(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей экстракт почек тополя для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, поражений кожи и бактериальных инфекций.
Евразийское (21) 201892349 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(51) Int. Cl. A61K36/76 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.05.22
(54) КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 102016000053369
(32) 2016.05.24
(33) IT
(86) PCT/IB2017/053000
(87) WO 2017/203414 2017.11.30
(71) Заявитель:
АБОКА С.П.А. СОСИЕТА' АГРИКОЛА (IT)
(72) Изобретатель:
Меркати Валентино, Маттоли Луиза, Майдекки Анна, Лугли Андреа (IT)
(74) Представитель:
Угрюмов В.М. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей экстракт почек тополя для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, поражений кожи и бактериальных инфекций.
КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ, И ИХ
ПРИМЕНЕНИЯ
ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей экстракт почек тополя, для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, поражений кожи и бактериальных инфекций.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ В литературе известно, что смолистый экссудат черного тополя (Populus nigra) составляет базовый элемент Европейского прополиса и, в целом, пчелиного прополиса в умеренных зонах.
Прополис, известный своими многочисленными фармакологическими воздействиями, представляет собой вещество, производимое пчелами после сбора последними смолистых экссудатов (главным образом, черного тополя). В среднем, он состоит из 25-35% пчелиного воска, 5% пыльцы, 5% различных веществ, присутствующих на лапках пчел, и около 50% растительных смол.
В литературе также известны различные применения лекарственных средств на основе почек тополя.
Учитывая постоянный и растущий интерес к применению веществ естественного происхождения для лечения многочисленных заболеваний и учитывая нынешнюю привлекающую внимание опасность исчезновения пчел, важно найти продукты природного происхождения, которые могут сопоставимо сравниваться или даже быть более эффективными, чем получаемые от пчел вещества.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения проанализировали экстракты почек тополя для того, чтобы проверить его возможное применение в терапевтических целях в качестве альтернативы прополису полностью растительного происхождения.
В отличие от прополиса, экстракты почек тополя также имеют преимущество, поскольку не содержат вещества животного происхождения и аллергенные веществ, такие как пыльца.
Авторы настоящего изобретения неожиданно нашли подтверждение тому, что в отношении Европейского прополиса экстракты почек тополя демонстрируют сравнимые или даже более высокие мукоадгезивные свойства.
Авторы настоящего изобретения впервые продемонстрировали эффективную антибактериальную активность, в частности, в отношении Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, экстрактов почек тополя, необязательно лиофилизированных, необязательно со-лиофилизированных с натуральными камедями (нанесенными на камедь).
Следовательно, объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая
Экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,1 до 70% и один или более фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, ароматизаторов, консервантов для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, повреждений кожи и бактериальных инфекций для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, повреждений кожи и бактериальных инфекций.
Кроме того, объектом настоящего изобретения является лечение ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного аппарата, повреждений кожи и бактериальных инфекций путем введения смеси или композиции по изобретению субъекту, подверженному указанным нарушениям.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фигура 1: Анализ мукоадгезии различных составов, проведенный, как описано в Примере 1.
Фиг. 1А: Процент мукоадгезивности композиции - разведенной (1:2,5 и 1:5). твердой композиции по Примеру 4 по отношению к буккальным клеткам человека; Фиг. 1В: Процент мукоадгезивности композиции - разведенной (1:2,5 и 1:5) твердой композиции по Примеру 3 по отношению к буккальным клеткам человека; Фиг. 1С: Процент мукоадгезивности композиции - не разведенной или разведенной (1:2 и 1:5) жидкой композиции по Примеру 4 по отношению к буккальным клеткам человека; Фиг. 1D: Процент мукоадгезивности композиции - неразведенной или разведенной (1:2 и 1:5) жидкой композиции по Примеру 3 по отношению к буккальным клеткам человека.
Фиг. 2 - Сопротивление мукоадгезивного слоя (полученное с различными составами по изобретению при различных разведениях и в разное время) в разное время моделированному раствору слюны (0,9% физиологический раствор NaCl).
Фиг. 2А: композиция - (разведенная 1:2,5) твердая композиция по Примеру 4 в разное время (0 ч, 0,5 ч, 1 ч и 2 ч) в моделированном растворе слюны (0,9% физиологический раствор NaCl); Фиг. 2В: композиция - (разведенная 1:2,5) твердая композиция по Примеру 3 в разное время (Время: 0 ч, 0,5 ч, 1 ч и 2 ч) в моделированном растворе слюны (0,9% физиологический раствор NaCl); Фиг. 2С: композиция -(разведенная 1:2) жидкая композиция по Примеру 4 в разное время (Время: 0 ч, 0,5 ч, 1 ч и 2 ч) в искусственном растворе слюны.
Фигура 3: Получение ГЬб в барьерном анализе; на графиках показана защита, оказываемая композицией по изобретению на клетки, и данные выражаются в терминах Fold Over (F.O.) по сравнению с контрольным
Fold Over С- = [измеренный ГЬ-6]/[С-ГЬ-6]
Фиг. ЗА: композиция - твердая композиция по Примеру 4, Фиг. ЗВ: композиция -твердая композиция по Примеру 3, Фиг. ЗС: композиция - жидкая композиция по Примеру 4, Фиг. 3D: композиция - жидкая композиция по Примеру 3.
На Фигуре 4 графически изображен барьерный эффект, рассчитанный для различных вариантов выполнения описанного изобретения в процентах от ингибирования высвобождения ГЬб.
Фиг. 4А: композиция - твердая композиция по Примеру 4, Фиг. 4В: композиция -твердая композиция по Примеру 3, Фиг. 4С: композиция - жидкая композиция по Примеру 4, Фиг. 4D: композиция - жидкая композиция по Примеру 3.
На Фигуре 5 графически изображены значения полученного в клетках ГЬ-6 в терминах Fold Over С- во внутреннем контроле.
Фиг. 5 А: композиция - твердая композиция по Примеру 4, Фиг. 5В: композиция -твердая композиция по Примеру 3, Фиг. 5С: композиция - жидкая композиция по Примеру 4, Фиг. 5D: композиция - жидкая композиция по Примеру 3.
Фигура 6: антиокислительная активность экстракта почек тополя согласно изобретению по сравнению с аскорбиновой кислотой.
Фигура 7: - ингибирующая активность бактериальной биопленки экстракта почек тополя согласно изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Таким образом, объектом настоящего изобретения является композиция, включающая
Экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,1 до 70% и один или более фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, ароматизаторов, консервантов для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, повреждений кожи и бактериальных инфекций для применения в лечении ротоглоточной полости, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, повреждений кожи и бактериальных инфекций.
Согласно одному варианту выполнения изобретения композиция может содержать или состоять из:
Экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,1 до 70%, Эксципиенты в процентах по массе от 1 до 80% Растворители в процентах по массе от 0 до 80%
Природные или лиофилизированные фруктовые соки в процентах по массе от 0 до 50%
Природные или искусственные ароматизаторы в процентах по массе от 0,05 до
Эфирные масла в процентах по массе от 0,01 до 1%.
В соответствии с еще одним вариантом выполнения композиция по изобретению может содержать или состоять из
Лиофилизированный сухой экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,5 до
10%,
Эксципиенты в процентах по массе от 10-97%
Природные или искусственные ароматизаторы в процентах по массе от 0,5 до 3% Эфирные масла в процентах по массе от 0,05 до 1%
Порошкообразные или лиофилизированные фруктовые соки и/или натуральные экстракты в процентах по массе от 0,5 до 15%
Подсластители в процентах по массе от 1 до 10%.
Под "экстрактом почек тополя" для целей настоящего изобретения подразумевается экстракт, полученный из листовых почек или преимущественно листовых почек черного тополя (Populus nigra).
В частности, экстракт по изобретению представляет собой экстракт нераскрытых листовых почек. Почки могут быть найдены нераскрытыми, в основном, весной, которая в Европе обычно продолжается с марта по май.
Согласно одному варианту выполнения изобретения единственное активное начало композиции представляет собой экстракт почек тополя.
В композиции в соответствии с любым из вышеописанных вариантов выполнения изобретения экстракт почек тополя может быть связан с природной камедью в соотношении экстрактжамедь в интервале от 1:2 - 1-20.
Композиция, как определено выше и как дополнительно проиллюстрировано в примерах ниже, может быть использована, как указано выше, для лечения заболеваний ротоглоточной полости. Такие заболевания могут быть выбраны, например, из воспаления горла, фарингита, афты, воспаления или инфекции полости рта.
В варианте выполнения изобретения, где указанная композиция применяется для лечения заболеваний пищеварительного/выделительного аппарата, заболевания могут быть выбраны из гастрита, рефлюкса, воспалительных заболеваний кишечника, синдрома раздраженного кишечника, геморроя, инфекций.
Кроме того, композиция по изобретению может использоваться для лечения заболеваний мочевых путей, таких как, например, цистит.
В одном предпочтительном варианте выполнения композиция по изобретению может быть использована для лечения бактериальных инфекций, среди которых особенно предпочтительны инфекции, по меньшей мере, из одного из Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.
При лечении инфекций Streptococcus pyogenes композиция в соответствии с настоящим изобретением может, например, применяться для лечения Фарингита, Скарлатины, Пиодермии или импетиго, Рожи, Целлюлита, Некротизирующего фасцита, Синдрома стрептококкового токсического шока, Бактериемии, Острой ревматической лихорадки, Острого гломерулонефрита, Узелковой эритемы, P.A.N.D.A.S (Педиатрических Аутоиммунных Нейропсихиатрических Расстройств, Связанных со Стрептококковыми инфекциями), Синдрома хронической усталости (CFS) и фибромиалгии, Синдрома Доброкачественной Фасцикуляции (BFS).
Для получения композиции по изобретению предпочтительно можно использовать водно-спиртовой экстракт почек тополя с градусами спирта от 35 до 70. В
особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения экстракт может быть лиофилизирован. Необязательно, экстракт может быть совместно лиофилизирован с натуральной камедью для того, чтобы повысить растворимость экстракта в воде и сделать сухой экстракт более легко обрабатываемым.
Однако полученные данные и те, которые можно увидеть в экспериментальном разделе, демонстрируют, что совместная лиофилизация (носитель) с натуральной камедью увеличивает мукоадгезивные и защитные характеристики экстракта, что делает особенно эффективными композиции по изобретению, содержащие экстракт, нанесенный на камедь.
В частности, экстракт почек тополя может быть экстрактом, получаемым способом, включающим следующие стадии:
a. приготовление водно-спиртового экстракта почек тополя путем экстракции 85° этанолом
b. приготовление водно-спиртового экстракта почек тополя путем экстракции 13° этанолом
c. получение мультифракционного спиртового экстракта, путем смешивания экстрактов, полученных в а. и Ь.
d. декантирование и/или центрифугирование и фильтрование указанного
спиртового экстракта (с), сбор супернатанта
e. отфильтрованный супернатант, полученный в d., подвергают
концентрированию и лиофилизации и, необязательно,
f. в отфильтрованный супернатант, полученный в d., добавляют натуральную
камедь (выбранную из смол, указанных ниже в описании, или их комбинаций, в
частности, добавляют аравийскую камедь) и затем подвергают концентрированию и
лиофилизации.
В частности, экстракты в а. и Ь. могут быть получены как путем экстракции перколятным расщеплением с движением единственного экстракционного растворителя, так и экстракцией в экстракторе, снабженном лопастной мешалкой, и перемещением как растворителя, так и почек. Экстракцию можно проводить при температуре, составляющей от 35 до 55°С, напр., при температуре, составляющей 40-50°С (крайние точки включены), в частности, при температуре около 40°С или 50°С.
Экстракцию можно проводить в течение времени от 4 до 12 часов, напр., около 8
часов.
Экстракты, приготовленные в а. и Ь., смешиваются, как на стадии с, предпочтительно в соотношении 50:50, но могут быть смешаны также в соотношении
35:65, 40:60, 45:55, 55:45, 60:40, 65:35. Смешивание проводят путем постепенного добавления (скорость добавления: от 15 до 20 л/мин) 13° спиртового экстракта в 85° спиртовом экстракте, но также возможно обратное добавление. Смешивание проводят при температуре 20±5°С.
Мультифракционный экстракт, полученный на стадии с, подвергают очистке путем декантации на контейнерах, снабженных коническим дном, в течение как минимум 72 часов. По истечении указанных часов экстракт выливают и фильтруют на целлюлозном фильтре. Такая фильтрация может быть выполнена, напр., на панельном фильтре с отсечением от 0,5 до 50 микрон (крайние точки включены) на единственной стадии или на нескольких последовательных стадиях, напр., с отсечением 0,5 микрон, 15 микрон или с отсечением 30 микрон или даже больше.
В конце фильтрации регулируют спиртовой градус и доводят до 50±15° градусов спирта.
В качестве альтернативы декантированию экстракт можно отделить центрифугированием на вертикальной центрифуге с подачей при скорости потока от 5 до 20 л/мин.
Экстракт, очищенный как в d., можно использовать как есть в виде мультифракционного спиртового экстракта.
Экстракт, очищенный как в d., подвергают процессу концентрирования и лиофилизации, как в е., для получения лиофилизированного экстракта, который может быть использован для твердых составов.
Экстракт, очищенный как в d., с добавлением аравийской камеди или натуральной камеди, подвергается концентрированию и лиофилизации, как в f., для получения лиофилизированного экстракта, нанесенного на аравийскую камедь, который может быть использован для твердых составов. Аравийскую камедь или одну или более натуральных камедей используют в таком количестве, чтобы получить процентное содержание 10-20% на твердом веществе.
Диаграмма 1: блок-схема спиртового мультифракционного экстракта почек
тополя
почки Popidm Xigra. разрезают
1 экстрагирование вЪ fctOH
эксфак! 85; EtOH
почки Populiis Nigra после стадии а.
Ь 2 экстрагирование 13' ЕЮН
5L
Эьчлуак! L- ElOH
Смешивание
4 декантирование ¦ цвн грыфугирование
и фильтрование
ЯМНМП
Диаграмма 2: блок-схема лиофилизированного мультифракционного экстракта почек тополя
СПИРТОВОЙ МУ ЛЬТ11ФРАКЦ1 гонньш ЭКСТРАКТ Фракция I (полярная фракция)
Концентрирование Лиофилнзация
Л ГОФЗ17П131IPOB АННЫЙ МУЛЬТИФРАКЦИОННЫЙ ЭКСТРАКТ Фракция 1 Iполярная фракция!
Диаграмма 3: блок-схема лиофилизированного мультифракционного экстракта почек тополя, нанесенного на аравийскую камедь (или одну или более природных камедей, как указано ниже)
СП! 1РТОВОЙ МУЛЫ! 1ФРАКЦ1ЮННЫЙ ЭКСТРАКТ Фракция 1 (полярная фракция!
Аравийская камедь
Концентрирование Лиофилизаппя
ЛИОФП ЛИП !ЮВ АННЪПI \ГУЛЬТ11ФРАКЦ1 ЮННЫЙ ЭКСТРАКТ Фракция 1 (полярная фракция!
Экстракт, полученный в соответствии с вышеописанным способом, характеризуется следующей композицией:
Спиртовой мультифракционный экстракт почек тополя (Единица измерения: мг/ЮОмл)
Общее содержание смол
270
Летучие терпены
17,2
Общее содержание флавоноидов
170,6
Пиноцембрин
73,40
Галангин
61,4
Таннины
13,5
Другие ФЕНОЛЫ (общее)
21,9
Органические кислоты
83,9
> 20кДа полисахариды
64,5
Лигнины
17,9
Салицилаты
28,1
Минералы
153
Значения приведены средние по анализам различных экстрактов в соответствии с вышеописанной методологией.
Согласно одному варианту выполнения изобретения экстракт почек тополя в любой форме, определенной выше, может находиться в процентном отношении от 0,3 до 45 %мас.
Например, композиция в жидкой форме может быть представлена в соответствии со следующими примерами
Пример жидкой композиции 1
компонент
%мас.
ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
0,70
КСАНТАНОВАЯ КАМЕДЬ
1,00
ВОДА
55,40
ПЕРСИКОВЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,40
ЛИМОННЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,10
ОСВЕТЛЕННЫЙ СОК ЛИМОНА
1,40
СЪЕДОБНЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН, В КГ
15,00
АПЕЛЬСИНОВЫЙ СОК
26,00
ОБЩ
100,00
Пример жидкой композиции 2
компонент
%мас.
ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
1,00
ГУ АРОВ АЯ КАМЕДЬ
1,00
ВОДА
55,10
ПЕРСИКОВЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,40
ЛИМОННЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,10
ОСВЕТЛЕННЫЙ СОК ЛИМОНА
1,40
СЪЕДОБНЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН, В КГ
15,00
АПЕЛЬСИНОВЫЙ СОК
26,00
ОБЩ
10000
Пример жидкой композиции 3 (сильнодействующий спрей)
компонент
%мас.
62,7° СПИРТОВОЙ ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
39,76
ДЕИОНИЗИРОВАННАЯ ВОДА
3,92
РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН
55,70
ЭФИРНОЕ МАСЛО ЛИМОНА
0,01
ЭФИРНОЕ МАСЛО СЛАДКОГО АПЕЛЬСИНА
0,01
ЦИТРУСОВЫЙ НАТУРАЛЬНЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,60
ОБЩ
100,00
Пример жидкой композиции 4 (бесспиртовой Спрей)
компонент
%мас.
ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫИ ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
0,55
АРАВИЙСКАЯ КАМЕДЬ
4,95
ВОДА
51,30
ВИШНЕВЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,20
КЛУБНИЧНЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,60
ОСВЕТЛЕННЫЙ СОК ЛИМОНА
1,40
СЪЕДОБНЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН, В КГ
35,00
ОСВЕТЛЕННЫЙ ЯБЛОЧНЫЙ СОК. КОНЦ
70BIX
6,00
ОБЩ
100,00
Пример твердой композиции 1
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
5,00
Маннит
46,14
Камедь тары
6,56
Инулин
38,60
Лиофилизированный сок малины
0,40
Лиофилизированный сок персика
2,50
Лимонный натуральный ароматизатор
0,80
Вишневый натуральный ароматизатор
Лиофилизированный экстракт мальвы
0,8
Общее
100,00
Пример твердой композиции 2
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
10,00
Сорбит
46,14
Гуаровая камедь
1,56
Инулин
15,00
Лиофилизированный сок лимона
0,40
Лиофилизированный сок апельсина
25,00
Лимонный натуральный ароматизатор
0,80
Малиновый натуральный ароматизатор
1,10
Лиофилизированный экстракт мальвы
0,8
Общее
100,00
Пример твердой композиции 3 (Таблетки для взрослых)
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
1,08
Коричневый сахар
71,5
Аравийская камедь
10,82
Мёд
Экстракт лайма (дерево)
1,5
Лиофилизированный сок апельсина
10,5
Апельсиновый ароматизатор
1,5
Лимон ЕО
Общее
100
Пример твердой композиции 4 (Детские таблетки)
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
1,14
Коричневый сахар
83,5
Аравийская камедь
6,56
Инулин
1,6
Лиофилизированный сок клубники
2,4
Лиофилизированный сок бузины
Клубничный натуральный ароматизатор
Вишневый натуральный ароматизатор
Лиофилизированный экстракт лайма (дерево)
0,8
Общее
100,00
Композиция по изобретению может быть, напр., в виде порошка, таблетки, капсулы, твердого или мягкого желатина, сиропа, спрея, суспензии.
Следовательно, можно использовать один или более из фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, ароматизаторов, консервантов, известных специалисту в данной области.
В широком смысле, когда ее изготавливают в жидкой форме, композиция будет содержать в качестве активного начала экстракт почек тополя в любом варианте выполнения изобретения, описанном в настоящем документе, и один или более эксципиентов, растворителей, ароматизаторов, консервантов и т.д., известных специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающего примера в качестве эксципиентов можно использовать одну или более натуральных камедей, таких как, напр., аравийская камедь, ксантановая камедь, гуаровая камедь, камедь тара или их смеси; природные и синтетические полиспирты, такие как, напр., сахароза, маннит, сорбит, ксилит или их смеси; целлюлозу и производные целлюлозы, такие как, напр., гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза
или их смеси; синтетические полимеры, такие как, напр., поливинилпирролидон, полиметакрилаты или их смеси; мальтодекстрины, инулин и/или циклодекстрины.
В качестве растворителей всегда в качестве неограничивающего примера можно использовать этанол, изопропанол, глицерин, пропиленгликоль или их смеси.
Могут также использоваться натуральные или лиофилизированные фруктовые соки, напр., яблочный, грушевый, апельсиновый, лимонный, малиновый, черничный сок или их смеси; натуральные или искусственные ароматизаторы, такие как, напр., клубничный, лимонный, апельсиновый, малиновый, персиковый, вишневый, ягодное ассорти, апельсиново-мандариновый ароматизатор или их смеси; эфирные масла (Е.О.), такие как, напр., лимонное, апельсиновое, мятное, эвкалиптовое эфирное масло или их смеси.
Вообще, при изготовлении в твердой форме композиция будет содержать в качестве активного начала экстракт почек тополя в любом варианте выполнения изобретения, описанном в настоящем документе, и один или более эксципиентов, растворителей, ароматизаторов, консервантов и т.д., известных специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающего примера в качестве эксципиентов можно использовать один или более Сахаров, таких как, напр., сахароза, маннит, сорбит, ксилит или их смеси; целлюлозу и производные целлюлозы, такие как, напр., микрокристаллическая целлюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза или их смеси; мальтодекстрины, циклодекстрины и/или инулин.
Могут быть использованы один или более крахмалов и производных крахмала, такие как, напр., рисовый крахмал, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, прежелатинизированный крахмал или их смеси; смазывающие вещества, такие как, напр., стеариновая кислота, стеарат магния, бегенат глицерина или их смеси; натуральные и синтетические ароматизаторы, такие как, напр., клубничный, лимонный, апельсиновый, малиновый, персиковый, вишневый ароматизатор, ароматизатор ягодное ассорти или их смеси; эфирные масла, такие как, напр., лимонное, апельсиновое, мятное эвкалиптовое эфирное масло или их смеси; лиофилизированные фруктовые соки, такие как яблочный, грушевый, апельсиновый, лимонный, малиновый, черничный, клубничный, бузинный сок или их смеси; порошковые или лиофилизированные природные экстракты лайма (дерева), мальвы, алоэ, алтея или их смесей; подсластители, такие как, напр., мед, сахара, аспартам, цикламаты, ацесульфам К, экстракты стевии, сукралоза или их смеси.
В любом месте описания и в формуле изобретения термин "содержащий" может быть заменен термином "состоящий из" или "изготовленный из".
Следующие примеры приведены для дальнейшего пояснения изобретения, но не для целей ограничения.
ПРИМЕРЫ
1. Анализ мукоадгезии
Хороший мукоадгезивный эффект является требованием первостепенной важности так, чтобы продукт мог оставаться в предполагаемом месте действия (фарингальная слизистая оболочка) и механически выполнять свои защитные и лечебные функции, как уже объяснялось выше в описании. Основная цель этого анализа состоит в том, чтобы оценить адгезию композиции по изобретению in vitro в разных составах на подходящей модели клеток, предусматривающей использование буккальных клеток. Вторая цель анализа состоит в том, чтобы определить устойчивость к биоадгезии во времени по отношению к потоку искусственного раствора слюны. Мукоадгезию композиции по изобретению в разных составах определяли путем оценки способности продукта прилипать к клеткам, ингибируя лектин (белок с высоким сродством к остаткам глюкозида и маннозида), связанный с мембранными гликопротеинами. Степень мукоадгезии измеряется колориметрической реакцией, позволяющей количественно определять сайты на гликопротеинах, не занятые лектином, а занятые мукоадгезивным продуктом. Колориметрическая реакция возможна благодаря особой системе маркировки лектинов, показанной на следующей диаграмме:
Уменьшение величины абсорбции пропорционально способности продукта прилипать ("мукоадгезировать") к клеткам. Мукоадгезивная способность выражается в процентах от ингибирования связывания гликопротеин/лектин и представляет собой процентное содержание сайтов слизистой оболочки, занимаемых продуктом, в соответствии с уравнением:
Процент мукоадгезии продукта = (1 - абс. образец/абс. контроль) х 100
Продукт наносят после разбавления, принимая во внимание тот факт, что в реальном использовании сразу после доставки происходит смешение с слюной, присутствующей в ротоглоточной полости. На следующих графиках представлены результаты, полученные с различными образцами композиции в соответствии с изобретением в различных составах.
Таблица 3 - Процент мукоадгезии продукта - жидкая композиция по Примеру 4, неразведенная или разведенная (1:2 и 1:5) по отношению к буккальным клеткам человека.
Во второй фазе эксперимента способность композиции сохранять сцепление со слизистой оболочкой во времени оценивали, подвергая систему потоку искусственной слюны 2 мл/мин, приготовленной из изотонического водного раствора, содержащего фосфатный буфер с рН 7 и 0,5% муцина. Полученные результаты выявили интересную способность продукта оставаться биоадгезированным на слизистых оболочках в течение первого часа применения.
Сопротивление мукоадгезивного слоя, полученного с использованием твердой композиции по Примеру 3, разведенной 1:2,5, в разное время, 0,5 ч 1 ч и 2 ч по отношению к моделированному раствору слюны (0,9% физиологического раствора NaCl) указано в Таблице 5 ниже.
Образцы
0 Часов
0.5 Часов
1 Час
2 Часа
ы" > :
M 7
ИЗ 3
11 4
55 8
48 8
14 g
ЬЪ п
: ¦ '
44?,?
Среднее 1 5 0 ? .}
s f г 1 s f' J
4^ 4 ' 4 3
Время 0 часов по отношению ко Времени 0,5 часа р < 0,05; Время 0,5 часа по отношению ко Времени 1 час р > 0,05
Время 2 часа по отношению ко Времени 1 час р < 0,05
Время 0 часов по отношению ко Времени 0,5 часа р > 0,05; Время 0,5 часа по отношению ко Времени 1 час р < 0,05
Время 2 часа по отношению ко Времени 1 час р < 0,01
Время 0 часов по отношению ко Времени 0,5 часа р > 0,05; Время 0,5 часа по отношению ко Времени 1 час р <0,05
Время 1 час по отношению ко Времени 0 часов р < 0,01; Время 2 часа по отношению ко Времени 1 час р > 0,05
Таблица 8: Сопротивление мукоадгезивного слоя, полученного с помощью продукта в виде жидкой композиция по Примеру 3, разведенной 1:2, в разное время (0,52 ч) по отношению к искусственному раствору слюны.
Образцы
0 Часов
0,5 Часов
1 Час
2 Часа
с; 6
Г-5 ь
',.¦> с
-is ;
ы ш
Jb Л
4> /.Ь \
1/ 4
41 ,
14 г- ]
Среднее 1 5,0. {'¦'*¦.)
f¦" 7 i i 1
Г.] ! : •? С-
46 5 * 7
Время 0 часов по отношению ко Времени 0,5 часа р < 0,05; Время 0,5 часа по отношению ко Времени 1 час р > 0,05
Время 1 час по отношению ко Времени 0 часов р = 0,01; Время 2 часа по отношению ко Времени 1 час р > 0,05
Результаты, полученные в этом эксперименте, демонстрируют, что различные составы композиции по изобретению обладают высокой способностью мукоадгезивности по отношению к буккальным клеткам. Кроме того, оценка устойчивости мукоадгезивно-защитного слоя по отношению к потоку искусственного раствора слюны позволила установить способность поддерживать хорошую мукоадгезию в течение первого часа применения.
В свете полученных результатов можно утверждать, что композиция по изобретению, демонстрирующая хорошую, устойчивую мукоадгезивность, может играть реальную защитную роль на орофарингеальную слизистую мембрану.
2. Барьерный анализ
Целью анализа является демонстрация механизма действия композиции по изобретению путем анализа ее пленкообразующей и защитной способности по сравнению с известным раздражающим агентом: используемым агентом является липополисахаридная (LPS) мембрана, классическая модель воспалительной индукции. Указанный анализ нацелен на то, чтобы подчеркнуть эффективную способность продукта ограничить контакт между слизистой оболочкой и внешними раздражающими агентами.
Выбранный раздражающий агент был выделен из клеточной мембраны Escherichia coli. Размеры LPS таковы, что позволяют рассматривать барьер как эффективный для защиты слизистой оболочки от пыли, смога, пыльцы и других веществ, вызывающих раздражение, и, следовательно, от возникновения различных патологий, отягощающих эту особую и деликатную среду.
Анализируя экспериментальный протокол более подробно, способность образца действовать в качестве барьера оценивается путем измерения продуцирования IL6, что
является следствием контакта между слоем клеток (фибробластов) и LPS. Экспериментальная система обеспечивает использование специальных трансвелл-лунок, снабженных покрытой коллагеном полупроницаемой мембраной, которая предотвращает прямой контакт между клетками, нанесенными на дно, и образцом, стратифицированным на нависающей полупроницаемой мембране, которая представляет собой единственный коммуникационный маршрут между двумя частями лунки. LPS инокулируется в пространство над образцом, в результате чего пересечение мембраны будет тем труднее, чем больше барьерный эффект, создаваемый самим образцом. Поэтому количественная оценка интерлейкинов, полученных при +24 ч от добавления LPS, дает прямое доказательство барьерного эффекта, оказываемого анализируемым образцом. Ингибирование JL6 является прямым измерением барьерного эффекта.
Барьерный эффект (BE) выражается в процентах от уменьшения высвобождения IL-6 и получается путем сравнения со значением, полученным из Положительного Контроля (С+), т.е. из клеток, обработанных только LPS в отсутствии образца.
% BE =% ингибирования полученного IL-6 (пг/мл)
Результаты, полученные в эксперименте, проведенном в трех повторах с различными вариантами выполнения композиции по изобретению, представлены в следующих таблицах. Из-за присутствия камедей в высоких концентрациях барьерный анализ проводили как на разведенном продукте 1:2,5, так и на разведенном продукте 1:5. Сначала - секретируемые клетками пикограммы IL6 после введения LPS, а в следующей Таблице сообщается о % ингибирования по сравнению с положительным контролем.
Таблица 9: Продуцирование IL6 в барьерном анализе с составом композиции по изобретению в таблетках для взрослых (твердая композиция по Примеру 3) в соответствии с примерами, представленными в разделе подробного описания изобретения.
Образец IL-6 (nr. мкл) С реднее Си. Откл.
Таблетки зля 1
В'рОСЛЫл ^
1 1 1 1
5Н?$ 1 330-41
5*1?\2 357.924 J4J.814 13.77
2,5+.PS 1 314,1^4
2.5+IPS2 шлм м^.гм т,шт
23+LPS 3 333.93 &
1:5UPS1 2л 1-027
1:5+^5 2 Ш.999 308.S4 24.752
1:5+10$ 3 315.595
1:2 S+lps 1 526."аЗ
1:2,5*LPS2 362-562 350.399 20.3 7S
1.-2.S+LPS 3 561.451
Контроль *"1 63s.705
Контроль+2 (LPS) 6^.4 99 tj?SJ6 32.55^
Контроль+3 |J"Sl 633.476
Контроль -1 (MEM) 62 328
Контра.", -2 i VЈM) оЗ.СЗЗ 64.679 3.4S
Контроль -3 (MEM) об.677
Из приведенных результатов видно, что очевидно заметное снижение концентрации ГЬ-б, полученное в экспериментах, в которых присутствует анализируемый продукт при обоих разведениях, с проявлением барьерного действия, продолжающегося во времени, эффективного также в случае частичной потери продукта из-за неспособности медленно растворять таблетку во рту.
Значение ГЬ-б, равное 64,6 пг/мкл, обнаруженное для отрицательного контроля, ассимилируется с нормальным базальным значением, то есть с невоспалительным состоянием. График на Фигуре 2 А ясно показывает защиту, оказываемую продуктом на клетки: данные выражаются в терминах Fold Over (F.O.) по сравнению с контролем С-.
Из средних значений ГЬ-б, измеренных в барьерном анализе и в положительном контроле, рассчитывается процент снижения высвобождения IL-6:
100-[(IL-6 ОБРАЗЕЦ)/IL-6C+) X100]
Таким образом, применяя формулу, получают значение снижения продуцирования ГЬ-б в присутствии анализируемого образца, которое составляет 54% при разведении 1:5 и 48% при разведении 1:2,5 по сравнению с положительным контролем, описанным в Таблице 10, для композиции по изобретению, выполненной в форме таблеток для взрослых (твердая композиция по Примеру 3), как описано в разделе подробного описания выше.
Барьерный Эффект
Образен пвгпсир
иб н Среднее Стд. Откл.
ТаолеткндлЕ взрослых
1,2 5 + lPS 1 i;i5+.PS 2 1:2 5+-PS 3 Контроль И . _•" Контроль *2 [ _ Р 51 Контроль +3 .z": ¦
.1.^2 1
53.305 51.635 46,311 46.52
0 5.4 *4й
48.155
3 002
3 015
ШШШШШШШШШШШШшШШШ
Таблица 11 Продуцирование ГЬб в барьерном анализе с составом композиции по изобретению в таблетках для детей (твердая композиция по Примеру 4) в соответствии с примерами, представленными в разделе подробного описания изобретения.
Образец [L-б (nroiK.-r) Среднее Стд. Откл.
Таблетки . 7 . : v :
для детей Эг-> аятчм utRiл г? ??
ко:-:т?о.ть KO:-:T?O~D г;о:-:т?о."з> - ¦ ^;о:-:г?о.ть : кс?:г?о.з
КОНТРО.ТЬ •
Из средних значений ГЬ-б, измеренных в барьерном анализе и в положительном контроле, рассчитывается процент снижения высвобождения ГЬ-б: 100-[(ГЬ-ОБРАЗЕЦ)/ IL-6C+)X 100]
Таким образом, применяя формулу, получают значение снижения продуцирования ГЬ-б в присутствии анализируемого образца, которое составляет 49% при разведении 1:5 и 51% при разведении 1:2,5 по сравнению с положительным контролем, приведенное в Таблице 12 для композиции по изобретению, изготовленной в виде таблеток для детей (твердая композиция по Примеру 4), как описано в разделе подробного описания выше.
Барьерный Эффект
ООрЗЗбЦ ПвГИСПрСЕаНЖг ВЫ1Б & &КК1*ВШ1 ILd °о Среднее Стд. Откл.
Таблетки ! .. '
J ля Детей , , 1 :. ¦
1/г"".-Е"И Г" 3 1 3
1 2 2 4't,?:"tj -Т> 1...Ш i '('?
"' ?. s",.-'. i H'l Vf I
Контроль -И Lf
КОНТРОЛЬ -2 . ¦ :
Контроль *3 - iJ Значения округлены до 3 десятичного знака
Таблица 13: Продуцирование ГЬб в барьерном анализе с составом композиции по изобретению в виде сильнодействующего спрея (жидкая композиция по Примеру 3) в соответствии с примерами, представленными в разделе подробного описания изобретения.
Образеи СНЛЬНОД. СИРЕЙ
ситьнод. СПРЕИ сильней СПРЕИ
КОНТРОЛЬ * 1 fif"Sf
КОНТРОЛЬ * 2 цт} КОНТРОЛЬ * J {LPS) КОНТРОЛЬ - i (MtMj КОНТРОЛЬ - 71MIM) КОНТРОЛЬ ~ * |MIW|
*mi
*tPS2
ГЬ-б (пг/мкл) Среднее
I шлш
•. -:
ызт
32Л09
тли
1.4"
Из средних значений ГЬ-б, измеренных в барьерном анализе и в положительном контроле, рассчитывается процент снижения высвобождения ГЬ-б: 100-[(ГЬ-ОБРАЗЕЦ)/ IL-6C+)X 100]
Таким образом, применяя формулу, получают значение снижения продуцирования ГЬ-б в присутствии анализируемого образца, которое составляет 39% по сравнению с положительным контролем, приведенное в Таблице 14 для композиции по изобретению, изготовленной в форме сильнодействующего спрея (жидкая композиция по Примеру 3), как описано в разделе подробного описания выше.
ОБРАЗЕЦ
СИТЬНОД. СПРЕИ - ii .
апмвд, СПРЕЙ * т г
СПЛЬНОД. СПРЕЙ ¦ LPS 3
Нвгвюврювага* Выаоооиэсжжя
1L6 "/о
41,960
СРЕДНЕ! D.S
J8.965
Таблица 15 ниже: продуцирование ГЬб в барьерном анализе с составом композиции по изобретению в виде бесспиртового спрея (жидкая композиция по Примеру 4) в соответствии с примерами, представленными в разделе подробного описания изобретения.
ОБРАЗЕЦ IL-б (пг/.чкл> СРЕДНЕЕ DS
5Е С СПИРТОВ ОЙ СПРЕЙ ¦ f'S I - . •
БЕС СПИРТОВОЙ СПРЕЙ - =• - . ¦ jn; -> 54 U о:..;
БЕС СПИР ТОВОЙ СПРЕЙ * № .i •¦ :
КОНТРОЛЬ ¦ 1 UPS;
КОНТРОЛЬ +1 {LPS) tWjhit, 676.973 МЛМ
КОНТРОЛЬ . 1 Г.РЧ
КОНТРОЛЬ - 1 (MEM) 1 .1 ч
КОНТРОЛЬ - 2 (MEM) t^JiW 64 301 3 489
КОНТРОЛЬ -1 гм[Mi * :
Из средних значений ГЬ-б, измеренных в барьерном анализе и в положительном контроле, рассчитывается процент снижения высвобождения ГЬ-б: 100-[(ГЬ-б ОБРАЗЕЦ)/ IL-6C+) X 100]
Таким образом, применяя формулу, получают значение снижения продуцирования ГЬ-б в присутствии анализируемого образца, которое составляет 56% по сравнению с положительным контролем, приведенное в Таблице 16 для композиции по изобретению, изготовленной в виде бесспиртового спрея (жидкая композиция по Примеру 4), как описано в разделе подробного описания выше.
j Оёрдма
Ишгшшрашмшт Вькжоболдевия IL6 •"
СРЕДНЕЕ
1 _БЖ€Ш^:ОШйёшШЙ_
" IPS2
S5.91H
( EFC СПИРТОВОЙ СПРЕИ
" 4Р".Ч
Для того чтобы валидировать используемый способ и убедиться, что результаты зависят только от барьерного эффекта анализируемых образцов и исключаются любые
фармакологические, иммунологические или метаболические эффекты (напр., модуляция синтеза цитокинов), барьерному анализу помогал ВНУТРЕННИЙ КОНТРОЛЬ (1С), одновременно выполняемый с каждым образцом.
В анализе 1С вначале клетки стимулируют LPS, тогда как образец добавляют к трансвелл только впоследствии: в этом случае ничтожный % ингибирования ГЬб ясно указывает на то, что присутствие анализируемой композиции обеспечивает механическую защиту, никоим образом не мешая синтезу цитокинов в клетках.
Значения концентрации ГЬ-б, измеренные в экспериментах по внутреннему контролю, где указанная обработка композицией в виде таблеток для взрослых (твердая композиция по Примеру 3) проводится после введения LPS, приведены в Таблице 17 ниже:
Fold over по сравнению с С- во Внутреннем Контролем
ОБРАЗЕЦ F.0 . (С-) Среднее (¦ 1) Стл, Откл. { }
tv"'S I 1 i А/ i
¦*L.Pb2 12,275 12.059 0,229
1 i"" S l?.07\,
1:2 *,* J'V 2 t0.c"/
l:,'rs"(f"s} I ИЛИ 0,1 ЯS
li2.5i.PS3 11.045
КОНТРОЛЬ • .- ¦ J •
KOHTPO.TD ¦ i-: -
КОНТРОЛЬ •* i iL42?
КОНТРОЛЬ HMEVj I. 099
КОНТРОЛЬ ; -VLV ".v.;,-. 1
КОНТРОЛЬ Значения округлены до 3 десятичного знака
Значения концентрации IL-6, измеренные в экспериментах по внутреннему контролю, где указанная обработка композицией в виде таблеток для детей (твердая композиция по Примеру 4) проводится после введения LPS, приведены в Таблице 18 ниже:
Fold over по сравнению с С- во Внутреннем Контроле
ОБРАЗЕЦ
F.0 . (С) Среднее ( : .) Стд. Откл.
Таблетки
-.": :
11.172
для Детей
1 015
*" *
.5 +J*-.v 1
11.593
,5*1 PS >
ii.mi
t), * ч9
^¦.Р%3
I1.H42
ко:-:т?о.7Ъ
- 1 UPS\
КОНТРОЛЬ
• "' i:P4
U> .OA?
I ?D7
КОНТРОЛЬ
" * (Lt> S|
11,4^7
КОНТРОЛЬ
- S
1 .Cm
КОНТРОЛЬ
2 iV4 V 'i
0.90S
КО НЛ PC.ЛЬ
- Я |Mf У1
Значения округлены до 3 десятичного знака
Значения концентрации ГЬ-б, измеренные в экспериментах по внутреннему контролю, где указанная обработка композицией в виде сильнодействующего спрея (твердая композиция по Примеру 3) проводится после введения LPS, приведены в Таблице 19 ниже:
ОБРАЗЕЦ
СИЛЬНОХ СПРЕЙ СИЛЬНОХ СГОЕЙ СИЛЬНОХ СПРЕЙ КОНТРОЛЬ * 1 ПК) КОНТРОЛЬ * 2 (IPS) КОНТРОЛЬ * 1 (IPS) КОНТРОЛЬ -1 (М?М> КОНТРОЛЬ - ДМЕМ) КОНТРОЛЬ -1 (МСМ)
¦ IPS I
¦ LPS 2
IL-6 (пг мкл) С РЕ ДНЕ Е ДОЛ"
м км
siSJJi
6S9S3
D.S
4 r> -51
Значения концентрации ГЬ-б, измеренные в экспериментах по внутреннему контролю, где указанная обработка композицией в форме бесспиртового спрея (жидкая
композиция по Примеру 4) проводится после введения LPS, приведены в Таблице 20 ниже:
ОБРАЗЕЦ БЕССПИРТОВОН СПРЕЙ
БЕС СПИРТОВОЙ СПРЕИ БЕ С" СПИРТ ОВОЙ СПРЕЙ
КОНТРОЛЬ *HtPil
КОНТРОЛЬ *2(mi
КОНТРОЛЬ * 3 (LPS)
КОНТРОЛЬ -1 (MIM) КОНТРОЛЬ - 2 {MIM) КОНТРОЛЬ - J(MfM)
+ LPS 2
* LPS 2
* L PS 3
IL-6 (ПГ/YIKJI) СРЕДНЕЕ
744.151
"/Sb.OOl
7ШШ7
825.721
liijii iiiSi
6S.9S3
S9 824 ЬЪ.Ш
D.S
80,223
6Л78
Установлено, что значения, полученные в этих экспериментах, являются однородными с величинами положительного контроля для барьерного анализа (в отсутствии образца) и подтверждают, что образец, введенный после введения LPS, не влияет на образование медиаторов воспаления и поэтому не имеет прямого противовоспалительного эффекта. Это лучше представлено на графиках, представленных на Фигуре 5, на которых значения IL-6, продуцируемого клетками, выражены в терминах Fold Over С.
3. Анализ DPPH на активность поглощения свободных радикалов
Антиоксидантная поглотительная активность под началом экстракта почек тополя в соответствии с настоящим описанием (полученная с использованием вышеописанного способа и имеющая вышеописанные характеристики), оценивалась с помощью анализа DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил); DPPH представляет собой окрашенный стабильный радикал: он меняет цвет при химическом взаимодействии с антиоксидантным соединением и может быть обнаружен с помощью спектрофотометрического считывания. Таким образом, целью этого анализа является демонстрация того, что анализируемые образцы обладают хорошей антиокислительной активностью, которая проводится чисто химическим способом (перенос водорода на свободный радикал) без применения фармакологических, иммунологических или метаболических механизмов, когда применяются на биологические субстраты. Проанализированный образец представляет собой экстракт почек тополя согласно настоящему описанию при концентрациях 1000, 100 и 10 мкг/мл. Активность сравнивали с активностью витамина С, используемого в качестве положительного контроля.
Как видно из Фигуры 6, экстракт почек тополя согласно изобретению обладает превосходной антиоксидантной активностью при более высоких концентрациях 1000 и 100 мкг/мл и хорошей активностью при меньшей концентрации 10 мкг/мл.
4. Анализ ингибирования образования биопленки
В методологии, применяемой в этом анализе, используется способность микроорганизмов прилипать и образовывать биопленки на лунках из пенополистирола: тогда масса биопленки будет определяться окрашиванием Кристаллического-фиолетового. Бактерия, используемая в анализе, является наиболее частой инфекцией слизистой оболочки глотки, т.е. Streptococcus pyogenes; анализируемый образец представляет собой экстракт почек тополя в соответствии с настоящим описанием (можно получить с помощью вышеописанного способа и с вышеописанными характеристиками). Первая фаза анализа состоит в оценке минимальной ингибирующей концентрации (MIC), т.е. Самой низкой концентрации, ингибирующей рост микроорганизмов. В качестве положительного контроля был выбран антибиотик гентамицин. Во второй фазе измеряется способность ингибировать образование биопленки; анализируемые образцы добавляют к среде в концентрациях, равных или меньших, чем MIC, для того чтобы исключить то, что активность антибиопленки можно приписывать ингибированию роста микроорганизмов. После соответствующего периода инкубации образовавшаяся биопленка окрашивалась Кристаллическим-фиолетовым; после окрашивания избыток красителя удаляли водой, а приклеившееся к биопленке растворяли в этаноле. Полученный раствор анализировали спектрофотометром при 570 нм: интенсивность поглощения в этом анализе будет тем больше, чем больше будет сформирована масса биопленки; соответственно, антибиопленочная активность и записанная абсорбция обратно пропорциональны друг другу. Для каждого образца использовались концентрации lx MIC, 0,5 xMIC и 0,1 MIC. Представленные данные являются средними по 9 измерениям, выполненным в трех повторах. Статистическая значимость, рассчитанная с помощью t-теста, * р <0,01 и **р <0,001 (обработанные бактерии против необработанных бактерий). Анализ показывает, как экстракт по изобретению более эффективен по сравнению со стандартным 50% водно-спиртовым экстрактом.
5. Сравнительный анализ мукоадгезии и устойчивости к стиранию между композицией в соответствии с изобретением в различных вариантах ее выполнения и прополисным спреем
5.
Прополисный спрей
деионизированная вода в % 33
прополис d.e. мульти-ф. % 41,6
растительный глицерин а % 55
эфирное масло лимона % 0,1
Бесспиртовой прополисный спрей
деионизированная вода в % 57,2
прополиса лиоф. экстракт е % 4
ВИПГНЕВЫЙ АРОМАТИЗАТОР нат. р % 0,8
клубничный натуральный ароматизатор % 1,2
осветленный сок лимона % 1,8
растительный глицерин а % 35
Анализы проводили, как описано выше для примера 1, анализируя композиции по изобретению и прополисный спрей при различных разведениях.
Таблица 22
Данные, представленные в таблицах, показывают, что прежде всего при более высоких разведениях композиции по изобретению обладают большим мукоадгезивным эффектом по сравнению с прополисом.
Таблетки для детей
Прополисный спрей
МУк'ОАДГЕ ШЯ
Разведенный 12 62.8 1 4 S Разведенный 15 47.1 1 3.5
Неразведенный Разведенным 1 2 57 5^31 Разведенный I S • Чь В т 5> 0
Сопротивление
старанию
Разведенный 1.2 ' 62.6 S. 45 30мш 57.81 4,7 бОмнн51.2 3 2.9
120ш" 3S 1 i 13
Разведенный 1 ? 57 5 1 3 1
Ю мин " 4 г J i 60 мин52 S ; 2 7 120 мин 34 1 Т. 1 ь
Таблица 23
СИЛЬНОДЕЙСГВЭТОЩИП СПРЕЙ
Прополисный спрей
МУКО АДГЕЗИЯ
Неразведенный 76 3 ± S 4 Разведенный ,12 оо 4 г 6 i Разведенный I 5 54 6 г Ъ 1
Неразведенный Разведенный 12 5? 5 * J.i
Разведенный 1 Ъ - 36 8 t 5 0
Сопротивление
стиранию
Разведенный 1:2 66,4*6,1 30 мин oJ 6 ¦ 5 3 60 мин 5 J 6 ? J S
Шмин 4J J j 4,4
Разведенный 12 Ы Ы. i 1
30 мин S4 4 12.1
60 шм 52 5 t 2 7
ПО mm 34,1 ; из
Таблица 24
Бесспнртовой спрей
Прополисный спрей
ЫУКОАД1ЕЗИЯ
Неразведенный ... z 2 " ^Неразведенный Разведенный i "" vi .;: ; ! {Разведенный 1 2 ;-- ' !. г ; i
Разведенный I : 2 0 Разведенный L.J " : Ь J
1
Сопротивление стиранию
-
Разведенный ; ? v \ "' - Ч. i [Разведенный 1 2 - \ 1
30 мин . 51 В t 4 0 30 мин 54 4 t 2 Л 60 мин Л " '-• г > - 7 60мш5^ : * J '' 120 мин 41,4 13 4 J 120 мин 34,1 ±16
Как видно из вышеприведенных анализов, анализируемые композиции демонстрируют в любом варианте выполнения (твердое вещество, спрей со спиртом, спрей без спирта), что экстракт почек тополя обладает мукоадгезивной способностью, большей, чем у прополиса, в частности, заметной при более высоких разведениях анализируемых продуктов, что видно из данных, полученных с разведениями 1:5.
6. Приготовление водно-спиртового мультифракционного экстракта
Почки черного тополя (Populus nigra) были фрагментированы и подвергнуты двум этапам экстракции в экстракторе, снабженном механической мешалкой, в этаноле при пониженных концентрациях, с выполнением первой стадии с 85% этанолом и второй стадии с 13% этанолом. Используемое соотношение D/S составляет 1:6. Температура экстракции составляет 40°С. Продолжительность экстракции с 85° этанолом составляет 8 ч, продолжительность экстракции с 13° этанолом составляет 8 часов.
Спиртовые экстракты, полученные, как описано, соединяли в соотношении 50:50. Смешивание предусматривало добавление 13° спиртового экстракта в 85° спиртовой экстракт (со скоростью добавления, равной 16 л/мин). Смешивание проводили при 20±5°С. По окончании добавления смесь подвергали декантации в течение 72 часов при 20±5°С, затем супернатант извлекали и дополнительно фильтровали на панельном фильтре, снабженном целлюлозным фильтром с отсечением 30 мкм. В конце фильтрования проверяется градус спирта и регулируется до 62°±1° спиртовых градусов.
7. Получение лиофилизированного мультифракционного экстракта
Очищенный спиртовой экстракт, полученный, как описано в Примере 1, без коррекции градусов спирта, концентрируют путем выпаривания этанола с использованием системы тонкопленочной дистилляции в соответствии со стандартным протоколом, предусматривающим подачу экстракта, который должен быть сконцентрирован, при скорости потока около 500 л/ч; операцию проводят путем установки остаточного вакуума 0,6-0,8 бар, а температуру жидкости, нагревающую стенки испарителя, доводят до 140° С, в результате чего после удаления этанола получают концентрированный водный экстракт. Полученный таким образом водный экстракт подвергали лиофилизации.
8. Получение лиофилизированного многокомпонентного экстракта,
нанесенного на аравийскую камедь
Осветленный спиртовой экстракт, полученный, как описано в Примере 1, смешивают с аравийской камедью и подвергают концентрированию и лиофилизации, как описано в Примере 2.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, содержащая экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,1 до 70% и один или более фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, ароматизаторов, консервантов для применения, для применения в лечении полости ротоглотки, мочевого аппарата, пищеварительного/выделительного аппарата, поражений кожи и бактериальных инфекций.
2. Композиция для применения по п. 1, в которой указанный экстракт почек тополя содержится в процентах по массе от 0,3 до 45%.
3. Композиция для применения по п. 1 или 2, содержащая: Экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,1 до 70% Эксципиенты в процентах по массе от 1 до 80% Растворители в процентах по массе от 0 до 80%
Натуральные или лиофилизированные фруктовые соки в процентах по массе от 0 до 50% Натуральные или искусственные ароматизаторы в процентах по массе от 0,05 до 2% Эфирные масла в процентах по массе от 0,01 до 1%.
4. Композиция для применения по п. 1 или 2, содержащая: Сухой экстракт почек тополя в процентах по массе от 0,5 до 10% Эксципиенты в процентах по массе 10-97%
Природные или искусственные ароматизаторы в процентах по массе от 0,5 до 3% Эфирные масла в процентах по массе от 0,05 до 1%
Порошкообразные или лиофилизированные фруктовые соки и/или натуральные экстракты в процентах по массе от 0,5 до 15% Подсластители в процентах по массе от 1 до 10%.
5. Композиция для применения по любому одному из п. 1,2 или 3, состоящая из
компонент
%мас.
ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
0,70
КСАНТАНОВАЯ КАМЕДЬ
1,00
ВОДА
55,40
ПЕРСИКОВЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,40
ЛИМОННЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,10
ОСВЕТЛЕННЫЙ СОК ЛИМОНА
1,40
СЪЕДОБНЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН, В КГ
15,00
АПЕЛЬСИНОВЫЙ СОК
26,00
ОБЩЕЕ
100,00
или
компонент
%мас.
ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
1,00
ГУАРОВАЯ КАМЕДЬ
1,00
ВОДА
55,10
ПЕРСИКОВЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,40
ЛИМОННЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,10
ОСВЕТЛЕННЫЙ СОК ЛИМОНА
1,40
СЪЕДОБНЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН, В КГ
15,00
АПЕЛЬСИНОВЫЙ СОК
26,00
ОБЩЕЕ
100,00
или
компонент
%мас.
ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЙ ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
0,55
АРАВИЙСКАЯ КАМЕДЬ
4,95
ВОДА
51,30
ВИШНЕВЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,20
КЛУБНИЧНЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,60
ОСВЕТЛЕННЫЙ СОК ЛИМОНА
1,40
СЪЕДОБНЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН, В КГ
35,00
ОСВЕТЛЕННЫЙ ЯБЛОЧНЫЙ СОК. КОНЦ 70BIX
6,00
ОБЩЕЕ
100,00
или
компонент
%мас.
62,7° СПИРТОВОЙ ЭКСТРАКТ ПОЧЕК ТОПОЛЯ
39,76
ДЕИОНИЗИРОВАННАЯ ВОДА
3,92
РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛИЦЕРИН
55,70
ЭФИРНОЕ МАСЛО ЛИМОНА
0,01
ЭФИРНОЕ МАСЛО СЛАДКОГО АПЕЛЬСИНА
0,01
ЦИТРУСОВЫЙ НАТУРАЛЬНЫЙ АРОМАТИЗАТОР
0,60
ОБЩЕЕ
100,00
где указанная композиция находится в жидкой форме.
6. Композиция для применения по любому одному из п. 1,2 или 4, состоящая из
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
5,00
Маннит
46,14
Камедь тары
6,56
Инулин
38,60
Лиофилизированный сок малины
0,40
Лиофилизированный сок персика
2,50
Лимонный натуральный ароматизатор
0,80
Вишневый натуральный ароматизатор
Лиофилизированный экстракт мальвы
0,8
Общее
100,00
1ЛИ
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
10,00
Сорбит
46,14
Гуаровая камедь
1,56
Инулин
15,00
Лиофилизированный сок лимона
0,40
Лиофилизированный сок апельсина
25,00
Лимонный натуральный ароматизатор
0,80
Малиновый натуральный ароматизатор
1,10
Лиофилизированный экстракт мальвы
0,8
Общее
100,00
или
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
1,08
Коричневый сахар
71,5
Аравийская камедь
10,82
Мёд
Экстракт лайма (дерево)
1,5
Лиофилизированный сок апельсина
10,5
Апельсиновый ароматизатор
1,5
Лимона ЭМ
Общее
100
или
компонент
%мас.
Лиофилизированный экстракт почек тополя
1,14
Коричневый сахар
83,5
Аравийская камедь
6,56
Инулин
1,6
Лиофилизированный сок клубники
2,4
Лиофилизированный сок бузины
Клубничный натуральный ароматизатор
Вишневый натуральный ароматизатор
Лиофилизированный экстракт лайма (дерево)
0,8
Общее
100,00
где указанная композиция находится в твердой форме.
7. Композиция для применения по любому одному из пп. 1-6, где указанные поражения полости ротоглотки выбраны из болей в горле, фарингита, афты, воспаления или инфекции полости рта.
8. Композиция для применения по любому одному из пп. 1-7, где указанные поражения пищеварительного/выделительного аппарата выбраны из гастрита, рефлюкса, воспалительных заболеваний кишечника, синдрома раздраженного кишечника, геморроя, инфекций.
9. Композиция для применения по любому одному из пп. 1-8, где указанными бактериальными инфекциями являются инфекции, вызванные одним или более из Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.
10. Композиция для применения по п. 9, в которой указанные инфекции S. pyogenes выбраны из фарингита, скарлатины, пиодермии или импетиго, рожи, целлюлита, некротизирующего фасцита, синдрома стрептококкового токсического шока, бактериемии, острой ревматической лихорадки, острого гломерулонефрита, узелковой эритемы, P.A.N.D.A.S (Педиатрических Аутоиммунных Нейропсихиатрических Расстройств, Связанных со Стрептококковыми инфекциями), синдрома хронической усталости (CFS), фибромиалгии, Синдрома доброкачественной фасцикуляции (BFS).
11. Композиция для применения по любому одному из пп. 1-10, в которой указанный экстракт из почек тополя представляет собой экстракт, полученный способом, включающим следующие стадии:
a. приготовление водно-спиртового экстракта почек тополя путем экстракции 85° этанолом
b. приготовление водно-спиртового экстракта почек тополя путем экстракции 13° этанолом
c. получение мультифракционного спиртового экстракта путем смешивания экстрактов, полученных в а. и Ь.
d. декантирование и/или центрифугирование и фильтрование указанного спиртового экстракта (с), сбор супернатанта
e. отфильтрованный супернатант, полученный в d., подвергают концентрированию и лиофилизации и, необязательно,
f. в отфильтрованный супернатант, полученный в d., добавляют натуральную камедь и затем подвергают концентрированию и лиофилизации.
12. Композиция по любому одному из пп. 1-11 в форме порошка, таблетки, капсулы, твердой или мягкой желатиновой, сиропа, аэрозоля, суспензии.
да •
40 20
Разведенный 1:2.5 ржведШНЫЙ 1;5 Фиг. 1А
41
4.)
Неражед!
Разведенный
Разведенный '
Фиг. 1С
73.2
51,6
Керазвер.'
Разведенный
1:2
Разведенный
фиг. Ш
68.3
57.2
S03
0 т ш ¦
Время 1ч ВреМЯ2' фиг. 2А
фиг. 2В
С+ Ti &iiTTK Вi. < Тхокитн В; ¦¦
Фиг. ЗВ
12,0
8,0 4 ШШШт
1,0 J ¦внн
10,523
4,0 А ЩШШ
2,0 \ ШШШ
0,0
5лгв
С* С- Спрей for
Фиг. ЗС
12,0
Cf с- Спрей без спирта
;J.-5
Т"5п"тги В г
Фиг. 4В
so 70,0 5 60,0
1АРЖЕРИЫИ АНАЛИЗ
[J 40,0
О ".о
ffl
10,0 10,0
J3.0f-b
С- Спрей for.
Фиг. 4С
70,0
о со
БАРЬЕРНЫЕ АНАЛИЗ
о с
. . ..шшшвшшшшш
Спрей Ьез стерта
Фиг. 4D
Габкегги л j 5 Табпаши
а -
4:2,5
Табпгткк В;. s Та5п=гки В
Фиг. 5В
16,0 14,0 12,0 10 0
8,0 I
6,0
4,0
20 -
0,0
12,52
12,72
1*3
12.3
ia з
1,0
*0 2.0 33
Фиг. 5 С
С npeii for.
С- Спрей Ьез спирта
7/8
Jit*""
в 1000 ЖЕГ/МЛ И 100 мкг/мл 10 мкг/мл
Почки тополя Аскорбиновая
кислота
Фиг. 6
1-10 1Л1 !Ш 80 60 40 70 0
Экстракт
по изобретению
Экстракт почек тополя EFM 50*М
¦Н §¦¦( jjij
_MH.I
О m
#° #
Фиг. 7
(19)
(19)
(19)
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Фиг. 3D
Фиг. 3D
Фиг. 3D
Фиг. 3D
Фиг. 3D
Фиг. 3D
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5А
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
Фиг. 5D
