EA201892362A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892362 Полный текст описания [**] EA201892362 20170418 Регистрационный номер и дата заявки US62/324,170 20160418 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2017/028162 Номер международной заявки (PCT) WO2017/184619 20171026 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] АГОНИСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С CD40 ЧЕЛОВЕКА, И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа [8] C07K 16/28 Индексы МПК [US] Келер Тибор, [US] Голдстейн Джоел, [US] Витале Лаура А., [US] Хе Лижен, [US] О'Нилл Том, [US] Крокер Андреа, [US] Сундарапандиян Каруна, [US] Томас Лоуренс Дж., [US] Виджер Дженифер Сведения об авторах [US] СЕЛЛДЕКС ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892362a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным агонистическим антителам, которые связываются с CD40 человека, и к соответствующим композициям и молекулам на основе антител. Настоящее изобретение также относится к терапевтическим и диагностическим способам применения указанных антител.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным агонистическим антителам, которые связываются с CD40 человека, и к соответствующим композициям и молекулам на основе антител. Настоящее изобретение также относится к терапевтическим и диагностическим способам применения указанных антител.


Евразийское (21) 201892362 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.18
(51) Int. Cl. C07K16/28 (2006.01)
(54) АГОНИСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С CD40 ЧЕЛОВЕКА, И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 62/324,170
(32) 2016.04.18
(33) US
(86) PCT/US2017/028162
(87) WO 2017/184619 2017.10.26
(88) 2017.12.21
(71) Заявитель:
СЕЛЛДЕКС ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Келер Тибор, Голдстейн Джоел, Витале Лаура А., Хе Лижен, О'Нилл Том, Крокер Андреа, Сундарапандиян Каруна, Томас Лоуренс Дж., Виджер Дженифер (US)
(57) Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным агонистическим антителам, которые связываются с CD40 человека, и к соответствующим композициям и молекулам на основе антител. Настоящее изобретение также относится к терапевтическим и диагностическим способам применения указанных антител.
(74)
Представитель: Квашнин В.П. (RU)
АГОНИСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С CD40 ЧЕЛОВЕКА, И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Родственная заявка
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на 5 патент США № 62/324170, поданной 18 апреля 2016 г. Содержание вышеупомянутой заявки включено в настоящую заявку посредством ссылки. Уровень техники
Взаимодействия между Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками вовлекают множество вспомогательных молекул, которые облегчают развитие иммунного ответа.
10 Одной из таких молекул является CD40, член супер семейства рецепторов факторов некроза опухолей (TNF-R), который связывается с CD40L (Ranheim ЕА, et al., Blood. 1995 June 15;85(12):3556-65). CD40 представляет собой трансмембранный гликопротеин массой 43-48 кДа, состоящий из 277 аминокислотных остатков (Braesch-Andersen et al., 1989). CD40 экспрессируется антигенпрезентирующими клетками (АПК), и связывание его
15 природного лиганда (CD40L) на Т-клетках активирует АПК, включая дендритные клетки и В-клетки (Khalil and Vonderhide (2007) Update Cancer Ther, 2(2): 61-65), усиливая тем самым иммунные ответы. CD40 также экспрессируется на многих опухолевых клетках, и в этом случае его лигирование обуславливает непосредственное цитотоксическое действие, например, вовлечение CD40 на опухолевых клетках приводит к апоптозу в
20 условиях in vitro и нарушению роста опухоли в условиях in vivo (Tai et al. (2004) Cancer Res, 64(8):2846-52).
Моноклональные антитела против CD40 обеспечивают ряд потенциальных терапевтических целей, включая лечение различных видов рака. Например, было показано, что агонистические антитела к CD40 заменяют помощь Т-клеток, обеспеченную
25 CD4+ лимфоцитами в мышиных моделях опосредуемого Т-клетками иммунитета, и у хозяев, несущих опухоли, агонисты CD40 запускают эффективные иммунные ответы против ассоциированных с опухолью антигенов (Bennett et al. (1998) Nature, 393(6684):478-80). Помимо этого антитела к CD40 являются очень перспективными для применения в вакцинах (Fransen et al. (2014) Vaccine 32:1654-1660). Тем не менее,
30 существуют потенциальные нежелательные эффекты, связанные с агентами, которые сильно модулируют иммунную систему (Sandin et al. (2014) Cancer Immunol Res, 2:80-90). Соответственно, существует потребность в более глубоком понимании специфических свойств и механизмов, которые делают антитела к CD40 терапевтически эффективными, а также в улучшенных терапевтических антителах против CD40, которые можно применять
35 для лечения и/или предотвращения заболеваний.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным антителам к CD40, обладающим конкретными функциональными свойствами, которые могут быть связанны с полезными и желательными терапевтическими эффектами. В частности, были получены и 5 охарактеризованы агонистические моноклональные антитела (МАТ) к CD40, способные повышать иммунный ответ на антиген (например, антиген, экспрессируемый на клетке). В настоящем документе термин "антитело" относится к полноразмерным антителам и их антигенсвязывающим частям.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитела к CD40 10 усиливают иммунные ответы против антигена, например, путем усиления опосредуемых Т-клетками иммунных ответов, активации В-клеток и/или выработки цитокинов. Антитела могут быть введены по отдельности или в составе различных видов комбинированной терапии (например, в комбинации с вакцинной терапией и/или химиотерапией).
15 Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела к CD40
способны увеличивать иммунный ответ на антиген без индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) СО40-экспрессирующих клеток и/или комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗЦ) СО40-экспрессирующих клеток. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела содержат
20 константную область, не обладающую эффекторными функциями. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения константная область представляет собой изотип IgG2 (например, IgG2 человека).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела к CD40 проявляют одно или более из следующих свойств:
25 (а) не способны блокировать связывание CD40L с CD40 человека, независимо
от связывания с рецептором Fc;
(b) способны блокировать связывание CD40L с CD40 человека, независимо от
связывания с рецептором Fc;
(c) активируют CD40 человека, экспрессируемый на антигенпрезентирующей 30 клетке (АПК), независимо от связывания с рецептором Fc;
(d) индуцируют апоптоз опухолевой клетки;
(e) обладают активностью, направленной на стимуляцию Т-клеток;
(f) способны усиливать активацию В-клеток; и/или
(g) способны к синергическому действию с CD40L.
(c)
Предпочтительно антитела действуют независимо от взаимодействия с рецептором Fc. Предпочтительно антитела представляют собой антитела изотипа IgG2.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агонистические антитела способны увеличивать иммунный ответ независимо от связывания с рецептором 5 Fc. Например, антитела могут проявлять сильные агонистические признаки без перекрестного связывания с рецептором Fc, таким как FcyR. Такие агонистические признаки включают, например, увеличение активности Т-клеток и/или увеличение активации В-клеток, согласно результатам измерения, например, на основании увеличения экспрессии маркеров клеточной поверхности, выбранных из группы,
10 состоящей из HLA-DR V450, СБ54-ФЭ, СБ86-АФЦ, CD83 BV510, CD 19 V500, СБ54-ФЭ, HLA-DR V450, CD23 РегСР-Су5.5, СБ69-АФЦ, СБ86-АФЦ, CD38 и СБ71-ФЭ.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела блокируют связывание CD40 с CD40L (CD 154) на СБ40-экспрессирующих клетках. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения антитела
15 ингибируют связывание растворимого CD40L с СВ40-экспрессирующими клетками по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения антитело к CD40 ингибирует связывание CD40L по меньшей мере приблизительно на 70%, согласно результатам
20 измерения, например, методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), интерферометрии биослоев (ВЫ) или с помощью системы Biacore. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к CD40 ингибирует связывание CD40L по меньшей мере приблизительно на 80%, согласно результатам измерения, например, методами FACS, ВЫ или с помощью системы Biacore.
25 Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела
индуцируют апоптоз клеток, согласно результатам измерения, например, на основании увеличения экспрессии CD95. Антитела также могут быть сконструированы так, чтобы включать область Fc, которая специфична в отношении конкретного рецептора Fc (например, FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIBl (CD32), FcyRIIB2 (CD32), FcyRIIIA
30 (CD16a), FcyRIim (CD 16b), FcsRI, FcsRII (CD23), FcaRI (CD89), Fca/uR и FcRn).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела способны связываться с CD40 человека с равновесной константой диссоциации Kd, составляющей 10"10 М или менее, предпочтительно 10"11 М или менее и/или перекрестно реагировать с CD40 яванских макак.
Конкретные антитела к CD40 согласно настоящему изобретению включают антитела ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK, 3B6-NS, и связанные с ними варианты реализации, описанные ниже.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитела содержат 5 последовательность гипервариабельного участка (CDR) 3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 9, 10, 23, 24, 37, 38, 51, 52, 65, 66, 65, 66, 79, 80, 93, 94, 107, 108, включая консервативные модификации этих последовательностей (например, консервативные замены аминокислот). Антитела могут дополнительно содержать последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи,
10 выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 29, 30, 43, 44, 57, 58, 71, 72, 85, 86, 99, 100, 113, 114, включая консервативные модификации этих последовательностей. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательности CDR2 и/или CDR1 тяжелой цепи выбраны из последовательностей, представленных в SEQ ГО NO: 7, 8, 21, 22, 35, 36, 49, 50, 63, 64, 77, 78, 91, 92, 105, 106 и SEQ ГО NO: 5, 6, 19,
15 20, 33, 34, 47, 48, 61, 62, 61, 62, 75, 76, 89, 90, 103, 104, соответственно, включая консервативные модификации этих последовательностей. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательности CDR2 и/или CDR1 легкой цепи выбраны из последовательностей, представленных в SEQ ГО NO: 13, 14, 27, 28, 41, 42, 55, 56, 69, 70, 84, 85, 97, 98, 111, 112 и SEQ ГО NO: 11, 12, 25, 26, 40, 41, 53, 54, 67, 68, 81, 82,
20 95, 96, 109, ПО, соответственно, включая консервативные модификации этих последовательностей.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО NO: 3, 17, 31, 45, 59, 73, 87, 101, включая
25 консервативные модификации этих последовательностей. Антитела могут дополнительно содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО NO: 4, 18, 32, 46, 60, 74, 88, 102, включая консервативные модификации этих последовательностей.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела содержат
30 вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей, соответственно, содержащие следующие аминокислотные последовательности (включая консервативные модификации последовательностей):
(a) SEQ ГО NO: 3 и/или 4;
(b) SEQ ГО NO: 17 и/или 18; 35 (с) SEQ ГО NO: 31 и/или 32;
(a)
(c) SEQ Ш NO: 45 и/или 46;
(d) SEQ Ш NO: 59 и/или 60;
(e) SEQ Ш NO: 73 и/или 74;
(f) SEQ Ш NO: 87 и/или 88; или 5 (h) SEQ Ш NO: 101 и/или 102.
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, последовательности которых по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей
10 мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или более идентичны любой из вышеуказанных последовательностей. Диапазоны, которые являются промежуточными по отношению к перечисленным выше значениям, например, вариабельные области тяжелой и легкой цепей, последовательности которых по меньшей мере на 80-85%, 85-90%, 9095% или 95-100% идентичны любой из вышеуказанных последовательностей, также
15 включены в объем настоящего изобретения.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела связываются с CD40 человека и содержат последовательности CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, соответственно, содержащих аминокислотные последовательности, приведенные в:
20 (a) SEQ ID NO: 3 и 4;
(b) SEQ ГО NO: 17 и 18;
(c) SEQ ГО NO: 31 и 32;
(d) SEQ ГО NO: 45 и 46;
(e) SEQ ГО NO: 59 и 60; или 25 (f) SEQ ГО NO: 73 и 74;
(g) SEQ ГО NO: 87 и 88; или
(h) SEQ ГО NO: 101 и 102
(в каждом случае включая одну консервативную модификацию последовательности, две консервативные модификации последовательности или вплоть до трех, вплоть до 30 четырех или вплоть до пяти консервативных модификаций последовательности в одном или более CDR).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела связываются с CD40 человека и содержат:
(a) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 5, 7, 9, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ IDNO: 11, 13, 15, соответственно;
(b) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
5 Ш N0: 19, 21, 23, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ Ш N0: 25, 27, 29, соответственно;
(c) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 33, 35, 37, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ Ш N0: 39, 41, 43, соответственно;
10 (d) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 47, 49, 51, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ IDNO: 53, 55, 57, соответственно;
(e) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 61, 63, 65, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
15 цепи, содержащие SEQ Ш N0: 67, 69, 71, соответственно;
(f) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 75, 77, 79, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ IDNO: 81, 83, 85, соответственно;
(g) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
20 Ш N0: 89, 91, 93, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ Ш N0: 95, 97, 99, соответственно; или
(h) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 103, 105, 107, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3
легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 109, 111, 113, соответственно (в каждом случае
25 необязательно включая одну консервативную модификацию последовательности, две консервативные модификации последовательности или вплоть до трех, вплоть до четырех или вплоть до пяти консервативных модификаций последовательности в одном или более указанных CDR).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела 30 связываются с CD40 человека и содержат:
(а) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 6, 8, 10, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ IDNO: 12, 14, 16, соответственно;
(b) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 20, 22, 24, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ Ш N0: 26, 28, 30, соответственно;
(c) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
5 Ш N0: 34, 36, 38, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ Ш N0: 40, 42, 44, соответственно;
(d) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 48, 50, 52, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
цепи, содержащие SEQ IDNO: 54, 56, 58, соответственно;
10 (е) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
Ш N0: 62, 64, 66, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 68, 70, 72, соответственно; или
(f) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 76, 78, 80, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой
15 цепи, содержащие SEQ IDNO: 82, 84, 86, соответственно;
(g) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 90, 92, 94, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ IDNO: 96, 98, 100, соответственно; или
(h) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ
20 Ш N0: 104, 106, 108, соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3
легкой цепи, содержащие SEQ Ш NO: 110, 112, 114, соответственно (в каждом случае необязательно включая одну консервативную модификацию последовательности, две консервативные модификации последовательности или вплоть до трех, вплоть до четырех или вплоть до пяти консервативных модификаций последовательности в одном или более
25 указанных CDR).
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к антителам, которые конкурируют за связывание с CD40 с конкретными антителами, описанными выше. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело конкурирует за связывание с CD40 с антителом, содержащим вариабельные области тяжелой и/или
30 легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ Ш NO: 3 и 4, SEQ Ш NO: 17 и 18, SEQ Ш NO: 31 и 32, SEQ Ш NO: 45 и 46, SEQ Ш NO: 59 и 60, SEQ Ш NO: 73 и 74, SEQ Ш NO: 87 и 88, SEQ Ш NO: 101 и 102, соответственно.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с тем же эпитопом, что и эпитоп на CD40, распознаваемый специфическими
35 антителами, описанными выше. Согласно одному варианту реализации настоящего
изобретения антитело связывается с эпитопом на CD40, распознаваемым антителом, содержащим вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ Ш N0: 3 и 4, SEQ Ш N0: 17 и 18, SEQ ID N0: 31 и 32, SEQ ГО N0: 45 и 46, SEQ ГО N0: 59 и 60, SEQ ГО N0: 73 и 74, 5 SEQ ГО N0: 87 и 88, SEQ ГО N0: 101 и 102, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело связывается с тем же эпитопом, как и антитело ЗСЗ или 3G5.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с одним или более остатками в пределах участка, содержащего остатки
10 аминокислот 1-5 и 33-36 внеклеточного домена (ВКД) CD40 человека (SEQ ГО N0: 133). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела также связываются с одной или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот 25, 26, 28 и 30 ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела связываются с одной или более
15 аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот 5, 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела связываются с аминокислотами 5, 33 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела связываются с аминокислотами 5, 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0:
20 133).
Согласно любому из вышеперечисленных аспектов настоящее изобретение относится к антителам, в которых замена аланина треонином в положении 5 ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133) снижает связывание антител по меньшей мере на 30% по сравнению со связыванием с ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133). Согласно некоторым
25 вариантам реализации настоящего изобретения замена аланина треонином в положении 5 ВКД CD40 человека снижает связывание антител по меньшей мере на 50% по сравнению со связыванием с ВКД CD40 человека (SEQ ID NO: 133). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения замена аланина треонином в положении 5 ВКД CD40 человека снижает связывание антител по меньшей мере на 80% по сравнению со
30 связыванием с ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133).
Согласно любому из вышеперечисленных аспектов настоящее изобретение относится к антителам, которые проявляют синергическое действие с CD40L, который может представлять собой эндогенный CD40L. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синергическое действие представляет собой
35 увеличенную индукцию экспрессии CD95 при инкубации с клетками линии Ramos.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синергическое действие представляет собой увеличение пролиферации В-клеток при инкубации с В-клетками человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синергическое действие представляет собой увеличенную индукцию экспрессии ИЛ-5 12р40 при инкубации с дендритными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синергическое действие измеряют на основании экспрессии CD95.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с одним или более остатками в пределах участка, содержащего остатки
10 аминокислот 13-15 и 33-36 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела связываются с одной или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ID N0: 133).
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть полноразмерными,
15 например, антитела IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD и IgE или их варианты. В другом варианте антитела могут представлять собой фрагменты, такие как Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечный Fv, выделенный гипервариабельный участок (CDR) или комбинацию двух или более выделенных CDR. Антитела могут относиться к любому известному типу или виду антител, включая, но не ограничиваясь указанными, полностью
20 антитела человека, гуманизированные и химерные антитела. Предпочтительно антитела представляют собой антитела IgG2. Следует понимать, что некоторые модификации могут быть внесены в последовательность IgG2, такие как делеция N-концевого лизина и/или различные другие мутации, известные в данной области техники. Следовательно, антитело IgG2 включает, например, антитела, содержащие константные домены,
25 последовательности которых по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97% и предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны нативной последовательности IgG2 человека.
Настоящее изобретение также относится к молекулярным конъюгатам, содержащим антитело согласно настоящему изобретению, соединенное с антигеном (включая
30 фрагменты, эпитопы и антигенные детерминанты), таким как опухолевый антиген, аутоантиген или компонент патогена. Например, антиген может включать опухолевый антиген, такой как phCG, gplOO или Pmell7, СЕА, gplOO, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), идиотип, тирозиназа, теломераза, SSX2, MUC-1, MAGE-АЗ и ассоциированный с меланомой высокомолекулярный антиген (HMW-MAA) MART1, мелан-А, NY-ESO-1,
MAGE-1, MAGE-3, WT1, Her2, мезотелин или ассоциированный с меланомой высокомолекулярный антиген (HMW-MAA).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения молекулярный комплекс дополнительно содержит терапевтический агент, такой как цитотоксический 5 агент, иммуносупрессорный агент или химиотерапевтический агент.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к биспецифическим молекулам, содержащим антитела согласно настоящему изобретению, соединенные со вторым функциональным фрагментом, имеющим отличающуюся специфичность связывания. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения
10 вторая молекула может связываться с рецептором Т-клеток (например, CD3, CD40 или CTLA-4), рецептором NK-клеток (например, CD56), рецептором В-клеток (например, CD20) или другим рецептором фактора некроза опухоли (например, CD95).
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитела, молекулярные конъюгаты или биспецифические молекулы, описанные в настоящем
15 документе, приготовленным с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции могут дополнительно содержать адъювант, иммуностимулирующий агент (например, лиганд CD40, лиганд FLT 3, цитокины, колониестимулирующие факторы, антитело к CTLA-4 (включая, но не ограничиваясь им, ипилимумаб), антитело к PD1 (включая, но не ограничиваясь им, MPDL3280A или дурвалумаб), антитело к 41ВВ, антитело к ОХ-40,
20 LPS (эндотоксин), оцРНК, дцРНК, бациллу Кальмета-Герена (BCG), гидрохлорид левамизола, внутривенные иммунные глобулины и агонист Toll-подобного рецептора (TLR) (например, агонист TLR3, такой как поли-IC, агонист TLR4, агонист TLR5, агонист TLR7, агонист TLR8 и агонист TLR9)), иммуносупрессорный агент, другое антитело или антиген или агонист STING.
25 Опухолевые антигены, которые могут быть включены в молекулярные конъюгаты
или композиции согласно настоящему изобретению (например, в вакцине, применяемой в комбинации с антителом к CD40 согласно настоящему изобретению), включают любой антиген или антигенную детерминанту, которая присутствует (или ассоциирована с ней) на опухолевой клетке, но не на обычных нормальных клетках, или антиген или
30 антигенную детерминанту, которая присутствует или ассоциирована с опухолевыми клетками в большем количестве, чем на нормальных (неопухолевых) клетках, или антиген или антигенную детерминанту, которая присутствует на опухолевых клетках в иной форме, чем на нормальных (неопухолевых) клетках. Такие антигены включают опухолеспецифические антигены, включая опухолеспецифические мембранные антигены,
35 ассоциированные с опухолью антигены, включая ассоциированные с опухолью
мембранные антигены, эмбриональные антигены на опухолях, рецепторы факторов роста, лиганды факторов роста и любой другой тип антигена, который ассоциирован с раком. Опухолевый антиген может представлять собой, например, антиген эпителиального рака (например, рака молочной железы, рака желудочно-кишечного тракта, рака легких), 5 специфический антиген предстательной железы (PSA) или специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA), антиген рака мочевого пузыря, антиген рака легких (например, мелкоклеточного рака легких), антиген рака прямой кишки, антиген рака яичников, антиген рака мозга, антиген рака желудка, антиген карциномы почек, антиген рака поджелудочной железы, антиген рака печени, антиген рака пищевода,
10 антиген рака головы и шеи или антиген колоректального рака. Например, антиген может включать опухолевый антиген, такой как |3hCG, gplOO или Pmell7, СЕА, gplOO, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), идиотип, тирозиназа, теломераза, SSX2, MUC-1, MAGE-АЗ и ассоциированный с меланомой высокомолекулярный антиген (HMW-MAA) MART1, мелан-А, EGFRvIII, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, WT1, Нег2 или мезотелин.
15 Другие антигены, применяемые согласно настоящему изобретению (например, в вакцине, применяемой в комбинации с антителом к CD40 согласно настоящему изобретению), включают антигены патогенов, вызывающих инфекционные заболевания, таких как вирусы, бактерии, паразиты и грибки, примеры которых раскрыты в настоящем документе.
20 Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот,
кодирующих все или части вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепей антител согласно настоящему изобретению, а также к векторам экспрессии, содержащим такие нуклеиновые кислоты, и клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы экспрессии. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения последовательности
25 нуклеиновых кислот выбраны из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 87-112, соответственно, или последовательностей нуклеиновых кислот, которые, например, по меньшей мере на 85%, 90% или 95% идентичны указанным последовательностям нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение также относится к способам усиления иммунного ответа 30 (например, опосредуемого Т-клетками иммунного ответа и/или опосредуемого NK-клетками ответа, и/или опосредуемого В-клетками иммунного ответа) против антигена у субъекта с применением агонистических антител, описанных в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитела связываются с CD40 человека (который экспрессируется на множестве типов иммунных клеток), 35 запуская тем самым пролиферацию и активацию антигенпрезентирующих клеток (АПК) и
активируя В-клетки, а также эффекторные Т-клетки и Т-клетки памяти, что приводит к усилению иммунных ответов, например, против опухолевых клеток. Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы включают введение антитела (например, полноразмерного антитела или его антигенсвязывающей 5 части), композиции или биспецифической молекулы согласно настоящему изобретению в количестве, эффективном для индукции или усиления иммунного ответа против антигена. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы дополнительно включают введение антигена, например, одновременно, по отдельности или после антитела, композиции или биспецифической молекулы.
10 Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования размножения
СО40-экспрессирующих клеток (например, при лечении рака). Например, было показано, что агонистические антитела согласно настоящему изобретению увеличивают экспрессию поверхностных молекул клетки, которые привлекают иммунные эффекторные клетки, что приводит к гибели клеток, например, апоптозу. Следовательно, согласно другому
15 варианту реализации настоящего изобретения способ включает введение или приведение в контакт с клетками антитела (например, полноразмерного антитела или его антигенсвязывающей части), композиции или биспецифической молекулы согласно настоящему изобретению в количестве, эффективном для ингибирования размножения СО40-экспрессирующих клеток.
20 Настоящее изобретение также относится к способам нацеливания антигена на
клетку, например, клетку, способную представлять антиген (например, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), моноциты (такие как ТНР-1), В-лимфобластные клетки (такие как C1R.A2, 1518 B-LCL) и ДК моноцитарного происхождения), у субъекта путем введения молекулы, которая связывается с рецептором на клетке (например, ранее
25 описанные антитела к CD40), соединенной с антигеном.
Способы, описанные в настоящем документе, можно применять при лечении различных заболеваний, в частности, разных видов рака (например, рака, выбранного из группы, включающей лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, такой как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный,
30 моноцитарный и эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелобластный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, первичную лимфому центральной нервной системы, лимфому Беркитта, В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, болезнь Ослера, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема,
35 болезнь тяжелых цепей, солидные опухоли, саркомы и карциномы, фибросаркому,
миксосаркому, липосаркому, хрондросаркому, остеогенную саркому, остеосаркому,
хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому,
лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, саркому толстой кишки, колоректальную карциному, рак 5 поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточную карциному, карциному базальных клеток, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, карциному почек, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному,
10 семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак матки, опухоль яичек, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, немелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, неврому слухового нерва, олигодендроглиому, менангиому, меланому,
15 нейробластому, ретинобластому, карциному носоглотки, карциному пищевода, базальноклеточный рак, рак желчных путей, рак мочевого пузыря, рак костей, рак головного мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рак шейки матки, хориокарциному, разновидности колоректального рака, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, рак эндометрия, рак пищевода, рак глаз, рак головы и шеи, рак
20 желудка, интраэпителиальное новообразование, рак почек, рак гортани, рак печени, рак легких (мелкоклеточный, крупноклеточный), меланому, нейробластому; рак полости рта (например, губы, языка, ротовой полости и глотки), рак яичников, рак поджелудочной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак прямой кишки; рак респираторной системы, саркому, рак кожи, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак матки и
25 рак мочевой системы). Конкретные виды рака включают СО40-экспрессирующие опухоли, выбранные из группы, состоящей из хронического лимфобластного лейкоза, лимфомы из клеток мантийной зоны, первичной лимфомы центральной нервной системы, лимфомы Беркитта и В-клеточной лимфомы из клеток краевой зоны.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы можно
30 применять для лечения или предотвращения бактериальной, грибковой, вирусной или паразитарной инфекции.
СВ40-экспрессирующие клетки включают любые и все клетки, экспрессирующие CD40, включая, но не ограничиваясь указанными, антигенпрезентирующие клетки (АПК), включая дендритные клетки (ДК), В-клетки, макрофаги и моноциты. CD40 также
35 экспрессируется на других типах клеток, таких как эпителиальные клетки,
эндотелиальные клетки и тромбоциты. Экспрессия CD40 была продемонстрирована на различных опухолевых клетках, включая В-клеточную лимфому и клетки рака почек. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения CD40-экспрессирующие клетки включают клеточные линии, такие как клетки линии Jurkat, 5 клетки линии Raji, клетки линии Ramos и клетки линии Daudi. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СО40-экспрессирующие клетки представляют собой опухолевые клетки или раковые клетки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СО40-экспрессирующие клетки включают В-клетки, NK-клетки, Т-клетки, которые, как обнаружено, являются инфильтрирующими опухолевыми или 10 раковыми клетками, также называемыми опухолевыми инфильтрирующими лимфоцитами.
Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение относится к применению антитела, композиции или биспецифической молекулы, описанных в настоящем документе, при производстве лекарственного средства для индукции или
15 усиления иммунного ответа против антигена (например, опухолевого антигена) у субъекта. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение относится к применению антитела или композиции, описанных в настоящем документе, при производстве лекарственного средства для (1) увеличения иммунного ответа на антиген, (2) ингибирования размножения СО40-экспрессирующих клеток, и/или (3) нацеливания
20 антигена на АПК.
Настоящее изобретение также относится к способам детектирования присутствия или отсутствия CD40 в биологическом образце путем (1) приведения биологического образца в контакт с антителом, описанным в настоящем документе (причем антитело помечено детектируемым веществом) и (2) детектирования антитела, связанного с CD40.
25 Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим композиции
(например, антитела и/или биспецифические молекулы) согласно настоящему изобретению, и необязательно инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный реагент, такой как цитокин или комплемент, или одно или более дополнительных антител согласно настоящему
30 изобретению.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания и формулы изобретения. Краткое описание чертежей
На ФИГ. 1 представлены значения равновесной константы диссоциации (KD), 35 кинетической константы скорости ассоциации (коп) и константы скорости диссоциации
(koff) для антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6 и 6Н6, определенные методом интерферометрии биослоев (ВЫ) с использованием прибора Octet(tm) QKe (Pall ForteBio, Менло Парк, Калифорния, США) в соответствии с рекомендациями производителя.
На ФИГ. 2 приведен график, на котором представлены результаты исследования 5 концентрационной зависимости связывания антител к CD40 человека (включая ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6 и 6Н6) с планшетами для микротитрования, покрытыми очищенным рекомбинантным CD40 человека, которое оценивали на основании поглощения (OD450) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
На ФИГ. 3 приведены графики, на которых представлены результаты исследования 10 концентрационной зависимости связывания антител к CD40 человека (ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6 и 6Н6) с очищенными МКПК человека (слева) и МКПК яванских макак (справа), представленные как значения средней интенсивности флуоресценции (MFI), измеренные методом проточной цитометрии.
На ФИГ. 4А и 4В приведены графики, на которых представлены результаты 15 исследования влияния антител к CD40 человека на связывание растворимого лиганда CD40 (sCD40L) с белком CD40, измеренное методом ИФА.
На ФИГ. 5 представлены результаты исследования связывания антител к CD40
человека (ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6 и 6Н6) с CD40 на клетках линии Raji, экспрессирующих
CD40 человека на своей поверхности, измеренного методом проточной цитометрии.
20 На ФИГ. 6 представлены результаты исследования связывания антител к CD40
человека (ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6 и 6Н6) с CD40 на клетках линии Ramos, экспрессирующих CD40 человека на своей поверхности, измеренного методом проточной цитометрии.
На ФИГ. 7А и 7В приведены графики, на которых представлены результаты исследования индукции CD95 на клетках линии Ramos под действием антител к CD40 25 человека.
На ФИГ. 8А и 8В приведены графики, на которых представлены результаты исследования активации дендритных клеток (ДК) под действием антител к CD40 человека (ЗСЗ и 3G5) на основании изменения уровня экспрессии следующих маркеров: CD54, HLA-DR, CD86, CD83 и процента CD83+ клеток, как указано на графиках.
30 На ФИГ. 9А и 9В приведены графики, на которых представлены результаты
исследования индукции ИЛ-12р40 под действием антител к CD40 человека (ЗСЗ и 3G5).
На ФИГ. 10А и 10В приведены графики, на которых представлены результаты исследования активации В-клеток под действием антител к CD40 человека (ЗСЗ и 3G5) на основании изменения уровня экспрессии следующих маркеров: CD54, HLA-DR, CD23,
35 процента CD23+ клеток, CD69, CD86, CD38 и CD71, как указано на графиках.
На ФИГ. ПА и 11В приведены графики, на которых представлены результаты исследования активации NFkB под действием антител к CD40 человека с использованием экспрессирующей CD40 клеточной линии, несущей репортер люциферазу.
На ФИГ. 12 приведены графики, на которых представлены результаты исследования 5 роста опухоли и выживаемости в мышиной опухолевой модели SCID (клетки линии Raji) после лечения с применением клонов антитела к CD40 человека, ЗСЗ и 3G5, путем внутрибрюшинного введения по 0,3 мг/дозу.
На ФИГ. 13 приведены графики, на которых представлены результаты исследования роста опухоли и выживаемости в мышиной опухолевой модели SCID (клетки линии 10 Ramos) после лечения с применением клонов антител к CD40 человека, ЗСЗ и 3G5, путем внутрибрюшинного введения по 0,3 мг/дозу.
На ФИГ. 14А и 14В приведены графики, на которых представлены результаты
исследования пролиферации Т-клеток для меченных МКПК, инкубированных с
антителами к CD40, как указано, или антителом для контроля изотипа (IgG2).
15 На ФИГ. 15 приведен график, на котором представлены результаты исследования
связывания с CD40, независимо от взаимодействия с рецептором Fc, с применением антител к CD40, ЗСЗ и 3G5.
На ФИГ. 16 приведен график, на котором представлены результаты исследования
активации NFKB с применением антител к CD40, ЗСЗ и 3G5.
20 На ФИГ. 17 приведен график, на котором представлены результаты исследования
индукции CD95 на клетках линии Ramos с применением антител к CD40, ЗСЗ и 3G5.
На ФИГ. 18 представлено схематическое изображение примерной нацеленной на АПК вакцинной конструкции, содержащей гибрид антитела к СО40/антигена.
На ФИГ. 19 приведен график, на котором представлены результаты исследования 25 синергического действия антитела к CD40, ЗСЗ, в комбинации с растворимым CD40L на экспрессию CD95 в клетках линии Ramos.
На ФИГ. 20 представлена схема кДНК растворимого CD40, кодирующей
полноразмерный внеклеточный домен (ВКД), охватывающий остатки аминокислот 1-173
с N-концевой легкой каппой-цепью и С-концевой меткой Flag.
30 На ФИГ. 21 представлены результаты выравнивания аминокислотной
последовательности ВКД CD40 человека с аминокислотной последовательностью ВКД CD40 обезьяны (верхняя панель) и с аминокислотной последовательностью ВКД CD40 мыши (нижняя панель). Полученные фрагменты указаны.
На ФИГ. 22 приведены графики, на которых представлены результаты исследования 35 связывания антитела к CD40, ЗСЗ, с фрагментом А ВКД CD40 человека (остатки
аминокислот 1-5, верхняя панель) или фрагментом D (остатки аминокислот 33-36, нижняя панель), содержащими различные точечные мутации или их комбинации.
На ФИГ. 23А-23С приведены графики, на которых представлены результаты исследования уровней аспартатаминотрансферазы (ACT; 23А), аланинаминотрансферазы 5 (АЛТ; 23В) и креатининкиназы (23С), измеренных у обезьян до и после лечения антителами к CD40, ЗСЗ или 3G5, в указанные моменты времени.
На ФИГ. 24 приведен график, на котором представлены результаты исследования
уровней ИЛ-12 (пг/мл), измеренных в крови у обезьян, получавших антитела к CD40, ЗСЗ
или 3G5, в указанные моменты времени.
10 На ФИГ. 25А-25С приведены графики, на которых представлены результаты
подсчета количества лейкоцитов (25А), нейтрофилов (25В) и лимфоцитов (25С) у обезьян до и после лечения антителами к CD40, ЗСЗ или 3G5, в указанные моменты времени.
На ФИГ. 26 приведен график, на котором представлены результаты оценки изменения в процентах, относительно начального уровня, количества В-клеток у обезьян, 15 получавших антитела к CD40, ЗСЗ или 3G5, в зависимости от времени (дни).
На ФИГ. 27 приведены графики, на которых представлены результаты оценки экспрессии HLA-DR на В-клетках, относительно начального уровня, после введения 2 мг (слева) или 0,2 мг (справа) антитела к CD40 ЗСЗ (квадрат), 3G5 (ромбы) или солевого раствора (круги).
20 На ФИГ. 28 приведен график, на котором представлены результаты исследования
пролиферации В-клеток, при культивировании клеток в присутствии МАТ к CD40, ЗСЗ.
На ФИГ. 29 и 30 приведены графики, на которых представлены результаты исследования синергетического действия комбинации МАТ к CD40, ЗСЗ, и CD40L в В-клетках.
25 На ФИГ. 31 представлена таблица, в которой приведены ответы цитокинов в цельной
крови при инкубации с МАТ к CD40, ЗСЗ. Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам к CD40, которые проявляют специфические функциональные свойства, коррелирующие со значительными
30 терапевтическими преимуществами, связанными с активацией иммунной функции (например, опосредуемого Т-клетками иммунного ответа как при различных видах вакциной терапии, активацией NK-клеток при различных видах терапии рака), ингибированием размножения клеток (например, при терапии рака) и/или усиленным процессингом и презентацией антигена АПК (например, при вакцинной терапии). Такие
35 функциональные признаки включают, например, повышенный иммунный ответ на
антиген, не зависящий от связывания с рецептором Fc и/или без индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) или комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗЦ). Дополнительные функциональные признаки включают, например, (1) ингибирование (например, полное или частичное блокирование) 5 связывания CD40L (CD 154) с СО40-экспрессирующими клетками по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%; (2) блокирование связывания CD40L с CD40 человека, не зависящее от связывания с рецептором Fc; (3) индукцию клеточного апоптоза (например, измеренного на основании увеличения экспрессии CD95); (4) повышение активности, направленной на стимуляцию Т-клеток (например,
10 измеренной на основании увеличения экспрессии ИЛ-12р40); и/или (5) увеличение активации В-клеток (например, измеренной на основании увеличения экспрессии по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR V450, С054-ФЭ, С086-АФЦ и CD83 BV510, CD 19 V500, С054-ФЭ, HLA-DR V450, CD23 РегСР-Су5.5, СОб9-АФЦ, С086-АФЦ, CD38 РегСР-Су5.5 и С071-ФЭ.
15 Для лучшего понимания настоящего изобретения в первую очередь приведены
определения некоторых терминов. Дополнительные определения изложены в тексте подробного описания.
Термин "CD40" (также называемый "молекула CD40", "Вр50", "CDW40", "TNFRSF5", "р50", "В-клеточный поверхностный антиген CD40", "ассоциированная с В-
20 клетками молекула", "антиген CD40", "член суперсемейства рецепторов ФНО 5", "изоформа CD40 типа II", "рецептор CD40L", "молекула активации В-лимфоцитов, родственная рецептору фактора роста нервов" или "член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей 5") относится к рецептору, который является членом суперсемейства рецепторов ФНО, который связывается с лигандом CD40L (также
25 называемым CD 154). CD40 выступает посредником широкого спектра иммунных и воспалительных ответов, включая переключение класса иммуноглобулинов, зависящее от Т-клеток, и выработку В-клеток памяти. Термин "CD40" включает любые варианты или изоформы CD40, которые экспрессируются клетками в естественных условиях (например, CD40 человека, депонированный в GenBank(r) под номером доступа № Р25942).
30 Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению могут перекрестно реагировать с CD40 из видов, отличных от человека. В другом варианте антитела могут быть специфическими в отношении CD40 человека и могут не проявлять перекрестной реактивности с другими видами. CD40 или любые его варианты и изоформы могут быть выделены из клеток или тканей, которые экспрессируют их в естественных условиях, или
35 рекомбинантно получены с использованием способов, хорошо известных в данной
области техники и/или описанных в настоящем документе. Предпочтительно антитела нацелены на CD40 человека (чСХ)40), который имеет природный характер гликозилирования.
Аминокислотная последовательность CD40 человека, депонированная в GenBank(r) 5 (номер доступа № Р25942), приведена ниже (SEQ Ш NO: 1):
MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI
10 IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
Термин "CD40L" (также называемый "СБ40-лиганд", "CD407L" или "CD154") относится к лиганду для CD40 (см., например, Schonbeck and Libby (2001) Cell Mol Life Sci, 58(l):4-43). CD40L экспрессируется главным образом на активированных Т-клетках и
15 является членом суперсемейства молекул ФНО. Он связывается с CD40 на антигенпрезентирующих клетках (АПК), что приводит к возникновению множества эффектов в зависимости от типа клеток-мишеней (Parham, Peter (2004). The Immune System (2nd ed.). Garland Science. Pp. 169-173).
Аминокислотная последовательность CD40L человека, депонированная в GenBank(r)
20 (номер доступа № NP_000065), приведена ниже (SEQ ID NO: 2):
MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL DKIEDERNLH EDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDFML NKEETKKENS FEMQKGDQNP QIAAHVISEA SSKTTSVLQW AEKGYYTMSN NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY IYAQVTFCSN REASSQAPFI ASLCLKSPGR
25 FERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE LQPGASVFVN VTDPSQVSHG TGFTSFGLLK
В настоящем документе термин "антитело" включает целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т. е. "антигенсвязывающую часть") или отдельную цепь. "Антитело" относится, согласно одному предпочтительному варианту, к гликопротеину,
30 содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе VH) И константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CHI, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из
3 5 вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе VL)
и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH И VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми 5 каркасными участками (FR). Каждая VH И VL СОСТОИТ ИЗ трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами
10 хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С 1 q) классической системы комплемента.
В настоящем документе термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела") относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, CD40
15 человека). Такие "фрагменты" содержат, например, от приблизительно 8 до приблизительно 1500 аминокислот в длину, приемлемо от приблизительно 8 до приблизительно 745 аминокислот в длину, приемлемо от приблизительно 8 до приблизительно 300 аминокислот в длину, например, от приблизительно 8 до приблизительно 200 аминокислот в длину или от приблизительно 10 до приблизительно
20 50 или 100 аминокислот в длину. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть выполнена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, доменов CL и CHI; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab,
25 соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH И CHI; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL И VH ОДНОГО плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; И (vi) выделенный гипервариабельный участок (CDR); или (vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть
30 соединены синтетическим линкером. Кроме того, несмотря на то, что два домена фрагмента Fv, VL И VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, используя рекомбинантные способы, с помощью синтетического линкера, который позволяет им формировать одну белковую цепь, в которой области VL И VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv), см.,
35 например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также включены в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием обычных методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу для определения их полезности тем же 5 способом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены методами рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов.
"Биспецифическое" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, содержащее две разные пары тяжел ой/легкой цепей и
10 два разных сайта связывания. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или соединение фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
В настоящем документе термин "моноклональное антитело" относится к антителу,
15 которое проявляет единственный вид специфичности связывания и аффинности в отношении конкретного эпитопа. Соответственно, термин "моноклональное антитело человека" относится к антителу, которое проявляет единственный вид специфичности связывания и которое содержит вариабельные и необязательные константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека.
20 Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения моноклональные антитела человека получают с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например, трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.
25 В настоящем документе термин "рекомбинантное антитело человека" включает все
антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных средств, такие как (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для генов иммуноглобулинов человека, или из гибридомы, полученной из такого животного, (Ь)
30 антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других средств, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с
35 другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат
вариабельные и константные области, в которых используются конкретные последовательности иммуноглобулинов зародышевой линии человека, кодируемые генами зародышевой линии, но включают последующие перегруппировки и мутации, которые происходят, например, во время созревания антител. Как известно в данной 5 области техники (см., например, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125), вариабельная область содержит антигенсвязывающий домен, который кодируется различными генами, которые перегруппировываются с образованием антитела, специфичного в отношении чужеродного антигена. В дополнение к перегруппировке вариабельная область может быть дополнительно модифицирована несколькими
10 изменениями отдельной аминокислоты (называемыми соматической мутацией или гипермутацией) для увеличения аффинности антитела в отношении чужеродного антигена. Константная область изменится при последующем ответе на антиген (т. е., произойдет переключение изотипа). Следовательно, перегруппированные и содержащие соматические мутации последовательности молекул нуклеиновых кислот, которые
15 кодируют полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи иммуноглобулина в ответ на антиген, могут не быть идентичны последовательностям исходных молекул нуклеиновых кислот, но, в качестве альтернативы, будут по существу идентичны или сходны с ними (т. е., имеют по меньшей мере 80% идентичность).
Термин "антитело человека" включает антитела, содержащие вариабельные и
20 константные области (если они присутствуют) из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека согласно настоящему изобретению могут содержать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфичного мутагенеза в
25 условиях in vitro или путем соматической мутации в условиях in vivo) (см. Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859); Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY. Acad. Sci 764:536-546). Однако термин "антитело человека" не включает антитела, в которых последовательности CDR,
30 полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты на последовательности каркаса человека (т. е. гуманизированные антитела).
В настоящем документе термин "гетерологичное антитело" определяется по отношению к трансгенному организму, отличному от человека, вырабатывающему такое антитело. Этот термин относится к антителу, содержащему аминокислотную
35 последовательность или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты,
соответствующую той, которая обнаружена в организме, не являющимся трансгенным животным, отличным от человека, и обычно относится к антителу из вида, отличного от вида трансгенного животного, не являющегося человеком.
В настоящем документе термин "выделенное антитело" предназначен для 5 обозначения антитела, которое по существу не содержит других антител, имеющих разные виды антигенной специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD40 человека, по существу не содержит антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от CD40 человека). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, может иметь
10 перекрестную реактивность с другими белками CD40 из разных видов. Тем не менее, антитело предпочтительно всегда связывается с CD40 человека. Помимо этого выделенное антитело, как правило, по существу не содержит других клеточных материалов и/или химических веществ. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения комбинация "выделенных" антител, имеющих разные виды
15 специфичности в отношении CD40, объединена в хорошо установленной композиции.
Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы могут быть образованы как из смежных аминокислот, так и из несмежных аминокислот, сближенных при сворачивании белка в третичную структуру. Эпитопы, образованные из смежных
20 аминокислот, обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные при сворачивании белка в третичную структуру, обычно теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, какие эпитопы связаны
25 данным антителом (т. е., картирование эпитопов), хорошо известны в данной области техники и включают, например, количественные исследования с помощью иммуноблоттинга и иммунопреципитации, в которых перекрывающиеся или смежные пептиды из CD40 испытывают для определения их способности реагировать с данным антителом к CD40. Способы определения пространственной конформации эпитопов
30 включают методики, известные в данной области техники и описанные в настоящем документе, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
Соответственно, антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом, или
35 эпитопом на CD40, который содержит весь или часть эпитопа, распознаваемого
конкретными антителами, описанными в настоящем документе (например, одну и ту же или перекрывающуюся область или область, которая находится в пределах или охватывает область эпитопа), также предусмотрены согласно настоящему изобретению. Антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом или эпитопом, который 5 содержит весь или часть эпитопа, распознаваемого конкретным антителом, могут быть идентифицированы с использованием стандартных методик. Такие методики включают, например, способы картирования эпитопов, такие как рентгеновские исследования кристаллов комплексов антиген:антитело, которые обеспечивают атомное разрешение эпитопа. Другие способы позволяют контролировать связывание антитела с фрагментами
10 антигена или мутированными вариантами антигена, при этом потеря связывания вследствие модификации аминокислотного остатка в последовательности антигена часто рассматривается как указание на эпитопный компонент. Помимо этого для картирования эпитопов также можно применять вычислительные комбинаторные способы. Эти способы основаны на способности антитела, представляющего интерес, обеспечивать аффинное
15 выделение специфических коротких пептидов из комбинаторных пептидных библиотек фагового дисплея. Пептиды затем рассматривают как средство для установления эпитопа, соответствующего антителу, использованному для скрининга библиотеки пептидов. Для картирования эпитопов также были разработаны вычислительные алгоритмы, которые, как было показано, картируют конформационные прерывистые эпитопы.
20 Настоящее изобретение также относится к антителам, которые конкурируют за
связывание с CD40 человека с антителами, описанными в настоящем документе. Антитела, которые конкурируют за связывание, могут быть идентифицированы с использованием стандартных методик. Подходящие методики включают, например, иммунологические количественные исследования, которые показывают способность
25 одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном, т. е. количественное исследование конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяют в количественном исследовании, в котором испытываемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как CD40. Известны многочисленные типы количественных исследований конкурентного
30 связывания, например: прямой или непрямой твердофазный радиоиммуноанализ (RIA), прямой или непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (EIA), количественное исследование конкурентного связывания в формате "сэндвич" (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); прямой твердофазный EIA на основе биотина-авидина (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); прямой твердофазный количественный способ
35 исследований с использованием метки, прямой твердофазный количественный способ
исследований с использованием метки в формате "сэндвич" (см. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); прямой твердофазный RIA с использованием метки 1-125 (см. Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); прямой твердофазный EIA на основе биотина-авидина (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); и 5 прямой RIA с использованием метки (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Как правило, такое количественное исследование включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих любой из немеченого испытываемого иммуноглобулина и меченого эталонного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной
10 с твердой поверхностью или клетками, в присутствии испытываемого иммуноглобулина. Обычно испытываемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или более.
15 В настоящем документе термин "специфическое связывание", "селективное
связывание", "селективно связывается" и "специфически связывается" относится к связыванию антитела с эпитопом на предварительно определенном антигене. Как правило, антитело связывается с равновесной константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно менее 10"7 М, например, приблизительно менее 10"8 М, 10"9
20 М или 10"10 М или даже ниже, определенной методом интерферометрии биослоев (BLI) с использованием прибора Octet(tm) QKE или технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIACORE 2000 с использованием рекомбинантного CD40 человека в качестве аналита и антитела в качестве лиганда, и связывается с заранее определенным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза выше, чем
25 аффинность его связывания с неспецифическим антигеном (например, БСА, казеином), отличным от заранее определенного антигена или близкородственного антигена. В настоящем документе выражения "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное в отношении антигена" используются взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном".
30 В объем настоящего изобретения также включены антитела, которые связываются с
CD40 человека и способны увеличивать иммунный ответ, независимо от связывания с рецептором Fc. Например, такие антитела проявляют сильные агонистические признаки без перекрестного сшивания с рецептором Fc, таким как FcyR. Такие агонистические признаки включают, например, увеличение активности Т-клеток и/или увеличение
активации В-клеток, согласно результатам измерения, например, на основании увеличения экспрессии маркеров клеточной поверхности.
В настоящем документе термин "KD" предназначен для обозначения равновесной константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, 5 антитела человека согласно настоящему изобретению связываются с CD40 с равновесной константой диссоциации (Ко), составляющей приблизительно 10"8 М или менее, например, менее 10"9 М, 10"10 М, 10"11 М или 10"12 М или даже ниже, определенной методом интерферометрии биослоев (ВЫ) с использованием прибора Octet1M QKE или методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIACORE 2000 с 10 использованием рекомбинантного CD40 человека в качестве аналита и антитела в качестве лиганда.
В настоящем документе термин "kd" предназначен для обозначения константы скорости обратной реакции для диссоциации антитела из комплекса антител о/антиген.
В настоящем документе термин "ка" предназначен для обозначения константы 15 скорости прямой реакции для ассоциации антитела с антигеном.
В настоящем документе термин "ЭК50" относится к концентрации антитела или его антигенсвязывающей части, которая индуцирует ответ как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo, который составляет 50% от максимального ответа, т. е. величина ответа находится на середине кривой с конечными точками, соответствующими максимальному 20 ответу и ответу в начальных условиях.
В настоящем документе термин "изотип" относится к классу антител (например, IgM или IgGl), который кодируется генами константной области тяжелой цепи. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения моноклональное антитело человека согласно настоящему изобретению относится к изотипу IgGl. Согласно другому варианту 25 реализации настоящего изобретения моноклональное антитело человека согласно настоящему изобретению относится к изотипу IgG2.
Термин "связывается с иммобилизованным CD40" относится к способности
антитела человека согласно настоящему изобретению связываться с CD40, например,
экспрессируемым на поверхности клетки или прикрепленным к твердой подложке.
30 В настоящем документе термин "перекрестно реагирует" относится к способности
антитела согласно настоящему изобретению связываться с CD40 из разных видов. Например, антитело согласно настоящему изобретению, которое связывается с CD40 человека, также может связываться с CD40 из другого вида. В настоящем документе перекрестную реактивность измеряют путем детектирования специфической реакционной 35 способности в отношении очищенного антигена в количественных исследованиях
связывания (например, SPR, ИФА) или связывания или иного функционального взаимодействия с клетками, экспрессирующими CD40. Способы определения перекрестной реакционной способности включают стандартные количественные исследования связывания, описанные в настоящем документе, например, 5 интерферометрию биослоев (ВЫ) с использованием прибора Octet(tm) QKe или поверхностный плазмонный резонанс (SPR) с использованием прибора Biacore(tm) 2000 SPR (Biacore АВ, Упсала, Швеция) или методики проточной цитометрии.
В настоящем документе термин "переключение изотипа" относится к явлению, при котором класс или изотип антитела изменяется с одного класса Ig на один из других 10 классов Ig.
В настоящем документе термин "непереключенный изотип" относится к изотипическому классу тяжелой цепи, которая вырабатывается в отсутствие переключения изотипа; ген СИ, кодирующий непереключенный изотип, как правило, является первым геном СИ, расположенным непосредственно после функционально
15 перестроенного гена VDJ. Переключение изотипов классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипов. Классическое переключение изотипов происходит посредством событий рекомбинации, которые вовлекают по меньшей мере один участок последовательности переключения в трансгене. Неклассическое переключение изотипов может происходить, например, путем гомологичной
20 рекомбинации между оц человека и человека (о-связанная делеция). Альтернативные неклассические механизмы переключения, такие как интертрансгенная и/или межхромосомная рекомбинация, помимо прочих, также могут происходить и приводить к переключению изотипа.
В настоящем документе термин "последовательность переключения" относится к
25 тем последовательностям ДНК, которые отвечают за рекомбинацию на этапе переключения. Последовательность "донора переключения", как правило, ц-участок переключения, будет расположена в направлении 5'-конца (т. е. перед) относительно участка конструкции, подлежащего удалению во время рекомбинации на этапе переключения. Участок "акцептора переключения" будет находиться между участком
30 конструкции, подлежащим удалению, и константной областью замещения (например, у, s и т. д.). Поскольку не существует конкретного сайта, в котором всегда происходит рекомбинация, конечная последовательность генов, как правило, не может быть предсказана на основании конструкции.
В настоящем документе термин "профиль гликозилирования" определяется как
35 профиль углеводных блоков, которые ковалентно присоединены к белку, более конкретно
к белку иммуноглобулина. Профиль гликозилирования гетерологичного антитела можно охарактеризовать как по существу аналогичный профилям гликозилирования, которые имеют место в естественных условиях на антителах, вырабатываемых видом трансгенного животного, отличного от человека, в том случае, когда специалист в данной области 5 техники установит, что профиль гликозилирования гетерологичного антитела является более сходным с указанным профилем гликозилирования у вида трансгенного животного, отличного от человека, чем у вида, от которого были получены гены СН трансгена.
В настоящем документе термин "природный", применительно к объекту, относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или 10 полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из источника в природе и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной.
В настоящем документе термин "перегруппированный" относится к конфигурации
15 локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, где V-сегмент расположен непосредственно рядом с D-J или J-сегментом в конформации, кодирующей по существу полноразмерный домен VH ИЛИ VL, соответственно, Перегруппированный локус гена иммуноглобулина можно идентифицировать путем сравнения с ДНК зародышевой линии; перегруппированный локус будет содержать по меньшей мере один рекомбинированный
20 гомологический элемент гептамера/нонамера.
В настоящем документе термин "неперегруппированный" или "конфигурация зародышевой линии" в отношении V-сегмента относится к конфигурации, в которой V-сегмент не рекомбинирован так, чтобы примыкать непосредственно к сегменту D или J. В настоящем документе термин "молекула нуклеиновой кислоты" предназначен для
25 включения молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.
В настоящем документе термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", используемый в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или части
30 антитела (например, VH, VL, CDR3), которые связываются с CD40, предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или части антител, которые связывают антигены, отличные от CD40, при этом указанные другие последовательности
3 5 могут фланкировать нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека.
В объем настоящего изобретения также включены "консервативные модификации последовательности" последовательностей, представленных в SEQ Ш N0: 3-132, т. е., модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, которые не устраняют связывание антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или 5 содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном. Такие консервативные модификации последовательности включают консервативные замены нуклеотидов и аминокислот, а также добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Например, модификации могут быть введены в последовательности, представленные в SEQ Ш N0: 3-148, с помощью стандартных методик, известных в данной области техники, таких как
10 сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез. Консервативные замены аминокислот включают те, в которых остаток аминокислоты заменен остатком аминокислоты, имеющим сходную боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин,
15 аргинин, гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), с бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин,
20 валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Следовательно, предсказанный остаток заменимой аминокислоты в антителе к CD40 человека предпочтительно заменен другим остатком аминокислоты из этого же семейства боковых цепей. Способы выявления консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не устраняют связывание антигена, хорошо
25 известны в данной области техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
Консервативные замены могут быть сделаны, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Например, аминокислоты в одном и том же блоке во второй
30 колонке и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут заменять друг друга.
Алифатические
Неполярные
GAP
ILV
Полярные незаряженные
CSTM
мутации могут быть введены случайным образом по всей длине или в части кодирующей последовательности антитела к CD40, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные модифицированные антитела к CD40 могут быть подвергнуты скринингу для 5 оценки активности связывания.
В случае нуклеиновых кислот термин "существенная гомология" указывает на то, что две нуклеиновые кислоты, или их специально выделенные последовательности, при оптимальном выравнивании и сравнении, являются идентичными, с соответствующими вставками или делециями нуклеотидов, в отношении по меньшей мере приблизительно
10 80% нуклеотидов, обычно в отношении по меньшей мере от приблизительно 90% до 95% нуклеотидов и более предпочтительно в отношении по меньшей мере от приблизительно 98% до 99,5% нуклеотидов. В другом варианте значительная гомология существует, если сегменты будут гибридизоваться в селективных условиях гибридизации с комплементарным партнером цепи.
15 Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от количества
идентичных положений, присутствующих в последовательностях (т. е. % гомологии = количество идентичных положений/общее количество положенийхЮО), с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей
20 и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма, описанного в приведенных ниже неограничивающих примерах.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с использованием программы GAP в программном пакете GCG (доступен
25 по веб-адресу http://www.gcg.com) с использованием матрицы NWSgapdna.CMP, штрафа за введение пробела 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафа за продолжение пробела 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями также может быть определен с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), который был встроен в программу ALIGN
30 (версия 2.0) с использованием таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафа за продолжение пробела 12 и штрафа за введение пробела 4. Помимо этого процент
идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), который был встроен в программу GAP в программном пакете GCG (доступен по веб-адресу http://www.gcg.com), используя матрицу Blossum 62 или матрицу РАМ250, и 5 штраф за введение пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штраф за увеличение пробела 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Последовательности нуклеиновых кислот и белков согласно настоящему изобретению можно далее использовать в качестве "последовательности для запроса" для выполнения поиска по общедоступным базам данных, например, для выявления
10 родственных последовательностей. Такие поиски могут быть выполнены с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиски нуклеотидов в BLAST могут быть выполнены с помощью программы NBLAST, оценка = 100, длина слова = 12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот согласно
15 настоящему изобретению. Поиск белка в BLAST может быть выполнен с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка согласно настоящему изобретению. Чтобы получить выравнивания с пробелами для целей сравнения можно применять Gapped BLAST, как описано в Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402.
20 При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота
25 "выделена" или "превращена в по существу чистую" при очистке от других клеточных компонентов или других загрязнений, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик, включая обработку щелочами/ДСН, разделение в градиенте CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие способы, хорошо известные в данной области техники. См. F. Ausubel, et al, ed.
30 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Композиции нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, несмотря на то, что они часто представлены в виде нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), из кДНК, геномной ДНК или их смесей 35 могут быть мутированы в соответствии со стандартными методиками, чтобы обеспечить
последовательности генов. В случае кодирующих последовательностей такие мутации могут влиять на аминокислотную последовательность, если необходимо. В частности, в объем настоящего изобретения включены последовательности ДНК, по существу гомологичные или происходящие из нативных V-, D-, J-, константных 5 последовательностей, переключателей и других таких последовательностей, описанных в настоящем документе (где "происходящие" указывает на то, что последовательность идентична другой последовательности или получена путем ее модификации).
Нуклеиновая кислота "функционально соединена", если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например,
10 промотор или энхансер функционально соединен с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. В отношении регулирующих транскрипцию последовательностей функционально соединенный означает, что соединенные последовательности ДНК являются смежными и, если необходимо соединить две кодирующие белок области, смежными и находящимися в одной рамке
15 считывания. В случае последовательностей переключения функциональное соединение указывает на то, что последовательности способны осуществлять рекомбинацию на этапе переключения.
В настоящем документе термин "вектор" предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с
20 которой она соединена. Один тип вектора представляет собой "плазмиду", которая относится к циклической петле двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они
25 введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и тем самым реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с
30 которыми они функционально соединены. В настоящем документе такие векторы называются "рекомбинантные векторы экспрессии" (или просто "векторы экспрессии"). Обычно векторы экспрессии, подходящие для применения в способах рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто
35 используемой формой вектора. Однако, подразумевается, что в объем настоящего
изобретения включены другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
В настоящем документе термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто 5 "клетка-хозяин") предназначен для обозначения клетки, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной клетки субъекта, но и потомства такой клетки. Поскольку определенные модификации могут произойти в последующих поколениях вследствие как мутаций, так и воздействий окружающей среды, такое 10 потомство не может, фактически, быть идентичным родительской клетке, тем не менее, оно все еще включено в объем термина "клетка-хозяин", используемого в настоящем документе.
В настоящем документе термин "антиген" относится к любому природному или синтетическому иммуногенному веществу, такому как белок, пептид или гаптен.
15 Антигены, подходящие для применения в настоящем изобретении (например, в вакцине в комбинации с антителом к CD40 согласно настоящему изобретению), включают, например, антигены инфекционных заболеваний и опухолевые антигены, против которых желательны защитные или терапевтические иммунные ответы, например, антигены, экспрессируемые опухолевой клеткой или патогенным организмом, или антигены
20 инфекционных заболеваний. Например, подходящие антигены включают ассоциированные с опухолью антигены для предотвращения или лечения рака. Примеры ассоциированных с опухолью антигенов включают, но не ограничиваются указанными, последовательности, содержащие полные последовательности или их части антигенов phCG, gplOO или Pmell7, HER2/neu, WT1, мезотелина, CEA, gplOO, MARTI, TRP-2,
25 мелана-А, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), идиотипа, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, тирозиназы, теломеразы, SSX2 и MUC-1, а также опухолевых антигенов, происходящих из зародышевых клеток. Ассоциированные с опухолью антигены также включают антигены группы крови, например, антигены Le , Le , LeX, LeY, H-2, B-l, В-2. В другом варианте более чем один антиген может быть включен в конструкции антиген-
30 антитело согласно настоящему изобретению. Например, антиген MAGE может быть комбинирован с другими антигенами, такими как меланин А, тирозиназа и gp 100, наряду с адъювантами, такими как ГМ-КСФ или ИЛ-12, и соединен с антителом к АПК.
Другие подходящие антигены включают вирусные антигены для предотвращения или лечения вирусных заболеваний. Примеры вирусных антигенов включают, но не
35 ограничиваются указанными, антигены gag ВИЧ-1, env ВИЧ-1, nef ВИЧ-1, ВГВ
(поверхностные или коровые антигены), ВПЧ, FAS, ВПГ-1, ВГГГ-2, р17, ORF2 и ORF3. Примеры бактериальных антигенов включают, но не ограничиваются указанными, Toxoplasma gondii или Treponema pallidum. Конъюгаты антитело-бактериальный антиген согласно настоящему изобретению можно применять при лечении или предотвращении 5 различных бактериальных заболеваний, таких как сибирская язва, ботулизм, столбняк, хламидиоз, холера, дифтерия, болезнь Лайма, сифилис и туберкулез. Другие подходящие антигены из патогенов, вызывающих инфекционные заболевания, таких как вирусы, бактерии, паразиты и грибки, описаны ниже.
Последовательности вышеуказанных антигенов хорошо известны в данной области
10 техники. Например, пример последовательности кДНК MAGE-3 представлен в патенте США №6235525 (Институт исследований рака Людвига); примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности NY-ESO-1 представлены в патентах США №№5804381 и 6069233 (Институт исследований рака Людвига); примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности мелана-А
15 приведены в патентах США №№5620886 и 5854203 (Институт исследований рака Людвига); примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности NY-BR-1 приведены в патентах США №№ 6774226 и 6911529 (Институт исследований рака Людвига), и примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности NY-CO-58 приведены в WO 02090986 (Институт
20 исследований рака Людвига); пример аминокислотной последовательности белка HER-2/neu доступен в GenBank(r) под номером доступа ААА58637; и нуклеотидная последовательность (мРНК) для сходного с карциноэмбриональным антигеном белка 1 (СЕА-1) человека доступна в GenBank(r) под номером доступа NM_020219.
Антиген ВПЧ, который можно применять в композициях и способах согласно
25 настоящему изобретению, может включать, например, антиген ВПЧ-16, антиген ВПЧ-18, антиген ВПЧ-31, антиген ВПЧ-33 и/или антиген ВПЧ-35; также допустим антиген ВПЧ-16 и/или антиген ВПЧ-18. Геном ВПЧ-16 описан в Virology, 145:181-185 (1985), и последовательности ДНК, кодирующие ВПЧ-18, описаны в патенте США № 5840306, раскрытие которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
30 Антигены ВПЧ-16 (например, серореактивные области белков Е1 и/или Е2 ВПЧ-16) описаны в патенте США № 6531127, и антигены ВПЧ-18 (например, серореактивные области белков L1 и/или L2 ВПЧ-18) описаны в патенте США № 5840306, раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Аналогичным образом, полный геном ВГВ доступен в GenBank(r) под номером доступа NC_003977, раскрытие
35 которого включено в настоящий документ. Геном ВГС описан в Европейской заявке на
патент № 318216, раскрытие которой включено в настоящий документ. В PCT/US90/01348, включенном в настоящий документ посредством ссылки, раскрыта информация о последовательности клонов генома ВГС, аминокислотных последовательностях вирусных белков ВГС и способах получения и применения таких 5 композиций для вакцин против ВГС, содержащих белки ВГС и пептиды, полученные из них.
Антигенные пептиды белков (т. е. те, которые содержат Т-клеточные эпитопы) могут быть выявлены различными способами, хорошо известными в данной области техники. Например, Т-клеточные эпитопы могут быть предсказаны путем анализа
10 последовательности белка с использованием прогностических алгоритмов (BIMAS & SYFPEITHI), доступных в Интернете, чтобы получить потенциальные пептиды, связывающиеся с ГКГС класса I и II, которые соответствуют внутренней базе данных 10000 хорошо охарактеризованных ГКГС-связывающих пептидов, определенных ранее с помощью ЦТЛ. Пептиды с высокими оценками могут быть отнесены к определенной
15 категории и отобраны как "интересные" на основании высокой аффинности в отношении данной молекулы ГКГС.
Другой способ выявления антигенных пептидов, содержащих Т-клеточные эпитопы, заключается в делении белка на неперекрывающиеся пептиды желаемой длины или перекрывающиеся пептиды желаемой длины, которые могут быть получены
20 рекомбинантными, синтетическими способами или, в определенных ограниченных ситуациях, путем химического расщепления белка, и испытания иммуногенных свойств, например, способности вызывать ответы Т-клеток (т. е. пролиферацию или секрецию лимфокинов).
Чтобы определить точные Т-клеточные эпитопы белка, например, с помощью 25 методик точного картирования, пептид, обладающий активностью, направленной на стимуляцию Т-клеток, и, следовательно, содержащий по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп, определенный с помощью методик биологии Т-клеток, может быть модифицирован путем добавления или делеции остатков аминокислот как на амино-конце, так и на карбокси-конце пептида, и испытан для определения изменения 30 реактивности Т-клеток в отношении модифицированного пептида. Если обнаружено, что два или более пептидов, которые имеют область перекрытия в нативной белковой последовательности, обладают активностью, направленной на стимуляцию Т-клеток человека, согласно результатам определения с помощью методик биологии Т-клеток, то могут быть получены дополнительные пептиды, содержащие такие полные пептиды или 35 их часть, и указанные дополнительные пептиды могут быть испытаны с помощью
аналогичной процедуры. Следуя этой методике, пептиды отбирают и получают рекомбинантно или синтетически. Пептиды отбирают на основании различных факторов, включая интенсивность ответа Т-клеток на пептид (например, индекс стимуляции). Физические и химические свойства таких отобранных пептидов (например, 5 растворимость, стабильность) затем можно исследовать для определения пригодности этих пептидов для применения в терапевтических композициях или необходимости модификации пептидов.
Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "АПК" обозначает клетку, которая представляет на своей поверхности чужеродный антиген, образующий комплекс с ГКГС.
10 Т-клетки распознают этот комплекс с помощью Т-клеточного рецептора (TCR). Примеры АПК включают, но не ограничиваются указанными, дендритные клетки (ДК), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), моноциты (такие как ТНР-1), В-лимфобластные клетки (такие как C1R.A2, 1518 B-LCL) и дендритные клетки моноцитарного происхождения (ДК). Некоторые АПК интернализуют антигены путем
15 фагоцитоза или опосредуемого рецепторами эндоцитоза. Примеры рецепторов АПК включают, но не ограничиваются указанными, лектины С-типа, такие как, рецептор дендритных или эпителиальных клеток человека 205 (DEC-205) и макрофагальный рецептор маннозы человека.
Термин "презентация антигена" относится к процессу, посредством которого АПК
20 захватывают антигены и обеспечивают их распознавание Т-клетками, например, в качестве компонента конъюгата ГКГС-I и/или ГКГС-П.
"Молекулы ГКГС" включают два типа молекул, ГКГС класса I и ГКГС класса П. Молекулы ГКГС класса I представляют антиген специфическим CD8+ Т-клеткам, и молекулы ГКГС класса II представляют антиген специфическим CD4+ Т-клеткам.
25 Антигены, доставленные к АПК экзогенно, в первую очередь подвергаются процессингу для ассоциации с ГКГС класса П. Напротив, антигены, доставленные к АПК эндогенно, в первую очередь подвергаются процессингу для ассоциации с ГКГС класса I.
В настоящем документе термин "иммуностимулирующий агент" включает, но не ограничивается указанными, соединения, способные стимулировать АПК, такие как ДК и
30 макрофаги. Например, подходящие иммуностимулирующие агенты для применения в настоящем изобретении способны стимулировать АПК так, что процесс созревания АПК ускоряется, увеличивается пролиферация АПК и/или усиливается привлечение или высвобождение костимулирующих молекул (например, CD80, CD86, ICAM-1, молекул ГКГС и CCR7) и провоспалительных цитокинов (например, ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-15 и
35 ИФН-у). Подходящие иммуностимулирующие агенты также способны увеличивать
пролиферацию Т-клеток. Такие иммуностимулирующие агенты включают, но не ограничиваются указанными, лиганд CD27; лиганд FLT 3; цитокины, такие как ИФН-а, ИФН-Р, ИФН-у и ИЛ-2; колониестимулирующие факторы, такие как Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и ГМ-КСФ (гранулоцитарно-5 макрофагальный колониестимулирующий фактор); антитело к CTLA-4, антитело к PD1, антитело к 41ВВ или антитело к ОХ-40; ЛПС (эндотоксин); оцРНК; дцРНК; бациллу Кальмета-Герена (БЦЖ); гидрохлорид левамизола; и внутривенные иммунные глобулины. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения иммуностимулирующий агент может представлять собой агонист Toll-подобного рецептора (TLR). Например,
10 иммуностимулирующий агент может представлять собой агонист TLR3, такой как двухцепочечный полинуклеотид инозин:цитозин (поли-1:С, например, доступный как амплиген (Ampligen(tm)) от Hemispherx Bipharma, Пенсильвания, США, или поли-1С:ЬС, доступный от Oncovir) или поли-А:П; агонист TLR4, такой как монофосфориллипид А (MPL) или RC-529 (например, доступный от GSK, Великобритания); агонист TLR5, такой
15 как флагеллин; агонист TLR7 или TLR8, такой как имидазохинолин, агонист TLR7 или TLR8, например, имиквимод (например, алдара (Aldara(tm))) или резиквимод и родственные имидазохинолиновые агенты (например, доступные от ЗМ Corporation); или агонист TLR 9, такой как дезоксинуклеотид с неметилированными мотивами CpG (так называемые "CpGs", например, доступные от Coley Pharmaceutical). Предпочтительным
20 иммуностимулирующим агентом является агонист TLR3, предпочтительно поли-1:С. Такие иммуностимулирующие агенты могут быть введены одновременно, по отдельности или последовательно с антителами и конструкциями согласно настоящему изобретению, а также могут быть физически соединены с антителами и конструкциями.
В настоящем документе термин "соединенный" относится к ассоциации двух или
25 более молекул. Связь может быть ковалентной или нековалентной. Связь также может быть генетической (т. е. рекомбинантно гибридизованной). Такие связи могут быть достигнуты с использованием широкого спектра общепринятых в данной области техники методик, таких как химическая конъюгация и получение рекомбинантного белка.
В настоящем документе термин "перекрестная презентация" антигена относится к
30 презентации экзогенных белковых антигенов Т-клеткам посредством молекул ГКГС класса I и класса II на АПК.
В настоящем документе термин "опосредуемый Т-клетками ответ" относится к любому ответу, опосредуемому Т-клетками, включая эффекторные Т-клетки (например, CD8+ клетки) и хелперные Т-клетки (например, CD4+ клетки). Опосредуемые Т-клетками
3 5 ответы включают, например, цитотоксичность и пролиферацию Т-клеток.
В настоящем документе термин "цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ)" относится к иммунному ответу, индуцированному цитотоксическими Т-клетками. Ответы ЦТЛ опосредуются в основном CD8+ Т-клетками.
В настоящем документе термины "ингибирует" или "блокирует" (например, в 5 отношении ингибирования/блокирования связывания CD40L с CD40 на клетках) используются взаимозаменяемо и включают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование CD40L предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип активности, который возникает при связывании CD40L без ингибирования или блокирования. Также подразумевается, что
10 ингибирование и блокирование включают любое измеримое уменьшение аффинности связывания CD40L при контакте с антителом к CD40, по сравнению с CD40L, не вступающим в контакт с антителом к CD40, например, ингибирование связывания CD40L по меньшей мере на приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Согласно
15 конкретному варианту реализации настоящего изобретения антитело к CD40 ингибирует связывание CD40L по меньшей мере на приблизительно 70%, согласно результатам измерения, например, с помощью ВЫ или SPR (Biacore). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к CD40 ингибирует связывание CD40L на по меньшей мере приблизительно 80%.
20 В настоящем документе термин "ингибирует размножение" (например, по
отношению к клеткам) предназначен для включения любого измеримого уменьшения размножения клетки, например, ингибирования размножения клетки по меньшей мере на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%.
Термины "индукция иммунного ответа", "увеличение иммунного ответа" и
25 "усиление иммунного ответа" используются взаимозаменяемо и относятся к стимуляции иммунного ответа (т. е., как пассивного, так и адаптивного) на определенный антиген.
Термины "индуцировать" и "увеличивать", используемые в отношении индукции КЗЦ или АЗКЦ, относятся к стимуляции конкретных механизмов непосредственного уничтожения клеток. Например, согласно одному варианту реализации настоящего
30 изобретения антитело в концентрации 10 мкг/мл индуцирует по меньшей мере приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% или 60% лизис CD40-экспрессирующих клеток посредством КЗЦ. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело в концентрации 10 мкг/мл индуцирует по меньшей мере приблизительно 40% лизис СО40-экспрессирующих клеток посредством
35 КЗЦ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело в
концентрации 10 мкг/мл индуцирует по меньшей мере приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% лизис CD40-экспрессирующих клеток посредством АЗКЦ (т. е. специфический лизис). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело в концентрации 10 мкг/мл 5 индуцирует по меньшей мере приблизительно 40% лизис СВ40-экспрессирующих клеток посредством АЗКЦ.
В настоящем документе термины "лечить", "лечащий" и "лечение" относятся к терапевтическим или профилактическим мерам, описанным в настоящем документе. В способах "лечения" применяют введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении,
10 антитела человека согласно настоящему изобретению, например, субъекту, нуждающемуся в усиленном иммунном ответе против конкретного антигена, или субъекту, у которого в конечном итоге может развиться такое расстройство, чтобы предотвратить, излечить, задержать, уменьшить степень тяжести или улучшить один или более симптомов расстройства или рецидивирующего расстройства, или для того чтобы
15 продлить период выживания субъекта сверх того, который ожидается при отсутствии такого лечения.
Термин "эффективная доза" или "эффективная дозировка" определяется как количество, достаточное для достижения или по меньшей мере частичного достижения желательного эффекта. Термин "терапевтически эффективная доза" определяется как 20 количество, достаточное для излечения или по меньшей мере частичного купирования заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего этим заболеванием. Количества, эффективные для такого применения, будут зависеть от степени тяжести расстройства, которое лечат, и общего состояния собственной иммунной системы пациента.
25 В настоящем документе термин "синергический" означает, что введение двух
лекарственных препаратов оказывает большее влияние при применении в комбинации, чем можно было бы ожидать от суммирования индивидуальных эффектов двух компонентов, например, более чем в два раза, более чем в три раза, более чем в пять раз или более чем в десять раз, чем можно было бы ожидать от суммирования
30 индивидуальных эффектов двух компонентов. Например, взаимодействия лекарственных препаратов можно исследовать с использованием коммерческого программного пакета Calcusyn, который основан на модели медианного эффекта, описанной Chou и Talalay (Chou, Т.С. & Talalay, P. (1984) Adv. Enzyme Regul. 22, 27-55. Quantatative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors).
35 Комбинированный индекс (К.И.) равный 1 указывал на аддитивное взаимодействие
лекарственных препаратов, тогда как К.И. больше 1 указывал на антагонистическое взаимодействие, и оценка ниже 1 указывала на синергическое взаимодействие. Определения значений К.И. заключаются в следующем: 1,45-1,2 является умеренно антагонистическим, 1,2-1,1 является незначительно антагонистическим, 1,1-0,9 является 5 аддитивным, 0,9-0,85 является незначительно синергическим, 0,85-0,7 является умеренно синергическим и 0,7-0,3 является синергическим.
Термин "пациент" включает человека и других субъектов-млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.
В настоящем документе термин "субъект" включает любого человека или животное,
10 отличное от человека. Например, способы и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения субъекта с иммунным расстройством. Термин "животное, отличное от человека" включает всех позвоночных животных, например, млекопитающих и животных, отличных от млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овца, собака, корова, куры, амфибии, рептилии и т. д.
15 Различные аспекты настоящего изобретения более подробно описаны в подразделах
ниже.
I. Получение антител к CD40
Антитела к CD40 согласно настоящему изобретению могут быть получены с
20 использованием ряда известных методик, таких как стандартная методика гибридизации соматических клеток, описанная Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Несмотря на то, что могут быть использованы процедуры гибридизации соматических клеток, в целом можно применять и другие способы получения моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов, методику фагового дисплея с
25 использованием библиотек генов антител человека.
В конкретном (примерном) варианте реализации настоящего изобретения мышь (например, трансгенных мышей линии H2L2 Harbour(r)) или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют подходящим антигеном, чтобы вызывать выработку лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут
30 специфически связываться с антигеном, использованным для иммунизации. В другом варианте лимфоциты могут быть иммунизированы в условиях in vitro. Затем лимфоциты могут быть слиты с клетками миеломы с использованием подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
35 Культуральную среду, в которой размножаются клетки гибридомы, исследуют для
определения выработки моноклональных антител, направленных против антигена. После выявления гибридомных клеток, которые вырабатывают антитела с требуемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы с помощью способа серийных разведений и размножены с помощью стандартных способов 5 (Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Культуральные среды, подходящие для этой цели, включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Помимо этого клетки гибридомы можно размножать в условиях in vivo как асцитные опухоли у животного. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть отделены от культуральной среды, асцитной жидкости или
10 сыворотки с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, очистка на носителе протеин А-сефароза, хроматография на гидроксилапатитном носителе, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела, направленные против CD40, получают с использованием трансгенных или
15 трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а не системы мыши. Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении применяют трансгенных мышей, называемых в настоящем документе "мыши НиМАЬ", которые содержат минилокусы гена иммуноглобулина человека, которые кодируют неперегруппированные последовательности тяжелой цепи (\х и у) и легкой к-цепи
20 иммуноглобулинов, вместе с целевыми мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы цик цепи (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Соответственно, мыши проявляют сниженную экспрессию мышиного IgM или к, и, в ответ на иммунизацию, введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека подвергаются переключению класса и соматическому мутированию для получения высокоаффинных
25 моноклональных антител IgGK человека (Lonberg, N. et al. (1994), см. выше; рассмотрено в Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY. Acad. Sci 764:536-546). Получение мышей HuMAb подробно описано в разделе II ниже и в Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993)
30 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:37203724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al, (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D.
35 (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY.
Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Также см. патенты США №№ 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все выданы Lonberg and Kay, и GenPharm International; патент США №5545807, выданный Surani et al.; международную публикацию WO 5 98/24884, опубликованную 11 июня 1998 г.; WO 94/25585, опубликованную 10 ноября 1994 г.; WO 93/1227, опубликованную 24 июня 1993 г.; WO 92/22645, опубликованную 23 декабря 1992 г.; WO 92/03918, опубликованную 19 марта 1992 г.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела, которые связываются с CD40 человека, могут быть выделены из фаговых библиотек антител,
10 созданных с использованием методик, описанных, например, в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) и Hoet et al (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348; патентах США №№ 5223409; 5403484; и 5571698, выданных Ladner et al.; патентах США №№ 5427908 и 5580717, выданных Dower et al.; патентах США №№ 5969108 и 6172197, выданных
15 McCafferty et al; и патентах США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданных Griffiths et al. Помимо этого для получения высокоаффинных (в диапазоне наномолярных концентраций) антител человека также можно применять способ перестановки цепей (Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторную инфекцию и рекомбинацию в условиях in vivo в качестве стратегии для
20 конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)).
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения антитело, которое связывается с CD40 человека, получают с использованием методики фагового дисплея, описанной Hoet et al, см. выше. Эта методика включает создание библиотеки Fab 25 человека, имеющей уникальную комбинацию последовательностей иммуноглобулинов, выделенных у людей-доноров, и имеющей синтетическое разнообразие в CDR тяжелой цепи. Затем библиотеку подвергают скринингу для выявления Fab, которые связываются с CD40 человека.
Предпочтительной системой на животных для создания гибридом, которые 30 вырабатывают антитела согласно настоящему изобретению, является система на мышах. Получение гибридом у мышей хорошо известно в данной области техники, включая протоколы иммунизации и методики выделения и слияния иммунизированных спленоцитов.
Получение трансфертом, вырабатывающих моноклоналъные антитела к CD40
Антитела согласно настоящему изобретению также могут быть получены в
трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, комбинацию методик
рекомбинантной ДНК и способов трансфекции генов, хорошо известных в данной области
техники (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
5 Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения
представляющий интерес ген (гены), например, гены антитела человека, можно лигировать в вектор экспрессии, такой как плазмида для экспрессии у эукариот, такая как система экспрессии на основе GS-гена, раскрытая в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338841, или другие системы экспрессии, хорошо известные в данной области техники.
10 Очищенную плазмиду с клонированными генами антитела можно вводить в эукариотические клетки-хозяева, такие как клетки линии СНО или клетки линии NSO или, в другом варианте, другие эукариотические клетки, такие как клетки, полученные из растений, грибковые или дрожжевые клетки. Способ, использованный для введения таких генов, может представлять собой способ, описанный в данной области техники, такой как
15 электропорация, липофектин, липофектамин или другие. После введения таких генов антител в клетки-хозяева могут быть выявлены и отобраны клетки, экспрессирующие антитело. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые затем могут быть подвергнуты амплификации для оценки уровня экспрессии, и их количество может быть увеличено для выработки антител. Рекомбинантные антитела могут быть выделены и
20 очищены из супернатантов указанных культур и/или клеток.
В другом варианте такие клонированные гены антител могут быть экспрессированы в других системах экспрессии, таких как Е. coli, или в полных организмах, или могут быть синтетически экспрессированы.
Применение частичных последовательностей антител для экспрессии интактных
25 антител
Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно посредством аминокислотных остатков, которые расположены в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелых и легких цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR более разнообразны в отдельных антителах, чем последовательности вне CDR.
30 Поскольку последовательности CDR ответственны за большую часть взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, путем конструирования векторов экспрессии, которые содержат последовательности CDR из специфического природного антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с
35 отличающимися свойствами (см., например, Riechmann, L. et al, 1998, Nature 332:323-327;
Jones, P. et al, 1986, Nature 321:522-525; и Queen, C. et al, 1989, Proc. Natl Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033). Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК, которые содержат последовательности генов антител зародышевой линии. Такие последовательности зародышевой линии будут отличаться от 5 последовательностей генов зрелых антител, поскольку они не будут содержать полностью собранные вариабельные гены, которые образуются путем У(0)1-соединения во время созревания В-клеток. Последовательности генов из зародышевой линии также будут отличаться от последовательностей высокоаффинных антител вторичного репертуара на индивидуальном уровне и равномерно по всей вариабельной области. Например,
10 соматические мутации относительно редки в амино-концевой части каркасного участка. Например, соматические мутации относительно редки в амино-концевой части каркасного участка 1 и в карбокси-концевой части каркасного участка 4. Кроме того, многие соматические мутации не оказывают существенного влияния на связывающие свойства антитела. По этой причине нет необходимости получать всю последовательность ДНК
15 конкретного антитела для воссоздания интактного рекомбинантного антитела, обладающего связывающими свойствами, которые аналогичны свойствам исходного антитела (см. PCT/US99/05535, поданный 12 марта 1999 г.). Для этой цели обычно достаточно частичной последовательности тяжелых и легких цепей, охватывающей участки CDR. Частичную последовательность применяют, чтобы определить какие
20 вариабельные и соединенные сегменты генов зародышевой линии внесли вклад в рекомбинированные вариабельные гены антител. Последовательность зародышевой линии затем применяют для заполнения отсутствующих частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепей отщепляются во время созревания белка и не вносят вклад в свойства готового антитела. Чтобы добавить отсутствующие
25 последовательности, клонированные последовательности кДНК можно комбинировать с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или амплификации методом ПЦР. В другом варианте полная вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких, перекрывающихся олигонуклеотидов и комбинирована путем амплификации методом ПЦР, чтобы создать клон полностью синтетической вариабельной
30 области. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминация или включение конкретных сайтов рестрикции, или оптимизация конкретных кодонов.
Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей из гибридомы применяют для конструирования перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов, чтобы создать синтетические V-последовательности с идентичными
35 способностями кодировать аминокислоты, как и у природных последовательностей.
Синтетические последовательности тяжелой цепи и легкой каппа-цепи могут отличаться от природных последовательностей тремя путями: нити повторяющихся нуклеотидных оснований прерываются для облегчения синтеза олигонуклеотидов и амплификации ПЦР; оптимальные сайты инициации трансляции встроены в соответствии с правилами Козак 5 (Kozak, 1991, J.Biol. Chem. 266:19867-19870); и сайты Hindlll конструируют в направлении 5 '-конца относительно сайтов инициации трансляции.
В случае вариабельных областей обеих тяжелой и легкой цепей оптимизированные последовательности кодирующих, и соответствующих некодирующих, цепей разбивают на 30-50 нуклеотидов приблизительно в середине соответствующего некодирующего
10 олигонуклеотида. Следовательно, для каждой цепи, олигонуклеотиды могут быть собраны в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем пулы применяют в качестве матриц для получения продуктов ПЦР-амплификации, содержащих 150-400 нуклеотидов. Как правило, отдельный набор олигонуклеотидов вариабельной области будет разбит на два пула, которые
15 амплифицируют по отдельности для создания двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Такие перекрывающиеся продукты затем комбинируют с помощью амплификации методом ПЦР для создания полной вариабельной области. Также желательным может быть включение перекрывающегося фрагмента константной области тяжелой или легкой цепей (включая сайт Bbsl легкой каппа-цепи или сайт Agel в случае тяжелой гамма-цепи)
20 при амплификации методом ПЦР, чтобы получить фрагменты, которые могут быть легко клонированы в конструкции векторов экспрессии.
Восстановленные вариабельные области тяжелой и легкой цепей затем комбинируют с клонированным промотором, лидерной последовательностью, сайтом инициации трансляции, лидерной последовательностью, константной областью, З'-нетранслируемой
25 областью, последовательностью полиаденилирования и сигналом терминации транскрипции, последовательностями для образования конструкций векторов экспрессии. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепей могут быть комбинированы в один вектор, котрансфецированы, последовательно трансфецированы или по отдельности трансфецированы в клетки-хозяева, которые затем сливаются с образованием клетки-
30 хозяина, экспрессирующей обе цепи.
Плазмиды для применения при конструировании векторов экспрессии были сконструированы так, что амплифицированные с помощью ПЦР последовательности кДНК V-тяжелой цепи и V-легкой каппа-цепи могут быть использованы для восстановления полных тяжелых и легких цепей. Указанные плазмиды можно применять
35 для экспрессии полностью антител человека IgGiK или IgG4K. Полностью антитела
человека и химерные антитела согласно настоящему изобретению также включают
антитела IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM и IgD. Сходные плазмиды могут быть
сконструированы для экспрессии других изотипов тяжелой цепи или для экспрессии
антител, содержащих легкие лямбда-цепи.
5 Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения структурные признаки
антител к CD40 согласно настоящему изобретению применяют для создания структурно родственных антител к CD40, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител согласно настоящему изобретению, такое как, например:
(a) индукция или усиление иммунного ответа на антиген, независимо от
10 связывания с рецептором Fc;
(b) индукция или усиление иммунного ответа на антиген без индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) СО40-экспрессирующих клеток;
(c) индукция или усиление иммунного ответа на антиген без индукции комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗЦ) СО40-экспрессирующих клеток;
15 и/или
(d) способность к синергическому действию с CD40L; и/или
Дополнительные признаки могут включать, например:
(d) отсутствие ингибирования или блокирования связывания CD40L;
(e) ингибирование или блокирование связывания CD40L;
20 (f) ингибирование или блокирование связывания CD40L с CD40 человека,
независимо от связывания с рецептором Fc;
(g) индукцию или усиление клеточного апоптоза опухолевой клетки;
(h) индукцию или усиление активности клетки, направленной на стимуляцию Т-клеток (например, измеренной на основании увеличения экспрессии ИЛ-12р40); и/или
25 (i) индукцию или усиление активации В-клеток (например, измеренной на
основании увеличения экспрессии по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR V450, СБ54-ФЭ, С086-АФЦ и CD83 BV510, CD19 V500, СБ54-ФЭ, HLA-DR V450, CD23 РегСР-Су5.5, СБ69-АФЦ, СБ86-АФЦ, CD38 РегСР-Су5.5 и СБ71-ФЭ.
30 Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения один или более
участков CDR антител согласно настоящему изобретению могут быть рекомбинантно комбинированы с известными каркасными участками и CDR для создания дополнительных рекомбинантно-модифицированных антител к CD40 согласно настоящему изобретению. Каркасные участки вариабельных областей тяжелой и легкой
35 цепей могут быть получены из последовательностей одних и тех же или разных антител.
Последовательности антител могут представлять собой последовательности природных
антител или могут представлять собой консенсусные последовательности нескольких
антител. См. Kettleborough et al, Protein Engineering 4:113 (1991); Kolbinger et al., Protein
Engineering 6:971 (1993) и Carter etal, WO 92/22653.
5 Соответственно, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложен способ получения антитела к CD40, включающий: получение антитела, содержащего (1) каркасные участки тяжелой цепи и CDR тяжелой цепи, причем по меньшей мере один из CDR тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, представленных в SEQ Ш N0:
10 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 47, 48, 49, 51, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 103, 104, 105, 106, 107, 108; и (2) каркасные участки легкой цепи и CDR легкой цепи, причем по меньшей мере один из CDR легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, представленных в SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14,
15 15, 16, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 109, ПО, 111, 112, 113, 114; при этом указанное антитело сохраняет способность связываться с CD40. Способность антитела связываться с CD40 может быть определена с использованием стандартных количественных исследований связывания, таких как те, которые указаны в примерах (например, ИФА или
20 FLISA).
В данной области техники хорошо известно, что домены CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антитела в отношении антигена (см. Hall et al., J. Imunol, 149:1605-1612 (1992); Polymenis et al, J. Immunol, 152:5318-5329 (1994); Jahn et al, Immunobiol, 193:400-419 (1995);
25 Klimka et al, Brit. J. Cancer, 83:252-260 (2000); Beiboer et al, J. Mol. Biol, 296:833-849 (2000); Rader et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998); Barbas et al, J. Am. Chem. Soc, 116:2161-2162 (1994); Ditzel et al, J. Immunol, 157:739-749 (1996)). Соответственно, рекомбинантные антитела согласно настоящему изобретению, полученные как изложено выше, предпочтительно содержат CDR3 из тяжелой и/или
30 легкой цепей антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK и 3B6-NS. Антитела также могут содержать CDR2 из антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK и 3B6-NS. Антитела также могут содержать CDR1 из антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1В5-NK и 3B6-NS. Антитела могут дополнительно содержать любые комбинации CDR.
Соответственно, согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение
35 также относится к антителам к CD40, содержащим: (1) каркасные участки тяжелой цепи,
участок CDR1 тяжелой цепи, участок CDR2 тяжелой цепи и участок CDR3 тяжелой цепи, причем указанный участок CDR3 тяжелой цепи выбран из CDR3 антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK, и (2) каркасные участки легкой цепи, участок CDR1 легкой цепи, участок CDR2 легкой цепи и участок CDR3 легкой цепи, причем указанный участок 5 CDR3 легкой цепи выбран из CDR3 антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK или 3B6-NS, при этом указанное антитело связывается с CD40. Антитело может дополнительно содержать CDR2 тяжелой цепи и/или CDR2 легкой цепи антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK или 3B6-NS. Антитело может дополнительно содержать CDR1 тяжелой цепи и/или CDR1 легкой цепи антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2,
10 1B5-NK или 3B6-NS.
Получение антител, имеющих модифицированные последовательности Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательности вариабельных областей, или их частей, антител к CD40 согласно настоящему изобретению модифицированы для создания структурно родственных антител к CD40, которые
15 сохраняют способность к связыванию (т. е. с тем же эпитопом, как и немодифицированное антитело) и, следовательно, функционально эквивалентны. Способы выявления остатков, которые могут быть изменены без устранения связывания антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Marks et al. (Biotechnology (1992) 10(7):779-83 (диверсификация моноклональных антител путем перестановки
20 вариабельных областей легкой цепи, затем вариабельных областей тяжелой цепи с фиксированными изменениями последовательности CDR3), Jespers et а/.(1994) Biotechnology 12(9):899-903 (отбор антител человека, направленных к одному эпитопу антигена, из репертуара фагового дисплея), Sharon et al. (1986) PNAS USA 83(8):2628-31 (сайт-направленный мутагенез инвариантного аминокислотного остатка в соединении
25 сегментов V-D антитела); Casson et al. (1995) J. Immunol. 155(12):5647-54 (эволюция потери и изменение специфичности в результате случайного мутагенеза вариабельной области тяжелой цепи антитела).
Соответственно, согласно одному аспекту настоящего изобретения участки CDR1, 2 и/или 3 модифицированных антител, описанных выше, могут содержать точную
30 аминокислотную последовательность (последовательности), такую как последовательности антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK или 3B6-NS, раскрытые в настоящем документе. Однако согласно другим аспектам настоящего изобретения антитела содержат производные точных последовательностей CDR антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK или 3B6-NS, но по-прежнему сохраняют
35 способность связываться с CD40. Такие модификации последовательности могут
включать одну или более добавок, делеций или замен аминокислот, например, консервативные модификации последовательности, описанные выше. Модификации последовательности также могут быть основаны на консенсусных последовательностях, описанных выше для конкретных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антител ЗСЗ, 5 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK или 3B6-NS.
Соответственно, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения модифицированное антитело может состоять из одного или более CDR, которые, например, на 90%, 95%, 98% или 99,5% идентичны одному или более CDR из антител ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK или 3B6-NS. Подразумевается, что диапазоны, 10 которые являются промежуточными по отношению к указанным выше значениям, например, CDR, которые на 90-95%, 95-98% или 98-100% идентичны одной или более из вышеперечисленных последовательностей, также включены в объем настоящего изобретения.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения один или более
15 остатков CDR могут быть изменены для модификации связывания, чтобы достичь более благоприятной скорости прямой реакции связывания, более благоприятной скорости обратной реакции связывания или и того и другого, так, что достигается идеальная константа связывания. Используя эту стратегию, может быть получено антитело, имеющее сверхвысокую аффинность связывания, например, 1010 М"1 или более. Методики
20 созревания аффинности, хорошо известные в данной области техники и описанные в настоящем документе, можно применять для изменения участка (участков) CDR с последующим скринингом полученных связывающих молекул для выявления желательного изменения связывания. Соответственно, поскольку участок (участки) CDR изменен, изменения аффинности связывания, а также иммуногенности можно
25 контролировать и оценивать так, чтобы получить антитело, оптимизированное для лучшего комбинированного связывания и низкой иммуногенности.
В дополнение к модификациям в CDR или вместо них модификации могут быть сделаны в пределах одного или более каркасных участков, FR1, FR2, FR3 и FR4, вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепей антитела, до тех пор, пока такие
30 модификации не устраняют аффинность связывания антитела. Например, один или более остатков аминокислот, не относящихся к зародышевой линии, в каркасных участках вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепей антитела согласно настоящему изобретению заменены остатком аминокислоты зародышевой линии, т. е., соответствующим остатком аминокислоты в последовательности зародышевой линии
35 человека для вариабельной области тяжелой или легкой цепей, с которой антитело имеет
значительную идентичность последовательности. Например, цепь антитела может быть выровнена с цепью антитела зародышевой линии, с которой она имеет значительную идентичность последовательности, и остатки аминокислот, которые не совпадают между каркасной последовательностью антитела и каркасом цепи зародышевой линии, могут 5 быть заменены соответствующими остатками из последовательности зародышевой линии. Если аминокислота отличается между каркасным участком вариабельной области антитела и эквивалентным каркасным участком вариабельной области последовательности зародышевой линии человека, то аминокислота каркасного участка антитела обычно должна быть заменена эквивалентной аминокислотой из 10 последовательности зародышевой линии человека, если есть основания полагать, что аминокислота попадает в одну из следующих категорий:
(1) остаток аминокислоты, который непосредственно нековалентно связывается с антигеном;
(2) остаток аминокислоты, который находится рядом с участком CDR;
15 (3) остаток аминокислоты, который иным образом взаимодействует с участком
CDR (например, находится в пределах приблизительно 3-6 А от участка CDR, согласно результатам определения с помощью компьютерного моделирования); или
(4) остаток аминокислоты, который участвует в создании границы раздела VL-
VH.
20 Остатки, которые "непосредственно нековалентно связываются с антигеном",
включают аминокислоты в каркасных участках в положениях, которые имеют высокую вероятность непосредственного взаимодействия с аминокислотами на антигене в соответствии с установленными химическими силами, например, с помощью водородной связи, сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий и т.п. Соответственно,
25 согласно одному варианту реализации настоящего изобретения остаток аминокислоты в каркасном участке антитела согласно настоящему изобретению заменен соответствующим остатком аминокислоты зародышевой линии, который непосредственно нековалентно связывается с антигеном.
Остатки, которые "прилегают к участку CDR", включают остатки аминокислот в
30 положениях, непосредственно примыкающих к одному или более CDR в первичной последовательности антитела, например, в положениях, непосредственно примыкающих к CDR, определенных Кабат (Kabat), или CDR, определенных Чотиа (Chothia) (см., например, Chothia and LeskJ. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, остаток аминокислоты в каркасном участке
антитела согласно настоящему изобретению заменен соответствующим остатком аминокислоты зародышевой линии, который примыкает к участку CDR.
Остатки, которые "иным образом взаимодействуют с участком CDR", включают те остатки, которые, как определено с помощью исследования вторичной структуры, 5 находятся в пространственной ориентации, достаточной для воздействия на участок CDR. Такие аминокислоты, как правило, имеют атом боковой цепи в пределах приблизительно 3 ангстрем (А) от некоторого атома в CDR и должны содержать атом, который может взаимодействовать с атомами CDR в соответствии с установленными химическими силами, такими как те, которые перечислены выше. Соответственно, согласно одному 10 варианту реализации настоящего изобретения, остаток аминокислоты в каркасном участке антитела согласно настоящему изобретению заменен соответствующим остатком аминокислоты зародышевой линии, который иным образом взаимодействует с участком CDR.
Известно, что аминокислоты в нескольких положениях в каркасе важны для
15 определения конформации CDR (например, способны взаимодействовать с CDR) во многих антителах (Chothia и Lesk, выше, Chothia et al., выше, и Tramontano et al, J. Mol. Biol. 215:175 (1990), все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки). Авторы указанных литературных источников выявили консервативные каркасные остатки, важные для конформации CDR, путем исследования структур
20 нескольких известных антител. Исследованные антитела входили в ограниченное число структурных или "канонических" классов на основании конформации CDR. Консервативные остатки каркаса в последовательностях членов канонического класса называются "каноническими" остатками. Канонические остатки включают остатки 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 и 95 легкой цепи и остатки 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 и 94
25 тяжелой цепи. Дополнительные остатки (например, остатки, определяющие структуру CDR) могут быть идентифицированы в соответствии с методологией Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263:800. Примечательно, что аминокислоты в положениях 2, 48, 64 и 71 легкой цепи и 26-30, 71 и 94 тяжелой цепи (нумерация по Кабат), как известно, способны взаимодействовать с CDR во многих антителах. Аминокислоты в положениях 35 в легкой
30 цепи и 93 и 103 в тяжелой цепи также, вероятно, могут взаимодействовать с CDR. Дополнительные остатки, которые могут влиять на конформацию CDR, могут быть идентифицированы в соответствии с методологией Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487. Такие остатки называются "верньерными" остатками и представляют собой остатки в каркасном участке, располагающиеся непосредственно под (т. е. образующие
35 "платформу" под) CDR.
Остатки, которые "участвуют в образовании границы раздела VL-VH" или "упаковывающие остатки", включают остатки на границе раздела VL и VH, определенные, например, Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985) или Chothia et al, выше.
5 Иногда возникает некоторое разночтение в отношении того, попадает ли конкретная
аминокислота в одну или более из вышеупомянутых категорий. В таких случаях получают альтернативные варианты антител, одно из которых содержит данную конкретную замену, а другое не содержит. Альтернативные варианты антител, полученные таким способом, могут быть испытаны в любом из количественных исследований, описанных в
10 настоящем документе для определения желательной активности, с отбором предпочтительного антитела.
Дополнительными кандидатами для замены в каркасном участке являются аминокислоты, которые являются необычными или "редкими" для антитела в этом положении. Такие аминокислоты могут быть заменены аминокислотами из
15 эквивалентного положения последовательности зародышевой линии человека или из эквивалентных положений более типичных антител. Например, замена может быть желательной, если аминокислота в каркасном участке антитела является редкой для данного положения, и соответствующая аминокислота в последовательности зародышевой линии является обычной для данного положения в последовательностях
20 иммуноглобулинов; или если аминокислота в антителе является редкой для данного положения, и соответствующая аминокислота в последовательности зародышевой линии также является редкой по сравнению с другими последовательностями. Подразумевается, что антитело может быть сделано менее иммуногенным путем замены необычной аминокислоты аминокислотой из последовательности зародышевой линии, которая
25 является типичной для антител. Замена также может быть желательной, например, в случае неспаренных остатков цистеина или предполагаемых сайтов N-гликозилирования.
В настоящем документе термин "редкий" означает аминокислоту, присутствующую в данном положении менее чем в приблизительно 20%, предпочтительно менее чем в приблизительно 10%, более предпочтительно менее чем в приблизительно 5%, еще более
30 предпочтительно менее чем в приблизительно 3%, даже более предпочтительно менее чем в приблизительно 2% и даже более предпочтительно менее чем в приблизительно 1% последовательностей в репрезентативной выборке последовательностей, и в настоящем документе термин "обычный" означает аминокислоту, присутствующую более чем в приблизительно 25%, но обычно более чем в приблизительно 50% последовательностей в
35 репрезентативной выборке. Например, все последовательности вариабельных областей
легкой и тяжелой цепей соответствующим образом сгруппированы в "подгруппы" последовательностей, которые являются особенно гомологичными друг другу и содержат одни и те же аминокислоты в определенных крайне важных положениях (Kabat et al, выше). При определении того, является ли аминокислота в последовательности антитела 5 "редкой" или "обычной" среди последовательностей, обычно предпочтительным будет рассмотрение только тех последовательностей, которые входят в ту же подгруппу, что и последовательность антитела.
В целом, каркасные участки антител обычно по существу идентичны и, более обычно, идентичны каркасным участкам последовательностей зародышевой линии
10 человека, из которых они были получены. Действительно, многие аминокислоты в каркасном участке практически не влияют на специфичность или аффинность антитела. Следовательно, многие индивидуальные консервативные замены каркасных участков могут быть допустимы без заметного изменения специфичности или аффинности полученного иммуноглобулина. Соответственно, согласно одному варианту реализации
15 настоящего изобретения последовательность каркасного участка вариабельной области антитела по меньшей мере на 85% идентична последовательности каркасного участка вариабельной области зародышевой линии человека или консенсусной области таких последовательностей. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность каркасного участка вариабельной области антитела по меньшей мере
20 на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности каркасного участка вариабельной области зародышевой линии человека или консенсусной области таких последовательностей.
Помимо простого связывания CD40 антитело может быть отобрано на основании его способности сохранять другие функциональные свойства антител согласно настоящему
25 изобретению, такие как, например:
(a) индукция или усиление иммунного ответа на антиген, независимо от связывания с рецептором Fc;
(b) индукция или усиление иммунного ответа на антиген без индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) СО40-экспрессирующих клеток;
30 (с) индукция или усиление иммунного ответа на антиген без индукции
комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗЦ) СО40-экспрессирующих клеток; и/или
(d) способность к синергическому действию с CD40L. Дополнительные признаки могут включать, например:
(е) отсутствие блокирования связывания CD40L с CD40 человека, независимо от связывания с рецептором Fc;
(е) блокирование связывания CD40L с CD40 человека, независимо от
связывания с рецептором Fc;
5 (g) активацию CD40 человека, экспрессированного на АПК, независимо от
связывания с рецептором Fc;
(h) индукцию апоптоза опухолевой клетки;
(i) активность, направленную на стимуляцию Т-клеток; и/или
(j) усиленную активацию В-клеток.
10 Характеристика моноклональных антител к CD40
Моноклональные антитела согласно настоящему изобретению могут быть охарактеризованы в отношении связывания с CD40 с использованием множества известных методик. Обычно антитела в первую очередь характеризуют с помощью ИФА. В общих чертах, планшеты для микротитрования могут быть покрыты очищенным CD40 в
15 фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и затем блокированы с использованием нецелевых белков, таких как бычий сывороточный альбумин (БСА), разбавленный в ФСБ. Разведения плазмы крови мышей, иммунизированных CD40, добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1-2 часов при 37 °С. Планшеты промывают ФСБ/твин-20 и затем инкубируют с поликлональным реагентом козы к IgG Fc человека, конъюгированным со
20 щелочной фосфатазой, в течение 1 часа при 37 °С. После промывания окрашивание в планшетах проявляют с использованием субстрата ABTS и оценивают оптическую плотность при длине волны 405 нм (OD405). Предпочтительно для слияний будут использованы клетки мышей, у которых вырабатывались самые высокие титры.
Количественное исследование методом ИФА, описанное выше, можно использовать
25 для скрининга антитела и, следовательно, гибридом, которые вырабатывают антитела, которые проявляют положительную реактивность с иммуногеном CD40. Гибридомы, которые связываются, предпочтительно с высокой аффинностью, с CD40, затем могут быть субклонированы и дополнительно охарактеризованы. Один клон от каждой гибридомы, который сохраняет реакционную способность исходных клеток (согласно
30 результатам ИФА), затем может быть отобран для получения банка клеток и для очистки антител.
Чтобы очистить антитела к CD40, отобранные гибридомы могут быть размножены в роллерных бутылках, двухлитровых колбах с перемешиванием или других системах культивирования. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед аффинной 35 хроматографией на носителе протеин А-сефароза (Pharmacia, Пискатеуей, Нью-Джерси,
США) для очистки белка. После обмена буфера на ФСБ концентрацию можно определить
на основании значений OD280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43 или
предпочтительно с помощью нефелометрического анализа. IgG может быть проверен с
помощью гель-электрофореза и антигенспецифического способа.
5 Чтобы определить, связываются ли отобранные моноклональные антитела к CD40 с
уникальными эпитопами, каждое антитело может быть биотинилировано с использованием коммерчески доступных реагентов (Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США). Связывание биотинилированного МАТ можно детектировать с помощью меченого стрептавидином зонда. Для определения изотипа очищенных антител может быть
10 выполнен ИФА для определения изотипа с использованием методик, общепризнанных в данной области техники. Например, лунки планшетов для микротитрования могут быть покрыты 10 мкг/мл анти-Ig в течение ночи при 4 °С. После блокирования с использованием 5% БСА планшеты подвергают взаимодействию с 10 мкг/мл моноклональных антител или очищенного антитела для контроля изотипа при
15 температуре окружающей среды в течение двух часов. Затем лунки могут быть подвергнуты взаимодействию либо с IgGl, либо с другими конъюгированными зондами, специфическими для изотипа. Окрашивание в планшетах проявляют и исследуют, как описано выше.
Связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими
20 CD40, может быть испытано с помощью проточной цитометрии. В общих чертах, линии клеток и/или МКПК человека, экспрессирующие связанный с мембраной CD40 (выращенные в стандартных условиях культивирования), смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в ФСБ, содержащем 0,1% БСА, при 4 °С в течение 1 часа. После промывания клетки подвергают взаимодействию с меченым
25 флуоресцеином антителом к IgG в условиях, аналогичных таковым при окрашивании первичным антителом. Образцы могут быть исследованы с помощью прибора FACScan с использованием свойств рассеяния света и бокового рассеяния для пропуска отдельных клеток и определения связывания меченых антител. Может быть применен альтернативный способ количественного исследования с использованием флуоресцентной
30 микроскопии помимо проточной цитометрии или вместо нее. Клетки можно окрашивать с помощью способа, идентичного тому, который описан выше, и исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот способ позволяет визуализировать отдельные клетки, но может иметь сниженную чувствительность в зависимости от плотности антигена.
Способность IgG, направленных против CD40, реагировать с антигеном CD40 также
35 может быть испытана с помощью Вестерн-блоттинга. В общих чертах, клеточные
экстракты из клеток, экспрессирующих CD40, могут быть получены и подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза отделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% мышиной сывороткой и исследуют, используя в качестве зонда 5 моноклональные антитела, подлежащие испытанию. Связывание IgG можно детектировать с использованием антитела к IgG, конъюгированного со щелочной фосфатазой, и окрашивание можно проявлять с использованием таблеток субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., Сент-Луис, Миссури, США).
Способы исследования аффинности связывания, перекрестной реактивности и 10 кинетики связывания различных антител к CD40 включают стандартные количественные исследования, известные в данной области техники, например, поверхностный
тм тм
плазмонный резонанс Biacore (SPR) с использованием прибора Biacore 2000 SPR (Biacore АВ, Уппсала, Швеция) или интерферометрию биослоев (ВЫ) с использованием прибора Octet(tm) QKe, как описано в примерах.
15 Настоящее изобретение также относится к агонистическим антителам к CD40,
которые связываются с тем же эпитопом, как и антитела к CD40, ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK и 3B6-NS (согласно результатам определения с помощью конкретной методики картирования эпитопа). Например, как описано в примере 17, антитела согласно настоящему изобретению (например, антитело ЗСЗ) связываются с одним или более
20 остатками в пределах участка, содержащего остатки аминокислот 1-5 и 33-36 внеклеточного домена (ВКД) CD40 человека (SEQ Ш NO: 133), например, аминокислоты 5, 33, 34 и/или 36 ВКД CD40 человека (SEQ ID NO: 133). Показано, что антитело ЗСЗ дополнительно связывается с одной или более аминокислотами 26, 28 и/или 30 ВКД CD40 человека (SEQ ГО NO: 133), например, аминокислотами 5, 33, 34 и36 ВКД CD40 человека
25 (SEQ ГО NO: 133) или аминокислотами 5, 33 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО NO: 133).
Другие антитела согласно настоящему изобретению (например, антитело 3G5) связываются с одним или более остатками в пределах участка, содержащего остатки аминокислот 13-15 и 33-36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО NO: 133), например, аминокислоты 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО NO: 133).
30 Антитела, которые связываются с эпитопами на CD40 человека, описанные в
настоящем документе (например, с теми же эпитопами, как и примерные антитела), проявляют терапевтически полезные свойства. Например, как показано в примере 16 и 20, антитела ЗСЗ проявляют синергическое агностическое действие с растворимым лигандом CD40 (sCD40L), измеренное, например, на основании увеличения индукции экспрессии
35 CD95 при инкубации с клетками линии Ramos, увеличения пролиферации В-клеток при
инкубации с В-клетками человека и/или увеличения индукции экспрессии ИЛ-12р40 при инкубации с дендритными клетками.
Соответственно, антитела, которые связываются с тем же эпитопом, как и ЗСЗ, способны к синергическому действию с другими терапевтическими агентами, включая те, 5 которые связываются с сайтом связывания лиганда CD40 человека. Типичные синергические эффекты включают, например, повышение иммунной функции (например, опосредуемые Т-клетками иммунные ответы как при различных видах вакцинной терапии, активация NK-клеток при различных видах терапии рака), ингибирование размножения клеток (например, при терапии рака) и/или усиление процессинга и
10 презентации антигена АПК (например, при вакцинной терапии).
Как описано в настоящем документе, методики определения антител, которые связываются с "одним и тем же эпитопом на CD40", как и антитела, описанные в настоящем документе, включают, например, способы картирования эпитопов, такие как рентгенографические исследования кристаллов комплексов антиген:антитело, которые
15 обеспечивают атомное разрешение эпитопа. Другие способы позволяют контролировать связывание антитела с фрагментами антигена или мутированными вариантами антигена, при этом потеря связывания вследствие модификации аминокислотного остатка в антигенной последовательности часто рассматривается как указание на эпитопный компонент. Помимо этого для картирования эпитопов также можно использовать
20 вычислительные комбинаторные методы. Методы также могут быть основаны на способности антитела, представляющего интерес, обеспечивать аффинное выделение специфических коротких пептидов (либо в нативной трехмерной форме, либо в денатурированной форме) из комбинаторных библиотек пептидов для фагового дисплея. Пептиды затем рассматривают как инструмент для определения эпитопа,
25 соответствующего антителу, использованному для скрининга библиотеки пептидов. Для картирования эпитопов также были разработаны вычислительные алгоритмы, которые, как было показано, обеспечивают картирование конформационных прерывистых эпитопов.
П. Молекулярные конъюгаты/иммунотоксины
30 Настоящее изобретение относится к различным терапевтическим молекулярным
конъюгатам (например, к конъюгированным вакцинам), которые содержат антиген, такой как опухолевый или вирусный антиген, соединенный с антителом, которое связывается с рецептором на АПК, например, антителом, которое связывается с CD40. Это позволяет нацеливать антиген на АПК, такие как клетки, экспрессирующие CD40 (например,
35 дендритные клетки, В-клетки и макрофаги) для усиления процессинга, презентации и, в
конечном итоге, иммунного ответа против антигена (ов). Схематическое изображение такого конъюгата представлено на Фигуре 18, на которой, например, антиген генетически гибридизован с доменом СНЗ каждой из тяжелых цепей по существу полного антитела к CD40. Однако следует понимать, что антиген может быть альтернативно соединен с 5 другими частями такого антитела или его фрагмента и что также можно применять другие формы конъюгации, такие как химическая конъюгация, как обсуждается ниже.
Антигены, подходящие для использования в молекулярных конъюгатах, включают, например, антигены инфекционных заболеваний и опухолевые антигены, против которых желательны защитные или терапевтические иммунные ответы, например, антигены,
10 экспрессируемые опухолевой клеткой или патогенным организмом, или антигены инфекционных заболеваний. Например, подходящие антигены включают ассоциированные с опухолью антигены для предотвращения или лечения рака. Примеры ассоциированных с опухолью антигенов включают, но не ограничиваются указанными, последовательности, содержащие полные последовательности или их часть антигенов
15 phCG, gplOO или Pmell7, HER2/neu, WT1, мезотелина, CEA, gplOO, MARTI, TRP-2, мелана-А, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), идиотипа, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, тирозиназы, теломеразы, SSX2 и MUC-1, а также опухолевые антигены, происходящие из зародышевых клеток. Ассоциированные с опухолью антигены также включают антигены группы крови, например, антигены Le , Le , LeX, LeY, H-2, B-l, В-2.
20 В другом варианте в конструкции антиген-антитело согласно настоящему изобретению может быть включено более одного антигена. Например, антиген MAGE может быть комбинирован с другими антигенами, такими как меланин А, тирозиназа и gp 100, наряду с адъювантами, такими как ГМ-КСФ или ИЛ-12, и соединен с антителом, нацеленным к АПК.
25 Другие подходящие антигены включают вирусные антигены для предотвращения
или лечения вирусных заболеваний. Примеры вирусных антигенов включают, но не ограничиваются указанными, gag ВИЧ-1, env ВИЧ-1, nef ВИЧ-1, ВГВ (поверхностные или коровые антигены), ВПЧ, FAS, ВПГ-1, ВПГ-2, р17, ORF2 и ORF3. Примеры бактериальных антигенов включают, но не ограничиваются указанными, Toxoplasma
30 gondii или Treponema pallidum. Конъюгаты антитело-бактериальный антиген согласно настоящему изобретению можно применять при лечении или предотвращении различных бактериальных заболеваний, таких как сибирская язва, ботулизм, столбняк, хламидиоз, холера, дифтерия, болезнь Лайма, сифилис и туберкулез.
Последовательности описанных выше антигенов хорошо известны в данной области
35 техники. Например, пример последовательности кДНК MAGE-3 приведен в патенте США
№6235525 (Институт исследований рака Людвига); примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности NY-ESO-1 приведены в патентах США №№ 5804381 и 6069233 (Институт исследований рака Людвига); примеры последовательности нуклеиновой кислоты и последовательности белка мелана-А 5 приведены в патентах США №№ 5620886 и 5854203 (Институт исследований рака Людвига); примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности NY-BR-1 приведены в патентах США №№ 6774226 и 6911529 (Институт исследований рака Людвига), и примеры последовательности нуклеиновой кислоты и белковой последовательности NY-CO-58 приведены в WO 02090986 (Институт
10 исследований рака Людвига); пример аминокислотной последовательности белка HER-2/neu доступен в GenBank(r) под номером доступа ААА58637; и нуклеотидная последовательность (мРНК) для сходного с карциноэмбриональным антигеном белка 1 человека (СЕА-1) доступна в GenBank(r) под номером доступа NM 020219.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антиген
15 представляет собой антиген ВПЧ, например, антиген ВПЧ-16, антиген ВПЧ-18, антиген ВПЧ-31, антиген ВПЧ-33 и/или антиген ВПЧ-35. Геном ВПЧ-16 описан в Virology, 145:181-185 (1985), и последовательности ДНК, кодирующие ВПЧ-18, описаны в патенте США № 5840306, раскрытие которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Антигены ВПЧ-16 (например, серореактивные области белков Е1
20 и/или Е2 ВПЧ-16) описаны в патенте США № 6531127 и антигены ВПЧ-18 (например, серореактивные области белков L1 и/или L2 ВПЧ-18) описаны в патенте США № 5840306, раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Аналогичным образом, полный геном ВГВ доступен в GenBank(r) под номером доступа NC_003977, раскрытие которого включено в настоящий документ. Геном ВГС описан в Европейской
25 заявке на патент № 318216, раскрытие которой включено в настоящий документ. В PCT/US90/01348, включенном в настоящий документ посредством ссылки, раскрыта информация о последовательности клонов генома ВГС, аминокислотные последовательности вирусных белков ВГС и способы получения и применения таких композиций для вакцин против ВГС, содержащих белки ВГС и полученные из них
30 пептиды.
Антигенные пептиды белков (т. е. те, которые содержат Т-клеточные эпитопы) могут быть выявлены различными способами, хорошо известными в данной области техники. Например, Т-клеточные эпитопы можно предсказать путем исследования последовательности белка с использованием предсказательных алгоритмов, доступных 35 через интернет (BIMAS & SYFPEITHI), для создания потенциальных пептидов,
связывающихся с ГКГС класса I и II, которые соответствуют внутренней базе данных 10000 хорошо охарактеризованных ГКГС-связывающих пептидов, ранее определенных с помощью ЦТЛ. Пептиды с высокими оценками могут быть разделены на классы и отобраны как "интересные" на основании высокой аффинности в отношении данной 5 молекулы ГКГС.
Другой способ выявления антигенных пептидов, содержащих Т-клеточные эпитопы, включает разделение белка на неперекрывающиеся пептиды желаемой длины или перекрывающиеся пептиды желаемой длины, которые могут быть получены рекомбинантными, синтетическими способами или, в определенных ограниченных
10 ситуациях, путем химического расщепления белка, и испытаны для выявления иммуногенных свойств, например, способности вызывать ответ Т-клеток (т. е. пролиферацию или секрецию лимфокинов).
Для того чтобы определить точные Т-клеточные эпитопы белка, например, с помощью методик точного картирования эпитопа, пептид, обладающий активностью,
15 направленной на стимуляцию Т-клеток, и, следовательно, содержащий по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп, определенный с помощью методик биологии Т-клеток, может быть модифицирован путем добавления или делеции остатков аминокислот на амино- или карбокси-конце пептида и испытан для определения изменения реактивности Т-клеток в отношении модифицированного пептида. Если обнаружено, что два или более пептидов,
20 которые имеют область перекрывания в нативной белковой последовательности, обладают активностью, направленной на стимуляцию Т-клеток человека, определенной с помощью методик биологии Т-клеток, то могут быть получены дополнительные пептиды, содержащие такие полные пептиды или их часть, и такие дополнительные пептиды могут быть испытаны с помощью аналогичной процедуры. Следуя этой методике, пептиды
25 отбирают и получают рекомбинантными или синтетическими способами. Пептиды отбирают на основании различных факторов, включая интенсивность ответа Т-клеток на пептид (например, индекс стимуляции). Физические и химические свойства таких отобранных пептидов (например, растворимость, стабильность) затем могут быть исследованы для определения пригодности пептидов для применения в терапевтических
30 композициях или необходимости модификации пептидов.
Помимо этого конъюгированная вакцина может содержать один или более иммуностимулирующих агентов, которые также усиливают иммунный ответ против антигена. Конъюгированные вакцины антитело-антиген согласно настоящему изобретению могут быть получены генетическими или химическими способами. В любом
35 случае антительная часть конъюгата может состоять из полного антитела или части
антитела, такой как фрагмент Fab или одноцепочечный Fv. Помимо этого в конъюгат может быть включено более одного антигена и/или иммуностимулирующего агента.
Химически сконструированные конъюгаты антитело-антиген могут быть получены с использованием ряда хорошо известных и легко доступных сшивающих реагентов. 5 Подходящие сшивающие реагенты могут представлять собой гомофункциональные или гетерофункциональные соединения, такие как Тч[-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), М-сукцинимидил-Б-ацетилтиоапетат (SATA), сульфосукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), 5,5'-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (DTNB), которые образуют ковалентные связи с
10 различными реакционноспособными аминокислотными или боковыми цепями углеводов на антителе, нацеленном к ДК, и выбранном антигене. Другие связывающие и сшивающие агенты также можно применять для получения ковалентных связей, такие как протеин А, карбодиимид и о-фенилендималеимид (oPDM); (см., например, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие
15 способы включают те, которые описаны Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), и Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 23672375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются SATA и сульфо-SMCC, оба доступны от Pierce Chemical Со. (Рокфорд, Иллинойс, США). Иммуностимулирующие агенты также могут быть химически соединены с молекулярными конъюгатами согласно
20 настоящему изобретению, используя те же способы соединения, которые описаны выше.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению соединены с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксин, лекарственный препарат или радиоизотоп. Если антитела конъюгированы с цитотоксином, такие конъюгаты антител называются "иммунотоксины". Цитотоксин или
25 цитотоксический агент включает любой агент, который вреден (например, вызывает гибель) для клеток. Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин,
30 пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают, но не ограничиваются указанными, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин,
35 митомицин С и цис-дихлордиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины
(например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Антитело согласно настоящему изобретению можно конъюгировать с радиоизотопом, например, 5 радиоактивным йодом, для получения цитотоксических радиофармацевтических препаратов для лечения расстройства, связанного с дендритными клетками, такого как аутоиммунное или воспалительное заболевание, или болезнь "трансплантат против хозяина".
Конъюгаты антител согласно настоящему изобретению можно применять для
10 модификации определенного биологического ответа, и лекарственный фрагмент не следует истолковывать как ограниченный классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственный фрагмент может представлять собой белок или полипептид, обладающий желательной биологической активностью. Подходящие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент,
15 такой как абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-у; или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 ("ИЛ-1"), интерлейкин-2 ("ИЛ-2"), интерлейкин-6 ("ИЛ-6"), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ("ГМ-КСФ"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("Г-КСФ") или
20 другие факторы роста.
Методики конъюгирования такого терапевтического фрагмента с антителами хорошо известны, см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery)), в Controlled
25 Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review)), в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)), в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et
30 al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), и Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)), Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). III. Композиции
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, например, композиция, содержащая одно или более моноклональных антител 35 согласно настоящему изобретению, приготовленная совместно с носителем (например,
фармацевтически приемлемым носителем). Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим биспецифические молекулы, которые содержат антитело согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композиции содержат комбинацию нескольких (например, двух или более) 5 выделенных антител согласно настоящему изобретению. Предпочтительно каждое из антител композиции связывается с отдельным, предварительно отобранным эпитопом CD40.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению также можно вводить в виде комбинированной терапии, т. е. в комбинации с другими агентами.
10 Например, комбинированная терапия может включать композицию согласно настоящему изобретению с по меньшей мере одним или более дополнительными терапевтическими агентами, такими как противовоспалительные агенты, DMARD (противоревматические препараты, модифицирующие течение болезни), иммуносупрессорные агенты и химиотерапевтические агенты. Фармацевтические композиции согласно настоящему
15 изобретению также можно вводить в комбинации с лучевой терапией. Совместное введение с другими антителами также включено в объем настоящего изобретения.
В настоящем документе термины "носитель" и "фармацевтически приемлемый носитель" включают любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие
20 всасывание агенты и т. п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение, т. е. антитело, биспецифическая и полиспецифическая молекула, может быть покрыто материалом для
25 защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.
Примеры адъювантов, которые можно применять с антителами и конструкциями согласно настоящему изобретению, включают: неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США); Merck Adjuvant 65
30 (Merck and Company, Inc., Рэуей, Нью-Джерси, США); AS-2 (SmithKline Beecham, Филадельфия, Пенсильвания, США); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимую суспензию ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно-или анионно-дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биоразлагаемые
35 микросферы; цитокины, такие как ГМ-КСФ, интерлейкин-2, -7, -12 и другие подобные
факторы; ЗД-МФЛ; олигонуклеотид CpG; и монофосфориллипид А, например, З-де-О-ацилированный монофосфориллипид А.
Адъюванты МФЛ доступны от Corixa Corporation (Сиэтл, Вашингтон, США, см., например, патенты США №№ 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094). CpG-содержащие 5 олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG не метилирован) хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555, WO 99/33488 и патентах США №№ 6008200 и 5856462. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описаны, например, Sato et al., Science 273:352, 1996.
Другие альтернативные адъюванты включают, например, сапонины, такие как Quil А
10 или его производные, включая QS21 и QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Фрамингем, Массачусетс, США); эскин; дигитонин; или сапонины Gypsophila или Chenopodium quinoa; Montanide ISA 720 (Seppic, Франция); SAF (Chiron, Калифорния, США); ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron); серию адъювантов SBAS (например, SBAS-2 или SBAS-4, доступные от SmithKline Beecham, Риксансар, Бельгия); детокс (энханзин(tm)) (Corixa,
15 Гамильтон, Монтана, США); RC-529 (Corixa, Гамильтон, Монтана, США) и другие аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты (AGP); адъюванты на основе простых эфиров полиоксиэтилена, такие как те, которые описаны в WO 99/52549А1; синтетические имидазохинолины, такие как имиквимод [S-26308, R-837] (Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001) и резиквимод [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al., Cellular immunology 204:
20 64-74, 2000); основания Шиффа карбонилов и аминов, которые конститутивно экспрессируются на антигенпрезентирующих клетках и поверхностях Т-клеток, такие как тукарезол (Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995), цитокины, хемокины и костимулирующие молекулы, такие как белок или пептид, включая, например, провоспалительные цитокины, такие как интерферон, ГМ-КСФ, ИЛ-1 альфа, ИЛ-1 бета,
25 TGF-альфа и TGF-бета, индукторы ТЫ, такие как интерферон-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и ИЛ-21, индукторы Th2, такие как ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-13 и другие хемокины, и костимулирующие гены, такие как МСР-1, MIP-1 альфа, MIP-1 бета, RANTES, ТСА-3, CD80, CD86 и CD70; иммуностимулирующие агенты, нацеленные на лиганды, такие как CTLA-4 и L-селектин, стимулирующие апоптоз белки и пептиды,
30 такие как Fas; синтетические адъюванты на основе липидов, такие как ваксфектин (Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001), сквален, альфа-токоферол, полисорбат 80, DOPC и холестерин; эндотоксин, [ЛПС], (Beutler, В., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); лиганды, которые запускают Toll-рецепторы для выработки ТЫ -индуцирующих цитокинов, такие как синтетические микобактериальные липопротеины,
35 микобактериальный белок р19, пептидогликан, тейхоевая кислота и липид А; и XT
(холерный токсин, субъединицы А и В) и LT (термолабильный энтеротоксин из Е. coli, субъединицы А и В), семейства белков теплового шока (HSP) и LLO (листериолизин О, WO 01/72329). Перечисленные и различные другие агонисты Toll-подобного рецептора (TLR) описаны, например, в Kanzler et al, Nature Medicine, May 2007, Vol 13, No 5. 5 Предпочтительным иммуностимулирующим агентом для применения в комбинации с антителом к CD40 согласно настоящему изобретению является агонист TLR3, такой как поли-IC.
"Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает нежелательного
10 токсического действия (см., например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфорная и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких
15 как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфокислоты и тому подобное. Основно-аддитивные соли включают соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N,N-
20 дибензилэтилендиамин, N-метилглю камин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.
Композицию согласно настоящему изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области техники. Специалист в данной области техники поймет, что путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от
25 желательных результатов. Активные соединения могут быть получены с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, например, состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и системы доставки, заключенные в микрокапсулы. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат,
30 полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или известны специалистам в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Для введения соединения согласно настоящему изобретению с помощью
35 определенных путей введения может потребоваться нанесение покрытия на это
соединение или совместное введение соединения с материалом, предотвращающим его инактивацию. Например, соединение может быть введено субъекту в подходящем носителе, например, липосомах, или разбавителе. Приемлемые разбавители включают солевые и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии "вода-в-масле в 5 воде" CGF, а также обычные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсии для инъекций. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любые обычные
10 среды или агент не совместимы с активным соединением, в объем настоящего изобретения включено их применение в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в
15 условиях производства и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие
20 их смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических агентов, например, Сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Длительное
25 всасывание композиций для инъекций может быть достигнуто путем включения в композицию агента, который задерживает всасывание, например, моностеаратных солей и желатина.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активного соединения в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или
30 комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Обычно дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, выбранные из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных
35 растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются вакуумная
сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые позволяют получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из раствора, ранее стерилизованного путем фильтрования.
Схемы дозирования корректируют так, чтобы обеспечить оптимальный желательный 5 ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены на протяжении определенного периода времени, или доза может быть пропорционально снижена или увеличена в соответствии с требованиями терапевтической ситуации. Например, антитела согласно настоящему изобретению могут быть введены один или два раза в неделю путем подкожной или
10 внутримышечной инъекции или один или два раза в месяц путем подкожной или внутримышечной инъекции.
Особенно полезным является приготовление композиций для парентерального введения в виде стандартной лекарственной формы для удобства введения и единообразия дозировки. В настоящем документе стандартная лекарственная форма относится к
15 физически дискретным единицам, подходящим в качестве унифицированных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желательного терапевтического действия в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Описание стандартной лекарственной формы согласно настоящему изобретению
20 обусловлено и зависит непосредственно от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического действия, которое должно быть достигнуто, и (Ь) исходных ограничений технологии смешивания такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1)
25 водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) хелатирующие металлы агенты, такие как лимонная кислота,
30 этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.
В случае терапевтических композиций составы согласно настоящему изобретению включают те, которые подходят для перорального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), ректального, вагинального и/или парентерального 35 введения. Для удобства составы могут быть представлены в виде стандартной
лекарственной формы и могут быть получены любыми способами, известными в области фармацевтики. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной стандартной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и конкретного способа 5 введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной стандартной лекарственной формы, обычно будет представлять собой такое количество композиции, которое обеспечивает терапевтическое действие. Обычно из ста процентов такое количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001% до приблизительно девяноста процентов активного
10 ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,005% до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,01% до приблизительно 30%.
Составы согласно настоящему изобретению, которые пригодны для вагинального введения, также включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или аэрозольные составы, содержащие носители, которые известны в данной области техники.
15 Лекарственные формы для местного или трансдермального введения композиций согласно настоящему изобретению включают порошки, аэрозольные препараты, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, патчи и ингаляционные препараты. Активное соединение можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут
20 потребоваться.
В настоящем документе выражения "парентеральное введение" и "вводимые парентерально" означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают, но не ограничиваются указанными, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную,
25 внутрикапсулярную, внутриорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, подкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, внутриспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в
30 фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования материалов для покрытия, таких как
лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.
Подходящие композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. 5 Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как с помощью процедур стерилизации, описанных выше, так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Желательным также может быть включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Помимо этого
10 пролонгированное всасывание фармацевтической формы для инъекций может быть обеспечено путем включения агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.
В случае если соединения согласно настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических препаратов, человеку и животным, они могут быть введены по
15 отдельности или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,001% до 90% (более предпочтительно от 0,005% до 70%, например, от 0,01% до 30 %) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Независимо от выбранного пути введения соединения согласно настоящему изобретению, которые можно применять в подходящей гидратированной форме, и/или
20 фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению получают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью обычных способов, известных специалистам в данной области техники.
Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению могут варьироваться так, чтобы получить
25 количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желательного терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретных композиций согласно настоящему изобретению или их сложного эфира, соли или амида, пути введения,
30 времени введения, скорости выделения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов, соединений и/или материалов, использованных в комбинации с конкретными примененными композициями, возраста, пола, массы, состояния, общего состояния здоровья и предшествующей истории болезни пациента, которого лечат, и подобных факторов, хорошо известных в медицине.
35 Врач или ветеринар, имеющий стандартную квалификацию в данной области техники,
может легко определить и назначить эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать введение доз соединений согласно настоящему изобретению, примененных в фармацевтической композиции, на более низких уровнях, чем те, которые требуются для достижения 5 желательного терапевтического действия, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желательного действия. Обычно подходящая суточная доза композиции согласно настоящему изобретению составит то количество соединения, которое представляет собой самую низкую дозу, эффективную для получения терапевтического действия. Такая эффективная доза обычно будет зависеть от факторов, описанных выше.
10 Предпочтительный способ введения включает внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение, предпочтительно проксимально относительно целевого места. При необходимости, эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, вводимых по отдельности через соответствующие интервалы времени в
15 течение суток, необязательно, в виде стандартных лекарственных форм. Несмотря на то, что соединение согласно настоящему изобретению может быть введено по отдельности, предпочтительным является введение соединения в виде фармацевтического состава (композиции).
Терапевтические композиции могут быть введены с помощью медицинских 20 устройств, известных в данной области техники. Например, в предпочтительном варианте реализации, терапевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена с помощью устройства для подкожных инъекций без иглы, такого как устройства, раскрытые в патентах США №№ 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824, или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, которые можно 25 применять в настоящем изобретении, включают: патент США № 4487603, в котором раскрыт имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США № 4486194, в котором раскрыто терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; патент США № 4447233, в котором раскрыт инфузионный насос для введения лекарственного 30 средства с точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, в котором раскрыт имплантируемый инфузионный аппарат с регулируемой скоростью потока для непрерывной доставки лекарственного препарата; патент США № 4439196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарственного препарата, имеющая многокамерные отсеки; и патент США № 4475196, в котором раскрыта осмотическая
система доставки лекарственного препарата. Специалистам в данной области техники известны многие другие подходящие имплантаты, системы доставки и модули.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены, чтобы обеспечить 5 надлежащее распределение в условиях in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) не пропускает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы гарантировать, что терапевтические соединения согласно настоящему изобретению пересекут ГЭБ (если необходимо), они могут быть приготовлены, например, в липосомах. Способы получения липосом описаны, например, в патентах США №№ 4522811; 5374548; и 5399331.
10 Липосомы могут содержать один или более фрагментов, которые селективно переносятся в определенные клетки или органы, повышая тем самым целевую доставку лекарственного препарата (см., например, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Примерные нацеливающие фрагменты включают фолат или биотин (см., например, патент США № 5416016, выданный Low et al); маннозиды (Umezawa et al, (1988) Biochem.
15 Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитела (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); рецептор протеина A сурфактанта (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), различные виды которого могут содержать составы согласно изобретениям, а также компоненты изобретенных молекул; р120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); также см. К. Keinanen; M L.
20 Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтические соединения согласно настоящему изобретению приготовлены в липосомах; в более предпочтительном варианте реализации липосомы включают нацеливающий фрагмент. В наиболее предпочтительном варианте реализации терапевтические соединения в
25 липосомах доставляют путем болюсной инъекции в участок, ближайший к опухоли или очагу инфекции. Композиция должна быть жидкой в такой степени, чтобы обеспечить проходимость через иглу. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть устойчива к загрязняющему действию микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.
30 Способность соединения ингибировать рак можно оценить в модельной системе на
животных, которая позволяет прогнозировать эффективность в опухолях человека. В другом варианте это свойство композиции можно оценить, исследуя ингибиторную способность соединения, такое ингибирование можно оценить в условиях in vitro с помощью количественных способов исследований, известных квалифицированному
35 практику. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может
уменьшить размер опухоли или иным образом улучшить симптомы у субъекта.
Специалист в данной области техники сможет определить такие количества на основании
таких факторов как размер субъекта, степень тяжести симптомов субъекта и выбранной
конкретной композиции или пути введения.
5 Композиция должна быть стерильной и жидкой в такой степени, чтобы обеспечить
доставку композиции с помощью шприца. Помимо воды носитель может представлять собой изотонический буферный солевой раствор, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие их смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью покрытия, такого как
10 лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным является включение в композиции изотонических агентов, например, Сахаров, полиспиртов, таких как маннит или сорбит, и хлорида натрия. Длительное всасывание инъекционных композиций может быть обеспечено путем включения в композицию
15 агента, который замедляет всасывание, например, моностеарата алюминия или желатина.
Когда активное соединение защищено соответствующим образом, как описано выше, соединение может быть введено перорально, например, с инертным разбавителем или ассимилируемым съедобным носителем.
IV Варианты применения и способы согласно настоящему изобретению
20 Антитела, молекулярные конъюгаты, биспецифические молекулы и композиции
согласно настоящему изобретению можно применять для лечения и/или предотвращения ряда заболеваний и состояний (например, иммунизации против них).
Одним из основных показаний для лечения является рак. Типы рака включают, но не ограничиваются указанными, лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый
25 миелобластный лейкоз, такой как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелобластный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, первичную лимфому центральной нервной системы, лимфому Беркитта и В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, болезнь Ослера,
30 ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, солидные опухоли, саркомы и карциномы, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хрондросаркому, остеогенную саркому, остеосаркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому,
35 рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, колоректальную карциному, рак
поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, цистаденокарциному, медуллярную карциному, 5 бронхогенную карциному, карциному почек, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак матки, опухоль яичек, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, немелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому,
10 пениалому, гемангиобластому, неврому слухового нерва, олигодендроглиому, менангиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, карциному носоглотки, карциному пищевода, базальноклеточную карциному, рак желчных путей, рак мочевого пузыря, рак костей, рак головного мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рак шейки матки, хориокарциному, разновидности колоректального рака, рак соединительной
15 ткани, рак пищеварительной системы, рак эндометрия, рак пищевода, рак глаз, рак головы и шеи, рак желудка, внутриэпителиальное новообразование, рак почек, рак гортани, рак печени, рак легких (мелкоклеточный, крупноклеточный), меланому, нейробластому; рак полости рта (например, губы, языка, ротовой полости и глотки), рак яичников, рак поджелудочной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак прямой кишки; рак
20 дыхательной системы, саркому, рак кожи, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак матки и рак мочевыделительной системы. Конкретные виды рака включают СХ)40-экспрессирующие опухоли, выбранные из группы, состоящей из хронического лимфобластного лейкоза, лимфомы из клеток мантийной зоны, первичной лимфомы центральной нервной системы, лимфомы Беркитта и В-клеточной лимфомы из клеток
25 краевой зоны.
Антитела и конъюгаты согласно настоящему изобретению также можно применять для лечения бактериальных, грибковых, вирусных и паразитарных инфекционных заболеваний.
При применении в терапии антитела согласно настоящему изобретению можно 30 вводить субъекту непосредственно (т. е., в условиях in vivo), либо в виде монотерапии, либо с другими видами терапии, такими как иммуностимулирующий агент, вакцина, химиотерапия или лучевая терапия. Во всех случаях антитела, конъюгаты, биспецифические молекулы, композиции и иммуностимулирующие агенты и другие виды терапии вводят в эффективном количестве, чтобы осуществить желательное 35 терапевтическое действие. Термин "эффективное количество" относится к тому
количеству, которое является необходимым или достаточным для осуществления желательного биологического эффекта. Например, эффективным количеством может быть количество, необходимое для устранения опухоли, рака или бактериальной, вирусной или грибковой инфекции. Эффективное количество для любого конкретного применения 5 может варьироваться в зависимости от таких факторов как заболевание или состояние, которое лечат, конкретное вводимое антитело, размер субъекта или степень тяжести заболевания или состояния. Специалист в данной области техники может эмпирически определить эффективное количество конкретной молекулы без излишних экспериментов. Предпочтительные пути введения включают, например, инъекцию (например,
10 подкожную, внутривенную, парентеральную, внутрибрюшинную, интратекальную). Инъекция может быть выполнена в виде болюса или непрерывной инфузии. Другие пути введения включают пероральное введение.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело вводят в комбинации с вакцинным антигеном для усиления иммунного ответа против вакцинного
15 антигена, такого как опухолевый антиген (усиливая тем самым иммунный ответ против опухоли) или антиген из возбудителя инфекционного заболевания (усиливая тем самым иммунный ответ против возбудителя инфекционного заболевания). Вакцинный антиген может представлять собой любой антиген или антигенную композицию, способную вызывать иммунный ответ против опухоли или против возбудителя инфекционного
20 заболевания, такого как вирус, бактерия, паразит или грибок. Он также может представлять собой, например, неоантиген, такой как те, которые получают в результате секвенирования опухолей пациентов. Антиген или антигены могут представлять собой, например, пептиды/белки, полисахариды и/или липиды, или могут быть введены в виде нуклеиновых кислот (таких как ДНК), кодирующих пептидные или белковые антигены,
25 которые могут быть экспрессированы в условиях in vivo. Антиген или антигены, происходящие из опухолей, такие как различные опухолевые антигены, описаны выше в настоящем документе. В другом варианте антиген или антигены могут быть получены из патогенов, таких как вирусы, бактерии, паразиты и/или грибки, такие как различные патогенные антигены, описанные выше в настоящем документе. Дополнительные
30 примеры подходящих патогенных антигенов включают, но не ограничиваются указанными, следующие:
Вирусные антигены или антигенные детерминанты могут быть получены, например, из: цитомегаловируса (особенно цитомегаловируса человека, например, gB или его производные); вируса Эпштейна-Барр (например, gp350); флавивирусов (например,
35 вируса желтой лихорадки, вируса денге, вируса клещевого энцефалита, вируса японского
энцефалита); вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (например, поверхностный антиген гепатита В, такой как антигены PreSl, PreS2 и S, описанные в ЕР-А-414 374; ЕР-А-0304 578 и ЕР-А-198474), вируса гепатита А, вируса гепатита С и вируса гепатита Е; ВИЧ-1 (такие как tat, nef, gpl20 или gpl60); вирусов герпеса человека, такие как gD или 5 его производные или немедленный ранний белок, такой как ICP27 из ВГЧ 1 или ВГЧ 2; вирусов папилломы человека (например, ВПЧ 6, 11, 16, 18); вируса гриппа (целый живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или клетках линии MDCK, или клетках Vero, или виросомы целого вируса (как описано Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920) или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки
10 NP, NA, НА или М); вируса кори; вируса свинки; вируса парагриппа; вируса бешенства; респираторно-синцитиального вируса (например, белки F и G); ротавируса (включая живые вирусы со сниженной вирулентностью); вируса оспы; вируса ветряной оспы (например, gpl, II и Ш63); и ВПЧ, ответственных за рак шейки матки (например, ранние белки Е6 или Е7, гибридизованные с белком D-носителем с образованием гибридов белок
15 D-E6 или Е7 из ВПЧ 16 или их комбинации; или комбинации Е6 или Е7 с L2 (см., например, WO 96/26277).
Бактериальные антигены или антигенные детерминанты могут быть получены, например, из Bacillus spp., включая В. anthracis (например, токсин ботулизма); Bordetella spp., включая В. pertussis (например, пертактин, коклюшный токсин, филаментный
20 гемагглютинин, аденилатциклазу, фимбрии); Borrelia spp., включая В. burgdorferi (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), В. garinii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Campylobacter spp., включая С. jejuni (например, токсины, адгезины и инвазины) и С coli; Chlamydia spp., включая С. trachomatis (например, МОМР,
25 связывающие гепарин белки), С. pneumonie (например, МОМР, связывающие гепарин белки), С. psittaci; Clostridium spp., включая С. tetani (такой как столбнячный токсин), С. botulinum (например, токсин ботулизма), С. difficile (например, клостридиальные токсины А или В); Corynebacterium spp., включая С diphtheriae (например, дифтерийный токсин); Ehrlichia spp., включая Е. equi и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; Rickettsia
30 spp., включая R rickettsii; Enterococcus spp., включая E. faecalis, E. faecium; Escherichia spp., включая энтеротоксическую E. coli (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или их производные или термостойкий токсин), энтерогеморрагическую E.coli, энтеропатогенную E.coli (например, токсин, подобный сига-токсину); Haemophilus spp., включая Н. influenzae типа В (например, PRP),
35 нетипируемый штамм Н. influenzae, например, ОМР26, высокомолекулярные адгезины,
Р5, Р6, белок D и липопротеин D, а также фимбрин и пептиды, полученные из фимбрина (см. пример US 5843464); Helicobacter spp., включая Н. pylori (например, уреазу, каталазу, вакуолирующий токсин); Pseudomonas spp., включая P. aeruginosa; Legionella spp., включая L. pneumophila; Leptospira spp., включая L. interrogans; Listeria spp., включая L. 5 monocytogenes; Moraxella spp., включая M. catarrhalis, также известный как Branhamella catarrhalis (например, высокомолекулярные и низкомолекулярные адгезины и инвазины); Morexella catarrhalis (включая их наружные мембранные везикулы и ОМР106 (см., например, W097/41731)); Mycobacterium spp., включая М. tuberculosis (например, ESAT6, антиген 85А, -В или -С), М. bovis, М. leprae, М. avium, М. paratuberculosis, М. smegmatis;
10 Neisseria spp., включая N. gonorrhea и N. meningitidis (например, капсулярные полисахариды и их конъюгаты, трансферринсвязывающие белки, лактоферринсвязывающие белки, РИС, адгезины); Neisseria meningitidis В (включая их наружные мембранные везикулы и NspA (см., например, WO 96/29412), Salmonella spp., включая S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis, Shigella spp., включая S. sonnei,
15 S. dysenteriae, S. flexnerii, Staphylococcus spp., включая S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus spp., включая S. pneumonie (например, капсулярные полисахариды и их конъюгаты, PsaA, PspA, стрептолизин, холинсвязывающие белки) и белковый антиген пневмолизин (Biochem Biophys Acta, 1989,67,1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25,337-342) и их мутированные детоксифицированные производные (см., например, WO
20 90/06951, WO 99/03884), Treponema spp. включая Т. pallidum (например, белки наружной мембраны), Т. denticola, Т. hyodysenteriae; Vibrio spp., включая V. cholera (например, холерный токсин); и Yersinia spp., включая Y. enterocolitica (например, Yop-белок), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis.
Паразитарные/грибковые антигены или антигенные детерминанты могут быть
25 получены, например, из: Babesia spp., включая В. microti; Candida spp., включая С. albicans; Cryptococcus spp., включая С. neoformans; Entamoeba spp., включая E. histolytica; Giardia spp., включая G. lamblia; Leshmania spp., включая L. major; Plasmodium falciparum (MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, секвестрин, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PffiXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 и их аналоги
30 в Plasmodium spp.); Pneumocystis spp., включая P. carinii; Schisostoma spp., включая S. mansoni; Trichomonas spp., включая Т. vaginalis; Toxoplasma spp., включая Т. gondii (например, SAG2, SAG3, Tg34); Trypanosoma spp., включая Т. cruzi.
Следует понимать, что в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения антигены и антигенные детерминанты можно применять во многих различных формах.
35 Например, антигены или антигенные детерминанты могут присутствовать в виде
выделенных белков или пептидов (например, в так называемых "субъединичных вакцинах") или, например, в качестве ассоциированных с клетками или ассоциированных с вирусами антигенов или антигенных детерминант (например, как в живых патогенных штаммах, так и в мертвых патогенных штаммах). Живые патогены предпочтительно будут 5 ослаблены известным способом. В другом варианте антигены или антигенные детерминанты могут быть получены у субъекта в условиях in situ с использованием полинуклеотида, кодирующего антиген или антигенную детерминанту (как при так называемой "ДНК-вакцинации"), хотя следует понимать, что полинуклеотиды, которые можно применять с таким подходом, не ограничены ДНК и также могут включать РНК и
10 модифицированные полинуклеотиды, как обсуждалось выше.
При применении в терапии молекулярные конъюгаты (т. е. конъюгированные вакцины) согласно настоящему изобретению могут быть введены субъекту непосредственно (т. е., в условиях in vivo), либо по отдельности, либо с иммуностимулирующим агентом. Согласно одному аспекту иммуностимулирующий
15 агент соединен с конъюгатом. В другом варианте конъюгаты могут быть введены субъекту косвенно путем приведения первого конъюгата (например, с помощью культивирования или инкубации) в контакт с АПК, такими как дендритные клетки, и затем введения клеток субъекту (т. е., в условиях ex vivo). Приведение в контакт и доставка конъюгатов в АПК так, что они подвергаются процессингу и представляются
20 АПК перед введением, также называется "загрузка" антигена или клеток. Методики загрузки антигенов в АПК хорошо известны в данной области техники и включают, например, те, которые описаны в Gunzer and Grabbe, Crit Rev Immunol 21 (1-3): 133-45 (2001) и Steinman, Exp Hematol 24(8): 859-62 (1996).
Во всех случаях конъюгированные вакцины и иммуностимулирующие агенты вводят
25 в количестве, эффективном для достижения желательного терапевтического действия.
Антитела, молекулярные конъюгаты, биспецифические молекулы и композиции согласно настоящему изобретению также могут быть введены совместно с адъювантами и другими терапевтическими агентами. Следует понимать, что в настоящем документе термин "совместно введенный" включает любой или все из одновременного, отдельного
30 или последовательного способа введения антител и конъюгатов согласно настоящему изобретению с адъювантами и другими агентами, включая введение в качестве части схемы дозирования. Антитела обычно получают только в носителе или в комбинации с такими агентами. Примеры подходящих носителей включают растворы, растворители, дисперсионные среды, замедляющие агенты, эмульсии и т.п. Применение таких сред для
35 фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. В объем
настоящего изобретения включен любой другой стандартный носитель, подходящий для использования с указанными молекулами.
Агенты, подходящие для совместного введения с антителами, конъюгатами,
биспецифическими молекулами и композициями, включают другие антитела,
5 цитотоксины и/или лекарственные препараты, а также адъюванты,
иммуностимулирующие агенты и/или иммуносупрессорные агенты. Согласно одному
варианту реализации настоящего изобретения агент представляет собой
химиотерапевтический агент. Антитела, биспецифические молекулы и композиции можно
вводить в комбинации с излучением.
10 Химиотерапевтические агенты, подходящие для совместного введения с антителами
и конъюгатами согласно настоящему изобретению при лечении опухолей, включают,
например, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин,
этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин,
дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-
15 дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и
пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Дополнительные агенты включают,
например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин,
цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин,
тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU),
20 циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-
дихлордиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин
(ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее
актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты
(например, винкристин и винбластин) и темозоломид.
25 Агенты, которые устраняют или ингибируют виды иммуносупрессорной активности,
например, иммунными клетками (например, регуляторными Т-клетками, NKT-клетками, макрофагами, супрессорными клетками миелоидного происхождения, незрелыми или супрессорными дендритными клетками) или супрессорными факторами, вырабатываемыми опухолевыми клетками или клетками-хозяевами в местное 30 микроокружение опухоли (например, TGF-P, индоламин-2,3-диоксигеназы - ШО), также могут быть введены с антителами и конъюгатами согласно настоящему изобретению. Такие агенты включают антитела и низкомолекулярные лекарственные препараты, такие как ингибиторы ШО, такие как 1-метилтриптофан или его производные.
Агенты, подходящие для совместного введения с антителами, конъюгатами и 35 биспецифическими молекулами согласно настоящему изобретению для индукции или
усиления иммунного ответа, включают, например, адъюванты и/или иммуностимулирующие агенты, неограничивающие примеры которых были раскрыты выше. Предпочтительным иммуностимулирующим агентом является агонист TLR3, такой как поли-IC.
5 V. Виды комбинированной терапии
Антитела к CD40, описанные в настоящем документе, также можно применять в комбинированной терапии, например, для лечения рака. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам комбинированной терапии, в которых антитело к CD40 вводят совместно с одним или более дополнительными агентами, например,
10 низкомолекулярными лекарственными препаратами, антителами или их антигенсвязывающими частями и/или белковыми лигандами, которые эффективно стимулируют иммунные ответы, чтобы тем самым дополнительно усиливать, стимулировать или активировать иммунные ответы у субъекта. Более того, как показано в приведенных в настоящем документе примерах, введение агонистического антитела к
15 CD40 и растворимого СО40-лиганда оказывает синергическое действие при индукции сигналов, опосредуемых рецепторами Т-клеток, например, о чем свидетельствует увеличение экспрессии CD95 в опухолевых клетках.
Например, антитело к CD40, например, описанное в настоящем документе, можно комбинировать с (i) агонистом стимулирующей (например, костимулирующей) молекулы
20 (например, рецептором или лигандом) и/или (ii) антагонистом ингибирующего сигнала или молекулы (например, рецептором или лигандом) на иммунных клетках, таких как Т-клетки, причем оба условия приводят к усилению иммунных ответов, таких как ответы антигенспецифических Т-клеток. Согласно некоторым аспектам иммуноонкологическим агентом является (i) агонист стимулирующей (включая костимулирующую) молекулы
25 (например, рецептора или лиганда) или (ii) антагонист ингибирующей (включая коингибирующую) молекулы (например, рецептора или лиганда) на клетках, участвующих во врожденном иммунитете, например, NK-клетках, и при этом иммуноонкологический агент усиливает врожденный иммунитет. Такие иммуноонкологические агенты часто называются регуляторами контрольной точки
30 иммунитета, например, ингибитором контрольной точки иммунитета или стимулятором контрольной точки иммунитета.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело к CD40 вводят с агентом, мишенью которого является стимулирующая или ингибирующая молекула, которая является членом суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF). Например,
35 антитела к CD40, например, описанные в настоящем документе, могут быть введены
субъекту с агентом, мишенью которого является член семейства IgSF, для увеличения иммунного ответа. Например, антитело к CD40 может быть введено с агентом, который нацелен (или специфически связывается с ним) на член семейства В7 связанных с мембраной лигандов, которое включает В7-1, В7-2, В7-Н1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), В7-Н2 5 (ICOS-L), В7-НЗ, В7-Н4, В7-Н5 (VISTA) и В7-Н6, или костимулирующий или коингибирующий рецептор, специфично связывающийся с членом семейства В7.
Антитело к CD40 также может быть введено с агентом, мишенью которого является член семейства молекул TNF и TNFR (лиганды или рецепторы), такой как CD40 и CD40L (например, CD40 человека и CD40L человека), ОХ-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30,
10 CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn 14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, В CM A, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGLTL1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, лимфотоксин a/TNFp, TNFR2, TNF a, LTpR, лимфотоксин a lp2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY и NGFR (см., например, Tansey (2009) Drug Discovery Today
15 00:1).
Ответы Т-клеток можно стимулировать с помощью комбинации антител к CD40, описанных в настоящем документе, например, ЗСЗ и 3G5, и одного или более антагонистов (ингибитора или блокирующего агента) белка, который ингибирует активацию Т-клеток (например, ингибиторы контрольной точки иммунитета), такого как
20 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 и LAG-3, как описано выше, и любого из следующих белков: TIM-3, галектин-9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, галектин-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, В7-НЗ, В7-Н4, 2В4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TFM-1 и TFM-4, и/или одного или более агонистов белка, который стимулирует активацию Т-клеток, такого как В7-1, В7-2, CD28, 4-1ВВ (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, ОХ40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 и CD28H.
25 Примерные агенты, которые модулируют один из вышеуказанных белков и могут
быть комбинированы с агонистическими антителами к CD40, например, описанными в настоящем документе, для лечения рака, включают: ервой (Yervoy(tm)) (ипилимумаб) или тремелимумаб (Tremelimumab) (против CTLA-4), галиксимаб (galiximab) (против В7.1), BMS-936558/ниволюмаб (nivolumab) (против PD-1), МК-3475/пембролизумаб
30 (pembrolizumab) (против PD-1), АМР224 (против B7DC), BMS-936559 (против В7-Н1), МРОЕ3280А/атезолизумаб (atezolizumab) (против В7-Н1), MEDI-570 (против ICOS), AMG557 (против В7Н2), MGA271 (против В7НЗ), FMP321 (против LAG-3), BMS-663513 (против CD137), PF-05082566 (против CD137), CDX-1127 (против CD27), анти-ОХ40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (против OX40L), атацицепт (Atacicept) (против
35 TACI), СР-870893 (против CD40), лукатумумаб (Lucatumumab) (против CD40),
дацетузумаб (Dacetuzumab) (против CD40), муромонаб (Muromonab)-CD3 (против CD3), ипилимумоб (Ipilumumab) (против CTLA-4).
Другие молекулы, которые можно комбинировать с агонистическими антителами к CD40 для лечения рака, включают антагонисты ингибирующих рецепторов на NK-клетках 5 или агонисты активирующих рецепторов на NK-клетках. Например, агонистические антитела к CD40 можно комбинировать с антагонистами KIR (например, лирилумабом).
Активацию Т-клеток также можно регулировать с помощью растворимых цитокинов, и антитела к CD40 могут быть введены субъекту, например, имеющему рак, с антагонистами цитокинов, которые ингибируют активацию Т-клеток, или агонистами
10 цитокинов, которые стимулируют активацию Т-клеток.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитела к CD40 можно применять в комбинации с (i) антагонистами (или ингибиторами или блокирующими агентами) белков семейства IgSF или семейства В7, или семейства TNF, которые ингибируют активацию Т-клеток, или антагонистами цитокинов, которые
15 ингибируют активацию Т-клеток (например, ИЛ-6, ИЛ-10, TGF-P, VEGF, "иммуносупрессорные цитокины"), и/или (ii) агонистами стимулирующих рецепторов семейства IgSF, семейства В7 или семейства TNF, или цитокинов, которые стимулируют активацию Т-клеток, чтобы стимулировать иммунный ответ, например, для лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак.
20 Другие агенты для разных видов комбинированной терапии включают агенты,
которые ингибируют или истощают макрофаги или моноциты, включая, но не ограничиваясь указанными, антагонисты КСФ-IR, такие как антагонисты КСФ-IR, включая RG7155 (W011/70024, W011/107553, W011/131407, W013/87699, W013/119716, WO13/132044) или FPA-008 (W011/140249; W013169264; WO14/036357).
25 Антитела к CD40 также могут быть введены с агентами, которые ингибируют
передачу сигналов с участием TGF-p.
Дополнительные агенты, которые можно комбинировать с антителом к CD40, включают агенты, которые усиливают презентацию опухолевых антигенов, например, вакцины на основе дендритных клеток, клеточные вакцины, секретирующие ГМ-КСФ,
30 олигонуклеотиды CpG и имиквимод, или виды терапии, которые усиливают иммуногенность опухолевых клеток (например, антрациклины).
Другие виды терапии, которые можно комбинировать с антителом к CD40, включают виды терапии, которые истощают или блокируют регуляторные Т-клетки, например, агент, который специфически связывается с CD25.
Другой вид терапии, который можно комбинировать с антителом к CD40, представляет собой терапию, которая ингибирует метаболический фермент, такой как индоламиндиоксигеназа (ШО), диоксигеназа, аргиназа или синтетаза оксида азота.
Другой класс агентов, которые можно применять с антителом к CD40, включает 5 агенты, которые ингибируют образование аденозина или ингибируют рецептор аденозина А2А.
Другие виды терапии, которые можно комбинировать с антителом к CD40 для лечения рака, включают виды терапии, которые обращают/пред отвращает анергию или истощение Т-клеток, и виды терапии, которые запускают активацию врожденного
10 иммунитета и/или воспаление в опухолевом очаге.
Антитело к CD40 можно комбинировать более чем с одним иммуноонкологическим агентом и можно применять, например, в сочетании с комбинаторным подходом, который нацелен на несколько элементов иммунного пути, таким как один или более из следующих: терапия, которая усиливает презентацию опухолевого антигена (например,
15 вакцина на основе дендритных клеток, клеточные вакцины, секретирующие ГМ-КСФ, олигонуклеотиды CpG, имиквимод); терапия, которая ингибирует отрицательную иммунную регуляцию, например, путем ингибирования CTLA-4 и/или пути с участием PD1/PD-L1/PD-L2 и/или истощения или блокирования регуляторных Т-клеток или других иммуносупрессорных клеток; терапия, которая стимулирует положительную иммунную
20 регуляцию, например, с использованием агонистов, которые стимулируют путь с участием CD-137, ОХ-40 и/или GITR и/или стимулируют эффекторную функцию Т-клеток; терапия, которая системно увеличивает частоту противоопухолевых Т-клеток; терапия, которая истощает или ингибирует регуляторные Т-клетки, такие как регуляторные Т-клетки в опухоли, например, с использованием антагониста CD25
25 (например, даклизумаба) или путем истощения CD25 с использованием специфичных для него гранул в условиях ex vivo; терапия, которая влияет на функцию супрессорных миелоидных клеток в опухоли; терапия, которая усиливает иммуногенность опухолевых клеток (например, антрациклины); адоптивный перенос Т-клеток или NK-клеток, включая генетически модифицированные клетки, например, клетки, модифицированные
30 химерными антигенными рецепторами (терапия CAR-T); терапия, которая ингибирует метаболический фермент, такой как индоламиндиоксигеназа (ШО), диоксигеназа, аргиназа или синтетаза оксида азота; терапия, которая обращает/пред отвращает анергию или истощение Т-клеток; терапия, которая запускает активацию врожденного иммунного ответа и/или воспаление в опухолевом очаге; введение иммуностимулирующих
35 цитокинов; или блокирование иммуносупрессорных цитокинов.
Агонистические антитела к CD40, описанные в настоящем документе, можно применять вместе с одним или более агонистическими агентами, которые лигируют положительные костимулирующие рецепторы, блокирующими агентами, которые ослабляют передачу сигналов через ингибирующие рецепторы, антагонистами, а также 5 одним или более агентами, которые системно увеличивают частоту противоопухолевых Т-клеток, агентами, которые преодолевают различные иммунные подавляющие пути в микроокружении опухоли (например, блокируют вовлечение ингибирующего рецептора (например, взаимодействия PD-L1/PD-1), истощают или ингибируют регуляторные Т-клетки (например, с использованием моноклонального антитела к CD25 (например, 10 даклизумаба) или путем истощения CD25 с использованием специфичных для него гранул), ингибируют метаболические ферменты, такие как ШО, или обращают/пред отвращают анергию или истощение Т-клеток), и агентами, которые запускают активацию врожденного иммунного ответа и/или воспаление в опухолевых очагах.
15 Настоящее изобретение относится к способам стимуляции иммунного ответа у
субъекта, включающим введение субъекту агонистической молекулы против CD40, например, антитела, и одного или более дополнительных иммуностимулирующих антител, таких как антагонист PD-1, например, антагонистическое антитело, антагонист PD-L1, например, антагонистическое антитело, антагонист CTLA-4, например,
20 антагонистическое антитело и/или антагонист LAG3, например, антагонистическое антитело, так, что у субъекта стимулируется иммунный ответ, например, для того чтобы ингибировать рост опухоли или стимулировать противовирусный ответ. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дополнительным иммуностимулирующим антителом (например, антагонистическим антителом к PD-1, антагонистическим
25 антителом к PD-L1, антагонистическим антителом к CTLA-4 и/или антагонистическим антителом к LAG3) является антитело человека.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения гиперпролиферативного заболевания (например, рака), включающим введение субъекту агонистического антитела к CD40 и антагонистического антитела к PD-1. Согласно
30 одному варианту реализации настоящего изобретения субъект является человеком. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к PD-1 представляет собой моноклональное антитело, содержащее последовательность антитела человека, и антитело к CD40 представляет собой моноклональное антитело, содержащее последовательность антитела человека, такое как антитело, содержащее CDR или
вариабельные области из ЗСЗ и 3G5, описанных в настоящем документе, или другое агонистическое антитело к CD40, описанное в настоящем документе.
Подходящие антагонисты PD-1 для применения в способах, описанных в настоящем документе, включают, но не ограничиваются указанными, лиганды, антитела (например, 5 моноклональные антитела и биспецифические антитела) и поливалентные агенты. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антагонист PD-1 представляет собой гибридный белок, например, гибридный белок Fc, такой как AMP-244. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антагонист PD-1 представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1.
10 Примерное антитело к PD-1 представляет собой ниволюмаб (BMS-936558) или
антитело, которое содержит CDR или вариабельные области одного из антител 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 7D3, 5F4 и 4А11, описанных в WO 2006/121168. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к PD1 представляет собой МК-3475 (ламбролизумаб), описанный в WO 02012/145493; и АМР-514, описанный в WO
15 2012/145493. Другие известные антитела к PD-1 и другие ингибиторы PD-1 включают те, которые описаны в WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, патентах США №№ 7635757 и 8217149 и публикации патента США № 2009/0317368. Также можно применять любые антитела к PD-1, описанные в WO 2013/173223. Антитело к PD-1, которое конкурирует за связывание и/или
20 связывается с тем же эпитопом на PD-1, как и одно из указанных антител, также можно применять в комбинированных способах лечения. Другим подходом к нацеливанию на рецептор PD-1 является рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточного домена PD-L2 (B7-DC), гибридизованного с частью Fc IgGl, называемый АМР-224.
Настоящее изобретение относится к способам лечения гиперпролиферативного
25 заболевания (например, рака), включающим введение субъекту агонистического антитела к CD40 и антагонистического антитела PD-L1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект является человеком. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к PD-L1 представляет собой моноклональное антитело, содержащее последовательность антитела человека, и антитело
30 к CD40 представляет собой моноклональное антитело, содержащее последовательность антитела человека, такое как антитело, содержащее CDR или вариабельные области из ЗСЗ и 3G5, описанных в настоящем документе, или другое агонистическое антитело к CD40, описанное в настоящем документе.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело к PD-L1
35 представляет собой BMS-936559 (называемое 12А4 в WO 2007/005874 и патенте США №
7943743), или антитело, которое содержит CDR или вариабельные области из 3G10, 12А4, 10А5, 5F8, 10Н10, 1В12, 7Н1, 11Е6, 12В7 и 13G4, которые описаны в РСТ публикации WO 07/005874 и в патенте США № 7943743. В определенном варианте реализации антитело к PD-L1 представляет собой MEDI4736 (также известное как анти-В7-Н1), MPDL3280A 5 (также известное как RG7446), MSB0010718C (WO2013/79174) или rHigM12B7. Также можно применять любые антитела к PD-L1, описанные в WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, патентах США №№ 7635757 и 8217149 и публикации US 2009/145493. Антитела к PD-L1, которые конкурируют и/или связываются с тем же эпитопом, как и любое из указанных антител, также можно применять в
10 комбинированных способах лечения.
Настоящее изобретение относится к способам лечения гиперпролиферативного заболевания (например, рака), включающим введение субъекту антитела к CD40, описанного в настоящем документе, и антагонистического антитела к CTLA-4. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект является человеком.
15 Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к CTLA-4 представляет собой антитело, выбранное из группы, включающей: ервой(tm) (ипилимумаб или антитело 10D1, описанное в РСТ публикации WO 01/14424), тремелимумаб (ранее тицилимумаб, СР-675206), моноклональное антитело или антитело к CTLA-4, описанное в любой из следующих публикаций: WO 98/42752; WO 00/37504; патент США № 6207156;
20 Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): реферат 2505 (антитело СР-675206); и Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. Также можно применять любые антитела к CTLA-4, описанные в WO2013/173223.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения 25 гиперпролиферативного заболевания (например, рака), включающим введение субъекту антитела к CD40 и антитела к LAG-3. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект является человеком. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к PD-L1 представляет собой моноклональное антитело, содержащее последовательность антитела человека, и антитело к CD40 представляет 30 собой моноклональное антитело, содержащее последовательность антитела человека, такое как антитело, содержащее CDR или вариабельные области из ЗСЗ или 3G5, описанных в настоящем документе, или другое агонистическое антитело к CD40, описанное в настоящем документе. Примеры антител к LAG3 включают антитела, содержащие CDR или вариабельные области антител 25F7, 26Н10, 25ЕЗ, 8В7, 11F2 или 35 17Е5, которые описаны в публикации патента США US2011/0150892, WO10/19570 и
WO2014/008218. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело к LAG-3 представляет собой BMS-986016. Другие общеизвестные в данной области техники антитела к LAG-3, которые можно применять, включают ГМР731 и ГМР-321, описанные в US 2011/007023, WO08/132601 и WO09/44273. Антитела к LAG-3, которые 5 конкурируют и/или связываются с тем же эпитопом, как и любое из указанных антител, также можно применять в комбинированных способах лечения.
Введение антител к CD40, описанных в настоящем документе, и антагонистов, например, антагонистических антител, к одному или более целевым антигенам, таким как LAG-3 и/или CTLA-4, и/или PD-1, и/или PD-L1, может усилить иммунный ответ на
10 раковые клетки у пациента. Виды рака, рост которых можно ингибировать с использованием антител согласно настоящему изобретению, включают виды рака, обычно отвечающие на иммунотерапию, и те, которые обычно не отвечают на иммунотерапию. Типичные примеры видов рака для лечения с применением комбинированной терапии согласно настоящему изобретению включают те виды рака, которые перечислены в
15 настоящем документе.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения комбинация терапевтических антител, обсуждаемых в настоящем документе, может быть введена одновременно в виде одной композиции в фармацевтически приемлемом носителе или одновременно в виде отдельных композиций, в которых каждое антитело находится в
20 фармацевтически приемлемом носителе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения комбинация терапевтических антител может быть введена последовательно. Например, антитело к CTLA-4 и антитело к CD40 можно вводить последовательно, например, сначала вводят антитело к CTLA-4 и затем вводят антитело к CD40, или сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к CTLA-4.
25 Дополнительно или в другом варианте антитело к PD-1 и антитело к CD40 можно вводить последовательно, например, сначала вводят антитело к PD-1 и затем вводят антитело к CD40, или сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к PD-1. Дополнительно или в другом варианте антитело к PD-L1 и антитело к CD40 можно вводить последовательно, например, сначала вводят антитело к PD-L1 и затем вводят
30 антитело к CD40 или сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к PD-L1. Дополнительно или в другом варианте антитело к LAG-3 и антитело к CD40 можно вводить последовательно, например, сначала вводят антитело к LAG-3 и затем вводят антитело к CD40 или сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к LAG-3. Помимо этого, если последовательно вводят более одной дозы комбинированной
35 терапии, то порядок последовательного введения может быть обращен или сохранен без
изменения в каждой временной точке введения, последовательные введения можно комбинировать с одновременными введениями или любой их комбинацией. Например, первое введение комбинации антитела к CTLA-4 и антитела к CD40 может быть одновременным, второе введение может быть последовательным, при этом сначала вводят 5 антитело к CTLA-4 и затем вводят антитело к CD40, и третье введение может быть последовательным, при этом сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к CTLA-4 и т. д. Дополнительно или в другом варианте первое введение комбинации антитела к PD-1 и антитела к CD40 может быть одновременным, второе введение может быть последовательным, при этом сначала вводят антитело к PD-1 и затем вводят
10 антитело к CD40, и третье введение может быть последовательным, при этом сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к PD-1 и т. д. Дополнительно или в другом варианте первое введение комбинации антитела к PD-L1 и антитела к CD40 может быть одновременным, второе введение может быть последовательным, при этом сначала вводят антитело к PD-L1 и затем вводят антитело к CD40, и третье введение может быть
15 последовательным, при этом сначала вводят антитело к CD40, затем вводят антитело к PD-L1 и т. д. Дополнительно или в другом варианте первое введение комбинации антитела к LAG-3 и антитела к CD40 может быть одновременным, второе введение может быть последовательным, при этом сначала вводят антитело к LAG-3 и затем вводят антитело к CD40, и третье введение может быть последовательным, при этом сначала
20 вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к LAG-3 и т. д. Другая типичная схема дозирования может включать первое введение, которое является последовательным, при этом сначала вводят антитело к CD40 и затем вводят антитело к CTLA-4 (и/или антитело к PD-1 и/или антитело к PD-L1, и/или антитело к LAG-3), и последующие введения могут быть одновременными.
25 Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего
заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой агонист CD 137 (4-1ВВ), такой
30 как агонистическое антитело CD 137. Подходящие антитела к CD 137 включают, например, урелумаб или PF-05082566 (W012/32433).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат
35 путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента,
причем иммуноонкологический агент представляет собой агонист ОХ40, такой как агонистическое антитело к ОХ40. Подходящие антитела к ОХ40 включают, например, MEDI-6383, MEDI-6469 или MOXR0916 (RG7888; WO06/029879).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего 5 заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой второй агонист CD40, такой как другое агонистическое антитело к CD40.
10 Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего
заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой агонист CD27, такой как
15 агонистическое антитело к CD27. Подходящие антитела к CD27 включают, например, варлилумаб (CDX-1127).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат
20 путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой MGA271 (против В7НЗ) (WO11/109400).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате 25 стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой антагонист КЖ, такой как лирилумаб.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего 30 заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой антагонист ШО. Подходящие антагонисты ШО включают, например, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598,
WO08/36653, WO08/36642), индоксимод, NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WOl 1/56652, W012/142237) или F001287.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате 5 стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента, причем иммуноонкологический агент представляет собой агонист Toll-подобного рецептора, например, агонист TLR2/4 (например, бациллу Кальмета-Герена); агонист TLR7 (например, хилтонол или имиквимод); агонист TLR7/8 (например, резиквимод); или
10 агонист TLR9 (например, CpG7909).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекта, имеющего заболевание, на которое можно оказать благоприятное воздействие в результате стимуляции иммунной системы, например, рак или инфекционное заболевание, лечат путем введения указанному субъекту антитела к CD40 и иммуноонкологического агента,
15 причем иммуноонкологический агент представляет собой ингибитор TGF-P, например, GC1008, LY2157299, TEW7197 или ГМС-TRl.
Согласно одному аспекту антитело к CD40 последовательно вводят перед введением второго агента, например, иммуноонкологического агента. Согласно одному аспекту антитело к CD40 вводят одновременно со вторым агентом, например, с
20 иммуноонкологическим агентом. Согласно другому аспекту антитело к CD40 последовательно вводят после введения второго агента. Введение двух агентов можно начинать во временных точках, которые разделены между собой интервалом времени, составляющим, например, 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 5 дней, 7 дней или одну или более недель, или
25 введение второго агента можно начинать через, например, 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 5 дней, 7 дней или одну или более недель после введения первого агента.
Согласно некоторым аспектам антитело к CD40 и второй агент, например, иммуноонкологический агент, вводят одновременно, например, вводят пациенту
30 одновременно в течение периода, составляющего, например, 30 или 60 минут. В другом варианте антитело к CD40 может быть получено совместно со вторым агентом, например, иммуноонкологическим агентом.
Необязательно антитело к CD40 вводят в качестве единственного иммунотерапевтического агента, или в комбинации с антителом к CD40, и одно или более
35 дополнительных иммунотерапевтических антител (например, антитело к CTLA-4 и/или
антитело к PD-1, и/или антитело к PD-L1, и/или антитело к LAG-3) можно дополнительно комбинировать с иммуногенным агентом, таким как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и молекулы углеводов), клетки и клетки, трансфецированные генами, кодирующими иммуностимулирующие 5 цитокины (Не et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Неограничивающие примеры опухолевых вакцин, которые можно применять, включают пептиды из антигенов меланомы, такие как пептиды gplOO, антигены MAGE, Trp-2, MART1 и/или тирозиназу, или опухолевые клетки, трансфецированные для экспрессии цитокина ГМ-КСФ (более подробно обсуждается ниже). Антитело к CD40 и одно или более дополнительных
10 антител (например, антитела к CTLA-4 и/или антитела к PD-1, и/или антитела к PD-L1, и/или антитела к LAG-3), также могут быть дополнительно комбинированы со стандартными способами лечения рака. Например, антитело к CD40 и одно или более дополнительных антител (например, антитела к CTLA-4 и/или антитела к PD-1, и/или антитела к PD-L1, и/или антитела к LAG-3) можно эффективно комбинировать с
15 химиотерапевтическими схемами. В этих случаях можно снизить дозу другого химиотерапевтического реагента, вводимого с комбинацией согласно настоящему изобретению (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Примером такой комбинации является комбинация агонистического антитела к CD40 (с дополнительным антителом, таким как антитела к CTLA-4 и/или антитела к PD-1, и/или антитела к PD-L1
20 и/или антитела к LAG-3 или без них) в комбинации с декарбазином для лечения меланомы. Другим примером является комбинация антитела к CD40 (с антителами к CTLA-4 и/или антителами к PD-1, и/или антителами к PD-L1, и/или антителами к LAG-3 или без них) в комбинации с интерлейкином-2 (ИЛ-2) для лечения меланомы. Научное обоснование комбинированного применения антитела к CD40 и антител к CTLA-4 и/или
25 антител к PD-1, и/или антител к PD-L1, и/или антител к LAG-3 с химиотерапией заключается в том, что гибель клетки, которая является следствием цитотоксического действия большинства химиотерапевтических соединений, должна приводить к увеличению уровней опухолевого антигена в пути презентации антигена. Другие виды комбинированной терапии, которые могут обеспечить синергическое действие с
30 антителом к CD40 (с антителом к CTLA-4 и/или антителом к PD-1, и/или антителом к PD-L1, и/или антителом к LAG-3 или без них), включают радиационную терапию, хирургическое вмешательство или гормональное истощение. Каждый из указанных протоколов создает в организме хозяина источник опухолевого антигена. Ингибиторы ангиогенеза также можно применять в сочетании с комбинацией антитела к CD40 и
35 антитела к CTLA-4 и/или антитела к PD-1, и/или антитела к PD-L1, и/или антитела к LAG
3. Ингибирование ангиогенеза приводит к гибели опухолевых клеток, которая может быть источником опухолевого антигена, введенного в пути презентации антигена в организме хозяина.
Агонистическое антитело к CD40 в качестве единственного иммунотерапевтического 5 агента или комбинацию агонистов CD40 и блокирующих антител к CTLA-4 и/или PD-1, и/или PD-L1, и/или LAG-3 также можно применять в комбинации с биспецифическими антителами, которые нацеливают эффекторные клетки, экспрессирующие рецептор Fca или Fey, на опухолевые клетки (см., например, патенты США №№ 5922845 и 5837243). Биспецифические антитела можно применять для нацеливания на два отдельных антигена.
10 Этапы этих реакций, опосредуемые Т-клетками, будут усилены за счет применения комбинации антитела к CD40 и антитела к CTLA-4 и/или антитела к PD-1, и/или антитела к PD-L1, и/или антитела к LAG-3.
В другом примере агонистическое антитело к CD40 в качестве единственного иммунотерапевтического агента или комбинация антитела к CD40 и дополнительного
15 иммуностимулирующего агента, например, антитела к CTLA-4 и/или антитела к PD-1, и/или антитела к PD-L1, и/или агента против LAG-3, например, антитела, может быть использована совместно с антинеопластическим антителом, таким как ритуксан (Rituxan(r)) (ритуксимаб), герцептин (Herceptin(r)) (трастузумаб), бексар (Веххаг(r)) (тозитумомаб), зевалин (Zevalin(r)) (ибритумомаб), кампат (Campath(r)) (алемтузумаб), лимфоцид
20 (Lymphocide(r)) (например, эпртузумаб), авастин (Avastin(r)) (бевацизумаб) и тарцева (Tarceva(r)) (эрлотиниб) и т.п. В качестве примера и безотносительно к какой-либо теории, авторы настоящего изобретения полагают, что лечение с применением противоракового антитела или противоракового антитела, конъюгированного с токсином, может привести к гибели раковых клеток (например, опухолевых клеток), что может усилить иммунный
25 ответ, опосредуемый иммуностимулирующим агентом, например, агентом против CD40, CTLA-4, PD-1, PD-L1 или LAG-3, например, антителом. В примерном варианте реализации настоящего изобретения лечение гиперпролиферативного заболевания (например, раковой опухоли) может включать противораковый агент, например, антитело, в комбинации с антителом к CD40 и необязательно дополнительным
30 иммуностимулирующим агентом, например, агентом против CTLA-4 и/или агентом против PD-1, и/или агентом против PD-L1, и/или агентом против LAG-3, например, антителом, при этом введение можно осуществлять одновременно или последовательно, или с помощью любой комбинации указанных типов введения, которые могут усилить противоопухолевые иммунные ответы в организме хозяина.
Опухоли уклоняются от иммунного надзора хозяина с помощью большого количества механизмов. Многие из этих механизмов могут быть преодолены путем инактивации белков, которые экспрессируются опухолями и которые являются иммуносупрессорными. Такие белки включают, в частности, TGF-P (Kehrl et al. (1986) J. 5 Exp. Med. 163: 1037-1050), ИЛ-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198200), и лиганд Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Антитела к каждой из указанных молекул можно дополнительно комбинировать с антителом к CD40 с дополнительным иммуностимулирующим агентом или без него, например, агентом против CTLA-4 и/или агентом против PD-1, и/или агентом против PD-L1, и/или агентом
10 против LAG-3, таким как антитело, чтобы противодействовать эффектам иммуносупрессорных агентов и способствовать развитию противоопухолевого иммунного ответа в организме хозяина.
Другие агенты, например, антитела, которые можно применять для активации восприимчивости иммунной системы хозяина, также можно применять в комбинации с
15 антителом к CD40 с дополнительным иммуностимулирующим агентом или без него, таким как антитело к CTLA-4 и/или антитело к PD-1, и/или антитело к PD-L1, и/или антитело к LAG-3. К ним относятся молекулы на поверхности дендритных клеток, которые активируют функцию ДК и презентацию антигена. Антитела к CD40 (Ridge et al., выше) можно применять в комбинации с антителом к CD40 и необязательно
20 дополнительным иммуностимулирующим агентом, например, агентом против CTLA-4 и/или агентом против PD-1, и/или агентом против PD-L1, и/или агентом против LAG-3, например, антителом. Другие активирующие антитела к костимулирующим молекулам Т-клеток (Weinberg et al., выше, Melero et al., выше, Hutloff et al., выше) также могут обеспечить повышенные уровни активации Т-клеток.
25 Как обсуждалось выше, трансплантация костного мозга в настоящее время
используется для лечения различных опухолей гемопоэтического происхождения. Для повышения эффективности пересаженных донорских опухолеспецифических Т-клеток можно применять иммунотерапию антителами к CD40 по отдельности или в комбинации с антителом к CTLA-4 и/или антителом к PD-1, и/или антителом к PD-L1, и/или антителом
30 KLAG-3.
Несколько экспериментальных протоколов лечения включают активацию в условиях ex vivo и размножение антигенспецифических Т-клеток и адоптивный перенос указанных клеток реципиентам для того чтобы обеспечить антигенспецифичные Т-клетки, направленные против опухоли (Greenberg & Riddell, выше). Указанные способы также 35 можно применять для активации ответов Т-клеток на инфекционные агенты, такие как
ЦМВ. Как ожидается, активация в условиях ex vivo в присутствии антитела к CD40 с
дополнительной иммуностимулирующей терапией или без нее, например, антителами к
CTLA-4 и/или антителами к PD-1, и/или антителами к PD-L1 и/или антителами к LAG-3,
увеличит частоту и активность адоптивно перенесенных Т-клеток.
5 Настоящее изобретение относится к способам изменения нежелательного явления,
связанного с лечением гиперпролиферативного заболевания (например, рака), с применением иммуностимулирующего агента, включающим введение субъекту антитела к CD40 в комбинации с агентом против CTLA-4 и/или агентом против PD-1, и/или агентом против PD-L1 и/или агентом против LAG-3, например, антителом, или без
10 указанных агентов. Например, способы, описанные в настоящем документе, обеспечивают способ снижения частоты колита или диареи, индуцированных иммуностимулирующим терапевтическим антителом, путем введения пациенту невсасывающегося стероида. В настоящем документе термин "невсасывающийся стероид" представляет собой глюкокортикоид, для которого характерен интенсивный пресистемный метаболизм, так,
15 что после метаболического превращения в печени биодоступность стероида является низкой, т. е. менее приблизительно 20%. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, описанному в настоящем документе, невсасывающимся стероидом является будесонид. Будесонид представляет собой глюкокортикостероид местного действия, который интенсивно метаболизируется, в основном печенью, после
20 перорального введения. Энтокорт ЕС (ENTOCORT ЕС(r)) (Astra-Zeneca) представляет собой состав для перорального введения с высвобождением, которое контролируется рН среды и зависит от времени, разработанный для оптимизации доставки лекарственного препарата в подвздошную кишку и на всем протяжении толстой кишки. Энтокорт ЕС(r) одобрен в США для лечения болезни Крона легкой и умеренной степени тяжести с
25 вовлечением подвздошной кишки и/или восходящей ободочной кишки. Обычная пероральная доза энтокорта ЕС(r) для лечения болезни Крона составляет от 6 до 9 мг/сутки. Энтокорт ЕС(r) высвобождается в кишечнике до момента всасывания и удержания в слизистой оболочке кишечника. После прохождения через слизистую оболочку кишечника, которая является целевой тканью, энтокорт ЕС(r) интенсивно
30 метаболизируется в печени системой цитохрома Р450, при этом его метаболиты обладают незначительной глюкокортикоидной активностью. Следовательно, его биодоступность является низкой (приблизительно 10%). Низкая биодоступность будесонида приводит к улучшенному терапевтическому соотношению по сравнению с другими глюкокортикоидами с менее интенсивным пресистемным метаболизмом. Будесонид
35 приводит к возникновению меньшего количества нежелательных явлений, включая менее
выраженную супрессию гипоталамо-гипофизарной оси, по сравнению с
кортикостероидами системного действия. Тем не менее, хроническое введение энтокорта
ЕС(r) может приводить к системным эффектам глюкокортикоидов, таким как
гиперкортицизм и подавление функции надпочечников. См. PDR 58thed. 2004; 608-610.
5 Согласно более подробным вариантам реализации настоящего изобретения антитело
к CD40 совместно с иммуностимулирующими терапевтическими антителами к CD40 или без них и необязательно антителами к CTLA-4 и/или антителами к PD-1, и/или антителами к PD-L1, и/или антителами к LAG-3, в комбинации с невсасывающимся стероидом можно дополнительно комбинировать с салицилатом. Салицилаты включают
10 агенты 5-ASA, такие как, например, сульфасалазин (азулфидин (AZULFroiNE(r)), Pharmacia & UpJohn); олсалазин (olsalazine) (дипентум (DIPENTUM(r)), Pharmacia & UpJohn); балсалазид (колазал (COLAZAL(r)), Salix Pharmaceuticals, Inc.); и мезаламин (азакол (ASACOL(r)), Procter & Gamble Pharmaceuticals, пентаса (PENTASA(r)), Shire US, канаса (CANASA(r)), Axcan Scandipharm, Inc, роваса (ROWASA(r)), Solvay).
15 В соответствии со способами, описанными в настоящем документе, салицилат
вводят в комбинации с антителом к CD40, совместно с антителами к CTLA-4 и/или антителами к PD-1, и/или антителами к PD-L1 и/или антителами к LAG-3 или без них, и невсасывающимся стероидом, чтобы снизить частоту возникновения колита, индуцированного иммуностимулирующими антителами. Соответственно, например,
20 способы снижения частоты колита, индуцированного иммуностимулирующими антителами, описанными в настоящем документе, включают введение салицилата и невсасывающегося стероида одновременно или последовательно (например, салицилат вводят через 6 часов после введения невсасывающегося стероида) или в любой их комбинации. Помимо этого салицилат и невсасывающийся стероид можно вводить с
25 помощью одного и того же пути введения (например, оба вводят перорально) или с помощью различных путей (например, салицилат вводят перорально, а невсасывающийся стероид вводят ректально), которые могут отличаться от пути (путей), используемого для введения антитела к CD40 и антител к CTLA-4 и/или антител к PD-1, и/или антител к PD-L1, и/или антител к LAG-3.
30 Антитела к CD40 и способы комбинированной терапии на основе антител,
описанные в настоящем документе, также можно применять в комбинации с другими хорошо известными способами лечения, которые выбраны на основании их особой полезности для показания, которое лечат (например, рака). Комбинации антител к CD40, описанные в настоящем документе, можно применять последовательно с известным
35 фармацевтически приемлемым агентом (агентами).
Например, антитела к CD40 и способы комбинированной терапии на основе антител, описанные в настоящем документе, можно применять в комбинации (например, одновременно или по отдельности) с дополнительным способом лечения, таким как облучение, химиотерапия (например, с использованием камптотецина (СРТ-11), 55 фторурацила (5-FU), цисплатина, доксорубицина, иринотекана, паклитаксела, гемцитабина, цисплатина, паклитаксела, карбоплатина-паклитаксела (таксола), доксорубицина, 5-фторурацила или камптотецина + apo21/TRAIL (6Х combo)), одним или более ингибиторами протеасом (например, бортезомибом или MG132), одним или более ингибиторами Вс1-2 (например, BH3I-2 (ингибитор bcl-xl), ингибитором
10 индоламиндиоксигеназы-1 (например, INCB24360, индоксимодом, NLG-919 или F001287) АТ-101 (производное Я-(-)-госсипола), АВТ-263 (небольшая молекула), GX-15-070 (обатоклакс) или антагонистами MCL-1 (белок дифференцировки клеток миелобластного лейкоза-1)), антагонистами iAP (ингибитор белка апоптоза) (например, smac7, smac4, низкомолекулярными миметиками smac, синтетическими smac-пептидами (см. Fulda et al.,
15 Nat Med 2002;8:808-15), ISIS23722 (LY2181308) или AEG-35156 (GEM-640)), ингибиторами HDAC (гистондеацетилазы), антителами к CD20 (например, ритуксимабом), ингибиторами ангиогенеза (например, бевацизумабом), антиангиогенными агентами, нацеленными на VEGF и VEGFR (например, авастином), синтетическими тритерпеноидами (см. Hyer et al, Cancer Research 2005;65:4799-808),
20 модуляторами c-FLIP (клеточный белок, ингибирующий FLICE) (например, природными и синтетическими лигандами PPARy (у-рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом), 5809354 или 5569100), ингибиторами киназ (например, сорафенибом), трастузумабом, цетуксимабом, темсиролимусом, ингибиторами mTOR, такими как рапамицин и темсиролимус, бортезомибом, ингибиторами JAK2, ингибиторами HSP90,
25 ингибиторами PI3K-AKT, леналилдомидом, ингибиторами GSK3P, ингибиторами ТАР и/или генотоксическими лекарственными препаратами.
Антитела к CD40 и способы комбинированной терапии на основе антител, описанные в настоящем документе, также можно применять в комбинации с одним или более антипролиферативными цитотоксическими агентами. Классы соединений, которые
30 можно применять в качестве антипролиферативных цитотоксических агентов, включают, но не ограничиваются указанными, следующие:
Алкилирующие агенты (включая, но не ограничиваясь указанными, азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены): урамустин, хлорметин, циклофосфамид (цитоксан(tm)), фосфамид, мелфалан, хлорамбуцил,
пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфоамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин и темозоломид.
Антиметаболиты (включая, но не ограничиваясь указанными, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пуринов и ингибиторы аденозиндезаминазы): 5 метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабина фосфат, пентостатин и гемцитабин.
Подходящие антипролиферативные агенты для комбинирования с агонистическими антителами к CD40 включают, но не ограничиваются указанными, таксаны, паклитаксел (паклитаксел коммерчески доступен как таксол(tm)), доцетаксел, дискодермолид (DDM),
10 диктиостатин (DCT), пелорузид А, эпотилоны, эпотилон А, эпотилон В, эпотилон С, эпотилон D, эпотилон Е, эпотилон F, фураноэпотилон D, дезоксиэпотилон В1, [17]-дегидродезоксиэпотилон В, [18]-дегидродезоксиэпотилоны В, С12ДЗ-циклопропилэпотилон А, С6-С8 мостиковый эпотилон А, транс-9,10-дегидроэпотилон D, цис-9,10-дегидроэпотилон D, 16-десметилэпотилон В, эпотилон В10, дискодеромолид,
15 патупилон (ЕРО-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, ХАА296А (дискодермолид), TZT-1027 (соблидотин), ILX-651 (тазидотин гидрохлорид), галихондрин В, эрибулина мезилат (Е-7389), гемиастерлин (HTI-286), Е-7974, цирптофицины, LY-355703, иммуноконъюгаты майтансиноидов (DM-1), МКС-1, АВТ-751, Tl-38067, Т-900607, SB-715992 (испинесиб), SB-743921, МК-0731, STA-5312, элеутеробин,17-бета-
20 ацетокси-2-этокси-6-оксо-В-гомо-эстра-1,3,5(10)-триен-3-ол, циклострептин, изолаулималид, лаулималид, 4-эпи-7-дегидрокси-14,16-дидеметил-(+)-дискодермолиды и криптотилон 1, в дополнение к другим стабилизирующим микротрубочки агентам, известным в данной области техники.
В тех случаях, когда необходимо перевести аберрантно пролиферативные клетки в
25 покоящее состояние в сочетании с лечением антителами к CD40, описанными в настоящем документе, или до начала такого лечения, гормоны и стероиды (включая синтетические аналоги), такие как 17а-этинилэстрадиол, диэтилстильбэстрол, тестостерон, преднизон, флуоксиместерон, пропионат дромостанолона, тестолактон, мегестролацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, преднизолон, триамцинолон,
30 хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглютетимид, эстрамустин,
медроксипрогестеронацетат, лейпролид, флутамид, торемифен, золадекс(tm), также могут быть введены пациенту. При применении способов или композиций, описанных в настоящем документе, другие агенты, используемые для модуляции роста или метастазирования опухоли в клинических условиях, такие как антимиметики, также могут
35 быть введены при необходимости.
Специалистам в данной области техники известны способы безопасного и эффективного введения химиотерапевтических агентов. Помимо этого их введение описано в стандартной литературе. Например, введение многих химиотерапевтических агентов описано в Physicians' Desk Reference (PDR), e.g., 1996 изд. (Medical Economics 5 Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA); содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
Химиотерапевтический агент (агенты) и/или лучевая терапия могут быть введены в
соответствии с терапевтическими протоколами, хорошо известными в данной области
техники. Специалисты в данной области техники поймут, что введение
10 химиотерапевтического агента (агентов) и/или лучевой терапии может быть изменено в
зависимости от заболевания, которое лечат, и известных эффектов
химиотерапевтического агента (ов) и/или лучевой терапии на данное заболевание.
Помимо этого в соответствии с навыками квалифицированного врача, терапевтические
протоколы (например, количество доз и время введения) могут варьироваться в
15 зависимости от наблюдаемого действия вводимых терапевтических агентов на пациента и
с учетом наблюдаемых ответов заболевания на вводимые терапевтические агенты.
VI. Результаты
Как показано в примерах в настоящем документе, совместное введение антитела к CD40 с одним или более дополнительными терапевтическими агентами (например,
20 растворимым СО40-лигандом или другим антителом, таким как антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к CTLA-4 и/или антитело к LAG-3) обеспечивает улучшенную эффективность, по сравнению с лечением антителом по отдельности или одним или более дополнительными терапевтическими агентами в отсутствие терапии антителом. Предпочтительно комбинация антитела к CD40 с одним или более дополнительными
25 терапевтическими агентами проявляет терапевтическое синергическое действие.
"Терапевтическое синергическое действие" относится к феномену, при котором лечение пациентов с применением комбинации терапевтических агентов проявляет терапевтически более благоприятный результат, по сравнению с результатом, который достигается при применении каждого отдельного компонента комбинации в оптимальной
30 дозе (Т. Н. Corbett et al., 1982, Cancer Treatment Reports, 66, 1187). В данном случае терапевтически более благоприятным результатом является тот, при котором пациенты либо а) имеют более низкую частоту нежелательных явлений, при этом получая терапевтическую пользу, которая аналогична или превышает пользу у пациентов, которым отдельные компоненты комбинации вводят в виде монотерапии в той же дозе, в
35 которой они входят в состав комбинации, или Ь) не имеют ограничивающей дозу
токсичности, получая терапевтическую пользу, которая аналогична или превышает пользу у пациентов, которые получают каждый отдельный компонент комбинации, причем каждый отдельный компонент вводят в тех же дозах, в которых они входят в состав комбинации (комбинаций), при их введении в виде индивидуальных компонентов. В 5 ксенотрансплантатных моделях комбинация, используемая в максимально переносимой дозе, в которой каждый из отдельных компонентов будет присутствовать в дозе, которая обычно не превышает индивидуальную максимально переносимую дозу для данного компонента, проявляет терапевтическое синергическое действие, когда, например, достигается уменьшение роста опухоли при введении комбинации, которое по величине
10 превышает уменьшение роста опухоли, вызываемое самым эффективным компонентом, при введении данного компонента в виде монотерапии.
Следовательно, в комбинации компоненты таких комбинаций обладают аддитивным или сверхаддитивным действием на подавление роста опухоли, по сравнению с монотерапией антителом к CD40 или лечением дополнительным терапевтическим агентом
15 (агентами) в отсутствие терапии антителом. Под термином "аддитивный" понимают результат, который превышает по степени (например, по степени уменьшения митотического индекса опухоли или роста опухоли или степени сжатия опухоли или частоты и/или продолжительности периодов без проявления симптомов или с меньшим количеством симптомов) лучший отдельный результат, достигаемый при применении
20 каждого отдельного компонента в виде монотерапии, тогда как термин "сверхаддитивный" используется, чтобы указать на результат, который превышает по степени сумму таких отдельных результатов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения аддитивный эффект измеряется как замедление или остановка роста опухоли. Аддитивный эффект также может быть измерен, например, как
25 уменьшение размера опухоли, уменьшение митотического индекса опухоли, уменьшение количества метастатических поражений с течением времени, увеличение общей частоты ответов или увеличение медианы выживаемости или общей выживаемости. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аддитивный эффект измеряется как увеличение индукции экспрессии CD95 при инкубации с клетками линии Ramos,
30 увеличение пролиферации В-клеток, инкубированных с В-клетками человека, и/или увеличение повышенной индукции экспрессии ИЛ-12р40 при инкубации с дендритными клетками.
Одним из неограничивающих примеров меры, с помощью которой можно количественно оценить эффективность терапевтического лечения, является вычисление 35 loglO гибели клеток, который определяется в соответствии со следующим уравнением:
loglO гибели клеток = ТС (дни)/3,32хТс1
в котором ТС представляет собой задержку размножения клеток, выраженную как среднее время в днях, необходимое для того чтобы опухоли в получившей лечение группе (Т) и опухоли в контрольной группе (С) достигли заранее определенного значения (1 г, 5 или 10 мл, например), и Td представляет собой период времени в днях, необходимый для удвоения объема опухоли у контрольных животных. При применении этой меры продукт считается активным, если loglO гибели клеток превышает или равен 0,7, и продукт считается очень активным, если loglO гибели клеток превышает 2,8. При применении этой меры комбинация, используемая в ее максимальной переносимой дозе, в которой каждый
10 из компонентов присутствует в дозе, которая обычно меньше или равна его максимальной переносимой дозе, проявляет терапевтическое синергическое действие, если значение loglO гибели клеток превышает значение loglO гибели клеток для самого эффективного отдельного компонента при его введении в виде монотерапии. В примерном случае значение loglO гибели клеток комбинации превышает значение loglO гибели клеток
15 наиболее эффективного отдельного компонента по меньшей мере на 0,1 log гибели клеток, по меньшей мере на 0,5 log гибели клеток или по меньшей мере на 1,0 log гибели клеток.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано с помощью нижеследующих примеров, которые не должны быть истолкованы как дополнительное ограничение. Содержание Перечня последовательностей, фигур и всех ссылок, патентов и
20 опубликованных заявок на патент, приведенных в тексте настоящей заявки, явным образом включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
25 Получение СВ40-специфических моноклональных антител человека
СО40-специфические моноклональные антитела человека получали путем иммунизации трансгенных мышей линии H2L2 Harbour(r) растворимым антигеном CD40 человека. Трансгенные мыши Harbour(r) имели устраненные последовательности ДНК тяжелой цепи (НС) и легкой каппа-цепи (к-цепи) и имели стабильно встроенные в их 30 геном последовательности вариабельных (V) областей человека и константных (С) областей крысы.
Антиген и иммунизация: антиген представлял собой растворимый гибридный белок, содержащий внеклеточный домен CD40, гибридизованный с доменом Fc антитела (R &D Systems), или рекомбинантный химерный белок CD40 человека-1ш02а (полученный как 35 собственная разработка). Антиген смешивали с полным адъювантом Фрейнда (Sigma) для
первой иммунизации. После этого антиген смешивали с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma). Дополнительных мышей иммунизировали растворимым белком CD40 в MPL с адъювантной системой TDM (Sigma). По 5-25 мкг растворимого рекомбинантного антигена CD40 в ФСБ или 5 х 106 клеток линии NSO, трансфецированных для 5 поверхностной экспрессии CD40 человека, в ФСБ смешивали с адъювантом в соотношении 1:1. Мышам вводили 200 мкл готового антигена путем инъекции в перитонеальную полость каждые 14 дней. Животные, у которых вырабатывались антитела к CD40, получали 5-10 микрограмм растворимого рекомбинантного антигена CD40 путем внутривенной инъекции за три-четыре дня до слияния. Селезенки мышей собирали, и
10 выделенные спленоциты использовали для получения гибридомы.
Получение гибридомы: для слияний использовали линию клеток миеломы мышей P3x63Ag8.653 (АТСС CRL 1580). Для культивирования клеток миеломы использовали RPMI 1640 (Invitrogen), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Дополнительные вспомогательные вещества для сред добавляли в ростовую среду для
15 гибридомы, которая содержала: вплоть до 10% добавки, способствующей росту гибридомы (Sigma), 10% ФБС (Sigma), L-глутамина (Gibco) 0,1 % гентамицина (Gibco), 2-меркаптоэтанола (Gibco) с HAT (Sigma, 1,0х104 М гипоксантина, 4,0> <10"7 М аминоптерина, 1,6* Ю"5 Мтимидиновых сред).
Клетки селезенки смешивали с клетками миеломы P3x63Ag8.653 в соотношении 6:1
20 и осаждали путем центрифугирования. Полиэтиленгликоль добавляли по каплям и осторожно перемешивали, чтобы облегчить слияние. Гибридомы выращивали в течение одной-двух недель до появления видимых колоний. Супернатант собирали и использовали для первоначального скрининга для определения IgG крысы с помощью ИФА с использованием растворимого гибридного белка CD40 человека и специфического
25 детектирования Fc крысы. IgG-положительные супернатанты затем количественно исследовали для определения специфичности в отношении CD40 с помощью проточной цитометрии. Гибридомы также подвергали скринингу для выявления перекрестной реактивности с CD40 яванских макак, при этом все гибридомы были положительными в отношении связывания.
30 Клетки гибридомы размножали, и клеточную массу замораживали для выделения и
секвенирования РНК. Области, кодирующие VH И VL, моноклональных антител человека идентифицировали с использованием РНК из соответствующих гибридом. РНК подвергали обратной транскрипции с получением кДНК, V-кодирующие области амплифицировали с помощью ПЦР, и продукт ПЦР секвенировали, вставляли в вектор,
35 экспрессирующий IgG2 человека, кратковременно экспрессировали и очищали с
помощью колоночной хроматографии на носителе протеине А, что позволило выделить ряд антител, представляющих особый интерес, которые были обозначены как ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 6Н6, 2Е1.2, 1B5-NK (в последнем случае после модификации N75K на FR3 тяжелой цепи) и 3B6-NS (после модификации N63 S на FR3 легкой цепи антитела ЗВ6 для 5 удаления сайта N-гликозилирования).
В таблицах 1, 2 и 3 обобщена информация о зародышевой линии и аминокислотных последовательностях областей VH И VL МАТ человека (в случае аминокислотных последовательностей выделены гипервариабельные участки (CDR)). Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот приведены в таблице последовательностей, 10 озаглавленной "Сводный обзор перечня последовательностей", в конце данных примеров. Таблица 1 - Данные по зародышевой линии
МАТ
VH/VL
Зародышевая линия
3G5
IGHV3-33*01 F (VH3-33)
IGHD3-10*01 F (D3-10)
IGHJ4*02 F (JH4b)
IGKV3-15*01 F (L2)
IGKJ5*01 F (JK5)
ЗСЗ
IGHV3-33*01 F (VH3-33)
IGHD3-10*02F (D4-b)
IGHJ4*02 F (JH4b)
IGKV1 -27*01 F (A20)
IGKJ3*01 F (JK3)
ЗВ6
IGHV3-23*01 F (VH3-23)
IGHD2-15*01 F (D2-15)
IGHJ6*02 F (JH6b)
IGKV2-28*01 F (A19)
IGKJ1*01 F (JK1)
6Н6
IGHV3-33*01 F (VH3-33)
IGHD3-10*01 F (D3-10)
IGHJ4*02 F (JH4b)
IGKV3-15*01 F (L2)
IGKJ4*01 F (JK4)
1В4
IGHV3-23*01 F (VH3-23)
IGHD 1-26*01 F (D2-15)
IGHJ6*02 F (JH6b)
IGKV2-28*01 F (A19)
IGKJ1*01 F (JK1)
1B5-NK
IGHV3-33*03 F (VH3-
IGHD6-19*01 F (D2-
IGHJ2*01 F (JH2)
33)
15)
IGKV1-27*01 F (A20)
IGKJ2*01 F (JK2)
2Е1.2
IGHV3-33*01 F (VH3-33)
IGHD3-10*01 F (D3-10)
IGHJ4*02 F (JH4B)
IGKV3-15*01 F (L2)
IGKJ4*01 F (JK4)
3B6-NS
IGHV3-23*01 F (VH3-23)
IGHD2-15*01 F (D2-15)
IGHJ6*02 F (JH6b)
IGKV2-28*01 F (A19)
IGKJ1*01 F (JK1)
1В4
SYAMT (GFTFSSY)
GITGSGANTFYTD S VKG (TGSGAN)
RNGGSYYYYYGMD V
(RNGGSYYYYYGMD V)
RSSQSLLHSSGYNYL D
(RSSQSLLHSSGYNYL D)
LGSNRAS (LGSNRAS)
MQALQIPWT (MQALQIPWT)
1В5-NK
SFGMH (GFTFSSF)
LIWFDGSSKYYADSVK G
(WFDGSS)
GFAAVAGWYFDF (GFAAVAGWYFDF)
RASQGVRKYLA (RASQSVRSNLA)
AASTLQS (AASTLQS)
QKYFSAPYT (QKYFSAPYT)
2E1.2
SYGMH (GFTFSSY)
VIWDDGSNKYYADSV KG (WDDGSN)
AGS SGRYYNYFD Y (AGS S GRY YN YFD Y)
RASQSVRSNLA (RASQSVRSNLA)
GASTRAT (GASTRAT)
QQYNKWLI (QQYNKWLI)
3B6-
SYAMS (GFTFSSY)
GITGTGGSTYYAD S VKG (TGTGGS)
RAGGSFYYYYGMDV
(RAGGSFYYYYGMD
RSSQSLLHSTGYNYL D
(RSSQSLLHSTGYNYL D)
LGSNRAS (LGSNRAS)
MQALQTPWT (MQALQTPWT)
WITFGQGTRLEIK
ЗСЗ
OVOLVESGGGVVOPGRSLRXSCAGSGFIFSRYGMYWVROAPGKGL
EWVAVIWYDGSYKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAE
DTAVYYCARESPWYYFDYWGOGTLVTVSS
DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISNYLAWYOOKPGKVPKL LIYAASTLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDVATYYCOKYKS APFTFGPGTKVDIK
ЗВ6
EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSC AASGFTF S SYAMSWVRO APGKGLE WVSGITGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYVOMNSLRAEDT AVYYC AKRAGGSFY YYYGMD VWGOGTT VT VS S
DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLHSTGYNYLDWYLOKPG
OSPOLLIYLGSNRASGVPDRFNGSGSGTDFTLKISRVEAEDFGVYYC
MOALOTPWTFGHGTKVEIK
6Н6
OVOLVESGGGVVOPGRSLRFSCAASGFTLSSYGMHWVROAPGKGL EWVAVIWDDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAE DT AVYYC ARAGGSGRYYNYFD YWGOGTL VT VS S
EIVMTOSPATLSVSPGERATLSCRASOSVRSNLAWYOOKPGOAPRL LIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLOSEDFAVYYCOOHNN WLTFGGGTKVEIK
1В4
EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSC AASGFTF S SYAMTW VRO VPGKGL EWVSGITGSGANTFYTDSVKGRFTISRDNSNNSLYLOMNSLRADD T AVYYC AKRNGGS Y YYYYGMD VWGOGTT VT VS S
DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLHSSGYNYLDWYLOKPGO
SPOLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
MOALOIPWTFGOGTKVEIK
1В5-NK
0 VOL VESGGGVVOPGRSLRLSC AASGFTF S SFGMHW VRO APGKGL EW VTLIWFDGS SKY Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLOMNSLR AED T AVYYC VRGFAA VAGW YFDFWGRGTL VT VS S
DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGVRKYLAWYOOKPGKVPK
LLIYAASTLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDVATYYCOKYFS
APYTFGOGTKLEIK
2Е1.2
0 VOL VESGGGVVOPGRSLRLSC AASGFTF S SYGMHWVRO APGKGL EWVAVIWDDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAE
Последовательность легкой цепи (с удаленной лидерной последовательностью)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSR 5 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVA TWCQKYKSAPFTFGPGTKVDIKRTYAAPSVVWYYSDIZQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Последовательность тяжелой цепи (с удаленной лидерной последовательностью)
10 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAGSGFIFSRYGMYWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSYKYYAD SVKGPJ^mmNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESPWYYFDYWGQGTLVTVSSA^TKGV^ VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN
15 STFRVVS VLT VVHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ V YTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
В каждом случае вариабельная последовательность выделена курсивным шрифтом, и константный домен выделен жирным шрифтом. Последовательность константного домена
20 представляет собой последовательность IgG2, из которой были удалены С-концевые лизины.
Идентичную последовательность константного домена использовали для других антител с их соответствующими вариабельными последовательностями, как указано выше.
Пример 2
Определение аффинности и кинетических констант МАТ человека с помощью интерферометрии биослоев (ВЫ)
Аффинность связывания и кинетику связывания различных антител к CD40 человека 5 исследовали с помощью интерферометрии биослоев (ВЫ) с использованием прибора Octet(tm) QKe (Pall ForteBio, Менло Парк, Калифорния, США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Очищенные антитела из примера 1 захватывали на биосенсоры Anti-Human Fc Capture (АНС) (Fortebio, каталожный номер 18-5060). Каждое антитело готовили в буфере 10 для разведения (10 мМ Р04 + 150 мМ NaCl + 1 мг/мл БСА + 0,5% Твин 20, рН=7,2) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и загружали на заново гидрированные биосенсоры АНС в течение 35-50 с при 25 °С и скорости встряхивания планшетов 1000 об./мин, чтобы достичь целевого отклика 0,2 нм. Низкие уровни лиганда захватывали, чтобы ограничить любые эффекты массопереноса аналита на кинетические параметры. Для проведения 15 одного количественного исследования восемь биосенсоров загружали одним и тем же антителом.
Связывание определяли, подвергая шесть из биосенсоров, загруженных антителами, воздействию аналита: растворимого CD40 человека-Мз1§02а (Celldex, 60 кДа согласно данным гель-электрофореза в ДСН-ПААГ). Параметры аффинности определяли с
20 использованием 2-кратных серийных разведений аналита в диапазоне от 3,13 до 0,098 нМ в буфере для разбавления при 25 °С и скорости встряхивания планшета 1000 об./мин. Ассоциацию загруженных антителами биосенсоров с аналитом в лунках проводили в течение 1200 секунд, затем биосенсоры помещали в лунки с буфером для разбавления на 2,5 ч (9000 с) для оценки параметров диссоциации.
25 Соответствующие контроли проводили в каждом случае, сохраняя два оставшихся
биосенсора с захваченным антителом в лунках с буфером для разбавления для стадий ассоциации и диссоциации. Данные для контрольных биосенсоров использовали для вычитания неспецифического сигнала, а также учета дрейфа биосенсора и диссоциации антител от биосенсоров.
30 Для получения кинетических параметров связывания с захваченным антителом из
серии концентраций аналита в буфере для разбавления в каждом случае использовали программное обеспечение для анализа данных Fortebio's, версия 8.2.0.7 (Pall ForteBio, Менло Парк, Калифорния, США). Кривые ассоциации и диссоциации аппроксимировали с использованием модели связывания в соотношении 1:1 с помощью программного
35 обеспечения для анализа данных в соответствии с рекомендациями производителя.
Определенные параметры аффинности и кинетики (после вычитания
неспецифического сигнала) представлены на Фигуре 1, где коп = константа скорости
ассоциации, kdis = константа скорости диссоциации, и KD = равновесная константа
диссоциации/связывания, определяемая соотношением kdis/kon.
5 Пример 3
Количественные исследования для определения характеристик связывания МАТ человека с CD40
Планшеты для микротитрования покрывали рекомбинантным CD40 человека-Fc в ФСБ и затем блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином в ФСБ. МАТ человека
10 после очистки на протеине А из примера 1 и контроль изотипа добавляли в различных концентрациях и инкубировали при 37 °С. Планшеты промывали с использованием ФСБ/твин и затем инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена (ПХ) поликлональным козьим реагентом, специфическим в отношении F(ab')2 IgG человека, при 37 °С. После промывки окрашивание в планшетах проявляли с использованием
15 субстрата ПХ и анализировали при OD450-650 с использованием считывателя для планшетов для микротитрования. Типичные кривые связывания приведены на Фигуре 2.
Чтобы установить, являются ли яванские макаки подходящей моделью для испытания МАТ к CD40, очищенные МКПК макаки или МКПК человека инкубировали с различными концентрациями МАТ к CD40 человека в течение 20 минут при комнатной
20 температуре на шейкере для планшетов. Затем клетки дважды промывали с использованием ФСБ, содержащего 0,1% БСА и 0,05% NaN3 (ФСБ-А). Затем вносили козье антитело к Fc IgG человека, конъюгированное с фикоэритрином (ФЭ), и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре на шейкере для планшетов. В-клетки выявляли путем последующего окрашивания с использованием антитела к
25 CD20, конъюгированного с аллофикоцианином (АФЦ). Клетки исследовали методом проточной цитометрии, и кривые связывания представлены на Фигуре 3, которые свидетельствуют об аналогичном связывании с CD40 от макаки и человека. Пример 4
Исследование блокирования связывания sCD40L методом ИФА
30 Действие МАТ человека из примера 1 на связывание растворимого СО40-лиганда
(sCD40L) с белком CD40 измеряли методом ИФА. Планшет для микротитрования покрывали с использованием 2 мкг/мл химерного белка растворимого рекомбинантного CD40 человека и области Fc, доступного от R &D Systems, затем блокировали с использованием 5% ФСБ-А. Антитела к CD40 ([конечная концентрация] = 100 мкг/мл)
35 добавляли в планшет и затем вносили растворимый рекомбинантный CD40L человека
биотин, доступный от Immunex ([конечная концентрация] = 0,5 мкг/мл). CD40-
захваченный rCD40L детектировали с использованием стрептавидин-ПХ и субстрата
Super Blue ТМВ. Результаты представлены на Фигурах 4А и В совместно с данными
контрольных образцов, как указано.
5 Пример 5
Связывание с СВ40-экспрессирующими клетками
Способность МАТ человека к CD40 связываться с CD40 на клетках, экспрессирующих CD40 человека на своей поверхности, исследовали методом проточной цитометрии, как описано далее:
10 Исследовали связывание антител из примера 1 с линиями клеток человека,
экспрессирующих CD40 человека на своей поверхности. МАТ человека, очищенные с помощью протеина А, ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6 и 6Н6, инкубировали с клетками линий Raji и Ramos, экспрессирующими CD40 человека, при комнатной температуре на шейкере для планшетов. Через 20 минут клетки промывали с использованием ФСБ, содержащего 0,1%
15 БСА и 0,05% NaN3 (ФСБ-А), и связанные антитела детектировали путем инкубации клеток с меченым фикоэритрином антителом-зондом козы, специфическим в отношении Fc IgG человека. Избыточное антитело-зонд отмывали с клеток с использованием ФСБ-А, и интенсивность флуоресценции, связанной с клеткой, определяли с использованием прибора FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США) в соответствии с
20 указаниями производителя.
Как показано на Фигуре 5 (связывание с клетками линии Raji) и Фигуре 6 (связывание с клетками линии Ramos), МАТ человека продемонстрировали высокие уровни связывания с клетками, экспрессирующими CD40 человека, которые зависели от концентрации антител.
25 Пример 6
Индукция CD95 на клетках линии Ramos
Клетки линии Ramos инкубировали в течение ночи при 37 °С, 6% СОг с 2 мкг/мл МАТ человека к CD40 из примера 1. На следующий день клетки промывали один раз с использованием ФСБ-А и окрашивали с использованием конъюгированного с
30 фикоэритрином антитела к CD95 (Becton Dickinson) в течение 20 минут при комнатной температуре со встряхиванием. Избыточное меченое антитело отмывали, и показатели образцов считывали на приборе FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). Как показано на Фигурах 7А и В ((на которых заштрихованные графики представляют необработанные/контрольные клетки, и черные линии представляют клетки,
35 обработанные антителами, как указано), антитела ЗСЗ и 1B5-NK вызывали увеличение
экспрессии CD95, и другие антитела 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2 и 3B6-NS были способны индуцировать сильное увеличение поверхностной экспрессии CD95. Пример 7
Активация дендритных клеток
5 Дендритные клетки получали из моноцитов человека следующим образом:
МКПК добавляли в колбы Т175 см2 и инкубировали для адгезии моноцитов в течение ~2 часов при 37 °С, 6% СОг. Клетки удаляли, и моноциты культивировали в течение 7 дней в RPMI, содержащей 10% ФБС, 10 нг/мл ИЛ-4 (R &D Systems) и 100 нг/мл ГМ-КСФ (R &D Systems). Клетки собирали, и их идентичность дендритным клеткам
10 подтверждали на основании экспрессии CD11с (данные не представлены).
Затем клетки инкубировали в присутствии 10 мкг/мл антител ЗСЗ и 3G5 к CD40 человека из примера 1 и соответствующих контролей при 37 °С, 6% СО2. Через 72 часа клетки собирали, и супернатант собирали и хранили для исследования цитокинов. Клетки окрашивали следующими мечеными антителами в течение 20 минут при комнатной
15 температуре при встряхивании: HLA-DR V450, С054-ФЭ, С086-АФЦ и CD83 BV510 (все от BD). Клетки затем дважды промывали и исследовали на приборе FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). На фигуре 8А представлен уровень экспрессии для каждого из перечисленных маркеров при инкубации с указанным антителом или контролем.
20 Индукцию ИЛ-12р40 оценивали в супернатантах из указанных 72-часовых культур
методом ИФА (R &D Systems). На Фигуре 9 показано увеличение выработки ИЛ-12р40 под действием антител ЗСЗ и 3G5 к CD40 по отношению к контролям, как указано.
В другом эксперименте клетки инкубировали в присутствии 10, 1 и 0,1 мкг/мл антител ЗСЗ и 3G5 к CD40 человека из примера 1 и соответствующих контролей при 37
25 °С, 6% СО2. Через 48 часов клетки собирали, и супернатант собирали и хранили для исследования цитокинов. Клетки окрашивали с использованием меченого антитела к CD54 (BD) в течение 20 минут при комнатной температуре при встряхивании. Клетки затем дважды промывали и исследовали на приборе FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). На Фигуре 8В представлен уровень экспрессии CD54 при инкубации
30 с указанным антителом или контролем.
Индукцию ИЛ-12р40 оценивали в супернатантах из указанных 48-часовых культур методом ИФА (R &D Systems). На Фигуре 9В показано увеличение выработки ИЛ-12р40 под действием антител ЗСЗ и 3G5 к CD40 относительно контролей, как указано. Пример 8
35 Активация В-клеток
Цельную кровь инкубировали с 10 мкг/мл антител ЗСЗ и 3G5 к CD40 из примера 1 в течение ночи при 37 °С, 6% СОг. На следующий день для окрашивания В-клеток и маркеров активации использовали следующие меченые антитела: С054-ФЭ, HLA-DR V450, CD23 РегСР-Су5.5, С069-АФЦ, СБ86-АФЦ, CD38 РегСР-Су5.5 и СБ71-ФЭ. Клетки 5 окрашивали в течение 20 минут при комнатной температуре и встряхивании, затем дважды промывали и параметры считывали на приборе FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). На Фигуре 10А показано изменение уровня экспрессии для каждого из указанных маркеров относительно контролей, как указано.
В другом эксперименте цельную кровь инкубировали с 10, 1 и 0,1 мкг/мл антител к 10 CD40, ЗСЗ и 3G5, из примера 1 в течение ночи при 37 °С, 6% СО2. На следующий день для окрашивания В-клеток и маркеров активации использовали следующие меченые антитела: CD 19 V500, HLA-DR V450, С086-АФЦ (все от BD). Клетки окрашивали в течение 20 минут при комнатной температуре и встряхивании, затем дважды промывали и параметры считывали на приборе FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). На Фигуре 15 10В показано изменение уровня экспрессии для каждого из указанных маркеров относительно контролей, как указано.
Пример 9
Активация NFKB
Клеточную линию, несущую репортер люциферазу, экспрессирующую CD40, 20 инкубировали в течение 6 часов при 37 °С, 6% СО2 с различными концентрациями антител к CD40 человека из примера 1. Экспрессию люциферазы детектировали с помощью системы для количественного исследования люциферазы от Promega в соответствии с рекомендациями производителя. На Фигурах ПА и 11В показан высокий уровень активации NFkB, индуцированный антителами ЗСЗ, 3G5, 1В4, ЗВ6, 6Н6, 2Е1.2, 25 1B5-NK и 3B6-NS, в зависимости от концентрации антител. Пример 10
Уничтожение опухоли в ксенотрансплантатной опухолевой модели на мышах SCID, несущих клетки линии Raji
Мышей линии СВ.17 SCID (приобретенных у Taconic Biosciences, Inc.) содержали в 30 стерильных условиях в виварии для мышей. Лимфомные клетки линии Raji (1x106) вводили подкожно мышам линии SCID, по 5 мышей на группу. На 1, 5 и 11 день указанным мышам вводили клон МАТ человека к CD40, ЗСЗ и 3G5, путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,3 мг. Рост опухоли измеряли с помощью штангенциркулей 2 раза в неделю. Результаты оценки роста опухоли и анализа 35 выживаемости представлены на Фигуре 12, на которой можно видеть, что у мышей,
зараженных опухолевыми клетками, лечение с применением антител к CD40 ингибирует рост опухолей и значительно продлевает выживаемость по сравнению с контролями, получавшими физиологический раствор. Пример 11
5 Уничтожение опухоли в ксенотрансплантатной опухолевой модели на мышах
SCID, несущих клетки линии Ramos
Мышей линии СВ.17 SCID (приобретенных у Taconic Biosciences, Inc.) содержали в стерильных условиях в виварии для мышей. Клетки лимфомы человека линии Ramos (1x106) вводили подкожно мышам линии SCID на 0 день, по 5 мышей на группу. На 1, 5 и 10 11 день указанным мышам вводили МАТ человека к CD40, ЗСЗ или 3G5, путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,3 мг. Рост опухоли измеряли с помощью штангенциркулей 2 раза в неделю.
Результаты, представленные на Фигуре 13, указывают на то, что МАТ к CD40 значительно ингибировали увеличение объема опухоли по сравнению с контрольными 15 животными, получавшими физиологический раствор, что привело к выживанию 100% (3G5) или 80% (ЗСЗ) мышей, зараженных опухолевыми клетками.
Пример 12
Пролиферация Т-клеток
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), выделенные из 20 препаратов лейкоцитарной пленки, помечали с использованием 0,5 мкМ сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE) при комнатной температуре при вращении в течение 5 минут. CFSE-меченые МКПК (1,5x106) распределяли в лунки, покрытые сухим способом антителом к CD3 (ОКТЗ) в концентрации 0,2 мкг/мл.
Антитела к CD40 (3G5, ЗСЗ, 1412) или антитело для контроля изотипа (IgG2) 25 распределяли в лунки в растворимой форме в конечной концентрации 10 мкг/мл. Планшеты инкубировали при 37 °С (5% СОг). На 6 день клетки собирали и окрашивали с использованием АФЦ-конъюгированного антитела к CD3 или контроля изотипа и исследовали методом проточной цитометрии. Типичные графики представлены на Фигуре 14А, из которой следует, что антитела значительно усиливали пролиферацию Т-клеток, о 30 чем свидетельствует сниженная интенсивность окрашивания CFSE в гейте CD3+. Результаты повторного эксперимента представлены на Фигуре 14В, которые свидетельствуют об увеличении количества делящихся клеток под действием антител к CD40, по сравнению с антителом для контроля изотипа. Пример 13
35 Связывание с CD40, не зависящее от взаимодействия с рецептором Fc
Планшеты для микротитрования покрывали рекомбинантным CD40 человека-Fc в ФСБ и затем блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином в ФСБ. МАТ человека, очищенные на протеине А (полный IgG и фрагменты F(ab')2, как указано) добавляли в различных концентрациях и инкубировали при 37 °С. Планшеты промывали с 5 использованием ФСБ/твин и затем инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена поликлональным козьим реагентом, специфическим в отношении F(ab')2 IgG человека, при 37 °С. После промывки окрашивание в планшетах проявляли с помощью субстрата ПХ и исследовали при OD450-650 с использованием считывателя для планшетов для микротитрования. Результаты представлены на Фигуре 15. Варианты IgG2 10 и варианты F(ab')2 каждого антитела проявляли сходную концентрационную зависимость связывания с CD40-Fc.
Пример 14
Активация CD40, не зависящая от взаимодействия с рецептором Fc
Клеточную линию, несущую репортер люциферазу, экспрессирующую CD40, из
15 примера 9, инкубировали в течение 6 часов при 37 °С, 6% СОг с различными концентрациями антител человека к CD40 (как с полным IgG, так и с фрагментами F(ab')2, как указано), Экспрессию люциферазы детектировали с помощью системы количественного исследования люциферазы от Promega в соответствии с рекомендациями производителя. Результаты представлены на Фигуре 16. Полученные результаты
20 свидетельствуют о том, что связывание с рецептором Fc не требуется для опосредуемой CD40 активации репортерной клеточной линии антителами ЗСЗ и 3G5, поскольку как интактные антитела с доменами Fc, так и соответствующие им варианты F(ab')2, не содержащие домены Fc, были способны активировать NFkB в репортерной клеточной линии.
25 Пример 15
Индукция CD95, не зависящая от взаимодействия с рецептором Fc Клетки линии Ramos инкубировали в течение ночи при 37 °С, 6% СО2 с различными концентрациями МАТ человека к CD40 (как с полным IgG, так и с фрагментами F(ab')2, как указано). На следующий день клетки промывали один раз с использованием ФСБ-А и
30 окрашивали ФЭ-конъюгированным антителом к CD95 (Becton Dickinson) в течение 20 минут при комнатной температуре при встряхивании. Избыточное меченое антитело отмывали, и параметры образцов считывали на приборе FACSCanto II(tm) (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). Результаты представлены на Фигуре 17. Полученные данные
указывают на то, что взаимодействия с рецептором Fc не требуются для индукции антителом 3G5 экспрессии CD95 на CD40+ линии лимфобластных клеток человека Ramos. Пример 16
Синергическое действие с sCD40L
5 Клетки линии Ramos инкубировали в течение ночи с антителом ЗСЗ с добавлением
0,1 мг/мл растворимого СО40-лиганда или без него. Затем клетки окрашивали ФЭ-конъюгированным антителом к CD95 и исследовали методом проточной цитометрии. Результаты представлены на Фигуре 19 и свидетельствуют о том, что антитело к CD40 ЗСЗ действует синергически с sCD40L. Соответственно, антитело ЗСЗ (и антитела к CD40,
10 которые связываются с тем же эпитопом, как и ЗСЗ) проявляет синергическое агонистическое действие с растворимым лигандом CD40 (sCD40L) и, следовательно, обладает способностью синергически взаимодействовать с другими терапевтическими агентами, включая те, которые связываются с сайтом связывания лиганда CD40 человека. Типичные синергические эффекты включают, например, повышение активности
15 иммунной системы (например, опосредуемые Т-клетками иммунные ответы, как при вакцинотерапии, активация NK-клеток при разных видах терапии рака), ингибирование размножения клеток (например, при терапии рака) и/или усиленный процессинг и презентацию антигена АПК (например, при вакцинной терапии). Пример 17
20 Картирование эпитопа антител к CD40 человека, ЗСЗ и 3G5, и sCD40
i) Получение усеченных и мутированных фрагментов растворимого CD40 (sCD40).
кДНК растворимого CD40 (sCD40), кодирующую полноразмерный внеклеточный домен (ВКД), охватывающий остатки аминокислот 1-173 (SEQ Ш N0: 133), а также три
25 меньших фрагмента, кодирующих аминокислоты 1-94, 36-130 и 84-173, синтезировали в компании GenScript и вставляли с сохранением открытой рамки считывания в вектор экспрессии млекопитающих с N-концевой легкой каппа-цепью и С-концевой меткой Flag. Полученные гибридные белки Kanna-sCD40-Flag экспрессировали с помощью кратковременной трансфекции в клетки ExpiCHO-S (SAFC). Поскольку антитело к CD40,
30 ЗСЗ, распознает CD40 человека и обезьяны, но не CD40 мыши, ряд мутированных кДНК sCD40aa 1-94 конструировали на основании различий между последовательностями человека и мыши, как показано на схемах выравнивания последовательностей на Фигурах 20 и 21. Мутированные варианты синтезировали и клонировали в компании GenScript. Все указанные усеченные или мутированные фрагменты клонировали в один и тот же вектор и
35 экспрессировали в той же клеточной линии, как и упомянутая выше.
ii) Определение связывания методом ИФА
Связывание ЗСЗ с серией фрагментов sCD40 испытывали методом ИФА. По 1 мкг/мл очищенных гибридных белков Kanna-sCD40-Flag или супернатантов клеток СНО, содержащих гибридные белки sCD40, захватывали на планшетах для микротитрования, 5 которые предварительно покрывали с использованием 5 мкг/мл мышиного антитела к FLAG (Sigma) в ФСБ и блокировали с использованием 5% бычьего сывороточного альбумина в ФСБ. После инкубации с антителом к CD40 планшеты для микротитрования промывали с использованием ФСБ/твин и инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена поликлональным козьим реагентом, специфичным в отношении Fc
10 IgG человека. После промывки окрашивание в планшетах проявляли с помощью субстрата ПХ и исследовали при OD450-650 с использованием считывателя для планшетов для микротитрования. ИФА с использованием конъюгированного с ПХ козьего антитела к Fab2 IgG человека для измерения связывания каппа-цепи проводили параллельно, чтобы проверить экспрессию гибридного белка sCD40 в образцах из разных
15 трансфекций.
Исследования методом ИФА с применением ~1 мкг/мл полноразмерного sCD40 и трех усеченных фрагментов позволили определить, что N-концевые остатки sCD40 1-94 имеют существенное значение и достаточны для связывания с ЗСЗ, поскольку фрагмент, кодирующий остатки аминокислот 1-94, связывался с ЗСЗ, также как и полноразмерный 20 ВКД, но фрагменты, кодирующие остатки аминокислот 36-130 или 84-173 данной последовательности, не связывались в какой-либо степени (см. таблицу 4). Таблица 4
Среднее значение OD
Остатки аминокислот фрагмента
ЗСЗ
aFaMHRP
1-173
1,264
1,264
1-94
1,803
1,720
36-130
0,024
1,695
84-173
0,024
1,669
Мутированный фрагмент аминокислот 1-94
А(1-5)
0,189
1,718
В (13-15)
2,032
1,730
С (25, 26, 28, 30)
1,487
1,685
D (33-36)
0,092
1,631
На основании полученных результатов установили, что крайне важные сайты распознавания для ЗСЗ находятся в пределах аминокислот 1-35.
Чтобы дополнительно идентифицировать области и остатки аминокислот, крайне важные для конформационной организации сайта связывания ЗСЗ, по ~2 мкг/мл 13 5 мутированных фрагментов sCD40 (остатки аминокислот 1-94) (4 региональные множественные мутации и 9 одиночных мутаций) испытывали методом ИФА (см. таблицы 5 и 6, в которых представлены результаты отдельных экспериментов, и Фигуру 22).
Среднее значение OD
Остатки аминокислот фрагмента
ЗСЗ
3G5
ctFab2HRP
Полноразмерный фрагмент 1-173
2,364
2,214
1,525
1-94
2,151
2,170
1,755
36-130
0,029
0,048
1,716
84-173
0,024
0,038
1,599
Мутированный фрагмент аминокислот 1-94
с ЗСЗ. Точечные мутации остатков 1-4 не уменьшали связывание с ЗСЗ. Точечная мутация
остатка 5 существенно уменьшала связывание, но не до той степени, которую наблюдали
при множественных мутациях белка.
5 Множественные мутации остатков 13-15 не уменьшали связывание с ЗСЗ.
Множественные мутации остатков 25, 26, 28 и 30 вызвали незначительное уменьшение связывания с ЗСЗ. Точечные мутации в данных областях не испытывали.
Множественные мутации остатков 33-36 почти полностью предотвращали связывание с ЗСЗ. Точечная мутация остатка 35 не влияла на связывание. Точечные
10 мутации 33, 34 и 36 уменьшали связывание с ЗСЗ, но не до той степени, которую наблюдали при множественных мутациях белка. Испытывали связывание альтернативного антитела к CD40, 3G5, со всеми фрагментами и мутированными вариантами, и было показано, что оно отличается от связывания ЗСЗ (таблица 6). Множественные мутации остатков 1-5 не уменьшали связывание, тогда как мутация
15 остатков 33-36 устраняла связывание. В отличие от ЗСЗ точечная мутация остатка 33 полностью устраняла связывание, и мутация 34 значительно уменьшала связывание.
Пример 18
Биологический профиль и профиль токсичности
Экспериментальное исследование, проведенное не в рамках НЛП, выполняли на наивных яванских макаках. Данное исследование было разработано для предоставления 5 предварительных данных о биологическом профиле и профиле токсичности ЗСЗ. Также оценивали альтернативное антитело к CD40 (3G5). Испытываемые продукты вводили путем внутривенной инъекции в подкожную вену в 1 день (0,2 мг/кг или носитель) и снова на 29 день (2 мг/кг или носитель). Животные также получали подкожную (1 мг) инъекцию гемоцианина лимфы улитки (KLH) на 1 и 29 день. Оценки потенциальных
10 эффектов, связанных с испытываемым продуктом, были основаны на клинических признаках, температуре тела, параметрах лабораторной диагностики (гематологический анализ, коагулограмма, биохимический анализ крови и анализ мочи), присутствии антител к лекарственному препарату, уровнях цитокинов, зависимом от Т-клеток ответе на антитела (TDAR), показателях проточной цитометрии и токсикокинетических параметрах.
15 Массу тела регистрировали один раз перед испытанием препарата и еженедельно после этого. Данное исследование было разработано как исследование выживаемости без запланированного вскрытия.
В данном исследовании введение ЗСЗ или 3G5 хорошо переносилось у яванских макак, при этом ни один из параметров токсичности значительно не превышал
20 контрольные уровни. Следует отметить незначительные повышения активности аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ) и креатининкиназы у обезьян, которым вводили ЗСЗ (Фигуры 23А-23С). Фармакологическое снижение уровня ИЛ-12 (Фигура 24), лейкоцитов (Фигура 25А), нейтрофилов (Фигура 25В) и лимфоцитов (Фигура 25С) наблюдали у обоих животных, получавших антитело к CD40, причем
25 наиболее значимым было кратковременное снижение количества В-клеток (Фигуры 26 и 27). В заключение следует отметить, что в условиях данного исследования ЗСЗ и 3G5 проявили минимальные свидетельства токсичности. Пример 19
Пролиферация В-клеток, не зависящая от взаимодействия с рецептором Fc
30 В-клетки человека выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови
путем магнитного отбора с использованием гранул, специфичных в отношении CD 19. Клетки метили с использованием 0,5 мкМ сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE) при комнатной температуре и вращении в течение 5 минут. Меченые клетки культивировали в присутствии МАТ к CD40, ЗСЗ, или антитела для
35 контроля изотипа (обоих полного IgG и фрагмента F(ab')2) в течение 6 дней. Затем клетки
собирали и исследовали методом проточной цитометрии для оценки пролиферации. Результаты представлены на Фигуре 28 и свидетельствуют о том, что связывание с рецептором Fc не требуется для СБ40-опосредуемой пролиферации под действием ЗСЗ, поскольку интактные антитела с доменами Fc и соответствующие им варианты F(ab')2, не 5 содержащие домены Fc, были способны индуцировать пролиферацию В-клеток. Пример 20
Синергическое действие с CD40L в В-клетках человека
В-клетки человека выделяли и помечали, как описано в примере 19. МАТ к CD40, ЗСЗ, или контроль изотипа в концентрации 0,1 мкг/мл инкубировали с клетками в течение 10 6 дней в присутствии 0,1 мкг/мл растворимого CD40L (Immunex) или без него. На Фигуре 29 показано, что при применении ЗСЗ по отдельности или антитела для контроля изотипа в комбинации с CD40L не наблюдали значительную пролиферацию, однако комбинация CD40L и ЗСЗ индуцировала пролиферацию в культуре.
Дендритные клетки получали и культивировали с 0,5 мкг/мл ЗСЗ, как описано в
15 примере 7, с добавлением 0,1 мкг/мл растворимого CD40L или без него. Выработку ИЛ-
12р40 измеряли методом ИФА (R &D Systems). На Фигуре 30 показано, что, по сравнению
с низким уровнем выработки, который был индуцирован при применении только ЗСЗ или
антитела для контроля изотипа с CD40L, комбинация ЗСЗ и CD40L индуцировала более
высокие уровни ИЛ-12р40.
20 Пример 21
Цитокиновый ответ в цельной крови
Цельную кровь инкубировали в течение ночи с 10 мкг/мл антитела для контроля изотипа или ЗСЗ или ЛПС в качестве положительного контроля. На следующий день плазму крови собирали и измеряли цитокины методом ИФА (R &D Systems). Результаты 25 представлены на Фигуре 31 и свидетельствуют об отсутствии существенной выработки воспалительных цитокинов. Эквиваленты
Специалисты в данной области техники будут осведомлены или смогут установить с использованием обычных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов 30 реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты включены в объем нижеследующей формулы изобретения.
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
3G5 - VH CDR2 (ЧОТИА)
WSDGSN
3G5 - VH CDR3 (КАБАТ)
ASGSGSYYNFFDY
3G5 - VH CDR3 (ЧОТИА)
ASGSGSYYNFFDY
3G5 - VL CDR1 (КАБАТ)
RASQSVRSNLA
3G5 - VL CDR1 (ЧОТИА)
RASQSVRSNLA
3G5 - VL CDR2 (КАБАТ)
GASTRAT
3G5 - VL CDR2 (ЧОТИА)
GASTRAT
3G5 - VL CDR3 (КАБАТ)
QQHNKWIT
3G5 - VL CDR3 (ЧОТИА)
QQHNKWIT
3C3 - VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAGSGFIFSRYGMYWVRQAPGKGLEWVAVIWYDG SYKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYC ARESPWYYFDYWGQ GTLVTVSS
3C3 - VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLL1YAASTLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYKSAPFTFGPGTKVDIK
3C3 - VH CDR1 (КАБАТ)
RYGMY
3C3 - VH CDR1 (ЧОТИА)
GFIFSRY
3C3 - VH CDR2 (КАБАТ)
VIWYDGSYKYYADSVKG
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
ЗСЗ - VH CDR2 (ЧОТИА)
WYDGSY
ЗСЗ - VH CDR3 (КАБАТ)
ESPWYYFDY
ЗСЗ - VH CDR3 (ЧОТИА)
ESPWYYFDY
ЗСЗ - VL CDR1 (КАБАТ)
RASQGISNYLA
3C3 - VL CDR1 (ЧОТИА)
RASQGISNYLA
3C3 - VL CDR2 (КАБАТ)
AASTLQS
3C3 - VL CDR2 (ЧОТИА)
AASTLQS
3C3 - VL CDR3 (КАБАТ)
QKYKSAPFT
3C3 - VL CDR3 (ЧОТИА)
QKYKSAPFT
3B6 - VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGTGG STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYVQMNSLRAEDTAVYYCAKRAGGSFYYYYGMD VWGQGTTVTVSS
3B6 - VL
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSTGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNR AS GVPDRFNGS GS GTDF TLKISRVE AEDF GV Y YCMQ ALQTP WTF GHGTK VEIK
3B6 - VH CDR1 (КАБАТ)
SYAMS
3B6 - VH CDR1 (ЧОТИА)
GFTFSSY
3B6 - VH CDR2 (КАБАТ)
GITGTGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
3B6 - VH CDR2 (ЧОТИА)
TGTGGS
3B6 - VH CDR3 (КАБАТ)
RAGGSFYYYYGMDV
3B6 - VH CDR3 (ЧОТИА)
RAGGSFYYYYGMDV
3B6 - VL CDR1 (КАБАТ)
RSSQSLLHSTGYNYLD
3B6 - VL CDR1 (ЧОТИА)
RSSQSLLHSTGYNYLD
3B6 - VL CDR2 (КАБАТ)
LGSNRAS
3B6 - VL CDR2 (ЧОТИА)
LGSNRAS
3B6 - VL CDR3 (КАБАТ)
MQALQTPWT
3B6 - VL CDR3 (ЧОТИА)
MQALQTPWT
6H6 - VH
Q VQLVESGGGVVQPGRSLRF SC AASGFTLS S YGMHW VRQ APGKGLEWVAVIWDDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYC ARAGGSGRYYNYFD YWGQGTLVT VS S
6H6 - VL
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQHNNWLTFGGGTKVEIK
6H6 - VH CDR1 (КАБАТ)
SYGMH
6H6 - VH CDR1 (ЧОТИА)
GFTLSSY
6H6 - VH CDR2 (КАБАТ)
VIWDDGSNKYYADSVKG
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
6H6 - VH CDR2 (ЧОТИА)
WDDGSN
6H6 - VH CDR3 (КАБАТ)
AGGSGRYYNYFDY
6H6 - VH CDR3 (ЧОТИА)
AGGSGRYYNYFDY
6H6 - VL CDR1 (КАБАТ)
RASQSVRSNLA
6H6 - VL CDR1 (ЧОТИА)
RASQSVRSNLA
6H6 - VL CDR2 (КАБАТ)
GASTRAT
6H6 - VL CDR2 (ЧОТИА)
GASTRAT
6H6 - VL CDR3 (КАБАТ)
QQHNNWLT
6H6 - VL CDR3 (ЧОТИА)
QQHNNWLT
1B4 - VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQVPGKGLEWVSGITGSGA NTFYTDSVKGRFTISRDNSNNSLYLQMNSLRADDTAVYYCAKRNGGSYYYYYGMD VWGQGTTVTVSS
1B4 - VL
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNR ASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQIPWTFGQGTKVEIK
1B4 - VH CDR1 (КАБАТ)
SYAMT
1B4 - VH CDR1 (ЧОТИА)
GFTFSSY
1B4 - VH CDR2 (КАБАТ)
GITGSGANTFYTDSVKG
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
1B4 - VH CDR2 (ЧОТИА)
TGSGAN
1B4 - VH CDR3 (КАБАТ)
RNGGSYYYYYGMDV
1B4 - VH CDR3 (ЧОТИА)
RNGGSYYYYYGMDV
1B4 - VL CDR1 (КАБАТ)
RS SQSLLHS SGYNYLD
1B4 - VL CDR1 (ЧОТИА)
RS SQSLLHS SGYNYLD
1B4 - VL CDR2 (КАБАТ)
LGSNRAS
1B4 - VL CDR2 (ЧОТИА)
LGSNRAS
1B4 - VL CDR3 (КАБАТ)
MQALQIPWT
1B4 - VL CDR3 (ЧОТИА)
MQALQIPWT
3B6-NS - VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGTGG STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYVQMNSLRAEDTAVYYCAKRAGGSFYYYYGMD VWGQGTTVTVSS
3B6-NS - VL
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSTGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNR ASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDFGVYYCMQALQTPWTFGHGTKVEIK
3B6-NS - VH CDR1 (КАБАТ)
SYAMS
3B6-NS - VH CDR1 (ЧОТИА)
GFTFSSY
3B6-NS - VH CDR2 (КАБАТ)
GITGTGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
3B6-NS - VH CDR2 (ЧОТИА)
TGTGGS
3B6-NS - VH CDR3 (КАБАТ)
RAGGSFYYYYGMDV
3B6-NS - VH CDR3 (ЧОТИА)
RAGGSFYYYYGMDV
3B6-NS - VL CDR1 (КАБАТ)
RSSQSLLHSTGYNYLD
3B6-NS - VL CDR1 (ЧОТИА)
RSSQSLLHSTGYNYLD
3B6-NS - VL CDR2 (КАБАТ)
LGSNRAS
3B6-NS - VL CDR2 (ЧОТИА)
LGSNRAS
3B6-NS - VL CDR3 (КАБАТ)
MQALQTPWT
3B6-NS - VL CDR3 (ЧОТИА)
MQALQTPWT
2E1.2 - VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAV1WDDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYC ARAGSSGRYYNYFDY WGQGTLVTVSS
2E1.2 - VL2
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGI PDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYHCQQYNKWLIFGGGTKVEIK
2E1.2 - VH CDR1 (КАБАТ)
SYGMH
2E1.2 - VH CDR1 (ЧОТИА)
GFTFSSY
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
2E1.2 - VH CDR2 (КАБАТ)
VIWDDGSNKYYADSVKG
2E1.2 - VH CDR2 (ЧОТИА)
WDDGSN
2E1.2 - VH CDR3 (КАБАТ)
AGS SGRYYNYFD Y
2E1.2 - VH CDR3 (ЧОТИА)
AGS SGRYYNYFD Y
2E1.2 - VL2 CDR1 (КАБАТ)
RASQSVRSNLA
2E1.2 - VL2 CDR1 (ЧОТИА)
RASQSVRSNLA
2E1.2 - VL2 CDR2 (КАБАТ)
GASTRAT
2E1.2 - VL2 CDR2 (ЧОТИА)
GASTRAT
2E1.2 -VL2 CDR3 (КАБАТ)
QQYNKWLI
100
2E1.2 - VL2 CDR3 (ЧОТИА)
QQYNKWLI
101
1B5-NK - VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVTLFWFDGS SKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRGFAAVAGWYFDFW GRGTLVTVSS
102
1B5-NK-VL
DIQMTQ SP S SLS AS VGDRVTITCRASQGVRK YL AW YQQKPGK VPKLLIYAAS TLQ SG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYFSAPYTFGQGTKLEIK
103
1B5-NK - VH CDR1 (КАБАТ)
SFGMH
104
1B5-NK - VH CDR1 (ЧОТИА)
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
GFTFSSF
105
1B5-NK - VH CDR2 (КАБАТ)
LIWFDGSSKYYADSVKG
106
1B5-NK - VH CDR2 (ЧОТИА)
WFDGSS
107
1B5-NK - VH CDR3 (КАБАТ)
GFAAVAGWYFDF
108
1B5-NK - VH CDR3 (ЧОТИА)
GFAAVAGWYFDF
109
1B5-NK- VL CDR1 (КАБАТ)
RASQGVRKYLA
110
1B5-NK- VL CDR1 (ЧОТИА)
RASQGVRKYLA
111
1B5-NK- VL CDR2 (КАБАТ)
AASTLQS
112
1B5-NK- VL CDR2 (ЧОТИА)
AASTLQS
113
1B5-NK-VL CDR3 (КАБАТ)
QKYFSAPYT
114
1B5-NK- VL CDR3 (ЧОТИА)
QKYFSAPYT
115
3G5 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
AtRRaRtttRRRCtgaCCtRRRttttCCtCRttRCtCttttaaRaRRtRtCCaRtRtCaRRtRCaRttRRtRRaatCt
Gggggaggcgtggtccagcctgggaagtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagcaatg
Gcattcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatctggtctgatggaagtaataa
Attctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctatatctgcaaatga
Acagcctgagagccgaggacacggctgtatattactgtgcgagagcctctggttcggggagttattataacttctttg
actactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
116
3G5 VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
AtgRaaRccccaRCRcaRcttctcttcctcctRctactctRRCtcccaRataRcactRRaRaaataRtRatRacRcaR
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
Tctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagaagtaac Ttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcc Cagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcaacagcctgcagtctgaagattttgcagt ttattactgtcagcagcataataagtggatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa
117
3C3 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgg
Gggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagggtctggattcattttcagtcgctatggcatg
Tactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagttataaatactat
Gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctg
Agagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaatcaccatggtactactttgactactggggccagggaacc
ctggtcaccgtctcctct
118
3C3 VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggacatgagggtccctgctcagctcctgggactcctgctgctctggctcccagataccagatgtgacatccagatgac
Ccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcattagcaatta Tttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtccc Atctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaactta ttactgtcaaaagtataagagtgccccattcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaa
119
3B6 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctattttaaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctgttggagtctgggg
Gaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagct
Gggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggtataactggtactggtggtagcacatactacgcag
Actccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatgtgcaaatgaacagcctgagagc
Cgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaagggctggtgggagcttctactactactacggtatggacgtctggggcc
aagggaccacggtcaccgtctcctca
120
3B6 VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atgaggctccctgctcagctcctggggctgctaatgctctgggtctctggatccagtggggatattgtgatgactcagtctc
Cactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtactggata Caactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggg Gtccctgacaggttcaatggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggattttgg ggtttattactgcatgcaagctctacaaactccgtggacgttcggccacgggaccaaggtggaaatcaaa
121
6H6 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggagtttgggctgagctgggtattcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggg
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
Gaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagattctcctgtgcagcgtctggattcaccctcagtagctatggcatgcactg
Ggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatgggatgatggaagtaataaatactatgcagact
Ccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgagg
Acacggctgtctattactgtgcgagagcggggggttcggggaggtattataactactttgactactggggccagggaaccct
ggtcaccgtctcctca
122
6H6 VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggagaaatagtgatgacgcagtctcc
Agccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagaagcaacttagcctgg Taccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcag Tggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagca Taataactggctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
123
1B4 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctattttaaaaggtgtccaatgtgaggtgcagctgttggaatctggggga
Ggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcggcctctgggttcacctttagcagctatgccatgacctgggtc
Cgccaggttccagggaagggcctggagtgggtctcaggtattactggtagtggtgctaacacattctacacagactccgtga
Agggccggttcaccatttccagagacaattccaataattcgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgatgacacggc
Cgtatactactgtgcgaaaagaaatggtgggagttactactactactacggcatggacgtctggggccaagggaccacggtc
accgtgtcctca
124
1B4 VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atgaggctccctgctcagctcctggggctgctaatgctctgggtctctggatccagtggggatattgtgatgactcagtctccac
Tctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtcaagtcagagcctcctgcatagtagtggatacaacta Tttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacaactcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgac Aggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactg catgcaagctctacaaattccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
125
2E1.2 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
AtggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtCcag cctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaAggggct ggagtgggtggcagttatatgggatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagAcaattccaag aacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagcgggaagttcggggaggtattataact actttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
126
2E1.2 VL2 с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggagaaatagtgatgacgcagtctccagcca
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
ccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttaggagcaacttagcctggtatcagcaga aacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagacaggttcagtggcagtgggtctg ggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttatcactgtcagcagtataataagtggctcattttc ggcggagggaccaaggtggagatcaaa
127
1B5 VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
AtRRaRtttRRRCtgaRCtRRRttttCCtCRttRCtCttttaaRaRRtRtCCaRtRtCaRRtRCaRCtRRtRRaRtCtRRRRRaRRCRtRRtCCaRC
Ctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctgg aGtgggtgacacttatatggtttgatggaagttctaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaactccaacaac acGctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtatattactgtgtgagaggttttgcagcagtggctgggtggtacttcga tttctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca
128
1B5 VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggacatgagggtccctgctcagctcctgggactcctgctgctctggctcccagataccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcc
cTgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcgttagaaagtatttagcctggtatcagcagaaaccaggga aAgttcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcac caTcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaaaagtatttcagtgccccgtacacttttggccaggggaccaaactggaga tcaaa
129
3B6-NS VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctattttaaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctgttggagtctgggggaggctt
ggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct ccagggaaggggctggagtgggtctcaggtataactggtactggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcac catctccagagacaattccaagaacacgctgtatgtgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcga a a agggctggtgggagcttcta eta eta eta cggta tgga cgtctggggcca aggga cca eggtea ccgtctcctca
130
3B6-NS VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
atgaggctccctgctcagctcctggggctgctaatgctctgggtctctggatccagtggggatattgtgatgactcagtctccactctcc
ctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtactggatacaactatttggattg gtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggc agtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggattttggggtttattactgcatgcaagctctacaa a ctccgtgga cgttcggccacgggaccaaggtgga a atca a a
131
1B5-NK VH с подчеркнутой лидерной последовательностью
atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgt
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
ggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctttggcatgcactgggtccgccaggctc caggcaaggggctggagtgggtgacacttatatggtttgatggaagttctaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcacca tctccagagacaactccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtatattactgtgtgaga ggttttgcagcagtggctgggtggtacttcgatttctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca
132
1B5-NK VL с подчеркнутой лидерной последовательностью
Atggacatgagggtccctgctcagctcctgggactcctgctgctctggctcccagataccagatgtgacatccagatgacccagtctc
catcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcgttagaaagtatttagcctggtatca gcagaaaccagggaaagttcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtgga tctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaaaagtatttcagtgccccgta cacttttggccaggggaccaaactggagatcaaa
133
Внеклеточный домен CD40 человека
EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCH QHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIA TGVSDTICEPCP VGFF SNVS S AFEKCHPWTSCETKDLVVQQ AGTNKTD VVCGPQDRL R
134
Константная область тяжелой гамма-цепи иммуноглобулина 2 (IgHG2) (Uniprot Р01859)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S SNFGTQT YTCNVDFIKP SNTK VDKT VER
KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSN
KGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
135
Тяжелая цепь ЗСЗ, в которой вариабельная область выделена курсивным шрифтом и константный домен выделен жирным шрифтом
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAGSGFIFSRYGMYWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSYKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESPWYYFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SEQ ID NO:
ОПИСАНИЕ
SSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP
VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQ
PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
136
Легкая цепь ЗСЗ, в которой вариабельная область выделена курсивным шрифтом и константный домен выделен жирным шрифтом
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLOPEDVATYYCOKYKSAPFTFGPGTKVDIKRTYAAPSYmVVVSVVO LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSOESVTEODSKDSTYSLSST
LTL SKAD YEKHKVY АСЕ VTHOGL S SP VTKSFNRGE С
136
Тяжелая цепь ЗСЗ, в которой лидерная последовательность выделена подчеркиванием, вариабельная область выделена курсивным шрифтом и константный домен выделен жирным шрифтом
MEFGLSWYFLYALLRGYOCOVOLVESGGGWOPGRSLRLSCAGSGFIFSRYGMYWVRO
APGKGLEWl^A VIWYDGSYKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARES
PWYYFDYWGQGTL F7rXSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV
DKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCK
VSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG
137
Легкая цепь ЗСЗ, в которой лидерная последовательность выделена подчеркиванием, вариабельная область выделена курсивным шрифтом и константный домен выделен жирным шрифтом
MGWSCIILFLVATATGVHSZ)/ <9Mr^^
KVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYKSAPFTFGPGTKV D/XRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNS
OESVTEODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CELLDEX THERAPEUTICS, INC.
<120> АГОНИСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С CD40 ЧЕЛОВЕКА, И ВАРИАНТЫ
ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> CDJ-393PC
<140> PCT/US2017/028162
<141> 2017-04-18
<150> US 62/324,170
<151> 2016-04-18
<160> 147
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> CD40 человека
<400> 1
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln 275
<210> 2 <211> 260 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> CD40L человека <400> 2
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys
260
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Phe Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL
<400> 4
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Trp Ile Thr
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH CDR1 (Кабат)
<400> 5
Ser Asn Gly Ile His
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH CDR1 (Чотиа)
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH CDR2 ( Кабат)
<400> 7
Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 8
Trp Ser Asp Gly Ser Asn
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH CDR3 (Кабат)
<400> 9
Ala Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH CDR3 (Чотиа)
<400> 10
Ala Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL CDR1 ( Кабат)
<400> 11
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL CDR1 ( Чотиа)
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL CDR2 ( Кабат) <400> 13
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL CDR2 ( Чотиа)
<400> 14
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL CDR3 ( Кабат)
<400> 15
Gln Gln His Asn Lys Trp Ile Thr 1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL CDR3 ( Чотиа)
<400> 16
Gln Gln His Asn Lys Trp Ile Thr 1 5
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Pro Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 - VL
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Lys Ser Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100
105
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH CDR1 (Кабат)
<400> 19
Arg Tyr Gly Met Tyr 1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH CDR1 (Чотиа)
<400> 20
Gly Phe Ile Phe Ser Arg Tyr 1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH CDR2 ( Кабат)
<400> 21
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 22
Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr 1 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH CDR3 (Кабат)
<400> 23
Glu Ser Pro Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH CDR3 (Чотиа)
<400> 24
Glu Ser Pro Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL CDR1 (Кабат)
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL CDR1 (Чотиа)
<400> 26
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL CDR2 (Кабат)
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL CDR2 (Чотиа)
<400> 28
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL CDR3 (Кабат)
<400> 29
Gln Lys Tyr Lys Ser Ala Pro Phe Thr 1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL CDR3 ( Чотиа)
<400> 30
Gln Lys Tyr Lys Ser Ala Pro Phe Thr 1 5
<210> 31
<211> 123
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Ala Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Asn Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<211> <212> <213>
PRT
Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH CDR1 ( Кабат) <400> 33
Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH CDR1 ( Чотиа)
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH CDR2 ( Кабат) <400> 35
Gly Ile Thr Gly Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 36
Thr Gly Thr Gly Gly Ser
1 5
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH CDR3 (Кабат) <400> 37
Arg Ala Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH CDR3 (Чотиа)
<400> 38
Arg Ala Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL CDR1 ( Кабат)
<400> 39
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL CDR1 ( Чотиа)
<400> 40
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL CDR2 ( Кабат)
<400> 41
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL CDR2 (Чотиа)
<400> 42
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL CDR3 (Кабат)
<400> 43
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL CDR3 ( Чотиа)
<400> 44
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 45
<211> 122
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 - VH
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 - VL
<400> 46
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Asn Trp Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH CDR1 ( Кабат) <400> 47
Ser Tyr Gly Met His 1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH CDR1 ( Чотиа)
<400> 48
Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH CDR2 ( Кабат) <400> 49
Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 50
Trp Asp Asp Gly Ser Asn 1 5
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH CDR3 ( Кабат)
Ala Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH CDR3 (Чотиа)
<400> 52
Ala Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL CDR1 (Кабат)
<400> 53
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL CDR1 ( Чотиа)
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL CDR2 ( Кабат)
<400> 55
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL CDR2 ( Чотиа)
<400> 56
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL CDR3 ( Кабат) <400> 57
Gln Gln His Asn Asn Trp Leu Thr 1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL CDR3 ( Чотиа)
<400> 58
Gln Gln His Asn Asn Trp Leu Thr 1 5
<210> 59
<211> 123
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 - VH
<400> 59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Asn Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 - VL
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH CDR1 ( Кабат)
Ser Tyr Ala Met Thr 1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH CDR1 (Чотиа)
<400> 62
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH CDR2 (Кабат)
<400> 63
Gly Ile Thr Gly Ser Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 64
Thr Gly Ser Gly Ala Asn
1 5
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH CDR3 ( Кабат)
<400> 65
Arg Asn Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH CDR3 (Чотиа)
<400> 66
Arg Asn Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL CDR1 (Кабат)
<400> 67
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL CDR1 ( Чотиа)
<400> 68
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL CDR2 ( Кабат)
<400> 69
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL CDR2 ( Чотиа)
<400> 70
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL CDR3 (Кабат)
<400> 71
Met Gln Ala Leu Gln Ile Pro Trp Thr 1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL CDR3 (Чотиа)
<400> 72
Met Gln Ala Leu Gln Ile Pro Trp Thr 1 5
<210> 73
<211> 123
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Ala Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH CDR1 ( Кабат)
<400> 75
Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH CDR1 ( Чотиа)
<400> 76
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH CDR2 ( Кабат)
<400> 77
Gly Ile Thr Gly Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 78
Thr Gly Thr Gly Gly Ser
1 5
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH CDR3 ( Кабат)
<400> 79
Arg Ala Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH CDR3 (Чотиа) <400> 80
Arg Ala Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL CDR1 (Кабат)
<400> 81
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL CDR1 ( Чотиа)
<400> 82
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL CDR2 ( Кабат)
<400> 83
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL CDR2 ( Чотиа)
<400> 84
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL CDR3 (Кабат)
<400> 85
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL CDR3 (Чотиа)
<400> 86
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 - VH
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 88
<211> 106
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2
<400> 88
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Leu Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 - VH CDR1 ( Кабат)
<400> 89
Ser Tyr Gly Met His 1 5
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 - VH CDR1 (Чотиа)
<400> 90
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 - VH CDR2 (Кабат)
<400> 91
Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2
VH CDR2 ( Чотиа)
<400> 92
Trp Asp Asp Gly Ser Asn
<210> <211>
93 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2
VH CDR3 ( Кабат)
<400> 93
Ala Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr
<210> <211>
94 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 - VH CDR3 ( Чотиа)
<400> 94
Ala Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2 CDR1 (Кабат)
<400> 95
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2 CDR1 (Чотиа)
<400> 96
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2 CDR2 ( Кабат)
<400> 97
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2 CDR2 ( Чотиа)
<400> 98
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2 CDR3 ( Кабат)
<400> 99
Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Leu Ile 1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2 CDR3 ( Чотиа)
<400> 100
Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Leu Ile 1 5
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Leu Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Phe Ala Ala Val Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Phe Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH CDR1 ( Кабат)
<400> 103
Ser Phe Gly Met His
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH CDR1 ( Чотиа)
<400> 104
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 1 5
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH CDR2 (Кабат)
<400> 105
Leu Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH CDR2 (Чотиа)
<400> 106
Trp Phe Asp Gly Ser Ser 1 5
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH CDR3 ( Кабат)
<400> 107
Gly Phe Ala Ala Val Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK - VH CDR3 ( Чотиа)
<400> 108
Gly Phe Ala Ala Val Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Phe
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL CDR1 (Кабат)
<400> 109
Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL CDR1 (Чотиа)
<400> 110
Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL CDR2 (Кабат)
<400> 111
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL CDR2 (Чотиа)
<400> 112
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL CDR3 (Кабат)
<400> 113
Gln Lys Tyr Phe Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL CDR3 (Чотиа)
<400> 114
Gln Lys Tyr Phe Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5
<210> 115 <211> 423
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VH
<400> 115
atggagtttg ggctgacctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagttgg tggaatctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaagtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc aatggcattc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttatc tggtctgatg gaagtaataa attctatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctatatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtatatt actgtgcgag agcctctggt 360
tcggggagtt attataactt ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420
tca 423
<210> 116
<211> 156
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3G5 VL подчеркнута
<400> 116
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga tagcactgga 60
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttaga agtaac 156
<210> 117
<211> 378
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VH
<400> 117
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga tagcactgga 60
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttaga agtaacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcaacag cctgcagtct 300
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cataataagt ggatcacctt cggccaaggg 360
acacgactgg agattaaa 378
<210> 118
<211> 387
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3C3 VL
<400> 118
atggacatga gggtccctgc tcagctcctg ggactcctgc tgctctggct cccagatacc 60
agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc attagcaatt atttagcctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagttcctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactttgca atcaggggtc 240
ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300
cagcctgaag atgttgcaac ttattactgt caaaagtata agagtgcccc attcactttc 360
ggccctggga ccaaagtgga tatcaaa 387
<210> 119
<211> 426
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VH
<400> 119
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcaggtata actggtactg gtggtagcac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatgtg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aagggctggt 360
gggagcttct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420
tcctca 426
<210> 120
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6 VL
<400> 120
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtactg gatacaacta tttggattgg 180
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 240
tccggggtcc ctgacaggtt caatggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300
agcagagtgg aggctgagga ttttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 360
tggacgttcg gccacgggac caaggtggaa atcaaa 396
<210> 121
<211> 423
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VH
<400> 121
atggagtttg ggctgagctg ggtattcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagattctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cctcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tgggatgatg gaagtaataa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtctatt actgtgcgag agcggggggt 360
tcggggaggt attataacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420
tca 423
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 6H6 VL
<400> 122
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttaga agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cataataact ggctcacttt cggcggaggg 360
accaaggtgg agatcaaa 378
<210> 123
<211> 426
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VH
<400> 123
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccaatgtgag 60
gtgcagctgt tggaatctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcggcct ctgggttcac ctttagcagc tatgccatga cctgggtccg ccaggttcca 180
gggaagggcc tggagtgggt ctcaggtatt actggtagtg gtgctaacac attctacaca 240
gactccgtga agggccggtt caccatttcc agagacaatt ccaataattc gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgatgacacg gccgtatact actgtgcgaa aagaaatggt 360
gggagttact actactacta cggcatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtg 420
tcctca 426
<210> 124
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B4 VL
<400> 124
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120
atctcctgca ggtcaagtca gagcctcctg catagtagtg gatacaacta tttggattgg 180
tacctgcaga agccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 240
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaattccg 360 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 396
<210> 125
<211> 423
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VH
<400> 125
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tgggatgatg gaagtaataa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agcgggaagt 360
tcggggaggt attataacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420
tca 423
<210> 126
<211> 378
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 2E1.2 VL2
<400> 126
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagg agcaacttag cctggtatca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagac 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300
gaagattttg cagtttatca ctgtcagcag tataataagt ggctcatttt cggcggaggg 360
accaaggtgg agatcaaa 378
<210> 127
<211> 420
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5 VH
<400> 127
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tttggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt gacacttata tggtttgatg gaagttctaa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaact ccaacaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtatatt actgtgtgag aggttttgca 360
gcagtggctg ggtggtactt cgatttctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 420
<210> 128
<211> 387
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5 VL
<400> 128
atggacatga gggtccctgc tcagctcctg ggactcctgc tgctctggct cccagatacc 60
agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc gttagaaagt atttagcctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagttcctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactttgca atcaggggtc 240
ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300
cagcctgaag atgttgcaac ttattactgt caaaagtatt tcagtgcccc gtacactttt 360
ggccagggga ccaaactgga gatcaaa 387
<210> 129
<211> 426
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VH
<400> 129
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcaggtata actggtactg gtggtagcac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatgtg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aagggctggt 360
gggagcttct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420
tcctca 426
<210> 130
<211> 396
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 3B6-NS VL
<400> 130
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtactg gatacaacta tttggattgg 180
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 240
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300
agcagagtgg aggctgagga ttttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 360
tggacgttcg gccacgggac caaggtggaa atcaaa 396
<210> 131
<211> 420
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VH
<400> 131
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tttggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt gacacttata tggtttgatg gaagttctaa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaact ccaagaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtatatt actgtgtgag aggttttgca 360
gcagtggctg ggtggtactt cgatttctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 420
<210> 132
<211> 387
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: 1B5-NK VL
<400> 132
atggacatga gggtccctgc tcagctcctg ggactcctgc tgctctggct cccagatacc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120
gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc gttagaaagt atttagcctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagttcctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactttgca atcaggggtc 240
ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300
cagcctgaag atgttgcaac ttattactgt caaaagtatt tcagtgcccc gtacactttt 360
ggccagggga ccaaactgga gatcaaa 387
<210> 133 <211> 173
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Внеклеточный домен CD40 человека
<400> 133
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
165
170
<210> 134
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Константная область гамма класса тяжелой цепи иммуноглобулина 2 (IgHG2)
<400> 134
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195
200
205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 135
<211> 443
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: тяжелая цепь 3C3
<400> 135
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Pro Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: легкая цепь 3C3
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Lys Ser Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100
105
110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 137
<211> 462
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: тяжелая цепь 3C3
<400> 137
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Ile Phe
35 40 45
Ser Arg Tyr Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Pro Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
225 230 235 240
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
<210> 138
<211> 233
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: легкая цепь 3C3
<400> 138
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Lys Ser
100
105
110
Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 139
<211> 173
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Обезьяна
<220>
<221> misc_feature
<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена CD40 обезьяны
<400> 139
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr Arg Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Leu His Cys Thr Ser Glu Ser Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Pro His Arg Ser Cys Leu Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys Arg Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Gln Arg 165 170
<210> 140
<211> 94
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 140
Gly Gln Cys Val Thr Cys Ser Asp Lys Gln Tyr Leu His Asp Gly Gln
1 5 10 15
Cys Cys Asp Leu Cys Gln Pro Gly Ser Arg Leu Thr Ser His Cys Thr
20 25 30
Ala Leu Glu Lys Thr Gln Cys His Pro Cys Asp Ser Gly Glu Phe Ser
35 40 45
Ala Gln Trp Asn Arg Glu Ile Arg Cys His Gln His Arg His Cys Glu
50 55 60
Pro Asn Gln Gly Leu Arg Val Lys Lys Glu Gly Thr Ala Glu Ser Asp
65 70 75 80
Thr Val Cys Thr Cys Lys Glu Gly Gln His Cys Thr Ser Lys 85 90
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 141
Asp Lys Gln Tyr Leu
<210> 142
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 142
Leu Cys Gln Pro Gly
<210> 143
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 143
Trp Asn Arg Glu 1
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 144
Cys His Gln His Lys His Cys Asp Pro Asn
1 5 10
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 145
Gly Leu Arg Val
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 146
Gly Thr Ala Glu Ser Asp Thr Ile Cys Thr Cys
1 5 10
<210> 147
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический: консенсусная последовательность
<400> 147
His Cys Thr Ser 1
Формула изобретения
1. Агонистическое выделенное моноклональное антитело, которое связывается с CD40 человека, причем указанное антитело непосредственно активирует АПК и/или увеличивает иммунный ответ на антиген:
(a) независимо от связывания с рецептором Fc;
(b) без индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) СО40-экспрессирующих клеток;
(c) без индукции комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗЦ) СО40-экспрессирующих клеток; и/или
(d) независимо от связывания с рецептором Fc, и способно к синергическому действию с CD40L.
2. Антитело по п. 1, которое дополнительно проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:
(a) индуцирует клеточный апоптоз;
(b) усиливает активность клетки, направленную на стимуляцию Т-клеток, измеренную на основании увеличения экспрессии ИЛ-12р40;
(c) усиливает активацию В-клеток, измеренную на основании увеличения экспрессии по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR V450, СЕ> 54-ФЭ, СЕ> 86-АФЦ и CD83 BV510, CD 19 V500, С054-ФЭ, HLA-DR V450, CD23 РегСР-Су5.5, С069-АФЦ, CD86-АФЦ, CD38 РегСР-Су5.5 и С071-ФЭ;
(d) связывается с CD40 человека с равновесной константой диссоциации Kd, составляющей 10"10 М или менее;
(e) перекрестно реагирует с CD40 яванских макак; и/или
(f) связывается с CD40 человека, что приводит к активации клеток, измеренной с помощью репортерной линии клеток, управляемой NFkB.
3. Антитело по п. 1, которое содержит константную область тяжелой цепи IgG2.
4. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, причем указанные вариабельные области тяжелой и легкой цепей соответственно содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична:
(a) SEQ ID N0: 3 и 4;
(b) SEQIDNO: 17 и 18;
(a)
(c) SEQ Ш NO: 31 и 32;
(d) SEQ Ш NO: 45 и 46;
(e) SEQ Ш NO: 59 и 60;
(f) SEQ Ш NO: 73 и 74;
(g) SEQ Ш NO: 87 и 88; или
(h) SEQ Ш NO: 101 и 102.
5. Антитело по п. 4, отличающееся тем, что указанные вариабельные области тяжелой и легкой цепей соответственно содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична:
(a) SEQ ID N0: 3 и 4;
(b) SEQ ГО NO: 17 и 18;
(c) SEQ ГО NO: 31 и 32;
(d) SEQ ГО NO: 45 и 46;
(e) SEQ ГО NO: 59 и 60;
(f) SEQ ГО NO: 73 и 74;
(g) SEQ ГО NO: 87 и 88; или
(h) SEQ ГО NO: 101 и 102.
6. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в:
(a) SEQ ГО NO: 3 и/или 4;
(b) SEQ ГО NO: 17 и/или 18;
(c) SEQ ГО NO: 31 и/или 32;
(d) SEQ ГО NO: 45 и/или 46;
(e) SEQ ГО NO: 59 и/или 60;
(f) SEQ ГО NO: 73 и/или 74;
(g) SEQ ГО NO: 87 и/или 88; или
(h) SEQ ГО NO: 101 и/или 102.
7. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит последовательности CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей соответственно содержащих аминокислотные последовательности, представленные в:
(a) SEQ ГО NO: 3 и 4;
(b) SEQ ГО NO: 17 и 18;
(a)
(c) SEQ Ш NO: 31 и 32;
(d) SEQ Ш NO: 45 и 46;
(e) SEQ Ш NO: 59 и 60;
(f) SEQ Ш NO: 73 и 74;
(g) SEQ Ш NO: 87 и 88; или
(h) SEQ Ш NO: 101 и 102.
8. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 17 и 18 соответственно.
9. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит тяжелые и легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 135 и 136 соответственно.
10. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит:
(a) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 5, 7, 9 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 11, 13, 15, соответственно;
(b) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 19, 21, 23 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 25, 27, 29 соответственно;
(c) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 33, 35, 37 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 39, 41, 43 соответственно;
(d) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 47, 49, 51 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 53, 55, 57 соответственно;
(e) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 61, 63, 65 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 67, 69, 71 соответственно;
(f) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 75, 77, 79 соответственно, и/или CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 81, 83, 85 соответственно;
(g) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 89, 91, 93 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 95, 97, 99 соответственно; или
(a)
(h) последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш N0: 103, 105, 107 соответственно, и/или последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ IDNO: 109, 111, 113 соответственно.
11. Выделенное антитело, которое связывается с CD40 человека и содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ Ш NO: 19, 21, 23 соответственно, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ Ш NO: 25, 27, 29 соответственно.
12. Выделенное антитело, которое связывается с тем же эпитопом на CD40 человека, что и антитело, содержащее вариабельные области тяжелой и легкой цепей, соответственно содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в:
(a) SEQ Ш NO: 3 и 4;
(b) SEQ Ш NO: 17 и 18;
(c) SEQ Ш NO: 31 и 32;
(d) SEQ Ш NO: 45 и 46;
(e) SEQ Ш NO: 59 и 60;
(f) SEQ Ш NO: 73 и 74;
(g) SEQ Ш NO: 87 и 88; или
(h) SEQ Ш NO: 101 и 102.
13. Выделенное антитело, которое конкурирует за связывание с CD40 человека с антителом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепей, соответственно содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в:
(a) SEQ Ш NO: 3 и 4;
(b) SEQ Ш NO: 17 и 18;
(c) SEQ Ш NO: 31 и 32;
(d) SEQ Ш NO: 45 и 46;
(e) SEQ Ш NO: 59 и 60;
(f) SEQ Ш NO: 73 и 74;
(g) SEQ Ш NO: 87 и 88; или
(h) SEQ Ш NO: 101 и 102.
14. Агонистическое выделенное моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, как и антитело ЗСЗ или 3G5.
14.
15. Агонистическое выделенное моноклональное антитело, которое связывается с одним или более остатками в пределах участка, содержащего остатки аминокислот 1-5 и 33-36 внеклеточного домена (ВКД) CD40 человека (SEQ IDNO: 133).
16. Антитело по п. 15, которое дополнительно связывается с одной или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот 25, 26, 28 и 30 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
17. Антитело по п. 15 или 16, которое связывается с одной или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот 5, 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
18. Антитело по п. 17, которое связывается с аминокислотами 5, 33 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
19. Антитело по п. 18, которое связывается с аминокислотами 5, 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
20. Антитело по любому из пп. 15-19, в котором замена аланина треонином в положении 5 ВКД CD40 человека (SEQ ID NO: 133) уменьшает связывание указанного антитела по меньшей мере на 30% по сравнению со связыванием с ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
21. Антитело по п. 20, в котором замена аланина треонином в положении 5 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133) уменьшает связывание указанного антитела по меньшей мере на 50% по сравнению со связыванием с ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
22. Антитело по п. 20, в котором замена аланина треонином в положении 5 ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133) уменьшает связывание указанного антитела по меньшей мере на 80% по сравнению со связыванием с ВКД CD40 человека (SEQ Ш N0: 133).
23. Антитело по любому из пп. 14-19, отличающееся тем, что указанное антитело проявляет синергическое действие в комбинации с CD40L.
24. Антитело по п. 23, отличающееся тем, что указанное синергическое действие представляет собой увеличение индукции экспрессии CD95 при инкубации с клетками линии Ramos.
25. Антитело по п. 23, отличающееся тем, что указанное синергическое действие представляет собой увеличение пролиферации В-клеток при инкубации с В-клетками человека.
14.
26. Антитело по п. 23, отличающееся тем, что указанное синергическое действие представляет собой увеличение индукции экспрессии ИЛ-12р40 при инкубации с дендритными клетками.
27. Антитело по п. 23, отличающееся тем, что указанное синергическое действие измеряется на основании экспрессии CD95.
28. Агонистическое выделенное моноклональное антитело, которое связывается с одним или более остатками в пределах участка, содержащего остатки аминокислот 13-15 и 33-36 ВКД CD40 человека (SEQ ID N0: 133).
29. Антитело по п. 28, которое связывается с одной или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот 33, 34 и 36 ВКД CD40 человека (SEQ ГО N0: 133).
30. Антитело по любому из пп. 1-29, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой антитело человека.
31. Антитело по любому из пп. 1-30, отличающееся тем, что указанное антитело содержит константную область человека.
32. Антитело по любому из пп. 1-30, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент Fab, Fab', (Fab')2, Fv или scFv.
33. Молекулярный конъюгат, содержащий антитело по любому из пп. 1-32, соединенное с антигеном.
34. Биспецифическая молекула, содержащая антитело по любому из пп. 1-32, соединенное со второй молекулой, имеющей специфичность связывания, которая отличается от специфичности связывания указанного антитела.
35. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанную вариабельную область легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепей антитела по любому из пп. 1-32.
36. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 35.
37. Клетка, трансформированная вектором экспрессии по п. 36.
38. Композиция, содержащая указанное антитело, молекулярный конъюгат или биспецифическую молекулу по любому из пп. 1-34 и носитель.
39. Композиция по п. 38, дополнительно содержащая адъювант.
40. Композиция по п. 38, дополнительно содержащая одно или более других антител.
14.
41. Композиция по п. 40, отличающаяся тем, что указанное одно или более других антител связываются с CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, ТГМ-З, галектином-9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, галектином-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, В7-НЗ, В7-Н4, 2В4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TFM-1, TFM-4, В7-1, В7-2, CD28, 4-1ВВ (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, ОХ40, OX40L, CD70, CD27, DR3 или CD28H.
42. Способ индукции или усиления иммунного ответа против антигена у субъекта, включающий введение указанному субъекту антитела, молекулярного конъюгата, композиции или биспецифической молекулы по любому из пп. 1-34 и 38-41 в количестве, эффективном для индукции или усиления иммунного ответа против антигена.
43. Способ по п. 42, дополнительно включающий этап введения антигена.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что указанный антиген вводят одновременно, раздельно или последовательно относительно введения указанного антитела, композиции или биспецифической молекулы.
45. Способ ингибирования роста СО40-экспрессирующих клеток, включающий приведение указанных клеток в контакт с антителом, композицией или биспецифической молекулой по любому из пп. 1-34 и 38-41 в количестве, эффективном для ингибирования размножения СО40-экспрессирующих клеток.
46. Способ лечения расстройства у субъекта, включающий введение указанному субъекту антитела, композиции или биспецифической молекулы по любому из пп. 1-34 и 38-41 в количестве, эффективном для лечения указанного расстройства.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из хронического лимфобластного лейкоза, лимфомы из клеток мантийной зоны, первичной лимфомы центральной нервной системы, лимфомы Беркитта и В-клеточной лимфомы из клеток краевой зоны.
48. Способ по любому из пп. 42-47, отличающийся тем, что указанное антитело не блокирует связывание CD40L с CD40 человека.
49. Способ по любому из пп. 42-48, дополнительно включающий введение субъекту одного или более терапевтических агентов.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент представляет собой другое антитело.
14.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что указанное антитело представляет собой антитело к PD-1, антитело к PD-L1 и/или антитело к CTLA-4.
52. Способ по п. 50, отличающийся тем, что указанные первое и второе антитела вводят одновременно.
53. Способ по п. 50, отличающийся тем, что указанные первое и второе антитела вводят последовательно.
54. Антитело по любому из пп. 1-32 для применения для индукции или усиления иммунного ответа против антигена у субъекта.
55. Применение антитела по любому из пп. 1-32 в производстве лекарственного средства для лечения рака.
14.
Клон
KD (пМ)
Коп (1/Мс)
Kdis (1/с)
ЗСЗ
10.7
8,13x105
8,67х10-6
3G5
3.3
9,05x105
2,97x106
1В4
10.5
8,32x105
8,76x10"6
ЗВ6
7.9
7,82x105
6,14х10-6
6Н6
2,8
9,05x105
2,49x10-6
ФИГ. 1
1.8
Концентрация (мкг/мл)
Связывание с sCD40-Fc
Связывание с В-клетками человека
Связывание с В-клетками яванских макак
20000 18000 16000 . 14000 t 12000 -8- 10000 | 8000 5 6000 <§- 4000
0.01 0.1 Концентрация (мкг/мл)
20000 18000 16000 §¦ 14000 | 12000
0.01 0.1 Концентрация (мкг/мл)
ФИГ. 3
3G5
6Н6
2 1.5 1
0.5 0
1В4
кЧЧЧЧ\!
| | Связывание СР401_-биотина
CD40L-6HOTHH С избытком CD40L CD40L-6HOTHH С антителами человека
ФИГ. 4А
Связывание с клетками линии Raji
-•-ЗСЗ
--S-3G5 1В4
-*-ЗВ6
-~ж- 6Н6
hulgG2
Концентрация (мкг/мл)
ФИГ. 5
0.0001 0.001 0.01 0.1
Концентрация (мкг/мл)
Связывание с клетками линии Ramos
Экспрессия CD54
Экспрессия HLA-DR
Экспрессия CD86
35000
? Среды
30000
Контр. lgG2
О > >
25000
621 чел-ка
[-] 1412 Монокл.
¦От
20000
антитело
-т~
¦ ЗСЗ
15000
И 3G5
10000
5000
О. О > >
с; ¦8-н
X S
180001600014000120001000080006000400020000-
CD83 клетки (%)
? Среды
Контр. lgG2 ^ чел-ка |-j 1412 Монокл.
антитело ¦ ЗСЗ
И 3G5
ФИГ. 8А
-У-ЩИ
I ^1кЛ
? Среды
^ контрольный lgG2 человека
1412 моноклон, антитело
¦ ЗСЗ
И 3G5
ФИГ. 9А
Выработка ИЛ-12р40: п = 6
Экспрессия CD54 i
4000
^Среды Контр. lgG2
чел-ка Экспрессия HLA-DR
антитело
¦ ЗСЗ
03G5
Q. 20000 § 15000
10000 5000-
1412 Монокл.2bU0Ul
,Среды
Й-каl9G2 Экспрессия CD23
1412 Монокл. 100" антитело
¦ ЗСЗ
03G5
Среды Контр. lgG2 'чел-ка
I--1412 Монокл.дБ '-'антитело
¦ ЗСЗ
? 3G5
? , Среды Контр. lgG2 CD23 КЛетКИ (%) ^ чел-ка
|-]1412 Монокл.
антитело ¦ ЗСЗ
IZI3G5
Экспрессия CD69 300
о-250
|200
ь 150-1 i
s 100
<Ч СП J
о- 50-о
Среды Контр. lgG2 чел-ка
Экспрессия CD86 ? 250
Среды Контр. lgG2 чел-ка
1412 Монокл. антитело ЗСЗ
Экспрессия CD38 600-
Среды
160
Контр. lgG2 0 чел-ка
¦ ЗСЗ
? 3G5
|-, 1412 Монокл. 140 '-'антитело .
о > > ц
-8-
X S
ч: Ф о. о
CL120
100 80 60Н 40 20 0
со го
Экспрессия CD71
¦П-
"Среды
Контр. lgG2 0чел-ка
1412 Монокл.
антитело
ЗСЗ
? 3G5
Активация NFKB
-(r)- ЗСЗ --и - 3G5 --¦--1В4
-*-ЗВ6
-ж- 6Н6
|gG2
человека
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 Концентрация (мкг/мл)
ФИГ. 11А
ФИГ. 11В
Кол-во дней после инокуляции
i i i i i i
10 20 30 40 50 60 Кол-во дней после инокуляции
Ramos, физиологический солевой раствор
10 20 30 40 50 Кол-во дней после инокуляции
СГ)
20 30 40 50 Кол-во дней после инокуляции
100-
га 80-ш
1 60-ш н
ф о
"бо"
физиологический • солевой раствор I- ЗСЗ ^- 3G5
lgG2
1412
ЗСЗ
3G5
18/32 Пролиферация Т-клеток
Концентрация (нМ)
Связывание с рекомбинантным CD40 человека-Fc
Активация NFKB
.о d
180000 160000 140000
о, 120000 p 100000 S 80000
x 60000 § 40000 20000 0
ЗСЗ
(tm)в~ ЗСЗ F'2 -в- 3G5 ¦-?¦-3G5 F'2
lgG2 человека . -е> - lgG2 человека F'2
о. 10000 > >
* 8000
сс 6000
о. О
4000
// //
// // // //
3G5 -?--3G5 F'2
|gG2 человека ¦ -€> - lgG2 человека F'2
2000
4^--(tm)ф^---ФС>
i i 11 iiiii-i i 11 IIIII i i 11 mil I I 11 mil i i 111 mi
0.001 0.01 0.1 1 10 100
Концентрация (нМ)
ФИГ. 17
ФИГ. 19
25000
20000
15000
10000
5000
Р 9-
i -*>
§-*"iecr
1 1 i
1 ниц
1 1 II 1 \ 11111
¦0 ЗСЗ
-(r)--lgG2 человека
-в-3C3 + SCD40L -е- lgG2 человека+
SCD40L
Только SCD40L
0.0001
0.01 1 Концентрация (мкг/мл)
100
ФИГ. 20
Каппа
SCD40 (1-173)
Метка FLAG
го со
1-94
36-130
84-173
ФИГ. 21
Полноразмерный участок, аминокислоты 1-73
CRD 1
CRD3
CRD2
1 МО20 30 40 50 60 70 8СЛ f 90 100 110 12о| ПзО 140 150 16оЛ 173
!_1 I I I ! I I I I I I I I I I I I
(1)3
Обезьяна (1) EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCTSEp Человек (1) EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSE \ 3SCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSBTIC
Аминокислоты 1-94 CRD 1+2
Аминокислоты 36-130 CRD 2 + 3
Аминокислоты84-173 CRD 3 + 4
(1)1 10 20 30 40 50 60 70
DUCTCEEGWHCTSE
v ' ¦ - | i 111 i f I i 11 11 i i-i ' ' - 11 - I i ' I
Человек (1) EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSCCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQBKKEPlNLSLRVQQKlGfflEjI
Мышь (1) GQCVTCSEKQYIHDGQCCCLCQPGS
(1), ,C DKQYL QCC LCQPG RL S CT T С PC EF WNRE CHQHRHCEPN GLRV GTAESDTVCTC EG HCTS
Мутиров. вариант A GQSVT
Мутиров. Мутиров. вариант С вариант D SRTH ALEK
Мутиров. вариант В HDG
ФИГ. 22
0217-17 MutA1-5
Концентрация (мкг/мл)
0217-17 MutD33-36
Концентрация (мкг/мл)
20.0 10.0 0.0
День1: День 4 День 5 День 8 День 29: День 32 День 39 День 44
До введения д0 введения
дозы дозы
-(r)- Контроль -о- ЗСЗ -0-3G5
ФИГ. 23В
ACT (Ед./л)
70.0 -
День 1: День 4 День 5 День 8 День 29: День 32 День 39 День 44
До введения До введения
дозы дозы
-"-Контроль-о-ЗСЗ -o-3G5
0.0
День 1: День 4 День 5 День 8 День 29: День 32 День 39 День 44
До введения До введения
дозы дозы
-е- Контроль -о-ЗСЗ -0-3G5
ФИГ. 24
Уровни ИЛ-12 в крови
500^ 1 1 1
0 200 400 600 800 1000 1200
Время (часы)
Физиолог, -о- 3C3-hG2 3G5-hG2 солевой раствор
10.00
5.00
0.00
8.00 6.00 4.00 2.00 0.00
День 1: день 4 день 5 день 8 день 29: День 32 День 39 День 44
До введения До введения
дозы дозы
Контроль -о- ЗСЗ -0-3G5
28/32
ФИГ. 25С
8.00
Лимфоциты (х103 клеток/мкл)
День 1: день 4 День 5 День 8 День 29: День 32 День 39 День 44
До введения До введения дозы
Д03Ь| _#-Контроль-о-зсз -0-3G5
В-клетки
Физиол. солевой " раствор -•-ЗСЗ
-¦-3G5
Дни
29/32
ФИГ. 27
Экспрессия HLA-DR на В-клетках после дозы 2 мг
О о
Экспрессия HLA-DR на В-клетках после дозы 0,2 мг
Пролиферация В-клеток
Выработка ИЛ-12р40 с ДК
'/////, I
Только "антитело
И Антитело < SCD40L
lgG2 человека
ЗСЗ
ФИГ. 30
Цитокиновый ответ в количественном исследовании цельной крови
ил-ip
[Донор 1
Донор 2
Донор 3
Донор 4
Донор 5
Контр. lgG2 чел-ка
0.2
1.4
1.6
4.5
ЛПС
682
697
885
882
858
ЗСЗ
0.1
1.3
11.3
5.6
ИЛ-6
Донор 1
Донор 2
Донор 3
Донор 4
Донор 5
,Контр. lgG2 чел-ка
2.1
12.3
1.3
2.9
ЛПС
12.5
12.6
11.6
11.7
ЗСЗ
1.9
0.9
1.2
2.5
ФНО-а
Донор 1
Донор 2
Донор 3
Донор 4
Донор 5
Контр. lgG2 чел-ка
0.6
0.7
1.4
1.3
ЛПС
45.2
43.9
48.7
45.6
27.5
ЗСЗ
0.7
1.2
1.5
1.1
1.6
ИФН-у
Донор 1
Донор 2
Донор 3
Донор 4
Донор 5
hulgG2 control
0.5
LPS
49.8
ЗСЗ
1.3
ФИГ. 31
(19)
(19)
(19)
(19)
109
112
112
<400>
<210> 23
<210> 23
<210> 23
<210> 23
<400>
<400>
<210> 33
<210> 33
<210> 33
<400> 51
<400> 51
56 7
PRT
<210> <211> <212>
56 7
PRT
<210> <211> <212>
<400>
80 14 PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
90 7
PRT
<210> <211> <212>
<210> 99
<210> 99
<210> 122 <211> 378 <212> ДНК
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
141 5
PRT
<210> <211> <212>
1/32
1/32
6/32
6/32
6/32
6/32
6/32
6/32
7/32
7/32
9/32
10/32
10/32
10/32
10/32
13/32
13/32
13/32
13/32
13/32
13/32
19/32
19/32
19/32
19/32
19/32
19/32
19/32
19/32
20/32
20/32
20/32
20/32
20/32
20/32
23/32
23/32
23/32
23/32
23/32
23/32
25/32
25/32
27/32
27/32
27/32
27/32
27/32
27/32
27/32
30/32
30/32
31/32
31/32
31/32
31/32
31/32
31/32
32/32
32/32