EA201892369A1 20190531 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892369 Полный текст описания [**] EA201892369 20170420 Регистрационный номер и дата заявки EP16305468.7 20160421 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2017/059435 Номер международной заявки (PCT) WO2017/182585 20171026 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21905 Номер бюллетеня [**] СПОСОБЫ СЕЛЕКТИВНОЙ МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ОТДЕЛЬНЫХ ПОДТИПОВ КЛЕТОК Название документа [8] C12N 15/86 Индексы МПК [FR] Коста Фехос Каролин, [FR] Верхёйен Эльс, [FR] Коссе Франсуа-Лоик, [DE] Бендер Рубен, [DE] Бухгольц Кристиан, [GB] Чжоу Ци Сведения об авторах [FR] ЭКОЛЬ НОРМАЛЬ СЮПЕРИЁР ДЕ ЛИОН, [FR] СЕНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ СЬЕНТИФИК, [FR] ЮНИВЕРСИТЕ КЛОД БЕРНАР ЛИОН I, [FR] ИНСТИТУТ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТЭ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ (ИНСЕРМ) Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892369a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к псевдотипированным ретровирусоподобным частицам или ретровирусным векторам, содержащим и сконструированные гликопротеины оболочки, происходящие из вируса семейства Paramyxoviridae, слитые с доменом, нацеливающим на клетку, и слитые с функциональным доменом. Настоящее изобретение также относится к применению указанных псевдотипированных ретровирусоподобных частиц или ретровирусных векторов для селективной модуляции активности специфических поднаборов клеток, в частности специфических иммунных клеток. Данные псевдотипированные ретровирусоподобные частицы или ретровирусные векторы являются особенно полезными для генотерапии, иммунотерапии и/или вакцинации.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к псевдотипированным ретровирусоподобным частицам или ретровирусным векторам, содержащим и сконструированные гликопротеины оболочки, происходящие из вируса семейства Paramyxoviridae, слитые с доменом, нацеливающим на клетку, и слитые с функциональным доменом. Настоящее изобретение также относится к применению указанных псевдотипированных ретровирусоподобных частиц или ретровирусных векторов для селективной модуляции активности специфических поднаборов клеток, в частности специфических иммунных клеток. Данные псевдотипированные ретровирусоподобные частицы или ретровирусные векторы являются особенно полезными для генотерапии, иммунотерапии и/или вакцинации.


Евразийское (21) 201892369 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.05.31
(22) Дата подачи заявки 2017.04.20
(51) Int. Cl. C12N15/86 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ СЕЛЕКТИВНОЙ МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ОТДЕЛЬНЫХ ПОДТИПОВ КЛЕТОК
(31) 16305468.7
(32) 2016.04.21
(33) EP
(86) PCT/EP2017/059435
(87) WO 2017/182585 2017.10.26
(71) Заявитель:
ЭКОЛЬ НОРМАЛЬ СЮПЕРИЁР ДЕ ЛИОН; СЕНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ СЬЕНТИФИК; ЮНИВЕРСИТЕ КЛОД БЕРНАР ЛИОН I; ИНСТИТУТ НАСЬОНАЛЬ
ДЕ ЛЯ САНТЭ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ
МЕДИКАЛЬ (ИНСЕРМ) (FR)
(72) Изобретатель:
Коста Фехос Каролин, Верхёйен Эльс, Коссе Франсуа-Лоик (FR), Бендер Рубен, Бухгольц Кристиан (DE), Чжоу Ци (GB)
(74) Представитель:
Липатова И.И., Хмара М.В., Осипов К.В., Новоселова С.В., Дощечкина В.В., Пантелеев А.С., Ильмер Е.Г.
(RU)
(57) Настоящее изобретение относится к псев-дотипированным ретровирусоподобным частицам или ретровирусным векторам, содержащим и сконструированные гликопротеины оболочки, происходящие из вируса семейства Paramyxoviridae, слитые с доменом, нацеливающим на клетку, и слитые с функциональным доменом. Настоящее изобретение также относится к применению указанных псевдотипированных ретровирусоподобных частиц или ретровирусных векторов для селективной модуляции активности специфических подна-боров клеток, в частности специфических иммунных клеток. Данные псевдотипированные ретро-вирусоподобные частицы или ретровирусные векторы являются особенно полезными для генотера-пии, иммунотерапии и/или вакцинации.
СПОСОБЫ СЕЛЕКТИВНОЙ МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ОТДЕЛЬНЫХ
ПОДТИПОВ КЛЕТОК
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам селективной модуляции активности отдельных подтипов клеток.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Клетки иммунной системы участвуют во многих типах патологий. Увеличение или уменьшение их активности, следовательно, является целью многих терапевтических стратегий. Многие типы иммунных клеток с очень отличающимися функциями могут быть различены по экспрессии определенных
15 белков клеточной поверхности. До сих пор нет доступной технологии, которая обеспечивает селективную активацию или дезактивацию только отдельного подтипа клеток, особенно in vivo.
Применение цитокинов для индукции или стимуляции образования желательного иммунного ответа является привлекательным подходом в
20 иммунотерапии против рака. Цитокины типично используются в качестве неспецифичных вспомогательных веществ для поддержки других иммунотерапий или вводятся дополнительно к химиотерапии. Однако вплоть до настоящего времени лечения на основе цитокинов редко используются из-за нерешенной проблемы системной токсичности. Кроме того, цитокины обычно применяются
25 системно, посредством этого затрагивая все типы клеток, экспрессирующих релевантный цитокиновый рецептор. Следовательно, тонко настроенная модуляция в месте, релевантном для заболевания, является невозможной.
Для преодоления данного недостатка цитокины можно сливать с противоопухолевым антителом или соединять с микро- или наночастицами с
30 противоопухолевым антителом, посредством этого нацеливая цитокины на опухоль и уменьшая системные побочные эффекты. Однако данные слитые белки или частицы, загруженные цитокином-антителом, являются менее стабильными и подвергаются быстрому клиренсу in vivo, приводя к относительно низкой концентрации цитокина в местах заболевания. Кроме того, высвобождение
35 цитокинов частицами, загруженными цитокином-антителом, зависит от рН. Кроме того, цитокины (такие как IL-2 (интерлейкин-2)), доставленные в опухоль этими
предыдущими подходами, неселективно стимулируют разные типы разных
иммунных клеток в сложном микроокружении опухоли, включая и
иммуноэффективные и подавляющие клетки, таким образом, ограничивая их
применения для лечения рака.
5 В том, что касается генотерапии, важные клетки-мишени, такие как
покоящиеся человеческие Т-клетки, В-клетки и HSC (гематопоэтические стволовые клетки) являются невосприимчивыми к трансдукции лентивирусными векторами. Трансдукция, опосредованная традиционным VSV-LV (вирус везикулярного стоматита-лентивирус), происходит только когда Т-клетки были активированы. В
10 генотерапевтических испытаниях, проведенных до настоящего времени, Т-клетки были активированы посредством рецепторов когнатного антигена, что обычно индуцирует фенотипические и функциональные изменения в Т-клетках, и, в конечном счете, приводит к пониженным выживаемости Т-клеток и противоопухолевому эффекту in vivo.
15 Для стимуляции переноса генов в покоящихся Т-клетках было получено
несколько химерных лентивирусных векторов. Например, Verhoeyen et al. (Blood, 2003, vol.101, n°6) раскрывают полученные из ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) векторы, псевдотипированные двумя типами гликопротеинов оболочки: химерным гликопротеином (др) оболочки MLV (вирус лейкоза мышей), N-
20 терминально слитым с IL-7 (интерлейкин-7), и VSV-G (гликопротеин вируса везикулярного стоматита). Данные векторные частицы с IL-7 могут эффективно трансдуцировать покоящиеся Т-клетки и индуцировать активацию Т-клеток, но равным образом трансдуцируют Т-клетки CD4+ и CD8+. Таким образом, они не могут различать разные поднаборы Т-клеток. Кроме того, тот факт, что необходим
25 ненацеленный др оболочки, такой как др VSV-G, возможно будет обеспечивать трансдукцию нежелательных гематопоэтических или эндотелиальных клеток. Одним исключением являются псевдотипированные гликопротеином вируса кори (MeV) лентивирусные векторы (MV-LV). MV-LV может опосредовать трансдукцию покоящихся Т-лимфоцитов без изменения статуса клеточного цикла G0/G1a. Zhou
30 et al. (J Immunol, 2015, vol. 195, n°5) также раскрывают нацеленный на CD4 LV, который может трансдуцировать свежевыделенные покоящиеся Т-клетки, но с очень низкой эффективностью (меньше, чем 10%) при высокой дозе частиц.
Наконец, современные стратегии получения менее дифференцированных опухолеспецифичных Т-клеток для адоптивной Т-клеточной терапии полагаются на
35 оптимизацию протокола стимуляции и культивирования Т-клеток. Например, для продукции большего числа клеток TSCM (стволовые Т-клетки памяти) или клеток ТСм
(центральные Т-клетки памяти) используются комбинации IL-15 и IL-7 или IL-21 и IL-7 для стимуляции и размножения Т-клеток. Данная система культивирования является очень дорогой, так как требуется рутинное повторное пополнение цитокинами (каждые двое суток). Затем обычно применяют несколько стадий 5 сортировки клеток с получением желательных типов клеток.
Следовательно, все еще имеется потребность в предложении способов селективного и эффективного модулирования активности отдельных подтипов иммунных клеток.
10 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения неожиданно обнаружили то, что возможно селективно модулировать активность отдельных подтипов иммунных клеток посредством применения псевдотипированных ретровирусоподобных частиц или ретровирусных
15 векторов (например, лентивирусоподобных частиц (VLP) или лентивирусных векторов (LV)), несущих и специфичный в отношении клетки нацеливающий домен (например, специфичный в отношении Т-клеток CD4+ или в отношении Т-клеток CD8+), и функциональный домен, например, цитокин, каждый из которых слит с гликопротеином вируса семейства Paramyxoviridae. Указанные ретровирусные
20 векторы также специфично и эффективно доставляют упакованный ген в клетки-мишени.
Фактически неожиданно обнаружили то, что объединение функционального домена со специфичным в отношении клетки нацеливающим доменом на псевдотипированных ретровирусоподобных частицах или ретровирусных векторах
25 значительно улучшало селективную модуляцию активности целевых подтипов иммунных клеток по сравнению с соответствующими частицами или векторами, содержащими только специфичный в отношении клетки нацеливающий домен.
Например, авторы изобретения показали то, что частицы, нацеленные на Т-клетки, экспонирующие стимулирующий цитокин, селективно активируют целевые
30 поднаборы Т-клеток смешанных типов клеток и in vivo - в мышиной модели человеческой кровеносной системы, и также доставляют упакованный ген в целевой подтип Т-клеток без какой-либо нобходимости в стимулирующих культуральных условиях. Экспонирующие IL-7 (интерлейкин-7), нацеленные на CD4 частицы на основе гликопротеинов MeV (вирус кори) (4H/IL7H-VLP), в самом
35 деле, специфично активируют и стимулируют выживание культивируемых первичных клеток CD4+, тогда как экспонирующие IL-7, нацеленные на CD8
частицы на основе гликопротеинов NiV (вирус Нипах) (8G/IL7G-VLP) селективно активируют и стимулируют выживание Т-клеток CD8+. Кроме того, 4H/IL7H-LV эффективно и специфично дозозависимо доставляет трансгены GFP (зеленый флуоресцентный белок) в Т-клетки CD4+ в смеси клеток. По сравнению с 5 родительским нацеленым на CD4 LV (не осуществляющим совместное экспонирование IL-7), 4H/IL7H-LV является более эффективным в доставке терапевтического трансгена ErbB2CAR селективно в покоящиеся Т-клетки CD4+. Аналогичный эксклюзивный перенос генов и стимуляцию Т-клеток CD8+ также наблюдали с лентивирусными векторами, псевдотипированными гликопротеином
10 NiV, совместно экспонирующими CD8/IL-7 (8G/IL7G-LV). В самом деле, 8G/IL7G-LV является более эффективным в селективной активации Т-клеток CD8+ и направленной доставке генов, чем 8G-LV (см. примеры).
Ретровирусоподобная частица и ретровирусный вектор согласно изобретению демонстрируют много преимуществ, таких как:
15 - предоставление высокой местной концентрации цитокинов в местах
клеток-мишеней, посредством этого улучшая эффективность и предупреждая тяжелые побочные эффекты цитокиновой терапии,
- обеспечение более стабильной и постоянной стимуляции клеток-мишеней по сравнению с растворимыми цитокинами, посредством этого улучшая
20 эффективность цитокиновой терапии,
- предоставление очень гибкой системы, обеспечивающей объединение разных типов цитокинов и разных типов нацеливающих доменов на одной частице или ретровирусном векторе,
- обеспечение связывания стимуляции клетки со специфичным в отношении 25 клетки переносом генов in vitro или in vitro, что приводит к более эффективной
трансдукции специфических поднаборов покоящихся Т-клеток,
- обеспечение связывания индукции фенотипа Т-клеток с переносом генов in vitro или in vivo из-за взаимодействия с экспонируемыми на частице или поверхности вектора цитокинами, причем дифференциация трансдуцированных
30 клеток контролируется,
и, как более общее:
обеспечение доставки биологического материала и/или терапевтического(ких) лекарственного(ных) средства(ств), включающих ген, мРНК, кшРНК (короткая шпилечная РНК), микроРНК, пептид, белок, фрагмент белка и их 35 комбинации, но не ограничивающихся ими, в конкретные клетки или подтипы клеток in vitro или in vivo,
- обеспечение более легкого способа изготовления клеток (например, способ изготовления Т-клеток или гематопоэтических клеток) для адоптивой терапии,
- предупреждение проблем устойчивости in vivo при применении 5 ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, псевдотипированного
гликопротеинами из вируса Нипах, благодаря низкому уровню предсуществующих антител у людей.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к псевдотипированной ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору, содержащему:
10 а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку,
содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично
15 не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки, или трансмембранный домен и (и) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
20 Paramyxoviridae, причем у указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки, или трансмембранный домен и (и) по меньшей
25 мере один функциональный домен, и
в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, и предпочтительно с отсутствием по
меньшей мере одной части цитоплазматической области указанного гликопротеина
F оболочки,
30 где указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный
модулирущий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G
или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Указанный вирус семейства Paramyxoviridae может представлять собой
вирус рода Morbillivirus, например, выбранный в группе, состоящей из вируса кори 35 (MeV), вируса собачьей чумы, морбилливируса китовых, вируса чумы мелких
жвачных животных, вируса чумы тюленей и вируса чумы, или вируса рода
Henipavirus, например, выбранного в группе, состоящей из вируса Нипах (NiV), вируса Цедар и вируса Хендра.
Белок а) и/или б) предпочтительно содержит по меньшей мере две мутации по сравнению с последовательностью указанного гликопротеина G или Н оболочки, 5 причем указанные по меньшей мере две мутации приводят к по меньшей мере частичной неспособности связываться с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки.
Указанный домен, нацеливающий на клетку, может быть выбран в группе, состоящей из DARPin, scFv, нацеливающего пептида и их комбинаций, и/или 10 указанный функциональный домен может быть выбран в группе, состоящей из цитокина, фактора роста, гормона, нейромедиатора, лиганда апоптоза и их комбинаций.
Клетки-мишени могут быть выбраны в группе, состоящей из клеток гематопоэтической системы (включая Т-клетки, В-клетки, моноциты, клетки Th1,
15 клетки Th2, клетки Treg, тучные клетки, дендритные клетки (DC), клетки природные киллеры (NK), Т-клетки природные киллеры (NKT), макрофаги, гематопоэтические стволовые клетки, предшественники Т- и/или В-клеток, эритробласты, тромбоциты и/или нейтрофилы), клеток стромы, эндотелиальных клеток, клеток печени, мышечных клеток, клеток нервной системы, больных клеток и их комбинаций.
20 Настоящее изобретение также относится к применению
псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, для селективной модуляции активности клеток-мишеней и/или селективной трансдукции клеток-мишеней, причем клетки-мишени являются, например, такими, как определено выше.
25 Настоящее изобретение также относится к способу селективной модуляции
активности клеток-мишеней и/или селективной трансдукции клеток-мишеней, где указанный способ включает приведение в контакт псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, с клетками, включающими указанные клетки-мишени, причем клетки-мишени
30 являются, например, такими, как определено выше.
Настоящее изобретение также относится к псевдотипированной ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору, как определено выше, для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в иммунотерапии, генотерапии и/или вакцинации, например, в предупреждении и/или
35 лечении иммунного заболевания (например, аутоиммунного заболевания), рака, генетического заболевания, аллергического заболевания, воспалительного
заболевания, инфекционного заболевания, метаболического заболевания, неврологического заболевания (например, нейродистрофии, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера), мышечного заболевания и их комбинаций.
5 Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте,
содержащей последовательность, кодирующую слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или последовательность, кодирующую модулирующий слитый белок, где:
- указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
10 Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (и) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку, и
- указанный модулирующий слитый белок содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (и) по меньшей мере один функциональный домен.
15 Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему
нуклеиновую кислоту, как определено выше.
Настоящее изобретение также относится к способу получения псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, где указанный способ включает сотрансфекцию линии
20 упаковывающих клеток:
(i) по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый белок, нацеливающий на клетку, причем указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (и) по меньшей
25 мере один домен, нацеливающий на клетку,
(и) по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей модулирующий слитый белок, причем указанный модулирующий слитый белок содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (и) по меньшей мере
30 один функциональный домен,
(iii) по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей
гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства
Paramyxoviridae,
(iv) по меньшей мере одним вектором, содержащим нуклеиновую кислоту,
35 кодирующую коровые белки из указанного ретровируса, и
(v) возможно по меньшей мере одним вектором, содержащим геном, происходящий от ретровирусного, компетентный в отношении упаковывания,
где указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный модулирующий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G 5 или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный
вектор
Термин "ретровирусоподобная частица" в том виде, в котором он 10 используется в данном документе, относится к частице, содержащей
ретровирусные белки Gag, Pol и Env (оболочка), но не содержащей какой-либо
генетической информации, происходящей из ретровируса.
Белки Gag, Pol и Env происходят из ретровируса и предоставляются в
транслированном виде посредством линии упаковывающих клеток.
15 "Ретровирусный вектор" в том виде, в котором он используется в данном
документе, содержит белки Gag, Pol и Env (оболочка) и молекулу РНК. Указанная
молекула РНК не содержит какого-либо гена gag, env или pol, но содержит элемент
psi и LTR (длинные концевые повторы), которые требуются для эффективной
упаковки молекулы РНК в образующиеся частицы. Указанная молекула РНК может 20 дополнительно содержать интересующий ген, который находится под контролем
подходящего промотора и, таким образом, экспрессируется при встраивании
указанного гена в геном хозяина или кетки-мишени.
Ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор представляют
собой вирусоподобную частицу или вирусный вектор, соответственно, коровые 25 белки которых, т.е. белки, кодируемые генами Gag и Pol, происходят из
ретровируса.
Под термином "ретровирус" в данном документе подразумевается вирус, геном которого состоит из молекулы РНК, и который содержит обратную транскриптазу.
30 Ретровирус является членом семейства Retroviridae. Ретровирус может
представлять собой онковирус, лентивирус или спумавирус.
Онковирус может представлять собой альфаретровирус, бетаретровирус, дельтаретровирус, эпсилонретровирус или гаммаретровирус.
Когда ретровирус представляет собой онковирус, указанный ретровирус 35 может представлять собой MLV (вирус мышиного лейкоза), ASV (вирус саркомы птиц), вирус лейкоза кошек, вирус коровьего лейкоза, RSV (вирус саркомы Рауса),
MPMV (вирус обезьян Мэйсона-Пфайзера), HTLV I (вирус-1 человеческого Т-клеточного лейкоза) или HTLV II (вирус-11 человеческого Т-клеточного лейкоза).
Когда ретровирус представляет собой лентивирус, указанный ретровирус может представлять собой ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), 5 предпочтительно ВИЧ-1 или ВИЧ-2, ВИО (вирус иммунодефицита обезьян), EIAV (вирус инфекционной анемии лошадей), FIV (вирус иммунодефицита кошек) или CAEV (вирус артрита-энцефалита коз).
Когда ретровирус представляет собой спумавирус, указанный ретровирус
может представлять собой HFV (человеческий пенящий вирус).
10 Например, ретровирусный вектор может представлять собой лентивирусный
вектор, альфаретровирусный вектор, мышиный ретровирусный вектор или вектор на основе FIV.
Геномы таких ретровирусов легко доступны в базах данных генов. В предпочтительном воплощении указанный ретровирус представляет 15 собой лентивирус, более предпочтительно ВИЧ, как, например, ВИЧ-1 или ВИЧ-2.
Настоящее изобретение, таким образом, предпочтительно относится к лентивирусоподобной частице (LVP) или к лентивирусному вектору (LV), предпочтительно к LVP или LV, полученным из ВИЧ.
Термин "псевдотипированный" в выражении "псевдотипированная 20 ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор" означает в данном документе то, что ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор несет гликопротеины оболочки, которые происходят по меньшей мере из другого вируса, чем указанный ретровирус, и/или которые представляют собой сконструированные гликопротеины оболочки, например, химерные и/или мутировавшие гликопротеины 25 оболочки.
Ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор согласно изобретению, например, псевдотипированы с использованием сконструированных гликопротеинов, происходящих из вируса семейства Paramyxoviridae, предпочтительно из вируса рода Morbillivirus или гликопротеинов рода Henipavirus, 30 как подробно описано ниже.
Гликопротеины оболочки семейства Paramyxoviridae
Модифицированные гликопротеины оболочки, используемые для псевдотипирования ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора 35 согласно изобретению, происходят из гликопротеинов оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Вирус семейства Paramyxoviridae предпочтительно представляет собой вирус рода Morbillivirus или рода Henipavirus.
Вирусы рода Morbillivirus и рода Henipavirus используют два типа гликопротеинов для поступления к клетку-мишень: белок прикрепления 5 (именуемый гликопротеин G у вируса рода Henipavirus или гликопротеин Н у вируса рода Morbillivirus) и гликопротеин F (также именуемый белок слияния или белок F). Белок F опосредует слияние вирусных мембран с клеточными мембранами клетки-хозяина. Гликопротеин G/H распознает рецептор на мембране-мишени и поддерживает белок F в его функции слияния с мембраной. И 10 гликопротеин G/H, и гликопротеин F используются для псевдотипирования ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора согласно изобретению в модифицированной форме.
Вирус рода Morbillivirus, например, выбран в группе, состоящей из вируса кори, вируса собачьей чумы, морбилливируса китовых, вируса чумы мелких 15 жвачных животных, вируса чумы тюленей и вируса чумы.
Предпочтительным вирусом рода Morbillivirus является вирус кори (MeV).
Вирус рода Henipavirus, например, выбран в группе, состоящей из вируса Нипах, вируса Цедар и вируса Хендра.
Предпочтительным вирусом рода Henipavirus является вирус Нипах (NiV).
20 В предпочтительном воплощении модифицированные гликопротеины
оболочки происходят из гликопротеина Н оболочки и гликопротеина F вируса кори или из гликопротеина G оболочки и гликопротеина F вируса Нипах.
Примером последовательности гликопротеина G оболочки вируса Нипах
является последовательность SEQ ID NO: 9.
25 Примером последовательности гликопротеина F оболочки вируса Нипах
является последовательность SEQ ID NO: 11.
Примером последовательности гликопротеина Н оболочки вируса кори (именуемого гликопротеин Н) является последовательность SEQ ID NO: 10.
Примером последовательности гликопротеина F оболочки вируса кори 30 является последовательность SEQ ID NO: 12.
Белок, происходящий из гликопротеина G/H оболочки
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор согласно изобретению содержит по меньшей мере один слитый белок, 35 нацеливающий на клетку, и по меньшей мере один модулирующий слитый белок. Слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или модулирующий слитый белок
содержат первый белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Гликопротеин G или Н оболочки является таким, как определено выше в
разделе "Гликопротеины оболочки семейства Paramyxoviridae".
5 Вирус семейства Paramyxoviridae является таким, как определено выше в
разделе "Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор".
Под выражением "белок, происходящий из гликопротеина G или Н
оболочки" в данном документе подразумевается то, что белок содержит по 10 меньшей мере одну модификацию по сравнению с последовательностью
гликопротеина G или Н оболочки.
Предпочтительный гликопротеин G оболочки представляет собой
гликопротеин G оболочки вируса Нипах, также именуемый гликопротеин G
оболочки NiV, гликопротеин G NiV или NiV-G.
15 Предпочтительный гликопротеин Н оболочки представляет собой
гликопротеин Н оболочки вируса кори, также именуемый гликопротеин Н MeV,
гемагглютинин MeV или MV-H.
Гликопротеин G или Н оболочки представляет собой гликопротеин оболочки
вируса дикого типа или вакцинного штамма вируса, или его вариант, при условии, 20 что указанный вариант сохраняет способность указанного гликопротеина дикого
типа или вакцинного штамма распознавать рецептор на мембране-мишени и
поддерживать белок F в его функции слияния с мембраной.
Эталонной последовательностью для гликопротеина G оболочки NiV
является последовательность SEQ ID NO: 9.
25 Гликопротеин G оболочки NiV может иметь последовательность, по
меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ
ID NO: 9. Например, гликопротеин оболочки NiV может иметь последовательность
SEQ ID NO: 9.
Эталонной последовательностью гемагглютинина MeV является 30 последовательность SEQ ID NO: 10.
Гемагглютинин MeV может иметь последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 10. Например, гемагглютинин MeV может иметь последовательность SEQ ID NO: 10.
В предпочтительном воплощении у белка, полученного из гликопротеина G 35 оболочки, отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G оболочки.
Белок, у которого отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G оболочки, также называется белок, усеченный в его цитоплазматической области.
Выражения "белок, у которого отсутствует х аминокислот 5 цитоплазматической области", "белок, усеченный на х аминокислот в его цитоплазматической области" и "белок Асх" являются в данном документе синонимичными и могут использоваться взаимозаменяемо.
Применение гликопротеина G оболочки, усеченного в его цитоплазматической области, значительно улучшает его включение в 10 ретровирусоподобные частицы и ретровирусные векторы, обеспечивая, посредством этого, получение псевдотипированных ретровирусоподобных частиц или ретровирусных векторов с более высокими титрами и выходом продукции.
Цитоплазматическая область гликопротеина G оболочки расположена на N-
конце.
15 Таким образом, при установлении расположения усеченной части
гликопротеина Асх относительно неусеченного гликопротеина G, отсчет начинается на втором аминокислотном остатке N-конца гликопротеина G оболочки, т.е. опуская первый остаток метионина.
В качестве примера, белок, у которого отсутствует X аминокислот в 20 цитоплазматической области гликопротеина G последовательности SEQ ID NO: Z, отличается от указанного гликопротеина G тем, что у него отсутствуют аминокислоты от 2 до 1 плюсХ последовательности SEQ ID NO: Z.
Расположение цитоплазматической области в последовательности
гликопротеина G оболочки может быть легко определено специалистом.
25 Цитоплазматическая область гликопротеина Н MeV, например, состоит из
аминокислот 1-34 последовательности SEQ ID NO: 10.
Цитоплазматическая область гликопротеина G NiV, например, состоит из аминокислот 1-45 последовательности SEQ ID NO: 9.
Например, у белка, происходящего из гликопротеина G или Н оболочки 30 могут отсутствовать по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 15 аминокислот, по меньшей мере 18 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот в цитоплазматической области.
Например, у белка, происходящего из гликопротеина Н оболочки вируса кори может отсутствовать по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 15 35 аминокислот, по меньшей мере 18 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 24 аминокислоты в цитоплазматической области. В
предпочтительном воплощении у белка, происходящего из гликопротеина Н оболочки вируса кори отсутствуют 15, 18, 20 или 24 аминокислоты.
Например, у белка, происходящего из гликопротеина G оболочки вируса Нипах может отсутствовать по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 15 5 аминокислот, по меньшей мере 18 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот или по меньшей мере 30 аминокислот в цитоплазматической области. В предпочтительном воплощении у белка, происходящего из гликопротеина G оболочки вируса Нипах отсутствуют 34 аминокислоты.
10 В предпочтительном воплощении белок, происходящий из гликопротеина G
или Н оболочки, по меньшей мере частично не способен связываться с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки.
Данная по меньшей мере частичная неспособность связываться с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н 15 оболочки может быть получена по меньшей мере одной мутацией, введенной в последовательность указанного гликопротеина G или Н оболочки.
Например, белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки, может содержать по меньшей мере одну точечную мутацию, предпочтительно по меньшей мере две точечные мутации, по сравнению с последовательностью 20 указанного гликопротеина оболочки.
Данная точечная мутация может представлять собой делецию, присоединение или замену аминокислоты.
В предпочтительном воплощении точечная мутация является заменой. В предпочтительном воплощении белок, происходящий из гликопротеина G 25 или Н оболочки, не способен к связыванию, т.е. полностью не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки.
Неспособность белка, происходящего из гликопротеина G или Н оболочки, связываться с его природным рецептором значительно увеличивает 30 эффективность нацеливания на клетку.
Оценка способности к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором гликопротеина G оболочки может осуществляться любым способом, хорошо известным специалисту.
Природными рецепторами NiV являются рецепторы NiV Ephrin-B2 и -ВЗ.
35 Белок, происходящий из гликопротеина G оболочки NiV, таким образом,
предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с
рецептором Ephrin-B2 и/или рецептором NiV Ephrin-ВЗ, предпочтительно с обоими: рецептором Ephrin-B2 и рецептором NiV Ephrin-ВЗ.
Например, гликопротеин оболочки NiV-G может содержать по меньшей мере две или по меньшей мере три точечные мутации по сравнению с 5 последовательностью SEQ ID NO: 9, где указанные точечные мутации выбраны в группе, состоящей из Е501А, W504A, Q530A и Е533А.
В предпочтительном воплощении гликопротеин NiV-G содержит или состоит
из точечных мутаций Е501А, W504A, Q530A и Е533А, таким образом, приводящих к
неспособности к связыванию с рецептором Ephrin-B2 и рецептором NiV Ephrin-ВЗ.
10 Природными рецепторами MeV являются SLAM, нектин-4 и CD46.
Белок, происходящий из гликопротеина Н оболочки MeV, таким образом, предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию со SLAM, нектином-4 и/или CD46, предпочтительно по меньшей мере с обоими - SLAM и CD46.
15 Например, гликопротеин оболочки MV-H может содержать по меньшей мере
две или по меньшей мере три точечные мутации по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 10, где указанные точечные мутации выбраны в группе, состоящей из Y481A, R533A, S548L и F549S.
В одном предпочтительном воплощении гликопротеин оболочки MV-H
20 содержит или состоит из двух точечных мутаций Y481A, R533A, S548L и F549S, таким образом, приводя к неспособности к связыванию со SLAM и CD46.
Таким образом, у белка, происходящего из гликопротеина G или Н оболочки, предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки, и/или он по меньшей мере
25 частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки.
В более предпочтительном воплощении у белка, происходящего из гликопротеина G или Н оболочки, и отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки, и он по
30 меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки.
Под "последовательностью, по меньшей мере на х% идентичной контрольной последовательности" в данном документе подразумевается то, что данная последовательность является идентичной контрольной
35 последовательности или отличается от данной контрольной последовательности
на вплоть до 100-х аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот контрольной последовательности.
Выравнивание и определение процентной доли идентичности может проводиться вручную или автоматически с использованием, например, программы 5 Needle, которая основана на алгоритме Needleman и Wunsch, описанном у Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443-453, например, со следующими параметрами для сравнения полипептидных последовательностей: матрица сравнений: BLOSUM62, штраф за открытие пробела: 10 и штраф за удлинение пробела: 0,5, штраф за концевой пробел: не правильно, штраф за открытие
10 концевого пробела - 10, штраф за удлинение концевого пробела - 0,5; и следующими параметрами для сравнения полинуклеотидных последовательностей: матрица сравнений: DNAFULL; штраф за открытие пробела - 10, штраф за удлинение пробела - 0,5, штраф за концевой пробел: не правильно, штраф за открытие концевого пробела - 10, штраф за удлинение концевого
15 пробела-0,5.
Как определено в данном документе, аминокислотная последовательность, "по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная" контрольной последовательности, может содержать мутации, такие как делеции, вставки и/или замены по сравнению с контрольной последовательностью.
20 В случае замен, замена предпочтительно соответствует консервативной
замене, как указано в Таблице 1 ниже. В предпочтительном воплощении последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная контрольной последовательности, отличается от контрольной последовательности только консервативными заменами.
25 Таблица 1
Консервативные замены
Тип аминокислоты
Ala, Val, Leu, Не, Met, Pro, Phe, Trp
Аминокислоты с алифатическими гидрофобными боковыми цепями
Ser, Tyr, Asn, Gin, Cys
Аминокислоты с незаряженными, но полярными боковыми цепями
Asp, Glu
Аминокислоты с кислотными боковыми цепями
Lys, Arg, His
Аминокислоты с основными боковыми цепями
Gly
Нейтральная боковая цепь
В другом предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%
или 99% идентичная контрольной последовательности, соответствует встречающемуся в природе аллельному варианту контрольной последовательности.
5 Гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор согласно изобретению также содержит по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, где у указанного гликопротеина предпочтительно отсутствует по 10 меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина F оболочки.
Гликопротеин F оболочки является таким, как определено выше в разделе "Гликопротеины оболочки семейства Paramyxoviridae".
Вирус семейства Paramyxoviridae является таким, как определено выше в 15 разделе "Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор".
Под выражением "белок, происходящий из гликопротеина F оболочки" в данном документе подразумевается то, что данный белок содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению с последовательностью гликопротеина F 20 оболочки.
Предпочтительный гликопротеин F оболочки представляет собой гликопротеин F оболочки вируса Нипах, также именуемый гликопротеин F оболочки NiV, гликопротеин F NiV или NiV-F.
Другим предпочтительный гликопротеином F оболочки является 25 гликопротеин F оболочки вируса кори, также именуемый гликопротеином F MeV или MeV-F.
Гликопротеин F оболочки представляет собой гликопротеин оболочки вируса дикого типа или вакцинного штамма или их вариант, при условии, что у указанного варианта сохраняется способность гликопротеина F дикого типа или
30 вакцинного штамма опосредовать слияние вирусных мембран с клеточной мембраной клетки-мишени или клетки-хозяина.
Эталонной последовательностью для гликопротеина F оболочки NiV является последовательность SEQ ID NO: 11. Гликопротеин F оболочки NiV может иметь последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,
35 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 11. Например, гликопротеин F оболочки NiV может иметь последовательность SEQ ID NO: 11.
Эталонной последовательностью для гликопротеина F оболочки MeV является последовательность SEQ ID NO: 12.
Гликопротеин F оболочки MeV может иметь последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ 5 ID NO: 12. Например, гликопротеин F оболочки MeV может иметь последовательность SEQ ID NO: 12.
В предпочтительном воплощении у белка, происходящего из гликопротеина
F оболочки, отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области
указанного гликопротеина F оболочки.
10 Белок, у которого отсутствует по меньшей мере одна часть
цитоплазматической области указанного гликопротеина F оболочки, также называется белок, усеченный в его цитоплазматической области.
Выражения "белок, у которого отсутствуют х аминокислот цитоплазматической области", "белок, усеченный на х аминокислот в его 15 цитоплазматической области" и "белок Асх" являются в данном документе синонимичными и могут быть использованы взаимозаменяемо.
Применение гликопротеина F оболочки, усеченного в его цитоплазматической области, значительно улучшает его включение в ретровирусоподобные частицы и ретровирусные векторы, обеспечивая, 20 посредством этого, получение псевдотипированных ретровирусоподобных частиц или ретровирусных векторов с более высокими титрами и выходом продукции.
Цитоплазматическая область гликопротеина F оболочки расположена на С-
конце.
Таким образом, при установлении расположения усеченной части 25 гликопротеина Асх относительно неусеченного гликопротеина F, отсчет начинается с С-конца гликопротеина F.
В качестве примера, гликопротеин, у которого отсутствует X аминокислот в его цитоплазматической области по сравнению с гликопротеином F последовательности SEQ ID NO: Z, состоящим из п аминокислот, отличается от 30 указанного гликопротеина F тем, что у него отсутствуют аминокислоты от п-х+1 до п последовательности SEQ ID NO: Z.
Расположение цитоплазматической области в последовательности гликопротеина F оболочки может быть легко определено специалистом.
Цитоплазматическая область гликопротеина F MeV, например, состоит из 35 аминокислот 518-550 последовательности SEQ ID NO: 12 (33 аминокислоты).
Цитоплазматическая область гликопротеина F NiV, например, состоит из аминокислот 519-546 последовательности SEQ ID NO: 11 (28 аминокислот).
Например, у белка, происходящего из гликопротеина F оболочки, могут отсутствовать по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 15 5 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот или по меньшей мере 30 аминокислот в цитоплазматической области.
Например, у белка, происходящего из гликопротеина F оболочки вируса кори, могут отсутствовать 30 аминокислот в цитоплазматической области по сравнению с указанным гликопротеином F оболочки вируса кори. Например, 10 указанный белок, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса кори, и у которого отсутствуют 30 аминокислот в цитоплазматической области, содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 15.
Например, у белка, происходящего из гликопротеина F оболочки вируса Нипах, могут отсутствовать 22 аминокислоты в цитоплазматической области по 15 сравнению с указанным гликопротеином F оболочки вируса Нипах. Например, указанный белок, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса Нипах, и у которого отсутствуют 22 аминокислоты в цитоплазматической области, содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 16.
20 Клетки-мишени
Клетки-мишени представляют собой интересующие клетки, активность которых подлежит модуляции и/или которые подлежат трансдукции по меньшей мере одним интересующим геном.
Клетки-мишени экспрессируют на их поверхности специфический рецептор 25 клеточной поверхности, обеспечивая, посредством этого, специфичное нацеливание на данные клетки, а не на клетки, которые не экспрессируют указанный рецептор клеточной поверхности.
Выражения "клетки-мишени" и "целевой поднабор клеток" являются в
данном документе синонимичными и могут использоваться взаимозаменяемо.
30 Клетки-мишени могут быть выбраны в группе, состоящей из
гематопоэтических клеток, клеток стромы, эндотелиальных клеток, клеток печени, мышечных клеток (например, сердечных клеток), клеток нервной системы и/или больных клеток.
Клетками нервной системы являются, например, нейроны и/или глиальные
35 клетки.
Под "гематопоэтическими клетками" в данном документе подразумеваются клетки гематопоэтической системы.
Предпочтительные клетки-мишени представляют собой гематопоэтические
клетки.
5 Гематопоэтические клетки могут быть выбраны в группе, состоящей из
следующих: Т-клетки, В-клетки, моноциты, клетки Th1, клетки Th2, клетки Treg, тучные клетки, дендритные клетки (DC), природные клетки-киллеры (NK), природные Т-клетки киллеры (NKT), макрофаги, гематопоэтические стволовые клетки, предшественники Т- и/или В-клеток, эритробласты, тромбоциты, 10 нейтрофилы и их комбинации.
Более предпочтительными гематопоэтическими клетками-мишенями являются Т-клетки, более предпочтительно Т-клетки CD8+ или Т-клетки CD4+.
Больными клетками могут быть опухолевые клетки, опухолевые стволовые клетки, клетки, не имеющие специфического функционального гена, 15 сверхэкспрессирующие специфический ген и/или экспрессирующие усеченную или мутировавшую форму специфического гена, инфицированные клетки и/или функционально ослабленные клетки.
Специфичный в отношении клетки нацеливающий домен
20 Специфичный в отношении клетки нацеливающий домен (также именуемый
"домен, нацеливающий на клетку") обеспечивает специфичное связывание псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора согласно изобретению с рецептором поверхности, селективно экспрессируемым клетками-мишенями.
25 Клетки-мишени могут быть такими, как определено выше в разделе с таким
же названием.
Домен, нацеливающий на клетку, нацеливающего слитого белка
предпочтительно выбран в группе, состоящей из DARPin, scFv, нацеливающего
пептида и их комбинаций.
30 Термин "DARPin" относится к разработанным белкам с анкириновыми
повторами.
Термин "scFv" относится к одноцепочечному вариабельному фрагменту антитела.
Например, домен, нацеливающий на клетку, является специфичным в 35 отношении CD3, CD8, CD4, маркера раковой клетки, CD11b, CD19, CD62L, CD56, С1иМ(глюкозный транспортер), CD19, CD22, CD20, CCR5 или CXCR4.
Предпочтительным доменом, нацеливающим на клетку, является DARPin, специфичный в отношении CD4, или scFv, специфичный в отношении CD8.
Функциональный домен
5 Функциональный домен обеспечивает модуляцию активности клеток-
мишеней.
Под "модуляцией активности клетки-мишени" в данном документе подразумевается активация или ингибирование, индукция фенотипического изменения (например, созревание и/или дифференциация), индукция 10 пролиферации и/или индукция апоптоза указанной клетки-мишени. Модуляция активности клетки-мишени, например, включает усиление или подавление иммунитета, стимуляцию иммунного(ных) ответа(тов), специфичного(ных) для типа клетки.
Функциональный домен модулирующего слитого белка предпочтительно 15 представляет собой лиганд рецептора.
Под "лигандом рецептора" в данном документе подразумевается молекула, предпочтительно белок, предпочтительно нормально высвобождаемая клетками, которая изменяет физиологическое состояние клеток, экспрессирующих когнатный рецептор на их клеточной поверхности. Лиганд рецептора, например, выбран в 20 группе, состоящей из цитокина, фактора роста, гормона, нейромедиатора, лиганда апоптоза, хемокина, транспортера глюкозы и их комбинаций.
Например, цитокин может быть выбран в группе, состоящей из интерлейкина (IL), TNF (фактор некроза опухоли) или интерферона.
Интерлейкин может представлять собой, например, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL15, 25 IL21, IL-17 или IL-12.
Например, лиганд апоптоза может представлять собой лиганд FAS, лиганд CD40 или TNF-альфа.
Например, хемокин может представлять собой CXCL4, CCL5 или CXCL10. Например, фактор роста может представлять собой GM-CSF 30 (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), фактор стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (ТРО) или лиганд Flt-3.
Например, гормон может представлять собой инсулин, гормон роста или гормональный пептид, например, вазопрессин. Например, нейромедиатор может представлять собой нейропептид, например, выбранный среди инсулина, 35 глюкагона, кальцитонина, нейротензина или брадикинина.
Предпочтительный функциональный домен представляет собой цитокин, предпочтительно интерлейкин, более предпочтительно IL-7.
Нацеливающие на клетку и модулирующие слитые белки
5 Ретровирусоподобная частица и ретровирусный вектор согласно данному
изобретению содержит два типа слитых белков: один слитый белок, нацеливающий на клетку, и один модулирующий слитый белок.
Слитый белок, нацеливающий на клетку, содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или 10 трансмембранный домен, и (и) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку.
Модулирующий слитый белок содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен, и (и) по меньшей мере один функциональный домен.
15 Специалисту будет совершенно понятно то, что поскольку слитый белок,
нацеливающий на клетку, и модулирующий слитый белок представляют собой два разных типа слитых белков, домен, нацеливающий на клетку, и функциональный домен являются разными.
Трансмембранный домен может представлять собой любой встречающийся
20 в природе или не встречающийся в природе трансмембранный домен.
Трансмембранный домен может представлять собой трансмембранный домен рецептора, трансмембранный белок, предпочтительно вирусный трансмембранный белок, фрагмент трансмембранного белка, трансмембранный пептид или его вариант, такой как генетически модифицированный
25 трансмембранный домен рецептора, генетически модифицированный трансмембранный белок, генетически модифицированный фрагмент трансмембранного белка или генетически модифицированный трансмембранный пептид.
Примерами трансмембранного домена являются трансмембранный домен 30 (TMD) рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFR), трансмембранный домен CD34 или трансмембранный домен гликопротеина VSVG.
С-конец белка, происходящего из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, предпочтительно слит, прямо или опосредованно (например, через линкер), с N-концом нацеливающего на клетку или 35 функционального домена.
С-конец трансмембранного белка предпочтительно слит, прямо или опосредованно (например, через линкер), с N-концом нацеливающего на клетку или функционального домена.
Белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства 5 Paramyxoviridae, гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки, домен, нацеливающий на клетку, и функциональный домен являются такими, как определено выше.
При наличии обоих в псевдотипированной ретровирусоподобной частице или ретровирусном векторе, белок, происходящий из гликопротеина G или Н 10 оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, и белки в модулирующем слитом белке могут происходить из того же самого вируса семейства Paramyxoviridae или из разных вирусов семейства Paramyxoviridae.
Когда белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса 15 семейства Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, и белки в модулирующем слитом белке происходят из разных вирусов семейства Paramyxoviridae, они предпочтительно происходят из вируса того же самого рода, более предпочтительно из вируса того же самого вида.
Белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства 20 Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, и белки в модулирующем слитом белке предпочтительно являются идентичными. В предпочтительном воплощении слитый белок, нацеливающий на клетку, таким образом, отличается от модулирующего слитого белка его нацеливающим доменом вместо функционального домена и, возможно, при его наличии, по 25 меньшей мере одним линкером и/или по меньшей мере одной меткой.
Два белка слитого белка могут быть связаны друг с другом линкером. Можно использовать любой подходящий линкер, хорошо известный специалисту.
Например, линкер может представлять собой (G4S)3, G4S, сайт разрезания
фактора Ха или спиральный линкер (например, HL3, HL7, ...).
30 Слитые белки могут быть мечеными, например, для облегчения их очистки
и/или выявления.
Метка, при ее наличии, предпочтительно расположена на С-конце слитого белка, т.е. слита с N-концом домена, нацеливающего на клетку, и/или функционального домена. Можно использовать любую подходящую метку, хорошо 35 известную специалисту.
Например, метка может представлять собой His метку, метку RGS-His, такую как RGSH6, метку НА (гемагглютинин) или метку с-тус.
Специфическая псевдотипированная ретровирусоподобная частица или 5 ретровирусный вектор
Настоящее изобретение, в частности, относится к псевдотипированной ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору, содержащим:
а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку,
содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса
10 семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (и) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (и) по меньшей мере один
15 функциональный домен, и
в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae,
где указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный модулирущий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G 20 или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор, таким образом, содержит по меньшей мере один слитый белок, содержащий белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем указанный слитый белок представляет собой 25 слитый белок, нацеливающий на клетку, или модулирующий слитый белок. В одном воплощении псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор, содержит два слитых белка, каждый из которых содержит белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, где один слитый белок представляет собой слитый белок, 30 нацеливающий на клетку, и второй слитый белок представляет собой модулирующий слитый белок.
В одном воплощении псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор содержит:
а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку, 35 содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса
семейства Paramyxoviridae, и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один функциональный домен, и
5 в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
В одном воплощении псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор содержит:
а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку,
10 содержащий: (i) трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один домен,
нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
Paramyxoviridae, и (ii) по меньшей мере один функциональный домен, и
15 в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
В одном воплощении псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор содержит:
а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку,
20 содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса
семейства Paramyxoviridae, и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
25 Paramyxoviridae, и (ii) по меньшей мере один функциональный домен, и
в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, белки в модулирующем 30 слитом белке и гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки, могут происходить из того же самого вируса семейства Paramyxoviridae или из разных вирусов семейства Paramyxoviridae.
Когда белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, белки в модулирующем 35 слитом белке и/или гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки, происходят из разных вирусов семейства Paramyxoviridae, они предпочтительно
происходят из вируса того же самого рода, более предпочтительно из вируса того же самого вида.
В одном воплощении белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, 5 белки в модулирующем слитом белке и гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки, происходят из того же самого вируса семейства Paramyxoviridae.
В другом воплощении белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, в слитом белке, нацеливающем на клетку, и
10 гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, происходят из того же самого вируса семейства Paramyxoviridae, тогда как модулирующий слитый белок содержит (i) трансмембранный домен, например, трансмембранный домен (TMD) рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFR), и (ii) по меньшей мере один функциональный домен.
15 В другом воплощении белок, происходящий из гликопротеина G оболочки
вируса семейства Paramyxoviridae, в модулирующем слитом белке и гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, происходят из того же самого вируса семейства Paramyxoviridae, тогда как слитый белок, нацеливающий на клетку, содержит (i) трансмембранный домен, например,
20 трансмембранный домен (TMD) рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFR), и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку.
Разные компоненты псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, в частности, слитый белок, нацеливающий на клетку, модулирующий слитый белок, гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
25 оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, и трансмембранный домен являются такими, как определено выше.
Предпочтительная псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор содержит:
а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку,
30 содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у указанного белка отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G оболочки, и он по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G оболочки, или
35 трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства
Paramyxoviridae, причем у указанного белка отсутствует по меньшей мере одна
часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G оболочки, и он по
5 меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G оболочки, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один функциональный домен, и
в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, и с отсутствием по меньшей мере
10 одной части цитоплазматической области указанного гликопротеина F оболочки,
где указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный модулирущий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Примеры псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или 15 ретровирусного вектора приводятся ниже в Таблице 2.
содержащая HcA15 и His метку
14, содержащая НсА15 и His метку
NO: 15
NiV
- GcA34
scFv, специ-
- GcA34
IL-7
FA22
8G/IL7G
- 4 мутации:
фичный в
- 4 мутации:
E501A,
отношении
Е501А,
W504A,
человечес-
W504A,
Q530A,
кого CD8
Q530A,
E533A
Е533А
Например, SEQ ID NO: 4, содержащая His метку и линкер (G4S)3
Например, SEQ ID NO: 6, содержащая His метку
Например, SEQ ID NO: 16
В предпочтительном воплощении псевдотипированную
ретровирусоподобную частицу или ретровирусный вектор можно получать или получают способом получения, описанным ниже в данном документе в разделе 5 "Способ получения псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора".
Нуклеиновая кислота и вектор
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, 10 кодирующей слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или модулирующий слитый белок, используемые для псевдотипирования ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора согласно данному изобретению.
Настоящее изобретение, таким образом, в частности, относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, кодирующую слитый 15 белок, нацеливающий на клетку, и/или последовательность, кодирующую модулирующий слитый белок, где:
- указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна 20 часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G
оболочки, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
- указанный модулирующий слитый белок содержит: (i) белок, происходящий из гликопротеина G оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у 5 указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G оболочки, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один 10 функциональный домен.
Когда нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую слитый белок, нацеливающий на клетку, и последовательность, кодирующую модулирующий слитый белок, указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный модулирующий слитый белок содержат(жит) белок, происходящий 15 из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Данная нуклеиновая кислота предпочтительно содержит или состоит из:
(i) последовательности, кодирующей белок, происходящий из гликопротеина оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической
20 области указанного гликопротеина G оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G оболочки,
(ii) последовательности, кодирующей один домен, нацеливающий на клетку, или один функциональный домен, и
25 (iii) возможно линкерной последовательности между последовательностями
(О и (ii),
(iv) возможно последовательности, кодирующей метку, предпочтительно на З'-конце последовательности (ii),
где последовательности (i) и (ii) слиты в рамке считывания.
30 Последовательность линкера кодирует линкер, как определено выше,
например, кодирует (G4S)3.
Последовательность (i) располагается в 5' нуклеиновой кислоты по сравнению с последовательностью (ii), расположенной в 3' нуклеиновой кислоты.
В одном воплощении нуклеиновая кислота содержит или состоит из 35 последовательности, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности, выбранной в группе, состоящей из SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13, и/или содержит или состоит из последовательности, кодирующей последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности, выбранной в группе, состоящей из последовательностей SEQ 5 ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 14.
В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота содержит или состоит из последовательности, выбранной в группе, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13, и/или содержит или состоит из последовательности, кодирующей последовательность, выбранную в 10 группе, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 14.
Определение процентной доли идентичности последовательности приводится выше.
Последовательность нуклеиновой кислоты, "по меньшей мере на 80%, 85%, 15 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная" эталонной последовательности, может содержать мутации, такие как делеции, вставки и/или замены, по сравнению с эталонной последовательностью.
В случае замен, замена предпочтительно соответствует молчащей замене или замене, приводящей к консервативной замене в транслированной 20 аминокислотной последовательности по сравнению с эталонной последовательностью, например, как показано в Таблице 1 выше.
В предпочтительном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная эталонной последовательности, отличается от эталонной 25 последовательности только молчащей(щими) заменой(нами) и/или заменой(нами), приводящей(щими) к консервативной аминокислотной замене.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей гликопротеин, просходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, и у которого предпочтительно отсутствует по меньшей 30 мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина F оболочки.
Гликопротеин, просходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, является таким, как определено выше.
Нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой выделенную 35 нуклеиновую кислоту.
Под выражением "нуклеиновая кислота" в данном документе подразумевается фосфатно-сложноэфирная полимерная форма рибонуклеозидов (также именуемая "молекула РНК"), дезоксирибонуклеозидов (также именуемая "молекула ДНК") или их любой фосфоэфирный аналог, такой как фосфоротиоаты 5 и тиоэфиры, либо в одноцепочечной форме, либо в двухцепочечной форме.
Термин "выделенная" по отношению к биологическому компоненту (такому как нуклеиновая кислота, вектор или белок) относится к биологическому компоненту, который был по существу отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, или от самого организма, в 10 котором данный компонент встречается в природе, таких как другие хромосомные и внехромосомные ДНК и РНК, белки, клетки и органеллы. Термин "выделенные нуклеиновые кислоты" или "выделенные векторы" включает молекулы нуклеиновых кислот, очищенные стандартными способами очистки. Данные термины также охватывают нуклеиновые кислоты и векторы, полученные 15 посредством амплификации и/или клонирования, а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты и векторы.
Нуклеиновую кислоту согласно изобретению предпочтительно клонируют в
вектор.
Термин "вектор", следовательно, имеет значение, отличное от 20 "ретровирусного вектора".
Под термином "вектор" в данном документе подразумевается вектор на основе нуклеиновой кислоты.
Вектор обычно содержит репликатор, сайт множественного клонирования и
селектируемый маркер.
25 Вектор предпочтительно содержит кассету экспрессии, т.е. нуклеиновую
кислоту согласно изобретению, помещенную под контроль по меньшей мере одного сигнала экспрессии, обеспечиващего ее экспрессию.
Сигнал экспрессии, в частности, выбран среди промотора, терминатора,
энхансера и их комбинаций.
30 Подходящие промоторы, терминаторы и энхансеры хорошо известны
специалисту.
Примером вектора является, например, плазмида.
Под "плазмидой" в данном документе подразумевается двухцепочечная кольцевая ДНК. Данная плазмида может включать маркерный ген, 35 обеспечивающий селекцию клеток, содержащих указанную плазмиду, репликатор для репликации для обеспечения репликации клеткой плазмиды и/или сайт
множественного клонирования, обеспечивающий вставку нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Настоящее изобретение, таким образом, также относится к вектору,
содержащему нукленовую кислоту, как определено выше.
5 Данный вектор предпочтительно представляет собой выделенный вектор.
Вектор может содержать или состоять из следующих:
- первая нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из следующих:
(i) последовательность, кодирующая а) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у
10 указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки, или б) трансмембранный домен,
15 (ii) последовательность, кодирующая один домен, нацеливающий на клетку,
(iii) возможно последовательность линкера между последовательностями (i)
и (ii),
(iv) возможно последовательность, кодирующая метку, предпочтительно на З'-конце последовательности (ii),
20 где последовательности (i) и (ii) слиты в рамке считывания,
- вторая нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из следующих:
(i) последовательность, кодирующая а) белок, происходящий из
гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, причем у
указанного белка предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть
25 цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки, и он предпочтительно по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки, или б) трансмембранный домен,
(ii) последовательность, кодирующая один функциональный домен,
30 (iii) возможно последовательность линкера между последовательностями (i)
и (ii),
(iv) возможно последовательность, кодирующая метку, предпочтительно на З'-конце последовательности (ii),
где последовательности (i) и (ii) слиты в рамке считывания,
где первая нуклеиновая кислота и/или вторая нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Указанная первая нуклеиновая кислота, таким образом, кодирует слитый 5 белок, нацеливающий на клетку, и указанная вторая нуклеиновая кислота кодирует модулирующий слитый белок.
Интересующий ген
При использовании псевдотипированного ретровирусного вектора в геноме,
10 происходящем от ретровируса, указанного ретровирусного вектора может присутствовать по меньшей мере один интересующий ген.
Интересующий ген может кодировать терапевтический белок, апоптозный белок, химерный рецептор антигена, рецептор клеточной поверхности, антитело, фрагмент антитела, мшРНК, антиген, цитокин, микроРНК, элемент(ты) CRISPR
15 (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)/САБ (например, CAS9 и/или РНК-проводники, в частности, для специфичного разрушения или редактирования гена), другую нуклеазную систему, такую как нуклеазы с цинковыми пальцами, S/MAR(KapKac/o6nacTb присоединения к матриксу)-эписому, лиганд и/или рецептор.
20 S/MAR-эписома вставляется в ядро клетки ретровирусными векторами,
которые затем реплицируются с ДНК клетки-хозяина.
Примеры интересующего гена включают ген глобина, ген гематопоэтического фактора роста (например, ген эритропоэтина (ЕРО)), ген интерлейкина (особенно интерлейкина-1, интерлейкина-2, интерлейкина-3,
25 интерлейкина-6 или интерлейкина-12), ген колониестимулирующего фактора (как, например, ген гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора или ген колониестимулирующего фактора стволовых клеток), ген специфичного для тромбоцитов интегрина allbp, ген множественной лекарственной устойчивости,
30 гены др91 или др47, которые являются дефектными у пациентов с хроническим гранулематозом (CGD), противовирусный ген, делающий клетки устойчивыми к инфекциям патогенами (таким как вирус иммунодефицита человека), ген, кодирующий факторы свертывания крови VIII или IX, которые мутируют при гемофилии, ген, кодирующий лиганд, участвующий в иммунных ответах,
35 опосредованных Т-клетками (как, например, рецепторы антигенов Т-клеток, химерный рецептор антигена (CAR), рецепторы антигенов В-клеток
(иммуноглобулины, нейтрализующие антитела против ВИЧ, гепатита С, гепатита В и/или других инфекционных заболеваний), ген обычной цепи у рецептора интерлейкина, ген TNF, ген интерферона гамма, ген CTLA4, гены, экспрессируемые в опухолевых клетках, такие как Melana, гены MAGE (как, например, MAGE-1, 5 MAGE-3), ген Р198, ген Р1А, ген дрЮО.
Способ получения псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора
Настоящее изобретение также относится к способу получения 10 псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, где указанный способ включает сотрансфицирование линии упаковывающих клеток следующими:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок,
нацеливающий на клетку,
15 (ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая модулирующий
слитый белок,
(iii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гликопротеин, просходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, и у которого предпочтительно отсутствует по меньшей мере одна часть
20 цитоплазматической области указанного гликопротеина F оболочки,
(iv) по меньшей мере один вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую коровые белки из указанного ретровируса, и
(v) возможно, по меньшей мере один вектор, содержащий компетентный к упаковке геном, происходящий от ретровируса,
25 получая, посредством этого, сотрансфицированные клетки.
Указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный модулирующий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
По меньшей мере один вектор, содержащий компетентный к упаковке геном, 30 происходящий от ретровируса, требуется только для получения ретровирусного вектора.
Можно использовать любую подходящую линию упаковывающих клеток, хорошо известную специалисту.
Под "линией упаковывающих клеток" в данном документе подразумевается 35 линия клеток, которая способна экспрессировать разные компоненты
псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора по изобретению.
Нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие разные компоненты псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора 5 по изобретению, могут быть интегрированы в геном линии упаковывающих клеток, например, в случае векторов на основе вируса мышиного лейкоза.
Линия упаковывающих клеток предпочтительно является совместимой с экспрессией лентивирусных генов Gag и Pol.
Например, линия упаковывающих клеток может быть выбрана в группе, 10 состоящей из клеток 293Т, клеток насекомых, клеток ТЕ 671 и клеток НТ1080.
Термин "трансфекция" означает введение по меньшей мере одной чужеродной нуклеиновой кислоты или вектора (например, ДНК, кДНК или РНК) в клетку, таким образом, что клетка-хозяин будет экспрессировать белок(ки), кодируемый(мые) указанной(ными) нуклеиновой(выми) кислотой(тами) или 15 вектором(рами). Чужеродная(ные) нуклеиновая(вые) кислота(ты) или вектор(ры) может(гут) включать регуляторные или контрольные последовательности, такие как последовательности начала, конца, промотора, сигнальные, секреции или другие последовательности, используемые генетическим аппаратом клетки.
Вектор, содержащий последовательность psi, необходимую для 20 инкапсулирования, называется psi-позитивным вектором, тогда как вектор, не содержащий последовательность psi, называется psi-негативным вектором.
Только вектор, содержащий происходящий от ретровируса геном,
компетентный к упаковке, является psi-позитивным вектором. Другие нуклеиновые
кислоты и векторы, используемые для сотрансфекции, является psi-негативными.
25 Нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, нацеливающий на клетку,
кодирующая слитый белок, нацеливающий на клетку, нуклеиновая кислота, кодирующая модулирующий слитый белок, и нуклеиновая кислота, кодирующая гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, являются такими, как определено выше. Они могут быть 30 предоставлены в виде двух или трех отдельных векторов: например, двух отдельных векторов, таким образом, что первый вектор содержит или состоит из нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, нацеливающий на клетку, и нуклеиновой кислоты, кодирующей модулирующий слитый белок, и второй вектор содержит или состоит из нуклеиновой кислоты, кодирующей гликопротеин, 35 происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae; или трех отдельных векторов, причем первый вектор содержит или состоит из
нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, нацеливающий на клетку, второй вектор содержит или состоит из нуклеиновой кислоты, кодирующей модулирующий слитый белок, и третий вектор содержит или состоит из нуклеиновой кислоты, кодирующей гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса 5 семейства Paramyxoviridae. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, нацеливающий на клетку, нуклеиновая кислота, кодирующая модулирующий слитый белок, и нуклеиновая кислота, кодирующая гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, могут быть предоставлены в одном векторе, содержащем или 10 состоящем из трех нуклеиновых кислот.
Также используется вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую коровые белки из указанного ретровируса.
Под "коровыми белками из ретровируса" в данном документе подразумеваются белки, кодируемые генами gag и pol. Ген gag кодирует 15 полипротеин, который подвергается дальнейшему процессингу ретровирусной протеазой до структурных белков, которые составляют ядро. Ген pol, в частности, кодирует ретровирусную протеазу, обратную транскриптазу и интегразу.
Нуклеиновая кислота, кодирующая коровые белки из ретровируса, таким
образом, содержит ген gag и ген pol указанного ретровируса.
20 По меньшей мере один коровый белок из ретровируса может быть
модифицирован, например, по сравнению с соответствующим коровым белком из ретровируса дикого типа.
В одном воплощении по меньшей мере один коровый белок из ретровируса модифицируется по меньшей мере одной аминокислотной мутацией, такой как 25 аминокислотная делеция, вставка или замена.
В предпочтительном воплощении указанный по меньшей мере один модифицированный коровый белок представляет собой дефицитную интегразу. Пример дефицитной интегразы несет мутацию D116A.
Нуклеиновая кислота, кодирующая коровые белки, таким образом, может 30 содержать по меньшей мере одну мутацию в гене pol и/или по меньшей мере одну мутацию в гене gag. Указанная по меньшей мере одна мутация может представлять собой нуклеотидную делецию, вставку или замену.
В одном предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая коровые белки, содержит по меньшей мере одну мутацию в гене pol, кодируя, 35 посредством этого, дефицитную интегразу.
Ретровирусный вектор, кодирующий дефицитную интегразу, называется дефицитный по интеграции ретровирусный вектор. Такой вектор обеспечивает кратковременный перенос инкапсулированной молекулы РНК, кодирующей интресующий ген.
5 Предпочтительный ретровирусный вектор, дефицитный по интеграции,
представляет собой IDLV (дефицитный по интеграции лентивирусный вектор).
Происхождение генов gag и pol дает название ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору. Например, выражение "ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор, происходящий из ВИЧ-
10 1" обычно указывает то, что гены gag и pol представляют собой гены ВИЧ-1 или представляют собой модифицированные гены gag и pol из ВИЧ-1.
Вектор, содержащий геном, происходящий от ретровируса, компетентный к упаковывынию, также может быть использован для сотрансфекции, в частности, для продукции ретровирусного вектора.
15 Под "вектором, содержащим геном, происходящий от ретровируса,
компетентным к упаковке" в данном документе подразуевается вектор, который содержит последовательности ретровирусных нуклеиновых кислот, известные как "цис-действующие" последовательности. Они включают длинные концевые повторы (LTR) или модифицированные LTR, например, у которых отсутствует по
20 меньшей мере одна часть области U3, для контроля транскрипции и интеграции, последовательность psi, необходимую для инкапсулирования, и последовательности сайта связывания праймеров (PBS) и полиуринового тракта (РРТ), необходимые для обратной транскрипции ретровирусного генома.
Ретровирусный вектор, продуцируемый с использованием вектора,
25 содержащего LTR, у которого отсутствует по меньшей мере одна часть области U3, например, представляет собой самоинактивирующийся (SIN-LTR) вектор.
В одном воплощении указанный вектор, содержащий геном, происходящий от ретровируса, компетентный к упаковке, дополнительно содержит интересующий(щие) ген(ны), включающий(щие) элемент(ты) CRISPR/CAS и/или
30 S/MAR-эписому.
При использовании системы CRISPR/CAS вектор, содержащий геном, происходящий от ретровируса, компетентный к упаковке, типично содержит ген, кодирующий эндонуклеазу CAS (например, CAS9), последовательность ДНК, соответствующую РНК-проводнику (пРНК), специфичную к интересующему гену,
35 подлежащему нацеливанию, и, возможно, последовательность для редактирования гена.
Указанный геном, происходящий от ретровируса, предпочтительно является дефектным в отношении репликации в отсутствие какой-либо транс-комплементирующей функции. Компетентный в отношении репликации геном дополнительно содержал бы гены gag, pol и env. В дефектном в отношении 5 репликации геноме вирусные гены gag, pol и env подвергаются делеции. Сборка ретровирусоподобных частиц или ретровирусных векторов по изобретению достигается посредством предоставления в транс системе другого вектора, который кодирует gag и pol, но который является дефектным в отношении "цис" последовательностей (такой как вектор (iv)), и по меньшей мере другого вектора
10 или нуклеиновой кислоты, которая кодирует гликопротеины псевдотипированной оболочки (такие как нуклеиновые кислоты (i), (ii) и (iii) вектора(ров), содержащего(щих) указанные нуклеиновые кислоты). Их экспрессия обеспечивает инкапсулирование интересующего гена, исключая гены, необходимые для размножения вирусного генома и для образования полных вирусных частиц.
15 Способ получения псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или
ретровирусного вектора, как определено выше, может дополнительно включать стадию:
б) культивирования сотрансфицированных клеток в течение достаточного
времени для обеспечения экспрессии белков, кодируемых указанной(ными)
20 нуклеиновой(выми) кислотой(тами) и вектором(рами); и
в) обеспечения образования кодируемыми белками ретровирусоподобных
частиц или ретровирусных векторов.
Модулирование активности и/или трансдуцирование специфических клеток 25 или подтипов клеток
Другой целью данного изобретения является применение, предпочтительно применение in vitro или ex vivo, псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, для селективной модуляции активности клеток-мишеней и, возможно, селективной трансдукции 30 клеток-мишеней.
Кроме того, другой целью данного изобретения является способ, предпочтительно способ in vitro или ex vivo, селективного модулирования активности клеток-мишеней и, возможно, селективного трансдуцирования клеток-мишеней, где указанный способ включает приведение в контакт 35 псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, с клетками, содержащими указанные клетки-мишени.
Термин "селективно" в выражении "селективное модулирование активности клеток-мишеней" означает то, что по существу только указанные клетки-мишени имеют их активность, модулируемую псевдотипированной ретровирусоподобной частицей или ретровирусным вектором. Например, клетки, 5 активность которых модулируется, составляют меньше, чем 10%, например, меньше, чем 5% или меньше, чем 1% клеток, не являющихся мишенями.
Термин "селективно" в выражении "селективное трансдуцирование клеток-мишеней" означает в данном документе то, что по существу трансдуцируются только клетки-мишени. Например, трансдуцированные клетки составляют меньше, 10 чем 10%, например, меньше, чем 5% или меньше, чем 1% клеток, не являющихся мишенями, подвергаемых трансдукции.
Выражение "модулирование активности клетки-мишени" определяется также, как и выше в разделе "Функциональный домен".
Термин "осуществление переноса" или "трансдуцирование" в том виде, в
15 котором он используется в данном документе, относится к способности
ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора доставлять
биологическое вещество в мембрану или цитоплазму клеток-мишеней при
связывании с клетками-мишенями. После доставки биологическое вещество может
транслоцироваться в другой(гие) компартмент(ты) клетки.
20 Выражение "биологическое вещество" в том виде, в котором оно
используется в данном документе, относится к одному или более чем одному соединению, способному изменять структуру и/или функцию клетки. В пределах контекста настоящего изобретения предпочтительно, чтобы биологическое вещество представляло собой одну или более чем одну нуклеиновую кислоту, 25 содержащую интересующий ген, которая может содержатся в геноме ретровирусного вектора, как объяснено выше.
Условия для проведения трансдукции клеток хорошо известны от специалистов и типично включают инкубирование клеток, подлежащих трансдукции, предпочтительно при культивировании во флаконах или на чашках, 30 покрытых, например, ретронектином, и, возможно, предварительно стимулированных смесями цитокинов, с псевдотипированным ретровирусным вектором, предпочтительно при МОИ (множественность инфекции) от 0,5 до 100.
Клетки-мишени, в частности, являются такими, как определено выше в разделе с таким же названием.
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор могут приводиться в контакт с клетками, содержащими клетки-мишени, в культуральной среде.
Специалисту известна культуральная среда, подходящая для данных
5 клеток.
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор, таким образом, могут использоваться in vitro или in vivo для изменения определенной функции клетки, предоставляя, посредством этого, новые средства для фундаментальных исследований.
Фармацевтическая композиция
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну псевдотипированную ретровирусоподобную частицу или ретровирусный вектор, как определено выше.
15 Количество псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или
ретровирусного вектора, подлежащих применению в фармацевтической композиции, зависит, например, от иммуногенности, состояния субъекта, которому назначено введение (например, масса, возраст, пол, состояние здоровья, сопутствующее лечение, при его наличии, и частота лечения), способа введения,
20 типа препарата и/или числа клеток-мишеней.
Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит по меньшей мере одну псевдотипированную ретровирусоподобную частицу или ретровирусный вектор и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Подразумевается то, что термин "фармацевтически приемлемый носитель"
25 в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает любой носитель, который не препятствует эффективности биологической активности активного ингредиента, и который предпочтительно не является токсичным для хозяина, которому он вводится.
Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в
30 фармацевтической композиции по изобретению, хорошо известны специалисту. Например, они включают ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, самоэмульгируемые системы доставки лекарственных средств (SEDDS), такие как d-a-токоферолполиэтиленгликоля 1000 сукцинат, поверхностно-активные вещества, используемые в фармацевтических лекарственных формах, такие как
35 разные виды Tween или другие аналогичные полимерные матрицы для доставки, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные
вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как протамина сульфат, динатрия гидрофосфат, калия гидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, 5 трисиликат магния, поливинилпирролидон, основанные на целлюлозе вещества, полиэтиленгликоль, натрия карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воска, полиэтилен-полиоксипропилен-блоксополимеры, полиэтилегликоль и шерстный жир. Для усиления доставки композиций согласно изобретению преимущественно также можно использовать циклодекстрины, такие как а-, р- и у-циклодекстрин, или
10 химически модифицированные производные, такие как
гидроксиалкилциклодекстрины, включающие 2- и 3-гидроксипропил-р-циклодекстрины, или другие солюбилизированные производные.
Данная фармацевтическая композиция может содержать от 106IU до 1012 IU псевдотипированного ретровирусного вектора, предпочтительно от 107 IU до 109 IU,
15 более предпочтительно от 107 IU до 108 IU.
Термины "III" или "инфекционная единица" в данном документе означают количество частиц инфекционного вектора, определенное титрованием на линии клеток и выраженное в виде IU/мл.
Введение может достигаться в одной дозе или нескольких дозах
20 фармацевтической композиции согласно изобретению, причем указанные несколько доз инъецируются в то же самое время или раздельно с течением времени.
В одном воплощении фармацевтические композиции представлены в стандартных лекарственных формах для облегчения точного дозирования. Термин
25 "стандартная лекарственная форма" относится к физически дискретным элементам, подходящим в качестве единичных дозировок для человеческих субъектов и других млекопитающих, причем каждый элемент содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в ассоциации с подходящим фармацевтическим
30 эксципиентом. Типичные стандартные лекарственные формы включают предварительно заполненные, предварительно отмеренные ампулы или шприцы с жидкими композициями. В таких композициях псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор обычно является минорным компонентом, причем остаток представляют собой разные наполнители
35 или носители и вспомогательные вещества для переработки, полезные для образования желательной лекарственной формы.
Согласно изобретению дополнительно предложены наборы, содержащие фармацевтическую композицию, содержащую псевдотипированную ретровирусоподобную частицу или ретровирусный вектор, как определено выше, и инструкции относительно способа введения. В данных инструкциях могут, 5 например, указываться медицинское показание, путь введения, дозировка и/или группа пациентов, подлежащих лечению.
Субъект, подлежащий лечению
Субъект, подлежащий лечению, может представлять собой млекопитающее, 10 например, человека или млекопитающее, не являющееся человеком.
Человека также называют "индивидом" или "пациентом".
Указанный человек может быть любого возраста, например, младенцем, ребенком, подростком, взрослым, пожилым человеком, и любого пола.
Млекопитающее, не являющееся человеком, предпочтительно 15 представляет собой грызуна (например, мышь, крысу или кролика), кошачьего (например, кошку), псового (например, собаку) или примата (например, шимпанзе).
Субъект, подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой человека.
20 Предупреждение и/или лечение заболевания
Настоящее изобретение является особенно полезным для предупреждения и/или лечения заболевания, которое можно предупреждать и/или излечивать посредством селективного модулирования активности специфических клеток или поднабора клеток и, возможно, посредством осуществления селективной 25 трансдукции указанных специфических клеток или поднабора клеток.
Указанное заболевание предпочтительно включает специфические клетки или поднабор клеток.
Субъект, подлежащий лечению, таким образом, может страдать от или, вероятно, может быть поражен заболеванием, которое можно предупреждать и/или 30 излечивать посредством селективного модулирования активности специфических клеток или поднабора клеток и, возможно, посредством осуществления селективной трансдукции указанных специфических клеток или поднабора клеток.
Указанное заболевание может быть выбрано в группе, состоящей из иммунного заболевания (например, аутоиммунного заболевания), рака, 35 генетического заболевания, аллергического заболевания, воспалительного заболевания, инфекционного заболевания (в частности, бактериальной и/или
вирусной инфекции), метаболического заболевания, нейродегенеративного заболевания (например, нейродистрофии, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера), мышечного заболевания и их комбинаций.
Выражение "аутоиммунное заболевание" в том виде, в котором оно 5 используется в данном документе, относится к заболеванию, обусловленному сверхактивным иммунным ответом организма против веществ и/или тканей, обычно присутствующих в организме. Соответственно, посредством специфичного нацеливания на иммунные клетки, участвующие в данном сверхактивном иммунном ответе, псевдотипированная ретровирусоподобная частица и
10 ретровирусный вектор по изобретению являются полезными средствами для предупреждения и/или лечения аутоиммунного заболевания.
Аутоиммунные заболевания включают, в частности, следующие: острый рассеянный энцефаломиелит, острый геморрагический лейкоэнцефалит, болезнь Аддисона, агаммоглобулинемия, круговая алопеция, боковой амиотрофический
15 склероз, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, антисинтетазный синдром, атопическая аллергия, аутоиммунная апластическая анемия, аутоиммунная кардиомиопатия, аутоиммунная энтеропатия, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, аутоиммунный липопролиферативный синдром, аутоиммунная
20 периферическая нейропатия, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная крапивница, аутоиммунный увеит, болезнь Бало, концентрический склероз Бало, синдром Бехчета, болезнь Бергера, энцефалит Бикерстаффа, синдром Блау, буллезный
25 пемфигоид, болезнь Кастелмана, целиакия, хроническая воспалительная демиелинирующая полинейропатия, хронический рецидивирующий множественный остеомиелит, синдром Чарга-Стросса, рубцовый пемфигоид, синдром Когана, синдром холодовой агглютинации, недостаточность компонента 2 комплемента, краниальный артериит, CREST-синдром, болезнь Крона, синдром
30 Кушинга, кожный лейкоцитокластический васкулит, болезнь Дего, болезнь Деркума, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, диффузный кожный системный склероз, синдром Дресслера, дискоидная волчанка, экзема, артрит, связанный с энтезитом, эозинофильный фасцит, эозинофильный гастроэнтерит, приобретенный буллезный эпидермолиз, узловатая эритема,
35 первичная криоглобулинемия смешанного типа, синдром Эванса, прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия, фиброзный альвеолит,
гастрит, желудочно-кишечный пемфигоид, узелковый периартериит, гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре (GBS), энцефалит Хашимото, тиреоидит Хашимото, гемолитическая анемия, пурпура Геноха-Шенлейна, герпес беременных, гипогаммаглобулинемия, 5 идиопатическое воспалительное демиелинизирующее заболевание, идиопатический легочный фиброз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, IgA нефропатия, миозит с тельцами включения, воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, интерстициальный цистит, юношеский идиопатический артрит, юношеский ревматоидный артрит, болезнь Кавасаки,
10 миастенический синдром Ламберта-Итона, лейкоцитокластический васкулит, лишай Вильсона, склеротический лишай, lgA-зависимый линейный дерматоз (LAD), болезнь Лу Герига, волчаночный гепатит, красная волчанка, синдром Маджеда, болезнь Менье, микроскопический полиангиит, синдром Миллера-Фишера, смешанное заболевание соединительной ткани, кольцевидная склеродермия,
15 болезнь Мухи-Габерманна, рассеянный склероз, тяжелая миастения, миозит, нейромиелит зрительного нерва, нейромиотония, глазной рубцевой пемфигоид, опсо-миоклональный синдром, обычный тиреоидит, палиндромный ревматизм, паранеопластическая мозжечковая дегенерация, ночная пароксизмальная гемоглобинурия (PNH), синдром Парри Ромберга, синдром Персонейджа-Тернера,
20 воспаление pars plana, пузырчатка, обыкновенная пузырчатка, пернициозная анемия, околовенозный энцефаломиелит, синдром POEMS (полиневропатия (полинейропатия) с органомегалией), узелковый полиартериит, ревматическая полимиалгия, полимиозит, первичный билиарный цирроз печени, первичный склерозирующий холангит, прогрессирующая воспалительная нейропатия,
25 псориаз, псориатический артрит, гангренозная пиодермия, истинная эритроцитарная аплазия, энцефалит Расмуссена, феномен Рейно, рецидивирующий полихондрит, синдром Райтера, синдром усталых ног, ретроперитонеальный фиброз, ревматоидный артрит, ревматоидная лихорадка, саркоидоз, синдром Шмидта, синдром Шнитцлера, склерит, склеродермия,
30 синдром Шегрена, спондилоартропатия, болезнь Стилла, синдром скованного человека, подострый бактериальный эндокардит, синдром Сусака, синдром Свита, болезнь Сиденгама, симпатетическая офтальмия, синдром дуги аорты, темпоральный артериит, синдром Толоса-Ханта, поперечный миелит, язвенный колит, недифференцированное заболевание соединительной ткани,
35 недифференцированная спондилоартропатия, васкулит, витилиго и синдром Вегенера.
Термин "рак" в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает любой тип рака, такой как глиобластома, нейробластома, В-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома, рак молочной железы, печеночно-клеточная карцинома, рак, возникающий из гематопоэтических клеток, включающий лейкоз, в 5 частности, B-CLL (В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз), CML (хронический миелогенный лейкоз) или лейкоз на основе Т-клеток, такой как ATL (острый Т-клеточный лейкоз), ALL (острый лимфобластный лейкоз), AML (острый миелобластный лейкоз) и/или меланома.
10 Терапевтические применения
Настоящее изобретение также относится к псевдотипированной ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору, как определено выше, для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в иммунотерапии, генотерапии и/или вакцинации.
15 Генотерапия представляет собой терапию с использованием гена(нов) в
качестве лекарственного средства, которое, например, может быть получено посредством доставки в клетку интересующего гена и/или редактирования интересующего(щих) гена(нов) в эндогенном сайте. В генотерапии нуклеиновая кислота, содержащая интересующий(щие) ген(ны), доставляется в клетки
20 пациента, а экспрессия белка(ков), кодируемого(мых) интересующим(щими) геном(нами), и/или посредством редактирования интересующего(щих) гена(нов), посредством этого обеспечивает предупреждение и/или лечение заболевания.
Указанный интересующий(щие) ген(ны) может(гут) присутствовать в молекуле РНК, содержащейся в ретровирусном векторе согласно изобретению.
25 Редактирование гена(нов) может проводиться посредством системы
CRISPR/CAS.
Иммунная терапия, также именуемая иммунотерапия, представляет собой терапию на основе модулирования активности иммунной системы (например, стимуляции или ингибирования) для предупреждения и/или лечения заболевания.
30 В контексте настоящего изобретения иммунотерапия заключается в
модулировании активности только специфично нацеленных иммунных клеток посредством применения ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора согласно изобретению и, возможно, селективного трансдуцирования указанных иммунных клеток-мишеней. Например, ретровирусный вектор можно
35 использовать для активации В-клеток, таким образом, чтобы заставить их дифференцироваться в плазматические клетки, и, возможно, трансдуцировать их
нуклеиновой кислотой, кодирующей эктопическое антитело против инфекционного
агента (например, против ВИЧ, HCV (вирус гепатита С) или НВС).
Иммунотерапия также включает Т-клеточную терапию. При Т-клеточной
терапии Т-клетки, кроме того, могут модулироваться в отношении их функции для 5 того, чтобы быть более пермиссивными для переноса генов, например, для
переноса гена рецептора Т-клетки (CAR).
Адоптивная Т-клеточная терапия представляет собой терапию, при которой
Т-клетки трансфундируются субъекту, нуждающемуся в этом. В контексте
настоящего изобретения активность указанных Т-клеток возможно модулировалась 10 до трансфузии посредством применения ретровирусоподобной частицы или
ретровирусного вектора согласно изобретению.
В контексте настоящего изобретения вакцинация заключается в
экспонировании на поверхности ретровирусоподобной частицы или
ретровирусного вектора специфических вирусных эпитопов, которые будут служить 15 мишенью и, в то же самое время, активировать антигенпрезентирующие клетки
(например, макрофаги), которые затем будут презентировать эпитопы иммунной
системе (Т- и В-клеткам).
Настоящее изобретение также относится к псевдотипированной
ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору, как определено выше, 20 для применения в качестве лекарственного средства, где указанная
псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор
селективно модулирует активность клеток-мишеней и, возможно, селективно
трансдуцирует клетки-мишени.
Настоящее изобретение, в частности, относится к псевдотипированной 25 ретровирусоподобной частице или ретровирусному вектору для применения, как
определено выше, в предупреждении и/или лечении заболевания, как определено
выше в разделе "Предупреждение и/или лечение заболевания".
Указанное заболевание, например, представляет собой иммунное
заболевание (например, аутоиммунное заболевание), рак, генетическое 30 заболевание, аллергическое заболевание, воспалительное заболевание,
инфекционное заболевание (в частности, бактериальную и/или вирусную
инфекцию), метаболическое заболевание, неврологическое заболевание (такое как
нейродистрофия, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь
Гентингтона), мышечное заболевание и их комбинации.
35 В одном воплощении псевдотипированная ретровирусоподобная частица
или ретровирусный вектор используются для улучшения вакцины на основе DC
(дендритная клетка), например, посредством совместной экспозиции
специфического лиганда DC клетки (такого как CD11b) и GM-CSF (гранулоцитарно-
макрофагальный колониестимулирующий фактор) на поверхности вектора для
переноса белка или гена.
5 В преимущественном воплощении активация Т-клеток связана со
специфичным для Т-клеток переносом генов, что значительно усиливало эффективность переноса генов в покоящихся Т-клетках, например, в генотерапии на основе Т-клеток. Эффективный перенос генов in vivo в поднабор Т-клеток представляет собой революцию в области генной и клеточной терапии, так как он
10 позволяет опускать процессы культивирования и трансдукции ex vivo, которые приводят к высоким затратам в отношении клинического применения. Кроме того, оставление клеток в их нормальном микроокружении in vivo позволяет им сохранять их фенотип и долговременно выживать в пациенте (например, опухолеспецифичные CD8 цитотоксические клетки).
15 В другом воплощении данное изобретение можно использовать для
усиления селективной доставки генов в покоящиеся В-лимфоциты, например, в генотерапии на основе В-клеток, такой как иммунотерапия, которая обеспечивает продукцию В-клетками нейтрализующих антител против инфекционного(ных) агента(тов) или обеспечивает секрецию В-клетками рекомбинантных белков,
20 которые переносятся иммунной системой, так как В-клетки могут действовать как толерогенные клетки.
Кроме того, экспонирование одного или более чем одного цитокина на поверхности псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора может индуцировать поднабор Т-клеток,
25 дифференцирующихся в фенотипы, подобные TSCM или ТСМ, которые могут долговременно выживать in vivo.
В другом воплощении данное изобретение можно использовать для размножения in vivo (аутологичных) противораковых природных клеток-киллеров для противораковой терапи.
30 В одном воплощении псевдотипированная ретровирусоподобная частица
или ретровирусный вектор используются для индукции апоптоза определенного поднабора клеток посредством совместного экспонирования лиганда апоптоза и нацеливающего домена, специфичного в отношении опухоли или иммунной клетки. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный
35 вектор могут быть предоставлены в виде фармацевтической композиции.
Фармацевтическая композиция предпочтительно является такой, как определено выше в разделе с таким же названием.
Настоящее изобретение также касается способа лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающего введение терапевтически эффективного 5 количества псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, предпочтительно в рамках иммунотерапии, генотерапии и/или вакцинации.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение терапевтически эффективного 10 количества псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, где указанная псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор селективно модулирует активность клеток-мишеней и, возможно, селективно трансдуцирует клетки-мишени.
15 Настоящее изобретение также касается способа предупреждения и/или
лечения заболевания, включающего введение субъекту, нуждающемуся в этом,
терапевтически эффективного количества псевдотипированной
ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора, как определено выше, где указанное заболевание предпочтительно является таким, как определено
20 выше.
Можно использовать любой подходящий способ введения, известный специалисту в данной области. В частности, псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор согласно изобретению может вводиться пероральным путем, парентеральным путем (предпочтительно
25 внутривенной инъекцией), медуллярным путем, в частности, внутрь бедренной кости (как, например, в полость костного мозга) или инъекцией медуллярным путем в плечевую кость и/или местной внутриопухолевой инъекцией.
При выборе парентерального пути псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор может находиться в виде
30 инъецируемого раствора или суспензии, например, приготовленной в ампуле или во флаконе.
Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный
вектор предпочтительно используется или вводится в терапевтически
эффективном количестве.
35 "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству
псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора,
которое придает терапевтический эффект субъекту, подвергающемуся лечению. Данный терапевтический эффект может быть объективным (т.е. измеряемым некоторым анализом или маркером) или субъективным (т.е. субъект дает указание или чувствует эффект). Как известно от специалиста, эффективные дозы будут 5 варьировать, в зависимости от пути введения, размера и/или массы субъекта, а также от возможности совместного применения с другими агентами.
Термин "содержащий" в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает термин "состоящий из".
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано, 10 принимая во внимание следующие примеры и графические материалы.
Все ссылки, процитированные в данном документе, включающие журнальные статьи или рефераты, опубликованную или неопубликованную патентную заявку, выданные патенты или любые другие ссылки, являются целиком включенными в данный документ посредством ссылки, включая все данные, 15 таблицы, графические материалы и текст, представленный в процитированных ссылках.
Краткое описание последовательностей
SEQ ID NO: 1 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты, 20 кодирующей усеченный и мутировавший (Y481A, R533A, S548L, F549S) белок Н MV (НсДельта18), слитый со сконструированным белком с анкириновыми повторами (DARPin)-29.2, специфичным в отношении человеческого CD4.
SEQ ID NO: 2 соответствует аминокислотной последовательности,
кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 1.
25 SEQ ID NO: 3 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты,
кодирующей усеченный и мутировавший (Е501А, W504, Q530A, Е533А) белок G NiV (GcA34), слитый с одноцепочечным антителом, направленным на человеческий CD8 (scFvC8-Vh1), связанный с дополнительным линкером (G4S)3.
SEQ ID NO: 4 соответствует аминокислотной последовательности, 30 кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный и мутировавший (Е501А, W504, Q530A, Е533А) белок G NiV (GcA34), слитый с IL-7.
SEQ ID NO: 6 соответствует аминокислотной последовательности, 35 кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 7 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты,
кодирующей усеченный и мутировавший (Е501А, W504, Q530A, Е533А) белок G NiV
(GcA34), слитый со сконструированным белком с анкириновыми повторами
(DARPin), направленным против человеческого ЕрСАМ.
5 SEQ ID NO: 8 соответствует аминокислотной последовательности,
кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 7.
SEQ ID NO: 9 соответствует полноразмерной аминокислотной последовательности гликопротеина G оболочки вируса Нипах.
SEQ ID NO: 10 соответствует полноразмерной аминокислотной 10 последовательности гликопротеина Н оболочки вируса кори.
SEQ ID NO: 11 соответствует полноразмерной аминокислотной последовательности гликопротеина F оболочки вируса Нипах.
SEQ ID NO: 12 соответствует полноразмерной аминокислотной
последовательности гликопротеина F оболочки вируса кори.
15 SEQ ID NO: 13 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты,
кодирующей усеченный и мутировавший белок Н MeV (НсА15), слитый с IL-7.
SEQ ID NO: 14 соответствует аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 13.
SEQ ID NO: 15 соответствует аминокислотной последовательности белка F 20 вируса кори, усеченного на 30 аминокислот в цитоплазматическом хвосте (FcA30).
SEQ ID NO: 16 соответствует аминокислотной последовательности белка F вируса Нипах, усеченного на 22 аминокислоты в цитоплазматическом хвосте (FCA22).
25 КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1: эффективный и стабильный перенос гена ErbB2-CAR в покоящиеся Т-клетки CD4+ посредством 4H/IL7H-LV. Для оценки того, может ли 4H/IL7H-LV эффективно переносить терапевтические гены (ЕгЬВ2-специфичный CAR - ErbB2-
30 CAR) в покоящиеся Т-клетки, свежевыделенные Т-клетки CD3+ трансдуцировали 4H-LV или 4H/IL7H-LV. Клетки, трансдуцированные VSV-LV или оставленные нетрансдуцированными (ut), использовали в качестве негативных контролей. Через трое суток половину трансдуцированных клеток анализировали посредством FACS (флуоресцентная сортировка клеток) для определения процентной доли клеток
35 ErbB2-CAR+ в клетках, отсортированных на CD4 или CD8. Для подтверждения
стабильной экспрессии ErbB2-CAR, другую половину трансдуцированных клеток дополнительно культивировали в присутствии стимула антитело против CD3/ антитело против CD28/IL-2, после стадии промывки в течение еще трех суток. Затем процентные доли клеток CD4+/ErbB2+ и клеток CD8+/ErbB2+ определяли 5 посредством FACS.
Фиг. 2: мутация гликопротеина G оболочки NiV для устранения распознавания природным рецептором. Показано связывание Ephrin-B2 (А) и ВЗ (Б) с мутантами NiV-G. Клетки 293Т трансфицировали либо имитацией -плазмидами, кодирующими GcA34Hls, или разными мутантами GcA34EpCAM:
10 немутировавшим (GcA34EpCAM), Е533А (GcA34EpCAMmut1), Q530A+E533A
(GcA34EpCAMmut2.1), E501A+W504A (GcA34EpCAMmut2.2) или
E501A+W504A+Q530A+E533A (GcA34EpCAMmut4), и инкубировали с 1 мкг/мл рекомбинантного Fc-Ephrin В2 или ВЗ. Количество связывания данного рецептора разными мутантами показано в виде значений MFI (средняя интенсивность
15 флуоресценции). Статистика по отношению к немутировавшему GA34-DARPin-Ac1 (п равно 3; показаны среднее плюс/минус стандартные отклонения (SD); * - Р меньше 0,1; ** - Р меньше 0,01; *** - Р меньше 0,001 посредством непарного t-критерия).
Фиг. 3: селективная активация Т-клеток CD4+ посредством 4H/IL7H-VLP.
20 Свежевыделенные Т-клетки CD3+ оставляли нетрансдуцированными (ut) или трансдуцировали разными типами VLP, псевдотипированных CD4-DARPin-Hmut (4Н -VLP), CD4-DARPin/IL7-Hmut (4H/IL7H-VLP) или IL7-Hnse (Hnse/IL7H-VLP). Через трое суток данные клетки окрашивали антителами против CD8, CD4 и CD71. Показана экспрессия CD71 в Т-клетках, отсортированных на CD4 или CD8.
25 Фиг. 4: функционально экспонированный IL7 на нацеленных VLP
стимулирует выживание Т-клеток. Профили прямого/бокового рассеивания взрослых покоящихся Т-клеток CD3+, которые инкубировались в течение 6 суток с вирусоподобными частицами (VLP), псевдотипированными нацеленным на CD4 MV-H (4H-VLP), нацеленным на CD8 MV-H (8H-VLP), экспонирующим IL7
30 нацеленным на CD4 MV-H (4H/IL7H-VLP) или экспонирующим IL7 нацеленным на CD8 MV-H (8H/IL7H-VLP). Клетки, культивированные в одной среде (нетрансдуцированные, ut) или в присутствии 15 нг/мл IL7, использовали в качестве контролей. На каждом дот-блоте показана процентная доля жизнеспособных клеток.
Фиг. 5: функционально экспонированный IL7 на LV, нацеленном на CD4, стимулирует выживание Т-клеток. Профили прямого/бокового рассеивания взрослых покоящихся Т-клеток CD3+, которые инкубировались в течение 6 суток с лентивирусными векторами (LV), псевдотипированными VSVG (VSV-LV), MV-Hmut 5 (Hnse-LV), нацеленным на CD4 MV-H (4H-LV), или экспонирующим IL7, нацеленным на CD4 MV-H (4H/IL7H-LV). Клетки, культивированные в одной среде (нетрансдуцированные, ut) или в присутствии 15 нг/мл IL7, использовали в качестве контролей. На каждом дот-блоте показана процентная доля жизнеспособных клеток.
10 Фиг. 6: селективная активация Т-клеток CD4+ посредством 4H/IL7H-LV.
Свежевыделенные Т-клетки CD3+ оставляли нетрансдуцированными (ut) или трансдуцировали разными типами LV, псевдотипированными CD4-DARPin-Hmut (4НА18 -LV), Hnse (Hnse-LV) или VSVG (VSVG-LV). Здесь IL7 экспонировался на двух разных версиях Hmut: либо с 20 аминокислотами, учеченными на С-конце (НА20),
15 либо с 15 аминокислотами, учеченными на С-конце (НА15). Соответственно, получали два типа 4H/IL7H-LV и трансдуцировали ими покоящиеся Т-клетки. Через трое суток данные клетки окрашивали антителами против CD3, CD8, CD69 и CD71. Показаны маркеры активации экспрессии CD69 и CD71 в клетках CD8+ и CD8" (CD4+).
20 Фиг. 7: Схематическое представление псевдотипированных лентивирусных
векторов (LV). 4H-LV представляет собой нацеленный на CD4 LV на основе псевдотипов гликопротеина MeV. 4H/IL7H-LV представляет собой экспонирующий IL7, нацеленный на CD4 LV на основе псевдотипов гликопротеина MV. Гликопротеин Н оболочки (MV-H) является усеченным в его цитоплазматическом
25 хвосте, например, на 15, 18 или 20 аминокислот, и вводятся по меньшей мере две из четырех точечных мутаций (Y481A, R533A, S548L и F549S) для ослепления его природного распознавания рецептором - SLAM и CD46, приводя, посредством этого, к гликопротеину Hmut оболочки. Затем нацеливающий домен (напимер, CD4-DARPin) и/или цитокин (например, IL7) сливают с мутантом Н (Hmut) с линкером
30 или без него. Гликопротеин F оболочки MV является усеченным в его цитоплазматическом хвосте на 30 аминокислот (MV-FA30).
Фиг. 8: схематическое представление псевдотипированных вирусоподобных частиц (VLP). 8G-VLP представляет собой нацеленную на CD8 VLP на основе псевдотипов гликопротеина NiV. 8G/IL7G-VLP представляет собой экспонирующую
35 IL7, нацеленную на CD8 VLP на основе псевдотипов гликопротеина NiV.
Гликопротеин оболочки NiV-G является усеченным в его цитоплазматическом хвосте на 34 аминокислоты (А34), и вводятся четыре точечные мутации (Е501А, W504A, Q530A и Е533А) для ослепления его распознавания природным рецептором Ephrin-B2/B3, приводя, посредством этого, к гликопротеину NiV-GA34 5 оболочки. Затем нацеливающий домен (CD8-scFv) и/или цитокин (IL7) сливают с мутантным белком G (NiV-GA34) с линкером или без него. Гликопротеин F оболочки NiV является усеченным в его цитоплазматическом хвосте на 22 аминокислоты (NiV-FA22).
Фиг. 9: эффективная и селективная трансдукция покоящихся Т-клеток CD4+
10 посредством 4H/IL7H-LV. Свежевыделенные Т-клетки CD3+ оставляли нетрансдуцированными (ut) или трансдуцировали разными типами LV, псевдотипированных CD4-DARPin-Hmut (4НА18 -LV), Hnse (Hnse-LV) или VSVG (VSVG-LV). Здесь IL7 экспонировался на двух разных версиях Hmut: либо с 20 аминокислотами, усеченными на С-конце (НА20), либо с 15 аминокислотами,
15 усеченными на С-конце (НА15). Соответственно, получали два типа 4H/IL7H-LV (4HA18/IL7HA15-LV и 4HA18/IL7HA20-LV) и трансдуцировали ими покоящиеся Т-клетки. Через трое суток данные клетки окрашивали антителами против CD3, CD8 и CD4. Показана экспрессия GFP в Т-клетках, сортированных на CD4 или CD8.
Фиг. 10: нейтрализация LV, псевдотипированных гликопротеином NiV.
20 Клетки СНО-ЕрСАМ или CHO-Ephrin-B2 трансдуцировали NivmutEpCAM (круг), MVEpCAM-LV (квадрат), NiVwt-LV (треугольник) или VSVG-LV (ромб) при МОИ 0,4 после инкубации с серийными разведениями объединенной человеческой сыворотки (IVIG) в течение 2 ч при 37°С. Через 72 ч клетки GFP+ определяли проточной цитометрией, и показано число клеток GFP+ относительно
25 необработанного контроля (п равно 3).
Фиг. 11: селективная активация Т-клеток CD8+ посредством 8G/IL7G-LV. Свежевыделенные Т-клетки CD3+ оставляли нетрансдуцированными (ut) или трансдуцировали разными типами LV, псевдотипированного CD8-scFv-Gmut (8G-LV) или CD8-scFv-Gmut /IL7-Gmut (8G/IL7G-LV). Через трое суток данные клетки
30 окрашивали антителами против CD8, CD4 и CD71. Показана экспрессия CD71 в Т-клетках, сортированных на CD4 или CD8.
Фиг. 12: эффективная и селективная трансдукция покоящихся Т-клеток CD8+ посредством 8G/IL7G-LV. Свежевыделенные Т-клетки CD3+ оставляли нетрансдуцированными (ut) или трансдуцировали разными типами LV,
35 псевдотипированных CD8-scFv-Gmut (8G-LV) или CD8-scFv-Gmut /IL7-Gmut (8G/IL7G-
LV). Через трое суток данные клетки окрашивали антителами против CD3, CD8 и CD4. Показана экспрессия GFP в Т-клетках, сортированных на CD4 или CD8.
Фиг. 13: эффективный перенос гена CAR19 в покоящиеся Т-клетки CD8+ посредством 8G/IL7G-LV. Свежевыделенные Т-клетки CD3+ оставляли 5 нетрансдуцированными (ut) или трансдуцировали разными типами LV, псевдотипированного CD8-scFv-Gmut (8G-LV), CD8-scFv-Gmut /IL7-Gmut (8G/IL7G-LV) или VSVG (VSV-LV). Терапевтический ген, кодирующий С019-специфичный CAR (CAR19), доставляли посредством LV. Через трое суток после трансдукции экспрессию CAR19 выявляли антителом против стус. Показана процентная доля 10 клеток, экспрессирующих CAR19, в Т-клетках CD4+ или CD8+.
Фиг. 14: 4H/IL7H-LV обеспечивает целевую активацию Т-клеток CD4+ in vivo у гуманизированных мышей.
Мышам NOD/SCID дс-/- инъецировали Т-клетки пуповинной крови, и через 2 месяца после перенесения (20%-ное восстановление Т-клеток) инъецировали 100 15 микролитров 4H/IL7H-LV (1Е6 IU) или 4H/IL7H-LV посредством в.в. инъекции. Через две недели после инъекции векторов мышей умерщвляли, и спленоциты оценивали на % Т-клеток CD71+ CD4+ (маркер активации).
ПРИМЕРЫ
Материал и методы Получение конструкций
Получали плазмиду pHL3-Ac1, кодирующую усеченный и мутировавший белок HcA18mut MV и линкер (G4S)3 (L3) между Н и меченным His DARPin Ас1,
25 посредством вставки ПЦР-амплифицированной кодирующей последовательности ЕрСАМ-специфичного DARPin Ас1 (Stefan et al. 2011) из pQE30ss_Ac1_corr в остов плазмиды pHL3-HRS3opt2#2 (Friedel et al. 2015) через Sfil/Notl.
Все плазмиды, кодирующие варианты белка G вируса Нипах, были получены из плазмиды pCAGGS-NiV-codonop-Gn. Кодирующую
30 последовательность домена, нацеленного на Ас1, сливали с С-концом рамки считывания белка G посредством ПЦР-амплификации каждого фрагмента и одновременного введения обычного рестрикционного сайта Agel, который использовали для лигирования, приводящего к плазмиде pCAGGS-NiV-G-DARPin-Ас1. Все другие нацеливающие домены заменяли посредством Agel/Notl. Усечения
35 цитоплазматического хвоста белка G вводили посредством ПЦР-амплификации рамки считывания белка G и вставки ПЦР-фрагментов в pCAGGS-NiV-G-DARPin-
Ас1, приводя к плазмидам pCAGGS-NiV-GcA33-DARPin-Ac1 и pCAGGS-NiV-GcA34-DARPin-Ac1. Меченные His белки G и GcA34 получали посредством ПЦР-амплификации из pCAGGS-NiV-codonop-Gn. Фрагменты клонировали посредством рестрикции Pacl/Notl в остов плазмиды pCAGGS-NiV-G-DARPin-Ac1, приводя к 5 pCAGGS-NiV-G-His и pCAGGS-NiV-GcA34-His соответственно. В кодирующую последовательность белка NiV-GcA34-DARPin-Ac1 были введены мутации, препятствующие распознаванию природным рецептором, посредством сайт-направленного мутагенеза. Каждая мутация была получена амплификацией двух фрагментов, несущих обозначенную мутацию, с гомологичными областями с месте
10 мутации. Данные фрагменты сливали и амплифицировали посредством фланкирующей пары праймеров. Образующиеся фрагменты клонировали в pCAGGS-NiV-GcA34-DARPin-Ac1 посредством Rsrll/Agel, получая плазмиды pCAGGS-NiV-GcA34EpCAMmut.
Для получения вариантов NiV-F кодирующие последовательности FcA22 и
15 FcA25 амплифицировали из pCAGGS-NiV-F и клонировали посредством рестрикции Pacl/Sacl в остов плазмиды pCAGGS-NiV-codonop-Gn, приводя к плазмидам pCAGGS-NiV-FcA22 и pCAGGS-NiV-FcA25. Меченные AU1 варианты NiV-F, использованные для анализа векторных частиц вестерн-блоттингом, получали посредством амплификации вариантов NiV-F из pCAGGS-NiV-F и
20 одновременного N-концевого добавления метки AU1. Образующиеся ПЦР-фрагменты клонировали посредством рестрикционного расщепления Pacl/Sacl в остов pCAGGS-NiV-codonop-Gn, приводя к плазмидам pCAGGS-AU1-NiV-F, pCAGGS-AU1-NiV-FcA22 и pCAGGS-AU1-NiV-FcA25.
25 Получение вектора
Векторные частицы получали временной трансфекцией клеток НЕК-293Т с использованием полиэтиленимина (PEI). За двадцать четыре часа до трансфекции 2,5x107 клеток высевали во флакон Т175. В сутки трансфекции среду культуры клеток замеяли на 10 мМ DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) с
30 15% FCS (фетальная телячья сыворотка) и 3 мМ L-глутамином. Смесь ДНК готовили посредством смешивания 35 мкг общей ДНК с 2,3 мл DMEM без добавок.
Например, следуя оптимизации отношений G к F, 0,9 мкг плазмиды, кодирующей варианты GcA34DARPin/scFv, смешивали с 4,49 мкг плазмиды, кодирующей варианты F. Использовали 14,4 мкг упаковывающей плазмиды на
35 основе ВИЧ-1 pCMVAR8.9 и 15,1 мкг плазмид для переноса на основе LV. Смесь
реактивов для трансфекции готовили смешиванием 140 мкл 18 мМ раствора PEI в Н20 с 2,2 мл DMEM без добавок. Данный раствор смешивали со смесью ДНК, встряхивали на вибромешалке, инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли к клеткам НЕК-293Т, приводя к DMEM с общим 5 содержанием 10% FCS, 2 мМ L-глутамина. Через 24 ч данную среду заменяли на DMEM с 10% FCS, 2 мМ L-глутамином для того, чтобы удалить остающиеся комплексы PEI/ДНК. В сутки два после трансфекции супернатант клеток, содержащий лентивирусные векторы, фильтровали через 0,45 мкм фильтр. При необходимости векторные частицы очищали посредством центрифугирования при
10 450 g в течение 24 ч через слой 20% сахарозы. Осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Для трансдукции 8x103 клеток СНО-ЕрСАМ и SK-OV-3 или 2x104 клеток Molt4.8 и Raji высевали в одну лунку 96-луночного планшета и трансдуцировали на следующие сутки. При необходимости среду для клеток заменяли на среду, содержащую разные концентрации
15 бафиломицина А1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Даллас, США), и клетки предынкубировали 30 мин при 37°С перед добавлением вектора. Для титрования использовали по меньшей мере четыре серийных разведения векторных частиц. Через 72 ч определяли процентное содержание клеток, позитивных в отношении зеленого флуоресцентного белка (GFP), посредством проточной цитометрии.
20 Трансдуцирование в единицах/мл (t.u./мл) рассчитывали посредством выбора разведений, показывающих линейную корреляцию между коэффициентом разведения и числом GFP-позитивных клеток (число трансдуцированных клеток/объем вектора в мкл/0,001).
Схематические представления псевдотипированной ретровирусоподобной
25 частицы или ретровирусного вектора согласно изобретению показаны на Фиг. 7 и 8.
Пример 1: селективная активация Т-клеток CD4+
Для того чтобы активировать CD4+, но не CD8+ лимфоциты, получали VLP, которые экспонируют С04-специфичный DARPin в качестве нацеливающего
30 лиганда и IL-7 в качестве активирующего домена на белке Н MV, наряду со слитым белком (F), приводя к 4H/IL7H-VLP (содержащей белки, последовательности SEQ ID NO: 2, 14 и 15). Для получения частиц создавали протокол трансфекции. Вкратце, для трансфекции клеток НЕК293Т в одном флаконе Т175 использовали 0,45 мкг pCG-Hmut-CD4-DARPin (Zhou et al., J Immunol, 2015), 0,45 мкг pCG-HAl5-IL7
35 (предоставленной Els Verhoeyen), 4,7 мкг pCG-FcA30 (Funke et al., Molecular
therapy, 2008), 14,4 мкг упаковывающей плазмиды на основе ВИЧ-1 pCMVAR8.9 (Funke et al., Molecular therapy, 2008) и 15,1 мкг pCG-1. После сбора векторные частицы дополнительно концентрировали посредством ультрацентрифугирования. Для LV были получены титры порядка 107 tu/мл, а для VLP было получено порядка 5 1,5 мкг р24/мл.
Функция 4H/IL7H-VLP была продемонстрирована на свежевыделенных покоящихся Т-клетках. Вкратце, Т-клетки CD3+ были выделены посредством негативной селекции с использованием набора для выделения Т-клеток Pan (Miltenyi Biotech) из периферической крови взрослого. Затем клетки инкубировали с
10 4H/IL7H-VLP в отсутствие какой-либо стимуляции. Через трое суток Т-клетки CD4+, но не Т-клетки CD4" в культуре клеток были активированы, что подтверждается анализом FACS для маркера активации CD71 (Фиг. 3). Ненацеленные частицы, экспонирующие IL-7, активировали и Т-клетки CD4+, и Т-клетки CD4". Известно то, что IL-7 представляет собой цитокин выживания Т-клеток. Следовательно, было
15 продемонстрировано то, что все VLP, экспонирущие IL7, были такими же эффективными, как и рекомбинантный человеческий IL-7, в предупреждении гибели первичных Т-клеток, тогда как большинство покоящихся Т-клеток, помещенных в культуру, были мертвы через шесть суток в присутствии традиционных 11_7-дефицитных частиц VLP (Фиг. 4).
20 Способность стимулировать выживание Т-клеток и селективно активировать
Т-клетки CD4+ также приобреталась экспонирующими IL7, нацеленными на CD4 LV (4H/IL7H-LV). Вирусные частицы получали, как описано выше, за исключением того, что pCG-1 была заменена плазмидой для переноса, кодирующей GFP. Кроме того, для того, чтобы протестировать гибкость системы и то, могла ли быть усилена
25 функция частиц посредством применения другой версии Hmut, для получения вектора использовали две другие плазмиды, кодирующие Hmut-IL7. pCG-HAl5-IL7 представляет собой 15 ак (аминокислотное) цитоплазматическое усечение Hmut-IL7 (для получения 4H/IL7HA15-LV) и pCG-HA20-IL7 представляет собой 20 ак цитоплазматическое усечение Hmut-IL7 (для получения 4H/IL7HA20-LV). Без
30 конкретного указания экспонирующие IL7 VLP и LV получали с использованием pCG-HA15-IL7. Аналогично тому, что достигалось посредством 4H/IL7H-VLP при инкубации свежевыделенных человеческих Т-клеток CD3+ с указанными LV в отсутствие стимуляции в течение 6 суток, 4H/IL7H-LV значимо стимулировал выживание Т-клеток по сравнению с родительским 4H-LV и ненацеленным Hnse-LV
35 (Фиг. 5). Как и ожидалось, наивысшая процентная доля жизнеспособных клеток
наблюдалась в позитивной группе обработанных rhlL-7, и наименее жизнеспособные клетки были в группах трансдуцированных VSV-LV или нетрансдуцированных (ut) (Фиг. 5). Кроме того, 4H/IL7H-LV был таким же мощным, как и 4H/IL7H-VLP в селективном стимулировании популяции его клеток-мишеней в 5 смешанной культуре клеток. Как показано на Фиг. 6, 4H/IL7H-LV осуществляет селективную повышающую регуляцию экспрессии клеток CD4+ с маркером активации CD69 и CD71, но не клеток CD4". Не было различий между 4H/IL7HA15-LV и 4H/IL7HA20-LV в стимуляции Т-клеток CD4+. Следовательно, успешно генерируются функциональные экспонирующие IL7 нацеленные LV.
Пример 2: доставка опухолеспецифичных химерных рецепторов антигена в покоящиеся Т-клетки
Поскольку 11_7-экспонирующие векторы запускали активацию покоящихся Т-клеток, ожидается то, что данные клетки являются пермиссивными для
15 лентивирусной трансдукции. Для того чтобы доказать это, были получены две версии 4H/IL7H-LV, доставляющего трансген GFP. Как показано на Фиг. 9, и 4H/IL7HA15-LV, и 4H/IL7HA20-LV могут эффективно и селективно трансдуцировать покоящиеся Т-клетки CD4+ в смеси клеток.
Химерные рецепторы антигена (CAR) представляют собой мощное средство
20 для терапии рака. До сих пор поднаборы Т-клеток должны очищаться и активироваться для генетической доставки CAR. В данном документе демонстрируется то, что CAR могут быть селективно доставлены в покоящиеся клетки CD4+. Частицы получали, как описано в Примере 1, за исключением того, что pCG-1 была заменена плазмидой для переноса, кодирующей CAR. При
25 трансдукции покоящихся Т-клеток 4H/IL7H-LV, доставляющей ЕгЬВ2-специфичные химерные рецепторы антигена (ErbB2-CAR), экспрессия ErbB2-CAR наблюдалась только в популяции Т-клеток CD4+. По сравнению с 11_7-дефицитным, нацеленным на CD4 LV (4H-LV), 4H/IL7H-LV был более эффективным в доставке гена CAR, при сохранении селективности в отношении Т-клеток CD4+ (Фиг. 1).
Пример 3: гликопротеины MV могут быть заменены гликопротеинами NiV для селективной активации и трансдукции покоящихся человеческих Т-клеток CD8+
Для того чтобы эффективно псевдотипировать VLP или LV гликопротеинами 35 NiV, NiV-G был усечен в его цитоплазматическом хвосте на 34 аминокислоты
(GcA34), a NiV-F был усечен в его цитоплазматическом хвосте на 22 аминокислоты (FA22). Затем было нарушено распознавание GcA34 природным рецептором -Ephrin-B2/B3 посредством введение в GcA34 четырех точечных мутаций (Е501А, W504A, Q530A, Е533А). LV, псевдотипированный данным сконструированным 5 белком G, полностью терял связывание с природными рецепторами NiV - Ephrin-В2 и -ВЗ (Фиг. 2) и не поступал в клетки, экспрессирующие данные рецепторы.
Кроме того, LV, псевдотипированные NiV, имеют некоторые привлекательные характеристики, подобные высокому выходу продукции и устойчивости ко внутривенным иммуноглобулинам. Поскольку отсутствует
10 вакцинация против NiV, и небольшое число вспышек ограничивается несколькими случаями в Малайзии, Бангладеш и Индии (SEARO / Регион Юго-восточной Азии ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения)), у людей не должны присутствовать нейтрализующие антитела. Для демонстрации этого, внутривенный иммуноглобулин (IVIG; Intratect(r)), охватывающий самый широкий интервал
15 доноров человеческой сыворотки, инкубировали с NiVwt-LV, NiVmutEpCAM-LV, MVEpCAM-LV и VSV-LV в возрастающих концентрациях до трансдукции клеток-мишеней. Экспрессию GFP затем определяли проточной цитометрией через трое суток после трансдукции. Как и ожидалось, трансдукция, опосредованная VSVG-LV и NiVwt-LV, не подвергалась влиянию посредством обработки IVIG. MVEpCAM-LV, с
20 другой стороны, показал дозозависимое уменьшение показателей трансдукции с полной нейтрализацией при 100 мкг/мл IVIG. В отличие от этого NiVmutEpCAM-LV был устойчивым против IVIG при всех использованных концентрациях и, таким образом, должен быть по меньшей мере в 10000 раз менее чувствительным против человеческого иммуноглобулина, чем соответствующий вектор на основе MV (Фиг.
25 10). Данные результаты показывают то, что нацеленные на рецептор векторы на основе гликопротеинов NiV не будут нейтрализованы при инъекции человеку.
Следовательно, из-за вышеописанных характеристик NiV-G псевдотипы NiV использовали далее для получения экспонирующих цитокин, нацеленных на CD8 частиц. Здесь С08-специфичный scFv, происходящий из ОКТ8, экспонировался на
30 NiV-GA34mut4 с получением оболочечной плазмиды pCG-Gmut-CD8scFv, а человеческий IL7 экспонировался на NiV-GA34mut4 с получением оболочечной плазмиды pCG-Gmut-IL7. Для того чтобы получить 8G/IL7G-LV, для трансфекции клеток НЕК293Т в одном флаконе Т175 использовали 0,45 мкг pCG-Gmut-CD8scFv, 0,45 мкг pCG-Gmut-IL7, 4,7 мкг pCG-FcA22, 14,4 мкг упаковывающей плазмиды на
35 основе ВИЧ-1 pCMVAR8.9 и 15,1 мкг плазмид для переноса на основе LV. Для LV
были получены титры порядка 107 tu/мл, а для VLP были получены титры порядка 1,5 мкг р24/мл.
Аналогично тому, что было достигнуто посредством 4H/IL7H-LV, 8G/IL7G-LV (содержащий белки последовательности SEQ ID NO: 4, 6 и 16) мог селективно 5 стимулировать и трансдуцировать Т-клетки CD8+ в смеси периферической крови. Как показано на Фиг. 11, при инкубации свежевыделенных человеческих Т-клеток CD3+ с 8G/IL7G-LV в течение 3 суток не только поднаборы Т-клеток CD8+ в культуре демонстрировали повышающую регуляцию экспрессии CD71, но также только эта популяция клеток эффективно экспрессировала репортерный трансген GFP (Фиг. 10 12) или терапевтический трансген CAR19 (Фиг. 13). Кроме того, по сравнению с родительским 11_7-дефицитным, нацеленным на CD8 LV (8G-LV), 8G/IL7G-LV был более эффективным в активации клеток-мишеней и доставке трансгенов без нарушения специфичности трансдукции Т-клеток CD8+.
15 Пример 4: идентификация оптимального отношения нацеливающих на
CD8 NiV-G к экспонирующим IL7 NiV-G
Для того чтобы задействовать больше клеток-мишеней, улучшить титр и увеличить специфичность частиц в отношении селективной активации и трансдукции отличной популяции клеток при максимальном уменьшении эффекта 20 вне мишени, протокол трансфекции дополнительно оптимизируется в отношении продукции вектора, и тщательно определяются количества плазмид, кодирующих
^нацеливающий домен (|/|ЛИ MV | |нацеливаю!_ций домену ^ NiV 0ФУнкЧионапьнь|и домен (|у]\/
функциональный домену СОХрЭНЯЮЩИХСЯ В упаКОВЫВЭЮЩИХ КЛеТКЭХ.
Для получения G8/GIL7-LV, как описано в Примере 3, для трансфекции клеток 25 НЕК293 в одном флаконе Т175 использовали общие количества плазмид pCG-Gmut 0,9 мкг, наряду с 4,7 мкг pCG-FcA22, 14,4 мкг упаковывающей плазмиды на основе ВИЧ-1 pCMVAR8.9 и 15,1 мкг pSEW. Тем временем плазмиды pCG-Gmut-CD8scFv и pCG-Gmut-IL7 смешиваются в разных соотношениях: 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 или 1:5. Соответствующие супернатанты клеток, содержащие 8G/IL7G-LV, 30 использовали для трансдукции клеток CD8+ Molt или А301, и через 48 ч после трансдукции процентная доля клеток GFP+ измеряется посредством FACS для расчета титров. Кроме того, 8G/IL7G-LV используются для трансдукции свежевыделенных Т-клеток CD3+, и затем определяется экспрессия CD71 и GFP в клетках CD8+ и CD8". Идентифицируется наилучшее соотношение, как дающее 35 наивысший титр, наивысшую экспрессию CD71 и GFP в целевой популяции и наименьшую экспрессию в нецелевой популяции.
Пример 5: характеристика трансдуцированных покоящихся Т-клеток посредством экспонирующих IL7, нацеленных VLP и LV
Компартменты Т-клеток являются высокогетерогенными, и поднаборы Т-5 клеток являются фенотипически и функционально отличными. Когда речь идет о Т-клеточной терапии рака, менее дифференцированные клетки обычно коррелируют с лучшим противоопухолевым эффектом in vivo. Следовательно, важно идентифицировать поднаборы Т-клеток, которые активируются или модифицируются векторными частицами согласно изобретению. Например, беря
10 8G/IL7G-LV-CAR, следует охарактеризовать фенотипы трансдуцированных покоящихся Т-клеток по сравнению с трансдуцированными предстимулированными Т-клетками (с применением шире всего используемого протокола стимуляции CD3/CD28). Вкратце, через 3 суток после трансдукции покоящихся или предстимулированных Т-клеток CD3+ отслеживается экспрессия многочисленных
15 маркеров Т-клеток, включающих CD11a, CD11b, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CD71, CD95, CD127 и CCR7. Данные молекулы выбираются, так как их использовали в прошлом для дифференциации следующих Т-клеток: CD45RA+CD45R0"CD62LBblC0Ka"CD95-CD27BblC0Ka"CCR7BblC0Ka" наивные (TN), CD45RA+CD45R0"CD62LBblC0Ka"CD95+CD27BblC0Ka"CCR7BblC0Ka" стволовые клетки
20 памяти (TSCM), CD45RA"CD45R0BblC0Ka*CD62L+CD95+CD27+ центральные памяти (Тем), CD45RA"/+CD45R0BblC0Ka*CD62L"CD95+CD27"/+CCR7" эффекторные памяти (ТЕМ) И CD45RA"/+CD45R0+CD62L"CD95BblC0Ka*CD27"CD28"CCR7" эффекторные (ТЕ). Фенотипы Т-клеток CAR+ анализируются посредством проточной цитометрии.
Кроме того, поднаборы предсортированных Т-клеток CD4+ (TSCM, ТСМ, ТЕМ И
25 ТЕ) инкубируются, например, с 4H/IL7H-VLP для демонстрации преимуществ настоящего изобретения в отношении активации Т-клеток по сравнению с традиционной стимуляцией TCR. Вкратце, после 3 суток инкубации с 4H/IL7H-VLP или стимуляции антителами против CD3/CD28 вышеуказанные поднаборы Т-клеток анализируются на отклонение фенотипа и уровни активации. Ожидается то, что
30 экспонирующие IL7, нацеленные на Т-клетки векторные частицы активируют и транедуцируют менее дифференцированные Т-клетки.
Пример 6: усиление функции полученных ex vivo Т-клеток с CAR и упрощение методики получения Т-клеток с CAR
35 Было продемонстрировано то, что адоптивная Т-клеточная иммунотерапия
является эффективной клинической схемой для лечения разных типов
заболеваний. Однако ее более широкое применение было ограничено несколькими проблеммами. С одной стороны, получение Т-клеток со сконструированным CAR или со сконструированным TCR является очень дорогим и трудозатратным из-за стимулирования in vitro, долговременного размножения и выделения, и очистки 5 клеток. С другой стороны, эффекторные Т-клетки, которые были размножены in vitro, часто плохо выживают in vivo и не могут демонстрировать поддерживающийся противоопухолевый эффект. Согласно настоящему изобретению предложены потенциальные решения для данных вызовов посредством объединения стимуляции клеток и переноса генов в одной стадии и
10 обеспечения трансдукции покоящихся Т-клеток. С использованием данного изобретения способ получения Т-клеток может быть значительно упрощен, следовательно, уменьшая затраты на изготовление Т-клеток. Кроме того, по сравнению с традиционно получаемыми клетками, Т-клетки со сконструированными CAR/TCR, полученные посредством настоящего изобретения,
15 могут быть более эффективными in vivo из-за потенциала эффективного конструирования менее дифференцированных клеток, как продемонстрировано в Примере 5.
Для демонстрации данных характеристик, свежевыделенные человеческие РВМС или Т-клетки CD8+ трансдуцируются, например, 8G/IL7G-LV-CAR или VSV-LV-
20 CAR в качестве контроля. Тем временем, параллельно получают традиционные Т-клетки с CAR согласно наиболее широко применяемому протоколу. Вкратце, выделенные человеческие РВМС или Т-клетки CD8+ от того же самого донора стимулируются антителами против CD3/CD28 и IL2. Затем клетки трансдуцируются 8G/IL7G-LV-CAR или VSV-LV-CAR, с последующими 10 сутками размножения в
25 присутствии IL2. Через 2-3 суток после трансдукции вектором покоящихся Т-клеток или через 12 суток после трансдукции стимулированных Т-клеток данные клетки сокультивируются с опухолевыми клетками-мишенями in vitro или инфундируются гуманизированной мыши, несущей опухоль. Затем оцениваются лизис опухолевых клеток in vitro и ремиссия опухоли in vivo, выживание животного, выживаемость и
30 пролиферация реагирующих на опухоль Т-клеток.
Пример 7: селективная активация и трансдукция экспонирующими IL7, нацеленными частицами в in wVo-подобных условиях
На следующей стадии исследуется возможность применения вирусных 35 частиц для нацеливания и функциональной модификации отдельных клеток в ситуациях in vivo. Таким образом, проводится трансдукция свежей человеческой
периферической крови вирусными частицами, например, G7G -LV. Это
обеспечивает оценку целевой активации и переноса генов в популяцию Т-клеток
CD8+ в присутствии активной системы человеческого комплемента - препятствия, с
которым вирусные частицы сталкиваются in vivo.
5 Вкратце, свежая периферическая кровь инкубируется с 8G/IL7G-LV-GFP или
другими контрольными векторами (VSV-LV, 8H/IL7H-LV, 8G-LV или VSV/IL7G-LV) в течение 6-8 ч. Затем общие РВМС выделяют из крови и дополнительно культивируют в культуральной среде для Т-клеток без добавления каких-либо стимулирующих реактивов. Через 3-4 суток клетки CD8+ и CD8" в культуре 10 оцениваются на экспрессию CD71 и GFP. Для подтверждения стабильного переноса генов, маленькая фракция клеток переносится в культуральную среду, дополненную антителами против CD3/CD28 и IL2 на 3 дополнительных суток перед анализом процентных содержаний клеток GFP+.
15 Пример 8: экспонирующие IL7, нацеленные частицы селективно
активируют и трансдуцируют циркулирующие покоящиеся Т-клетки в гуманизированных мышинных моделях
Для того чтобы продемонстрировать то, что частицы согласно изобретению способны к локальному или системному применению in vivo для обеспечения
20 специфичной для типа клеток активации или модификации, их применяли у мышей с пересаженными человеческими CD34+ гематопоэтическими стволовыми клетками (HSC) от здоровых доноров. В данной мышиной модели могут быть получены человеческие гематопоэтические клетки многих линий, и данные клетки переносятся мышиным хозяином.
25 Здесь в качестве примера берется применение С8АЗ"~7-псевдотипированных
частиц для активации и модификации человеческих Т-клеток CD8+. Вкратце, после подтверждения того, что человеческая иммунная система была успешно установлена посредством выявления около 10% человеческих Т-клеток CD3+, С8АЗ"~7-псевдотипированные частицы системно применяются посредством
30 внутривенной инъекции (в.в.) или локально посредством внутриселезеночной или внутритимусной инъекции. G8/GIL7-VLP инъецируется для оценки возможности селективной активации человеческих Т-клеток CD8+ in vivo. В данной экспериментальной постановке уровень/продолжительность активации и пролиферация Т-клеток CD8+ анализируются в разные моменты времени после
35 инъекции VLP. G8/GIL7-LV-GFP инъецируется для оценки функции доставки генов in vivo. В данной постановке эксперимента в разные моменты времени после
инъекции LV анализируются экспрессия GFP, фенотипы трансдуцированных клеток, их пролиферация и выживание. G8/GIL7-LV-CAR инъецируется для оценки возможности доставки терапевтического гена и получения in vivo Т-клеток с CAR. В данной постановке эксперимента в разные моменты времени после инъекции LV 5 анализируются экспрессия CAR, фенотипы трансдуцированных клеток, пролиферация и выживание трансдуцированных клеток в присутствии/отсутствие опухолевых клеток/антигенов-мишеней, устранение местной/системной опухоли.
Пример 9: селективная активация Т-клеток CD4+ макака-резуса
10 Т-клетки примата, не являющегося человеком (NHP), являются
фенотипически сходными с человеческими Т-клетками, делая их наилучшей животной моделью человеческого иммунитета и иммунотерапий. Что касается Т-клеточной терапии, модель NHP могла бы быть более надежной в прогнозировании эффекта, дозировки, путей применения и безопасности
15 потенциальных лекарственных средств. Следовательно, весьма желательным является средство для специфичной модификации или индукции функционального изменения в отдельном типе клеток у NHP.
Здесь в качестве примера подробно описываются вектор 4H/IL7H-SIV и его применение для макака-резуса. Во-первых, в качестве нацеливающего домена,
20 экспонируемого на белке Hmut (H-CD4057 2), используется С04-специфичный DARPin57.2 (CD40572) макака-резуса, а в качестве функционального домена, экспонируемого на Hmut (H-rmlL7), используется IL7, реактивный у макака-резуса. Затем два вышеописанных белка Н, например, в соотношениях, определенных в Примере 4, используются для псевдотипирования LV, полученного из вируса
25 иммунодефицита обезьян mac 251 (SIVmac251). После определения выхода вектора и титров посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) P27/Nano-sight и трансдукции обезьяньих клеток CD4+, свежевыделенные обезьяньи Т-клетки CD3+ трансдуцируются 4H/IL7H-SIV, доставляющим GFP или CAR. Затем определяли маркеры активации и экспрессии трансгенов в Т-клетках
30 CD4+ по сравнению с CD4", как описано выше. Затем в моделях NHP оценивается возможность применения in vivo. С этой целью одна доза векторов медленно инъецируется в два подмышечных лимфатических узла каждого из зарегестрированных животных (например, макака-резуса). Через одну неделю после инъекции отбираются образцы крови, и один из двух подвергнутых инъекции
35 лимфатических узлов удаляется посредством хирургии и разъединяется на суспензии одиночных клеток. Проводится подробный анализ для определения
фенотипов, специфичной активации, уровней экспрессии трансгена и/или функции (при доставке терапевтического трансгена) Т-клеток, трансдуцированных in vivo. Кроме того, второй лимфатический узел получает вторую дозу того же самого вектора, и зарегестрированные животные отслеживаются в течение шести месяцев 5 для оценки пролиферации, жизнеспособности и/или функции (при доставке терапевтического трансгена) Т-клеток, трансдуцированных in vivo.
Пример 10: селективно активные и размноженные антигенспецифичные Т-клетки в иммунокомпетентной мышиной модели
10 Потенциал нацеливания цитокина для функционирования в месте
заболевания, при избегании системной токсичности, может быть хорошо оценен в модели меланомной опухоли иммунокомпетентных мышей. В качестве примера берется VLP, нацеленная на мышиный CD8, экспонирующая IL12 (m8G/mll_12G-VLP). Предыдущие исследования показали то, что применение IL12 может
15 усиливать толерантность и противоопухолевую эффективность перенесенных Т-клеток, реагирующих на опухоль, но является очень токсичным системно. Для преодоления данного недостатка в исследовании авторов изобретения для контроля функции IL12 в местах опухоли используется m8G/mlL12G-VLP. Мышам дикого типа C57/BI6 трансплантируют меланомные клетки B16/OVA, после
20 развития опухоли мышей обрабатывают радиацией и переносят Т-клетки, выделенные у трансгенных мышей C57/BI6 OT-I. После трансплантации Т-клеток OT-I мышей обрабатывают m8G/mlL12G-VLP или мышиным IL12, или PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в качестве контролей посредством в.в. инъекции. Анализируются объем опухоли, выживаемость in vivo, функция Т-клеток
25 OT-I и выживание мышей.
Пример 11: целевая активация человеческих Т-клеток CD4+ in vivo
Для того чтобы оценить эффективность in vivo MV-4H/IL7H-LVs в отношении активации человеческих Т-клеток CD4+, мышам NOD/SCID gc-/- (NSG)
30 пересаживали Т-клетки пупочной крови CD3+. Восстановление человеческими Т-клетками определяли в крови еженедельно. При выявлении 20% пТ-клеток (человеческих Т-клеток) (% клеток hCD3+ / общее количество клеток hCD45++mCD45+), мышам в.в. инъецировали 1Е6 IU MV-4H/IL7H-LV или MV-4H-LV. Через две недели после инъекции векторов мышей умерщвляли, и выделяли
35 спленоциты и одноядерные клетки периферической крови. Примечательно то, что была обнаружена более сильная специфичная для IL-7 активация, выявленная
посредством позднего маркера активации CD71 человеческих Т-клеток CD4+, в случае MV-4H/IL7H-LV (25% клеток CD4+ CD71+) по сравнению с MV-4H-LV (8% клеток CD4+ CD71+) (Фиг. 14). Кроме того, Т-клетки CD4-, которые представляют собой Т-клетки CD8+, демонстрируют идентичную экспрессию CD71 для обоих 5 нацеливающих векторов. Последнее подчеркивает то, что сигнализация выживания IL-7 активировала только целевые Т-клетки CD4+, а не клетки CD8+.
В заключение, наряду со специфичной активацией in vitro клеток-мишеней, достигаемой с использованием MV-4H/IL7H-LV, специфичная активация Т-клеток CD4+ посредством MV-4H/IL7H-LV была подтверждена in vivo в мышиной модели 10 человеческой кровеносной системы.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON (ENS LYON)
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) Universitй Claude Bernard Lyon 1 (UCBL)
INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
<120> СПОСОБЫ СЕЛЕКТИВНОЙ МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ОТДЕЛЬНЫХ
ПОДТИПОВ КЛЕТОК
<130> BET 17L1339
<150> EP16305468.7
<151> 2016-04-21
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2217
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный и мутировавший белок Н MV (Y481A, R533A, S548L, F549S)
(HcДельта18), слитый со сконструированным белком с анкириновыми повторами (DARPin)-29.2, специфичным в отношении человеческого CD4
<220> <221> <222>
CDS
(1)..(2217)
<400> 1
atg gga agt agg ata gtc att aac aga gaa cat ctt atg att gat aga
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
cct tat gtt ttg ctg gct gtt ctg ttt gtc atg ttt ctg agc ttg atc
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser Leu Ile
20 25 30
ggg ttg cta gcc att gca gga att cga ctt cat cgg gca gcc atc tac
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
144
acc gca gag atc cat aaa agc ctc agc acc aat cta gat gta act aac
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
192
tca atc gag cat cag gtc aag gac gtg ctg aca cca ctc ttc aaa atc
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
240
atc ggt gat gaa gtg ggc ctg agg aca cct cag aga ttc act gac cta
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
288
gtg aaa ttc atc tct gac aag att aaa ttc ctt aat ccg gat agg gag Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
336
tac gac ttc aga gat ctc act tgg tgt atc aac ccg cca gag aga atc
384
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
aaa ttg gat tat gat caa tac tgt gca gat gtg gct gct gaa gag ctc 432
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
atg aat gca ttg gtg aac tca act cta ctg gag acc aga aca acc aat 480
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
cag ttc cta gct gtc tca aag gga aac tgc tca ggg ccc act aca atc 528
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
aga ggt caa ttc tca aac atg tcg ctg tcc ctg tta gac ttg tat tta 576 Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
ggt cga ggt tac aat gtg tca tct ata gtc act atg aca tcc cag gga 624
Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
atg tat ggg gga act tac cta gtg gaa aag cct aat ctg agc agc aaa 672
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
agg tca gag ttg tca caa ctg agc atg tac cga gtg ttt gaa gta ggt 720
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
gtt atc aga aat ccg ggt ttg ggg gct ccg gtg ttc cat atg aca aac 768
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
tat ctt gag caa cca gtc agt aat gat ctc agc aac tgt atg gtg gct 816
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
ttg ggg gag ctc aaa ctc gca gcc ctt tgt cac ggg gaa gat tct atc 864 Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
aca att ccc tat cag gga tca ggg aaa ggt gtc agc ttc cag ctc gtc 912
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
aag cta ggt gtc tgg aaa tcc cca acc gac atg caa tcc tgg gtc ccc 960
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
tta tca acg gat gat cca gtg ata gac agg ctt tac ctc tca tct cac 1008 Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
aga ggt gtt atc gct gac aac caa gca aaa tgg gct gtc ccg aca aca 1056
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
cga aca gat gac aag ttg cga atg gag aca tgc ttc caa cag gcg tgt 1104
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
aag ggt aaa atc caa gca ctc tgc gag aat ccc gag tgg gca cca ttg
1152
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
aag gat aac agg att cct tca tac ggg gtc ttg tct gtt gat ctg agt 1200 Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
ctg aca gtt gag ctt aaa atc aaa att gct tcg gga ttc ggg cca ttg 1248
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
atc aca cac ggt tca ggg atg gac cta tac aaa tcc aac cac aac aat 1296
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
gtg tat tgg ctg act atc ccg cca atg aag aac cta gcc tta ggt gta 1344
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
atc aac aca ttg gag tgg ata ccg aga ttc aag gtt agt ccc gca ctc 1392
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Ala Leu
450 455 460
ttc act gtc cca att aag gaa gca ggc gga gac tgc cat gcc cca aca 1440
Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Gly Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
tac cta cct gcg gag gtg gat ggt gat gtc aaa ctc agt tcc aat ctg 1488 Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
gtg att cta cct ggt caa gat ctc caa tat gtt ttg gca acc tac gat 1536
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
act tcc gcg gtt gaa cat gct gtg gtt tat tac gtt tac agc cca agc 1584
Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Ser
515 520 525
cgc cta tcg tct tac ttt tat cct ttt agg ttg cct ata aag ggg gtc 1632 Arg Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
ccc atc gaa tta caa gtg gaa tgc ttc aca tgg gac caa aaa ctc tgg 1680
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
tgc cgt cac ttc tgt gtg ctt gcg gac tca gaa tct ggt gga cat atc 1728
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
act cac tct ggg atg gtg ggc atg gga gtc agc tgc aca gtc acc cgg 1776
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
gaa gat gga acc aat gcg gcc cag ccg gcc gac ctg ggt aag aaa ctg 1824
Glu Asp Gly Thr Asn Ala Ala Gln Pro Ala Asp Leu Gly Lys Lys Leu
595 600 605
ctg gaa gct gct cgt gct ggt cag gac gac gaa gtt cgt atc ctg atg 1872
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met
610 615 620
gct aac ggt gct gac gtt aac gct act gac act ctt ggt cgt act ccg
1920
Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr Asp Thr Leu Gly Arg Thr Pro
625 630 635 640
cta cac ctg gct gct cag aat ggt cac ctg gaa atc gtt gaa gtt ctg 1968
Leu His Leu Ala Ala Gln Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
645 650 655
ctg aag cac agt gct gac gtt aac gct att gaa gag gtt ggt atg act 2016
Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Ile Glu Glu Val Gly Met Thr
660 665 670
ccg ctg cac ctg gct gtt gtt gct ggt cac ctg gaa atc gtt gaa gtt 2064
Pro Leu His Leu Ala Val Val Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
675 680 685
ctg ctg aag aac ggt gct gac gtt aac gct cag gac aaa ttc ggt aag 2112
Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys
690 695 700
acc gct ttc gac atc tcc atc gac tac ggt aac gag gac ctg gct gaa 2160
Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Tyr Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu
705 710 715 720
atc ctg caa aag ctt aat gcg gcc gca aga ggt tct cat cac cat cac 2208
Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Ala Arg Gly Ser His His His His
725 730 735
cat cac taa 2217
His His
<210> 2
<211> 738
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser Leu Ile
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Ala Leu
450 455 460
Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Gly Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Ser
515 520 525
Arg Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
Glu Asp Gly Thr Asn Ala Ala Gln Pro Ala Asp Leu Gly Lys Lys Leu
595 600 605
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met
610 615 620
Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr Asp Thr Leu Gly Arg Thr Pro
625 630 635 640
Leu His Leu Ala Ala Gln Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
645 650 655
Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Ile Glu Glu Val Gly Met Thr
660 665 670
Pro Leu His Leu Ala Val Val Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
675 680 685
Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys
690 695 700
Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Tyr Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu
705 710 715 720
Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Ala Arg Gly Ser His His His His
725 730 735
His His
<210> 3
<211> 2529
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный и мутировавший (E501A, W504A, Q530A, E533A) белок G NiV
^^ельта34), слитый с одноцепочечным антителом, направленным на человеческий
CD8 (scFvC8-Vh1), связанный с дополнительным (G4S)3 линкером
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2529)
<400> 3
atg aag aag atc aac gag ggc ctg ctg gac agc aag atc ctg agc gcc 48 Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
ttc aac acc gtg atc gcc ctg ctg ggc agc atc gtg atc Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile 20 25
att gtg atg
Ile Val Met 30
aac atc atg atc atc cag aac tac acc aga agc acc gac aac cag gcc 144
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
gtg atc aag gac gct ctc cag ggg atc cag cag cag atc aag ggc ctg 192
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
gcc gac aag atc ggc acc gag atc ggc ccc aag gtg tcc ctg atc gac 240
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
acc agc agc acc atc acc atc ccc gcc aac atc ggc ctg ctg ggg tcc 288
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
aag atc agc cag agc acc gcc agc atc aac gag aac gtg aac gag aag 336
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
tgc aag ttc acc ctg ccc ccc ctg aag atc cac gag tgc aac atc agc 384
Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
tgc ccc aac ccc ctg ccc ttc cgg gag tac cgg ccc cag acc gag ggc 432
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
gtg agc aac ctg gtc ggc ctg ccc aac aac atc tgc ctg cag aaa acc 480
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
agc aac cag atc ctg aag ccc aag ctc att tcc tac acc ctg ccc gtg 528
Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
gtg ggc cag agc ggc acc tgc atc acc gac ccc ctg ctg gcc atg gac 576
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
gag ggc tac ttc gcc tac agc cac ctg gaa cgg atc ggc agc tgc agc 624
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
agg ggc gtg tcc aag cag cgg atc atc ggc gtg ggc gag gtg ctg gac 672
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
cgg ggc gac gag gtg ccc agc ctg ttc atg acc aac gtg tgg acc ccc 720
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
ccc aac ccc aac acc gtg tac cac tgc agc gcc gtg tac aac aac gag 768
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
ttc tac tac gtg ctg tgc gcc gtg agc acc gtg ggc gac ccc atc ctg 816
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
aac agc acc tac tgg tcc ggc agc ctg atg atg acc cgg ctg gcc gtg 864
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
aag cct aag agc aat ggc ggc gga tac aac cag cac cag ctg gcc ctg 912
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
cgg agc atc gag aag ggc aga tac gac aaa gtg atg ccc tac ggc ccc 960
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
agc ggc atc aag cag ggc gac aca ctg tac ttc ccc gcc gtg ggc ttc 1008
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
ctg gtc cgg acc gag ttc aag tac aac gac agc aac tgc ccc atc acc 1056
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
aag tgc cag tac agc aag ccc gag aac tgc aga ctg agc atg ggc atc 1104
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
cgg ccc aac agc cac tac atc ctg cgg agc ggc ctg ctg aag tac aac 1152
Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
ctg agc gac ggc gag aac ccc aaa gtc gtc ttt att gag atc agc gac 1200
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
cag cgg ctg tcc atc ggc agc ccc agc aag atc tac gac agc ctg ggc 1248
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
cag ccc gtg ttc tac cag gcc agc ttc agc tgg gac acc atg atc aag 1296
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
ttc ggc gac gtg ctg acc gtg aac ccc ctg gtg gtg aac tgg cgg aac 1344
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
aat acc gtg atc agc aga ccc ggc cag agc cag tgc ccc cgg ttc aac 1392
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
acc tgc ccc gcg atc tgc gcg gag ggc gtg tac aac gac gcc ttc ctg 1440
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
atc gac cgg atc aac tgg atc tct gcc ggc gtg ttc ctg gac tcc aac 1488
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
gcg acc gcc gcg aat ccc gtg ttc acc gtg ttt aag gac aac gag atc 1536
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
ctg tac cgg gcc cag ctg gcc agc gag gac acc aac gcc cag aaa acc 1584
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
atc acc aac tgc ttt ctg ctg aag aac aag atc tgg tgc atc agc ctg 1632
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
gtg gag atc tac gat acc ggc gac aac gtg atc agg ccc aag ctg ttc 1680
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
gcc gtg aag atc ccc gag cag tgc acc ggt gga ggt ggc tct ggt gga 1728
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
565 570 575
gga ggc tct gga ggt ggt gga tca gcg gcc cag ccg gcc cag gtg cag 1776
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gln Pro Ala Gln Val Gln
580 585 590
ctg gtg cag agc gga gcc gag gat aag aaa cct ggc gct agc gtg aag 1824
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Asp Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
595 600 605
gtg tcc tgc aag gcc agc ggc ttc aac atc aag gac acc tac atc cac 1872
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
610 615 620
tgg gtg cgc cag gct cca gga cag ggc ctg gaa tgg atg ggc cgg atc 1920
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile
625 630 635 640
gac ccc gcc aac gac aac acc ctg tac gcc agc aag ttc cag ggc aga 1968
Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Gly Arg
645 650 655
gtg acc atc acc gcc gac acc agc agc aac acc gcc tac atg gaa ctg 2016
Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu
660 665 670
agc agc ctg aga agc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt ggc aga ggc 2064
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly
675 680 685
tac ggc tac tac gtg ttc gac cac tgg ggc cag ggc acc acc gtg aca 2112
Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
690 695 700
gtg tct agc ggc gga ggc gga agt gga ggc gga gga agc gga ggc ggc 2160
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
705 710 715 720
gga tcc gac atc gtg atg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc 2208
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
725 730 735
gtg ggc gac cgc gtg acc att acc tgc cgg acc agc cgg tcc atc agc 2256
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser
740 745 750
cag tac ctg gcc tgg tat cag gaa aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg 2304
Gln Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
755 760 765
ctg atc tac agc ggc agc acc ctg cag agc ggc gtg cca agc aga ttc 2352
Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
770 775 780
agc ggc agc ggc tcc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg 2400
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
785 790 795 800
cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag cac aac gag aac 2448
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn
805 810 815
ccc ctg acc ttc ggg cag gga aca aag gtg gag atc aag aga gcg gcc 2496
Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala
820 825 830
gca aga ggt tct cat cac cat cac cat cac taa 2529
Ala Arg Gly Ser His His His His His His 835 840
<210> 4
<211> 842
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420
425
430
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gln Pro Ala Gln Val Gln
580 585 590
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Asp Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
595 600 605
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
610 615 620
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile
625 630 635 640
Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Gly Arg
645 650 655
Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu
660 665 670
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly
675 680 685
Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
690 695 700
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
705 710 715 720
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
725 730 735
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser
740 745 750
Gln Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
755 760 765
Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
770 775 780
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
785 790 795 800
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn
805 810 815
Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala
820 825 830
Ala Arg Gly Ser His His His His His His 835 840
<210> 5
<211> 2211
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный и мутировавший (E501A, W504A, Q530A, E533A) белок G NiV
^^ельта34), слитый с IL-7
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2211)
<400> 5
atg aag aag atc aac gag ggc ctg ctg gac agc aag atc ctg agc gcc 48 Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
ttc aac acc gtg atc gcc ctg ctg ggc agc atc gtg atc att gtg atg
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
aac atc atg atc atc cag aac tac acc aga agc acc gac aac cag gcc 144
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
gtg atc aag gac gct ctc cag ggg atc cag cag cag atc aag ggc ctg 192
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
gcc gac aag atc ggc acc gag atc ggc ccc aag gtg tcc ctg atc gac 240
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
acc agc agc acc atc acc atc ccc gcc aac atc ggc ctg ctg ggg tcc 288
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
aag atc agc cag agc acc gcc agc atc aac gag aac gtg aac gag aag 336
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
tgc aag ttc acc ctg ccc ccc ctg aag atc cac gag tgc aac atc agc 384 Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
tgc ccc aac ccc ctg ccc ttc cgg gag tac cgg ccc cag acc gag ggc 432
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
gtg agc aac ctg gtc ggc ctg ccc aac aac atc tgc ctg cag aaa acc 480
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
agc aac cag atc ctg aag ccc aag ctc att tcc tac acc ctg ccc gtg 528 Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
gtg ggc cag agc ggc acc tgc atc acc gac ccc ctg ctg gcc atg gac 576
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
gag ggc tac ttc gcc tac agc cac ctg gaa cgg atc ggc agc tgc agc 624
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
agg ggc gtg tcc aag cag cgg atc atc ggc gtg ggc gag gtg ctg gac 672
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
cgg ggc gac gag gtg ccc agc ctg ttc atg acc aac gtg tgg acc ccc 720
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
ccc aac ccc aac acc gtg tac cac tgc agc gcc gtg tac aac aac gag 768
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
ttc tac tac gtg ctg tgc gcc gtg agc acc gtg ggc gac ccc atc ctg 816
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
aac agc acc tac tgg tcc ggc agc ctg atg atg acc cgg ctg gcc gtg
864
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
aag cct aag agc aat ggc ggc gga tac aac cag cac cag ctg gcc ctg 912
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
cgg agc atc gag aag ggc aga tac gac aaa gtg atg ccc tac ggc ccc 960
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
agc ggc atc aag cag ggc gac aca ctg tac ttc ccc gcc gtg ggc ttc 1008
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
ctg gtc cgg acc gag ttc aag tac aac gac agc aac tgc ccc atc acc 1056
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
aag tgc cag tac agc aag ccc gag aac tgc aga ctg agc atg ggc atc 1104
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
cgg ccc aac agc cac tac atc ctg cgg agc ggc ctg ctg aag tac aac 1152 Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
ctg agc gac ggc gag aac ccc aaa gtc gtc ttt att gag atc agc gac 1200
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
cag cgg ctg tcc atc ggc agc ccc agc aag atc tac gac agc ctg ggc 1248
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
cag ccc gtg ttc tac cag gcc agc ttc agc tgg gac acc atg atc aag 1296
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
ttc ggc gac gtg ctg acc gtg aac ccc ctg gtg gtg aac tgg cgg aac 1344
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
aat acc gtg atc agc aga ccc ggc cag agc cag tgc ccc cgg ttc aac 1392
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
acc tgc ccc gcg atc tgc gcg gag ggc gtg tac aac gac gcc ttc ctg 1440
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
atc gac cgg atc aac tgg atc tct gcc ggc gtg ttc ctg gac tcc aac 1488
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
gcg acc gcc gcg aat ccc gtg ttc acc gtg ttt aag gac aac gag atc 1536
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
ctg tac cgg gcc cag ctg gcc agc gag gac acc aac gcc cag aaa acc 1584
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
atc acc aac tgc ttt ctg ctg aag aac aag atc tgg tgc atc agc ctg
1632
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
gtg gag atc tac gat acc ggc gac aac gtg atc agg ccc aag ctg ttc 1680
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
gcc gtg aag atc ccc gag cag tgc acc ggt atg gcc gat tgt gat att 1728
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr Gly Met Ala Asp Cys Asp Ile
565 570 575
gaa ggt aaa gat ggc aaa caa tat gag agt gtt cta atg gtc agc atc 1776
Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile
580 585 590
gat caa tta ttg gac agc atg aaa gaa att ggt agc aat tgc ctg aat 1824 Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn
595 600 605
aat gaa ttt aac ttt ttt aaa aga cat atc tgt gat gct aat aag gaa 1872
Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu
610 615 620
ggt atg ttt tta ttc cgt gct gct cgc aag ttg agg caa ttt ctt aaa 1920
Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys
625 630 635 640
atg aat agc act ggt gat ttt gat ctc cac tta tta aaa gtt tca gaa 1968
Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu
645 650 655
ggc aca aca ata ctg ttg aac tgc act ggc cag gtt aaa gga aga aaa 2016
Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys
660 665 670
cca gct gcc ctg ggt gaa gcc caa cca aca aag agt ttg gaa gaa aat 2064
Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn
675 680 685
aaa tct tta aag gaa cag aaa aaa ctg aat gac ttg tgt ttc cta aag 2112 Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys
690 695 700
aga cta tta caa gag ata aaa act tgt tgg aat aaa att ttg atg ggc 2160
Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly
705 710 715 720
act aaa gaa cac gcg gcc gca aga ggt tct cat cac cat cac cat cac 2208
Thr Lys Glu His Ala Ala Ala Arg Gly Ser His His His His His His
725 730 735
taa 2211
<210> 6
<211> 736
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 6
Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr Gly Met Ala Asp Cys Asp Ile
565 570 575
Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile
580 585 590
Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn
595 600 605
Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu
610 615 620
Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys
625 630 635 640
Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu
645 650 655
Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys
660 665 670
Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn
675 680 685
Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys
690 695 700
Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly
705 710 715 720
Thr Lys Glu His Ala Ala Ala Arg Gly Ser His His His His His His
725 730 735
<210> 7
<211> 2229 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный и мутировавший (E501A, W504A, Q530A, E533A) белок G NiV
^^ельта34), слитый со сконструированным белком (DARPin),
направленным против человеческого EpCAM
с анкириновыми повторами
<220>
<221> CDS <222> (1)..(2229)
<400> 7
atg aag aag atc aac gag ggc ctg ctg gac agc aag atc ctg agc gcc 48 Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
ttc aac acc gtg atc gcc ctg ctg ggc agc atc gtg atc att gtg atg 96
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
aac atc atg atc atc cag aac tac acc aga agc acc gac aac cag gcc 144
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
gtg atc aag gac gct ctc cag ggg atc cag cag cag atc aag ggc ctg 192
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
gcc gac aag atc ggc acc gag atc ggc ccc aag gtg tcc ctg atc gac 240
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
acc agc agc acc atc acc atc ccc gcc aac atc ggc ctg ctg ggg tcc 288
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
aag atc agc cag agc acc gcc agc atc aac gag aac gtg aac gag aag 336
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
tgc aag ttc acc ctg ccc ccc ctg aag atc cac gag tgc aac atc agc 384 Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
tgc ccc aac ccc ctg ccc ttc cgg gag tac cgg ccc cag acc gag ggc 432
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
gtg agc aac ctg gtc ggc ctg ccc aac aac atc tgc ctg cag aaa acc 480
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
agc aac cag atc ctg aag ccc aag ctc att tcc tac acc ctg ccc gtg 528 Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
gtg ggc cag agc ggc acc tgc atc acc gac ccc ctg ctg gcc atg gac 576
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
gag ggc tac ttc gcc tac agc cac ctg gaa cgg atc ggc agc tgc agc 624
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
agg ggc gtg tcc aag cag cgg atc atc ggc gtg ggc gag gtg ctg gac
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
cgg ggc gac gag gtg ccc agc ctg ttc atg acc aac gtg tgg acc ccc 720
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
ccc aac ccc aac acc gtg tac cac tgc agc gcc gtg tac aac aac gag 7 68
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
ttc tac tac gtg ctg tgc gcc gtg agc acc gtg ggc gac ccc atc ctg 816
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
aac agc acc tac tgg tcc ggc agc ctg atg atg acc cgg ctg gcc gtg 864
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
aag cct aag agc aat ggc ggc gga tac aac cag cac cag ctg gcc ctg 912
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
cgg agc atc gag aag ggc aga tac gac aaa gtg atg ccc tac ggc ccc 960
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
agc ggc atc aag cag ggc gac aca ctg tac ttc ccc gcc gtg ggc ttc 1008
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
ctg gtc cgg acc gag ttc aag tac aac gac agc aac tgc ccc atc acc 1056
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
aag tgc cag tac agc aag ccc gag aac tgc aga ctg agc atg ggc atc 1104
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
cgg ccc aac agc cac tac atc ctg cgg agc ggc ctg ctg aag tac aac 1152 Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
ctg agc gac ggc gag aac ccc aaa gtc gtc ttt att gag atc agc gac 1200
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
cag cgg ctg tcc atc ggc agc ccc agc aag atc tac gac agc ctg ggc 1248
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
cag ccc gtg ttc tac cag gcc agc ttc agc tgg gac acc atg atc aag 1296
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
ttc ggc gac gtg ctg acc gtg aac ccc ctg gtg gtg aac tgg cgg aac 1344
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
aat acc gtg atc agc aga ccc ggc cag agc cag tgc ccc cgg ttc aac 1392
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
acc tgc ccc gcg atc tgc gcg gag ggc gtg tac aac gac gcc ttc ctg Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465
470
475
480
atc gac cgg atc aac tgg atc tct gcc ggc gtg ttc ctg gac tcc aac 1488
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
gcg acc gcc gcg aat ccc gtg ttc acc gtg ttt aag gac aac gag atc 1536
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
ctg tac cgg gcc cag ctg gcc agc gag gac acc aac gcc cag aaa acc 1584
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
atc acc aac tgc ttt ctg ctg aag aac aag atc tgg tgc atc agc ctg 1632 Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
gtg gag atc tac gat acc ggc gac aac gtg atc agg ccc aag ctg ttc 1680
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
gcc gtg aag atc ccc gag cag tgc acc ggt gac ctg ggt aag aaa ctg 1728
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr Gly Asp Leu Gly Lys Lys Leu
565 570 575
ctg gaa gct gct cgt gct ggt cag gac gac gaa gtt cgt atc ctg atg 1776
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met
580 585 590
gct aac ggt gct gac gtt aac gct aag gac gag tat ggt tct act ccg 1824
Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Ser Thr Pro
595 600 605
ctg cac cta gct gct act ctt ggt cac ctg gaa atc gtt gaa gtt ctg 1872
Leu His Leu Ala Ala Thr Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
610 615 620
ctg aag cac ggt gct gac gtt aac gct gat gac gct act ggt ctt act 1920
Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp Ala Thr Gly Leu Thr
625 630 635 640
ccg ctg cac ctg gct gct tgg aat ggt cac ctg gag atc gtt gaa gtt 1968
Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
645 650 655
ctg ctg aag tac ggt gct gac gtt aac gct atg gac ttt gag ggt tgg 2016
Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Met Asp Phe Glu Gly Trp
660 665 670
act ccg ctg cac ctg gct gct cat ttt ggt cac ctg gaa atc gtt gaa 2064
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu
675 680 685
gtt ctg ctg aag tac ggt gct gac gtt aac gct cag gac aaa ttc ggt 2112
Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly
690 695 700
aag acc ccg ttc gac cta gcg atc gac aac ggt aac gag gac att gct 2160
Lys Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Ile Ala
705 710 715 720
gaa gtg ctg caa aaa gcg gcg aag ctt aat gcg gcc gca aga ggt tct Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Asn Ala Ala Ala Arg Gly Ser
725
730
735
cat cac cat cac cat cac taa 2229
His His His His His His
740
<210> 8
<211> 742
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr Gly Asp Leu Gly Lys Lys Leu
565 570 575
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met
580 585 590
Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Ser Thr Pro
595 600 605
Leu His Leu Ala Ala Thr Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
610 615 620
Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp Ala Thr Gly Leu Thr
625 630 635 640
Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
645 650 655
Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Met Asp Phe Glu Gly Trp
660 665 670
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu
675 680 685
Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly
690 695 700
Lys Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Ile Ala
705 710 715 720
Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Asn Ala Ala Ala Arg Gly Ser
725 730 735
His His His His His His
740
<210> 9
<211> 602
<212> ПРТ
<213> Вирус Нипах
<400> 9
Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp
1 5 10 15
Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser
35 40 45
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val
50 55 60
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly
85 90 95
Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu
130 135 140
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu
165 170 175
Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met
210 215 220
Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn
275 280 285
Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala
305 310 315 320
Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala
325 330 335
Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser
420 425 430
Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu
435 440 445
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg
465 470 475 480
Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser
515 520 525
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr 595 600
<210> 10
<211> 617
<212> ПРТ
<213> Вирус кори
<400> 10
Met Ser Pro Gln Arg Asp Arg Ile Asn Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Pro
1 5 10 15
His Pro Lys Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile
20 25 30
Asp Arg Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser
35 40 45
Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala
50 55 60
Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val
65 70 75 80
Thr Asn Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr
100 105 110
Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp
115 120 125
Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu
130 135 140
Arg Ile Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu
145 150 155 160
Glu Leu Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr
165 170 175
Thr Asn Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr
180 185 190
Thr Ile Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu
195 200 205
Tyr Leu Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser
210 215 220
Gln Gly Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser
225 230 235 240
Ser Lys Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu
245 250 255
Val Gly Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met
260 265 270
Thr Asn Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met
275 280 285
Val Ala Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp
290 295 300
Ser Ile Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln
305
310
315
320
Leu Val Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp
325 330 335
Val Pro Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser
340 345 350
Ser His Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro
355 360 365
Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln
370 375 380
Ala Cys Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala
385 390 395 400
Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp
405 410 415
Leu Ser Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly
420 425 430
Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His
435 440 445
Asn Asn Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu
450 455 460
Gly Val Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro
465 470 475 480
Tyr Leu Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Gly Asp Cys His Ala
485 490 495
Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser
500 505 510
Asn Leu Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr
515 520 525
Tyr Asp Thr Ser Arg Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser
530 535 540
Pro Ser Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys
545 550 555 560
Gly Val Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys
565 570 575
Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly
580 585 590
His Ile Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val
595 600 605
Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Arg Arg 610 615
<210> 11
<211> 546
<212> ПРТ
<213> Вирус Нипах
<400> 11
Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile
85 90 95
Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly
100 105 110
Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys Arg
325 330 335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn Met
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro Pro
435 440 445
Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg Leu
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
515 520 525
Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile
530 535 540
Gly Thr 545
<210> 12
<211> 553
<212> ПРТ
<213> Вирус кори
<400> 12
Met Ser Ile Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Asn
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Val Val Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val
35 40 45
Met Thr Arg Ser Ser His Gln Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn
50 55 60
Ile Thr Leu Leu Asn Asn Cys Thr Arg Val Glu Ile Ala Glu Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Leu Leu Arg Thr Val Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ala Leu Asn Ala
85 90 95
Met Thr Gln Asn Ile Arg Pro Val Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg
100 105 110
His Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val
115 120 125
Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met
130 135 140
Leu Asn Ser Gln Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr
145 150 155 160
Asn Gln Ala Ile Glu Ala Ile Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Ile Leu
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser
180 185 190
Met Asn Gln Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys
195 200 205
Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly
245 250 255
Gly Asp Leu Leu Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile
260 265 270
Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr
275 280 285
Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
290 295 300
Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser
325 330 335
Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr
340 345 350
Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys Ser
355 360 365
Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile Leu
370 375 380
Ser Gln Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys
385 390 395 400
Tyr Thr Thr Gly Thr Ile Ile Asn Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr
405 410 415
Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val Asn Gly Val Thr
420 425 430
Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu His Arg
435 440 445
Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr
450 455 460
Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu Leu
465 470 475 480
Glu Ser Ser Asp Gln Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser Thr
485 490 495
Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly
500 505 510
Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly
515 520 525
Glu Gln Val Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly
530 535 540
Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu
545 550
<210> 13
<211> 2328
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный и мутировавший (Y481A, R533A, S548L, F549S) белок Н MeV
(^Дельта15), слитый с IL-17
<221> CDS <222> (1)..(2328)
<400> 13
atg cat ccc aag gga agt agg ata gtc att aac aga gaa cat ctt atg 48
Met His Pro Lys Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met
1 5 10 15
att gat aga cct tat gtt ttg ctg gct gtt ctg ttt gtc atg ttt ctg 96
Ile Asp Arg Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu
20 25 30
agc ttg atc ggg ttg cta gcc att gca ggc att aga ctt cat cgg gca 144
Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala
35 40 45
gcc atc tac acc gca gag atc cat aaa agc ctc agc acc aat cta gat 192
Ala Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp
50 55 60
gta act aac tca atc gag cat cag gtc aag gac gtg ctg aca cca ctc 240
Val Thr Asn Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu
65 70 75 80
ttc aaa atc atc ggt gat gaa gtg ggc ctg agg aca cct cag aga ttc 288
Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe
85 90 95
act gac cta gtg aaa ttc atc tct gac aag att aaa ttc ctt aat ccg 336 Thr Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro
100 105 110
gat agg gag tac gac ttc aga gat ctc act tgg tgt atc aac ccg cca 384 Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro
115 120 125
gag aga atc aaa ttg gat tat gat caa tac tgt gca gat gtg gct gct 432
Glu Arg Ile Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala
130 135 140
gaa gag ctc atg aat gca ttg gtg aac tca act cta ctg gag acc aga 480
Glu Glu Leu Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg
145 150 155 160
aca acc aat cag ttc cta gct gtc tca aag gga aac tgc tca ggg ccc 528
Thr Thr Asn Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro
165 170 175
act aca atc aga ggt caa ttc tca aac atg tcg ctg tcc ctg tta gac 576
Thr Thr Ile Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp
180 185 190
ttg tat tta ggt cga ggt tac aat gtg tca tct ata gtc act atg aca 624
Leu Tyr Leu Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr
195 200 205
tcc cag gga atg tat ggg gga act tac cta gtg gaa aag cct aat ctg 672
Ser Gln Gly Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu
210 215 220
agc agc aaa agg tca gag ttg tca caa ctg agc atg tac cga gtg ttt 720
Ser Ser Lys Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe
225 230 235 240
gaa gta ggt gtt atc aga aat ccg ggt ttg ggg gct ccg gtg ttc cat 768
Glu Val Gly Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His
245 250 255
atg aca aac tat ctt gag caa cca gtc agt aat gat ctc agc aac tgt 816
Met Thr Asn Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys
260 265 270
atg gtg gct ttg ggg gag ctc aaa ctc gca gcc ctt tgt cac ggg gaa 864
Met Val Ala Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu
275 280 285
gat tct atc aca att ccc tat cag gga tca ggg aaa ggt gtc agc ttc 912
Asp Ser Ile Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe
290 295 300
cag ctc gtc aag cta ggt gtc tgg aaa tcc cca acc gac atg caa tcc 960
Gln Leu Val Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser
305 310 315 320
tgg gtc ccc tta tca acg gat gat cca gtg ata gac agg ctt tac ctc 1008 Trp Val Pro Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu
325 330 335
tca tct cac aga ggt gtt atc gct gac aat caa gca aaa tgg gct gtc 1056
Ser Ser His Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val
340 345 350
ccg aca aca cga aca gat gac aag ttg cga atg gag aca tgc ttc caa 1104
Pro Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln
355 360 365
cag gcg tgt aag ggt aaa atc caa gca ctc tgc gag aat ccc gag tgg 1152
Gln Ala Cys Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp
370 375 380
gca cca ttg aag gat aac agg att cct tca tac ggg gtc ttg tct gtt 1200 Ala Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val
385 390 395 400
gat ctg agt ctg aca gtt gag ctt aaa atc aaa att gct tcg gga ttc 1248
Asp Leu Ser Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe
405 410 415
ggg cca ttg atc aca cac ggt tca ggg atg gac cta tac aaa tcc aac 1296
Gly Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn
420 425 430
cac aac aat gtg tat tgg ctg act atc ccg cca atg aag aac cta gcc 1344
His Asn Asn Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala
435 440 445
tta ggt gta atc aac aca ttg gag tgg ata ccg aga ttc aag gtt agt 1392
Leu Gly Val Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser
450 455 460
ccc gcg ctc ttc aat gtc cca att aag gaa gca ggc gaa gac tgc cat 1440
Pro Ala Leu Phe Asn Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Glu Asp Cys His
465 470 475 480
gcc cca aca tac cta cct gcg gag gtg gat ggt gat gtc aaa ctc agt 1488
Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser
485 490 495
tcc aat ctg gtg att cta cct ggt caa gat ctc caa tat gtt ttg gca 1536 Ser Asn Leu Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala
500 505 510
acc tac gat act tcc gcg gtt gaa cat gct gtg gtt tat tac gtt tac 1584
Thr Tyr Asp Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr
515 520 525
agc cca agc cgc tca ttt tct tac ttt tat cct ttt agg ttg cct ata 1632 Ser Pro Ser Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile
530 535 540
aag ggg gtc ccc atc gaa tta caa gtg gaa tgc ttc aca tgg gac caa 1680
Lys Gly Val Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln
545 550 555 560
aaa ctc tgg tgc cgt cac ttc tgt gtg ctt gcg gac tca gaa tct ggt 1728
Lys Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly
565 570 575
gga cat atc act cac tct ggg atg gag ggc atg gga gtc agc tgc aca 1776
Gly His Ile Thr His Ser Gly Met Glu Gly Met Gly Val Ser Cys Thr
580 585 590
gtc acc cgg gaa gat gga acc aat atc gag gga agg gcg gcc cag ccg 1824
Val Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Ile Glu Gly Arg Ala Ala Gln Pro
595 600 605
gcc atg gcc gat tgt gat att gaa ggt aaa gat ggc aaa caa tat gag 1872
Ala Met Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu
610 615 620
agt gtt cta atg gtc agc atc gat caa tta ttg gac agc atg aaa gaa 1920
Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu
625 630 635 640
att ggt agc aat tgc ctg aat aat gaa ttt aac ttt ttt aaa aga cat 1968
Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His
645 650 655
atc tgt gat gct aat aag gaa ggt atg ttt tta ttc cgt gct gct cgc 2016
Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg
660 665 670
aag ttg agg caa ttt ctt aaa atg aat agc act ggt gat ttt gat ctc 2064
Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu
675 680 685
cac tta tta aaa gtt tca gaa ggc aca aca ata ctg ttg aac tgc act 2112
His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr
690 695 700
ggc cag gtt aaa gga aga aaa cca gct gcc ctg ggt gaa gcc caa cca 2160
Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro
705 710 715 720
aca aag agt ttg gaa gaa aat aaa tct tta aag gaa cag aaa aaa ctg 2208 Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu
725 730 735
aat gac ttg tgt ttc cta aag aga cta tta caa gag ata aaa act tgt 2256 Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys
740 745 750
tgg aat aaa att Trp Asn Lys Ile
755
ttg atg ggc act aaa gaa cac gcg gcc gca aga gga
Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ala Ala Ala Arg Gly 760 765
2304
tcg cat cac cat cac cat cac tga 2328
Ser His His His His His His
770 775
<210> 14
<211> 775
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 14
Met His Pro Lys Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met
1 5 10 15
Ile Asp Arg Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu
20 25 30
Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala
35 40 45
Ala Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp
50 55 60
Val Thr Asn Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu
65 70 75 80
Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe
85 90 95
Thr Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro
100 105 110
Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro
115 120 125
Glu Arg Ile Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala
130 135 140
Glu Glu Leu Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg
145 150 155 160
Thr Thr Asn Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro
165 170 175
Thr Thr Ile Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp
180
185
190
Leu Tyr Leu Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr
195 200 205
Ser Gln Gly Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu
210 215 220
Ser Ser Lys Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe
225 230 235 240
Glu Val Gly Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His
245 250 255
Met Thr Asn Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys
260 265 270
Met Val Ala Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu
275 280 285
Asp Ser Ile Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe
290 295 300
Gln Leu Val Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser
305 310 315 320
Trp Val Pro Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu
325 330 335
Ser Ser His Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val
340 345 350
Pro Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln
355 360 365
Gln Ala Cys Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp
370 375 380
Ala Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val
385 390 395 400
Asp Leu Ser Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Gly Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn
420 425 430
His Asn Asn Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala
435
440
445
Leu Gly Val Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser
450 455 460
Pro Ala Leu Phe Asn Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Glu Asp Cys His
465 470 475 480
Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser
485 490 495
Ser Asn Leu Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala
500 505 510
Thr Tyr Asp Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr
515 520 525
Ser Pro Ser Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile
530 535 540
Lys Gly Val Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln
545 550 555 560
Lys Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly
565 570 575
Gly His Ile Thr His Ser Gly Met Glu Gly Met Gly Val Ser Cys Thr
580 585 590
Val Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Ile Glu Gly Arg Ala Ala Gln Pro
595 600 605
Ala Met Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu
610 615 620
Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu
625 630 635 640
Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His
645 650 655
Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg
660 665 670
Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu
675 680 685
His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr
690 695 700
Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro
705 710 715 720
Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu
725 730 735
Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys
740 745 750
Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ala Ala Ala Arg Gly
755 760 765
Ser His His His His His His
770 775
<210> 15
<211> 523
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный слитый гликопротеин MeV ^^ельта30)
<400> 15
Met Ser Ile Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Asn
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Val Val Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val
35 40 45
Met Thr Arg Ser Ser His Gln Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn
50 55 60
Ile Thr Leu Leu Asn Asn Cys Thr Arg Val Glu Ile Ala Glu Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Leu Leu Arg Thr Val Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ala Leu Asn Ala
85 90 95
Met Thr Gln Asn Ile Arg Pro Val Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg
100 105 110
His Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val
115 120 125
Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met
130 135 140
Leu Asn Ser Gln Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr
145 150 155 160
Asn Gln Ala Ile Glu Ala Ile Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Ile Leu
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser
180 185 190
Met Asn Gln Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys
195 200 205
Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly
245 250 255
Gly Asp Leu Leu Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile
260 265 270
Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr
275 280 285
Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
290 295 300
Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser
325 330 335
Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr
340 345 350
Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys Ser
355 360 365
Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile Leu
370 375 380
Ser Gln Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys
385 390 395 400
Tyr Thr Thr Gly Thr Ile Ile Asn Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr
405 410 415
Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val Asn Gly Val Thr
420 425 430
Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu His Arg
435 440 445
Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr
450 455 460
Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu Leu
465 470 475 480
Glu Ser Ser Asp Gln Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser Thr
485 490 495
Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly
500 505 510
Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg 515 520
<210> 16
<211> 524
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный слитый гликопротеин NiV ^^ельта22)
<400> 16
Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr Lys
Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile
85 90 95
Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly
100 105 110
Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys Arg
325
330
335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn Met
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro Pro
435 440 445
Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg Leu
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr 515 520
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор, содержащий:
5 а) по меньшей мере один слитый белок, нацеливающий на клетку,
содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку,
б) по меньшей мере один модулирующий слитый белок, содержащий: (i)
10 белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один функциональный домен, и
в) по меньшей мере один гликопротеин, происходящий из гликопротеина F
оболочки вируса семейства Paramyxoviridae,
15 где указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный
модулирущий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae,
где у указанного белка, происходящего из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, отсутствует по меньшей мере одна часть
20 цитоплазматической области указанного гликопротеина G или Н оболочки.
2. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор по п. 1, где указанный вирус семейства Paramyxoviridae представляет собой вирус рода Morbillivirus или рода Henipavirus.
3. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный 25 вектор по п. 1 или 2, в котором указанный белок, происходящий из гликопротеина G
или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, по меньшей мере частично не способен к связыванию с по меньшей мере одним природным рецептором указанного гликопротеина G или Н оболочки.
4. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный 30 вектор по любому из пп. 1-3, в котором у указанного гликопротеина, происходящего
из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, отсутствует по меньшей мере одна часть цитоплазматической области указанного гликопротеина F оболочки.
5. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный 35 вектор по любому из пп. 1-4, в котором указанный домен, нацеливающий на клетку,
выбран в группе, состоящей из DARPin, scFv, нацеливающего пептида и их комбинаций.
6. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор по любому из пп. 1-5, где указанный функциональный домен, выбран из
5 группы состоящей из цитокина, фактора роста, гормона, нейромедиатора, лиганда апоптоза или их комбинации.
7. Применение псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора по любому из пп. 1-6 для селективной модуляции активности клеток-мишеней и, возможно, селективной трансдукции указанных
10 клеток-мишеней.
8. Способ селективной модуляции активности клеток-мишеней и/или селективной трансдукции клеток-мишеней, где указанный способ включает приведение в контакт псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора по любому из пп. 1-6 с клетками, содержащими указанные
15 клетки-мишени.
9. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор по любому из пп. 1-6 для применения в качестве лекарственного средства.
10. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный вектор по п. 9 для применения в иммунотерапии, генотерапии и/или вакцинации.
20 11. Псевдотипированная ретровирусоподобная частица или ретровирусный
вектор по п. 9 или 10 для применения в предупреждении и/или лечении иммунного заболевания, рака, генетического заболевания, аллергического заболевания, воспалительного заболевания, инфекционного заболевания, метаболического заболевания, неврологического заболевания, мышечного заболевания и их
25 комбинаций.
12. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок, нацеливающий на клетку, и последовательность, кодирующую модулирующий слитый белок, где:
- указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, содержит (i) белок, 30 происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства
Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на клетку, и
- указанный модулирующий слитый белок содержит (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или
35 трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один функциональный домен.
13. Нуклеиновая кислота по п. 12, где указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность, выбранную в группе, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13, и/или содержит последовательность, кодирующую последовательность, выбранную в группе,
5 состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 14.
14. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по пп. 12 или 13.
15. Способ получения псевдотипированной ретровирусоподобной частицы или ретровирусного вектора по любому из пп. 1-6, где указанный способ включает
10 сотрансфицирование линии упаковывающих клеток:
(i) по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый белок, нацеливающий на клетку, содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один домен, нацеливающий на
15 клетку,
(ii) по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей модулирующий слитый белок, содержащий: (i) белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, или трансмембранный домен и (ii) по меньшей мере один функциональный домен ,
20 (iii) по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей
гликопротеин, происходящий из гликопротеина F оболочки вируса семейства Paramyxoviridae, и
(iv) по меньшей мере одним вектором, содержащим нуклеиновую кислоту,
кодирующую коровые белки из указанного ретровируса,
25 где указанный слитый белок, нацеливающий на клетку, и/или указанный
модулирущий слитый белок содержит белок, происходящий из гликопротеина G или Н оболочки вируса семейства Paramyxoviridae.
Сутки 3
Сутки 6
4H-LV
4H/IL7H-LV
VSV-LV
CD8+
Erb82-CAR
Erb82-CAR
Erb82-CAR
Erb82-CAR
<
< ¦
со со
<
О со
CD4*
CD4CAR
Erb82-CAR
CD <-CAR; 4 4'.
Erb82-CAR
CD4 СДЯ
39.0'.
Erb82-CAR
Erb82~CAR
Q О
CD8*
CD4+
I CO &'CAR
1 o,ot%
CD4
CD4XAR 0.01% /
Erb82-CAR
Erb82-CAR
/ C08.CAR ( 0.04%
CD4
CD4JCAR / 10.48%
Erb82-CAR
Erb82-CAR
/ CD8/CAR j 2,M%
CD4
C04/CAR , < M.ii% "'
Erb82-CAR
Erb82-CAR
/ CWCAR ; 0,02%
CD4
CO"AB ;
0.02% j
mm;
: ! ¦
Erb82-CAR
Erb82-CAR
4H-VLP
во О
I 1
CD8/CD71
0,00%
о о
CD4/CD71 0.08°о
Г |
CD8/CD71
0,03%
C04/CD71
0.09%
CD71 CD71
Hnse/IL7H-VLP
CD71
CD71
4H/IL7H~VLP
CWCDI1
11,37%
CD4/C071 21.52%
- 1
CD8/CD71
0,74%
CD4/C071
11.63%
CD71
CD71
CD71
CD71
4H-VLP
8H-VLP
жичнеспособныс клетки 1,44% жизнеспособные клетки 2,93% жизнеспособные клетки 1,79%
<
6 со со \
<
6 со
FSC-A
FSC-A
FSC-A
4H/IL7H-VLP 8H/IL7H-VLP
rhlL7
жизнеспосоопые клетки 55,22% жизнеспосоопые клетки 39,08% жизнеспособные клетки 35,80%
со со б
со со \
FSC-A
FSC-A
ФИГ 4
VSV-LV
Hnse-LV
жизнеспособные клетки 14,76%
жизнеспособные
клетки 15,66%
/\.
'. '
, - жизнеспособные
• клетки 15,97%
1. '
: • • ' -/\
Л *. : / \
•: .' - V
...
FSC-A
FSC-A
FSC-A
4H-LV
жизнеспособные 4H/IL7H-LV
жизнеспособные клетки 70,20% rhlL7
жизнеспособные ¦ клетки 79,44%
FSC-A
FSC-A
FSC-A
VSVG-LV
Hnse-LV
i4.es
0.0%
65.1%
0.0%
4Kil"-LV
2? .8%
72.0%
0,1%
1?.?%
0.0%
12,3%
0.1%
4MMe/IL7MA20-LV
0.3%
49.9%
29. %%
16.54
0,0%
S3.4%
0.0%
4Hi,Vll7Ki,4-LV
0.5%
46.3%
30.2%
*CD69
0.0%
0.0%
4M*'e-LV
27 84.
0.0%
7' ¦
0.2%
VSVG-LV
0.1%
0,2%
4K*'*/IL7H*6-LV
Hnse-LV
te.s*
0.1%
к-.--
0.3%
4MA,,/tL7HA,5-LV
21."
2,2%
3!-"--
37.1%
-> CD71
4H-LV 4H/IL7H-LV
Hmut <•
"IL7
ФИГ 7
CD4+
CD8+
4HA18/|L7HA20.LV
• NiVmutEpCAM-LV
* NiVwt-LV^ VSV-LV
-2 10-1 i0o iqi 102 103 104 105 106 107 108
Концентрация IVIG [нг/мл]
ФИГ 10
CD8+
CD4+
262144 196606
|131072
S8536 0
CD8/CD71 0.02%
ю'ю' io' ioJ io* CD71
чиц io" 10'" ю:' io' te* CD71
8G-LV
•10'10/ 10" ю4 108
CD71
CD71
8G/IL7G-LV
26214*
262144
CD71
ФИГ. 11
CD8+
CD4+
-w* юг m} то3 10s GFP
GFP
8G-LV
GFP
-10г юг то' iff* 10s GFP
8G/IL7G-LV
CD47GFP
0,07%
-юг юг ю' 104 10*
GFP
ФИГ. 12
CD8+
CD4*
262144 1968081151072-
85538-
CD8/CAR 0,0%
282144 196608
H31072-
essse-
C 04'CAR 0.01%
O'l и ¦
10 10 10 10 10
CAR 19
10" i
CAR19
•io' 10* 10 10" 10
8G-LV
8G/IL7G-LV
198808 > 13107?-655Э8
0-"
CDS/CAR 47,3%
-io' 10' 10* Ю" 10*
CAR 19
CAR 19
VSV-LV
282144
2821*"
198808
mm-о
CD4/CAR 0.24'".
-10* 1С* 10' 10* 1С'
CAR19 •10" io* io1 to* 10'
CAR19
MV-CD4H/IL7H-LV
MV-CD4H-LV
A T
6,6
CD71
CD71
ФИГ. 14
(19)
(19)
(19)
672
672
1440
1440
2208
2208
2208
2208
<220>
<220>