EA201892343A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201892343 Полный текст описания [**] EA201892343 20170413 Регистрационный номер и дата заявки US62/323,228 20160415 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2017/027317 Номер международной заявки (PCT) WO2017/180813 20171019 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] НОВЫЕ В7-Н3 СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа [8] A61K 39/395, [8] A61K 47/68, [8] C07K 16/28 Индексы МПК [US] Лу Дерик Т., [US] Хуан Лин, [US] Джонсон Лесли С., [US] Сон Томас, [US] Скрибнер Джунипер, [US] Бонвини Эзио Сведения об авторах [US] МЭКРОУДЖЕНИКС, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201892343a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение направлено на новые B7-H3-связывающие молекулы, способные связываться с B7-H3 человеческой и нечеловеческой природы, и в частности на такие молекулы, которые являются перекрестно-реактивными с B7-H3 приматов, отличных от человека (например, яванского макака). Изобретение дополнительно относится к B7-H3-связывающим молекулам, которые включают вариабельные домены легкой цепи и/или вариабельные домены тяжелой цепи (VH), которые были гуманизированы и/или деиммунизированы для того, чтобы проявлять сниженную иммуногенность при введении объектам-реципиентам. Изобретение, в частности, относится к биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим B7-H3-связывающим молекулам, включая биспецифические диатела, BiTE, биспецифические антитела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д., которые включают (i) такие B7-H3-связывающие вариабельные домены и (ii) домен, способный связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают любую из таких B7-H3-связывающих молекул, и к способам, связанным с применением любой из таких B7-H3-связывающих молекул при лечении рака и других заболеваний и состояний. Изобретение также, в частности, относится к молекуле, которая включает домен, связывающий B7-H3 человека, гуманизированного антитела против B7-H3 человека, конъюгированной по меньшей мере с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение направлено на новые B7-H3-связывающие молекулы, способные связываться с B7-H3 человеческой и нечеловеческой природы, и в частности на такие молекулы, которые являются перекрестно-реактивными с B7-H3 приматов, отличных от человека (например, яванского макака). Изобретение дополнительно относится к B7-H3-связывающим молекулам, которые включают вариабельные домены легкой цепи и/или вариабельные домены тяжелой цепи (VH), которые были гуманизированы и/или деиммунизированы для того, чтобы проявлять сниженную иммуногенность при введении объектам-реципиентам. Изобретение, в частности, относится к биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим B7-H3-связывающим молекулам, включая биспецифические диатела, BiTE, биспецифические антитела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д., которые включают (i) такие B7-H3-связывающие вариабельные домены и (ii) домен, способный связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают любую из таких B7-H3-связывающих молекул, и к способам, связанным с применением любой из таких B7-H3-связывающих молекул при лечении рака и других заболеваний и состояний. Изобретение также, в частности, относится к молекуле, которая включает домен, связывающий B7-H3 человека, гуманизированного антитела против B7-H3 человека, конъюгированной по меньшей мере с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.


Евразийское (21) 201892343 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.13
(51) Int. Cl.
A61K 39/395 (2006.01) A61K 47/68 (2017.01) C07K16/28 (2006.01)
(54) НОВЫЕ В7-Н3 СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 62/323,228; 62/323,249; 62/432,314
(32) 2016.04.15; 2016.04.15; 2016.12.09
(33) US
(86) PCT/US2017/027317
(87) WO 2017/180813 2017.10.19
(71) Заявитель: МЭКРОУДЖЕНИКС, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Лу Дерик Т., Хуан Лин, Джонсон Лесли С., Сон Томас, Скрибнер Джунипер, Бонвини Эзио (US)
(74) Представитель:
Бадаева Т.Н., Фелицына С.Б. (RU)
(57) Настоящее изобретение направлено на новые В7-Н3-связывающие молекулы, способные связываться с B7-H3 человеческой и нечеловеческой природы, и в частности на такие молекулы, которые являются перекрестно-реактивными с B7-H3 приматов, отличных от человека (например, яванского макака). Изобретение дополнительно относится к B7-H3-связывающим молекулам, которые включают вариабельные домены легкой цепи и/ или вариабельные домены тяжелой цепи (VH), которые были гуманизированы и/или деиммунизиро-ваны для того, чтобы проявлять сниженную имму-ногенность при введении объектам-реципиентам. Изобретение, в частности, относится к биспеци-фическим, триспецифическим или мультиспеци-фическим B7-H3-связывающим молекулам, включая биспецифические диатела, BiTE, биспецифи-ческие антитела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д., которые включают (i) такие B7-H3-связывающие вариабельные домены и (ii) домен, способный связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают любую из таких B7-H3-связывающих молекул, и к способам, связанным с применением любой из таких B7-Ю-связывающих молекул при лечении рака и других заболеваний и состояний. Изобретение также, в частности, относится к молекуле, которая включает домен, связывающий B7-H3 человека, гуманизированного антитела против B7-H3 человека, конъюгированной по меньшей мере с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к I способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.
Исследование эффективности множественной дозы
1811536
НОВЫЕ В7-НЗ СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ ИХ
ПРИМЕНЕНИЯ
Перекрестная ссылка на связанные заявки
[0001] Эта заявка испрашивает приоритет по патентным заявкам США № 62/432314 (подана 9 декабря 2016 г.; рассматривается), 62/323249 (подана 15 апреля 2016 г.; рассматривается), 62/323228 (подана 15 апреля 2016 г.; рассматривается) каждая из которых включена в настоящее описание ссылкой в полном объеме.
Ссылка на перечень последовательностей
[0002] Это заявка включает один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 CFR 1.821 и далее, которые раскрываются на машиночитаемых носителях (название файла: 1301_0143-0144PCT_ST25.txt, создан 28 марта 2017 года и имеет размер 104 762 байта), который включен в настоящее описание ссылкой в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
[0003] Настоящее изобретение направлено на новые В7-НЗ-связывающие молекулы, способные связывать В7-НЗ человеческой природы и нечеловеческой природы, и в частности на такие молекулы, которые являются перекрестно-реактивными с В7-НЗ приматов, отличных от человека {например, яванского макака). Изобретение дополнительно относится к В7-НЗ-связывающим молекулам, которые включают вариабельные домены легкой цепи и/или вариабельные домены тяжелой цепи (VH), которые были гуманизированы и/или деиммунизированы для того, чтобы проявлять сниженную иммуногенность при введении объектам-реципиентам. Изобретение, в частности, относится к биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, включая биспецифические диатела, BiTE, биспецифические антитела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д. которые включают: (i) такие В7-НЗ-связывающие вариабельные домены и (ii) домен, способный связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают любую из таких В7-НЗ-связывающих молекул, и к способам, связанным с применением любой из таких В7-НЗ-связывающих молекул при лечении рака и других заболеваний и состояний. Изобретение также, в частности, относится к молекуле, которая включает домен, связывающий В7-НЗ человека, гуманизированного антитела против В7-НЗ
человека, конъюгированного, по меньшей мере, с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний. Предшествующий уровень техники
[0004] Рост и метастазирование опухолей во многом зависят от их способности уклоняться от иммунного надзора хозяина и преодолевать защиту хозяина. Большинство опухолей экспрессируют антигены, которые могут быть распознаны в значительной степени иммунной системой хозяина, но во многих случаях неадекватный иммунный ответ возникает из-за неэффективной активации эффекторных Т-клеток (Khawli, LA et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328).
I. Суперсемейство B7 и B7-H3
[0005] B7-H3 является представителем суперсемейства B7-CD28 и экспрессируется на антигенпредставляющих клетках. Он связывается с Т-клетками, однако контр-рецептор В7-НЗ на поверхности таких Т-клеток еще не полностью охарактеризован.
[0006] В7-НЗ уникален тем, что основная человеческая форма содержит два внеклеточных домена с тандемами IgV-IgC {т.е. IgV-IgC-IgV-IgC) (Collins, М. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). Хотя первоначально предполагалось, что он содержит только 2 домена Ig (IgV-IgC), был идентифицирован вариант с четырьмя внеклеточными иммуноглобулиновыми доменами ("4Ig-B7-H3") и он был признан более распространенной формой белка в человеке (Sharpe, АН et al, (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Однако естественная форма у мышей (2Ig) и форма 4Ig у человека демонстрируют сходную функцию (Hofmeyer К. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278). Молекула 4Ig-B7-H3 ингибирует опосредованный NK-клетками лизис раковых клеток (Castriconi, R. et al. "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645). Сообщается, что B7-H3 человека (форма 2Ig) способствует активации Т-клеток и продуцированию IFN-у путем связывания с предполагаемым рецептором на активированных Т-клетках (Chapoval, A. et al. (2001) "В7-НЗ: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production," Nature Immunol. 2:269-274), однако более поздние исследования указывают на ингибирующую роль В7-НЗ мыши и В7-НЗ человека (Prasad, D. V., et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells, J Immunol. 173:2500-2506; Leitner, J., et al. (2009)
"В7-НЗ Is A Potent Inhibitor Of Human T-Cell Activation: No Evidence For B7-H3 And TREML2 Interaction" Eur. J. Immunol. 39:1754-1764; Veenstra, R.G., et al. (2015) "B7-H3 expression in Dnor T Cells and Host Cells Negatively Regulates Acute Graft-Versus-Host Disease Lethality" Blood 125:3335-3346.). Экспрессия мРНК B7-H3 была обнаружена в клетках сердца, почки, яичка, легкого, печени, поджелудочной железы, предстательной железы, толстой кишки и в остеобластах (Collins, М. et al. (2005) "The В7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). На уровне белка B7-H3 обнаруживается в печени, легких, мочевом пузыре, яичке, предстательной железе, молочной железе, плаценте и лимфоидных органах человека (Hofmeyer К. et al. (2008) "The Contrasting Role OfB7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).
[0007] Хотя B7-H3 не экспрессируется в покоящихся В или Т-клетках, моноцитах или дендритных клетках, он индуцируется на дендритных клетках с помощью IFN-y и на моноцитах с помощью GM-CSF (Sharpe, АН et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Механизм действия B7-H3 является сложным, и сообщается, что белок опосредует как костимуляцию, так и коингибирование Т-клеток (Hofmeyer К. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity " Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Mol. Med. 83:193-202). B7-H3 связывается с еще неидентифицированным рецептором(ами), опосредуя коингибирование Т-клеток. Кроме того, В7-НЗ через взаимодействия с неизвестным рецептором(ами) является ингибитором NK-клеток и остеобластов (Hofmeyer К. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278). Ингибирование может действовать посредством взаимодействий с представителями основных сигнальных путей, через которые рецептор Т-клеток (TCR) регулирует транскрипцию генов {например, факторы NFTA, NF-кВ ИЛИ АР-1). Считается, что В7-НЗ ингибирует ТЫ, Th2 или Thl7 in vivo (Prasad, DV et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells," J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) "B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice," Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 AndB7-H4," Immunol. Rev. 229:145-151).
П. В7-НЗ-экспрессирующие опухоли
[0008] Известно также, что В7-НЗ экспрессируется в различных раковых клетках {например, нейробластомы, раках желудка, яичника, немелкоклеточного рака легкого и т.д., см., например, Modak, S., et al. (2001) "Monoclonal antibody 8H9 targets a novel cell
surface antigen expressed by a wide spectrum of human solid tumors" Cancer Res 61:4048-54) и культивируемых раковыхх клетках. Несколько независимых исследований показали, что раковые клетки человека проявляют заметное увеличение экспрессии белка В7-НЗ и что эта повышенная экспрессия связана с повышенной тяжестью заболевания (Zang, X. et al.
(2007) "The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition" Clin. Cancer Res. 13:5271-5279; Sun, Y., et al. (2006) "B7-H3 andB7-H4 expression in non-small-cell lung cancer" Lung Cancer 53:143-51; Tekle, C, et al. (2012) "B7-H3 Contributes To The Metastatic Capacity Of Melanoma Cells By Modulation Of Known Metastasis-Associated Genes" Int. J. Cancer 130:2282-90; Wang, L., et al. (2013) "B7-H3 Mediated Tumor Immunology: Friend Or Foe?" Int. J. Cancer 134(12):2764-2771), что подтверждает, что B7-H3 используется опухолями в качестве пути ухода из под иммунологического надзора (Hofmeyer, К. et al.
(2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 1027710278).
[0009] Экспрессия белка B7-H3 также была иммуногистологически обнаружена в линиях опухолевых клеток (Chapoval, A. et al. (2001) "В7-НЗ: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production" Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation" Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Mather, J. et al, WO 2004/001381; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes" J. Immunol. 168:6294-6297).
[0010] Роль B7-H3 в ингибировании иммунной системы и увеличение экспрессии В7-НЗ на опухолях человека предполагает, что эта молекула может служить терапевтической мишенью для лечения рака. Таким образом, было предложено применение анти-В7-НЗ антител и других молекул, которые модулируют экспрессию В7-НЗ, для лечения опухолей и/или положительной модуляции иммунного ответа (см. Loo, D. et al. (2012) "Development of an Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody with Potent Antitumor Activity" Clin Cancer Res; 18: 3834-3845; Ahmed, M. et al (2015) "Humanized Affinity-Matured Monoclonal Antibody 8H9 Has Potent Anti-Tumor Activity and Binds to FG Loop of B7-H3" J. Biol. Chem. 290: 30018-30029; Nagase-Zembutsu, A. et al. (2016) "Development of DS-5573a: A novel afucosylated monoclonal antibody directed at B7-H3 with potent antitumor activity" Cancer Sci. 2016, doi: 10.1111/cas. 12915; Modak, S. et al. (March 1999) "Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And
Rhabdomyosarcoma (RMS)" Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40:474 (90th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999; Modak, S. et al. (March 2000) "Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9," Proc. Am. Assoc. Cancer Res.41:724; Modak, S. et al. (2001) "Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors" Cancer Res. 61(10):4048-4054; Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains" J. Immunol. 172(4):2352-2359; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors" Cancer Res. 69(15):5275-6281; см. также пат. США № 7,279,567, 7,358,354, 7,368,554, 7,527,969,7,718,774, 8,216,570, 8,779,098, 8,802,091, 9,150,656, публ. пат. США № 2002/0168762; 2005/0202536, 2008/0081346, 2008/0116219, 2009/0018315, 2009/0022747, 2009/0087416, 2013/0078234, 2015/0274838, публ. РСТ № WO 2008/066691; WO 2006/016276; WO 2008/116219; WO 04/001381, WO 2001/094413, WO 2002/10187, WO 2002/32375, WO 2004/093894, WO 2006/016276,WO 2008/116219,WO 2011/109400; и ЕР 1292619В.
[0011 ] Несмотря на все такие предварительные успехи, существует потребность в дополнительных терапевтических агентах, которые нацеливаются и убивают опухолевые клетки, экспрессирующие В7-НЗ. Настоящее изобретение призвано решить эту и другие задачи.
Сущность изобретения
[0012] Настоящее изобретение направлено на новые В7-НЗ-связывающие молекулы, способные связываться с В7-НЗ человеческой и нечеловеческой природы, и в частности с такими молекулами, которые являются перекрестно-реактивными с В7-НЗ приматов, отличных от человека (например, яванского макака). Изобретение дополнительно относится к молекулам связывания В7-НЗ, которые включают вариабельные домены легкой цепи и/или вариабельные домены тяжелой цепи (VH), которые были гуманизированы и/или деиммунизированы для того, чтобы они проявляли сниженную иммуногенность при введении объектам-реципиентам. Изобретение, в частности, относится к биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, включая биспецифические диатела, BiTE, биспецифические антитела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д. которые включают: (i) такие В7-НЗ-связывающие вариабельные домены и (И) домен, способный связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки.
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают любую из таких В7-НЗ-связывающих молекул, и к способам, связанным с применением любой из таких В7-НЗ-связывающих молекул при лечении рака и других заболеваний и состояний. Изобретение также, в частности, относится к молекуле, которая включает домен, связывающий В7-НЗ человека из гуманизированного антитела против В7-НЗ человека, конъюгированного, по меньшей мере, с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.
[0013] В частности, один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает молекулу, связывающую В7-НЗ, которая включает вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), в котором упомянутый домен вариабельной цепи содержит домен CDRHI, домен CDRH2 И домен CDRH3, а указанный вариабельный домен легкой цепи содержит домен CDRLI, домен CDRL2 И домен CDRL3, В котором, по меньшей мере, три из указанных доменов, по меньшей мере, четыре из указанных доменов, по меньшей мере, пять из указанных доменов или все указанные домены выбраны из группы, состоящей из:
(1) домен CDRHI, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;
(2) домен CDRH2, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;
(3) домен CDRH3, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29;
(4) Домен CDRLI, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23;
(5) домен CDRL2, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и
(6) домен CDRL3, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. [0014] Изобретение дополнительно относится к воплощению такой В7-НЗ-
связывающей молекулы, которая включает указанный вариабельный домен легкой цепи (VL), который включает домен CDRLI, домен CDRL2 И домен CDRL3 И указанный вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который включает домен CDRHI, домен CDRH2 и домен CDRH3, где:
(1) указанный домен CDRHI включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;
(2) указанный домен CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;
(3) указанный домен CDRH3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
[0015] Изобретение дополнительно относится к воплощению такой В7-НЗ
связывающей молекулы, которая включает указанный вариабельный домен легкой цепи (VL), который включает домен CDRLI, домен CDRL2 И домен CDRL3 И указанный вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который включает домен CDRHI, домен CDRH2 и домен CDRH3, где:
(1) указанный домен CDRLI включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 23;
(2) указанный домен CDRL2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и
(3) указанный домен CDRL3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
[0016] Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где указанный вариабельный домен тяжелой цепи (VH) включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 26 или SEQ IDNO: 31.
[0017] Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где указанный вариабельный домен легкой цепи (VL) включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 30.
[0018] Изобретение дополнительно относится к В7-НЗ-связывающим молекулам, которые включают домен VL и домен VH, где указанный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 20.
[0019] Изобретение дополнительно относится к В7-НЗ-связывающим молекулам, которые включают домен VL и домен VH, где указанный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 21.
[0020] Изобретение дополнительно относится к В7-НЗ-связывающим молекулам, которые включают домен VL и домен VH, где указанный домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, а указанный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 21.
[0021] Изобретение также относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где молекула представляет собой антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент. Изобретение также относится к воплощениям такой В7-НЗ-связывающей молекулы, где молекула представляет собой биспецифическое антитело или диатело, особенно диатело или комплекс диатела, которые содержат две, три, четыре или пять полипептидных цепей, каждая из которых имеет N-конец и С-конец, где такие полипептидные цепи связаны друг с другом через одну или несколько ковалентных связей, и особенно одну или несколько ковалентных дисульфидных связей. Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где
молекула представляет собой трехвалентную связывающую молекулу, и особенно в которой трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит три, четыре, пять или более полипептидных цепей. Изобретение также относится к воплощению такой В7-НЗ-связывающей молекулы, где молекула включает домен Fc. Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где молекула представляет собой диатело и включает домен, связывающий альбумин, и, в частности, деиммунизированный домен, связывающий альбумин.
[0022] Изобретение также относится к воплощениям всех таких В7-НЗ-связывающих молекул, которые дополнительно содержат домен Fc, и особенно где домен Fc является вариантным доменом Fc, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, уменьшающих аффинность вариантного домена Fc для FcyR и/или увеличивающих период полувыведения в сыворотке В7-НЗ-связывающей молекулы, а более конкретно, где модификации включают, по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из:
(a) L234A;
(b) L235A;
(c) L234AHL235A;
(d) M252Y; M252Y и S254T;
(e) M252Y и Т256Е;
(f) M252Y, S254T и Т256Е; и
(g) K288D иН435К;
где нумерация - это индекс EU, как у Kabat.
[0023] Изобретение также относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где молекула является биспецифичной, и особенно относится к воплощению, в котором молекула содержит два эпитопсвязывающих сайта, способных к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом В7-НЗ и два эпитопсвязывающих сайта, способных к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки, или к воплощению, в котором молекула содержит один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом В7-НЗ и один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки.
[0024] Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где молекула представляет собой трехвалентную связывающую молекулу и, в частности, относится к воплощениям, в которых молекула содержит один
эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом В7-НЗ, один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом первой молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки; и один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом второй молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки, причем такие первая и вторая молекулы не являются В7-НЗ.
[0025] Изобретение далее относится к воплощению такой В7-НЗ-связывающей молекулы, где молекула способна одновременно связываться с В7-НЗ и со вторым эпитопом и, в частности, относится к воплощению, в котором второй эпитоп является эпитопом второй молекулы присутствующей на поверхности эффекторной клетки (особенно в которой второй эпитоп представляет собой эпитоп CD2, CD3, CD8, CD 16, TCR или NKG2D и наиболее конкретно, где второй эпитоп является эпитопом CD3). Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где эффекторные клетки представляют собой цитотоксическую Т-клетку или клетку-естественный киллер (NK). Изобретение дополнительно относится к воплощению таких В7-НЗ-связывающих молекул, где молекула также способна связывать третий эпитоп и, в частности, относится к воплощению, в котором третий эпитоп является эпитопом CD8. Изобретение также относится к воплощениям таких молекул, где молекула опосредует координированное связывание клетки, экспрессирующей В7-НЗ, и цитотоксической Т-клетки.
[0026] Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество любой из вышеописанных В7-НЗ-связывающих молекул, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
[0027] Изобретение дополнительно направлено на применение любой из вышеописанных В7-НЗ-связывающих молекул, при лечении заболевания или состояния, связанного с В7-НЗ или характеризуемого экспрессией В7-НЗ, или способ лечения заболевания или состояния, которое характеризуется экспрессией В7-НЗ, в частности, где заболевание или состояние, связанное с экспрессией В7-НЗ или характеризуемое экспрессией В7-НЗ, является раков, а более конкретно, где рак выбран из группы, состоящей из опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, В-клеточной неоплазии, рака молочной железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, язвенной карциномы клетки, рака ободочной кишки, колоректального рака, кожной
доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, опухоли зародышевых клеток, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легкого, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, детского онкологического заболевания, опухоли периферических нервных оболочек, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, увеальной меланомы заднего полюса, почечного метастатического рака, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.
[0028] Второй аспект настоящего изобретения относится к молекуле, которая включает домен, связывающий В7-НЗ человека, из гуманизированного антитела против В7-НЗ человека, конъюгированного, по меньшей мере, с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.
[0029] В частности, изобретение относится к конъюгату лекарственного средства и анти-В7-НЗ антитела (B7-H3-ADC), имеющему формулу: Ab-(LM)m-(D)", где:
АЬ представляет собой антитело, которое связывается с В7-НЗ, включающее гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и гуманизированный вариабельный домен легкой цепи (VL), или его В7-НЗ-связывающий фрагмент;
D представляет собой цитотоксический лекарственный компонент;
LM является линкерной молекулой, которая ковалентно связывается с АЬ и D;
m представляет собой целое число от 0 до п и обозначает количество линкерных молекул в B7-H3-ADC;
п представляет собой целое число от 1 до 10 и обозначает количество цитотоксических лекарственных форм, ковалентно связанных с ADC.
[0030] Кроме того, изобретение относится к такому B7-H3-ADC, в котором линкерная молекула LM отсутствует (т.е., m = 0), и B7-H3-ADC, которые обладают более чем одной линкерной молекулой LM (т.е., m представляет собой целое число от 2 до п), где каждая из линкерных молекул LM ковалентно связывает цитотоксический лекарственный компонент D с АЬ такого B7-H3-ADC. Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, АЬ которых ковалентно связаны с более чем одной линкерной молекулой LM, где все такие линкерные молекулы идентичны. Цитотоксические лекарственные компоненты D, которые ковалентно связаны с АЬ таких B7-H3-ADC, могут быть все одинаковыми или могут включать 2, 3, 4, или более неидентичных цитотоксических лекарственных фрагментов D. Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых АЬ ковалентно связано с более чем одной линкерной молекулой LM, где все такие линкерные молекулы не идентичны. Цитотоксические лекарственные компоненты D, которые ковалентно связаны с АЬ таких B7-H3-ADC, могут быть все одинаковыми или могут включать 2, 3, 4 или более неидентичных цитотоксических лекарственных фрагментов D.
[0031] Изобретение далее обеспечивает такие B7-H3-ADC, в которых:
(A) (i) гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99 и
(ii) гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQIDNO: 104; или
(B) (i) гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 и
(ii) гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQIDNO: 21; или
(C) (i) гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 и
(ii) гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQIDNO: 31.
[0032] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность
SEQ ID NO: 99, а гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104.
[0033] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, а гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
[0034] Кроме того, изобретение обеспечивает такие B7-H3-ADC, в которых гуманизированный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, а гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 31.
[0035] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых АЬ представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела.
[0036] Изобретение далее обеспечивает такие B7-H3-ADC, где B7-H3-ADC включает домен Fc из IgG человека (особенно IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека).
[0037] Изобретение далее обеспечивает такие B7-H3-ADC, где B7-H3-ADC содержит вариантный домен Fc, который включает:
(a) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc по отношению к FcyR; и/или
(b) одна или несколько аминокислотных модификаций, которые увеличивают период полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc.
[0038] Изобретение далее обеспечивает такие B7-H3-ADC, которые включают вариантный домен Fc, причем модификации, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc по отношению к FcyR, включают замену L234A; L235A; или L234A и L235A, где нумерация соответствует нумерации индекса EU, как у Kabat.
[0039] Изобретение далее обеспечивает такие B7-H3-ADC, которые включают вариантный домен Fc, причем модификации, которые улучшают период полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc, включают замену M252Y; M252Y и S254T; M252Y и Т256Е; M252Y, S254T и Т256Е; или K288D и Н435К, где нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
[0040] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых, по меньшей мере, один из LM является линкерной молекулой, и в частности, где линкерная молекула является пептидным линкером и/или расщепляемым линкером.
[0041] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых молекула имеет формулу:
АЬ - [V-(W)k-(X)i-A] - D
где:
V - расщепляемая линкерная молекула LM ,
(W)k-(X)i-A - удлиненная самоэлиминируемая спейсерная система, которая самоэлиминируется посредством 1,(4+2п)-элиминации,
W и X каждый представляют собой спейсер каскада электронов а 1,(4+2п), которые являются одинаковыми или различными,
А представляет собой либо спейсерную группу формулы (Y)m, где Y представляет собой а 1,(4+2п) спейсер каскада электронов, или группу формулы U, являющуюся спейсером для исключения циклизации,
k, 1 и m независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно),
п представляет собой целое число от 0 (включительно) до 10 (включительно), при условии, что:
когда А представляет собой (Y)m: тогда k + 1 + m > 1, и если к + 1 + m = 1, то n> 1; когда А равно U: тогда k + 1 > 1.
W, X и Y независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
-Р^С Y~ (l)a-(F)b-(G)c-/ R1^R2 R
-^-(l)a-(F)b-(G)c- R1 R2
где: Q представляет собой -R5C=CR6-, S, О, NR5, -R5C=N- или -N=CR5-г представляет собой NR7, О или а
a, b и с независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно);
I, F и G независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
r! , r\ ф
или 4^=^*" или --
где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 и R9 независимо представляют собой Н, Ci-6 алкил, Сз-2о гетероциклил, С5-20 арил, Ci-6 алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный амино (NRXH), дизамещенный амино (NRx^x2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2,
SChMe, CONHMe, циклический C1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-6 алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2)x, где Rx, Rx1 и Rx2 независимо выбраны из Ci-б алкильной группы, Сз-2о гетероциклической группы или С5-20 арильной группы, два или более заместителей R^, R2, R3, R4, R^, R^, R7, R8 или R9 необязательно соединены друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур; U выбран из соединений, имеющих формулу:
Ч' R'J R' R' Н! И'"
¦ < - или /или
Ч'1 R" В
ИЛИ
'. ч' . 1
N К' -i-1
где:
a, b и с независимо выбраны как целое число 0 или 1; при условии, что а + b + с = 2 или 3;
R1 и/или R2 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, причем алкил необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: гидрокси (ОН), простой эфир (ORx), амино (NH2), монозамещенный амино (NRXH), дизамещенный амино (MtjRx2), нитро (N02), галоген, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-6 алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (СРХ), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)2ORx), сульфонил (S(=0)2Rx), сульфокси (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфонокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, Сз- 20 гетероциклической группы или С5-20 арильной группы; и
R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, С3-20 гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный амино (NRxH), дизамещенный амино (NRx^x2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2, БОгМе, CONHMe, циклический С1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфокси (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфата (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20
гетероциклической группы или С5-20 арильной группы и два или более заместителей R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, или R8 необязательно связаны друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур.
[0042] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, в которых линкерная молекула LM включает:
(1) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
(2) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-
аминобензилоксикарбонил;
(3) п-аммоциннамилоксикарбонил;
(4) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
(5) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
(6) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
(7) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
(8) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-арниноциннамилоксикарбонил;
(9) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-паминобензилоксикарбонил;
(10) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-
аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
(11) п-аминобензилоксикарбонил(метиламино)этил(метиламино)карбонил;
(12) п-аминоциннамилоксикарбонил(метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(13) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил
(метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(14) п-аминоиндинамикоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино)карбонил;
(15) п-аминобензилоксикарбонил-п-арниноциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино)-карбонил;
(16) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино)карбонил;
(17) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
(18) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
(19) п-аминоциннамил;
(20) п-аминоциннанилоксикарбонил-п-аминобензил;
(21) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(22) п-амино-циннамилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(23) п-аминофенилпентадиенил;
(24) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(17)
(25) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминобензил; или
(26) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминофенилпентадиенил.
[0043] Кроме того, изобретение предлагает такие B7-H3-ADC, в которых линкерная молекула LM конъюгирована с боковой цепью аминокислоты полипептидной цепи АЬ и связывает АЬ с молекулой цитотоксического лекарственного компонента D и, в частности, где цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин, радиоизотоп, иммуномодулятор, цитокин, лимфокин, хемокин, фактор роста, фактор некроза опухоли, гормон, антагонист гормона, фермент, олигонуклеотид, ДНК, РНК, миРНК, РНКи, микроРНК, фотоактивный терапевтический агент, антиангиогенный агент, проапоптотический агент, пептид, липид, углевод, хелатирующий агент или их комбинации.
[0044] Кроме того, изобретение предлагает такие B7-H3-ADC, в которых линкерная молекула LM конъюгирована с боковой цепью аминокислоты полипептидной цепи АЬ и связывает АЬ с молекулой цитотоксического лекарственного компонента D и, в частности, где цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин, выбранный из группы, состоящая из тубулизина (особенно цитотоксина тубулизина, выбранного из группы, состоящей из тубулизина А, тубулизина В, тубулизина С и тубулизина D), ауристатина (особенно цитотоксина ауристатина, выбранного из группы, состоящей из ММАЕ (N-метилвалин-валин-долаизолеуин-долапроин-норэфедрин) и MMAF (N-метилвалин-валин-долаизолеуин-долапроин-фенилаланин), майтанзиноида (особенно цитотоксина майтанзиноида, выбранного из группы, состоящей из майтанзина, DM 1 и DM4), калихеамицина (особенно цитотоксина калихеамицина, выбранного из группы, состоящей из калихеамицина yl, калихеамицина piBr, калихеамицина ylBr, калихеамицина а21, калихеамицина а31, калихеамицина pil, калихеамицина уII и калихеамицина АН), пирролобензодиазепина (особенно цитотоксина пирролобензодиазепина, выбранного из группы, состоящей из вадастуксимабатаририна, SJG-136, SG2000, SG2285 и SG2274) и дуокармицина (особенно цитотоксина дуокармицина, выбранного из группы, состоящей из дуокармицина А, дуокармицина В1, дукармицина В2, дуокармицина С1, дуокармицина С2, дуокармицина D, дуокармицина SA, СС-1065, адозелезина, бизелезина, карцелезина (U-80244) и спиро-дуокармицина (DUBA)).
[0045] Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество любого из вышеописанных B7-H3-ADC и фармацевтически приемлемого носителя, эксципиента или разбавителя.
[0046] Изобретение дополнительно направлено на применение любого из вышеописанных B7-H3-ADC при лечении заболевания или состояния, связанного с экспрессией В7-НЗ или характеризующегося экспрессией В7-НЗ, или в способе лечения заболевания или состояния, характеризующихся экспрессией В7-НЗ, в частности, где заболевание или состояние, связанное с экспрессией В7-НЗ или характеризующееся экспрессией В7-НЗ, представляет собой рак, и более конкретно, где рак выбран из группы, состоящей из острого миелолейкоза, опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, В-клеточной неоплазии, рака молочной железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, язвенной карциномы клетки, рака ободочной кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, опухоли зародышевых клеток, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легкого, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, детского онкологического заболевания, опухоли периферических нервных оболочек, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, увеальной меланомы заднего полюса, почечного метастатического рака, рабдоидной опухоли, рабдомизаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.
Краткое описание фигур
[0047] На Фигуре 1 представлена схема типичного ковалентно связанного диатела, имеющего два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет Е-спираль или К-спираль, способствующие образованию гетеродимера (ниже приведены альтернативные домены, способствующие образованию гетеродимера). Остаток цистеина может присутствовать в линкере и/или в домене,
способствующем образованию гетеродимера, как показано на Фигуре ЗВ. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с применением единой схемы затенения или заливки.
[0048] На Фигуре 2 представлена схема типичной ковалентно связанной молекулы диатела, имеющей два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух полипептидных цепей, каждый из которых имеет домен СН2 и СНЗ, так что связанные цепи образуют весь или часть домена Fc. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с применением единой схемы затенения или заливки.
[0049] На Фигурах ЗА-ЗС представлены схемы, показывающие репрезентативные ковалентно связанные четырехвалентные диатела, имеющие четыре эпитопсвязывающих участка, состоящих из двух пар полипептидных цепей (т.е. всего из целых 4 полипептидных цепей). Один полипептид каждой пары имеет домен СН2 и СНЗ, так что связанные цепи образуют весь или часть домена Fc. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с применением единой схемы затенения или заливки. Две пары полипептидных цепей могут быть одинаковыми. В таких воплощениях, где две пары полипептидных цепей являются одинаковыми, а домены VL и VH распознают разные эпитопы (как показано на Фигурах ЗА-ЗВ), полученная молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является биспецифической и двухвалентной по отношению к каждому связанному эпитопу. В таких воплощениях, где домены VL и VH распознают один и тот же эпитоп (например, одни и те же CDR домена VL и одни и те же CDR домена VH используются в обеих цепях), полученная молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является моноспецифичной и четырехвалентной по отношению к одному эпитопу. В ином случае, две пары полипептидов могут быть разными. В таких воплощениях, где две пары полипептидных цепей различны, а домены VL и VH каждой пары полипептидов распознают разные эпитопы (как показано различными затенениями и рисунками на Фигуре ЗС), полученная молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является тетраспецифической и моновалентной по отношению к каждому связанному эпитопу. На Фигуре ЗА показано диатело, содержащее домен Fc, который включает пептид домена, способствующего гетеродимеризации, содержащий остаток цистеина. На Фигуре ЗВ показано диатело, содержащее домен Fc, которое включает домены, способствующие гетеродимеризации с Е-спиралью и К-спиралью, которые содержат остаток цистеина и линкер (с необязательным остатком цистеина). На Фигуре ЗС показано диатело, содержащее область Fc, которое включает домены СН1 и CL антитела.
[0050] На Фигурах 4А и 4В представлены схемы типичной молекулы ковалентно
связанного диатела, включающего два эпитопсвязывающих участка, состоящих из трех полипептидных цепей. Две полипептидные цепи обладают доменами СН2 и СНЗ, так что связанные цепи образуют весь или часть домена Fc. Полипептидные цепи, содержащие домены VL и VH, дополнительно включают домен, способствующий гетеродимеризации. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с применением единой схемы затенения или заливки.
[0051] На Фигуре 5 представлена схема типичной молекулы ковалентно связанного диатела, включающего четыре эпитопсвязывающих участка, состоящих из пяти полипептидных цепей. Две полипептидные цепи обладают доменами СН2 и СНЗ, так что связанные цепи образуют домен Fc, который включает весь или часть домена Fc. Полипептидные цепи, включающие связанные домены VL и VH, дополнительно содержат домен, способствующий гетеродимеризации. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с применением единой схемы затенения или заливки.
[0052] На Фигурах 6A-6F представлены схемы типичных Fc домен-содержащих трехвалентных связывающих молекул, имеющих три эпитопсвязывающих сайта. На Фигурах 6А и 6В, соответственно, схематично показаны домены трехвалентных связывающих молекул, содержащие два домена связывания двух антител и связывающий домен типа Fab, имеющий различные доменные ориентации, в которых связывающие домены по типу диатела являются N-концевыми или С-концевыми по отношению к домену Fc. Молекулы на Фигурах 6А и 6В содержат четыре цепи. На Фигурах 6С и 6D, соответственно, схематично показаны домены трехвалентных связывающих молекул, включающих связывающие домены по типу диатела, являющихся N-концевыми по отношению к домену Fc, и связывающий домен типа Fab, в котором легкая цепь и тяжелая цепь связаны через полипептидный спейсер или связывающий домен по типу scFv. Трехвалентные связывающие молекулы на Фигурах 6Е и 6F, соответственно, схематично иллюстрируют домены трехвалентных связывающих молекул, включающих два связывающих домена по типу диатела, которые являются С-концевыми по отношению к домену Fc, и связывающий домен Fab-типа, в котором легкая цепь и тяжелая цепь связаны через полипептидный спейсер или связующий домен scFv-типа. Трехвалентные связывающие молекулы на Фигурах 6С - 6F содержат три цепи. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с применением единой схемы затенения или заливки.
[0053] На Фигуре 7 показаны результаты скрининга анти-В7-НЗ антител, способных интернализоваться в раковых клетках поджелудочной железы Hs700T.
[0054] На Фигурах 8A-8J показаны результаты исследования способности В7-НЗ-
ADC по настоящему изобретению опосредовать цитотоксичность in vitro против В7-НЗ-экспрессирующих клеток рака молочной железы ЛМТ-1 (Фигура 8А), клеток рака молочной железы MDA-MB-468 (Фигура 8В), клеток меланомы А375.52 (Фигура 8С), клеток немелкоклеточного рака легкого Calu-б (Фигура 8D), клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-H1703 (Фигура 8Е), клеток немелкоклеточного рака легкого NCI- HI975 (Фигура 8F), клеток рака яичника РА-1 (Фигура 8G), клеток рака поджелудочной железы Hs700T (Фигура 8Н), клеток рака предстательной железы DU145 (Фигура 81) и клеток В-клеточной лимфомы Raji, отрицательных по В7-НЗ (Фигура 8J).
[0055] На Фигуре 9 показаны результаты исследования способности B7-H3-ADC по настоящему изобретению опосредовать цитотоксичность in vivo по отношению к опухолевым клеткам рака молочной железы MDA-MB-468, имплантированным в жировое тело молочной железы в модели на голых мышах CD1. Кривые роста опухоли представлены для мышей, обработанных внутрибрюшинно 10 мг/кг chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE и chmAb-D-vc-MMAE или только одним носителем в день 25 (показано стрелкой).
[0056] На Фигурах 10А-10С показаны результаты исследования способности В7-H3-ADC по настоящему изобретению опосредовать цитотоксичность in vivo против подкожно имплантированных опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-HI 703 NCI в модели на голых мышах CD1. Кривые роста опухолей представлены для мышей, которым вводили внутрибрюшинно 10 мг/кг (Фигура 10А), 3 мг/кг (Фигура 1), 1 мг/кг (Фигура ЮС) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-B-vc-MMAE и chmAb-B-vc-MMAE при 10 мг/кг или носитель отдельно в день 52 (показано стрелкой).
[0057] На Фигурах 11А-11С показаны результаты исследования способности В7-H3-ADC по настоящему изобретению опосредовать цитотоксичность in vivo против подкожно имплантированных опухолевых клеток рака яичника РА-1 в модели на голых мышах CD1. Кривые роста опухоли представлены для мышей, получавших внутрибрюшинно 10 мг/кг (Фигура ПА), 3 мг/кг (Фигура 11В), 1 мг/кг (Фигура 5С) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc -ММАЕ и chmAb-D-vc-MMAE при 10 мг/кг или носитель отдельно в день 42 (показано стрелкой).
[0058] На Фигурах 12А-12С показаны результаты исследования способности В7-H3-ADC по настоящему изобретению опосредовать цитотоксичность in vivo против подкожно имплантированных опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого Calu-6 в модели на голых мышах CD1. Кривые роста опухолей представлены для мышей, которым вводили внутрибрюшинно 10 мг/кг (Фигура 12А), 3 мг/кг (Фигура 1), 1 мг/кг (Фигура 12С) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-B-vc-MMAE и chmAb-D-vc-MMAE при 10
мг/кг или носитель отдельно в день 20 (показано стрелкой).
[0059] На Фигурах 13А-13С показаны результаты исследования способности В7-H3-ADC по настоящему изобретению опосредовать цитотоксичность in vivo против подкожно имплантированных клеток меланомы A375.S2 в модели на голых мышах CD1. Кривые роста опухолей представлены для мышей, которым вводили внутрибрюшинно 10 мг/кг (Фигура 13А), 3 мг/кг (Фигура 1), 1 мг/кг (Фигура 13С) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE и chmAb-D-vc-MMAE при 10 мг/кг или носитель отдельно в день 30 (показано стрелкой).
[0060] На Фигурах 14А-14С показаны результаты исследования фармакокинетической стабильности молекул B7-H3-ADC. Кривые концентрации антител в сыворотке представлены для всех антител (кружки) и интактного B7-H3-ADC (квадраты), полученного из chmAb-B (Фигура 14A), chmAb-C (Фигура 14В) и chmAb-D (Фигура 14С).
[0061] На Фигурах 15А-15С показано сохранение биологической активности посредством hmAb-C B7-H3-ADC, имеющего типичный компонент дуокармицина (DUBA), связанный с аминокислотным остатком части АЬ через расщепляемый линкер ("hmAb-C-DUBA"). Фигура 15А клетки Calu-б; Фигура 15В, клетки NCI-H1703; Фигура 15С, клетки Hs700T. Контрольная молекула связывает CD20 и конъюгирована с DUBA ("Ctrl-DUBA").
[0062] На Фигуре 16 показаны результаты исследования in vivo эффективности hmAb-C-DUBA на клетках немелкоклеточной карциномы легкого Calu-6. hmAb-C-DUBA вводили группам мышей (п = 5), которым подкожно инокулировали клетки немелкоклеточной карциномы легкого Calu-б. Дозы hmAb-C-DUBA (1 мг/кг х 3, 3 мг/кг х 3 или 6 мг/кг х 3) вводили внутрибрюшинно мышам в дни 24, 31, 38 и 45 (показаны стрелками) после инокуляции, и животных оценивали по объему опухоли вплоть до 62 дней.
[0063] На Фигуре 17 показаны результаты исследования in vivo эффективности hmAb-C-DUBA против клеток карциномы немелкоклеточного легкого Calu-6. hmAb-C-DUBA вводили в группы мышей (п = 7), которым подкожно инокулировали клетки немелкоклеточной карциномы легкого Calu-б. Дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (3 мг/кг или 10 мг/кг) вводили мышам на 20-й день (показано стрелкой) после инокуляции, а животных оценивали по объему опухоли вплоть до 55 дней.
[0064] На Фигуре 18 показаны результаты in vivo исследования эффективности hmAb-C-DUBA против клеток карциномы яичника РА-1. hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA вводили в группы мышей (п = 6), которым подкожно инокулировали клетки карциномы
яичника РА-1. Дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (3 мг/кг, 6 мг/кг или 10 мг/кг) вводили мышам в день 25 (показано стрелкой) после инокуляции, а животных оценивали по объему опухоли вплоть до 60 дней.
[0065] На Фигуре 19 показаны результаты исследования in vivo эффективности hmAb-C-DUBA против клеток меланомы A375.S2. hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA вводили группам мышей (п = 7), которым подкожно инокулировали клетки меланомы A375.S2. Дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (1 мг/кг или 3 мг/кг) вводили мышам на 25-й день (показано стрелкой) после инокуляции, а животных оценивали по объему опухоли вплоть до 60 дней.
[0066] На Фигурах 20A-20D показаны результаты in vivo исследования эффективности hmAb-C-DUBA против ксенотрансплантов в жировое тело клеток карциномы молочной железы MDA-MB468. hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA вводили внутрибрюшинно в группы мышей в дни 70, 74 и 78 после инокуляции клеток карциномы молочной железы MDA-MB468 в жировое тело молочной железы. Дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (либо разовая доза 3 мг/кг, либо 6 мг/кг) на 70-й день или три дозы 3 мг/кг в дни 70, 74 и 78 (показаны стрелками) была предоставлена после инокуляции, и животных оценивали по объему опухоли вплоть до 110 дней. На Фигуре 20А показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 6 мг/кг (однократная доза). На Фигуре 20В показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 3 мг/кг (однократная доза). На Фигуре 20С показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 3 мг/кг (три дозы). На Фигуре 20D показаны все результаты на одном графике.
[0067] На Фигурах 21A-21D показаны результаты in vivo исследования эффективности hmAb-C-DUBA против подкожно имплантированных ксенотрансплантов клеток карциномы яичника РА-1. hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA вводили внутрибрюшинно (однократную дозу 3 мг/кг, 6 мг/кг или 10 мг/кг) в день 24 после инокуляции или две дозы 10 мг/кг hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (на 24 и 28 дни после инокуляции) или четыре дозы 6 мг/кг hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (в дни 24, 28, 31 и 35 после инокуляции). Животных оценивали по объему опухоли в течение 70 дней. На Фигуре 21А показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA при 10 мг/кг (однократная или двойная доза). На Фигуре 21В показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA при 6 мг/кг (однократная или четырехкратная доза).На Фигуре 21С показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 3 мг/кг (однократные дозы). На Фигуре 21D показаны все результаты на одном графике.
[0068] На Фигурах 22 показана фармакокинетика введения chmAb-C-DUBA у
мышей. На фигуре показан общий IgG человека и интактный ADC chmAb-C-DUBA при 3 мг/кг (п = 3).
[0069] На Фигурах 23А-23В показана фармакокинетика введения hmAb-C-DUBA у яванского макака. На фигурах показан общий IgG человека (Фигура 23 А) и интактный ADC (Фигура 23В) hmAb-C-DUBA при 1 мг/кг (1 самец, 1 самка), 3 мг/кг (1 самец, 1 самка), 10 мг/кг (1 самец, 1 самка) или 27 мг/кг (2 самца, 2 самки)).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0070] Настоящее изобретение направлено на новые В7-НЗ-связывающие молекулы, способные связываться с В7-НЗ человеческой и нечеловеческой природы, и в частности с такими молекулами, которые являются перекрестно-реактивными с В7-НЗ приматов, отличных от человека (например, яванского макака). Изобретение дополнительно относится к В7-НЗ-связывающим молекулам, которые включают вариабельные домены легкой цепи и/или вариабельные домены тяжелой цепи (VH), которые были гуманизированы и/или деиммунизированы так, чтобы они проявляли сниженную иммуногенность при введении объектам-реципиентам. Изобретение, в частности, относится к биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, включая биспецифические диатела, BiTE, биспецифические антитела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д. которые включают: (i) такие В7-НЗ-связывающие вариабельные домены и (ii) домен, способный связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают любую из таких В7-НЗ-связывающих молекул, и к способам, связанным с применением любой из таких В7-НЗ-связывающих молекул при лечении рака и других заболеваний и состояний. Изобретение также, в частности, относится к молекуле, которая включает домен, связывающий В7-НЗ человека из гуманизированного антитела против В7-НЗ человека, конъюгированного, по меньшей мере, с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.
[0071] Настоящее изобретение также относится к молекуле, которая включает домен, связывающий В7-НЗ человека, из гуманизированного антитела против В7-НЗ человека, конъюгированного, по меньшей мере, с одним лекарственным компонентом ("B7-H3-ADC"). Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые включают такие B7-H3-ADC, и к способам, связанным с применением любого из таких B7-H3-ADC при лечении рака и других заболеваний и состояний.
[0072] Молекулы B7-H3-ADC по настоящему изобретению включают формулу:
Ab-(LM)m-(D)",
где:
АЬ представляет собой антитело, которое связывается с В7-НЗ, которое включает гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и гуманизированный вариабельный домен легкой цепи (VL) или является его В7-НЗ-связывающим фрагментом; и;
D представляет собой цитотоксический лекарственный компонент; LM представляет собой связь или линкерную молекулу, которая ковалентно связывает АЬ и D;
m представляет собой целое число от 0 до п и обозначает количество линкерных молекул в B7-H3-ADC; и
п представляет собой целое число от 1 до 10 и обозначает количество цитотоксических лекарственных компонентов, ковалентно связанных с молекулой В7-НЗ-ADC.
I. Антитела и их связывающие домены
[0073] Антитела по настоящему изобретению представляют собой молекулы иммуноглобулина, способные специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д. через, по меньшей мере, один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина. Молекулы B7-H3-ADC по настоящему изобретению, таким образом, включают антитело, которое связывается с В7-НЗ, или В7-НЗ-связывающий фрагмент. Используемые в данном документе термины "антитело" и "антитела" относятся к моноклональным антителам, мультиспецифическим антителам, человеческим антителам, гуманизированным антителам, синтетическим антителам, химерным антителам, поликлональным антителам, камелизированным антителам, одноцепочечным Fv (scFv), одноцепочечным антителам, Fab-фрагментам, Р(аЬ')-фрагментам, дисульфидсвязанным биспецифическим Fv (sdFv), интрателам и эпитопсвязывающим фрагментам любого из вышеуказанных. В частности, термин "антитело" включает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, то есть молекулы, которые включают сайт, связывающий эпитоп. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi и IgA2) или подкласса. Антитела способны "иммуноспецифически связываться" с полипептидом или белком или небелковой молекулой (или связываться с такой
молекулой "иммуноспецифическим образом") из-за присутствия на такой молекуле определенного домена или фрагмента или конформации ("эпитопа"). Эпитопсодержащая молекула может иметь иммуногенную активность, так что она вызывает реакцию продуцирования антитела у животного; такие молекулы называются "антигенами". В последние несколько десятилетий наблюдается возрождение интереса к терапевтическому потенциалу антител, и антитела стали одним из ведущих классов лекарственных средств, полученных с помощью биотехнологии (Chan, СЕ et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases" Singapore Med. J. 50(7):663-666). Более 200 лекарственных средств на основе антител были одобрены для применения или находятся в стадии разработки.
[0074] При использовании в данном документе, антитело, диатело или другая эпитопсвязывающая молекула, согласно сообщениям, "иммуноспецифически" связывает область другой молекулы (т.е. эпитоп), если она реагирует или ассоциируется чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с этим эпитопом относительно альтернативных эпитопов. Например, антитело, которое иммуноспецифически связывается с вирусным эпитопом, представляет собой антитело, которое связывает этот вирусный эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей продолжительностью, чем оно иммуноспецифически связывается с другими вирусными эпитопами или невирусными эпитопами. Также понятно, прочитав это определение, что, например, антитело (или фрагмент или эпитоп), которое иммуноспецифически связывается с первой мишенью, может или не может специфически или предпочтительно связываться со второй мишенью. Таким образом, "иммуноспецифическое связывание" необязательно требует (хотя и может включать) исключительного связывания. Как правило, но необязательно, ссылка на связывание означает "иммуноспецифическое" связывание. Сообщается, что две молекулы способны связываться друг с другом "физиоспецифическим" образом, если такое связывание проявляет специфичность, с которой рецепторы связываются с их соответствующими лигандами.
[0075] Термин "моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, где моноклональное антитело состоит из аминокислот (встречающихся в природе или не встречающихся в природе), которые участвуют в селективном связывании антигена. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного эпитопа (или антигенного сайта). Термин "моноклональное антитело" охватывает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv и т.д.),
одноцепочечные (scFv) связывающие молекулы, их мутанты, гибридные белки, содержащие часть антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любые другие модифицированные конфигурации молекулы иммуноглобулина, которые включают сайт распознавания антигена требуемой специфичности и имеют способность связываться с антигеном. Термин не предназначен для ограничения в отношении источника антитела или способа его получения (например, с помощью гибридомы, фагового отбора, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает целые иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением "антитело". Способы получения моноклональных антител известны в данной области. Одним из способов, который может быть использован, является способ Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity" Nature 256:495-497 или его модификация. Обычно моноклональные антитела вырабатывают в мышах, крысах или кроликах. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые включают искомый эпитоп. Иммуноген может представлять собой, без ограничения указанным, первичные клетки, культивируемые клеточные линии, раковые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткань. Клетки, используемые для иммунизации, могут культивироваться в течение периода времени (например, по меньшей мере, 24 часа) до их применения в качестве иммуногена. Клетки могут быть использованы в качестве иммуногенов сами по себе или в сочетании с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, VM (1995) ((Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production}}, ILAR J. 37 (3): 119-125). Как правило, клетки должны быть сохранены интактными и предпочтительно должны быть жизнеспособными при использовании в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут позволить антигенам лучше детектироваться иммунизированными животными, чем в случае антигенов поврежденных клеток. Применение денатурации или жестких адъювантов, например адъюванта Фрейда, может привести к разрыву клеток и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить несколько раз с периодическими интервалами, такими как, дважды в неделю или еженедельно, или может вводиться таким образом, чтобы поддерживать жизнеспособность у животного (например, в тканевом рекомбинанте). В ином случае, существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются иммуноспецифическими для искомого патогенного эпитопа, могут быть секвенированы и получены рекомбинантно любыми способами, известными в данной области. В одном воплощении такое антитело секвенировано и полинуклеотидная
последовательность затем клонируется в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая антитело, может поддерживаться в векторе в клетке-хозяине, и затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для будущего использования. Полинуклеотидную последовательность таких антител можно использовать для генетической манипуляции для получения моноспецифических или мультиспецифических (например, биспецифических, триспецифических и тетраспецифических) молекул по изобретению, а также оптимизированного сродства, химерного антитела, гуманизированного антитела и/или канинизированного антитела, для улучшения аффинности или других характеристик антитела. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности антигенсвязывающей части антитела, с заменой при этом нечеловеческого остатка антитела на последовательности человеческих антител.
[0076] Природные антитела (такие как антитела IgG) состоят из двух "легких цепей" в комплексе с двумя "тяжелыми цепями". Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен ("VL") и константный домен ("CL"). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен ("VH"), три константных домена ("СН1", "СН2" и "СНЗ") и "шарнирный" участок ("Н"), расположенный между доменами СН1 и СН2. Таким образом, основной структурной единицей природных иммуноглобулинов (например, IgG) является тетрамер, имеющий две легкие цепи и две тяжелые цепи, обычно экспрессируемые в виде гликопротеина около 150 ООО Да. Аминоконцевая ("N-концевая") часть каждой цепи включает вариабельный домен, содержащий от 100 до 110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевая ("С-концевая") часть каждой цепи определяет константный участок, причем легкие цепи имеют один константный домен, а тяжелые цепи, обычно имеют три константных домена и шарнирный домен. Таким образом, структура легких цепей молекулы IgG представляет собой n-VL-CL-c, а структура тяжелых цепей IgG представляет собой n-VH-CHl-H-CH2-СНЗ-с (где п и с представляют соответственно, N-конец и С-конец полипептида).
А. Характеристики вариабельных доменов антител
[0077] Вариабельные домены молекулы IgG состоят из участков, определяющих комплементарность ("CDR"), которые включают остатки контактирующие с эпитопом и не-CDR сегменты, называемые каркасными фрагментами ("FR"), которые в целом поддерживают структуру и определяют расположение петель CDR, чтобы обеспечить указанный контакт (хотя некоторые каркасные остатки также могут контактировать с антигеном). Таким образом, VL- и VH-домены имеют структуру n-FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C. Полипептиды, которые являются (или могут служить) первым, вторым
и третьим CDR легкой цепи антитела, обозначены соответственно как: домен CDRLI, домен CDRL2 И домен CDRL3. Аналогично, полипептиды, которые (или могут служить) как первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела, обозначены соответственно как: домен CDRHI, домен CDRH2 И домен CDRH3. Таким образом, термины Домен CDRLI, Домен CDRL2, Домен CDRL3, Домен CDRHI, домен CDRH2 И домен CDRH3 ОТНОСЯТСЯ К полипептидам, которые при включении в белок приводят к тому, что этот белок может связываться с определенным эпитопом независимо от того, является ли такой белок антителом, имеющим легкие и тяжелые цепи, или является диателом или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и да. д.) или является другим типом белка. Соответственно, при использовании в данном документе, термин "эпитопсвязывающий фрагмент" обозначает фрагмент молекулы, способной к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом. Эпитопсвязывающий фрагмент может содержать любое из числа 1, 2, 3, 4 или 5 доменов CDR антитела или может содержать все 6 доменов CDR антитела и, хотя он способен иммуноспецифически связываться с таким эпитопом, может проявлять иммуноспецифичность, аффинность или селективность по отношению к эпитопу, который отличается от эпитопа такого антитела. Однако предпочтительно, чтобы эпитопсвязывающий фрагмент содержал все 6 доменов CDR такого антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может быть одной полипептидной цепью (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет аминоконец и карбоксильный конец (например, диатело, фрагмент Fab, фрагмент Fab2 и т.д.). Если специально не указано, порядок доменов молекул белка, описанных в данном документе, приводится в направлении "N-конец-С-конец".
[0078] Изобретение, в частности, относится к одноцепочечным вариабельным фрагментам ("scFv"), содержащим гуманизированный анти-В7-НЗ-"уЪ и/или домен VH настоящего изобретения, а также к мультиспецифическим связывающим молекулам, содержащим их. Одноцепочечные вариабельные фрагменты содержат домены VL и VH, которые связаны друг с другом с помощью короткого "линкерного" пептида. Такие линкеры могут быть модифицированы для обеспечения дополнительных функций, например, для обеспечения прикрепления лекарственного средства или для прикрепления к твердой подложке. Одноцепочечные варианты могут быть получены либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического продуцирования scFv может использоваться автоматизированный синтезатор. Для рекомбинантного продуцирования scFv, подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, который кодирует scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как
E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющие интерес scFv, могут быть получены с помощью обычных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv может быть выделен с применением стандартных методов очистки белка, известных в данной области.
[0079] Изобретение также, в частности, охватывает CDRHI, CDRH2, CDRH3, CDRLI, CDR L 2, CDRL3 ИЛИ домен VL и/или домен VH гуманизированных вариантов В7-НЗ-антител изобретения, а также мультиспецифические связывающие молекулы, содержащие то же самое. Термин "гуманизированное" антитело относится к гибридной молекуле, обычно полученной с применением рекомбинантных методик, имеющей эпитопсвязывающий сайт иммуноглобулина из видов, не являющихся человеком, и остальную структуру иммуноглобулиновой молекулы, которая основана на структуре и/или последовательность человеческого иммуноглобулина. анти-В7-НЗ антитела по настоящему изобретению, в частности, включают гуманизированные, гибридные или канинизированные варианты антител mAb-A, mAb-B, mAb-C или mAb-D. Полинуклеотидная последовательность вариабельных доменов таких антител может быть использована для генетической манипуляции с целью получения таких производных и улучшения аффинности или других характеристик таких антител. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности эпитопсвязывающей части антитела, при замене нечеловеческого остатка антитела на последовательности антитела человека. Существует четыре общих стадии гуманизации моноклонального антитела. Это: (1) определение нуклеотидной и спрогнозированной аминокислотной последовательности исходных вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антитела, (2), конструирование гуманизированного антитела или канинизированного антитела, то есть решение о том, какой каркасный участок антитела будет использоваться процесса гуманизации или канинизации, (3) фактические методологии/методы гуманизации или канинизации, и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, пат. США № 4816567; 5807715; 5866692; и 6331415.
[0080] Эпитопсвязывающий сайт может содержать либо полный вариабельный домен, объединенный с константными доменами, либо только участки, определяющие комплементарность (CDR) такого вариабельного домена, привитые в соответствующие каркасные области. Домены, связывающие эпитоп, могут быть дикого типа или модифицироваться одной или несколькими аминокислотными заменами. Это исключает константный участок в качестве иммуногена у людей, но оставляет возможность иммунного ответа на чуждый вариабельный домен (LoBuglio, AF et al. (1989)
"Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Другой подход фокусируется не только на предоставлении константных участков человеческого происхождения, но и на изменении вариабельных доменов для того, чтобы как можно более точно изменить их на человеческую форму. Известно, что вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей содержат три области, определяющие комплементарность (CDR), которые изменяются в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют способность связывания, фланкированные четырьмя каркасными областями (FR), которые относительно консервативные у данных видов и которые предположительно обеспечивают поддерживающий каркас для CDR. Когда антитела нечеловеческого происхождения получают к определенному антигену, вариабельные домены могут быть "изменены" или "гуманизированы" путем прививки CDR, полученных из антител нечеловеческого происхождения, на FR, присутствующие в человеческом антителе, подлежащем модификации. Применение этого подхода к различным антителам сообщалось Sato, К. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy" Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity" Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation" Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV -Neutralizing Activity" Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo" Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:28692873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:11491154. В некоторых воплощениях гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В других воплощениях гуманизированные антитела имеют один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), которые отличаются по последовательности от исходного антитела.
[0081] Было описано несколько молекул гуманизированного антитела, содержащих эпитопсвязывающий сайт, полученный из иммуноглобулина, отличного от человека,
включая гибридные антитела, содержащие вариабельный домен из грызунов или модифицированный вариабельный домен из грызунов, и связанные с ними области, определяющие комплементарность (CDR), слитые с константными доменами человека (см., например, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies" Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1 A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen," J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583). Другие источники описывают CDR грызунов, привитые в поддерживающую каркасную область (FR) человека перед слиянием с соответствующим константным доменом антител человека (см., например, Riechmann L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525). В другом источнике описываются CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно венированными каркасными областями грызунов. См., например, Европейскую патентную публикацию № 519596. Эти "гуманизированные" молекулы предназначены для минимизации нежелательной иммунологической реакции на антительные молекулы грызунов против человеческого белка, которые ограничивают продолжительность и эффективность терапевтических применений этих фрагментов у реципиентов-людей. Другие способы гуманизации антител, которые также могут быть использованы, раскрыты Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins" Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476 и в пат. США № 6180377; 6054297; 5997867;и 5866692.
В. Характеристики константных доменов антитела
1. Константные домены легкой цепи
[0082] Как указано выше, каждая легкая цепь антитела содержит вариабельный домен ("VL") и константный домен ("CL").
[0083] Предпочтительным доменом CL является домен CL-каппа из IgG человека. Аминокислотной последовательностью типичного домена CL-каппа человека является (SEQ ID NO: 1):
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC [0084] В ином случае типичный домен CL является доменом CL лямбда из IgG
человека. Аминокислотной последовательностью типичного домена CL лямбда человека
является (SEQ ID N0:2):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS 2. Константные домены тяжелой цепи
[0085] Как указано выше, тяжелые цепи антитела могут содержать константные домены СН1, шарнирный домен, СН2 и СНЗ. Домены СН1 двух тяжелых цепей антительного комплекса с константной областью "CL" легкой цепи антитела прикреплены к доменам тяжелой цепи СН2 через промежуточный шарнирный домен.
[0086] Типичный домен СН1 является доменом СН1 из IgGl человека. Аминокислотная последовательность типичного домена СН1 из IgGl человека представляет собой (SEQ ID NO: 3):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
[0087] Типичный домен CHI является доменом CHI из IgG2 человека. Аминокислотная последовательность типичного домена СН1 из IgG2 человека представляет собой (SEQ ID NO: 4):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
[0088] Типичный домен CHI является доменом CHI из IgG3 человека. Аминокислотная последовательность типичного домена человеческого IgG 3 CHI представляет собой (SEQ ID NO: 5):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
[0089] Типичный домен CHI является доменом CHI из IgG4 человека. Аминокислотная последовательность типичного домена СН1 из IgG4 человека представляет собой (SEQ ID NO: 6):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
[0090] Типичным шарнирным доменом является шарнирный домен из IgGl человека. Аминокислотная последовательность типичного шарнирного домена из IgGl человека представляет собой (SEQ ID N0:7): EPKSCDKTHTCPPCP
[0091 ] Другим типичным шарнирным доменом является шарнирный домен из IgG2
человека. Аминокислотная последовательность типичного шарнирного домена из IgG2 человека представляет собой (SEQ ID N0:8): ERKCCVECPPCP
[0092] Другим типичным шарнирным доменом является шарнирный домен из IgG3 человека. Аминокислотная последовательность типичного шарнирного домена из IgG3 человека представляет собой (SEQ ID NO: 9):
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP
[0093] Другим типичным шарнирным доменом является шарнирный домен из IgG4 человека. Аминокислотная последовательность типичного шарнирного домена из IgG4 человека представляет собой (SEQ ID NO: 10): ESKYGPPCPSCP. Как описано в данном документе, шарнирный домен из IgG4 может включать стабилизирующую мутацию, такую как замена S228P. Аминокислотная последовательность типичного S228P-стабилизированного шарнирного домена из IgG4 человека представляет собой (SEQ ID NO: 11): ESKYGPPCPPCP.
[0094] Домены СН2 и СНЗ двух тяжелых цепей антитела взаимодействуют с образованием "домена Fc", который является областью, которая распознается клеточными рецепторами Fc, включая, без ограничения указанным, рецепторы Fc гамма (FcyR). Используемый в данном документе термин "домен Fc" используется для определения С-концевой области тяжелой цепи IgG. Предполагается, что домен Fc относится к определенному изотипу IgG, классу или подклассу, если его аминокислотная последовательность наиболее гомологична этому изотипу относительно других изотипов IgG. В дополнение к их известным применениям в диагностике, антитела, как было показано, полезны в качестве терапевтических агентов.
[0095] В настоящем описании нумерация остатков в константной области тяжелой цепи IgG соответствует нумерации индекса EU, как в Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5TH ED. PUBLIC HEALTH SERVICE, NHl, MD (1991) ("KABAT"), явно включенного в данный документ ссылкой. Термин "индекс EU, как у Kabat" относится к нумерации константных доменов антитела IgGl EU человека. Аминокислоты из вариабельных доменов зрелых тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов обозначаются положением аминокислоты в цепи. Kabat описал многочисленные аминокислотные последовательности для антител, идентифицировал аминокислотную консенсусную последовательность для каждой подгруппы и присвоил номер остатка каждой аминокислоте, a CDR идентифицировали, как определено Kabat (понятно, что CDRHI, определенный в Chothia, С. & Lesk, AM ((1987) "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins" J. Mol. Biol. 196: 901-917) начинается на пять
остатков ранее). Схема нумерации Kabat расширяется до антител, не включенных в его сборник, путем выравнивания рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей в Kabat по отношению к консервативным аминокислотам. Этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в данной области и легко идентифицирует аминокислоты в эквивалентных положениях в разных антителах, включая гибридные или гуманизированные варианты. Например, аминокислота в положении 50 легкой цепи человеческого антитела занимает эквивалентное положение аминокислоты в положении 50 легкой цепи мышиного антитела.
[0096] Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ типичного IgGl человека (SEQ ID N0: 12):
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
согласно нумерации по индексу EU, представленном у Kabat, где X является лизином (К) или отсутствует.
[0097] Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ типичного IgG2 человека представляет собой (SEQ ID NO: 13):
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430
WE SNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
согласно нумерации по индексу EU, представленном у Kabat, где X является
лизином (К) или отсутствует.
[0098] Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ типичного IgG3 человека представляет собой (SEQ ID NO: 14):
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
согласно нумерации по индексу EU, представленном у Kabat, где X является лизином (К) или отсутствует.
[0099] Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ типичного IgG4 человека представляет собой (SEQ ID NO: 15):
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WE SNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
согласно нумерации по индексу EU, представленном у Kabat, где X является лизином (К) или отсутствует.
[00100] Полиморфизмы наблюдались в нескольких разных положениях в константных участках антитела (например, в положениях Fc, включая, без ограничения указанным, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358, согласно нумерации по индексу EU, как указано у Kabat), и, таким образом, могут существовать небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями в известном уровне техники. Хорошо известны полиморфные формы иммуноглобулинов человека. В
настоящее время известны 18 аллотипов Gm: Glm (1, 2, 3, 17) или Glm (а, х, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (bl, сЗ, b3, bO, ЬЗ, b4, s, t, gl, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al, "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.}}. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). В частности, предполагается, что антитела по настоящему изобретению могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей, представленных в данном документе. Кроме того, в некоторых системах экспрессии С-концевой аминокислотный остаток (выделенный жирным шрифтом) домена СНЗ может быть посттрансляционно удален. Соответственно, С-концевой остаток домена СНЗ является необязательным аминокислотным остатком в молекулах, связывающих В7-НЗ (включая молекулы B7-H3-ADC) по изобретению. В частности, объектом настоящего изобретения являются В7-НЗ-связывающие молекулы (включая молекулы B7-H3-ADC), лишенные С-концевого остатка домена СНЗ. Также в частности в настоящее изобретение включены такие конструкции, которые содержат С-концевой остаток лизина в домене СНЗ.
[00101] В традиционной иммунной функции взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит к широкому спектру ответов, от эффекторных функций, таких как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как регулирование пролиферации лимфоцитов и секреция антител. Все эти взаимодействия инициируются посредством связывания домена Fc антител или иммунных комплексов со специализированными клеточными рецепторами на кроветворных клетках и, в частности, с рецепторами (в частности, называемыми "Fc-гамма-рецептором" "FcyR", и в совокупности "FcyRs"), обнаруженными на поверхностях нескольких типов клеток иммунной системы (например, В-лимфоцитов, фолликулярных дендритных клеток, естественных киллеров, макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и тучных клеток). Такие рецепторы имеют "внеклеточную" часть (которая, таким образом, способна лигировать с доменом Fc), "трансмембранную" часть (которая проходит через клеточную мембрану и "цитоплазматическую" часть (расположенную внутри клетки).
[00102] Разнообразие клеточных ответов вызванных антителами и иммунными комплексами является результатом структурной неоднородности трех Fc рецепторов: FcyRI (CD64), CD32A (FcyRIIA), FcyRIIB (CD32B), CD16A (FcyRIIIA) и CD 16В (FcyRIIIB). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD 16) являются активирующими рецепторами, так что их лигирование с доменом Fc активирует иммунную систему или
усиливает иммунный ответ. Напротив, FcyRIIB (CD32B) является ингибирующим рецептором; лигирование с доменом Fc ингибирует иммунный ответ или ослабляет существующий иммунный ответ. Кроме того, взаимодействие домена Fc с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) опосредует рециркуляцию молекул IgG из эндосомы на поверхность клетки и высвобождение в кровь. Аминокислотная последовательность примерных доменов Fc дикого типа IgGl (SEQ ID NO: 12), IgG2 (SEQ ID NO: 13), IgG3 (SEQ ID NO: 14) и IgG4 (SEQ ID NO: 15) представлена выше.
[00103] CD 16 является общим названием для активирующих рецепторов Fc, FcyRIIIA (CD 16А) и FcyRIIIB (CD 16В). CD 16 экспрессируют нейтрофилы, эозинофилы, клетки-естественные киллеры (NK) и тканевые макрофаги, которые связывают агрегированный, но не мономерный IgG человека (Peltz, GA et al. (1989) "Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3): 1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) "NK Cells In Therapy Of Cancer," Crit. Rev. Oncog. 19(1-2): 133-141; Miller, J.S. (2013) "Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic," Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al (2002) "Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases," Autoimmun Rev. 1(1-2): 13-19; Peipp, M. et al. (2002) "Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells," Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511). Эти рецепторы связываются с Fc-частью антител IgG, тем самым вызывая высвобождение цитокинов. Если такие антитела связаны с антигеном чужеродных клеток (например, опухолевых клеток), то такое высвобождение опосредует убийство опухолевой клетки. Поскольку такое убийство является антителозависимым, то оно называется антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC).
[00104]CD32A (FcyRIIA) (Brandsma, A.M. (2015) "Fc Receptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy," Immunol Rev. 268(l):74-87; van Sorge, N.M. et al. (2003) "Fcgammar Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy," Tissue Antigens 61(3): 189-202; Selvaraj, P. et al. (2004) "Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors," Immunol. Res. 29(l-3):219-230) и CD64 (FcyRI) (Lu, S. et al. (2015) "Structural Mechanism Of High Affinity FcyRI recognition Of Immunoglobulin G," Immunol. Rev. 268(1): 192-200; Swisher, J.F. et al. (2015) "The Many Faces Of FcyRI: Implications For Therapeutic Antibody Function," Immunol. Rev. 268(1): 160174; Thepen, T. et al. (2009) "Fcgamma Receptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer," Curr. Pharm. Des. 15(23):2712-2718; Rouard, H. et al. (1997) "Fc Receptors As Targets For Immunotherapy," Int. Rev. Immunol. 16(1-2): 147-185) активируют рецепторы Fc, которые
экспрессируются на макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах и дендритных клетках (и в случае CD32A, также на тромбоцитах и клетках Лангерганса). Напротив, CD32B (FcyRIIB) является ингибирующим Fc-рецептором на В-лимфоцитах (макрофагах, нейтрофилах и эозинофилах) (Stopforth, RJ et al. (2016) "Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcyRIIB," J. Clin. Immunol. [2016 Feb 27 Epub], pp. 1-7; Bruhns, P. et al. (2009) "Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants For Human IgG Subclasses," Blood. 113(16):3716-3725; White, AL. et al. (2014) "FcyRIIB As A Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy," Curr. Top. Microbiol. Immunol. 382:355372; Selvaraj, P. et al. (2004) "Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors," Immunol. Res. 29(l-3):219-230).
[00105] Способность различных FcyR опосредовать диаметрально противоположные функции отражает их структурные различия, и, в частности, обладает ли FcyR иммунорецепторным тирозиновым активирующим мотивом ("1ТАМ") или иммунорецепторным тирозиновым ингибирующим мотивом ("1Т1М"). Рекрутирование различных цитоплазматических ферментов в эти структуры диктует результат опосредованных FcyR клеточных ответов. ITAM-содержащие FcyR включают FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA и активируют иммунную систему при связывании с доменами Fc (например, агрегированными доменами Fc, присутствующими в иммунном комплексе). FcyRIIB является единственным в настоящее время известным природным ITIM-содержащим FcyR; он действует путем ослабления или ингибирования иммунной системы при связывании с агрегированными доменами Fc. Человеческие нейтрофилы экспрессируют ген FcyRIIA. Кластеризация FcyRIIA через иммунные комплексы или специфическое перекрестное связывание антителами служит для агрегации ITAM с рецептор-ассоциированными киназами, которые способствуют фосфорилированию IT AM. Фосфорилирование ITAM служит местом стыковки Syk-киназы, активация которой приводит к активации нижележащих субстратов (например, PL-K). Клеточная активация приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов. Ген FcyRIIB экспрессируется на В-лимфоцитах; его внеклеточный домен на 96% идентичен FcyRIIA и связывает комплексы IgG неразличимым образом. Присутствие ITIM в цитоплазматическом домене FcyRIIB определяет этот ингибирующий подкласс FcyR. Недавно была установлена молекулярная основа этого ингибирования. При совместном лигировании с активирующим FcyR ITIM в FcyRIIB становится фосфорилированным и притягивает домен SH2 инозитполифосфат-5'-фосфатазы (SHIP), который гидролизует мессенджер фосфоинозитол, высвобождаемый в результате активации тирозинкиназы, опосредованной ITAM-содержащим FcyR, следовательно, предотвращая приток
внутриклеточного Са++. Таким образом, перекрестное сшивание FcyRIIB ослабляет активирующий ответ на лигирование FcyR, ингибирует клеточную реакцию и останавливает активацию В-клеток, в результате чего пролиферация В-клеток и секреция антитела прекращаются.
П. Биспецифические антитела, мультиспецифические диатела и диатела DART(r)
[00106] Способность антитела связывать эпитоп антигена зависит от наличия и аминокислотной последовательности доменов антитела VL и VH. Взаимодействие легкой цепи и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействие его доменов VL и VH образует один из двух эпитопсвязывающих сайтов природного антитела, такого как IgG. Природные антитела способны связываться только с одним видом эпитопа (то есть, они моноспецифичны), хотя они могут связывать множество копий этого вида (т. е. проявлять бивалентность или мультивалентность).
[00107] Функциональность антител может быть повышена за счет получения мультиспецифичных молекул на основе антител, которые могут одновременно связывать два отдельных и отличающихся антигена (или различных эпитопов одного и того же антигена) и/или путем получения молекулы на основе антитела, имеющей более высокую валентность (т.е. более двух сайтов связывания) для того же эпитопа и/или антигена.
[00108] Для предоставления молекул, обладающих большими возможностями, чем природные антитела, был разработан широкий спектр форматов рекомбинантных биспецифических антител (см., например, публикации РСТ № WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), большинство из которых используют линкерные пептиды либо для того, чтобы соединить дополнительный эпитопсвязывающий фрагмент (например, scFv, VL, VH и т.д.) с или внутри ядра антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) или соединить множество эпитопсвязывающих фрагментов (например, два Fab-фрагмента или scFv). Альтернативные форматы используют линкерные пептиды для слияния эпитопсвязывающего фрагмента (например, scFv, VL, VH и т.д.) с доменом димеризации, таким как домен СН2-СНЗ или альтернативные полипептиды (WO 2005/070966, WO 2006/107786А WO 2006/107617А, WO 2007/046893). В публикациях РСТ, опубликованных в публикациях WO 2013/174873, WO 2011/133886 и WO 2010/136172, раскрывается триспецифическое антитело, в котором домены CL и СН1 переключаются с их соответствующих естественных положений, а домены VL и VH были диверсифицированы (WO 2008/027236 WO 2010/108127), чтобы они могли связываться с более чем одним антигеном. В публикациях РСТ № WO 2013/163427 и WO 2013/119903 раскрывается
модификация домена СН2, так, чтобы он содержал аддукт гибридного белка, включающий связывающий домен. В публикациях РСТ WO 2010/028797, WO2010028796 и WO 2010/028795 раскрыты рекомбинантные антитела, чьи домены Fc заменены дополнительными доменами VL и VH, чтобы образовать трехвалентные связывающие молекулы. В публикациях РСТ № WO 2003/025018 и WO2003012069 раскрыты рекомбинантные диатела, чьи индивидуальные цепи, содержат домены scFv. В публикации РСТ № WO 2013/006544 раскрыты многовалентные Fab-молекулы, которые синтезируются как одна полипептидная цепь, а затем подвергаются протеолизу с образованием гетеродимерных структур. Публикации РСТ № WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 и WO 1991/003493 раскрывают добавление дополнительных связывающих доменов или функциональных групп к антителу или части антитела (например, добавление диатела к легкой цепи антитела или добавление дополнительных доменов VL и VH в легкие и тяжелые цепи антитела, или добавления гетерологичного гибридного белка или связывания нескольких Fab-доменов друг с другом).
[00109] Кроме того, в данной области техники отмечается способность продуцировать диатела, которые отличаются от таких природных антител, способных связывать два или более различных видов эпитопов (т.е. проявлять биспецифичность или мультиспецифичность в дополнение к двухвалентной или многовалентной форме) (см., например, Holliger et al. (1993) "" Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments;' Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al); US 2004/0220388 / WO 02/02781 (Mertens et al); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity;" J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications" Protein Eng. Des. Sel. 17(l):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD 20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange" Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain" Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System" Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P. A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy" Cancer Res.
69(12):4941-4944).
[00110] Дизайн диатела основан на производном антитела, известном как одноцепочечный фрагмент вариабельного домена (scFv). Такие молекулы получают путем связывания вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепи с помощью короткого связующего пептида. Bird et al. (1988) ^Single-Chain Antigen-Binding Proteins" Science 242:423-426) описывает пример связывания пептидов, которые соединяют приблизительно 3,5 нм между карбоксильным концом одного вариабельного домена и аминоконцом другого вариабельного домена. Были разработаны и использованы линкеры с другими последовательностями (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins" Science 242:423-426). В свою очередь, линкеры могут быть модифицированы для дополнительных функций, таких как прикрепление лекарственных средств или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты могут быть получены либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетической выработки scFv может использоваться автоматизированный синтезатор. Для рекомбинантного продуцирования scFv подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, который кодирует scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как клетка дрожжей, растения, насекомого или млекопитающего, либо прокариотическую, такую как Е. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, могут быть изготовлены обычными манипуляциями, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv может быть выделен с применением стандартных способов очистки белка, известных в данной области.
[00111] Обеспечение биспецифических связывающих молекул (например, немоноспецифических диател) дает значительное преимущество перед антителами, включая, без ограничения указанным, "транс" связывающую способность, достаточную для совместного лигирования и/или совместной локализации различных клеток, которые экспрессируют различные эпитопы и/или "с18"-связывающую способность, достаточную для совместного лигирования и/или совместной локализации различных молекул, экспрессируемых одной и той же клеткой. Таким образом, биспецифические связывающие молекулы (например, немоноспецифические диатела) имеют широкое применение, включая терапию и иммунодиагностику. Биспецифичность обеспечивает большую гибкость в дизайне и разработке диатела в различных применениях, обеспечивая повышенную авидность к мультимерным антигенам, сшивание различных антигенов и направленное нацеливание на конкретные типы клеток, основанное на присутствии обоих целевых антигенов. Из-за их повышенной валентности, низких скоростей диссоциации и быстрого клиренса из кровотока (для небольших размеров, около или ниже ~ 50 кДа),
молекулы диател, известные в данной области, также показали особое применение в области визуализации опухоли (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris, " Protein Eng. 10:1221-1225).
[00112] Способность продуцировать биспецифические диатела привела к их применению (в "транс") для совместного лигирования двух клеток вместе, например, путем совместного лигирования рецепторов, присутствующих на поверхности разных клеток (например, соединяющего цитотоксические Т-клетки с опухолевыми клетками) (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies" Acta Pharmacol. Sin. 26:649658). Альтернативно (или дополнительно) биспецифические (или три- или мультиспецифические) диатела могут использоваться (в цис) для совместного лигирования молекул, таких как рецепторы и т.д., которые присутствуют на поверхности одной и той же клетки. Совместное лигирование различных клеток и/или рецепторов полезно для модуляции эффекторных функций и/или передачи сигналов иммунной системы. Мультиспецифические молекулы (например, биспецифические диатела), содержащие сайты, связывающие эпитоп, могут быть направлены на поверхностную детерминанту любой иммунной клетки, такой как CD2, CD3, CD8, CD 16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д., которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, клетках естественных киллерах (NK), антигенпредставляющих клетках или других мононуклеарных клетках. В частности, эпитопсвязывающие сайты, направленные на рецептор клеточной поверхности, которые присутствуют в иммунных эффекторных клетках, полезны для генерации мультиспецифических связывающих молекул, способных опосредовать перенацеленное уничтожение клеток.
[00113] Однако вышеупомянутые преимущества имеют значительную цену. Формирование таких немоноспецифических диател требует успешной сборки двух или более различных и несходных полипептидов (т.е. такое образование требует, чтобы диатела образовывались путем гетеродимеризации различных видов полипептидной цепи). Этот факт контрастирует с моноспецифическими диателами, которые образуются путем гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку, по меньшей мере, два разнородных полипептида (т.е. два вида полипептидов) должны быть предоставлены для образования немоноспецифического диатела, а также потому, что гомодимеризация таких полипептидов приводит к образованию неактивных молекул (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding
System" Protein Eng. 13(8):583-588), получение таких полипептидов должно осуществляться таким образом, чтобы предотвратить ковалентное связывание между полипептидами одного вида (то есть, чтобы предотвратить гомодимеризацию) (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System" Protein Eng. 13(8):583-588). Таким образом, в данной области сообщается о нековалентной ассоциации таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain" Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System" Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity" J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
[00114] Однако в данной области признается, что биспецифические диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются неустойчивыми и легко диссоциируют на нефункциональные мономеры (см., например, Lu, D. et al. (2005) "А Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity" J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
[00115] Столкнувшись с этой проблемой, в данной области удалось разработать стабильные, ковалентно связанные гетеродимерные немоноспецифические диатела, называемые диателами DART(r); см., например, публ. пат. США № 2013-0295121; 20100174053 и 2009-0060910; Европейские патентные публикации № ЕР 2714079; ЕР 2601216; ЕР 2376109; ЕР 2158221 и публ. РСТ № WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; и Sloan, DD et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells" PLoS Pathog. 11(1 l):el005233. doi: 10.1371/journal.ppat. 1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) "Targeting CD 123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(r)) Platform," Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates" Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P. A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C.
et al. (2010) "Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor lib (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold" Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion" J. Mol. Biol. 399(3):436-449). Такие диатела содержат два или более ковалентно комплексированных полипептида и включают создание одного или нескольких остатков цистеина в каждом из используемых полипептидных соединений, которые позволяют образовывать дисульфидные связи и тем самым ковалентно связывать одну или несколько пар таких полипептидных цепей друг с другом. Например, было показано, что добавление остатка цистеина к С-концу таких конструкций позволяет осуществить дисульфидное связывание между включенными полипептидными цепями, стабилизирующими полученное диатело, без интерференции с характеристиками связывания диатела.
[00116] Много вариаций таких молекул было описано (см., например, публ. пат. США № 2015/0175697, 2014/0255407, 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053, 2009/0060910, 2007-0004909, публ. европейского патента № ЕР 2714079, ЕР 2601216, ЕР 2376109, ЕР 2158221, ЕР 1868650 и публ. РСТ № WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538, WO 2006/113665) и приведено в данном документе.
[00117] Альтернативные конструкции известны в данной области для применений, в которых четырехвалентная молекула является предпочтительной, но Fc не требуется, включая, без ограничения указанным, четырехвалентные тандемные антитела, также называемые "TandAb" (см., например, публ. пат. США № 2005 -0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013-0189263, европейские патентные публикации № ЕР 1078004, ЕР 2371866, ЕР 2361936 и ЕР 1293514; публ. РСТ № WO 1999/057150, WO 2003/025018 и WO 2013/013700), которые образованы гомодимеризацией двух идентичных полипептидных цепей, каждая из которых обладает областью VH1, VL2, VH2 и VL2.
[00118] Недавно были описаны трехвалентные структуры, включающие два домена связывания по типу диатела и один домен не по типу диатела и домен Fc (см., например, публикации РСТ № WO 2015/184207 и WO 2015/184203). Такие трехвалентные связывающие молекулы могут быть использованы для получения моноспецифических, биспецифических или триспецифических молекул. Возможность связывания трех различных эпитопов обеспечивает расширенные возможности.
III. В7-НЗ человека
[00119] В7-НЗ человека существует как форма "4Ig" и как форма "2Ig". Аминокислотная последовательность типичной формы "4Ig" В7-НЗ человека (включая
сигнальную последовательность из 29 аминокислотных остатков, показанную подчеркиванием) представлена в последовательности NCBI NP_001019907 (SEQ ID NO: 16, сигнальная последовательность из 29 аминокислотных остатков показана подчеркиванием):
MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPVVA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYQG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSILRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQ VPEDPVVALV GTDATLRCSF SPEPGFSLAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG RDQGSAYANR TALFPDLLAQ GNASLRLQRV RVADEGSFTC FVSIRDFGSA AVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVFWQDGQ GVPLTGNVTT SQMANEQGLF DVHSVLRVVL GANGTYSCLV RNPVLQQDAH GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVALAFVCWR KIKQSCEEEN AGAEDQDGEG EGSKTALQPL KHSDSKEDDG QEIA
[00120] Аминокислотная последовательность "2Ig" формы В7-НЗ человека полностью охватывает форму "4Ig" В7-НЗ человека. Аминокислотная последовательность репрезентативной формы "2Ig" В7-НЗ человека (включая сигнальную последовательность из 29 аминокислотных остатков, показанную подчеркиванием) представлена в последовательности NCBI NP_079516 (SEQ ID NO: 17):
MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPVVA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALW VTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQ PLKHSDSKED DGQEIA
[00121] В некоторых воплощениях B7-H3-связывающие молекулы (например, scFv, антитела, биспецифические диатела и т.д.) по изобретению характеризуются любыми одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью или девятью из следующих критериев:
(1) способность иммуноспецифически связывать В7-НЗ человека, эндогенно экспрессируемого на поверхности раковой клетки;
(2) специфически связывать В7-НЗ приматов, не являющихся человеком (например, В7-НЗ яванского макака);
(1)
(3) специфически связывать В7-НЗ человека с равновесной константой связывания (KD) 1 нМ или менее;
(4) специфически связывать В7-НЗ приматов, не являющихся человеком, с равновесной константой связывания (KD) 1 нМ или менее;
(5) специфически связывать В7-НЗ человека со скоростью ассоциации (ka) 1 х 106 М"1 мин _1 или более;
(6) специфически связывать В7-НЗ приматов, не являющихся человеком, со скоростью ассоциации (ka) 1 х 106 М _1 мин _1 или более;
(7) специфически связывать В7-НЗ человека со скоростью диссоциации (kd) 15 х 10 "4 мин _1 или менее;
(8) специфически связывать В7-НЗ приматов, не являющихся человеком, со скоростью диссоциации (kd) 15 х 10 "4 мин _1 или менее;
(9) обладает способностью опосредовать перенацеленное уничтожение клеток (например, уничтожение раковых клеток, экспрессирующих В7-НЗ).
[00122] Как описано в данном документе в другом месте, константы связывания В7-НЗ-связывающей молекулы, могут быть определены с применением поверхностного плазмонного резонанса, например, с помощью анализа BIACORE(r). Данные поверхностного плазмонного резонанса могут быть апроксимированы к 1:1 модели связывания Ленгмюра (одновременно ka kd) и равновесная константа связывания KD, может быть рассчитана из соотношения констант скоростей реакции kd/ka. Такие константы связывания могут быть определены для моновалентной молекулы В7-НЗ-связывающей молекулы (т.е. молекулы, содержащей единственный В7-НЗ-эпитопсвязывающий сайт), двухвалентной молекулы В7-НЗ-связывающей молекулы (т.е. молекулы, содержащей два В7-НЗ-эпитопсвязывающих сайта) или В7-НЗ-связывающей молекулы, имеющие более высокую валентность (например, молекулы, содержащей три, четыре или более эпитопсвязывающих сайтов В7-НЗ).
[00123] Используемый в данном документе термин "перенацеленное уничтожение клеток" относится к способности молекулы опосредовать убийство клетки-мишени (например, раковой клетки) путем локализации иммунной эффекторной клетки (например, Т-клетки, NK-клетки и т.д.), в месте расположения клетки-мишени посредством связывания эпитопов, присутствующих на поверхностях таких эффекторных и клеток-мишеней, что приводит к уничтожению клетки-мишени. Способность В7-НЗ-связывающей молекулы (например, биспецифической В7-НЗ х CD3-связывающей молекулы) опосредовать перенаправленную активность уничтожения клеток может быть определена с применением анализа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Такие анализы
хорошо известны в данной области, и предпочтительные анализы описаны ниже.
[00124] Настоящее изобретение, в частности, охватывает В7-НЗ-связывающие молекулы (например, антитела, диатела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д.), содержащие анти-В7-НЗ вариабельные домены (т.е. VL и/или VH-домены), которые иммуноспецифически связываются с эпитопом полипептида В7-НЗ человека. Если не указано иное, все такие В7-НЗ-связывающие молекулы способны иммуноспецифически связываться с В7-НЗ человека. При использовании в данном документе, такие В7-НЗ вариабельные домены называются "анти-В7-НЗ-"уЪ" и "анти-В7-НЗ-УН" соответственно.
IV. Мышиные антитела против В7-НЗ человека и их гуманизированные производные
[00125] Из гибридомных клеток, которые были получены путем иммунизации клетками, экспрессирующими В7-НЗ человека, полипептидом В7-НЗ или его пептидным эпитопом, были выделены четыре типичных анти-В7-НЗ антитела, обозначенные как "mAb-A", "mAb-B", "mAb-С" и "mAb-D". Антитела "mAb-B", "mAb-С" и "mAb-D" были гуманизированы.
[00126] Было обнаружено, что антитела "mAb-С" и "mAb-D" являются перекрестно-реактивными с В7-НЗ яванского макака. Ниже приведены аминокислотные последовательности доменов VL и VH mAb-C и mAb-D. В одном воплощении предпочтительные связывающие молекулы против В7-НЗ человека настоящего изобретения обладают 1, 2 или всеми 3 CDRH домена VH и/или 1, 2 или всеми 3 CDRL домена VL, доменов VH и/или VL мышиного анти-В7-НЗ-моноклонального антитела mAb-D, химерного моноклонального антитела mAb-D ("chmAb-D") или гуманизированного моноклонального антитела mAb-C или mAb-D ("HmAb-С" или "hmAb-D"). Такие предпочтительные связывающие молекулы против В7-НЗ человека включают биспецифические (или мультиспецифические) антитела, химерные или гуманизированные антитела, BiTe, диатела и т.д., и такие связывающие молекулы, имеющие вариантные домены Fc. Изобретение охватывает применение любых mAb-A, mAb-B, mAb-C или mAb-D для образования В7-НЗ-связывающих молекул и, в частности, B7-H3-ADC.
А. Мышиные антитела против В7-НЗ человека mAb-A [00127] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL мышиного
анти-В7-НЗ антитела, обозначенного как "mAb-A" (SEQ ID NO: 95) (остатки CDRL
показаны подчеркиванием):
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS
ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS GTKLEIK
[00128] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH mAb-A (SEQ ID NO: 96) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS
B. Мышиные антитела против B7-H3 человека mAb-B
[00129] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL мышиного анти-В7-НЗ антитела, обозначенного как "mAb-B" (SEQ ID NO: 97) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK
[00130] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из mAb-B (SEQ ID NO: 98) (остатки CDRH показаны подчеркиванием).
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS
C. Гуманизированное антитело против B7-H3 человека hmAb-B [00131] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из hmAb-B
(SEQ ID NO: 99) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK
[00132] В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность CDRLI ИЗ hmAb-B (RASQDISJVYLN) (SEQ ID NO: 100) может быть заменена альтернативным CDRLI, имеющим аминокислотную последовательность RASQ51S5YLN (SEQ ID NO: 101). Аналогично, аминокислотная последовательность CDRL2 ИЗ hmAb-B (YTSRL/7S) (SEQ ID NO: 102) может быть заменена альтернативным CDRL2, имеющим аминокислотную последовательность YTSRL^S (SEQ ID NO: 103).
[00133] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из hmAb-B (SEQ ID NO: 104) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
[00134] В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность CDRH2 ИЗ hmAb-B (TIYPGDGDTRYTQKF^G) (SEQ ID NO: 105) может быть заменена альтернативным CDRH2, имеющим аминокислотную последовательность:
TIYPGGGDTRYTQKF^G (SEQ ID NO: 106)
D. Мышиное антитело против B7-H3 человека mAb-C
[00135] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL мышиного анти-В7-НЗ антитела, обозначенного как "mAb-С" (SEQ ID NO: 18) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG GGTNLEIK
[00136] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из mAb-C (SEQ ID NO: 19) (остатки CDRH показаны подчеркиванием).
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD GGAMDYWGQG TSVTVSS
E. Гуманизированное антитело против B7-H3 человека hmAb-C [00137] Вариабельные домены анти-В7-НЗ антитела mAb-C были гуманизированы.
В некоторых случаях были созданы альтернативные гуманизированные вариабельные домены для оптимизации активности связывания и/или для удаления антигенных эпитопов и/или для удаления потенциально лабильных аминокислотных остатков.
[00138] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из hmAb-C (SEQ ID NO: 20) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG QGTRLEIK
[00139] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из hmAb-C (SEQ ID NO: 21) (остатки CDRH показаны подчеркиванием).
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD GGAMDYWGQG TTVTVSS
F. Мышиное антитело против B7-H3 человека mAb-D
[00140] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL мышиного анти-В7-НЗ антитела, обозначенного как "mAb-D" (SEQ ID NO: 22) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKQ GHSPEALIYS ASYRYSGVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGG GTKLEIK
[00141] Аминокислотная последовательность домена CDRLI ИЗ mAb-D представляет собой (SEQ ID NO: 23): KASQNVDTNVA.
[00142] Аминокислотная последовательность домена CDRL2 ИЗ mAb-D
представляет собой (SEQ ID NO: 24): SASYRYS.
[00143] Аминокислотная последовательность домена CDRL3 ИЗ mAb-D представляет собой (SEQ ID NO: 25): QQYNNYPFT.
[00144] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из mAb-D (SEQ ID NO: 26) ( остатки CDR н показаны подчеркиванием):
DVQLAESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNSLF LQMTSLRSED TAMYYCARHG YRYEGFDYWG QGTTLTVSS
[00145] Аминокислотная последовательность домена CDRHI ИЗ mAb-D представляет собой (SEQ ID NO: 27): SFGMH.
[00146] Аминокислотная последовательность домена CDRH2 ИЗ mAb-D представляет собой (SEQ ID NO: 28): YISSGSGTIYYADTVKG.
[00147] Аминокислотная последовательность домена CDRH3 ИЗ mAb-D представляет собой (SEQ ID NO: 29): HGYRYEGFDY.
G. Гуманизированное антитело против B7-H3 человека mAb-D
[00148] Вариабельные Домены анти-В7-НЗ антитела mAb-D были гуманизированы. В некоторых случаях были созданы альтернативные гуманизированные вариабельные домены для оптимизации активности связывания и/или для удаления антигенных эпитопов и/или для удаления потенциально лабильных аминокислотных остатков.
[00149] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из hmAb-D (SEQ ID NO: 30) (остатки CDRL показаны подчеркиванием).
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK
[00150] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из hmAb-D (SEQ ID NO: 31) (остатки CDRH показаны подчеркиванием).
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHG YRYEGFDYWG QGTTVTVSS
V. Химерные антигенные рецепторы
[00151] B7-H3-связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими одноцепочечными молекулами, такими как одноцепочечные вариабельные фрагменты ("aHTH-B7-H3-scFv") или химерные антигенные рецепторы ("aHTH-B7-H3-CAR")). Как обсуждалось выше, scFv создаются путем связывания вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей вместе с помощью короткого связующего пептида. Первоначальные CAR обычно имели внутриклеточный домен из CD3 (^-цепи,
который является основным передатчиком сигналов от эндогенных TCR. CAR второго поколения обладают дополнительными внутриклеточными сигнальными доменами из различных костимулирующих белковых рецепторов (например, CD28, 41ВВ, ICOS и т.д.), присоединенных к цитоплазматическому хвосту CAR для того, чтобы обеспечить дополнительные сигналы Т-клетке. CAR третьего поколения объединяют несколько сигнальных доменов, таких как CD3z-CD28-41BB или CD3z-CD28-OX40, для дальнейшего повышения активности (Tettamanti, S. et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor" Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) "Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells" Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) "T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia" Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) "Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo" Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62).
[00152] AHTH-B7-H3-CAR по настоящему изобретению содержат aHTH-B7-H3-scFv, слитые с внутриклеточным доменом рецептора. Вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи aHTH-B7-H3-scFv предпочтительно представляют собой hmAb-C VL (SEQ ID NO: 20) и hmAb-C VH (SEQ ID NO: 21) или представляют собой предпочтительно hmAb-D VL (SEQ ID NO: 30) и hVH из mAb-D (SEQ ID NO: 31).
[00153] Внутриклеточный домен aHTH-B7-H3-CAR по настоящему изобретению предпочтительно выбран из внутриклеточного домена любого из: 41BB-CD3(^, b2c-CD3(^, CD28, CD28-4-lBB-CD3(; CD28-CD3(; CD28 -FcsRIy, CD28mut-CD3z, CD28-OX40-CD3z, CD28-OX40-CD3z, CD3z, CD4-CD3z, CD4-FcRRI, CD8-CD3z, FcsRIy, FcRRIyAAIX, херегулин-СОЗ(; IL-13-CD3(; или Ly49H-CD3z (Tettamanti, S. et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor" Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) "Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells" Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) "T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia" Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) "Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo" Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62).
VI. Мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы
[00154] Настоящее изобретение также направлено на мультиспецифические (например, биспецифические, триспецифические и т.д.). В7-НЗ-связывающие молекулы, содержащие эпитопсвязывающий сайт (предпочтительно содержащий 1, 2 или все 3 домена CDRH ИЗ домена VH против В7-НЗ по изобретению и/или 1, 2 или все 3 домена CDRL ИЗ домена VL против В7-НЗ по изобретению или такой домен VH против В7-НЗ и/или такой домен VL против В7-НЗ) и дополнительно содержащие второй эпитопсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывается со вторым эпитопом, где такой второй эпитоп представляет собой (i) другой эпитоп В7-НЗ или (ii) эпитоп молекулы, которая не является В7-НЗ. Такие мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы предпочтительно содержат комбинацию сайтов, связывающих эпитоп, которые распознают множество антигенов, уникальных для клеток-мишеней или типа ткани. В частности, настоящее изобретение относится к мультиспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, которые способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки, особенно Т-лимфоцита, естественного киллера (NK) или других мононуклеарных клеток. Например, такие В7-НЗ-связывающей молекулы по настоящему изобретению могут быть сконструированы так, чтобы содержать эпитопсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с CD2, CD3, CD8, CD 16, Т-клеточным рецептором (TCR) или NKG2D.
[00155] Одно воплощение настоящего изобретения относится к биспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, которые способны связываться с "первым эпитопом" и "вторым эпитопом", причем такие эпитопы не являются идентичными друг другу. Такие биспецифические молекулы содержат домены "VL1"/"VH1", которые способны связываться с первым эпитопом и домены "VL2"/"VH2", которые способны связываться со вторым эпитопом. Обозначения "VL1" и "VH1" указывают, соответственно, на вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают "первый" эпитоп таких биспецифических молекул. Точно так же обозначения "VL2" и "VH2" соответственно, указывают на вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают "второй" эпитоп таких биспецифических молекул. Не имеет значения, обозначен ли конкретный эпитоп первым и вторым эпитопом; причем такие обозначения имеют отношение только к наличию и ориентации доменов полипептидных цепей связывающих молекул по настоящему изобретению. В одном воплощении один из таких эпитопов представляет собой эпитоп В7-НЗ человека, а другой представляет собой другой эпитоп В7-НЗ или представляет
собой эпитоп молекулы, которая не является В7-НЗ. В конкретных воплощениях один из таких эпитопов представляет собой эпитоп В7-НЗ человека, а другой представляет собой эпитоп молекулы (например, CD2, CD3, CD8, CD16, Т-клеточного рецептора (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующие на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, клетка естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка. В некоторых воплощениях биспецифическая молекула содержит более двух эпитопсвязывающих сайтов. Такие биспецифические молекулы связывают, по меньшей мере, один эпитоп В7-НЗ и, по меньшей мере, один эпитоп молекулы, не являющийся В7-НЗ, и могут дополнительно связывать дополнительные эпитопы В7-НЗ и/или дополнительные эпитопы молекулы, которая не является В7 -НЗ.
[00156] Настоящее изобретение, в частности, относится к биспецифическим, триспецифическим и мультиспецифическим В 7-НЗ-связывающим молекулам (например, биспецифическим антителам, биспецифическим диателам, трехвалентным связывающим молекулам и т.д.), которые обладают эпитопсвязывающими фрагментами антител (например, доменами VL и VH), которые позволяют им иметь возможность координировать связь, по меньшей мере, с одним эпитопом В7-НЗ и, по меньшей мере, с одним эпитопом второй молекулы, которая не является В7-НЗ. Выбор доменов VL и VH полипептидных доменов таких молекул координируется таким образом, что полипептидные цепи, которые образуют такие мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы, собираются для образования, по меньшей мере, одного функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен, по меньшей мере, для одного эпитопа В7-НЗ и, по меньшей мере, одного функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен, по меньшей мере, для одного эпитопа молекулы, которая не является В7-НЗ. Предпочтительно, чтобы мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы содержали 1, 2 или все 3 CDRH домена VH против В7-НЗ по изобретению и/или 1, 2 или все 3 CDRL домена VL против В7-НЗ изобретения, или такой домен VH против В7-НЗ и/или такой домен VL против В7-НЗ, как предусмотрено в настоящем документе. А. Биспецифические антитела
[00157] Настоящее изобретение охватывает биспецифические антитела, способные одновременно связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом молекулы, которая не является В7-НЗ. В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, способное одновременно связываться с В7-НЗ и второй молекулой, которая не является В7-НЗ, получают с применением любого из способов, описанных в публикациях РСТ WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO
2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO 02010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 и WO 2014/022540, каждая из которых включена в настоящее описание ссылкой во всей своей полноте.
В. Биспецифические диатела, утратившие домены Fc
[00158] Одно воплощение настоящего изобретения относится к биспецифическим диателам, которые способны связываться с первым эпитопом и вторым эпитопом, причем первый эпитоп является эпитопом В7-НЗ человека, а второй является эпитопом молекулы, которая не является В7- НЗ, предпочтительно молекулы (например, CD2, CD3, CD8, CD 16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующей на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, клетка естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка. Такие диатела содержат и наиболее предпочтительно состоят из первой полипептидной цепи и второй полипептидной цепи, последовательности которых позволяют полипептидным цепям ковалентно связываться друг с другом с образованием ковалентно ассоциированного диатела, которое способно одновременно связываться с эпитопом В7 -НЗ и вторым эпитопом.
[00159] Первая полипептидная цепь такого воплощения биспецифических диател включает в направлении от N-конца к С-концу: N-конец домена VL моноклонального антитела, способного связываться с первым или вторым эпитопом (то есть, либо VL- анТи-B7-H3-VL либо УЬ-эпитогй), первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способный связываться со вторым эпитопом (если такая первая полипептидная цепь содержит УЬ-ан-ги-в7-нз-уь) или В7-НЗ (если такая первая полипептидная цепь содержит "УЪ-ЭПИТСИЙ), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий остаток цистеина, домен, стимулирующий гетеродимеризацию, и С-конец (Фигура 1).
[00160] Вторая полипептидная цепь этого воплощения биспецифических диател включает в направлении от N-конца к С-концу: N-конец, домен VL моноклонального антитела, способный связываться с первым или вторым эпитопом (т.е. либо VL ан-ги-в7-нз-VL, либо УЬ-ЭПИТСИЙ, являющийся доменом VL, не выбранным для включения в первую полипептидную цепь диатела), промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связывать либо второй эпитоп (если такая вторая полипептидная цепь содержит УЬ-ан-ги-в7-нз-уь), либо В7-НЗ (если такая вторая полипептидная цепь содержит УЬ-ЭПИТСИЙ), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий цистеиновый остаток, домен, способствующий
гетеродимеризации, и С-конец (Фигура 1).
[00161] Домен VL первой полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH второй полипептидной цепи с образованием первого функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен для первого антигена (т.е. либо В7-НЗ, либо молекулы, которая включает второй эпитоп). Аналогично, домен VL второй полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH первой полипептидной цепи, чтобы сформировать второй функциональный эпитопсвязывающий сайт, который специфичен для второго антигена (т.е. либо молекулы, которая включает второй эпитоп, либо В7-НЗ). Таким образом, выбор доменов VL и VH первой и второй полипептидных цепей координируется таким образом, что две полипептидные цепи диатела в совокупности содержат домены VL и VH, способные связываться как с эпитопом В7-НЗ, так и со вторым эпитоп (т.е. они в совокупности содержат VL-aHTH-B7-H3-vL/VH ан-ги-в7-нз-ун и VL-
эпитоп 2/УН-эпитоп 2).
[00162] Наиболее предпочтительно, чтобы длина промежуточного спейсерного пептида (т.е. "линкера 1", который разделяет такие домены VL и VH), была выбрана для существенного или полного предотвращения связывания VL- и VH-доменов полипептидной цепи друг с другом (например, состоящего из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислотных остатков промежуточного линкера). Таким образом, домены VL и VH первой полипептидной цепи по существу или полностью неспособны связываться друг с другом. Аналогично, Домены VL и VH второй полипептидной цепи по существу или полностью неспособны связываться друг с другом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) имеет последовательность (SEQ ID NO: 32): GGGSGGGG.
[00163] Длину и состав второго промежуточного спейсер ного пептида ("линкера 2") выбирают на основе выбора одного или нескольких полипептидных доменов, которые способствуют такой димеризации (т.е. "домена, способствующего гетеродимеризации"). Как правило, второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2) будет содержать 3-20 аминокислотных остатков. В частности, когда используемый домен(ы), способствующий гетеродимеризации, не содержит цистеиновый остаток, используется цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2). Цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2) будет содержать 1, 2, 3 или более цистеинов. Предпочтительный цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) имеет последовательность GGCGGG (SEQ ID NO: 33). В ином случае, линкер 2 не содержит цистеин (например, GGG, GGGS (SEQ ID NO: 34), LGGGSG (SEQ ID NO: 35), GGGSGGGGGGG (SEQ ID NO: 36), ASTKG (SEQ ID NO: 37), LEPKSS (SEQ ID NO: 38), APSSS (SEQ ID NO: 39) и т.д.) и цистеинсодержащий домен, способствующих
гетеродимеризации, как описано ниже. Необязательно, используются и цистеинсодержащий линкер 2, и цистеинсодержащий домен, способствующий гетеродимеризации.
[00164] Домены, способствующие гетеродимеризации, могут представлять собой GVEPKSC (SEQ ID NO: 40) или VEPKSC (SEQ ID NO: 41) или AEPKSC (SEQ ID NO: 42) на одной полипептидной цепи и GFNRGEC (SEQ ID NO: 43) или FNRGEC (SEQ ID NO: 42) ID NO: 44) на другой полипептидной цепи (US2007/0004909).
[00165] В предпочтительном воплощении домены, способствующие гетеродимеризации, будут содержать тандемно повторяющиеся спиральные домены противоположного заряда, например, спиральные домены "Е-спираль" (SEQ ID NO: 45: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK), чьи глутаматные остатки образуют отрицательный заряд при рН 7, и домены "К-спираль" (SEQ ID NO: 46: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE), чьи лизиновые остатки образуют положительный заряд при рН 7. Наличие таких заряженных доменов способствует ассоциации между первым и вторым полипептидами и, таким образом, способствует образованию гетеродимера. Домены, способствующие гетеродимеризации, которые включают модификации описанных выше последовательностей Е-спирали и К-спирали, могут включать один или несколько остатков цистеина. Наличие таких цистеиновых остатков позволяет спирали, присутствующей в одной полипептидной цепи, ковалентно связываться с дополнительной спиралью, присутствующей в другой полипептидной цепи, тем самым ковалентно связывая полипептидные цепи друг с другом и увеличивая стабильность диатела. Примеры таких особенно предпочтительных доменов, способствующих гетеродимеризации, включают модифицированную Е-спираль, имеющую аминокислотную последовательность EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 47), и модифицированную К-спираль, имеющую аминокислотную последовательность KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 48).
[00166] Как раскрыто в WO 2012/018687, с целью улучшения фармакокинетических свойств диател in vivo, диатело может быть модифицировано для включения полипептидной части связываемого сывороткой белка на одном или нескольких концах диатела. Наиболее предпочтительно такая полипептидная часть сывороточного связывающего белка будет установлена на С-конце полипептидной цепи диатела. Альбумин является самым распространенным белком в плазме и имеет период полувыведения 19 дней у людей. Альбумин обладает несколькими узлами связывания малых молекул, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и
тем самым продлевать период полувыведения в сыворотке. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) протеина G штамма G148 Streptococcus состоит из 46 аминокислотных остатков, образующих стабильный узел с тремя спиралями и обладающий широкой альбумин-связывающей специфичностью (Johansson, MU et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules" J. Biol. Chem. 277(10): 81148120. Таким образом, особенно предпочтительная полипептидная часть сывороточного связывающего белка для улучшения фармакокинетических свойств диатела in vivo представляет собой связывающий альбумин домен (ABD) из стрептококкового протеина G и более предпочтительно домен, связывающий альбумин 3 (ABD3) протеина G штамма Streptococcus G148 (SEQ ID NO: 49): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP.
[00167] Как раскрыто в WO 2012/162068 (в данный документ включен ссылкой), "деиммунизированные" варианты SEQ ID NO: 49 обладают способностью ослаблять или исключать связывание МНС класса П. Исходя из результатов комбинаторных мутаций, следующие комбинации замен считаются предпочтительными заменами для формирования такого деиммунизированного ABD: 66D/70S + 71 A; 66S/70S + 71 А; 66S/70S + 79А; 64А/65А/71А; 64А/65А/71А + 66S; 64А/65А/71А + 66D; 64А/65А/71А + 66е; 64А/65А/79А + 66S; 64А/65А/79А + 66D; 64А/65А/79А + 66е. Варианты ABD, имеющие модификации L64A, I65A и D79A или модификации N66S, T70S и D79A. Вариант деиммунизированного ABD, имеющий аминокислотную последовательность:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDeeNAKSvo A71EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:50),
или аминокислотную последовательность:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA^AesNNAKT VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ ID N0:51),
или аминокислотную последовательность:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLISeeNAKSvo VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ ID N0:52),
особенно предпочтительны, так как такие деиммунизированные ABD демонстрируют, по существу, связывание дикого типа, обеспечивая при этом ослабленное связывание с МНС класса П. Таким образом, первая полипептидная цепь такого диатела, имеющего ABD, содержит третий линкер (линкер 3), предпочтительно расположенный на С-конце Е-спирального (или К-спирального) домена такой полипептидной цепи, с целью интервенции между Е-спиральным (или К-спиральным) доменом и ABD (который предпочтительно является деиммунизированным ABD). Предпочтительной
последовательностью для такого линкера 3 является SEQ ID NO: 34: GGGS.
С. Мультиспецифические диатела, содержащие домены Fc [00168] Одно воплощение настоящего изобретения относится к мультиспецифическим диателам, способным одновременно связываться с эпитопом В7-НЗ и вторым эпитопом (т.е. с другим эпитопом В7-НЗ или эпитопом молекулы, которая не является В7-НЗ), которые включают домен Fc. Добавление домена IgG СН2-СНЗ в одну или обе из полипептидных цепей антитела, с которым комплексообразование цепей диатела приводит к образованию домена Fc, увеличивает биологический период полувыведения и/или изменяет валентность диатела. Такие диатела содержат две или более полипептидных цепей, последовательности которых позволяют полипептидным цепям ковалентно связываться друг с другом с образованием ковалентно связанного диатела, которое способно одновременно связываться с эпитопом В7-НЗ и вторым эпитопом. Включение доменов IgG СН2-СНЗ в оба полипептида диатела позволит сформировать двухцепочечное биспецифическое диатело, содержащее Fc-участок (Фигура 2).
[00169] В ином случае, включение доменов СН2-СНЗ из IgG только в один из
полипептидов диатела позволит образовывать более сложное четырехцепочечное
биспецифическое Fc-домен содержащее диатело (Фигура ЗА-ЗС). На Фигуре ЗС показано
типичное четырехцепочечное диатело, обладающее константным доменом легкой цепи
(CL) и константным доменом тяжелой цепи СН1, однако в качестве альтернативы могут
использоваться фрагменты таких доменов, а также другие полипептиды (см., например,
Фигуры ЗА и ЗВ, публ. пат. США № 2013-0295121, 2010-0174053 и 2009-0060910, европ.
пат. публ. № ЕР 2714079, ЕР 2601216, ЕР 2376109, ЕР 2158221 и публ. РСТ № WO
2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Так, например, вместо домена СН1
можно использовать пептид, имеющий аминокислотную последовательность GVEPKSC
(SEQ ID NO: 40), VEPKSC (SEQ ID NO: 41) или AEPKSC (SEQ ID NO: 42), полученный из
шарнирной области человеческого IgG, а вместо домена CL можно использовать С-
концевые 6 аминокислот легкой цепи каппа человека, GFNRGEC (SEQ ID NO: 43) или
FNRGEC (SEQ ID NO: 44). Репрезентативное четырехцепочечное диатело, содержащее
пептид, показано на Фигуре ЗА. В ином случае, или, кроме того, можно использовать
пептид, содержащий тандемные спиральные домены противоположного заряда, такие как
спиральные домены "Е-спираль" (SEQ ID N0:45: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-
EVAALEK или SEQ ID N0:47: ЕVААСЕК-ЕVAALEK-EVAALEK-EVAALEK); и домены
"К-спираль" (SEQ ID N0:46: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE или SEQ ID
N0:48: К V А АСКЕ-К V AALKE-K V A ALKE-K V A ALKE). Репрезентативное
четырехцепочечное диатело, содержащее спиральный домен, показано на Фигуре ЗВ.
[00170] Молекулы, содержащие домен Fc, по настоящему изобретению, могут включать дополнительные промежуточные спейсерные пептиды (линкеры), как правило, такие линкеры будут включены между доменом, способствующим гетеродимеризации (например, Е-спиралью или К-спиралью) и доменом СН2-СНЗ и/или между доменом СН2-СНЗ и вариабельным доменом (т.е. VH или VL). Как правило, дополнительные линкеры будут содержать 3-20 аминокислотных остатков и могут необязательно содержать всю или часть шарнирного домена IgG (предпочтительно цистеин-содержащую часть шарнирного домена IgG). Линкеры, которые могут быть использованы в биспецифических Fc-домен-содержащих молекулах диател по настоящему изобретению, включают: GGGS (SEQ ID NO: 34), LGGGSG (SEQ ID NO: 35), GGGSGGGGGGG (SEQ ID NO: 36), ASTKG (SEQ ID NO: 34) ID NO: 37), LEPKSS (SEQ ID NO: 38), APSSS (SEQ ID NO: 39), APSSSPME (SEQ ID NO: 53), VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 54), LEPKSADKTHTCPPC (SEQ ID NO: 55), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 56), GGC и GGG. LEPKSS (SEQ ID NO: 38) можно использовать вместо GGG или GGC для удобства клонирования. Кроме того, аминокислоты GGG или LEPKSS (SEQ ID NO: 38) могут следовать сразу после DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 56) с образованием альтернативных линкеров: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 57); и LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 58). Биспецифические Fc-домен-содержащие молекулы по настоящему изобретению могут включать шарнирный домен IgG в дополнение к или вместо линкера. Типичные шарнирные домены включают: EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 7) из IgGl, ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 8) из IgG2, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 10) из IgG4 и ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 11), вариант шарнира из IgG4, включающий стабилизирующую замену S228P (согласно нумерации в индексе EU, как указано в Kabat) для уменьшения обмена нитей.
[00171] Как показано на Фигурах ЗА-ЗС, Fc-домен-содержащие диатела изобретения могут включать четыре цепи. Первая и третья полипептидные цепи такого диатела включают три домена: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, (ш) домен, способствующий гетеродимеризации, и (iv) домен, содержащий СН2 -СНЗ. Вторая и четвертая полипептидные цепи содержат: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (ш) домен, способствующий гетеродимеризации, где домены, способствующие гетеродимеризации, стимулируют димеризацию первой/третьей полипептидных цепей со второй/четвертой полипептидными цепями. Области VL и/или VH третьей и четвертой полипептидных цепей, а также домены VL и/или VH первой и второй полипептидных цепей могут быть одинаковыми или различными с тем, чтобы
обеспечить четыреххвалентное связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим или тетраспецифическим. Обозначения "VL3" и "VH3" обозначают соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают "третий" эпитоп такого диатела. Аналогично, обозначения "VL4" и "VH4" обозначают соответственно: вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают "четвертый" эпитоп такого диатела. Общая структура полипептидных цепей репрезентативных четырехцепочечных биспецифических Fc-домен-содержащих диател по изобретению представлена в Таблице 1:
Таблица 1
Биспецифиче
ские
2- я цепь
NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH
1- я цепь
NH2 - VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
1- я цепь
NH2 - VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
2- я цепь
NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH
Тетраспециф ические
2- я цепь
NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH
1- я цепь
NH2 - VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH
3- я цепь
NH2 -VL3 -VH4-HPD-CH2-CH3 -COOH
4- я сеть
NH2 -VL4-VH3 -HPD-COOH
HPD = домен, способствующий гетеродимеризации
[00172] В конкретном воплощении изобретения антитела по настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-содержащими диателами, которые состоят из четырех полных полипептидных цепей (Фигуры ЗА-ЗС). Биспецифические, четырехвалентные, Fc-содержащие диатела по изобретению включают два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных к В7-НЗ (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом В7-НЗ или с различными эпитопами В7-НЗ), и два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифических ко второй молекуле (которая может быть способна связываться с одним и тем же эпитопом второй молекулы или с различными эпитопами второй молекулы). Предпочтительно, вторая молекула представляет собой молекулу (например, CD2, CD3, CD8, CD16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующую на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка.
[00173] В еще одном воплощении Fc-домен-содержащие диатела по настоящему изобретению, могут включать три полипептидные цепи. Первый полипептид такого диатела включает три домена: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, и (ш) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Второй полипептид такого диатела
включает: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (ш) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентной связи с первой полипептидной цепью диатела. Третий полипептид такого диатела включает последовательность СН2-СНЗ. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи такого диатела объединяются вместе с образованием эпитопсвязывающего сайта VL1/VH1, который способен связываться с первым антигеном (т.е. либо В7-НЗ, либо молекулой, которая включает второй эпитоп), а также эпитопсвязывающий сайт VL2/VH2, который способен связываться со вторым антигеном (т.е. либо с молекулой, которая включает второй эпитоп, либо В7-НЗ). Первый и второй полипептиды связаны друг с другом через дисульфидную связь, включающую цистеиновые остатки в их соответствующих третьих доменах. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи объединяются друг с другом с образованием домена Fc, который стабилизируется через дисульфидную связь. Такие биспецифические диатела обладают повышенной эффективностью. На Фигурах 4А и 4В показаны структуры таких диател. Такие Fc-участок-содержащие диатела могут иметь одну из двух ориентаций (Таблица 2):
Таблица 2
Первая ориентация
3- я
цепь
NH2-CH2-CH3-COOH
1- я цепь
NH2-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
2- я цепь
NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
Вторая ориентация
3- я цепь
NH2-CH2-CH3-COOH
1- я цепь
NH2-CH2-CH3 - VL 1 - VH2-HPD-COOH
2- я цепь
NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
HPD = домен, способствующий гетеродимеризации
[00174] В конкретном воплощении изобретения антитела по настоящему изобретению являются биспецифическими, двухвалентными (т.е. обладают двумя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-содержащими диателами, которые состоят из трех полных полипептидных цепей (Фигуры 4А-4В). Биспецифические двухвалентные Fc-содержащие диатела по изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифичный к В7-НЗ, и один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифичный ко второй молекуле. Предпочтительно, вторая молекула представляет собой молекулу (например, CD2, CD3, CD8, CD16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующую на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит,
естественный киллер (NK) или другие мононуклеарные клетки.
[00175] В еще одном воплощении Fc-домен-содержащие диатела, могут содержать в общей сложности пять полипептидных цепей. В конкретном воплощении две из указанных пяти полипептидных цепей имеют одинаковую аминокислотную последовательность. Первая полипептидная цепь такого диатела включает: (i) домен, содержащий VH1, (ii) содержащий СН1 домен и (ш) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Первой полипептидной цепью может быть тяжелая цепь антитела, которая включает VH1 и константную область тяжелой цепи. Вторая и пятая полипептидные цепи такого диатела включают: (i) домен, содержащий VL1, и (ii) домен, содержащий CL. Вторая и/или пятая полипептидные цепи такого диатела могут быть легкими цепями антитела, которые содержат VL1, комплементарный VH1 первой/третьей полипептидной цепи. Первую, вторую и/или пятую полипептидные цепи можно выделить из встречающегося в природе антитела. В ином случае, они могут быть сконструированы рекомбинантно. Третья полипептидная цепь такого диатела включает: (i) домен, содержащий VH1, (ii) домен, содержащий СН1, (ш) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ, (iv) домен, содержащий VL2, (v) домен, содержащий VH3, и (vi) домен, способствующий гетеродимеризации, где домены, способствующие гетеродимеризации, стимулируют димеризацию третьей цепи с четвертой цепью. Четвертый полипептид таких диател включает: (i) домен, содержащий VL3, (ii) домен, содержащий VH2, и (ш) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентной связи с третьей полипептидной цепью диатела.
[00176] Таким образом, первая и вторая, и третья и пятая полипептидные цепи таких диател связываются вместе с образованием двух эпитопсвязывающих сайтов VL1/VH1, способных связывать первый эпитоп. Третью и четвертую полипептидные цепи таких диател связывают вместе с образованием эпитопсвязывающего сайта VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом, а также сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом. Первый и третий полипептиды связаны друг с другом через дисульфидную связь, включающую цистеиновые остатки в их соответствующих константных областях. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи образуют комплекс друг с другом для образования домена Fc. Такие мультиспецифические диатела обладают повышенной эффективностью. На Фигуре 5 показана структура таких диател. Понятно, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различными для того, чтобы сделать возможным связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим. Как указано в данном документе, эти домены предпочтительно
выбирают таким образом, чтобы связывать эпитоп В7-НЗ, эпитоп второй молекулы и необязательно эпитоп третьей молекулы.
[00177] Домены VL и VH полипептидных цепей выбирают так, чтобы образовались сайты связывания VL/VH, специфичные к искомому эпитопу. Сайты связывания VL/VH, образованные ассоциацией полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различными для того, чтобы обеспечить однохвалентное связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или тетраспецифическим. В частности, домены VL и VH могут быть выбраны таким образом, при котором мультивалентное диатело может включать два сайта связывания для первого эпитопа и два сайта связывания для второго эпитопа или три сайта связывания для первого эпитопа и один сайт связывания для второго эпитопа, или два сайта связывания для первого эпитопа, один сайт связывания для второго эпитопа и один сайт связывания для третьего эпитопа (как показано на Фигуре 5). Общая структура полипептидных цепей репрезентативных пятицепочечных Fc-домен-содержащих диател по изобретению представлена в Таблице 3:
Таблица 3
Биспецифические (2x2)
2- я цепь
NH2-VLI-CL-COOH
1- я цепь
NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-C00H
3- я цепь
NH2-VH1-CHI-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH
5- я цепь
NH2-VLI-CL-COOH
4- я цепь
NH2-VL2-VH2-HPD-COOH
Биспецифический (3x1)
2- я цепь
NH2-VLI-CL-COOH
1- я цепь
NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-C00H
3- я цепь
NH2-VH1 -CHI -СН2-СНЗ - VL 1 - VH2-HPD-COOH
5- я цепь
NH2-VLI-CL-COOH
4- я сеть
NH2-VL2-VHI-HPD-COOH
Триспецифические (2x1x1)
2- я цепь
NH2-VLI-CL-COOH
1- я цепь
NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-C00H
3- я цепь
NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH
5- я цепь
NH2-VLI-CL-COOH
4- я цепь
NH2-VL3-VH2-HPD-COOH
HPD = домен, способствующий гетеродимеризации
[00178] В конкретном воплощении изобретения антитела по настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-содержащими диателами, которые состоят из пяти
полных полипептидных цепей, имеющих два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных к В7-НЗ (который могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом В7-НЗ или с различными эпитопами В7-НЗ) и двумя эпитопсвязывающими сайтами, специфичными ко второй молекуле (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом второй молекулы или с различными эпитопами второй молекулы). В другом воплощении биспецифические, четырехвалентные Fc-содержащие диатела по изобретению содержат три эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифических к В7-НЗ (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом В7-НЗ или с двумя или тремя различными эпитопами В7-НЗ) и один эпитопсвязывающий сайт, специфичный к второй молекуле. В другом воплощении биспецифические, четырехвалентные Fc-содержащие диатела по изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифичный к В7-НЗ, и три эпитопсвязывающих сайта, специфичных ко второй молекуле (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом второй молекулы или двумя или тремя разными эпитопами второй молекулы). Как указано выше, домены VL и VH могут быть выбраны для разрешения триспецифического связывания. Соответственно, изобретение также охватывает триспецифические четырехвалентные Fc-содержащие диатела. Триспецифические четырехвалентные Fc-содержащие диатела по изобретению содержат два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных к В7-НЗ, один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифичный ко второй молекуле, и один эпитопсвязывающий сайт иммуноспецифичный к третьей молекуле. В некоторых воплощениях вторая молекула представляет собой молекулу (например, CD2, CD3, CD8, CD 16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующую на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка. В некоторых воплощениях вторая молекула представляет собой CD3, а третья молекула представляет собой CD8.
D. Трехвалентные связывающие молекулы, содержащие домены Fc [00179] Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к трехвалентным связывающим молекулам, содержащим домен Fc, которые способны одновременно связывать первый эпитоп, второй эпитоп и третий эпитоп, причем, по меньшей мере, один из таких эпитопов не идентичен другому. Такие трехвалентные связывающие молекулы содержат три эпитопсвязывающих сайта, два из которых являются связующими доменами по типу диатела, которые обеспечивают связывание сайта А и связывание сайта В, и один из которых является связывающим доменом Fab-типа или связывающим доменом scFv-типа, которые обеспечивают связывающий сайт С (см., например, Фигуры 6A-6F и РСТ №
заявки: PCT/US15/33081 и PCT/US15/33076). Таким образом, такие трехвалентные связывающие молекулы включают домены "VL1"/"VH1", которые способны связываться с первым эпитопом и домены "VL2"/"VH2", которые способны связываться со вторым эпитопом и домены "VL3" и "VH3" которые способны связываться с "третьим" эпитопом такой трехвалентной связывающей молекулы. "Связывающий домен по типу диатела" является типом эпитопсвязывающего сайта, присутствующего в диателе, и, в частности, диателе DART(r), как описано выше. Каждый из "связывающих доменов Fab-типа" и "связывающих доменов scFv-типа" являются эпитопсвязывающими сайтами, которые образованы взаимодействием домена VL легкой цепи иммуноглобулина и комплементарного домена VH тяжелой цепи иммуноглобулина. Связывающие домены Fab-типа отличаются от связывающих доменов по типу диатела, поскольку две полипептидные цепи, которые образуют связывающий домен Fab-типа, содержат только один эпитопсвязывающий сайт, тогда как две полипептидные цепи, которые образуют связывающий домен по типу диатела, включают не менее двух эпитопсвязывающих сайтов. Аналогичным образом, связывающие домены scFv-типа также отличаются от связывающих доменов по типу диатела, поскольку они содержат только один эпитопсвязывающий сайт. Таким образом, используемые в данном документе связывающие домены Fab-типа и scFv-типа отличаются от связывающих доменов по типу диатела.
[00180] Как правило, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению будут содержать четыре различные полипептидные цепи (см. Фигуры 6А-6В), однако молекулы могут содержать меньшее или большее количество полипептидных цепей, например, путем слияния таких полипептидных цепей друг с другом (например, через пептидную связь) или путем деления таких полипептидных цепей с образованием дополнительных полипептидных цепей или путем связывания меньших или дополнительных полипептидных цепей через дисульфидные связи. Фигуры 6C-6F иллюстрируют этот аспект настоящего изобретения, схематически изображая такие молекулы, имеющие три полипептидные цепи. Как показано на Фигурах 6A-6F, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут иметь альтернативные ориентации, в которых области связывания типа диатела являются N-концевыми (Фигуры 6А, 6С и 6D) или С-концевыми (Фигуры 6В, 6Е и 6F) относительно домена Fc.
[00181] В некоторых воплощениях первая полипептидная цепь таких трехвалентных связывающих молекул по настоящему изобретению включает: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, (ш) домен, способствующий
гетеродимеризации, и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Домены VL1 и VL2 расположены на N-конце или С-конце относительно домена, содержащего СН2-СНЗ, как представлено в Таблице 3 (см. также Фигуры 6А и 6В). Вторая полипептидная цепь таких воплощений включает: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (ш) домен, способствующий гетеродимеризации. Третья полипептидная цепь таких воплощений содержит: (i) домен, содержащий VH3, (ii) домен, содержащий СН1, и (ш) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Третья полипептидная цепь может быть тяжелой цепью антитела, которая включает VH3 и константную область тяжелой цепи, или полипептид, который содержит такие домены. Четвертый полипептид таких воплощений содержит: (i) домен, содержащий VL3, и (ii) домен, содержащий CL. Четвертые полипептидные цепи могут быть легкой цепью антитела, которая содержит VL3, комплементарный VH3 третьей полипептидной цепи, или полипептид, который содержит такие домены. Третья или четвертая полипептидные цепи могут быть выделены из встречающихся в природе антител. В ином случае, они могут быть сконструированы рекомбинантно, синтетически или другими способами.
[00182] Вариабельный домен легкой цепи первой и второй полипептидных цепей отделяются от вариабельных доменов тяжелой цепи таких полипептидных цепей промежуточным спейсерным пептидом, длина которого слишком коротка для того, чтобы позволить их доменам VL1/VH2 (или их VL2/VH1) ассоциироваться вместе для того, чтобы образовать эпитопсвязывающий сайт, способный связываться с первым или вторым эпитопом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) для этой цели имеет последовательность (SEQ ID NO: 32): GGGSGGGG. Другие домены трехвалентных связывающих молекул могут быть разделены одним или несколькими промежуточными спейсерными пептидами (линкерами), необязательно содержащими остаток цистеина. В частности, как указано выше, такие линкеры обычно будут включены между вариабельными доменами (т.е. VH или VL) и пептидными доменами, способствующими гетеродимеризации, (например, Е-спиральным или К-спиральным) и между пептидными доменами, способствующими гетеродимеризации, (например, Е-спиральным или К-спиральным) и СН2-СНЗ-доменами. Примерные линкеры, полезные для получения трехвалентных связывающих молекул, приведены выше и также представлены в заявках РСТ No: PCT/US 15/33081; и PCT/US 15/33076. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких трехвалентных связывающих молекул связываются вместе, образуя сайт связывания VL1/VH1, способный связывать первый эпитоп, а также сайт связывания VL2/VH2, который способен связывать второй эпитоп. Третья и четвертая полипептидные цепи таких трехвалентных связывающих молекул
связываются вместе, образуя сайт связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом.
[00183] Как описано выше, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут содержать три полипептида. Трехвалентные связывающие молекулы, содержащие три полипептидные цепи, могут быть получены путем связывания доменов N-конца четвертого полипептида с VH3-содержащим доменом третьего полипептида (например, с применением промежуточного спейсерного пептида (Линкер 4)). В ином случае, в третьей полипептидной цепи трехвалентной связывающей молекулы по изобретению, содержащей следующие домены, используется: (i) домен, содержащий VL3, (ii) домен, содержащий VH3, и (ш) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ, в которой VL3 и VH3 отделены друг от друга промежуточным спейсерным пептидом, который является достаточно длинным (по меньшей мере, 9 или более аминокислотных остатков), для того, чтобы при ассоциации этих доменов мог образовываться эпитопсвязывающий сайт. Один предпочтительный промежуточный спейсерный пептид для этой цели имеет последовательность: GGGGGGGGGGGGGGS (SEQ ID NO: 59).
[00184] Понятно, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 таких трехвалентных связывающих молекул могут быть разными, чтобы можно было обеспечить моноспецифическое, биспецифическое или триспецифическое связывание. В частности, домены VL и VH могут быть выбраны таким образом, чтобы трехвалентная связывающая молекула содержала два сайта связывания для первого эпитопа и один сайт связывания для второго эпитопа или один сайт связывания для первого эпитопа и два сайта связывания для второго эпитопа, или один сайт связывания для первого эпитопа, один сайт связывания для второго эпитопа и один сайт связывания для третьего эпитопа.
[00185] Однако, как указано в данном документе, эти домены предпочтительно выбирают таким образом, чтобы связывать эпитоп В7-НЗ, эпитоп второй молекулы и эпитоп третьей молекулы. В некоторых воплощениях вторая молекула представляет собой молекулу (например, CD2, CD3, CD8, CD16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующую на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, клетка естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка. В некоторых воплощениях третья молекула представляет собой CD8.
[00186] Общая структура полипептидных цепей репрезентативных трехвалентных связывающих молекул по изобретению представлена на Фигурах 6A-6F и в Таблице 4:
Таблица 4
Четыре цепи 1 -я ориентация
2- я цепь
NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
1- я цепь
NH2-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
3- я цепь
NH2-VH3 -СН1-СН2-СНЗ -СООН
2- я цепь
NH2 -VL3-CL-COOH
Четыре цепи 2-я ориентация
2- я цепь
NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH
1- я цепь
NH2 -CH2-CH3 - VL 1-VH2-HPD-COOH
3- я цепь
NH2 -VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
2- я цепь
NH2 -VL3-CL-COOH
Три цепи
1 -я ориентация
2- я цепь
NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH
1- я цепь
NH2 - VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH
3- я цепь
NH2, -VL3-VH3-nrn-CH2-CH3-COOH
Три цепи
2- я ориентация
2- я цепь
NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
1- я цепь
NH2-CH2-CH3 - VL 1-VH2-HPD-COOH
3- я цепь
NH2-VL3-VH3 -HPD-CH2-CH3 -COOH
HPD = домен, способствующий гетеродимеризации
[00187] Одно воплощение настоящего изобретения относится к трехвалентным связывающим молекулам, которые включают два эпитопсвязывающих сайта для В7-НЗ и один эпитопсвязывающий сайт для второй молекулы. Два эпитопсвязывающих сайта для В7-НЗ могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы. Другое воплощение настоящего изобретения относится к трехвалентным связывающим молекулам, которые включают один эпитопсвязывающий сайт для В7-НЗ и два эпитопсвязывающих сайта для второй молекулы. Два эпитопсвязывающих участка для второй молекулы могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы второй молекулы. Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к триспецифическим трехвалентным связывающим молекулам, которые включают один эпитопсвязывающий сайт для В7-НЗ, один эпитопсвязывающий сайт для второй молекулы и один эпитопсвязывающий сайт для третьей молекулы. В некоторых воплощениях вторая молекула представляет собой молекулу (например, CD2, CD3, CD8, CD16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.), присутствующую на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, клетка естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка. В некоторых воплощениях вторая молекула представляет собой CD3, а третья молекула представляет собой CD8. Как
указано выше, такие трехвалентные связывающие молекулы могут содержать три, четыре, пять или более полипептидных цепей. VII. Модификация домена Fc
[00188] Домен Fc из Fc-домен-содержащих молекул (например, антител, диател, трехвалентных связывающих молекул и т.д.) по настоящему изобретению может быть либо полным доменом Fc (например, полным доменом IgG Fc), либо только фрагментом домена Fc. Необязательно, домен Fc из Fc-домен-содержащих молекул по настоящему изобретению не имеет С-концевого аминокислотного остатка лизина.
[00189] В традиционной иммунной функции взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит к широкому спектру ответов, начиная от эффекторных функций, таких как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как регулирование пролиферации лимфоцитов и секреция антител. Все эти взаимодействия инициируются посредством связывания домена Fc антител или иммунных комплексов с специализированными клеточными рецепторами клеток на гематопоэтических клетках. Разнообразие клеточных ответов, вызванных антителами и иммунными комплексами, обусловлено структурной гетерогенностью трех Fc-рецепторов: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD 16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD 16) являются активирующими (т.е. усиливающими иммунную систему) рецепторами; FcyRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. ослабляющим иммунную систему) рецептором. Кроме того, взаимодействие с неонатальным рецептором Fc (FcRn) опосредует рециркуляцию молекул IgG из эндосомы на поверхность клетки и высвобождение в кровь. Ниже представлена аминокислотная последовательность типичного IgGl (SEQ ID NO: 12), IgG2 (SEQ ID NO: 13), IgG3 (SEQ ID NO: 14) и IgG4 (SEQ ID NO: 15) дикого типа.
[00190] Модификация домена Fc может привести к измененному фенотипу, например, измененному периоду полувыведения в сыворотке, измененной стабильности, измененной восприимчивости к клеточным ферментам или измененной эффекторной функции. Поэтому может быть желательно модифицировать, например, Fc-домен-содержащую В7-НЗ-связывающую молекулу в отношении эффекторной функции для того, чтобы повысить эффективность такой молекулы при лечении рака. Снижение или исключение эффекторной функции желательно в некоторых случаях, например, в случае антител, механизм действия которых связан с блокированием или антагонизмом, но не с уничтожением клеток, несущих целевой антиген. Повышенная эффекторная функция, как правило, является желательной, когда она направлена на нежелательные клетки, такие как опухолевые и инородные клетки, где FcyR экспрессируются на низких уровнях, например,
опухолеспецифические В-клетки с низким уровнем FcyRIIB (например, неходжкинская лимфома, CLL, и лимфома Беркитта). Молекулы по изобретению, обладающие такой назначенной или измененной эффекторной функциональной активностью, полезны для лечения и/или профилактики заболевания, расстройства или инфекции, в которых желательна повышенная эффективность активности эффекторных функций.
[00191] Соответственно, в некоторых воплощениях домен Fc из Fc-домен-содержащих молекул настоящего изобретения может быть сконструированным вариантным доменом Fc. Хотя домен Fc из биспецифических Fc-домен-содержащих молекул по настоящему изобретению может обладать способностью связываться с одним или несколькими Fc-рецепторами (например, FcyR (R)), более предпочтительно, если такой вариантный домен Fc имеет измененное связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD 16a) или FcyRIIIB (CD 16b) (относительно связывания, проявляемого доменом Fc дикого типа), например, будет иметь усиленное связывание с активирующим рецептором и/или будет иметь существенно сниженное связывание или не будет обладать способностью связываться с ингибирующим рецептором(ами). Таким образом, домен Fc из Fc-домен-содержащих молекул по настоящему изобретению может включать часть или весь домен СН2 и/или часть или весь домен СНЗ полного домена Fc или может включать вариант СН2 и/или вариант СНЗ (который может включать, например, одну или несколько вставок и/или одну или несколько делеций по отношению к доменам СН2 или СНЗ полного домена Fc). Такие домены Fc могут содержать фрагменты He-Fc-полипептида, или могут содержать части неприродных полных доменов Fc или могут содержать неприродные ориентации доменов СН2 и/или СНЗ (такие как, например, два домена СН2 или два СНЗ или в направлении от N-конца к С-концу, домен СНЗ, связанный с доменом СН2 и т.д.).
[00192] Модификации домена Fc, идентифицированные как изменяющие эффекторную функцию, известны в данной области, и включают модификации, которые увеличивают связывание с активирующими рецепторами (например, FcyRIIA (CD 16А) и уменьшают связывание с ингибирующими рецепторами (например, FcyRIIB (CD32B) (см., например, Stavenhagen, JB et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors" Cancer Res. 57(18):8882-8890). В Таблице 5 приведены типичные одиночные, двойные, тройные, четверные и пятикратные замены (нумерация и замены относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12) типичной модификации, которая увеличивает связывание с активирующими рецепторами и/или уменьшает связывание с ингибирующими рецепторами.
Таблица 5
Вариации предпочтительных активирующих доменов Fc
Вариации и одном саше
F243L
R292G
D270E
R292P
Y300L
P396L
Вариации в .тух caii ia\
1243L и R292P
F243L и Y3UUL
F243L и P396L
R292P и Y3UUL
D270EHP396L
R292P и V305I
P396L и Q419H
P247LHN421K
R292P и P396L
Y300L и P396L
R255LHP396L
R292P и P305I
K392T и Р396Т.
Вариации в i рс\ cai'nax
F243L, P247LHN421K
P247L, D270EHN421K
F243L, R292P и Y300L
R255L, D270EHP396L
F243L, R292P и V305I
D270E, G316DHR416G
F243L, R292P и P396L
D270E, K392T иР396Ь
F243L, Y300L и P396L
D270E, P396L и Q419H
V284M, R292L и K370N
R292P, Y300LHP396L
Вариации n MCI i.ipcx caii ia\
L234F, F243L, R292P и Y300L
F243L, P247L, D270E HN421K
L234F, F243L, R292P и Y300L
F243L, R255L, D270E и P396L
L235I, F243L, R292P и Y300L
F243L, D270E, G316D и R416G
L235Q, F243L, R292P и Y300L
F243L, D270E, K392T и P396L
P247L, D270E, Y300L HN421K
F243L, R292P, Y300L и P396L
R255L, D270E, R292G и P396L
F243L, R292P, V305I и P396L
R255L, D270E, Y300L и P396L
F243L, D270E, P396L и Q419H
D270E, G316D, P396L и R416G
Вариации и и"iи cai'nax
L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L
F243L, R292P, V305I, Y300L и P396L
L235P, F243L, R292P, Y300L и P396L
[00193] Примерные варианты доменов Fc из IgGl человека с уменьшенным связыванием с CD32B и/или повышенным связыванием с CD16A содержат замены F243L, R292P, Y300L, V305I или P296L. Эти аминокислотные замены могут присутствовать в домене Fc из IgGl человека в любой комбинации. В одном воплощении вариантный домен Fc из IgGl человека содержит замены F243L, R292P и Y300L. В другом воплощении вариантный домен Fc из IgGl человека содержит замены F243L, R292P, Y300L, V305IHP296L.
[00194] В некоторых воплощениях предпочтительно, чтобы домены Fc из В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению демонстрировали уменьшенное (или практически отсутствующее) связывание с FcyRI A (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD 16а)) или FcyRIIIB (CD 16b) (относительно связывания, проявляемого доменом Fc из IgGl дикого типа (SEQ ID NO: 12). В конкретном воплощении В7-НЗ-связывающие молекулы настоящего изобретения содержат домен Fc из IgG, который демонстрирует уменьшенную эффекторную функцию ADCC. В
предпочтительном воплощении домены СН2-СНЗ таких В7-НЗ-связывающих молекул включают любые 1, 2, 3 или 4 замены: L234A, L235A, D265A, N297Q и N297G. В другом воплощении домены СН2-СНЗ включают замену N297Q, замену N297G, замены L234A и L235A или замену D265A, поскольку эти мутации устраняют связывание с FcR. В ином случае, используется домен СН2-СНЗ естественного домена Fc, который по своей природе проявляет уменьшенное (или практически отсутствующее) связывание с FcyRIIIA (CD 16а) и/или сниженную эффекторную функцию (относительно связывания и эффекторной функции, проявляемой доменом Fc из IgGl дикого типа (SEQ ID NO: 12)). В конкретном воплощении В7-НЗ-связывающие молекулы настоящего изобретения содержат домен Fc из IgG2 (SEQ ID NO: 13) или домен Fc из IgG4 (SEQ ID NO: 4). Когда используется домен Fc из IgG4, настоящее изобретение также охватывает введение стабилизирующей мутации, такой как замена S228P в шарнирном домене, описанная выше (см., например, SEQ ID NO: 11). Поскольку замены N297G, N297Q, L234A, L235A и D265A отменяют эффекторную функцию, в тех случаях, когда желательна эффекторная функция, эти замены предпочтительно не будут использоваться.
[00195] Предпочтительная последовательность IgGl для доменов СН2 и СНЗ из Fc-домен-содержащих молекул по настоящему изобретению, имеющих пониженную или отсутствующую эффекторную функцию, будет включать замены L234A/L235A (SEQ ID NO: 60):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WE SNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX
где X представляет собой лизин (К) или отсутствует.
[00196] Период полувыведения белков в сыворотке, содержащих домены Fc, может быть увеличен за счет увеличения аффинности связывания домена Fc с FcRn. Используемый в данном документе термин "период полувыведения" означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое является мерой среднего времени выживания молекул после их введения. Период полувыведения может быть выражен как время, необходимое для устранения 50% известного количества молекулы из организма объекта (например, человека или другого млекопитающего) или, например, из его определенного отдела, измеренный в сыворотке, т.е. период полувыведения в кровотоке или в других тканях. В общем, увеличение периода полувыведения приводит к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке для введенной молекулы.
[00197] В некоторых воплощениях В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный домен Fc, где указанный вариантный домен Fc включает, по меньшей мере, одну модификацию аминокислоты относительно домена Fc дикого типа, так что указанная молекула имеет увеличенный период полувыведения (относительно молекулы, содержащей домен Fc дикого типа). В некоторых воплощениях В7-НЗ-связывающей молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный домен Fc из IgG, где указанный домен Fc домена включает аминокислотную замену для увеличения периода полувыведения в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 и 436. Многочисленные мутации, способные увеличивать период полувыведения Fc-домен-содержащей молекулы, известны в данной области и включают, например, M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации. Например, см. мутации, описанные в пат. США № 6277375, 7083784; 7217797, 8088376; публ. США № 2002/0147311; 2007/0148164; и публ. РСТ № WO 98/23289; WO 2009/058492; и WO 2010/033279, которые включены в настоящее описание ссылкой во всей полноте. В7-НЗ-связывающие молекулы с увеличенным периодом полувыведения также включают те, которые обладают вариантными доменами Fc, которые включают замены в двух или более остатках домена Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 и 436. В частности, две или более замен, выбранных из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, Н435Ки Y436I.
[00198] В конкретном воплощении В7-НЗ-связывающая молекула по настоящему изобретению, имеет вариантный домен Fc из IgG, включающий замены:
(A) M252Y, S254T и Т256Е;
(B) M252Y и S254T;
(C) M252Y и Т256Е;
(D) T250Q и M428L;
(E) T307QHN434A;
(F) A378V и N434A;
(G) N434A и Y436I;
(H) V308PHN434A; ИЛИ
(I) K288D иН435К.
[00199] В предпочтительном воплощении В7-НЗ-связывающая молекула по настоящему изобретению имеет вариантный домен Fc из IgG, включающие любые 1, 2 или 3 замены: M252Y, S254T и Т256Е. Изобретение далее охватывает В7-НЗ
связывающие молекулы, обладающие вариантными доменами Fc, включающие:
(A) одну или несколько мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcyR; и
(B) одну или несколько мутаций, которые продлевают период полувыведения в сыворотке.
[00200] Для некоторых антител, диател и трехвалентных связывающих молекул, чьи Fc-домен-содержащие первая и третья полипептидные цепи не являются идентичными, желательно уменьшить или предотвратить гомодимеризацию между доменами СН2-СНЗ двух первых полипептидных цепей или между доменами СН2-СНЗ двух третьих полипептидных цепей. Домены СН2 и/или СНЗ таких полипептидных цепей не обязательно должны быть одинаковыми по последовательности и преимущественно модифицированы для содействия образованию комплекса между двумя полипептидными цепями. Например, замещение аминокислоты (предпочтительно замещение аминокислотой, содержащей громоздкую боковую группу, образующую "выступ", например, триптофаном), может быть введена в домен СН2 или СНЗ, так что стерическая интерференция предотвратит взаимодействие с аналогично мутированным доменом и обязывает мутированный домен спариваться с доменом, в котором была спроектирована комплементарная или вмещающая мутация, т. е. "отверстие" (например, замена на глицин). Такие наборы мутаций могут быть сконструированы в любой паре полипептидов, содержащих домены СН2-СНЗ, которые образуют домен Fc, способствующий гетеродимеризации. Способы белковой инженерии, способствующие гетеродимеризации, а не гомодимеризации, хорошо известны в данной области, в частности, в отношении инженерии иммуноглобулиноподобных молекул и охватываются данным документом (см., например, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, " Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35 и Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, " J. Immunol. Methods 296:95-101; каждый из которых полностью включен в настоящее описание ссылкой).
[00201] Предпочтительный выступ создается путем изменения домена Fc из IgG так, чтобы он содержал модификацию T366W. Предпочтительное углубление создается путем модификации домена Fc из IgG так, чтобы он содержал модификации T366S, L368A и Y407V. Чтобы облегчить очистку гомодимера третьей полипептидной цепи, несущей углубление, от конечной биспецифической Fc-домен-содержащей гетеродимерной
молекулы, сайт связывания протеина А в доменах СН2 и СНЗ, несущих углубление, третьей полипептидной цепи предпочтительно мутирован путем аминокислотной замены в положении 435 (H435R). Таким образом, гомодимер третьей полипептидной цепи, несущий углубление, не будет связываться с протеином А, тогда как биспецифический гетеродимер сохранит свою способность связывать протеин А через сайт связывания протеина А в первой полипептидной цепи. В альтернативном воплощении третья полипептидная цепь, несущая углубление, может включать аминокислотные замены в положениях 434 и 435 (N434A/N435K).
[00202] Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG для доменов СН2 и СНЗ первой полипептидной цепи Fc-домен-содержащей молекулы, по настоящему изобретению, будет иметь "несущую выступ" последовательность (SEQ ID NO: 61):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WE SNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX
где X представляет собой лизин (К) или отсутствует.
[00203] Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG для доменов СН2 и СНЗ второй полипептидной цепи Fc домен-содержащей молекулы по настоящему изобретению, имеющей две полипептидные цепи (или третья полипептидная цепь Fc-домен-содержащей молекулы, имеющей три, четыре, или пять полипептидных цепей) будет иметь "несущую углубление" последовательность (SEQ ID NO: 62):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WE SNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX
где X представляет собой лизин (К) или отсутствует.
[00204] Следует отметить, что домены СН2-СНЗ из SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 62 включают замену в положении 234 на аланин и 235 на аланин и, таким образом, образуют домен Fc, демонстрирующий сниженное (или практически отсутствующее) связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD 16a) или FcyRIIIB (CD 16b) (относительно связывания, демонстрируемого доменом Fc дикого типа (SEQ ID NO: 12). Изобретение также охватывает такие домены СН2-СНЗ, которые включают остатки аланина дикого типа, альтернативные и/или дополнительные замены,
которые модифицируют эффекторную функцию и/или активность связывания с FyR домена Fc. Изобретение также охватывает такие домены СН2-СНЗ, которые дополнительно включают одну или несколько аминокислотных замен, увеличивающих период полувыведения. В частности, изобретение охватывает такие несущие углубления и такие несущие выступ домены СН2-СНЗ, которые дополнительно включают M252Y/S254T/T256E.
[00205] Предпочтительно, если первая полипептидная цепь будет иметь "несущую выступ" последовательность СН2-СНЗ, такую как последовательность SEQ ID NO: 61. Однако, как будет признано, в первой полипептидной цепи может быть использован "несущий углубление" домен СН2-СНЗ (например, SEQ ID NO: 62), и в этом случае "несущий выступ" домен СН2-СНЗ (например, SEQ ID NO: 61) будет использоваться во второй полипептидной цепи Fc-домен-содержащей молекулы по настоящему изобретению, имеющей две полипептидные цепи (или в третьей полипептидной цепи Fc-домен-содержащей молекулы, имеющей три, четыре или пять полипептидных цепей).
[00206] В других воплощениях изобретение охватывает В7-НЗ-связывающие молекулы, содержащие домены СН2 и/или СНЗ, которые были спроектированы для содействия гетеродимеризации, а не гомодимеризации, с применением мутаций, известных в данной области, таких как раскрытые в публ. РСТ № WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867, все из которых включены в настоящее описание ссылкой во всей полноте.
VIII. Способности к связыванию с эффекторными клетками
[00207] В соответствии с данным документом В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению, включая молекулы B7-H3-ADC, могут быть сконструированы так, чтобы они содержали комбинацию эпитопсвязывающих сайтов, которые распознают множество антигенов, уникальных для клетки-мишени или типа ткани. В частности, настоящее изобретение относится к мультиспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, которые способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки, такой как Т-лимфоцит, естественный киллер (NK) или другая мононуклеарная клетка. Например, В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению может быть конструкцией, содержащей эпитопсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывает CD2, CD3, CD8, CD 16, Т-клеточный рецептор (TCR) или NKG2D. Изобретение также относится к триспецифическим В7-НЗ-связывающим молекулам, которые способны связываться с эпитопом CD3 и эпитопом CD8 (см., например, публ. РСТ № WO 2015/026894).
А. Способности к связыванию с CD2
[00208] В одном воплощении биспецифические, триспецифические или мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом CD2. CD2 представляет собой молекулу клеточной адгезии, обнаруженную на поверхности Т-клеток и клеток-естественных киллеров (NK). CD2 усиливает цитотоксичность NK-клеток, возможно, в качестве промотора образования нанотрубок NK-клетками (Mace, ЕМ et al. (2014) "Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity" Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci, C.J. et al. (2012) "CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation" PLoS One 7(10):e47664:l-12). Молекулы, которые специфически связывают CD2 включают анти-С02 антитело "Lo-CD2a".
[00209] Аминокислотная последовательность домена VH из Lo-CD2a (учетный номер АТСС No: 11423); SEQ ID NO: 63) показана ниже (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
[00210] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из Lo-CD2a (учетный номер АТСС № 11423, SEQ ID NO: 64) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP YTFGAGTKLE LK
В.Способности к связыванию CD3
[00211] В одном воплощении биспецифические, триспецифические или мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом CD3. CD3 представляет собой ко-рецептор Т-клеток, состоящий из четырех различных цепей (Wucherpfennig, KW et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling" Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; страницы 1-14). У млекопитающих комплекс содержит цепь CD3y, цепь CD38 и две цепи CD3s. Эти цепи связываются с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор (TCR), для того, чтобы генерировать сигнал активации в Т-лимфоцитах. В отсутствие CD3 TCR не собираются должным образом и деградируют (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer" Immunology
129(2): 170-177). CD3 обнаруживается связанным с мембранами всех зрелых Т-клеток и практически не обнаруживается на других типах клетках (см., Janeway, С A et al. (2005) In: IMMTJNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3s:y Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex" Immunity. 2006 Feb;24(2): 133-139). Молекулы, которые специфически связывают CD3, включают анти-СОЗ-антитела "CD3 mAb-l" и "ОКТЗ". Анти-СБЗ-антитело CD3 mAb-1 способно связывать белок приматов, не являющихся человеком (например, яванского макака).
[00212] Аминокислотная последовательность домена VH из CD3 mAb-1 VH (1) (SEQ ID NO: 65) показана ниже (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
[00213] Аминокислотная последовательность альтернативного домена VH из CD3 mAb-1 VH (2) (SEQ ID NO: 66) показана ниже (остатки CDRH показаны одним подчеркиванием; различия относительно домена VH из CD3 MAB-1 VH (1) (SEQ ID NO: 65) показаны двойном подчеркиванием).
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
[00214] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
[00215] Область VH из CD3 mAb-1 VH (1) (SEQ ID NO: 65) можно использовать с доменом VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67) с образованием функциональной CD3-связывающей молекулы в соответствии с настоящим изобретением. Аналогично, домен VH из CD3 mAb-1 VH (2) (SEQ ID NO: 66) можно использовать с доменом VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67) с образованием функциональной CD3-связывающей молекулы в соответствии с настоящим изобретением.
[00216] Как обсуждается ниже, для лучшей иллюстрации настоящего изобретения были получены биспецифические В7-НЗ х CD3-связывающие молекулы. В некоторых
конструкциях В7-НЗ х CD3 использовался вариант CD3 mAb-1. Вариант "CD3 mAb-1 (D65G)" содержит домен VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67) и домен VH из CD3 mAb-1, имеющий замену D65G (положение 65 по Kabat, соответствующее остатку 68 из SEQ ID NO: 65). Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из CD3 mAb-1 (D65G) (SEQ ID NO: 68) (показаны остатки CDRH, замещенное положение (D65G) показано двойным подчеркиванием):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA
PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT
EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
[00217] В ином случае, может быть включен аффинный вариант CD3 mAb-1.
Варианты включают вариант с низкой аффинностью, обозначенный как "CD3 mAb-1 Low", и вариант с более быстрой скоростью диссоциации, обозначенный как "CD3 mAb-1 Fast". Домен VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67) является общим для CD3 mAb-1 Low и CD3 mAbl Fast и представлен выше. Ниже приведены аминокислотные последовательности доменов VH каждого из CD3 mAb-1 Low и CD3 mAb-1 Fast.
[00218] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из анти-CD3 человека mAb-1 Low (SEQ ID NO: 69) (остатки CDRH показаны подчеркиванием, различия относительно домена VH CD3 mAb-1 VH (1) (SEQ ID NO: 65) показаны двойным подчеркиванием):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA
PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT
EDTAVYYCVR HGNFGNSYYT WFAYWGQGTL VTVSS
[00219] Ниже показана аминокислотная последовательность цепи домена VH из анти-СОЗ человека mAb-1 Fast (SEQ Ш NO: 70) (остатки CDRH показаны подчеркиванием, различия относительно домена VH CD3 mAb-1 VH (1) (SEQ ID NO: 65) показаны двойным подчеркиванием):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA
PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT
EDTAVYYCVR HGNFGNS YYT WFAYWGQGTL VTVSS
[00220] Другим анти-СОЗ-антителом, которое может быть использовано, является антитело Muromonab-CD3 "ОКТЗ" (Xu et al. (2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, " Cell. Immunol. 200:16-26); Norman, D.J. (1995) "Mechanisms Of Action And Overview OfOKT3," Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) "Monoclonal Anti lymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection" Pharmacotherapy 7(4): 121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) "OKT3
Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation" Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678).
[00221] Аминокислотную последовательность из домена VH из ОКТЗ (SEQ ID NO: 71) показана ниже (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSS
[00222] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из ОКТЗ (SEQ ID NO: 72) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG TKLEINR
[00223] Дополнительные анти-СОЗ антитела, которые могут быть использованы, включают, без ограничения указанным, те, которые описаны в публикациях РСТ № WO 2008/119566: и WO 2005/118635.
С. Способности к связыванию CD8
[00224] В одном воплощении биспецифические, триспецифические или мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом CD8. CD8 представляет собой ко-рецептор Т-клеток, состоящий из двух различных цепей (Leahy, D.J., (1995) "A Structural View of CD4 and CD8" FASEB J., 9:17-25), который экспрессируется на цитотоксических Т-клетках. Обнаружено, что активация CD8+ Т-клеток опосредована путем костимулирующих взаимодействий между молекулярным комплексом антиген: основной комплекс гистосовместимости I класса (МНС I), который размещается на поверхности клетки-мишени и комплекса CD8 и Т-клеточного рецептора, которые размещены на поверхности CD8 + Т-клетки (Gao, G., and Jakobsen, В., (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor". Immunol Today 21: 630-636). В отличие от молекул МНС II, которые экспрессируются только определенными клетками иммунной системы, молекулы МНС I экспрессируются очень широко. Таким образом, цитотоксические Т-клетки способны связываться с широким диапазоном типов клеток. Активированные цитотоксические Т-клетки опосредуют гибель клеток путем высвобождения цитотоксинов, перфорина, гранзимов и гранулизина. Антитела, которые специфически связывают CD8, включают анти-С08 антитела "ОКТ8" и "TRX2".
[00225] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из ОКТ8
(SEQ ID NO: 73) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
[00226] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL ОКТ8 (SEQ ID NO: 74) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI KR
[00227] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH TRX2 (SEQ ID NO: 75) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
[00228] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL TRX2 (SEQ ID NO: 76) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIK
D. Способности к связыванию CD 16
[00229] В одном воплощении мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом CD 16. CD 16 является рецептором FcyRIIIA. CD 16 экспрессируют нейтрофилы, эозинофилы, клетки-естественные киллеры (NK) и тканевые макрофаги, которые связывают агрегированный, но не мономерный IgG человека (Peltz, GA et al. (1989) "Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3): 1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) "NK Cells In Therapy Of Cancer," Crit. Rev. Oncog. 19 (1-2): 133-141; Miller, JS (2013) "Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic" Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013: 247-253; Youinou, P. et al. (2002) "Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases" Autoimmun Rev. 1(1-2): 13-19; Peipp, M. et al. (2002) "Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells" Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511). Молекулы, которые специфически связывают CD16, включают антитела против CD16 "3G8" и "А9". Гуманизированные антитела А9 описаны в публ. РСТ WO 03/101485.
[00230] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из 3G8
(SEQ ID NO: 77) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSA
[00231] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из 3G8 (SEQ ID NO: 78) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY TFGGGTKLEI К
[00232] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из А9 (SEQ ID NO: 79) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD IYPGGGYTNY NEKFKGKATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA SWYFDVWGAR ТТVTVSS
[00233] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из А9 (SEQ ID NO: 80) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG LIGHTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW VFGGGTKLTV L
[00234] Дополнительные анти-С019-антитела, которые могут быть использованы, включают, без ограничения указанным, те, которые описаны в публикациях РСТ WO 03/101485; и WO 2006/125668.
Е. Способности к связыванию TCR
[00235] В одном воплощении биспецифические, триспецифические или мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом Т-клеточного рецептора (TCR). Т-клеточный рецептор изначально экспрессируется CD4+ или CD8+ Т-клетками и позволяет таким клеткам распознавать антигенные пептиды, которые связаны и представлены белками МНС класса I или класса II антигенпрезентирующих клеток. Распознавание комплекса рМНС (пептид-МНС) с помощью TCR инициирует распространение клеточного иммунного ответа, что приводит к образованию цитокинов и лизису антигенпредставляющей клетки (см., например, Armstrong, KM et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes" Biochem. J. 415(Pt 2): 183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy"
Cytometry A. 73(11): 1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation" Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes" Am. J. Ther. 12(6):534-550). CD3 представляет собой рецептор, который связывается с TCR (Thomas, S. et al (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer" Immunology 129(2): 170-177; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex" Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity" Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648657; Baeuerle, P. A. et al. (Epub 2009 Jun 9) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation," Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression," Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).
[00236] Молекулы, которые специфически связываются с Т-клеточным рецептором, включают антитело против TCR "ВМА 031" (ЕР 0403156, Kurrle, R. et al.(1989) "ВМА 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application" Transplant Proc. 21(1 Pt 1): 1017-1019; Nashan, B. etal. (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human a/p T Cell," J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human a/p T Cell Receptor " J. Immunol. 147(12):4366-4373).
[00237] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из ВМА 031 (SEQ ID NO: 81) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY INPYNDVTKY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS
[00238] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из ВМА 031 (SEQ ID NO: 82) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIK F. Способности к связыванию NKG2D
[00239] В одном воплощении мультиспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению способны связываться с эпитопом В7-НЗ и эпитопом рецептора NKG2D. Рецептор NKG2D экспрессируется на всех человеческих (и из других млекопитающих) клетках-естественных киллерах (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK
Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1): 19-29) as well as on all CD8+ T cells (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8a/i T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells" Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing" Immunity 17(1): 19-29). Такие связывающие лиганды, и особенно те, которые не экспрессируются на нормальных клетках, включают молекулу гистосовместимости 60 (Н60), продукт раннего гена индуцируемого ретиноевой кислотой-1 (RAE-1) и транскрипт 1, подобный мышиному иЫ6-связывающему белку (MULT1) (Raulet DH (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands" Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells" Blood 106:1711-1717). Молекулы, которые специфически связываются с рецептором NKG2D, включают антитела против NKG2D "КУК-1.0" и "КУК-2.0" (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156; and PCT/US09/54911).
[00240] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из KYK-1.0 (SEQ ID NO: 83) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
[00241] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из KYK-1.0 (SEQ ID NO: 84) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG GGTQLTVL
[00242] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из KYK-2.0 (SEQ ID NO: 85) (остатки CDRH показаны подчеркиванием):
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
[00243] Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL KYK-2.0 (SEQ ID NO: 86) (остатки CDRL показаны подчеркиванием):
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDD SLNGP V FGGGTKLTVL
IX. Мультиспецифические B7-H3-связывающие молекулы A. B7-H3 x CD3 Биспецифические двухцепочечные диатела [00244] Области VL и VH вышеописанных связывающих молекул В7-НЗ могут быть использованы для конструирования биспецифических диател В7-НЗ х CD3, состоящих из двух ковалентно связанных полипептидных цепей. Чтобы проиллюстрировать этот аспект настоящего изобретения, домены VL и VH вышеописанного анти-В7-НЗ антитела mAb-D использовали для конструирования биспецифических диател В7-НЗ х CD3, состоящих из двух ковалентно связанных полипептидных цепей и содержащих обсуждаемые выше мышиные или гуманизированные домены VL и VH из mAb-D. Ниже представлена общая структура и аминокислотные последовательности таких биспецифических диател В7-НЗ х CD3.
[00245] Первая полипептидная цепь одного примерного биспецифического двухцепочечного диатела В7-НЗ х CD3 содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL из анти-В7-НЗ антитела (например, mAb-D VL (SEQ ID NO: 22) или hmAb-D VL (SEQ ID NO: 30); промежуточный спейсерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 32)); домен VH из анти-СОЗ-антитела (например, CD3 mAb 1 (D65G) (SEQ ID NO: 68)); цистеинсодержащий промежуточный спейсерный пептид (линкер 2: GGCGGG (SEQ ID NO: 33)); домен, способствующий гетеродимеризации (например, Е-спираль) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 45)); и С-конец.
[00246] Вторая полипептидная цепь такого примерного биспецифического двухцепочечного диатела В7-НЗ х CD3 содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL соответствующего анти-СОЗ-антитела (например, VL-домен, который совместно с доменом VH первой полипептидной цепи образует сайт связывания CD3, например, домен VL из CD3-mAb-1 (SEQ ID NO: 67), промежуточный спейсерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 32)), домен VH соответствующий анти-В7-НЗ антителу (например, домен VH, который в сочетании с доменом VL первого полипептида цепь образует сайт связывания В7-НЗ, например, VH из mAb-D (SEQ ID NO: 26) или VH из hmAb-D (SEQ ID NO: 31); цистеин-содержащий промежуточный спейсерный пептид (линкер 2: GGCGGG (SEQ ID NO: 33)), домен, способствующий гетеродимеризации (например, К-спираль) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 46)) и С-конец.
[00247] В соответствии с данным документом, альтернативные линкеры и/или
альтернативные домены, способствующие гетеродимеризации, могут быть использованы для получения таких диател. Например, первая полипептидная цепь альтернативного примерного биспецифического двухцепочечного диатела В7-НЗ х CD3 может содержать в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL из анти-В7-НЗ антитела; промежуточный спейсерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 32)); домен VH из анти-СОЗ-антитела или соответствующего анти-СОЗ антитела; промежуточный спейсерный пептид (линкер 2: ASTKG (SEQ ID NO: 37)); цистеинсодержащий домен, способствующий гетеродимеризации (например, К-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 46)); и С-конец. Вторая полипептидная цепь такого альтернативного примерного диатела может содержать в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL соответствующего анти-СОЗ-антитела; промежуточный спейсерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 32)); домен VH соответствующего анти-В7-НЗ антитела (например, VH из mAb-D (SEQ ID NO: 26) или hVH из mAb-D (SEQ ID NO: 31)); промежуточный спейсерный пептид (линкер 2: ASTKG (SEQ ID NO: 37)); цистеинсодержащий домен, способствующий гетеродимеризации (например, Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 47)); и С-конец.
1. DART-D1
[00248] Сконструировано репрезентативное BIS-H3 х CD3 биспецифическое двухцепочечное диатело, содержащее домены VH и VL из hmAb-C ("DART-D1").
[00249] Ниже показана аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART-D1 (SEQ ID NO: 87) (подчеркнута последовательность домена VL из hmAb-C (SEQ ID NO: 20)):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG QGTRLEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSTYAM NWVRQAPGKG LEWVGRIRSK YNNYATYYAD SVKGRFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SGGCGGGEVA ALEKEVAALE KEVAALEKEV AALEK
[00250] Ниже показана аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи DART-D1 (SEQ ID NO: 88) (подчеркнута последовательность домена VH из hmAb-C (SEQIDNO: 21)):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGS GGGGE V QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSSY
GMSWVROAPG KGLEWVATIN SGGSNTYYPD SLKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARHDGG AMDYWGQGTT VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE 2. DART-D2
[00251] Сконструировали репрезентативное BIS-H3 x CD3 биспецифическое двухцепочечное диатело, содержащее домены VH и VL из hmAb-D ("DART-D2").
[00252] Ниже показана аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART-D2 (SEQ ID NO: 89) (подчеркнута последовательность домена VL из hmAb-D (SEQ ID NO: 30)):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NN Y AT Y Y AD S VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTL VTVSS AS TKGE V A AC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
[00253] Ниже показана аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи DART-D2 (SEQ ID NO: 90) (подчеркнута последовательность домена VH из hmAb-D (SEQIDNO: 31)):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGS GGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SGSGTIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARHGYR YEGFDYWGQG TT VTVSS AST KGKVAACKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE
[00254] Следует принять во внимание в свете описания, изложенного в данном документе о том, что для получения альтернативных двухцепочечных диател В7-НЗ х CD3 можно использовать различные доменные ориентации, домены VH, домены VL, линкеры и/или домены, способствующие гетеромеризации.
В. В7-НЗ х CD3 биспецифические трехцепочечные диатела
[00255] Получали В7-НЗ х СОЗ-диатело, имеющее три цепи и обладающее доменом Fc, которое имеет один сайт связывания, специфичный к В7-НЗ (содержащий гуманизированные домены VH и VL из hmAb-D) и один сайт связывания, специфичный к CD3 (содержащий Домены VL и VH из CD3 mAb 1 (D65G)). Диатело обозначается как "DART-D3".
[00256] Первая полипептидная цепь примерного биспецифического
трехцепочечного диатела DART-D3 В7-НЗ х CD3 содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL из анти-В7-НЗ антитела (VL из hmAb-D (SEQ ID NO: 30), промежуточный спейсерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 32)), домен VH из CD3 mAb 1 (DGCG) (SEQ ID NO: 68), промежуточный спейсерный пептид (линкер 2: ASTKG (SEQ ID NO: 37)), цистеинсодержащий домен, способствующий гетеродимеризации (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 47)); промежуточный спейсерный пептид (линкер 3: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 57)); Несущий выпуклость домен СН2-СНЗ из IgGl (SEQ ID NO: 61); и С-конец. Полинуклеотиды, кодирующие этот полипептидную цепь могут кодировать С-концевой остаток лизина SEQ ID NO: 61 (т.е. X из SEQ ID NO:. 61), однако, как указывалось выше, этот остаток лизина может быть посттрансляционно удален в некоторых системах экспрессии. Соответственно, настоящее изобретение включает такую первую полипептидную цепь, которая содержит такой остаток лизина (т.е. SEQ ID NO: 61, где X представляет собой лизин), а также первую полипептидную цепь, которая утратила такой остаток лизина (т.е. SEQ ID NO:.: 61, где X отсутствует). Ниже приведены аминокислотные последовательности такой первой полипептидной цепи (SEQ ID NO: 91) (подчеркнута последовательность домена VL из hmAb-D (SEQ ID NO: 30)):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NN Y AT Y Y AD S VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTL VTVSS AS TKGE V A AC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGX
где X представляет собой лизин (К) или отсутствует.
[00257] Вторая полипептидная цепь примерного биспецифического трехцепочечного диатела DART-D3 В7-НЗ х CD3 содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67); промежуточный спейсерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 32)); домен VH из анти-В7-НЗ антитела (hVH из mAb-D (SEQ ID NO: 31), промежуточный спейсерный пептид (линкер 2: ASTKG (SEQ ID NO: 37)), цистеинсодержащий домен (К-спираль), способствующий
гетеродимеризации (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 48)) и С-конец. Ниже представлена аминокислотная последовательность такой второй полипептидной цепи (SEQ ID NO: 92) (подчеркнута последовательность домена VH из hmAb-D (SEQ ID NO: 31)):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGS GGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SGSGTIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARHGYR YEGFDYWGQG TT VTVSS AST KGKVAACKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE
[00258] Третья полипептидная цепь примерного биспецифического трехцепочечного диатела DART-D3 В7-НЗ х CD3 включает в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; спейсерный пептид (DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 56)); несущий углубление домен IgGl СН2-СНЗ (SEQ ID NO: 62); и С-конец. Полинуклеотиды, кодирующие этот полипептидную цепь может кодировать С-концевой остаток лизина SEQ ID NO: 62 (т.е., X из SEQ ID NO:. 62), однако, как указывалось выше, этот остаток лизина может быть посттрансляционно удален в некоторых системах экспрессии. Соответственно, настоящее изобретение включает такую третью полипептидную цепь, которая содержит такой остаток лизина (т.е. SEQ ID NO: 62., Где X представляет собой лизин), а также третью полипептидную цепь, которая утратила такой остаток лизина (т.е. SEQ ID NO:.: 62, где X отсутствует). Ниже представлена аминокислотная последовательность такой третьей полипептидной цепи (SEQ ID NO: 93):
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WE SNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX
где X представляет собой лизин (К) или отсутствует.
[00259] Понятно, что в свете изложенного в данном документе описания могут быть использованы различные доменные ориентации, домены VH, домены VL, линкеры и/или гетеродимеры, способствующие развитию, для получения альтернативных биспецифических трехцепочечных диател В7-НЗ х CD3. В частности, можно использовать домен VH и домен VL из hmAb-C (SEQ ID NO: 20-21).
С. Трехвалентные связывающие молекулы В7-НЗ х CD3 х CD8
[00260] Типичные трехвалентные связывающие молекулы В7-НЗ х CD3 х CD8,
имеющие один сайт связывания, специфичный для В7-НЗ (содержащий родительский и/или гуманизированный домен анти-В7-НЗ-"уЪ и соответствующий домен анти-В7-НЗ-VH, как описано выше), один сайт связывания, специфичный для CD3 (содержащий, например, домен VL из CD3 mAb-1 (SEQ ID NO: 67) и домен VH из анти-СОЗ-антитела (например, CD3 mAb 1 (D65G) (SEQ ID NO: 68)) и один сайт связывания, специфичный для CD8 (содержащий, например, домены VH и VL из TRX2 (SEQ ID NO: 75 и 76, соответственно). Такие трехвалентные связывающие молекулы могут иметь две полипептидные цепи (см., например, Фигуру 6Е и Фигуру 6F), три полипептидные цепи (см., например, Фигуру 6С и Фигуру 6D), четыре полипептидные цепи (см., например, Фигуру 6А и Фигуру 6В) или пять полипептидных цепей (см., например, Фигуру 5). X. Способы получения
[00261] В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению, наиболее предпочтительно получают посредством рекомбинантной экспрессии нуклеотидных молекул, которые кодируют такие полипептиды, как хорошо известно в данной области.
[00262] Полипептиды по изобретению могут быть легко получены с применением твердофазного пептидного синтеза (Merrifield, В. ( 1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century" Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
[00263] В альтернативном варианте антитела могут быть получены рекомбинантно и экспрессированы с применением любого способа, известного в данной области. Антитела могут быть получены рекомбинантным сначала путем выделения антител, полученных из животных-хозяев, получения последовательности генов и использования последовательности генов для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другим способом, который может быть использован, является экспрессия последовательности антител в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Были раскрыты подходящие способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters et al (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants" Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice" Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et al (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies" J. Immunol Methods 231:147-157). Подходящие способы получения производных антител, например гуманизированные, одноцепочечные и т.д. известны в данной области и были описаны
выше. В другом варианте антитела могут быть получены рекомбинантно с помощью технологии фагового дисплея (см., например, патенты США № 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и Winter G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology" Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).
[00264] Векторы, содержащие интересующие полинуклеотиды (например, полинуклеотиды, кодирующие полипептидные цепи В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению), могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих средств, включая электропорацию, трансфекцию с применением хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор является инфекционным агентом, таким как вирус осповакцины). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов будет часто зависеть от особенностей клетки-хозяина.
[00265] Любая клетка-хозяин, способная к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК, может быть использована с целью экспрессии представляющего интерес полипептида или белка. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают, без ограничения указанным, клетки COS, HeLa и СНО.
[00266] Изобретение включает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность В7-НЗ-связывающей молекулы по настоящему изобретению. Полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены способами, известными в данной области. Полипептиды могут быть получены путем протеолитической или другой деградации антител рекомбинантными способами (т.е. одиночные или слитые полипептиды), как описано выше, или химическим синтезом. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды до около 50 аминокислот, обычно получают путем химического синтеза. Способы химического синтеза известны в данной области и являются коммерчески доступными.
[00267] Изобретение включает варианты В7-НЗ-связывающих молекул, включая функционально эквивалентные полипептиды, которые не оказывают существенного влияния на свойства таких молекул, а также варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью. Модификация полипептидов является обычной практикой в данной области и не нуждается в подробном описании в данном документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одну или несколько делеций или добавок аминокислот, которые не оказывают значительного вредного влияния на функциональную активность или применение химических аналогов. Аминокислотные остатки, которые могут быть консервативно замещены друг другом, включают, без ограничения указанным:
глицин/аланин; серин/треонин; валин/изолейцин/лейцин; аспарагин/глютамин; аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота; лизин/аргинин; и фенилаланин/тирозин. Эти полипептиды также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно, аминокислотные замены будут консервативными, то есть замещенная аминокислота будет обладать такими же химическими свойствами, что и исходная аминокислота. Такие консервативные замены известны в данной области, и примеры были приведены выше. Модификации аминокислот могут варьировать от изменения или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реорганизации участка, такого как вариабельный домен. Изменения в вариабельном домене могут изминять аффинность связывания и/или специфичность. Другие способы модификации включают применение способов связывания, известных в данной области, включая, без ограничения указанным, ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации могут использоваться, например, для прикрепления меток для иммуноанализа, таких как прикрепление радиоактивных компонентов для радиоиммунологического анализа. Модифицированные полипептиды получают с применением известных процедур в данной области и они могут быть подвергнуты скринингу с применением стандартных анализов, известных в данной области.
[00268] Изобретение охватывает слитые белки, содержащие один или несколько анти-В7-НЗ-"уЪ и/или VH этого изобретения. В одном воплощении предусмотрен слитый полипептид, который включает легкую цепь, тяжелую цепь или как легкую, так и тяжелую цепь. В другом воплощении слитый полипептид содержит константную область гетерологичного иммуноглобулина. В другом воплощении слитый полипептид содержит вариабельный домен с легкой цепью и домен с переменной длиной цепи антитела, продуцируемый из публично депонированной гибридомы. Для целей настоящего изобретения гибридный белок антитела содержит один или несколько полипептидных доменов, которые специфически связываются с В7-НЗ и другую аминокислотную последовательность, которой он не присоединен в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другого участка.
[00269] Настоящее изобретение, в частности, охватывает В7-НЗ-связывающие молекулы (например, антитела, диатела, трехвалентные связывающие молекулы и т.д.), конъюгированные с диагностическим или терапевтическим компонентом. Для целей
диагностики В7-НЗ-связывающей молекулы по изобретению могут быть связаны с детектируемым веществом. Такие В7-НЗ-связывающие молекулы полезны для мониторинга и/или прогнозирования развития или прогрессирования заболевания в рамках процедуры клинических испытаний, таких как определение эффективности конкретной терапии. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты (например, пероксидазу хрена, бета-галактозидазу и т.д.), простетические группы (например, авидин/биотин), флуоресцентные материалы (например, умбеллиферон, флуоресцеин или фикоэритрин), люминесцентные материалы (например, люминол), биолюминесцентные материалы (например, люцифераза или экворин), радиоактивные материалы (например, углерод-14, марганец-54, стронций-85 или цинк-65), позитронно-активные металлы и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. Поддающееся обнаружению вещество можно связать или конъюгировать либо непосредственно с В7-НЗ-связывающей молекулой, либо опосредованно через интермедиат (например, линкер), используя методы, известные в данной области техники.
[00270] В терапевтических целях В7-НЗ-связывающие молекулы по изобретению могут быть конъюгированы с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксин (например, цитостатический или цитоцидный агент), терапевтический агент или ион радиоактивного металла, например альфа-излучатель. Цитотоксин или цитотоксический агент включают любой агент, который вреден для клеток, таких как, например, экзотоксин синегнойной палочки, дифтерийный токсин, ботулинический токсин A-F, рицин-абрин, сапорин и цитотоксические фрагменты таких агентов. Терапевтическое средство включает любое средство, имеющее терапевтический эффект для профилактического или терапевтического лечения расстройства. Такими терапевтическими агентами могут быть химические терапевтические агенты, белковые или полипептидные терапевтические агенты и включаются терапевтические агенты, которые обладают искомой биологической активностью и/или модифицируют данный биологический ответ. Примеры терапевтических агентов включают алкилирующие агенты, ингибиторы ангиогенеза, антимитотические агенты, агенты гормональной терапии и антитела, полезные для лечения клеточных пролиферативных нарушений. Терапевтический фрагмент может быть связан или конъюгирован либо непосредственно с В7-НЗ-связывающей молекулой, либо опосредованно через интермедиат (например, линкер) с применением методов, известных в данной области.
XI. Конъюгаты лекарственного средства и антитела
[00271] Настоящее изобретение относится к терапевтическим антителам против В7-НЗ человека (или к его В7-НЗ-связывающим доменам) и, в частности, к любому из
вышеописанных антител против В7-НЗ человека или к В7-НЗ-связывающим доменам, которые конъюгированы с лекарственным средством (молекула "B7-H3-ADC"). Такие В7-H3-ADC усиливают цитотоксичность терапии против В7-НЗ человека, особенно при лечении рака. Как указано выше, молекулы B7-H3-ADC по настоящему изобретению включают формулу:
Ab-(LM)m-(D)",
где:
АЬ представляет собой антитело, которое связывается с В7-НЗ, которое включает гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и гуманизированный вариабельный домен легкой цепи (VL) или является его В7-НЗ-связывающим фрагментом;
D представляет собой цитотоксический лекарственный компонент; LM представляет собой связь или линкерную молекулу, которая ковалентно связывает АЬ и D;
m представляет собой целое число от 0 до п и обозначает количество линкерных молекул в B7-H3-ADC; и
п представляет собой целое число от 1 до 10 и обозначает количество цитотоксических лекарственных компонентов, ковалентно связанных с молекулой В7-НЗ-ADC.
[00272] В предпочтительных воплощениях B7-H3-ADC будет связываться с опухолевой клеткой, экспрессирующей В7-НЗ, и затем будет интернализован в такую клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Оказавшись внутри лизосомы B7-H3-ADC будет предпочтительно деградировать, чтобы тем самым вызвать высвобождение цитотоксического лекарственного компонента внутри клетки, что приведет к гибели клеток. Как будет понятно, механизм действия гибели клеток может варьировать в зависимости от используемого класса цитотоксического лекарственного средства (например, нарушения цитокинеза ингибиторами тубулиновой полимеризации, такими как майтанзины и ауристатины, повреждение ДНК взаимодействующими с ДНК агентами, такими как калихеамицины и дуокармицины) и др. Соседние раковые клетки также могут быть уничтожены, когда свободное лекарственное средство высвобождается в опухолевую среду умирающей клеткой в процессе, известном как эффект наблюдателя (Panowski, S. et al. (2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy" mAbs 6(l):34-45; Kovtun, Y.V. et al. (2006) "Antibody-Drug Conjugates Designed To Eradicate Tumors With Homogeneous And Heterogeneous Expression Of The Target Antigen"
Cancer Res. 66:3214-3221).
[00273] B7-H3-ADC по настоящему изобретению может содержать домен Fc, который может быть природным доменом Fc, или может иметь последовательность, которая обладает одним или более отличиями от встречающегося в природе домена Fc, и который может быть полным доменом Fc, (например, полным доменом Fc из IgG) или только частью полного домена Fc. Такие домены Fc могут быть любого изотипа (например, IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4). Такой домен Fc может включать или не включать С-концевой остаток лизина в домене СНЗ. B7-H3-ADC по настоящему изобретению может дополнительно включать домен СН1 и/или шарнирный домен. В случае наличия, домен СН1 и/или шарнирный домен могут быть любого изотипа (например, IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4) и предпочтительно будут иметь тот же изотип, что и искомый домен Fc.
А. Типичные линкерные молекулы изобретения
[00274] Изобретение, таким образом, в частности, предусматривает такие В7-НЗ-ADC, в котором линкерная молекула LM отсутствует (т.е., m = 0), и B7-H3-ADC, которые обладают более чем одной линкерной молекулы LM (т.е., m представляет собой целое число от 2 до п, где п представляет собой целое число от 2 до 10), при этом каждая из линкерных молекул LM ковалентно связывает D цитотоксический лекарственный компонент D с АЬ, таким как B7-H3-ADC.
[00275] Изобретение далее обеспечивает B7-H3-ADC, АЬ которых ковалентно связан с более чем одной линкерной молекулой LM, где все такие линкерные молекулы идентичны. Цитотоксические лекарственные компоненты D, которые ковалентно связаны с АЬ таких B7-H3-ADC могут быть все одинаковыми или могут включать 2, 3, 4, или более независимо различных цитотоксических лекарственных компонентов D.
[00276] Кроме того, настоящее изобретение относится к таким B7-H3-ADC, чьи АЬ ковалентно связаны с более чем одной линкерной молекулой LM, где все такие линкерные молекулы не идентичны и могут независимо отличаться. Цитотоксические лекарственные компоненты D, которые ковалентно связаны с АЬ такого B7-H3-ADC могут быть все одинаковыми или могут включать 2, 3, 4, или более независимо различных цитотоксических лекарственных компонентов D.
[00277] Примерные гуманизированные домены VH и VL антител, которые связываются с В7-НЗ человека, и примерные константные домены человеческого антитела, которые могут быть включены в B7-H3-ADC по изобретению, приведены выше. Как указано выше, B7-H3-ADC по изобретению дополнительно включает, по меньшей мере, один цитотоксический лекарственный компонент, который предпочтительно ковалентно связан с атомом боковой цепи аминокислотного остатка такого домена VH
или домена VL и/или константного домена, либо непосредственно, либо через линкерную молекулу, интеркалированную между атомом боковой цепи и лекарственным компонентом. Линкерная молекула может быть непептидной молекулой или молекулой, которая включает непептидную часть и пептидную часть, или она может быть молекулой, которая состоит исключительно из аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки любых таких линкерных молекул могут содержать природные или неприродные аминокислотные остатки, включая D-варианты встречающихся в природе аминокислотных остатков, п- ацетилфенилаланин, селеноцистеин и т.д. Необязательно или дополнительно конкретные остатки, имеющие искомую боковую цепь (например, боковую цепь -СШ-SH, боковую цепь -СШ-ОН, боковую цепь -CH(CH2)-SH, -CH2-CH2-S-СНз, боковую цепь -CH2-C(0)-NH2, боковую цепь -CH2-CH2-C(0)-NH2, боковуюя цепь -СН2-С(0)ОН-, боковую цепь СН2-СН2-С(0)ОН-, боковую цепь -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2, боковую цепь -CH2-CH2-CH2-NH-C(NH2)2, боковую цепь имидазола, бензильную боковую цепь, боковую цепь фенола, боковую цепь индола и т.д.) могут быть введены в конструкцию B7-H3-ADC по изобретению.
[00278] Линкерная молекула может быть не расщепляемой в физиологических условиях, например, состоящей из гидролитически стабильного фрагмента, например тиоэфирного линкера или экранированного дисульфидного линкера. Гидролитически стабильные линкеры по существу стабильны в воде и не реагируют с водой при полезных значениях рН, включая, без ограничения указанным, физиологические условия в течение длительного периода времени. Напротив, гидролитически нестабильные или разлагающиеся линкеры деградируют в воде или в водных растворах, включая, например, кровь.
[00279] В ином случае, линкерная молекула может быть расщепляемой или может содержать расщепляемую часть. Примеры такой расщепляемой части включают кислотно-лабильный линкер (например, линкер 4- (4'-ацетилфенокси) бутановой кислоты, который образует гидразиновую связь), расщепляемый дисульфидный линкер (который расщепляется в восстановительной внутриклеточной среде) и протеазорасщепляемый линкер. Кислотно-лабильные линкеры рассчитаны на стабильность при уровнях рН, встречающихся в крови, но становятся неустойчивыми и деградируют, когда встречается среда с низким рН в лизосомах. Протеазорасщепляемые линкеры также предназначены для стабилизации в крови/плазме, но быстро высвобождают свободное лекарственное средство внутри лизосом в раковых клетках при расщеплении лизосомными ферментами (Panowski, S. et al. (2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy" mAbs 6(l):34-45). В ином случае, линкерная молекула может быть фермент
расщепляемым субстратом или содержать фермент-расщепляемый субстрат, такой как расщепляемый пептид (например, расщепляемый дипептид, такой как дипептид валин-цитруллин линкер пара-аминобензилового спирта (cAC10-mc-vc-PABA), который селективно расщепляется лизосомными ферментами). Подходящие расщепляемые линкеры известны в данной области техники, см., например, de Groot, Franciscus МН, et al. (2002) "Design, Synthesis, and Biological Evaluation of a Dual Tumor-Specific Motive Containing Integrin-Targeted Plasmin-Cleavable Doxorubicin Prodrug" Molecular Cancer Therapeutics, 1: 901-911; Dubowchik et al., (2002) "Doxorubicin Immunoconjugates Containing Bivalent, Lysosomally-Cleavable Dipeptide Linkages." Bioorganic & Medicinal Chemistry Lettersl2:1529-1532; пат. США № 5547667; 6,214,345; 7,585,491; 7,754,681; 8,080,250; 8,461,117; и WO 02/083180.
[00280] Могут использоваться ферментативно нестабильные или деградирующие линкеры. Такие линкеры деградируют одним или несколькими ферментами. Например, PEG и родственные полимеры могут включать деградируемую молекулу(ы) линкера в полимерной основной цепи или в линкерной группе между полимерной основой и одной или несколькими концевыми функциональными группами полимерной молекулы. Такая деградируемая линкерная молекула(ы) включают, без ограничения указанным, сложноэфирные связи, образованные реакцией PEG-карбоновых кислот или активированных PEG-карбоновых кислот со спиртовыми группами на биологически активном веществе, где такие сложноэфирные группы обычно гидролизуются в физиологических условиях до высвобождения биологически активного агента. Другие гидролитически деградируемые линкерные молекулы включают, без ограничения указанным, карбонатные связи; иминовые связи, образующиеся в результате взаимодействия амина и альдегида; фосфатные сложные эфиры, образующиеся при взаимодействии спирта с фосфатной группой; гидразоновые связи, которые являются продуктом реакции гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые являются продуктом реакции альдегида и спирта; ортоэфирные связи, которые являются продуктом реакции формиата и спирта; пептидные связи, образованные аминогруппой, включая, без ограничения указанным, на конце полимера, такого как PEG, и карбоксильную группу пептида; и олигонуклеотидные связи, образованные фосфорамидитной группой, включая, без ограничения указанным, на конце полимера и 5'-гидроксильной группе олигонуклеотида.
[00281] В одном воплощении линкерная молекула по настоящему изобретению может представлять собой, или может включать, отщепляемую линкерную молекулу, V-(W)k-(X)i-A, как описано в публикации РСТ WO 02/083180, которая имеет формулу:
Ab - [V-(W)k-(X)i-A] - D где:
V является необязательным отщепляемым компонентом,
(W)k-(X)i-A - удлиненная самоэлимирующуяся спейсерная система, которая самоэлиминируется а 1,(4+2п)-элиминацией,
W и X каждый представляют собой спейсер каскада электронов al (4 + 2п), являющиеся одинаковыми или различными,
А представляет собой либо спейсерную группу формулы (Y)m, где Y представляет собой а 1,(4+2п) спейсер каскада электронов, или группу формулы U, являющуюся спейсером циклизации-элиминации.
k, 1 и m независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно),
п представляет собой целое число от 0 (включительно) до 10 (включительно), при условии, что:
когда А равно (Y)m: тогда k + 1 + m > 1, и если к + 1 + m = 1, то n> 1; когда А равно U: тогда k + 1 > 1.
W, X и Y независимо выбран из соединений, имеющих формулу:
-Р^С > -(l)a-(F)b-(G)c-/ R1^R2 R
или формулу
-^-(l)a-(F)b-(G)c- R1 R2
где: Q представляет собой -R5C=CR6-, S, О, NR5, -R5C=N- или -N=CR5-г представляет собой NR7, О или а
a, b и с независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно);
I, F и G независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
или \=^гл или
где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 и R9 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, Сз-2о гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный
амино (NRXH), дизамещенный амино (NRojRx2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2,
БОгМе, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил,
морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx),
сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид
(S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и
фосфат (OP(=0)(ORx)2) х, Rx1 и Rx2 независимо выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20
гетероциклильной группы или С5-20 арильной группы, двух или более заместителей R1, R2,
R3, R4, R5, R6, R7, R8 или R9 необязательно связанных друг с другом с образованием одной
или нескольких алифатических или ароматических циклических структур;
U выбран из соединений, имеющих формулу:
К Ч (| в- Г| к' ь1 ^
или ' \ или
R' I I I ... "> I 1 \
В1 Р Р'' R' R '
R R' К Н'
_, _, _ или .
Н м1 ? R Р
где:
a, b и с независимо выбраны как целое число 0 или 1; при условии, что а + b + с = 2 или 3;
R1 и/или R2 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, причем указанный алкил необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: гидрокси (ОН), простой эфир (ORx), амино (NH2), монозамещенный амино (NRXH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (N02), галоген, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, циклический Ci-s алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (СРХ), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)2ORx), сульфонил (S(=0)2Rx), сульфокси (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфонокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20 гетероциклической группы или С5-20 арильной группы; и
R 3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, С3-20 гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный амино (NRxH), дизамещенный амино (NRx^x2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2, БОгМе, CONHMe, циклический С1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и
фосфата (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20 гетероциклильной группы или С5-20 арильной группы и два или более заместителей R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, или R8 необязательно связаны друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур.
[00282] Типичные молекулы включают:
п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
п-аммоциннамилоксикарбонил;
п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил; п-амино-бензилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил; п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил; п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-раминобензилоксикарбонил;
п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
п-аминобензилоксикарбонил (метиламин)этил(метиламин) карбонил;
п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламин)этил(метиламин) карбонил;
п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил (метиламин)этил(метиламин) карбонил;
п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил (метиламин)этил(метиламин) карбонил;
п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламин)этил(метиламин) -карбонил;
п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламин)этил(метиламин) карбонил;
п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил; п-аминоциннамил;
п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминобензил; п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамил; п-амино-циннамилоксикарбонил-п-аминоциннамил; п-аминофенилпентадиенил;
п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминоциннамил; п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминобензил;
п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминофенилпентадиенил.
[00283] В некоторых воплощениях B7-H3-ADC по изобретению содержит две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять цитотоксических лекарственных компонентов, которые могут быть одинаковыми или могут независимо быть одинаковыми или отличными от другого цитотоксического лекарственного компонента B7-H3-ADC. В одном воплощении каждый такой фрагмент цитотоксического лекарственного компонента конъюгирован с АЬ из B7-H3-ADC по изобретению посредством отдельной линкерной молекулы. В ином случае, более чем один цитотоксический лекарственный компонент может быть присоединен к АЬ из B7-H3-ADC по изобретению через одну и ту же линкерную молекулу.
[00284] Цитотоксические лекарственные части могут быть конъюгированы с АЬ из B7-H3-ADC по изобретению известными в данной области способами (см., например, Yao, Н. et al. (2016) "Methods to Design and Synthesize Antibody-Drug Conjugates (ADC)" Intl. J. Molec. Sci. 17(194): 1-16); Behrens, C. R. et al. (2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies" mAbs 6(l):46-53; Bouchard, H. et al. (2014) "Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs" Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:53575363). Тиольная группа цистеина, аминогруппа лизина, глутамина или аргинина или карбоксильная группа глутамата или аспартата могут быть использованы для конъюгации линкерной молекулы-цитотоксического лекарственного компонента (LM-D) с АЬ из В7-H3-ADC по изобретению. Нативные антитела содержат многочисленные сайты конъюгации с лизином и, таким образом, способны связывать множество конъюгированных молекул на антитело. Действительно, картирование пептида определило, что конъюгация происходит как на тяжелой, так и на легкой цепи около на 20 различных лизиновых остатках (40 лизинов на mAb). Таким образом, может генерироваться более одного миллиона различных видов ADC. Конъюгирование с цистеином происходит после восстановления от одной до четырех межцепочечных дисульфидных связей, и поэтому в нативных доменах VL и VH конъюгация ограничена восемью экспонированными сульфгидрильными группами. Однако при желании дополнительные реактивные остатки (например, лизин, цистеин, селеноцистеин и т.д.) могут быть введены в антитела (например, в пределах домена VL и/или домена VH и/или константного домена). Например, один или несколько природных аминокислотных остатков могут быть замещены остатком цистеина. Неестественная аминокислота (например, и-ацетилфенилаланин), может быть генетически введена в антитело с применением ингибитора стоп-кодона янтарь парой супрессирующей тРНК/aaRS. (См.,
например, Behrens CR, and Liu B. (2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies" mAbs 6(l):46-53. doi:10.4161/mabs.26632; Panowksi, S., et al. (2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy" mAbs, 6(1), 34-45, doi:10.4161/mabs.27022; and WO 2008/070593). В ином случае, или дополнительно, ферменты (например, гликотрансфераза) могут быть использованы для конъюгации линкерной молекулы-цитотоксического лекарственного компонента (LM-D) с АЬ из В7-H3-ADC по изобретению. Платформа гликотрансферазы присоединяет сахарный компонент к сайту гликозилирования на антителе (например, в положении N297 домена Fc антитела IgG человека), который затем может служить в качестве линкерной молекулы по настоящему изобретению и конъюгировать цитотоксический лекарственный компонент (D) к АЬ из B7-H3-ADC по изобретению. В ином случае, трансглутаминаза может быть использована для каталитического образования ковалентной связи между свободной аминогруппой и боковой цепью глутамина.
[00285] Предпочтительной для этой цели является коммерчески доступная трансглутаминаза из Streptoverticillium mobaraense (mTG) (Pasternack, R. et al (1998) "Bacterial Pro-Transglutaminase From Streptoverticillium mobaraense - Purification, Characterisation And Sequence Of The Zymogen" Eur. J. Biochem. 257(3):570-576; Yokoyama, K. et al. (2004) "Properties And Applications Of Microbial Transglutaminase" Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:447-454). Этот фермент не распознает любые природные остатки глютамина в домене Fc гликозилированных антител, но распознает тетрапептид LLQL (SEQ ID NO: 94) (Jeger, S. et al. (2010) "Site-Specific And Stoichiometric Modification Of Antibodies By Bacterial Transglutaminase" Angew Chem. Int. Ed. Engl. 49:9995-9997), который может быть введен в домен VL и/или домен VH и/или константный домен. Такие соображения рассматриваются Panowski, S. et al. (2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy" mAbs 6(l):34-45.
В. Типичные цитотоксические лекарственные компоненты по изобретению [00286] В некоторых воплощениях цитотоксический лекарственный компонент В7-H3-ADC по изобретению включает цитотоксин, радиоизотоп, иммуномодулятор, цитокин, лимфокин, хемокин, фактор роста, фактор некроза опухоли, гормон, антагонист гормонов, фермент, олигонуклеотид, молекулу ДНК, молекулу РНК, молекулу миРНК, молекулу РНКи, молекулу микроРНК, фотоактивный терапевтический агент, антиангиогенный агент, проапоптотическин агент, пептид, липид, углевод, хелатирующий агент или их комбинацию.
1. Цитотоксические лекарственные компоненты тубулизина
[00287] B7-H3-ADC согласно изобретению может включать цитотоксический
Производные Тубулизина
Тубулизин А
СН2СН(СНз)2
Тубулизин В
СН(СНз)2
Тубулизин С
СН2СН3
Тубулизин D
СН2СН(СНз)2
[00288] Тубулизины являются представителями класса натуральных продуктов, выделенных из миксобактериальных видов (Sasse et al. (2000) "Tubulysins, New Cytostatic Peptides From Myxobacteria Acting On Microtubuli. Production, Isolation, Physico-Chemical And Biological Properties" J. Antibiot. 53:879-885). В качестве взаимодействующих с цитоскелетом агентов тубулизины представляют собой митотические яды, которые ингибируют полимеризацию тубулина и приводят к остановке клеточного цикла и апоптозу (Steinmetz et al. (2004) "Isolation, Crystal And Solution Structure Determination, And Biosynthesis Of Tubulysins-Powerful Inhibitors Of Tubulin Polymerization From Myxobacteria" Chem. Int. Ed. 43:4888-4892; Khalil et al. (2006) "Mechanism Of Action Of Tubulysin, An Antimitotic Peptide From Myxobacteria" ChemBioChem. 7:678-683; Kaur et al. (2006) "Biological Evaluation Of Tubulysin A: A Potential Anticancer And Antiangiogenic Natural Product" Biochem. J. 396: 235-242). Тубулизины являются чрезвычайно мощными цитотоксическими молекулами, активность ингибирования которыми роста клеток превышает активность любого клинически значимого традиционного химиотерапевтического средства, например, эпотилонов, паклитаксела и винбластина. Кроме того, они являются эффективными против клеточных линий с множественной лекарственной устойчивостью (Domling, A. et al. (2005) "Myxobacteria! Epothilones And Tubulysins As Promising Anticancer Agents" Mol. Diversity 9:141-147). Эти соединения демонстрируют высокую цитотоксичность, протестированную против панели раковых линий с величинами IC50 в низком пикомолярном диапазоне; таким образом, они представляют интерес в качестве противоопухолевой терапии. См., например, WO
2012/019123, WO 2015/157594. Конъюгаты тубулизина раскрыты, например, в пат. США № 7 776 814. В некоторых воплощениях молекула тубулизина или его производное представляет собой пролекарство.
2. Цитотоксические лекарственные компоненты ауристатина [00289] Альтернативно или дополнительно B7-H3-ADC по изобретению может включать цитотоксический лекарственный компонент ауристатин, (например, ММАЕ (N-метилвалин-валин-долаизолеуин-долапроин-норэфедрин) и MMAF (N-метилвалин-валин-долаизолеуин-долапроин-фенилаланин). Доластатины первоначально были обнаружены как компоненты морского зайца Dolabella auricularia и были модифицированы для получения производных, также известных как ауристатин (например, монометилауристатин Е и F). Доластатины и ауристатины взаимодействуют с сайтом связывания алкалоидов барвинка с а-тубулином и блокируют его полимеризацию. Показано, что они влияют на динамику микротрубочек, гидролиз GTP и ядерное и клеточное деление (Woyke et al, Antimicrob. Agents and Chemother. 45:3580-3584 (2001)) и имеют противоопухолевую активность (пат. США № 5663149, 6884869, 7964566). Лекарственный компонент ауристатина может быть присоединен к антителу через N-(амино) конец или С-(карбокси) конец пептидного лекарственного фрагмента (см., например, WO 2002/088172). В некоторых воплощениях молекула, вариант или производное ауристатина или доластатина представляет собой пролекарство. ММАЕ может быть конъюгирован с белком путем модификации тиолов боковой цепи цистеина (Senter, PD et al. (2012) "The Discovery And Development Of Brentuximab Vedotin For Use In Relapsed Hodgkin Lymphoma And Systemic Anaplastic Large Cell Lymphoma" Nat. Biotechnol. 30:631-637; van de Donk, N.W. et al. (2012) "Brentuximab vedotin" MAbs 4:458-465). Этот способ включает восстановление одной или нескольких дисульфидных связей, экспонированных растворителю цистеиновых остатков, с помощью восстанавливающего агента (например, дитиотреитола (DTT) или трис (2-карбоксиэтил) фосфина (ТСЕР)) с последующей модификацией полученных тиолов с помощью малеимид-содержащего лекарственного средства (см., Behrens, CR et а/.(2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies" mAbs 6(l):46-53).
fyj. Л" l.-B-J
YI./VH или лнтитепьныи
константый
домен
I константый
Схема 1
[00290] Типичное цитотоксическое лекарственное средство, которое может быть конъюгировано таким образом, включает сайт25 расщепления протеазой катепсином В (VC: валин, цитруллин) и саморасщепляющийся линкер (РАВ: парааминобензилоксикарбонил) между малеимидной группой (МС: малеимидокапроил) и цитотоксическим лекарственным средством (ММАЕ) (Doronina, SO et al. (2003) "Development Of Potent Monoclonal Antibody Auristatin Conjugates For Cancer Therapy" Nat. Biotechnol. 21:778-784).
Схема 2: Синтез MC-VC-PAB-MMAE
[00291] В ином случае, фрагмент ауристатин-цитотоксического лекарственного
фрагмента может представлять собой AcLys-VC-PAB-MMAD
(ацетилсилинвалинцитруллин-п-аминобензилоксикарбонилмонометилдоластатин),
который может быть конъюгирован с группой NH2 боковой цепи глутаминового остатка в домене VL и/или домене VH и/или константном домене части АЬ из B7-H3-ADC по изобретению с применением фермента, микробной трансглутаминазы, для того, чтобы катализировать сайт-специфическую реакцию между боковой цепью ацетилированного остатка лизина и боковыми цепями глутамина:
Схема 3
[00292] В ином случае, п-ацетилфенилаланин может быть включен в домен VL и/или домен VH и/или константный домен части АЬ в B7-H3-ADC согласно изобретению, а затем использован для конъюгации ауристатина F-оксиамина с таким доменом путем лигирования оксима:
лмтровани" оиима
'¦' "it' • J H 1
г О
Схема 4
3. Майтанзиноидные цитотоксические лекарственные компоненты [00293] B7-H3-ADC по изобретению может альтернативно или дополнительно включать майтанзиноидный цитотоксический лекарственный компонент, например, антибиотик ансамицин, характеризующийся 19 членной структурой ансамакролида, присоединенной к хлоразмещенному бензольному кольцу хромофора. Майтанзиноиды -митотические ингибиторы, которые действуют путем ингибирования полимеризации тубулина. Майтанзин изначально был выделен из восточноафриканского кустарника Maytenus serrata (патент США № 386111). Было обнаружено, что некоторые микробы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры майтанзинола С-3 (патент США № 4 151 042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги раскрыты, например, в пат. США № 4 137 230 и 4 248 870. Майтанзиновые лекарственные компоненты являются привлекательными лекарственными компонентами в конъюгатах лекарственных средств и антител, поскольку они: (i) относительно доступны для получения путем ферментации или химической модификации, дериватизации продуктов ферментации, (ii) поддаются дериватизации с функциональными группами, подходящими для конъюгации через недисульфидные линкеры с антителами, (ш) стабильны в плазме и (iv) эффективны против множества линий опухолевых клеток. Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение, раскрыты, например, в пат. США № 5202020 и 5416064 и европейском патенте ЕР 0425235В1; Liu, С. et al. (1996) "Eradication
Of Large Colon Tumor Xenografts By Targeted Delivery Of Maytansinoids" Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 8618-8623 (описанные иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноид, обозначенный DM1) и Chari, RV et al (1992) "Immunoconjugates Containing Novel Maytansinoids: Promising Anticancer Drugs" Cancer Research 52:127-131.
[00294] Майтанзин, DM I и DM4 являются образцовыми майтанзиноидными цитотоксическими лекарственными компонентами:
[00295] Майтанзин может быть конъюгирован с Ab-частью B7-H3-ADC по изобретению путем реакции с боковой цепью лизина или глутамина. DM1 и DM4 может быть конъюгирован с СООН боковой цепи остатка глутамата или аспартата домена VL и/или домена VH и/или константного домена части АЬ из B7-H3-ADC по изобретению (см., Behrens, CR et al (2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies" mAbs 6(l):46-53; Bouchard, H. et al. (2014) "Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs" Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363):
\ I \ II
или анлтльный юнстантый
домен
О NH
/ н он
l"'"'lf
ОМ1
VL / VH или анлтольныи юншнтыи
домен
Схема 5
[00296] Трастузумаб эмтанзин (адо-трастузумаб эмтанзин, T-DM1, торговое название KADCYLA(r)) представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства, состоящее из моноклонального антитела трастузумаба (HERCEPTIN(r)), конъюгированного с майтанзиноидом мертанзином (DM1). См., например, LoRusso et al. (2011) "Trastuzumab Emtansine: A Unique Antibody-Drug Conjugate In Development For Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Cancer" Clin. Cancer Res. 20:64376447. Разработанный тио-трастузумаб-DMl ADC также описан в Junutual et al. (2010) "Engineered Thio-Trastuzumab-DMl Conjugate With An Improved Therapeutic Index To Target Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Breast Cancer" Clin, Cancer Res. 16:4769-4778. В некоторых воплощениях молекула майтанзиноида, его вариант или
производное представляет собой пролекарство.
4. Цитотоксические лекарственные фрагменты калихеамицина
[00297] B7-H3-ADC по изобретению может альтернативно или дополнительно
включать цитотоксический лекарственный компонент калихеамицина:
[00298] Описанные конъюгаты антител на основе калихеамицина являются дисульфидными вариантами исходного соединения трисульфида. До сих пор сообщалось о двух стратегиях соединения с диметилгидразидом N-ацетил-с-калихеамицина (CalichDMH): (i) с гидразидом; и (ii) с амидным сочетанием (Bouchard, Н. et al. (2014) "Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs" Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363).
[00299] Семейство калихеамициновых эндииновых противоопухолевых антибиотиков способно производить разрывы двухцепочечной ДНК в субпикомолярных концентрациях. Калихеамицины представляют собой класс эндииновых антибиотиков, полученных из бактерии Micromonospora echinospora, причем наиболее важным является калихеамицин yl. Другими калихеаминами являются piBr, ylBr, a2I, a3I, pi I, yll и All (см. Lee, MD et al. (1989) "Calicheamicins, A Novel Family Of Antitumor Antibiotics. 3. Isolation, Purification And Characterization Of Calicheamicins Beta IBr, Gamma IBr, Alpha 21, Alpha 31, Beta II, Gamma II And Delta II." J. Antibiotics 42(7): 1070-1087). Для получения конъюгатов семейства калихеамицина см. пат. США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 577001 и 5877296. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы, включают, без ограничения указанным, yll, а21, а31, N-ацетил-уП, PSAG и 911 (Hinman et al. (1993) "Preparation And Characterization Of Monoclonal Antibody Conjugates Of The Calicheamicins: A Novel And Potent Family Of Antitumor Antibiotics" Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al. (1998) "Targeted Therapy With A Novel Enediyene Antibiotic Calicheamicin Theta(I)l Effectively Suppresses Growth And Dissemination Of Liver Metastases In A Syngeneic Model Of Murine Neuroblastoma" Cancer Research 58:2925-2928 (1998). В некоторых воплощениях
молекула, вариант или производное калихеамицина представляет собой пролекарство. 5. Цитотоксические лекарственные компоненты пирролобензодиазепина [00300] B7-H3-ADC согласно изобретению может включать альтернативно или
дополнительно лекарственный компонент пирролобензодиазепина (например, природный
пирролобензодиазепин и SJG-136, его производное):
[00301] Предпочтительным пирролбензодиазепиновым лекарственным компонентом является вадастуксимаб талирин (SGN-CD33A, Seattle Genetics):
Схема 6
[00302] Пирролобензодиазепины (PBD) представляют собой класс натуральных продуктов с антибиотической или противоопухолевой активностью. В природе они продуцируются актиномицетами. Они являются соединениями, алкилирующими ДНК, а некоторые являются селективными к последовательности. Ряд PBD и их производных известны в данной области, например, димеры PBD (например, SJG-136 или SG2000), С2-ненасыщенные димеры PBD, димеры пирролобензодиазепина, содержащие С2-арильные замены (например, SG2285) лекарственное средство, которое активируется гидролизом (например, SG2285) и полипиррол-PBD (например, SG2274). PBD описаны далее в WO 2000/012507, WO 2007/039752, WO 2005/110423, WO 2005/085251 и WO 2005/040170 и
WO 2014/057119. В некоторых воплощениях молекула, вариант или производное PBD представляет собой пролекарство.
6. Цитотоксические лекарственные компоненты дуокармицина [00303] B7-H3-ADC по изобретению может альтернативно или дополнительно включать лекарственный фрагмент дуокармицина. Дуокармицины являются представителями ряда родственных натуральных продуктов, впервые выделенных из бактерий Streptomyces, и представляют собой мощные противоопухолевые антибиотики (см. Dokter, W. et al. (2014) "Preclinical Profile oftheHER2-TargetingADCSYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform" Mol. Cancer Ther. 13(ll):2618-2629; Boger, D.L. et al. (1991). "Duocarmycins - A New Class Of Sequence Selective DNA Minor Groove Alkylating Agents," Chemtracts: Organic Chemistry 4 (5): 329-349 (1991); Tercel et al. (2013) "The Cytotoxicity Of Duocarmycin Analogues Is Mediated Through Alkylation Of DNA, Not Aldehyde Dehydrogenase 1: A Comment" Chem. Int. Ed. Engl. 52(21):5442-5446; Boger, D.L. et al. (1995) "CC-1065 And The Duocarmycins: Unraveling The Keys To A New Class Of Naturally Derived DNA Alkylating Agents" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92(9):3642-3649; Cacciari, B. et al. (2000) "CC-1065 And The Duocarmycins: Recent Developments" Expert Opinion on Therapeutic Patents 10(12): 1853-1871).
[00304] Природные дуокармицины включают дукокармицин А, дуокармицин В1, дукармицин В1, дукоармицин В1, дуокармицин С2, дуокармицин D, дуокармицин SA и СС-1065 (публикация РСТ № WO 2010/062171, Martin, DG et al. (1980) "Structure Of CC-1065 (NSC 298223), A New Antitumor Antibiotic " J. Antibiotics 33:902-903; Boger, D.L. et al. (1995) "CC-1065 And The Duocarmycins: Unraveling The Keys To A New Class Of Naturally Derived DNA Alkylating Agents " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:3642-3649).
[00305] Подходящие синтетические аналоги дуокармицина включают адозелезин, бизелезин, карцелезин (U-80244) и спиро-дуокармицин (DUBA) (Dokter, W. et al. (2014) "Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform" Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629; Elgersma, R.C. et al. (2014) "Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Pay loads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985" Mol. Pharmaceut. 12:18131835):
Адозелезин
[00306] Дополнительные синтетические аналоги дуокармицина включают те, которые раскрыты в публ. РСТ № WO 2010/062171 и, в частности, такие аналоги, которые имеют формулу:
DA1 DA2
или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват, где DB является ДНК-связывающей частью и выбрана из группы, состоящей из:
х-:
> х"'- А I: в :
DB1
• - А : В \
"¦> -
% X3* А "1 I
DB5
\ - х;1 А 'V'
Х'"-А-
v-f Л" -X'
DBS
X '
-х-! A -j-А. 1 в
х < - й
DB7
DBS
м. , К • I- А '.X'
DBD
где:
R представляет собой уходящую группу;
R 2, R2, R3, R3', R4, R4, R12 и R19 независимо выбраны из Н, ОН, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(0)NH2, C(0)H, C(0)OH, галогена, Ra, SRa, S(0)Ra, S(0)2Ra, S(0)ORa, S(0)2ORa, OS(0)Ra, OS(0)2Ra, OS(0)ORa, OS(0)2ORa, ORa, NHRa, N(Ra)Rb, +N(Ra)(Rb)Rc, P(0)(ORa)(ORb), OP(0)(ORa)(ORb), SiRaRbRc, C(0)Ra, C(0)ORa, C(0)N(Ra)Rb, OC(0)Ra, OC(0)ORa, OC(0)N(Ra)Rb, N(Ra)C(0)Rb, N(Ra)C(0)ORb, и N(Ra)C(0)N(Rb)Rc, где Ra, Rb, and Rc независимо выбраны из H и необязательно замещенного Сьз алкила или Сьз гетероалкила, или R3 + R3' и/или R4 + R4' независимо выбраны из = О, = S, = NOR 18, = С (R 18) R18' и = NR 18, R18 и R18' независимо выбран из Н и необязательно замещенного Сьз алкила, два или более из R2, R2', R3, R3', R4, R4' и R12, необязательно соединяются одной
или несколькими связями с образованием одного или более необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов;
X2 выбран из О, C(R14)(R14') и NR14', где R14 и R14' имеют такое же значение, что и определенные для R7, и независимо выбраны, или R14 и R7 отсутствуют, что приводит к двойной связи между атомами, предназначенными для того, чтобы нести R7 и R14 ;
R5, R5 , R6, R6, R7 и R7' независимо выбраны из Н, ОН, SH, NH2, N3, N02, NO, CF3, CN, С (О) NH2, С (О) Н, С (О) ОН, галогена, Re, SRe, S(0)Re, S(0)2Re, S(0)ORe, S(0)2ORe, OS(0)Re, OS(0)2Re, OS(0)ORe, OS(0)2ORe, ORe, NHRe, N(Re)Rf, +N(Re)(Rf)Rg, P(0)(ORe)(ORf), OP(0)(ORe)(ORf), SiR^5, C(0)Re, C(0)ORe, C(0)N(Re)Rf, OC(0)Re, OC(0)ORe, OC(0)N(Re)Rf, N(Re)C(0)Rf, N(Re)C(0)ORf, N(Re)C(0)N(Rf)Rg и водорастворимой группы,
где
Re, Rf и Rg независимо выбраны из Н и необязательно замещенного (CH2CH20)eeCH2CH2X13Rel, С1-15 алкила, С1-15 гетероалкила, С3-15 циклоалкила, Сы5 гетероциклоалкила, С5-15 арила или Сы5 гетероарила, где ее выбирают от 1 до 1000, X13 выбирают из О, S и NRfl, a Rfl и Rel являются независимо выбранными из Н и Сьз алкила, один или нескольких необязательных заместителей в Re, Rf и/или Rg' необязательно являются водорастворимой группой, два или более из Re, Rf и Rg, необязательно, соединяются одной или несколькими связями с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов,
или R5 + R5' и/или R6 + R6' и/или R7 + R7' независимо выбраны из = О, = S, = NORe3, =C(Re3)Re4 и =NRe3, Re3 и Re4 независимо выбраны из Н и необязательно замещенного Сьз алкила или R5 + R6 и/или R6 + R7' и/или R7' + R14', что приводит к двойной связи между атомами, предназначенными для того, чтобы нести R5 + R6 и/или R6 + R7' и/или R7' + R14' соответственно, два или более из R5, R5, R6, R6, R7, R7', R14 и R14' необязательно соединяются одной или несколькими связями с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов;
X1 выбран из О, S и NR, где R выбран из Н и необязательно замещенного Ci-8 алкила или Ci-8 гетероалкила и не присоединен ни к какому другому заместителю;
X3 выбран из О, S, C(R15)R15', -C(R15)(R15')-C(R15")(R15'")-, -N(R15)-N(R15')-, -C(R15)(R15)-N(R15")-, -N(R15")-C(R15)(R15)-, -C(R15)(R15)-0-, -0-C(R15)(R15)-, -C(R15)(R15)-S-, -S-C(R15)(R15)-, -C(R15)=C(R15)-, =C(R15)-C(R15)=, -N= C(R15)-, =N- C(R15)=, -C(R15)=N-, =C(R15)-N=, -N=N-, =N-N=, CR15, N, NR15, или DB1 и DB2-X3-представляет собой - X3a и X3b-, где X3a соединен с X34, между X34 и X4 присутствует двойная связь, а Хзь связана с X11, где Х3а независимо выбран из Н и необязательно
замещенных (СШСШО^еСШСШХ13!^61, Ci-8 алкила или Ci-8 гетероалкила и не присоединенный к какому-либо другому заместителю; X 4 выбран из О, S, С (R16) R16', NR16, N и CR16;
X 5 выбран из О, S, С (R17)R1T, NOR17 и NR17, где R17 и R17' независимо выбраны из Н и необязательно замещенного Ci-8 алкила или Ci-8 гетероалкила и не присоединен к какому-либо другому заместителю;
X6 выбран из CR11, CR11 (R11'), N, NR11, О и S;
X7 выбран из CR8, CR8 (R8'), N, NR8, О и S;
X8 выбран из CR9, CR9 (R9'), N, NR9, О и S;
X9 выбран из CR10, CR10 (R10'), N, NR10, О и S;
X10 выбран из CR20, CR20 (R20'), N, NR20, О и S;
X11 выбран из С, CR21 и N или X11 -Хзь выбран из CR21, CR21 (R21'), N, NR21, О и S; X12 выбран из С, CR22 и N;
X6*, X7*, X8*, X9*, X10* и X11* имеют то же значение, что определенные для X6, X7, X8, X9, Х10иХп, соответственно, и независимо выбираются; X34 выбран из С, CR23 и N;
атом кольца В X11* в DB6 и DB7 соединен с атомом кольца А так, что кольцо А и кольцо В в DB6 и DB7 непосредственно связаны одинарной связью;
пунктирная двойная связь означает, что указанная связь может представлять собой одинарную связь или некумулятивную, необязательно делокализованную двойную связь;
R8 R8' Т> 9 Т> 9' Т? 1° Т) Ю' nil т}1Г Rl5 Т> 15' X? 15" тз 15" т> 16 т> 16' R20 R20' R21 R21' R22 T.
R23 каждый независимо выбран из Н, ОН, SH, NH2, N3, N02, NO, CF3, CN, C(0)NH2, C(0)H, C(0)OH, halogen, Rh, SRh, S(0)Rh, S(0)2Rh, S(0)ORh, S(0)2ORh, OS(0)Rh, OS(0)2Rh, OS(0)ORh, OS(0)2ORh, ORh, NHRh, N(Rh)Ri, +N(Rh)(Ri)Rj, P(0)(ORh)(ORi), OP(0)(ORh)(ORi), SiR^R, C(0)Rh, C(0)ORh, C(0)N(Rh)Ri, OC(0)Rh, OC(0)ORh, OC(0)N(Rh)Ri, N(Rh)C(0)Ri, N(Rh)C(0)ORi, N(Rh)C(0)N(Ri)Rj и водорастворимой группы, где
Rh, R1 и RJ независимо выбраны из Н и необязательно замещенного (CH2CH20)eeCH2CH2X13Rel, Сы5 алкила, Сы5 гетероалкила, С 3-15 циклоалкила, Сы5 гетероциклоалкила, С 5-15 арила или Сы5 гетероарила, один или несколько необязательных заместителей в Rh, R1 и/или RJ' необязательно являющихся водорастворимой группой, два или более Rh, R1 и RJ необязательно соединяются одной или несколькими связями с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов,
или R8 + R8' и/или R9 + R9 и/или R10 + R10' и/или R11 + R11' и/или R15 + R15 и/или R15"
+ R15 " и/или R16 + R16' и/или R20 + R20' и/или R21 + R21' независимо выбраны из =0, =S, =NOR hl, = С (R hl) RM и = NR ы, Rhl и RM независимо выбраны из H и необязательно замещенного Сьз алкила, два или более R8, R8', R9, R9, R10, R10', R11, R11', R15, R15, R15 ", R15', R16, R20, R20', R21, R21', R22 и R23 необязательно соединены одной или несколькими связями с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов;
R 8Ь и R9b независимо выбраны и имеют такое же значение, что и R8, за исключением того, что они не могут быть соединены с каким-либо другим заместителем;
один из R4 и R4 и один из R16 и R16 могут быть необязательно соединены одной или несколькими связями с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов;
один из R4 и R4 и один из R16 и R16 может быть необязательно присоединены к одному из R2, R2, R3 и R3 и один из R5 и R5 могут быть необязательно соединены одной или несколькими связями с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов;
а и b независимо выбран из 0 и 1;
компонент DB не включает компонент DAI, DA2, DAT, или DA2'; кольцо В в DB 1 является гетероциклом;
если X3 в DB1 представляет собой - Х3а и Хзь - и кольцо В является ароматическим, то два вицинальных заместителя на указанном кольце В соединяются с образованием необязательно замещенного карбоцикла или гетероцикла, слитого с указанным кольцом В;
если X3 в DB2 представляет собой - Х3а и Хзь - а кольцо В является ароматическим, то два вицинальных заместителя на указанном кольце В соединяются с образованием необязательно замещенного гетероцикла, слитого с указанным кольцом В, необязательно замещенного неароматического карбоцикла, слитого с указанное кольцо В или замещенный ароматический карбоцикл, который слит с указанным кольцом В и к которому присоединен, по меньшей мере, один заместитель, который содержит гидроксигруппу, первичную аминогруппу или вторичную аминогруппу, причем первичный или вторичный амин не является кольцевым атомом в системе ароматических колец или не являющийся частью амида;
если кольцо А в DB2 представляет собой 6-членное ароматическое кольцо, то заместители на кольце В не соединяются с образованием кольца, слитого с кольцом В;
два вицинальных заместителя на кольце А в DB8 соединяются с образованием необязательно замещенного карбоцикла или гетероцикла, конденсированного с указанным кольцом А, с образованием бициклической группы, к которой не
присоединены никакие дополнительные кольца; и кольцо А в DB9 вместе с любыми кольцами, конденсированными с указанным кольцом А, содержит, по меньшей мере, два кольцевых гетероатома.
[00307] Вышеописанные линкерные молекулы могут быть конъюгированы с цистеиновой тиольной группой с применением тиол-малеимидной химии, как показано выше. В некоторых воплощениях цитотоксический лекарственный компонент дуокармицина представляет собой пролекарство. Например, пролекарство, vc-seco-DUBA может быть конъюгировано с самоэлиминирующимся компонентом, связанным с малеимидным линкером, с помощью расщепляемого пептидного компонента:
расщепляемый пептидный компонент
. иомпонент
\ пролегарства "v DU6A
Г, :Г
,-~\ 11 '/
к /~~н
IT;;
4 ы
^L. "Jv
v. и
н : <
N л
само-
v алиминир^юицйся компонент
малеимидныи лин горный
гомпонент
к H-.N t)
Схема 7
[00308] Компонент малеимидного линкера молекулы может быть конъюгирован с тиоловой группой остатка цистеина домена VL и/или домена VH и/или константного домена части АЬ из B7-H3-ADC по изобретению. Последующее протеолитическое расщепление расщепляемого пептидного компонента сопровождается спонтанным элиминированием самоэлиминирующегося фрагмента, что приводит к высвобождению seco-DUBA, который спонтанно перестраивается с образованием активного лекарственного средства DUBA:
Схема 8
(см. Dokter, W. et al. (2014) "Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform" Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629).
[00309] В предпочтительном способе получения конъюгатов В7-НЗ-дуокармициновый лекарственный компонент, может быть использован способ Elgersma, RC et al. (2014) "Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Pay loads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985" Mol. Pharmaceut. 12: 18131835 или документа WO 2011/133039. Таким образом, тиол-содержащая группа цепи VL или VH антитела или фрагмента антитела анти-В7-НЗ конъюгированы с seco-DUBA или другим пролекарством через малеимидный линкерный компонент, расщепляемый пептидный компонент, самоэлиминирующийся компонент (схема 9А):
расщепляемый пелчдный компонент
> компонент
VL / VH
или антительный константный домен
Н J
Схема 9А
[00310] Хотя изобретение проиллюстрировано в отношении пролекарства DUBA, альтернативно могут быть использованы другие пролекарства, например СС-1065, как показано на схеме 9В:
компонент пролевзрства CCV-10G5
Л.
расщепляемый пептидный компонент
О к
> ГУ } ' X
-sh * .К---^-К. -Ч> ~-Ач
> , элиминирующийся компонент
малеимидный лин герный компонент ;
VL i VH или антательный константный
компонент пролекарства OCV-1Q69
малеимидный лин ирный компонент
VLim
или антательный константный домен
...
Схема 9В
[00311] При расщеплении расщепляемого пептидного компонента и элиминации самоэлеминирующегося компонента, пролекарственный компонент подвергается спироциклизации Винштейна с получением активного лекарственного средства (например, DUBA из seco-DUBA, как показано на Схеме 9С).
Схема 9С
[00312] seco-DUBA получают из соответствующих ДНК-алкилирующих и ДНК-связывающих компонентов (например, каркаса 1,2,9,9а-тетрагидроциклопропил [ с ] бензо [ е ] индол-4-она, как описано Elgersma, RC et al. (2014) "Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985" Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835 (см., Boger, D.L. et al. (1989) "Total Synthesis and Evaluation of (±)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-CBI, (±)-CBI-CDPIl, and (±)-CBI-
CDPI2: CC-1065 Functional Agents Incorporating the Equivalent 1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[l,2-c]benz[l,2-e]indol-4-one (CBI) Left-Hand Subunit" J. Am. Chem. Soc. 111:6461-6463; Boger, D.L. et al. (1992) "DNA Alkylation Properties of Enhanced Functional Analogs of CC-1065 Incorporating the l,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropafl,2-c]benz[l,2-e]indol-4-one (CBI) Alkylation Subunit" J. Am. Chem. Soc. 114:5487-5496).
[00313] Схема 9D иллюстрирует изобретение, демонстрируя синтез ДНК-алкилирующего фрагмента для DUBA. Так, о-толуальдегид (1) и диметилсукцинат (2) подвергают взаимодействию с получением смеси кислот (За/ЗЬ) через конденсацию Штоббе. Кольцевое замыкание смеси кислот может быть выполнено трифторуксусным ангидридом с получением спирта (4), который затем защищается бензилхлоридом с получением бензилового эфира (5). Последующий гидролиз группы метилового эфира дает карбоновую кислоту (6), за которой следует перегруппировка Курциуса в смеси толуола и трет-бутилового спирта с получением карбамата (7). Бромирование с помощью N-бромсукцинимида дает бромид (8). Бромид (8) алкилируют (8)-глицидил-нозилатом в присутствии дареда-бутоксида калия с получением эпоксида (9). Реакция с н-бутиллитием дает смесь искомого соединения (10) и дебромированного перестроенного производного (11). Выход целевого соединения (10) выше, когда в качестве растворителя используют тетрагидрофуран и температуру реакции поддерживают между -25 и -20 °С. В этих условиях искомое соединение (10) и дебромированное, перегруппированное производное (11) получают в приблизительном соотношении 1:1. Обработка и-толуолсульфоновой кислотой приводит к превращению дебромированного, перегруппированного производного (11) в (7), тем самым способствуя восстановлению искомого соединения (10). Мезилирование гидроксильной группы в (10) с последующим замещением хлоридом с применением хлорида лития дает ключевое промежуточное соединение (12).
Схема 9D
[00314] Схема 9E иллюстрирует изобретение, демонстрируя синтез ДНК-связывающего фрагмента для DUBA. Так, реакции циклизации по Чичибабину разрешается протекать между этилбромируваватом (13) и 5-нитропиридин-2-амином (14), с получением при этом нитросоединения (15). Восстановление нитрогруппы цинком в кислых условиях дает амин (16). Соединение с метилоксиметил (MOM) -защищенной 4-гидроксибензойной кислотой (17), полученной из метил-4-гидроксибензоата путем реакции с хлорметилметиловым эфиром с последующим гидролизом сложного эфира (см. WO 2004/080979) дает этиловый эфир (18), который может гидролизоваться гидроксидом натрия в водном 1,4-диоксане с получением кислоты (19).
NH2
.ОМОМ
Схема 9E
[00315] seco-DUBA затем синтезируется из ДНК-алкилирующей единицы (12) и ДНК-связывающего фрагмента (19). Трет-бутоксикарбонильную (Вое) защитную группу удаляют из (12) в кислых условиях с образованием амина (20). EDC-опосредованное соединение амина (20) и соединения (19) дает защищенное соединение (21), с которого затем полностью снимается защита в двух последовательных стадиях (с Pd/C, NH4HCO2, MeOH/THF, 3 часа, 90%, с получением (22), а затем с помощью НС1, 1,4-диоксан/вода, 1 ч, 95%, чтобы обеспечить seco-DUBA (23) в виде его HCl-соли (схема 9F).
Схема 9F
[00316] Пролекарства других лекарственных средств, например СС-1065, могут быть синтезированы, как описано, например, в WO 2010/062171.
[00317] Пролекарственное соединение предпочтительно связывается с другими фрагментами ADC в соответствии со схемой 9G. Структурный блок малеимидного линкера синтезировали, начиная с реакции конденсации между (24) и 2- (2-аминоэтокси) этанолом (25) с получением спирта (26), который затем превращали в реакционноспособный карбонат (27) путем реакции с 4 -нитрофенилхлорформиатом. Соединение (27) с Н-валин-цитруллин-РАВА (28), полученное согласно Dubowchik, GM et al. (2002) "Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers For Lysosomal Release Of Doxorubicin From Internalizing Immunoconjugates: Model Studies Of Enzymatic Drug Release And Antigen-Specific In Vitro Anticancer Activity" Bioconjugate Chem. 13:855-869) приводит к образованию линкера (29), который обрабатывают бис (4-нитрофенил) карбонатом с получением активированного линкера (30).
Схема 9G
Как показано на схеме 9Н, seco-DUBA-MOM (22) модифицируют для конъюгации в две стадии. Последовательная обработка (22) 4-нитрофенилхлорформиатом и трет-бутилметил (2- (метиламино) этил) карбаматом (31) дает соединение (32). Удаление защитных групп Вое и MOM в (32) с помощью трифторуксусной кислоты (TFA) обеспечивало (33) в виде его соли TFA.
Схема 9Н
[00318] ADC был синтезирован реакцией активированного линкера (30) с конструкцией циклизационный спейсер-дуокармицин (33) в слабо основных условиях. В этих условиях самоэлиминация циклизационного спейсера и образование За было подавлено (схема 91).
Схема 91
[00319] Процесс генерирует в среднем две свободные тиоловые группы на mAb, что приводит к статистическому распределению B7-H3-ADC со средним соотношением лекарственного средства к антителу (DAR) около двух и низкими количествами высокомолекулярных частиц и остаточным неконъюгированным дуокармициновым компонентом.
[00320] Порядок стадий синтеза может изменяться по желанию. Предпочтительно, используемый способ будет тем, что на схемах 9A-9I, как описано выше.
XII. Применения В7-НЗ-связывающих молекул настоящего изобретения [00321] Настоящее изобретение охватывает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие В7-НЗ-связывающей молекулы по
настоящему изобретению (например, антитела, биспецифические антитела, биспецифические диатела, трехвалентные связывающие молекулы, B7-H3-ADC и т.д.), полипептиды, полученные из таких молекул, полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие такие молекулы или полипептиды, и другие агенты, как описано в данном документе.
[00322] В соответствии с данным документом, В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению, включающие aHTH-B7-H3-VL и/или VH-домены, предлагаемые в данном документе, обладают способностью связывать В7-НЗ, присутствующий на поверхности клетки, и индуцировать антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплементарно-зависимую цитотоксичность (CDC) и/или опосредовать перенацеленное уничтожение клеток (например, перенацеленную цитотоксичность Т-клеток). Без указания какого-либо механизма действия, молекулы В7-H3-ADC по настоящему изобретению интернализуются при связывании с В7-НЗ, экспрессируемом опухолевой клеткой, и опосредуют уничтожение опухолевой клетки посредством действия конъюгированного цитотоксина.
[00323] Таким образом, В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению, включающие aHTH-B7-H3-VL и/или VH-домены, обладают способностью лечить любое заболевание или состояние, связанное с В7-НЗ или характеризуемое экспрессией В7-НЗ. Как обсуждалось выше, В7-НЗ является онко-эмбриональным антигеном, экспрессируемым в многочисленных злокачественных новообразованиях системы кроветворения и солидных опухолях, который ассоциирован с опухолями высокой степени злокачественности, демонстрирующими менее дифференцированную морфологию, и коррелирует с плохими клиническими результатами. Таким образом, без ограничения указанным, В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для диагностики или лечения раков, в частности раков, характеризующихся экспрессией В7-НЗ.
[00324] Рак, на который можно воздейтсвовать В7-НЗ-связывающими молекулами по настоящему изобретению, включает рак, характеризующийся наличием раковой клетки, выбранной из группы, состоящей из клетки опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, В-клеточной неоплазии, рака молочной железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, язвенной карциномы клетки, рака ободочной кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной
гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли
Юинга, внескелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного
фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока,
рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, опухоли зародышевых клеток,
рака головы и шеи, глиобластомы, гемобластозов, гепатоцеллюлярной карциномы,
опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза (например, острого
миелоидного лейкоза), липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака
печени, лимфомы, рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC)),
медуллобластомы, меланомы, менингиомы, мезотелиомы фарингеального рака,
множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы,
миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, детского онкологического заболевания, опухоли периферических нервных оболочек, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, увеальной меланомы заднего полюса, почечного метастатического рака, рабдоидной опухоли, рабдомизаркомы, саркомы, рака кожи, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластомы и рабдомиосаркомы), саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN)), рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
[00325] В частности, В7-НЗ-связывающей молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака желудка, глиобластомы, рака почки, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), острогой лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфомы Беркетта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток зоны мантии, лимфомы из клеток маргинальной зоны, мезотелиомы фарингеального рака, неходжкинской лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, множественной миеломы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, карциномы почек, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластому и рабдомиосаркому), плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN), рака яичек, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
[00326] Биспецифические В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению дополняют терапию рака, обеспечиваюмую В7-НЗ, путем содействия перенацеленному уничтожению опухолевых клеток, которые экспрессируют вторую специфичность таких молекул (например, CD2, CD3, CD8, CD 16, Т-клеточный рецептор (TCR), NKG2D и т.д.). Такие В7-НЗ-связывающие молекулы, особенно полезны при лечении рака.
[00327] В дополнение к их полезности в терапии, В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть детектируемо маркированы и использованы для диагностики рака или при визуализации опухолей и опухолевых клеток.
XIII. Фармацевтические композиции
[00328] Композиции по изобретению включают нерасфасованные лекарственные композиции, пригодные для изготовления фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиций) и фармацевтических композиций (т.е. композиции, которые подходят для введения объекту или пациенту), которые могут быть использованы в подготовке стандартных лекарственных форм. Такие композиции включают профилактически или терапевтически эффективное количество В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению или комбинацию таких агентов и фармацевтически приемлемого носителя. Предпочтительно композиции по изобретению содержат профилактически или терапевтически эффективное количество В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение также охватывает такие фармацевтические композиции, которые дополнительно включают второе терапевтическое антитело (например, опухолеспецифичное моноклональное антитело), которое является специфичным для конкретного ракового антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.
[00329] В конкретном воплощении термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, и, более конкретно, на людях. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), эксципиенту или носителю, с которым вводится терапевтическое средство. Как правило, ингредиенты композиций по изобретению поставляются либо отдельно, либо смешиваются вместе в стандартной дозированной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или концентрата без воды в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, указывающей количество активного агента. Там, где композиция должна вводиться путем инфузии, ее можно распределять из
инфузионной бутылки, содержащей стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической категории. Когда композицию вводят путем инъекции, может быть предусмотрена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения.
[00330] Изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько контейнеров, наполненных В7-НЗ-связывающей молекулой по настоящему изобретению, отдельно или с таким фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, один или несколько других профилактических или терапевтических агентов, полезных для лечения заболевания, также могут быть включены в фармацевтический пакет или набор. Изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по изобретению. Необязательно связанным с таким контейнером(ами) может быть уведомление в форме, предписанной правительственным учреждением, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, которое отражает одобрение агентства по производству, использованию или продаже для введения людям.
[00331] Настоящее изобретение предлагает наборы, которые могут использоваться в вышеуказанных способах. Набор может содержать любую из В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению, включая B7-H3-ADC. Набор может дополнительно содержать один или несколько других профилактических и/или терапевтических агентов, полезных для лечения рака, в одном или нескольких контейнерах.
XIV. Способы введения
[00332] Композиции по настоящему изобретению могут быть предусмотрены для лечения, профилактики и улучшения одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, расстройством или инфекцией, путем введения объекту эффективного количества гибридного белка или конъюгированной молекулы по изобретению, или фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок или конъюгированную молекулу по изобретению. В предпочтительном аспекте такие композиции по существу очищаются (т.е. практически не содержат веществ, которые ограничивают его действие или вызывают нежелательные побочные эффекты). В конкретном воплощении объектом является животное, предпочтительно млекопитающее, такое как не примат (например, бык, лошадь, кошка, собачий, грызун и т.д.) или примат (например, обезьяна, такая как яванский макак, человек и т. д.). В предпочтительном воплощении объект является человеком.
[00333] Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения композиций по изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантных клетках, способных экспрессировать антитело или гибридный белок, опосредуемый рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et al, (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, " J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д.
[00334] Способы введения молекулы по изобретению включают, без ограничения указанным, парентеральное введение (например, внутрикожные, внутримышечные, внутрибрюшинные, внутривенные и подкожные), эпидуральные и слизистые (например, интраназальные и пероральные пути). В конкретном воплощении В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению, вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным способом, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизистые выстилки (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и слизистую оболочку кишечника и т.д.) и могут быть введены вместе с другими биологически активными агента. Введение может быть системным или местным. Может быть использовано введение через легкие, например, с помощью ингалятора или распылителя и состава с распыляемым агентом. См., например, пат. США № 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; и 4880078; и публ. РСТ № WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; и WO 99/66903, каждый из которых включен в настоящее описание ссылкой во всей полноте.
[00335] Изобретение также предусматривает, что препараты В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению, упаковывают в герметически закрытый контейнер, такой как ампула или саше, указывающие количество молекулы. В одном воплощении такие молекулы поставляются в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или концентрата без воды в герметично закрытом контейнере и могут быть восстановлены, например, водой или физиологическим раствором до соответствующей концентрации для введения объекту. Предпочтительно В7-НЗ-связывающие молекулы по настоящему изобретению, поставляются в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере.
[00336] Лиофилизированные препараты В7-НЗ-связывающих молекул по настоящему изобретению следует хранить при температуре от 2 °С до 8 °С в исходном контейнере, а молекулы следует вводить в течение 12 часов, предпочтительно в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 3 часов или в течение 1 часа после восстановления. В
альтернативном воплощении такие молекулы поставляются в жидкой форме в герметично закрытом контейнере, указывающем количество и концентрацию молекулы, гибридного белка или конъюгированной молекулы. Предпочтительно такие В7-НЗ-связывающие молекулы, если они представлены в жидкой форме, поставляются в герметично закрытом контейнере.
[00337] Количество таких препаратов по изобретению, которые будут эффективны при лечении, профилактике или улучшении одного или нескольких симптомов, связанных с расстройством, могут быть определены стандартными клиническими методами. Точная доза, которая будет использоваться в препарате, будет также зависеть от способа введения и от тяжести состояния и должна определяться в соответствии с суждением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из in vitro тест-систем или тест-систем на животных.
[00338] Используемый в данном документе термин "эффективное количество" фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для получения полезных или искомых результатов, включая, без ограничения указанным, клинические результаты, такие как уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, ослабление симптома инфекции (например, вирусной нагрузки, лихорадки, боли, сепсиса и т. д.) или симптома рака (например, пролиферации, раковых клеток, наличия опухоли, метастазов опухоли и т. д.), тем самым повышая качество жизни страдающих от болезни, уменьшая дозу других лекарств, необходимых для лечения болезни, усиливая эффект другого лекарственного средства, например, путем нацеливания и/или интернализации, тем самым задерживая прогрессирование заболевания и/или пролонгирования выживания индивидуумов.
[00339] Эффективное количество можно вводить в одном или нескольких введениях. Для целей настоящего изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для снижения пролиферации (или эффекта) вирусного присутствия, а также для уменьшения и/или замедления развития вирусного заболевания, либо непосредственно, либо косвенно. В некоторых воплощениях эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнуто или не достигнуто в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективное количество" может быть рассмотрено в контексте введения одного или нескольких химиотерапевтических агентов, и один агент может считаться указанным в эффективном
количестве, если в сочетании с одним или несколькими другими агентами искомый результат может быть достигнут или был достигнут. В то время как индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента входит в компетенцию специалистов.
[00340] Для В7-НЗ-связывающих молекул, охватываемых изобретением, дозировка, вводимая пациенту, предпочтительно определяется на основе массы тела (кг) объекта-реципиента. Для В7-НЗ-связывающих молекул, охватываемых изобретением, дозировка, вводимая пациенту, обычно составляет от около 0,01 мкг/кг до около 30 мг/кг или более от массы тела объекта.
[00341] Дозировка и частота введения В7-НЗ-связывающей молекулы по настоящему изобретению могут быть уменьшены или изменены из-за усиления поглощения и проникновения в ткани молекулы посредством модификаций, таких как, например, липидация.
[00342] Дозировка молекулы В7-НЗ-связывающей молекулы по изобретению, вводимой пациенту, может быть рассчитана для использования в качестве монотерапии. В ином случае, молекула может использоваться в комбинации с другими терапевтическими композициями, а дозировка, вводимая пациенту, ниже, чем когда указанные молекулы используются как монотерапия.
[00343] Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить локально в область, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например, без ограничения указанным, местной инфузией путем инъекции или с помощью имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или желатинообразный материал, включая мембраны, такие как мембраны sialastic, или волокна. Предпочтительно, при введении молекулы по изобретению следует проявлять осторожность при использовании материалов, которые могут абсорбировать молекулу.
[00344] Композиции по изобретению могут быть доставлены в везикуле, в частности липосоме (See Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery, " Science 249:15271533); Treat et al, in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327).
[00345] Обработка объекта терапевтически или профилактически эффективным количеством В7-НЗ-связывающей молекулы по настоящему изобретению может включать однократную обработку или, предпочтительно, может включать серию обработок. В предпочтительном примере объект обрабатывают таким диателом один раз в неделю в течение от 1 до 10 недель, предпочтительно от 2 до 8 недель, более предпочтительно от 3
до 7 недель и еще более предпочтительно около 4,5, или 6 недель. Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить один раз в день с таким введением один раз в неделю, два раза в неделю, раз в две недели, один раз в месяц, раз в шесть недель, один раз в два месяца, два раза в год или один раз в год и т.д. В ином случае, фармацевтические композиции по изобретению можно вводить два раза в день, причем такое введение происходит один раз в неделю, два раза в неделю, раз в две недели, один раз в месяц, раз в шесть недель, один раз в два месяца, два раза в год или один раз в год и т.д. В ином случае, фармацевтические композиции по изобретению можно вводить три раза в день при таком введении один раз в неделю, два раза в неделю, раз в две недели, один раз в месяц, раз в шесть недель, один раз в два месяца, два раза в год или раз в год и т.д. Также будет понятно, что эффективная доза молекул, используемых для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в течение конкретной обработки. XV. Воплощения изобретения
[00346] Изобретение, в частности, относится к следующим воплощениям (ЕА И ЕВ): ЕА1. Конъюгат анти-В7-НЗ антитела и лекарственного средства (B7-H3-ADC), который включает формулу: Ab-(LM)m-(D)", где:
АЬ представляет собой антитело, которое связывается с В7-НЗ, которое включает гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и гуманизированный вариабельный домен легкой цепи (VL) или является его В7-НЗ-связывающим фрагментом;
D представляет собой цитотоксический лекарственный компонент; LM представляет собой связь или линкерную молекулу, которая ковалентно связывает АЬ и D;
m представляет собой целое число от 0 до п и обозначает количество линкерных молекул в B7-H3-ADC; и
п представляет собой целое число от 1 до 10 и обозначает количество цитотоксических лекарственных компонентов, ковалентно связанных с молекулой В7-НЗ-ADC.
Ед2. The B7-H3-ADC из Ед1, в котором:
(A) (i) указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99 и
(ii) указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 104; или
(B) (i) указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и
(ii) указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; или
(C) (i) указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 и
(ii) указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
ЕдЗ. B7-H3-ADC по Ед1, в котором указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, и указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104.
Ед4. B7-H3-ADC по Ед1, в котором указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
Ед5. B7-H3-ADC по Ед1, в котором указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
Едб. B7-H3-ADC по любому из ЕА1-ЕА5, В котором АЬ представляет собой антитело.
Ед7. B7-H3-ADC по любому из Е1 - Ед5, в котором АЬ представляет собой антиген - связывающий фрагмент антитела.
Ед8. B7-H3-ADC по любому из Ед1-Е А 7, в котором B7-H3-ADC содержит домен Fc IgG человека.
Ед9. B7-H3-ADC по Ед8, в котором IgG человека представляет собой IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
ЕдЮ. B7-H3-ADC по Ед8 или Ед9, в котором домен Fc представляет собой вариантный домен Fc, который включает:
(а) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc к FcyR; и/или
(b) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые увеличивают период полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc.
EAII. B7-H3-ADC по ЕдЮ, в котором модификации, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc к FcyR, включают замену L234A; L235A; или L234A и L235A, где указанная нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
Ед12. B7-H3-ADC по ЕдЮ или Ед11, в котором модификации, которые увеличивают время полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc, включают замену M252Y; M252Y и S254T; M252Y и Т256Е; M252Y, S254T и Т256Е; или K288D и Н435К, где указанная нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
Ед13. B7-H3-ADC по любому из ЕА1-ЕА12, В котором, по меньшей мере, один из указанных LM представляет собой линкерную молекулу.
Ед14. B7-H3-ADC по Ед13, в котором линкерная молекула LM представляет собой пептидный линкер.
Ед15. B7-H3-ADC по Ед13, в котором линкерная молекула LM является расщепляемым линкером.
ЕА16. B7-H3-ADC по Ед15, в котором указанная молекула включает формулу:
АЬ - [V-(W)k-(X)i-A] - D
где:
V является указанной расщепляемой линкерной молекулой LM,
(W) к - (X) 1 -А представляет собой удлиненную самоэлиминирующуюся спейсерную систему, которая самоэлиминируется посредством а 1,(4+2п)-элиминации,
W и X каждый представляют собой спейсер каскада электронов а 1,(4+2п), являющихся одинаковыми или различными,
А представляет собой либо спейсерную группу формулы (Y)m, где Y представляет собой спейсер каскада электронов а 1,(4+2п), либо группу формулы U, являющуюся спейсером циклизации-элиминации,
k, 1 и m независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно),
п представляет собой целое число от 0 (включительно) до 10 (включительно), при условии, что:
когда А равно (Y)m: тогда k + 1 + m > 1, и если к + 1 + m = 1, то n> 1; когда А равно U: тогда k + 1 > 1.
W, X и Y независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
-P~\_J}- (l)a-(F)b-(G)o-^R4
R' R
R1 R2 или формулу: ,Q
-^-(D,-(F)b-(G)c- где: Q представляет собой -R5C=CR6-, S, O, NR5, -R5C=N- или -N=CR5-r представляет собой NR7, О или a
a, b и с независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно);
I, F и G независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
R8 RF д9
/ / \
где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 и R9 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, Сз-2о гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный амино (NRxH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2, БОгМе, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2) х, Rx1 и Rx2 независимо выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20 гетероциклильной группы или С5-20 арильной группы, два или более заместителей R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 или R9 необязательно связаны друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур;
U выбран из соединений, имеющих формулу:
л' К" к ч- К' к'
I Г IIе' = о
M-ILL-IC, -Ci. -Г,- 10111 м [ч • или
I?' I I I I
R"' RU R" R1 RЈ
R-1 R'"~ К" (tm)f
-N . ¦-N- ипи > J - . к
к' R' к1 R' к F" Ч
где:
a, b и с независимо выбраны как целое число 0 или 1; при условии, что а + b + с = 2 или 3;
R1 и/или R2 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, причем указанный алкил необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: гидрокси (ОН), простой эфир (OR х), амино (NH2), монозамещенный амино (NRXH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (N02), галоген, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (СРХ), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)2ORx), сульфонил (S(=0)2Rx), сульфокси (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфонокси (ОП (= О) (ОН) 2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, С з- 20 гетероциклической группы или С5-20 арильной группы; и
R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, С3-20 гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный амино (NRxH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2, БОгМе, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфата (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20 гетероциклической группы или С5-20 арильной группы и два или более заместителей R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, или R8 необязательно связаны друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур.
Ед17. B7-H3-ADC по Ед16, в котором линкерная молекула LM включает:
(1) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
(2) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-
аминобензилоксикарбонил;
(3) п-аммоциннамилоксикарбонил;
(4) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
(5) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
(6) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
(7) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
(8) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-арниноциннамилоксикарбонил;
(9) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонилпаминобензилоксикарбонил;
(10) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-
аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
(11) п-аминобензилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(12) п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(13) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил
(метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(14) п-аминоиндинамикоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(15) п-аминобензилоксикарбонил-п-арниноциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) -карбонил;
(16) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(17) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
(18) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
(19) п-аминоциннамил;
(20) п-аминоциннанилоксикарбонил-п-аминобензил;
(21) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(22) п-амино-циннамилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(23) п-аминофенилпентадиенил;
(24) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(25) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминобензил; или
(26) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминофенилпентадиенил.
Ед18. B7-H3-ADC по любому из ЕА13-ЕА17, В котором указанном линкерная молекула LM конъюгирована с боковой цепью аминокислоты в полипептидной цепи АЬ и связывает указанное АЬ с молекулой указанного цитотоксического лекарственного компонента D.
Ед19. B7-H3-ADC по любому из ЕА1-ЕА18, где указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин, радиоизотоп, иммуномодулятор, цитокин, лимфокин, хемокин, фактор роста, фактор некроза опухоли, гормон, антагонист гормонов, фермент, олигонуклеотид, ДНК, РНК, миРНК РНКи, микроРНК, фотоактивный терапевтический агент, антиангиогенный агент, проапоптотический агент, пептид, липид, углевод, хелатирующий агент или их комбинации.
Ед20. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин и выбран из группы, состоящая из тубулизина, ауристатина, меитанзиноида, калихеамицина, пирролобензодиазепина и дуокармицина.
Ед21. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин тубулизин и выбран из группы, состоящей из
тубулизина А, тубулизина В, тубулизина С, и тубулизина D.
Ед22. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает ауристатин цитотоксин и выбран из группы, состоящей из ММАЕ (N-метилвалин-валин-долаизолеуин-долапроин-норэфедрина) и MMAF (N-метилвалина-валин-долаизолеуин-долапроин-фенилаланина).
Ед23. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает майтанзиноид цитотоксин и выбран из группы, состоящей из майтанзина, DM1 и DM4.
Ед24. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин калихеамицин и выбран из группы, состоящей из калихеамицина Г1, калихеамицина piBr, калихеамицина у IBr, калихеамицина а21, калихеамицина а31, калихеамицина pil, калихеамицина yll, и калихеамицина АН.
Ед25. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин пирролобензодиазепин и выбран из группы, состоящей из вадастуксимаба талирина, SJG-136, SG2000, SG2285 и SG2274.
Ед26. B7-H3-ADC по Ед19, в котором указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин дуокармицин и выбран из группы, состоящей из дуокармицина А, дуокармицина В1, дуокармицина В2, дуокармицина С1, дуокармицина С2, дуокармицина D, дуокармицина SA, СС-1065, адозелезина, бизелезина, карзелезина (U-80244) и спиро-дуокармицина (DUBA).
Ед27. B7-H3-ADC по любому из ЕА1-ЕА26, В котором линкерная молекула LM ковалентно связана с указанным АЬ с помощью восстановленных межцепочечных дисульфидов.
Ед28. Фармацевтическая композиция, которая включает эффективное количество B7-H3-ADC по любому из ЕА1-ЕА27 И фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
Ед29. Применение B7-H3-ADC по любому из ЕА1-ЕА27 ИЛИ фармацевтической композиции Ед28 при лечении заболевания или состояния, связанного с экспрессией В7-НЗ или характеризующегося экспрессией В7-НЗ.
ЕдЗО. Применение Ед29, в котором указанное заболевание или состояние, связанное с или характеризующееся экспрессией В7-НЗ, представляет собой рака.
Ед31. Применение ЕдЗО, где указанное рак характеризуется наличием раковой клетки, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга,
метастатической опухоли головного мозга, В-клеточной неоплазии, рака молочной
железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы,
хромофобной почечно-клеточной карциномы, язвенной карциномы клетки, рака
ободочной кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной
гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли
Юинга, внескелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного
фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока,
рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, опухоли зародышевых клеток,
рака головы и шеи, глиобластомы, гемобластозов, гепатоцеллюлярной карциномы,
опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза (например, острого
миелоидного лейкоза), липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака
печени, лимфомы, рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC)),
медуллобластомы, меланомы, менингиомы, мезотелиомы фарингеального рака,
множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы,
миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, детского онкологического заболевания, опухоли периферических нервных оболочек, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, увеальной меланомы заднего полюса, почечного метастатического рака, рабдоидной опухоли, рабдомизаркомы, саркомы, рака кожи, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластомы и рабдомиосаркомы), саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN)), рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
Ед31. Применение ЕдЗО, в котором указанный рак выбран из группы, включающей рак надпочечников, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак почки, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, лимфому Беркетта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток зоны мантии, лимфомы из клеток маргинальной зоны, мезотелиомы фарингеального рака, неходжкинской лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, множественной миеломы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, карциномы почек, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей
(включая нейробластому и рабдомиосаркому), плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN), рака яичек, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
Ев1. В7-НЗ-связывающая молекула, которая включает вариабельный домен легкой цепи (VL), который включает домен CDRLI, домен CDRjJZ и домен CDRL3 И вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который включает домен CDRHI, домен CDRH2 и домен CDRH3, где:
(1) указанный домен CDRHI включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;
(2) указанный домен CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; и
(3) указанный домен CDRH3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
Ев2. В7-НЗ-связывающая молекула Ев1, которая включает указанный домен VL, который включает домен CDRLI, домен CDRL2 И домен CDRL3 И указанный домен VH, который включает домен CDRHI, домен CDRH2 И домен CDRH3, где:
(1) указанный домен CDRLI включает аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 23;
(2) указанный домен CDRL2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и
(3) указанный домен CDRL3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
ЕвЗ. В7-НЗ-связывающая молекула Ев1, которая включает указанный домен VL, который включает домен CDRLI, домен CDRL2 И домен CDRL3 И указанный домен VH, который включает домен CDRHI, домен CDRH2 И домен CDRH3, причем указанные домены выбраны из группы, состоящей из:
(1) домен CDRHI, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;
(2) домен CDRH2, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;
(3) домен CDRH3, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29;
(4) домен CDRLI, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23;
(5) домен CDRL2, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и
(6) домен CDRL3, включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. Ев4. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-ЕвЗ, где указанный домен VH
включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 31.
Ев5. B7-H3-связывающая молекула любого из Ев1-Ев4, где указанный домен VL
включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 30.
Евб. B7-H3-связывающая молекула, которая включает домен VL и домен VH, где указанный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
Ев7. В7-НЗ-связывающая молекула, которая включает домен VL и домен VH, где указанный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
Ев8. В7-НЗ-связывающая молекула, которая включает домен VL и домен VH, где указанный домен VL содержит аминокислоту SEQ ID NO: 20 и указанный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
Ев9. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-Ев8, где указанная молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
ЕвЮ. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-Ев8, где указанная молекула представляет собой:
(a) биспецифическое антитело; или
(b) диатело, причем указанный диатело представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит две, три, четыре или пять полипептидных цепей; или
(c) трехвалентную связывающую молекулу, причем трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит три, четыре, пять или более полипептидных цепей.
Ев11. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-Ев10, где указанная молекула включает домен Fc.
Ев12. В7-НЗ-связывающая молекула ЕвЮ, где указанная молекула является диателом и включает домен, связывающий альбумин (ABD).
Ев13. В7-НЗ-связывающая молекула Ев11, где указанный домен Fc является вариантным доменом Fc, который включает:
(a) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc для FcyR; и/или
(b) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые увеличивают период полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc.
Ев14. В7-НЗ-связывающая молекула Ев13, где указанные модификации, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc для FcyR, включают замещение L234A; L235A; или L234A и L235A, где указанная нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
Ев15. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев 13 или Ев 14, где указанные модификации, которые улучшают период полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc, включают замещение M252Y; M252Y и S254T; M252Y и Т256Е; M252Y, S254T
и Т256Е; или K288D и Н435К, где указанная нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
Ев16. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-Ев15, где указанная молекула является биспецифической и содержит два эпитопсвязывающих сайта, способных к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом В7-НЗ и два эпитопсвязывающих сайта, способных иммуноспецифически связываться с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки.
Ев17. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-Ев15, где указанная молекула является биспецифической и содержит один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом В7-НЗ и один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки.
Ев18. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1- Ев15, где указанная молекула является триспецифичной и включает:
(a) один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом В7-НЗ;
(b) один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом первой молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки;и
(c) один эпитопсвязывающий сайт, способный к иммуноспецифическому связыванию с эпитопом второй молекулы, присутствующей на поверхности эффекторной клетки.
Ев19. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев1-Ев8, где указанная молекула способна одновременно связываться с В7-НЗ и молекулой, присутствующей на поверхности эффекторной клетки.
Ев20. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев16-Ев18, где указанная молекула, присутствующая на поверхности эффекторной клетки, представляет собой CD2, CD3, CD8, TCR или NKG2D.
Ев21. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Е16-Ев20, где эффекторная клетка представляет собой цитотоксическую Т-клетку или клетку естественный киллер (NK).
Ев22. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев16-Ев21, где указанная молекула, присутствующая на поверхности эффекторной клетки, представляет собой CD3.
Ев23. В7-НЗ-связывающая молекула Ев 18, где указанная первая молекула, присутствующая на поверхности эффекторной клетки, представляет собой CD3, а указанная вторая молекула, присутствующая на поверхности эффекторной клетки,
представляет собой CD8.
Ев24. В7-НЗ-связывающая молекула любого из Ев16-Ев23, где указанная молекула опосредует координированное связывание клетки, экспрессирующей В7-НЗ и цитотоксическую Т-клетку.
Ев25. Фармацевтическая композиция, которая включает эффективное количество В7-НЗ-связывающей молекулы любого из Ев1-Ев24 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
Ев26. Применение В7-НЗ-связывающей молекулы любого из Ев1-Ев24 или фармацевтической композиции Ев26 при лечении заболевания или состояния, связанного с экспрессией В7-НЗ или характеризующегося экспрессией В7-НЗ.
Ев27. Применение Ев26, где указанное заболевание или состояние, связанное с экспрессией В7-НЗ или характеризующееся экспрессией В7-НЗ, представляет собой рак.
Ев28. Применение Ев27, где указанный рак характеризуется наличием раковой
клетки, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечников, СПИД-
ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли,
рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга,
метастатической опухоли головного мозга, В-клеточной неоплазии, рака молочной
железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы,
хромофобной почечно-клеточной карциномы, язвенной карциномы клетки, рака
ободочной кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной
гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли
Юинга, внескелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного
фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока,
рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, опухоли зародышевых клеток,
рака головы и шеи, глиобластомы, гемобластозов, гепатоцеллюлярной карциномы,
опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза (например, острого
миелоидного лейкоза), липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака
печени, лимфомы, рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC)),
медуллобластомы, меланомы, менингиомы, мезотелиомы фарингеального рака,
множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы,
миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, детского онкологического заболевания, опухоли периферических нервных оболочек, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, увеальной меланомы заднего полюса, почечного
метастатического рака, рабдоидной опухоли, рабдомизаркомы, саркомы, рака кожи, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластомы и рабдомиосаркомы), саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN)), рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
Ев29. Применение Ев27, где указанный рак выбрано из группы, состоящей из рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака желудка, глиобластомы, рака почки, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), острогой лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфомы Беркетта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток зоны мантии, лимфомы из клеток маргинальной зоны, мезотелиомы фарингеального рака, неходжкинской лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, множественной миеломы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, карциномы почек, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластому и рабдомиосаркому), плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN), рака яичек, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
ПРИМЕРЫ
[00347] Теперь, когда изобретение в целом описано, оно станет более понятным при помощи следующих примеров. Следующие примеры иллюстрируют различные способы композиций в диагностических или терапевтических способах изобретения. Примеры предназначены для иллюстрации, но никоим образом не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Получение, гуманизация и определение характеристик анти-В7-НЗ антител [00348] Моноклональные антитела были получены путем иммунизации мышей жизнеспособными человеческими фетальными клетками-предшественниками или опухолевыми инициирующими/раковыми стволоподобными клетками (CSLC), как описано ранее (Loo et al. (2007) "The glycotope-specific RAV12 monoclonal antibody induces oncosis in vitro and has antitumor activity against gastrointestinal adenocarcinoma tumor xenografts in vivo" Mol Cancer Ther; 6: 856-65). Скрининг ШС опухолеспецифическими mAb идентифицировал панель анти-В7-НЗ (CD276) реактивных mAb с сильно
дифференцированным связыванием в опухолевой ткани относительно нормальной ткани. Подмножество анти-В7-НЗ-антител, которые были эффективно интернализованы, идентифицировали с применением анализа интернализации, проведенного в 5-дневном анализе, с применением конъюгированного с сапорином антитела против мышиного Fab при 1: 1 или 10: 1 Fab-ZAP:B соответствии с протоколом производителей (Advanced Targeting Systems). Как показано на Фигуре 7, ряд антител против В7-НЗ, включая анти-В7-НЗ антитела, обозначенные как "mAb-С", и "mAb-D", были эффективно интернализованы.
[00349] Вышеописанные мышиные анти-В7-НЗ mAb: mAb-B, mAb-C и mAb-D используются для образования гуманизированных доменов VL и VH, в которых CDRL И CDRH ИХ доменов слиты с каркасными доменами человека. Гуманизированные домены VH и VL затем используются для получения гуманизированных легких цепей, имеющих константную область легкой цепи каппа (т.е. SEQ ID NO: 1) и домен СН1 из IgGl, шарнирный домен и домен Fc (т.е. SEQ ID NO: 3, 6, 12). Гуманизированные антитела были обозначены как "hmAb-B", "hmAb-С" и "hmAb-D".
[00350] Аминокислотные последовательности гуманизированных доменов VL и VH приведены выше. Следует отметить, что CDR hmAb-B могут быть модифицированы для получения альтернативных гуманизированных доменов VL и VH, как описано выше. Аминокислотная последовательность всех гуманизированных легких и тяжелых цепей hmAb-C и hmAb-D приведена выше.
[00351] Кинетику связывания гуманизированных антител исследовали с применением анализа Biacore, в котором растворимый гибридный белок В7-НЗ (4Ig) человека или яванского макака с меткой His (shB7-H3-His или scB7-H3-His, соответственно) пропускали через иммобилизованные антитела. Вкратце, каждое гуманизированное антитело захватывалось иммобилизованным козьим Fab2 против Fc человека и инкубировалось с shB7-H3-His или scB7-H3-ero (6,25-100 нМ), а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Вычисленные k а, к а и К D из этих исследований с применением апроксимации двухвалентного связывания представлены в Таблице 6. Результаты показывают, что гуманизированные антитела связываются В7-НЗ человека и яванского макака в диапазоне аффинностей.
Таблица 6
Человек
Яванский макак
Антитело
Ка(х104)
Kd(xl0-4)
KD (НМ)
Ка(х104)
Kd(xl0-4)
KD (НМ)
hmAb-B
11,0
0,12
0,11
2,9
hmAb-C
21,3
6,4
48,4
hmAb-D
3,4
62,9
1,35
592,3
[00352] Тканевая перекрестная реактивность гуманизированных антител исследовалась иммуногистохимией (ШС). В Таблице 7 приведены результаты нескольких исследований ШС, выполненных на нормальных тканях человека, тканях опухолей человека, линиях раковых клеток человека и клеточных линиях СНО, экспрессирующих или не экспрессирующих В7-НЗ, с применением гуманизированных антител против В7-НЗ в указанных концентрациях антител. Критерий оценки этих исследований приведен в
с: цитоплазма ш: мембрана epi: эпителий Ти: опухоль кровеносный
сосуд
Таблица 8
Критерии подсчета баллов нормальной ткани:
Критерии подсчета баллов опухоли:
отрицательный
, "ч отсутствие окрашивания (отрицательный):
± неоднозначный
1-100% специфически окрашенных клеток с
л , г "ч интенсивностью окрашивания 1+или 1-20% 1 (слабый): ,
специфически окрашенных клеток с
интенсивностью окрашивания 2+
1+ слабый
2+ умеренный
интенсивность окрашивания 2+ в 21-79%
п , "ч специфически окрашенных клеток или 2 (умеренный): ^ г , "п0/ интенсивность окрашивания 3+в 1-49%
специфически окрашенных клеток
3+ сильный
очень сильный
интенсивность окрашивания 2+ в 80-100%
"ч специфически окрашенных клеток или 3 (сильный): ^ г
интенсивность окрашивания 3+ в > 50%
специфически окрашенных клеток.
[00353] Эти результаты показывают, что все гуманизированные антитела проявляют связывание с многочисленными опухолевыми клетками, положительными по В7-НЗ. hmAb-B проявляет наибольшую реактивность в отношении опухоли в испытуемых условиях, но также проявляет нормальную тканевую реактивность к гепатоцитам печени и надпочечной ткани. hmAb-C проявляет некоторую сниженную реактивность в опухоли по сравнению с hmAb-B, но также проявляет существенно меньшую реактивность с нормальными гепатоцитами печени, а также реакционную способность на менее независимых образцах. hmAb-D обладает общей пониженной реакционной способностью к опухолевым и нормальным тканям. Антитела демонстрируют сопоставимую перекрестную реактивность с тканями яванского макака, хотя hmAb-D связывается с меньшей интенсивностью в этих ШС-исследованиях. Для минимизации целевой
токсичности hmAb-C и hmAb-D могут быть предпочтительными для получения молекул B7-H3-ADC по изобретению. Пример 2
Получение B7-H3-ADC
[00354] Вышеописанные мышиные анти-В7-НЗ mAb: mAb-A, mAb-B, mAb-C и mAb-D использовали для получения химерных антител, в которых домен VL таких антител был объединен с константной областью легкой цепи каппа человека (SEQ ID NO: 1) и в которых домен VH таких антител объединен с СН1-Шарнир-СН2-СНЗ константной областью из IgGl человека (SEQ ID NO: 3, 7 и 12 соответственно). Химеризованные антитела ("chmAb-A", "chmAb-B", "chmAb-С" и "chmAb-D") преобразовывали в В7-НЗ-ADC посредством конъюгации по цистеину в его В7-НЗ-связывающем домене с расщепляемым линкером-полезной нагрузкой ауристатином Е "vc-MMAE" (Concortis Biosystems), как обсуждалось выше.
Пример 3
B7-H3-ADC демонстрируют эффективную активность in vitro
[00355] Для того чтобы продемонстрировать противоопухолевую активность В7-H3-ADC по настоящему изобретению, описанный выше B7-H3-ADC (ММАЕ) инкубировали в концентрациях от 1 до 100000 пМ с экспрессирующими В7-НЗ клетками рака молочной железы ЛМТ-1, клетками рака молочной железы MDA-MB-468, клетками меланомы A3 75.52, клетками немелкоклеточного рака легкого Calu-б, клетками немелкоклеточного рака легкого NCI-H1703, клетками немелкоклеточного рака легкого NCI-H1975, клетками рака яичника РА-1, клетками рака поджелудочной железы Hs700T, клетками рака предстательной железы DU145 или В7-НЗ-отрицательными клетками В-клеточной лимфомы Raji. Цитотоксичность in vitro определяли количественно через 7 дней. Вкратце, B7-H3-ADC и контрольные образцы разводили и помещали в микротитровальные планшеты, 5000 клеток добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 4-7 дней. Реактив аламаровый синий (например, BioRad/ThermoFisher/Invitrogen) добавляли к планшетам и считывали данные в соответствии с протоколом изготовителя. Количество сайтов связывания антител, присутствующих в этих клетках, определяли с помощью набора Bangs QFACS(tm).
[00356] Кривые цитотоксичности из этого исследования представлены на Фигурах 8A-8J. Значения IC50 были определены и приведены в Таблице 9. Результаты этих исследований показывают, что каждое из протестированных интернализованных антител против В7-НЗ проявляло дозозависимую цитотоксичность in vitro против экспрессирующих В7-НЗ опухолевых клеток. Антитела демонстрировали диапазон
активности. Относительная активность в этих анализах составляла: chmAb-C > chmAb-B > chmAb-D > chmAb-A.
Таблица 9
B7-H3-ADC
Клеточная линия
Рак
молочной железы
Меланома
Немелкоклеточный рак легкого
Рак
яичника
Рак
поджелудочной железы
Рак
предстательной железы
лмт-1
MDA-MB-468
А375.52
Calu-
NCI-Н1703
NCI-Н1975
РА-1
Hs700T
DU145
Сайты связывания антител на клетку (х 10 5)
4,2
7,5
8,5
8,1
4,8
6,1
2,4
1С50(
рМ)
chmAb-A B7-H3 ADC
9100
8095
703
995
1517
26976
8326
607
20153
chmAb-B B7-H3 ADC
221
352
153
555
159
3770
chmAb-C B7-H3 ADC
124
201
267
409
109
465
chmAb-D B7-H3 ADC
735
1383
887
171
219
162
1795
303
2587
Пример 4
B7-H3-ADC демонстрирует мощную активность in vivo
[00357] Чтобы дополнительно продемонстрировать противоопухолевую активность B7-H3-ADC по настоящему изобретению, описанные выше молекулы chmAb-B В7-НЗ-ADC, chmAb-C B7-H3-ADC и/или chmAb-D B7-H3-ADC (ММАЕ) оценивали на токсичность in vivo в модели голых мышей CD1 с применением различных линий опухолевых клеток. Короче говоря, ~ 5 х 106 опухолевых клеток (суспендированных 1:1 в среде и MATRIGEL(r)) подкожно имплантировали в бок голых мышей CD1 (Charles River Laboratories). Когда опухоли достигали объема приблизительно 150 мм3, мышей рандомизировали и B7-H3-ADC или контрольный носитель вводили внутрибрюшинно. В этих исследованиях вводили одну дозу B7-H3-ADC или контрольного носителя (qdxl). Опухоли измеряли два раза в неделю путем ортогональных измерений с помощью электронных штангенциркулей, при этом объемы опухолей, рассчитывали как: (длина х ширина х высота)/2. Определяли объем опухоли (относительно контроля) ("Т/С").
Обнаружение того, что объем опухоли обработанных животных уменьшился до < 5 мм3 в
течение периода исследования, считали полным ответом ("CR").
Активность in vivo против опухолевых клеток рака молочной железы MDA-MB-468 [00358] Результаты этого исследования по отношению к опухолевым клеткам рака
молочной железы MDA-MB-468 представлены в Таблице 10 и на Фигуре 9 и показывают
Активность in vivo против опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого NCI-H1703
[00359] Результаты этого исследования относительно подкожно имплантированных опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого NKI-H1703 представлены в Таблице 11 и на Фигурах 10А-10С и показывают респонсивность
Активность in vivo против опухолевых клеток рака яичника РА-1 [00360] Результаты этого исследования относительно подкожно имплантированных опухолевых клеток рака яичника РА-1 представлены в Таблице 12 и
chmAb-C B7-H3-ADC
3/7
Высоко активный
1/7
Активный
0/7
Не активный
chmAb-D B7-H3-ADC
7/7
Высоко активный
1/7
Активный агент
113
0/7
Не активный
Активность in vivo против опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого
Calu-6
[00361] Результаты этого исследования относительно подкожно имплантированных опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого Calu-6 представлены в Таблице 13 и на Фигурах 12А-12С и показывают респонсивность
Активность in vivo против опухолевых клеток меланомы A375.S2 [00362] Результаты этого исследования относительно подкожно имплантированных опухолевых клеток меланомы A375.S2 представлены в Таблице 14 и
[00363] Результаты этих исследований показывают, что каждый из протестированных B7-H3-ADC проявлял значительную дозозависимую противоопухолевую активность in vivo по отношению к В7-НЗ-положительным опухолям в мышиных моделях ксенотрансплантата рака молочной железы, легкого и яичника, а также меланомы.
[00364] Фармако кинетику вышеуказанных молекул B7-H3-ADC (ММАЕ) оценивали у не несущих опухоль голых мышей CD1, путем введения таких молекул внутрибрюшинно в разовой дозе 5 мг/кг. Образцы крови собирали в течение 10 дней, а сэндвич-ELISA проводили на сыворотке для количественного определения общего количества антител и интактных концентраций B7-H3-ADC.
[00365] Репрезентативные результаты этого исследования, в отношении chmAb-B В7-НЗ ADC, chmAb-C В7-НЗ ADC, и chmAb-D B7-H3 ADC, представлены на Фигурах 14А-14С и в Таблице 15 и показывают, что молекулы B7-H3-ADC были очень стабильными, причем период полувыведения составлял приблизительно 2,2-3,6 дня. Период полувыведения конъюгатов был сопоставим с периодом полувыведения неконъюгированных молекул, демонстрируя, что молекулы B7-H3-ADC являются высокостабильными у мышей.
Таблица 15
B7-H3-ADC
Общее анти-В7-НЗ антитело
Интактный B7-H3-ADC*
Tl/2
(часы)
AUC (ч * нг/мл)
Tl/2
(часы)
AUC (ч * нг/мл)
chmAb-B В7-НЗ ADC
114,1
4796235
58,9
4032575
chmAb-C В7-НЗ ADC
75,9
2698831
52,6
2201893
chmAb-D B7-H3 ADC
177,2
5162024
87,3
3502158
* Конъюгат ММАЕ Пример 5
B7-H3-ADC с расщепляемым линкером - дуокармициновым компонентом [00366] Сконструировали B7-H3-ADC ("hmAb-C B7-H3-ADC"), имеющий типичный дуокармициновый компонент (DUBA), связанный с аминокислотным остатком части АЬ через расщепляемый линкер, конъюгированный с антителом, посредством восстановленных межцепочечных дисульфидов, как описано выше (см. Схемы 9A-9I) и Elgersma, RC et al. (2014) "Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985" Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835 (см., также WO 02/083180; WO 2010/062171; WO 2011/133039;
WO 2015/104359; and WO 2015/185142). Среднее соотношение лекарственное средство/антитело (DAR) составляет около 2-4, обычно около 2,7. Понятно, что точный DAR может варьировать для каждого препарата. Порядок стадий синтеза может изменяться по желанию. Предпочтительно, чтобы используемый способ был описан на Схемах 9A-9I, как описано выше, и линкер-DUBA конъюгирован с антителом через восстановленные межцепочечные дисульфиды. Пример 6
B7-H3-ADC с расщепляемым линкером-дуокармицином сохраняет биологическую активность
[00367] Вышеописанный hmAb-C B7-H3-ADC (имеющий типичный дуокармициновый компонент (DUBA), связанный с аминокислотным остатком части АЬ через расщепляемый линкер) ("hmAb-C-DUBA"), инкубировали с клетками в течение 7 дней и определяли жизнеспособность, используя анализ с аламаровым синим, как описано выше. Как показано на Фигурах 15А-15С, конструкция hmAb-C-DUBA сохранила биологическую активность, о чем свидетельствует ее цитотоксическая активность на опухолевых клетках, положительных по В7-НЗ. Аналогичные результаты наблюдались для вышеописанного chmAb-C, связанного с дуокармицином ("chmAb-C-DUBA").
[00368] В этом исследовании и дополнительных исследованиях, описанных ниже, молекула, которая связывает несвязанный антиген (CD20), конъюгированный с DUBA ("Ctrl-DUBA"), использовалась в качестве связывающего контрольного ADC для учета неспецифической активности in vivo из-за специфической для грызунов карбоксиэстеразы CESlc, присутствующей в плазме грызунов.
Пример 7
B7-H3-ADC демонстрирует мощную противоопухолевую активность in vivo [00369] Было проведено многодозовое исследование для оценки эффективности молекулы in vivo. Calu-6, клетки немелкоклеточной карциномы легкого, подкожно имплантировали в группы мышей (п = 5), по существу, как описано выше, которые затем получали дозы hmAb-C-DUBA (1 мг/кг х 3, 3 мг/кг х 3 или 6 мг/кг х 3) в день 24, 31, 38 и 45 (показанные стрелками) после инокуляции, и животных оценивали по объему опухоли (по существу, как описано выше) вплоть до 62 дня. Как показано на Фигуре 16, все три проверенные дозы hmAb-C-DUBA оказались эффективными в снижении или устранении объема опухоли. Calu-б продемонстрировали балл ШС 2+, а сайты связывания антител на клетку (ABC) представлены в Таблице 9.
[00370] Во втором исследовании in vivo (выполняемом, по существу, как описано выше), клетки немелкоклеточной карциномы легкого Calu-б были подкожно
имплантированы в группы мышей (п = 7), которые затем получали разовую дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (3 мг/кг или 10 мг/кг) на 20-й день (показано стрелкой). В Таблице 16 и 17 приведены результаты и показано, что введение hmAb-C-DUBA значительно
[00371] В третьем исследовании in vivo (выполняемом, по существу, как описано выше) клетки карциномы яичника РА-1 подкожно имплантировали в группы мышей (п = 6), которые затем получали разовую дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (1 мг/кг, 6 мг/кг или 10 мг/кг) в день 25 (показано стрелкой). В Таблице 17 и на Фигуре 18 приведены результаты и показано, что введение hmAb-C-DUBA значительно уменьшало объем
[00372] Мощная in vivo активность наблюдаются также против клеток меланомы A375.S2. Такие клетки подкожно имплантировали в группы мышей (п = 7) (по существу, как описано выше), которые затем получали разовую дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (1 мг/кг или 3 мг/кг) в день 25 (показано стрелкой). В Таблице 18 и на Фигуре 19 приведены результаты и показано, что введение hmAb-C-DUBA значительно уменьшало объем опухоли и приводило к полной ремиссии у 5/7 обработанных животных при более
hmAb-C-DUBA
1/7
Ctrl-DUBA
0/7
Ctrl-DUBA
1/7
[00373] Мощная in vivo активность наблюдались против клеток карциномы молочной железы MDA-MB468. Такие клетки были имплантированы в жировое тело молочной железы групп мышей (п = 5) (по существу, как описано выше), которые затем получали либо разовую дозу hmAb-C-DUBA, либо Ctrl-DUBA (3 мг/кг или 6 мг/кг) в день 70 или три дозы hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (3 мг/кг (показано стрелками). Животных оценивали по объему опухоли (по существу, как описано выше) на срок до 110 дней. Клетки MDA-MB468 демонстрировали балл ШС 2+, и ABC представлен в Таблице 9. Результаты представлены в Таблице 19 и на Фигурах 20A-20D. На Фигуре 20А показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 6 мг/кг (разовая доза). На Фигуре 20В показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 3 мг/кг (разовая доза). На Фигуре 20С показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 3 мг/кг (три дозы). На Фигуре 20D показаны все результаты на одном графике. Данные показывают, что предоставление hmAb-C-DUBA значительно уменьшало объем опухоли и достигало полной ремиссии у 4/5 обработанных животных при более высокой дозе, и что предоставление повторных доз значительно улучшало исход обработки.
Таблица 19
Обработка
Доза - QW
Объем опухоли
Полная ремиссия
(мг/кг)
обработка/контроль %
hmAb-C-DUBA
4/5
hmAb-C-DUBA
1/5
hmAb-C-DUBA
3x3 дозы
3/5
Ctrl-DUBA
0/5
Ctrl-DUBA
0/5
Ctrl-DUBA
3x3 дозы
0/5
[00374] В дальнейшем исследовании ксенотрансплантаты клеток карциномы яичника РА-1 (~ 5 х ю6, суспендированных 1: 1 в среде и MATRIGEL(r)) подкожно вводили в группы мышей, которые затем получали дозу hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA (однократная доза 3 мг/кг, 6 мг/кг или 10 мг/кг) на 24 день после инокуляции или две дозы 10 мг/кг hmAb-C-DUBA (на 24 и 24 днях 28 после инокуляции) или четыре дозы 6 мг/кг hmAb-C-DUBA (в дни 24, 28, 31 и 35 после инокуляции). Животных оценивали по объему опухоли вплоть до 70 дней (по существу, как описано выше). Клетки РА-1 показали балл ШС 2+, и ABC представлен в Таблице 9. Фигуры 21A-21D обобщают результаты. На Фигуре 21А показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA при 10
мг/кг (разовая или двойная доза). На Фигуре 21В показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA при 6 мг/кг (однократная или четырехкратная доза). На Фигуре 21С показаны результаты для носителя, hmAb-C-DUBA или Ctrl-DUBA по 3 мг/кг (разовые дозы). На Фигуре 21D показаны все результаты на одном графике. Данные показывают, что предоставление hmAb-C-DUBA значительно уменьшало объем опухоли у обработанных животных. Пример 8
Фармако кинетика B7-H3-ADC
[00375] Фармакокинетику вышеописанного chmAb-C-DUBA исследовали, используя логарифмический/линейный график общих IgG или кривой интактного ADC у мышей (п = 3), каждая из которых получала одну внутривенную дозу chmAb-C-DUBA (5 мг/кг). Результаты представлены на Фигуре 22.
[00376] Фармакокинетику hmAb-C-DUBA исследовали, используя логарифмический/линейный график общих IgG или кривой интактного ADC у яванского макака, каждый из которых получал одну внутривенную дозу hmAb-C-DUBA (1 мг/кг (1 самец, 1 самка), 3 мг/кг (1 самец, 1 самка), 10 мг/кг (1 самец, 1 самка) или 27 мг/кг (2 самца, 2 самки)). Результаты показаны на Фигуре 23А (общие IgG) и Фигуре 23В (интактный ADC).
[00377] В этих исследованиях общий IgG определяли с помощью ELISA. Вкратце, образцы, стандарты и контрольные образцы сыворотки были зафиксированы на микротитровальных планшетах, покрытых козьим антителом против IgG человека (Н + L). После промывки планшеты инкубировали с козьим антителом против Fc из IgG человека, конъюгированным с пероксидазой. После промывки давали развиться в планшетах окраске с субстратом 3, 3, 5, 5'-тетраметилбензидином (ТМВ), реакцию останавливали фосфорной кислотой и планшеты считывали при 405 нм. Общий IgG в тестовых образцах рассчитывали по стандартной кривой. Интактный ADC также определяли с помощью ELISA. Вкратце, мышиное mAb против дуокармицина иммобилизовали на планшетах для микротитрования. После промывки планшеты инкубировали с козьим антителом против Fc из IgG человека, конъюгированным с пероксидазой. После промывки давали развиться в планшетах окраске с субстратом с 3, 3, 5, 5'-тетраметилбензидином (ТМВ), реакция останавливали фосфорной кислотой и планшеты считывали при 405 нм. Интактный ADC в тестовых образцах рассчитывали по стандартной кривой.
[00378] Фармакокинетические параметры для дозы 5 мг/кг для мыши и доз 3 мг/кг и 10 мг/кг для яванского макака были получены путем сравнения таких данных и суммирования в Таблице 20 (где AUC Last обозначает область под кривой от начала до
конца наблюдения). Воздействие на мышь интактного ADC ограничено из-за карбоксиэстеразы CESlc, специфичной для грызунов. Эти данные указывают на большой терапевтический индекс в преклинических условиях.
Таблица 20
Вид
доза (мг/кг)
Tl/2
(ч)
Cmax
(нг/мл)
AUC Last (ч * мкг/мл)
мышь
50(ii)
яванский
62,7
113484
3798
макак
яванский
57.3
330983
17978
макак
Пример 9
Определение характеристик анти-В7-НЗ диател
[00379] Биспецифические двухцепочечные и трехцепочечные диатела В7-НЗ х CD3 оценивали для того, чтобы определить их способность опосредовать перенацеленное уничтожение клеток и/или выделение цитокинов из клеток-мишеней, экспрессирующих на поверхности В7-НЗ клеток. Перенацеленное уничтожение клеток исследовали с применением анализа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Вкратце, биспецифические антитела В7-НЗ х CD3 (или отрицательное контрольное диатело, которое связывает нерелевантный антиген вместо В7-НЗ), инкубировали в течение 24 часов с эффекторными пан Т-клетками и целевыми В7-НЗ-экспрессирующими опухолевыми клетками при соотношении эффектор:клетка-мишень 10:1. Процентная цитотоксичность (т.е. гибель клеток) определялась путем измерения высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в среду поврежденными клетками. Высвобождение цитокинов исследовали с применением аналогичного формата. Вкратце, биспецифические антитела В7-НЗ х CD3 (или отрицательные контрольные диатела, лишенные В7-НЗ-связывающего сайта), инкубиовали в течение 24 часов с эффекторными клетками РВМС отдельно или в присутствии целевых опухолевых клеток (например, клеток карциномы легкого SK-MES-1) при соотношении эффектор:мишень 10: 1 или 30: 1 и определяли выделение цитокинов IFNy, TNF- и IL-10. Анализ показывает способность биспецифических диател В7-НЗ х CD3 опосредовать перенацеленное уничтожение клеток и высвобождение цитокинов.
[00380] Все публикации и патенты, упомянутые в этом описании, включены в данный документ ссылкой в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки в полном объеме. Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными
воплощениями, следует понимать, что оно способно к дальнейшим модификациям, и эта заявка предназначена для охвата любых изменений, применений или адаптаций по изобретению, следуя, в общем, принципам изобретения и включая такие отклонения от настоящего раскрытия, которые входят в известную или обычную практику в области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, изложенным выше.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> MacroGenics, Inc. Loo, Deryk Huang, Ling Johnson, Leslie S. Son, Thomas Scribner, Juniper Bonvini, Ezio
<120> Новые B7-H3 связывающие молекулы, их конъюгаты антитело-лекарственное средство и способы их применения
<130> 1301.0143-0144PCT
<150> US 62/432,314 <151> 2016-12-09
<150> US 62/323,249
<151> 2016-04-15
<150> US 62/323,228
<151> 2016-04-15 <160> 106
<170> версия PatentIn 3.5
<210> 1 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> Домен CL каппа из IgG человека
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(104)
<223> Домен CL лямбда из IgG человека
<400> 2
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> Домен CH1 из IgG1 человека
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 4 <211> 98 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> Домен CH1 из IgG2 человека
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> Домен CH1 из IgG3 человека
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 6 <211> 98 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> Домен CH1 из IgG4 человека
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> Шарнирный домен из IgG1 человека
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> Шарнирный домен из IgG2 человека
<400> 8
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 62
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(62)
<223> Шарнирный домен из IgG3 человека
<400>
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> Шарнирный домен из IgG4 человека
<400> 10
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> S228P-стабилизированный Шарнирный домен из IgG4 человека
<400> 11
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> Домен CH2-CH3 из IgG1 человека
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 12
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 13
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(216)
<223> Домен CH2-CH3 из IgG2 человека
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (216)..(216)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 13
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 14
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> Домен CH2-CH3 из IgG3 человека
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 14
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 15
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> Домен CH2-CH3 из IgG4 человека
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 15
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 16 <211> 534 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(534)
<223> 4Ig форма B7-H3 человека
<400> 16
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450 455 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465 470 475 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485 490 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500 505 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515 520 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala 530
<210> 17 <211> 316
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(316)
<223> 2Ig форма B7-H3 человека
<400> 17
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Met Thr Phe Pro Pro Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser
245 250 255
Val Cys Leu Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg
260 265 270
Lys Ile Lys Gln Ser Cys Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln
275 280 285
Asp Gly Glu Gly Glu Gly Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His
290 295 300
Ser Asp Ser Lys Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ile Ala
305 310 315
<210> 18 <211> 108 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(108)
<223> Домен VL мышиного анти-B7-H3 антитела "mAb-C"
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> Домен VH мышиного анти-B7-H3 антитела "mAb-C"
<400>
Glu Val Gln Gln Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен VL гуманизированного анти-B7-H3 антитела "hmAb-C"
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен VH гуманизированного анти-B7-H3 антитела "hmAb-C"
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> Домен VL мышиного анти-B7-H3 антитела "mAb-D"
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly His Ser Pro Glu Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR1 легкой цепи антитела mAb-D
<400> 23
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR2 легкой цепи антитела mAb-D
<400> 24
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR3 легкой цепи антитела mAb-D
<400> 25
Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr 1 5
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(119)
<223> Домен VL мышиного анти-B7-H3 антитела "mAb-D"
<400> 26
Asp Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Tyr Arg Tyr Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5)
<223> CDR1 тяжелой цепи антитела mAb-D <400> 27
Ser Phe Gly Met His 1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR2 тяжелой цепи антитела mAb-D
<400> 28
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> CDR3 тяжелой цепи антитела mAb-D
<400> 29
His Gly Tyr Arg Tyr Glu Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен VL гуманизированного Анти-B7-H3 антитела "hmAb-D"
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен VH гуманизированного Анти-B7-H3 антитела "hmAb-D"
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Tyr Arg Tyr Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер (Линкер 1)
<400> 32
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
<210> <211>
33 6
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Цистеин-содержащий спейсерный пептид (Линкер 2)
<400> 33
Gly Gly Cys Gly Gly Gly
1 5
<210> <211>
34 4
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный спейсерный линкер ( Альтернативный линкер 2)
<400> 34
Gly Gly Gly Ser 1
<210> <211>
35 6
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный спейсерный линкер ( Альтернативный линкер 2)
<400> 35
Leu Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> <211>
36 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный спейсерный линкер ( Альтернативный линкер 2)
<400> 36
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> <211>
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный спейсерный линкер ( Альтернативный линкер 2)
<400> 37
Ala Ser Thr Lys Gly 1 5
<210> <211>
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный спейсерный линкер ( Альтернативный линкер 2)
<400> 38
Leu Glu Pro Lys Ser Ser 1 5
<210> <211>
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный спейсерный линкер ( Альтернативный линкер 2)
<400> 39
Ala Pro Ser Ser Ser 1 5
<210> <211>
40 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации
<400> 40
Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации
<400> 41
Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации
<400> 42
Ala Glu Pro Lys Ser Cys 1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации
<400> 43
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации
<400>
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5
<210> 45
<211> 28
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации с E-спиралью
<400> 45
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25
<210> 46
<211> 28
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен, способствующий гетеродимеризации с К-спиралью
<400> 46
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 47
<211> 28
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Цистеин-содержащий домен, способствующий гетеродимеризации с E-спиралью
<400> 47
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25
<210> 48
<211> 28
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<223> Цистеин-содержащий домен, способствующий гетеродимеризации с К-спиралью
<400> 48
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 49
<211> 46
<212> PRT
<213> Streptococcus agalactiae
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(46)
<223> Альбумин-связывающий домен 3 (ABD3) протеина G из штамма Streptococcus
G148
<400> 49
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 50
<211> 46
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Деиммунизованный вариант альбумин-связывающего домена 3 (ABD3) протеина G из штамма Streptococcus G148
<400> 50
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 51
<211> <212> <213>
46 PRT
искусственная последовательность
<220>
<223> Деиммунизованный вариант альбумин-связывающего домена 3 (ABD3) протеина G из штамма Streptococcus G148
<400> 51
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 52
<211> 46
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Деиммунизованный вариант альбумин-связывающего домена 3 (ABD3) протеина G из штамма Streptococcus G148
<400> 52
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 53
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu 1 5
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 54
Val Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
<210> <211>
55 15
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 55
Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
<210> <211>
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 56
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> <211>
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 57
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> <211>
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 58
Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Полипептидный линкер
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 217
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> L234A/L235A Human IgG1 CH2 and CH3 Domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 60
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 61
<211> 217
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> несущий выступ" вариант домена CH2 и CH3 из IgG1 человека
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 61
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100
105
110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 62
<211> 217
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> "Hole-Bearing" Variant of Human IgG1 CH2 and CH3 Domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 62
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 100
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 130 135
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150
Tyr Lys
Val Ser
Phe Ser
Lys Ser
210
<210> <211> <212> <213>
<220> <221> <222> <223>
<400> 63
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
1 5
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg 35 40
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 105 110
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 125
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro 140
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 155 160
Pro Glu Leu Gln Arg Pro Gly Ala 10 15
Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Glu Tyr 25 30
Pro Lys Gln Gly Leu Glu Leu Val 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Ser Ile Asp Tyr Val Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Phe Asn Tyr Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD2 человека Lo-CD2a
<400> 64
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Leu Ala Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Thr Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Pro Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Phe
85 90 95
Thr His Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> <211> <212>
125
PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD3 человека CD3 mAb-1 VH(1)
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 66
<211> 125
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD3 человека CD3 mAb-1 VH(2)
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 67
<211> 110
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD3 человека CD3 mAb-1
<400> 67
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 68
<211> 125
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD3 человека CD3 mAb-1 (D65G)
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 69
<211> 125
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD3 человека CD3 mAb-1 Low
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Thr Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 70
<211> 125
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD3 человека CD3 mAb-1 Fast
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Lys Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Thr Trp Phe
100
105
110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 71 <211> 119 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(119)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD3 человека OKT3
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD3 человека OKT3
<400>
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg 100 105
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD8 человека OKT8
<400> 73
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Phe Arg Tyr Thr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD8 человека OKT8
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 75
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD8 человека TRX2
<400>
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 76
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD8 человека TRX2
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 77 <211> 118 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD16 человека 3G8
<400> 77
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 78
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD16 человека 3G8
<400> 78
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 79
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> Домен VH из мышиного антитела против CD16 человека A9
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Ala Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
Ala Arg Ser Ala Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Arg Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 80
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> Домен VL из мышиного антитела против CD16 человека A9
<400> 80
Asp Ile Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Asn Thr Gly Thr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe
35 40 45
Thr Gly Leu Ile Gly His Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr
65 70 75 80
Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr
85 90 95
Asn Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 81
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Домен VH из мышиного антитела против Т-клеточного рецептора человека BMA
031
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> Домен VL из мышиного антитела против Т-клеточного рецептора человека BMA
031
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 83
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> Домен VH из мышиного антитела против NKG2D-рецептора человека KYK-1.0
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Lys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Phe Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 84
<211> 108
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108)
<223> Домен VL из мышиного антитела против NKG2D-рецептора человека KYK-1.0 <400> 84
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Pro Cys Gly Gly Asp Asp Ile Glu Thr Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Phe Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Ser Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asp Asn Asn Asp Glu
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 85
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> Домен VH из мышиного антитела против NKG2D-рецептора человека KYK-2.0
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 86
<211> 110
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Домен VL из мышиного антитела против NKG2D-рецептора человека KYK-2.0
<400> 86
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 87
<211> 275
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Первая полипептидная цепь DART-D1
<400>
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
115 120 125
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
130 135 140
Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
180 185 190
Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr
210 215 220
Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
245 250 255
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
260 265 270
Leu Glu Lys
275
<210> 88
<211> 269
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Вторая полипептидная цепь DART-D1
<400> 88
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asn Thr
165 170 175
Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265
<210> 89
<211> 273
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Первая полипептидная цепь DART-D2
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys
<210> 90
<211> 270
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Вторая полипептидная цепь DART-D2
<400> 90
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Tyr Arg Tyr Glu Gly Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 91
<211> 503
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Первая полипептидная цепь "DART-D3"
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (503)..(503)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
500
<210> 92
<211> 270
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Вторая полипептидная цепь "DART-D3"
<400> 92
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Tyr Arg Tyr Glu Gly Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 93
<211> 227
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Третья полипептидная цепь "DART-D3"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (227)..(227)
<223> X является лизином или отсутсвует
<400> 93
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Xaa 225
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Субстрат-тетрапептид транслутаминазы Streptoverticillium mobaraense
<400> 94
Leu Leu Gln Leu
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> Домен VL мышиного антитела против B7-H3 "mAb-A"
<400> 95
Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 96
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(122)
<223> Домен VH мышиного антитела против B7-H3 "mAb-A"
<400> 96
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> Домен VL мышиного антитела против B7-H3 "mAb-B"
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asp Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 98
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Домен VH мышиного антитела против B7-H3 "mAb-B"
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен VL гуманизированного антитела против B7-H3 "hmAb-B"
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 легкой цепи гуманизированного антитела против B7-H3 "hmAb-B"
<400> 100
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Альтернативный CDR1 легкой цепи гуманизированного антитела против B7-H3
"hmAb-B"
<400> 101
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 легкой цепи гуманизированного антитела против B7-H3 "hmAb-B"
<400> 102
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Альтернативный CDR2 легкой цепи гуманизированного антитела против B7-H3
"hmAb-B"
<400> 103
Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser 1 5
<210> <211> <212>
104 120 PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Домен VH гуманизированного антитела против B7-H3 "hmAb-B"
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи гуманизированного антитела против B7-H3 "hmAb-B"
<400> 105
Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 106 <211> 17 <212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Альтернативный CDR2 тяжелой цепи гуманизированного антитела против B7-H3 "hmAb-B"
<400> 106
Thr Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Конъюгат анти-В7-НЗ антитела и лекарственного средства (B7-H3-ADC),
который имеет формулу:
Ab-(LM)m-(D)", где:
АЬ представляет собой антитело, которое связывается с В7-НЗ, которое включает гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и гуманизированный вариабельный домен легкой цепи (VL) или является его В7-НЗ-связывающим фрагментом, и;
D представляет собой цитотоксический лекарственный компонент; LM представляет собой связь или линкерную молекулу, которая ковалентно связывает АЬ и D;
m представляет собой целое число от 0 до п и обозначает количество линкерных молекул в B7-H3-ADC; и
п представляет собой целое число от 1 до 10 и обозначает количество цитотоксических лекарственных компонентов, ковалентно связанных с молекулой В7-НЗ-ADC.
2. B7-H3-ADC по п. 1, отличающийся тем, что:
(A) (i) указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99 и
(ii) указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; или
(B) (i) указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 и
(ii) указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; или
(C) (i) указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 и
(ii) указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
3. B7-H3-ADC по п. 1, отличающийся тем, что указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, и указанный
3.
гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104.
4. B7-H3-ADC по п. 1, отличающийся тем, что указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
5. B7-H3-ADC по п. 1, отличающийся тем, что указанный гуманизированный домен VL включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и указанный гуманизированный домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
6. B7-H3-ADC по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что АЬ представляет собой антитело.
7. B7-H3-ADC по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что АЬ представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела.
8. B7-H3-ADC по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что B7-H3-ADC включает домен Fc из IgG человека.
9. B7-H3-ADC по п. 8, отличающийся тем, что IgG человека представляет собой IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
10. B7-H3-ADC по п. 8 или 9, отличающееся тем, что домен Fc представляет собой
вариантный домен Fc, который включает:
(a) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc для FcyR; и/или
(b) одну или несколько аминокислотных модификаций, которые увеличивают период полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc.
11. B7-H3-ADC по п. 10, отличающийся тем, что модификации, которые уменьшают аффинность вариантного домена Fc для FcyR включают замену L234A; L235A; или L234A и L235A, где указанная нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
12. B7-H3-ADC по п. 10 или 11, отличающемуся тем, что модификациям, которые, что увеличивает время полувыведения в сыворотке вариантного домена Fc включает замену M252Y; M252Y и S254T; M252Y и Т256Е; M252Y, S254T и Т256Е; или K288D и Н435К, где указанная нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat.
13. B7-H3-ADC по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один из указанных LM представляет собой линкерную молекулу.
14. B7-H3-ADC по п. 13, отличающийся тем, что линкерная молекула LM
11.
представляет собой пептидный линкер.
15. B7-H3-ADC по п. 13, отличающийся тем, что линкерная молекула LM является расщепляемым линкером.
16. B7-H3-ADC по п. 15, отличающийся тем, что указанная молекула включает формулу:
АЬ - [V-(W)k-(X)i-A] - D где:
V является указанной расщепляемой линкерной молекулой LM,
(W)k-(X)i-A является удлиненной, самоэлиминирующейся спейсерной системой, которая самоэлиминируется посредством а 1,(4+2п)- -элиминации,
W и X представляют собой каждый спейсер каскада электронов, а 1,(4+2п), являющиеся одинаковыми или различными,
А представляет собой либо спейсерную группу формулы (Y)m, где Y представляет собой а 1,(4+2п) спейсер каскада электронов, или группу формулы U, являющуюся спейсером циклизации-элиминации,
k, 1 и m независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно),
п представляет собой целое число от 0 (включительно) до 10 (включительно), при условии, что:
когда А равно (Y)m: ток + 1 + ш> 1,и если к + 1 + m = 1, то n> 1; когда А равно U: тогда k+1 > 1.
или формулу:
W, X и Y независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
где: Q представляет собой -R5C=CR6-, S, О, NR5, -R5C=N- или -N=CR5-г представляет собой NR7, О или а
а, Ь и с независимо представляют собой целое число от 0 (включительно) до 5 (включительно);
I, F и G независимо выбраны из соединений, имеющих формулу:
или \==^" или
где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 и R9 независимо представляют собой H, Ci-б алкил, Сз-2о гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный амино (NRXH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2, БОгМе, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2) х, Rx1 и Rx2 независимо выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20 гетероциклильной группы или С5-20 арильной группы, два или более заместителей R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 или R9 необязательно связаны друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур;
U выбран из соединений, имеющих формулу:
-V R' R' к' _ Н.! К"'
N-iO-(C*-.*-4- < ИЛИ N 4N / ИЛИ
Г* 111* \ I 1 ^
:1 R1 R' Ч' R:
R К; KJ
или
- Ч •-U-- N к К
Н' ' н1 R R'"
где:
a, b и с независимо выбраны как число 0 или 1; при условии, что а + b + с = 2 или 3;
R1 и/или R2 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, причем указанный алкил необязательно замещен одной или несколькими из следующих групп: гидрокси (ОН), простой эфир (OR х), амино (NH2), монозамещенный амино (NRXH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (N02), галоген, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (СРХ), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)2ORx), сульфонил (S(=0)2Rx), сульфокси (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфонокси (ОП (= О) (ОН) 2) и фосфат (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильной группы, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 арильную группу; и
R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляют собой Н, Ci-б алкил, С3-20 гетероциклил, С5-20 арил, Ci-б алкокси, гидрокси (ОН), амино (NH2), монозамещенный
амино (NRXH), дизамещенный амино (NRx1 Rx2), нитро (NO2), галоген, CF3, CN, CONH2, БОгМе, CONHMe, циклический С 1-5 алкиламино, имидазолил, Ci-б алкилпиперазинил, морфолино, тиол (SH), тиоэфир (SRX), тетразол, карбокси (СООН), карбоксилат (COORx), сульфокси (S(=0)20H), сульфонат (S(=0)20RX), сульфонил (S(=0)2RX), сульфиксид (S(=0)OH), сульфинат (S(=0)ORx), сульфинил (S(=0)Rx), фосфоноокси (ОР(=0)(ОН)2) и фосфата (OP(=0)(ORx)2), где Rx, Rx1 и Rx2 выбраны из Ci-б алкильную группу, С3-20 гетероциклильную группу или С5-20 ар ильную группу и два или более заместителей R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, или R8 необязательно связаны друг с другом с образованием одной или нескольких алифатических или ароматических циклических структур.
17. B7-H3-ADC по п. 16, отличающийся тем, что линкерная молекула LM включает:
(1) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
(2) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-
аминобензилоксикарбонил;
(3) п-аммоциннамилоксикарбонил;
(4) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил;
(5) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
(6) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил;
(7) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
(8) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-арниноциннамилоксикарбонил;
(9) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонилпаминобензилоксикарбонил;
(10) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-
аминофенилпентадиенилоксикарбонил;
(11) п-аминобензилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(12) п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(13) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил
(метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(14) п-аминоиндинамикоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(15) п-аминобензилоксикарбонил-п-арниноциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) -карбонил;
(16) п-аминоциннамилоксикарбонил-п-аминоциннамилоксикарбонил (метиламино)этил(метиламино) карбонил;
(17) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
(18) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензилоксикарбонил-п-аминобензил;
(17)
(19) п-аминоциннамил;
(20) п-аминоциннанилоксикарбонил-п-аминобензил;
(21) п-аминобензилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(22) п-амино-циннамилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(23) п-аминофенилпентадиенил;
(24) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминоциннамил;
(25) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминобензил; или
(26) п-аминофенилпентадиенилоксикарбонил-п-аминофенилпентадиенил.
18. B7-H3-ADC по любому из предыдущих пп. 13-17, отличающееся тем, что линкерная молекула LM конъюгирована с боковой цепью аминокислоты в полипептидной цепи АЬ и связывает указанное АЬ с молекулой указанного цитотоксического лекарственного компонента D.
19. B7-H3-ADC по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин, радиоизотоп, иммуномодулятор, цитокин, лимфокин, хемокин, фактор роста, фактор некроза опухоли, А гормон, антагонист гормона, фермент, олигонуклеотид, ДНК, РНК, миРНК,
РНКи, микроРНК, фотоактивный терапевтический агент, антиангиогенный агент, проапоптотический агент, пептид, липид, углевод, хелатирующий агент или их комбинации.
20. B7-H3-ADC по п. 19, отличающийся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин и выбран из группы, состоящей из тубулизина, ауристатина, мейтанзиноида, калихеамицина, пирролобензодиазепина и дуокармицина.
21. B7-H3-ADC по п. 19, отличающийся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин тубулизин и выбран из группы, состоящей из тубулизина А, тубулизина В, тубулизина С, и тубулизина D.
22. B7-H3-ADC по п. 19, отличающийся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин ауристатин и выбран из группы, состоящей из ММАЕ (N-метилвалин-валин-долаизолеуин-долапроин-норэфедрина) и MMAF (N-метилвалин-валина -долаизолеуин-долапроин-фенилаланина).
23. B7-H3-ADC по п. 19, отличающийся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает маитансиноид цитотоксин и выбран из группы, состоящей из Майтанзин, DM1 и DM4.
24. B7-H3-ADC по п. 19, отличающийся тем, что указанный цитотоксический
лекарственный компонент D включает цитотоксин калихеамицин и выбран из группы, состоящей из калихеамицина yl, калихеамицина piBr, калихеамицина у IBr, калихеамицина а21, калихеамицина а31, калихеамицина pil, калихеамицина уII и калихеамицина АН.
25. B7-H3-ADC по п. 19, отличающиеся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин пирролобензодиазепин и выбран из группы, состоящей из вадастуксимаба талирина, SJG-136, SG2000, SG2285 и SG2274.
26. B7-H3-ADC по п. 19, отличающиеся тем, что указанный цитотоксический лекарственный компонент D включает цитотоксин дуокармицин и выбран из группы, состоящей из дуокармицина А, дуокармицина В1, дуокармицина В2, дуокармицина С1, дуокармицина С2, дуокармицина D, дуокармицина SA, СС -1065, адозелезина, бизелезина, карцелезина (U-80244) и спиро-дуокармицина (DUBA).
27. B7-H3-ADC по любому из пп 1-26, отличающееся тем, что линкерная молекула LM ковалентно связана с указанным АЬ через восстановленные межцепочечные дисульфиды.
28. Фармацевтическая композиция, которая включает эффективное количество В7-H3-ADC по любому из пп. 1-11 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
29. Применение B7-H3-ADC по любому из пп. 1-27 или фармацевтической композиции по п. 28 при лечении заболевания или состояния, связанного с экспрессией В7-НЗ или характеризующейся экспрессией В7-НЗ.
30. Применение по п. 29, отличающееся тем, что указанное заболевание или состояние, связанное с экспрессией В7-НЗ или характеризующееся экспрессией В7-НЗ, представляет собой рак.
31. Применение по п. 30, отличающееся тем, что указанный рак характеризуется наличием раковой клетки, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, В-клеточной неоплазии, рака молочной железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, язвенной карциномы клетки, рака ободочной кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного
25.
пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, опухоли зародышевых клеток, рака головы и шеи, глиобластомы, гемобластозов, гепатоцеллюлярной карциномы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза (например, острого миелоидного лейкоза), липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC)), медуллобластомы, меланомы, менингиомы, мезотелиомы фарингеального рака, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, детского онкологического заболевания, опухоли периферических нервных оболочек, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, увеальной меланомы заднего полюса, почечного метастатического рака, рабдоидной опухоли, рабдомизаркомы, саркомы, рака кожи, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластомы и рабдомиосаркомы), саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN)), рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки.
32. Применение по п. 30, отличающееся тем, что указанный рак характеризуется наличием рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака надпочечников, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака желудка, глиобластомы, рака почки, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), острогой лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфомы Беркетта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток зоны мантии, лимфомы из клеток маргинальной зоны, мезотелиомы фарингеального рака, неходжкинской лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, множественной миеломы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, карциномы почек, сине-мелкокруглоклеточных опухолей детей (включая нейробластому и рабдомиосаркому), плоскоклеточного рака (например, плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN), рака яичек, рака щитовидной железы (например, метастатического рака щитовидной железы) и рака матки, клетка выбрана из группы, включающей клетки: надпочечник.
Фиг 1
Собранное диатело
Фиг. 2
Фиг. ЗА
Домен, способствующий
гетеродимеризации уН1
соон
Линкер с
необязательным ^^l^"'
остатком s^^t^
(c) цистеина jci^" VL2
Остатки ни7 цистеина
соон
Домен, способствующий гетеродимеризации
iker / Л]
/ необя
Биспецифическое тетравалентное Fc-диатело
соон
соон
соон
ни.
Фиг. ЗВ
Фиг. ЗС
Линкер 3 сш мн, -с- с- <Д]
Полипептидная цепь 1
Полипептидная цепь 2
Линкер 3
Полипептидная цепь 3
соон
Собранное Fc-диатело (Версия 2)
Фиг. 4В
Полипептидная цепь 2
соон
Полипептидная цепь 1
Полипептидная цепь 5
соон
Фиг.
^ VH1
Вторая полипептидная цепь г '
соон
Четвертая полипептидная цепь
13 NH,
Два связывающих домена по типу диатела
соон
К-спираль
(или Е-спираль)
Линкер 2
ШМгсоон
Линкер 2 Е-спираль
(или К-спираль)
VL2 NH Вторая полипептидная цепь
соон
СООН
Два связывающих
Связывающий домен не по типу диатела
Фиг. 6В
Фиг. 6D
Два связывающих домена по типу диатела
Два связывающих домена по типу диатела
Два связывающих
Сайт В 1
Связывающий домен не по типу диатела
Фиг. 6Е
Сайт В L г
Связывающий домен не по типу диатела
Фиг. 6F
Клетки рака поджелужочной железы Hs700T
-ZAP
Fab-ZAP|nM]
Фиг У
JIMT-1
Рак молочной железы
12000-1
10000- ц 8000? 6000400020000-
-т-10
1 -г-
100 1000
mAb [пМ]
chmAb-A B7-H3-ADC (tm)*~ chmAb-B B7-H3-ADC -*- chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
г---1
10000 100000
Фиг. 8А
MDA-MB-468
Рак молочной железы
8000-1 6000-
2 4000Н
2000 О
ChmAb-A B7-H3-ADC ChmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
10 100 1000 10000 100000
тАЬ[иМ]
Фиг. 8В
A375.S2
Меланома
8000 л 6000-
2 4000Н DC
2000
-ф- chmAb-A B7-H3-ADC -я- chmAb-B B7-H3-ADC -*- chmAb-C B7-H3-ADC ch mAb-D B7-H3-ADC
10 100 1000
mAb [нМ ]
10000 100000
Фиг. 8C
Calu-6 NSCLC
12000-1 1000080002 6000400020000-
-я- chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
10 100 1000
mAb [nM] 10000 100000
Фиг. 8D
NCI-H1703
NSCLC
12000-1 10000 8000? 6000400020000
100 1000 mAb(iiM] 10000 100000
Фиг. 8E
NCI-H1975 NSCLC
8000-1
2000 0
chmAb-A B7-H3-ADC chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
10 100 1000 mAb [nM]
10000 100000
Фиг. 8F
PA-1
Рак яичника
з u_
10000-1 80006000400020000
chmAb-A B7-H3-ADC chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
100 1000
mAb[iiM]
10000 100000
Фиг. 8G
Hs700T
Рак поджелудочной железы
8000-1 6000-
? 4000H
2000-
chmAb-A B7-H3-ADC -m- chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC ch mAb-D B7-H3-ADC
10 100 1000
mAb [пМ]
10000 100000
Фиг. 8H
DU145 Рак предстательной железы
1000080006000400020000
chmAb-A B7-H3-ADC chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC ch mAb-D B7-H3-ADC
10 100 1000
mAb[nM|
10000 100000
Фиг. 81
Raji
В-клеточная лимфома
8000-1
E 4000-ОС
chmAb-A B7-H3-ADC chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
2000-
10 100
mAb[nM j
-f- ¦ r______|
1000 10000 100000
Фиг 8J
Рак молочной железы MDA-MB-468 (10 мг/кг)
День исследования
Фиг. 9
Нсмслкоклсточный рак легкого 1000 NCI-H1703 (10 мг/кг)
Hocniejib(PBS) chmAb-B B7-H3-ADC ChmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
Hсмелкоклеточный рак легкого
NCI-H1703 (3 мг/кг)
1000 т
День исследования
Фиг. 10В
1000-1 800600400200-
0-.
Н смел ко клеточный рак легкого NCI-H1703 (1 мг/кг)
20 40 60 80
День исследования
Носитель(РВЗ) chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
Фиг. ЮС
Рак яичника РА-1
(10 мг/кг)
*т*
20 40
День исследования
Носитель (PBS)
chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
Фиг. 11А
Рак яичника РА-1 (3 мг/кг)
20 40 День исследования
Носитель (PBS) ChmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC
ChmAb-D B7-H3-ADC
Фиг. 11В
Рак яичника РА-1 (1 мг/кг)
Носитель (PBS) chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
Рак легкого Calu-6
День исследования
(10 мг/кг)
Рак легкого Calu-6
~ф- Носитель (PBS)
-*- chmAb-B B7-H3-ADC chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
День исследования
Фиг. 12В
Мсланома A375.S2 (10 мг/кг)
-#- Носитель (PBS)
-ш~ chmAb-B B7-H3-ADC
chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
-г -f -i
20 40
День исследования
Фиг. 13А
Меланома A375.S2 (3 мг/кг) "¦" Носитель (PBS) ни- chmAb-B B7-H3-ADC -*- chmAb-C B7-H3-ADC chmAb-D B7-H3-ADC
20 40
День исследования
Фиг. 13В
Меланома A375.S2
(10 мг/кг)
Носитель (PBS) chmAb-B B7-H3-ADC ChmAb-C B7-H3-ADC ChmAb-D B7-H3-ADC
0 20
День исследования
Фиг. 13С
chmAb-B
Время (часы)
Фиг. 14A
chmAb-C
0 100 200 300
Время (часы)
Фиг. 14В
chmAb-D
-ADC
0" i i 1
0 100 200 300
Время (часы)
Фиг. 14C
Calu-6
Инкубация 7 дней
12000-j 10000-
Z^"T"*V • hmAb-C
chmAb-i
| 8000-i 1 6000H
- 4000H
Ш 20004
-r(tm) 0,01
1 100 mAbl'iM]
Фиг. 15A
10000
8000-
4000
hmAb-C-DUBA
chmAb-C-DUBA
Ctrl-DUBA
0.01
1 100
mAb [nM] 10000 1000000
Фиг. 15В
м о
12000т
8000-
4000-
HS700T
Инкубация 7 дней нн hmAb-C-DUBA -*- chmAb-C-DUBA
~* < Ctrl-DUBA
0,01
1 100 mAb [пМ]
10000 1000000
Фиг. 15С
Исследование эффективности множественной дозы in vivo. hmAb-C-DUBA-Calu-6
День исследования
Фиг. 16
2600-1
° 1000-
О 5004
2500 \ 2000 I 15004
Исследование эффективности одиночной дозы in vivo. hmAb-C-DlJBA-Calu-6
-#" Носитель (PBS)
-ф- hmAb-C-DUBA [10 мг/кг 1 hmAb-C-DUBA [3мг/кг; Ctrl-DUBA [10мг/кг|
20 40
День исследования
Ctrl-DUBA [3мг/кг;
Исследование эффективности одиночной дозы
in vivo, hmAb-C-DUВ А-клетки РА-1 -(r)- Носитель (PBS)
День исследования
-Н- hmAb-C-DUBA [10мг/кг ;] -A- hmAb-C-DUBA [6мг/кг ;]
День исследования
Исследование эффективности одиночной дозы in vivo, h mAb-C- D U В А-мел а н ом a A375.S2
День исследования
Ксенотрансплантаты в жировую подушку молочной железы MDA-MB-468 для anm-B7-H3-DUBA (данные по одиночной дозе 6 мг/кг)
Ксенотрансплантаты в жировую подушку молочной железы MDA-MB-468 для ainn-B7-H3-DUBA (данные по одиночной дозе 3 мг/кг)
О 20 40 60 80 100 120
День исследования
Фиг. 20В
День исследования
Фиг. 20С
Ксенотрансплантаты в жировую подушку молочной железы MDA-MB-468 для amn-B7-H3-DUBA (данные по тройной дозе 3 мг/кг)
Ксенотрансплантаты в жировую подушку молочной железы MDA-MB-468 для anTH-B7-H3-DUBA
(все данные)
-#- Носитель (PBS)
НО" hmAb-C-DUO [6 мг/кг х 1]
День исследования
-й- hmAb-C-DUO [3 мг/кг х 1]
2400-1 22002000180016001400120010008006004002000
Подкожные ксенотрансплантаты РА-1 для anm-B7-H3-DUBA (10 мг/кг одиночная или двойная доза)
Т 1-
20 40
День исследования
Носитель (PBS) -О- hmAb-C-DUBA [Ю мг/кг х 1] -О- hmAb-C-DUBA [Ю мг/кг х 2] -Н- Ctrl-DUBA [10 мг/кг х 1] -О- Ctrl-DUBA [10 мг/кг х 2]
2400 2200
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
¦Иг hmAb-C-DUBA [6 мг/кг х 1]
#- hmAb-C-DUBA [6 мг/кг х 4]
^- Ctrl-DUBA [б.ч. к! х 1]
•О- Ctrl-DUBA [6 мг/кг х 4]
20 40 60
День исследования
Фиг 21В
2400-1
2200-
2000-
1800-
1600-
1400-
1200-
1000-
800-
600-
400-
200-
Подкожные ксенотрансплантаты РА-1 для anTH-B7-H3-DUBA (3 мг/кг, одиночная доза)
20 40
День исследования
-#- Носитель (PBS) -A- hmAb-C-DUBA [3mg/kg х 1] "О- Ctrl-DUBA [3mg/kg х 1]
Подкожные ксенотрансплантаты РА-1 для B7-H3-DIIBA (все данные)
20 ш 60
День исследования
Носитель (PBS) hmAb-C-DUBA [10mg/kg х 1] hmAb-C-DUBA [6mg/kg х 1] hmAb-C-DUBA [3mg/kg x 1] hmAb-C-DUBA [10mg/kg x 2] hmAb-C-DUBA [6mg/kg x 4]
Ctrl-DUBA [10mg/kg x 1] Ctrl-DUBA [6mg/kg x 11 Ctrl-DUBA [3mg/kg x 1] Ctrl-DUBA [10mg/kg x2] Ctri-DUBA [6mg/kg x 41
Фиг. 21D
30ч
Время (часы)
Фиг. 22
Общий IgG
27 мг/кг, самец 27 мг/кг, самка
10 мг/кг, самец 10 мг/кг, самка
3 мг/кг, самец 3 мг/кг, самка
10 мг/кг, самец 1 мг/кг, самка
Часы
интактный ADC
400
Время (часы)
27 мг/кг, самец 27 мг/кг, самка
10 мг/кг, самец 10 мг/кг, самка
3 мг/кг, самец 3 мг/кг, самка
1 мг/кг, самец 1 мг/кг, самка
Фиг. 23В
(19)
(19)
(19)
105
105
105
105
105
105
109
109
109
109
109
109
109
112
114
114
115
115
115
115
115
115
115
115
115
115
119
119
119
119
119
119
119
119
119
119
119
119
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
122
122
122
122
122
122
125
126
125
126
128
128
140
140
140
140
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
164
164
1/39
1/39
2/39
2/39
4/39
4/39
4/39
4/39
4/39
4/39
4/39
4/39
4/39
4/39
5/39
5/39
8/39
8/39
8/39
8/39
8/39
8/39
8/39
8/39
9/39
9/39
9/39
9/39
9/39
9/39
10/39
10/39
10/39
10/39
10/39
10/39
10/39
10/39
11/39
11/39
12/39
12/39
12/39
12/39
13/39
13/39
13/39
13/39
14/39
14/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
15/39
18/39
17/39
18/39
17/39
18/39
17/39
18/39
17/39
18/39
18/39
18/39
18/39
18/39
18/39
18/39
18/39
19/39
19/39
20/39
20/39
20/39
20/39
20/39
20/39
22/39
22/39
23/39
23/39
23/39
23/39
24/39
24/39
24/39
24/39
24/39
24/39
25/39
25/39
26/39
26/39
26/39
26/39
26/39
26/39
27/39
27/39
28/39
28/39
28/39
28/39
28/39
28/39
29/39
29/39
29/39
29/39
29/39
29/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
30/39
31/39
31/39
31/39
31/39
32/39
32/39
33/39
33/39
34/39
34/39
35/39
35/39
36/39
36/39
36/39
36/39
36/39
36/39
37/39
37/39
37/39
37/39
37/39
37/39
38/39
38/39
39/39
39/39