленный гликозаминогликан, состоящий из альтернативных единиц D-глюкуроновой кислоты (GIcUA) и Ы-ацетил-Б-глюкозамина (GIcNAc) , связанных через чередующиеся [3-1,4 и [3-1,3 гликозидные связи, структура которых может быть представлена следующей формулой:
ОН он
HO^----*^^^0-~\-^^V
GIcUA GIcNAc,
которая показывает дисахаридную единицу, и где число п повторяющихся пар единиц такова, что молекулярная масса полисахарида составляет от 50000 до нескольких миллионов Дальтон (Da) .
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты (в форме соответствующей натриевой соли) составляет от 100000 Da до 10000000 Da, и более предпочтительно, от 1000000 Da до 5000000 Da. В наиболее предпочтительном варианте осуществления средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты (в форме соответствующей натриевой соли) составляет от 2000000 Da до 3000000 Da.
Гиалуроновая кислота может быть выделена из различных источников, например, из пуповины человека, петушиного гребня или соединительной ткани позвоночных. Гиалуроновая кислота присутствует также в бактериях, таких как streptococci, а также может быть получена посредством способов ферментации.
Гиалуроновая кислота или соль гиалуроновой кислоты может
быть использована согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно, данной солью является фармацевтически приемлемая соль. Примерами фармацевтически приемлемых солей являются соли щелочных металлов, такие как соли натрия или калия, или соли щелочноземельных металлов, такие как соли магния или кальция. В наиболее предпочтительном варианте осуществления используют гиалуронат натрия.
Офтальмологическая композиция настоящего изобретения содержит гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в количестве от 0,05% до 0,3% масс./масс, предпочтительно, от 0,1% до 0,25% масс./масс, и более предпочтительно, от 0,15% до 0,2% масс./масс.
Предпочтительно, офтальмологическая композиция настоящего изобретения содержит гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в количестве примерно 0,15% масс./масс.
Офтальмологическая композиция настоящего изобретения содержит гликоген и гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в массовом соотношении в диапазоне примерно от 5:1 до примерно 40:1, предпочтительно, примерно от 10:1 до примерно 30:1, более предпочтительно, примерно от 15:1 до примерно 25:1.
Предпочтительно, офтальмологическая композиция настоящего изобретения содержит гликоген и гиалуроновую кислоту или ее
фармацевтически приемлемую соль в массовом соотношении примерно 20:1.
Как правило, офтальмологическая композиция по настоящему изобретению имеет вязкость от 5 до 100 сП, предпочтительно, от 10 до 40 сП, и даже более предпочтительно, от 15 до 30 сП.
Как правило, офтальмологическая композиция по настоящему изобретению имеет онкотическое давление менее чем 5 ммНд. Предпочтительно, она имеет онкотическое давление менее чем 3 ммНд.
Офтальмологическая композиция по настоящему изобретению также может содержать другие обычные ингредиенты, такие как один или более фармацевтически приемлемые буферирующие агенты, консерванты, регулирующие тоничность агенты, регуляторы рН, растворяющие агенты, стабилизирующие агенты, красители, антиоксиданты, хелатирующие агенты, размягчители, увлажнители и/или лубриканты.
Буферирующие агенты могут включать любую слабо соединенную пару кислота-основание, подходящую для поддержания рН в желаемом диапазоне. Полезные примеры включают, но, не ограничиваясь ими, бикарбонатный буфер, ацетатный буфер, цитратный буфер, фосфатный буфер, боратный буфер или трометаминный (TRIS, 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) буфер, и их комбинацию. Например, могут быть использованы комбинации одноосновных фосфатов, двухосновных фосфатов и подобных, или трометамина и гидрохлорида трометамина, и их количество будет выбрано таким образом, чтобы регулировать рН офтальмологической композиции по настоящему изобретению в пределах от 5 до 9, предпочтительно, от б до 8. Предпочтительно, данный буфер будет представлять собой фосфатный буфер или трометаминный буфер. Предпочтительно, рН офтальмологической композиции по настоящему изобретению будет доводиться в пределах от 6,5 и 7,5.
Консерванты могут варьироваться, и могут включать любое соединение или вещество, подходящее для предотвращения микробного загрязнения в составленной офтальмологической композиции. Консерванты выбирают из группы, состоящей из персолей, таких как пербораты, перкарбонаты и подобные; спиртов,
таких как бензиловый спирт, хлорбутанол и подобные;
консервантов, содержащих четвертичные аммониевые соли, такие как
бензалконий хлорид, бензалконий бромид, поликватерниум;
консервантов на основе гуанидина, включая
полигексаметиленбигуанид (РНМВ), хлоргексидин и подобные; ртутных консервантов, таких как тимеросал, ацетат фенилртути и нитрат фенилртути; хлоритов металлов, таких как хлориты щелочных металлов и щелочноземельных металлов и подобные; сорбиновой кислоты и ее офтальмологически приемлемых солей, таких как сорбат калия и их смеси; окисляющих консервантов, таких как стабилизированные оксихлорокомплексы (например, Purite(r)) . Purite(r) является зарегистрированным товарным знаком Allergan, Inc. Количество консервантов варьируется в относительно широком диапазоне, в зависимости от конкретно применяемого консерванта. Если консерванты не добавляются в офтальмологический раствор, данный офтальмологический раствор может использоваться в качестве разовой дозы типа глазных капель, в которых офтальмологический раствор используется при одном введении. В противном случае, данный офтальмологический раствор может быть использован в виде множественной дозы типа глазных капель при заключении его, например, в контейнер, обеспеченный фильтром, присоединенным к насадке контейнера, для дозирования глазных капель, или включенным в устройство системы безвоздушного применения.
Тоничность регулируют посредством усилителей тоничности. Такие агенты могут, например, быть ионного и/или неионного типа. Примерами ионных усилителей тоничности являются галогениды щелочных и щелочноземельных металлов, таких как, например, один или более из следующих: хлорид кальция, хлорид калия, хлорид натрия, хлорид лития, бромид калия, бромид натрия, йодид натрия, фосфат натрия, фосфат калия, сульфаты натрия и калия, бикарбонаты натрия и калия, и борная кислота. Неионными усилителями тоничности являются, например, мочевина, глицерин, сорбитол, маннитол, пропиленгликоль, декстроза или их комбинации. Глицерин, хлорид натрия и маннитол являются наиболее
предпочтительными усилителями тоничности. Количество регулятора тоничности может варьироваться в зависимости от желаемой изотоничности, гапертоничности или гипотоничности жидкости. Композиция настоящего изобретения, как правило, имеет показатель осмоляльности в диапазоне 150-1500 мОсм/кг, предпочтительно, в диапазоне 150-500 мОсм/кг и наиболее предпочтительно, в диапазоне 180-250 мОсм/кг.
Офтальмологическая композиция по настоящему изобретению может быть получена путем растворения данных ингредиентов в водной среде. Деионизированная вода является предпочтительной водной средой, которая может включать незначительное количество других гидрофильных растворителей, таких как гликоли и/или полиолы. Композиция может быть получена либо путем получения раствора одного или более ингредиентов и последующего добавления одного или более оставшихся ингредиентов, или путем получения двух или более отдельных растворов, каждый из которых содержит один или более ингредиентов, и последующего смешивания таких растворов всех вместе.
В предпочтительном варианте осуществления
офтальмологическую композицию настоящего изобретения получают путем добавления гликогена к предварительно полученному водному раствору гиалуроновой кислоты или ее соли, предпочтительно гиалуроната натрия, и последующего добавления других обычных ингредиентов.
Однако точный порядок добавления обычных ингредиентов не особенно важен. В качестве неограничивающего примера, буфер можно добавлять после того, как все активные ингредиенты были смешаны, чем после получения раствора, содержащего только один из них. Обычно корректировка осмолярности и рН является последней стадией получения, но промежуточные добавления соли, кислоты и основания, имеющие место между другими стадиями изобретения, предусмотрены авторами, как входящие в объем настоящего изобретения. Раствор, наконец, стерилизуют обычными методами, такими как нагревание при высокой температуре, предпочтительно, от 50°С до 80°С, более предпочтительно, от 60°
до 80°С, в течение периода времени от 30 минут до нескольких часов. Предпочтительно, стерильную композицию получают нагреванием при 7 0°С в течение 1 часа и последующим фильтрованием данного раствора через 0,22 мкм PES стерилизующий фильтр (как описано в US20110195925A1, включенной в данное описание посредством ссылки). Более предпочтительно, стерильную композицию получают фильтрованием данного раствора через 0,22 мкм стерилизующий фильтр.
Следующие примеры служат для иллюстрации изобретения, однако, без ограничения.
ПРИМЕР 1
Получение офтальмологических растворов
Набор из шести офтальмологических растворов 1-6 получали растворением компонентов, перечисленных в следующей таблице 1, в установленном количестве воды при комнатной температуре. После полного растворения всех ингредиентов, полученный раствор нагревали при 7 0°С в течение 1 часа. После стадии термообработки, водный раствор фильтровали через 0,22 мкм PES стерилизующий фильтр, с получением стерильного раствора.
описано выше, имели свойства, суммированные в последующей таблице 2.
Automatic. Вязкость определяли с использованием вискозиметра Bohlin Gemini 150 при интенсивности 0,5 Ра и при 25°С. ПРИМЕР 2
Определение мукоадгезивных свойств
Мукоадгезия может быть определена, как состояние, при котором два материала, по меньшей мере, один из которых является биологическим субстратом, таким как муцин, удерживаются вместе в течение длительного времени с помощью межфазных сил.
Мембраны слизистых оболочек человеческого организма, включая носовые, глазные, буккальные, вагинальные и ректальные мембраны, характеризуются эпителиальным слоем, поверхность которого покрыта слизью. Указанная слизь содержит гликопротеины, наиболее важным из которых является муцин. Муцин участвует в механизме адгезии путем установления взаимодействия с макромолекулами, содержащимися в мукоадгезивных составах. Реологический тест, основанный на измерении вязкости, является простым in vitro методом, используемым для измерения взаимодействия лекарственная форма-муцин. Благодаря такому тесту, можно определить силу мукоадгезии путем мониторинга вискозиметрических изменений системы, представляющей собой смесь анализируемой лекарственной формы и муцина, в сравнении с суммой изменений, соответственно, в системах только лекарственной формы и муцина, (Hassan, Е. Е., Gallo, J. М., "A simple rheological method for the in vitro assessment of mucin-polymer bioadhesive bond strength", Pharm. Res., v.7, n.5, p.491-495, 1990).
Свиной желудочный муцин (тип II) (Sigma-Aldrich, Milano, Italy) суспендировали при 4% масс./масс, и 8% масс./масс, в искусственной слезной жидкости, содержащей 6,8 г/л NaCl, 2,2 г/л NaHC03, 0, 084 г/л СаС12 2 Н20, 1,4 г/л КС1, и рН, доведенным до 7,4 при помощи НС1 1Н.
Измерение вязкости осуществляли при помощи ротационного вискозиметра (Rheostress 600, Haake, Enco, Italy), оборудованного комбинацией конусных пластин (СР1/60).
Данный тест проводили с офтальмологическими растворами 1, 2 и 4 по изобретению. Для каждого реологического теста получали
следующие образцы и тестировали:
муциновая дисперсия при 4% масс./масс. в искусственной слезной жидкости (образец А);
офтальмологический раствор настоящего изобретения, смешанный с искусственной слезной жидкостью при массовом соотношении 1:1 (образец В);
офтальмологический раствор настоящего изобретения, смешанный с 8% муциновой дисперсией в искусственной слезной жидкости при массовом соотношении 1:1 (образец С).
У каждого образца измеряли вязкость при 32°С. Взаимодействие между муцином и композицией настоящего изобретения количественно рассчитывали с помощью компонента вязкости биоадгезии Ац в диапазоне скорости сдвига (10-100 1/с), следующим образом:
Аг)=Лс- (ЛВ+ЛА) ,
где Лс обозначает вязкость образца С (Па.с); Лв обозначает вязкость образца В (Па.с), ЛА обозначает вязкость образца А (Па.с), и Ал обозначает компонент вязкости биоадгезии.
Увеличение вязкости смеси композиции настоящего изобретения с муцином (образец С) при сравнении с суммой вязкости растворов композиции настоящего изобретения (образец В) и муцина (образец А) по-отдельности показывает положительное значение компонента вязкости биоадгезии (Ал> 0) и, таким образом, мукоадгезивные свойства данной композиции.
Положительное значение компонента вязкости биоадгезии указывает на рост вязкости смеси, который происходит, когда композиция настоящего изобретения смешана с муциновой дисперсией, и который зависит от взаимодействия между цепями макромолекулярных групп.
Иными словами, значение выше нуля компонента Ал указывает на особое воздействие на вязкость при взаимодействии муцина с композицией настоящего изобретения, по сравнению со значением, ожидаемым при простом сложении влияния на вязкость, оказываемое муцином и композицией настоящего изобретения по-отдельности.
Результаты каждого реологического теста с
офтальмологическими растворами 1, 2 и 4 по изобретению при
IN vitro модели для изучения симптомов дискомфорта в глазах
Синергический эффект на терапевтическую эффективность, обеспечиваемый комбинацией гиалуроната натрия и гликогена, описан на двух различных in vitro моделях: модель для изучения симптомов сухого глаза и модель для изучения повреждения поверхности эпителия.
Первая модель представляет собой 3D модель сухости роговицы человека и гиперосмолярности. Контролируемые параметры продемонстрировали синергический эффект гиалуроната натрия и гликогена в отношении уменьшения воспалительных параметров и защиты глаз от чрезмерной деградации матрицы.
Модель для изучения повреждения эпителиальной поверхности
представляет собой модель in vitro, используемую для мониторинга
ответа эпителия роговицы человека на механические повреждения.
Эту модель использовали для демонстрации синергического эффекта
комбинации настоящего изобретения в промотировании
реэпителизации роговицы, являющейся результатом повреждения поверхности эпителия.
В обеих моделях использовали 3D реконструированный эпителий роговицы (НСЕ) человека, поставленный лабораторией SkinEthic(r) (Nice, France). НСЕ представляет собой модель, состоящую из иммортализованных НСЕ клеток с общей морфологией, сходной с
эпителием роговицы человека. ПРИМЕР 3.1
Модель для изучения симптомов сухого глаза
В данном примере использовали НСЕ для создания модели сухости роговицы человека и гиперосмолярности (HYP-DRY НСЕ).
НСЕ ткани помещали в контролируемые условия окружающей среды для имитации сухости ( <4 0% относительная влажность, Т°> 37°С в присутствии О,6М сорбитола в среде) на 16 часов. По окончании стрессового периода, образцы обрабатывали продуктами (30 мкл) в течение 2 4 часов, и ткани исследовали по различным параметрам (экспрессия мРНК, гистологические и ультраструктурные анализы). Тест проводили с офтальмологическим раствором 1 настоящего изобретения и сравнительными офтальмологическими растворами 5 и 6.
Пример 3.1а - Транскрипционный анализ
Общую мРНК, экстрагированную из НСЕ, анализировали при
помощи транскрипционного анализа (ПЦР-анализ в реальном времени)
для количественного определения экспрессии матрицы
металлопептидазы-9 (ММР-9) и интегрина-(И (ITG-J31) .
ММР-9 является наиболее важной гелатиназой на поверхности глаза. Этот фермент лизирует целый ряд различных субстратов, включая компоненты базальной мембраны эпителия роговицы и непроницаемые перегородки белков, которые поддерживают барьерную функцию эпителия роговицы. В слезную жидкость пациентов с сухостью глаз дозами вводили высокий уровень ММР-9. Уровни активности ММР-9 в слезной жидкости положительно коррелировали с тяжестью заболевания роговицы. Увеличение экспрессии ММР-9 коррелировал с повышенным воспалением поверхности глаза.
ITG-Р1 является членом большого семейства интегринов. Интегрины представляет сбой ключевые компоненты для миграции и активации иммунных клеток в глазной поверхности пациентов с сухостью глаз. Было продемонстрировано, что I TG-131 может служить мишенью для лечения воспалительных заболеваний. Местное применение антагониста а4±1-интегрина приводит к ремиссии заболевания; блокада а4|31 снижает симптомы сухого глаза и
воспаление. Увеличение I TG-|3l является сигналом симптомов сухого глаза и воспаления, указывая на активацию иммунных клеток в поверхности глаза.
Результаты, показанные в следующей таблице 4, выражены в виде относительной количественной оценки (RQ), указывая на кратность изменений в экспрессии по сравнению с калибратором (необработанной НСЕ тканью).
ТАБЛИЦА 4
ММР-9
ITG-P1
НСЕ
HYP-DRY НСЕ
2, 82*
5, 39*
Раствор 1
2, 08*
4, 8*
Раствор 5
2,71*
11,37*
Раствор б
2,40*
6,28*
* Значение считается с повышенной регуляцией, когда RQ> 2, или пониженной регуляцией, когда RQ <0,5 в сравнении с необработанной НСЕ (RQ=1) Результаты четко показали, что сравнительный раствор 5 не
изменяет уровни ММР-9 в отношении HYP-DRY НСЕ (2,71 против
2,82), и сравнительный раствор б может лишь слегка снизить
уровни ММР-9 в отношении HYP-DRY НСЕ (2,4 против 2,82), при этом
раствор 1 по изобретению индуцировал наибольшее сокращение
экспрессии ММР-9, указывая на защиту от чрезмерной деградации
матрицы (2,08 против 2,82) .
Дальнейшие результаты ясно показали, что сравнительные растворы 5 и б индуцировали гиперэкспрессию ITG-|3l, хотя раствор 1 по изобретению продуцировал низкую экспрессию, по сравнению с положительным контролем (HYP-DRY НСЕ) . Сокращение I TG-131 является позитивным сигналом для уменьшения симптомов сухого глаза и воспаления.
Пример 3.lb - Ультраструктурный анализ
Ультраструктурный анализ проводили при помощи сканирующей электронной микроскопии (SEM). Образцы обследовали на электронном микроскопе SEM Zeiss Sigma. Увеличение составляло 2000х. Оценку эпителия роговицы проводили на основе результатов по качеству оценки гладкости роговицы: 0 (стандарт: гладкая поверхность), 1 (незначительное), 2 (явное) и 3 (ярко выраженное: гофрированная поверхность).
ПРИМЕР 3.2
Модель для изучения повреждения поверхности эпителия
В данном примере использовали НСЕ для создания модели заживления ран роговицы человека. НСЕ получали повреждения с 4 симметричными повреждениями на поверхности эпителия, и спустя 1 ч после повреждений, ткани обрабатывали данными продуктами (30 мкл) в течение 24 часов и 72 часа. В конце обработки ткани исследовали по различным параметрам (экспрессия мРНК, иммунофлюоресцентный, гистологический и ультраструктурный анализ). Тест проводили с офтальмологическим раствором 1 настоящего изобретения и сравнительными офтальмологическими растворами 5 и б.
Пример 3.2а - Транскрипционный анализ
Общую мРНК, экстрагированную из НСЕ, анализировали при
помощи транскрипционного анализа (ПЦР-анализ в реальном времени)
для количественного определения экспрессии матрицы
металлопептидазы-1 (ММР-1).
Матрицы металлопротеиназ (ММР) представляют собой группу цинк-зависимых протеиназ, субстраты которых включают большинство компонентов внеклеточного матрикса и базальной мембраны. После повреждения и в ответ на высвобождение цитокинов, несколько ММР в роговице было разрегулировано по транскрипции или активации. ММР-1 является ключевым посредником эпителиальной миграции. Исследования ex vivo повреждений ткани роговицы человека подтвердили наличие ММР-1 в ведущих эпителиальных клетках роговицы в ходе реэпителизации над стромой.
Результаты, показанные в следующей таблице б, выражают как относительно количественную оценку (RQ), указывая на кратность изменений в экспрессии в сравнении с калибратором (необработанная НСЕ ткань).
* Значение считается с повышенной регуляцией, когда RQ> 2, или пониженной регуляцией, когда RQ <0,5 в сравнении с необработанной НСЕ (RQ=1) В поврежденной ткани показано разрегулирование ММР-1 за 24
ч, демонстрируя первую позитивную реакцию клеток на
реэпителизацию и ремоделирование матрицы.
Растворы 5 и б сильно снизили уровень ММР-1 за 24 ч, указывая, таким образом, на снижение процесса реэпителизации и ремоделирования матрицы. Более высокий уровень ММР-1, промотированный раствором 1 по изобретению, является позитивным сигналом для реэпителизации и ремоделирования матрицы.
Пример 3.2Ь - Гистологический анализ
После экспозиции, ткани фиксировали в забуференном 10% формалине и включали в парафиновые блоки для получения профилей 5 мкм. Предметное стекло окрашивали гематоксилином и эозином, и анализировали под световым микроскопом (2 Ох) . Прогрессирование исцеления оценивали, сравнивая состояние исцеления с контрольными тканями. Использовали классификатор, основанный на уровне исцеления (хороший> средний> слабый).
Результаты суммированы в следующей таблице 7 и на фиг.2.
Пример 3.2с - Ультраструктурный анализ
Ультраструктурный анализ проводили при помощи сканирующей электронной микроскопии (SEM). Образцы обследовали на микроскопе SEM Zeiss Sigma. Увеличение составляло 2000х. Оценку повреждения эпителия роговицы проводили на основе результатов по характерным изменениям в миграции эпителиальных клеток: 0 (стандарт:
отсутствие поврежденной поверхности), 1 (сохранение регенерация или роговичный эпителиальный клеточный слой) (неполная регенерация) и 3 (отсутствие реэпителизации).
Результаты суммированы в следующей таблице 8 и на фиг.3.
ТАБЛИЦА 8
Оценка SEM
НСЕ
Поврежденная НСЕ
2-3
Раствор 1
Раствор 5
Раствор б
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Офтальмологическая композиция, содержащая синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, где указанная композиция содержит указанный гликоген в количестве от 1% до б% масс./масс, и указанную гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в количестве от 0,05% до 0,3% масс./масс.
2. Офтальмологическая композиция по п.1, где указанная композиция содержит указанный гликоген в количестве от 2% до 5% масс./масс, предпочтительно, от 3% до 4% масс./масс.
3. Офтальмологическая композиция по п.2, где указанная композиция содержит указанный гликоген в количестве примерно 3% масс./масс.
4. Офтальмологическая композиция по п.1, где указанная композиция содержит указанную гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в количестве от 0,1% до 0,25% масс./масс, предпочтительно, от 0,15% до 0,2% масс./масс.
5. Офтальмологическая композиция по п.4, где указанная композиция содержит указанную гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в количестве примерно 0,15% масс./масс.
6. Офтальмологическая композиция по п.1, где указанная композиция содержит гликоген и гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в массовом соотношении в диапазоне примерно от 5:1 до примерно 40:1, предпочтительно, примерно от 10:1 до примерно 30:1, более предпочтительно, примерно от 15:1 до примерно 25:1.
7. Офтальмологическая композиция по п.б, где указанная композиция содержит гликоген и гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в массовом соотношении примерно 20:1.
8. Офтальмологическая композиция по п.1, где указанная композиция имеет вязкость от 5 до 100 сП, предпочтительно, от 10 до 40 сП, и более предпочтительно, от 15 до 30 сП.
9. Офтальмологическая композиция по п.1, где указанная
композиция имеет онкотическое давление менее чем 5 ммНд, предпочтительно, менее чем 3 ммНд.
10. Офтальмологическая композиция по п.1, где указанная композиция имеет показатель осмоляльности в диапазоне 150-1500 мОсм/кг, предпочтительно, в диапазоне 150-500 мОсм/кг, и наиболее предпочтительно, в диапазоне 180-250 мОсм/кг.
11. Офтальмологическая композиция для применения при лечении синдрома сухого глаза, содержащая синергическую комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
12. Способ лечения синдрома сухого глаза, включающий
нанесение терапевтически эффективного количества
офтальмологической композиции, содержащей синергическую
комбинацию гликогена и гиалуроновой кислоты или ее
фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один
фармацевтически приемлемый эксципиент, пациенту, нуждающемуся в
этом.
13. Способ получения офтальмологической композиции по п.1, включающий стадии растворения указанного гликогена и гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли в водной среде, добавления по меньшей мере одного указанного фармацевтически приемлемого эксципиента, доведения концентрации указанного гликогена до диапазона от 1% до б% масс./масс, и концентрации указанной гиалуроновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли до диапазона от 0,05% до 0,3% масс./масс, доведения рН указанной офтальмологической композиции до значения в диапазоне от б до 8, доведения показателя осмоляльности указанной офтальмологической композиции до значения в диапазоне от 150 до 1500 мОсм/кг, и стерилизации указанной офтальмологической композиции.
По доверенности
552670
ФИГ. 1
2000 х
ЮОООх
20000x
НСЕ
HYP-DRY НСЕ
ШШШШШШШШШШШШШШт
' vt> ?r
i. r < SB
ФИГ. 2
24 ч
72 ч
НСЕ
ПОВРЕЖДЕННАЯ НСЕ
ФИГ. з
НСЕ
ПОВРЕЖДЕННАЯ НСЕ
И? * ".¦
(19)
(19)
(19)
1/3
1/3
3/3
3/3
