|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Описаны, среди прочего, способы и композиции, используемые для детекции и/или количественного определения белков клетки-хозяина во время получения продукта, например рекомбинантного белка, например, антитела. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Описаны, среди прочего, способы и композиции, используемые для детекции и/или количественного определения белков клетки-хозяина во время получения продукта, например рекомбинантного белка, например, антитела.
Евразийское (21) 201892325 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N33/543 (2006.01)
2019.04.30 C07K16/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.04.12
(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА
(31) (32)
62/322,621 2016.04.14
(33) US
(86) PCT/EP2017/058775
(87) WO 2017/178526 2017.10.19
(71) Заявитель: ЛОНЦА ЛТД (CH)
(72) Изобретатель: Мао Гоцзе (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Описаны, среди прочего, способы и композиции, используемые для детекции и/или количественного определения белков клетки-хозяина во время получения продукта, например рекомби-нантного белка, например, антитела.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-553064ЕА/011 КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 62/322621, поданной 14 апреля 2016 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам детектирования и/или количественного определения загрязняющих белков клетки-хозяина во время получения продукта, например, рекомбинантного белка, например, антитела.
Уровень техники
Белок клетки-хозяина (НСР) представляет собой нежелательную сложную смесь белков хозяина, которые могут присутствовать в конечном продукте после различных процессов получения. Такие НСР могут представлять угрозу, среди прочего, для эффективности продукта и безопасности пациентов. Следовательно, существует потребность в способах детектирования и количественного определения НСР в конечных биофармацевтических продуктах.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает, среди прочего, высокочувствительный способ детектирования НСР. В одном из аспектов, раскрываются способы детектирования, контроля, идентификации или количественного определения белка клетки-хозяина GS-CHO (НСР) в образце, содержащем рекомбинантный полипептид, где способ включает: а) обеспечение или получение образца, содержащего рекомбинантный полипептид; Ь) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) детектирование присутствия GS-CHO НСР, связанного с
антителом, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) необязательно количественное определение уровня GS-CHO НСР; д) необязательно идентификацию одного или более детектированных GS-CHO НСР; и h) необязательно количественное определение одного или более идентифицированных GS-CHO НСР.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является терапевтическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии последующей обработки в процессе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии предшествующей обработки в процессе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в процессе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело детектируется непосредственно. В некоторых вариантах
осуществления детектируемое антитело амплифицируется
флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления
детектируемое антитело биотинилируется, и средством
детектирования является авидин- или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам получения лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида, где способ включает: а) обеспечение или получение образца препарата рекомбинантного полипептида; Ь) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР ниже предварительно выбранного эталонного уровня, тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления обработка включает одно или более из: получение состава полипептидного препарата; обработки полипептидного препарата в лекарственный продукт; объединения полипептидного препарата со вторым компонентом, например, эксципиентом или буфером; изменения концентрации полипептида в препарате; лиофилизации полипептидного препарата; объединения первой и второй аликвотной части полипептида с получением третьей, большей, аликвотной части; разделения полипептидного препарата на меньшие аликвотные части; помещения полипептидного препарата в контейнер, например, в герметичный контейнер для газа или жидкости; упаковки полипептидного препарата; связывания контейнера, содержащего полипептидный препарат, с этикеткой (например, маркировкой); перевозки или перемещения полипептидного препарата в другое место.
В некоторых вариантах осуществления стадия обработки включает объединение полипептидного препарата с эксципиентом или буфером. В некоторых вариантах эталонный уровень составляет примерно 100 част./млн. (например, ниже 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 част./млн.). В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень составляет от 1 до 1000 част./млн. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень составляет, по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.. В некоторых вариантах эталонный уровень не превышает 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 20 част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.. В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня является спецификацией на коммерческий выпуск лекарственного продукта. В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня является спецификацией на коммерческий выпуск лекарственного продукта в соответствии с разделом 351 (а) закона Службы общественного здравоохранении (PHS). В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР определяют для одного, двух или более образцов или партий.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления
рекомбинантный полипептид представляет антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является терапевтическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело детектируется непосредственно. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело амплифицируется флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин-или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам получения лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида, где способ включает: а) культивирование клетки GS-CHO, культивированной в условиях, подходящих для продукции, например, экспрессии и секреции, рекомбинантного полипептида, Ь) выделение секретированного рекомбинантного полипептида из клетки-хозяина; с) проведение одной или более стадий очистки секретированного рекомбинантного полипептида с получением препарата рекомбинантного полипептида; d) отбор образца препарата рекомбинантного полипептида; е) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитела-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; f) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое
связывается с GS-CHO НСР; g) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и h) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР ниже предварительно выбранного эталонного уровня, тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления обработка включает одно или более из: получение состава полипептидного препарата; обработки полипептидного препарата в лекарственный продукт; объединения полипептидного препарата со вторым компонентом, например, эксципиентом или буфером; изменения концентрации полипептида в препарате; лиофилизации полипептидного препарата; объединения первой и второй аликвотной части полипептида с получением третьей, большей, аликвотной части; разделения полипептидного препарата на меньшие аликвотные части; помещения полипептидного препарата в контейнер, например, в герметичный контейнер для газа или жидкости; упаковки полипептидного препарата; связывания контейнера, содержащего полипептидный препарат, с этикеткой (например, маркировкой); перевозки или перемещения полипептидного препарата в другое место.
В некоторых вариантах осуществления стадия обработки включает объединение полипептидного препарата с эксципиентом или буфером. В некоторых вариантах эталонный уровень составляет примерно 100 част./млн. (например, ниже 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 част./млн.). В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень составляет от 1 до 1000 част./млн.. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень составляет, по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.. В некоторых вариантах эталонный уровень не превышает 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 2 0 част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.. В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня является спецификацией на коммерческий выпуск
лекарственного продукта. В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня является спецификацией на коммерческий выпуск в соответствии с разделом 351 (а) закона Службы общественного здравоохранении (PHS). В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР определяют для одного, двух или более образцов или партий.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является терапевтическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело детектируется
непосредственно. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело амплифицируется флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин-или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам получения лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептид, где способ включает: а) обеспечение или получение образца препарата рекомбинантного полипептида из культуры клеток GS-CHO; b) получение показателя для белка клетки-хозяина GS-CHO (НСР) в образце, где показатель является функцией, пропорционален, или был получен связыванием поликлонального антитела GS-CHO с образцом, тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку полученного показателя, например, сравнением полученного показателя с эталонным значением. В некоторых вариантах осуществления способ включает: реагирование на оценку, классификацию, отбор, приемку, выпуск, обработку в лекарственный продукт, перевозку, перемещение в другое место, формуляцию, маркировку, упаковку, выпуск в продажу, продажу или предложение на продажу препарата. В некоторых вариантах осуществления показатель определяли способом, описанным здесь.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления
рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является терапевтическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело детектируется непосредственно. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело амплифицируется флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин-или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам оценки способа получения рекомбинантного полипептида в клетке-хозяине GS-CHO, где способ включает: а) культивирование клетки GS-CHO, культивированной в условиях, подходящих для продукции, например, экспрессии и секреции, рекомбинантного полипептида; Ь) выделение секретированного рекомбинантного полипептида из клетки-хозяина; с) необязательно отбор образца первого полипептидного препарата; d) проведение стадии очистки первого полипептидного препарата с получением второго полипептидного препарата; е) отбор образца второго полипептидного препарата; f) необязательно проведение второй, третьей, четвертой, пятой или шестой стадии очистки второго полипептидного препарата с получением последующих полипептидных препаратов; д) необязательно отбор образца любых последующих
полипептидных препаратов, полученных на стадии f); h) приведение в контакт и инкубацию каждого из образцов, отобранных с использованием поликлонального анти-GS-CHO НСР-антитела, иммобилизованного на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; i) отделение каждого из образцов от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; j) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; к) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и 1) на основе указанного количественного определения, составление определения о способе, тем самым оценки способа получения рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления способ включает сравнение уровня GS-CHO НСР с эталонным уровнем, где, например, если уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня, то валидацию способа для применения в продукции рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах эталонный уровень составляет: i) между 1 част./млн. и 1000 част./млн., ii) по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн., или iii) не выше 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 20 част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн..
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который
раскрыт в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является терапевтическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело детектируется непосредственно. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело амплифицируется флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин-или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам оценки способа очистки рекомбинантного полипептида, где способ включает: а) проведение стадии очистки первого полипептидного препарата с получением второго полипептидного препарата; Ь) отбор образца второго полипептидного препарата; с) необязательно проведение второй, третьей, четвертой, пятой или шестой стадии очистки второго полипептидного препарата с получением последующих полипептидных препаратов; d) необязательно отбор образца любых последующих полипептидных препаратов, полученных на стадии с) ; е) приведение в контакт и инкубацию каждого из образцов, отобранных с использованием поликлонального анти-GS-CHO НСР-антитела, иммобилизованного на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное
антитело-GS-CHO НСР; f) отделение каждого из образцов от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; д) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; h) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и i) на основе указанного количественного определения, составление определения способа, тем самым оценки способ очистки рекомбинантного терапевтического средства.
В некоторых вариантах осуществления способ включает: сравнение уровня GS-CHO НСР с эталонным уровнем. В некоторых вариантах осуществления, если уровень GS-CHO НСР находится ниже эталонного уровня, то валидацию способа для применения в получении рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень составляет от 1 до 1000 част./млн.. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень составляет, по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.. В некоторых вариантах эталонный уровень не превышает 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 2 0 част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн..
В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает
одно или более, или любую комбинацию эксклюзионной хроматографии
(SEC), ионообменной хроматографии (IEX), хроматографии
гидрофобного взаимодействия (HIC), обращенно-фазовой
хроматографии (RPC), хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов, осаждения сульфатом аммония, тиофильной адсорбционной хроматографии, хроматографии на основе белка А, хроматографии на основе белка G, хроматографии на основе белка L и аффинной хроматографии.
В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает одну или более стадий аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает: хроматографию на основе белка А и одну или более стадий аффинной
хроматографии. В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает: хроматографию на основе белка А и хроматографию на CNBr-активированном сорбенте. В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает: хроматографию на основе белка А и последующую хроматографию на CNBr-активированном сорбенте. В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает: хроматографию на основе белка А и хроматографию на NHS-активированном сорбенте. В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает: хроматографию на основе белка А и последующую хроматографию на NHS-активированном сорбенте.
В некоторых вариантах осуществления стадия очистки включает: i) хроматографию на основе белка А и одну или более стадий аффинной хроматографии, ii) хроматографию на основе белка А и хроматографию на CNBr-активированном сорбенте, например, хроматографию на основе белка А и последующую хроматографию на CNBr-активированном сорбенте, или iii) хроматографию на основе белка А и хроматографию на NHS-активированном сорбенте, например, хроматографию на основе белка А и последующую хроматографию на NHS-активированном сорбенте.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело. В некоторых
вариантах осуществления антитело представляет моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является терапевтическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления образец получают на
стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного
полипептида. В некоторых вариантах осуществления образец
получают на стадии предшествующей обработки в способе получения
рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления
образец получают из конечного продукта рекомбинантного
полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ включает
два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или
более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в
способе получения рекомбинантного полипептида. В некоторых
вариантах осуществления детектируемое антитело детектируется
непосредственно. В некоторых вариантах осуществления
детектируемое антитело амплифицируется флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин-или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов обеспечиваются наборы, содержащие: а) поликлональное анти-GS-CHO НСР-антитело, иммобилизованное на твердой подложке; Ь) необязательно детектируемое антитело; с) необязательно буфер для промывания; и d) необязательно детектирующий реагент. В некоторых вариантах осуществления детектирующий реагент является таким же, как реагент захвата. В некоторых вариантах осуществления детектирующий реагент является таким же, как реагент захвата, только модифицированный для амплификации флуориметрическим реагентом. В некоторых вариантах осуществления детектирующее антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин- или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов обеспечиваются очищенные препараты поликлонального анти-GS-CHO НСР-антитела. В некоторых вариантах осуществления анти-GS-CHO НСР-антитело представляет овечье антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-GS-CHO НСР-антитело представляет козье, лошадиное, кроличье, бычье,
мышиное, хомячье или человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления препарат по существу не содержит неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 4 0% или 50% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистку проводят методами, включающими: хроматографию на основе белка А, и одну или более стадий аффинной хроматографии (например, хроматографию на CNBr-активированном сорбенте, хроматографию на NHS-активированном сорбенте).
В одном из аспектов обеспечиваются реакционные смеси, содержащие поликлональный препарат (например, поликлональный препарат, описанный здесь) анти-GS-CHO НСР-антитела и рекомбинантный полипептид, выбранный из таблицы 1 или таблицы 2. В некоторых вариантах осуществления реакционная смесь содержит антитело, которое связывается с анти-GS-CHO НСР-антителом.
В одном из аспектов обеспечиваются способы определения
того, насколько партия или серия лекарственного продукта на
основе рекомбинантного полипептид отвечает или соответствует
спецификации на выпуск, где спецификация на выпуск представляет
заранее выбранный эталонный уровень GS-CHO НСР, где способ
включает: а) обеспечение или получение образца препарата
рекомбинантного полипептида; Ь) приведение в контакт и инкубацию
образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом,
иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР отвечает, соответствует или находится ниже спецификации на
выпуск, тем самым определение того, насколько партия или серия лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептид отвечает или соответствует спецификации на выпуск. В некоторых вариантах осуществления способ включает: классификацию, отбор, приемку, выпуск, обработку в лекарственный продукт, перевозку, перемещение в другое место, формуляцию, маркировку, упаковку, выпуск в продажу, продажу или предложение на продажу препарата. В некоторых вариантах осуществления показатель определяли способом, описанным здесь.
В одном из аспектов раскрываются способы получения препарата поликлонального анти-НСР-антитела, где способ включает: а) получение образца, содержащего антитела, например, антисыворотки, от животного (например, овцы, кролика, мыши, крысы, хомяка, козы и т. д.), иммунизированного НСР клетки-хозяина (например, клеточной линии, например, клетки или клеточной линии млекопитающего, грызуна или насекомого, например, клетки-хозяина СНО, SP2, NSO) ; и Ь) выделение анти-НСР-антитела из образца, например, приведение в контакт образца с аффинным реагентом для НСР, тем самым получение препарата поликлонального анти-НСР-антитела.
В некоторых вариантах осуществления стадия Ь) включает: Ь.1) выделение антител, например, IgG антител, из образца с получением препарата антител; и Ь.2) выделение анти-НСР-антитела из препарата антител. В некоторых вариантах осуществления выделение антител включает приведение в контакт антител с аффинным реагентом, например, белком А. В некоторых вариантах осуществления выделение антител включает очистку поликлонального анти-НСР-антитела из антисыворотки посредством способа очистки, включающего хроматографию на основе белка А. В некоторых вариантах осуществления выделение анти-НСР-антитела из препарата антител включает приведение в контакт препарата антител с аффинным реагентом для НСР. В некоторых вариантах осуществления аффинный реагент для НСР включает НСР, связанный с субстратом, например, нерастворимым или твердым субстратом, например, агарозовой гранулой, например, Сефаразой, например, субстратом,
дериватизированным цианогенбромидом (CNBr) или N-
гидроксисукцинимидом (NHS) для хроматографии.
В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет, по меньшей мере, 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет более 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет более 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат поликлонального антитела по существу не содержит неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат поликлонального антитела содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат поликлонального антитела содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG.
В одном из аспектов раскрываются способы получения поликлонального анти-НСР-антитела для применения в ELISA для детектирования НСР в препарате рекомбинантного полипептида, где способ включает: а) получение образца, содержащего антитела, например, антисыворотки, от животного (например, овцы, кролика, мыши, крысы, хомяка, козы и т. д.), иммунизированного НСР клетки-хозяина (например, клеточной линии, например, клетки или клеточной линии млекопитающего, грызуна или насекомого, например, клетки-хозяина СНО, SP2, NSO); и Ь) выделение антител из антисыворотки приведение в контакт антисыворотки с аффинным реагентом на основе белка А с получением препарата антител; с) выделение анти-НСР-антитела из препарата антител приведение в контакт препарата антител с аффинным реагентом для НСР, тем самым получение препарата поликлонального анти-НСР-антитела.
В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет, по меньшей мере, 99%
неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет более 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет более 99% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат поликлонального антитела по существу не содержит неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат поликлонального антитела содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% неспецифических для НСР IgG. В некоторых вариантах осуществления препарат поликлонального антитела содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG.
В одном из аспектов обеспечиваются способы детектирования,
контроля, идентификации или количественного определения белка
клетки-хозяина (НСР) (например, СНО НСР) в образце, содержащем
рекомбинантный полипептид, где способ включает: а) обеспечение
или получение образца, содержащего рекомбинантный полипептид; Ь)
приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-
НСР-антителом (например, анти-СНО НСР-антителом),
иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-НСР, где поликлональное антитело получено любым из способов, описанных в настоящем документе; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) детекция присутствия НСР, связанного с антителом, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) необязательно количественное определение уровня детектированного НСР; д) необязательно идентификацию одного или более детектированных НСР; и h) необязательно количественное определение одного или более идентифицированных НСР.
В одном из аспектов обеспечиваются способы детектирования, контроля, идентификации или количественного определения белка клетки-хозяина GS-CHO (НСР) в образце, содержащем рекомбинантный полипептид, например, терапевтический полипептид, где способ включает: а) обеспечение или получение образца, содержащего
рекомбинантный полипептид; b) инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на подложке, например, нерастворимой или твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым реагентом, например, антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) детекция присутствия GS-CHO НСР, связанного с антителом, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) необязательно количественное определение уровня детектированного GS-CHO НСР; д) необязательно идентификацию одного или более детектированных GS-CHO НСР; и h) необязательно количественное определение одного или более идентифицированных GS-CHO НСР.
В некоторых вариантах осуществления i) рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например, человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела, или ii) рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблицах 1 или 2.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело, например моноклональное антитело, например, терапевтическое антитело.
В некоторых вариантах осуществления i) образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида; ii) образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида; iii) образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида; или iv) способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов,
полученных на одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело: i) детектируется непосредственно, ii) амплифицируется флуориметрическим реагентом или iii) биотинилируется, и средством детекции является авидин- или стрептавидин-пероксидаза и 3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов раскрываются способы получения
рекомбинантного полипептида, например, терапевтического
полипептида, лекарственного продукта, где способ включает: а)
обеспечение или получение образца, содержащего препарат
рекомбинантного полипептида; Ь) приведение в контакт и инкубацию
образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом,
иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР ниже предварительно выбранного эталонного уровня, где необязательно обработка включает одно или более из: получение состава полипептидного препарата; обработки полипептидного препарата в лекарственный продукт; объединения полипептидного препарата со вторым компонентом, например, эксципиентом или буфером; изменения концентрации полипептида в препарате; лиофилизации полипептидного препарата; объединения первой и второй аликвотной части полипептида с получением третьей, большей, аликвотной части; разделения полипептидного препарата на меньшие аликвотные части; помещения полипептидного препарата в контейнер, например, в герметичный контейнер для газа или жидкости; упаковки полипептидного препарата; связывания контейнера, содержащего полипептидный препарат, с этикеткой
(например, маркировкой); перевозки или перемещения
полипептидного препарата в другое место.
В одном из аспектов раскрываются способы получения рекомбинантного полипептида, например, терапевтического полипептида, лекарственного продукта, где способ включает: а) культивирование клетки GS-CHO, культивированной в условиях, подходящих для продукции, например, экспрессии и секреции, рекомбинантного полипептида, Ь) выделение секретированного рекомбинантного полипептида из клетки-хозяина; с) проведение одной или более стадий очистки секретированного рекомбинантного полипептида с получением препарата рекомбинантного полипептида; d) отбор образца препарата рекомбинантного полипептида; е) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; f) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; д) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и h) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР ниже заранее выбранного эталонного уровня, где обработка включает одно или более из: получение состава полипептидного препарата; обработки полипептидного препарата в лекарственный продукт; объединения полипептидного препарата со вторым компонентом, например, эксципиентом или буфером; изменения концентрации полипептида в препарате; лиофилизации полипептидного препарата; объединения первой и второй аликвотной части полипептида с получением третьей, большей, аликвотной части; разделения полипептидного препарата на меньшие аликвотные части; помещения полипептидного препарата в контейнер, например, в герметичный контейнер для газа или жидкости; упаковки полипептидного препарата; связывания контейнера, содержащего полипептидный препарат, с этикеткой
(например, маркировкой); перевозки или перемещения
полипептидного препарата в другое место, тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах эталонный уровень составляет: i) примерно 100 част./млн. (например, ниже 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 част./млн.), ii) от 1 част./млн. до 1000 част./млн., iii) по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн., или iv) не выше 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 20 част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн..
В некоторых вариантах осуществления уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня является спецификацией на коммерческий выпуск лекарственного продукта, например, в соответствии с разделом 351 (а) закона Службы общественного здравоохранении (PHS), и где необязательно уровень GS-CHO НСР определяется для одного, двух или более образцов или партий.
В некоторых вариантах осуществления i) рекомбинантный
полипептид представляет собой гомополимерный или
гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например, человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела или ii) рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблицах 1 или 2.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет антитело, например моноклональное антитело, например, терапевтическое антитело.
В некоторых вариантах осуществления i) образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида; ii) образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида; iii) образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида; или iv) способ включает два, три, четыре, пять,
шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных с одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления детектируемое антитело: i) детектируется непосредственно; ii) амплифицируется флуориметрическим реагентом, или iii) биотинилируется, и средством детекции является авидин- или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов обеспечиваются способы получения лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида, где способ включает: а) обеспечение или получение образца препарата рекомбинантного полипептида из культуры клетки GS-CHO; b) получение показателя для белка клетки-хозяина GS-CHO (НСР) в образце; и с) необязательно оценку полученного показателя, например, сравнением полученного показателя с эталонным значением; и d) необязательно реагирование на оценку, классификацию, отбор, приемку, выпуск, обработку в лекарственный продукт, перевозку, перемещение в другое место, формуляцию, маркировку, упаковку, выпуск в продажу, продажу или предложение на продажу препарата, где показатель является функцией, пропорционален, или получен связыванием поликлонального анти-GS-СНО-антитела с образцом, тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления показатель определяли способом, описанным здесь.
В одном из аспектов обеспечиваются наборы, содержащие: а) поликлональное анти-GS-CHO НСР-антитело, иммобилизованное на твердой подложке; Ь) необязательно детектируемое антитело; с) необязательно буфер для промывания; и d) необязательно детектирующий реагент, где, например, детектирующий реагент является таким же, как реагент захвата, или детектирующий реагент является таким же, как реагент захвата, только модифицированный для амплификации флуориметрическим реагентом, или где необязательно детектирующее антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин- или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
В одном из аспектов раскрываются очищенные препараты поликлонального анти-бЭ-СНО-антитела, где необязательно анти-GS-СНО-антитело представляет овечье, козье, лошадиное, кроличье, бычье, мышиное, хомячье или человеческое антитело.
В некоторых вариантах осуществления препарат по существу не содержит неспецифических для НСР IgG, например, препарат содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% неспецифических для НСР IgG, или препарат содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG.
В одном из аспектов раскрываются способы определения того,
насколько партия или серия лекарственного продукта на основе
рекомбинантного полипептида отвечает или соответствует
спецификации на выпуск, где спецификация на выпуск представляет
заранее выбранный эталонный уровень GS-CHO НСР, где способы
включают: а) обеспечение или получение образца препарата
рекомбинантного полипептида; Ь) приведение в контакт и инкубацию
образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом,
иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР; d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР; е) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и f) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР отвечает, соответствует или находится ниже спецификации на выпуск, и где необязательно обработка включает: классификацию, отбор, приемку, выпуск, обработку в лекарственный продукт, перевозку, перемещение в другое место, получение состава, маркировку, упаковку, выпуск в продажу, продажу или предложение на продажу препарата, тем самым определение того, насколько партия или серия лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида отвечает или соответствует спецификации на выпуск.
В одном из аспектов раскрываются способы получения
поликлонального анти-НСР-антитела, где способ включает: а)
получение образца, содержащего антитела, например,
антисыворотки, от животного (например, овцы, кролика, мыши, крысы, хомяка, козы и т. д.), иммунизированного НСР клетки-хозяина (например, клеточной линии, например, клетки или клеточной линии млекопитающего, грызуна или насекомого, например, клетки-хозяина СНО, SP2, NSO) ; и Ь) выделение анти-НСР-антитела из образца, например, приведение в контакт образца с аффинным реагентом для НСР, например, белком А, и где необязательно стадия Ь) включает: Ь.1) выделение антител, например, IgG антител, из образца с получением препарата антител; и Ь.2) выделение анти-НСР-антитела из препарата антител, например, приведение в контакт препарата антител с аффинным реагентом для НСР, тем самым получение препарата поликлонального анти-НСР-антитела.
В некоторых вариантах осуществления очистка удаляет: i) по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% неспецифических для НСР IgG, по меньшей мере, 99% неспецифических для НСР IgG, или ii) более 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% неспецифических для НСР IgG, например, более 99% неспецифических для НСР IgG.
В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат поликлонального антитела по существу не содержит неспецифических для НСР IgG, например, содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% неспецифических для НСР IgG или содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG.
Краткое описание фигур
На фиг.1 показан пример способа очистки овечьего анти-GS-CHO НСР-антитела.
Подробное описание изобретения
Для того, чтобы рекомбинантные биофармацевтические белки были приемлемыми для введения людям-пациентам, важно, чтобы остаточные загрязняющие вещества, образующиеся в процессе производства и очистки, удалялись из конечного биологического
продукта. Такие загрязнители процесса включают белки культуральной среды, аффинные лиганды для иммуноглобулина, вирусы, эндотоксины, ДНК и белки клетки-хозяина (НСР). НСР могут создавать ряд нежелательных эффектов, которые могут отрицательно повлиять на профиль безопасности продукта, включая иммунный ответ, адъювантную активность, непосредственную биологическую активность или взаимодействие/деградацию продукта. Такие загрязнители из клетки-хозяина включают специфические для процесса получения НСР, которые представляют связанные с процессом получения примеси/загрязняющие вещества в биологических препаратах, полученных технологией рекомбинантной ДНК.
Согласно регламентам, принятым в США и других странах, обычно требуется удаление таких загрязнителей. Например, согласно требованиям Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов необходимо, чтобы биофармацевтические препараты, предназначенные для применения человеку in vivo, были как можно более свободными от посторонних иммуноглобулинов и загрязнителей, отличных от иммуноглобулинов, и в этом случае требуются тесты для детектирования и количественного определения потенциальных загрязнителей, таких как НСР. Международная конференция по гармонизации (ICH) обеспечивает указания по процедурам испытаний и критериям приемлемости для биотехнологических/биологических продуктов. В этих указаниях предусматривается применение для НСР чувствительного иммуноанализа, способного детектировать широкий ряд белковых примесей. Несмотря на наличие коммерчески доступных анализов и реагентов для детектирования иммуноглобулинов, ДНК, эндотоксинов, вирусов и т. д., в настоящее время отсутствуют коммерчески доступные реагенты или аналитические методы, доступные для детектирования и количественной оценки НСР, специфических для клеточных линий GS-CHO.
Настоящее раскрытие обеспечивает, среди прочего, устойчивый, чувствительный анализ НСР на основе ELISA и способы его применения для поддержки многочисленных экспрессионных систем, включая, например, экспрессионные системы млекопитающих,
например, экспрессионную систему CH0K1SV. Качество способа анализа НСР на основе ELISA определяется главным образом двумя параметрами: (1) пределом количественного определения (LOQ) и (2) процентным покрытием НСР, которые могут присутствовать в качестве загрязнителей. В настоящее время доступные методы анализа НСР на основе ELISA обеспечивают LOQ на уровне 200 нг/мл-1000 нг/мг и покрытие на уровне 40%-б0% подсчетом пятен. Описанный здесь ELISA обеспечивает L0Q на уровне 2 нг/мг и покрытие на уровне 71% сравнением пятен (что является лучшим подходом, чем подсчет пятен), удовлетворяя оба этих параметра. Аналитическая платформа может служить основой для детектирования НСР в разных продуктах из стабильной клеточной линии и процесса получения (например, GS-CHO). Определения
Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в области техники, к которой относится изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы на практике и/или при тестировании настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные материалы и способы. При описании и в формуле изобретения будет использоваться следующая терминология в соответствии с тем, как она определена, где определение предоставляется.
Следует также понимать, что терминология, используемая здесь, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
Как здесь используется, термин "белок клетки-хозяина" или "НСР" относится к любому белку, продуцированному или кодированному организмом, использованным для получения рекомбинантного полипептидного продукта, и не относящемуся к предполагаемому рекомбинантному продукту. Присутствие НСР нежелательно в конечном лекарственном препарате.
Как здесь используется, термин "GS-СНО" относится к клетке яичника китайского хомячка (СНО), которая экспрессирует
рекомбинантную глутатионсинтетазу (GS). Например, CH0-K1SV GS (Lonza Biologies, Inc.).
Как здесь используется, термин "GS-СНО НСР" относится к белку клетки-хозяина, происходящему из клетки GS-CHO.
Как здесь используется, термин "эндогенный" относится к любому материалу, происходящему из или естественным образом продуцированному в организме, клетке, ткани или системе.
Как здесь используется, термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному или продуцированному вне организма, клетки, ткани или системы. Следовательно, "экзогенная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, которая вводится или продуцируется вне организма, клетки, ткани или системы. В варианте осуществления последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты естественным образом не продуцируются или не могут быть естественным образом обнаружены внутри организма, клетки, ткани или системы, в которые вводится экзогенная нуклеиновая кислота. В одном из вариантов осуществления последовательности экзогенных нуклеиновых кислот являются последовательностями, не встречающимися в природе, или кодируют не встречающиеся в природе продукты.
Как здесь используется, термин "гетерологичный" относится к любому материалу одного вида, когда он вводится в организм, клетку, ткань или систему из другого вида.
Как здесь используется, термины "нуклеиновая кислота", "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" используются взаимозаменяемо и относятся к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК), или к комбинации ДНК или ее РНК, и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме. Термин "нуклеиновая кислота" включает, не ограничиваясь этим, ген, кДНК или мРНК. В одном из вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты является синтетической (например, химически синтезированной или искусственной) или рекомбинантной. Если конкретно не ограничивается, то термин охватывает молекулы, включающие аналоги или производные природных нуклеотидов, которые обладают аналогичными связывающими свойствами, как эталонная нуклеиновая кислота, и метаболизируются аналогично
встречающимся в природе или не встречающимся в природе нуклеотидам. Если не указано иное, то последовательность конкретной нуклеиновой кислоты также косвенным образом включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP, и комплементарные последовательности, а также точно указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов можно провести получением последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещается на остатки из смешанных оснований и/или дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991), Ohtsuka et al. , J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985) и Rossolini et al., Mol. Cell Probes 8: 91-98 (1994)).
Как здесь используется, термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями, или другими средствами, отличными от пептидных связей. Белок или пептид должен содержать, по меньшей мере, две аминокислоты, и никакое ограничение не установлено на максимальное количество аминокислот, которое может содержать последовательность белка или пептида. В одном из вариантов осуществления белок может содержать более одного, например, два, три, четыре, пять или более полипептидов, где каждый полипептид связан с другим посредством ковалентных или нековалентных связей/взаимодействий. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или другими средствами, отличными от пептидных связей. Как здесь используется, термин относится к коротким цепям, которые в данной области также обычно называются пептидами, олигопептидами и олигомерами, и к более длинным цепям, которые обычно в данной области называются белками, которых имеется много типов. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки и другие.
Как здесь используется, термин "продукт" относится к молекуле, нуклеиновой кислоте, полипептиду или любому его гибриду, который продуцируется, например, экспрессируется клеткой, которая была модифицирована или сконструирована для продукции продукта. В одном из вариантов осуществления продукт представляет собой встречающийся в природе продукт или не встречающийся в природе продукт, например синтетический продукт. В одном из вариантов осуществления часть продукта является природной, в то время как другая часть продукта является неприродной. В одном из вариантов осуществления продукт представляет полипептид, например, рекомбинантный полипептид. В одном из вариантов осуществления продукт подходит для применения для диагностики или доклинических исследований. В еще одном варианте осуществления продукт подходит для терапевтического применения, например, для лечения заболевания. В еще одном варианте осуществления продукт выбран из таблицы 1 или таблицы 2. В одном из вариантов осуществления модифицированные или сконструированные клетки содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, которая регулирует экспрессию или кодирует продукт. В еще одном варианте осуществления модифицированные или сконструированные клетки содержат другие молекулы, например, которые не являются нуклеиновыми кислотами, которые регулируют экспрессию или образование продукта в клетке.
В одном из вариантов осуществления модификация клетки включает введение экзогенной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая контролирует или изменяет, например, повышает экспрессию последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, например, эндогенного гена. В таких вариантах осуществления модифицированная клетка продуцирует эндогенный полипептидный продукт, который естественно или эндогенно экспрессируется клеткой, но модификация повышает продукцию продукта и/или улучшает качество продукта по сравнению с немодифицированной клеткой, например, по сравнению с эндогенной продукцией или качеством полипептида.
В еще одном варианте осуществления модификация клетки включает введение экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей
рекомбинантный полипептид, как здесь описано. В таких вариантах осуществления модифицированная клетка продуцирует рекомбинантный полипептидный продукт, который может быть природным или неприродным. В таких вариантах осуществления модифицированная клетка продуцирует рекомбинантный полипептидный продукт, который также может эндогенно экспрессироваться клеткой или нет. В вариантах осуществления, где рекомбинантный полипептидный продукт также эндогенно экспрессируется клеткой, то модификация повышает продукцию продукта и/или улучшает качество продукта по сравнению с немодифицированной клеткой, например, по сравнению с эндогенной продукцией или эндогенным качеством полипептида.
Как здесь используется, термин "рекомбинантный полипептид"
или "рекомбинантный белок" относится к полипептиду, который
может продуцироваться клеткой, описанной здесь. Рекомбинантный
полипептид представляет рекомбинантный полипептид, для которого,
по меньшей мере, один нуклеотид последовательности, кодирующей
полипептид, или, по меньшей мере, один нуклеотид
последовательности, которая регулирует экспрессию полипептида,
был получен с помощью генной инженерии (клетки или клетки-
предшественника) . Например, по меньшей мере, один нуклеотид был
изменен, например, он был введен в клетку или он является
продуктом перестройки методами генной инженерии. В одном из
вариантов осуществления последовательность рекомбинантного
полипептида не отличается от природной изоформы полипептида или
белка. В варианте осуществления аминокислотная
последовательность рекомбинантного полипептида отличается от последовательности встречающейся в природе изоформы полипептида или белка. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид и клетка происходят из одного и того же вида. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид является эндогенным по отношению к клетке, другими словами, клетка относится к первому виду, а рекомбинантный полипептид является "родным" для этого первого вида. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида является идентичной или существу идентичной, или отличается не более чем 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,
30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% от полипептида, кодированного эндогенным геномом клетки. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид и клетка относятся к разным видам, например, рекомбинантный полипептид представляет полипептид человека, а клетка является клеткой, отличной от клетки человека, например, клеткой грызуна, например, СНО, или клеткой насекомого. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид является экзогенным по отношению к клетке, другими словами, клетка относится к первому виду, а рекомбинантный полипептид относится ко второму виду. В одном из вариантов осуществления полипептид представляет собой синтетический полипептид. В одном из вариантов осуществления полипептид получен из источника, не встречающегося в природе. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид представляет человеческий полипептид или белок, который не отличается по аминокислотной последовательности от встречающейся в природе изоформы человеческого полипептида или белка. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид отличается от встречающейся в природе изоформы человеческого полипептида или белка не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 2 0 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид отличается от встречающейся в природе изоформы человеческого полипептида не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 или 15% от его аминокислотных остатков.
Как здесь используется, термины "получать" или "получение"
относятся к получению обладания физическим объектом или
показателем, например, числовым значением, путем
"непосредственного получения" или "опосредованного получения" физического объекта или показателя. "Непосредственное получение" означает осуществление способа (например, осуществление синтетического или аналитического способа) для получения образца или показателя. "Опосредованное получение" относится к получению физического объекта или показателя от другой стороны или источника (например, от лаборатории третьей стороны, которая непосредственно получила физический объект или показатель).
Непосредственное получение физического объекта включает осуществление способа, который включает физическое изменение физического вещества, например, исходного материала. Примеры изменения включают создание физического объекта из двух или более исходных веществ, разделение или фрагментацию вещества, выделение или очистку вещества, объединение двух или более отдельных объектов в смесь, проведение химической реакции, которая включает разрушение или образование ковалентной или не-ковалентной связи. Непосредственное получение показателя включает осуществление способа, который включает физическое изменение в образце или другом веществе, например, выполнение аналитического способа, который включает физическое изменение вещества, например, образца, аналита или реагента (иногда относится здесь к "физическому анализу"), выполнение аналитического способа, например, способа, который включает одно или более из следующего: выделение или очистку вещества, например, аналита или его фрагмента, или другого его производного из другого вещества; объединение аналита или его фрагмента, или другого его производного с другим веществом, например, буфером, растворителем или реагентом; или изменение структуры аналита или его фрагмента, или другого его производного, например, разрушением или образованием ковалентной или нековалентной связи между первым и вторым атомами аналита; или изменение структуры реагента или его фрагмента, или другого его производного, например, разрушением или образованием ковалентной или нековалентной связи между первым и вторым атомами реагента.
Как здесь используется, термин "получение образца" относится к получению владения образцом, например, образцом ткани или образцом нуклеиновой кислоты, посредством "непосредственного получения" или "опосредованного получения" образца. "Непосредственное получение образца" означает осуществление способа (например, осуществление физического способа, такого как хирургическая операция или экстракция) для получения образца. "Опосредованное получение образца" относится к получению образца от другой стороны или источника (например,
от лаборатории третьей стороны, которая непосредственно получила образец). Непосредственное получение образца включает осуществление способа, который включает физическое изменение физического вещества, например исходного материала, такого как ткань, например, ткань человека-пациента или ткань, которая ранее была выделена из организма пациента. Примеры изменения включают создание физического объекта из исходного материала, иссечение или очистку ткани; выделение или очистку вещества (например, образца ткани или образца нуклеиновой кислоты); объединение двух или более отдельных объектов в смесь; осуществление химической реакции, которая включает разрушение или образование ковалентной или нековалентной связи. Непосредственное получение образца включает осуществление способа, который включает физическое изменение в образце или другом веществе, например, как описано выше.
Как здесь используется, выражение "стадия последующей обработки" относится к любой стадии способа получения рекомбинантного полипептида, которая следует после/за выбранной стадии выделения, например, после/за выделением клеток из среды, содержащей рекомбинантный белковый продукт.
Как здесь используется, выражение "стадия предшествующей обработки" относится к любой стадии способа получения рекомбинантного полипептида, которая предшествует или находится до выбранной стадии выделения, например, до выделения рекомбинантного белкового продукта из среды, содержащей клетки.
Как здесь используется, термин "конечный продукт" относится к рекомбинантному полипептиду, по существу очищенному от других клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления конечный продукт представляет рекомбинантный полипептид, который формулируется для хранения, доставки и/или применения в качестве лекарственного средства.
Как здесь используется, термин "способ получения" относится к способу или серии стадий, которые продуцируют рекомбинантный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ получения представляет производственный способ, предназначенный для получения рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах
осуществления способ получения представляет способ очистки рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах осуществления способ получения дополнительно включает стадии оценки, стадии анализа и/или стадии определения на основе указанной оценки и анализа. В некоторых вариантах осуществления конечным продуктом способа получения является рекомбинантный полипептид, формулированный для применения в качестве лекарственного средства.
Раскрытие каждого патента, заявки на патент и публикации, цитируемых в настоящем документе, включено здесь посредством ссылки во всей их полноте. Несмотря на то, что настоящее изобретение раскрыто со ссылкой на конкретные аспекты, очевидно, что другие аспекты и варианты настоящего изобретения могут быть разработаны другими специалистами в данной области, не отступая от истинной сущности и объема изобретения. Прилагаемая формула изобретения должна толковаться как включающая все такие аспекты и эквивалентные варианты.
Общее описание способа
Способы, описанные здесь, можно охарактеризовать как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Специалистам в данной области известен общий метод ELISA и варианты ELISA. Ниже приводится общее описание способов, раскрытых здесь, только для иллюстрации временной последовательности стадий, входящих в способы. В любом случае раскрытие ни коем образом не должно ограничиваться или сводиться к данному описанию. Компоненты просто описаны для иллюстрации.
Агент для покрытия (например, анти-GS-CHO НСР-антитело) иммобилизуют на твердой подложке (например, на микротитрационном планшете). После того как агент для покрытия иммобилизован на твердой подложке, оставшиеся сайты связывания на твердой подложке блокируются с использованием блокирующего буфера (например, 0,2% казеин в lx DPBS). Блокирующий буфер содержит компонент, способный неспецифически связываться с твердой подложкой, с насыщением открытых сайтов связывания, тем самым предотвращая связывание свободного лиганда с любыми остаточными
сайтами на твердой подложке. Конкретные условия в отношении нанесения покрытия и периодов блокирования и инкубации выбираются для максимального покрытия твердой подложки; и варианты известны специалистам в данной области техники. После покрытия и блокирования твердой подложки стандарты и/или образцы (например, образцы, предназначенные для определения НСР) , подлежащие анализу, соответствующим образом разбавляют подходящим буфером для разведения (например, 0,2% казеин в 1х DPBS) и добавляют к иммобилизованной подложке. Конкретные условия в отношении периода инкубации стандарта/образца выбираются для обеспечения максимальной чувствительности анализа и сведения к минимуму диссоциации; вариации известны специалистам в данной области техники.
Любой неиммобилизованный стандарт/образец (например, НСР) удаляют, промыванием твердой подложки подходящим буфером для
промывания (например, 0,05% Твин(r) 20 в lx DPBS), подходящее число
раз (например, Зх с 300 мкл) . Конкретный буфер для промывания и
число промываний на любой стадии промывания выбирают для
сведения к минимуму фона и обеспечения максимальной
чувствительности; и вариации этих процедур известны специалистам
в данной области техники. Затем любой иммобилизованный
стандарт/образец можно детектировать опосредованно или
непосредственно. Для опосредованного детектирования антитело
(первичное антитело) к антигену, представляющему интерес, в
стандарте/образце (например, анти-GS-CHO НСР-антитело),
добавляют к твердой подложке; и выбирают условия инкубации для
обеспечения максимального усиления сигнала. Любое
неиммобилизованное антитело затем удаляют промыванием твердой подложки подходящим промывочным буфером в течение подходящего числа раз. Затем к твердой подложке добавляют антитело, конъюгированное с группой, которая детектируется определенным средством (детектирующим антитело) и способная связываться с иммобилизованным стандартом или НСР в образце. Затем любое несвязанное детектирующее антитело удаляют промыванием твердой подложки подходящим промывочным буфером в течение подходящего
числа раз. Уровень представляющего интерес антигена в стандарте/образце (например, НСР), связанного с агентом для покрытия, можно определить с использованием системы детектирования, совместимой с используемым детектирующим антителом. Специалисту в данной области техники известны подходящие средства детектирования.
В случае использования непосредственного детектирования
представляющего интерес антигена в стандарте/образце первичное
антитело конъюгируют с группой, которая детектируется
определенным средством и, таким образом, также является
детектирующим антителом, т. е. первичное антитело и
детектирующее антитело являются одинаковыми. Затем любое
несвязанное детектирующее антитело удаляют промыванием твердой
подложки подходящим промывочным буфером в течение подходящего
числа раз. Уровень представляющего интерес антигена в
стандарте/образце (например, НСР), связанного с агентом для
нанесения покрытия, можно определить с использованием системы
детектирования, совместимой с используемым
первичным/детектирующим антителом. Подходящая система
детектирования известна специалисту в данной области техники.
Результаты показывают, среди прочего, устойчивый, чувствительный анализ НСР на основе ELISA для поддержки многочисленных экспрессионных систем клеток-хозяев, включая, например, экспрессионную систему CH0K1SV и экспрессионную систему GS-CHO. Повышение чувствительности анализа ELISA составляет, по меньшей мере, примерно 4 0 раз, что выше чувствительности метода анализа НСР ELISA, в котором не используется поликлональное анти-НСР-антитело, очищенное как здесь описано. Во время очистки анти-НСР-антитела более 99% общих IgG не проявляли иммунного ответа на НСР и, следовательно, они были исключены из конечного анти-НСР-антитела. Поскольку отсутствуют точно согласованные стандарты количественного анализа в промышленности и регулировании, то чувствительность анализа НСР является анализом, специфичным для клеточной линии и способа. Способы, описанные здесь, можно использовать для создания устойчивого и чувствительного анализа НСР на основе
ELISA для любой рекомбинантной клетки-хозяина, включая, не ограничиваясь этим, например, клетки-хозяева млекопитающих (например, СНО, например, GS-CHO) , эукариотическую клетку-хозяин, прокариотическую клетку-хозяин, клетки насекомых. Кроме того, способы по изобретению можно использовать в сочетании с существующими регуляторными требованиями в отношении получения рекомбинантных белков.
В некоторых вариантах осуществления анализ НСР на основе ELISA по настоящему изобретению демонстрирует приемлемую точность, прецизионность и линейность для устойчивого и надежного детектирования НСР в диапазонах концентраций, составляющих 0,1-100, 0,5-100, 1-100, 1,5-100, 2-100, 2,5-100, 3-100, 0,1-90, 0,5-90, 1-90, 1,5-90, 2-90, 2,5-90, 3-90, 0,1-80, 0,5-80, 1-80, 1,5- 80, 2-80, 2,5-80, 3-80, 0,1-70, 0,5-70, 1-70, 1,5-70, 2-70, 2,5-70, 3-70, 0,1-60, 0,5-60, 1-60, 1,5-60, 2-60, 2,5-60 или 3-60 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления анализ НСР на основе ELISA демонстрирует приемлемую точность, прецизионность и линейность для устойчивого и надежного детектирования НСР в диапазоне концентраций, включающих от 2 до 60 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления анализ НСР на основе ELISA демонстрирует приемлемую точность, прецизионность и линейность для устойчивого и надежного детектирования НСР в диапазоне концентраций, включающих от 3 до 8 0 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления предел детектирования в анализе НСР ELISA по настоящему изобретению составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления предел детектирования в анализе НСР ELISA по настоящему изобретению составляет 0,5 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления предел детектирования в анализе НСР ELISA по настоящему изобретению составляет 2 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления предел количественного определения в анализе НСР ELISA по настоящему изобретению составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления предел детектирования в анализе НСР ELISA по настоящему изобретению составляет 3 нг/мл.
Анти-GS-CHO НСР-антитела
Способы, описанные здесь, могут обеспечить анти-GS-CHO НСР-антитело для определения НСР. Анти-GS-CHO НСР-антитела можно получить стандартными методами молекулярной биологии. Антитела могут происходить из любых видов. Антитела могут быть моноклональными или поликлональными, или представлять любую вариацию "антитела", описанную здесь. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет поликлональное антитело, полученное в организме овцы. Антитела могут быть непосредственно детектируемыми за счет присоединения детектируемой метки, например, химической модификацией, конъюгацией фермента, мечением флуоресцентным красителем, мечением люминесцентной меткой и т. д. Данные антитела также могут быть опосредованно детектируемыми, и в этом случае необходимо вторичное средство детектирования. Антитела с этими различными свойствами можно приобрести или приготовить стандартными методами молекулярной биологии.
Образцы
Образцы могут включать, не ограничиваясь этим, образцы, отобранные из культуры клеток в любой период во время продукции рекомбинантного белка, например, в любой точке во время предшествующей или последующей обработки. Например, образцы можно отобрать из культуры клеток (например, до выделения рекомбинантного белкового продукта). Образцы можно отобрать во время последующей обработки в способе получения, например, после выделения клеток из среды, содержащей рекомбинантный белковый продукт. Образец можно отобрать в любой и в нескольких точках во время способа очистки. Образец может включать образец конечного продукта. Следовательно, образцы могут включать продукты способа (до конечной получение состава) и конечные продукты (например, конечные формулированные продукты после всех стадий очистки). Твердая подложка
Твердые подложки могут включать любую поверхность, на которой можно иммобилизовать агент для покрытия, например анти-GS-CHO-HCP-антитело или его эквивалент. Твердые подложки,
используемые для иммобилизации, могут представлять любую инертную подложку или носитель, которые по существу нерастворимы в воде и пригодны для применения в иммунометрических анализах, включая подложки в виде, например, поверхностей, частиц, пористых матриксов и т.д. Примеры широко используемых подложек включают небольшие пластины, Сефадекс, поливинилхлорид, пластиковые гранулы и планшеты для анализа или пробирки, изготовленные из полиэтилена, полипропилена, полистирола и т.п., включая 9б-луночные микротитрационные планшеты, а также зернистые материалы, такие как фильтровальная бумага, агароза, сшитый декстран и другие полисахариды. Альтернативно, реакционноспособные нерастворимые в воде матрицы, такие как углеводы, активированные цианогенбромидом, подходящим образом применяются для иммобилизации реагента для покрытия. Иммобилизованный агент для покрытия можно нанести на микротитрационный планшет, например, на мультилуночный микротитрационный планшет, который можно использовать для анализа нескольких образцов одновременно. Поверхности твердых подложек также могут включать, не ограничиваясь этим, мембрану, например, нитроцеллюлозную мембрану, политетрафторэтиленовую мембрану, мембрану из ацетата целлюлозы, мембрану из нитрата целлюлозы, твердую поверхность, покрытую молекулами, содержащими гидрофобные группы, твердую поверхность, покрытую молекулами, содержащими гидрофильные группы. Поверхности твердых подложек могут находиться в форме микротитрационного планшета, например, полистиролового микротитрационного планшета, планшета для культивирования клеток или любого его варианта. Реагент захвата
Термин "реагент захвата" относится к антителу, которое прямо связывается с представляющим интерес антигеном (например, GS-CHO НСР) . Антитело захвата также может представлять детектирующее антитело с модификацией белка, например биотинилированием. Антитела можно получить от разных видов, включая, не ограничиваясь этим, человека, кролика, мышь, крысу, овцу, козу, курицу, человека, лошадь, собаку, кошку, хомяка, обезьяну, шимпанзе, представителей вида овец, представителей
семейства лошадиных, представителей семейства свиньи, представителей подсемейства быки, примата и т. д. В некоторых вариантах осуществления первичное антитело представляет анти-GS-CHO НСР-антитело, продуцированное в организме овцы и аффинно очищенное.
Детектирующий реагент
Термин "детектирующий реагент" или "реагент для детектирования" относится к меченому антителу, используемому для детектирования "антигена" или "антитела". Детектирующее антитело также может представлять первичное антитело. Антитела можно получить от разных видов, включая, не ограничиваясь этим, человека, кролика, мышь, крысу, овцу, козу, курицу, человека, лошадь, собаку, кошку, хомяка, обезьяну, шимпанзе, представителей вида овец, представителей семейства лошадиных, представителей семейства свиньи, представителей подсемейства быки, примата и т. д. Метка, используемая в детектирующем антителе, может представлять любую детектируемую функциональную группу, которая не мешает связыванию НСР с антителом. Примерами подходящих меток являются многочисленные метки, которые известны для применения в иммуноанализах, включая группы, которые могут непосредственно детектироваться, такие как флуорохромные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки, а также группы, такие как ферменты, которые для детектирования должны вступить в реакцию или дериватизироваться. Подходящие методы мечения, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь этим, мечение изотопом, химическую модификацию, конъюгацию ферментов, мечение флуоресцентным красителем, мечение люминесцентной меткой и другие методы мечения, известные специалистам в данной области техники.
В данной области известны коммерчески доступные антитела к
широкому ряду антигенов. Специалистам в данной области известно
о различных методах мечения антитела или другого агента для
детектирования. Методы мечения включают, не ограничиваясь этим,
применение фермента, такого как пероксидаза хрена (HRP),
щелочная фосфатаза (АР), бета-галактозидаза, глюкоамилаза,
лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидаза,
галактозооксидаза и глюкоза-б-фосфатдегидрогеназа,
гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза,
в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода
для окисления предшественника красителя, такого как HRP,
лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин,
биотин/стрептавидин, биотин/стрептавидин-|3-галактозидаза с MUG,
спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные
радикалы или другие ферменты, и тому подобное. Агент для
детектирования также можно пометить радиоактивными изотопами,
например, 1251 , 32Р, 14С, 3Н и 1311 или другим изотопом.
Флуоресцентные метки могут включать, не ограничиваясь этим,
флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или
флуоресцеин и его производные, родамин и его производные,
дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза
светлячков и бактериальная люцифераза (патент США № 4737456),
люциферин, (FITC), родамин, техасский красный, Alexa 488, Су5,
СуЗ, Alexa 610, 7-AAD, йодид пропидия, Су7, фикоэритрин и т. д.
Агент для детектирования можно пометить флуорохромом
(флуоресцентным красителем), который можно детектировать на
планшетном ридере для измерения флуоресценции, флуоресцентным
микроскопе, флуорометре, камере или сканере. Агент для
детектирования также можно пометить люмихромом, который может
детектироваться люминесцентными методами. Альтернативно, агент
для детектирования можно пометить биотином, который может
связываться с авидином или стрептавидином. Авидин или
стрептавидин можно использовать в качестве детектирующих
агентов, которые могут связываться с биотином,
биотинилированными антителами или биотинилированными
полипептидами.
Для ковалентного связывания этих меток с белками или полипептидами доступны подходящие методы. Например, для мечения антител описанными выше флуоресцентными, хемилюминесцентными и ферментными метками можно использовать агенты для сочетания, такие как диальдегиды, карбодиимиды, дималеимиды, бис-имидаты, бис-диазотированный бензидин и тому подобное. См., например,
патент США № 3940475 (флуориметрия) и патент США № 3465090 (ферменты); Hunter et al. Nature 144: 945 (1962); David et al. Biochemistry 13: 1014-1021 (1974); Pain et al. J. Immunol. Methods 40: 219-230 (1981); и Nygren J. Histochem. и Cytochem. 30: 407-412 (1982). Предпочтительными метками для настоящего изобретения являются флуоресцентные метки для повышения амплификации и чувствительности до 8 пг/мл, более предпочтительно биотин со стрептавидином-|3-галактозидазой и MUG для усиления сигнала.
Конъюгация такой метки, включая ферменты, с антителом является стандартной манипуляционной процедурой для специалиста с обычной квалификацией в области методов иммуноанализа. См., например, О'Sullivan et al. "Methods for the Preparation из Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay)), в Methods in Enzymology, ed. J. Langone и H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166. Системы детектирования
Термин "система детектирования" относится к средствам,
которые можно использовать для получения показаний, содержащих
информацию, относящуюся к количеству или относительному
количеству белка или агента в образце. Выбор системы
детектирования зависит от выбора используемого детектирующего
антитела. Например, если детектирующее антитело содержит
ферментную метку, где химическая реакция может привести к
развитию окраски или хемилюминесцентного сигнала, то система
детектирования может включать подходящий субстрат и любые
необходимые реагенты, связанные с химической реакцией, и
средства детектирования химической реакции, например, визуальный
осмотр, устройство, способное обнаруживать сигнал, например,
планшетный ридер для измерения оптической плотности, планшетный
ридер для измерения хемилюминесции, камера CCD и т. д.;
альтернативно, если детектирующее антитело содержит
флуоресцентную метку, то можно использовать флуоресцентный микроскоп, планшетный ридер для измерения флуоресценции, флуоресцентный сортер клеток, флуоресцентный сканер, камеру и т.
д.; альтернативно, если детектирующее антитело помечено изотопом, то можно использовать рентгеновскую пленку или другой материал, чувствительный к изотопу.
Специалистам в данной области известно о различных системах детектирования, пригодных для использования. Такие системы детектирования могут включать, например, системы детектирования с использованием хромогенных реакций репортерных ферментов, таких как пероксидаза хрена (HRP) или щелочная фосфатаза (АР) или тому подобное. Для репортерных ферментов можно использовать разные субстраты для хромогенного детектирования, например, для HRP может использоваться 4 CN(4-хлор-1-нафтол), DAB/N1CI2 (3,3'-диаминобензидин/ЫлХЗ-г) или ТМВ в качестве субстратов для хромогенного детектирования. Флуоресцентные метки включают, не ограничиваясь этим, флуоресцин изотиоцинат (FITC), родамин, техасский красный, Alexa 488, Су5, СуЗ, Alexa 610, 7-AAD, йодид пропидия, Су7, фикоэритрин и т. д. Для остановки реакции детектирования можно использовать различные и соответствующие останавливающие агенты. Конкретный используемый останавливающий агент будет зависеть от используемого агента для детектирования и будет известен специалисту в данной области техники. Например, можно использовать 1 М серную кислоту в качестве останавливающего субстрата для систем детектирования с использованием фермента пероксидазы хрена.
Блокирующие буферы
Можно использовать блокирующие буферы, применяемые для блокирования любых оставшихся сайтов связывания на твердой подложке после инкубации с агентом для покрытия. Примеры блокирующих буферов включают, не ограничиваясь этим, казеин, например, казеин в lx PBS, 0,1-1% казеин в lx PBS, 0,1-0,5% казеин в lx PBS, 0,2% казеин в lx PBS; BSA, например, BSA в 1х PBS, например, 1% BSA в lx PBS, 1-10% BSA в lx PBS, 1-20% BSA в lx PBS, 1-50% BSA в lx PBS; обезжиренное молоко, рыбий желатин или другой химический реагент. Любой из реагентов, описанных выше, или другой подходящий химический реагент можно развести в любом подходящем буфере, например забуференном фосфатом
физиологическом растворе (PBS) или трис-буферном солевом растворе (TBS).
Буферы для промывания можно использовать для удаления несвязанных компонентов на разных стадиях. Примеры буферов для промывания включают, не ограничиваясь этим, казеин, например, казеин в lx PBS, 0,1-1% казеин в lx PBS, 0,1-0,5% казеин в 1х PBS, 0,2% казеин в lx PBS; BSA, например, BSA в lx PBS, например, 1% BSA в lx PBS, 1-10% BSA в lx PBS, 1-20% BSA в lx PBS, 1-50% BSA в lx PBS; BSA в lx PBS, содержащем Твин(r) 20, например BSA в lx PBS, содержащем 0,05% Твин(r) 20, 1% BSA в lx PBS, содержащем 0,05% Твин(r) 20, 1% BSA в lx PBS, содержащем 0,05-1% Твин(r) 20; Твин(r) 20, например, Твин(r) 20 в lx PBS, например 0,05% Твин(r) 20 в lx PBS; обезжиренное молоко, казеин, рыбий желатин или другой химический реагент. Буферы для промывания могут включать любое из следующего: BSA, обезжиренное молоко, казеин, рыбий желатин или другой химический агент в растворе с Тритоном X 100 или Твином(r) 2 0 или тому подобное. Эти растворы можно развести в любом подходящем буфере, включая, не ограничиваясь этим, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), трис-буферный солевой раствор (TBS).
Стадии промывания можно выполнить многократно, и их число будет зависеть от используемого буфера для промывания. Например, стадии промывания можно повторить один раз, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти раз за данный период промывания. Специалист в данной области может определить число необходимых стадий промывания с учетом используемого буфера для промывания и других экспериментальных условий.
Буферы, используемые для разведения любых стандартов, образцов, антител или детектирующих агентов, известны специалистам в данной области, и могут включать, не ограничиваясь этим, казеин, например казеин в lx PBS, 0,1-1% казеин в lx PBS, 0,1-0,5% казеин в lx PBS, 0,2% казеин в lx PBS; BSA, например, BSA в lx PBS, например, 1% BSA в lx PBS, 1-10% BSA
в lx PBS, 1-20% BSA в lx PBS, 1-50% BSA в lx PBS; обезжиренное молоко, казеин, рыбий желатин или другой химический реагент. В некоторых случаях буфер, используемый для разведения любых стандартов, образцов, антител или агентов для детектирования, будет тем же самым агентом, который используется в качестве блокирующего буфера.
Периоды времени инкубации и температуры
Специалисты в данной области техники могут определить
соответствующие периоды инкубации для различных стадий. Период
времени для конкретной стадии инкубации может быть изменен за
счет изменения температуры на стадии инкубации, и также
изменение времени на стадии инкубации может потребовать
изменения температуры на стадии инкубации. Стадию покрытия можно
проводить, например, в течение ночи при или примерно 4°С, в
течение ночи при или примерно 2-10°С, 4 ч при или примерно
примерно 37°С, 2-4 ч при или примерно 37°С, 1-4 ч при или
примерно 37°С, 4 ч при или примерно 32°С, 2-4 ч при или примерно
примерно 32°С, 1-4 ч при или примерно примерно 32°С. Стадию
блокирования можно проводить, например, в течение 1 ч при или
примерно 32°С; 1-2 ч при или примерно 32°С; в течение ночи при
или примерно 4°С. Стадию инкубации стандарта/образца можно
проводить, например, в течение 2 ч при или примерно 32°С; 1-2 ч
при или примерно 32°С; в течение ночи при температуре примерно
4°С. Стадию инкубации первичного антитела или
первичного/детектирующего антитела можно проводить, например, в течение 1 ч при или примерно 32°С; 1-2 ч при или примерно 32°С; в течение ночи при или примерно 4°С. Период инкубации и температура для любой системы детектирования будут зависеть от конкретного используемого детектирующего антитела, и эти параметры известны специалистам в данной области.
Наборы
Наборы, содержащие один или более компонентов, пригодных для осуществления способов, описанных в настоящем документе, могут включать, не ограничиваясь этим, любые необходимые
компоненты, реагенты или материалы, необходимые для осуществления способов, описанных в настоящем документе, и/или инструкции для осуществления способов, описанных в настоящем документе. Набор может необязательно включать любые дополнительные агенты для промывания, контейнеры для инкубации, поверхности твердых подложек и тому подобное для осуществления способов, описанных в настоящем документе.
Набор может включать твердую подложку для агентов для покрытия, которые могут быть обеспечены в виде отдельного элемента или на которых уже были иммобилизованы покрывающие агенты. Следовательно, агент для покрытия в наборе может быть иммобилизован на твердой подложке, или он может быть иммобилизован на такой подложке, которая входит в набор или обеспечивается отдельно от набора. Покрывающие агенты можно нанести на микротитрационый планшет. Первичное антитело может быть немеченным или меченным. Первичное антитело может быть меченным и также представлять детектирующее антитело. Когда метка представляет собой фермент, то набор может включать субстраты и кофакторы, необходимые для фермента, и где метка представляет собой флуорофор, то набор может включать предшественник красителя, который обеспечивает детектируемый хромофор. Набор также может содержать инструкции для проведения анализа и/или эталонный стандарт, а также другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы для промывания и проведения инкубации и тому подобное.
Продукты и нуклеиновые кислоты, кодирующие их Настоящее изобретение обеспечивает способы идентификации, селекции или получения клетки или клеточной линии, способной продуцировать продукт. Продукты, охватываемые настоящим изобретением, включают, не ограничиваясь этим, молекулы, нуклеиновые кислоты, полипептиды (например, рекомбинантные полипептиды) или их гибриды, которые могут продуцироваться, например, в клетке. В некоторых вариантах осуществления клетки сконструированы методами генной инженерии или модифицированы для продукции продукта. Такие модификации включают введение молекул, которые регулируют или обеспечивают получение продукта.
Например, клетку модифицируют введением экзогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, например, рекомбинантный полипептид, и клетку культивируют в условиях, подходящих для продукции, например, экспрессии и секреции полипептида, например, рекомбинантного полипептида. В еще одном примере клетку модифицируют введением экзогенной нуклеиновой кислоты, которая регулирует, например, повышает экспрессию полипептида, который эндогенно экспрессируется клеткой, так что в результате клетка продуцирует более высокий уровень или количество полипептида, чем уровень или количество полипептида, которое продуцируется эндогенно, например, в немодифицированной клетке.
В вариантах осуществления клетка или клеточная линия, идентифицированная, селектированная или полученная способами, описанными здесь, продуцирует продукт, например, рекомбинантный полипептид, пригодный в лечении патологического состояния, расстройства или заболевания. Примеры заболеваний, расстройств или заболеваний включают, не ограничиваясь этим, метаболическое заболевание или расстройство (например, недостаточность метаболических ферментов), эндокринные заболевания (например, гормональные нарушения), гемостаз, тромбоз, гемопоэтические болезни, заболевания легких, заболевания органов желудочно-кишечного тракта, иммунорегуляцию (например, иммунодефицит), бесплодие, трансплантацию, рак и инфекционные заболевания.
В некоторых вариантах осуществления продукт представляет
собой экзогенный белок, например, белок, который естественным
образом не экспрессируется клеткой. Продукт может представлять
терапевтический белок или диагностический белок, например,
пригодный для скрининга лекарственных препаратов.
Терапевтический или диагностический белок может представлять молекулу антитела, например, антитело или фрагмент антитела, слитый белок, гормон, цитокин, фактор роста, фермент, гликопротеин, липопротеин, репортерный белок, терапевтический пептид, или структурный и/или функциональный фрагмент или гибрид любого из них.
В одном из вариантов осуществления продукт, например, рекомбинантный полипептид, представляет молекулу антитела.
Продукты, охватываемые настоящим изобретением, включают молекулы диагностических и терапевтических антител. Молекула диагностического антитела включает антитело, например, моноклональное антитело или его фрагмент антитела, пригодный для методов визуализации. Молекула терапевтического антитела подходит для введения субъектам, например, для лечения или профилактики заболевания или расстройства.
Молекула антитела представляет белок или полипептидную последовательность, полученную из молекулы иммуноглобулина, которая специфически связывается с антигеном. В одном из вариантов осуществления молекула антитела представляет полноразмерное антитело или фрагмент антитела. Антитела и мультиформатные белки могут быть поликлональными или моноклональными, многоцепочечными или одноцепочечными, или интактными иммуноглобулинами, и могут быть получены из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут представлять тетрамеры молекул иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. Антитело может быть человеческим или гуманизированным антителом. В одном из вариантов осуществления антитело представляет IgA, IgG, IgD или IgE антитело. В одном из вариантов осуществления антитело представляет IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 антитело.
"Фрагмент антитела" относится, по меньшей мере, к одной части интактного антитела или его рекомбинантным вариантам, и относится к антигенсвязывающему участку, например, к определяющей антиген вариабельной области интактного антитела, что является достаточным для обеспечения распознавания и специфического связывания фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь этим, Fab-, Fab'-, F(ab')2~ и Fv-фрагменты, scFv-фрагменты антитела, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (VL или VH) , верблюжьи VHH-домены и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, таких как бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной
области, и выделенные CDR или другие эпитопсвязывающие фрагменты антитела. Антигенсвязывающий участок также может быть включен в однодоменные антитела, макситела, минитела, наночастицы, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 11261136, 2005). Антигенсвязывающие фрагменты также могут пересажены на каркасы на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны минитела на основе полипептида фибронектина).
Иллюстративные продукты, например, полипептиды, например, рекомбинантные полипептиды, полученные в способах или клетках, описанных в настоящем документе, представлены в таблицах ниже.
(rIFN-P)
Интерферон-ylb (IFN У)
Алдеслейкин (интерлейкин 2(IL2), эпидермальный фактор активации тимоцитов; ETAF
Палифермин (фактор роста кератиноцитов; KGF)
Бекаплемин (тромбоцитарный фактор роста; PDGF) Анакинра (антагонист рекомбинатного IL1)
Anril, Kineret
Молекулы антител
Бевацизумаб (VEGFA
Avastin
mAb)
Erbitux
Цетуксимаб (EGFR
Vectibix
mAb)
Campath
Панитумумаб (EGFR
Rituxan
mAb)
Herceptin
Алемтузумаб (CD52
Orencia
mAb)
Humira
Ритуксимаб (CD2 0
Enbrel
химерное АЬ)
Remicade
Трастузумаб(HER2/Neu
Amevive
mAb)
Raptiva
Абатацепт (слитый
Tysabri
белок CTLA Ab/Fc)
Soliris
Адалимумаб (TNFot
Orthoclone, 0KT3
mAb)
Этанерцепт (слитый
белок TNF
рецептор/Fc)
Инфликсимаб (TNFot
химерное mAb)
Алефацепт (CD2
слитый белок)
Эфализумаб (CDlla
mAb)
Натализумаб
(интегрин а4
субъединица mAb)
Экулизумаб (C5mAb)
MypoMOHa6-CD3
Другие: слитые
белки/белковые вакцины/пептиды
Инсулин Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) вакцина от HPV OspA
Анти-резусн(Rh)
иммуноглобулин G
Энфувиртид
Белки шелковичных
коконов, например,
фибрион
Humulin, Novolin
Engerix, Recombivax HB
Gardasil
LYMErix
Rhophylac
Fuzeon
QMONOS
В еще одном варианте осуществления продукт представляет биспецифическую молекулу. Биспецифические молекулы, как здесь описано, включают молекулы, которые могут связываться с двумя или более разными антигенами или мишенями. В одном из вариантов осуществления биспецифическая молекула включает фрагменты антитела. В одном из вариантов осуществления биспецифическая молекула включает биспецифическое антитело, биспецифическое антитело на основе слитого белка или конъюгат биспецифического антитела, биспецифические активаторы Т-клеток (BiTE), перенацеливающие молекулы с двойной аффинностью (DART), Fab с двойным действием (DAF), наночастицу или другое расположение фрагментов антител, в результате чего молекула обладает способностью распознавать или связываться с двумя различными антигенами.
MEDI 565 (AMG 211, Medlmmune, Amgen)
BiTE
CD3, CEA
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I
Аденокарцинома органов желудочно-кишечного тракта
R06958688 (Roche)
BsAb
CD3, CEA
BAY2010112 (AMG 212, Bayer; Amgen)
BiTE
CD3, PSMA
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I
Рак
предстательной железы
MGD006 (Macrogenics )
DART
CD3,
CD123
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I
AML
MGD007 (Macrogenics )
DART
CD3, дрАЗЗ
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I
Колоректальный рак
MGD011 (Macrogenics )
DART
CD19, CD3
SCORPION (Emergent Biosolutions , Trubion)
BsAb
CD3, CD19
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
AFM11 (Affimed Therapeutics )
TandAb
CD3, CD19
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I
NHL и ALL
AFM12
(Affimed Therapeutics
TandAb
CD19, CD16
Перенацеливание NK-клеток в опухоль
AFM13
(Affimed Therapeutics
TandAb
CD30, CD16A
Перенацеливание NK-клеток в опухоль
Фаза II
Лимфома Ходжкина
GD2 (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute)
Т-клетки, предварительн о нагруженные BsAb
CD3, GD2
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I/II
Нейробластома и остеосаркома
pGD2
(Barbara Ann Karmanos Cancer Institute)
T-клетки, предварительн о нагруженные BsAb
CD3, Нег2
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза II
Метастатический рак молочной железы
EGFRBi-нагруженные аутологичные активированы ые T-клетки (Roger Williams Medical Center)
T-клетки, предварительн о нагруженные BsAb
CD3, EGFR
Аутологичные активированные T-клетки к EGFR-положительной опухоли
Фаза I
Рак легких и другие солидные опухоли
Анти-EGFR-нагруженные активированы ые Т-клетки (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute)
T-клетки, предварительн о нагруженные BsAb
CD3, EGFR
Аутологичные активированные T-клетки к EGFR-положительной опухоль
Фаза I
Рак ободочной
кишки и поджелудочной железы
rM2 8
(University Hospital Tubingen)
Тандемная молекула scFv
CD2 8, MAPG
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза II
Метастатическая меланома
IMCgplOO
(Immunocore)
ImmTAC
CD3, пептид
мне
Перенацеливание Т-клеток в опухоль
Фаза I/II
Метастатическая меланома
DT2219ARL (NCI,
University из
Minnesota)
2 молекулы
scFv, связанные с дифтерийным токсином
CD19, CD22
Нацеливание белка токсина на опухоль
Фаза I
В-клеточный лейкоз или лимфома
XmAb5871 (Xencor)
BsAb
CD19, CD32b
N1-1701 (Novlmmune)
BsAb
CD47, CD19
MM-111 (Merrimack)
BsAb
ErbB2, ЕгЬВЗ
MM-141 (Merrimack)
BsAb
IGF-IR, ЕгЬВЗ
Данные отсутствуют (Merus)
BsAb
HER2, HER3
Данные отсутствуют (Merus)
BsAb
CD3, CLEC12A
Данные отсутствуют (Merus)
BsAb
EGFR, HER3
Данные отсутствуют (Merus)
BsAb
PD1, не раскрыт
Данные отсутствуют (Merus)
BsAb
CD3, не раскрыт
Дулиготузума б
(MEHD7945A, Genentech, Roche)
DAF
EGFR, HER3
Блокирование 2 рецепторов, ADCC
Фаза I и II Фаза II
Злокачественные опухоли головы
и шеи Колоректальный рак
LY3164530 (Eli Lily)
He раскрыт
EGFR, MET
Блокирование 2 рецепторов
Фаза I
Распространенны
й или метастатический рак
ММ-111 (Merrimack Pharmaceutic als)
Антитело к HSA
HER2, HER3
Блокирование 2 рецепторов
Фаза II Фаза I
Рак желудка и
пищевода Рак молочной железы
MM-141, (Merrimack Pharmaceutic als)
IgG-scFv
IGF-1R, HER3
Блокирование 2 рецепторов
Фаза I
Солидные опухоли на поздних стадиях
RG7221 (RO5520985, Roche)
CrossMab
Ang2, VEGF А
Блокирование 2 проангиогенных факторов
Фаза I
Солидные опухоли
RG7716 (Roche)
CrossMab
Ang2, VEGF А
Блокирование 2 проангиогенных факторов
Фаза I
Влажная форма AMD
OMP-305B83 (OncoMed)
BsAb
DLL4/VEGF
TF2
(Immunomedic s)
Док и замок
CEA, HSG
Преднацеливающая обработка опухоли для проведения ПЭТ или
радионуклидной визуализации
Фаза II
Колоректальный
рак, рак молочной железы и легких
ABT-981 (AbbVie)
DVD-Ig
IL-la, IL-ip
Блокирование 2 провоспалительны х цитокинов
Фаза II
Остеоартрит
ABT-122 (AbbVie)
DVD-Ig
TNF, IL-
17A
Блокирование 2 провоспалительны х цитокинов
Фаза II
Ревматоидный артрит
COVA322
IgG-финомер
TNF, IL17A
Блокирование 2 провоспалительны х цитокинов
Фаза I/II
Бляшечный псориаз
SAR156597 (SanM3i)
Тетравалентны й
биспецифическ ий тандемный IgG
IL-13, IL-4
Блокирование 2 провоспалительны х цитокинов
Фаза I
Идиопатический фиброз легких
GSK2434735 (GSK)
Домен с двойной нацеленностью
IL-13, IL-4
Блокирование 2 провоспалительны х цитокинов
Фаза I
(Здоровые добровольцы)
Озорализумаб (ATN103, Ablynx)
Нанотело
TNF, HSA
Блокирование провоспалительно
го цитокина,
связывается с HSA с повышением периода
полураспада
Фаза II
Ревматоидный артрит
ALX-0761 (Merck Serono, Ablynx)
Нанотело
IL-17A/F, HSA
Блокирование провоспалительно
го цитокина,
связывается с HSA с повышением периода
полураспада
Фаза I
(Здоровые добровольцы)
белки включают, не ограничиваясь этим, любой белок, приведенный в таблицах 1-10 в публикации Leader et al., "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7: 21-39 (включенной здесь порседством ссылки); или любой конъюгат, вариант, аналог или функциональный фрагмент рекомбинантных полипептидов, описанных в настоящем документе.
Другие рекомбинантные продукты включают каркасные белки, отличные от антител, или альтернативные каркасные белки, такие как, не ограничиваясь этим: дарпины, аффитела и аднектины. Такие каркасные белки, отличные от антител, или альтернативные каркасные белки, могут быть сконструированы для распознавания или связывания с одной или двумя, или более, например, 1, 2, 3, 4 или 5 или более различными мишенями или антигенами.
Также настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновые
кислоты, например, экзогенные нуклеиновые кислоты, которые
кодируют продукты, например, полипептиды, например,
рекомбинантные полипептиды, описанные здесь. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие желаемые рекомбинантные полипептиды, могут быть получены с использованием рекомбинантных методов, известных в данной области, например, таких как скрининг библиотек из клеток, экспрессирующих желаемую последовательность нуклеиновой кислоты, например, гена, получение последовательности нуклеиновой кислоты из вектора, который, как известно, включает то же самое, или выделение
непосредственно из клеток и тканей, содержащих их, с использованием стандартных методов. Альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид, может быть получена синтетически, а не клонирована. Методы и технологии рекомбинантной ДНК являются хорошо разработанными и хорошо известными в данной области. Следовательно, специалист с обычной квалификацией в данной области, имеющий информацию об аминокислотной последовательности рекомбинантного полипептида, описанного здесь, может легко представить или получить последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует рекомбинантный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления экзогенная нуклеиновая
кислота регулирует экспрессию продукта, который эндогенно
экспрессируется клеткой-хозяином. В таких вариантах
осуществления экзогенная нуклеиновая кислота содержит одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, которые повышают экспрессию эндогенного продукта (также относящихся здесь к "последовательностям трансактивации эндогенного продукта"). Например, последовательность нуклеиновой кислоты, которая повышает экспрессию эндогенного продукта, содержит конститутивно активный промотор или промотор, который является более сильным, например, повышает транскрипцию в желаемом сайте, например, повышает экспрессию гена желаемого эндогенного продукта. После введения экзогенной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность трансактивации эндогенного продукта, указанная экзогенная нуклеиновая кислота интегрируется в хромосомный геном клетки, например, в предварительно выбранный участок, ближайший к геномной последовательности, кодирующей эндогенный продукт, так что последовательность трансактивации эндогенного продукта увеличивает трансактивацию или экспрессию желаемого эндогенного продукта. Другие способы модификации клетки, например, введение экзогенной нуклеиновой кислоты для увеличения экспрессии эндогенного продукта, описаны, например, в патенте США № 5277071; который включен посредством ссылки в его полном объеме.
Экспрессия продукта, описанного здесь, обычно достигается операбельным связыванием нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид или его фрагмент, с промотором и включением конструкции в экспрессионный вектор. Векторы могут быть пригодны для репликации и интеграции в эукариоты или прокариоты. Типичные клонирующие векторы содержат другие регуляторные элементы, такие как терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, пригодные для регуляции экспрессии желаемой последовательности нуклеиновой кислоты.
Последовательности нуклеиновой кислоты, описанные здесь, кодирующие продукт, например, рекомбинантный полипептид, или содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая может регулировать экспрессию эндогенного продукта, можно клонировать в несколько типов векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включающий, не ограничиваясь этим, плазмиду, фагемид, производное фага, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессионные векторы, реплицирующиеся векторы, векторы для генерации зондов и векторы для секвенирования. В вариантах осуществления экспрессионный вектор может быть обеспечен клетке в виде вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области и описана, например, в руководстве Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, том 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY) , а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые пригодны в качестве векторов, включают, не ограничиваясь этим, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В общем, подходящий вектор содержит ориджин репликации, функциональный, по меньшей мере, в одном организме, промоторную последовательность, сайты для соответствующих рестриктаз и один или более селектируемых маркеров (например, WO 01/96584, WO 01/29058 и патент США № 6326193). Векторы, полученные из вирусов, являются подходящими инструментами для достижения стабильного переноса генов, поскольку они
обеспечивают долговременную стабильную интеграцию трансгена и его репликацию в дочерних клетках.
Вектор также может включать, например, сигнальную последовательность для обеспечения секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена гормона роста крупного рогатого скота (BGH)), элемент, обеспечивающий эписомальную репликацию и репликацию в прокариотах (например, ориджин SV4 0 и ColEl или другие известные в данной области техники) и/или элементы, которые обеспечивают селекцию, например, селектируемый маркер или репортерный ген.
В одном из вариантов осуществления вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, например, рекомбинантный полипептид, дополнительно содержит промоторную последовательность, ответственную за рекрутинг полимераз, для обеспечения инициации транскрипции для экспрессии полипептида, например, рекомбинантного полипептида. В одном из вариантов осуществления промоторные последовательности, подходящие для способов, описанных в настоящем документе, обычно ассоциируются с энхансерами для обеспечения высокой степени транскрипции и, следовательно, доставки больших количеств копий экзогенной мРНК-мишени. В одном из вариантов осуществления промотор включает основной немедленный ранний промотор цитомегаловируса (СМА) (Xia, Bringmann et al. , 2006) и промотор SV40 (Chernajovsky, Могу et al. 1984), оба полученные из названий их вирусов или промоторы, полученные из них. Несколько других, менее распространенных вирусных промоторов были успешно использованы для регуляции транскрипции при включении в экспрессионный вектор, включая длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса (RSV-LTR) и вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV) LTR (Papadakis, Nicklin et al., 2004) . В еще одном варианте осуществления конкретные эндогенные промоторы млекопитающих могут использоваться для регуляции конститутивной транскрипции представляющего интерес гена (Pontiller, Gross et al., 2008). Промотор гена фактора элонгации 1-альфа (CHEFla) СНО китайского хомячка является высокоэффективной альтернативой для вирусных
последовательностей (Deer, Allison 2004). В дополнение к промоторам векторы, описанные здесь, дополнительно содержат энхансерную область, как описано выше; область специфического нуклеотидного мотива, ближайшую к основному промотору, которая может обеспечивать повышающую регуляцию транскрипционных факторов, чтобы активировать скорость транскрипции (Riethoven 2 010). Аналогично промоторным последовательностям, данные области часто происходят из вирусов и находятся внутри промоторной последовательности, такой как энхансерные последовательности hCMV и SV4 0, или дополнительно могут быть включены последовательности, полученные из аденовирусов
(Gaillet, Gilbert et al., 2007).
В одном из вариантов осуществления вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую продукт, например, полипептид, например, рекомбинантный полипептид, описанный здесь, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует селектируемый маркер. В одном из вариантов осуществления селектируемый маркер включает глутаминсинтетазу (GS); дигидрофолатредуктазу (DHFR), например, фермент, который придает резистентность к метотрексату (МТХ); или антибиотический маркер, например, фермент, который придает резистентность к антибиотику, такому как гигромицин, неомицин
(G418), зеоцин, пуромицин или бластицидин. В еще одном варианте осуществления селектируемый маркер содержит или совместим с системой селекции Selexis (например, SUREtechnology Platform(tm) и Selexis Genetic Elements(tm), коммерчески доступные от Selexis SA) или системой селекции Catalant.
В одном из вариантов осуществления вектор, содержащий
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую
рекомбинантный продукт, описанный здесь, содержит селектируемый маркер, который пригоден для идентификации клетки или клеток, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный продукт, описанный здесь. В еще одном варианте осуществления селектируемый маркер пригоден для идентификации клетки или клеток, которые включают интеграцию последовательности
нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный продукт, в геном, как здесь описано. Идентификация клетки или клеток, которые интегрировали последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок, может быть пригодна для селекции и получения клетки или клеточной линии, которая стабильно экспрессирует продукт.
Подходящие векторы для использования являются коммерчески
доступными и включают векторы, связанные с экспрессионными
системами GS Expression System(tm), GS Xceed(tm) Gene Expression
System или технологией Potelligent(r) CH0K1SV, доступной от Lonza
Biologies, Inc., например, векторы, описанные в публикации Fan
et al. , Pharm. Bioprocess. (2013); 1(5) :487-502, которая
включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее
полноте. Экспрессионные векторы GS содержат ген GS или его
функциональный фрагмент (например, мини-ген GS) и одну или
более, например, 1, 2 или 3 или более высокоэффективных
транскрипционных кассет для экспрессии гена, например,
нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид,
описанный здесь. Мини-ген GS состоит, например, из интрона б
геномного гена СНО GS. В одном из вариантов осуществления вектор
GS содержит ген GS, операбельно связанный с промотором SV4 0L, и
одну или две поли(А)-сигнальных последовательности. В еще одном
варианте осуществления вектор GS содержит ген GS, операбельно
связанный с промотором SV4 0E, сайт сплайсинга SV4 0 и сигналы
полиаденилирования. В таких вариантах осуществления
транскрипционная кассета, например, для экспрессии
представляющего интерес гена или рекомбинантного полипептида, описанного здесь, включает промотор hCMV-MIE и 5'-нетранслируемые последовательности из гена hCMV-MIE, включая первый интрон. Можно сконструировать другие векторы на основе экспрессионных векторов GS, например, где другие селектируемые маркеры замещаются на ген GS в экспрессионных векторах, описанных в настоящем документе.
Векторы, подходящие для применения в способах, описанных в настоящем документе, включают, не ограничиваясь этим, другие
коммерчески доступные векторы, такие как pcDNA3.1/Zeo, pcDNA3.1/САТ, рсГМАЗ.3T0P0 (Thermo Fisher, ранее Invitrogen); pTarget, HaloTag (Promega); pUC57 (GenScript); pFLAG-CMV (Sigma-Aldrich); pCMV6 (Origene); pEE12 или pEE14 (Lonza Biologies), или pBK-CMV/pCMV-3Tag-7/pCMV-Tag2B (Stratagene). Клетки и клеточные линии
В вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего. В еще одних вариантах осуществления клетка представляет клетку, отличную от клетки млекопитающего. В варианте осуществления клетка представляет клетку мыши, крысы, китайского хомяка, сирийского хомяка, обезьяны, человекообразной обезьяны, собаки, лошади, хорька или кошки. В вариантах осуществления клетка представляет клетку млекопитающего, например, клетку человека или клетку грызуна, например, клетку хомяка, клетку мыши или клетку крысы. В еще одном варианте осуществления клетка представляет клетку утки, попугая, рыбы, насекомого, растения, гриба или дрожжей. В одном из вариантов осуществления клетка является клеткой Archaebacteria. В одном из вариантов осуществления клетка является клеткой вида Actinobacteria.
В одном из вариантов осуществления клетка представляет клетку яичника китайского хомячка (СНО). В одном из вариантов осуществления клетка представляет клетку СН0-К1, клетку СН0-К1 SV, клетку DG44 СНО, клетку DUXB11CH0, CHOS, клетку СНО с нокаутом гена GS, клетку СНО FUT8 с нокаутом гена GS, CHOZN или клетку, полученную из СНО. Клетку СНО с нокаутом гена GS (например, клетка GSKO) представляет, например, клетку CH0-K1SV с нокаутом гена GS (Lonza Biologies, Inc.). Клетка с нокаутом СНО FUT8 представляет, например, Potelligent(r) СН0К1 SV (Lonza Biologies, Inc.).
В одном из вариантов осуществления клетка представляет клетку яичника китайского хомячка (СНО). В одном из вариантов осуществления клетка представляет клетку СН0-К1, клетку СН0-К1 SV, клетку CHO-GSKO, клетку CHOXceed. Клетка СНО с нокаутом гена GS (например, клетка GS-CHO) представляет, например, клетку СНО-
K1SV с нокаутом гена GS (Lonza Biologies, Inc.). Клетка с нокаутом СНО FUT8 представляет, например, Potelligent(r) СН0К1 SV (Lonza Biologies, Inc.).
В еще одном варианте осуществления клетка представляет клетки HeLa, НЕК293, НТ1080, Н9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, РС12, PER.C6, ВНК (клетки почки новорожденного хомяка), VERO, SP2/0, NSO, YB2/0, Y0, ЕВ66, С127, L cell, COS, например, C0S1 и C0S7, QC1-3, СН0К1, CH0K1SV, Potelligent CH0K1SV, клетку СНО с нокаутом гена GS, CH0K1SV GS-KO, CHOS, СНО DG44, СНО DXB11 и CHOZN, или любые клетки, полученные из них. В одном из вариантов осуществления клетка представляет стволовую клетку. В одном из вариантов осуществления клетка представляет дифференцированную форму любой из клеток, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка представляет клетку, полученную из любой первичной клетки в культуре.
В одном из вариантов осуществления клетка представляет
любую из клеток, описанных в настоящем документе, которая
включает экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую
рекомбинантный полипептид, например, экспрессирует
рекомбинантный полипептид, например, рекомбинантный полипептид, выбранный из таблицы 1 или 2.
В одном из вариантов осуществления культивирование клеток осуществляют в виде периодической культуры, подпитываемой культуры, отъемно-доливной культуры или непрерывной культуры. В одном из вариантов осуществления клеточная культура представляет собой суспензионную культуру. В одном из вариантов осуществления клетку или клеточную культуру помещают in vivo для экспрессии рекомбинантного полипептида, например, помещенные в организм модели или организм человека.
В одном варианте культуральная среда не содержит сыворотки. Бессывороточные и безбелковые среды коммерчески доступны, например, от Lonza Biologies.
Подходящие среды и методы культивирования клеточных линий млекопитающих хорошо известны в данной области, описаны, например, в патенте США № 5633162. Примерами стандартных сред
для культивирования клеток в лабораторной колбе или культивирования клеток с низкой плотностью, адаптированными к потребностям конкретных типов клеток, являются, например, среда 164 0 среда Мемориального института Розуэлла Парк (RPMI) (Могге G., The Journal из the American Medical Association, 199, p. 519, 1967), среда L-15 (Leibovitz, A. et al. , Amer J. из Hygiene, 78, lp. 173 ff, 1963), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), минимальная эссенциальная среда (MEM), среда Ham's F12 (Ham, R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 и 1965) среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков, без альбумина, трансферрина и лецитина (Iscoves et al., J. Exp. Med., 1, p. 923 ff., 1978) . Например, среда Хэма F10 или F12 была специально разработана для культивирования клеток СНО. Другие среды, специально адаптированные для культивирования клеток СНО, описаны в ЕР-481 791. Известно, что такие культуральные среды могут быть дополнены фетальной бычьей сывороткой (FBS, также называемой фетальной телячьей сывороткой FCS), которая обеспечивает естественный источник большого количества гормонов и факторов роста. Культивирование клеток млекопитающих в настоящее время является обычной процедурой, хорошо описанной в научных пособиях и руководствах, она подробно освещена, например, в R. Ian Fresney, Culture из Animal cells, a manual, 4th edition, Wiley-Liss/N.Y., 2000.
Другие подходящие методы культивирования известны специалистам в данной области и могут зависеть от продукта рекомбинантного полипептида и используемой клетки-хозяина. Специалист с обычной квалификацией в данной области может определить или оптимизировать условия, подходящие для экспрессии и продукции рекомбинантного полипептида, который будет экспрессироваться клеткой.
В одном из аспектов клетка или клеточная линия содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует продукт, например, рекомбинантный полипептид. В одном из вариантов осуществления клетка или клеточная линия экспрессирует продукт, например, терапевтический или диагностический продукт. Способы
генетической модификации или генной инженерии клетки для экспрессии желаемого полипептида или белка хорошо известны в данной области и включают, например, трансфекцию, трансдукцию (например, вирусную трансдукцию) или электропорацию.
Физические способы введения нуклеиновой кислоты, например, экзогенной нуклеиновой кислоты или вектора, описанных в настоящем документе, в клетку-хозяина, включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и тому подобное. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области. См., например, руководство Sambrook et al. , 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, том 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY).
Химические средства для введения нуклеиновой кислоты, например, экзогенной нуклеиновой кислоты или вектора, описанных в настоящем документе, в клетку-хозяин, включают коллоидно-дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Примером коллоидной системы для применения в качестве носителя для доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). В данной области имеются другие способы направленной доставки нуклеиновых кислот, такие как доставка полинуклеотидов с нацеленными наночастицами или другая подходящая система доставки субмикронного размера.
В вариантах осуществления желательна интеграция экзогенной нуклеиновой кислоты в нуклеиновую кислоту клетки-хозяина, например, геном или хромосомную нуклеиновую кислоту клетки-хозяина. Способы определения того, имела ли место интеграция экзогенной нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина, могут включать метод селекции GS/MSX. В методе селекции GS/MSX используется комплементация ауксотрофии по глутамину рекомбинантным геном GS для селекции высокой экспрессии белков из клеток. Вкратце, метод селекции GS/MSX включает интродукцию нуклеиновой кислоты, кодирующей глутаминсинтетазу, в вектор, содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую продукт
рекомбинантный полипептид. Введение метионинсульфоксимина (MSX) обеспечивает селекцию клеток, которые стабильно интегрируют в геном экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую как рекомбинантный полипептид, так и GS. Поскольку GS может эндогенно экспрессироваться некоторыми клетками-хозяевами, например, клетками СНО, то концентрация и продолжительность селекции с помощью MSX могут быть оптимизированы для идентификации высокопродуцирующих клеток с устойчивой интеграцией экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептидный продукт, в геном хозяина. Селекция GS и системы на ее основе также описаны в публикации Fan et al., Pharm. Bioprocess. (2013); 1(5) :487-502, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте.
Другие способы идентификации и селекции клеток, которые стабильно интегрировали экзогенную нуклеиновую кислоту в геном клетки-хозяина, могут включать, не ограничиваясь этим, включение репортерного гена в экзогенную нуклеиновую кислоту и оценку наличия репортерного гена в клетке, и ПЦР-анализ и деетктирование экзогенной нуклеиновой кислоты.
В одном из вариантов осуществления клетки, отобранные, идентифицированные или полученные с использованием способов, описанных в настоящем документе, способны продуцировать более высокие выходы белкового продукта, чем клетки, которые отобраны с использованием только метода селекции на стабильную экспрессию, например, интеграцию экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид. В одном из вариантов осуществления клетки, селектированные, идентифицированные или полученные с использованием способов, описанных в настоящем документе, продуцируют в 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или в 10 раз или больше продукта, например, рекомбинантного полипептида, по сравнению с клетками, которые не контактировали с ингибитором деградации белка, или клетками, которые были отобраны только на стабильную экспрессию, например, на интеграцию экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид.
Способы получения клеточной линии и рекомбинантного полипептида
Современный уровень в области систем селекции клеток млекопитающих и микроорганизмов основан на применении селективного давления на уровне транскрипции ДНК в РНК. Ген, представляющий интерес, тесно связан с селектируемым маркером, что обеспечивает высокий уровень экспрессии селектируемого маркера, что может привести к высокой экспрессии гена, представляющего интерес. Клетки, которые экспрессируют селектируемый маркер на высоком уровне, способны выживать и пролиферировать, а клетки, которые не способны к такой экспрессии, выживают и пролиферируют с меньшей вероятностью, например, в результате апоптоза и/или гибели. При этом популяция клеток может быть обогащена клетками, экспрессирующими селектируемый маркер, и, следовательно, представляющий интерес ген на высоких уровнях. Данный способ оказался очень успешным для экспрессии простых белков.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к
способам получения клеток или клеточной линии для продукции
продукта, например, рекомбинантного полипептида. В еще одном
аспекте изобретение относится к способам продукции продукта,
например, рекомбинантного полипептида, описанного здесь, с
использованием клетки, которая идентифицирована,
классифицирована, селектирована или получена с использованием способов, описанных в настоящем документе. Любой из вышеуказанных способов включает оценку, идентификацию, классификацию или селекцию клетки, как здесь описано, например, приведение в контакт клетки с ингибитором деградации белка, для идентификации или получения клетки, которая обладает способностью к высокой продукции продукта, например, рекомбинантного полипептида. Способы, описанные здесь, повышают продукцию, например экспрессию и/или секрецию рекомбинантного полипептида.
Не желая связываться с теорией, полагается, что клетки, способные к более высокой продуктивности, менее восприимчивы к ингибиторам деградации белка, и, следовательно, полагается, что приведение в контакт клеток с ингибитором деградации белка, включающим экзогенную нуклеиновую кислоту, описанную здесь,
приводит к селекции клетки, способной к более высокой продуктивности.
В некоторых вариантах осуществления могут быть выполнены
дополнительные стадии для повышения экспрессии продукта,
например, транскрипции, трансляции и/или секреции продукта, или
улучшения качества продукта, например, правильного фолдинга
и/или точности первичной последовательности. Такие
дополнительные стадии включают введение агента, который повышает экспрессию продукта или улучшает качество продукта. В одном из вариантов осуществления агент, который повышает экспрессию продукта или улучшает качество продукта, может представлять собой небольшую молекулу, полипептид или нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, которые улучшают фолдинг белка, например, шаперон. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота включает ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, микроРНК или IncPHK. В одном из вариантов осуществления агент, который помогает в фолдинге белка, содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует шаперон, например, BiP, PD1 или ER01 (Chakravarthi & Bulleid 2004; Borth et al. , 2005; Davis et al., 2000). Другие дополнительные стадии для повышения выхода и улучшения качества продукта включают сверхэкспрессию транскрипционных факторов, таких как SBP1 и ATF6 (Tigges & Fussenegger 2006, Cain et al., 2013, Ku et al. , 2008) и лектин-связывающие шапероны, такие как кальнексин и кальретинулин (Chung et al. , 2004) . Сверхэкспрессия агентов, которые помогают или улучшают фолдинг белка, а также улучшают качество продукта и выход белков, описанных в настоящем документе, может быть достигнута введением экзогенных нуклеиновых кислот, кодирующих белки. В еще одном варианте осуществления агент, который повышает экспрессию продукта или улучшает качество продукта, представляет небольшую молекулу, которая может быть внесена в культуру клеток для повышения экспрессии продукта или улучшения качества продукта. В одном из вариантов осуществления культура клеток при более низкой температуре, например, на 1°С, 2°С, 3°С,
4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или на 10°С ниже, чем температура, при которой обычно растут клетки.
Любой из способов, описанных в настоящем документе, может дополнительно включать дополнительные стадии селекции для идентификации клеток, которые имеют высокую продуктивность или обеспечивают продукцию продуктов высокого качества. Например, селекцию FACS можно использовать для селекции и выделения специфических клеток с желаемыми характеристиками, например, с более высокой экспрессией белков белкового фолдинга, например, шаперонов; или повышенной экспрессией продукта.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам, которые включают стадию выделения или извлечения рекомбинантного полипептидного продукта. В вариантах осуществления, где рекомбинантный полипептид секретируется из клетки, то способы могут включать стадию извлечения, сбора или выделения рекомбинантного полипептида из клетки, клеточной популяции или культуральной среды, в которой культивировали клетки. В вариантах осуществления, где рекомбинантный полипептид находится внутри клетки, то очистка рекомбинантного полипептидного продукта включает отделение рекомбинантного полипептида, продуцированного клеткой, от любого одного или более из следующего: белков клетки-хозяина, нуклеиновых кислот клетки-хозяина, липидов клетки-хозяина и/или другого дебриса из клетки-хозяина.
В вариантах осуществления способ, описанный здесь, обеспечивает по существу чистый белковый продукт. Как здесь используется, термин "по существу чистый" означает практически не содержащий пирогенных веществ, по существу не содержащий нуклеиновых кислот, и/или по существу не содержащий эндогенных клеточных белков-ферментов и компонентов из клетки-хозяина, таких как полимеразы, рибосомальные белки и шапероны. По существу чистый белковый продукт содержит, например, менее 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2 или 1% загрязняющего эндогенного белка, нуклеиновой кислоты или другой макромолекулы из клетки-хозяина.
Способы выделения и очистки продукта, например,
рекомбинантного полипептида, хорошо известны в данной области.
Для выделения рекомбинантного полипептидного продукта используют
физический или химический или физико-химический метод.
Физический или химический или физико-химический способ может
представлять метод фильтрации, метод центрифугирования, метод
ультрацентрифугирования, метод экстракции, метод лиофилизации,
метод осаждения, метод кристаллизации, хроматографический метод
или комбинацию двух или более методов. В одном из вариантов
осуществления хроматографический метод включает одно или более
из эксклюзионной хроматографии (или гель-фильтрации),
ионообменной хроматографии, например, анионообменную или
катионообменную хроматографию, аффинной хроматографии,
хроматографии гидрофобного взаимодействия и/или мультимодальной хроматографии.
Примеры
Далее изобретение будет подробно описано со ссылкой на следующие экспериментальные примеры. Данные примеры приведены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, изобретение никоим образом не должно истолковываться как ограниченное следующими примерами, а скорее должно истолковываться как охватывающее любой вариант и все варианты, которые становятся очевидными за счет приведенной здесь идеи.
Без дальнейшего описания полагается, что специалист в данной области техники может, используя предшествующее описание и следующие иллюстративные примеры, может получить и использовать соединения по настоящему изобретению и применить на практике заявленные способы. Следующие рабочие примеры конкретно указывают на различные аспекты настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие каким-либо образом остальную часть раскрытия.
Пример 1: получение поликлонального антитела к белку клетки-хозяина GS-CHO
Способы, описанные в данном примере, относятся к получению поликлонального антитела к белку клетки-хозяина GS-CHO (НСР).
Антитело использовали для экспериментов с ELISA, описанных в примере 2.
Продукция анти-GS-CHO НСО-антител
Трех овец иммунизировали НСР из нулевой клеточной линии GS-CHO (т. е. клеток CH0-K1SV, трансфектированных пустым вектором GS) . НСР, используемые в качестве антигена, получали из клеточного экстракта (СЕ) или клеточного супернатанта (SN). Антиген готовили в соответствии со стандартными методами (например, см. "Фармакопею США" (USP), в которой публикуются все указания по официальной процедуре анализа и рекомендации. В статье <1132> Фармакопеи США описано "Измерение остаточного белка клетки-хозяина в биофармацевтических препаратах" (второе дополнение к USP 38-NF 33, 7647-7667), опубликованной в декабре 2015 г.).
Овечью антисыворотку собирали на разные сроки отбора крови. Полученную овечью антисыворотку использовали для аффинной очистки анти-GS СНО НСР-антител.
Очистка анти-GS-CHO НСР-антител
Способ очистки состоял из аффинной хроматографии MabSelect
SuRe (MSS), концентрирования/диафильтрации, аффинной
хроматографии на активированном цианогенбромидом (CNBr) сорбенте и конечной стадии диафильтрации. Уникально, что настоящий иллюстративный способ сочетает хроматографию на основе протеина А и на CNBr-активированном сорбенте в двустадийной аффинной очистке. Данная двустадийная аффинная очистка удаляла большую часть неспецифических IgG (т. е. IgG, которые не связываются с НСР). В современных способах очистки используют антитело к НСР из смеси IgG необработанной антисыворотки (т. е. без очистки) или общую фракцию IgG, которая содержит примерно 99% неспецифических IgG.
Проводили два раунда очистки, 1 и 2 раунды, в одинаковых условиях. Способ очистки тестировали и подтверждали в 1 раунде очистки с 18 00 мл овечьей антисыворотки. Аффинно очищенные анти-GS-CHO НСР-антитела тестировали с помощью ELISA, SDS-PAGE, вестерн-блоттинга и 2D SDS-PAGE на их иммунное покрытие против GS-CHO НСР. При очистке во 2 раунде, который начинался с 8 000 мл
антисыворотки, проводили повторную проточную загрузку для обеспечения максимальной продукции анти-GS-CHO НСР-антител при очистке MSS и CNBr.
Титр IgG в необработанной овечьей антисыворотке определяли с помощью РгА ВЭЖХ, и выход со стадии MSS составлял 96,33% при очистке в 1 раунде и 122,8 6% при очистке во 2 раунде для антисыворотки овец, которые были иммунизированы экстрактами нулевых клеток GS-CHO (несоответствие выхода выше 100% было вызвано использованием разного метода концентрирования белка). В общей сложности элюировали 10,315 мг IgG при очистке в 1 раунде и 60,518 мг IgG при очистке во 2 раунде MSS-хроматографией. MSS-элюированные IgG были предназначены для использования на следующей стадии очистки на CNBr-активированном сорбенте после концентрирования и диафильтрации. В CNBr-хроматографии смолу CNBr сочетали с экстрактами клеток GS-CHO и использовали для аффинной очистки анти-GS-CHO НСР-антител от СЕ MSS IgG. Выделяли 39,6 мг анти-НСР-антител с выходом 0,37% при очистке в 1 раунде, и 361,2 мг анти-НСР-антител с выходом 0,62% получали при очистке во 2 раунде. Анти-GS-CHO НСР-антитела, полученные в 1 раунде очистки, тестировали на иммунное покрытие с помощью 2DE вестерн-блоттинга. Покрытие против экстракта нулевой клеточной линии GS-CHO составляло 72% и 82% против клеточного экстракта из клеточной линии с нокаутом GS на основе подсчета пятен.
Анти-GS-CHO НСР-антитела, полученные в 1 и 2 раундах очистки, объединяли с получением однородного препарата анти-GS-СНО-НСР-антитела. Было получено общее количество 391 мг антитела, определенное анализом оптической плотности А280, с общим суммарным выходом 0,65% для всего способа очистки. Конечное анти-GS-CHO НСР-антитело тестировали на иммунное покрытие с помощью 2DE вестерн-блоттинга. Покрытие против экстракта нулевой клеточной линии GS-CHO составляло 77% против клеточного экстракта из клеточной линии GS-CHO на основе общего подсчета пятен и 71% на основе сравнения пятен.
Иллюстративный способ очистки, описанный в данном примере, показан на фиг. 1. Конечное анти-GS-CHO НСР-антитело использовали в ELISA, описанном в примере 2. Конечное антитело
также биотинилировали для использования в ELISA, описанном в примере 2.
Пример 2: ELISA для анализа GS-CHO НСР
Способы, приведенные в данном примере, относятся к ELISA сэндвич-типа, разработанным для детектирования и количественного определения GS-CHO НСР. Условия анализа ELISA были оптимизированы для высокой производительности по сравнению с имеющимися современными методами (см., например, пример 3).
ELISA оптимизировали с помощью аффинно очищенного анти-GS-CHO НСР-антитела, описанного в примере 1. Планшет для постановки ELISA покрывали 100 мкл раствора анти-GS-CHO НСР-антитела с титром 2 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере на лунку и инкубировали при 5±3°С в течение ночи (18+2 ч). Покрытый планшет трижды промывали 300 мкл промывочного буфера (0,05% Твин 20 в 1х DPBS) с последующим добавлением 300 мкл блокирующего буфера (0,2% казеин в lx DPBS) на лунку и инкубировали в течение 60+5 мин при 23+2°С со встряхиванием со скоростью 300+50 об/мин. Девять стандартов (от 80 нг/мл до 0,31 нг/мл) готовили методом серийных разведений 1 к 2 стандарта GS-CHO НСР с использованием блокирующего буфера. Примерная схема разведения приведена в таблице 3.
Образец разбавляли блокирующим буфером в заранее определенных разведениях, например, в разведении 1 к 5, разведении 1 к 10 и т. д. Планшет трижды промывали 300 мкл буфера для промывания (0,05% Твин 20 в lx DPBS). 100 мкл приготовленных образцов и образцы вносили в лунку в трех повторностях. Затем планшет инкубировали в течение 90+5 мин при 23+2°С при встряхивании со скоростью 300+50 об/мин. Планшет трижды промывали 300 мкл буфера для промывания (0,05% Твин 20 в lx DPBS) и вносили 100 мкл биотинилированного SG-CH0 НСР антитела в концентрации 2 мкг/мл, разведенного в блокирующем буфере на лунку. Планшет инкубировали в течение 60+5 мин при 2 3+2°С при встряхивании со скоростью 300+50 об/мин. Планшет промывали три раза 300 мкл буфера для промывания (0,05% Твин 20 в lx DPBS) и вносили 100 мкл стрептавидин-HRP в разведении 1 к 100000 в блокирующем буфере на лунку. Планшет инкубировали в течение 60+5 мин при 23+2°С при встряхивании со скоростью 300+50 об/мин. Планшет промывали три раза 300 мкл буфера для промывания (0,05% Твин 20 в lx DPBS) и вносили 100 мкл ТМВ 1С на лунку. Планшет инкубировали в течение 10+1 мин при 2 3+2°С при встряхивании со скоростью 300+50 об/мин. После инкубации реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора (2,5 М серной кислоты, хранящегося при комнатной температуре) на лунку. Планшет анализировали на планшетном ридере при длине волны 4 50 нм с волной сравнения 630 нм. Данные анализировали SoftMax Pro (Ver 5.4.3), и строили стандартную кривую с использованием 4-параметрической логистической модели.
Пример 3: оценка анализа GS-CHO НСР в ELISA
В следующем примере представлена оценка анализа GS-CHO НСР в ELISA сэндвич-типа, описанного в примере 2. Результаты оценки приведены ниже.
Соответственно, пять очищенных балк-продуктов GS-CHO, три технологических продукта GS-CHO и конечную формуляцию в буфере, тестировали для оценки анализа GS-CHO НСР ELISA. Данные испытуемые образцы были репрезентативными для образцов продукта для анализа GS-CHO НСР ELISA. Продукты GS-CHO разбавляли с использованием серийных разведений 1 к 2 и тестировали в ELISA, описанном в примере 2. Испытывали пять концентраций добавления аналита, 1, 2, 5, 10 и 20 нг/мл, в разведениях продукта. Степень извлечения аналита использовали для характеристики анализа для каждого продукта.
Тестировали пять очищенных балк-продуктов (BDS Mab DV, МаЬ ВМ, продукт А15, Mab DU и Mab DH) и три технологических образца (MSS элюаты Mab CZ, Mab ВМ, Mab) и конечную формуляцию Mab ВМ в буфере. Определяли точность, прецизионность, линейность, рабочий диапазон, предел детектирования, предел количественного определения и специфичность, и результаты описаны ниже.
Точность
Точность ELISA определяли по степени извлечения всех пяти концентраций добавленного аналита. Точность для концентраций добавленного аналита 5, 10 и 20 нг/мл была в пределах приемлемой степени извлечения от 75% до 125%. Для концентрации 2 нг/мл большинство разведений продуктов имели приемлемую степень извлечения в пределах от 75% до 125%. Высокие концентрации эндогенного НСР оказывали влияние на точность определения при добавлении аналита в концентрации 2 нг/мл. Общая точность определения добавленного аналита при 1 нг/мл расценивалась как неприемлемая за счет влияния высокого эндогенного уровня НСР.
Продукты GS-CHO, BDS MAb DV, MAb ВМ, MAb DU и MAb DH тестировали в трех разведениях каждый конечным способом на основе ELISA. Все результаты по степени извлечения добавленного аналита при 2, 5, 10 и 20 нг/мл (п=38) были в пределах от 75 до 125%. В 5 из 38 случаев степень извлечения добавленного аналита при 1 нг/мл выходила за рамки приемлемого показателя.
Рассчитывали степень извлечения для пяти различных концентраций аналита, и точность способа оценивали по степени извлечения добавленного аналита. Точность анализа расценивали как приемлемую, если в общем средняя процентная степень извлечения для каждой концентрации добавленного НСР составляла от 75 до 125%. Для концентраций добавленного НСР 5, 10 и 20 нг/мл общая степень извлечения для всех четырех тестированных продуктов BDS с тремя различными разведениями составляла от 75 до 125%, и раценивалась как приемлемая. Концентрация эндогенного НСР варьировала от 1,395 нг/мл до 24,044 нг/мл.
Для концентрации добавленного НСР, равной 2 нг/мл, степень извлечения аналита для всех четырех тестированных продуктов BDS с двумя разными разведениями, за исключением низкого разведения продуктов BDS (например, разведение 1 в 2 (1 к 2) в BDS MAb DV) , составляло от 75% до 125%, и была приемлемой. Концентрация эндогенного НСР в разведении продукта BDS с неприемлемой степенью извлечения варьировала от 13,467 нг/мл до 24,044 нг/мл. Концентрация эндогенного НСР в разведении продукта BDS с приемлемой степенью извлечения добавленного аналита колебалась от 1,395 нг/мл до 4,536 нг/мл.
Для концентрации добавленного НСР 1 нг/мл степень извлечения для четырех испытуемых продуктов BDS в различных разведениях составляла от 75% до 125%, и была расценена как приемлемая. Концентрация эндогенного НСР в них варьировала в пределах от 1,395 нг/мл до 4,536 нг/мл. Степень извлечения для самых низких разведений продуктов BDS, например, разведения 1 в 2 (1 к 2) для MAb DV, MAb DU, MAb ВМ и разведения 1 в 32 (1 к 32) для MAb DH, находилась в диапазоне от 75% до 125%. Концентрация эндогенного НСР в разведении продукта BDS с неприемлемой степенью извлечения колебалась от 13,467 нг/мл до 24,044 нг/мл.
По данным определения степени извлечения добавленного аналита и концентрации добавленного аналита был сделан вывод о том, что высокая концентрация эндогенного НСР, присутствующая в тестированном образце, оказывала отрицательное влияние на надежность измерения степени извлечения при низкой концентрации
аналита, например, 1 нг/мл или 2 нг/мл. Следовательно, в общем точность была определена как приемлемая. Прецизионность
Анализ НСР в четырех продуктах GS-CHO BDS (очищенные балк-продукты) оценивали на прецизионность в условиях повторяемости и внутрилабораторную прецизионность. Значения как прецизионности в условиях повторяемости, так и внутрилабораторной прецизионности были ниже 2 0% CV. Прецизионность в условиях повторяемости для концентрации НСР в продукте GS-CHO находилась на верхней границе приемлемого диапазона, равного 20% CV. Прецизионность дополнительно анализировали измерением НСР по контролям внутри методики и контролю с добавленным аналитом во время всей оценки. Прецизионность в условиях повторяемости и внутрилабораторная прецизионность составляли менее 15% CV для высоких и низких контролей внутри методики (IAC). Для контролей с добавлением концентраций 1, 2, 5, 10 и 20 нг/мл прецизионность в условиях повторяемости и внутрилабораторная прецизионность были ниже 15% CV.
Определяли прецизионность в условиях повторяемости (внутри методики анализа) и внутрилабораторную прецизионность для измерения концентрации НСР в продуктах GS-CHO BDS для каждой из шести концентраций эндогенного НСР в продуктах BDS. Концентрацию эндогенного НСР в каждом продукте BDS рассчитывали по образцу без добавления аналита в каждом измерении с учетом коэффициента разбавления. Для каждого анализа НСР определяли в трех разных разведениях каждого продукта. Рассчитывали прецизионность в условиях повторяемости в % CV и внутрилабораторную прецизионность в % CV для концентрации НСР в каждом продукте. Прецизионность в условиях повторяемости % CV для всех четырех продуктов GS-CHO BDS варьировалась в пределах от 10,7% до 15,0%. Прецизионность в условиях повторяемости % CV была приемлемой по сравнению с установленным целевым значением <20%. Следует отметить, что прецизионность в условиях повторяемости рассчитывали по результатам всех разведений. Внутрилабораторная прецизионность в % CV для всех четырех продуктов GS-CHO BDS
варьировала от 7,5% до 16,2% (п=18), что считалось приемлемым по сравнению с установленным целевым значением < 20%. Линейность
Линейность является важным параметром анализа, который показывает, что аналитический ответ пропорционален концентрации аналита в тестируемом образце, за счет чего ответ образца можно интерпретировать непосредственно по калибровочной кривой зависимости доза-ответ. Линейность анализа GS-CHO НСР в ELISA оценивали измерением НСР в продуктах GS-CHO с пятью концентрациями добавленного НСР. Значение линейности (г2) варьировалось от 0,984 до 1,000 в каждом анализе определения точности и четырех тестированных продуктов GS-CHO НСР.
Рабочий диапазон
Рабочий диапазон стандартной кривой анализа GS-CHO НСР ELISA был определен как диапазон от 2 нг/мл до 8 0 нг/мл с приемлемой точностью. Рабочий диапазон также тестировали и подтверждали измерением НСР для продуктов GS-CHO BDS.
Предел детектирования
Предел детектирования (LOD) GS-CHO НСР ELISA определяли как равный 0,9 нг/мл, что было самым высоким LOD, рассчитанным по стандартной кривой во всех б анализах с 41 планшетом для четырех продуктов GS-CO BDS. LOD каждого анализа (планшета) рассчитывали по концентрации НСР, полученной по стандартной кривой, со средней оптической плотностью холостого контроля (0 нг/мл стандарта) плюс 2,5-кратное стандартное отклонение, которое обеспечивало достоверно разный сигнал. Самое высокое значение LOD из всех тестированных планшетов составляло 0,875 нг/мл, которое округлили до 0,9 нг/мл. 0,9 нг/мл определяли как LOD для анализа GS-CO BDS в ELISA.
Предел количественного определения
Предел количественного определения (LOQ) анализа GS-CHO НСР в ELISA определяли как равный 2 нг/мл. Предел количественного определения (LOQ) GS-CHO НСР ELISA определяли сочетанием приемлемых обратно рассчитанных стандартов и приемлемой точности для тестированных продуктов GS-CHO. Самый низкий стандарт GS-CHO
НСР в ELISA с приемлемым обратным расчетом (%RE <15%) и прецизионностью в условиях повторяемости (% CV <2 0%) составлял 1,25 нг/мл. Значения LOQ для каждого продукта с приемлемой степенью извлечения (от 75% до 125%, по меньшей мере, в трех из шести измерений) приведены в таблице 12. Значение LOQ для современных стандартов СНО НСР ELISA составляет примерно 200 нг/мл.
Специфичность
Специфичность анализа GS-CHO НСР в ELISA тестировали против примесей белка А и ДНК СНО, которые могли бы выделены вместе с СНР в процессе очистки. Специфичность % как для белка А, так и для ДНК СНО находилась в пределах от 97% до 103%. Перекрестная реактивность в % была ниже 1% как для белка А, так и ДНК СНО. На основании результатов оценки специфичности можно предположить, что никакой потенциальной отрицательной или положительной погрешности от присутствия белка А и ДНК СНО не наблюдали в GS-CHO НСР ELISA при измерении НСР в продуктах антител.
Таким образом, иллюстративные результаты, описанные здесь, демонстрируют устойчивый, чувствительный анализ НСР на основе ELISA для поддержки многочисленных систем экспрессии, включая, например, системы экспрессии млекопитающих, например, систему экспрессии CHOK1SV. Поликлональное антитело к НСР, полученное в организме овец, аффинно очищали, и иммунное покрытие антитела
против клеточного экстракта ложно-трансфицированных нулевых клеток составлял 71%, что было определено сравнением пятен в двумерном (2D) вестерн-блоттинге. Концентрация антитела, буферная система и система детектирования были оптимизированы во время разработки ELISA для высокого иммунного покрытия и LOQ.
Конечный устойчивый и чувствительный метода анализа НСР ELISA оценивали в соответствии с указаниями Международного совета по гармонизации технических требований для регистрации фармацевтических продуктов, предназначенных для человека (ICH) Q2 (R1). Параметры анализа НСР ELISA оценивали по заранее определенным критериям. Точность, прецизионность внутри методики, внутрилабораторная прецизионность и линейность теоретической концентрации НСР против измеренной концентрации НСР были приемлемыми. Рабочий диапазон данного анализа ELISA был определен как равный от 2 нг/мл до 8 0 нг/мл. LOQ, предел количественного определения НСР ELISA, определяли как равный 2 нг/мл с приемлемой степенью извлечения добавленного аналита на основе нескольких очищенных балк-продуктов. Также было доказано, что специфичность для белка А и ДНК СНО, которые являются основными источниками загрязняющих примесей, вместе с НСР, также является приемлемой.
Анализ НСР ELISA может служить в качестве аналитической основы для контроля примеси НСР во время процесса биоочистки и конечного нерасфасованного лекарственного препарата. Анализ может также служить для валидации и выпуска партий продуктов, полученных в экспрессионной системе GS-CHO. Кроме того, способы, описанные здесь, могут использоваться в сочетании с нормативными требованиями в отношении получения рекомбинантных белков; поскольку в рекомендациях ICH Q6B 6.2 указано, что для детектирования ряда НСР, которые могут присутствовать в биологических продуктах, необходимо использовать подходящий чувствительный иммуноанализ.
Стабильность
Реагенты GS-CHO НСР ELISA, в частности, аналит НСР, тестировали на стабильность в отношении температуры хранения, времени хранения и замораживания-оттаивания. Стабильность GS-CHO
НСР в образцах MAb или дополнительных GS-CHO НСР, внесенных в образцы MAb, оценивали на различных временных точках после закладки на хранение при 5±3°С или -65°С или ниже. Результаты указывали на нестабильность НСР и возможную деградацию при обоих значениях температуры в течение периода хранения от t=0 суток до t=l суток, но в данном случае стабильность НСР сохранялась в период хранения от t=l сутки до t=85 суток. Для двух из трех образцов MAb, где в образец не добавляли никакого дополнительного НСР, изменения в НСР были ниже или равны 3 0% при обоих значениях температурах хранения и были приемлемыми. Результаты данного исследования показали, что эндогенный НСР, присутствующий в образце MAb, был стабильным при хранении до 8 5
суток при 5±3°С или -65°С или ниже. Был сделан вывод о том, что
температура хранения -65°С или ниже для анализа НСР пригодна для испытания образцов очищенных балк-продуктов, и образцы могут храниться до 85 суток при -65°С или ниже. Устойчивость
Для демонстрации того, что небольшое изменение в методике подготовки образца не оказывает влияния на эффективность способа, оценивали устойчивость при изменении условий анализа, времени инкубации, температуры инкубации и срока хранения реагента.
Устойчивость при изменении условий анализа определяли, внесением контрольных образцов внутри методики (IAC), включающих образец с высокой концентрацией пг/мл или образец с низкой концентрацией пг/мл, в лунки планшета для постановки ELISA, и затем через 5 мин, внесением второго набора IAC в планшет ELISA, и оценкой различий в IAC. Добавление образцов в разное время в ELISA НСР не влияло на точность или прецизионность результатов анализа, все результаты находились в пределах обычной вариабельности анализа, и ELISA НСР был определен в качестве устойчивого во времени (до 5 мин), необходимого для добавления образцов в планшет ELISA.
Устойчивость в зависимости от времени инкубации исследовали, внесением двух образцов MAb и IAC, включающих
образец с высокой концентрацией пг/мл или образец с низкой концентрацией пг/мл в лунки трех планшетов для постановки ELISA, и затем изменением времени инкубации на стадиях анализа, которым были подвергнуты планшеты ELISA. Результаты IAC и результаты образцов MAb для трех планшетов были приемлемыми. Все результаты находились в пределах обычной вариабельности анализа, и испытуемый способ был определен как устойчивый к вариациям в отношении времени инкубации.
Устойчивость в отношении температуры инкубации определяли внесением двух образцов MAb и IAC, с высокой концентрацией пг/мл или низкой концентрацией пг/мл, в лунки трех планшетов для постановки ELISA, и затем тестированием одного планшета при 17°С,
одного планшета при 23°С и одного планшета при 27°С. Результаты анализа IAC и результаты анализа MAb были приемлемыми. Внутрилабораторная прецизионность для степени извлечения добавленного контроля и добавленного НСР в образце MAb была приемлема для всех трех планшетов. В целом, все результаты находились в пределах обычной вариабельности анализа, и испытуемый способ был определен как устойчивый к изменениям температуры инкубации в пределах от 17±2°С до 2 5±2°С.
Устойчивость анализа в зависимости от срока хранения реагента определяли с использованием аналитических реагентов (буфера для покрытия, блокирующего буфера и буфера для промывания), приготовленных через 1 неделю, две недели, три недели и четыре недели по сравнению с первоначальным приготовлением. В целом было сделано заключение, что аналитические реагенты стабильны сроком до одного месяца.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ детектирования, контроля, идентификации или
количественного определения белка клетки-хозяина GS-CHO (НСР) в
образце, содержащем рекомбинантный полипептид, например,
терапевтический полипептид, который включает:
a) обеспечение или получение образца, содержащего рекомбинантный полипептид;
b) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, например, нерастворимой или твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
c) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
e) детектирование присутствия GS-CHO НСР, связанного с
антителом, с использованием средства детекции детектируемого
антитела; и
f) необязательно количественное определение уровня
детектированного GS-CHO НСР;
д) необязательно идентификацию одного или более детектированных GS-CHO НСР; и
h) необязательно количественное определение одного или
более идентифицированных GS-CHO НСР.
2. Способ по п.1, в котором:
i) рекомбинантный полипептид представляет гомополимерный
или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста,
рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный
фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент
антитела, например, человеческое антитело или гуманизированное
антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело
или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего,
козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего
антитела, или
ii) рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблицах 1 или 2.
3. Способ по пп.1 или 2, в котором рекомбинантный
полипептид представляет антитело, например, моноклональное
антитело, например, терапевтическое антитело.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором:
i) образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида;
ii) образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида;
iii) образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида; или
iv) способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных на одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида.
5. Способ по п.1, в котором детектируемое антитело:
i) детектируется непосредственно,
ii) амплифицируется флуориметрическим реагентом, или
iii) биотинилируется, и средством детекции является авидин-
или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
6. Способ получения рекомбинантного полипептида, например, терапевтического полипептида, лекарственного продукта, который включает:
a) обеспечение или получение образца, содержащего препарат
рекомбинантного полипептида;
b) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
c) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
b)
e) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции детектируемого антитела; и
f) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР ниже предварительно выбранного эталонного уровня, где необязательно обработка включает одно или более из: получение состава полипептидного препарата; обработки полипептидного препарата в лекарственный продукт; объединения полипептидного препарата со вторым компонентом, например, эксципиентом или буфером; изменения концентрации полипептида в препарате; лиофилизации полипептидного препарата; объединения первой и второй аликвотной части полипептида с получением третьей, большей, аликвотной части; разделения полипептидного препарата на меньшие аликвотные части; помещения полипептидного препарата в контейнер, например, в герметичный контейнер для газа или жидкости; упаковки полипептидного препарата; связывания контейнера, содержащего полипептидный препарат, с этикеткой (например, маркировкой); перевозки или перемещения полипептидного препарата в другое место,
тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
7. Способ получения рекомбинантного полипептида, например, терапевтического полипептида, лекарственного продукта, который включает:
a) культивирование клетки GS-CHO, культивированной в условиях, подходящих для продукции, например, экспрессии и секреции, рекомбинантного полипептида,
b) выделение секретированного рекомбинантного полипептида из клетки-хозяина;
c) проведение одной или более стадий очистки секретированного рекомбинантного полипептида с получением препарата рекомбинантного полипептида;
d) отбор образца препарата рекомбинантного полипептида;
e) приведение в контакт и инкубацию образца с
поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на
твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
с) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
f) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
д) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции для детектируемого антитела; и
h) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде
лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР ниже заранее
выбранного эталонного уровня, где обработка включает одно или
более из: получение состава полипептидного препарата; обработки
полипептидного препарата в лекарственный продукт; объединения
полипептидного препарата со вторым компонентом, например,
эксципиентом или буфером; изменения концентрации полипептида в
препарате; лиофилизации полипептидного препарата; объединения
первой и второй аликвотной части полипептида с получением
третьей, большей, аликвотной части; разделения полипептидного
препарата на меньшие аликвотные части; помещения полипептидного
препарата в контейнер, например, в герметичный контейнер для
газа или жидкости; упаковки полипептидного препарата; связывания
контейнера, содержащего полипептидный препарат, с этикеткой
(например, маркировкой); перевозки или перемещения
полипептидного препарата в другое место,
тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
8. Способ по пп.б или 7, в котором эталонный уровень составляет:
i) примерно 100 част./млн. (например, ниже 100, 90, 80, 70,
60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 част./млн.),
ii) между 1 част./млн. и 1000 част./млн.,
iii) по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50
част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.,
или
iv) не выше 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 2 0 част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн..
9. Способ по пп.б или 7, в котором уровень GS-CHO НСР ниже эталонного уровня является спецификацией на коммерческий выпуск лекарственного продукта, например, в соответствии с разделом 351 (а) закона Службы общественного здравоохранении (PHS), и где необязательно уровень GS-CHO НСР определяется для одного, двух или более образцов или партий.
10. Способ по пп.б или 7, в котором:
i) рекомбинантный полипептид представляет собой гомополимерный или гетерополимерный полипептид, например гормон, фактор роста, рецептор, антитело, цитокин, лиганд рецептора, транскрипционный фактор или фермент, предпочтительно антитело или фрагмент антитела, например, человеческое антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или его фрагмент, полученные из мышиного, крысиного, кроличьего, козьего, овечьего или коровьего антитела, обычно кроличьего антитела, или
ii) рекомбинантный полипептид представляет полипептид, который раскрыт в таблицах 1 или 2.
11. Способ по пп.б или 7, в котором рекомбинантный
полипептид представляет антитело, например, моноклональное
антитело, например, терапевтическое антитело.
12. Способ по одному из пп.б-11, в котором:
i) образец получают на стадии последующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида,
ii) образец получают на стадии предшествующей обработки в способе получения рекомбинантного полипептида,
iii) образец получают из конечного продукта рекомбинантного полипептида, или
iv) способ включает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти образцов, полученных с одной или более стадий в способе получения рекомбинантного полипептида.
13. Способ по пп.б или 7, в котором детектируемое антитело:
13.
I) детектируется непосредственно,
ii) амплифицируется флуориметрическим реагентом, или
iii) биотинилируется, и средством детекции является авидин-
или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
14. Способ получения лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида, где способ включает:
a) обеспечение или получение образца препарата
рекомбинантного полипептида из культуры клетки GS-CHO;
b) получение показателя для белка клетки-хозяина GS-CHO (НСР) в образце; и
c) необязательно оценку полученного показателя, например, сравнением полученного показателя с эталонным значением; и
d) необязательно реагирование на оценку, классификацию, отбор, приемку, выпуск, обработку в лекарственный продукт, перевозку, перемещение в другое место, формуляцию, маркировку, упаковку, выпуск в продажу, продажу или предложение на продажу препарата, где показатель является функцией, пропорционален, или получен связыванием поликлонального анти-бЭ-СНО-антитела с образцом,
тем самым получение лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида.
15. Способ по п.14, в котором показатель определяли способом по любому из пп.1-12.
16. Способ оценки способа получения рекомбинантного полипептида в клетке-хозяине GS-CHO, который включает:
a) культивирование клетки GS-CHO, культивированной в условиях, подходящих для продукции, например, экспрессии и секреции, рекомбинантного полипептида;
b) выделение секретированного рекомбинантного полипептида из клетки-хозяина с получением первого полипептидного препарата;
c) необязательно отбор образца первого полипептидного препарата;
d) проведение стадии очистки первого полипептидного препарата с получением второго полипептидного препарата;
e) отбор образца второго полипептидного препарата;
f) необязательно проведение второй, третьей, четвертой, пятой или шестой стадии очистки второго полипептидного препарата с получением последующих полипептидных препаратов;
д) необязательно отбор образца любых последующих
полипептидных препаратов, полученных на стадии f);
h) приведение в контакт и инкубацию каждого из образцов,
отобранных с использованием поликлонального анти-GS-CHO НСР-
антитела, иммобилизованного на твердой подложке, с образованием
комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
i) отделение каждого из образцов от комплекса
иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
j) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
к) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства обнаружения детектируемого антитела; и
1) на основе указанного количественного определения, составление определения о способе,
тем самым оценки способа получения рекомбинантного полипептида.
17. Способ оценки способа очистки рекомбинантного полипептида, который включает:
a) проведение стадии очистки первого полипептидного
препарата с получением второго полипептидного препарата;
b) отбор образца второго полипептидного препарата;
c) необязательно проведение второй, третьей, четвертой,
пятой или шестой стадии очистки второго полипептидного препарата
с получением последующих полипептидных препаратов;
d) необязательно отбор образца любых последующих
полипептидных препаратов, полученных на стадии с);
е) приведение в контакт и инкубацию каждого из образцов,
отобранных с использованием поликлонального анти-GS-CHO НСР-
антитела, иммобилизованного на твердой подложке, с образованием
комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
f) отделение каждого из образцов от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
д) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
h) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного
с реагентом захвата, с использованием средства детекции для
детектируемого антитела; и
i) на основе указанного количественного определения,
составление определения способа,
тем самым оценки способ очистки рекомбинантного терапевтического средства.
18. Способ по пп.16 или 17, который включает сравнение уровня GS-CHO НСР с эталонным уровнем, например, если уровень GS-CHO НСР находится ниже эталонного уровня, то валидацию способа для применения в получении рекомбинантного полипептида.
19. Способ по п.18, в котором эталонный уровень составляет:
i) примерно 100 част./млн. (например, ниже 100, 90, 80, 70,
60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 част./млн.),
ii) между 1 част./млн. и 1000 част./млн.,
iii) по меньшей мере, 1 част./млн., 10 част./млн., 50
част./млн., 100 част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн.,
или
iv) не выше 1 част./млн., 5 част./млн., 10 част./млн., 2 0
част./млн., 30 част./млн., 40 част./млн., 50 част./млн., 100
част./млн., 500 част./млн. или 1000 част./млн..
20. Способ по пп.1б или 17, в котором стадия очистки включает одно или более, или любую комбинацию эксклюзионной хроматографии (SEC), ионообменной хроматографии (IEX), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), обращенно-фазовой хроматографии (RPC) , хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов, осаждения сульфатом аммония, тиофильной адсорбционной хроматографии, хроматографии на основе белка А, хроматографии на основе белка G, хроматографии на основе белка L и аффинной хроматографии.
20.
21. Способ по пп.16 или 17, в котором стадия очистки включает:
i) хроматографию на основе белка А и одну или более стадий
аффинной хроматографии,
ii) хроматографию на основе белка А и хроматографию на CNBr-активированном сорбенте, например, хроматографию на основе белка А и последующую хроматографию на CNBr-активированном сорбенте, или
iii) хроматографию на основе белка А и хроматографию на NHS-активированном сорбенте, например, хроматографию на основе белка А и последующую хроматографию на NHS-активированном сорбенте.
22. Набор, содержащий:
a) поликлональное анти-GS-CHO НСР-антитело,
иммобилизованное на твердой подложке;
b) необязательно детектируемое антитело;
c) необязательно буфер для промывания; и
d) необязательно детектирующий реагент, например,
детектирующий реагент, который является таким же, как реагент
захвата или является таким же, как реагент захвата, только
модифицированный для амплификации флуориметрическим реагентом, и
где необязательно детектирующее антитело биотинилируется, и средством детекции является авидин- или стрептавидин-пероксидаза и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.
23. Очищенный препарат поликлонального анти-GS-CHO НСР-антитела, в котором, необязательно, анти-GS-CHO НСР-антитело представляет овечье, козье, лошадиное, кроличье, бычье, мышиное, хомячье или человеческое антитело.
24. Очищенный поликлональный препарат по п.23, который по существу не содержит неспецифических для НСР IgG, например, препарат содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 4 0% или 50% неспецифических для НСР IgG, или препарат содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG.
25. Очищенный поликлональный препарат по п.23, очищенный способом, включающим: хроматографию на основе белка А, и одну
23.
или более стадий аффинной хроматографии (например, хроматографию на CNBr-активированном сорбенте, хроматографию на NHS-активированном сорбенте).
26. Реакционная смесь, содержащая поликлональный препарат (например, поликлональный препарат, описанный здесь) анти-GS-CHO НСР-антитела и рекомбинантный полипептид, выбранный из таблицы 1 или таблицы 2.
27. Реакционная смесь по п.2 6, содержащая антитело, которое связывается с анти-GS-CHO НСР-антителом.
28. Способ определения того, насколько партия или серия лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептид отвечает или соответствует спецификации на выпуск, где спецификация на выпуск представляет заранее выбранный эталонный уровень GS-CHO НСР, где способ включает:
a) обеспечение или получение образца препарата рекомбинантного полипептида;
b) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-GS-CHO НСР-антителом, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
c) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР;
d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-GS-CHO НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
e) количественное определение уровня GS-CHO НСР, связанного с реагентом захвата, с использованием средства детекции для детектируемого антитела; и
f) обработку, по меньшей мере, части препарата в виде лекарственного продукта, если уровень GS-CHO НСР отвечает, соответствует или находится ниже спецификации на выпуск, и
где необязательно обработка включает: классификацию, отбор, приемку, выпуск, обработку в лекарственный продукт, перевозку, перемещение в другое место, получение смеси, маркировку, упаковку, выпуск в продажу, продажу или предложение на продажу препарата,
тем самым определение того, насколько партия или серия лекарственного продукта на основе рекомбинантного полипептида отвечает или соответствует спецификации на выпуск
29. Способ по п.28, в котором показатель определяли способом по любому из пп.1-21.
30. Способ получения препарата поликлонального анти-НСР-антитела, который включает:
a) получение образца, содержащего антитела, например, антисыворотки, от животного (например, овцы, кролика, мыши, крысы, хомяка, козы и т. д.), иммунизированного НСР клетки-хозяина (например, клеточной линии, например, клетки или клеточной линии млекопитающего, грызуна или насекомого, например, клетки-хозяина СНО, SP2, NSO); и
b) выделение анти-НСР-антитела из образца, например, приведение в контакт образца с аффинным реагентом для НСР,
где необязательно стадия Ь) включает:
Ь.1) выделение антител, например, IgG антител, из образца с получением препарата антител; и
Ь.2) выделение анти-НСР-антитела из препарата антител, например, приведение в контакт препарата антител с аффинным реагентом, например, белком А,
тем самым получение препарата поликлонального анти-НСР-антитела .
31. Способ по п.30, в котором выделение антител включает очистку поликлонального анти-НСР-антитела из антисыворотки посредством способа очистки, включающего хроматографию на основе белка А.
32. Способ по пп.ЗО или 31, в котором аффинный реагент для
НСР включает НСР, связанный с субстратом, например,
нерастворимым или твердым субстратом, например, агарозовой
гранулой, например, Сефаразой, например, субстратом,
дериватизированньгм цианогенбромидом (CNBr) или N-
гидроксисукцинимидом (NHS) для хроматографии.
33. Способ получения поликлонального анти-НСР-антитела для применения в ELISA для детектирования НСР в препарате рекомбинантного полипептида, который включает:
31.
a) получение образца, содержащего антитела, например,
антисыворотки, от животного (например, овцы, кролика, мыши,
крысы, хомяка, козы и т. д.), иммунизированного НСР клетки-
хозяина (например, клеточной линии, например, клетки или
клеточной линии млекопитающего, грызуна или насекомого,
например, клетки-хозяина СНО, SP2, NSO); и
b) выделение антител из антисыворотки приведение в контакт
антисыворотки с аффинным реагентом на основе белка А с
получением препарата антител;
c) выделение анти-НСР-антитела из препарата антител
приведение в контакт препарата антитела с аффинным реагентом для
НСР,
тем самым получение препарата поликлонального анти-НСР-антитела .
34. Способ по любому из пп.30-33, в котором очистка удаляет:
i) по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98% или 99% неспецифических для НСР IgG, например, по меньшей
мере, 99% неспецифических для НСР IgG, или
ii) более 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или
99% неспецифических для НСР IgG, например, более 99%
неспецифических для НСР IgG.
35. Способ по любому из пп.30-33, в котором препарат поликлонального антитела по существу не содержит неспецифических для НСР IgG, например, содержит не более 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% неспецифических для НСР IgG, или содержит менее 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% неспецифических для НСР IgG.
36. Способ по любому из пп.1-21, в котором поликлональное антитело получают способом по любому из пп.30-35.
37. Поликлональное анти-НСР-антитело, полученное способом по любому из пп.3 0-35.
38. Очищенный препарат поликлонального анти-GS-CHO НСР-антитела, полученный способом по любому из пп.30-35.
39. Способ детектирования, контроля, идентификации или количественного определения белка клетки-хозяина (НСР)
35.
(например, СНО НСР) в образце, содержащем рекомбинантный полипептид, который включает:
a) обеспечение или получение образца, содержащего рекомбинантный полипептид;
b) приведение в контакт и инкубацию образца с поликлональным анти-НСР-антителом (например, анти-СНО НСР-антителом) , иммобилизованным на твердой подложке, с образованием комплекса иммобилизованное антитело-НСР, где поликлональное антитело получено любым из способов, описанных в настоящем документе;
c) отделение образца от комплекса иммобилизованное антитело-НСР;
d) приведение в контакт комплекса иммобилизованное антитело-НСР с детектируемым антителом, которое связывается с GS-CHO НСР;
e) детектирование присутствия НСР, связанного с антителом,
с использованием средства детекции детектируемого антитела; и
f) необязательно количественное определение уровня
детектированного НСР;
д) необязательно идентификацию одного или более детектированных НСР; и
h) необязательно количественное определение одного или более идентифицированных НСР.
40. Способ по любому из пп.1-21, в котором поликлональное анти-GS-CHO НСР-антитело получают способом по любому из пп.ЗО-35.
По доверенности
1/1
Объединенная овечья антисыворотка, пропущенная через фильтр 0,22 мкм
Хроматография MabSelect Sure Общая фракция IgG овцы, полученная на основе белка А
Диафильтрация/концентрирование Буфер обмена
Хроматография на CNBr-активированном сорбенте Аффинная очистка против антигена GS-CHOHCP
Диафильтрация/Концентрирование
ФИГ.1
|
