|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Данное изобретение относится к способам приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л β-глюкана, при этом указанные β-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа. Эти способы включают затирание зёрен ячменя, содержащих по меньшей мере 10% β-глюканов, имеющих отношение DP3/DP4 в указанном β-глюкане, равное по меньшей мере 3, при наличии активности α-амилазы и активности эндо-1,3(4)- β-глюканазы. Напитки обладают вязкостью, обеспечивающей приятное ощущение во рту, в то же время они содержат β-глюканы, которые способствуют понижению уровней LDL холестерина. Эти напитки в общем являются стабильными и могут храниться месяцами при комнатной температуре без значительного снижения содержания β-глюканов.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Данное изобретение относится к способам приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л β-глюкана, при этом указанные β-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа. Эти способы включают затирание зёрен ячменя, содержащих по меньшей мере 10% β-глюканов, имеющих отношение DP3/DP4 в указанном β-глюкане, равное по меньшей мере 3, при наличии активности α-амилазы и активности эндо-1,3(4)- β-глюканазы. Напитки обладают вязкостью, обеспечивающей приятное ощущение во рту, в то же время они содержат β-глюканы, которые способствуют понижению уровней LDL холестерина. Эти напитки в общем являются стабильными и могут храниться месяцами при комнатной температуре без значительного снижения содержания β-глюканов.
Евразийское (21) 201892351 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.05.02
(51) Int. Cl.
A23L 2/38 (2006.01) A23L 2/52 (2006.01) A23L 2/66 (2006.01) C12C 7/00 (2006.01)
(54) НАПИТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ Р-ГЛЮКАН ЯЧМЕНЯ
(31) PA201670285
(32) 2016.05.02
(33) DK
(86) PCT/EP2017/060376
(87) WO 2017/191109 2017.11.09
(71) Заявитель:
КАРЛСБЕРГ БРЮИРИЗ А/С; ЮНИВЕРСИТИ ОФ КОПЕНГАГЕН (DK)
(72) Изобретатель:
Моллер Бирте, Миккелсен Метте Скау, Йенсен Мортен Георг, Гойкович Зоран (DK)
(74) Представитель:
Угрюмов В.М. (RU)
(57) Данное изобретение относится к способам приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л Р-глюкана, при этом указанные Р-глюка-ны имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа. Эти способы включают затирание зёрен ячменя, содержащих по меньшей мере 10% Р-глюканов, имеющих отношение DP3/DP4 в указанном р-глюкане, равное по меньшей мере 3, при наличии активности а-амилазы и активности эндо-1,3(4)-р-глюканазы. Напитки обладают вязкостью, обеспечивающей приятное ощущение во рту, в то же время они содержат Р-глюканы, которые способствуют понижению уровней LDL холестерина. Эти напитки в общем являются стабильными и могут храниться месяцами при комнатной температуре без значительного снижения содержания Р-глюканов.
НАПИТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ р-ГЛЮКАН ЯЧМЕНЯ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области напитков для здоровья, а также к способам их приготовления. В частности, данное изобретение относится к способам изготовления напитков и полуфабрикатов для напитков, имеющих высокое содержание Р-глюканов ячменя.
Сведения о предшествующем уровне техники
Р-Глюканы имеют ряд замечательных преимуществ для здоровья, включая улучшение работы сердца, нормальный уровень содержания глюкозы в зерне хлебных злаков, они представляют собой длинные линейные полисахариды, состоящие из единиц глюкозы, соединённых (1 -> 3) или (1 -> 4)-Р-связями. Из всех зёрен злаков наиболее богатым источником волокон Р-глюканов является ячмень.
Однако жидкости, содержащие высокий уровень Р-глюканов, обычно являются очень вязкими и, таким образом, менее подходящими для применения в качестве напитков.
Сущность изобретения
Следовательно, существует неудовлетворённая потребность в способах и материалах для приготовления напитков, имеющих высокое от природы содержание Р-глюкана.
Настоящее изобретение предусматривает, что при применении зёрен ячменя, имеющих высокое отношение DP3 к DP4, и при обработке экстрактов таких зёрен смесью ферментов, обладающей активностью а-амилазы и активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и необязательно активностью глюкоамилазы и/или пуллуланазы, можно приготавливать стабильные напитки, обладающие вязкостью, обеспечивающей приятное ощущение во рту, и в то же само время содержащие Р-глюканы, которые способны содействовать понижению уровней LDL холестерина (липопротеинов низкой плотности). Напитки предпочтительно являются стабильными и могут месяцами храниться при комнатной температуре без значительного уменьшения содержания Р-глюкана.
Таким образом, данное изобретение предусматривает способы приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л Р-глюкана, причём указанные Р-глюканы
имеют среднюю молекулярную массу в интервале от 80 до 200 кДа, и указанный способ включает стадии
a) обеспечения зёрен ячменя, при этом указанные зёрна имеют следующие характеристики:
i. содержат по меньшей мере 10 % Р-глюканов,
ii. имеют отношение DP3/DP4 в указанных Р-глюканах равное по меньше мере 3;
b) затирания указанных зёрен в воде в присутствии ферментной композиции, причём указанная композиция обладает активностью а-амилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, с получением при этом водного экстракта;
c) отделения указанного водного экстракта от зёрен ячменя с получением при этом напитка или основы напитка;
d) необязательного превращения основы напитка в напиток.
Данное изобретение предусматривает также напитки, содержащие по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в интервале от 80 до 200 кДа и указанный напиток получается способами по изобретению для снижения риска появления клинического состояния у субъекта, который нуждается в этом, причём это клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца и диабета.
Данное изобретение предусматривает также способы уменьшения риска появления клинического состояния у субъекта, который нуждается в этом, причём это клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, диабета и инфекций, при этом такой способ включает введение напитков по изобретению в эффективном количестве указанному субъекту.
Данное изобретение предусматривает также способы снижения в крови уровней по меньшей мере одного липида, выбранного из группы, состоящей из триглицеридов, холестерина и LDL у субъекта, нуждающегося в этом, при этом такой способ включает употребление напитка согласно данному изобретению указанным субъектом.
Настоящее изобретение предусматривает также способы уменьшения риска ожирения или уменьшения степени ожирения у субъекта, нуждающегося в этом, при этом такой способ включает употребление указанным субъектом напитка согласно данному изобретению.
Описание рисунков
Фигура 1: Конечные продукты разложения Р-глюкана (Р-глюкан ячменя средней вязкости компании Megazyme) под действием Attenuzyme(r) Flex, Attenuzyme(r) and Termamyl(r) SC при 18°C.
Фигура 2: Спектр COSY Р-глюкана lys5f, экстрагированного при помощи
Termamyl(r) SC частично расщеплённого под действием побочного действия лихеназы Attenuzyme(r) Flex при 65 ° С.
Фигура 3: Кривые адсорбции Лэнгмюра Р-глюканов lys5f ТА (530 кДа) и lys5f TAF (150 кДа) после добавления увеличивающихся концентраций гликохолята (0, 5, 15, 30, 45 мМ) при рН 5.
Фигура 4: Изменение уровня триглицерида (ммол/л) в сравнении с исходным уровнем через 4 нед после лечения крыс Р-глюканом. Средние величины ± SEM, п=12 на курс лечения.
Фигура 5: Изменение уровня общего холестерина (ммол/л) в сравнении с исходным уровнем через 4 нед после лечения крыс Р-глюканом. Средние величины ± SEM, п=12 на курс лечения.
Фигура 6: Изменение уровня LDL-холестерина (ммол/л) в сравнении с исходным уровнем через 4 нед после лечения крыс Р-глюканом. Средние величины ± SEM, п=12 на курс лечения.
Фигура 7: Изменение уровня HDL-холестерина (ммол/л) в сравнении с исходным уровнем через 4 нед после лечения крыс Р-глюканом. Средние величины ± SEM, п=12 на курс лечения.
Фигура 8: Разница в общем содержании SCFA (ммол/кг), умноженная на содержимое аппендикса (г) через 4 нед после лечения крыс Р-глюканом. Средние величины ± SEM, п=12 на курс лечения.
Фигура: Стабильность содержания Р-глюкана (г/л) в бутылках, хранившихся при комнатной температуре в течение 6 мес. Определения в суспензиях Glucagel(tm) и lys5f TAF проводили методом с окрашиванием калькофлуором. Средние величины ± SEM, п=2 в мес.
Фигура 10: Выравнивание (последовательностей) между HvNSTl и ВТ1 маисом.
Фигура 11 показывает величину отношения DP3/DP4 в зёрнах ячменя различных сортов вместе с молекулярной массой(М\?) Р-глюканов в вытяжке из указанных зёрен с использованием или смеси Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) Flex (TAF), или смеси Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) (ТА) или Termamyl(r) (Т).
Фигура 12 показывает величину вязкости вытяжки бета-глюкана после экстракции различных сортов ячменя при помощи ферментов Т, ТА и TAF.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Определения
Используемые в данной заявке термины могут означать один предмет или более в зависимости от контекста, где они используются.
Применяемый при указании количества термин "примерно" означает +/- 5 %, предпочтительно, +/- 2 %, ещё более предпочтительно, +/- 1 %.
Термин "пиво", используемый в данной заявке, относится к напитку, приготовленному путём ферментации экстракта (пивного сусла). Предпочтительно указанную ферментацию проводить в присутствии дрожжей.
Термин "Р-глюкан со смешанными связями", используемый в данной заявке, относится к полисахаридам на основе мономеров D-глюкозы, соединённых Р-(1 -> 3) или (1 -> 4) гликозидными связями. Оба типа гликозидных связей могут образовываться в молекуле одного полисахарида. Термины "Р-глюкан" и "бета-глюкан" используются в данной заявке как взаимозаменяемые. Термин "Р-глюкан", используемый в данной заявке, может относиться к любому Р-глюкану, но предпочтительно термин "Р-глюкан" относится к "Р-глюкану со смешанными связями".
Термин "основа напитка", используемый в данной заявке, относится к жидкости, которая может быть переработана в готовый для питья напиток. В общем, основа напитка может быть превращена в готовый напиток путём добавления одного или более дополнительных соединений и/или дополнительных жидкостей, и/или путём ферментации.
Термин "зерно" означает зерновки злаков, называемые внутренними семенами, лемма и палеа. У большинства сортов ячменя лемма и палеа прикреплены к зерновке и являются частью зерна после молотьбы. Однако существуют голозёрные виды ячменя. У этих видов зерновка не содержит структур лемма и палеа и является голозёрной после
обмолота, как пшеница. Термины "зерно" и "жито" используются в данной заявке как взаимозаменяемые.
Термин "затирание" означает выдержку зёрен ячменя в воде при определённой (-ых) температуре (-ах). Часто перед выдержкой в воде зёрна ячменя измельчают.
Величина "отношения количества воды к количеству зёрен ячменя/помола ячменя" равная 1 к X, означает 1 часть воды на X частей зёрен ячменя или размолотого ячменя. Отношения могут быть также указаны как как 1 к интервалу XX или YY, что означает 1 часть воды к интервалу количества XX или YY зёрен ячменя или размолотого ячменя. Все отношения приводятся как весовые.
Термин "сусло" означает жидкий экстракт зёрен ячменя, приготовленный путём затирания. Другие виды несоложёного сырья могут быть смешаны с зёрнами ячменя и подвергнуты затиранию для получения сусла. Другие виды несоложёного сырья могут быть добавлены к суслу. Таким несоложёным сырьём может быть любой материал, содержащий крахмал, такой как другие злаки, отличающиеся от ячменя, солода или сиропов.
Способ приготовления напитка
Настоящее изобретение относится к способу приготовления напитка, имеющего природное высокое содержание Р-глюкана. Указанный напиток может быть любым из напитков, описанных в данной заявке ниже, в разделе "Напиток".
Этот способ включает затирание зёрен ячменя в воде в присутствии ферментной композиции, обладающей активностью а-амилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, и необязательно активностью глюкоамилазы и/или пуллуланазы. Согласно одному из вариантов изобретения указанные зёрна ячменя предпочтительно не подвергают никакой тепловой обработке перед затиранием. В частности, может быть предпочтительно не проводить затирание зёрен. В особенности, может быть предпочтительно не проводить соложение. Вообще предпочтительно, чтобы указанные зёрна ячменя измельчали перед затиранием. Указанные зёрна имеют высокое содержание Р-глюканов (предпочтительно, по меньшей мере равное 10 %) и высокое отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане (предпочтительно, по меньшей мере равное 3). Ячмень может быть любым из сортов ячменя, описанных в данной заявке ниже в разделе "Ячмень". Затирание включает выдержку зёрен ячменя, предпочтительно, измельчённых (дроблёных) зёрен ячменя, в воде при определённой (-ых) температуре (-ах). Затирание можно осуществлять любым из способов, описанных ниже в разделе "Затирание". Ферментная композиция обладает
активностью а-амилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и необязательно также второстепенной активностью глюкоамизазы и/или пуллуланазы. Эти виды активности могут быть получены на основе одного или более ферментов. Таким образом, не требуется, чтобы ферментная композиция включала 3 или 4 разных фермента, если некоторые из ферментов обладают более, чем одним видом активности. Однако вообще ферментная композиция содержит фермент, который обладает активностью а-амилазы, фермент с активностью пуллуланазы и фермент с активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и фермент с активностью глюкоамилазы. Указанная ферментная композиция может быть любой из ферментных композиций, описанных в данной заявке ниже в разделе "Ферментная композиция".
После затирания водный экстракт отделяют от зёрен ячменя. Указанный водный экстракт может быть также назван в данной заявке "суслом". Водный экстракт может быть готов для употребления в качестве напитка по изобретению. Однако часто водный экстракт нужно обрабатывать дальше для получения напитка. В таких случаях водный экстракт может также называться в данной заявке "основой напитка". Основа напитка может быть переработана в напиток любым из способов, описанных в данной заявке ниже в разделе "переработка основы напитка в напиток".
Таким образом, одна из целей настоящего изобретения состоит в обеспечении способов приготовления любого из напитков, описанных в данной заявке ниже в разделе "Напиток", при этом указанный способ включает стадии
a) предоставления зёрен ячменя, который может быть одним из видов ячменя, описанных ниже в данной заявке в разделе "Ячмень";
b) затирания указанных зёрен любым из способов, описанных в данной заявке ниже в разделе "Затирание", в присутствии ферментной композиции, , которая может быть любой композицией, описанной в данной заявке ниже в разделе "Ферментная композиция", с получением при этом водного экстракта;
c) отделения указанного водного экстракта от зёрен ячменя с получением при этом напитка или основы напитка;
d) необязательной переработки основы напитка в напиток любым из способов, описанных ниже в данной заявке в разделе "Переработка основы напитка в напиток".
Напиток
Данное изобретение относится к способам приготовления напитка, имеющего высокое содержание Р-глюкана, но в то же самое время обладающего вязкостью, которая
является достаточно низкой, чтобы придать напитку способность давать приятное ощущение во рту.
Было установлено, что Р-глюканы уменьшают/снижают содержание холестерина в крови. Согласно Европейскому агентству по безопасности продуктов питания (EFSA), положительный эффект может быть получен при употреблении 3 г Р-глюкана ячменя ежедневно. Положительный эффект может быть также получен при употреблении пищевого продукта, содержащего по меньшей мере 1 г Р-глюкана в применяемом количестве продукта. Соответственно, предпочтительно, чтобы напитки по изобретению содержали достаточное количество Р-глюкана для обеспечения дневного потребления, составляющего по меньшей мере 3 г. Так, согласно одному из вариантов напитки по изобретению содержат от 0.5 до 2 г, например, от 0.5 до 1.5 g, например, примерно 1 г, то есть, 1 г Р-глюканов на порцию. В контексте напитков по данному изобретению такая порция составляет обычно или 250, или 330 мл. Таким образом, напитки по изобретению предпочтительно содержат указанные выше количества Р-глюканов в 250 - 330 мл, например, в 250 мл и/или в 330 мл.
Таким образом, напитки, приготовленные согласно настоящему изобретению, предпочтительно содержат по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов. Более предпочтительно, когда напитки содержат 3 г/л Р-глюканов. Ещё более предпочтительно, когда напитки содержат по меньшей мере 4 г/л Р-глюканов. Изобретение также предусматривает, что напитки могут содержать больше Р-глюканов, например, в пределах от 4 до 20 г/л, в том числе, в пределах от 4 to 15 г/л, например, в пределах от 4 до 10 г/л. Напиток может быть также концентратом, содержащим очень большое количество Р- глюканов, например, более 8 г/л, например, от 8 до 20 г/л. Такие концентраты могут быть перед употреблением разбавлены.
Содержание Р-глюкана в готовом напитке можно регулировать несколькими методами. Один метод регулирования содержания Р-глюкана в напитке заключается в регулировании отношения зёрен ячменя к воде во время затирания. Подходящие отношения зёрен ячменя к воде, которые могут быть использованы в способах по изобретению, описаны в разделе "Затирание" ниже в данной заявке. Для того, чтобы получить меньшее содержание Р-глюкана основа напитка может быть также разбавлена дополнительным количеством жидкости.
Данное изобретение предусматривает, что Р-глюканы с низкой молекулярной массой оказывают благоприятное действие на здоровье, то есть, что Р-глюканы с низкой
молекулярной массой способны снижать уровень холестерина в крови и, в частности, способны снижать уровень LDL в крови.
Кроме того, данное изобретение свидетельствует, что напитки, содержащие низкомолекулярные Р-глюканы также имеют низкую вязкость.
Соответственно, предпочтительно, чтобы напитки, приготовленные способами по изобретению, содержали Р-глюканы, имеющие в среднем низкую молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа. Например, указанные Р-глюканы могут иметь в среднем молекулярную массу в пределах от ПО до 190 кДа, например, в пределах от 120 до 180, например, в пределах от 130 до 170, например, в пределах от 140 до 160 кДа. Согласно одному из вариантов напитки, приготовленные способами по изобретению, содержат Р-глюканы, имеющие среднюю молекулярную массу равную примерно 150 кДа.
Среднюю молекулярную массу предпочтительно определять по сравнению со стандартами Р-глюкана. Такие стандарты Р-глюкана являются коммерчески доступными, например, они могут быть приобретены в компании Megazyme, Ireland. Молекулярную массу можно определять любым подходящим методом, например, традиционным методом эксклюзионной хроматографии, используя стандарты Р-глюкана, например, используя Asahipak фирмы Shodex, US. Предпочтительный метод определения молекулярной массы описан ниже в Примере 5 а.
Низкомолекулярные Р-глюканы, содержащиеся в напитках согласно данному изобретению, полезны для здоровья в той же степени, что и Р-глюкан со средней молекулярной массой (530 кДа), экстрагированный в похожих условиях. Например, указанные Р-глюканы предпочтительно способны к связыванию солей жёлчных кислот, таких как гликохолят. Предпочтительно указанные Р-глюканы предпочтительно способны к связыванию солей желчных кислот, таких как гликохолят при непосредственном молекулярном взаимодействии. Связывание солей жёлчных кислот можно определить, например, путём определения изменения сигналов (А8) для двух резонансов Р-глюкана, когда изменения показывают непосредственное взаимодействие между Р-глюканами и солью жёлчной кислоты в растворе, как описано ниже в Примере 6. Так, Р-глюканы, содержащиеся в напитках, могут характеризоваться увеличением А8 13С, составляющим по меньшей мере 5 б. д., например, 7 б.д. после добавления 50 мМ гликохолята при проведении определения, как описано в Примере 6.
Как указано выше, предпочтительно также, чтобы напиток имел достаточно низкую вязкость для того, чтобы напиток имел приятный вкус во рту. Так,
предпочтительно, чтобы вязкость напитка составляла максимально 55 мПа-с, например, максимально 50 мПа-с, например, максимально 40 мПа-с, например, максимально 35 мПа-с. Вязкость можно определить с использованием любого стандартного вискозиметра. В частности, вязкость можно определить, как описано в Примере 5а.
Напитки согласно данному изобретению предпочтительно являются стабильными, то есть, содержание Р-глюкана не уменьшается значительно при хранении. Так, предпочтительно, чтобы содержание Р-глюкана в напитках не уменьшалось более, чем на 5 %, например, не уменьшалось более, чем на 3 % при хранении при комнатной температуре в течение 6 мес. Указанные напитки могут содержать стабилизатор для предотвращения осаждения Р-глюкана, например, содержание стабилизатора может составлять от 0.01 до 0.050 %, например, быть равным 0.025% в случае геллановой камеди, как описано ниже.
Напиток по изобретению может быть водным экстрактом, полученным после затирания зёрен ячменя в присутствии ферментной композиции. Этот водный экстракт в данной заявке может также называться суслом. Однако напиток может также быть пивом, полученным путём ферментации водного экстракта при помощи микроорганизмов, например, дрожжей. Такой напиток может также быть смесью водного экстракта с одной или более дополнительными жидкостями. Напиток может также быть водным экстрактом, в который добавлены одно или более дополнительных соединений.
Затирание
Способы согласно изобретению включают стадию затирания зёрен ячменя в присутствии ферментной композиции.
Затирание представляет собой выдержку зёрен ячменя в воде при определённой (-ых) температуре (-ах). Затирание можно рассматривать как способ получения водного экстракта зёрен ячменя. Для того, чтобы сделать водную экстракцию как можно более эффективной, предпочтительно, чтобы зёрна ячменя подвергали дроблению перед затиранием. Предпочтительно, чтобы зёрна ячменя размалывали перед затиранием до получения ячменной муки, и проводили затирание с использованием указанной ячменной муки. Измельчённые зёрна ячменя могут называться в данной заявке "измельчённым ячменём", "измельчёнными зёрнами ячменя" или "ячменной мукой".
Зёрна ячменя, например, измельчённые зёрна ячменя, затем выдерживают в воде. Таким образом, стадия Ь) этого способа может включать смешение измельчённых зёрен ячменя с водой.
Отношение зёрен ячменя к воде может быть выбрано таким образом, чтобы достичь желательной концентрации Р-глюканов в водном экстракте. В общем, чем выше отношение зёрен ячменя к воде, тем выше содержание Р-глюкана в напитке.
Поскольку предпочтительно, чтобы содержание Р-глюканов в напитке составляло по меньшей мере 2 г/л, предпочтительно, чтобы отношение зёрен ячменя к воде было достаточно высоким для получения такого содержания Р-глюканов.
Соответственно, предпочтительно, чтобы отношение воды к зёрнам ячменя было равно от 1 до по меньшей мере 10, например, от 1 до по меньшей мере 12, в том числе от 1 до по меньшей мере 15. В частности, отношение воды к зёрнам ячменя может составлять от 1 до 10 - 20, например, от 1 до 12 - 18. Согласно одному из вариантов изобретения отношение воды к зёрнам ячменя составляет от 1 до примерно 15. Указанное отношение приведено в весовых частях воды в расчёте на сухой вес указанных зёрен ячменя.
Согласно вариантам изобретения, когда затирание включает выдержку измельчённого ячменя в воде, предпочтительно, чтобы отношение воды к зёрнам ячменя составляло от 1 до по меньшей мере 10, например, от 1 до по меньшей мере 12, например, от 1 до по меньшей мере 15. В частности, отношение воды к измельчённому ячменю может составлять от 1 до 10 - 20, например, от 1 до 12 - 18. Согласно одному из вариантов изобретения отношение воды к измельчённому ячменю составляет от 1 до примерно 15.
Выдержка зёрен ячменя (например, измельчённого ячменя) в воде предпочтительно проводится при определённой температуре. Эта температура может иметь значение, так как её величина может влиять на активность ферментов.
Затирание можно осуществлять в присутствии несоложёного сырья, которое, как понимается, содержит любой источник углеводов, отличающийся от зёрен ячменя, такой как, например, без ограничения, ячмень, сиропы ячменя, маис, рис, сорго, рожь, овёс или пшеница - или в виде целых зёрен, или обработанных продуктов, таких как крупы, сиропы или крахмал. Все из перечисленных добавок можно использовать в основном как дополнительный источник экстракта (сиропы обычно вводятся после проведения затирания).
Затирание с водой может включать использование одного или более дополнительных соединений, например, солей или агентов, регулирующих рН. Неограничивающие примеры агентов, регулирующих рН, включают буферы и кислоты,
например, фосфатный буфер или фосфорную кислоту. Неограничивающим примером подходящих солей является хлористый кальций.
Обычно затирание включает или даже состоит из выдержки при температуре в пределах от 60 до 72 ° С, например, при температуре в пределах от 60 до 70 ° С, например, при температуре от 62 до 68 ° С, например, при температуре в пределах от 64 до 66 ° С, например, при температуре равной примерно 65 ° С. Зёрна ячменя, например, измельчённый ячмень, могут быть смешаны с водой на любой стадии, но часто могут быть добавлены к воде, как только вода достигла указанной выше температуры.
Выдержка при указанной температуре может продолжаться в течение любого желательного промежутка времени, обычно в пределах от 30 до 120 мин, предпочтительно, в пределах от 30 до 60 мин, например, в течение примерно в течение 45 мин. Например, величина рН может быть доведена до 5 - 7, например, до 5 - 6, например, до примерно 5.48.
В способах согласно данному изобретению затирание проводится в присутствии ферментной композиции, обладающей активностью а-амилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и необязательно также активностью глюкоамизазы и/или пуллуланазы, это может быть любая ферментная композиция из композиций, описанных ниже в данной заявке в разделе "Ферментная композиция". Указанная ферментная композиция может быть добавлена перед затиранием или после затирания. Обычно она добавляется, как только температура экстракта или воды для затирания достигнет температуры, указанной выше. Напитки, приготовленные согласно настоящему изобретению, содержат Р-глюканы определённой молекулярной массы. Затирание с помощью ферментной композиции по изобретению может влиять на величину молекулярной массы. Соответственно, предпочтительно, чтобы затирание в присутствии ферментной композиции проводили в течение времени и при температуре, которые приводят к образованию Р-глюканов со средней молекулярной массой в пределах от 80 до 200 кДа. Этого можно достигнуть, отбирая образцы водного экстракта в определённые моменты времени во время затирания и при разных температурных условиях с последующим измерением средней молекулярной массы Р-глюканов, содержащихся в водном экстракте. Таким образом, специалист в данной области сможет выбрать адекватные величины времени и температуры для затирания. Согласно одному из вариантов время и температура выбираются, как описано выше.
В конце стадии затирания часто бывает желательно нагреть смесь вода/зёрна ячменя/ферментная композиция до по меньшей мере 75 ° С. Это может обеспечить
несколько эффектов, включая инактивацию ферментной композиции. Указанный нагрев предпочтительно осуществлять при температуре равной по меньшей мере 75 ° С, предпочтительно равной по меньшей мере 85 ° С, более предпочтительно по меньшей мере 90 ° С, например, при температуре в пределах от 85 до 100 ° С, например, в пределах от 90 до 100 ° С. Нагрев можно проводить в течение подходящего времени, например, в течение 15 - 120 мин. в том числе в течение 15-60 мин, например, в течение примерно 30 мин.
Таким образом, согласно одному из вариантов затирание может состоять из выдержки при температуре 60 - 72 ° С, как указано выше, и последующей выдержки при температуре равной по меньшей мере 85 ° С, например, по меньшей мере при 90 ° С, как описано выше.
После затирания водный экстракт отделяют от зёрен ячменя (например, от измельчённого ячменя) для того, чтобы получить или напиток, или основу напитка, которая может быть далее превращена в напиток.
Указанное отделение можно проводить любым подходящим методом, например, с использованием любого из методов отделения сусла от отработанных зёрен, обычно применяемых в пивоварнях. Неограничивающие методы отделения водного экстракта от зёрен ячменя (например, от измельчённого ячменя) включают центрифугирование, декантацию, фильтрование или применение бочки для сцеживания пивного сусла.
Ячмень
Настоящее изобретение предусматривает способы приготовления напитков с высоким содержанием Р-глюкана из зёрен ячменя. Для того, чтобы получить напитки с достаточно высоким содержанием Р-глюкана, которые в то же самое время стабильны и имеют низкую вязкость, предпочтительно использовать ячмень, имеющий высокое содержание Р-глюканов и содержащий Р-глюкан, характеризующийся высоким отношением DP3/DP4.
Ячмень может быть любым растением вида Hordeum vulgare (ячмень обыкновенный), включая любую линию скрещивания, или выведенный сорт, или вариетет.
Таким образом, ячмень, используемый при осуществлении способов согласно изобретению, может иметь следующие характеристики:
i. содержит по меньшей мере 10 % Р-глюканов,
ii. имеет отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане, равное по меньшей мере 3.
При варке пива обычно предпочитают использовать ячмень с низким уровнем Р-глюканов, и поэтому типичные сорта пивоваренного ячменя имеют низкое содержание Р-глюканов. Р-Глюканы придают суслу вязкость, которая обычно менее желательна. Однако, виды ячменя, которые следует использовать согласно данному изобретению, предпочтительно имеют высокое содержание Р-глюканов.
Таким образом, предпочтительно, чтобы ячмень, используемый в способах по изобретению, имел зёрна, которые содержат по меньшей мере 10 % Р-глюканов, более предпочтительно по меньшей мере 11 % Р-глюканов, даже более предпочтительно по меньшей мере 12 % Р-глюканов, например, по меньшей мере 13 % Р-глюканов, например, по меньшей мере 14 % Р-глюканов, например, по меньшей мере 15 % Р-глюканов. Указанные количества приведены в % от веса сухого вещества в зёрнах.
Для того, чтобы определить процентное содержание Р-глюканов в зёрнах ячменя, определяют вес Р-гдюканов в зёрнах и общий вес сухого вещества в зёрнах. Тогда рассчитывают процентное содержание Р-глюкана. Содержание Р-глюкана может быть определено путём экстракции Р-глюканов, например, путём затирания, как описано в данной заявке выше в разделе "Затирание", и определения содержания Р-глюкана в водном экстракте. Количество Р-глюкана может быть, например, определено с использованием метода окрашивания калькофлуором. Метод окрашивания калькофлуором является флуометрическим методом и может быть осуществлён в соответствии со стандартами Brewing ЕВСД994. Краситель калькофлуор способен связывать Р-глюканы, содержащиеся в растворе, и повышать интенсивность их флуоресценции прямо пропорционально содержанию связанного Р-глюкана.
Подходящий метод определения процентного содержания Р-глюканов в зёрнах ячменя описан в Примере 5а ниже в данной заявке.
В дополнение к высокому содержанию Р-глюкана важно также, чтобы ячмень имел высокое отношение DP3/DP4. Отношение DP3/DP4 характеризует структуру блок-олигомеров Р-глюкана. Так, Р-глюкан в ячмене содержит блоки целлотриозы и блоки целлотетраозы, и отношение DP3/DP4 характеризует отношение между блоками целлотриозы и блоками целлотетраозы. Целлотриоза является трисахаридом, в котором три единицы глюкозы соединены 1, 4-Р-связями. Целлотетраоза является тетрасахаридом,
в котором четыре остатка гнлюкозы соединены 1, 4-Р-связями. Указанное отношение может быть определено путём разложения Р-глюкана лихеназой и определения количества высвободившихся блоков DP3 и DP4. Лихеназа представляет собой фермент, катализирующий гидролиз (1-> -3)-Р-глюкозидных связей, которые расположены следом за (1-> 4)-Р-глюкозидными связями. Один подходящий способ определения отношения DP3/DP4 описан в Примере 5а.
Согласно одному из вариантов настоящее изобретение охватывает затирание зёрен ячменя в присутствии ферментной композиции, обладающей активностью а-амилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и необязательно также активностью глюкоамилазы и/или пуллуланазы. Ферменты способствуют надлежащей экстракции Р-глюкана, и также получению Р-глюкана со средней молекулярной массой в пределах от 80 до 200 кДа. Однако, если Р-глюкан имеет низкое отношение DP3/DP4, это обычно приводит к более или менее сложному расщеплению Р-глюкана ферментной композицией, и, соответственно, затрудняет приготовление напитков с природным высоким содержанием Р-глюкана согласно изобретению.
Соответственно, предпочтительно, когда Р-глюкан, содержащийся в ячмене, используемом по изобретению, имеет высокое отношение DP3/DP4. В частности, предпочтительно, когда зёрна используемого ячменя содержат Р-глюкан, имеющий отношение DP3/DP4, составляющее по меньшей мере 3, например, по меньшей мере 3.2. Согласно предпочтительному варианту зёрна используемого ячменя содержат Р-глюкан, имеющий отношение DP3/DP4 равное по меньшей мере 3.4, например, по меньшей мере 3.6, такое, как, например, по меньшей мере 3.7.
Согласно одному из вариантов данного изобретения ячмень содержит мутацию в гене HvNstl. Такие мутации приводят к получению ячменя, содержащего по меньшей мере 10 % Р-глюканов и имеющего отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане равное по меньшей мере 3, например, по меньшей мере 3.4.
В частности, предпочтительно, чтобы мутация приводила к уменьшенной функции NST1, более предпочтительно, чтобы указанная мутация приводила к полной потере функции NST1. Последовательность NST1 в ячмене дикого типа представлена в виде SEQ ID N0:1. NST1 ячменя является транспортёром ADP-Glc, и термин "полная потеря функции NST1", используемый в данной заявке, относится к одной из следующих ситуаций:
1) ячмень не содержит белка NST1,
2) ячмень содержит мутантный NST1, при этом указанный мутантный NST1 не способен транспортировать ADP-глюкозу.
Таким образом, согласно одному из вариантов данного изобретения ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, приводящую к уменьшенной экспрессии белка NST1. Так, ячмень может содержать мутацию в гене HvNstl, приводящую к экспрессии белка NST1 со степенью по меньшей мере на 80 % уменьшенной по сравнению с экспрессией белка NST1 в ячмене дикого типа, таком как сорт Quench (Квенч).
Согласно другому варианту настоящего изобретения ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, причём указанный мутантный ген HvNstl кодирует мутантный белок NST1 с потерей функции. В частности, указанный мутантный NST1 содержит по меньшей мере замену одной аминокислоты по сравнению с SEQ Ш N0:1, такую, как замена по меньшей мере одной консервативной аминокислоты по сравнению с SEQ Ш N0:1. В частности, мутантный NST1 содержит замену по меньшей мере одной из аминокислот, отмеченных чёрным прямоугольником на Фигуре 10, на другую аминокислоту.
Настоящее изобретение предусматривает также, что ячмень содержит мутацию в гене HvNstl gene, причём указанный мутантный ген HvNstl кодирует мутантный белок NST1, в котором отсутствует по меньшей мере одна аминокислота по сравнению с SEQ Ш N0:1, например, отсутствует по меньшей мере одна консервативная аминокислота по сравнению с SEQ Ш N0:1. В частности, в мутантном NST1 отсутствует одна или более аминокислот, отмеченных чёрными прямоугольниками на Фигуре 10. Так, указанный мутантный белок NST1 может не содержать по меньшей мере 10, например, по меньшей мере, 20, например, по меньшей мере 30, например, по меньшей мере 50 аминокислот, отмеченных чёрными прямоугольниками на Фигуре 10.
Согласно одному варианту настоящего изобретения ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, причём указанный мутантный ген HvNstl кодирует мутантный белок NST1, в котором аминокислота в положении 228 в последовательности SEQ Ш N0:1 была делецирована или заменена на другую аминокислоту. В частности ячмень может содержать мутацию в гене HvNstl, причём указанный мутантный ген HvNstl кодирует мутантный белок NST1 в SEQ Ш N0:1, где остаток Pro в положении 228 был заменён на остаток Ser.
Согласно другому варианту данного изобретения ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, причём указанный мутантный ген HvNstl кодирует мутантный белок NST1, где
аминокислота 273 в последовательности SEQ Ш N0:1 была делецирована или заменена на другую аминокислоту. В частности, ячмень может содержать мутацию в гене HvNstl, причём указанный мутантный ген HvNstl кодирует NST1 в последовательности SEQ Ш N0:1, где остаток Val в положении 273 был заменён на остаток Glu.
Одним неограничивающим примером ячменя, содержащего мутацию в гене HvNstl, причём мутантный ген HvNstl кодирует NST1 в последовательности SEQ Ш N0:1, где остаток Val в положении 273 был заменён на остаток Glu, является ячмень, известный как lys5f, доступный в Nordic Genetic Resource Center под номером доступа NGB20030.
Ферментная композиция
Данное изобретение предусматривает способы приготовления напитков с высоким содержанием Р-глюканов из зёрен ячменя путём затирания зёрен ячменя (например, дроблёного ячменя) в присутствии ферментной композиции. Указанная ферментная композиция обладает активностью а-амилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и необязательно также активностью глюкоамилазы и/или пуллуланазы. Один фермент может обладать одним или более видами указанной активности, но в общем. Ферментная композиция содержит один фермент, обладающий активностью а-амилазы и один фермент, обладающий активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы и необязательно один фермент., обладающий активностью глюкоамилазы и/или один фермент, обладающий активностью пуллуланазы.
Согласно одному из вариантов ферментная композиция обладает активностью а-амилазы, глюкоамилазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы.
Согласно одному из вариантов ферментная композиция обладает активностью а-амилазы, глюкоамилазы, пуллуланазы и эндо-1,3(4)-Р-глюканазы.
Фермент, обладающий активностью а-амилазы может быть а-амилазой. а-Амилаза согласно изобретению представляет собой фермент, способный катализировать эндогидролиз (1-> 4)-а-0-глюкозидных связей в полисахаридах, содержащих три или более (1-> 4)-а-соединённых единиц D-глюкозы. В частности, а-амилаза согласно данному изобретению представляет собой фермент а-амилазу, классифицируемую согласно ЕС 3.2.1.1.
Конкретная а-амилаза, используемая в способах согласно данному изобретению, может быть а -амилазой Bacillus. Хорошо известные а-амилазы Bacillus включают а
амилазу, полученную из штамма В. licheniformis, В. Amyloliquefaciens или В. stearothermophilus. Согласно одному из аспектов настоящего изобретения используемая а-амилаза Bacillus представляет собой а-амилазу, охарактеризованную в заявке WO 99/19467 на стр. 3, строка 18 - стр. 6, строка 27.
Другим примером а-амилазы, используемой согласно данному изобретению, является фермент с последовательностью SEQ Ш N0: 3, описанный в заявке W0 99/19467, или его функциональный гомолог, который имеет с этим ферментом по меньшей мере 70 %, например, по меньшей мере 75 %, например, по меньшей мере 80 %, например, по меньшей мере 85 %, например, по меньшей мере 90 %, например, по меньшей мере 95 %, например, по меньшей мере 98 % идентичности последовательностей. а-Амилаза может также быть а -амилазой, имеющей по меньшей мере 70 %, например, по меньшей мере 75 %, например, по меньшей мере 80 %, например, по меньшей мере 85 %, например, по меньшей мере 90 %, например, по меньшей мере 95 %, например, по меньшей мере 98 % идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, описанной как SEQ Ш NO: 3 в заявке WO 99/19467 с мутациями: 1181* + G182* + N193F. Изобретение предусматривает также а-амилазу Termamyl(r) SC, доступную в Novozymes A/S, Denmark. Другой конкретной а -амилазой, используемой в способах по изобретению, может быть любая грибковая а -амилаза, например, а-амилаза, полученная из вида Aspergillus, и предпочтительно из штамма Aspergillus niger. Особенно предпочтительной является а -амилаза, представленная как SEQ Ш NO: 1 в заявке WO 2002/038787 или её функциональный гомолог, который имеет с ней по меньшей мере 70 %, например, по меньшей мере 75 %, например, по меньшей мере 80 %, например, по меньшей мере 85 %, например, по меньшей мере 90 %, например, по меньшей мере 95 %, например, по меньшей мере 98 % идентичности последовательностей. Согласно предпочтительному варианту а-амилаза представляет собой полипептид с последовательностью SEQ Ш N0:3 или его функциональный гомолог, который имеет с ним по меньшей мере 70 %, например, по меньшей мере 75 %, например, по меньшей мере 80 %, например, по меньшей мере 85 %, например, по меньшей мере 90 %, например, по меньшей мере 95 %, например, по меньшей мере 98 % идентичности последовательностей.
Количество а-амилазы, которая должна добавляться, зависит от различных параметров и обычно известно специалисту в данной области. Согласно одному аспекту активность а-амилазы в экстракте составляет 0.1-1.0 KNU/r, более предпочтительно, 0.2
0.4 KNU/r, и наиболее предпочтительно, 0.25-0.35 KNU/r в расчёте на сухой вес ячменя. Согласно другому аспекту активность а-амилазы в сусле составляет по меньшей мере 0.1 KNU/r, например, по меньшей мере 0.2-0.4 KNU/r, например, по меньшей мере 0.25 KNU/r в расчёте на сухой вес ячменя. Согласно другому аспекту активность а-амилазы в сусле находится в пределах от 0.1 до 10 KNU/r, например, в пределах 0.1-5 KNU/r, например, в пределах от по меньшей мере 0.2 до 5 KNU/r в расчёте на сухой вес ячменя. Одна единица Kilo Novozymes активности а-амилазы (KNU) равняется 1000 NU. Одна единица KNU определяется как количество фермента, которое в стандартных условиях (то есть, при 37 ° С +/- 0.05; 0.0003 М Са2+; и рН 5.6) приводит к декстринизации 5.26 г сухого растворимого крахмального вещества Merck Amylum.
Функциональный гомолог а-амилазы представляет собой фермент, который может катализировать эндогидролиз (1-> 4)-а-0-глюкозидных связей в полисахаридах, содержащих три или более (1-> 4)-а-связанньгх единиц D-глюкозы.
Фермент, обладающий активностью глюкоамилазы, может быть любой глюкоамилазой, но вообще это фермент, имеющий активность глюкан-1,4-а-глюкозидазы. В частности, глюкоамилаза может быть ферментом, успешно катализирующим гидролиз концевых (1-> 4)-связанньгх остатков a-D-глюкозы из невосстанавливающих концов цепей с высвобождением P-D-глюкозы. В частности, глюкоамилаза согласно данному изобретению представляет ферменты a-амилазы, классифицируемые по ЕС 3.2.1.3.
Одним примером глюкоамилаз является Uniprot: B0CVJ1, который выявляет полипептид из Laccaria bicolor. Другими примерами являются глюкоамилазы из рода Trametes cingulata, описанные в заявке in WO 2006/069289.
Глюкоамилаза может быть также глюкоамилазой из грибка рода Gloeophyllum, например, из G. abietinum, G. sepiarium или G. trabeum. Такие глюкоамилазы могут быть, например, полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности зрелого полипептида, представленной SEQ Ш NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ Ш NO: 6, SEQ Ш NO: 8, SEQ Ш NO: 10, SEQ Ш NO: 12, SEQ Ш NO: 14, SEQ Ш NO: 16 или SEQ Ш NO: 18, описанного в заявке WO 2011/068803, составляющей предпочтительно по меньшей мере 82 %, более предпочтительно, по меньшей мере 83 %, более предпочтительно, по меньшей мере 84 %, более предпочтительно, по меньшей мере 85 %, более предпочтительно, по меньшей мере 86 %, более предпочтительно, по меньшей мере 87 %, более предпочтительно, по меньшей мере 88 %, более предпочтительно, по меньшей мере 89 %, более предпочтительно, по меньшей мере 90 %, более
предпочтительно, по меньшей мере 91 %, более предпочтительно, по меньшей мере 92 %, даже более предпочтительно, по меньшей мере 93 %, наиболее предпочтительно по меньшей мере[[т] 94%, и ещё наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 %, например, по меньшей мере 96 %, по меньшей мере 97 %, по меньшей мере 98 %, по меньшей мере 99 % или даже 100 %.
Глюкоамилаза может быть также глюкоамилазой из рода Penicillium oxalicum, например, глюкомилазой, описанной в публикации Yoshiki YAMASAKI, Agric. Biol. Chem., 41 (5), 755-762, 1977). Глюкоамилаза может быть также глюкоамилазой полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности SEQ Ш N0: 2 зрелого полипептида, описанного в заявке WO 2011/127802, составляющей предпочтительно по меньшей мере 61.5 %, более предпочтительно, по меньшей мере 63 %, более предпочтительно, по меньшей мер 65 %, более предпочтительно, по меньшей мере 68 %, более предпочтительно, по меньшей мере 70 %, более предпочтительно, по меньшей мере 75 %, более предпочтительно, по меньшей мере 80 %, более предпочтительно, по меньшей мере 85 %, более предпочтительно, по меньшей мере 90 %, более предпочтительно, по меньшей мере 91 %, более предпочтительно, по меньшей мере 92 %, даже более предпочтительно, по меньшей мере 93 %, наиболее предпочтительно по меньшей мере 94 %, и даже наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 %, даже по меньшей мере 96 %, 97 %, 98 %, 99 % или 100%.
Фермент, обладающий активностью пуллуланазы, может быть любой пуллуланазой. Пуллуланаза предпочтительно представляет собой фермент, способный катализировать гидролиз а-(1-> -6)-0-глюкозидных связей в пуллулане, амилопектине и гликогене. Пуллулан является линейным полимером, содержащим 1-> -6-связанные единицы мальтотриозы. Пуллуланаза согласно настоящему изобретению предпочтительно является пуллуланазой, классифицированной согласно классификации ЕС 3.2.1.41.
Пуллуланаза согласно настоящему изобретению может быть пуллуланазой, например, из рода Pyrococcus или Bacillus, например, Bacillus acidopullulyticus, например, пуллуланазой, описанной в публикации Kelly et al , 1994, FEMS Microbial. Letters 115: 97106, или пуллуланазой доступной в Novozymes A/S в виде Promozyme 400L. Пуллуланаза может быть также из рода Bacillus naganoencis или Bacillus deramificans, например, из Bacillus deramificans (патент США № 5,736,375). Пуллуланаза может также быть полученной методом генетической инженерии из, например, штамма Bacillus.
Пуллуланаза может также быть доступной в Novozymes A/S, Denmark как Attenuzyme(r) Flex. Другие пуллуланазы могут быть получены из Pyrococcus woesei, описанного в заявке PCT/DK 91/00219, или пуллуланаза может быть получена из рода Fervidobacterium sp. Ven, описанного в заявке PCT/DK92/00079, или пуллуланаза может быть получена из рода Thermococcus celer, описанного в заявке PCT/DK95/00097, или пуллуланаза может быть получена из рода Pyrodictium abyssei, описанного в заявке PCT/DK95/00211, или пуллуланаза может быть получена из рода FetVidobacterium pennavorans, описанного в заявке PCT/DK95/00095, или пуллуланаза может быть получена из рода Desulforococcus mucosus, описанного в заявке PCT/DK95/00098.
Наиболее предпочтительно, если пуллуланаза получена из рода Bacillus acidopullulyticus. Предпочтительная пуллуланаза, используемая в способах по изобретению, представляет собой полипептид с последовательностью SEQ Ш N0:4 или его функциональный гомолог, последовательность которого идентична последовательности полипептида на по меньшей мере на 70 %, например, по меньшей мере 75 %, например, по меньшей мере 80 %, например, по меньшей мере 85 %, например, по меньшей мере 90 %, например, по меньшей мере 95 %, например, по меньшей мере 98 %.
Пуллуланаза может быть добавлена в эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области. Согласно одному из аспектов пуллуланаза добавляется в количестве от 0.1 до 3 PUN/r в расчёте на вес сухого ячменя, например, от 0.2 до 2.9, например, от 0.3 до 2.8, например, от 0.3 до 2.7, например, от 0.3 до 2.6, например, от 0.3 до 2.5, например, от 0.3 до 2.4, например, от 0.3 до 2.3, например, от 0.3 до 2.2, например, от 0.3 до 2.1, например, от 0.3 до 2.0, например, от 0.3 до 1.9, например, от 0.3 до 1.8, например, от 0.3 до 1.7, например, от 0.3 до 1.6, наиболее предпочтительно добавлять пуллуланазу в количестве от 0.3 до 1.5, предпочтительно, от 0.4 до 1.4, более предпочтительно, от 0.5 до 1.3, более предпочтительно, от 0.6 до 1.2, более предпочтительно, от 0.7 до 1.1, более предпочтительно, от 0.8 до 1.0, более предпочтительно, от 0.9 до 1.0. Согласно конкретному варианту этот фермент добавляют в количестве примерно 0.3 PUN/r в расчёте на вес сухого ячменя, например, примерно 0.4 PUN/r в расчёте на вес сухого ячменя, например, примерно 0.5 PUN/r в расчёте на вес сухого ячменя.
Одна единица пуллуланазы (PUN) равна количеству фермента, которое в стандартных условиях (то есть, через 30 мин реакции при 40 ° С и рН 5.0; и в присутствии
0.2 % пуллулана в качестве субстрата) приводит к гидролизу пуллулана, высвобождая восстанавливающий углевод с восстановительной способностью, которая эквивалентна 1 микромолю глюкозы в минуту. Активность пуллуланазы измеряют путём определения увеличенной восстановительной способности сахара.
Функциональный гомолог полипептида последовательности SEQ Ш N0:4 представляет собой фермент, который может катализировать гидролиз а-(1-"6)-D-глюкозидных связей в пуллулане, амилопектине и гликогене.
Фермент, обладающий активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, может быть любой эндо-1,3(4)-Р-глюканазой. Эндо-1,3(4)-Р-глюканаза предпочтительно представляет собой фермент, способный катализировать эндогидролиз (1-> 3)- или (1-> 4)-связей в Р-глюканах, когда остаток глюкозы, чья восстановительная группа находится в связи, подвергающейся гидролизу, сам замещён в положении С-3.
Согласно одному из вариантов данного изобретения эндо-1,3(4)-Р-глюканаза по данному изобретению является ферментом эндо-1,3(4)-Р-0-глюканазой. Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения эндо-1,3(4)-Р-глюканаза представляет собой лихеназу, предпочтительно, лихеназу, классифицируемую по ЕС 3.2.1.73.
Эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть получена из любого подходящего организма, например, эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть лихеназой из Bacillus subtilis. Например, эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть полипептидом SEQ Ш N0:5 или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида по меньшей мере на 70 %, например, по меньшей мере на 75 %, например, по меньшей мере на 80 %, например, по меньшей мере на 85 %, например, по меньшей мере на 90 %, например, по меньшей мере на 95 %, например, по меньшей мере на 98 %.
Согласно другому варианту эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть лихеназой, кодированной геном GluB Bacillus polymyxa, или её функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 75 %, например, по меньшей мере на 80 %, например, по меньшей мере на 85 %, например, по меньшей мере на 90 %, например, по меньшей мере на 95 %, например, по меньшей мере на 98 %.
Последовательность лихеназы, кодированная геном GluB Bacillus polymyxa, показана на Фигуре 2 в публикации Gosalbes et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1991, Vol. 173, No. 23, p. p. 7705-7710.
Согласно другому варианту эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть любой из лихеназ, описанных в патенте США № 6,103,511, в частности, эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть полипептидом, представленным SEQ Ш N0:2 в патенте США № 6,103,511 или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида по меньшей мере на 70 %, например, по меньшей мере на 75 %, например, по меньшей мере на 80 %, например, по меньшей мере на 85 %, например, по меньшей мере на 90 %, например, по меньшей мере на 95 %, например, по меньшей мере на 98 %.
Согласно одному из вариантов данного изобретения эндо-1,3(4)-Р-глюканаза может быть Р-глюканазой, классифицируемой по классификации Е.С. 3.2.1.4. Р-Глюканаза может иметь микробное происхождение, например, она может быть получена из штамма бактерий (например, Bacillus) или из нитчатого гриба (например, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium). Предпочтительными являются бета-глюканазы, полученные из рода Trichoderma может быть полипептидом с любой из последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 6, SEQ ГО N0:7 или SEQ ID N0:8 в заявке WO 2006/066582 или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 75 %, например, по меньшей мере на 80 %, например, по меньшей мере на 85 %, например, по меньшей мере на 90 %, например, по меньшей мере на 95 %, например, по меньшей мере на 98 %.
Коммерчески доступные препараты бета-глюканазы, которые можно использовать, включают CELLUCLAST(r)), CELLUZYME(r), CEREFLO(r) и ULTRAFLO(r) (доступные в Novozymes A/S), GC 880, LAMINEX(tm) и SPEZYME(r) CP (лоступные в Genencor Int.) и ROHAMENT(r) 7069 W (доступен в Rohm, Germany).
Согласно одному из вариантов эндо-1,3(4)-Р-глюканаза представляет собой эндоглюканазу, полученную из Humicola sp., например, эндоглюканазу из Humicola insolens, эндоглюканазу из Н. insolens или из Thermoascus sp., например, эндоглюканазу из Thermoascus aurantiacus, или из Aspergillus sp., например, эндоглюканазу, полученную из Aspergillus aculeatus, из Trichoderma sp., предпочтительно, из Т. reesei и/или Т. viride, например, семейство 5-эндоглюканаз, семейство 7, бета-глюканаз или семейство 12, бета
глюканаз. Эндо-1,3(4)-Р-глюканаза, в частности, может быть полипептидом с любой из последовательностей, представленных в виде SEQ ID N0: 3, SEQ ГО N0:4, SEQ ГО N0:6, SEQ ГО N0:16, SEQ ГО N018, SEQ ГО N0:19 или SEQ ГО N0:20 в заявке WO2005/059084, или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 75 %, например, по меньшей мере на 80 %, например, по меньшей мере на 85 %, например, по меньшей мере на 90 %, например, по меньшей мере на 95 %, например, по меньшей мере на 98 %.
Функциональный гомолог эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, например, полипептид с последовательностью SEQ ГО N0:5 является ферментом, который может катализировать эндогидролиз (1-> 3)- или (1-> 4)-связей в Р-глюканах, когда остаток глюкозы, чья восстановительная группа содержится в этих гидролизуемых связях, сам является замещённым в положении С-3.
Количество эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, которое следует добавлять, может зависеть от различных параметров. В общем, добавляется количество Р-глюканазы, которое приводит к получению Р-глюканов, после затирания имеющих среднюю молекулярную массу Mw в пределах 80 - 200 кДа. В общем предпочтительно, чтобы применялись довольно небольшие количества эндо-1,3(4)-Р-глюканазы. Так, согласно одному из вариантов активность эндо-1,3(4)-Р-глюканазы в экстракте составляет максимально 0.5 EGU/r, и наиболее предпочтительно максимально 0.3 EGU/r в расчёте на вес сухого ячменя, даже максимум 0.1 EGU/r, например, максимум 0.05 EGU/r, например, максимум 0.03 EGU/r. Согласно другому варианту активность эндо-1,3(4)-Р-глюканазы в экстракте находится в пределах от 0.0005 до 0.5 EGU/r, предпочтительно, в пределах от 0.005 до 0.3 EGU/r, например, в пределах от 0.001 до 0.1 EGU/r, например, в пределах от по меньшей мере 0.001 до 0.05 EGU/r в расчёте на вес сухого ячменя. Активность эндо-1,3(4)-Р-глюканазы можно измерить в единицах эндо-глюканазы (EGU), определённых при рН 6.0 с карбоксиметилцеллюлозой (CMC) в качестве субстрата следующим образом. Готовят раствор субстрата, содержащий 34.0 г/л CMC (Hercules 7 LFD) в 0.1 М фосфатном буфере при рН 6.0. Образец анализируемого фермента растворяют в том же буфере. 5 мл раствора субстрата и 0.15 мл раствора фермента смешивают и помещают в вибрационный вискозиметр (например, MIVI 3000 фирмы Sofraser, France), затем термостатируют при 40 ° С. в течение 30 мин. Одна единица EGU означает количество фермента, которое приводит к уменьшению вязкости наполовину в указанных условиях.
Используемый в данной заявке термин "X в сусле (экстракте)" относится к количеству X, содержащемуся во время затирания (например, на стадии Ь) при осуществлении способов, описанных в данной заявке). Активность фермента в сусле можно указывать в единицах на грамм сухого ячменя, который содержится при затирании.
Согласно одному предпочтительному варианту настоящего изобретения ферментная композиция содержит Attenuzyme(r) Flex, доступный в Novozymes, Denmark. В частности, ферментная композиция может содержать или даже состоять из смеси Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) Flex, которые оба доступны в Novozymes, Denmark.
Переработка основы напитка в напиток
Настоящее изобретение относится также к способам приготовления напитка, причём эти способы включают затирание зёрен ячменя в присутствии ферментной композиции и отделение водного экстракта ог зёрен ячменя (например, дроблёного ячменя).
Указанный водный экстракт может представлять собой напиток. Однако часто водный экстракт является основой напитка, которая затем пред употреблением перерабатывается в готовый напиток.
Основа напитка часто подвергается нагреву до температуры равной по меньшей мере 75 ° С. Это может обеспечить несколько эффектов, включая пастеризацию напитка. Указанный нагрев предпочтительно осуществляют при температуре, составляющей по меньшей мере 75 ° С, предпочтительно по меньшей мере 85 ° С, более предпочтительно, по меньшей мере 90 ° С, например, при температуре в пределах от 85 до 100 ° С, например, в пределах от 90 до 100 ° С. Нагрев производят в течение любого подходящего промежутка времени, например, в пределах от 15 до 120 мин. например, в пределах от 15 до 60 мин, например, в течение примерно 30 мин. Таким образом, напиток согласно данному изобретению может быть пастеризованным напитком.
Основа напитка может быть подвергнута обработке при ультравысокой температуре (UHT) при предварительном нагреве до температуры в пределах 70-80 ° С с последующим нагревом до температуры выше 90 0 С в течение короткого промежутка времени, например, в течение времени от 1 до 5 с, например, в течение времени от 1 до 2 с или в течение 4- 5 с.
Напиток может быть также подвергнут гомогенизации, например, обработкой при давлении 100-200 бар.
Часто стадия d) включает добавление одного или более соединений и/или одной или более дополнительных жидкостей к основе напитка, полученной на стадии с), для того, чтобы получить напиток. В таких случаях указанная выше тепловая обработка или UHT могут проводиться до или после добавления одного или более соединений и/или одной или более дополнительных жидкостей.
Способы согласно изобретению могут включать стадию добавления одного или более дополнительных соединений. Дополнительное соединение может быть, например, вкусовым веществом, консервантом или функциональным ингредиентом. Дополнительное соединение может также быть красителем, подсластителем, агентом, регулирующим рН, или солью. Подсластитель может, например, быть искусственным подсластителем низкокалорийным подсластителем или сахаром. Агент, регулирующий рН, может быть, например, буфером или кислотой, такой как молочная кислота или лимонная кислота.
Функциональные ингредиенты могут быть любым ингредиентом, добавляемым для получения заданной функции. Предпочтительно, функциональный ингредиент делает напиток более полезным для здоровья. Неограничивающие примеры функциональных ингредиентов включают растворимые волокна, белки, добавляемые витамины или минералы.
Консервант может быть любым пищевым консервантом, например, он может быть бензойной кислотой, сорбиновой кислотой, сорбатом (например, сорбатом калия), сульфитом и/или солями указанных кислот.
Дополнительным соединением может также быть СО2. В частности, СО2 можно добавлять для получения газированного напитка.
Используемое согласно данному изобретению вкусовое вещество может быть любым подходящим вкусовым веществом. Вкусовое вещество может, например, выбираться из группы, состоящей из ароматизаторов, растительных экстрактов, растительных концентратов, частей растений и травяных настоев
Так, вкусовое вещество может быть, например, ароматизатором. Ароматизаторы обычно представляют собой органические соединения, например, они могут быть вторичными метаболитами растений. Ароматизатор может быть любым ароматизатором, например, фруктовым ароматизатором или ванильным ароматизатором.
Растительный экстракт может быть, например, травяным экстрактом. Неограничивающие примеры травяных экстрактов включают экстракт зелёного чая,
чёрного чая, ройбуш, экстракт перечной мяты или хмеля. Растительный экстракт может также быть цветочным экстрактом. Неограничивающие примеры цветочных экстрактов включают экстракты гибискуса, ромашки, цветков бузины, лаванды или цветов липы.
Растительный экстракт может также быть фруктовым экстрактом. Части растений могут быть, например, высушены или используют свежие травы, например, гранулы хмеля, высушенные или свежие цветы, или фрукты.
Концентрат растений может быть фруктовым, например, фруктовым соком, который концентрировали путём удаления воды.
Неограничивающие примеры фруктов, пригодных для получения вкуса, фруктового экстракта или фруктового концентрата включают апельсины, яблоки, бананы, лимоны, пассифлору, манго, ананас, груши, кумкваты или помело.
Вкусовое вещество может также быть хинином, например, в вариантах, где напиток является тонизирующим.
По меньшей мере одно дополнительное соединение может также быть стабилизатором. Указанный стабилизатор может быть, например, любым ингредиентом, способным стабилизировать растворимые Р-глюканы, например, способным стабилизировать растворимые Р-глюканы в эластичной гелеобразующей матрице. Указанный стабилизатор может быть, например, геллановой камедью, такой как Kelcogel(r) LT-100, доступный в CP Kelco, Denmark. Указанный стабилизатор можно добавлять в напиток в любом подходящем количестве, например, до получения конечной концентрации, составляющей величину в пределах от 0.001 до 0.1 % (вес/вес), например, до получения конечной концентрации в пределах от 0.01 до 0.05 % (вес/вес).
Дополнительной жидкостью может быть вода. Дополнительной жидкостью может также быть другой напиток, например, фруктовый сок, сироп, газированный прохладительный напиток или пиво. В частности, дополнительной жидкостью может быть фруктовый сок.
Стадия d) может также включать ферментацию основы напитка с помощью одного или более микроорганизмов. В частности, основа напитка может ферментироваться с помощью дрожжей для того, чтобы получить алкогольный напиток. Указанные дрожжи могут быть любыми, например, видом S. cerevisiae или S. pastorianus. Указанные микроорганизмы могут быть также бактериями, например, бактериями Lactobacillus, например, L. lactis. Например, основу напитка можно подвергать ферментации так же, как
проводят ферментацию обычного сусла при получении пива. Таким образом, можно применять любой способ получения пива, при котором обычное сусло заменяют основой пива, приготовленного по способам согласно изобретению.
Клинические условия
Примечательно, что, как было показано, Р-глюканы, полученные согласно способам по изобретению, пригодны для снижения уровня как LDL, так и общего холестерина. Соответственно, напитки, приготовленные согласно данному изобретению, пригодны для уменьшения риска развития нескольких клинических состояний, ассоциированных с повышенным содержанием LDL и холестерина.
Так, согласно одному из аспектов изобретение относится к напитку, содержащему по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, а напиток предназначен для уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, и клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца и диабета.
Настоящее изобретение предусматривает также способ уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, и клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, диабета и инфекций, причём указанный способ включает введение напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, указанному субъекту в эффективном количестве.
Предпочтительно, чтобы указанный субъект принимал напитки по изобретению, в количестве достаточном для дневного потребления по меньшей мере 2 г Р-глюканов, например, по меньшей мере 3 г Р-глюканов, например, в пределах от 3 до 50 г Р-глюканов, например, в пределах от 3 до 20 г Р-глюканов, например, в пределах от 3 до 10 г Р-глюканов. Может быть также предпочтительно, чтобы указанный субъект потреблял Р-глюканы в количестве в пределах от 0.5 до 2 г, например, в пределах от 0.5 до 1.5 г, например, примерно 1 г, например, 1 г Р-глюканов на порцию. В контексте напитков согласно данному изобретению порция обычно составляет от 250 до 330 мл, например, примерно 250 мл и/или примерно 330 мл.
Таким образом, указанное эффективное количество составляет по меньшей мере 2 г Р-глюканов, например, по меньшей мере 3 г Р-глюканов, например, от 3 до 50 г Р-глюканов, например, от 3 до 20 г Р-глюканов, например, от 3 до 10 г Р-глюканв в день.
Данное изобретение предусматривает также способ снижения уровня по меньшей мере одного липида, выбранного из группы, состоящей из триглицеридов, холестерина и LDL в крови у субъекта, нуждающегося в этом, причём указанный способ включает потребление указанным субъектом напитка по изобретению, содержащего по меньшей мере 2 г Р-глюканов, например, по меньшей мере 3 г Р-глюканов, например, по меньшей мере от 3 до 50 г Р-глюканов, например, от 3 до 20 г Р-глюканов, например, по меньшей мере от 3 до 10 г Р-глюканов, в соответствии с любым из пунктов 29-31.
Цель данного изобретения заключается также в создании способов уменьшения риска развития ожирения у субъекта, нуждающегося в этом. Эти способы включают потребление в эффективном количестве, указанном выше, указанным субъектом напитка по изобретению, содержащего по меньшей мере 2 г Р-глюканов, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа. Эффективное количество предпочтительно является количеством, указанным выше.
Цель данного изобретения заключается также в создании способов уменьшения степени ожирения у субъекта, нуждающегося в этом. Эти способы включают потребление в эффективном количестве указанным субъектом напитков согласно изобретению, содержащих по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа. Эффективное количество предпочтительно является количеством, указанным выше.
Указанный субъект предпочтительно является человеком. Согласно некоторым вариантам субъектом является человек, страдающий ожирением.
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:l
Белковая последовательность NST1 ячменя
Номер доступа в банке генов AY560327
SEQ ID NO:2
ДНК последовательность гена Hv.Nstl ячменя
SEQ ID NO:3
Белковая последовательность а-амилазы Bacillus stearothermophilus
SEQ ID NO:4
Белковая последовательность пуллуланазы Bacillus acidopullulyticus
SEQ ID
NO:5
Белковая последовательность лихеназы Bacillus subtil is
Gene Bank accession
Z46862.1
Объекты изобретения
Настоящее изобретение характеризуется следующими объектами изобретения:
1. Способ приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л Р-глюкана, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, включающий стадии
a) предоставления зёрен ячменя, причём указанные зёрна обладают следующими характеристиками:
i. содержат по меньшей мере 10 % Р-глюканов,
ii. имеют отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане, составляющее по меньше мере 3,
b) затирания указанных зёрен с водой в присутствии ферментной композиции, при этом указанная композиция обладает активностью а-амилазы и активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, с получением при этом водного экстракта,
c) отделения указанного водного экстракта от зёрен ячменя с получением при этом напитка или основы напитка,
d) необязательного превращения основы напитка в напиток.
2. Способ по пункту 1, где ферментная композиция обладает также активностью глюкоамилазы.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ферментная композиция обладает также активностью пуллуланазы.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток содержит по меньшей мере 3 г/л, например, по меньшей мере 4 г/л Р-глюканов.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные зёрна содержат по меньшей мере 11 %, например, по меньшей мере 12 % Р-глюканов.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отношение DP3/DP4 в
указанном Р-глюкане составляет по меньшей мере 3.2, например, по меньшей мере 3.4,
например, по меньшей мере 3.6, например, по меньшей мере 3.7.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ячмень имеет мутацию в гене HvNstl.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ячмень имеет мутацию в гене HvNstl, приводящую к полной потере функции NST1.
9. Способ по любому из п. п. 7 - 8, где мутация приводит к образованию мутировавшего гена HvNstl, кодирующего мутировавший NST1, содержащий замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с последовательностью SEQ Ш N0:1, причём эта аминокислота выбрана, например, из аминокислоты в положении 228 и аминокислоты в положении 273 последовательности SEQ Ш N0:1.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, причём мутантный ген HvNstl кодирует NST1 последовательности SEQ Ш N0:1, и остаток Pro в положении 228 заменён на остаток Ser.
11. Способ по любому из п. п. 1 - 10, где ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, причём мутантный ген HvNstl кодирует NST1 последовательности SEQ Ш N0:1, и остаток Val в положении 273 заменён на Glu.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ячмень содержит мутацию в гене HvNstl, приводящую к экспрессии белка NST1 со степенью по меньшей мере 80 %, уменьшенной по сравнению с экспрессией белка NST1 в ячмене дикого типа, таком как ячмень сорта Quench.
7.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия Ь) включает смешение измельчённых зёрен ячменя с водой.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия Ь) включает смешение измельчённых зёрен ячменя с водой при отношении воды к измельчённому ячменю от 1 до 10-20.
15. Способ по любому из предыдущих пунктов, где затирание на стадии Ь) включает выдержку при температуре в пределах от 60 до 72 ° С.
16. Способ по любому из предыдущих пунктов, где затирание на стадии Ь) включает выдержку при температуре в пределах от 60 до 72 ° С в течение времени от 30 до 60 мин.
17. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная а-амилаза является ферментом, классифицируемым согласно классификации ЕС 3.2.1.1.
18. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная а-амилаза является полипептидом с SEQ Ш N0:3 или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида на по меньшей мере на 70 %.
19. Способ по любому из пунктов 2-18, где глюкоамилаза является ферментом, классифицируемым согласно классификации ЕС 3.2.1.3.
20. Способ по любому из пунктов 3-19, где указанная пуллуланаза является ферментом, классифицируемым согласно классификации ЕС 3.2.1.41.
21. Способ по любому из пунктов 3 - 20, где указанная пуллуланаза является полипептидом с SEQ Ш N0:4 или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида на по меньшей мере на 70 %.
22. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная эндо-1,3(4)-Р-глюканаза является лихеназой.
23. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная эндо-1,3(4)-Р-глюканаза является ферментом, классифицируемым по классификации ЕС 3.2.1.73.
24. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная эндо-1,3(4)-Р-глюканаза является полипептидом с SEQ Ш N0:5 или его функциональным гомологом, последовательность которого идентична последовательности полипептида на по меньшей мере на 70 %.
7.
25. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная эндо-1,3(4)-Р-глюканаза является ферментом, классифицируемым по классификации Е.С.3.2.1.4.
26. Способ по любому из предыдущих пунктов, где активность эндо-1,3(4)-Р-глюканазы во время затирания составляет самое большое 0.5 EGU на г ячменя (сухой вес), предпочтительно самое большое 0.1 EGU на г ячменя (сухой вес).
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, где активность эндо-1,3(4)-Р-глюканазы во время затирания составляет самое большое 0.05 EGU на г ячменя (сухой вес).
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, где он включает стадию инактивации ферментной композиции, например, путём выдержки при температуре более 75 ° С.
29. Способ по любому из предыдущих пунктов, где водный экстракт, полученный на стадии с) представляет собой напиток.
30. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает нагрев основы напитка до температуры равной по меньшей мере 75 ° С.
31. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает добавление одного или более дополнительных соединений или дополнительных жидкостей к основе напитка, полученной на стадии с), для получения напитка.
32. Способ по п. 31, где по меньшей мере одно дополнительное соединение выбрано из группы, состоящей из вкусового вещества, консерванта и функционального ингредиента.
33. Способ по любому из п. п. 31 - 32, где по меньшей мере одна дополнительная жидкость выбрана из группы, состоящей из фруктового сока, воды и пива.
34. Способ по любому из п. п. 31 - 33, где по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой стабилизатор.
35. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает ферментацию основы напитка с помощью одного или более микроорганизмов.
36. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает ферментацию основы напитка с помощью дрожжей для получения алкогольного напитка.
35.
37. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток имеет вязкость равную самое большое 55 мПа-с.
38. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток имеет вязкость равную самое большое 50 мПа-с, например, самое большее 40 мПа-с, например, самое большое 35 мПа-с.
39. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток имеет вязкость равную самое большее 35 мПа-с.
40. Напиток, содержащий по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, причём указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, и указанный напиток получен способом по любому из предыдущих пунктов.
41. Напиток по п. 40, который содержит по меньшей мере 3 г/л, например, по меньшей мере 4 г/л Р-глюканов.
42. Напиток по любому из п. п. 40 - 41, который имеет вязкость самое большое 50 мПа-с, например, самое большее 40 мПа-с, например, самое большое 35 мПа-с.
43. Напиток по любому из п. п. 40 - 42, который предназначен для уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, при этом клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца и диабета.
44. Способ уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, при этом клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, диабета и инфекций, включающий введение напитка по любому из п. п. 40 - 42 указанному субъекту в эффективном количестве
45. Способ снижения в крови уровня по меньшей мере одного липида, выбранного из группы, состоящей из триглицеридов, холестерина и LDL, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение напитка по любому из п. п. 40 - 42 указанному субъекту.
46. Способ уменьшения риска развития ожирения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий потребление указанным субъектом напитка по любому из п. п. 40 - 42.
47. Способ по любому из п. п. 43 - 46, где указанный субъект является человеком.
48. Способ по любому из п. п. 44 - 47, где указанному субъекту ежедневно вводят напиток, содержащий по меньшей мере 3 г Р-глюкана.
35.
Примеры
Данное изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует считать ограничивающими данное изобретение.
Пример 1
Получение сусла с высоким содержанием Р-глюкана
Получение сусла (экстракта) с высоким содержанием Р-глюкана осуществляли в электронном заторном аппарате фирмы Lochner с 8 заторными стаканами. Получали сусло с высоким содержанием Р-глюкана - > 8 г/л. В этом примере использовали ячмень сорта lys5f. Lys5f доступен в Nordic Genetic Resource Center под номером доступа NGB20030. Зёрна ячменя измельчали в мельнице ЕВС (до 0.5 мм). Отношение вода : мука было равно 1:15 по весу, что эквивалентно 27 г (на сухой вес) ячменной муки, заваренной в 400 мл стандартной воды для пивоварения при 65 ° С в металлическом стакане объёмом 500 мл. Сразу после смешения измельчённого ячменя с водой добавляли вместе два коммерческих ферментных препарата (концентрация 0.2 %/влажный вес - соответствует 400 мкл каждого ферментного препарата), обладающих активностью а-аамилазы, а-1,4-глюкозидазы, пуллуланазы и Р-глюканазы, для того, чтобы облегчить процесс декстринизации крахмала и экстракции Р-глюкана. Использовали две разных ферментных смеси, или смесь Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) Flex (TAF), или смесь Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) (ТА). Все ферменты были куплены в Novozymes, Denmark. Termamyl(r) SC обладал активностью а-амилазы 120 KNU/r, соответственно примерно 48 KNU а-амилазы на 27 г ячменя (соответствует 1.8 KNU на г ячменя - в расчёте на сухой вес). На этой стадии величину рН устанавливали равной 5.5 добавлением фосфорной кислоты. Через 45 мин выдержки при 65 ° С температуру постепенно повышали до 90 ° С в течение 25 мин и, наконец, выдерживали смесь при 90 ° С в течение 30 мин. Сусло центрифугировали при 3500 об/мин (RC5C) в течение 10 мин для удаления нерастворимых отработанных зёрен. Всё количество сусла (340 мл) выливали в сосуды Blue Cap b и кипятили при 90 ° С в течение 30 мин. Измеренное количество Р-глюкана составило 8.4 г/л для сусла lys5f TAF (применяли окрашивание калькофлуором (Brewing ЕВС standards, 1994)) (система Р-глюкан Carlsberg 5700 Analyzer, Tecator, Sweden). После кипячения в сусло добавляли коммерческую геллановую смолу в качестве стабилизатора (Kelcogel(r) LT-100, CP Kelco, Lille Skensved, Denmark) для стабилизации растворимых Р-глюканов в мягкой и эластичной гелеобразующей матрице. Конечная концентрация добавленного
стабилизатора составляла 0.025 %. Сусло с высоким содержанием Р-глюкана хранили при 5 ° С до последующего дображивания и добавления вкусовых веществ.
Пример 2
Получение сусла, содержащего Р-глюкан
По существу, процесс проводили, как описано в Примере 1 за исключением того, что сусло получали на пилотной установке (500 л) с применением декантера (скорость потока 700 л/ч) с последующим центрифугированием (475 л/ч, обратное давление 3 бар) для отделения нерастворимого ячменя. Выход сусла составил 85 % в расчёте на количество загруженной воды, содержание Р-глюкана, определённого окрашиванием калькофлуором, составило 4 г/л. Сусло помещали в пищевые контейнеры, добавляли сорбат калия (25 мг/л), величину рН устанавливали равной 4.0 при помощи раствора лимонной/молочной кислоты и сусло выдерживали при 5 ° С перед стабилизацией и добавлением вкусовых веществ. Ингредиенты, состоящие из 5 % сахара, 0.3 % вкусового вещества, 0.1 % красителя и 0.025 % геллановой камеди, диспергировали в основе с высоким содержанием Р-глюкана при комнатной температуре, используя смеситель с высокой скоростью сдвига с последующей низкой скоростью в течение 5 мин и гидратировали в течение 15 мин. После смешения ингредиентов напиток подвергали воздействию UHT и гомогенизировали для сохранения стабильности. На первой стадии осуществляли предварительный нагрев до 80 ° С и гомогенизировали при давлении 180 бар. Затем подвергали действию UHT при 90 ° С в течение 4 с. Затем напиток охлаждали до 20 ° С и помещали в стерильные бутылки из PET (250 мл).
Пример 3
Процесс по существу осуществляли, как описано в Примере 1 за исключением того, что сусло получали на пилотной установке с применением сусловарочных котлов. Использовали опять ячмень lys5f, однако собранный в другой сезон. После проведения затирания жидкость подавали насосом в фильтрационный чан и снижали температуру до 75 ° С и оставляли для осаждения на 24 ч для удаления нерастворимого ячменя. Всё сусло в количестве 160 л помещали в сусловарочный котёл и кипятили при 90 ° С в течение 30 мин. Определяли содержание Р-глюкана при помощи калькофлуора, оно составило 6 г/л сусла.
Пример 4
Описание действия второстепенной активности р-глюканазы ферментов, использованных в Примерах 1, 2 и 3
Наличие действия Р-глюканазы в трёх разных коммерческих ферментных смесях, использованных при получении экстракта, проверяли, применяя Р-глюкан ячменя средней вязкости (200 кДа) фирмыБ Megazyme (Ireland). Р-Глюкан растворяли при осторожном нагреве и вихревом перемешивании до получения концентрации 1 мг в 600 мкл 50 мМ фосфата калия в качестве буфера в D2O (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, USA), pH 6. Таким образом получали три образца субстрата и смешивали их с 0.5 мкл раствора фермента (Termamyl(r) SC, Attenuzyme(r) или Attenuzyme(r) Flex, соответственно). После окончания реакций проводили in situ спектроскопию ядерного магнитного резонанса высокого разрешения (NMR) в течение 240 мин при 18 ° С. На Фигуре 1 показаны конечные продукты разложения Р-глюкана с помощью Attenuzyme(r) Flex, Attenuzyme(r) и Termamyl(r) SC при 18 ° С. Самое высокое побочное действие Р-глюканазы показал Attenuzyme(r) Flex (Фигура 1) с последующим действиеем Attenuzyme(r). В случае Termamyl(r) SC активность Р-глюканазы не наблюдалась. Об активности фермента судили по появлению сигналов восстанавливающих концов, отличных от звеньев глюкозы (содержащейся в ферментных смесях), как показано на Фигуре 2, которая иллюстрирует спектр ^^Н COSY Р-глюкана lys5f, разложение которого произошло под действием активности Р-глюканазы (лихеназы) Attenuzyme(r) Flex при 65 ° С.
Сайт-специфическое действие второстепенной активности Р-глюканазы изучали, используя образец Р-глюкана lys5f, экстрагированного одним Termamyl(r) SC в реальных условиях процесса (как описано в Примере 1), то есть, при 65 ° С. Спектры lH -lH DQF COSY гомонуклеарных молекул записывали для образцов, разложившихся под действием ферментов, используя спектрометр 800 Гц Bruker (Fallanden, Switzerland). ЯМР спектрометр, снабжённый криопробой TCI и магнитом 18.7 Т (Oxford Magnet Technology, Oxford, UK) использовали для идентификации Р-глюканов, образовавшихся под действием ферментной смеси Attenuzyme(r) Flex (Фигура 2). Назначение сигналов сайтов промежуточных соединений разложения осуществляли путём сравнения спектров 2D с эталонными назначениями по предыдущим работам (Petersen et al 2013). Эти назначения показывают, что преобладающие в основном сигналы сайтов разложения могут быть сигналами восстановительных Р-(1-3) концов, образовавшихся при разложении активной эндо-1,3-1,4-Р-0-глюканазой (Lichenase, ЕС 3.2.1.73) в препаратах Attenuzyme(r) Flex и Attenuzyme(r). Наличие указанной активности эндоглюканазы объясняет быстрое уменьшение молекулярной массы Р-глюкана. Согласно данному изобретению предпочтительно использовать второстепенную активность коммерческих препаратов
Attenuzyme(r) Flex и Attenuzyme(r), поскольку эта активность приводит к регулируемому разложению Р-глюканов ячменя до достижения нужной вязкости.
Пример 5а
Характеристики Р-глюкана
Определение характеристик и количественное определение Р-глюкана из ячменного сусла, полученного, как описано в Примере 1, описано в этом Примере. Сусло приготавливали из нескольких сортов ячменя, включая lys5f и различные коммерческие виды. Общее содержание Р-глюкана в зёрнах использованного ячменя приведено в Таблице 1 ниже.
Для определения содержания Р-глюкана в сусле, а также в зёрнах ячменя использовали флуометрический метод (Brewing ЕВС standards, 1994). Использовавшийся прибор представлял собой анализатор Р-глюкана Carlsberg System 5700 Analyzer, Tecator, Sweden, для анализа впрыска потока, использующий в качестве основных параметров измерения изменения интенсивности флуоресценции красителя калькофлуор, основанные на его способности связываться с Р-глюканом. Калькофлуор имеет способность
способности связываться с Р-глюканом с молекулярной массой > 10-30 кДа, находящимся в растворе и увеличивает его интенсивность флуоресценции прямо пропорционально содержанию связанного Р-глюкана.
Стабильность содержания Р-глюкана определяли путём хранения сусла (4 г/л Р-глюкана) в течение 6 мес при комнатной температуре и регулярного определения содержания Р-глюкана с применение метода окрашивания калькофлуором, описанного выше. Определяли содержание Р-глюкана в сусле, полученном из lys5f, как описано в Примере 1, и в растворе Glucagel(tm), результаты показаны на Фигуре 9.
Вязкость сусла измеряли вискозиметром Vibro SV-10 (A &D Company Limited, Tokyo) при 20 ° С в течение 1 ч после центрифугирования сусла (как описано в Примере 1). Затем помещали 10 мл экстракт в вискозиметр и записывали результаты измерения вязкости в мПа-с. Результаты приведены в Таблице 2.
Перед определением молекулярной массы и отношения DP3/DP4 Р-глюканы осаждали из сусла, используя этанол. Осаждение проводили смешением 1:1 сусла, полученного, как описано в Примере 1 в 80 % этаноле в стеклянном стакане при комнатной температуре. Смесь оставляли для осаждения на 30 мин. Полученный осадок Р-глюканов собирали на сите и сушили при замораживании в течение 24 ч. Высушенные осадки Р-глюканов взвешивали и размалывали в порошок.
Определение молекулярной массы проводили методом эксклюзионной хроматографии (SEC). Образцы помещали в колонку Asahipak GS 520HQ (7.5*300 мм) или Asahipak GS 320HQ (7.5*300 мм) (Shodex, US). Колонку калибровали с помощью пяти стандартов Р-глюкана; ячмень BG 650000, овёс BG 391000, овёс BG 265000, ячмень BG 229000, овёс BG 70600 и овёс BG 35600 (Megazyme, Ireland). Элюирование проводили с помощью 50 мМ буфера NH4COOH с рН 5 и 0.01 % Na№ при 60 ° С с постоянной скоростью потока 0.5 мл/мин. Разделение осуществляли, используя систему GPC (Viscotek 270max, Malvern), снабжённую online дегазатором, насосом и дифференциальным рефрактометром при 40 ° С. Порошковый образец смачивали 20 мкл 50 % этанола перед растворением в буферном растворе. Перед центрифугированием 1 мг/мл раствора нагревали до 80 ° С в течение 2 ч. Все образцы центрифугировали и фильтровали (0.45 мкм) перед впрыском 50 мкл. Результаты определения молекулярной массы анализировали при помощи программы Omni sec software (версия 4.7.0.406, Malvern), основанной на переходящей калибровке гомополимеров.
Результаты определения молекулярной массы трёх видов Р-глюканов показаны в Таблице 3.
Отношение DP3/DP4 (целлотриозы к целлотетраозе) описывает структуру блоков олигомера Р-глюкана. Определение отношения DP3/DP4 было основано на полном
разложении Р-глюкана, осаждённого из сусла, приготовленного как описано выше, лихеназой. Отношение DP3/DP4 определяли для Р-глюканов в экстрактах, приготовленных из различных сортов ячменя, а также для Р-глюканов коммерческого сорта ячменя Glucagel(tm). Смесь для анализа состояла из 2.5 мг образца Р-глюкана в 500 мкл 10 мМ буфера NaH2P04/Na2HP04 и ПО мкл суспензии лихеназы (10 Ед.) (Megazyme, Ireland). Перед растворением в буферном растворе образец смачивали 10 мкл этанола (50 % об/об). Полученный раствор нагревали до 96 ° С в течение 2 ч перед добавлением лихеназы. Образец выдерживали в течение ночи при 60 ° С. Фермент инактивировали обработкой на бане с кипящей водой в течение 30 мин.
Аминобензамид (2-АВ) является распространённой флуоресцентной меткой, прикреплённой к восстановительным концам олигосахаридов путём восстановительного аминирования. Флуоресцентное мечение меткой 2-АВ (2-аминобензамидом) до UPLC анализа (Waters) проводили на эталонных стандартах и образцах следующим образом. Глюкозу, мальтозу, мальтотриозу, мальтотетраозу и мальтопентаозу растворяли в воде до получения концентрации 1 мг/мл. 200 мкл такого раствора подвергали лиофилизации. 200 мкл каждого образца также подвергали лиофилизации. К этим растворам добавляли 200 мкл 2-АВ и 200 мкл NaBHsCN. Образцы перемешивали при помощи вихревой мешалки и выдерживали в течение ночи при 60 0 С, затем охлаждали до комнатной температуры, разбавляли 3.6 мл ШО и промывали CH2CI2 (2x8 мл). Из каждого слоя собирали 1 мл, центрифугировали в течение 5 мин и разбавляли 1 : 10 смесью 10 мМ буфера формиата аммония (рН 4.5) и ацетонитрила (22:78).
Результаты определения отношения DP3/DP4 приведены в Таблице 4.
Chameleon и Columbus являются коммерчески доступными сортами ячменя.
На Фигуре 11 показано отношение DP3/DP4 в зёрнах ячменя различных сортов (показанных на Фигуре) вместе с Mw Р-глюканов в экстрактах, приготовленных из указанных зёрен ячменя, как описано в Примере 1, после экстракции с использованием или смеси Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) Flex (TAF), или смеси Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) (ТА) или Termamyl(r) (Т).
Пример 6
In vitro действие р-глюканов из экстракта (сусла)
Этот опыт проводится для определения того, как молекулярная масса Р-глюканов влияет на способность полисахаридов связывать соль жёлчной кислоты in vitro. Мы использовали метод XH-13C ЯМР (800 МГц) высокого разрешения, описанный в публикации Mikkelsen et al. 2014 для зондирования взаимодействия между Р-глюканом и гликохолятом на молекулярном уровне. Тестируемые Р-глюканы представляли собой:
A. Низкомолекулярный lys5f TAF (LMw - 150 кДа) - экстрагированный из Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) Flex, как описано в Примере 1
B. Iys5f ТА со средней молекулярной массой (MMw - 530 Ша) -экстрагированный из Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r), как описано в Примере 1
Образцы Р-глюкана растворяли (1 % вес/об) в 100 мМ буферного раствора ацетата натрия (рН 5) в D2O и гидратировали при 99 ° С в течение 30 мин. Ацетатный буфер с рН 5 готовили в Н2О до лиофилизации и последующего растворения в D2O. Соль жёлчной кислоты смешивали с раствором PG с концентрациями 0, 5, 15, 30 или 45 мм и смеси выдерживали при 37 ° С в течение 120 мин. После этой выдержки образцы перемещали в трубки 5 мм для ЯМР и анализировали при 37 ° С методом ХН-13С гетероядерной одноквантовой корреляционной спектроскопии (HSQC).
Адсорбцию соли жёлчных кислот Р-глюканами оценивали по изотерме адсорбции Лэнгмюра и при использовании разницы химических сдвигов в модели адсорбции Лэнгмюра для количественного определения влияния величины молекулярной массы Р-глюканов на взаимодействие с гликохолятом. Результаты показаны на Фигуре 3.
Изменения сигналов (Д5) между резонансами двух Р-глюканов свидетельствуют о непосредственном взаимодействии между Р-глюканами и солью жёлчной кислоты в растворе. Это согласуется с прямым связыванием гликохолята и Р-глюканов, полученным
в присутствии Termamyl(r) SC и Attenuzyme(r) (lys5f ТА на Фигуре 3) при дополнительной обработке Attenuzyme(r) Flex (lys5f TAF на Фигуре 3). В то время как обнаруживается адсорбция соли жёлчной кислоты обоими Р-глюканами, степень связывания соли жёлчной кислоты между двумя препаратами не меняется в значительной степени. Следовательно, эти in vitro результаты подтверждают, что Р-глюкан с молекулярной массой 150 кДа lys5f TAF сохраняет способность Р-глюкана с молекулярной массой 530 кДа lys5f ТА адсорбировать соли жёлчных кислот путём непосредственного молекулярного взаимодействия.
Пример 7
In-vivo действие Р-глюкана из экстракта (сусла)
Цель исследования на животных заключалась в определении того, как вид и качество Р-глюкана влияют на метаболизм холестерина в организме гиперхолестеринемических крыс. В этой in vivo модели мы выбрали три разных вида Р-глюканов с сильно отличающимися структурами и молекулярными массами. Основное внимание обращалось на понижение уровня холестерина в крови. Тест начинали с подготовительного периода, составившего 3 нед, когда использовали корм с высоким содержанием липидов (2 %) (плюс 0.5 % холевой кислоты натриевой соли/соли жёлчной кислоты), который, как было установлено, индуцировал гиперхолестеринемию у самцов крыс линии Wistar.
Использовали тестовый режим питания, когда все порции корма содержали одно и то же количество белка, жира, крахмала и клетчатки (5 %). Затем в корм добавляли 2 % холестерина. Основываясь на точном определении содержания белка, крахмала и пищевой клетчатки в порошке Р-глюкана, состав корма регулировали таким образом, чтобы содержание различных питательных компонентов в ежедневной порции корма было идентичнымБ. Состав корма в трёх экспериментах (А, В, С) был основан на высоком содержании жира (клетчатку см. Таблицу 5), когда содержалось 5 % клетчатки из следующих трёх видов Р-глюкана:
А: Контрольный Р-глюкан - Glucagel(tm) (DKSH)
В: низкомолекулярный lys5f TAF (LMw) - экстрагированный с помощью Termamyl(r) S
С: lys5f ТА со средней молекулярной массой (MMw) - экстрагированный Termamyl(r) SC & Attenuzyme(r) Flex, как описано в Примере 5а.
Lys5f Р-глюканы с низкой и средней молекулярной массами получали путём осаждения Р-глюканов из экстракта. Экстракт готовили, как описано в Примере 1, используя ячмень lys5f, и осаждение проводили, как описано в Примере 5а.
Таблица 5: Пищевая композиция с высоким содержанием жира (% от основы).
Ингредиенты:
Белая пшеничная мука
42.0
Р-глюкан
Казеин Miprodan 30
19.0
Сахароза
12.0
Соевое масло
5.0
Шпиг
10.0
Холестерин
2.0
Порошковая целлюлоза
5.0
Минеральная смесь AIN 93G
3.5
Смесь витаминов AIN 93
1.0
L-цистин
0.3
Битартрат холина
0.3
% содержание
100.1
В эксперименте использовали всего 36 крыс линии Wistar (12 на группу) в возрасте 5 нед. Тест проводил 2 блоками с 24 или крысами, с промежутком в 3 нед. По прибытии крыс маркировали с помощью чипов и помещали в контейнеры (4/6 на контейнер). По прибытии крыс кормили ad lib (вволю) стандартным кормом AIN93G (в виде гранул), 1затем кормили ad libitum (без ограничения) испытуемым кормом с высоким содержанием жира в течение 3 нед. Расход корма в каждом контейнере (4-5 животных) записывали еженедельно.
Через 3 нед. животных взвешивали и отбирали кровь из хвостов под общей анестезией для определения уровня липидов в крови. Животных распределяли рандомизированно на 3 группы по весу (похожий вес в группе) и помещали по 4
животных в клетку (одна клетка на группу в блоке) и кормили ad libitum. Еженедельно записывали расход корма и вес животных.
Через 5 нед крыс размещали по одной в метаболические клетки. Через 3 дня пребывания проводили тесты по определению усвояемости при ежедневном добавлении 20 г корма/день. Общее количество корма (80rg) фиксировали и полученные удобрения собирали в один пакет.
Через 7 нед каждую крысу взвешивали и умерщвляли под анестезией. Отбирали кровь для определения содержания:
триглицеридов в плазме, общего холестерина в плазме, HDL в плазме, LDL в плазме из желудка. Содержание твёрдых веществ в % в аппендиксе анализировали по содержанию летучих жирных кислот.
Удобрение из балансового опыта сушили при замораживании и анализировали на содержание сухого вещества и золы.
Результаты изменения липидного профиля после обработки крыс показаны на Фигурах 4-7. Содержание всех липидов определяли на анализаторе Pentra 400. Поскольку липопротеины низкой плотности (LDL холестерин) является основным фактором риска развития ишемической болезни сердца, предпочтительно, чтобы содержание LDL снижалось. Точно так же предпочтительно, чтобы снижался уровень общего холестерина. Однако липопротеины высокой плотности (HDL холестерин) известны как "хороший" холестерин, потому, что он способствует предотвращению закупорки артерий, и, следовательно, предпочтительно чтобы уровень HDL не снижался.
Численные изменения общего содержания SCFA определяли после обработки (см. Фигуру 8). Определяли общее количество SCFA = масляная кислота, пропионовая кислота и уксусная кислота (ммол во влажном образце, кг) х вес (г) содержание аппендикса.
Статистический анализ показал значительную разницу общего содержания SCFA между экспериментальным введением Р-глюкана (LMw lys5f, MMw lys5f), и коммерчески доступного Р-глюкана ячменя Glucagel(tm). Увеличение общего содержания SCFA после введения Р-глюканов рассматривается как благоприятное, поскольку SCFA были связаны с механизмом снижения уровня холестерина и их функция в качестве источника энергии для клеток толстой кишки важна для хорошего здоровья кишечника.
Пример 8
Экстракт ячменя готовили путём затирки ячменной муки в следующих смесях:
Состав экстракта -опыт 1
27 г т ячменной муки сорта Lys5f
400 мл воды (водопроводная)
530 мкл 25 % фосфорной кислоты
120 мкл 35 % раствора хлорида кальция
800 мкл Termamyl (r) Sc
4 мкл Р-глюканазы (Attenuzyme(r) flex или Ultraflo(r) max) Состав экстракта -опыт 2
27 г т ячменной муки сорта Lys5f 400 мл воды (водопроводная) 530 мкл 25 % фосфорной кислоты 120 мкл 35 % раствора хлорида кальция 800 мкл Termamyl (r) Sc
0.4 мкл бета-глюканазы (Attenuzyme flex или Ultraflo max) Состав экстракта -опыт 3
27 г т ячменной муки сорта Lys5f 400 мл воды (водопроводная) 530 мкл 25 % фосфорной кислоты 120 мкл 35 % раствора хлорида кальция 800 мкл Termamyl (r) Sc
0,04 мкл Р-глюканазы (Attenuzyme(r) flex или Ultraflo(r) max) Ultraflo max)
Termamyl(r) SC, Attenuzyme(r) Flex или Ultraflo(r) max были доступны в Novozymes, Denmark. Для получения небольших количеств фермента использовали разведение 100
мкл фермента + 9,9 ml воды, однако, указанные количества соответствуют объёму первоначального ферментного препарата.
Затирание проводили при 65 ° С в металлическом стакане объёмом 500 мл. Через 45 мин выдержки при 65 ° С температуру постепенно повышали до 90 ° С в течение 25 мин и, наконец, выдерживали экстракт при 90 ° С в течение 30 мин. Экстракт подвергали центрифугированию при 5000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре (20-24 ° С) для удаления нерастворимого отработанного зернистого материала.
Величину вязкости и содержание бета-глюкана определяли практически, как описано в Примере 5 выше. Результаты приведены в Таблице 6.
Согласно данным производителя Attenuzyme(r) Flex содержит глюкоамилазу, а-амилазу и пуллуланазу. Однако, как описано в Примере 4 выше в данной заявке, Attenuzyme(r) Flex также обладает второстепенной активностью Р-глюканазы. Когда Attenuzyme(r) Flex используют в очень небольших количествах, полученный экстракт обладает вязкостью, величина которой находится в дальнем конце предела. Однако, как показано в Примере 5а, где применяли большие количества Attenuzyme(r) Flex, получался экстракт с меньшей вязкостью.
Согласно данным производителя Ultraflo(r) Мах содержит Р-глюканазу (700 EGU/r) и ксиланазу (250 FXU/r). Используемое в данной заявке сокращение EGU обозначает единицы эндоглюканазы. При использовании примерно 0.28 EGU Ultraflo(r) Мах на 27 г
ячменя (что соответствует 0.01 EGU/r ячменя), получался экстракт с приемлемой концентрацией Р-глюкана и приемлемой вязкостью. Когда использовали примерно 2.8 EGU Ultraflo(r) Мах на 27 г ячменя (что соответствует 0.01 EGU/r ячменя), получался экстракт с меньшей, но всё ещё приемлемой концентрацией Р-глюканов и приемлемой вязкостью. Когда использовали примерно 0.028 EGU Ultraflo(r) Мах на 27 ячменя (что соответствует 0.01 EGU/r ячменя), получался экстракт с приемлемой концентрацией Р-глюканов, который имел вязкость, величина которой находится в дальнем конце приемлемого предела.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> КАРЛСБЕРГ БРЮИРИЗ А/С
ЮНИВЕРСИТИ ОФ КОПЕНГАГЕН
<120> НАПИТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ Р-ГЛЮКАН ЯЧМЕНЯ
<130> P3695DK00
<160> 5
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 425
<212> БЕЛОК
<213> Hordeum vulgare
<400> 1
Met Ala Ala Ala Met Ala Ala Thr Thr Met Val Thr Lys Asn Asn Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Ala Met Asp Lys Lys Asn Trp Phe Phe Arg Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Val Ala Phe Ser Trp Ser Ser Gln Pro Glu Ser Arg Ser Leu Glu
35 40 45
Phe Pro Arg Arg Ala Leu Phe Ala Ser Val Gly Leu Ser Leu Ser His
50 55 60
Asp Gly Lys Ala Arg Pro Ala Asp Asp Val Ala His Gln Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gly Asp Ala Gly Val Gln Gln Ala Gln Lys Ala Lys Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Gln Gln Leu Gly Leu Arg Lys Val Arg Val Lys Ile Gly Asn Pro
100 105 110
His Leu Arg Arg Leu Val Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Val Ser Arg
115 120 125
Thr Phe Val Ala Pro Leu Glu Thr Ile Arg Thr His Leu Met Val Gly
130 135 140
Ser Ser Gly Ala Asp Ser Met Gly Gly Val Phe Arg Trp Ile Met Arg
145 150 155 160
Thr Glu Gly Trp Pro Gly Leu Phe Arg Gly Asn Ala Val Asn Val Leu
165 170 175
Arg Val Ala Pro Ser Lys Ala Ile Glu His Phe Thr Tyr Asp Thr Ala
180 185 190
Lys Lys Tyr Leu Thr Pro Glu Ala Gly Glu Pro Ala Lys Val Pro Ile
195 200 205
Pro Thr Pro Leu Val Ala Gly Ala Leu Ala Gly Val Ala Ser Thr Leu
210 215 220
Cys Thr Tyr Pro Met Glu Leu Val Lys Thr Arg Leu Thr Ile Glu Lys
225 230 235 240
Asp Val Tyr Asp Asn Leu Leu His Ala Phe Val Lys Ile Val Arg Asp
245 250 255
Glu Gly Pro Gly Glu Leu Tyr Arg Gly Leu Ala Pro Ser Leu Ile Gly
260 265 270
Val Val Pro Tyr Ala Ala Ala Asn Phe Tyr Ala Tyr Glu Thr Leu Arg
275 280 285
Gly Ala Tyr Arg Arg Ala Ser Gly Lys Glu Glu Val Gly Asn Val Pro
290 295 300
Thr Leu Leu Ile Gly Ser Ala Ala Gly Ala Ile Ala Ser Thr Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Leu Glu Val Ala Arg Lys Gln Met Gln Val Gly Ala Val Gly
325 330 335
Gly Arg Gln Val Tyr Lys Asn Val Leu His Ala Met Tyr Cys Ile Leu
340 345 350
Asn Lys Glu Gly Ala Ala Gly Leu Tyr Arg Gly Leu Gly Pro Ser Cys
355 360 365
Ile Lys Leu Met Pro Ala Ala Gly Ile Ser Phe Met Cys Tyr Glu Ala
370 375 380
Cys Lys Lys Ile Leu Val Asp Asp Lys Gln Asp Gly Glu Pro Gln Asp
385 390 395 400
Gln Glu Glu Thr Glu Thr Gly His Thr Gln Gly Gln Ala Ala Pro Lys
405 410 415
Ser Pro Asn Ala Asn Gly Asp Arg Pro
420 425
<210> 2
<211> 1278
<212> ДНК
<213> Hordeum vulgare
<400> 2
atggcggcgg caatggctgc aacgacaatg gtgaccaaga acaacggcgg ctcgctcgcc 60
atggacaaga agaactggtt ctttcggccg gcccctgagg tcgccttctc ttggagctcg 120
cagcccgagt ccaggagctt ggagttccca cgcagggctc tgttcgccag cgtcggactc 180
agcctgtccc acgacgggaa ggctcggccc gccgacgacg tcgcacacca actcgcagcc 240
gcgggcgatg cgggcgtcca gcaggcccag aaggcgaaaa aggccaagaa gcagcagctg 300
ggtctgagga aggtgagggt caagatcggc aacccgcacc tgcgtcggct ggtcagcggc 360
gccatcgccg gcgccgtttc gaggactttc gtggcgccgc tggagacgat caggacgcac 420
ctgatggtgg gaagctccgg cgccgactcc atgggcgggg ttttccggtg gatcatgagg 480
acggaggggt ggcccggcct cttccgcggc aacgccgtca acgtcctccg cgtcgcgccg 540
agcaaggcca tcgagcactt cacttacgac acggccaaga agtacctgac cccggaggcc 600
ggcgagccag ccaaggtccc catccccacg ccgcttgtcg ccggagcgct cgccggagtg 660
gcctcaaccc tgtgcaccta tcccatggag ctcgtcaaga cccgtctcac catcgagaag 720
gatgtgtacg acaacctcct ccacgcgttc gtcaagatcg tgcgcgacga ggggcccgga 780
gagctgtacc gcgggctggc gccgagcctg atcggcgtgg tgccgtacgc ggcggccaac 840
ttctacgcct acgagacact gcggggcgcg taccgccgcg cgtcggggaa ggaggaggtg 900
ggcaacgtgc cgacgctgct gatcgggtcc gcggcgggcg ccatcgccag cacggccacc 960
ttcccgctgg aggtggcgcg gaagcagatg caggtgggcg ccgtgggcgg gaggcaggtg 1020
tacaagaacg tcctgcacgc catgtactgc atcctcaaca aggagggcgc cgccgggctc 1080
taccgcgggc tcggccccag ctgcatcaag ctcatgcccg ccgccggcat ctccttcatg 1140
tgctacgagg cctgcaagaa gatactcgtc gacgacaaac aagacggcga gccccaggac 1200
caggaggaga cggagaccgg acacacacaa ggacaggcgg cgcccaagag ccccaacgcc 1260
aacggtgatc gaccatga 1278
<210> 3
<211> 512
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus stearothermophilus
<400> 3
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly
180 185 190
Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu
195 200 205
Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr
210 215 220
Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser
225 230 235 240
Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro
245 250 255
Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His
260 265 270
Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro
275 280 285
Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr Phe Asp
290 295 300
Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu
305 310 315 320
Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu
325 330 335
Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile
340 345 350
Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr
355 360 365
Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro
370 375 380
Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr
385 390 395 400
Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val Thr Glu
405 410 415
Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly
420 425 430
Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr
435 440 445
Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly
450 455 460
Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro
465 470 475 480
Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr Arg Pro
485 490 495
Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp
500 505 510
<213> Bacillus acidopullulyticus
<400> 4
Met Ser Leu Ile Arg Ser Arg Tyr Asn His Phe Val Ile Leu Phe Thr
1 5 10 15
Val Ala Ile Met Phe Leu Thr Val Cys Phe Pro Ala Tyr Lys Ala Leu
20 25 30
Ala Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val
50 55 60
Asn Gly Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly
65 70 75 80
Val Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu
85 90 95
Ile Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Ser Asp Asp Leu
100 105 110
His Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp
115 120 125
Pro Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro
130 135 140
Lys Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys
145 150 155 160
Leu Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn
180 185 190
Ala Asn Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr
195 200 205
Leu Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr Ile Gln Val Gly Ala Ala
210 215 220
Gly Tyr Glu Ala Val Asn Leu Ile Pro Arg Asn Val Leu Asn Leu Pro
225 230 235 240
Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp Val Gln Leu
260 265 270
Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln Leu Glu Met
275 280 285
Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro Gly Asn Leu
290 295 300
Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Gln
305 310 315 320
Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn Ala Thr Arg
325 330 335
Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly Trp Lys Glu
340 345 350
Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val Ile Tyr Glu
355 360 365
Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly Met Lys Asn
370 375 380
Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys Gly Pro Asp
385 390 395 400
Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly Ile Asn Ala
405 410 415
Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Asn Ser Ile Asp Glu Thr Gln
420 425 430
Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asn Val Pro
435 440 445
Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg Ile Thr Gln
450 455 460
Leu Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile Ala Ile Asn
465 470 475 480
Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Asn Val Gly Val Ser Asp Phe
485 490 495
Asp Lys Ile Val Pro Gln Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Ser Ala Gly Asn
500 505 510
Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Val Gly Asn Glu Ile Ala Thr Glu Arg Pro
515 520 525
Met Val Gln Lys Phe Val Leu Asp Ser Val Lys Tyr Trp Val Lys Glu
530 535 540
Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys
545 550 555 560
Asp Thr Met Ala Lys Ile Ser Lys Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly
565 570 575
Ile Val Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ser
580 585 590
Ser Asp Gln Leu Val Thr Lys Gly Gln Gln Lys Gly Leu Gly Ile Gly
595 600 605
Val Phe Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp
610 615 620
Lys Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Asp Pro Asn Gln Val Asn Val
625 630 635 640
Ile Lys Asn Gly Val Met Gly Ser Ile Ser Asp Phe Thr Ser Ala Pro
645 650 655
Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Met Thr Leu Trp
660 665 670
Asp Lys Ile Ser Ala Ser Asn Pro Asn Asp Thr Gln Ala Asp Arg Ile
675 680 685
Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Phe Thr Ser Gln Gly Val
690 695 700
Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn
705 710 715 720
Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ser Val Asn Gln Phe Asp Trp Ser
725 730 735
Arg Lys Ala Gln Phe Glu Asn Val Phe Asp Tyr Tyr Ser Trp Leu Ile
740 745 750
His Leu Arg Asp Asn His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asp Gln
755 760 765
Ile Lys Gln Asn Leu Thr Phe Leu Asp Ser Pro Thr Asn Thr Val Ala
770 775 780
Phe Glu Leu Lys Asn His Ala Asn His Asp Lys Trp Lys Asn Ile Ile
785 790 795 800
Val Met Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Gln Thr Leu Thr Leu Pro Ser
805 810 815
Gly Asn Trp Thr Ile Val Gly Leu Gly Asn Gln Val Gly Glu Lys Ser
820 825 830
Leu Gly His Val Asn Gly Thr Val Glu Val Pro Ala Leu Ser Thr Ile
835 840 845
Ile Leu His Gln Gly Thr Ser Glu Asp Val Ile Asp Gln Asn
850 855 860
<210> 5
<211> 242
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus subtitlis
<400> 5
Met Pro Tyr Leu Lys Arg Val Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Leu Phe
1 5 10 15
Met Ser Leu Phe Ala Val Thr Ala Thr Ala Ser Ala Gln Thr Gly Gly
20 25 30
Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Gly Tyr Asn Ser Gly Phe Trp Gln Lys
35 40 45
Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys Thr Trp Arg Ala
50 55 60
Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg Leu Ala Leu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Ala Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn Arg Ser Val Gln
85 90 95
Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys Pro Ala Lys Asn
100 105 110
Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Thr Asp Gly
115 120 125
Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr
130 135 140
Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ala Gly Asn His Glu Lys
145 150 155 160
Ile Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr His Thr Tyr Ala
165 170 175
Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser Ile Lys Trp Tyr Val Asp Gly Gln Leu
180 185 190
Lys His Thr Ala Thr Asn Gln Ile Pro Thr Thr Pro Gly Lys Ile Met
195 200 205
Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp Leu Gly Ser Tyr
210 215 220
Asn Gly Val Asn Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr
225 230 235 240
Lys Lys
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л Р-глюкана, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, включающий стадии
a) предоставления зёрен ячменя, причём указанные зёрна обладают
следующими характеристиками:
i. содержат по меньшей мере 10 % Р-глюканов,
ii. имеют отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане, составляющее по меньше мере 3,
b) затирания указанных зёрен с водой в присутствии ферментной композиции, при этом указанная композиция обладает активностью а-амилазы и активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, с получением при этом водного экстракта,
c) отделения указанного водного экстракта от зёрен ячменя с получением при этом напитка или основы напитка,
d) необязательного превращения основы напитка в напиток.
2. Способ по пункту 1, где ферментная композиция обладает также активностью глюкоамилазы.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ферментная композиция обладает также активностью пуллуланазы.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток содержит по меньшей мере 3 г/л, например, по меньшей мере 4 г/л Р-глюканов.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные зёрна содержат по меньшей мере 11 %, например, по меньшей мере 12 % Р-глюканов.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отношение DP3/DP4 в
указанном Р-глюкане составляет по меньшей мере 3.2, например, по меньшей мере 3.4,
например, по меньшей мере 3.6, например, по меньшей мере 3.7.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ячмень имеет мутацию в гене
HvNstl.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия Ь) включает смешение измельчённых зёрен ячменя с водой при отношении вода: измельчённый ячмень от 1 до 10-20.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает добавление одного или более дополнительных соединений или дополнительных жидкостей к основе напитка, полученной на стадии с), для получения напитка.
10. Способ по п. 9, где по меньшей мере одно дополнительное соединение выбрано из группы, состоящей из вкусового вещества, консерванта и функционального ингредиента и/или по меньшей мере одна дополнительная жидкость выбрана из группы, состоящей из фруктового сока, воды и пива.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает
ферментацию основы напитка с помощью одного или более микроорганизмов.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток имеет вязкость равную самое большое 50 мПа-с, например, самое большее 40 мПа-с, например, самое большое 35 мПа-с.
13. Напиток, содержащий по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, причём указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, и указанный напиток получен способом по любому из предыдущих пунктов.
14. Напиток по п. 13, который имеет вязкость равную самое большое 50 мПа-с, например, самое большее 40 мПа-с, например, самое большое 35 мПа-с.
15. Напиток по любому из п. п. 13-14, который предназначен для уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, при этом клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца и диабета.
16. Способ уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, при этом клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, диабета и инфекций, включающий введение напитка по любому из п. п. 13 - 14 указанному субъекту в эффективном количестве
17. Способ снижения в крови уровня по меньшей мере одного липида, выбранного из группы, состоящей из триглицеридов, холестерина и LDL, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение напитка по любому из п. п. 13 - 14 указанному субъекту.
12.
18. Способ уменьшения риска развития ожирения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий потребление указанным субъектом напитка по любому из п. п. 13 - 15.
19. Способ по любому из п. п. 17 - 18, где субъектом является человек.
20. Способ по любому из п. п. 16 - 19, указанному субъекту ежедневно вводят напиток, содержащий по меньшей мере 3 г Р-глюкана.
ИЗМЕНЁННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ приготовления напитка, содержащего по меньшей мере 2 г/л Р-глюкана, при этом указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, включающий стадии
a) предоставления зёрен ячменя, причём указанные зёрна обладают
следующими характеристиками:
i. содержат по меньшей мере 10 % Р-глюканов,
ii. имеют отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане, составляющее по меньше мере 3,4
b) затирания указанных зёрен с водой в присутствии ферментной композиции, при этом указанная композиция обладает активностью а-амилазы и активностью эндо-1,3(4)-Р-глюканазы, с получением при этом водного экстракта,
c) отделения указанного водного экстракта от зёрен ячменя с получением при этом напитка или основы напитка,
d) необязательного превращения основы напитка в напиток.
2. Способ по пункту 1, где ферментная композиция обладает также активностью глюкоамилазы.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ферментная композиция обладает также активностью пуллуланазы.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток содержит по меньшей мере 3 г/л, например, по меньшей мере 4 г/л Р-глюканов.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные зёрна содержат по меньшей мере 11 %, например, по меньшей мере 12 % Р-глюканов.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отношение DP3/DP4 в указанном Р-глюкане составляет по меньшей мере 3.6, например, по меньшей мере 3.7.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ячмень имеет мутацию в гене HvNstl.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия Ь) включает смешение измельчённых зёрен ячменя с водой при отношении вода: измельчённый ячмень от 1 до 10-20.
2.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает добавление одного или более дополнительных соединений или дополнительных жидкостей к основе напитка, полученной на стадии с), для получения напитка.
10. Способ по п. 9, где по меньшей мере одно дополнительное соединение выбрано из группы, состоящей из вкусового вещества, консерванта и функционального ингредиента и/или по меньшей мере одна дополнительная жидкость выбрана из группы, состоящей из фруктового сока, воды и пива.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия d) включает
ферментацию основы напитка с помощью одного или более микроорганизмов.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где напиток имеет вязкость равную самое большое 50 мПа-с, например, самое большее 40 мПа-с, например, самое большое 35 мПа-с.
13. Напиток, содержащий по меньшей мере 2 г/л Р-глюканов, причём указанные Р-глюканы имеют среднюю молекулярную массу в пределах от 80 до 200 кДа, и указанный напиток получен способом по любому из предыдущих пунктов.
14. Напиток по п. 13, который имеет вязкость равную самое большое 50 мПа-с, например, самое большее 40 мПа-с, например, самое большое 35 мПа-с.
15. Напиток по любому из п. п. 13-14, который предназначен для уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, при этом клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца и диабета.
16. Способ уменьшения риска развития клинического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, при этом клиническое состояние выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, диабета и инфекций, включающий введение напитка по любому из п. п. 13 - 14 указанному субъекту в эффективном количестве
17. Способ снижения в крови уровня по меньшей мере одного липида, выбранного из группы, состоящей из триглицеридов, холестерина и LDL, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение напитка по любому из п. п. 13 - 14 указанному субъекту.
18. Способ уменьшения риска развития ожирения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий потребление указанным субъектом напитка по любому из п. п. 13 - 15.
19. Способ по любому из п. п. 17 - 18, где субъектом является человек.
12.
20. Способ по любому из п. п. 16 - 19, указанному субъекту ежедневно вводят напиток, содержащий по меньшей мере 3 г Р-глюкана.
1=4 ч
t=3 ч
1=2ч
t=1 ч
Attenuzyme Flex Attenuzyme Termamyl SC
~~i 1-I-I- -I-I 1-I- -I-I-Г~
4.6 4.4 4.6 4.4 4.6 4.4
Химический сдвиг (1H, м.д.)
Фигура 1
Концентрация (гликохолат, мМ)
Триглицерид
ц о
2,00
1,80 1,60 1,40
1,20 1,00
0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 1.1:
1. If.
Начало Конец
Глкжагель(tm)
5f (н. м. м.)
5f (ср. м. м.)
Фигура 4
Общий холестерин
4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 3,89
.76
3,/J
2,65
3,88
.75
Начало Конец
Глюкагель(tm)
5f (н. м. м.)
5f (ср. м. м.)
LDL- холестерин
о Е Е
2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 1,38
1/15
Начало
Конец
Глюкагель
5f (н. м. м.)
5f (ср. Р.1. м.)
Фигура 6
HDL-холестерин
Е Е
1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 о,/
0./4
0.77
О, ¦¦¦¦¦¦¦
Начало Конец
Глюкагель(tm)
5f (н. м. м.)
5f (ср. м. м.)
600,0
ID 500,0 4-
0 I
^ (
S 1
ct I
X 1
§ 400,0
ra !
m s
Ф {
1 300,0 f
CL CD
g 200,0 x
I 100,0
0,0
Глюкагель
(H. м. м )
51 (ср. м. м.)
Фигура 8
5,0 4,8 сГ 4,6
A 44
51 I
Ё. 4,2
о О
4,0 3,8
Месяцы
¦5f
3,6
4,2 4,3 1
4,4 4,5
2 4,4 4,5
SSQP-mRS
KPRGn?:jc __ : о'
DLL-:HLU • KSs i'A..evBi ЛЙАА -J L A.:
... . JV iGt: ?
IAGAVSRTFҐAPLETIRTH1MVG
1!§j M S
Фигура 10
4,0
ТА ИТАР DP3/DP4
600
А х
га . с <и
2, о
га 1
о о
0 400 g
s 3.0 g
га с;
1 °
? 3-
5 200 *
& 2.5 Q.
oS О
5 ; 1Ш11И ДИИ- ШШШ Янн МН й
? ввнв^н "¦"¦" вввв ВИВВ BBHI о.
2.0
ВВВВвв ВВН ШВВ ВВН о
LysSf KVL408 KVL1104 Chameleon Columbus
Фигура 11
га с
3. юо
и о
га ^ о а> т s
¦8-
га i_
I ТА v TAF
LysSf
KVL408
KVL1104
Chameleon
Columbus
(19)
(19)
(19)
1/8
3/8
Фигура 3
4/8
Фигура 5
4/8
Фигура 5
4/8
Фигура 5
4/8
Фигура 5
5/8
Фигура 7
5/8
Фигура 7
5/8
Фигура 7
5/8
Фигура 7
6/8
Фигура 9
6/8
Фигура 9
6/8
Фигура 9
6/8
Фигура 9
6/8
Фигура 9
6/8
Фигура 9
7/8
7/8
7/8
7/8
8/8
Фигура 12
8/8
Фигура 12
8/8
Фигура 12
|
