(57) Реферат / Формула:
Описаны композиции антител, содержащие смесь невосстанавливающего сахара, анти- α4 β7 антитела и по меньшей мере одной аминокислоты. Раскрытые композиции обладают улучшенной стабильностью, пониженным образованием агрегатов и могут замедлять деградацию содержащегося в них анти- α4 β7 антитела по настоящему изобретению или демонстрируют любые комбинации этих характеристик. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает безопасный режим дозирования таких композиций антител, простой в реализации и обеспечивающий терапевтически эффективное количество анти- α4 β7 антител in vivo.
Евразийское (21) 201892377 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.03.29
(22) Дата подачи заявки 2012.05.02
(51) Int. Cl.
A61P1/00 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) C07K16/28 (2006.01)
(54) КОМПОЗИЦИЯ АНТИ-а4р7 АНТИТЕЛА
(31) 61/481,533; 61/550,545; 61/585,859
(32) 2011.05.02; 2011.10.24; 2012.01.12
(33) US
(62) 201391614; 2012.05.02
(71) Заявитель: МИЛЛЕННИУМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Дилузио Уиллоу, Труонг Нобель Т., Варга Ксанад М., Паланиаппан Ваитхианатхан, Браун Джейсон, Фокс Ирвинг Х., Сколз Кэтрин (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Описаны композиции антител, содержащие смесь невосстанавливающего сахара, анти-а4р7 антитела и по меньшей мере одной аминокислоты. Раскрытые композиции обладают улучшенной стабильностью, пониженным образованием агрегатов и могут замедлять деградацию содержащегося в них анти-а4р7 антитела по настоящему изобретению или демонстрируют любые комбинации этих характеристик. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает безопасный режим дозирования таких композиций антител, простой в реализации и обеспечивающий терапевтически эффективное количество анти-а4р7 антител in vivo.
2420-553651ЕА/061
КОМПОЗИЦИЯ АНТИ-А4В7 АНТИТЕЛА
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка претендует на преимущества временной заявки США 61/585859, поданной 12 января 2012 г., временной заявки США 61/550545, поданной 24 октября 2011 г. и временной заявки США 61/481533, поданной 2 мая 2011 г. Содержание вышеуказанных заявок настоящим включены сюда в качестве ссылок.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка включает Перечень последовательностей, который был подан в ASCII-формате через систему EFS-Web и настоящим целиком включен в настоящий документ в качестве ссылки. Указанный ASCII-документ, созданный 30 апреля 2012 г., имеет название 92596615.txt и размер 17024 байт.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Прогресс в биотехнологии создал возможности получения различных белков, предназначенных для применения в фармацевтике, с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Поскольку белки имеют большие размеры и более сложны, чем традиционные органические и неорганические лекарственные препараты (т.е., содержат многочисленные функциональные группы в дополнение к сложным трехмерным структурам), составление композиций таких белков связано с особыми проблемами. Для того, чтобы белок оставался биологически активным, композиция должна сохранять конформационную целостность по меньшей мере коровой последовательности аминокислот белка, в то же самое время защищая многочисленные функциональные группы белка от деградации. Белки могут иметь недостаточную стабильность, и моноклональные и поликлональные антитела, в особенности, могут быть относительно нестабильными (см., напр., Wang, et al., J. Pharm Sci. 96:1-26 (2007)) . Имеется большое число вариантов составления композиций, и ни один из подходов или систем не является пригодным для всех белков. Было описано несколько факторов, которые необходимо учитывать (см., напр., Wang et
al. ) .
Стабильность белка может зависеть от многочисленных характеристик. Фактически, даже в случае очищенных антител, структуры антител могут быть гетерогенными, что дополнительно усложняет составление композиций таких систем. Кроме того, эксципиенты, включаемые в состав композиций антител, предпочтительно минимизируют любой потенциальный иммунный ответ.
В случае антител, сохранение конформационной целостности является еще более важным. Пути деградации белков могут быть связаны с химической нестабильностью (т.е., с любым процессом, включающим модификацию белка путем образования или разрыва связи, приводящего к новой химической сущности) или физической нестабильностью (т.е., изменениями структуры белка более высокого порядка). Химическая нестабильность проявляется, например, в деамидировании, изомеризации, гидролизе, окислении, фрагментации, бета-элиминировании гликана или дисульфидном обмене. Физическая нестабильность может быть вызвана, например, денатурацией, агрегированием, преципитацией или адсорбцией. Четырьмя наиболее распространенными путями деградации белка являются фрагментация, агрегирование, деамидирование и окисление белка. Последствия химической или физической нестабильности терапевтического белка включают уменьшение эффективной введенной дозы, снижение безопасности терапии вследствие, например, облучения или иммунологической реактивности, и большая частота производства из-за короткого срока хранения.
Сушка вымораживанием является методикой, обычно используемой для консервации белков; сушка вымораживанием предназначена для удаления воды из белковых препаратов, представляющих интерес. Сушка вымораживанием или лиофилизация представляет собой процесс, в котором материал, который необходимо высушить, сначала замораживают, а затем лед или замороженный растворитель удаляют путем сублимации под вакуумом. Эксципиенты могут быть включены в композицию перед лиофилизацией для стабилизации белков в процессе лиофилизации и/или для улучшения стабильности композиций лиофилизированных белков (Pikal М., Biopharm. 3(9)26-30 (1990), и Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)).
Несколько публикаций раскрывают в общем различные способы лечения воспалительных болезней кишечника, и предусматривают схемы дозирования для введения агентов, предназначенных для лечения воспалительной болезни кишечника. Например, W0 96/24 673 раскрывает мукозальные сосудистые адрессины и лечение заболеваний, ассоциированных с рекрутментом лейкоцитов в желудочно-кишечный тракт в результате связывания лейкоцитов с клетками, экспрессирующими MAdCAM. US 2005/0095238 описывает способы лечения болезни, ассоциированной с инфильтрацией лейкоцитов в мукозальную ткань, и введение человеку эффективного количества человеческого или гуманизированного иммуноглобулина или антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с интегрином а4(37. US 2005/0095238 дополнительно описывает различные дозы (например, 0,15, примерно 0,5, примерно 1,0, примерно 1,5 или примерно 2,0 мг иммуноглобулина или фрагмента на кг веса тела) и различные интервалы между дозами (7, 14, 21, 28, или 3 0 дней) . Однако, вышеуказанные патенты и публикации не раскрывают конкретные композиции анти-а4(37 антитела или конкретные дозы и режимы дозирования, описанные и заявляемые в данном документе. Важно отметить, что вышеуказанные патенты не раскрывают композиции, дозы и режимы дозирования, обеспечивающие способы лечения (подтвержденные данными клинических испытаний) , описанные и заявляемые в данном документе.
Композиции антител по настоящему изобретению могут быть полезны для ингибирования связывания лейкоцитов с клетками, экспрессирующими MAdCAM, и тем самым способствовать лечению воспалительной болезни кишечника у пациентов. Соответственно, существует насущная потребность в определении пригодных дозировок и режимов дозирования таких соединений, и в разработке композиций, предпочтительно, композиций для внутривенного введения, позволяющих обеспечить стабильные, терапевтически эффективные уровни в крови композиций антител на протяжении длительного периода времени, в стабильной и удобной форме.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к идентификации невосстанавливающего
сахара и по меньшей мере одной аминокислоты, в качестве пригодных эксципиентов для составления композиций анти-а4(37 антител, нестабильность которых делает их восприимчивыми к деамидированию, окислению, изомеризации и/или агрегированию. Композиция улучшает стабильность, уменьшает образование агрегатов и замедляет деградацию антитела, входящего в ее состав.
Таким образом, в первом аспекте, изобретение относится к стабильной композиции, содержащей смесь невосстанавливающего сахара, анти-а4(37 антитела и по меньшей мере одной свободной аминокислоты, причем молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль: моль) имеет значение более 600:1. Композиция может быть жидкой композицией или сухой композицией (например, лиофилизированной). Композиция может также содержать буферный агент. В некоторых вариантах исполнения, невосстанавливающий сахар представляет собой маннит, сорбит, сахарозу, трегалозу или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах исполнения, свободная аминокислота композиции представляет собой гистидин, аланин, аргинин, глицин, глутаминовую кислоту или любую их комбинацию. Композиция может включать от примерно 50 мМ до примерно 17 5 мМ свободной аминокислоты. Композиция может включать от примерно 100 мМ до примерно 175 мМ свободной аминокислоты. Молярное соотношение свободной аминокислоты к антителу может составлять по меньшей мере 2 50:1.
Композиция может также содержать поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активное вещество может представлять собой полисорбат 20, полисорбат 80, полоксамер или любую их комбинацию.
В некоторых аспектах, композиция может минимизировать иммуногенность анти-а4(37 антитела.
Композиция, например, в высушенном состоянии, может быть стабильной в течение по меньшей мере трех месяцев при 40°С, 75% относительной влажности (RH).
В другом аспекте, композиция является лиофилизированной и содержит от по меньшей мере примерно 5% до примерно 10% анти
а4(37 антитело перед лиофилизацией. Композиция может содержать по меньшей мере примерно 6% анти-а4(37 антитела перед лиофилизацией. Композиция может быть восстановлена из лиофилизированной композиции (например, восстановлена до стабильной жидкой композиции).
В другом аспекте, изобретение относится к стабильной композиции, содержащей смесь невосстанавливающего сахара, анти-а4(37 антитела и по меньшей мере одной свободной аминокислоты, причем молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль:моль) имеет значение более 600:1 и соотношение свободной аминокислоты к анти-а4(37 антителу (моль:моль) имеет значение более 250:1.
В другом аспекте, изобретение относится к стабильной жидкой композиции, содержащей в водном растворе невосстанавливающий сахар, анти-а4(37 антитело и по меньшей мере одну свободную аминокислоту, где молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль: моль) имеет значение более 600:1. В еще одном аспекте, изобретение касается жидкой композиции, содержащей по меньшей мере от примерно 4 0 мг/мл до примерно 8 0 мг/мл анти-а4(37 антитела, по меньшей мере примерно 50-175 мМ одной или нескольких аминокислот и от по меньшей мере примерно 6% до по меньшей мере примерно 10% (мае./об.) сахара. Жидкая композиция может также содержать буферный агент. В некоторых вариантах исполнения жидкая композиция также содержит хелатирующий агент, взаимодействующий с металлами. В некоторых вариантах исполнения, жидкая композиция также содержит антиоксидант.
В другом аспекте, изобретение относится к жидкой композиции, содержащей по меньшей мере примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, по меньшей мере примерно 10% (мае./об.) невосстанавливающего сахара и по меньшей мере примерно 125 мМ одной или нескольких свободных аминокислот.
В другом аспекте, изобретение относится к жидкой композиции, содержащей по меньшей мере примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, по меньшей мере примерно 10% (мае./об.) невосстанавливающего сахара и по меньшей мере примерно 175 мМ одной или нескольких
свободных аминокислот
В еще одном аспекте, изобретение также относится к сухой, например, лиофилизированной композиции, содержащей смесь невосстанавливающего сахара, анти-а4(37 антитела, гистидина, аргинина и полисорбата 80, где композиция находится в твердой форме и молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль:моль) имеет значение более 600:1.
В еще одном аспекте, изобретение относится к
лиофилизированной композиции, содержащей смесь
невосстанавливающего сахара, анти-а4(37 антитела, гистидина, аргинина и полисорбата 80. В этом аспекте, молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль: моль) имеет значение более 600:1. Кроме того, молярное соотношение аргинина к анти-а4(37 антителу (моль:моль) в композиции имеет значение более 250:1.
В другом аспекте, изобретение относится к способу изготовления композиции, описанной в настоящем изобретении, включающему поддержание температуры продукта ниже температуры коллапса при первичном высушивании. Способ может также включать стадию отжига.
В одном аспекте, изобретение относится к способу лечения
пациента, страдающего от воспалительной болезни кишечника, где
способ включает стадию введения пациенту, страдающему от
воспалительной болезни кишечника, гуманизированного
иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином а4(37, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область не-человеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (а) начальная доза 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем внутривенной инфузии; (Ь) с последующей второй дозой 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем внутривенной инфузии
примерно через две недели после начальной дозы; (с) с
последующей третьей дозой 300 мг гуманизированного
иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем
внутривенной инфузии через примерно шесть недель после начальной
дозы; (d) с последующей четвертой и последующими дозами 300 мг
гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего
фрагмента путем внутривенной инфузии раз в четыре недели или раз
в восемь недель после третьей последовательной дозы
гуманизированного антитела при необходимости; где режим
дозирования вызывает клинический ответ и/или клиническую
ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где
дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или
антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом а4(37, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID N0:9, CDR2 SEQ ID N0:10, CDR3 SEQ ID N0:11; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID N0:12, CDR2 SEQ ID N0:13, CDR3 SEQ ID N0:14.
В другом аспекте, изобретение относится к режиму дозирования
для терапевтического лечения воспалительной болезни кишечника,
где режим дозирования включает стадию: введения пациенту,
страдающему от воспалительной болезни кишечника,
гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего
фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим
интегрином а4(37, где гуманизированный иммуноглобулин или
антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область
не-человеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела
человеческого происхождения, причем гуманизированный
иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (а) начальная доза 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем внутривенной инфузии; (Ь) с последующей второй дозой 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем
внутривенной инфузии через примерно две недели после начальной
дозы; (с) с последующей третьей дозой 300 мг гуманизированного
иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем
внутривенной инфузии через примерно шесть недель после начальной
дозы; (d) с последующей четвертой и последующими дозами 300 мг
гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего
фрагмента путем внутривенной инфузии раз в четыре недели или раз
в восемь недель после третьей последовательной дозы
гуманизированного антитела при необходимости; где режим
дозирования вызывает клинический ответ и/или клиническую
ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где
дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или
антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом а4(37, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID N0:9, CDR2 SEQ ID N0:10, CDR3 SEQ ID N0:11; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID N0:12, CDR2 SEQ ID N0:13, CDR3 SEQ ID N0:14.
В некоторых аспектах способ лечения композицией анти-а4(37 антитела, доза или режим дозирования могут минимизировать иммуногенность анти-а4(37 антитела.
Пациент может демонстрировать отсутствие адекватного ответа, потерю ответа, или быть интолерантным к лечению по меньшей мере одним иммуномодулятором, антагонистом фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a) или их комбинациями.
Воспалительн болезнь кишечника может быть болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. Воспалительн болезнь кишечника может быть неспецифическим язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности.
Режим дозирования может приводить к заживлению слизистой у пациентов, страдающих от неспецифического язвенного колита от умеренной до тяжелой степени активности.
Пациент может ранее получать лечение воспалительной болезни кишечника по меньшей мере одним кортикостероидом. Режим
дозирования может приводить к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероида пациентом.
В некоторых аспектах, гуманизированный иммуноглобулин или
его антигенсвязывающий фрагмент вводят в готовой лекарственной
форме при концентрации от примерно 1,0 мг/мл до примерно 1,4
мг/мл. Гуманизированный иммуноглобулин или его
антигенсвязывающий фрагмент может быть введен в виде готовой лекарственной формы при примерно 1,2 мг/мл. Гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент может быть введен пациенту на протяжении примерно 3 0 минут.
Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент может быть восстановлен из лиофилизированной композиции.
Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент может быть восстановлен с получением стабильной жидкой композиции.
В некоторых аспектах, режим дозирования не изменяет соотношение CD4 к CD8 в спинномозговой жидкости пациентов, получающих указанное лечение.
Пациент может быть особой в возрасте 65 лет или старше и не требовать какой-либо коррекции режима дозирования.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 представляет собой изображение нуклеотидной последовательности (SEQ ID N0:1), кодирующей тяжелую цепь гуманизированного анти-а4(37 иммуноглобулина и расшифрованной аминокислотной последовательности тяжелой цепи (SEQ ID N0:2). Нуклеотидная последовательность содержит сайты клонирования
(строчные буквы), последовательность Козака (прописные буквы, нуклеотиды 18-23 SEQ ID N0:1) и лидерную последовательность
(строчные буквы, нуклеотиды 24-86 SEQ ID N0:1) на 5'-конце тяжелой цепи. Открытая рамка считывания нуклеотидной последовательности включает нуклеотиды 24-1433 SEQ ID N0:1.
Фиг. 2 представляет собой изображение нуклеотидной последовательности (SEQ ID N0:3), кодирующей легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, называемого в данном документе ведолизумаб, и расшифрованной аминокислотной
последовательности (SEQ ID NO: 4) легкой цепи. Нуклеотидная последовательность содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные буквы, нуклеотиды 18-23 SEQ ID N0:3) и лидерную последовательность (строчные буквы, нуклеотиды 24-80 SEQ ID N0:3) на 5'-конце тяжелой цепи. Открытая рамка считывания нуклеотидной последовательности включает нуклеотиды 24-737 SEQ ID N0:3.
Фиг. 3 изображает выравнивание аминокислотных
последовательностей (А) зрелой гуманизированной легкой цепи
(аминокислоты 2 0-2 3 8 SEQ ID N0:4) гуманизированного иммуноглобулина, называемого в данном документе ведолизумаб, и
(В) зрелой гуманизированной легкой цепи гуманизированного иммуноглобулина, называемого в данном документе LDP-02 (SEQ ID N0:5). (касательно LDP-02, см. W0 98/06248 и Feagan et al. , N. Eng. J. Med. 352:2499-2507 (2005). Feagan et al. описывают клинические исследования LDP-02, но в их статье LDP-02 называется MLN02.) Выравнивание показывает, что аминокислотные последовательности легкых цепей ведолизумаба и LDP-02 различаются в положениях 114 и 115 зрелых легких цепей.
Фиг. 4 изображает выравнивание аминокислотных
последовательностей (А) родовой человеческой константной области каппа-легкой цепи (SEQ ID N0:6) и (В) родовой мышиной константной области каппа-легкой цепи (SEQ ID N0:7). Аминокислотные остатки Thr и Val (находящиеся в положениях 114 и 115 зрелой легкой цепи ведолизумаба (аминокислоты 133 и 134 SEQ ID N0:4)) присутствуют в константной области человеческой каппа-легкой цепи, тогда как аминокислотные остатки Ala и Asp
(находяшиеся в положениях 114 и 115 зрелой легкой цепи LDP-02
(SEQ ID N0:5)) присутствуют в константной области мышиной каппа-легкой цепи.
Фиг. 5 представляет собой карту вектора pLKTOK38D (также называемого pTOK38MLN02-TV), который кодирует гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь MLN02 и является пригодным для продуцирования ведолизумаба в клетках СНО (см. публикацию патентной заявки США № 2004/0033561 А1, которая раскрывает pLKTOK38. pLKTOK38D представляет собой вариант
pLKTOK3 8, в котором сайты рестрикции, указанные на карте, фланкируют последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи).
Фиг. 6А изображает прогностические модели изменения процентного содержания мономера, изменения процентного содержания агрегатов и изменения процентного содержания главной изоформы лиофилизированной композиции анти-а4(37. Модели основаны на статистическом анализе данных, приведенных в Примере 1. Средняя линия показывает результаты для прогностических моделей и внешние линии показывают 95% доверительные пределы для прогностических моделей. Фиг. 6В изображает альтернативные модели, основанные на статистическом анализе данных для 4 0°С из Таблиц 1-3, входными параметрами которых являются рН, молярное соотношение сахар:белок и молярное соотношение аргинин:белок. Средняя линия показывает результаты для прогностических моделей и внешние линии показывают 95% доверительные пределы для прогностических моделей.
Фиг. 7 изображает аминокислотные последовательности (А) вариабельной области каппа-легкой цепи зрелого человеческого GM607'CL антитела и (В) вариабельной области тяжелой цепи человеческого 21/28'CL.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий, что содержание твердых веществ и нагрузка влияют на время высушивания (числа на линиях указывают время высушивания в минутах).
Фиг. 9 представляет собой график, показывающий, что ведолизумаб не задерживает начало проявления клинических симптомов экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) по сравнению с контролем по плацебо. Натализумаб существенно (р <0,05) задерживает проявление клинических симптомов ЕАЕ по сравнению с контролем по плацебо.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к композиции, содержащей анти-а4(37 антитела. Композиции могут быть смесями, содержащими невосстанавливающий сахар, анти-а4(37 антитело и одну или несколько свободных аминокислот, причем молярное соотношение
невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу имеет значение более 600 моль невосстанавливающий сахар: 1 моль анти-а4(37 антитела. Композиции могут находиться в твердой или жидкой форме.
Определения
Термин "фармацевтическая композиция" относится к препарату, содержему анти-а4(37 антитело в форме, позволяющей эффективно обеспечить биологическую активность антитела, и не содержащей дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться композиция.
"Стабильной" является композиция, в которой содержащееся в ней антитело в значительной степени сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или свою биологическую активность при хранении. В одном аспекте, композиция в значительной степени сохраняет свою физическую и химическую стабильность, а также свою биологическую активность при хранении. Период хранения обычно выбирают на основании предполагаемого срока годности композиции. Различные аналитические методики измерения стабильности белка известны специалистам и рассмотрены, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).
"Дeамидированноe" моноклональное антитело представляет собой антитело, в котором один или несколько аспарагиновых или глутаминовых остатков были дериватизированы, например, до аспарагиновой кислоты или изоаспарагиновой кислоты.
Антитело, "восприимчивое к деамидированию", представляет собой антитело, включающее один или несколько остатков, демонстрирующих склонность к деамидированию.
Антитело, "восприимчивое к окислению", представляет собой антитело, включающее один или несколько остатков, демонстрирующих склонность к окислению.
Антитело, "восприимчивое к агрегированию", представляет собой антитело, которое демонстрирует агрегирование с другой (другими) молекулами антитела, особенно, при замораживании,
нагревании, высушивании, восстановлении и/или перемешивании.
Антитело, "восприимчивое к фрагментация", представляет собой антитело, которое демонстрирует расщепление на два или больше фрагментов, например, в своей шарнирной области.
"Восстановительное деамидирование, окисление, агрегирование или фрагментация" используются для обозначения предотвращения или снижения (например, до 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% или 10%) величины деамидирования, агрегирования или фрагментации по сравнению с моноклональным антителом, приготовленным при отличном значении рН или в другом буфере.
"Агрегат", "агрегат SEC (агрегат, определяемый методом эексклюзионной хроматографии)" или "растворимый агрегат" представляют собой от более одного до не более десяти белков и/или фрагментов антител, ассоциированных друг с другом путем ковалентных или ионных или гидрофобных взаимодействий с образованием более крупного белкового тела.
"Нерастворимый агрегат" или "частица" представляет собой более десяти белков и/или фрагментов антител, ассоциированных друг с другом путем ковалентных или ионных или гидрофобных взаимодействий с образованием более крупного белкового тела.
В используемом тут значении, "биологическая активность" моноклонального антитела относится к способности антитела связываться с антигеном и приводить к измеримому биологическому ответу, который может быть измерен in vitro или in vivo. Такая активность может быть антагонистической или агонистической.
Молекула клеточной поверхности, "интегрин а4(37", или "а4(37", представляет собой гетеродимер с <4 цепи (CD49D, ITGA4) и р7 цепи (ITGB7). Каждая цепь может формировать гетеродимер с альтернативной цепью интегрина, с образованием c <4pi или акр7. Человеческие гены с <4 и р7 (GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) RefSeq номера доступа NM_000885 и NM_000889, соответственно) экспрессируются В и T лимфоцитами, в частности, лимфоцитами памяти CD4+. Типично для многих интегринов, а4(37 может существовать в состоянии покоя или в активированном состоянии. Лиганды а4(37 включают молекулу адгезии сосудистых клеток (VCAM), фибронектин и мукозальный
адрессин (MAdCAM, например, MAdCAM-1).
В используемом тут значении, человеческий иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий "специфичностью связывания с комплексом а4(37", связывается с а4(37, но не с а4(31 или аЕВ7.
В используемом тут значении, "изотоническая" композиция имеет по существу такое же осмотическое давление, как и человеческая кровь. Изотонические композиции будут обычно иметь осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм. Изотоничность может быть измерена, например, по давлению пара или с помощью осмометра замораживающего типа.
В используемом тут значении, "буферный агент" относится к
буферу, который противодействует изменениям рН в результате
воздействия конъюгированных компонентов кислота-основание.
Буферный агент может присутствовать в жидкой или твердой
композиции по изобретению. Буферный агент устанавливает величину
рН композиции в интервале от примерно 5,0 до примерно 7,5, от
примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6,0 до примерно 6,5,
или величину рН, равную примерно 6,3. В одном аспекте, примеры
буферных агентов, которые будут регулировать величину рН в
диапазоне значений от 5,0 до 7,5, включают ацетат, сукцинат,
глюконат, гистидин, цитрат, фосфат, малеат, какодилат, 2-[N-
морфолино]этансульфоновую кислоту (MES), бис(2-
гидроксиэтил)иминотрис[гидроксиметил]метан (Bis-Tris), N-[2-ацетамидо]-2-иминодиуксусную кислоту (ADA), глицилглицин и другие буферы на основе органических кислот. В другом аспекте, буферный агент по настоящему изобретению представляет собой гистидин или цитрат.
"Гистидиновый буфер" представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры гистидиновых буферов включают растворы гистидина хлорида, гистидина ацетата, гистидина фосфата, гистидина сульфата. Гистидиновый буфер или буфер гистидин-НС1 имеет рН примерно от 5,5 до 6,5, примерно от 6,1 до 6,5, или примерно рН 6,3.
"Сахарид" в данном документе означает соединение, имеющее общую формулу (СНгО)п, и его производные, включая топосахариды,
дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахароспирты,
восстанавливающие сахара, невосстанавливающие сахара и т.п. В одном аспекте, примеры сахаридов по настоящему изобретению включают глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, декстран, эритрит, глицерин, арабит, силит, сорбит, маннит, мелибиозу, мелицитозу, рафинозу, маннотриозу, стахиозу, мальтозу, лактулозу, мальтулозу, глюцит, мальтит, лактит, изомальтулозу и т.п. Сахарид может быть лиопротектантом. В другом аспекте, сахарид в данном документе означает невосстанавливающий дисахарид, такой как сахароза.
"Поверхностно-активное вещество" в данном документе
относится к агенту, который понижает поверхностное натяжение
жидкости. Поверхностно-активное вещество может быть неионным
поверхностно-активным веществом. В одном аспекте, примеры
поверхностно-активных веществ в данном документе включают
полисорбат (полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, например,
полисорбат 20 и полисорбат 80); TRITON (т-
октилфеноксиполиэтоксиэтанол, неионный детергент, Union Carbide,
дочерняя компания Dow Chemical Co., Midland MI); додецилсульфат
натрия (ДСН); лаурилсульфат натрия; натрия октилгликозид;
лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-,
миристил-, линолеил- или стеарилсаркозин; линолеил-, миристил-
или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-,
линолеамидопропил-, миристамидопропил-, палмамидопропил- или
изостеарамидопропилбетаин (например, лауроамидопропил);
миристамидопропил-, палмамидопропил- или
изостеарамидопропилдиметиламин; натрия метилкокоил- или динатрия
метилолеилтаурат; сорбитанмонопальмитат; и серия продуктов
MONAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.);
полиэтилгликоль (PEG), полипропипенгликоль (PPG) и сополимеры полоксиэтилен- и полоксипропипенгликоля (например, плюроник (Pluronics)/полоксамер (Poloxamer), PF68 и т.д.); и т.д. В другом аспекте, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
Термин "антитело" в данном документе используется в самом широком смысле и, более конкретно, охватывает полноразмерные
моноклональные антитела, иммуноглобулины, поликлональные
антитела, мультиспецифические антитела (например,
биспецифические антитела), образованные из по меньшей мере двух полноразмерных антител, например, каждое к отличному антигену или эпитопу, и индивидуальные антигенсвязывающие фрагменты, включая dAbs, scFv, Fab, F(ab)'2, Fab', включая человеческие, гуманизированные и антитела от видов, не являющихся человеком, и рекомбинантные антигенсвязывающие формы, такие как монотела и диатела.
Молярные количества и соотношения анти-а4(37 антитела к другим эксципиентам, описанным в данном документе, рассчитывают на основе предположения о приблизительном молекулярном весе антитела примерно 150000 дальтон. Фактический молекулярный вес антитела может отличаться от 150000 дальтон, в зависимости от аминокислотного состава или посттрансляционной модификации, например, в зависимости от клеточной линии, используемой для экспрессии антитела. Фактический молекулярный вес антитела может находиться в пределах ±5% от 150000 дальтон.
Термин "человеческое антитело" включает антитело, содержащее
последовательность, выделенную из последовательности
человеческого зародышевого иммуноглобулина, такое как антитело, полученное от трансгенных мышей, содержащих гены человеческого иммуноглобулина (например, XENOMOUSE генно-инженерных мышей (Abgenix, Fremont, СА) , HUMAB-MOUSE (r), KIRIN ТС MOUSE(tm) трансхромосомных мышей, KMMOUSE(r) (MEDAREX, Princeton, NJ) ) , их человеческих библиотек фагового дисплея, клеток человеческой миеломы или человеческих В-клеток.
Термин "моноклональное антитело", в используемом тут значении, относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени гомогенных антител, т.е., индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов, которые могут возникать при продуцировании моноклональных антител, причем такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают
разные антитела, направленные против разных детерминантов (эпитопов), где каждое моноклональное антитело направлено против отдельного детерминанта антигена. Определение "моноклональный" указывает на характер антитела как полученного от в значительной степени гомогенной популяции антител и не должно истолковываться как требующее продуцирования антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al. , Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567) . "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из библиотеки фаговых антител с использованием методик, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Моноклональные антитела по настоящему изобретению, в частности, включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична с или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична с или гомологична соответствующей последовательности антител, полученной от другого вида или принадлежащей к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желательную биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес по настоящему изобретению, включают "приматизированные" антитела, содержащие вариабельный домен антигенсвязывающих последовательностей, полученный от не являющегося человеком примата (например, мартышки, человекообразной обезьяны и т.д.) и последовательности человеческой константной области.
"Антигенсвязывающие фрагменты" гуманизированного
иммуноглобулина, приготовленные в композиции по изобретению, содержат по меньшей мере вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей анти-а4(37 антитела. Например, антигенсвязывающий
фрагмент ведолизумаба содержит аминокислотные остатки 2 0-131 последовательность гуманизированной легкой цепи SEQ ID N0:4. Примеры таких антигенсвязывающих фрагментов включают фрагменты Fab, фрагменты Fab', scFv и фрагменты F(ab')2 гуманизированного иммуноглобулина, известные специалистам. Антигенсвязывающие фрагменты гуманизированного иммуноглобулина по изобретению могут быть получены путем ферментативного расщепления или рекомбинантными методами. Например, гидролиз папаином или пепсином может быть использован для получения фрагментов Fab или F(ab')2, соответственно. Антитела могут также быть получены в различных укороченных формах с использованием генов антитела, в которые были введены один или несколько терминирующих кодонов левее природного сайта терминации. Например, рекомбинантный конструкт, кодирующий тяжелую цепь фрагмента F(ab')2, может быть сконструирован таким образом, чтобы он включал ДНК-последовательности, кодирующие CHi домен и шарнирную область тяжелой цепи. В одном аспекте, антигенсвязывающие фрагменты ингибируют связывание интегрина а4(37 с одним или несколькими из его лигандов (например, мукозальным адрессином MAdCAM (например, MAdCAM-1), фибронектином).
Гидролиз антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт и остаточный фрагмент "Fc", название которого отображает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих сайта и сохраняет способность к перекрестному связыванию с антигеном.
"Fv" представляет собой фрагмент антитела, состоящий из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи с нековалентной ассоциацией.
Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбокси-конце CHI-домена тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в данном документе обозначает Fab', в котором цистеиновый остаток
(остатки) константных доменов несет по меньшей мере одну
свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антител
первоначально получали в виде пар Fab'-фрагментов с шарнирными цистеинами между ними. Также известны другие химические связи фрагментов антител.
"Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антител содержат VH И VL домены антител, в которых такие домены присутствуют в отдельной полипептидной цепи. В одном аспекте, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH И VL, который обеспечивает возможность образования желательной для связывания антигена структуры scFv. Обзор scFv приведен Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315
(1994).
Термин "диатела" относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащим вариабельный тяжелый домен (VH), соединенный с вариабельным легким доменом (VL) В ТОЙ же полипептидной цепи (VH~VL) . Благодаря использованию линкера, слишком короткого для того, чтобы обеспечить возможность спаривания двух доменой одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описанны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
"Полноразмерное антитело" представляет собой антитело,
содержащее антигенсвязывающую вариабельную область, а также
константный домен легкой цепи (CL) И константные домены тяжелой
цепи, CHI, Снг и Снз • Константные домены могут быть константными
доменами нативной последовательности (например, константными
доменами нативной последовательности человека) или вариантами их
аминокислотной последовательности. В одном аспекте,
полноразмерное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями.
"Вариант аминокислотной последовательности" антитела по настоящему изобретению означает антитело с аминокислотной последовательностью, которая отличается от основного типа
антител. Обычно, варианты аминокислотных последовательностей
будут обладать по меньшей мере примерно 7 0%, по меньшей мере
примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере
примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% гомологии с
основным типом антител. Варианты аминокислотных
последовательностей имеют замещения, делеции и/или аддиции в определенных положениях в или рядом с аминокислотной последовательностью основного типа антител, но сохраняют антигенсвязывающую активность. Варианты в последовательностях константных областей антитела будут обладать меньшим эффектом на антигенсвязывающую активность, чем варианты в вариабельных областях. В вариабельных областях, варианты аминокислотных последовательностей будут по меньшей мере на примерно 90% гомологичны, по меньшей мере на примерно 95% гомологичны, по меньшей мере на примерно 97% гомологичны, по меньшей мере на примерно 98% гомологичны или по меньшей мере на примерно 99% гомологичны основному типу антител.
"Гомология" определяется как процентное содержание в варианте аминокислотной последовательности идентичных остатков после выравнивания последовательности и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимального процента гомологии. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны специалистам.
"Терапевтическое моноклональное антитело" представляет собой антитело, используемок для терапии человека. Терапевтические моноклональные антитела, раскрытые в данном документе, включают анти-а4(37 антитела.
"Вариант гликозилирования" антитела по настоящему изобретению означает антитело с присоединенными к нему одним или несколькими углеводными фрагментами, которые отличаются от одного или нескольких углеводных фрагментов, присоединенных к основному типу антител. Примеры вариантов гликозилирования по настоящему изобретению включают антитело с G1 или G2 олигосахаридной структурой, вместо G0 олигосахаридной структуры, присоединенной к его Fc-области, антитело с одним или двумя углеводными фрагментами, присоединенными к одной или двум его
легким цепям, антитело, не имеющее углеводов, присоединенных к одной или двум тяжелым цепям антитела, и т.д., и комбинации изменений гликозилирования.
"Эффекторные функции" антитела относятся к тем биологическим активностям, которые приписываются Fc-области (Fc-области нативной последовательности или Fc-области варианта аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание Clq; комплемент-зависимая цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.п.
В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей, полноразмерные антитела могут быть отнесены к разным "классам". Существует пять основных классов полноразмерных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на "подклассы" (изотипы), например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам антител, называются а, 5, ?, у и ц, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.
"Легкие цепи" антител любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (к) и лямбда (А), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.
"Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" относятся к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксичные клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcRs) (например, природные клетки-убийцы (NK) , нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, медиирующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FCYRIH/ В ТО время как моноциты экспрессируют FcyRI/ FcyRH и FcyRIH-Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в Таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Аппи. Rev. Immunol
9:457-92 (1991) . Для оценки ADCC активности молекулы, представляющей интерес, может быть проведен in vitro анализ ADCC, такой как описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-убийцы (NK) . Альтернативно или дополнительно, ADCC активность молекулы, представляющей интерес, может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как раскрытая в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. В одном аспекте, FcR представляет собой последовательность нативного человеческого FcR. В другом аспекте, FcR представляет собой рецептор, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcyRI/ FcyRH и FcyRIII/ включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы таких рецепторов. Рецепторы FcyRH включают FcyRUA ("активирующий рецептор") и FcyRUB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют схожие аминокислотные последовательности, различающиеся преимущественно в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcyRUA содержит иммунорецепторный тирозин-активируемый мотив (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcyRUB содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см. обзор в M.Daeron, Аппи. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcRs приведен Ravetch and Kinet, Аппи. Rev. Immunol 9:457-92
(1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. lab. Clin. Med. 126:33-41 (1995). Другие FcRs, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охвачены в данном документе термином "FcR". Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, отвечающий за перенос материнских IgG плоду
(Guyer et al. , J. Immunol. 11 7:587 (1976) и Kim et al. r J. Immunol. 24:249 (1994)).
Термин "гипервариабельная область" при использовании в данном документе относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельная область
обычно содержит аминокислотные остатки из "участок, определяющий
комплементарность" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-
56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35
(HI), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой
цепи; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или остатки из
"гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (HI), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Остатки "каркасного участка" или "FR" представляют собой остатки вариабельного домена кроме остатков гипервариабельной области, как они определены в данном документе. Гипервариабельная область или ее CDR могут быть перенесены из одной цепи антитела в другую или в другой белок для придания специфичности связывания антигена полученному (комплексному) антителу или связывающему белку.
"Гуманизированные" формы не-человеческих (например, принадлежащих грызунам) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, выделенную из не-человеческого иммуноглобулина. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной область реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области не являющегося человеком вида (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, обладающего желательной специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях, остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие не-человеческие остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, отсутствующие в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антитела. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, типично, двух
вариабельных доменов, в которых все или по существу все
гипервариабельные петли соответствуют не-человеческому
иммуноглобулину и все или по существу все FR принадлежат
последовательностям человеческого иммуноглобулина.
Гуманизированное антитело, необязательно, будет также содержать
по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc),
типично, человеческого иммуноглобулина. Дополнительные
подробности приведены в Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких его гипервариабельных областях, которые приводят к улучшению аффинности антитела к антигену, по сравнению с родительским антителом, не имеющим такого изменения (изменений). В одном аспекте, подвергнутые аффинному созреванию антитела будут иметь наномолярны или даже пикомолярные аффинности к антигену-мишени. Подвергнутые аффинному созреванию антитела получают с помощью процедур, известных специалистам. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описывает аффинное созревание путем перемешивания доменов VH и VL. Случайный мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004
(1995); Jackson et al. , J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al. , J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
"Изолированное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его природного окружения. В определенных вариантах исполнения, антитело будет очищено (1) до более 95% мае. белка, при определении по методу Лоури, альтернативно, более 99% мае,
(2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15
остатков N-концевой или внутренней аминокислотной
последовательности с помощью секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности при определении методом ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с
использованием окрашивания кумасси синим или серебром. Изолированное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Обычно, однако, изолированное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки.
"Лечение" относится как к терапевтическому, так и профилактическому лечению или предохранительным мерам. Особы, нуждающиеся в лечении, включают тех, кто уже болен, а также тех, кому нужно предотвратить болезнь или ее рецидив. Таким образом, пациент, подлежащий лечению по настоящему изобретению, может иметь установленный диагноз болезни или может быть предрасположен или восприимчив к болезни. Термины "пациент" и "субъект" в настоящем изобретении используются взаимозаменяемо.
Антитело, используемое для приготовления композиции, является по существу чистым и, желательно, в значительной степени гомогенным (т.е. не содержащим белковых загрязнений и т.д.) . "По существу чистое" антитело означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 90% мае. антитела, в пересчете на общий вес белка в композиции, по меньшей мере примерно 95% или 97% мае. "В значительной степени гомогенное" антитело означает композицию, содержащую белок, в которой по меньшей мере примерно 99% мае. белка представляет собой специфическое антитело, например, анти-а4(37 антитело, в пересчете на общий вес белка.
"Клиническая ремиссия" в используемом тут значении по отношению к субъектам с неспецифическим язвенным колитом относится к оценке по полной шкале Мейо 2 или меньше баллов и отсутствию оценок по индивидуальным подшкалам более 1 балла. "Клиническая ремиссия" болезни Крона относится к оценке по шкале CDAI, равной 150 баллам или меньше.
"Клинический ответ", в используемом тут значении, по отношению к субъектам с неспецифическим язвенным колитом, относится к снижению по полной шкале Мейо на 3 или больше балла и на 30% от базовой линии (или по частичной шкале Мейо на 2 или больше балла и на 25% или больше от базовой линии, если оценка
по полной шкале Мейо не проводилась при посещении врача) с сопровождающим снижением по подшкале ректального кровотечения на 1 или больше баллов или по абсолютной шкале ректального кровотечения на 1 или меньше баллов. "Клинический ответ" в используемом тут значении по отношению к субъектам с болезнью Крона относится к снижению на 7 0 баллов или больше оценки по шкале CDAI от базовой линии (неделя 0).
"Заживление слизистой" в используемом тут значении по отношению к субъектам с неспецифическим язвенным колитом относится к оценке по эндоскопической подшкале 1 балл или меньше.
В используемом тут значении, "терапевтическая неудача" относится к ухудшению болезни, необходимости в применении препаратов неотложной терапии или хирургическом вмешательстве для лечения неспецифического язвенного колита или болезни Крона. Препараты неотложной терапии представляют собой любой новый лекарственный препарат или любое увеличение дозы препарата базовой линии, необходимые для лечения новых или некупированных симптомов неспецифического язвенного колита или болезни Крона (за исключением противодиарейных средств для борьбы с хронической диареей).
Композиции
Как описано в настоящем изобретении, было обнаружено, что анти-а4(37 антитела являются высокостабильными в сухой, например, лиофилизированной, композиции с избытком (в пересчете на молярное количество) невосстанавливающего сахара. В частности, в настоящем изобретении было показано, что лиофилизированные композиции, в которых соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль:моль) имеет значение более 600:1, являются стабильными на протяжении по меньшей мере 2 лет.
Настоящее изобретение предусматривает, в первом аспекте, стабильную композицию анти-а4(37 антитела. В одном аспекте, композиция содержит буфер, по меньшей мере один стабилизатор и анти-а4(37 антитело. В одном аспекте, сухая композиция содержит один или несколько невосстанавливающих Сахаров и анти-а4(37 антитело, где соотношение невосстанавливающего сахара к анти
а4(37 антителу (моль:моль) имеет значение более 600:1. Композиция также содержит одну или несколько свободных аминокислот. Одна или несколько аминокислот могут также выступать в роли буфера. В одном аспекте, одна или несколько аминокислот могут действовать как стабилизатор. Композиция может необязательно дополнительно содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. В одном варианте исполнения, композиция является сухой, например, лиофилизированной. Антитело в композиции может быть полноразмерным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, таким как фрагмент Fab, Fv, scFv, Fab' или F(ab')2.
Композиция может содержать любые желательные
невосстанавливающие сахара. В одном аспекте, невосстанавливающие
сахара, которые могут быть использованы в композиции, включают,
например, маннит, сорбит, сахарозу, трегалозу, рафинозу,
стахиозу, мелицитозу, декстран, мальтит, лактит, изомальтулозу,
палатинит и их комбинации. В другом аспекте,
невосстанавливающими сахарами являются сахароза, трегалоза, маннит и сорбит. Абсолютное количество невосстанавливающего
сахара в композиции не является критичным,
соотношение
невосстанавливающего сахара к
анти-а4 (37
антителу
(моль:
моль)
имеет значение
более 400:1.
В другом
аспекте,
соотношение
невосстанавливающего сахара к
анти-а4 (37
антителу
(моль:
моль)
имеет значение
по меньшей мере
примерно
600:1;
меньшей
мере
примерно 62 5:1 ;
по меньшей мере
примерно
650:1;
меньшей
мере
примерно 675:1,
по меньшей мере
примерно
7 0 0:1;
меньшей
мере
примерно 7 50:1,
по меньшей мере
примерно
800:1,
меньшей
мере
примерно 10 00:1, по меньшей мере примерно 1200:1, по меньшей мере примерно 14 00:1, по меньшей мере примерно 1500:1, по меньшей мере примерно 1600:1, по меньшей мере примерно 17 00:1, по меньшей мере примерно 18 00:1, по меньшей мере примерно 1900:1 или по меньшей мере примерно 2 000:1. В общем является желательным, чтобы невосстанавливающий сахар присутствовал в количестве, уменьшающем образование растворимых агрегатов в жидкой композиции, такое как образование агрегатов, происходящее при замораживании и оттаивании и/или высушивании и восстановлении. Отношение невосстанавливающего сахара к анти
а4(37 антителу (моль: моль) выше примерно 730:1 может давать немного сниженное образование растворимых агрегатов в лиофилизированном состоянии. Весовое отношение сахар:белок может иметь значение более 1,5:1 (мае./мае.). В другом аспекте, концентрации невосстанавливающего сахара для жидких (например, до высушивания или после восстановления) композиций находятся в диапазоне значений от примерно 10 мМ до примерно 1 М, например, от примерно 60 мМ до примерно 60 0 мМ, примерно 100 мМ до примерно 4 50 мМ, примерно 2 00 мМ до примерно 350 мМ, примерно 250 мМ до примерно 325 мМ, до примерно 275 мМ до примерно 300 мМ. В другом аспекте, количество невосстанавливающего сахара в сухой (например, лиофилизированной) композиции имеет значение в диапазоне от примерно 4 0% до примерно 7 0% (мае./мае. сухой композиции). В другом аспекте, количество невосстанавливающего сахара в сухой (например, лиофилизированной) композиции находятся в диапазоне значений от примерно 4 0% до примерно 60%, от примерно 45% до примерно 55%, или примерно 51% (мае./мае.) . В других аспектах, количество невосстанавливающего сахара в сухой, (например, лиофилизированной) композиции составляет более примерно 51% (мае./мае. сухой композиции), когда количество белка составляет примерно 31 % (мае./мае. сухой композиции), или массовое отношение невосстанавливающего сахара к белку в сухой композиции имеет значение более примерно 1,6:1. В еще одном аспекте, невосстанавливающим сахаром для использования в композиции является сахароза.
Композиция может содержать любую желательную свободную аминокислоту, которая может находиться в L-форме, D-форме или любой желательной смеси таких форм. В одном аспекте, свободные аминокислоты, которые могут быть включены в композиции, включают, например, гистидин, аланин, аргинин, глицин, глутаминовую кислоту, серии, лизин, триптофан, валин, цистеин и их комбинации. Некоторые аминокислоты могут стабилизировать белки от деградации в процессе производства, при высушивании, лиофилизации и/или хранении, например, благодаря образованию водородных связей, солевых мостиков, антиоксидантным свойствам или гидрофобным взаимодействиям или путем исключения из белковой
поверхности. Аминокислоты могут действовать как модификаторы тоничности или могут вызывать снижение вязкости композиции. В другом аспекте, свободные аминокислоты, такие как гистидин и аргинин, могут действовать как криопротектанты и лиопротектанты и не кристаллизуются при лиофилизации в качестве компонентов композиции. Свободные аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и гистидин, сами или в комбинации, могут действовать как буферные агенты в водном растворе в диапазоне значений рН от 5 до 7,5. В еще одном аспекте, композиция содержит гистидин или гистидин и аргинин. В еще одном аспекте, концентрация свободной аминокислоты для жидких композиций находится в диапазоне значений от примерно 10 мМ до примерно 0,5 М, например, от примерно 15 мМ до примерно 300 мМ, примерно 2 0 мМ до примерно 2 00 мМ или примерно 2 5 мМ до примерно 150 мМ, от примерно 50 мМ или примерно 125 мМ. В еще одном аспекте, количество гистидина в сухой (например, лиофилизированной) композиции находится в диапазоне значений от примерно 1% до примерно 10% (мае./мае. сухой композиции) или от примерно 3% до примерно б% (мае./мае.). В некоторых вариантах исполнения, количество гистидина в сухой
(например, лиофилизированной) композиции составляет более примерно 4% (мае./мае. сухой композиции), когда количество белка составляет примерно 31% (мае./мае. сухой композиции) или массовое отношение гистидина к белку в сухой композиции составляет более примерно 0,15:1. В еще одном аспекте, количество аргинина в сухой (например, лиофилизированной) композиции находится в диапазоне значений от примерно 4% до примерно 2 0% (мае./мае. сухой композиции) или от примерно 10% до примерно 15% (мае./мае.). В некоторых вариантах исполнения, количество аргинина в сухой (например, лиофилизированной) композиции составляет более примерно 13% (мае./мае. сухой композиции), когда количество белка составляет от примерно 31%
(мае./мае. сухой композиции) или массовое отношение аргинина к белку в сухой композиции имеет значение более примерно 0,4:1. В вариантах исполнения комбинаций аминокислот, таких как гистидин и аргинин, молярное соотношение общей аминокислоты к антителу может составлять по меньшей мере 2 00:1, от примерно 2 00:1 до
примерно 500:1, или по меньшей мере 4 00:1.
Композиция может необязательно дополнительно содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. В одном аспекте, поверхностно-активные вещества, которые могут быть включены в композиции, включают, например, полисорбат 20, полисорбат 80, полоксамер (Pluronic(r)) и их комбинации. В случае его присутствия, поверхностно-активное вещество обычно используется в количестве, которое уменьшает образование нерастворимых агрегатов антитела, например, при разливе во флаконы, замораживании, высушивании, лиофилизации и/или восстановлении. Концентрация поверхностно-активного вещества, например, в композиции до высушивания (например, лиофилизации) или после восстановления, обычно составляет от примерно 0,0001% до примерно 1,0%, от примерно 0,01% до примерно 0,1%, например, примерно 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08,% или 0,09% (мае./об.), от 0,05% до 0,07%, или 0,06% (мае./об.). Количество поверхностно-активного вещества, например, в сухой
(например, лиофилизированной) композиции, обычно составляет от примерно 0,01% до примерно 3,0% (мае./мае), от примерно 0,10% до примерно 1,0%, например, примерно 0,15%, 0,20%, 0,25%, 0,30%, 0,35%, 0,40% или 0,50% (мае./мае.). В другом аспекте, молярное соотношение поверхностно-активное вещество:антитело составляет примерно 1:1. Анти-а4р7 антитело может присутствовать в композиции в любом желательном количестве, при условии, что соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу
(моль:моль) имеет значение более примерно 600:1. Однако, композиция может содержать высокую концентрацию анти-а4(37 антитела. Например, жидкие композиции могут содержать по меньшей мере примерно 10 мг/мл, по меньшей мере примерно 2 0 мг/мл, по меньшей мере примерно 3 0 мг/мл, по меньшей мере примерно 4 0 мг/мл, по меньшей мере примерно 50 мг/мл, по меньшей мере примерно 60 мл/мл, по меньшей мере примерно 7 0 мг/мл, по меньшей мере примерно 8 0 мг/мл, по меньшей мере примерно 90 мг/мл, по меньшей мере примерно 100 мг/мл, от примерно 4 0 мг/мл до примерно 8 0 мг/мл анти-а4(37 антитела, примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела. Сухие композиции (например, лиофилизированные)
могут содержать по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 3 0%, или примерно 31%, или примерно 32% анти-а4(37 антитела по весу.
При необходимости, композиция может дополнительно содержать
хелатирующий агент, взаимодействующий с металлами, и/или
антиоксидант, а также другие фармацевтически приемлемые
эксципиенты. Пригодные хелатирующие агенты для связывания
металлов включают, например, метиламин, этилендиамин,
десфероксамин, триентин, гистидин, малатные, фосфонатные
соединения, например, этидроновую кислоту,
этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА),
этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA) и т.п. Пригодные антиоксиданты включают, например, лимонную кислоту, мочевую кислоту, аскорбиновую кислоту, липоевую кислоту, глутатион, токоферол, каротин, ликопен, цистеин и т.п.
Композиция может быть жидкостью или твердым веществом. Жидкие композиции могут быть водными растворами или суспензиями, приготовленными в пригодном водном растворителе, таком как вода или водно-органическая смесь, такая как водно-спиртовые смеси. Жидкие композиции могут иметь рН от примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6,0 до примерно 7,0 или от примерно 6,0 до примерно 6,5, такие как примерно 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5. Жидкие композиции могут охлаждаться (например, 2-8°С) или замораживаться (например, при -20°С или -80°С) для хранения. Твердые композиции могут быть приготовлены любым пригодным способом и могут иметь форму, например, брикета или порошка. Твердую композицию готовят высушиванием жидкой композиции, как описано в настоящем изобретении, например, путем лиофилизации, распылительной сушки, сушки на воздухе в виде пленки (например, для трансдермальной доставки), смешивания с липидной эмульсией и высушивания в виде сфер для пероральной доставки или пленки для трансдермальной доставки. В тех случаях, когда композиция представляет собой твердую композицию, она может иметь влагосодержание не более чем примерно 5%, не более чем примерно
4,5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3,5%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2,5%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1,5%, не более чем примерно 1%, или быть по существу безводной. Твердые композиции могут быть растворены, т.е. восстановлены, в пригодной среде или растворителе для получения жидкости, пригодной для введения. Пригодные растворители для восстановления твердой композиции включают воду, изотонический солевой раствор, буфер, например, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера (с лактозой или декстрозой), минимальной поддерживающей средой, спиртово-водные растворы, раствор декстрозы и т.д. Количество растворителя может обеспечивать терапевтическую концентрацию белка выше, равную или ниже концентрации до высушивания. В одном аспекте, концентрация восстановленого анти-а4(37 антитела представляет собой ту же самую концентрацию, что концентрация жидкой композиции перед высушиванием.
Композиция может быть стерильной, и это может быть достигнуто в соответствии с известными квалифицированному специалисту процедурами получения стерильных фармацевтических композиций, пригодных для введения людям, до или после приготовления композиции. Композиция может быть стерилизована в виде жидкости, например, перед высушиванием и/или после восстановления путем фильтрации через мелкие поры, путем асептической обработки или путем воздействия ультрафиолетового излучения. Размеры пор фильтра могут составлять 0,1 мкм или 0,2 мкм для фильтрации микроорганизмов или от 10 до 2 0 нм для фильтрации вирусных частиц. 7Альтернативно или дополнительно, высушенная композиция может быть стерилизована, например, путем облучения гамма-излучением. В одном аспекте, жидкую композицию анти-а4(37 антитела стерилизуют путем фильтрации перед высушиванием.
В одном аспекте, композиция является стабильной при хранении. В другом аспекте, композиция является стабильной при хранении в сухом состоянии. Стабильность может быть протестирована путем оценки физической стабильности, химической стабильности и/или биологической активности антитела в
композиции во время приготовления композиции, а также после
хранения при указанных температурах. Физическая и/или химическая
стабильность жидкой композиции или восстановленого сухого
порошка может быть оценена качественно и/или количественно
множеством различных способов (см., например, Analytical
Techniques for Biopharmaceutical Developmentr Rodriguez-Diaz et
al. eds. Informa Healthcare (2005)), включая оценку образования
агрегатов (например, с использованием эксклюзионной (или гель-
фильтрационной) хроматографии хроматография (SEC), матрично-
активированной лазерной десорбционной/ионизационной
времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), аналитического ультрацентрифугирования, светорассеяния (фотонно-корреляционная спектроскопия, динамическое светорассеяние (DLS), многоугловое лазерное светорассеяние (MALLS)), микроскопической визуализации в потоке, подсчета методом электронного импеданса
(культеровским), затемнения света или с помощью других систем подсчета частиц в жидкости, путем измерения мутности, центрифугированием в градиенте плотности и/или путем визуального контроля); путем оценки гетерогенности заряда с использованием катионообменной хроматографии (см. также Vlasak and Ionescu, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468-481 (2008) и Harris et al. J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 752:233-245 (2001)), изоэлектрического фокусирования (IEF), например, капиллярной методики (cIEF) , или электрофореза в капиллярной зоне; анализа аминоконцевых или карбоксиконцевых последовательностей; масс-спектрометрического анализа; анализа методом ДСН-ПААГ или SEC
(эксклюзионной хроматографии) для сравнения фрагментированных, интактных и мультимерных (т.е., димерных, тримерных и т.д.) антител; пептидных карт (например, триптических или LYS-, и т.п.), оценки биологической активности или антигенсвязывающей функции антитела; и т.п. Биологическая активность или антигенсвязывающие функции, например, связывание анти-а4(37 антитела с MAdCAM (например, MAdCAM-1) или ингибирование связывания клетки, экспрессирующей интегрин а4(37, с MAdCAM
(например, MAdCAM-1), например, иммобилизированным MAdCAM
(например, MAdCAM-1), может быть оценена с использованием
различных методик, доступных квалифицированному специалисту-практику (см., напр., Soler et al. , J. Pharmacol. Exper. Ther. 330:864-875 (2009)). Измерение влагосодержания сухой композиции может указывать вероятность протекания химической или физической деградации композиции, причем большая влажность вызывает более сильную деградацию.
Стабильность твердофазной композиции может также быть оценена качественно и/или количественно множеством различных способов, включая прямые испытания, такие как определение кристаллической структуры методом рентгеновской порошковой дифракции (XRPD); оценка структуры антитела в твердом состоянии с использованием инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR); и измерение термических переходов в лиофилизированном твердом веществе (плавление, стеклование и т.д.) с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии
(ДСК, например, для оценки денатурации), и непрямые испытания, такие как измерение влагосодержания с помощью теста Карла Фишера, например, для экстраполяции вероятности химической нестабильности вследствие гидролиза. Измерение влагосодержания сухой композиции может указывать вероятность протекания химической или физической деградации композиции, причем большая влажность вызывает более сильную деградацию.
Стабильность может быть измерена при выбранной температуре для выбранного периода времени. В одном аспекте, сухая
(например, лиофилизированная) композиция является стабильной при
примерно 40°С, 75% RH, в течение по меньшей мере примерно 2-4
недель, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере
примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно б месяцев, по
меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 12
месяцев или по меньшей мере примерно 18 месяцев. В другом
аспекте, композиция (жидкая или сухая (например,
лиофилизированная)), является стабильной при примерно 5°С и/или 25°С и 60% RH в течение по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно б месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 12 месяцев, по меньшей мере примерно 18 месяцев, по меньшей мере примерно 2 4 месяцев, по
меньшей мере примерно 3 0 месяцев, по меньшей мере примерно 3 6
месяцев или по меньшей мере примерно 4 8 месяцев. В другом
аспекте, композиция (жидкая или сухая (например,
лиофилизированная)), является стабильной при примерно -2 0°С в течение по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно б месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 12 месяцев, по меньшей мере примерно 18 месяцев, по меньшей мере примерно 2 4 месяцев, по меньшей мере примерно 3 0 месяцев, по меньшей мере примерно 3 6 месяцев, по меньшей мере примерно 42 месяцев или по меньшей мере примерно 4 8 месяцев. Кроме того, жидкая композиция может, в некоторых вариантах исполнения, быть стабильной после замораживания
(например, до -80°С) и оттаивания, такого как, например, после 1, 2 или 3 циклов замораживания и оттаивания.
Нестабильность может включать любое одно или несколько из
следующих явлений: агрегирование (например, нековалентное
агрегирование растворимых веществ (вызванное гидрофобными или
зарядовыми взаимодействиями), ковалентное агрегирование
растворимых веществ (например, перегруппировка/перемешивание дисульфидных связей), агрегирование нерастворимых веществ
(вызванное денатурированием белка на поверхностях раздела жидкость/воздух и жидкость/твердое вещество)), деамидирование
(например, деамидирование Asn), окисление (например, окисление
Met), изомеризация (например, изомеризация Asp), денатурация,
отсечение/гидролиз/фрагментация (например, фрагментация
шарнирной области), образование сукцинимида, N-концевое удлинение, С-концевой процессинг, различия в гликозилировании и т.п.
Стабильная композиция может способствовать низкой иммуногенности анти-а4(37 антитела. Иммуногенное анти-а4(37 антитело может приводить к ответу с образованием человеческих антител против иммуноглобулина человека (НАНА) у людей или пациентов. У пациентов с возникающим НАНА-ответом на анти-а4(37 антитело могут наблюдаться нежелательные эффекты (например, реакция места инфузии) при лечении или анти-а4(37 антитело может быстро элиминироваться, приводя к более низкой дозе, чем
запланированная для лечения. В отчете (Feagen et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:2499-2507) о ранних исследованиях лечения анти-а4(37 антителами указывалось, что человеческие антитела против иммуноглобулина человека образовывались к неделе 8 у 44% получавших лечение пациентов. Антитело в данных исследованиях хранилось в виде жидкости не содержало полисорбата.
В некоторых вариантах исполнения, композиция увеличивать долю НАНА-негативных пациентов до по меньшей мере 4 0%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 7 0%, по меньшей мере 8 0% или по меньшей мере 90% пациентов по сравнению с результатами НАНА для менее стабильной композиции.
В некоторых вариантах исполнения, композиция анти-а4(37 антитела содержит > 50% главной заряженной изоформы, > 55% главной заряженной изоформы или от 65 до 7 0% главной заряженной изоформы. В других аспектах, стабильная композиция анти-а4(37 антитела содержит <45% кислотных заряженных изоформ, <40% кислотных заряженных изоформ, <30% кислотных заряженных изоформ или от 22 до 28% кислотных изоформ. В других аспектах, стабильная композиция анти-а4(37 антитела содержит <25% основных изоформ, <20% основных изоформ, <15% основных изоформ, примерно 5% основных изоформ или примерно 10% основных изоформ. В одном аспекте, стабильная композиция анти-а4(37 антитела содержит > 55% главной изоформы, <30% кислотных изоформ и/или <20% основных изоформ, например, при определении по методу СЕХ. В другом аспекте, стабильная композиция анти-а4(37 антитела содержит > 50% главной изоформы, <45 % кислотных изоформ и/или <10% основных изоформ, например, при определении по методу cIEF.
В некоторых аспектах, сухая твердая композиция анти-а4(37 антитела имеет <10% влагосодержания, <5% влагосодержания или <2,5% влагосодержания. Время, необходимое для восстановления, составляет <60 минут, <50 минут или <40 минут или <30 минут или <2 0 минут.
Содержание мономеров и/или содержание агрегатов (например, в виде димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, олигомеров и агрегатов более высокого порядка), например, в жидкой композиции или в сухой композиции после восстановления, может быть измерено
методами SEC, MALDI-TOF MS, аналитического
ультрацентрифугирования, светорассеяния (DLS или MALLS) или наномасштабных измерений, таких как анализ траекторий наночастиц
(NTA) (NanoSight Ltd., Wiltshire, UK). Разрешение,
характеризация и количественное определение агрегатов могут быть
осуществлены рядом способов, включая увеличение длины разделения
на колонке для эксклюзионной хроматографии, например, путем
использования более длинной колонки или путем последовательного
присоединения второй или большего часла SEC-колонок к исходной
аналитической SEC-колонке, дополнение количественного
определения мономеров методом SEC светорассеянием, или путем использования NTA.
В одном варианте исполнения, композиция анти-а4(37 антитела содержит > 90% мономерного антитела, > 95% мономерного антитела или от 97 до 99% мономерного антитела. В другом варианте исполнения, большая часть материала в композиции анти-а4(37 антитела имеет средний радиус ^2 0 нм, <15 нм, <10 нм или от примерно 5 до примерно 7 нм. В одном аспекте, композиция анти-а4(37 антитела содержит > 8 0% по количеству тяжелой плюс легкой цепей по результатам белкового анализа. В одном аспекте, присутствует > 90% тяжелой плюс легкой цепей. В другом аспекте, композиция анти-а4(37 антитела содержит <10% агрегатов, <5% агрегатов, <2,5% агрегатов, <1,5% агрегатов, <1,0% агрегатов или <0,5% агрегатов. В другом аспекте, стабильная композиция анти-а4(37 антитела содержит > 9б% мономеров и/или <2,5% агрегатов. В еще одном аспекте, стабильная композиция анти-а4(37 антитела содержит примерно 99% мономеров и/или примерно <1% агрегатов.
Размеры частиц, например, агрегатов или нерастворенного эксципиента, например, в восстановленной композиции, могут быть измерены методом затемнения света (например, система для подсчета частиц в жидкости (HIAC) фирмы Hach Ultra Analytics
(Grants Pass, OR) ) , микроскопии, культеровским счетчиком или
системой на основе цифровой (например, поточной)
микроскопической визуализации, такой как микрофлюидная визуализация (MFI) фирмы Brightwell (Ottawa, СА) или анализатор частиц FLOWCAM(r) Image фирмы Fluid Imaging Technologies
(Yarmouth, ME) . В одном аспекте, размер частиц в препарате анти-а4(37 антитела составляет примерно 3 0 мкм, примерно 25 мкм, примерно 10 мкм, примерно 5 мкм, примерно 2 мкм или 1 мкм или меньше. Количество частиц в композиции антител должно быть минимальным. В одном аспекте, композиция анти-а4(37 антитела содержит <б000 частиц > 10 мкм и/или <б00 частиц диаметром > 25 мкм в одной дозе (US Pharmacopoeia Chp. 788, способ подсчета методом затемнения света; составляет половину от количества, измеренного микроскопическими способами количественного определения). В еще одном аспекте, количество частиц на миллилитр, например, определенное путем измерения методом MFI, в дозе композиции анти-а4(37 антитела, например, восстановленной композиции, составляет от примерно 500 до примерно 2000, или от примерно 1000 до примерно 3000, частиц размером 2-10 мкм на мл, от примерно 50 до примерно 350 частиц размером > 10 мкм на мл, от примерно 0 до примерно 50 частиц размером > 2 5 мкм на мл.
В одном варианте исполнения, композиция анти-а4(37 антитела имеет аффинность связывания от примерно 60% до примерно 14 0% от значения для эталонного стандарта анти-а4(37 антитела. В одном аспекте, анти-а4(37 антитело в композиции, описанной в настоящем изобретении, связывается с а4(37, например, на клетке (WO98/06248 или патент США № 7147851), со значением, составляющим от примерно 80% до примерно 120% от значения для эталонного стандарта. В другом варианте исполнения, композиция анти-а4(37 антитела обладает способностью ингибировать по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% связывания клетки, экспрессирующей интегрин а4(37, с MAdCAM? например, MAdCAM-1, химерой MAdCAM- Ig
(см. публикацию патентной заявки США № 20070122404, где также приведены примеры эталонных стандартов).
Как было отмечено выше, замораживание композиции is специально предусматривается по настоящему изобретению. Hence, композиция может быть tested for стабильность при замораживании и оттаивание. Соответственно, антитело в жидкой композиции может быть стабильн при замораживании и оттаивание композиция, например, антитело может быть стабильн after one, two, three, four, пять или больше циклы замораживание/оттаивание.
В некоторых вариантах исполнения, композиция представляет собой жидкую композицию, содержащую по меньшей мере примерно 50 мг/мл до примерно 100 мг/мл анти-а4(37 антитела, буферный агент
(например, гистидин) и по меньшей мере примерно 9% (мае./мае.) невосстанавливающего сахара (например, сахарозы, трегалозы или маннита). В одном варианте исполнения, композиция содержит по меньшей мере от примерно 50 до примерно 8 0 мг/мл, примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, буферный агент (например, гистидин) , свободную аминокислоту (например, аргинин) и по меньшей мере примерно 9% или 10% (мае./мае.) невосстанавливающего сахара
(например, сахарозы, трегалозы или маннита).
В другом варианте исполнения, композиция содержит по меньшей мере примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, буферный агент
(например, гистидин), свободную аминокислоту (например, аргинин) и по меньшей мере примерно 10% (мае./мае.) невосстанавливающего сахара (например, сахарозы, трегалозы или маннита). В таких вариантах исполнения, концентрация буфера составляет от примерно 15 до примерно 7 5 мМ, от примерно 2 5 до примерно 65 мМ, или примерно 50 мМ. Концентрация свободной аминокислоты составляет от примерно 50 до примерно 2 50 мМ, от примерно 7 5 до примерно 2 00 мМ, от примерно 100 до примерно 150 мМ, или примерно 12 5 мМ.
В одном варианте исполнения, композиция представляет собой сухую твердую композицию (например, лиофилизированную композицию), содержащую смесь невосстанавливающего сахара, анти-а4(37 антитела, гистидина, аргинина и полисорбата 80, и молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу
(моль:моль) имеет значение более 600:1.
В другом варианте исполнения, композиция представляет собой сухую твердую аморфную композицию (например, лиофилизированную композицию), содержащую смесь невосстанавливающего сахара, анти-а4(37 антитела, гистидина, аргинина и полисорбата 80, и молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу
(моль:моль) имеет значение более 600:1.
В одном варианте исполнения, композиция является лиофилизированной композицией, содержащей невосстанавливающий сахар, анти-а4(37 антитело, гистидин, аргинин и полисорбат 80, и
молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль:моль) в композиции имеет значение более 600:1.
В одном варианте исполнения, композиция является лиофилизированной композицией, содержащей невосстанавливающий сахар, анти-а4(37 антитело, гистидин, аргинин и полисорбат 80, где молярное соотношение невосстанавливающего сахара к анти-а4(37 антителу (моль:моль) в композиции имеет значение более 600:1 и молярное соотношение аргинина к анти-а4(37 антителу (моль:моль) в композиции имеет значение более 250:1.
В одном варианте исполнения, композиция представляет собой жидкую композицию и содержит по меньшей мере примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, по меньшей мере примерно 10% (мае./об.) невосстанавливающего сахара и по меньшей мере примерно 125 мМ одной или нескольких свободных аминокислот.
В одном варианте исполнения, композиция представляет собой жидкую композицию и содержит по меньшей мере примерно 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, по меньшей мере примерно 10% (мае./об.) невосстанавливающего сахара и по меньшей мере примерно 175 мМ одной или нескольких свободных аминокислот.
В одном варианте исполнения, композиция представляет собой жидкую композицию и содержит от примерно 60 мг/мл до примерно 8 0 мг/мл анти-а4(37 антитела, буферный агент и по меньшей мере примерно 10% (мае./мае.) сахара.
В одном варианте исполнения, композиция представляет собой жидкую композицию и содержит от примерно 60 мг/мл до примерно 8 0 мг/мл анти-а4(37 антитела, гистидин и по меньшей мере примерно 10% (мае./мае.) сахарозы.
В одном варианте исполнения, композиция лиофилизирована и хранится в виде разовой дозы в одном флаконе. Флакон желательно хранится при примерно 2-8°С до момента введения нуждающемуся в этом субъекту. Флакон может, например, представлять собой флакон на 2 0 или 50 куб. см (например, для дозы 60 мг/мл) . Флакон может содержать по меньшей мере примерно 12 0 мг, по меньшей мере примерно 180 мг, по меньшей мере примерно 24 0 мг, по меньшей мере примерно 300 мг, по меньшей мере примерно 3 60 мг, по меньшей мере примерно 54 0 мг или по меньшей мере примерно 90 0 мг
анти-а4(37 антитела. В одном аспекте, флакон содержит примерно 300 мг анти-а4(37 антитела.
Один или несколько других фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или стабилизаторов, таких как описанные в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Hendrickson, R. Ed. (2005), могут быть включены в композиции при условии, что они не будут оказывать нежелательного эффекта на требуемые характеристики композиции. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают: дополнительные буферные агенты; сорастворители; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); биодеградируемые полимеры, такие как полиэфиры; консерванты; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.
а4(37 Антитела
Анти-а4(37 антитела, пригодные для использования в композициях, включают антитела из любого желательного источника, такого как полностью человеческие антитела, мышиные антитела, кроличьи антитела и т.п., и любые желательные сконструированные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и т.п. Антигенсвязывающие фрагменты любых таких типов антител, такие как фрагменты Fab, Fv, scFv, Fab' и F(ab')2, также являются пригодными для использования в композициях.
Анти-а4(37 антитело может связываться с эпитопом на а4 цепи (например, гуманизированного МАЬ 21,6 (Bendig et al. , патент США № 5840299) ) , на (37 цепи (например, FIB504 или гуманизированного производного (например, Fong et al., патент США № 7528236)) или с комбинационным эпитопом, образующимся d htpekmnfnt ассоциации цепи а4 с цепью (37. В одном аспекте, антитело связывает комбинационный эпитоп на комплексе а4(37, но не связывает эпитоп на а4 цепи или (37 цепи, если цепи не ассоциированы друг с другом. Ассоциация а4 интегрина с (37 интегрином может создавать комбинационный эпитоп например, в результате сближения вследствие образования мостиковых связей остатков, расположенных в обоих цепях, которые вместе образуют эпитоп, или в результате
конформационного обнажения на одной цепи, например, а4 цепи интегрина или (37 цепи интегрина, эпитопного связывающего сайта, который является недоступным для связывания антителом в отсутствие соответствующего партнера интегрина или без активации интегрина. В другом аспекте, анти-а4(37 антитело связывает как а4 цепь интегрина, так и (37 цепь интегрина и, таким образом, является специфическим по отношению к интегриновому комплексу а4(37. Такие антитела могут связывать а4(37, но не связывают, например, а4(31 и/или не связывают ак(37. В другом аспекте, анти-а4(37 антитело связывается с таким же или по существу с таким же эпитопом, как и Act-1 антитело (Lazarovits, A. I. et al. , J. Immunol., 133(4): 1857-1862 (1984), Schweighoffer et al., J. Immunol., 151(2): 717-729, 1993; Bednarczyk et al. , J. Biol. Chem., 269(11): 8348-8354, 1994). Клеточная линия мышиной гибридомы АСТ-1, которая продуцирует мышиное моноклональное антитело Act-1, была депонирована согласно Будапештскому договору 22 августа 2001 г., от имени фирмы Millennium Pharmaceuticals, Inc., 40 Landsdowne Street, Cambridge, Mass. 02139, U.S.A., в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., под номером доступа PTA-3663. В другом аспекте, анти-а4(37 антитело представляет собой человеческое антитело или а4(37 связывающий белок, в котором используются CDR, предусмотренные в публикации патентной заявки США № 2010/0254975.
В одном аспекте, анти-а4(37 антитело ингибирует связывание а4(37 с одним или несколькими из его лигандов (например, мукозальным адрессином, например, MAdCAM (например, MAdCAM-1), фибронектином и/или сосудистым адрессином (VCAM)). MAdCAM приматов описаны в публикации РСТ WO 96/24673, полное описание которой настоящим включено в данное описание в качестве ссылки. В другом аспекте, анти-а4(37 антитело ингибирует связывание а4(37 с MAdCAM (например, MAdCAM-1) и/или фибронектином без ингибирования связывания VCAM.
В одном аспекте, анти-а4(37 антитела для использования в композициях представляют собой гуманизированные варианты
мышиного Act-1 антитела. Пригодные способы получения гуманизированных антитела хорошо известны специалистам. Обычно, гуманизированное анти-а4(37 антитело содет содержать тяжелую цепь, которая включает 3 гипервариабельных участка тяжелой цепи
(CDR - CDR1, SEQ ID N0:8, CDR2, SEQ ID N0:9 и CDR3, SEQ ID N0:10) мышиного Act-1 антитела и пригодные каркасные участки человеческой тяжелой цепи; а также содержит легкую цепь, которая включает 3 CDR легкой цепи (CDR1, SEQ ID N0:11, CDR2, SEQ ID N0:12 и CDR3, SEQ ID N0:13) мышиного Act-1 антитела и пригодные каркасные участки человеческой легкой цепи. Гуманизированное Act-1 антитело может содержать любые пригодные человеческие каркасные участки, включая консенсусные каркасные участки, с аминокислотными замещениями или без них. Например, одна или несколько каркасных аминокислот может быть заменена на другую аминокислоту, такую как аминокислота в соответствующем положении мышиного Act-1 антитела. Человеческая константная область или ее часть, в случае присутствия, может быть выделена из к- или А-легких цепей и/или из у- (например, yl, у2, уЗ, у4) , ц-, а-
(например, al, a2), 5- или s-тяжелых цепей человеческих антител, включая аллельные варианты. Конкретный вариант константной области или ее частей (например, IgGl), может быть выбран с целью регулирования эффекторной функции. Например, мутированная константная область (вариант) может быть включена в слитый белок для минимизации связывания с Fc-рецепторами и/или способности фиксировать комплемент (см., напр., Winter et al., GB 2209757 В; Morrison et al. , W0 89/07142; Morgan et al. , W0 94/29351, Dec. 22, 1994). Гуманизированные варианты Act-1 антитела были описаны в публикациях РСТ №№ WO98/06248 и WO07/61679, содержание которых настоящим целиком включено в данное описание в качестве ссылки.
В другом аспекте, анти-а4(37 гуманизированные антитела для использования в композиции содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты 2 0-14 0 SEQ ID N0:2 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты 2 0-131 SEQ ID N0:4 или аминокислоты 21-132 SEQ ID N0:5. При необходимости, может присутствовать пригодная человеческая константная область
(области) . Например, гуманизированное анти-а4(37 антитело может
включать тяжелую цепь, содержащую аминокислоты 20-470 SEQ ID N0:2 и легкую цепь, содержащую аминокислоты 21-239 SEQ ID N0:5. В другом примере, гуманизированное анти-а4(37 антитело может включать тяжелую цепь, содержащую аминокислоты 20-470 SEQ ID N0:2 и легкую цепь, содержащую аминокислоты 2 0-2 3 8 SEQ ID N0:4. Фигура 4 изображает выравнивание, сравнивающее типичные легкие цепи человеческих антител с мышиными антителами. Выравнивание показывает, что гуманизированная легкая цепь ведолизумаба (например, Chemical Abstract Service (CAS, American Chemical Society) № регистрации 943609-66-3), с двумя мышиными остатками, замененными на человеческие остатки, является более человеческой, чем легкая цепь LDP-02 (Фигура 3) . Кроме того, LDP-02 содержит слабо гидрофобный, гибкий аланин 114 и гидрофильный сайт (аспартат 115), которые заменены в ведолизумабе на слабо гидрофильный гидроксил-содержащий треонин 114 и гидрофобный, потенциально направленный вовнутрь остаток валина 115.
Дополнительные замещения в последовательности антитела могут быть, например, мутациями каркасных участков тяжелой и легкой цепей, такими как мутация изолейцина на валин в положении остатка 2 SEQ ID N0:14; мутация метионина на валин в положении остатка 4 SEQ ID N0:14; мутация аланина на глицин в положении остатка 24 SEQ ID N0:15; мутация аргинина на лизин в положении остатка 38 SEQ ID N0:15; мутация аланина на аргинин в положении остатка 40 SEQ ID N0:15; мутация метионина на изолейцин в положении остатка 4 8 SEQ ID N0:15; мутация изолейцина на лейцин в положении остатка 69 SEQ ID N0:15; мутация аргинина на валин в положении остатка 71 SEQ ID N0:15; мутация треонина на изолейцин в положении остатка 73 SEQ ID N0:15; или любую их комбинацию; и замещение CDR тяжелой цепи на CDR (CDR1, SEQ ID N0:8, CDR2, SEQ ID N0:9 и CDR3, SEQ ID N0:10) мышиного Act-1 антитела; и замещение CDR легкой цепи на CDR легкой цепи (CDR1, SEQ ID N0:11, CDR2, SEQ ID N0:12 и CDR3, SEQ ID N0:13) мышиного Act-1 антитела.
В некоторых вариантах исполнения, анти-а4(37 гуманизированные антитела для использования в композиции содержат вариабельную
область тяжелой цепи, имеющую примерно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотами 20-140 SEQ ID N0:2, и вариабельную область легкой цепи, имеющую примерно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотами 20-131 SEQ ID N0:4 или аминокислотами 21-132 SEQ ID N0:5. Идентичность аминокислотной последовательности может быть определена с использованием пригодного алгоритм выравнивания последовательностей, такого как система Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), с использованием параметров по умолчанию. В варианте исполнения, анти-а4(37 антитело для использования в композиции представляет собой ведолизумаб (CAS, American Chemical Society, № регистрации 943609-66-3).
Другие а4(37 антитела также могут быть использованы в композициях и режимах дозирования, описанных в настоящем изобретении. Например, а4(37 антитела, описанные в US 2010/0254975 (Amgen, Inc.), целиком включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки, являются пригодными для использования в композициях и способах лечения воспалительной болезни кишечника у людей.
Анти-а4р7 антитело может быть получено путем экспрессии
последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих каждую цепь
в живых клетках, например, клетках в культуре. Различные системы
хозяин-экспрессионный вектор могут быть использованы для
экспрессии молекул антител по изобретению. Такие системы
экспрессии в хозяине предусматривают носители, с помощью которых
кодирующие последовательности, представляющие интерес, могут
быть получены, а затем очищены, но также предусматривают клетки,
которые могут, при трансформации или трансфекции пригодными
кодирующими нуклеотидными последовательностями, экспрессировать
анти-а4(37 антитело in situ. Они включают, без ограничений,
микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coliг В.
subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага,
экспрессионными векторами плазмидной ДНК или космидной ДНК,
содержащими кодирующие последовательности антитела; дрожжи
(например, Saccharomyces, Pichia) , трансформированные
рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными векторами,
содержащими кодирующие последовательности антитела; системы
клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными
экспрессионными векторами (например, бакуловирусными),
содержащими кодирующие последовательности антитела; системы растительных клеток, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV), или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессионными векторами (например, Ti-плазмиды), содержащими кодирующие последовательности антитела; или системы клеток млекопитающих
(например, клетки COS, СНО, ВНК, 293, ЗТЗ, NS0), содержащие рекомбинантные экспрессионные конструкты, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих
(например, аденовирусный поздний промотор; промотор вирус коровьей оспы 7,5К). Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, таким как промоторный элемент главного предраннего гена человеческого цитомегаловируса, являются эффективной системой экспрессии антител (Foecking et al., Селе 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
В бактериальных системах, ряд экспрессионных векторов может быть предпочтительно выбран в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемой молекулы антитела. Например, если нужно продуцировать большое количество такого белка для получения фармацевтических композиций молекулы антитела, могут быть желательными векторы, направляющие экспрессию высоких уровней продуктов слитых белков, которые могут быть легко очищены. Такие векторы включают, без ограничений, экспрессионный вектор Е. coli pUR278 (Ruther et al. , EMBO J. 2:1791 (1983)), в котором кодирующая последовательность антитела может быть лигирована индивидуально в вектор в рамке с кодирующей областью lac Z для получения слитого белка; векторы pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); и т.п. Векторы pGEX также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в
виде слитых белков с глутатион-Б-трансферазой (GST). В общем, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матрицей глутатион-агарозных бусин с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX конструируют таким образом, чтобы они включали сайты расщепления протеазы тромбина или фактора Ха, чтобы клонированный целевой генный продукт мог быть отделен от GST-фрагмента.
В системах насекомых, вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность антитела может быть клонирована индивидуально в несущественные области (например, ген полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV
(например, полиэдринового промотора).
В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использован ряд экспрессионных систем на основе вирусов. В тех случаях, когда в качестве экспрессионного вектора используется аденовирус, кодирующая последовательность антитела, представляющая интерес, может быть лигирована с аденовирусным комплексом контроля транскрипции/трансляции, например, поздним промотором и трехкомпонентной лидерной последовательностью. Этот химерный ген может быть затем вставлен в геном аденовируса путем in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или ЕЗ) будет давать рекомбинантный вирус, который является жизнеспособным и способен экспрессировать молекулу антитела в инфицированных хозяевах
(например, см. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355359 (1984)). Специфические инициирующие сигналы также могут быть необходимы для эффективной трансляции вставленных кодирующих последовательностей антитела. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG и прилегающие к нему последовательности. Кроме того, инициирующий кодон должен быть согласован с рамкой считывания желательной кодирующей последовательности для обеспечения трансляции полной вставки. Такие экзогенные сигналы контроля трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное
происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть усилена путем включения пригодных энхансерных элементов транскрипции, терминаторов транскрипции и т.д. (см. Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).
Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который
модулирует экспрессию вставленной последовательности или
модифицирует и процессирует генный продукт конкретным
желательным образом. Такие модификации (например,
гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функционирования белка. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Пригодные клеточные линии или системы хозяев могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессированного чужеродного белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточными механизмами для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают, без ограничений, клетки яичника китайского хомячка (СНО), NS0, HeLa, VERY, почки новорожденного хомяка (ВНК), почки обезьяны (COS), MDCK, 293, ЗТЗ, WI38, человеческой почечноклеточной карциномы (например, Hep G2) , клеточные линии рака молочной железы, такие как, например, ВТ483, Hs578T, НТВ2, ВТ20 и T47D, и клеточная линия нормальной молочной железы, такая как, например, CRL7030 и Hs578Bst.
Механизмы гликозилирования разных типов клеток могут продуцировать антитела с составами гликозилирования, отличными от других типов клеток, или без гликозилирования, как в случае бактериальных клеток. В одном аспекте, типами клеток, пригодными для продуцирования анти-а4(37 антител, являются клетки млекопитающих, такие как NS0 или клетки СНО. В одном аспекте, клетки млекопитающих могут включать делецию фермента, участвующего в клеточном метаболизме, и экзогенный ген, представляющий интерес, может быть функционально связан с
замещающим ферментом, например, в конструкте или векторе для
введения в клетки, например, путем трансформации или
трансфекции. Конструкт или вектор с экзогенным геном создает для
клеток-хозяев конструкта или вектора селекционное преимущество,
способствующее продуцированию полипептида, кодируемрнр
экзогенным геном. В одном варианте исполнения, клетки СНО представляют собой клетки DG44 (Chasin and Urlaub (1980) PNAS USA 77:4216), включающие делецию или инактивацию гена дигидрофолатредуктазы. В другом варианте исполнения, клетки СНО представляют собой клетки СНО К1, включающие делецию или инактивацию гена глутаминсинтазы (см., например, патенты США №№ 5122464 или 5827739).
Твердые композиции
Твердые композиции по изобретению обычно получают высушиванием жидкой композиции. Может быть использован любой пригодный способ высушивания, такой как лиофилизация или распылительная сушка. Лиофилизация предусматривает замораживание жидкой композиции, обычно в контейнере, который будет использоваться для хранения, транспортировки и распространения композиции (например, флакон) (см., например, Gatlin and Nail в Protein Purification Process Engineering, ed. Roger G. Harrison, Marcel Dekker Inc., 317-367 (1994)). После замораживания композиции, атмосферное давление снижают и температуру регулируют таким образом, чтобы обеспечить удаление замороженного растворителя, например, путем сублимации. Эта стадия процесса лиофилизация иногда называется первичным высушиванием. При необходимости, температура может быть затем поднята для удаления какого-либо растворителя, остающегося связанным с сухой композицией, путем испарения. Эта стадия процесса лиофилизации иногда называется вторичным высушиванием. В тех случаях, когда композиция достигла желательной степени сухости, процесс высушивания завершается и контейнеры герметизуют. Готовую твердую композицию иногда называют "лиофилизированной композицией" или "сухарем" (cake). Процесс лиофилизации может быть проведен с использованием любого пригодного оборудования. Пригодное оборудование для лиофилизации
является доступным из ряда коммерческих источников (например, SP Scientific, Stone Ridge, NY).
Различные пригодные аппараты могут быть использованы для высушивания жидких композиций для получения твердой (например, лиофилизированной) композиции. Обычно, квалифицированные специалисты в данной области техники получают лиофилизированные композиции путем использования герметичной камеры, имеющей полки, на которых размещают флаконы с жидкой композицией для высушивания. Температура полок, а также скорость охлаждения и нагревания, могут контролироваться, так же как и давление внутри камеры. Следует понимать, что различные параметры процесса, описанные в настоящем изобретении, относятся к процессам, осуществляемым с использованием этого типа аппаратов. Рядовые специалисты при необходимости могут легко адаптировать параметры, описанные в настоящем изобретении, к другим типам аппаратов для высушивания.
Пригодные температуры и величина вакуума для первичного и вторичного высушивания могут быть легко определены рядовым специалистом. В общем, композицию замораживают при температуре примерно -30°С или ниже, такой как -4 0°С или -50°С. Скорость охлаждения может влиять на количество и размеры кристаллов льда в матрице. Первичное высушивание обычно проводят при температуре на примерно 10°С, примерно 2 0°С, примерно 30°С, примерно 4 0°С или примерно 50°С выше температуры замораживания. В одном аспекте, условия первичного высушивания могут быть установлены для поддержания анти-а4(37 антитела ниже температуры стеклования или температуры коллапса композиции. Выше температуры коллапса, аморфная замороженная матрица можеть течь (коллапсировать), в результате чего молекулы белка могут не быть окружены жесткой твердой матрицей и молекулы белка могут не быть стабильными в коллапсированной матрице. Также, композицию может быть трудно полностью высушить в случае коллапса. Получаемые при этом более высокие количества влаги в композиции могут приводить к более высоким скоростям деградации белка и уменьшении продолжительности времени, в течение которого лиофилизированный продукт может храниться до снижения его качества до
неприемлемого уровня. В одном аспекте, температуру полок и давление в камере выбирают для поддержания температуры продукт ниже температуры коллапса при первичном высушивании. Температура стеклования замороженной композиции может быть измерена способами, известными специалистам, например, дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК). Температура коллапса может быть измерена способами, известными специалистам, например, микроскопии с вымораживанием жидкой фазы. Соотношение невосстанавливающего сахара к белку (моль:моль) и количества других компонентов композиции будут влиять на температуру стеклования и температуру коллапса. В некоторых вариантах исполнения, температура стеклования для композиции антитела а4(37 составляет от примерно -35°С до примерно -10°С, от примерно -35°С до примерно -25°С, или от примерно -35°С до примерно -2 9°С. В другом варианте исполнения, температура стеклования композиции антитела а4(37 составляет примерно -29°С. В некоторых вариантах исполнения, температура стеклования композиции антитела а4(37 составляет примерно -30°С, примерно -31°С, примерно -32°С, примерно -33°С, примерно -34°С, примерно -35°С или примерно -Зб°С. В некоторых вариантах исполнения, температура коллапса композиции антитела а4(37 составляет от примерно -30°С до примерно 0°С, от примерно -2 8°С до примерно -25°С, или от примерно -20°С до примерно -10°С. В другом варианте исполнения, температура коллапса композиции антитела а4(37 составляет примерно -2б°С. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, укажем, что чем выше скорость нагрева, тем выше будет температура коллапса продукта. Первичная стадия высушивания может удалять по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или больше растворителя. В одном аспекте, первичная стадия высушивания удаляет более 8 0% растворителя из композиции анти-а4(37 антитела.
Первичное высушивание зависит от температуры полок и давления. Условия первичного высушивания могут быть определены эмпирически путем проведения лиофилизации при разных параметрах процесса. Первичное высушивание также может быть математически смоделировано на основе температуры продукта. Уравнения массо- и
теплопередачи (Milton, et al. (1997) PDA J of Pharm Sci & Tech, 51: 7-16), в сочетании со знанием значений Rp и Kv, позволяет понять комбинацию и взаимодействие входных переменных, включая входные переменные процесса, такие как температура полок и давление, и переменные композиции, входящие в значение Rp. Такие модели могут помочь определить параметры, которые должны использоваться для обеспечения эффективного процесса, на основании ограничений, накладываемых на температуру продукта температурой коллапса и производительностью оборудования.
dm А(Ро-Рс)
_ __р
dt R 1пРо= -6144, 96/Тр
Уравнение 1 Уравнение 2
^- = АУК{Т-т) ^Q = AH^_
dt р dt dt
Уравнение 3 Уравнение 4
Уравнение 1 связывает скорость сублимации (dm/dt) при первичном высушивании с площадью внутреннего поперечного сечения контейнера (Ар) , давлением пара льда (Р0) , давление в камере (Рс) и нормированным по площади сопротивления массопереносу для брикета и пробки (Rp) . Р0 на поверхности раздела сублимации может быть определено из Уравнения 2, где Р0 относится к температуре льда продукта на поверхности раздела сублимации, которая принимается приблизительно равной температуре продукта (Тр) , которую можно измерить с помощью термопары на дне флакона, или может быть определена из приведенных выше уравнений после определение всех остальных переменных. Уравнение 3 связывает скорость теплопередачи от полки к флаконам, где Av обозначает площадь флакона, Kv обозначает коэффициент теплопередачи флакона, Ts обозначает температуру полки, и Тр обозначает температуру продукта. Уравнение 4 связывает уравнения тепло- и массопереноса, где AHS обозначает теплоту сублимации.
Как видно из уравнений для первичного высушивания, на скорость сублимации могут влиять температура полки (Ts),
температура продукта (Тр) , давление в камере (Рс) , сопротивление массопереносу брикета (Rp) и коэффициент теплопередача (Kv) .
Необязательной стадией после замораживания и перед первичным высушиванием является отжиг. На этой стадии температура полки лиофилизатора поднимают выше температуры стеклования композиции на короткий период времени, например, примерно 2-6 часов, примерно 3-5 часов, или примерно 4 часа, после чего температуру полки снова снижают до значения ниже температуры стеклования композиции. Отжиг может быть использован для кристаллизации наполнителей и для образования более крупных, более однородных кристаллов льда. Процесс отжига может влиять на время восстановления, поскольку подвергнутый отжигу высушенный брикет имеет большую площадь поверхности, чем высушенный брикет, который не был подвергнут отжигу. Стадия отжига композиции антитела а4(37 может проводиться при температуре от примерно -30°С до примерно -10°С, или от примерно -25°С до примерно -15°С. В одном аспекте, температура отжига композиции антитела а4(37 составляет примерно -20°С.
Вторичное высушивание обычно проводят при температуре выше температуры замораживания жидкой композиции. Например, вторичное высушивание может быть проведено при примерно 10°С, примерно 2 0°С, примерно 30°С, примерно 4 0 °С или примерно 50°С. В одном аспекте, температура вторичного высушивания представляет собой температуру окружающей среды, например, 20-30°С. Время вторичного высушивания должно быть достаточным для уменьшения количество влаги до <5%.
В другом аспекте, цикл лиофилизации включает замораживание при примерно -45°С, отжиг при примерно -20°С, повторное замораживание при примерно -45°С, первичное высушивании при примерно -24°С и 150 миллиторр (0,02 кПа) и вторичное высушивание при примерно 21°С и 150 миллиторр.
Rp зависит от содержания твердых веществ в замороженном DP и от тепловой предыстории DP (стадии замораживания, отжига и повторного замораживания), которые влияют на пористую структуру брикета. Тепловая предыстория может также влиять на стадию вторичного высушивания, когда большая площадь поверхности может
способствовать десорбции воды (Pikal, et al. (1990) Int. J. Pharm., 60: 203-217). Параметрами процесса, которые полезно контролировать на стадиях первичной и вторичной лиофилизации, могут быть температура полки и давление в камере на каждой стадии цикла высушивания.
При масштабировании, загрузка сублимационной сушилки и содержание твердых веществ могут влиять на цикл высушивания. Время первичного высушивания может зависеть от содержания твердых веществ в композиции. При более высоком содержании твердых веществ, например, когда общая концентрация твердых веществ (эксципиентов и/или белка) находится, например, в диапазоне значений более 10 % мае./об. или более 15 % мае./об., отличаясь на величину от 50 до 100% от композиций, время высушивания которых было определено, время высушивания может менятьься. Например, композиция с высоким содержанием твердых веществ может иметь большее время высушивания, чем композиция с низким содержанием твердых веществ. В некоторых вариантах исполнения, процент загрузки сублимационной сушилки по производительности может изменяться в диапазоне значений от примерно 25 до примерно 100%. При большем % загрузки по производительности, время первичного высушивания может увеличиваться до 2 раз по сравнению с меньшим % загрузки по производительности. Разница между временами первичного высушивания при разных % загрузки возрастает с увеличением содержания твердых веществ. В одном варианте исполнения, содержание твердых веществ составляет менее 20-25% и загрузка находится в диапазоне значений 25-100%.
Размер флакона может быть выбран на основании площади поверхности, которая будет контактировать с полкой и вакуума во время лиофилизации. Время высушивания прямо пропорционально высоте слоя, поэтому размер флакона может быть выбран на основании высоты слоя осадка, которая будет определена как разумная. Флакон с большей величиной отношения диаметра к объему может обеспечивать больший контакт с полкой для эффективной теплопередачи на протяжении цикла лиофилизации. Разбавленный раствор антитела в большом объеме жидкости потребует большего
времени для высушивания. Необходимо обеспечить баланс между размером флакона и объемом композиции, потому что флаконы большего размера могут требовать больших затрат при хранении и транспортировке и имеют большее соотношение пустого пространства к композиции и могут увеличивать долю композиции, подверженную разрушительным эффектам влаги при долгосрочном хранении. Для дозы 300 мг, композиция анти-а4(37 антитела может иметь объем перед лиофилизацией, равный 3 мл, 5 мл, б мл, 10 мл, 2 0 мл, 50 мл или 100 мл. В одном аспекте, размер флакона составляет 20 мл для 60 мг/мл раствора при дозе 300 мг.
После лиофилизации, флакон может быть герметизирован, например, закрыт пробкой, под вакуумом. 7Лльтернативно, перед герметизацией во флакон может быть впущен газ, например, сухой воздух или азот. В тех случаях, когда существует проблема окисления, газ, запускаемый в камеру лиофилизации, может включать газ, который замедляет или предотвращает окисление лиофилизированного продукта. В одном аспекте, газ представляет собой бескислородный газ, например, азот, или инертный газ, например, гелий, неон, аргон, криптон или ксенон. В другом аспекте, газ представляет собой азот или аргон.
В некоторых вариантах исполнения, объем композиции анти-а4(37 антитела перед лиофилизацией является таким же, как и объем восстановленого раствора перед введением. Например, композиция, имевшая перед лиофилизацией объем примерно 5,5 мл, может быть восстановлена до объема, равного примерно 5,5 мл, путем прибавления такого количества жидкости, например, воды или солевого раствора, которое учитывает объем сухих твердых веществ. В других вариантах исполнения, может быть желательным лиофилизировать композицию анти-а4(37 антитела в объеме, отличном от объема восстановленого раствора. Например, композиция анти-а4(37 антитела могут быть лиофилизирована в виде разбавленного раствора, например, 0,25х, 0,5х или 0,75х, и восстановлена до 1х путем прибавления меньшего количества жидкости, например, на 75% меньше, наполовину или на 2 5% меньше, чем объем перед лиофилизацией. В варианте исполнения, доза 300 мг может быть лиофилизирована в виде раствора 30 мг/мл антитела в 5% сахарозе
и восстановлена до раствора 60 мг/мл антитела в 10% сахарозе. Альтернативно, лиофилизированная композиция анти-а4(37 антитела может быть восстановлена до более разбавленного раствора, чем композиция перед лиофилизацией.
Лечение композицией антитела
В одном аспекте, изобретение предусматривает способ лечения болезни или расстройства у субъекта, включающий введение субъекту композиции анти-а4(37 антитела, описанной в настоящем изобретении, в количестве, эффективном для лечения болезни или расстройства, например, у людей. Человек может быть взрослым (например, 18 лет или старше), подростком или ребенком. Человек может быть особой в возрасте 65 лет или старше. В отличие от альтернативных терапевтических режимов дозирования, человек в возрасте 65 лет или старше не требует какой-либо модификации режима дозирования, описанного в настоящем изобретении, и ему может быть введена обычная композиция анти-а4(37 антитела, описанная в настоящем изобретении.
Субъект может демонстрировать отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или непереносимость лечения иммуномодулятором, антагонистом TNF-a или их комбинациями. Пациент может ранее получать лечение воспалительной болезни кишечника по меньшей мере одним кортикостероидом (например, преднизоном). Неадекватный ответ на кортикостероиды относится к признакам и симптомам персистентно активной формы болезни вопреки анамнезу по меньшей мере одной 4-недельной схемы индукции, которая включает эквивалент дозы преднизона 3 0 мг в день перорально в течение 2 недель или внутривенно в течение 1 недели. Потеря ответа на кортикостероиды относится к двум неудачным попыткам снизить кортикостероиды до уровня ниже соответствующего эквиваленту дозы преднизона 10 мг в день перорально. Непереносимость кортикостероидов включает анамнез синдрома Кушинга, омтеопении/омтеопороза, гипергликемии, бессонницы и/или инфекции.
Иммуномодулятор может быть, например, азатиоприном перорально, б-меркаптопурином или метотрексатом. Неадекватн ответ на иммуномодулятор относится к признакам и симптомам
персистентно активной болезни вопреки анамнезу по меньшей мере одной 8-недельной схемы или азатиоприна перорально (^1,5 мг/кг), б-меркаптопурина (> 0,75 мг/кг) или метотрексата (^12,5 мг/неделю). Непереносимость иммуномодулятор включает, без ограничений, тошноту/рвоту, боль в животе, панкреатит, аномалии функциональной пробы печени (LFT), лимфопению, генетическую мутацию тиопуринметилтрансферазы (ТРМТ) и/или инфекцию.
В одном аспекте, субъект может демонстрировать отсутствие адекватного ответа с потерей ответа или непереносимостью лечения антагонистом ФНО-а. Антагонист ФНО-а (фактор некроза опухоли-а) , например, представляет собой агент, который ингибирует биологическую активность ФНО-а и, предпочтительно, связывает ФНО-а, такой как моноклональное антитело, например, РЕМИКЕЙД (инфликсимаб), ХУМИРА (адалимумаб), СИМЗИЯ (цертолизумаб пегол), СИМПОНИ (голимумаб) или циркулирующий рецепторный слитый белок, такой как ЭНБРЕЛ (этанерцепт). Неадекватный ответ на антагонист ФНО-а относится к признакам и симптомам персистентно активной формы болезни вопреки анамнезу по меньшей мере одной 4-недельной схемы индукции инфликсимаблм 5 мг/кг внутривенно (IV), 2 дозы с промежутком по меньшей мере 2 недели; одна 8 0 мг подкожная доза адалимумаба, с последующей одной 4 0 мг дозой с промежутком в по меньшей мере две недели; или 4 00 мг подкожно цертолизумаба пегола, 2 дозы с промежутком в по меньшей мере 2 недели. Потеря ответа на антагонист ФНО-а относится к рецидиву симптомов на стадии поддерживающего дозирования после ранее достигнутого клинического эффекта. Непереносимость антагониста ФНО-а включает, без ограничений, реакции, ассоциированные с инфузией, демиелинизацию, застойную сердечную недостаточность и/или инфекцию.
Потеря поддержания ремиссии, в используемом тут значении для субъектов с неспецифическим язвенным колитом, относится к увеличению оценки по шкале Мейо на по меньшей мере 3 балла и оценке по модифицированной шкале Baron, равной по меньшей мере 2 .
В другом аспекте, настоящее изобретение предусматривает композиции анти-а4(37 антител, которые (1) могут связывать
интегрин а4(37 in vitro и/или in vivo; и (2) могут модулировать активность или функцию интегрина а4(37, такую как (а) функция связывания (например, способность интегрина а4(37 связываться с MAdCAM (например, MAdCAM-1), фибронектином и/или VCAM-1) и/или
(Ь) функция инфильтрации лейкоцитов, включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях (например, способность ингибировать миграцию лейкоцитов к кишечной мукозальной ткани). В одном варианте исполнения, антитело в композиции может связывать интегрин а4(37 и может ингибировать связывание интегрина а4(37 с одним или несколькими из его лигандов
(например, MAdCAM (например, MAdCAM-1), VCAM-1, фибронектин), тем самым ингибируя инфильтрацию тканей лейкоцитами (включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях). В другом варианте исполнения, антитело в композиции может связывать интегрин а4(37 и может селективно ингибировать связывание интегрина а4(37 с одним или несколькими из его лигандов
(например, MAdCAM (например, MAdCAM-1), VCAM-1, фибронектин), тем самым ингибируя инфильтрацию тканей лейкоцитами (включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях). Такие композиции анти-а4(37 антител могут ингибировать клеточную адгезию клеток, несущих интегрин а4(37, с клетками сосудистого эндотелия в мукозальных тканях, включая кишечник-ассоциированные ткани, лимфоидные органы или лейкоциты (особенно лимфоциты, такие как Т- или В-клетки) in vitro и/или in vivo. В еще одном варианте исполнения, композиция анти-а4(37 антитела по настоящему изобретению может ингибировать взаимодействие а4(37 с MAdCAM
(например, MAdCAM-1) и/или фибронектином. В еще одном варианте исполнения, композиция анти-а4(37 антитела по настоящему изобретению может селективно ингибировать взаимодействие а4(37 с MAdCAM (например, MAdCAM-1) и/или фибронектином, например, без ингибирования взаимодействия а4(37 with VCAM.
Композиции анти-а4(37 антител по настоящему изобретению могут быть использованы для модулирования (например, ингибирования
(уменьшения или предотвращения)) функции связывания и/или функции инфильтрации лейкоцитов (например, лимфоцитов, моноцитов) интегрина а4(37. Например, гуманизированные
иммуноглобулины, ингибирующие связывание интегрина а4(37 с лигандом (т.е., одним или несколькими лигандами), могут вводиться в соответствии со способом лечения заболеваний, ассоциированных с инфильтрацией лейкоцитов (например, лимфоцитов, моноцитов) в ткани (включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях), в частности, в ткани, экспрессирующие молекулу MAdCAM (например, MAdCAM-1).
Эффективное количество композиции анти-а4(37 антитела по настоящему изобретению (т.е., одного или нескольких) вводят индивидууму (например, млекопитающему, такому как человек или другой примат) с целью лечения такой болезни. Например, воспалительные болезни, включая болезни, ассоциированные с инфильтрацией лейкоцитами желудочно-кишечного тракта (включая кишечник-ассоциированный эндотелий), другие мукозальные ткани или ткани, экспрессирующие молекулу MAdCAM (например, MAdCAM-1)
(например, кишечник-ассоциированные ткани, такие как венулы собственной пластинки тонкой и толстой кишки; и молочной железы
(например, молочной железы в период лактации)), можно лечить в соответствии со способом по настоящему изобретению. Аналогично, индивидуум, имеющий болезнь, ассоциированную с инфильтрацией лейкоцитов в ткани в результате связывания лейкоцитов с клетками
(например, эндотелиальными клетками), экспрессирующими MAdCAM
(например, MAdCAM-1), может получать лечение в соответствии с настоящим изобретением.
В одном варианте исполнения, болезни, которые можно лечить, соответственно включают воспалительную болезнь кишечника (ВБК), такую как неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, илеит, глютеновую болезнь, нетропическую спру, энтеропатию, ассоциированную с серонегативными артропатиями, микроскопический или коллагеновый колит, эозинофильный гастроэнтерит или резервуарный илеит, возникающий после проктоколэктомии и илеоанального анастомоза. Предпочтительно, воспалительная болезнь кишечника представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. Неспецифический язвенный колит может быть от умеренной до тяжелой активной формы неспецифического язвенного колита. Лечение может приводить к
заживлению слизистой у пациентов, страдающих от умеренной до тяжелой активной формы неспецифического язвенного колита. Лечение может также приводить к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероида пациентом.
Другими болезнями, которые можно лечить с использованием
композиции по изобретению, являются панкреатит и инсулин-
зависимый сахарный диабет. Сообщалось, что MAdCAM (например,
MAdCAM-1) экспрессируется некоторыми сосудами в экзокринной
поджелудочной железе NOD (не страдающих ожирением диабетических)
мышей, а также from BALB/c и SJL мышей. Сообщалось, что
экспрессия MAdCAM-1 индуцируется на эндотелии воспаленных
островков поджелудочной железы NOD-мыши, и MAdCAM-1 был
преимущественным адрессином, экспрессируемым эндотелием
островков NOD на ранних стадиях инсулита (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)). Лечение NOD-мышей с использованием анти-MAdCAM (например, анти-MAdCAM-l) или анти-(37 антител предотвращало развитие диабета (Yang et al., Diabetes, 46:1542-1547 (1997)) . Кроме того, наблюдалось накопление лимфоцитов, экспрессирующих а4(37 в островках, и MAdCAM-1 был задействован в связывании клеток лимфомы через а4(37 с сосудами воспаленных островков (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)) или с желудочно-кишечным трактом в лимфоме из клеток мантии (Geissmann et al., Am. J. Pathol., 153:17011705 (1998) ) .
Примеры воспалительных болезней, ассоциированных с
мукозальными тканями, которые можно лечить с использованием
композиции по изобретению, включают холецистит, холангит (Adams
and Eksteen Nature Reviews 6:244-251 (2006) Grant et al. ,
Hepatology 33:1065-1072 (2001)), например, первичный
склерозирующий холангит, болезнь Бехчета, например, кишечника или перихолангит (желчный проток и окружающая ткань печени) и болезнь "трансплантат против хозяина" (например, в желудочно-кишечном тракте (например, после трансплантации костного мозга) (Petrovic et al. Blood 103:1542-1547 (2004)). Как видно при болезни Крона, воспаление часто выходит за пределы мукозальной поверхности, соответственно, восприимчивыми к лечению могут быть
хронические воспалительные болезни, такие как саркоидоз, хронический гастрит, например, аутоиммунный гастрит (Katakai et al. , Int. Immunol., 14:167-175 (2002)) и другие идиопатические состояния.
Изобретение также относится к способу ингибирования инфильтрации лейкоцитами мукозальной ткани. Изобретение также относится к способу лечения рака (например, а4 (37-положительная опухоль, такая как лимфома). Другие примеры воспалительных болезней, ассоциированных с мукозальными тканями, которые можно лечить с использованием композиции по изобретению, включают мастит (молочной железы) и синдром раздраженного кишечника.
Болезни или патогены, этиологии которых задействуют взаимодействие MAdCAM (например, MAdCAM-1) с а4(37, можно лечить анти-а4(37 антителом в композициях, описанных в настоящем изобретении. Примеры таких болезней включают иммунодефицитные расстройства, такие как вызванные вирус иммунодефицита человека (см., например, WO2008140602).
Композицию по изобретению вводят в эффективном количестве,
ингибирующим связывание интегрина а4(37 с его лигандом. Для
терапии, эффективное количество будет достаточным для достижения
желательного терапевтического (включая профилактический) эффекта
(таким как количество, достаточное для уменьшения или
предотвращения интегрин а4 (37-медиируемого связывания и/или
передачи сигналов, тем самым ингибируя адгезию и инфильтрацию
лейкоцитов и/или ассоциированные клеточные ответы). Эффективное
количество анти-а4(37 антитела, например, эффективный титр,
достаточный для поддержания насыщения, например, нейтрализации,
интегрина а4(37, может индуцировать клинический ответ или
ремиссию воспалительной болезни кишечника. Композиция по
изобретению может быть введена в виде разовой дозы или кратных
доз. Дозировка может быть определена способами, известными
специалистам, и может зависеть, например, от возраста
индивидуума, восприимчивости, толерантности и общего
самочувствия. Примеры схем введения включают местные пути, такие как назальное или ингаляционное или трансдермальное введение, энтеральные пути, такие как через питательную трубку или
суппозиторий, и парентеральные пути, такие как внутривенное,
внутримышечное, подкожное, интраартериальное,
интраперитонеальное или интравитреальное введение. Пригодные дозы антитела могут составлять от примерно 0,1 мг/кг веса тела до примерно 10,0 мг/кг веса тела за одно введение, например, от примерно 2 мг/кг до примерно 7 мг/кг, от примерно 3 мг/кг до примерно б мг/кг или от примерно 3,5 до примерно 5 мг/кг. В конкретных вариантах исполнения, вводимая доза составляет примерно 0,3 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно б мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг.
Готовая лекарственная форма, например, после разбавления восстановленого анти-а4(37 антитела (например, в системе для инфузии с солевым раствором или 5% декстрозой) может иметь концентрацию для введения от примерно 0,5 мг/мл до примерно 5 мг/мл. Готовая лекарственная форма может иметь концентрацию от примерно 1,0 мг/мл до примерно 1,4 мг/мл, от примерно 1,0 мг/мл до примерно 1,3 мг/мл, от примерно 1,0 мг/мл до примерно 1,2 мг/мл, от примерно 1,0 до примерно 1,1 мг/мл, от примерно 1,1 мг/мл до примерно 1,4 мг/мл, от примерно 1,1 мг/мл до примерно 1,3 мг/мл, от примерно 1,1 мг/мл до примерно 1,2 мг/мл, от примерно 1,2 мг/мл до примерно 1,4 мг/мл, от примерно 1,2 мг/мл до примерно 1,3 мг/мл или от примерно 1,3 мг/мл до примерно 1,4 мг/мл. Готовая лекарственная форма может иметь концентрацию примерно 0,6 мг/мл, 0,8 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,1 мг/мл, примерно 1,2 мг/мл, примерно 1,3 мг/мл, примерно 1,4 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл, примерно 1,6 мг/мл, примерно 1,8 мг/мл, или примерно 2,0 мг/мл. В одном варианте исполнения, общая доза составляет 180 мг. В другом варианте исполнения, общая доза составляет 300 мг. Доза 300 мг анти-а4(37 антитела может быть разбавлена 250 мл солевого раствора или 5% раствора декстрозы для введения.
В некоторых аспектах, режим дозирования имеет две фазы, индукционную фазу и поддерживающую фазу. В индукционной фазе, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят способом, быстро обеспечивающим эффективное количество антитела или его
антигенсвязывающего фрагмента, пригодное для определенных целей, таких как индуцирование иммунной толерантности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту или для индуцирования клинического ответа и облегчения симптомов воспалительной болезни кишечника. Пациенту может быть проведена индукционная фаза лечения при его начальном лечении анти-а4(37 антителом, при лечении после длительного перерыва в терапии, например, более трех месяцев, более четырех месяцев, более шести месяцев, более девяти месяцев, более одного года, более восемнадцати месяцев или более двух лет после терапии анти-а4(37 антителом, или во время поддерживающей фазы терапии анти-а4(37 антителом, если наблюдается возврат симптомов воспалительной болезни кишечника, например, рецидив из ремиссии болезни. В некоторых вариантах исполнения, режим индукционной фазы приводит к более высокому значению средней минимальной остаточной концентрации, например, концентрации непосредственно перед введением следующей дозы, чем средняя минимальная остаточная концентрация в состоянии равновесия в сыворотке, поддерживаемая на протяжении поддеживающего режима.
В поддерживающей фазе, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят способом, обеспечивающим продолжение ответа, достигнутого при индукционной терапии, со стабильным уровнем антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Поддерживающий режим может предотвращать возврат симптомов или рецидив воспалительной болезни кишечника. Поддерживающий режим может обеспечивать удобство для пациента, например, представлять собой простой режим дозирования или требовать нечастых поездок для лечения. В некоторых вариантах исполнения, поддерживающий режим может включать введение анти-а4(37 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, в композиции, описанной в настоящем изобретении, в соответствии со стратегией, выбранной из группы, состоящей из низких доз, нечастого введения, самовведения и комбинации любых вышеперечисленных элементов.
В одном варианте исполнения, например, во время индукционной фазы терапии, режим дозирования предусматривает эффективное количество анти-а4(37 антитела или антигенсвязывающего фрагмента
в композиции, описанной в настоящем изобретении, для индуцирования ремиссии воспалительной болезни кишечника у пациента. В некоторых вариантах исполнения, эффективное количество анти-а4(37 антитела является достаточным для достижения средней минимальной остаточной концентрации анти-а4(37 антитела от примерно 5 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл, от примерно 15 мкг/мл до примерно 4 5 мкг/мл, от примерно 2 0 мкг/мл до примерно 30 мкг/мл, или от примерно 25 мкг/мл до примерно 35 мкг/мл к концу индукционной фазы. Продолжительность индукционной фазы может составлять примерно четыре недели, примерно пять недель, примерно шесть недель, примерно семь недель или примерно восемь недель лечения. В некоторых вариантах исполнения, схема индукции может использовать стратегию, выбранную из группы, состоящей из высокой дозы, частого введения и комбинации высокой дозы и частого введения анти-а4(37 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, в композиции, описанной в настоящем изобретении. Индукционная доза может быть введена один раз или множество раз, составляющее несколько доз, например, по меньшей мере две дозы. На протяжении индукционной фазы, доза может вводиться раз в день, через день, два раза в неделю, раз в неделю, раз в десять дней, раз в две недели или раз в три недели. В некоторых вариантах исполнения, индукционная доза вводится в первые две недели терапии анти-а4(37 антителом. В одном варианте исполнения, индукционная доза может быть введена один раз при начале лечения (день 0) и один раз примерно через две недели после начала лечения. В другом варианте исполнения, продолжительность индукционной фазы составляет шесть недель. В другом варианте исполнения, продолжительность индукционной фазы составляет шесть недель, и множество индукционных доз вводится в течение первых двух недель.
В некоторых вариантах исполнения, например, при начале лечения пациента с тяжелой воспалительной болезнью кишечника (например, пациентов с неудачной анти-ФНОа терапией), индукционная фаза должна иметь большую продолжительность, чем у пациентов со слабой или умеренной формой болезни. В некоторых вариантах исполнения, индукционная фаза для пациента с тяжелой
болезнью может иметь продолжительность, составляющую по меньшей мере б недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 12 недель или по меньшей мере 14 недель. В одном варианте исполнения, индукционный режим дозирования для пациента с тяжелой болезнью может включать дозу в неделю 0 (начало лечения), дозу в неделю 2 и дозу в неделю б. В другом варианте исполнения, индукционный режим дозирования для пациента с тяжелой болезнью может включать дозу в неделю 0 (начало лечения), дозу в неделю 2, дозу в неделю б и дозу в неделю 10.
В одном варианте исполнения, например, на протяжении поддерживающей фазы терапии, режим дозирования поддерживает среднюю минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия в сыворотке, например, концентрацию плато непосредственно перед введением следующей дозы, от примерно 5 до примерно 2 5 мкг/мл, от примерно 7 до примерно 2 0 мкг/мл, от примерно 5 до примерно 10 мкг/мл, от примерно 10 до примерно 2 0 мкг/мл, от примерно 15 до примерно 2 5 мкг/мл или от примерно 9 до примерно 13 мкг/мл анти-а4(37 антитела. В другом варианте исполнения, режим дозирования например, на протяжении поддерживающей фазы терапии, поддерживает среднюю минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия в сыворотке от примерно 2 0 до примерно 3 0 мкг/мл, от примерно 2 0 до примерно 55 мкг/мл, от примерно 3 0 до примерно 4 5 мкг/мл, от примерно 4 5 до примерно 55 мкг/мл или от примерно 35 до примерно 4 0 мкг/мл анти-а4(37 антитела.
Доза может быть введена раз в неделю, раз в 2 недели, раз в
3 недели, раз в 4 недель, раз в б недель, раз в 8 недель или раз в 10 недель. Более высокая или более частое введение дозы, например, раз в неделю, раз в 2 недели, раз в 3 недели или раз в
4 недели, может быть полезным для индуцирования ремиссии активной формы болезни или для лечения нового пациента, например, для индуцирования толерантности к анти-а4(37 антителу. Меньшая частота введения доз, например, раз в 4 недели, раз в 5 недель, раз в б недель, раз в 8 недель или раз в 10 недель, может быть полезной для профилактической терапии, например, для поддержания ремиссии у пациента с хронической болезнью. В одном
аспекте, схема лечения предусматривает проведение лечения в день О, примерно в неделю 2, примерно в неделю б и через каждые 4 или 8 недель после этого. В одном варианте исполнения, поддерживающий режим включает введение дозы раз в 8 недель. В варианте исполнения, когда пациент на поддерживающем режиме с введением дозы раз в восемь недель, испытывает возврат одного или нескольких симптомов болезни, например, имеет рецидив, частота введения доз может быть увеличена, например, до раза в 4 недели.
Доза может быть введена пациенту в течение примерно 2 0 минут, примерно 2 5 минут, примерно 3 0 минут, примерно 35 минут или примерно 4 0 минут.
Режим дозирования может быть оптимизирован для индукции клинического ответа и клинической ремиссии воспалительной болезни кишечника у пациента. В некоторых вариантах исполнения, режим дозирования не изменяет соотношение CD4 к CD8 в спинномозговой жидкости пациентов, получающих лечение.
В некоторых аспектах, стойкая клиническая ремиссия, например, клиническая ремиссия, которая сохраняется на протяжении по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех посещений лечащего врача на протяжении периода времени шесть месяцев или один год после начала лечения, может быть достигнута при оптимизированном режиме дозирования.
В некоторых аспектах, стойкий клинический ответ, например, клинический ответ, сохраняющийся на протяжении по меньшей мере б месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере года после начала лечения, может быть достигнут при оптимизированном режиме дозирования.
В одном варианте исполнения, режим дозирования включает начальную дозу 300 мг, вторую последовательную дозу 300 мг примерно через две недели после начальной дозы, третью последовательную дозу 300 мг через примерно шесть недель после начальной дозы, с последующей четвертой и последующими дозами 300 мг раз в четыре недели или раз в восемь недель после третьей последовательной дозы.
В некоторых вариантах исполнения, способ лечения, доза или
режим дозирования уменьшают вероятность развития у пациента НАНА-ответа на анти-а4(37 антитело. Развитие НАНА, например, измеряемое по антителам, реактивным к анти-а4(37 антителу, может увеличить клиренс анти-а4(37 антитела, например, снизить концентрацию в сыворотке анти-а4(37 антитела, например, уменьшить число анти-а4(37 антител, связанных с интегрином а4(37, тем самым снижая эффективность лечения. В некоторых вариантах исполнения, для предотвращения НАНА, пациента можно лечить по схеме индукции с последующим поддерживающим режимом. В некоторых вариантах исполнения, между схемой индукции и поддерживающим режимом отсутствует перерыв. В некоторых вариантах исполнения, схема индукции включает введение пациенту множества доз анти-а4(37 антитела. Для предотвращения НАНА, пациента можно лечить с высокой начальной дозой, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, по меньшей мере 2 мг/кг, по меньшей мере 2,5 мг/кг, по меньшей мере 3 мг/кг, по меньшей мере 5 мг/кг, по меньшей мере 8 мг/кг, по меньшей мере 10 мг/кг или от примерно 2 до примерно б мг/кг, или с частыми начальными введениями, например, примерно раз в неделю, примерно раз в две недели или примерно раз в три недели, стандартной дозы при начале терапии анти-а4(37 антителом. В некоторых вариантах исполнения, способ лечения поддерживает по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 7 0%, по меньшей мере 8 0%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% пациентов в НАНА-отрицательном состоянии. В других вариантах исполнения, способ лечения поддерживает пациенты в НАНА-отрицательном состоянии в течение по меньшей мере б недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 15 недель, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет или на протяжении периода проведения терапии. В некоторых вариантах исполнения, пациенты или по меньшей мере 3 0%, по меньшей мере 4 0%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% пациентов, у которых развивается НАНА, сохраняют низкий титр, например, <125, анти-а4(37 антитела. В варианте исполнения, способ лечения поддерживает по меньшей мере 7 0% пациентов в НАНА-отрицательном состоянии в течение по меньшей мере 12 недель после начала
терапии анти-а4(37 антителом.
Композиция может быть введена индивидууму (например,
человеку) сама по себе или в сочетании с другим агентом.
Композиция по изобретению может быть введена до, одновременно с,
или после введения дополнительного агента. В одном варианте
исполнения вводят несколько композиций, ингибирующих связывание
интегрина а4(37 с его лигандами. В таком вариане исполнения может
быть введен агент, например, моноклональное антитело, такое как
анти-MAdCAM (например, анти-MAdCAM-l) или анти-VCAM-l
моноклональное антитело. В другом варианте исполнения,
дополнительный агент ингибирует связывание лейкоцитов с
эндотелиальным лигандом в пути, отличном от пути а4(37. Такой
агент может ингибировать связывание, например, хемокинового (С-С
мотив) рецептора 9 (CCR9)-экспрессирующих лимфоцитов
экспрессированным тимусом хемокином (ТЕСК или CCL2 5) или
агентом, который препятствует связыванию LFA-1 с молекулой
межклеточной адгезии (ICAM). Например, в дополнение к композиции
по настоящему изобретению вводят анти-ТЕСК или анти-ССК9
антитело или ингибитор малой молекулы CCR9, такой как
ингибиторы, раскрытые в публикациях РСТ WO03/099773 или
WO04/046092, или анти-ICAM-l антитело или олигонуклеотид,
предотвращающий экспрессию ICAM. В еще одном варианте
исполнения, дополнительный активный ингредиент (например,
противовоспалительное соединение, такое как сульфасалазин,
азатиоприн, б-меркаптопурин, противовоспалительные средства,
содержащие 5-аминосалициловую кислоту, другое нестероидное
противовоспалительное соединение, стероидное
противовоспалительной соединение или антибиотики, которые обычно вводят для борьбы с ВБК (например, ципрофлоксацин, метронидазол) или другой биологический агент (например, антагонисты ФНО-альфа) может быть введен в сочетании с композицией по настоящему изобретению.
В варианте исполнения, доза совместно вводимого лекарственного препарата может снижаться со временем на протяжении периода лечения с помощью композиции, содержащей анти-а4(37 антитело. Например, пациент, которого лечат стероидом
(например, преднизоном, преднизолоном) в начале или перед лечением композицией анти-а4р7 антитела, будет следовать схеме со снижением дозы стероида начиная с б недель лечения композицией анти-а4(37 антитела. Доза стероида будет уменьшена на примерно 25% на протяжении 4-8 недель после начала снижения, до 50% через примерно 8-12 недель и 75% через примерно 12-16 недель уменьшения дозы во время лечения композицией анти-а4(37 антитела. В одном аспекте, через примерно 16-2 4 недель лечения композицией анти-а4(37 антитела, доза стероида может быть отменена. В другом примере, пациент, которого лечат противовоспалительным соединением, таким как б-меркаптопурин, в начале или перед лечением композицией анти-а4(37 антитела, будет следовать схеме с уменьшением доз противовоспалительного соединения, аналогичной схеме уменьшения дозы стероида, описанной выше.
В одном варианте исполнения, способ включает введение пациенту эффективного количества композиции по изобретению. Если композиция находится в твердой форме, например, в сухом состоянии, процесс введения может включать стадию превращения композиции в жидкое состояние. В одном аспекте, сухая композиция может быть восстановлена, например, жидкостью, как описано выше, для использования в инъекции, например, внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции. В другом аспекте, твердая или сухая композиция может быть введена местно, например, в виде пластыря, крема, аэрозоля или суппозитория.
Изобретение также относится к способу лечения болезни, ассоциированной с инфильтрацией лейкоцитами тканей, экспрессирующих молекулу MAdCAM (например, MAdCAM-1). Способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества композиции анти-а4(37 антитела по изобретению. В варианте исполнения, болезнь представляет собой болезнь "трансплантат против хозяина". В некоторых вариантах исполнения, болезнь представляет собой болезнь, ассоциированную с инфильтрация лейкоцитами тканей в результате связывания лейкоцитов, экспрессирующих интегрин а4(37, с кишечник-ассоциированным эндотелим, экспрессирующим молекулу MAdCAM
(например, MAdCAM-1). В других вариантах исполнения, болезнь
представляет собой гастрит (например, эозинофильный гастрит или аутоиммунный гастрит), панкреатит или инсулин-зависимый сахарный диабет. В других вариантах исполнения, болезнь представляет собой холецистит, холангит или перихолангит.
Изобретение также относится к способу лечения воспалительной болезнь кишечника у пациента. В одном варианте исполнения, способ включает введение пациенту эффективного количества композиции анти-а4(37 антитела по изобретению. В некоторых вариантах исполнения, воспалительная болезнь кишечника представляет собой неспецифически язвенный колит или болезнь Крона. В других вариантах исполнения, воспалительная болезнь кишечника представляет собой глютеновую болезнь, энтеропатию, ассоциированную с серонегативными артропатиями, микроскопический или коллагеновый колит, гастроэнтерит (например, эозинофильный гастроэнтерит) или резервуарный илеит.
В некоторых вариантах исполнения, лечение анти-а4(37 антителом не изменяет соотношения CD4:CD8 лимфоцитов. Соотношения CD4:CD8 могут быть измерены в крови, аспирате лимфатических узлов и спинномозговой жидкости (СМЖ). Соотношения CD4+:CD8+ лимфоцитов в СМЖ здоровых особ типично имеют значения больше или равные примерно 1 (Svenningsson et al., J. Neuroimmunol. 1995; 63:39-46; Svenningsson et al. , Ann Neurol. 1993; 34:155-161). Иммуномодулятор может изменять соотношение CD4:CD8 до значений менее 1.
Промышленные изделия
В другом аспекте, изобретение представляет собой изделие, содержащее фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и предусматривает инструкции по его использованию. Изделие содержит контейнер. Пригодные контейнеры включают, например, бутылки, флаконы (например, двухкамерные флаконы, флакон жидкой композиции с иглой или без нее, флакон твердой композиции с флаконом жидкости для восстановления или без него и с иглой или без нее), шприцы (такие как двухкамерные шприцы, предварительно наполненные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сформован из различных материалов, таких как стекло, металл или пластик. Контейнер содержит композицию, а ярлык на
контейнере или ассоциированный с ним может содержать указания по использованию. В другом варианте исполнения, композиция может быть подготовлена для самовведения и/или содержать инструкции для самовведения. В одном аспекте, контейнер, содержащий композицию, может быть флаконом для одноразового использования. В другом аспекте, контейнер, содержащий композицию, может быть флаконом для многоразового использования, позволяющим осуществлять повторное введение (например, 2-6 введений) композиции, например, с использованием нескольких порций восстановленой композиции. Изделие может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковки с инструкциями по применению, как указано в предыдущем разделе.
Клинические анализы и анализ качества
В другом аспекте, изобретение предусматривает способ
определения соответствия фармацевтической композицией стандартам
качества продукта. Способ может включать оценку
лиофилизированной фармацевтической композиции (например, гуманизированного анти-а4(37 антитела) , включающую осмотр композиции для оценки внешнего вида, определение времени восстановления, определение влагосодержания лиофилизированной композиции, измерение агрегатов в лиофилизированной композиции, измерение фрагментации, измерение окисления/деамидирования и, необязательно, оценку биологической активности и эффективности, где достижение предварительно определенных стандартов демонстрирует, что продукт показан для клинического применения.
Приемлемые уровни качества включают влажность <5,0%, время восстановления <40 минут, значение рН восстановленной жидкости, равное б,3±0,3, концентрацию антитела от 54,0 до 66,0 мг/мл, содержание главной изоформы > 55,0% при определении методом СЕХ (катионообменной хроматографии), содержание мономер > 9б,0% при определении методом SEC (эксклюзионной хроматографии), содержание высокомолекулярных веществ (агрегатов) <2,5%, содержание H+L цепей > 90% при определении методом ДСН-П7ААГ, показатели адгезии в пределах 60-140% от эталонного стандарта.
Изобретение можно более полно понять со ссылкой на приведенные далее примеры. Однако, они не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения. Все литературные и патентные источники целиком включены в настоящий документ в качестве ссылок.
РАЗРАБОТКА ПРОТОКОЛА ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ
A. Раствор анти-а4(37 антитела
Бутылки с замороженным высококонцентрированным препаратом анти-а4(37 антитела (ведолизумаб, 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбат 80, рН 6,3) оттаивают при комнатной температуре в течение 16-2 4 часов. Оттаянные бутылки сливают в смесительный сосуд из нержавеющей стали и перемешивают. Препарат затем разбавляют буфером для разбавления А (50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, рН 6,3) до 80 мг/мл ведолизумаба и перемешивают. Затем прибавляют сахарозу путем разбавления препарата буфером для разбавления В, содержащим сахарозу (50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 40% сахарозы, 0,06% полисорбата 80, рН 6,3) . На этой стадии препарат разбавляют анти-а4(37 антитела до жидкой композиции с 60 мг/мл ведолизумаба, 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 10% сахарозы, 0,06% полисорбата 80, рН 6,3.
B. Лиофилизация
Жидкой композицией анти-а4(37 антитела с концентрацией 60 мг/мл в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, рН 6,3, заполняют стеклянные флаконы на 20 мл по 5,52 мл на флакон и пробки устанавливают в положение для лиофилизации. Флаконы устанавливают в лиофилизатор на полки с заданной температурой примерно 2 0°С. После загрузки всех флаконов и закрывания дверцы, температуру полок снижают для замораживания раствора до примерно -45°С. Через 3 часов при этой температуре, температуру полок повышают до -2 0°С для отжига. После отжига в течение четырех часов, температуру полок понижают для повторного замораживания раствора до примерно -45°С. После уравновешивания флаконов при этой температуре из камеры откачивают воздух. Когда давление достигает 150 мторр (0,02 кПа), температуру полок постепенно повышают до температуры
первичного высушивания, равной примерно -24°С. Первичное высушивание проводится до тех пор, пока из флаконов не сублимируется весь кристаллический лед. Затем температуру полок повышают до 27 °С для вторичного высушивания в течение 16 часов, пока влажность лиофилизированной композиции не достигнет значения менее приблизительно 2,5%. После завершения вторичного высушивания, камеру заполняют газообразным азотом до достижения давления окружающей среды. Флаконы закрывают пробками и вынимают из лиофилизатора.
С. Хранение и использование лиофилизированного анти-а4(37 антитела
Флаконы с лиофилизированным анти-а4(37 антителом хранят при -70°С, -20°С, 2-8°С или 25°С на протяжении желательных периодов времени. Перед использованием, флакон уравновешивают при комнатной температуре. Затем содержимое флакона восстанавливают с помощью шприца, содержащего воду для инъекций ("WFI") с использованием иглы калибра 21G. Количество воды для инъекций определяют таким образом, чтобы конечный объем восстановленого раствора антитела был равен объему раствора перед лиофилизацией. Для величины объема перед лиофилизацией, равной 5,52 мл, прибавляют 4,8 мл воды для инъекций. Флакон осторожно перемешивают с помощью вихревой мешалки, а затем выдерживают в течение 10-30 минут для восстановления композиции, после чего раствор антитела набирают в шприц и прибавляют в мешок для внутривенной (IV) инфузии пациенту.
ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ПРИМЕРЫ
Пример 1
Сравнительные данные для переменного содержания сахара и аминокислот (%) в лиофилизированных композициях
Была разработана схема эксперимента с целью изучения эффекта изменения молярного соотношения сахара (сахарозы и маннита) к белку, молярного соотношение аргинина к белку и молярного количества гистидинаового буфера. Известно, что гистидин и аргинин не кристаллизуются в процессе лиофилизации, что делает их потенциальными крио- или лиопротектантами. Помещают во флаконы на 5 мл по 1,5 мл композиции, лиофилизируют при
первичнов высушивании при -30°С, 150 мТорр и вторичном высушивании при 20°С, 150 мТорр. Стабильность лиофилизированных композиций, восстановленных до 1,5 мл после хранения в разных условиях, приведена в Таблицах 1-3 (объединяющих результаты двух экспериментов для 60 мг/мл). Фигура 6А изображает прогностические модели изменения процентного содержания мономера, процентного содержания агрегатов и процентного содержания главной изоформы для хранения при 4 0°С с меняющимися значениями рН и молярного соотношения сахара и аргинина. Стабильность композиции была наилучшей при низком рН и высоком молярном соотношении (сахар + аргинин) к белку. При исследованных молярных количествах гистидина, он не влиял на стабильность композиции. Все композиции имели влажность при хранении 1-2%.
(SEC).
Композиция 60 мг/мл ведолизумаба +
% агрегатов по методу SEC
t=0
5°С 3 мес.
25°С 60%RH 3 мес.
40°С 75% RH 3 мес.
25 мМ гистидина, 75 мМ аргинина, 2% сахарозы, 0,05% полисорбата 80, рН 6, 3
0,42
0, 53
0, 89
1, 99
25 мМ гистидина, 75 мМ аргинина, 4% сахарозы, 0,05% полисорбата 80, рН 6, 9
0,41
0,51
0, 62
1, 15
50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 2% сахарозы, 0,05% полисорбата 80, рН 6, 7
0,42
0,47
0, 60
1,23
50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 4% сахарозы, 0,05% полисорбата 80, рН 6, 9
0,36
0,44
0, 52
0, 82
50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 6% сахарозы, 1,5% маннита, 0,06% полисорбата 80, рН 6,3
0, 53
0,49
0,51
0,56
50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 9% сахарозы, 0,06% полисорбата 80, рН 6, 3
0,51
0,51
0,59
0,56
Фиг. 6А изображает прогностические модели, основанные на статистическом анализе данных для 40°С из Таблиц 1-3. Модель изменений процентного содержания мономера за месяц при 40°С, определенного методом анализа SEC, описывается уравнением -3,10 + (0,38б)*рН + 0, 000516* ( (число молей сахара+число молей аргинина)/число молей белка)). Модель изменений процентного содержания агрегатов за месяц при 40°С, определенного методом
анализа SEC, имеет вид 2,43 - (0,263)*рН - 0,000787*((число молей сахара+число молей аргинина)/число молей белка)). Модель изменений процентного содержания главной изоформы за месяц при 40°С, определенного методом анализа СЕХ, имеет вид -2,54 + (0,109)*рН - 0,00130*((число молей сахара+число молей аргинина)/число молей белка)). Средняя линия показывает результаты для прогностических моделей, и внешние линии показывают 95% доверительные пределы для прогностических моделей.
Фиг. 6В изображает альтернативные модели, основанные на статистическом анализе данных для 40°С из Таблиц 1-3, входными факторами для которых являются рН, молярное соотношение сахар:белок и молярное соотношение аргинин:белок. Модель изменений процентного содержания мономера за месяц при 40°С, определенного методом анализа SEC, имеет вид -3,02 + (0,370)*рН + 0,000482*((число молей сахара)/(число молей белка) + 0,000657*((число молей аргинина/число молей белка). Модель изменений процентного содержания агрегатов за месяц при 40°С, определенного методом анализа SEC, имеет вид 2,35 - (0,244)*рН -0, 000727* ( (число молей сахара)/(число молей белка) -0,00102*((число молей аргинина)/(число молей белка)). Модель изменений процентного содержания главной изоформы за месяц при 40°С, определенного методом анализа СЕХ, имеет вид -2,92 + (0,210)*рН + 0,00164*((число молей сахара)/)/(число молей белка) - 0, 000220*( (число молей аргинина)/(число молей белка) ) . Средняя линия показывает результаты для прогностических моделей, и внешние линии показывают 95% доверительные пределы для прогностических моделей.
Пример 2
Данные по стабильности
Были проведены испытания трех партий композиции для определения первичной стабильности (партии А, В и С) на стабильность после хранения в заданных условиях хранения (5 и 25°С/60% RH на протяжении до 24 месяцев). Все три партии содержали одну и ту же жидкую композицию, которую подвергали лиофилизации: 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, 50 мМ гистидина, 125
мМ аргинина, 10% сахарозы, 0,06% полисорбата 80, рН 6,3. Для партии А, 3,5 мл раствора помещали во флаконы на 2 0 мл и лиофилизировали, для партий В и С, 5,52 мл раствора помещали во флаконы на 2 0 мл и лиофилизировали.
В отдельных исследованиях, одну композицию лекарственного препарата с 60 мг/мл анти-а4(37 антитела, 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 10% сахарозы, 0,06% полисорбата 80, рН 6,3, лиофилизировали в двух объемах - 3,5 мл и 9,5 мл, соответственно, для получения партий R и S образцов на стабильность, которые анализировали на протяжении 3 8 месяцев. Холостые пробы не тестировались (NT).
Данные (Таблицы 4-19) продемонстрировали, что композиции антител оставались стабильными при хранении на протяжении до 3 8 месяцев при 5°С и до 30 месяцев при 25°С/60% RH. Все характеристики продуктов не выходили за пределы, установленные техническими условиями, до момента времени 3 8 месяцев.
Таблица 4
Изменение процентного содержания мономера, определяемого методом
Таблица б
Изменения процентного содержания главной изоформы, определяемого методом СЕХ, в условиях хранения при 5°С.
Изменение % (H+L), определяемое методом ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, в условиях хранения при 5°С.
Время (месяцев)
Партия А
Партия В
Партия С
Партия R
Партия S
(месяцев)
0,5
0, б
0, б
0, 8
1,0
0,5
0,4
0, б
0,5
0, б
0, б
0, 6
0,7
0,5
0, 8
1,3
0, б
0, б
0,7
0, 9
0, 9
0,5
0,7
0,7
0, 9
0, 9
0,7
0,7
0,2
0,2
0,2
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,2
0,3
0,3
0,3
0,3
0,2
0,4
0,3
21,7
21, 9
22, 6
20,7
20,7
22,7
23,2
Катионообменная хроматография (СЕХ)
Градиент фосфата/хлорида натрия на колонке со слабым катионообменником использовали в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии для выделения заряженных материалов в композиции анти-а4(37 антител и определения заряда материалов композиции антитела. Кислотные изоформы элюируются раньше
главной изоформы, а основные изоформы элюируются после главной изоформы.
Данные по стабильности для всех партий ведолизумаба, полученные с использованием анализа методом СЕХ, приведены в Таблицах 3, 6-8 и 14-16. Таблицы показывают, что в таких условиях хранения, не наблюдалось тенденции снижения % главной изоформы до значений ниже 55,0%.
Эксклюзионная хроматография (SEC)
Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводят с использованием колонки для аналитической SEC (Tosoh Bioscience, LLC, King of Prussia, PA) . Подвижная фаза представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор, и оптическое поглощение контролируют при 280 нм.
Данные по стабильности, полученные с использованием метода анализа SEC, приведены в Таблицах 1, 2, 4, 5, 12 и 13. Таблицы показывают, что ни одни из перечисленных условий хранения не приводили к снижению % мономера ниже 96,0%. Аналогично, % агрегаты оставался <2,5% для всех партий во всех перечисленных условиях хранения.
Анализ ДСН-ПААГ
ДСН-ПААГ проводят с использованием Трис-глицинового геля фирмы Invitrogen (Carlsbad, СА) , 4-20% для восстанавливающих условий и 4-12% для невосстанавливающих условий. Восстановленный образец композиции антитела разбавляют в буфере жидкой композиции, затем разбавляют один к двум буфером Трис-глицин ДСН для образца (2х, Invitrogen) с 10% 2-меркаптоэтанола (восстанавливающий буфер образца) или без 2-меркаптоэтанола (невосстанавливающий буфер образца). Образцы кратковременно нагревают и загружают для анализа в сравнении с маркером молекулярного веса (Invitrogen). Гели окрашивают коллоидным кумасси синим (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Полосы белка анализируют методом денситометрии для определения % тяжелой и легкой цепей для восстановленных гелей и % IgG для невосстановленных гелей.
Данные по стабильности, полученные с использованием метода анализа ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях приведены в
Таблицах 9 и 17. Не наблюдалось заметных изменений в % тяжелых+легких цепей (H+L) во всех перечисленных условиях хранения для всех партий, использованных для определений стабильности. Характер сегментации был аналогичен эталонному стандарту и % (H+L) оставался на уровне ^90%. Эффективность связывания
Клетки НиТ78 (клетки Т-клеточной лимфомы человека, 7American Type Culture Collection, Manassas, VA) , суспендированные в 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в PBS (фосфатно-солевой буфер), вводят в контакт с 0,01% азидом натрия с серийными разведениями первичного испытуемого антитела. После инкубации на льду, клетки промывают и обрабатывают флуоресцентно меченым вторичным антителом. После дополнительного промывания, клетки фиксируют и суспендируют в реагенте FACS для анализа методом проточной цитометрии (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ) ; см. также патент США № 7147851.
Эффективность связывания ведолизумаба измеряли по отношению к эталонному стандарту и определяли в % от эталонного стандарта и ЕС50. Данные по стабильности приведены в Таблицах 10 и 18. Данные для % от эталонного стандарта показали наличие изменчивости, но оставались в пределах, определенных техническими условиями, во всех условиях хранения. Ни одна из исследованных партий ведолизумаба не продемонстрировала тенденции к снижению эффективности связывания в перечисленных условиях хранения.
Влажность по методу Карла Фишера
Композицию титруют метанолом для кулонометрического определения влажности по методу Карла Фишера. Данные по влажности приведены в Таблицах 11 и 19. Все исследованные партии ведолизумаба имели влажность менее 5% во всех перечисленных условиях хранения.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (cIEF) Проводят cIEF с использованием системы iCE280 с детектированием на полной колонке cIEF (Convergent Biosciences, Toronto, Ontario). Амфолит может быть выбран в соответствии с рекомендациями производителя или может быть комбинацией
коммерчески доступных амфолитов. Пригодной комбинацией является смесь 3-10 и 5-8 PHARMALYTE(tm) (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Пример 3j Моделирование масштабированиа процесса
лиофилизации
Был использован принцип "качество на этапе проектирования" при манипулировании загрузкой сублимационной сушилки и содержанием твердых веществ в композиции. Загрузкак изменялась от 33 до 100%. Содержание твердых веществ в композиции изменялось от 9 до 27% путем включения в загрузку композиций с концентрациями, составляющими 0,5х, 1,0* и 1,5х от целевой композиции. Эти композиции имели близкие значения Тд-. При более высоком содержании твердых веществ (%), время первичного высушивания возрастало. Кроме того, при увеличении содержания твердых веществ, температура продукта возрастала вследствие более высокого значения Rp. Загрузка также оказывала влияние на обе стадии высушивания (Фиг. 8).
Пример 4: Неклинические исследования безопасности Были спроектированы исследования для сравнения эффекта натализумаба и ведолизумаба на иммуннологический надзор ЦНС при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ) макак-резус. Восемь животных получали дозы контроля плацебо, раз в неделю. Семь животных получали дозы 3 0 мг/кг натализумаба, раз в неделю. Семь животных получали дозы 3 0 мг/кг ведолизумаба, раз в неделю. Наблюдались клинические симптомы ЭАЭ; частоту и соотношение подгрупп лейкоцитов в СМЖ измеряли методом проточной цитометрии; общую нагрузку поражениями Т2 в мозгу измеряли с использованием магниторезонансной визуализации (МРВ); и нагрузку поражениями и демиелинизацию мозга измеряли путем гистопатологии.
Ведолизумаб не задерживает начало проявления клинических симптомов ЭАЭ по сравнению с контролем плацебо. Он не снижает частоту случаев ЭАЭ или величину клинических показателей. Натализумаб значительно (р <0,05) задерживает проявление клинических симптомов ЭАЭ по сравнению с контролем плацебо. Он снижает частоту случаев ЭАЭ и величину клинических показателей (Фиг. 9) .
Ведолизумаб не предотвращает инфильтрацию СМЖ лейкоцитами, Т-лимфоцитами (Т лимфоцитами-помощниками, цитотоксичными Т лимфоцитами), В лимфоцитами, природными клетками-убийцами или моноцитами. В отличие от него, натализумаб ингибировал инфильтрацию СМЖ.
Ведолизумаб не ингибирует накопление поражений мозга, на что указывают повышенные значения Т2 и пониженные значения MTR (коэффициент передачи намагничивания), полученные при МРВ. Натализумаб предотвращал образование поражений у всех животных, кроме одного. Значительное (р <0,05) ингибирование в инфильтратах мозга и демиелинизацию измеряли гистологически.
Интегрин а4(37 был насыщен ведолизумабом при проведении исследований, на что указывает анализ методом конкурентного связывания между ведолизумабом, вводимым in vivo, и аналитическим анти-а4(37 моноклональным антителом (mAb) , добавляемым ex vivo. Аналитическое анти-а4(37 mAb не связывается с Т-лимфоцитами-помощниками памяти у животных, получавших дозы ведолизумаба. Отсутствие эффекта ведолизумабаа в ЦНС поэтому связано с ЖКТ-тропной биологией интегрина а4(37.
В общем, ведолизумаб (антагонист а4(37) не ингибирует ЭАЭ. В отличие от него, натализумаб (антагонист а4(31 и а4(37) ингибирует ЭАЭ. Интегрин а4(31 медиирует инфильтрацию ЦНС при ЭАЭ. Таким образом, ведолизумаб может характеризоваться меньшим риском вызывать предрасположенность пациентов к PML (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия) , чем натализумаб, поскольку он не антагонизирует интегрин а4(31 и не нарушает иммуннологический надзор ЦНС при ЭАЭ у резус-макак.
Пример 5: Клинические испытания фазы I с использованием ведолизумаба
Сорок девять здоровых субъектов были рандомизированы и получили разовую дозу исследуемого лекарственного препарата: 39 субъектов получили ведолизумаб (5 мг/мл антитела, 2 0 мМ цитрата/лимонной кислоты, 125 мМ хлорида натрия, 0,05% полисорбата 80, рН 6,0 (долгосрочное хранение при -70°С и до 3 месяцев при -20°С)) и 10 субъектов получили плацебо. Из 39 субъектов, которые получили ведолизумаб, по 8 субъектов получили
каждый дозы 0,2, 2,0, 6,0 и 10,0 мг/кг, и 7 субъектов получили ведолизумаб 0,5 мг/кг. Все 49 субъектов завершили испытания.
Не наблюдалось заметной разницы между когортами ведолизумаба по любым демографическим показателям или характеристикам базовой линии. Средний возраст составлял от 35,4 лет до 51,0 года; возраст индивидуальных субъектов менялся в диапазоне от 21 года до 63 лет.
Фармакокинетические (РК) результаты
Ведолизумаб был введен в виде 3 0-минутной внутривенной инфузии от 0,2 до 10,0 мг/кг. Значения Стах и площадь под кривой зависимости концентрации препарата в сыворотке от времени (AUC) возрастали с увеличением дозы. Скорректированные по дозе значения Стах были приблизительно одинаковыми для всех когорт, что указывает на пропорциональность доз по этому параметру. Нормированное по дозе значение площади под кривой концентрации препарата в сыворотке от начала отсчета времени до бесконечности (AUCo-inf) возрастало с увеличением дозы до 2,0 мг/кг, указывая на нелинейный рост AUCo-inf с увеличением дозы для более низких доз, использовавшихся в данных испытаниях. Затем AUCo-inf возрастала пропорционально дозе, указывая на линейность зависимости AUCo-inf в диапазоне доз от 2,0 до 10,0 мг/кг. Увеличение AUCo-inf превышало ожидаемые значения приблизительно в 2,4-раза при дозе 10,0 мг/кг по сравнению с дозой 0,2 мг/кг.
Аналогично, оценки клиренса, объема распределения и периода полувыведения были доза-зависимыми для диапазона доз от 0,2 до 2,0 мг/кг. С увеличением дозы, клиренс уменьшался, объем распределения возрастал и, вследствие этого, период полувыведения увеличивался. Однако, от 2 до 10,0 мг/кг не наблюдалось видимых изменений этих параметров, что позволяет предположить насыщение процесса быстрой элиминации для ведолизумаба в низких концентрациях. Более медленные процессы линейной элиминации, вероятно, обеспечивают большую часть клиренса ведолизумаба при более высоких дозах.
У некоторых субъектов, у которых вырабатывались НАНА к ведолизумабу, наблюдался более быстрый клиренс ведолизумаба по сравнению с НАНА-отрицательными субъектами с соответствующим
уровнем доз.
Таблица 2 0
Обзор фармакокинетики (РК) ведолизумаба (VDZ) по дозовым когортам после внутривенного (IV) введения 0,2-10,0 мг/кг ведолизумаба здоровым субъектам (популяция для РК-анализа)
Параметр
Доза VDZ
Среднее
СТ.
ОТКЛ.
Геом. среднее
%CV
Медиана
Мин.
Макс.
Стах (МКГ/МЛ)
0,2 мг/кг
5,65
0,629
5,62
11,1
5,45
5,13
6,56
0,5 мг/кг
10,6
2,09
10,4
19,7
10,6
8,07
13,1
2,0 мг/кг
59,3
11,6
58,4
19,6
58,4
47,6
78,4
6,0 мг/кг
151
19,1
150
12,6
157
120
168
10,0 мг/кг
243
22,1
243
9,07
242
213
281
AUC o-tlast
(день*мкг/мл)
0,2 мг/кг
31,6
4,98
31,3
15,8
31,6
25,7
37,5
0,5 мг/кг
127
48,0
119
37,9
129
70,9
178
2,0 мг/кг
964
147
955
15,2
972
772
1170
6,0 мг/кг
3090
749
3020
24,2
2830
2360
4100
10,0 мг/кг
4870
624
4840
12,8
4750
4120
5870
AUCo-inf (день*мкг/мл)
0,2 мг/кг
39,5
5,79
39,1
14,7
40,2
31,7
45,7
0,5 мг/кг
134
48,9
127
36,5
134
79,2
188
2,0 мг/кг
979
146
969
14,9
993
784
1180
6,0 мг/кг
3100
750
3030
24,2
2840
2390
4110
10,0 мг/кг
4880
637
4850
13,0
4750
4130
5920
VzOO
0,2 мг/кг
4,02
0,151
4,02
3,76
4,03
3,83
4,18
0,5 мг/кг
4,92
0,620
4,89
12,6
4,66
4,52
5,84
2,0 мг/кг
3,34
0,665
3,28
19,9
3,23
2,29
4,27
6,0 мг/кг
2,98
0,644
2,92
21,6
2,98
2,06
3,98
10,0 мг/кг
2,89
1,02
2,73
35,2
2,98
1,49
4,58
CL (л/день)
0,2 мг/кг
0,413
0,042
0,412
10,1
0,395
0,388
0,476
0,5 мг/кг
0,310
0,106
0,297
34,3
0,291
0,212
0,446
2,0 мг/кг
0,165
0,018
0,164
10,7
0,162
0,145
0,194
6,0 мг/кг
0,140
0,031
0,136
22,0
0,145
0,083
0,166
10,0 мг/кг
0,140
0,024
0,139
16,9
0,135
0,103
0,171
ti/2 (день
0,2 мг/кг
6,79
0,736
6,76
10,8
6,95
5,79
7,47
0,5 мг/кг
11,7
2,83
11,4
24,2
11,4
9,09
14,8
2,0 мг/кг
14,1
2,67
13,9
18,9
14,3
10,6
17,5
6,0 мг/кг
15,1
3,15
14,8
20,9
14,0
11,9
20,3
10,0 мг/кг
14,8
7,38
13,7
49,8
12,5
8,26
30,7
Сокращения: AUCo-inf = площадь под кривой зависимости
концентрации лекарственного препарата от времени,
экстраполированная до бесконечности; AUCo-tiast = площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного препарата от времени от момента введения до момента последнего измерения, при котором концентрация была выше нижнего предела количественного определения; CL = общий клиренс; Стах = максимальная концентрация лекарственного препарата; ti/г = период полувыведения; Vz = объем распределения, определенный на основе фазы выведения.
После достижения Стах, концентрация ведолизумаба в сыворотке снижается обычно по моноэкспоненциальному закону до достижения концентрации приблизительно от 1 до 10 мг/л. После этого концентрации, по-видимому, снижаются нелинейно.
Значения Стах и AUC возрастали с увеличением дозы. Для имеющихся данных, скорректированные по дозе Стах были приблизительно одинаковыми для всех когорт, что указывает на пропорциональность доз по этому параметру. Нормированная по дозе AUCo-inf возрастала с увеличением дозы до 2,0 мг/кг, указывая на нелинейный рост AUCo-inf с увеличением дозы для более низких значений доз, использовавшихся в данных испытаниях. Затем, AUCo-inf увеличивалась пропорционально дозе, что указывает на линейность AUCo-inf для диапазона доз от 2,0 до 10,0 мг/кг. Увеличение AUCo-inf было приблизительно в 2,4-раза выше ожидаемых значений при дозе 10,0 мг/кг по сравнению с дозой 0,2 мг/кг.
Фармакодинамические (PD) результаты
Фармакодинамические (PD) параметры ведолизумаба после 30-минутной внутривенной инфузии от 0,2 до 10,0 мг/кг ведолизумаба по когортам приведены в Таблице 21 и Таблице 22 для Act-1 и MAdCAM, соответственно.
Таблица 21: Обзор фармакодинамики ведолизумаба, процент ингибирования %Act-l+ [CD4+ CD45ROhi9h] , по дозовым когортам после внутривенного (IV) введения 0,2-10,0 мг/кг ведолизумаба здоровым
лекарственного препарата от времени от момента времени 0 до момента времени, соответствующего последней ненулевой концентрации; Етах = максимальный эффект лекарственного препарата
Ведолизумаб ингибировал фармакодинамические (PD) параметры, Act-1 и MAdCAM-1-Fc, почти максимально во все моменты времени, когда концентрация ведолизумаба в сыворотке была измеримой. После того, как концентрации ведолизумаба опускались ниже предела детектирования метода анализа, ингибирование Act-1 и MAdCAM-1-Fc возвращалось приблизительно на уровень базовой линии.
У некоторых субъектов, у которых вырабатывались НАНА к ведолизумабу, наблюдалась более быстрая утрата насыщения рецепторов а4(37 по сравнению с НАНА-отрицательными субъектами с соответствующим уровнем доз.
Результаты по безопасности
Ведолизумаб обычно был безопасным и хорошо переносился при разовых внутривенных (IV) дозах до 10,0 мг/кг. На протяжении исследований не наблюдалось случаев смерти, серьезных нежелательных эффектов (SAE) или нежелательных эффектов (АЕ) , приводивших к прекращению участия в исследованиях.
Иммуногенность/Образование человеческих антител против иммуноглобулина человека (НАНА)
Один (10%) субъект в группе плацебо и 21 (54%) субъект в объединенной группе доз ведолизумаба были НАНА-позитивными в какие-либо моменты времени на протяжении испытаний. Хотя НАНА-положительные образцы наблюдались во всех дозовых когортах, титры НАНА > 125 были обнаружены только в 2 группах с наименьшими дозами ведолизумаба. Ранее для ведолизумаба наблюдалось доза-зависимое подавление образования НАНА. У девятнадцати из 22 получавших ведолизумаб субъектов, которые были НАНА-положительными, присутствие НАНА было нейтрализовано.
Таблица 2 3
Обзор результатов определения человеческих антител против иммуноглобулина человека: Популяция испытаний безопасности
ведолизумаба были персистентно НАНА-позитивными.
b Изолированные НАНА: Субъекты, имеющие только 1 НАНА-положительный образец с титром <2 5
с Персистентные НАНА: Субъекты с 2 или больше НАНА-положительными образцами или с 1 положительным образцом с титром > 25
Выводы
Эти испытания фазы 1 охарактеризовали фармакокинетику (РК)/фармакодинамику (PD) и начальные профили безопасности ведолизумаба, полученного из клеток СНО. Результаты этих испытаний были использованы для обоснования выбора доз для базовых клинических испытаний фазы 3 больных с воспалительной болезнью кишечника.
Ведолизумаб продемонстрировал пропорциональность доз в испытанном диапазоне доз для параметра Стах; однако, доза-зависимые изменения AUCO-inf, CL, Vz и tl/2 наблюдались при дозах от 0,2 до 2,0 мг/кг, что позволяет предположить нелинейный фармакокинетический (РК) характер поведения ведолизумаба. При уровнях доз выше 2,0 мг/кг, никаких дополнительных изменений этих параметров не наблюдалось, что позволяет предположить насыщение процесса быстрого элиминирования ведолизумаба при нихких концентрациях. Более медленные процессы линейного элиминирования, вероятно, отвечают за большую часть клиренса ведолизумаба при более высоких дозах.
Ведолизумаб ингибировал фармакодинамические (PD) параметры, Act-1 и MAdCAM-1 -Fc, при максимальных или близких к ним уровнях во все моменты времени, когда концентрация ведолизумаба в сыворотке была измеримой. После уменьшения концентрации
ведолизумаба ниже преденла детектирования метода анализа, ингибирование Act-1 и MAdCAM-1-Fc возвращалось на уровень, приблизительно соответствующий базовой линии.
У некоторых субъекты, у которых вырабатывались НАНА к ведолизумабу, наблюдался более быстрый клиренс ведолизумаба и утрата насыщения рецептора а4(37 по сравнению с НАНА-отрицательными субъектами с соответствующим уровнем доз.
Ведолизумаб хорошо переносился. На протяжении исследований не наблюдалось случаев смерти, серьезных нежелательных эффектов
(SAE) или нежелательных эффектов (АЕ), приводящих к отказу от участтия в испытаниях введения лекарственного препарата, а также не наблюдалось каких-либо взаимосвязей доза-токсичность. Не было сообщений о системных оппортунистических инфекциях (включая PML
(прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия) ) или неоплазмах.
В отличие от неспецифических антагонистов а4, ведолизумаб не был ассоциирован с лимфоцитозом или увеличением средних значений циркулирующих эозинофилов, базофилов или моноцитов, также не наблюдалось свидетельств истощения лимфоцитов.
Ведолизумаб вызывал образование НАНА, но наивысшие титры (> 125) наблюдались только в 2 группах наименьших доз, что подтверждает полученные ранее наблюдения о доза-зависимом снижении иммуногенности. Эти данные показывают, что введение более высоких доз ведолизумаба может минимизировать клинически значимое образование НАНА.
В заключение, ведолизумаб обычно был безопасным и хорошо переносился при введении разовых доз от 0,2 до 10,0 мг/кг здоровым субъектам.
Пример 6: Определение эффекта ведолизумаба на соотношение CD4:CD8
Здоровым субъектам в возрасте 18-45 вводили разовую дозу 450 мг ведолизумаба, восстановленного из лиофилизированной композиции с 10% сахарозы и разбавленной в системе для инфузии 0,9% солевым раствором. Спинномозговую жидкость (СМЖ) брали люмбальной пункцией перед (базовая линия) и через 5 недель после разовой дозы 450 мг ведолизумаба. Каждый субъект использовался в
качестве своего собственного контроля.
Момент времени 5 недель был выбран на основании предыдущих
испытаний, которые продемонстрировали, что пациенты с рассеянным
склерозом (MS), получавшие лечение натализумабом,
продемонстрировали влияние на соотношение лимфоцитов CD4+:CD8+ в СМЖ и уменьшение числа поражений мозга после всего одной дозы (Stuve et al. Arch Neurol, 2 00 6; 63:1383-1387; Stuve et al. Алл Neurol. 2006; 59:743-747. Miller et al. N Engl J Med. 2003; 348(1) :15-23); а также потому, что доза 450 мг ведолизумаба была достаточной для насыщения мишени через 5 недель и обеспечивала концентрации в сыворотке, превышающие расчетные остаточные уровни в стабильном состоянии, ассоциированные с режимом дозирования фазы 3 раз в 4 недели по 300 мг.
Приблизительно 15 мл СМЖ получали от каждого субъекта для
иммунофенотипирования. Образцы СМЖ включали для прооведения
анализов, если они удовлетворяли следующим критериям: <10
красных кровяных клеток (RBC)/мкл на образец (для
минимизирования загрязнения периферической кровью);
отрицательный результат культивирования СМЖ; достаточное число Т-лимфоцитов в каждом образце для проточной цитометрии; и отсутствие детектируемых антител к ведолизумабу в сыворотке.
Медианное значение для недели 5 (34,80 мкг/мл) и концентрации ведолизумаба в сыворотке для индивидуальных субъектов (диапазон значений 24,9-47,9 мкг/мл) были более высокими, чем предполагаемые остаточные концентрации в состоянии равновесия (-24 мкг/мл) для режима дозирования фазы 3. В неделю 5 наблюдалась высокая степень (> 90%) насыщения рецептора а4(37 по результатам измерений MAdCAM-1-Fc, что указывает на насыщение ведолизумабом его мишени в момент времени, соответствующий проведению оценки конечной точки.
Ведолизумаб не детектировался ни в одном образце СМЖ (предел детектирования = 0,125 мкг/мл).
Влияние на число и соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов
Ведолизумаб не снижал значительно соотношение CD4+:CD8+ (Таблица 25). Ни у кого из субъектов не наблюдалось после введения дозы величина соотношения CD4+:CD8+ <1 (р <0,0001 (1
сторонний t-критерий)). Ведолизумаб не снижал значительно число CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов в СМЖ. Кроме того, не наблюдалось значительных изменений % CD4+ и % CD8+ Т-лимфоцитов в СМЖ (Таблица 2 6) . Также не наблюдалось значительных изменений количеств белых кровяных клеток (WBC), CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов памяти периферической крови (Таблица 27).
НО:ц <1 vs. HI: ц> =1).
тРазница определяется как величина соотношения для недели 5 минус величина соотношения для базовой линии
Эффект лечения на число CD4+ и CD8+ лимфоцитов в СМЖ
Резюме
Ведолизумаб нге влияет на число клеток CD4+ и CD8+ в СМЖ или соотношение CD4+:CD8+ у здоровых добровольцев после разовой дозы 450 мг. Ни у одного из субъектов не наблюдалось уменьшения соотношение CD4+:CD8+ в СМЖ после введения дозы до значений менее 1. Ведолизумаб не детектировался в СМЖ. Кроме того, не наблюдалось изменений общего числа белых кровяных клеток (WBC) или подмножеств CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов памяти в периферической крови. Насыщение мишени (а4(37) в крови наблюдаалось у всех субъектов в момент времени, соответствующий конечной точке оценки. Уровни содержания и соотношение CD4+ и CD8+ лимфоцитов в СМЖ были близки к значениям, ранее описанным в литературе.
Такие результаты согласуются с отсутствием влияния ведолизумаба как на физиологический иммуннологический надзор ЦНС, так и на патологическое воспаление ЦНС у обезьян (см. Пример 4).
Пример 7: Долгосрочная клиническая практика применения ведолизумаба для лечения воспалительной болезни кишечника (ВБК)
Были завершены открытые продолженные испытания безопасности фазы 2 для оценки долгосрочной фармакокинетики (РК), фармакодинамики (PD), безопасности и эффективности ведолизумаба. Пациенты имели возраст от 18 до 7 5 лет и или раньше участвовали в ранее проводившихся испытаниях PK/PD/безопасности пациентов с неспецифическим язвенным колитом, или имели симптомы воспалительной болезни кишечника (ВБК) в течение по меньшей мере 2 месяцев, подтвержденные эндоскопично и/или гистопатологично и/или радиологично на протяжении периода 3 6 месяцев после проведения скрининга.
Все пациенты получали внутривенный режим дозирования или 2 мг/кг или б мг/кг ведолизумаба (5 мг/мл антитела, 2 0 мМ цитрата/лимонной кислоты, 125 мМ хлорида натрия, 0,05% полисорбата 80, рН 6,0 (долгосрочное хранение при -70°С и до 3 месяцев (то) при -2 0°С) ) в дни 1, 15 и 43, с последующим введением доз раз в 8 недель на протяжении до в общей сложности 7 8 недель. Пациенты или не получали ранее лечения неспецифического язвенного колита или были пациентами с болезнью Крона или пациентами с неспецифическим язвенным колитом, которые участвовали в проводившихся ранее клинических испытаниях.
Для оценки результатов данного исследования использовали показатели эффективности/качества жизни (QoL); частичную шкалу Мейо (PMS), индекс активности болезни Крона (CDAI) и опросник для воспалительной болезни кишечника (BBKQ).
Фармакокинетические (РК) результаты
Средние концентрации ведолизумаба перед инфузией были доза-пропорциональными и оставались стабильными и детектируемыми на протяжении исследований.
Фармакодинамические (PD) результаты
Рецепторы (%АСТ-1 + [CD4+CD45RO HIGH] и %MADCAM+ [CD4+CD45RO HIGH] были почти полностью ингибирован на протяжении периода исследований при всех уровнях доз.
Частичная шкала Мейо (PMS)
Средний показатель PMS для базовой линии был выше у не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом (5,4), чем у продолжающих лечение пациентов с неспецифическим язвенным колитом (2,3). К дню 43, средний показатель PMS демонстрировал значительное снижение как для продолжающих лечение, так и для не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом. К дню 155 средние показатели двух групп сблизились. Средние показатели PMS продолжали снижаться до дня 2 67 и впоследствии выходили на плато.
Индекс активности болезни Крона (CDAI)
Среднее значение индекса активности болезни Крона (CDAI) у пациентов с болезнью Крона (CD) снижалось с 294,6 на базовой
линии до 237, 7 в день 43 и продолжало снижаться до дня 155 (156,1) .
BBKQ (Опросник для больных ВЗК)
Продолжающие лечение пациенты с неспецифическим язвенным колитом имели наибольшие средние показатели BBKQ на базовой линии. К дню 43, средние показатели BBKQ увеличивались во всех трех группах больных. Средние показатели BBKQ продолжали возрастать со временем во всех 3 группах больных, достигая максимума в день 155 for пациенты с болезнью Крона и в день 491 для не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом и продолжающих лечение пациентов с неспецифическим язвенным колитом.
С-реактивный белок (CRP)
Как продолжающие лечение пациенты с неспецифическим язвенным колитом, так и пациенты с болезнью Крона продемонстрировали снижение средних уровней CRP до дня 155 с последующим выходом на плато. Не получавшие ранее лечения пациенты с неспецифическим язвенным колитом имели более низкий средний уровень CRP на базовой линии, чем продолжающие лечение пациенты с неспецифическим язвенным колитом (2,28 v. 7,09). Средние уровни CRP у не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом оставались относительно постоянными для всех проанализированных моментов времени.
Другие результаты, касающиеся безопасности
Не было сообщений о других системных оппортунистических инфекциях (включая PML) на протяжении исследований. Для одного пациента был получен положительный результат теста на JC-виремию в один из моментов времени, при отрицательных результатах на JCV во все три другие момента времени. У трех из 7 2 пациентов (4%) были получены положительные результаты на НАНА (два из них были транзиентно положительными). Исследование не выявило свидетельств почечной токсичности, лимфоцитоза или лимфопении или любых других ассоциированных с препаратом изменений лабораторных параметров.
Выводы
Ведолизумаб при введении в дозах 2,0 или 6,0 мг/кг раз в 8
недель на протяжении до 7 8 недель обеспечивал достижение насыщения рецептора-мишени, был ассоциирован с продолжительным снижением средней активности болезни и улучшение показателей BBKQ, был обычно безопасным и хорошо переносился и продемонстрировал приемлемую иммуногенность.
Пример 8: Индукция ответа и ремиссии у пациентов с болезнью Крона от умеренной до тяжелой степени активности
Были проведены рандомизированные двойные слепые, с контролем по плацебо многоцентровые испытания для оценки эффекта индукции ведолизумаба в дозе 300 мг (восстановленной из лиофилизированной композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при рН 6,3), у пациентов с неудачей терапии антагонистом ФНОа в неделю б (после 2 доз -недели 0 и 2) ив неделю 10 (после 3 доз) . В испытаниях участвовали 416 пациентов, 7 5% из которых имели неудачи лечения антагонистами ФНОа, a 2 5% не получали ранее ФНОа. Группы лечения были сбаалансированы демографически и по сопутствующим препаратам для лечения ВБК. Характеристики болезни базовой линии также были сбалансированы по группам лечения, за исключением активности болезни на базовой линии.
Первичной конечной точкой, предусмотренной для данных испытаний, была ремиссия на неделе б (%) в популяции с неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а. Ключевыми вторичными конечными точками, оценка которых проводилась (последовательная процедура проверки), были: ремиссия на неделе б (%) от общей популяции, ремиссия на неделе 10 (%) в популяции с неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а и общей популяции (с использованием процедуры Хохберга), устойчивая ремиссия на неделю б и 10 (%) в популяции с неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а и общей популяции (с использованием процедуры Хохберга) и повышенный ответ в неделю б (%) в популяции с неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а.
Таблица 2 8
Индекс активности болезни Крона (
CDAI) базовой
линии
Плацебо
Ведолизумаб
р-значение
Испытания показали, что пациенты с неудачей антагониста ФНО-а требовали 3 дозы для индукции ремиссии. Показатели ремиссии у пациентов с неудачей антагониста ФНО-а возрастали между неделей б и неделей 10, но только для группы ведолизумаба (не плацебо). Показатели ремиссии для пациентов, не получавших ранее антагонисты ФНО-а, не увеличивались в значительной степени между неделями б и 10. Из популяции с неудачей антагониста ФНО-а с высокой степенью тяжести болезни, 43% никогда не реагировали на антагонист ФНО-а и 45% утрачивали ответ.
Пример 9: Индукция и поддержание ответа и ремиссии у пациентов с неспецифическим язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности
Единые испытания, включающие два рандомизированных двойных слепых многоцентровых исследования, предназначенные для оценки индукции и поддержания ответа и ремиссии у пациентов с неспецифическим язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени
активности. Демографические показатели и характеристики болезни базовой линии были сопоставимыми для всех групп лечения.
Испытания индукции, с использованием внутривенного введения, сравнивали плацебо с ведолизумабом, для дозы 300 мг, восстановленной из лиофилизированной композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при рН 6,3, с конечной точкой в неделю б после 2 доз ведолизумаба.
Испытания поддержания, с использованием той же композиции и
пути введения, что и при испытаниях индукции, сравнивали плацебо
с ведолизумабом при введении доз раз в четыре недели, и плацебо
с ведолизумабом при введении доз раз в восемь недель. Все
пациенты имели возраст в диапазоне 18-80 лет, диагноз
неспецифического язвенного колита от умеренной до тяжелой
степени активности; продемонстрировали, в теченеие
предшествующего 5-летнего периода, неадекватный ответ на, потерю ответа на, или непереносимость по меньшей мере одной обычной терапии (например, кортикостероидов); и могут получать терапевтическую дозу обычных терапий ВБК. Конечной точкой этих исследований был момент времени 52 недели, когда проводился анализ индукции в популяции, вырабатывающей ответ. Обе фазы испытаний достигли своих первичных конечных точек, а именно, клинический ответ при индукции и клиническая ремиссия при поддержании.
Образцы крови брали для измерения концентрации ведолизумаба на протяжении исследований. Средняя концентрация ведолизумаба в сыворотке в конце индукционной фазы составляла от 2 0 до 3 0 мкг/мл. Средние остаточные концентрации ведолизумаба в сыворотке в состоянии равновесия после введенния дозы 300 мг 30 мин. внутривенной (IV) инфузией составляли от 9 до 13 мкг/мл для схемы введения q8wks (раз в 8 недель) и от 35 до 40 мкг/мл для схемы введения q4wks (раз в 4 недели). В конце инфузии, медианные концентрации ведолизумаба в плазме составляли от 98 до 101 мкг/мл для схемы q8wks (8 недель) и примерно от 129 до 137 мкг/мл для q4wks (4 недели).
Краткие сведения о реакции на исследования индукции и
поддержания приведены в Таблицах 32-35. Клинический ответ, ремиссия и заживление слизистой к неделе б были достигнуты у значительно большей части пациентов, получавших лечение ведолизумабом, по сравнению с плацебо (Таблица 32). В фазе индукции 39% ITT-популяции (intent-to-treat - все включенные в исследование пациенты, принявшие хотя бы одну дозу того или иного препарата) имели предшествовавшую неудачу анти-ФНОа терапии. Показатели клинического ответа и ремиссии были более высокими у пациентов, получавших ведолизумаб, по сравнению с плацебо, как для пациентов с предшествовавшей неудачей анти-ФНО терапии, так и для пациентов без предшествовавшей экспозиции анти-ФНО. В предварительных анализах до недели б, показатели частоты нежелательных эффектов (АЕ), серьезных АЕ и нежелательных эффектов, приводящих к прекращению участия в исследованиях, были более высокими в группе плацебо, чем в группе ведолизумаба. У значительно большей части пациентов, получавших ведолизумаб, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо, были достигнуты клиническая ремиссия, заживление слизистой и ремиссия без использования кортикостероидов к неделе 52, и длительный ответ и ремиссия (Таблица 33) . У 32% популяции исследований поддержания наблюдалась предшествующая неудача анти-ФНОа терапии. Показатели клинической ремиссии и длительного клинического ответа для ведолизумаба были выше, чем для плацебо, как у пациентов с неудачей ФНО-терапии, так и у пациентов, не получавших ФНО. В популяции исследований безопасности (N=8 95) для недель 0-52, показатели нежелательных эффектов (АЕ) , серьезных АЕ и серьезных инфекций были близкими для групп ведолизумаба и плацебо. Не наблюдалось увеличения частоты оппортунистических или кишечных инфекций в группе ведолизумаба.
Результаты исследований индукции - Первичные и ключевые
вторичные конечные точки
Исследования индукции: Клинический ответ и ремиссия в неделю б у пациентов с предшествующей неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом и без экспозиции анти-ФНО, ITT популяция (все включенные в исследование пациенты, принявшие хотя бы одну дозу
того или иного препарата)
Пациенты с предшествующей неудачей терапии анти-ФНО-а
антагонистом (39%)
Конечная точка
Плацебо N=63
Ведолизумаб N=82
Разница
95%
доверительный интервал (С1)
Клинический ответ (%)
20, 6
39, 0
18,4
3,9, 32,9
Клиническая ремиссия (%)
3,2
9,8
6, 6
-9,8, 22,8
Клиническая ремиссия и длительный клинический ответ на неделю
52: Пациенты с предшествующей неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом или без экспозиции анти-ФНО-а антагонистом, ITT
популяция
Пациенты с предшествующей неудачей терапии анти-ФНО-а
антагонистом (32%)
Конечная точка
Плацебо N=3 8
VDZ Q8Wks N=4 3
VDZ Q4Wks N=4 0
Разница Q8wks vs.
плацебо Q4wks vs.
плацебо
95% CI
Клиническая ремиссия (%)
5, 3
37,2
35, 0
31, 9 29, 7
10,3, 51,4 7,4, 49,4
Длительный клинический ответ (%)
15, 8
46,5
42,5
30,7 26,7
11,8, 49,6 7,5, 45,9
Пациенты без экспозиции анти-ФНО-а антагонистом (60%)
Плацебо N=7 9
VDZ Q8wks N=72
VDZ Q4wks N=7 3
Разница Q8wks vs.
плацебо Q4wks vs.
плацебо
95% CI
Клиническая ремиссия (%)
19, 0
45, 8
47, 9
26,8 29, 0
12,4, 41,2 14,6, 43,3
Длительный клинический ответ (%)
26,6
65, 3
56, 2
38,7 29, 6
24,0, 53,4 14,6, 44,6
Пример 10: Индукция и поддержание ответа и ремиссии у пациентов с болезнью Крона от умеренной до тяжелой степени активности
Единые исследования, включающие два рандомизированных двойных слепых многоцентровых испытания, предназначенные для оценки индукции и поддержания ответа и ремиссии у пациентов с болезнью Крона с от умеренной до тяжелой степенью активности. Демографические показатели и характеристики болезни базовой линии были сопоставимыми для всех групп лечения.
Испытания индукции, с использованием внутривенного введения, сравнивали плацебо с ведолизумабом, для 300 мг дозы, восстановленной из лиофилизированной композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при рН 6,3, с конечной точкой в неделю б после 2 доз ведолизумаба.
Испытания поддержания, с использованием той же композиции и пути введения, что и при испытаниях индукции, сравнивали плацебо с ведолизумабом при введении доз раз в четыре недели, и плацебо с ведолизумабом при введении доз раз в восемь недель. Конечной точкой этих испытаний была неделя 52, когда проводился анализ индукции в популяции, вырабатывающей ответ.
Неожиданно, данные испытания показали, что группы Q4 и Q8 недель дали очень схожие результаты. Сведения об ответах, наблюдавшихся в исследованиях индукции и поддержания, приведены в Таблицах 36-39. Значительно большая часть пациентов, получавших лечение ведолизумабом, достигала клинической ремиссии и повышенного ответа, по сравнению с плацебо (Таблица 36) . Показатели клинической ремиссии и повышенного ответа были более высокими у пациентов, получавших ведолизумаб, по сравнению с плацебо, как для популяции с предшествующей неудачей анти-ФНО терапии, так и для пациентов без предшествующей экспозиции анти-ФНО. Частота нежелательных эффектов (АЕ), серьезных АЕ и серьезных инфекций была схожей для групп ведолизумаба и плацебо. Не наблюдалось увеличения частоты случаев оппортунистических или кишечных инфекций в группе ведолизумаба.
Таблица 3 8
Клиническая ремиссия и повышенный ответ в неделю б у пациентов с предшествующей неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а и без экспозиции анти-ФНО, ITT популяция
Клиническая ремиссия и повышенный ответ в неделю 52: Пациенты с предшествующей неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а или без экспозиции антагонистом анти-ФНО-а, ITT популяция
Пациенты с предшествующей неудачей терапии антагонистом анти-ФНО-а (51%)
Конечная точка
Плацебо N=7 8
VDZ Q8Wks N=82
VDZ Q4Wks N=7 7
Разница Q8wks vs.
плацебо Q4 wks vs.
плацебо
95% CI
Клиническая ремиссия (%)
12, 8
28, 0
27,3
15, 2 14,5
(3,0, 27,5) (2,0, 26,9)
Повышенный ответ (%)
20,5
29, 3
37,7
8, 8 17, 1
(-4,6, 22,1) (3,1, 31,2)
Информация о последовательностях
SEQ ID NO:
Последовательность приведена на
Описание
Фиг. 1
ДНК, кодирующая тяжелую цепь гуманизированного анти-а4(37 иммуноглобулина
Фиг. 1
7Лминокислотная
последовательность тяжелой цепи гуманизированного анти-а4(37 иммуноглобулина
Фиг. 2
ДНК, кодирующая легкую цепь гуманизированного анти-а4(37 иммуноглобулина
Фиг. 2
7Аминокислотная
последовательность легкой цепи гуманизированного анти-а4(37 иммуноглобулина
Фиг. 3
Легкая цепь зрелого гуманизированного LDP-02
Фиг. 4
Константная область родовой человеческой каппа-легкой цепи
Фиг. 4
Константная область родовой мышиной каппа-легкой цепи
Упоминается на странице 30
SYWMH
CDR1 тяжелой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 30
EIDPSESNTNYNQKFKG
CDR2 тяжелой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 30
GGYDGWDYAIDY
CDR3 тяжелой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 30
RSSQSLAKSYGNTYLS
CDR1 легкой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 30
GISNRFS
CDR2 легкой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 30
LQGTHQPYT
CDR3 легкой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Фиг. 7
Вариабельная область каппа-легкой цепи человеческого GM607 CL антитела
Фиг. 7
Вариабельная область тяжелой цепи человеческого 21/28 CL антитела
Хотя настоящее изобретение было конкретно проиллюстрировано и описано со ссылками на предпочтительные варианты его исполнения, квалифицированным специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные изменения по форме и в деталях могут быть выполнены в настоящем изобретении без выхода за пределы объема изобретения, ограниченные приложенной формулой изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> MILLENNIUM PHARMACEUTICALS, INC. <120> КОМПОЗИЦИЯ АНТИ-АЛЬФА-4-БЕТА-7 АНТИТЕЛА <130> 079259-0615
<140> <141>
<150> 61/585,859
<151> 2012-01-12
<150> 61/550,545 <151> 2011-10-24
<150> 61/481,533 <151> 2011-05-02
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 1445 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание = "Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид"
<400> 1
gaattctcga gatcgatctc accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa 60
cagctacagg tgtccactcc caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gttaagaagc 12 0
ctggggcttc agtgaaggtg tcctgcaagg gttctggcta caccttcacc agctactgga 180
tgcattgggt gaggcaggcg cctggccaac gtctagagtg gatcggagag attgatcctt 240
ctgagagtaa tactaactac aatcaaaaat tcaagggacg cgtcacattg actgtagaca 300
tttccgctag cacagcctac atggagctct ccagcctgag atctgaggac actgcggtct 360
actattgtgc aagagggggt tacgacggat gggactatgc tattgactac tggggtcaag 420
gcaccctggt caccgtcagc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 480
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact 540
tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct 600
tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct 660
ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca 720
aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780
cagcacctga actcgcgggg gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840
ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900
accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960
agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020
accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140
ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200
aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260
actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc 1320
tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 1380
aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataatcta 1440
gagca 1445
<210> 2 <211> 470 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание = "Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 2
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala Ile Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 3 <211> 751 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание = "Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид"
<400> 3
gaattctcga gatcgatctc accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa 60
cagctacagg tgtccactcc gatgtagtga tgactcaaag tccactctcc ctgcctgtca 120
cccctggaga accagcttct atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aagagttatg 180
ggaacaccta tttgtcttgg tacctgcaga agcctggcca gtctccacag ctcctcatct 240
atgggatttc caacagattt tctggggtgc cagacaggtt cagtggcagt ggttcaggga 300
cagatttcac actcaagatc tcgcgagtag aggctgagga cgtgggagtg tattactgct 360
tacaaggtac acatcagccg tacacgttcg gacaggggac caaggtggag atcaagcgta 420
cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 480
ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 540
aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 600
aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgaccctgag caaagcagac tacgagaaac 660
acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 720
tcaacagggg agagtgttag tctagagcag c 751
<210> 4
<211> 238 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание = "Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 4
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 5 <211> 219 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание = "Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 5
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Lys Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 6 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 7 <211> 107 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 7
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105
<210> 8 <211> 5
<212> PRT <213> Mus sp.
<400> 8
Ser Tyr Trp Met His 1 5
<210> 9 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 9
Glu Ile Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10 <211> 12 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 10
Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 11 <211> 16 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 11
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 12 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 12
Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser
<210> 13 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 13
Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr 1 5
<210> 14 <211> 111 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15 <211> 119 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение антитела, которое обладает специфичностью связывания с человеческим интегрином 0x4(37, в производстве лекарственного средства для достижения клинического ответа на болезнь Крона у пациента, являющегося человеком, с болезнью Крона, где антитело вводят пациенту, являющемуся человеком, внутривенно в виде первой дозы 300 мг, второй дозы 300 мг через две недели после первой дозы и третьей дозы 300 мг через шесть недель после первой дозы, где указанный пациент, являющийся человеком, проявлял отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или был интолерантным к антагонисту ФНО-а, и, где антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную аминокислотами 20-140 SEQ ID NO: 2, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную аминокислотами 20-131 SEQ ID NO: 4.
2. Применение по п.1, в котором тяжелая цепь антитела содержит аминокислоты 20-470 SEQ ID NO: 2, и легкая цепь антитела содержит аминокислоты 20-238 SEQ ID NO: 4.
3. Применение по п.1, в котором каждую дозу вводят внутривенно в виде инфузии в течение примерно 3 0 минут.
4. Применение по п.1, в котором болезнь Крона представляет собой болезнь Крона с от умеренной до тяжелой степенью активности.
5. Применение ведолизумаба в производстве лекарственного средства для достижения клинического ответа на болезнь Крона у пациента, являющегося человеком, с болезнью Крона, где ведолизумаб вводят внутривенно пациенту, являющемуся человеком, в виде первой дозы 300 мг, второй дозы 300 мг через две недели после первой дозы и третьей дозы 300 мг через шесть недель после первой дозы, и, где указанный пациент, являющийся человеком, проявлял отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или был интолерантным к антагонисту ФНО-а.
6. Применение по п. 5, в котором болезнь Крона представляет собой болезнь Крона с от умеренной до тяжелой степенью активности.
1.
7. Применение антитела, которое обладает специфичностью связывания с человеческим интегрином а4(37, в производстве лекарственного средства для индуцирования клинической ремиссии у пациента, являющегося человеком, с язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности, где указанное антитело вводят внутривенно пациенту, являющемуся человеком, в виде первой дозы 300 мг, второй дозы 300 мг антитела через две недели после первой дозы, третьей дозы 300 мг антитела через шесть недель после первой дозы, и затем 300 мг антитела каждые восемь недель после этого, где антитело включает последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную аминокислотами 20-140 SEQ ID NO: 2, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную аминокислотами 20-131 SEQ ID NO: 4, и, где указанный пациент, являющийся человеком, проявлял отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или был интолерантным к антагонисту ФНО-а.
8. Применение по п.7, в котором тяжелая цепь антитела содержит аминокислоты 20-470 SEQ ID NO: 2, и легкая цепь антитела содержит аминокислоты 20-238 SEQ ID NO: 4.
9. Применение по п. 7, в котором каждую дозу вводят внутривенно в виде инфузии в течение примерно 3 0 минут.
10. Применение ведолизумаба в производстве лекарственного средства для индуцирования клинической ремиссии у пациента, являющегося человеком, с язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности, где ведолизумаб вводят внутривенно пациенту, являющемуся человеком, в виде первой дозы 300 мг, второй дозы 300 мг ведолизумаба через две недели после первой дозы, третьей дозы 300 мг ведолизумаба через шесть недель после первой дозы, и затем 300 мг ведолизумаба каждые восемь недель после этого, где указанный пациент, являющийся человеком, проявлял отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или был интолерантным к антагонисту ФНО-а.
11. Применение антитела, которое обладает специфичностью связывания с человеческим интегрином а4(37, в производстве лекарственного средства для достижения заживления слизистой и поддержания клинической ремиссии у пациента, являющегося
1.
человеком, с язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности, где антитело вводят внутривенно в качестве клинически доказанной эффективной дозы 300 мг каждые восемь недель пациенту, являющемуся человеком, где антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную аминокислотами 20-140 SEQ ID NO: 2, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную аминокислотами 20-131 SEQ ID NO: 4, где достигается заживление слизистой, и поддерживается клиническая ремиссия, и, где заживление слизистой определяется как 1 балл или менее по эндоскопической подшкале.
12. Применение по п.11, в котором тяжелая цепь антитела содержит аминокислоты 20-470 SEQ ID NO: 2, и легкая цепь антитела содержит аминокислоты 20-238 SEQ ID NO: 4.
13. Применение по п.11, в котором каждую дозу вводят внутривенно в виде инфузии в течение примерно 3 0 минут.
14. Применение по п.11, в котором пациент, являющийся человеком, проявлял отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или был интолерантным к антагонисту ФНО-а.
15. Применение ведолизумаба в производстве лекарственного средства для достижения заживления слизистой и поддержания клинической ремиссии у пациента, являющегося человеком, с язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности, где ведолизумаб вводят внутривенно в качестве клинически доказанной эффективной дозы 300 мг каждые восемь недель, где достигается заживление слизистой, и поддерживается клиническая ремиссия, и, где заживление слизистой определяется как 1 балл или менее по эндоскопической подшкале.
По доверенности
Новая ДНК LDP02 тяжелая цепь - содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные буквы) и лидерную последовательность (строчные)
gaattctcgagatcgatCTCACCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccag
gtgCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA
GGTGTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCATTGGG
TGAGGCAGGCGCCTGGCCAACGTCTAGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTC
TGAGAGTAATACTAACTACAATCAAAAATTCAAGGGACGCGTCACATTGACT
GTAGACATTTCCGCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCTG
AGGACACTGCGGTCTACTATTGTGCAAGAGGGGGTTACGACGGATGGGACTA
TGCTATTGACTACTGGGGTCAAGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCA
CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG
GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA
CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC
TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCT
CCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG
CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC
ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCC
TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT
GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGC
ФИГ. 1A
AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA
AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT
GCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG
GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC
CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG
AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAtaatctagagca
Новый белок LDP02 тяжелая цепь (промежуток между VHL, VH и человеческий lgG1-FcRmut) MGWSCIILFLVATATGVHS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDP SESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDY AID Y WGQGTLVT VS S
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
ФИГ. 1B
Новая ДНК LDP02 легкая цепь - содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные) и лидерную последовательность (строчные)
gaattctcgagatcgatCTCACCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgat
GTAGTGATGACTCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCCTGGAGAACCAGC
TTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGCAAAGAGTTATGGGAACACCT
ATTTGTCTTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCTAT
GGGATTTCCAACAGATTTTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTT
CAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCTCGCGAGTAGAGGCTGAGGACGTGGG
AGTGTATTACTGCTTACAAGGTACACATCAGCCGTACACGTTCGGACAGGGG
ACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC
GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGA
ATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT
CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG
CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAA
CACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA
CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTtagtctagagcagc
Новый белок LDP02 легкая цепь (промежуток между VKL, VK и человеческой С-каппа) MGWSCIILFLVATATGVHS
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGOSPQLLIYGI SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEI К
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ФИГ. 2
попарно newMLN02-no sig
LDP-02-no sig.txt
A 1 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQ 50 В 1 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQ 50
• • • • •
51 LLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQP 100 51 LLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQP 100
• • • • •
101 YTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK 150
I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i 101 YTFGQGTKVEIKRADAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK 150
• • * • •
151 VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE 200 151 VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE 200
201 VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 219
I II I ! I I I ! I ! II I I И! I 201 VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 219
ФИГ. 3
попарно Hum kappa-const MI:Mur kappa-const.txt
A 1 rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsg 50 В 1 radaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqn 50
• • • • •
51 nsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtk 100 51 gvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivk 100
101 sfnrgec 107
101 sfnrnec 107
ФИГ. 4
Bgl II (1/12226)
Xhol Cla EcoRV BsiWI
SnaBI (1670)
Xba I (2330)
Bam H l/Bgl II
Nrul Hind III (2858)
EcoRI (4182) Xhol Cla I Mfel Spe I
BIpL Mfel (4267)
BsiW I (2006)
Xba I (4393) Blp I (4619)
Hind III (7508)
pLKTOK38D
ФИГ. 5
I I I I I I I 6.2 6.4 6.6 6.8 7
300 500 700 900
6.5556 рН
657.8
сахар+аргинин/ белок
ФИГ. 6А
Прогноз профиля
Вариабельный участок каппа-легкой цепи антитела GM607'CI
SEQ ID NO: 14
Asp lie l
Glu Pro
Asn Gly
Pro Gin 50
Asp Arg 65
Ser Arg Leu Gin
Ala Ser
Tyr Asn 35
Leu Leu Phe Ser Val Glu
Thr Pro 100
Ile Ser Cys Arg
Tyr Leu Asp Trp 40
Ile Tyr Leu Gly 55
Gly Ser Gly Ser 70
Ala Glu Asp Val 85
Leu Ser Leu 10
Ser Ser Gin 25
Tyr Leu Gin Ser Asn Arg
Gly Thr Asp 75
Gly Val Tyr 90
Pro Val Ser Leu Lys Pro
Ala Ser
Phe Thr Tyr Cys Lys Val
Thr Pro Gly 15
Leu His Ser 30
Gly Gin Ser Gly Val Pro
Leu Lys Ile 80
Met Gin Ala 95
Glu Ile Lys 110
Вариабельный участок тяжелой цепи антитела 21/28'CL
SEQ ID NO: 15
Gin Val Gin Leu Val Gin 1 5
Ser Val Lys Val Ser Cys 20
Ala Met His Trp Val Arg 35
Gly Trp Ile Asn Ala Gly 50
Gin Gly Arg Val Thr Ile 65 70
Met Glu Leu Ser Ser Leu 85
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr 100
Thr Leu Val Thr Val Ser 115
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 40 45
Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 55 60
Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 75 80
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110
Ser
ФИГ. 7
ФИГ. 9
PATENT COOPERATION TREATY
PCT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
(PCT Article 18 and Rules 43 and 44)
Applicant's or agent's file reference 079259-0615
FOR FURTHER see FORM PCT/ISA/220
ACTION as we" as' wnere applicable, item 5 below.
International application No. PCT/US2 012/03 6 07 2
International filing date (day/month/year) 02/05/2012
(Earliest) Priority Date (day/month/year) 02/05/2011
Applicant
MILLENNIUM PHARMACEUTICALS, INC.
This international search report has been prepared by this International Searching Authority and is transmitted to the applicant according to Article 18. A copy is being transmitted to the International Bureau.
This international search report consists of a total of 5. sheets.
| | It is also accompanied by a copy of each prior art document cited in this report.
1. Basis of the report
a. With regard to the language, the international search was carried out on the basis of: | X | the international application in the language in which it was filed
atranslation of the international application into_
of a translation furnished for the purposes of international search (Rules 12.3(a) and 23.1 (b))
Ь ?
This international search report has been established taking into account the rectification of an obvious mistake authorized by or notified to this Authority under Rule 91 (Rule 43.6b/s(a)).
With regard to any nucleotide and/or amino acid sequence disclosed in the international application, see Box No. I. Certain claims were found unsearchable (See Box No. II) Unity of invention is lacking (see Box No III)
4. With regard to the title,
| X | the text is approved as submitted by the applicant
| | the text has been established by this Authority to read as follows:
With regard to the abstract,
| X | the text is approved as submitted by the applicant
| | the text has been established, according to Rule 38.2, by this Authority as it appears in Box No. IV. The applicant
may, within one month from the date of mailing of this international search report, submit comments to this Authority
With regard to the drawings,
a. the figure of the drawings to be published with the abstract is Figure No.
| | as suggested by the applicant
| | as selected by this Authority, because the applicant failed to suggest a figure
| | as selected by this Authority, because this figure better characterizes the invention
b. X none of the figures is to be published with the abstract
Form PCT/ISA/210 (first sheet) (July 2009)
International application No. PCT/US2 012/03 6 07 2
Box No. I Nucleotide and/or amino acid sequence(s) (Continuation of item 1 .c of the first sheet)
1. With regard to any nucleotide and/or amino acid sequence disclosed in the international application and necessary to the claimed invention, the international search was carried out on the basis of:
a. (means)
| | on paper
| X | in electronic form
b. (time)
| | in the international application as filed
| X | together with the international application in electronic form
| | subsequently to this Authority for the purpose of search
2. I I In addition, in the case that more than one version or copy of a sequence listing and/or table relating thereto has been filed
| | or furnished, the required statements that the information in the subsequent or additional copies is identical to that in the
application as filed or does not go beyond the application as filed, as appropriate, were furnished.
3. Additional comments:
Form PCT/ISA/210 (continuation of first sheet (1)) (July 2009)
International application No.
PCT/US2012/036072
Box No. II Observations where certain claims were found unsearchable (Continuation of item 2 of first sheet)
This international search report has not been established in respect of certain claims under Article 17(2)(a) for the following reasons: 1. | | Claims Nos.:
because they relate to subject matter not required to be searched by this Authority, namely:
Claims Nos.:
because they relate to parts of the international application that do not comply with the prescribed requirements to such an extent that no meaningful international search can be carried out, specifically:
3. Claims Nos.:
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).
Box No. Ill Observations where unity of invention is lacking (Continuation of item 3 of first sheet)
This International Searching Authority found multiple inventions in this international application, as follows:
see additional sheet
1. As all required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers all searchable
I 1 claims.
2. | | As all searchable claims could be searched without effort justifying an additional fees, this Authority did not invite payment of
additional fees.
As only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers
' ' only those claims for which fees were paid, specifically claims Nos.:
No required additional search fees were timely paid by the applicant. Consequently, this international search report is restricted to the invention first mentioned in the claims; it is covered by claims Nos.:
1-34, 67, 68
Remark on Protest The additional search fees were accompanied by the applicant's protest and, where applicable, the
' ' payment of a protest fee.
The additional search fees were accompanied by the applicant's protest but the applicable protest
' ' fee was not paid within the time limit specified in the invitation.
I I No protest accompanied the payment of additional search fees.
Form PCT/ISA/210 (continuation of first sheet (2)) (April 2005)
International application No
PCT/US2012/036072
A. CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER
INV. A61P1/00 A61K39/395 C07K16/28
ADD.
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B. FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
C07K A61K A61P
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
EPO-Internal, BIOSIS, EMBASE, WPI Data
C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
CLELAND J L ET AL: "A SPECIFIC MOLAR RATIO OF STABILIZER TO PROTEIN IS REQUIRED FOR STORAGE STABILITY OF A LYOPHILIZED MONOCLONAL ANTIBODY", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION, WASHINGTON, US,
vol. 90, no. 3, 1 March 2001 (2001-03-01), pages 310-321, XP001179875, ISSN: 0022-3549, D0I:
10.1002/1520-6017(200103)90:3 <310::AID-JPS
6> 3.0.C0;2-R
abstract
page 313, column 1, paragraph 1; figures 1-4; tables 1,2
1-34,67, 68
-/-
X Further documents are listed in the continuation of Box C.
See patent family annex.
* Special categories of cited documents :
"A" document defining the general state of the art which is not considered to be of particular relevance
"E" earlier application or patent but published on or after the international filing date
"L" documentwhich may throw doubts on priority claim(s) orwhich is cited to establish the publication date of another citation or other special reason (as specified)
"O" document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
"T" later document published after the international filing date or priority date and not in conflict with the application but cited to understand the principle or theory underlying the invention
"X" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considered novel or cannot be considered to involve an inventive step when the document is taken alone
"Y" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considered to involve an inventive step when the document is combined with one or more other such documents, such combination being obvious to a person skilled in the art
Category*
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
WO 01/78779 A2 (MILLENNIUM PHARM INC [US]; GENENTECH INC [US]; BRETTMAN LEE R [US]; F0) 25 October 2001 (2001-10-25) claims 1-69
1-34,67, 68
US 2007/122404 Al (0'KEEFE THERESA L 31 May 2007 (2007-05-31) claims 1-29
[US])
1-34,67, 68
W0 98/06248 A2 (LEUK0SITE INC [US]) 19 February 1998 (1998-02-19) page 30, paragraph 3
1-34,67, 68
Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (April 2005)
International Application No. PCT/US2012/036072
FURTHER INFORMATION CONTINUED FROM PCT/ISA/ 210
This International Searching Authority found multiple (groups of) inventions in this international application, as follows:
1. claims: 1-34, 67, 68
Stable formulation of the anti-alpha 4 beta 7 antibody
2. claims: 35, 36
Determination of the quality of a lyophi1ized product
3. claims: 37-66
Treatment of inflammatory disease with antibodies directed against alpha4beta7 integrin
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
109
112
112
115
115
6/10
6/10
6/10
6/10
6/10
6/10
6/10
6/10
7/10
7/10
9/10
10/10
10/10
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 1 of 2
page 1 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 2 of 2
page 2 of 2
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
page 2 of 2
page 2 of 2
